TW201803573A

TW201803573A - 包含itac抑制劑之組成物

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Publication number: TW201803573A
Application number: TW106123288A
Authority: TW
Inventors: 崔瑞娟; 曺恩敬; 賓範浩; 李泰龍
Original assignee: 愛茉莉太平洋股份有限公司
Priority date: 2016-07-13
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2018-02-01
Also published as: TWI767921B; KR20180007669A

Abstract

在本文中所揭示係一種用於白斑病(vitiligo)或白斑病擴散(vitiligo spread)之預防或治療的組成物，其包含干擾素誘導性T細胞α趨化因子(interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant，ITAC)抑制劑。該組成物可壓制ITAC的作用，以抑制黑色素細胞(melanocyte)遷移(migration)及展現色素過少(hypopigmentation)效應。此外，該組成物藉由壓制ITAC的作用來預防或治療白斑病或白斑病轉移(metastasis)。

Description

包含ITAC抑制劑之組成物

在本文中揭示包含ITAC抑制劑之組成物。

趨化激素(chemokines)的重要角色之一係藉由誘導細胞遷移(cell migration)以介導免疫反應及腫瘤發生。一些趨化激素參與小鼠白斑病(vitiligo)。干擾素誘導性T細胞α趨化因子(Interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant，ITAC)對CXCR3具有比其他配體(ligands)更高的結合親和力，從免疫細胞激發強烈的趨化性反應。ITAC對黑色素細胞遷移(melanocyte migration)及色素沉著(pigmentation)的影響以及其相關病症的關聯性是未知的。第二類組蛋白去乙醯酶(Class II histone deacetylase，HDAC)，特別是HDAC5，將p53蛋白去乙醯化，該p53蛋白參與各種細胞過程其包括細胞遷移以及調控蛋白質穩定性及活性。

技術問題

本發明係透過p53藉由HDAC5的去乙醯化(deacetylation)以提供ITAC對黑色素細胞的移動效應及色素過少效應(hypopigmentation effects)的活體外證據，並從轉譯上的觀點深入了解ITAC在病理狀況諸如白斑病中的角色。技術方案

在一態樣中，本發明提供用於預防或治療白斑病或白斑病轉移的組成物，該組成物包含干擾素誘導型T細胞α趨化因子(ITAC)抑制劑。

在另一態樣中，本發明提供一種用於檢測白斑病的組成物，其包含用於ITAC基因表現量(gene expression level)之檢測的試劑。

而在另一態樣中，本發明提供一種用於篩選白斑病預防性或治療性試劑的方法，其包含鑑定至少一種選自ITAC、CXCR3、和CXCR7中的表現是否被抑制。有益效果

本發明透過HDAC5對p53的去乙醯化，提供ITAC對黑色素細胞的移動效應及色素過少效應的活體外證據，並從轉譯上的觀點深入了解ITAC在病理狀況諸如白斑病中的角色。

現在將參照附圖更詳細地描述本申請的實施例。然而，本申請所揭示的技術不限於在本文中描述的實施例，而是可以其他形式實施。應當理解，提供在本文中揭示的實施例使得本揭露將是徹底且完整的，以及將向所屬技術領域中具有通常知識者充分地傳達本發明的範疇。在圖中，放大組分的寬度及厚度，以清楚地闡述每個組分。進一步，雖然為了便於說明，僅示出了一部分組分，但是所屬技術領域中具有通常知識者將容易理解組分的其餘部分。對於所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見的是，在不脫離本發明的精神和範疇下，可以在本發明中進行各種修改及變化。

如本文所用，用語「中和(neutralize)」及「抑制(inhibit)」意指活性因抑制劑的存在而降低，此是與沒有物質存在的活性相比。活性可降低例如，約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%、或更多。

本發明之一實施例關於用於預防或治療白斑病或白斑病轉移的組成物，該組成物包含干擾素誘導性T細胞α趨化因子(ITAC)抑制劑。

根據上述實施例之組成物可有效抑制黑色素細胞遷移，以及有助於預防或治療白斑病或白斑病轉移、或改善其症狀。

ITAC抑制劑可係抑制ITAC基因表現或活性、或ITAC的作用或活性的物質。

在一實例中，ITAC抑制劑可係與至少一部分的ITAC mRNA結合的寡核苷酸(oligonucleotide)、或對抗ITAC的中和抗體。

寡核苷酸可係siRNA、shRNA、及miRNA中的一或多者。抑制基因表現或活性的物質可係siRNA、shRNA、及miRNA中的一或多者，其包括RNA干擾(RNAi)現象。在本發明一態樣中，誘導基因的mRNA干擾的RNAi現象可用以抑制基因的mRNA的表現。

miRNA是一種內源性(endogenous)小RNA。它衍生自不合成蛋白質的DNA，且產生自髮夾形轉錄本(hairpin-shaped transcript)。miRNA與標靶mRNA的3'-UTR的互補序列(complementary sequence)結合，以誘導mRNA轉譯(translation)或去穩定化(destabilization)的抑制作用，最終作為抑制標靶mRNA的蛋白質合成的抑制子(repressor)。已知一種miRNA靶向數種mRNA，而mRNA也可被數種miRNA調控。誘導RNAi現象的其他RNA包括短干擾RNA (short interfering RNA，siRNA)，其是約19至27個單體單元(mer)的短RNA，以及具有短髮夾結構的shRNA。

在一具體實施例中，寡核苷酸可係雙股(double-stranded)，且係siRNA、shRNA、及miRNA中的任一種。

當ITAC抑制劑是對抗ITAC的中和抗體時，ITAC抑制劑可係抗ITAC抗體。

在一實例中，ITAC抑制劑可係抑制ITAC受體(receptor)的表現或活性的物質。在一實例中，ITAC受體可係第3型CXC-趨化激素受體(CXC-chemokine receptor type 3，CXCR3)、第7型CXC-趨化激素受體(CXC-chemokine receptor type 7，CXCR7)、或其混合物。

抑制ITAC受體的表現或活性的物質可係與至少一部分ITAC受體mRNA結合的寡核苷酸或對抗ITAC受體的中和抗體。

寡核苷酸可係siRNA、shRNA、及miRNA中的一或多者。siRNA、shRNA、及miRNA係如上所述，因此將省略其描述。

當ITAC抑制劑是對抗ITAC受體的中和抗體時，ITAC抑制劑可係抗CXCR3抗體、抗CXCR7抗體、或其混合物。

在一實例中，ITAC抑制劑可係抑制組蛋白去乙醯酶-5 (histone deacetylase-5，HDAC5) (一種ITAC的下游效應子(effector))的物質。抑制HDAC5的物質可係，例如，抑制HDAC5的表現或活性的物質。

抑制HDAC5的表現或活性的物質可係，例如，與至少一部分HDAC5 mRNA結合的寡核苷酸或對抗HDAC5的中和抗體。

對抗HDAC5之中和抗體可係抗HDAC5抗體。

ITAC的mRNA序列可由NM_005409、NM_001302123、或SEQ ID NO：1表示。CXCR3的mRNA序列可由NM_001142797、NM_001504、或SEQ ID NO：2表示。 CXCR7的mRNA序列可由NM_001047841、NM_020311、或SEQ ID NO：3表示。HDAC5 mRNA序列可由NP_001015053、NM_005474、NM_139205、或SEQ ID NO：4表示。

根據本發明之實施例，組成物可提供作為各種類型的食品添加劑或功能性食品。例如，可將其加工成發酵乳、乾酪、酸酪乳、果汁、益生菌、保健食品等，以及各種食品添加劑。

根據本發明之實施例，組成物可係用於保健食品之組成物。用於保健食品之組成物壓制ITAC的作用，以抑制黑色素細胞遷移及展現色素過少效應。此外，用於保健食品之組成物可抑制ITAC的作用，以緩解或改善白斑病、或白斑病的症狀或擴散。

在一具體實施例中，用於保健食品之組成物可以配製成丸劑(pill)、膠囊(capsule)、片劑(tablet)、顆粒(granule)、焦糖(caramel)、或飲料(drink)等。在另一具體實施例中，其可加工成液體、粉末(powder)、顆粒、片劑、或茶包等。

組成物可根據各種方法施用，諸如簡單飲用、注射、噴霧、或擠壓。

食物組成物可包含提供協同效應(synergic effect)的其他成分而不會負面地影響主效應。例如，為了提高性能，可進一步包含添加劑，諸如調味劑(flavoring)、色素(pigment)、殺菌劑(sterilizer)、抗氧化劑(antioxidant)、防腐劑(preservative)、保濕劑(humectant)、增稠劑(thickener)、礦物鹽(mineral salt)、乳化劑(emulsifier)、合成聚合物(synthetic polymer)等。此外，還可進一步包含輔助成分，諸如水溶性維生素、油溶性維生素、聚合物肽(polymer peptide)、聚合物多醣(polymer polysaccharide)、海藻萃取物(seaweed extract)等。考慮到製劑或用途，所屬技術領域中具有通常知識者可適當地選擇這些成分。可在不負面影響本發明的目的及效應的範圍內決定這些成分的量。例如，以該組成物之總重量計，成分量可係0.01 wt%至5 wt%，例如0.01 wt%至3 wt%。

根據本發明之實施例，組成物可係藥物組成物。藥物組成物可壓制ITAC的作用，以抑制黑色素細胞遷移、展現色素過少效應，以及預防、治療或、減輕白斑病或白斑病的症狀或轉移。

在一具體實施例中，藥物組成物可進一步包含根據習知方法常用的無機材料或無機載體，以及可製備成用於口服(oral)或非經腸(parenteral)給藥的各種製劑，其形式為固體、半固體(semi-solid)、或液體等。

用於口服給藥的製劑可包括，例如片劑、丸劑、顆粒、硬或軟膠囊、粉末、細粒(fine particle)，粉劑(dust)、乳劑(emulsion)、糖漿、小丸(pellet)等。用於非經腸給藥的製劑可包括，例如注射劑(injection)、滴劑(drop)、軟膏(ointment)、洗劑(lotion)、噴霧劑(spray)、懸浮劑(suspension)、乳劑、栓劑(suppository)等。藥物組成物可進一步包含藥用佐劑(adjuvant)，例如防腐劑、安定劑(stabilizer)、保濕劑(hydrating agent)、乳化促進劑(emulsifying accelerator)、用於控制滲透壓(osmotic pressure)的鹽或緩衝劑(buffer)等、以及其他治療上有用的物質。

施用藥物組成物可口服、非經腸、外用(topically)、經皮(transdermally)、皮下(subcutaneously)、直腸(rectally)、靜脈內(intravenously)、肌內(intravenously)、腹膜內(intraperitoneally)等。

活性成分的劑量將根據各種相關因子而變化，諸如症狀的嚴重性、給藥途徑、年齡、性別、體重、及受試者的健康狀態等。活性成分的一般劑量係0.001 mg/kg/天至2000 mg/kg/天，例如0.5 mg/kg/天至1500 mg/kg/天。

在另一態樣中，本發明之一實施例提供一種用於檢測白斑病的組成物，其包含用於ITAC基因表現量之檢測的試劑。

用於檢測ITAC基因表現量的試劑可係能夠測量ITAC基因轉錄量之一試劑。在一實例中，用於檢測的試劑可係特異性結合至ITAC轉錄本(transcript)之引子對(primer pair)或探子(probe)。

當ITAC表現與正常群組相比係因組成物而增加時，可判定係有白斑病或白斑病轉移。

引子可包括但不限於與基因的mRNA互補及能夠擴增(amplifying) mRNA的引子對。

探子可包含一或多種由基因的mRNA序列組成的多核苷酸(polynucleotide)；而多核苷酸，其係該多核苷酸的片段且包含10或更多個連續的核苷酸，但不限於此。

在上述實施例中，基因表現量可藉由PCR (聚合酶連鎖反應，polymerase chain reaction)、RT-PCR (反轉錄酶-聚合酶連鎖反應，reverse transcriptase polymerase chain reaction)、北方墨點分析(Northern blot analysis)、西方墨點分析(Western blot analysis)、點墨法(dot blot assay)、ELISA (酵素結合免疫吸附法，enzyme-linked immunosorbent assay)、或微陣列(microarray)測定，例如，使用對偶基因特異性雜合(allele-specific hybridization)的TaqMan™探子方法、一種透過聚合使用對偶基因特異性雜合的探子方法、使用限制酶的限制片段長度多型性法(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、使用融解溫度(melting temperature，Tm)的動態對偶基因特異性雜合(dynamic allele-specific hybridization，DASH)、使用聚合的焦磷酸根定序法(pyrosequencing)、使用對偶基因特異性延伸的微陣列方法等，但不限於此。

樣品可係從人類分離而來的上皮細胞、角質細胞(keratinocytes)、黑色素細胞、諸如肥大細胞的免疫細胞、或纖維母細胞，例如角質細胞。

可根據本領域中習知方法自受試者獲取樣品。可用非侵入性的方式進行，而不會對皮膚造成刺激，諸如在皮膚上藉由膠帶剝離(tape stipping)，但不限於此。在一實例中，可進行膠帶剝離，例如1至20次，例如5次。在上述範圍內，可獲得樣品而不引起皮膚刺激。

基因表現量的測定可包括測量樣品中來自基因或蛋白質表現的轉錄量。當使用引子對或探子時，可藉由測量與一或多個引子對及探子雜合(hybridized)的樣品中的轉錄量來判定基因轉錄量。當使用抗體時，可藉由測量與抗體雜合的樣品中的蛋白質量來判定經表現之蛋白質的量。

根據另一實施例，本發明提供用於白斑病診斷的套組(kit)，其包含特異性結合至ITAC、CXCR3、及CXCR7中的一或多者之轉錄本之一或多種引子對或探子，以及特異性結合至經一或多種基因表現的蛋白質之抗體。

在另一態樣中，本發明之實施例提供一種用於診斷白斑病或基於ITAC表現之白斑病轉移的方法。

該方法允許檢測ITAC在樣品中的表現量，以及當ITAC過度表現時(與正常量相比)診斷白斑病。樣品可係受試者的表皮組織。在一實例中，樣品可係從受試者分離而來的一或多種的上皮細胞、角質細胞、黑色素細胞、及免疫細胞，諸如肥大細胞。

在過度表現的情況下，基因表現量係正常群組表現量的1.1倍或以上、1.2倍或以上、1.3倍或以上、1.4倍或以上、1.5倍或以上、1.6倍或以上、1.7倍或以上、1.8倍或以上、1.9倍或以上、2.0倍或以上、2.1倍或以上、2.2倍或以上、2.3倍或以上、2.4倍或以上、2.5倍或以上、2.6倍或以上、2.7倍或以上、2.8倍或以上、2.9倍或以上、3.0倍或以上、3.1倍或以上、3.2倍或以上、3.3倍或以上、3.4倍或以上、3.5倍或以上、3.6倍或以上、3.7倍或以上、3.8倍或以上、3.9倍或以上、4.0倍或以上、4.1倍或以上、4.2倍或以上、4.3倍或以上、4.4倍或以上、4.5倍或以上、4.6倍或以上、4.7倍或以上、4.8倍或以上、4.9倍或以上、或5.0倍或以上，及20.0倍或以下、19.5倍或以下、19.0倍或以下、18.5倍或以下、18.0倍或以下、17.5倍或以下、17.0倍或以下、 16.5倍或以下、16 .0倍或以下、15.5倍或以下、15.0倍或以下、14.5倍或以下、14.0倍或以下、13.5倍或以下、13.0倍或以下、12.5倍或以下、12.0倍或以下、11.5倍或以下、11.0倍或以下、10.5倍或以下、10.0倍或以下、9.5倍或以下、9.0倍或以下、8.5倍或以下、8.0倍或以下、7.5倍或以下、7.0倍或以下、6.5倍或以下、6.0倍或以下、5.5倍或以下、或5.0倍或以下。例如，當基因表現量係正常群組表現量的1.1至20.0倍，例如1.5至10.0倍、例如2至8倍時，可診斷白斑病。

該方法除了ITAC表現量之外，可進一步包含測量作為ITAC受體的CXCR3或CXCR7的表現量、或兩者的表現量。與ITAC表現一樣，當CXCR3或CXCR7過度表現時，可診斷白斑病或白斑病轉移。

根據又另一實施例，本發明提供用於篩選對於白斑病的預防性或治療性試劑的方法。

在一實例中，用於篩選白斑病的預防性或治療性試劑的方法，可包含用測試物質處理人類表皮組織，以及鑑定該測試物質是否抑制人類表皮組織中ITAC、CXCR3、及CXCR7基因中的一或多者之表現。

表皮組織可係從受試者分離而來的一或多種上皮細胞、角質細胞、黑色素細胞、及免疫細胞，諸如肥大細胞。

在一實例中，當測試物質顯著地抑制表現時(與未經處理的群組相比)，可將其判定為預防性或治療性試劑。例如，當表現被抑制時，與未經處理的群組相比，表現量會降低為P ＜ 0.05。實施例

以下，將透過測試實例、實例、及比較實例詳細描述本發明的特徵及效應。然而，提供以下測試實例、實例、及比較實例，僅為了說明目的，並不意圖限制本發明之範疇。

透過經由 HDAC5 將 p53 去穩定化， ITAC 誘導黑色素細胞遷移及色素過少： ITAC 在色素相關病症中的可能角色

關於這個主題已知為何？ ●趨化激素的重要角色之一係經由誘導細胞遷移以介導免疫反應及腫瘤發生。 ●一些趨化激素參與小鼠白斑病。 ● 干擾素誘導性T細胞α趨化因子(ITAC)有著比其他配體對CXCR3更高的結合親和力，從免疫細胞激發強烈的趨化性反應。 ●ITAC對黑色素細胞遷移及色素沉著的影響以及其在相關病症的參與是未知的。 ● 第二類(HDAC)，特別是HDAC5，將p53蛋白去乙醯化，該p53蛋白參與各種細胞過程其包括細胞遷移以及調控蛋白質穩定性及活性。

這項研究增加了什麼？ ●在CXCR3靶向趨化激素中，僅ITAC有效地誘導黑色素細胞及黑色素瘤細胞的遷移以及色素過少。 ●ITAC表現在白斑病皮膚表皮中增加。 ●HDAC5藉由去乙醯化及去穩定化其基質p53而參與ITAC介導的細胞過程。 ●本研究經由HDAC5藉由p53的去穩定化，提供ITAC對黑色素細胞的移動效應及色素過少效應的活體外證據以及ITAC在病理狀況諸如黑色素瘤及白斑病中的角色轉譯上的洞察。

縮寫

CXCR3：第3型CXC-趨化激素受體；HDAC：組蛋白去乙醯酶；IP-10：干擾素γ誘導蛋白10 (interferon-gamma-induced protein 10)；ITAC：干擾素誘導性T細胞α趨化因子；MIG：干擾素-γ誘導之單核細胞因子(monokine induced by interferon-gamma)；MMP1：基質金屬蛋白酶1 (matrix metallopeptidase 1)；NHEM：正常人類表皮黑色素細胞；TYR：酪胺酸酶(tyrosinase)；MITF：小眼症相關轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor)；TRP1：酪胺酸酶相關蛋白1 (tyrosinase-related protein-1)；DCT：多巴色素異構酶(dopachrome tautomerase)；HMB45：人類黑色素瘤45 (human melanoma black-45)

藉由抑制 ITAC 及其受體調控細胞遷移及護理皮膚病 ●ITAC (趨化激素)：誘導黑色素細胞、黑色素瘤、及免疫細胞的遷移 ●透過ITAC受體CXCR3、CXCR7之信號轉移 ●透過較低的信號因子HDAC5活化、p53抑制來誘導細胞遷移 ●治療中和抗體(抗CXCR3、抗CXCR7)抑制ITAC誘導的細胞遷移 ●細胞遷移相關皮膚病：黑色素瘤、白斑病 ●ITAC及受體的表現在轉移性黑色素瘤組織中增加 ●ITAC的表現在白斑病病灶中增加 ●因此，據認為抑制ITAC及其受體可有助於黑色素瘤及白斑病的改善 ●在這方面，用於照護/治療特定皮膚病之組成物使用ITAC及ITAC受體的中和抗體。改善各種趨化激素/細胞激素(cytokine)的細胞遷移效應

使用趨化激素來改善黑色素細胞的遷移

彙總

背景細胞遷移在免疫反應和腫瘤發生中扮演主要角色。干擾素誘導性T細胞α趨化因子(ITAC)從免疫細胞激發強烈的趨化性反應。

目標檢查ITAC對黑色素細胞遷移及色素沉著的效應以及其在相關病症的參與，以及調查在這些過程中潛在的關鍵參與者。

方法用ITAC處理人類黑色素細胞或黑色素瘤細胞，以及進行遷移試驗(migration assay)。進行整體基因表現分析(Global gene expression analysis)以找出藉由ITAC處理所調控的基因。參與ITAC誘導的細胞過程之關鍵參與者的功能係結合ITAC處理使用減弱或過度表現實驗來解決。檢查ITAC在炎症相關的色素過少病症(白斑症)中的表現。

結果在CXCR3配體中，僅ITAC誘導黑色素細胞遷移。ITAC處理上調了組蛋白去乙醯酶5 (HDAC5)的表現，以及下調了p53 (HDAC5的已知標靶)的表現。透過HDAC5及p53的減弱或過度表現，我們證實了藉由降低p53的表現量(經由去乙醯化)，HDAC5介導ITAC誘導的遷移。此外，ITAC處理可降低p53依賴及HDAC5依賴方式的色素沉著。最後，驗證了藉由ITAC處理增加的人類黑色素瘤細胞的遷移以及在白斑病皮膚表皮中增加的ITAC表現。

結論本研究提供ITAC對黑色素細胞的移動效應及色素過少效應的活體外 證據及ITAC在病理狀況中的角色轉譯上的洞察，以及意味著HDAC5及其基質p53係用於調控ITAC誘導的細胞過程的潛在標靶。

關鍵字：HDAC5、p53、ITAC、黑色素細胞、遷移、黑色素瘤、白斑病

導論

離胺酸(lysines)乙醯化係一種轉譯後修飾(post-translational modification)，可影響人類細胞中超過1750種蛋白質¹ ，意味著乙醯化/去乙醯化係生理蛋白活性重要的調控因子。組蛋白乙醯轉移酶(acetyltransferases)藉由將乙醯部分從乙醯輔酶A(coenzyme A)轉移到標靶蛋白上的離胺酸殘基的ε-胺來催化組蛋白上的離胺酸乙醯化，而組蛋白去乙醯酶(HDAC)則催化反向過程。不像組蛋白乙醯移轉酶具有不同結構和功能，HDAC可基於與其酵母對應物的序列同源性(sequence homology)分成四個不同的類別：第I類(HDAC1、2、3、及8)、第II類(IIa：HDAC4、5、7、9、及MITR；IIb：HDAC6及10)、第III類(SIRT1-7)、以及第IV類(HDAC11)。² 第I類HDAC組成型表現於細胞核中且發現於所有組織中，而第II類HDAC顯示組織特異性表現模式並進行細胞核質(nucleocytoplasmic)穿梭，意味著它們參與非組蛋白的去乙醯化。在非組蛋白中，一種在細胞生長停滯、細胞凋亡(apoptosis)、及老化中起作用的轉錄因子p53，是一種代表性的蛋白質，其穩定性係透過HDAC藉由離胺酸去乙醯化來調控。^3-4 最近，亦報導HDAC5藉由將離胺酸120(K120)去乙醯化而作用於p53上。⁵

儘管HDAC及其可能的標靶已被相對地好好研究，但是活化特定HDAC的因子了解甚少。因為HDAC參與各種細胞過程，因此其失調與癌症及炎症疾病的致病機制有關。儘管臨床試驗已經研究了用於治療這些疾病的HDAC抑制劑，但在患者身上HDAC抑制的分子基礎尚未完全了解。⁶ 先前透過移動性相關蛋白(諸如α-微管蛋白及皮質肌動蛋白(cortactin))的去乙醯化，顯示了HDAC對於在各種細胞及腫瘤中的細胞移動性(cell motility)是重要的。^7-8 此發現及HDAC在轉移及炎症中的有力角色意味著HDAC與疾病過程之間的關係涉及細胞遷移。

在皮膚中，免疫細胞及皮膚細胞在正常條件下以及回應環境壓力而分泌各種細胞激素及趨化激素。尤其是經由這些分泌因子(secreted factor)，暴露於UVB波長導致黑色素細胞微環境(microenvironment)的失調(dysregulation)，造成黑色素細胞向異常區域過度增殖(hyper-proliferation)及遷移。⁹ 然而，關於趨化激素對成熟黑色素細胞遷移的影響報導很少。我們先前證明了皮膚衍生的趨化因子SDF1在成熟的黑色素細胞中誘導趨化作用(chemotaxis)。¹⁰ 其他趨化激素，特別是藉由干擾素-g (MIG)、干擾素-g誘導的蛋白10 (IP-10)、及干擾素誘導性T細胞α趨化因子(ITAC)所誘導的第3型CXC-趨化激素受體(CXCR3)靶向趨化激素單體激素(monokine)，在將不同亞型(subtypes)的免疫細胞募集(recruitment)至炎症部位中發揮重要作用。¹¹ 有趣地，這些趨化激素的表現模式及結合親和力(binding affinities)有所不同：IP-10及ITAC在基底角質細胞中表現，但MIG在真皮滲入物(infiltrates)中表現，¹² 以及ITAC以高於IP-10或MIG兩者之一的親和力與CXCR3結合。¹³ MIG及IP-10在慢性UVB曝露下參與延遲色素沉著¹⁴ 以及在角質細胞及黑色素細胞的共培養物中誘導色素沉著，¹⁵ 但是ITAC在黑色素細胞遷移及色素沉著中的作用仍然係未知的。基於ITAC相對於其他CXCR3配體的不同表現模式及受體結合活性，我們預測ITAC在這些過程中扮演不同的角色。

在本研究中，我們確立了ITAC對人類黑色素細胞及黑色素瘤遷移的影響。我們鑑定了HDAC5 (第IIA類HDAC)，在ITAC誘導的黑色素細胞遷移中作為介質以及p53作為HDAC5的去乙醯化標靶。我們進一步驗證了ITAC治療降低了p53依賴及HDAC5依賴方式的色素沉著，以及在白斑病皮膚的表皮中增加了ITAC表現。

材料及方法

細胞培養 購買來自中等膚色的NHEM (Cascade Biologics, Portland, OR)，以及在含有5% CO₂ 、補充有人類黑色素細胞生長補充劑(HMGS; Life Technologies, Carlsbad, CA)的培養基254中的潮濕培養箱中培養。用各種濃度的經指示趨化激素處理NHEM (表S1；R&D system, Minneapolis, MN)。

細胞遷移試驗 (Cell migration assay) 根據已發表的程序，在所示細胞處理後於博伊登室(Boyden chamber)中進行遷移試驗。¹⁰ 在所選擇的實驗中，用對抗CXCR3 (R&D system)、CXCR7 (Biolegend, San Diego, CA) 、或個別的同型匹配(isotype-matched)的對照抗體之50 νg/mL中和抗體預處理NHEM。博伊登室試驗(Boyden chamber assays)的詳細計劃書提供於輔助資料中。

西方墨點分析及瞬時轉染 (transient transfection) 使用25 mg細胞溶胞產物(cell lysates)進行西方墨點分析。有關抗體的詳細計劃書及資訊描述於輔助資料中。根據製造商的說明書，使用Lipofectamine RNAiMAX或Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Washington, Dc)將用於HDAC5、HDAC9、及p53 (Dharmacon, Lafayette, CO)的各50 nM siRNA的等分試樣(aliquot)，或用於HDAC5-Myc及p53-Flag (GeneCopoeia, Rockville, Md)的2 mg DNA質體轉染到細胞中，分別進行48小時。

微陣列分析 (Microarray analysis) 用50 ng/mL ITAC處理NHEM 48小時，以及使用TRIzol試劑(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)分離總RNA。使用五十奈克之總RNA進行分析。在輔助資料中詳細介紹微陣列分析程序。

定量即時 PCR 分析按照製造商的說明，藉由使用隨機六聚體(random hexamers)及反轉錄酶(Promega, Madison, WI)使用二微克總RNA以合成cDNA。在輔助資料中提供詳細的程序。

黑色素試驗 (Melanin assay) 用50或200 ng/mL ITAC處理4天、或用各種濃度的HDAC5-Myc表現質體轉染細胞2天。細胞裂解及黑色素試驗的詳細程序給於輔助資料中。

人類白斑病皮膚的免疫組織化學分析 (Immunohistochemical analysis) 診斷患有白斑病的兩名患者在提供書面知情同意書後參加了本研究。使用抗ITAC (R&D系統)及抗HMB45 (黑色素細胞標記)的抗體(GeneTex, Irvine, Ca)，用3毫米直徑的穿刺針(punch)將三對色素過少及正常色素的皮膚樣品切片(biopsied)以用於免疫組織化學分析。該研究得到了東國大學伊山醫院(Dongguk University Ilsan Hospital)機構審查委員會(Institutional Review Board)的核准，並根據「赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki Principles)」進行。

統計分析 所有數據表示為平均值± SD。雙尾司圖頓t -檢驗(two-tailed Student'st -test)用於分析兩組之間的差異。

結果

ITAC 誘導人類表皮黑色素細胞的遷移。 皮膚細胞，例如巨噬細胞(macrophages)、蘭格漢氏細胞(Langerhans cells)、γδ-T細胞、肥大細胞、角質細胞、及黑色素細胞產生各種趨化激素(表S1，參見輔助資料)。趨化激素的重要作用之一係介導細胞遷移。我們使用博伊登室試驗篩選了皮膚衍生的趨化激素誘導正常人類表皮黑色素細胞(NHEM)遷移的能力。NHEM朝向FK506及SDF1遷移，FK506係一種已知的黑色素細胞遷移誘導因子、SDF1已被證明可誘導NHEM遷移(表1，參見輔助資料)。¹⁰ 相較於未處理的對照組，許多其他趨化激素諸如CTACK、PARC、ITAC、RANTES、TARC、及Lptn與SDF1在相同的濃度下亦顯著增加遷移(圖8，參見輔助資料)。我們專注於ITAC，因為CXCR3靶向趨化激素其重要地參與不同亞型的免疫細胞募集到炎症部位，僅ITAC而非MIG和IP-10顯著地誘導了NHEM遷移(圖8、圖1A、圖1B)。ITAC的遷移效應也在三種不同的人類黑色素瘤細胞系中得到驗證，導致這些細胞的遷移顯著地增加(圖9)。鑑於先前已知MIG及IP-10參與色素沉著^14-15 但ITAC並沒有，ITAC可能發揮與黑色素生成有關的MIG與IP-10不同的作用，也就是，藉由調控黑色素細胞遷移。為了解決ITAC誘導的NHEM遷移的機制，我們首先使用特異性抗體評估了ITAC的受體(啟動ITAC相關訊號¹⁶ )CXCR3及CXCR7的表現量，並發現兩種蛋白質均在NHEM中表現(圖1C)。為了判定每個在ITAC誘導遷移的參與程度，在使用特異性中和抗體消耗內源性CXCR3或CXCR7蛋白後，我們執行了遷移試驗。相較於每個同型對照，用任一中和抗體處理後，ITAC誘導的遷移顯著降低(圖1D；泳道4與5及泳道6與7)，意味著CXCR3和CXCR7二者均參與ITAC誘導的黑色素細胞遷移。為了研究ITAC和兩種受體在病理狀況如黑色素瘤中的表現是否發生改變，我們進行了可公開取得的微陣列基因表現資料庫(Gene Expression Omnibus，GEO)的綜合分析，並發現相較於黑色素細胞(GSE29377)，ITAC及兩種受體的表現在黑色素瘤組織中顯示增加趨勢。儘管患者之間存在差異，但該分析結果意味著ITAC及其受體可能相互關聯以及參與某些黑色素瘤病理學。

ITAC 上調 NHEM 中遷移相關基因的 mRNA 表現。 為了瞭解潛在的ITAC誘導NHEM遷移的訊息傳遞途徑，我們使用對照組或ITAC處理的NHEM進行整體基因表現分析。IITAC處理上調了391個基因及下調了350個基因，相較於未處理的對照組，變化大於2倍(表2)。基於功能分類分析，我們觀察到許多細胞移動性相關基因被上調，而一些黑色素生成相關基因諸如酪氨酸酶(TYR )及多巴色素異構酶(DCT )被下調(圖2A；表2)。從細胞移動性相關基因(23)中，我們選出了兩個基因HDAC5 及HDAC9 ，其作為第IIa類成員，可藉由去乙醯化非組蛋白來調控蛋白活性，並且已被認為參與細胞移動性。^7-8 我們證實了在RT-qPCR分析中，藉由ITAC處理顯著地增加了這兩個基因的mRNA表現量(圖2B、圖2C)。

HDAC5 介導 ITAC 誘導的 NHEM 遷移。 為了檢查這些基因是否參與ITAC誘導的黑色素細胞遷移，我們使用各種特定的siRNA抑制了HDAC5 及HDAC9 ，以及在ITAC存在或不存在的情況下執行博伊登室試驗。藉由用RT-qPCR測量mRNA表現量來證實每個基因減弱(圖10)。NHEM對FK506的反應如預期，顯示遷移量增加約2倍(圖3A，泳道2)。相較於沒有ITAC的情況下(泳道3)誘導NHEM遷移的凌亂siRNA，HDAC5 的減弱減少了遷移，但HDAC9 的抑制卻沒有影響(泳道4、5)。在ITAC存在下，相較於凌亂對照(泳道6與7)，只有HDAC5 的減弱顯著抑制了遷移，並與沒有ITAC之HDAC5 減弱顯示了相似的遷移量(泳道4與7)，表示ITAC誘導的遷移主要由HDAC5介導。因此，我們聚焦於判定HDAC5在黑色素細胞遷移中的角色。使用HDAC5-Myc表現質體(plasmid)之HDAC5的過度表現大幅增加了NHEM遷移(圖3B，前兩個泳道)。透過ITAC處理，對照組細胞的遷移顯著增加到可與HDAC5過度表現相較的表現量，而過度表現HDAC5的細胞顯示出添加的遷移效應(圖3B，最後兩條泳道)，表示藉由過度表現或 ITAC處理的HDAC5上調有效地介導NHEM遷移。我們證實了在ITAC處理後，HDAC5的蛋白質量隨著HDAC5 mRNA的上調而增加(圖3C)。

HDAC5 影響 p53 在 ITAC 處理的 NHEM 中的乙醯化狀態。 我們鑑定了HDAC5在ITAC誘導的遷移中之下游標靶。我們首先檢查了遷移相關蛋白，α-微管蛋白，其在神經元中藉由HDAC5去乙醯化。⁷ 然而，α-微管蛋白的乙醯化狀態不受ITAC處理(圖11A)或NHEM中HDAC5缺失的影響(圖 11B)，表示在ITAC誘導的黑色素細胞遷移中，HDAC5並未靶向α-微管蛋白。在藉由乙醯化及去乙醯化調節的非組蛋白中，p53在細胞遷移中發揮作用。¹⁷ 此外，p53係HDAC5交互作用蛋白，其藉由在過度表現HDAC5的細胞中之免疫親和分離而鑑定，¹⁸ 而HDAC5直接將p53的K120去乙醯化，⁵ 導致MDM2依賴之泛素化及降解途徑。¹⁹ 因此，當HDAC5 mRNA及蛋白質表現量升高時，我們檢查了乙醯化或總p53的量是否受到ITAC處理的影響(圖2B、圖3C)。在ITAC處理的NHEM中，乙醯化p53的量隨著總p53略為減少而降低，該乙醯化p53的量藉由抗體識別p53之373及382處的至少兩個乙醯化離胺酸殘基來證實(圖4A)。在人類黑色素瘤細胞系SK-MEL-28中(其藉由ITAC處理顯示了遷移增加(圖9B))，藉由ITAC處理顯著降低了總p53蛋白量(圖11C)。為了探討HDAC5對p53表現量的影響，我們將HDAC5過度表現或減弱。HDAC5過度表現對應於乙醯化的及總p53的表現量的降低(圖4B)，以及當siRNA抑制了HDAC5時，兩種p53物種都增加(圖4C)。這些數據表示p53的乙醯化狀態係藉由HDAC5調控，且p53的下調參與ITAC誘導的細胞活性。

p53 的過度表現抑制 ITAC 誘導及 HDAC5 介導的 NHEM 遷移。 為了探討在HDAC5依賴方式中的ITAC治療後，p53是否影響NHEM遷移，我們在NHEM中過度表現HDAC5、p53、或兩者，並進行博伊登室遷移法。在沒有ITAC的情況下，HDAC5過度表現顯大幅增加了細胞遷移(圖5A，泳道2)，但是p53過度表現取消了這種影響(泳道4)，表示在HDAC5誘導的細胞遷移中之p53參與。 p53過度表現亦抑制了在細胞遷移中ITAC誘導的增加(泳道5與7)。與模擬處理的對照組相比，在ITAC處理的細胞中HDAC5過度表現進一步增加了細胞遷移(泳道5與6)，而p53過度表現消除了此種作用(泳道6與8)。這些數據意味著p53係HDAC5的下游效應子，並且參與ITAC及HDAC5誘導的細胞遷移。此外，已知由p53負調控的p53轉錄標靶，遷移相關基因基質金屬蛋白酶1 (matrix metallopeptidase 1) (MMP1 )²⁰ 及膠原蛋白 (Collagens) ²¹ 藉由ITAC處理反向上調，如微陣列分析(表2)及 MMP1 的RT-qPCR (圖5B)所測定，表示在ITAC處理的細胞中p53的轉錄活性降低。

ITAC 處理經由 p53 下調導致在 NHEM 中色素過少。 一些CXCR3配體，諸如IP-10及MIG，在延遲的色素斑點中上調。¹⁴ 在ITAC處理的SK-MEL-28細胞中，TYR蛋白的量隨著p53表現量的降低而顯著地降低(圖11C)。為了評估這些CXCR3配體(包括ITAC)是否對黑色素生成有影響，我們各用200 ng/mL處理NHEM。ITAC降低了酪胺酸酶相關蛋白-1 (TRP1 ，黑色素生成相關基因TYR )及DCT 的mRNA表現量(圖12)，此與整體基因表現分析結果一致，其中TYR 及DCT 在ITAC處理的細胞中下調(圖2A；表2)。然而，MIG及IP-10並未改變這些基因的mRNA量(圖12)，表示與細胞遷移結果相似，在CXCR3配體之間對黑色素生成的影響不同(圖1A)。此外，我們用200 ng/mL ITAC處理NHEM四天後，測得了黑色素含量顯著的劑量依賴性(dose-dependent)降低(圖6A)。先前，據報導藉由上調色素沉著相關基因如TYR 及TRP1 ，p53在UV照射後，在皮膚色素沉著中發揮作用。^22-23 該發明人檢驗了ITAC是否可在UV照射後降低p53介導的色素沉著。在UV處理的NHEM中，黑色素含量增加，並且總的或乙醯化的p53蛋白的量隨之增加(圖6B，泳道1與2)。藉由ITAC處理減少了UV照射後的這些效應，導致黑色素含量及p53蛋白量降低(圖6B，泳道2與3)。我們進一步藉由在ITAC存在下分析p53 siRNA處理後之黑色素生成相關基因的表現，進一步證實了p53在ITAC誘導的色素過少中的影響。結果，藉由p53 siRNA處理(相對於凌亂的對照組)(圖13，泳道1和2)及ITAC處理(TYR 及TRP1 ；圖13，泳道3)，這些基因的表現顯著地降低，但是在ITAC處理前後，p53減弱的效果相似(圖13，泳道2與4)。此外，我們發現HDAC5在NHEM中的過度表現誘導了色素過少(圖6C)。總之，這些結果意味著ITAC誘導的色素過少係部分藉由p53介導，透過HDAC5對p53的去乙醯化，從而導致黑色素細胞的不穩定。

儘管ITAC可以在p53關聯的色素沉著中帶來抗黑色素生成的效果，但由於其對於免疫及黑色素細胞的遷移能力，ITAC的過度產生可能與色素沉著失調有關。白斑病係一種炎症相關的色素過少病症常見的形式。本發明人通過使用抗ITAC抗體的免疫組織化學分析研究了ITAC表現是否在白斑病病灶中發生改變。一如預期，僅在正常皮膚中沿著表皮的基底膜觀察到黑色素(箭頭)及黑色素細胞(箭頭) (圖7，N#1)。有趣的是，與正常皮膚相比(幾乎沒有檢測到ITAC)，在白斑病病灶的表皮中ITAC表現大幅地上調且富集(圖7，L#1、L#2、與N#1)。與在人類黑色素瘤組織(GSE29377)中的ITAC表現分析結果一致，此結果表示ITAC在病理狀況中包括白斑病及黑色素瘤可能上調，並藉由影響細胞遷移及黑色素生成而參與其致病機制(pathogenesis)。

討論在本研究中，我們證實了ITAC，一種由皮膚細胞產生的趨化激素，藉由上調HDAC5的表現(其反過來藉由去乙醯化下調p53的量)，來誘導黑色素細胞遷移。ITAC誘導的遷移效應亦顯示在人類黑色素瘤細胞系中。用ITAC處理增加了黑色素細胞的遷移，如同以FK506處理一樣有效，而此現象是由其已知的受體CXCR3及CXCR7所介導。基於GEO資料庫的整體基因表現分析，比較黑色素細胞與黑色素瘤組織，ITAC及兩受體CXCR3與CXCR7的表現顯示了在黑色素瘤組織中增加的趨勢。CXCR3或CXCR7的消耗完全阻斷NHEM遷移的發現，表明CXCR3及CXCR7形成異二聚體(heterodimer)以介導黑色素細胞遷移。先前已經研究了CXCR類(例如CXCR4和CXCR7)之間的異二聚化(heterodimerization)；²⁴ 然而，黑色素細胞中CXCR3及CXCR7之間是否發生異二聚化仍有待闡明。

與未經處理的對照組相比，我們發現在ITAC處理的細胞中HDAC5 及HDAC9 的量增加。在這些基因之間，僅HDAC5與ITAC誘導的NHEM遷移相關聯(圖3A)。根據以前的報告，⁷ 我們最初測試了α-微管蛋白作為HDAC5的標靶，以解釋ITAC的遷移效應。ITAC處理及HDAC5的siRNA減弱與乙醯化的α-微管蛋白量的變化無關(圖11A、圖11B)，表示另一個標靶參與ITAC誘導的黑色素細胞遷移。p53係各種訊息傳遞途徑中的重要調控蛋白，包括DNA損傷反應²⁵ 以及各種細胞類型的遷移，其包括腫瘤細胞、²⁶ 纖維母細胞、²⁷ 和角質形成細胞。²⁸ p53的活性及穩定性在很大程度上取決於其乙醯化狀態，其被含有HDAC1或SIRT1的特異性HDAC蛋白質複合物所拮抗。因為HDAC1主要存在於細胞核中，其他HDAC則可在細胞質中調節p53乙醯化。⁴ 最近，據報導HDAC5在K120調控p53乙醯化。⁵ 基於在ITAC誘導的黑色素細胞遷移中p53可被HDAC5去乙醯化的假說，我們顯示了HDAC5降低乙醯化及總p53蛋白(圖4B、圖4C)，從而介導了黑色素細胞遷移(圖5A)。雖然本研究並未鑑定藉由HDAC5去乙醯化所靶向的特異性離胺酸殘基，但我們認為在373/382處的離胺酸殘基及p53的120處可能是標靶位置(target site)。⁵ 為了檢測乙醯化的p53蛋白，我們使用抗乙醯化p53抗體，據認為其在373及382處識別至少兩個乙醯化的離胺酸殘基，以及發現這些殘基上的乙醯化p53被HDAC5過度表現或減弱分別地下調或上調(圖4B、圖C)，意味著這些殘基作為HDAC5去乙醯化的可能標靶位置。

除了遷移，我們觀察到ITAC處理誘導了正常及紫外線處理的黑色素細胞之色素過少(圖6A、圖6B)。ITAC處理下調黑色素生成相關基因及p53蛋白量的表現(圖2、圖4A、圖6B)。p53藉由紫外線照射而上調，以及藉由增加TYR 及TRP1 表現誘導黑色素生成。^22-23 我們發現p53參與ITAC誘導的色素過少(圖6B)。因為HDAC5係p53穩定性的主要調控因子，係透過在ITAC誘導的黑色素細胞遷移中之去乙醯化來調控，以及HDAC5過度表現與脫色作用(depigmentation)相關聯(圖6C)，因此HDAC5可能透過p53的去乙醯化直接參與ITAC誘導的色素過少，其反過來下調黑色素生成相關(melanogenesis-related)的基因。受p53下調影響的基因可能係在ITAC治療後黑色素細胞遷移、色素過少、或兩者的原因。我們發現在ITAC處理的細胞中上調了膠原蛋白 及MMP1 (由p53負調控之細胞遷移相關基因) (圖5B；表2)。這些上調基因亦可參與ITAC誘導的色素過少。總之，這些數據意味著經由第IIa類HDAC (特別是HDAC5)對p53的去乙醯化，p53的去穩定化在ITAC誘導的細胞過程中諸如遷移及色素過少發揮關鍵作用。

急性及慢性皮膚炎症可能導致色素過少或色素過多(hyperpigmentation)，取決於環境和遺傳因子之間的交互作用。²⁹ 在CXCR3配體中，MIG及IP-10在炎症細胞累積的延遲色素斑點中上調，導致黑色素細胞的活化及慢性黑色素合成。¹⁴ 相反地，ITAC在色素過少的失調白斑病皮膚中上調(圖7)，其中IP-10與健康的對照組相比沒有放鬆管制，³⁰ 意味著CXCR3配體之間具有不同的功能以及ITAC在人類白斑病致病機制中可能的參與度。先前，據稱MIG和IP-10對於小鼠白斑病至關重要，而其中ITAC未發揮主要作用。³¹ 我們認為這種分歧(discrepancy)可能是由於小鼠與人類之間的表皮結構的差異，例如，1)人類表皮由多層組成，與小鼠的薄表皮產生不同的環境，2)人類表皮黑色素細胞同時存在於濾泡(follicular)及濾泡間(interfollicular)之區域，但是小鼠黑色素細胞僅存在於濾泡區中。也許，自基底膜上的角質形成細胞分泌的ITAC可直接影響濾泡間區域的黑色素細胞，該區域並不存在小鼠黑色素細胞。

在人類角質形成細胞及黑色素細胞的共培養系統中，低濃度(10 ng/mL)的MIG、IP-10、及ITAC增加了黑色素含量。¹⁵ 然而，在黑色素細胞單一培養系統中，這三種趨化激素的低濃度對黑色素生成相關基因的表現沒有影響(數據未顯示)，而且只有ITAC以高濃度(200 ng/mL)下調了這些基因表現(圖12)。這些不同的觀察結果可歸因於，在共培養系統中，ITAC處理(其可能間接影響黑色素細胞活化)後，角質形成細胞釋放的可溶性因子(soluble factors)。MIG及IP-10即使在高濃度下，對色素沉著或黑色素細胞遷移都沒有影響，意味著它們並不直接影響黑色素細胞，而是必須發揮不同於ITAC的作用。雖然MIG、IP-10、及ITAC與干擾素-g-反應趨化激素密切相關，並透過CXCR3介導信號以吸引T淋巴細胞(T lymphocytes)，但它們對黑色素細胞遷移及黑色素生成的影響似乎根據細胞環境(cellular context)而不同。此觀察結果可部分地藉由它們對CXCR3的不同結合親和力、其它ITAC輔助受體如CXCR7在黑色素細胞上的存在、以及它們在病理生理(pathophysiological)狀況下表現量的差異來解釋。考慮到ITAC主要由疾病斑點周圍的基底膜上的角質形成細胞及數種類型的炎性皮膚疾病中的皮膚細胞所分泌，¹² 其下游效應子(downstream effectors) HDAC5及p53對於調控成熟黑色素細胞行為可能是重要的。許多色素沉著相關疾病諸如日光性小痣(solar lentigo)、黑皮病(melasma)、及黑色素瘤係由黑色素細胞凝結(condensation)代表及惡化。我們的研究強調透過HDAC5刺激的p53下調是用來減輕這些疾病的策略之一，其係藉由同時誘導凝結的黑色素細胞遷移及色素過少。

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圖 1. ITAC 誘導人類表皮黑色素細胞的遷移 。

在以200 ng/mL MIG、IP-10、或ITAC (a)、或各種濃度的ITAC (b)處理後，使用博伊登室試驗評估正常人類表皮黑色素細胞(新生兒的(NHEM))的遷移。允許細胞遷移24小時。數據代表三項獨立實驗(*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01)。(c) 藉由西方墨點法測定CXCR3及CXCR7的蛋白表現量。重複執行西方墨點分析，並顯示代表性圖像。(d) 用對抗CXCR3或CXCR7的中和抗體預處理NHEM 30分鐘，以及在ITAC存在下執行遷移試驗。抗IgG (CXCR3)及抗IgG (CXCR7)抗體分別用作抗CXCR3及抗CXCR7中和抗體的同型對照。數據代表三項獨立實驗(***P ＜ 0.001)。

圖 2. ITAC 上調 NHEM 中遷移相關基因的 mRNA 表現。 以50 ng/mL ITAC處理NHEM 48小時，以及用50 ng總RNA執行微陣列分析。(a) 藉由使用DAVID進行基因本體(GO)分析將ITAC處理顯著上調或下調的生物過程分類。B-H P值：Benjamini-Hochberg多重測試校正的p值。(b-c) 藉由RT-qPCR測定NHEM中HDAC5 (b)及HDAC9 (c)的mRNA量。數據代表三項獨立實驗(*P ＜ 0.05)。

圖 3. HDAC5 介導在 NHEM 中 ITAC 誘導的遷移。 (a) 將siRNA轉染到NHEM中48小時。在50 ng/mL ITAC不存在或存在的情況下，使細胞在轉染後遷移24小時，然後固定以計數。凌亂siRNA (Scrambled siRNA)及FK506分別用作陰性及陽性對照。數據代表三項獨立實驗(*P ＜ 0.05, ***P ＜ 0.001)。(b) 將HDAC5-Myc質體導入NHEM中48小時。在50 ng/mL ITAC不存在或存在的情況下允許細胞遷移24小時。計算遷移的細胞。數據代表三項獨立實驗(*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01)。(c) 以50 ng/mL ITAC處理48小時後藉由西方墨點法測定HDAC5蛋白表現量。重複執行西方墨點分析，並顯示代表性的圖像。示出相對帶強度。

圖 4. HDAC5 影響 p53 在 ITAC 處理的 NHEM 中的乙醯化狀態。 (a)用50 ng/mL ITAC處理NHEM 48小時。乙醯化及總p53蛋白的量以所示抗體藉由西方墨點法測定。將HDAC5-Myc過度表現構建體(construct) (b) 或對抗HDAC5之siRNA (c)轉染到NHEM中48小時。模擬及凌亂siRNA分別用作HDAC5-Myc及HDAC5特異性siRNA的對照。乙醯化及總p53蛋白量藉由使用所示抗體之西方墨點法測定。GAPDH用作加載控制。重複執行西方墨點分析，並顯示代表性圖像。示出相對帶強度。a-Ac-p53，抗乙醯化p53抗體。

圖 5. p53 的過度表現抑制 ITAC 誘導及 HDAC5 介導的 NHEM 遷移。 (a)模擬轉染NHEM (泳道1、5)或用表現質體轉染HDAC5-Myc (泳道2、6)、p53-Flag (泳道3、7)、或兩者(泳道4、8。在轉染後48小時，允許細胞在50 ng/mL ITAC存在或不存在的情況下遷移24小時，然後固定以計數。數據代表三項獨立實驗(^* P ＜ 0.05)。(b) 在ITAC處理前後，藉由RT-qPCR測定NHEM中MMP1的mRNA量。將值標準化(normalized)至GAPDH。數據代表三項獨立實驗(*P ＜ 0.05)。

圖 6. ITAC 處理經由 p53 下調導致在 NHEM 中色素過少。 (a) 將NHEM用不同濃度的ITAC處理4天。觀察每個沉澱物(pellet)，測定黑色素含量。數據代表三項獨立實驗(^* P ＜ 0.05)。(b) 藉由UV (20 mJ/cm² )照射NHEM兩次以及維持兩週。照射後每三天處理一次ITAC (50 ng/ml)。測定黑色素含量。數據代表三項獨立實驗(^* P ＜ 0.05)。乙醯化及總p53蛋白量藉由使用所示抗體之西方墨點法測定。GAPDH用作加載控制。重複執行西方墨點分析，並顯示代表性圖像。示出相對帶強度。a-Ac-p53，抗乙醯化p53抗體。(c) 模擬轉染或用不同濃度的HDAC5-Myc表現質粒轉染NHEM 48小時。離心後觀察每個沉澱物，確定黑色素含量。數據代表三項獨立實驗(*P ＜ 0.05)。

圖 7. ITAC 富含於白斑病皮膚表皮中。 從兩位白斑病患者(#1及#2)獲得正常(N)或色素過少病灶(L)的皮膚樣品，用抗ITAC (綠色)和抗HMB45 (紅色)抗體染色；細胞核用DAPI (藍色)染色。拍攝明亮的野外圖像以分析(visualize)組織中的黑色素(箭頭)。箭頭表示黑色素細胞。HMB45，人類黑色素瘤45比例尺，50μm。

＜ 輔助資料 ＞

補充材料及方法：

細胞培養 人類黑色素瘤MNT-1細胞系係由東國大學的Ai-Young Lee博士所提供，他最初係收到來自國家衛生研究院(National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA)的Vincent J. Hearing博士送的禮物。細胞在37℃、含有20% FBS及抗生素的DMEM (Lonza, Basel, Switzerland)中培養。WM266-4人類黑色素瘤細胞系得自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA)。SK-MEL-28人類黑色素瘤細胞系係得自韓國細胞系銀行 (Korean Cell Line Bank, KCLB, Seoul, Korea)。將那些細胞保持在37℃、含有10% FBS及抗生素的EMEM培養基(ATCC)中。

西方墨點分析 藉由在4℃下於溶解緩衝液(lysis buffer) (20 mM Tris [pH7.5]、0.1% Triton X-100、0.5%去氧膽酸鹽(deoxycholate)、1 mM PMSF、10 μg/ml抑胰肽酶(aprotinin)、及10 μg/ml亮抑酶肽(leupeptin))中培育(incubation) 10分鐘來萃取細胞(2 x 10⁶ )，並以13,000 rpm離心5分鐘。根據製造商的說明，使用二辛可寧酸試劑套組(BCA assay kit；Sigma, St. Louis, MO)測量蛋白質濃度。藉由SDS/PAGE分離25 mg總蛋白，並轉移到PVDF膜(Invitrogen, Washington, DC)。用含有0.3%酪蛋白(casein)的PBS在室溫下封閉(blocking))0.5小時後，在4℃下將膜與3-5 μg/ml一級抗體在含有0.1% Tween 20的PBS中的培育過夜。使用ImagePro Plus軟體版本4.0定量信號強度，並將其標準化至GAPDH的強度。各種抗體資訊如下：抗CXCR3、抗CXCR7 (Abcam, Cambridge, UK)、抗-HDAC5、抗p53 (Cell Signaling, Danvers, MA),、抗乙醯化p53(Millipore, MA)、抗α-微管蛋白、抗乙醯化α-微管蛋白(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、抗ITAC (R&D system, Minneapolis, MN)、抗HMB45 (GeneTex, Irvine, CA)、抗GAPDH抗體 (Santa Cruz Biotechnology, Dollas, TX)。所有數據均得自兩次以上的獨立實驗，每個實驗重複進行三次。

用於原代黑色素細胞 (primary melanocytes) 及黑色素瘤細胞系 (melanoma cell lines) 之細胞遷移試驗 (Cell migration assay) 在室溫下將博伊登室(孔徑8νm；Corning Inc., Corning, NY)中的濾器用第IV型膠原蛋白包覆3小時。將5 X 10⁴ 個細胞置於腔室的上部孔中，並將下部孔用含有0.5%牛血清白蛋白(bovine albumin)的EpiLife培養基(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)及包括不同濃度的ITAC之所示趨化激素填充。於37℃培養24小時後，用甲醇固定過濾插入物，用蘇木色素(hematoxylin)及曙紅(eosin，Merck, Darmstadt, Germany)染色。在相位差顯微鏡(phase-contrast microscopy)下拍攝圖像，並計算細胞以定量。所有數據均得自兩次以上的獨立實驗，每個實驗重複進行三次。

微陣列分析 (Microarray analysis) 用50 ng/mL ITAC處理NHEM 48小時，以及使用TRIzol試劑(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)分離總RNA。按照製造商的計劃書，使用Quick Amp Kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)將50奈克總RNA轉換成Cy3或Cy5標記的cRNA。使用Agilent Bioanalyzer測定260及280 nm處之吸光度比以用於品質評估(quality assessment)及濃度。將來自兩個不同樣本之等量Cy3或Cy5-標記的cRNA與Agilent Human Whole Genome 4 X 44k微陣列雜合。使用Feature Extraction 10.2版(Agilent Technologies)從掃描圖像中提取數據。每個樣本重複雜合反應。

定量即時 PCR 分析使用Superscript II 反轉錄酶套組(Superscript II Reverse Transcriptase Kit) (Life Technologies, Grand Island, NY)將來自每個樣本的二νg總RNA用於cDNA合成。購買TaqMan®探子 (Themo Fisher Scientific, Waltham, MA)，並使用ABI Fast Real-Time PCR System (Life Technologies)執行qPCR。將樣本中每個基因的相對表現量標準化(normalized)至管家基因(housekeeping gene) (甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH))，以及使用式2^-ΔΔCt 計算樣本之間的基因表現差異。

黑色素試驗 (Melanin assay) 在含有1% Nonidet P-40、0.01% SDS，及蛋白酶抑制劑混合物(protease inhibitor cocktail，Roche Molecular Biochemical, Indianapolis, IN)的0.1M Tris-HCl (pH 7.2)緩衝液中，藉由超音波震盪(sonicating)正常的或UV處理的NHEM來製備細胞溶胞產物。黑色素在溶解於1N NaOH之前，藉由離心(centrifugation)自細胞溶胞產物中分離。藉由使用Synergy H2酶標儀 (microplate reader，BioTek, Winooski, VT, USA)測量在490 nm的吸光度來測定黑色素含量，並將其標準化至蛋白質輸入。執行了三次獨立實驗。

補充參考 Avery-Kiejda, K.A., Bowden, N.A., Croft, A.J., Scurr, L.L. et al. (2011). P53 in human melanoma fails to regulate target genes associated with apoptosis and the cell cycle and may contribute to proliferation.BMC Cancer 11, 203 Camp, R.D., Bacon, K.B., and Fincham, N.J., (1990). Lymphocyte chemoattractants in psoriasis and normal skin. J. Invest. Dermatol. 95, 22S-23S Gunther, C., Zimmermann, N., Berndt, N., Groβer, M., Stein, A., Koch, A., and Meurer, M. (2011). Up-regulation of the chemokine CCL18 by macrophages is a potential immunomodulatory pathway in cutaneous T-cell lymphoma.Am. J. Pathol.179, 1434-1442 Horikawa, T., Nakayama, T., Hikita, I., Yamada, H., Fujisawa, R., Bito, T., Harada, S., Fukunaga, A., Chantry, D., Gray, P.W. et al. (2002). IFN-gamma-inducible expression of thymus and activation-regulated chemokine/CCL17 and macrophage-derived chemokine/CCL22 in epidermal keratinocytes and their roles in atopic dermatitis.Int. Immunol.14, 767-773 Hub, E., and Rot, A. (1998). Binding of RANTES, MCP-1, MCP-3, and MIP-1alpha to cells in human skin.Am. J. Pathol.152, 749-757 Kanda, N., Mitsui, H., and Watanabe, S. (2004). Prostaglandin E (2) suppresses CCL27 production through EP2 and EP3 receptors in human keratinocytes.J. Allergy Clin.Immunol.114, 1403-1409 Menezes-Souza, D., Guerra-Sa, R., Carneiro, C.M., Vitoriano-Souza, J., Giunchetti, R.C., Teixeira-Carvalho, A., Silveira-Lemos, D., Oliveira, G.C., Correa-Oliveira, R., and Reis, A.B. (2012). Higher expression of CCL2, CCL4, CCL5, CCL21, and CXCL8 chemokines in the skin associated with parasite density in canine visceral leishmaniasis. PLoS Negl.Trop.Dis.6, e1566 Papadopoulos, E.J., Sassetti, C., Saeki, H., Yamada, N., Kawamura, T., Fitzhugh, D.J., Saraf, M.A., Schall, T., Blauvelt, A., Rosen, S.D. et al. (1999). Fractalkine, a CX3C chemokine, is expressed by dendritic cells and is up-regulated upon dendritic cell maturation.Eur.J. Immunol.29, 2551-2559 Uchi, H., Terao, H., Koga, T., and Furue, M. (2000). Cytokines and chemokines in the epidermis。 J. Dermatol.Sci.24 Suppl 1, S29-38 Vestergaard, C., Bang, K., Gesser, B., Yoneyama, H., Matsushima, K., and Larsen, C. G. (2000). A Th2 chemokine, TARC, produced by keratinocytes may recruit CLA+CCR4+ lymphocytes into lesional atopic dermatitis skin.J. Invest.Dermatol.115, 640-646 Yaszay, B., Trindade, M. C., Lind, M., Goodman, S. B., and Smith, R. L. (2001). Fibroblast expression of C-C chemokines in response to orthopaedic biomaterial particle challenge in vitro. J. Orthop.Res.19, 970-976

圖 8. NHEM 對皮膚細胞衍生的趨化因子的遷移能力 藉由博伊登室試驗分析細胞遷移，如補充材料及方法中所述。對於博伊登室試驗，將細胞加至上部孔中，而所示趨化激素加至下部孔中(200ng / ml)。允許細胞遷移24小時以及固定、染色、成像、及定量。這裡顯示的結果在兩次獨立實驗中是可再現的(***P ＜ 0.001).。

圖 9. ITAC 對人類黑色素瘤細胞系的遷移效應 藉由博伊登室試驗分析細胞遷移。將人類黑色素瘤細胞系WM266-4 (a)、SK-MEL-28 (b)、及MNT-1 (c) 在不含I-TAC (對照)的培養基或含200 ng/ml的I-TAC (I-TAC)遷移24 h。將細胞固定、染色、及定量。數據代表三項獨立實驗(*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01)。

圖 10. HDAC5 特異性 siRNA 及 HDAC9 特異性 siRNA 在 NHEM 中的有效性 將對抗HDAC5、HDAC9、JUB、或THBS的各個siRNA轉染入NHEM中48小時，並萃取總RNA。凌亂siRNA用作陰性對照。藉由RT-qPCR測定NHEM中HDAC5 (a)及HDAC9 (b)的mRNA量。藉由GAPDH將各值標準化。數據代表三項獨立實驗(***P ＜ 0.001)。

圖 11. ITAC 處理對 NHEM 或人類黑色素瘤細胞中蛋白質表現的影響 (a) 用50 ng/ml ITAC處理NHEM、或(b) 用對抗HDAC5的siRNA轉染48小時。藉由使用所示抗體之西方墨點法測定α-微管蛋白的乙醯化量。凌亂siRNA用作HDAC5特異性siRNA的對照。(c) 人類黑色素瘤細胞系SK-MEL-38用ITAC (50 ng/ml) 處理48 h，並收集以用於使用抗p53及抗酪胺酸酶(TYR)抗體之西方墨點分析。重複執行西方墨點分析，並顯示代表性圖像。GAPDH用作加載控制。a-Ac-p53，抗乙醯化p53抗體。α-Ac-α-微管蛋白，抗乙醯化的α-微管蛋白抗體。

圖 12. MIG 、 IP-10 、或 ITAC 對 NHEM 中黑色素生成的影響 用200 ng/ml MIG、IP-10、或ITAC處理NHEM 48小時，並萃取總RNA。藉由RT-qPCR測定NHEM中TYR( a)、MITF (b)、TRP1 (c)、及DCT (d)的mRNA量。藉由GAPDH將各值標準化。數據代表兩獨立實驗。(*P ＜ 0.05)

圖 13. p53 減弱對在 ITAC 誘導的色素過少中黑色素生成相關基因表現的影響 (a-d) 用凌亂siRNA或對抗p53的siRNA轉染NHEM 48小時及用200 ng/mL ITAC轉染另外48小時。藉由RT-qPCR測定每個mRNA量。數據代表三項獨立實驗(^** P ＜ 0.01,^*** P ＜ 0.001)。表 1. 用於細胞遷移試驗的趨化激素列表 表 2. 由 ITAC 調控的基因列表及功能分類

無

圖1A顯示根據用ITAC、MIG、或IP-10處理的正常人類表皮黑色素細胞 (NHEM)遷移的比較結果。圖1B顯示隨著ITAC濃度變化，NHEM遷移的結果。圖1C顯示CXCR3及CXCR7蛋白質表現量的西方墨點法(Western blot)結果。圖1D顯示在ITAC存在下NHEM的遷移隨後用CXCR3或CXCR7中和抗體處理後的分析結果。圖2A顯示藉由ITAC處理顯著地上調(up-regulated)或下調(down-regulated)生物過程的分析結果。圖2B顯示根據ITAC處理，在NHEM中的HDAC5 mRNA量。圖2C顯示根據ITAC處理的HDAC9 mRNA量。圖3A顯示根據在NHEM中HDAC5及HDAC9的減弱(knockdown )，細胞遷移的結果。圖3B顯示根據HDAC5過度表現(overexpression)，細胞遷移的結果。圖3C顯示根據ITAC處理的HDAC5蛋白量。圖4A顯示根據ITAC處理，在NHEM中總p53及乙醯化p53的量。圖4B顯示根據HDAC5過度表現，總p53及乙醯化p53的量。圖4C顯示根據HDAC5減弱，總p53及乙醯化p53的量。圖5A顯示在ITAC存在或不存在的情況下，HDAC5 (HDAC5-myc)的過度表現、p53 (p53-Flag)的過度表現、或兩者(HDAC5-Myc + p53-Flag)的過度表現對細胞遷移的影響。圖5B顯示根據ITAC處理，對MMP1表現的影響。圖6A顯示根據ITAC處理，黑色素含量中的變化。圖6B顯示根據UV照射，ITAC處理後的黑色素含量及總p53或乙醯化p53蛋白的量。圖6C顯示根據HDAC5過度表現的黑色素含量。圖7顯示用抗ITAC抗體(綠色)及抗HMB45(紅色)染色正常皮膚(N)或有色素過少病灶的皮膚(L)樣本(#1及#2)的結果。核用DAPI (藍色)染色，箭頭表示黑色素，而三角形表示黑色素細胞。圖8顯示皮膚細胞衍生的趨化激素誘導NHEM遷移的能力。圖9A顯示ITAC在人類黑色素瘤(melanoma)細胞系(cell line) (WM266-4)中的細胞遷移效應。圖9B顯示ITAC在人類黑色素瘤細胞系(SK-MEL-28)中的細胞遷移效應。圖9C顯示ITAC在人類黑色素瘤細胞系(MNT-1)中的細胞遷移效應。圖9D顯示在黑色素細胞及黑色素瘤細胞中ITAC、CXCR3、及CXCR7的檢測結果。圖10A顯示mRNA表現的結果，確認HDAC5是否因siRNA處理而減弱。圖10B顯示mRNA表現的結果，確認HDAC9是否因siRNA處理而減弱。圖11A顯示在NHEM中，鑑定α-微管蛋白(alpha-tubulin)的乙醯化是否因ITAC處理而受影響的結果。圖11B顯示在NHEM中，鑑定α-微管蛋白的乙醯化是否因HDAC5缺失(deletion)而受影響的結果。圖11C顯示在黑色素瘤細胞中根據ITAC處理，p53及TYR之表現的變化的結果。圖12A顯示在NHEM中，ITAC處理對TYR表現的影響。圖12B顯示在NHEM中，ITAC處理對MITF表現的影響。圖12C顯示在NHEM中，ITAC處理對TRP1表現的影響。圖12D顯示在NHEM中，ITAC處理對DCT表現的影響。圖13A顯示在p53減弱的情況下，ITAC處理對TYR表現的影響。圖13B顯示在p53減弱的情況下，ITAC處理對MITF表現的影響。圖13C顯示在p53減弱的情況下，ITAC處理對TRP1表現的影響。圖13D顯示在p53減弱的情況下，ITAC處理對DCT 表現的影響。

【序列表】<110> 愛茉莉太平洋股份有限公司(AMOREPACIFIC CORPORATION)<120> 包含ITAC抑制劑之組成物<130> 16P414/IND<160> 4<170> KoPatentIn 3.0<210> 1<211> 1610<212> RNA<213> 智人(Homo sapiens)<400> 1agagaacaaa acagaaactc ttggaagcag gaaaggtgca tgactcaaag agggaaattc 60ctgtgccata aaaggattgc tggtgtataa aatgctctat atatgccaat tatcaatttc 120ctttcatgtt cagcatttct actccttcca agaagagcag caaagctgaa gtagcagcag 180cagcaccagc agcaacagca aaaaacaaac atgagtgtga agggcatggc tatagccttg 240gctgtgatat tgtgtgctac agttgttcaa ggcttcccca tgttcaaaag aggacgctgt 300ctttgcatag gccctggggt aaaagcagtg aaagtggcag atattgagaa agcctccata 360atgtacccaa gtaacaactg tgacaaaata gaagtgatta ttaccctgaa agaaaataaa 420ggacaacgat gcctaaatcc caaatcgaag caagcaaggc ttataatcaa aaaagttgaa 480agaaagaatt tttaaaaata tcaaaacata tgaagtcctg gaaaagagca tctgaaaaac 540ctagaacaag tttaactgtg actactgaaa tgacaagaat tctacagtag gaaactgaga 600cttttctatg gttttgtgac tttcaacttt tgtacagtta tgtgaaggat gaaaggtggg 660tgaaaggacc aaaaacagaa atacagtctt cctgaatgaa tgacaatcag aattccactg 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Claims

一種用於預防或治療白斑病或白斑病轉移的組成物，其包含干擾素誘導型T細胞α趨化因子(ITAC)抑制劑。
如請求項1所述之該組成物，其中該ITAC抑制劑係對抗ITAC的中和抗體或與至少一部分ITAC mRNA結合的寡核苷酸。
如請求項1所述之該組成物，其中該ITAC抑制劑係對抗ITAC受體的中和抗體或與至少一部分ITAC受體mRNA結合的寡核苷酸。
如請求項1所述之該組成物，其中該ITAC受體係CXCR3及CXCR7中的一或多者。
如請求項1所述之該組成物，其中該ITAC抑制劑係對抗HDAC5的中和抗體或與至少一部分HDAC5 mRNA結合之寡核苷酸。
如請求項1至5任一項所述之該組成物，其中該寡核苷酸係siRNA、shRNA、及miRNA中的一或多者。
一種用於檢測白斑病之組成物，其包含用於ITAC基因表現量之該檢測的試劑。
如請求項7所述之該組成物，其中該檢測試劑包含一或多種與該基因的轉錄物特異性地結合之引子對或探子，以及與該基因所表現的蛋白質特異性地結合之抗體。
如請求項8所述之該組成物，其中該引子對包含與該基因的mRNA互補且能夠擴增該mRNA的引子對；以及該探子包含一或多個由該基因的mRNA序列組成之多核苷酸(polynucleotide)；而多核苷酸，其係包含10或更多個連續核苷酸之該多核苷酸的片段。
如請求項7至9任一項所述用於診斷白斑病之套組，其包含用於檢測白斑病之該組成物。
一種用於篩選白斑病所用之預防性或治療性試劑的方法，其包含：用測試物質處理人類表皮組織，以及鑑定該測試物質是否抑制人類表皮組織中ITAC、CXCR3、及CXCR7基因中的一或多者之該表現。