KR20180007669A

KR20180007669A - Itac의 억제제를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20180007669A
Application number: KR1020170083366A
Authority: KR
Inventors: 최서연; 조은경; 빈범호; 이태룡
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2016-07-13
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2018-01-23
Also published as: TWI767921B; TW201803573A

Abstract

본 명세서는 인터페론-유도성 T-세포 알파 화학주성인자(interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant; ITAC) 억제제를 포함하는 백반증 또는 백반증 전이의 예방 또는 치료용 조성물에 관하여 기술한다. 상기 조성물은 ITAC의 작용을 억제하여 멜라닌형성세포 이동을 억제하고 저색소침착 효과를 나타낼 수 있다. 또한 상기 조성물은 ITAC 작용을 억제하여 백반증 또는 백반증 전이의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.

Description

ITAC의 억제제를 포함하는 조성물{Composition comprising ITAC inhibitor}

본 명세서는 ITAC의 억제제를 포함하는 조성물에 관하여 기술한다.

케모카인(chemokine)의 중요한 역할 중 하나는 세포이동(cell migration) 유도를 통하여 면역 반응 및 종양형성(tumorigenesis)을 매개하는 것이다. 몇몇의 케모카인은 마우스 백반증(vitiligo)에 관여한다. 인터페론-유도성 T-세포 알파 화학주성인자(Interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant; ITAC)는 다른 리간드에 비해 CXCR3에 높은 결합 친화성을 가져 면역 세포로부터 강력한 화학주성 반응을 이끌어낸다. ITAC의 멜라닌형성세포 이동 및 색소침착에 대한 효과와 관련 장애에 대한 관련성에 대해서는 알려진 바 없다. Class II 히스톤디아세틸라아제(HDAC), 특히 HDAC5는 세포이동을 포함한 다양한 세포 과정에 관여하는 p53 단백질을 탈아세틸화하며 단백질 안정성 및 활성을 조절한다.

본 연구는 HDAC5를 통한 p53의 탈아세틸화에 의한 ITAC의 멜라닌형성세포에 있어서의 이동성(migratory) 및 저색소침착(hypopigmentation) 효과에 대한 in vitro 증거 및 백반증과 같은 병리 조건에서의 ITAC의 역할에 대한 번역 측면에서의 고찰을 제공한다.

일 관점에서, 본 발명은 인터페론-유도성 T-세포 알파 화학주성인자(interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant; ITAC) 억제제를 포함하는 백반증 또는 백반증 전이의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

다른 관점에서, 본 발명은 ITAC의 유전자 발현량의 검출시약을 포함하는 백반증 또는 검출용 조성물을 제공한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 ITAC, CXCR3 및 CXCR7 중 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 것을 포함하는 백반증 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

도 1은 ITAC, MIG 및 IP-10 처리에 따른 인간 표피 멜라닌형성세포(NHEM)의 이동을 비교한 결과 (a), ITAC 농도 변화에 따른 NHEM 이동 결과 (c) CXCR3 및 CXCR7 단백질 발현 수준의 웨스턴블롯 결과 및 NHEM을 CXCR3 또는 CXCR7 중화항체 처리 후 ITAC 존재 하에 이동 분석한 결과 (d) 를 나타낸다.
도 2는 ITAC 처리에 의하여 현저하게 상향- 또는 하향- 조절되는 생물학적 과정을 분석한 결과(a), 및 ITAC 처리에 따른 NHEM 내 HDAC5 mRNA 수준 (b) 및 HDAC9 mRNA 수준 (c)을 나타낸다.
도 3은 NHEM 내 HDAC5 및 HDAC9 녹다운에 따른 세포 이동을 확인한 결과 (a), HDAC5 과발현에 따른 세포 이동을 확인한 결과 (b) 및 ITAC 처리에 따른 HDAC5 단백질 수준을 확인한 결과 (c) 를 나타낸다.
도 4는 ITAC 처리에 따른 NHEM에서의 총 p53 및 아세틸화 p53의 수준을 확인한 결과 (a), HDAC5 과발현에 따른 총 p53 및 아세틸화 p53의 수준을 확인한 결과 (b), 및 HDAC5 녹다운에 따른 총 p53 및 아세틸화 p53의 수준을 확인한 결과 (c)를 나타낸다.
도 5는 HDAC5 과발현 (HDAC5-myc), p53 과발현 (p53-Flag) 또는 양 자 모두를 과발현 (HDAC5-Myc+p53-Flag)시킨 경우의 ITAC 존재 또는 부존재하의 세포 이동에 대한 효과를 확인한 결과(a) 및 ITAC 처리에 따른 MMP1 발현에 대한 효과를 확인한 결과 (b)를 나타낸다.
도 6는 ITAC 처리에 따른 멜라닌 양 변화를 확인한 결과 (a), UV 조사 후 ITAC처리에 따른 멜라닌 양, 총 p53 또는 아세틸화 p53 단백질 수준을 확인한 결과 (b), 및 HDAC5 과발현에 따른 멜라닌 양을 확인한 결과 (c)를 나타낸다.
도 7. 정상 (N) 또는 저색소침착 병소 (L)의 피부 시료 (#1 및 #2)를 항-ITAC 항체(녹색) 및 항-HMB45(적색)으로 염색한 결과를 나타낸다. 핵은 DAPI(청색)으로 나타나며, 화살표는 멜라닌, 삼각형은 멜라닌 형성세포를 나타낸다.
도 8은 NHEM의 피부 세포 유래 케모카인으로의 이동능을 나타낸 결과이다.
도 9는 인간 흑색종 세포주(WM266-4, SK-MEL-28 및 MNT-1)에서의 ITAC의 세포 이동 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 siRNA처리에 따른 HDAC5(a)와 HDAC9(b)의 녹다운 여부를 확인한 mRNA 발현 결과이다.
도 11는 NHEM 내 ITAC 처리(a) 또는 NHEM에서의 HDAC5 결실(b)에 의해 알파-튜불린의 아세틸화가 영향받는지를 확인한 결과, 및 흑색종 세포 내에서의 ITAC 처리에 따른 p53 및 TYR 발현 변화를 확인한 결과(c)이다.
도 12는 ITAC 처리에 따른 NHEM 내에서의 TYR (a), MITF (b), TRP1 (c) 및 DCT (d) 발현에 대한 효과를 확인한 결과이다.
도 13는 p53 녹다운의 경우 ITAC 처리에 따른 TYR (a), MITF (b), TRP1 (c) 및 DCT (d) 발현에 대한 효과를 확인한 결과이다.

이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 출원의 실시예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 출원에 개시된 기술은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 출원의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 또한, 설명의 편의를 위하여 구성요소의 일부만을 도시하기도 하였으나, 당업자라면 구성요소의 나머지 부분에 대하여도 용이하게 파악할 수 있을 것이다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 출원의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다.

본 명세서에서, "중화", "억제"는 해당 물질 부재시의 활성과 비교하여, 억제제 존재에 따라 활성을 감소시키는 것을 의미한다. 활성 감소는 예를 들어 약 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 그 이상일 수 있다.

다른 관점에서 본 발명 일 실시예는 인터페론-유도성 T-세포 알파 화학주성인자(interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant; ITAC) 억제제를 포함하는 백반증 또는 백반증 전이의 예방 또는 치료용 조성물에 관한다.

상기 실시예들에 따른 조성물은 멜라닌형성세포 이동을 효과적으로 억제할 수 있으며, 백반증 또는 백반증 전이의 예방, 치료 또는 이들의 증상 개선에 기여할 수 있다.

상기 ITAC 억제제는 ITAC 유전자의 발현 또는 활성, 또는 ITAC의 작용 또는 활성을 억제하는 물질일 수 있다.

일예에서, 상기 ITAC 억제제는 ITAC mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 상기 ITAC의 중화항체일 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는　siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 유전자의 발현 또는 활성 억제제는 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상을 유도하는　siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일측면에서, 상기 유전자의 mRNA 발현을 억제하기 위해 상기 유전자 mRNA의 간섭을 유도하는 RNAi현상을 이용할 수 있다.

miRNA는 세포 내에 존재하는 작은 RNA(endogenous small RNA)의 일종으로 단백질을 합성하지 않는 DNA에서 유래되어 헤어핀-구조 전사체(hairpin-shaped transcript)로부터 생성이 된다. miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR의 상보적 서열(sequence)에 결합하여 그 mRNA의 번역 억제 또는 불안정화를 유도하여, 궁극적으로 그 표적 mRNA의 단백질 합성을 억제하는 리프레서(repressor) 역할을 하게 된다. 하나의 miRNA는 여러 개의 mRNA를 타겟팅하며, mRNA 역시 여러 개의 miRNA에 의해 조절될 수 있다고 알려져 있다. RNAi 현상을 유도하는 다른 RNA로 19 내지 27 mer 내외의 짧은 RNA인 short interfering RNA(siRNA)가 있으며, 짧은 헤어핀(short hairpin) 구조를 가지는 shRNA가 있다.

구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며,　siRNA, shRNA 및 miRNA중 어느 하나 일 수 있다.

상기 ITAC의 중화항체인 경우 ITAC 억제제는 항-ITAC 항체일 수 있다.

일 예에서, 상기 ITAC 억제제는 ITAC 수용체의 발현 또는 활성을 억제하는 물질일 수 있다. 일 예에서, 상기 ITAC 수용체는 CXC-케모카인 수용체 타입 3(CXC- chemokine receptor type 3; CXCR3), CXC-케모카인 수용체 타입 7(CXC- chemokine receptor type 7; CXCR7 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 ITAC 수용체의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 상기 ITAC 수용체 mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 상기 ITAC 수용체의 중화항체일 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는　siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 siRNA, shRNA 및 miRNA에 관하여는 상술한 바와 같으므로 설명을 생략한다.

상기 ITAC 수용체의 중화항체인 경우 ITAC 억제제는 항-CXCR3 항체, 항-CXCR7 항체 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

일 예에서, 상기 ITAC 억제제는 ITAC의 하류 작동자인 HDAC: 히스톤디아세틸라아제 5(histone deacetylase-5; HDAC5)를 억제하는 물질일 수 있다. 상기 HDAC5를 억제하는 물질은 예를 들어 HDAC5 발현 또는 활성을 억제하는 물질일 수 있다.

상기 HDAC5의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 예를 들어 HDAC5 mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 HDAC5의 중화항체일 수 있다.

상기 HDAC5의 중화항체는 항-HDAC5 항체일 수 있다.

상기 ITAC의 mRNA 서열은 NM_005409, NM_001302123, 또는 서열번호 1로 나타낼 수 있다. CXCR3의 mRNA 서열은 NM_001142797, NM_001504 또는 서열번호 2로 나타낼 수 있다. CXCR7의 mRNA 서열은 NM_001047841, NM_020311, 또는 서열번호 3으로 나타낼 수 있다. HDAC5 mRNA의 서열은 NP_001015053, NM_005474, NM_139205, 또는 서열번호 4로 나타낼 수 있다.

본 발명 실시예들에 따른 조성물은 다양한 형태의 식품 첨가제 또는 기능성 식품으로 제공될 수 있다. 예를 들어 발효유, 치즈, 요구르트, 주스, 생균제제 및 건강식품 등으로 가공될 수 있으며, 그 외 다양한 식품 첨가제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 실시예들에 따른 조성물은 건강 식품용 조성물일 수 있다. 상기 건강 식품용 조성물은 ITAC의 작용을 억제하여 멜라닌형성세포 이동을 억제하고, 저색소침착 효과를 나타낸다. 또한, 상기 건강 식품용 조성물은 ITAC의 작용을 억제하여 백반증, 백반증의 증상 또는 전이를 완화 또는 개선시킬 수 있다.

구체예에서, 상기 건강 식품용 조성물은 환제, 캅셀제, 정제, 과립제, 캬라멜제 또는 드링크제 등으로 제형화할 수 있다. 다른 구체예에서, 액제, 분말, 과립, 정제 또는 티백 등의 형태로 가공될 수도 있다.

상기 조성물은 단순 음용, 주사 투여, 스프레이 방식 또는 스퀴즈 방식 등의 다양한 방법으로 투여될 수 있다.

상기 조성물은 본 발명의 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분들의 첨가량은, 조성물 전체 중량을 기준으로, 0.01중량% 내지 5 중량%, 예를 들어 0.01중량% 내지 3중량% 일 수 있다.

본 발명의 실시예들에 따른 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 상기 약학 조성물은 ITAC의 작용을 억제하여 멜라닌형성세포 이동을 억제하고, 저색소침착 효과를 나타내며, 백반증 또는 백반증의 증상 또는 전이를 예방, 치료 또는 완화시킬 수 있다.

구체예에서, 상기 약학 조성물은, 통상적인 방법에 따라 상용되는 무기 또는 무기의 담체를 더 포함하여 고체, 반고체 또는 액상 등 다양한 형태로 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다.

상기 경구 투여형 제재는 예를 들어 정제, 환제, 과립제, 연/경 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제, 시럽제, 펠렛제 등일 수 있으며, 비경구 투여형 제재는 예를 들어 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제 등일 수 있다. 상기 약학 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제 등의 약학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있다.

상기 약학 조성물은 경구, 비경구, 국소, 경피, 피하, 직장, 정맥 내, 근육 내, 복강 내 등으로 투여될 수 있다.

유효성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로 유효성분의 투여량은 0.001mg/kg/일 내지 2000mg/kg/일, 예를 들어 0.5mg/kg/일 내지 1500mg/kg/일이다.

또 다른 관점에서, 본 발명 일실시예는 ITAC 유전자 발현량의 검출시약을 포함하는 백반증 검출용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 ITAC 유전자 발현의 검출시약은 ITAC 유전자의 전사체의 수준을 측정할 수 있는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 검출시약은 ITAC 전사체에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브일 수 있다.

상기 조성물에 의하여 ITAC 발현량이 정상군에 비하여 증가하면 백반증 또는 백반증의 전이가 있는 것으로 판단할 수 있다.

상기 프라이머는 상기 유전자 mRNA에 상보적이며, 상기 mRNA를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 프로브는 상기 유전자 mRNA의 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 실시예들에 있어서 유전자의 발현량 검정은 PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction), 노던블로팅(northern blot analysis), 웨스턴블로팅(western blot analysis), 점블럿(dot blot assay), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 및 마이크로어레이, 예를 들어 대립형질 특이적 혼성화(Allele-specific hybridization)를 이용한 TaqManTM　프로브법, 중합반응을 통한 대립형질 특이적 혼성화(Allele-specific hybridization)를 이용한 프로브법, 제한효소를 이용한 제한 단편화 길이 다형성(RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism)법, 용융온도(Tm, melting temperature)을 이용한 역동적 대립형질 특이적 혼성화(DASH, Dynamic Allele-Specific Hybridization)법, 중합반응을 이용한 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 대립형질 특이적 신장(Allele-Specific Extension)을 이용한 마이크로어레이 방법 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

검체는 인간으로부터 분리된 상피세포(epithelial cell), 각질형성세포(keratinocyte), 멜라닌형성세포(melanocyte), 비만세포(mast cell)와 같은 면역세포, 또는 섬유아세포(fibroblast)일 수 있으며, 예를 들어 각질형성세포일 수 있다.

대상으로부터 검체를 얻는 것은 기술 분야의 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있으며, 피부에 대한 테이프스트리핑(tape stripping)과 같이 피부에 자극을 발생시키지 않고 비침습적 방법으로 수행할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일예에서 상기 테이프스트리핑은 예를 들어 1-20회, 예를 들어 5회 수행할 수 있으며 상기 범위 내에서 피부 자극을 발생하지 않고 검체를 얻을 수 있다.

상기 유전자의 발현량을 검정하는 것은 상기 검체에서 유전자의 전사체 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 프라이머쌍 또는 프로브를 사용하는 경우, 유전자의 전사체의 수준 측정은 상기 검체 중 상기 프라이머쌍 및 프로브 중 하나 이상과 혼성화된 전사체의 양을 측정하여 수행할 수 있다. 상기 항체를 사용하는 경우, 발현된 단백질 수준 측정은 상기 검체 중 상기 항체와 혼성화된 단백질의 양을 측정하여 수행할 수 있다.

본 발명 또 다른 실시예에 따르면, ITAC, CXCR3 및 CXCR7 중 하나 이상의 유전자의 전사체에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브, 상기 하나 이상의 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 중 하나 이상을 포함하는 백반증 진단용 키트를 제공할 수 있다.

또 다른 관점에서 본 발명 일 실시예는 ITAC 발현을 통하여 백반증 또는 백반증의 전이를 진단할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

상기 방법은 검체에서의 ITAC 발현량을 검출하여 ITAC가 정상에 비하여 과발현되는 경우 백반증으로 진단할 수 있다. 상기 검체는 진단 대상의 표피조직일 수 있다. 일 예에서 상기 검체는 진단 대상으로부터 분리된 상피세포(epithelial cell), 각질형성세포(keratinocyte), 멜라닌형성세포(melanocyte), 비만세포(mast cell)와 같은 면역세포 중 하나 이상일 수 있다.

상기 과발현은 정상 발현에 비하여 유전자의 발현량이 정상군 발현량 대비 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상, 1.5배 이상, 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 2.0배 이상, 2.1배 이상, 2.2배 이상 2.3배 이상, 2.4배 이상, 2.5배 이상, 2.6배 이상, 2.7배 이상, 2.8배 이상, 2.9배 이상, 3.0배 이상, 3.1배 이상, 3.2배 이상, 3.3배 이상, 3.4배 이상, 3.5배 이상, 3.6배 이상, 3.7배 이상, 3.8배 이상, 3.9배 이상, 4.0배 이상, 4.1배 이상, 4.2배 이상, 4.3배 이상, 4.4배 이상, 4.5배 이상, 4.6배 이상, 4.7배 이상, 4.8배 이상, 4.9배 이상, 또는 5.0배 이상이고, 20.0배 이하, 19.5배 이하, 19.0배 이하, 18.5배 이하, 18.0배 이하, 17.5배 이하, 17.0배 이하, 16.5배 이하, 16.0배 이하, 15.5배 이하, 15.0배 이하, 14.5배 이하, 14.0배 이하, 13.5배 이하, 13.0배 이하, 12.5배 이하, 12.0배 이하, 11.5배 이하, 11.0배 이하, 10.5배 이하, 10.0배 이하, 9.5배 이하, 9.0배 이하, 9.0배 이하, 8.5배 이하, 8.0배 이하, 7.5배 이하, 7.0배 이하, 6.5배 이하, 6.0배 이하, 5.5배 이하 또는 5.0배 이하일 수 있으며, 예를 들어 1.1 내지 20.0배, 예를 들어 1.5 내지 10.0배, 예를 들어 2배 내지 8배인 경우 백반증으로 진단할 수 있다.

상기 방법은 ITAC 발현에 더하여 ITAC 수용체인 CXCR3 또는 CXCR7, 또는 양 자 모두의 발현을 측정하는 것을 더 포함할 수 있다. ITAC 발현과 마찬가지로 CXCR3 또는 CXCR7가 과발현될 경우 백반증, 또는 백반증 전이를 진단할 수 있다.

본 발명 또 다른 실시예에 따르면, 백반증의 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.

일 예에서, 상기 백반증 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법은 인간 표피 조직에 시험물질을 처리하고, 상기 시험물질이 인간 표피 조직에서 ITAC, CXCR3 및 CXCR7 중 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 것을 포함할 수 있다.

상기 표피 조직은 진단 대상으로부터 분리된 상피세포(epithelial cell), 각질형성세포(keratinocyte), 멜라닌형성세포(melanocyte), 비만세포(mast cell)와 같은 면역세포 중 하나 이상일 수 있다.

일 예에서, 상기 예방 또는 치료물질로 판정하는 것은 미처리군의 발현 대비 유의적인 발현 억제를 나타낼 경우 예방 또는 치료물질로 판정할 수 있다. 예를 들어 발현 억제는 미처리군의 발현에 대한 발현 감소가 P<0.05일 수 있다.

이하, 실험예, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실험예, 실시예 및 비교예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

ITAC는 HDAC5를 통한 p53 탈아세틸화를 통하여 멜라닌형성세포 이동 및 저색소침착을 유도한다 : 색소관련 장애에서의 ITAC의 가능한 역할

- 케모카인(chemokine)의 중요한 역할 중 하나는 세포이동(cell migration) 유도를 통하여 면역 반응 및 종양형성(tumorigenesis)을 매개하는 것이다.

- 몇몇의 케모카인은 마우스 백반증(vitiligo)에 관여한다.

- 인터페론-유도성 T-세포 알파 화학주성인자(Interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant; ITAC)는 다른 리간드에 비해 CXCR3에 높은 결합 친화성을 가져 면역 세포로부터 강력한 화학주성 반응을 이끌어낸다.

- ITAC의 멜라닌세포 이동 및 색소침착에 대한 효과와 관련 장애에 대한 관련성에 대해서는 알려진 바 없다.

- Class II 히스톤디아세틸라아제(HDAC), 특히 HDAC5는 세포이동을 포함한 다양한 세포 과정에 관여하는 p53 단백질을 탈아세틸화하며 단백질 안정성 및 활성을 조절한다.

- CXCR3-타게팅 케모카인 중 ITAC만이 멜라닌형성세포 및 흑색종 세포의 이동 및 저색소침착을 효율적으로 유도한다.

- ITAC 발현이 백반증 피부의 표피 내에서 증가한다.

- HDAC5가 그 기질인 p53 를 탈아세틸화 및 불안정화하여 ITAC-매개 세포 과정에 관여한다.

- 본 연구는 HDAC5를 통한 p53의 탈아세틸화에 의한 ITAC의 멜라닌형성세포에 있어서의 이동성(migratory) 및 저색소침착(hypopigmentation) 효과에 대한 in vitro 증거 및 흑색종 및 백반증과 같은 병리 조건에서의 ITAC의 역할에 대한 번역 측면에서의 고찰을 제공한다.

약어

CXCR3: CXC-케모카인 수용체 타입 3(CXC- chemokine receptor type 3); HDAC: 히스톤디아세틸라아제(histone deacetylase); IP-10: 인터페론-감마-유도 단백질 10(interferon-gamma-induced protein 10); ITAC: 인터페론-유도성 T-세포 알파 화학주성인자(interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant; ITAC); MIG: 인터페론-감마에 의해 유도된 모노카인(monokine induced by interferon-gamma); MMP1: 매트릭스 메탈로펩티다아제 1(matrix metallopeptidase 1); NHEM: 정상 인간 표피 멜라닌형성세포(normal human epidermal melanocyte); TYR: 타이로시나아제(tyrosinase); MITF: 마이크로프탈미아-연관 전사 인자(microphthalmia-associated transcription factor); TRP1: 타이로시나아제-관련 단백질-1(tyrosinase-related protein-1); DCT: 도파크롬 토토머라아제(dopachrome tautomerase); HMB45: 인간 흑색종 블랙-45(human melanoma black-45)

ITAC 및 그 수용체의 억제에 의한 세포 이동 조절 및 피부 질환 관리

- ITAC(케모카인): 멜라닌형성세포, 흑색종 및 면역 세포의 이동을 유도함

- ITAC 수용체 CXCR3, CXCR7를 통한 신호 전달

- 하위 신호 인자 HDAC5 활성, p53 억제를 통해 세포 이동이 유도됨

- 중화 항체(항-CXCR3, 항-CXCR7) 처리는 ITAC-유도 세포 이동을 억제함

- 세포 이동-관련 피부 질환: 흑색종, 백반증

- ITAC 및 수용체 발현이 전이성 흑색종 조직 내에서 증가함

- ITAC 발현이 백반증 병소 내에서 증가함

- 따라서, ITAC 및 그 수용체를 억제하는 것이 흑색종 및 백반증의 개선에 기여.

- 이와 관련하여, ITAC 및 ITAC 수용체의 중화 항체를 이용한 특정 피부 질병의 관리/치료용 조성물.

- 다양한 케모카인/사이토카인의 세포 이동 증진의 효과

- 멜라닌형성세포의 이동 증진을 위한 케모카인의 사용

요약

배경

세포 이동은 면역 반응 및 종양형성에서 주요한 역할을 한다. 인터페론-유도성 T-세포 알파 화학주성인자(Interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant; ITAC)는 면역 세포로부터 강력한 화학주성 반응을 이끌어낸다.

목적

ITAC의 멜라닌형성세포 이동 및 색소침착에 대한 효과 및 관련 장애에 대한 관련성을 실험하고, 이 과정들의 잠재적 핵심 요소를 조사하기 위함

방법

인간 멜라닌형성세포 또는 흑색종 세포에 ITAC를 처리하고 이동 측정(migration assay)를 수행하였다. ITAC 처리에 의해 조절되는 유전자를 찾기 위해 전체적 유전자 발현 분석(global gene expression analysis)을 수행했다. ITAC 처리와 함께 녹다운 또는 과발현 실험을 이용하여 ITAC-유도 세포 과정에 관여하는 주요 요소들의 역할을 알아보았다. 염증-연관 저색소침착 장애인 백반증에서의 ITAC 발현을 실험하였다.

결과

CXCR3 리간드 중 오직 ITAC 만이 멜라닌형성세포 이동을 유도한다. ITAC 처리는 히스톤디아세틸라아제 5(HDAC5)를 상향조절(up-regulate)하였고, HDAC5의 알려진 타겟인 p53를 하향조절(down-regulate)하였다. HDAC5 및 p53의 녹다운 또는 과발현을 통하여, HDAC5가 탈아세틸화를 통해 p53 레벨을 감소시켜 ITAC-유도성 이동을 매개한다는 것을 확인하였다. 또한 ITAC 처리가 p53- 및 HDAC5-의존성으로 색소침착을 감소시킬 수 있다. 마지막으로, ITAC 처리에 의한 인간 흑색종 세포의 증가된 이동 및 백반증 피부의 표피 내에서의 ITAC 발현 증가를 확인하였다.

결론

본 연구는 HDAC5를 통한 p53의 탈아세틸화에 의한 ITAC의 멜라닌형성세포에 있어서의 이동성(migratory) 및 저색소침착(hypopigmentation) 효과에 대한 in vitro 증거 및 흑색종 및 백반증과 같은 병리 조건에서의 ITAC의 역할에 대한 번역 측면에서의 고찰을 제공하며, HDAC5 및 그 기질인 p53을 ITAC-유도성 세포 과정을 조절하는 잠재적 타겟으로 제안한다.

키워드: HDAC5, p53, ITAC, 멜라닌형성세포, 이동, 흑색종, 백반증

Introduction

리신(lysine) 아세틸화는 인간 세포 내에서 1750 이상의 단백질에 영향을 미칠 수 있는 전사 후 변형으로 ¹, 아세틸화/탈아세틸화가 생리적 단백질 활성의 중요한 조절자라는 점을 시사한다. 히스톤아세틸트랜스퍼라제는 아세틸조효소 A(acetyl coenzyme A)로부터 리신 잔기의 ε-아민(ε-amine)으로 아세틸 모이어티(moiety)를 전달하여 히스톤 단백질 상의 리신 아세틸화를 촉매하며, 히스톤디아세틸라아제(HDAC)는 그 반대 과정을 촉매한다. 반대의 구조 및 기능을 갖는 히스톤아세틸트랜스퍼라제와 달리, HDAC는 효모 대응부(counterpart)에 대한 서열 상동성을 기초로 4개의 별개의 클래스(class)로 분류된다: Class I (HDAC1, 2, 3, 및 8), Class II (IIa: HDAC4, 5, 7, 9, 및 MITR; IIb: HDAC6 및 10), Class III (SIRT1-7), 및 Class IV (HDAC11).² Class I HDAC는 본질적으로 핵에서 발현되며 모든 조직에서 발견되고, Class II HDAC는 조직 특이적 발현 패턴을 나타내며 핵원형질 셔틀링(nucleocytoplasmic shuttling)을 수반하고, 이는 비-히스톤 단백질의 탈아세틸화에 관여한다는 것을 시사한다. 비-히스톤 단백질 중 세포 성장 정지, 세포사멸(apoptosis), 및 세포노화(senescence)에 기능하는 전사 인자인 p53는 HDAC를 통한 리신 탈아세틸화에 의해 안정적으로 조절되는 대표적 단백질이다.^3-4 또한 근래 HDAC5가 리신120(K120)을 탈아세틸화하여 p53dp 작용한다는 것이 보고되었다.⁵

비록 HDAC 및 그 타겟이 비교적 잘 연구되어 있으나, 특정 HDAC를 활성화하는 인자는 보다 적게 이해되어 있다. HDAC가 다양한 세포 과정에 참여하기 때문에 그 조절장애는 암의 발병 및 염증성 질환과 연관되어 있다. 비록 이들 질병의 치료를 위해 임상실험으로 HDAC 억제제가 연구되어 왔으나, 환자에서의 HDAC 억제에 대한 분자적 근거는 완전히 알려져 있지 않다.⁶ HDAC는 종래 알파-튜불린(alpha-tubulin) 및 코르탁틴(cortactin)과 같은 운동성 관련 단백질의 탈아세틸화를 통해 다양한 세포 및 종양의 운동성에 중요한 것으로 나타났다.^7-8 이 발견 및 HDAC의 전이와 염증에서의 잠재적 역할은 HDAC와 세포 이동에 관여하는 질병 과정과의 관계를 시사한다.

피부에서, 면역 세포 및 피부 세포는 정상 상태 및 환경 스트레스에 대한 반응으로 다양한 사이토카인 및 케모카인을 분비한다. 특히 UVB 파장에 노출되면 분비된 인자들을 매개로 하여 멜라닌형성세포 미세환경(microenvironment)의 조절장애를 야기하며, 멜라닌형성세포의 과증식(hyper-proliferation)과 비정상 영역으로의 이동을 유발한다.⁹ 그러나 성숙 멜라닌형성세포 이동에 대한 케모카인의 영향에 대하여는 거의 보고되어 있지 않다. 우리는 피부-유래 케모카인인 SDF1가 성숙 멜라닌형성세포에서의 주화성(chemotaxis)을 유도한다는 것을 입증하였다.¹⁰ 다른 케모카인, 특히 CXC-케모카인 수용체 타입 3(CXCR3)-타케팅 케모카인, 인터페론-g에 의해 유도된 모노카인(MIG), 인터페론-g 유도 단백질(IP-10), 및 인터페론 유도성 T-세포 알파 화학주성인자(ITAC)가 염증 부위로 다른 아형(subtype)의 면역 세포의 동원에 중요한 역할을 한다. ¹¹ 흥미롭게도 이들 케모카인들의 발현패턴 및 결합 친화도는 차이를 갖는다: IP-10 및 ITAC는 기저 각질형성세포 내에서 발현되지만 MIG는 피부 침윤(dermal infiltrate) 내에서 발현되고, ITAC는 CXCR3에 IP-10 또는 MIG에 비해 높은 친화도로 결합한다.¹³ MIG 및 IP-10은 만성적인 UVB 노출 하에서의 지연된 색소침착에 관여하며, ¹⁴ 각질형성세포 및 멜라닌형성세포의 공생배양(co-culture)에서 색소침착을 유도하지만, ¹⁵ 멜라닌형성세포 이동 및 색소침착에서의 ITAC의 역할은 알려져 있지 않다. 우리는 ITAC가 다른 CXCR3 리간드에 비해 다른 발현 패턴 및 수용체-결합 활성을 나타내는 점을 기초로 ITAC가 이들 과정에서 별개의 역할을 할 것으로 예측하였다.

본 연구에서, 우리는 ITAC의 인간 멜라닌형성세포 및 흑색종 이동에 대한 효과를 확립하였다. 우리는 Class IIa HDAC인 HDAC5를 ITAC-유도 멜라닌 형성세포 이동의 매개체로서, 그리고 p53을 HDAC5의 탈아세틸화 타겟으로 확인하였다. 또한 우리는 ITAC 처리가 p53- 및 HDAC5- 의존적으로 색소침착을 감소시키며, 백반증 피부의 표피 내에서 ITAC 발현이 증가되는 것을 입증하였다.

재료 및 방법

세포 배양

중간 색소의 피부 유래의 NHEM을 구입하여(Cascade Biologics, Portland, OR) 인간 멜라닌형성세포 성장 보조제(HMGS; Life Technologies, Carlsbad, CA)가 첨가된 배지254(Medium 254)에서 5% CO₂ 포함하는 습윤 인큐베이터 내에서 배양하였다. NHEM에 다양한 농도의 표시된(표 S1; R&D R&D system, Minneapolis, MN) 케모카인을 처리하였다.

세포 이동 어세이

이동 어세이는 공개된 방법¹⁰에 따라 세포에 표시된 처리 후에 보이든(Boyden) 챔버 내에서 수행하였다. 선택된 실험에서 NHEM을 CXCR3 (R&D system), CXCR7 (Biolegend, San Diego, CA), 또는 각각의 아이소타입 대조항체(isotype-matched control antibody)에 대하여 중화항체 50 ㎍/㎖로 전처리하였다. 보이든 챔버 어세이(Boyden chamber assay)의 구체적인 프로토콜은 보충 정보에 제시된다.

웨스턴 블롯 분석 및 일시적 트랜스펙션 (transient transfection )

웨스턴블롯은 25mg의 세포 용출물을 사용하여 수행하였다. 구체적인 프로토콜과 항체 정보는 보충 정보에 기술된다. HDAC5, HDAC9 및 p53 (Dharmacon, Lafayette, CO) 각각에 대한 siRNA 50nM 또는 HDAC5-Myc 및 p53-Flag (GeneCopoeia, Rockville, MD)를 위한 플라스미드 DNA 2mg 시료를 각각 Lipofectamine RNAiMAX 또는 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Washington, DC)를 사용하여 48 시간 동안 제조사 지침에 따라 세포에 트랜스펙션하였다.

마이크로어레이 분석( Microarray analysis)

NHEM에 ITAC 50ng/㎖를 48시간 처리하고, TRIzol 시약(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA의 15ng을 분석에 사용하였다. 마이크로어레이 분석 방법은 보충 정보에 구체적으로 기술된다.

정량적 실시간 PCT 분석(Quantitative real-time PCR analysis)

랜덤헥사머(random hexamers) 및 리버스 트랜스크립타아제(reverse transcriptase (Promega, Madison, WI))를 제조사 지침에 따라 이용하여 총 RNA의 2㎍을 cDNA 합성에 사용하였다. 구체적인 프로토콜은 보충 정보에 제시된다.

멜라닌 어세이 (Melanin assay)

세포에 ITAC 50 또는 200ng/㎖로 4일 처리하거나, 다양한 농도의 HDAC5-Myc 발현 플라스미드로 2일간 트랜스펙션하였다. 세포 용출 및 멜라닌 어세이의 구체적인 방법은 보충 정보에 제시된다.

인간 백반증 피부의 면역조직화학적 분석( Immunohistochemical analysis of human vitiligo skins)

백반증 진단을 받은 2명의 환자에게 서면 협조를 받은 후 본 연구에 참여시켰다. 3쌍의 저색소침착된 피부 및 정상 색소 피부 샘플을 3mm-직경 펀치로 생검하여 항-ITAC(R&D system) 및 항-HMB45(melanocyte marker) 항체(GeneTex, Irvine, CA)를 사용하여 면역조직화학 분석하였다. 연구는 동국대학교 일산병원의 임상시험심사위원회의 인가를 받고, 헬싱키 선언에 따라 이루어졌다.

통계 분석

모든 데이터는 평균± SD 으로 나타낸다. 두 그룹간의 차이를 분석하는 데에 스튜던트 t-테스트 양측검정(two-tailed Student's t-test )을 이용하였다.

결과

ITAC는 인간 표피 멜라닌형성세포 이동을 유도한다

피부 세포, 예를 들어 대식세포, 랑게르한스 세포, 감마델타-T 세포(γδ -T cell), 비만 세포(mast cell), 각질형성세포 및 멜라닌형성세포는 다양한 케모카인을 생성한다(표 1, 보충 정보 참고). 케모카인의 중요한 역할 중 하나는 세포 이동을 매개하는 것이다. 우리는 피부-유래 케모카인의 정상 인간 표피 멜라닌형성세포(NHEM)의 이동을 유도하는 능력을 보이든 챔버 어세이를 이용하여 확인하였다. NHEM은 알려진 멜라닌형성세포 이동의 유도인자인 FK506, 및 NHEM 이동을 유도하는 것으로 보이는 SDF1로 이동한다(도 8, 보충 정보 참고).¹⁰ CTACK, PARC, ITAC, RANTES, TARC 및 Lptn와 같은 많은 다른 케모카인들 역시 SDF1의 동일 농도에서 비처리군 현저하게 이동이 증가하였다(도 8). 우리는 염증 부위로 다른 아형의 면역 세포를 동원하는데에 관여하는 CXCR3-타게팅 케모카인으로, MIG 및 IP-10이 아닌 오직 ITAC 만이 NHEM 이동을 유도하였기 때문에 ITAC에 주목하였다(도 8, 도 1a,b). 또한 ITAC의 이동 효과는 3개의 다른 인간 흑색종 세포주에서 확인하였으며, 이들 세포의 이동이 현저하게 증가하였다(도 9). MIG 및 IP-10이 종래 색소침착에 관여한다는 것이 알려진 반면 ITAC는 알려지지 않은 것을 고려할 때, ITAC가 멜라닌형성에 관하여, 즉 멜라닌형성세포 이동을 조절함으로서 MIG 및 IP-10와는 구별되는 역할을 할 것이다. ITAC-유도 NHEM 기작(mechanism)을 밝히기 위하여, 우리는 먼저 ITAC-관련 시그널을 개시시키는 ITAC 수용체인 CXCR3 및 CXCR7 ¹⁶의 수준을 특정 항체를 사용하여 평가하였으며 NHEM에서 두 단백질 모두가 발현되는 것을 확인하였다(도 1c). ITAC-유도 이동에서의 각각의 관여를 결정하기 위하여 우리는 특정 중화 항체를 사용하여 내생 CXCR3 또는 CXCR7을 제거한 후에 이동 어세이를 수행하였다. ITAC-유도 이동은 각각의 아이소타입 대조군과 비교할때 두 중화항체 각각의 처리 후에 현저하게 감소하였으며(도 1d; 레인 4 vs. 5 및 레인 6 vs. 7), 이는 CXCR3 및 CXCR7 모두 ITAC-유도 멜라닌형성세포 이동에 관여함을 시사한다. ITAC 및 두 수용체의 발현이 흑색종과 같은 병리 조건에서 변화하는지 조사하기 위하여 우리는 공개적으로 사용 가능한 마이크로어레이 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터셋의 분석을 통합하고 ITAC 및 두 수용체의 발현이 멜라닌형성세포(GSE29377)와 대비하여 흑색종 조직에서 증가하는 경향을 보인다는 것을 확인하였다. 비록 환자 간 편차가 있지만, 이 통계적 결과는 ITAC 및 그 수용체가 밀접한 연관을 가지며 일부 흑색종 병리에 관여한다는 것을 시사한다.

ITAC는 NHEM의 이동-관련 유전자의 mRNA 발현을 상향조절(up-regulate)한다.

ITAC-유도 NHEM 이동의 근본적인 신호 경로를 이해하기 위하여 대조군 또는 ITAC-처리 NHEM을 사용하여 전체적 유전자 발현 분석을 수행하였다. ITAC 처리는 비처리군과 비교하여 2배를 넘는 변화로 391 유전자를 상향-조절하고 350 유전자를 하향-조절하였다(표 2). 기능적 분류 분석에 기초하여 우리는 많은 세포 운동성-관련 유전자가 상향조절되었으며, 티로시나아제(TYR) 및 도파크롬토토머라제(DCT)와 같은 몇가지 멜라닌형성-관련 유전자가 하향조정된 것을 관찰하였다(도 2a; 표 2). 운동성-관련 유전자(23) 중, 우리는 Class IIa 구성원으로서 비-히스톤 단백질을 탈아세틸화함으로써 단백질 활성을 조절할 수 있으며 세포-운동성에 관여할 것으로 시사된 HDAC5 및 HDAC9의 두개의 유전자를 선택하였다. 우리는 RT-qPCT 분석에서 이들 두 유전자의 mRNA 수준이 ITAC 처리에 의해 현저하게 증가하는 것을 확인하였다(도 2b, c)

HDAC5 는 NHEM의 ITAC -유도 이동을 매개한다.

이들 유전자가 ITAC-유도 이동에 관여하는지 확인하기 위하여 HDAC5 및 HDAC9 각각에 특이적인 siRNA를 사용하여 HDAC5 및 HDAC9를 녹다운(knockdown)시키고 ITAC 존재 또는 부존재 하에서 보이든 챔버 어세이를 수행하였다. 각각의 유전자 녹다운은 RT-qPCT로 mRNA 발현 수준을 측정하여 확인하였다(도 10). NHEM은 예상한 바와 같이 약 2배 이동 증가를 보이며 FK506에 반응하였다(도 3a, 레인 2). ITAC 없이 NHEM 이동을 유도한 스크램블 siRNA 대조군(scrambled siRNA control)과 비교하여(레인 3), HDAC5 녹다운은 이동을 감소시켰으나 HDAC9 녹다운은 영향이 없었다(레인 4, 5). ITAC 존재 하에서 HDAC5 만이 스크램블 대조군에 비하여 이동을 현격하게 억제하였으며(레인 6 vs. 7), ITAC 없이 HDAC5 녹다운의 경우 이동 수준이 유사하게 나타났고(레인 4 vs. 7), 이는 ITAC-유도 이동이 대부분 HDAC5에 의해 매개됨을 시사한다. 따라서 우리는 HDAC5의 멜라닌형성세포 이동에서의 역할에 주목하였다. HDAC5-Myc 발현 플라스미드를 사용한 HDAC5 과발현은 NHEM 이동을 현저하게 증가시켰다(도 3b, 첫번째 2개 레인). ITAC 처리에 의해, 대조군 세포의 이동은 HDAC5 과발현 경우에 비교될 정도의 수준으로 현저하게 증가하였으며, HDAC5 과발현 세포는 가산적(additive) 이동 효과를 나타냈고(도 3b, 마지막 2개 레인), 이는 HDAC5 과발현 또는 ITAC 처리를 통한 상향조절이 효과적으로 NHEM 이동을 매개함을 나타낸다. 우리는 HDAC5 단백질 수준이 ITAC 처리 후 HDAC5 mRNA의 상향조절에 따라 증가함을 확인하였다(도 3c).

HDAC5 는 ITAC -처리된 NHEM 내의 p53 아세틸화 상태에 영향을 미친다.

ITAC-유도 이동에서 HDAC5의 하류 타겟을 확인하였다. 먼저 이동-관련 단백질로서 뉴런에서 HDAC5에 의해 탈아세틸화되는 알파-튜불린을 실험하였다.⁷ 그러나 알파-튜불린의 아세틸화 상태는 ITAC 처리(도 11a) 또는 NHEM에서의 HDAC5 결실(도 11b)에 의해 영향받지 않았으며, 이는 알파-튜불린이 ITAC-유도 멜라닌형성세포 이동에서 HDAC5에 의한 표적이 아님을 시사한다. 아세틸화 및 탈아세틸화에 의하여 조절되는 비-히스톤 단백질 중, p53이 세포 이동에서의 역할을 맡는다.¹⁷ 또한 p53은 면역친화성 분리(immunoaffinity isolation)에 의해 세포 내에서 HDAC5를 과발현시키는 것으로 확인된 HDAC5-상호작용 단백질로서, ¹⁸ HDAC5는 직접적으로 p53의 K120을 탈아세틸화하여, ⁵ MDM2-의존성 유비퀴틸화 및 분해경로로 이어진다. 따라서 ITAC 처리에 의해 HDAC5 mRNA 및 단백질 수준이 증가할 때 아세틸화된 p53 또는 총 p53 수준이 영향받는지를 실험하였다 (도 2b, 3c). ITAC 처리된 NHEM에서, p53의 적어도 2개의 아세틸화된 리신 잔기 373 및 382를 인식하는 항체에 의해 판명된 아세틸화된 p53의 양은 총 p53에서 경미한 감소를 나타냈다 (도 4a). ITAC 처리에 의해 이동 증가를 나타낸 인간 흑색종 세포주 SK-MEL-28에서 (도 9b), ITAC 처리에 의해 총 p53 단백질이 현저하게 감소하였다 (도 11c). HDAC5의 p53 발현 수준에 대한 효과를 살펴보기 위해 HDAC5를 과발현시키거나 녹다운시켰다. HDAC5 과발현은 아세틸화된 p53 및 총 p53 수준의 감소에 대응하였으며 (도 4b), HDAC5가 siRNA로 녹다운되었을 때 두가지 p53 모두 증가하였다 (도 4c). 이 데이터는 p53의 아세틸화 상태는 HDAC5에 의해 조절되며, p53의 하향조절이 ITAC-유도 세포 활성에 관여한다는 것을 시사한다.

p53 과발현은 ITAC -유도 및 HDAC5 -매개 NHEM 이동을 억제한다.

ITAC 처리 후에 HDAC5 의존적으로 p53가 NHEM 이동에 영향을 미치는지 살펴보기 위하여 NHEM에서 HDAC5, p53 또는 양 자 모두를 과발현시키고 보이든챔버어세이를 수행하였다. ITAC 부존재 하에서 HDAC5 과발현은 세포 이동을 현저하게 증가시켰지만 (도 5a, 레인 2), p53 과발현에 의해 이 효과는 사라졌으며 (레인 4), 이는 p53의 HDAC5-유도 세포 이동에 대한 관여를 시사한다(레인 5 vs. 7). ITAC 처리 세포에서의 HDAC5 과발현은 모의처리(mock-treated)된 대조군과 비교하여 세포 이동을 보다 증가시켰으며 (레인 5 vs. 6), 이 효과는 p53 과발현에 의해 감소되었다 (레인 6 vs. 8). 이들 데이터는 p53이 HDAC5의 하류 작동자(effector)이며 ITAC- 및 HDAC5-유도 세포 이동에 관여한다는 점을 암시한다. 또한 p53에 의해 음성 조절되는 것으로 알려진 p53 전사 타겟, 이동-관련 유전자 매트릭스메탈로펩티다아제 1(MMP1)²⁰ 및 콜라겐²¹ 은 MMP1의 마이크로어레이 분석(표 2) 및 RT-qPCR(도 5b)에 의해 측정된 바와 같이 ITAC 처리에 의해 반대로 상향조절되었으며, 이는 p53의 전사 활성이 ITAC-처리 세포에서 감소함을 나타낸다.

ITAC 처리는 p53 하향조절을 통해 NHEM의 저색소침착을 야기한다.

IP-10 및 MIG와 같은 몇몇 CXCR3 리간드들은 지연된 색소침착된 개소에서 상향조절된다.¹⁴ ITAC-처리된 SK-MEL28 세포에서, p53 발현 레벨 감소와 함께 TYR 단백질 양이 현저하게 감소했다(도 11c). ITAC를 포함하는 이들 CXCR3 리간드가 멜라닌형성에 효과가 있는지 확인하기 위하여 NHEM에 각각을 200ng/㎖씩 처리하였다. ITAC 처리 세포에서 TYR 및 DCT가 하향 조절된 전체적 유전자 발현 분석(global gene expression analysis) 결과와 일관되게(도 2a, 표 2), ITAC는 멜라닌형성-관련 유전자 TYR, TRP1(tyrosinase-related protein-1) 및 DCT mRNA 발현 수준을 감소시켰다 (도 12). 그러나 MIG 및 IP-10은 이들 유전자들의 mRNA 수준을 변경시키지 않았으며(도 12), 이는 세포 이동 결과(도 1a)와 유사하게 CXCR3 리간드 중 멜라닌형성에 대하여 다른 효과를 나타냄을 가리킨다. 더욱이 NHEM에 ITAC 200ng/㎖를 4일 간 처리한 후 멜라닌 양이 현저하게 용량의존적으로 감소한 것이 측정되었다(도 6a). 종래 p53은 UV 조사 후 피부 색소침착에 TYR 및 TRP1과 같은 색소침착-관련 유전자의 상향조절에 의해 역할을 하는 것으로 보고되었다.²² ^-23 본 발명자들은 ITAC가 UV 조사 후 p53-매개 색소침착을 감소시킬 수 있는지 실험하였다. UV 처리된 NHEM 내에서 멜라닌 양이 증가하였고, 총 p53 단백질 또는 아세틸화 p53 단백질 수준이 이에 수반하여 증가하였다(도 6b, lane 1 vs 2). 이들 UV 조사 후 효과는 ITAC 처리에 의해 약화하였고, 결과적으로 멜라닌 양 및 p53 단백질 수준이 감소하였다(도 6b, lane 2 vs 3). 또한 ITAC-유도 저색소증에서의 p53의 효과를 p53 ITAC 존재 하에 siRNA 처리 후 멜라닌생성-관련 유전자 발현을 분석하여 확인하였다. 결과로서 이들 유전자 발현은 p53 siRNA 처리에 의하여 스크램블 대조군 (도 13, lane 1 및 2)에 비해, 그리고 ITAC 처리군(TYR 및 TRP1; 도 13, lane 3)에 의해 현저하게 감소하였으나, p53 녹다운 효과는 ITAC 전 또는 후에 유사하였다(도 13, lane 2 vs. 4). 덧붙여, NHEM에서의 HDAC5 과발현이 저색소침착증을 유도한다는 것을 발견하였다(도 6c). 종합적으로, 이들 결과는 ITAC-유도 저색소침착증이 HDAC5에 의한 p53 탈아세틸화 및 이에 따른 멜라닌형성세포 내 불안정화에 의해 일부 매개된다는 점을 시사한다.

비록 ITAC가 p53-연관 색소침착에서 항-멜라닌생성 효과를 야기하지만, ITAC 과생산은 그 면역세포 및 멜라닌형성세포로의 이동성 때문에 저색소침착성 장애에 관련될 수 있다. 백반증은 면역-연관 저색소침착 장애의 일반적인 유형이다. 본 발명자들은 백반증 병소 내에서 ITAC 발현이 변화하는지를 항-ITAC 항체를 사용하여 면역조직화학 분석을 통해 조사하였다. 예상대로 멜라닌(화살표) 및 멜라닌형성세포(삼각형)가 오로지 정상 피부에서만 표피의 기저막을 따라 관찰되었다(도 7, N#1). 흥미롭게도 백반증 병소 표피 내에서 ITAC 발현은 상당히 상향조절되며, ITAC가 거의 발견되지 않는 정상 피부에 비해 풍부하였다(도 7, L#1, L#2, vs N#1). 인간 흑색종 조직(GSE29377) 내에서의 ITAC 발현 분석 데이터와 일관되게, 이 결과는 백반증 및 흑색종을 포함하는 병리조건에서 ITAC가 상향조절될 수 있으며, 세포 이동 및 멜라닌생성에 영향을 줌으로써 이들의 발명에 관여한다는 것을 시사한다.

토의

이 연구에서 피부 세포에 의해 생산되는 케모카인인 ITAC가 HDAC5 발현을 상향조절하며, 결과적으로 탈아세틸화를 통해 p53 수준을 하향조절하여 멜라닌형성세포 이동을 유도한다는 것을 보였다. ITAC 처리는 FK506 처리 만큼 효율적으로 멜라닌형성세포 이동을 증가시켰으며, 이 현상은 알려진 수용체인 CXCR3 및 CXCR7에 의해 매개되었다. GEO 데이터베이스의 전체적 유전자 분석에 기초하여 멜라닌형성세포를 흑색종 조직과 비교하여, ITAC 및 두 수용체 CXCR3 및 CXCR7 는 흑색종 조직 내에서 증가하는 경향을 나타냈다. CXCR3 또는 CXCR7 의 감소가 NHEM 이동을 완벽하게 차단하는 발견은 CXCR3 및 CXCR7이 헤테로다이머(heterodimer)를 형성하여 멜라닌형성세포 이동을 매개한다는 것을 시사한다. CXCR들(예를 들어, CXCR4 및 CXCR7) 간의 헤테로다이머화(heterodimerization) 종래 연구되었다.²⁴ 그러나 멜라닌형성세포 내에서 CXCR3 및 CXCR7 간에 발생하는 헤테로다이머화는 보다 설명되어야 한다.

ITAC 처리된 세포 내에서 HDAC5 및 HDAC9 수준이 무처리 대조군에 비하여 증가하는 것을 발견하였다. 이들 유전자 중 오직 HDAC5 만이 ITAC-유도 NHEM 이동에 관련되었다(도 3a). 종래 보고에 기초하여, ⁷ 먼저 ITAC의 이동 효과를 설명하기 위해 HDAC5의 타겟으로서 알파-튜불린을 실험하였다. ITAC 처리 및 HDAC5의 siRNA 녹다운은 아세틸화된 알파-튜불린 수준 변화에 연관이 없었으며(도 11a,b), 이는 ITAC-유도 멜라닌형성세포 이동에 다른 타겟이 관여함을 시사한다. p53은 DNA 손상 반응 ²⁵ 을 포함하는 다양한 신호경로 및 종양 세포, ²⁶섬유아세포, ²⁷ 및 각질형성세포 ²⁸ 를 포함하는 다양한 세포 유형의 이동에서 중요한 조절 단백질이다. p53의 활성 및 안정성은 그 아세틸화 상태에 크게 의존하며, 이는 HDAC1 또는 SIRT1을 포함하는 특정 HDAC 단백질 복합체에 의해 길항된다(antagonize). HDAC1이 1차적으로 핵에 존재하며, 다른 HDAC들은 세포질에서 p53 아세틸화를 조절할 수 있다. ⁴ 최근 HDAC5가 K120에서 p53 아세틸화를 조절한다는 것이 보고되었다. ⁵ p53이 ITAC-유도 멜라닌형성세포 이동에서 HDAC5에 의해 탈아세틸화 된다는 가설에 근거하여, HDAC5가 아세틸화 p53 단백질 및 총 p53 단백질을 감소시키며(도 4b,c), 이에 의하여 멜라닌형성세포 이동을 매개함을 보였다(도 5a). 비록 HDAC5에 의한 탈아세틸화 타겟인 특정 리신 잔기가 이 연구에서 확인되지 않았지만, p53의 120 뿐 아니라 373/382의 리신 잔기가 타겟 위치일 수 있다고 예상했다. ⁵ 아세틸화된 p53 단백질을 찾기 위하여 적어도 2개의 373 및 382 위치의 아세틸화 리신 잔기를 인식하는 것으로 생각되는 항-아세틸화 p53 항체를 사용하였으며, 이 잔기들 상의 아세틸화 p53이 HDAC5 과발현 또는 녹다운에 의하여 각각 하향- 또는 상향-조절되는 것을 발견하였으며(도 4b, c), 이들 잔기가 HDAC5에 의해 탈아세틸화되는 가능한 타겟 위치임을 시사한다.

이동에 더하여, ITAC 처리가 정상 및 UV-처리 멜라닌형성세포의 저색소침착을 유도하는 것을 관찰하였다(도 6a, b). ITAC 처리는 멜라닌생성-관련 유전자 발현 및 p53 단백질 수준을 하향-조절하였다(도 2; 도 4a, 도 6b). p53은 UV 노출에 의해 상향-조절되었으며, TYR 및 TRP1 발현 증가에 의해 멜라닌생성을 유도하였다. ^22-23 p53이 ITAC-유도 저색소침착에 관여함을 발견하였다(도 6b). HDAC5가 ITAC-유도 멜라닌형성세포 이동에서 탈아세틸화를 통한 p53 안정도의 1차 조절자이고, HDAC5 과발현이 탈색소와 연관되기 때문에(도 6c), HDAC5는 p53 탈아세틸화, 결과적으로 멜라닌생성-관련 유전자를 하향-조절을 통해 ITAC-유도 저색소침착에 직접적으로 관련될 수 있다. p53 하향-조절에 의해 영향 받은 유전자는 ITAC 처리 후에 멜라닌형성세포 이동, 저색소침착 또는 두가지 모두의 원인일 수 있다. p53에 의하여 음성(negatively) 조절되는 Collagens 및 MMP1, 세포 이동-관련 유전자들이 ITAC-처리 세포에서 상향-조절되는 것을 발견하였다(도 5b; 표 2). 이 상향-조절되는 유전자들 또한 ITAC-유도 저색소침착에 연관될 수 있다. 또한 이들 데이터는 Class IIa HDAC, 특히 HDAC5 를 통한 탈아세틸화를 통한 p53의 불안정화가 이동 및 저색소침착과 같은 ITAC-유도 세포 과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.

급성 및 만성 피부염은 환경 및 유전적 요인 사이의 상호작용에 따라 저색소침착 또는 과색소침착을 야기할 수 있다. ²⁹ CXCR3 리간드 중, 염증 세포가 축절된 지연된 색소 침착된 부위에서 MIG 및 IP-10가 상향-조절되고, 멜라닌형성세포 활성 및 만성적 멜라닌 합성을 야기한다. ¹⁴ 이와 반대로, ITAC는 저색소침착성 질환인 백반증 피부의 표피에서 상향조절되며(도 7), 건강한 대조군과 비교할 때 IP-10은 탈조절되지 않았고, ³⁰ 이는 CXCR3 리간드들 간의 다른 기능과 ITAC의 인간 백반증 발병에 대한 잠재적 관여를 시사한다.

종래에, MIG 및 IP-10이 마우스 백반증에서 중요하며 ITAC가 주요한 역할을 하지 않는다고 주장되었었다.³¹ 이러한 차이점은 마우스와 사람 간의 표피 구조 차이, 예를 들어 1) 인간 표피는 다층으로 이루어져 마우스의 얇은 표피와 다른 환경을 만들고, 2) 인간 표피 멜라닌형성세포는 소포 및 소포간 영역(interfollicular region) 모두에 존제하지만, 마우스 멜라닌형성세포는 오로지 소포 내 영역에만 존재한다. 기저막 상 각질형성세포로부터 분비된 ITAC는 마우스의 멜라닌형성세포가 존재하지 않는 소포간 영역의 멜라닌형성세포에 직접적으로 영향을 미칠 것이다.

인간 각질형성세포와 멜라닌형성세포의 공배양 시스템에서, 저농도(10ng/ml)의 MIG, IP-10 및 ITAC가 멜라닌 양을 증가시켰다. ¹⁵ 그러나 이들 저동노의 3가지 케모카인은 멜라닌형성세포 단배양 시스템에서 멜라닌생성-관련 유전자 발현에 영향이 없었고(데이터 미표시), 오로지 ITAC가 고농도 (200ng/ml) 에서 이들을 하향-조절하였다(도 12). 이 차이의 관찰은 ITAC 처리 후 공배양 시스템에서 각질형성세포에 의해 분비되는 가용성 인자들에 기인한 것일 수 있으며, 가용성 인자들은 멜라닌형성세포 활성화에 간접적으로 영향을 미칠 수 있다. MIG 및 IP-10은 고농도에서도 색소침착이나 멜라닌형성세포 이동에 영향이 없었으며, 이는 이들이 멜라닌형성세포에 직접적으로 영향을 주지 않으며 ITAC와는 다른 역할을 할 것임을 암시한다. MIG, IP-10 및 ITAC가 밀접하게 관련된 인터페론-g-반응성 케모카인이며 CXCR3을 통해 T 림프구를 유인하기 위한 신호를 매개하지만, 그들의 멜라닌형성세포 이동 및 멜라닌생성에 대한 효과는 세포 환경(cellular context)에 따라 다르다. 이 발견은 그들의 CXCR3에 대한 서로 다른 결합 친화도, CXCR7 과 같은 멜라닌형성세포 상의 다른 ITAC 공동 수용체, 및 병리 조건에서의 그들의 서로 다른 발현 수준에 의하여 부분적으로 설명된다. ITAC가 병소(disease spots) 주변 기저막 상의 각질형성세포에 의해, 그리고 다양한 종류의 염증성 피부병에서 피부 세포에 의해 주로 분비되는 점을 고려하면, ¹² 이것의 하류 작동자인 HDAC5 및 p53이 성숙 멜라닌형성세포 작용을 조절하는 데에 중요할 수 있다. 일광흑색점(solar lentigo), 기미(melasma), 및 흑색종(melanoma)와 같은 여러 색소침착-관련 장애가 멜라닌형성세포 축합(melanocyte condensation)으로 대표되며 이에 의해 악화된다. 본 연구는 HDAC5 자극을 통한 p53 하향-조절이 축합된 멜라닌형성세포의 이동을 유도하고 동시에 저색소침착을 유도하여 이들 장애를 완화시키는 전략 중 하나라는 가능성을 강조한다.

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도 1. ITAC는 인간 표피 멜라닌형성세포의 이동을 유도한다

정상 인간 신생아 표피 멜라닌형성세포(NHEM)의 이동을 200ng/ml MIG, IP-10 또는 ITAC (a) 또는 다양한 농도의 ITAC(b) 로 처리한 후 보이든 챔버 어세이를 이용하여 측정하였다. 세포들은 24시간 동안 이동하도록 하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험을 나타낸다 (*P < 0.05, **P < 0.01). (c) CXCR3 및 CXCR7의 단백질 발현 수준을 웨스턴블롯으로 측정하였다. 웨스턴블롯 분석은 반복적으로 수행하였고 대표 이미지를 나타낸다. (d) NHEM을 CXCR3 또는 CXCR7의 중화항체로 30분간 전처리하고, 이동 분석은 ITAC 존재 하에 수행하였다. 항-IgG (CXCR3) 및 항-IgG (CXCR7) 항체는 각각 항-CXCR3 및 항-CXCR7 중화 항체의 아이소타입 대조항체로서 사용하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험을 대표한다(***P < 0.001).

도 2. ITAC는 NHEM의 이동-관련 유전자의 mRNA 발현을 상향-조절한다.

NHEM을 50 ng/ml ITAC로 48시간 처리하고, 50ng 총 RNA를 사용하여 마이크로어레이 분석을 수행하였다. (a) ITAC 처리에 의하여 현저하게 상향- 또는 하향- 조절되는 생물학적 과정을 DAVID를 통해 유전자 온톨로지(gene ontology analysis; GO) 분석을 사용하여 그룹화하였다. B-H P value: Benjamini-Hochberg multiple test-corrected p value. (b-c) RT-qPCR로 측정한 NHEM 내 HDAC5 (b) 및 HDAC9 (c) mRNA 수준. 데이터는 3회의 독립적 실험을 대표한다(*P < 0.05).

도 3. HDAC5는 NHEM 내의 ITAC -유도를 매개한다.

(a) NHEM 내에 siRNA를 48시간 동안 트랜스펙션하였다. 세포는 트랜스펙션 후 50ng/ml ITAC의 부존재 또는 존재 하에 24시간 동안 이동하도록 하였고 카운팅을 위해 고정하였다. 스크램블 siRNA 및 FK506을 각각 음성대조군 및 양성대조군으로 사용하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험을 대표한다(*P < 0.05, ***P < 0.001). (b) HDAC5-Myc 플라스미드를 NHEM 내로 48시간 동안 도입하였다. 세포를 50ng/ml ITAC의 부존재 또는 존재 하에 24시간 동안 이동하도록 하였다. 이동된 세포를 카운팅하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험을 대표한다(*P < 0.05, ***P < 0.001). (c) HDAC5 단백질 발현 수준은 50 ng/ml ITAC 48시간 처리 후에 웨스턴블롯으로 측정하였다. 웨스턴블롯 분석은 반복적으로 수행하였고 대표 이미지를 나타낸다. 상대적 밴드 강도를 나타낸다.

도 4. HDAC5 는 ITAC -처리된 NHEM 내의 p53 아세틸화 상태에 영향을 미친다.

(a) NHEM을 50 ng/ml ITAC 48시간 처리하였다. 아세틸화 p53 단백질 및 총 p53 단백질의 수준을 표기된 항체로 웨스턴블롯에 의해 측정하였다. HDAC5-Myc 과발현 구성체(overexpression construct) (b) 또는 HDAC5에 대한 siRNA (c)를 NHEM 내로 48시간 동안 트랜스펙션하였다. 모의(mock) siRNA 및 스크램블 siRNA를 각각 HDAC5-Myc 및 HDAC5-특이적 siRNA의 대조군으로 사용하였다. 아세틸화 p53 단백질 및 총 p53 단백질의 수준을 표시된 항체로 웨스턴블롯에 의해 측정하였다. GAPDH를 로딩 대조군으로 사용하였다. 웨스턴블롯 분석은 반복적으로 수행하였고 대표 이미지를 나타낸다. 상대적 밴드 강도를 나타낸다. a-Ac-p53, 항-아세틸화 p53 항체

도 5. p53 과발현은 ITAC -유도 및 HDAC5 -매개 NHEM 이동을 억제한다.

(a) NHEM은 모의-트랜스펙션 (레인 1, 5), 또는 HDAC5-Myc 발현 플라스미드 (레인 2, 6), p53-플래그 (레인 3, 7) 또는 둘 모두 (레인 4, 8)로 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 48시간 후 50ng/ml ITAC의 부존재 또는 존재 하에 24시간 동안 이동하도록 하였고 카운팅을 위해 고정하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험의 대표이다(*P < 0.05). (b) NHEM 내 MMP1의 mRNA 수준을 RT-qPCT로 ITAC 처리 전후에 측정하였다. 상기 값은 GAPDH로 정규화하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험을 대표한다(*P < 0.05).

도 6. ITAC 처리는 p53 하향조절을 통해 NHEM의 저색소침착을 야기한다.

(a) NHEM을 다양한 농도의 ITAC로 4일간 처리하였다. 각각의 펠렛을 가시화하여, 멜라닌 양을 측정하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험의 대표이다(*P < 0.05). (b) NHEM에 2주간 UV (20 mJ/cm²)로 2회 폭로하고 유지하였다. 폭로 후 매 3일째 날에 ITAC (50 ng/ml)를 처리하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험의 대표이다(*P < 0.05). 아세틸화 p53 단백질 및 총 p53 단백질의 수준을 표시된 항체로 웨스턴블롯에 의해 측정하였다. GAPDH를 로딩 대조군으로 사용하였다. 웨스턴블롯 분석은 반복적으로 수행하였고 대표 이미지를 나타낸다. 상대적 밴드 강도를 나타낸다. a-Ac-p53, 항-아세틸화 p53 항체. (c) NHEM을 모의-트랜스펙션 또는 다양한 농도의 HDAC5-Myc 발현 플라스미드로 48시간 동안 트랜스펙션하였다. 각 펠렛을 원심분리한 후 가시화하고, 멜라닌 양을 측정하였다. 데이터는 3회의 독립적 실험을 대표한다(*P < 0.05).

도 7. ITAC는 백반증 피부의 표피 내에 풍부하다.

2명의 백반증 환자로부터 얻은 정상 (N) 또는 저색소침착 병소 (L)의 피부 시료 (#1 및 #2)를 항-ITAC 항체(녹색) 및 항-HMB45(적색)으로 염색하였으며, 핵은 DAPI(청색)으로 염색하였다. 조직 내 멜라닌을 가시화 하기 위해 명시야(bright field) 이미지를 촬영하였다(화살표). 삼각형은 멜라닌형성세포를 나타낸다. HMB45, 인간 흑색종 블랙-45(human melanoma black-45). 스케일바 50㎛.

<보충 정보>

ITAC는 HDAC5에 의해 p53 비안정화를 통해 멜라닌형성세포 이동 및 저색소침착을 유도한다 : ITAC의 색소-관련 이상에서의 가능한 역할

보충 재료 및 방법:

세포 배양

인간 흑색종 MNT-1 세포주는 National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA의 빈센트 J. 히어링(Vincent J. Hearing) 박사로부터 상기 세포주를 받은 동국대학교 이애영 박사로부터 제공받았다. 세포를 20% FBS 및 항체를 포함하는 DMEM(Lonza, Basel, Switzerland)에서 37℃에서 배양하였다. WM266-4 인간 흑색종 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)으로부터 입수하였다. SK-Mel-28 인간 흑색종 세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank; KCLB, Seoul, Korea)로부터 입수하였다. 이들 세포는 10% FBS 및 항체를 포함하는 EMEM 배지 (ATCC) 내에서 37℃에서 유지하였다.

웨스턴 블롯 분석

세포(2 x 10⁶)를 용출 버퍼 (20 mM Tris [pH 7.5], 0.1% Triton X-100, 0.5% deoxycholate, 1 mM PMSF, 10 μg/ml aprotinin, and 10 μg/ml leupeptin) 내에서 4℃ 10분간 배양하여 추출하고 13,000 rpm으로 5분 원심분리하였다. 단백질 농도는 BCA 어세이 키트 (BCA assay kit; Sigma, St. Louis, MO)를 이용하여 제조사 지시서에 따라 측정하였다. 25mg의 총 단백질이 SDS/PAGE에 의해 분리되었고 PVDF 막(Invitrogen, Washington, DC)으로 이동하였다. 0.3% 카세인 함유 PBS로 0.5 시간 실온에서 블록한 후, 막을 3-5㎍/ml의 1차 항체와 함께 0.1% Tween 20 함유 PBS 내에서 4℃에서 밤샘배양하였다. 신호 강도는 ImagePro Plus software version 4.0를 사용하여 정량화하고 GAPDH로 정규화하였다. 각 항체 정보는 다음과 같다: 항-CXCR3, 항-CXCR7 (Abcam, Cambridge, UK), 항-HDAC5, 항-p53 (Cell Signaling, Danvers, MA), 항-아세틸화 p53 (Millipore, MA), 항-알파-튜불린, 항-아세틸화 알파-튜불린 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 항-ITAC (R&D system, Minneapolis, MN), 항-HMB45 (GeneTex, Irvine, CA,), 항-GAPDH 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Dollas, TX). 모든 데이터는 3회 수행 중 2회 이상의 독립적 실험으로부터 얻어졌다.

일차 멜라닌형성세포 및 흑색종 세포주의 세포 이동 분석

보이든챔버(pore size, 8 ㎍; Corning Inc., Corning, NY) 내의 필터를 실온에서 3시간 동안 타입 IV 콜라겐으로 코팅하였다. 5 X 10⁴ 개 세포를 챔버의 상부 웰(well)에 두고 하부 웰을 0.5% 우혈청 알부민 및 서로 다른 농도의 ITAC를 포함하는 지정된 케모카인 함유 EpiLife 배지 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)로 채웠다. 37℃ 에서 24시간 배양 후 필터 인서트(insert)를 헤마토실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) (Merck, Darmstadt, Germany)으로 염색하기 위하여 메탄올로 고정하였다. 위상 현미경(phase-contrast microscopy) 하에서 이미지를 촬영하고, 정량을 위해 세포를 카운팅하였다. 모든 데이터는 3회 수행 중 2회 이상의 독립적 실험으로부터 얻어졌다.

마이크로어레이 분석

NHEM을 50 ng/ml ITAC로 48시간 처리하고, 총 RNA를 트리졸 시약 (TRIzol reagent; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)을 사용하여 분리하였다. 50 ng의 총 RNA를 Quick Amp Kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 Cy3 또는 Cy5-표지된 cRNA로 전환하였다. 질적 평가를 위해 260 nm 및 280 nm에서의 흡광도 비 및 농도를 Agilent Bioanalyzer를 사용하여 측정하였다. 다른 샘플로부터 동일한 양의 Cy3- 또는 Cy5-표지된 cRNA를 Agilent Human Whole Genome 4 X 44k Microarrays에 하이브리드하였다. 데이터는 Feature Extraction version 10.2 (Agilent Technologies)를 사용하여 스캔한 이미지로부터 추출하였다. 하이드리드화 반응은 각 샘플에 대하여 2회 수행하였다.

정량적 실시간 PCR 분석

각 샘플로부터 2 ㎍의 총 RNA를 사용하여 Superscript II Reverse Transcriptase Kit (Life Technologies, Grand Island, NY)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. TaqMan® 프로브 (Themo Fisher Scientific, Waltham, MA)는 구입하였으며, qPCR은 ABI Fast Real-Time PCR System (Life Technologies)를 사용하여 수행하였다. 샘플 내 각 유전자의 상대적 발현 수준을 하우스키핑 유전자인 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로지네이즈(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)를 사용하여 정규화하였으며, 샘플 간 유전자 발현 차이는 formula 2^- ^ΔΔCt 을 이용하여 계산하였다.

멜라닌 어세이

정상 또는 UV-처리한 NHEM을 1% Nonidet P-40, 0.01% SDS 및 프로테아제 저해제 칵테일 (protease inhibitor cocktail; Roche Molecular Biochemical, Indianapolis, IN).를 포함하는 0.1M Tris-HCl (pH 7.2) 버퍼 내에서 음파처리하여 세포 용출물을 제조하였다. 세포 용출물로부터 원심분리에 의해 멜라닌을 분리하여 1N NaOH에 용해시켰다. 멜라닌 양은 Synergy H2 microplate reader (BioTek, Winooski, VT, USA) 를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하고 투입된 단백질로 정규화하였다. 3회의 독립적인 실험을 수행하였다.

보충 참고문헌

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도 8. NHEM의 피부 세포 유래 케모카인으로의 이동능

세포이동은 보충 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 보이든챔버 어세이에 의해 분석되었다. 보이든챔버 어세이를 위하여 상부 웰에 세포를 첨가하고, 지정된 케모카인 (200ng/ml)를 하부 웰에 첨가하였다. 세포는 24시간 동안 이동하도록 하고, 고정하고, 염색하고 촬영하고 정량화하였다. 나타난 결과는 2회의 독립적인 실험에서 재현 가능하다(***P < 0.001).

도 9. 인간 흑색종 세포주에서의 ITAC 이동 효과

세포 이동은 보이든챔버 어세이에 의해 분석되었다. 인간 흑색종 세포주 WM266-4(a), SK-MEL-28 (b), 및 MNT-1 (c)는 I-TAC 없이 (대조군) 또는 200ng/ml I-TAC (I-TAC)를 포함하는 배지에서 24시간 이동하였다. 세포는 고정, 염색 및 정량화되었다. 데이터는 3회 독립적 실험을 대표한다 (*P < 0.05, **P < 0.01).

도 10. NHEM 내에서의 HDAC5 - 및 HDAC9 - 특이적 siRNA의 효율성

HDAC5, HDAC9, JUB, 또는 THBS에 대한 각 siRNA를 NHEM 내로 48시간 트랜스펙션하고 총 RNA를 추출하였다. 스크램블 siRNA는 음성 대조군으로 사용하였다. NHEM 내 HDAC5 (a) 및 HDAC9 (b)의 mRNA 수준을 RT-qPCR에 의해 측정하였다. 각 값은 GAPDH에 의해 정규화되었다. 데이터는 3회 독립적 실험을 대표한다 ( ***P < 0.001).

도 11. NHEM 내 또는 인간 흑색종 세포 내에서의 ITAC 처리의 단백질 발현에 대한 효과

NHEM은 48시간 동안 (a) 50ng/ml ITAC로 처리되거나 (b) HDAC5에 대한 siRNA로 트랜스펙션되었다. 알파-튜불린의 아세틸화 수준은 표시된 항체로 웨스턴블롯에 의해 측정되었다. 스크램블 siRNA는 HDAC5 특이적 siRNA의 대조군으로 사용되었다. (c) 인간 흑색종 세포주 SK-MEL-38은 ITAC (50ng/ml)로 48시간 처리된 후 항-p53 및 항-타이로시네이즈(TYR) 항체를 사용한 웨스턴블롯을 위해 수확하였다. 웨스턴블록 분석은 반복적으로 수행하였고 대표 이미지를 나타낸다. GAPDH는 로딩 대조군으로 사용되었다. a-Ac-p53, 항-아세틸화 p53 항체. α-Ac-alpha-tubulin, 항-아세틸화 알파-튜불린 항체.

도 12. NHEM 내에서의 MIG, IP-10 또는 ITAC의 멜라닌생성에 대한 효과

NHEM은 200ng/ml의 MIG, IP-10 또는 ITAC로 48시간 처리하고, 총 RNA를 추출하였다. NHEM 내 TYR (a), MITF (b), TRP1 (c) 및 DCT (d)의 mRNA 수준을 RT-qPCR을 이용하여 측정하였다. 각 값은 GAPDH에 의해 정규화되었다. 데이터는 2회 독립적 실험을 대표한다. (*P < 0.05)

도 13. ITAC -유도 저색소침착에서 p53 녹다운의 멜라닌생성-관련 유전자 발현에 대한 효과

(a-d) NHEM은 스크램블 siRNA 또는 p53에 대한 siRNA로 48시간 트랜스펙션되고 200ng/ml ITAC로 48시간 더 처리하였다. 각 값은 GAPDH에 의해 정규화되었다. 데이터는 3회 독립적 실험을 대표한다(^** P < 0.01, ^*** P < 0.001).

<110> AMOREPACIFIC CORPORATION <120> Composition comprising ITAC inhibitor <130> 16P414/IND <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1610 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 agagaacaaa acagaaactc ttggaagcag gaaaggtgca tgactcaaag agggaaattc 60 ctgtgccata aaaggattgc tggtgtataa aatgctctat atatgccaat tatcaatttc 120 ctttcatgtt cagcatttct actccttcca agaagagcag caaagctgaa gtagcagcag 180 cagcaccagc agcaacagca aaaaacaaac atgagtgtga agggcatggc tatagccttg 240 gctgtgatat tgtgtgctac agttgttcaa ggcttcccca tgttcaaaag aggacgctgt 300 ctttgcatag gccctggggt aaaagcagtg aaagtggcag atattgagaa agcctccata 360 atgtacccaa gtaacaactg tgacaaaata gaagtgatta ttaccctgaa agaaaataaa 420 ggacaacgat gcctaaatcc caaatcgaag caagcaaggc ttataatcaa aaaagttgaa 480 agaaagaatt tttaaaaata tcaaaacata tgaagtcctg gaaaagagca tctgaaaaac 540 ctagaacaag tttaactgtg actactgaaa tgacaagaat tctacagtag gaaactgaga 600 cttttctatg gttttgtgac tttcaacttt tgtacagtta tgtgaaggat gaaaggtggg 660 tgaaaggacc aaaaacagaa atacagtctt cctgaatgaa tgacaatcag 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Claims

인터페론-유도성 T-세포 알파 화학주성인자(interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant; ITAC) 억제제를 포함하는 백반증 또는 백반증 전이의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 ITAC 억제제는 ITAC 억제제는 ITAC의 중화항체 또는 ITAC mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 ITAC 억제제는 ITAC 수용체의 중화항체 또는 ITAC 수용체 mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드인, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 ITAC 수용체는 CXCR3 및 CXCR7 중 하나 이상인, 조성물
제1항에 있어서,
상기 ITAC 억제제는 HDAC5의 중화항체 또는 HDAC5의 mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드인, 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는　siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상인, 조성물.
ITAC의 유전자 발현량의 검출시약을 포함하는 백반증 검출용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 검출시약은 상기 유전자의 전사체에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브, 및 상기 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
제8항에 있어서,
상기 프라이머쌍은 상기 유전자 mRNA에 상보적이며, 상기 mRNA를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하고;
상기 프로브는 상기 유전자 mRNA의 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 백반증 검출용 조성물을 포함하는 백반증 진단용 키트.
백반증의 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법으로서,
인간 표피 조직에 시험물질을 처리하고, 상기 시험물질이 인간 표피 조직에서 ITAC, CXCR3 및 CXCR7 중 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 것을 포함하는, 백반증의 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법.