KR101221593B1 - Ｈ19 ｍｉｃｒｏＲＮＡ을 함유하는 기미 발생 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기미 발생 억제용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명에서는 H19 microRNA (miRNA)의 발현양이 기미를 가진 사람의 색소침착 병변 부위에서 저하되고, H19 microRNA 의 발현 억제로 인해 기미를 발생시키는 티로시나제의 발현양이 증가됨을 확인하고, H19 microRNA 을 유효성분으로 함유하는 기미 발생 억제용 조성물을 제공한다.

Description

Ｈ19 ｍｉｃｒｏＲＮＡ을 함유하는 기미 발생 억제용 조성물 {A composition for suppressing melanogenesis containing H19 microRNA}

본 발명은 기미의 발생을 억제할 수 있는 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 H19 microRNA 을 유효성분으로 함유하는 기미 발생 억제용 조성물에 관한 것이다.

과다색소침착은 멜라닌 색소의 증가로 인해 발생하며 이러한 멜라닌 색소는 모든 과다 색소침착 질병에 깊이 관여되어 있다. 종전의 연구들은 대부분 과다 색소침착 질병에서 멜라닌 색소의 증가를 야기시키는 근원적인 메커니즘에 대한 것이었다.

멜라닌은 티로시나제가 포함된 멜라노좀에서 만들어지며, 기미형성과정은 복잡한 경로에 의해 조절된다.

염증이나 UV노출에 의해 생긴 과다색소침착의 경우에는 더 이상의 UV를 노출시켜주지 않으면 보통 자발적으로 회복된다. 그러나 기미의 경우에는 그렇지 못하다. UV 노출이 기미 형성 과정에 영향을 미칠 수 있다 하더라도 (Sanchez et al., 1981; Kang et al., 2002) 기미 형성 과정은 염증이나 UV 노출에 의해 생기는 과다색소침착과는 다른 조절 메커니즘을 가지고 있다. 기미 형성에는 임신 (Sodhi and Sausker, 1988), 자궁과 난소의 호르몬 변화 및 유전적 경향 (Sanchez et al., 1981) 등 다양한 요인들이 영향을 미친다고 보고 되었다.

H19 유전자는 2.3kb 의 비번역 RNA (non-coding RNA) (Gabory et al., 2006) 로 전사 (transcription) 된다. H19 RNA 를 포함한 여러 종류의 비번역 RNA 들은 유전자 발현을 조절할 수 있다.

H19는 인슐린 유사 성장 인자 Ⅱ (IGF2; Reese and Bartolomei, 2006) 와 각인 클러스터 (imprinted cluster) 로 구성되어 있으며, 각인 조절 지역 ICR은 상기 두 유전자의 발현을 조절한다 (Jinno et al., 1996). 모계 염색체에서 ICR의 메틸화는 H19 유전자의 발현 저하를 유도하고 동시에 IGF2의 과발현을 유도하여 종양을 형성한다.

한번 생긴 기미는 완전히 제거하기가 어렵기 때문에 예방이 중요하며 미리 발생을 억제시키는 것이 중요한데, 상기 기술한 바와 같이 아직 기미의 원인에 대해 명확하게 밝혀진 바가 없기 때문에 기미 자체를 억제시킬 수 있는 연구가 절실하다.

본 발명자는 기미 형성을 미리 억제할 수 있는 방법을 찾고자 연구 노력한 결과, H19 유전자의 발현저하와 기미 생성에 깊은 상관관계가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 기미 발생을 억제하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 H19 microRNA 을 유효성분으로 함유하는 기미 발생 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 기미를 가진 환자의 색소침착이 일어난 병변 부위에서는 H19 RNA 발현저하가 일어났으나, UV 노출에 의한 색소침착이 일어난 피부에서는 H19 RNA 발현저하가 일어나지 않았다 (도 1). 이는 H19 RNA 발현저하가 기미 생성과 깊은 연관관계가 있음을 보여준다.

H19 유전자는 IGF2 유전자와 상호적으로 각인되어 있다고 보고되었다 (Zemel et al., 1992). IGF2 유전자는 ICR 이 메틸화된 채로 부계로부터 유래된 대립유전자에서만 발현된다 (Ohlsson et al., 1993: Giannoukalis et al.,1993). 반면에 H19 유전자는 ICR 의 탈메틸화된 상태로 모계로부터 유래된 대립유전자에서만 발현된다. 따라서 모계 염색체에서의 ICR 메틸화는 H19의 발현을 저하시키며 IGF2의 발현을 유도한다. 그러나 기미를 가진 환자의 색소침착된 부분과 정상 피부 부분에서, 모계 염색체 상 ICR 부위의 H19 프로모터 지역의 메틸화 패턴은 다양하였다 (도 3).

H19의 발현저하는 기미와 관련이 있다고 판단되어, H19의 발현을 억제시킨 멜라닌 세포 단일 배양에서는 티로시나제의 과발현이 일어나 멜라닌이 많이 생성될 것으로 예상되었다. 그러나 H19의 발현이 억제된 멜라닌 세포의 단일 배양에서는 티로시나제의 과발현이 일어나지 않았다 (도 4B). 사람의 각질형성세포 (keratinocyte)의 H19로부터 유래된 microRNA에 관한 보고서 (Cai and Cullen, 2007) 및 H19 RNA가 백반증 환자의 표피에서 발현된다는 사실들은 H19 RNA 의 주요 근원은 각질형성세포임을 의미한다. 또한 H19 RNA의 발현은 멜라닌 세포보다 각질형성세포에서 더 많이 발현되었다.

상기의 실험 결과들은 H19 RNA의 주요 근원은 각질형성세포이며, 각질형성세포는 기미 생성에 있어서 중요한 역할을 하고 있음을 뒷받침해준다. 이러한 사실을 바탕으로 혼합 세포 배양 시스템 (H19 RNA의 발현이 억제된 각질형성세포와 정상 멜라닌 세포로 구성됨) 을 본 발명의 실시예에서 사용하였다. 본 발명의 일 실시예에서는 정상 멜라닌 세포의 배양액에서보다 혼합 세포 배양 시스템에서 더 많은 티로시나제의 과발현이 일어났다 (도 4B).

H19 RNA 가 억제된 각질형성세포 단일 배양에서 Erk 와 CREB 의 인산화가 일어났으며, 멜라닌 세포 단일 배양에서는 일어나지 않았다 (도 5A). Trp-1 과 케라틴 14 (keratin 14) 로 표지된 모델 시스템은 얼마만큼의 멜라노좀이 멜라닌 세포에서 각질형성세포로 전이되었는지를 셀 수 있도록 발달되어 왔다 (Lin et al., 2008). 멜라닌 세포에서 각질형성세포로의 멜라노좀 전이는 과다 색소침착과 깊은 관련이 있음이 밝혀졌다. 본 발명의 일 실시예에서는 H19 RNA의 발현 억제가 주변에 있는 멜라닌 세포에서 전이된 멜라노좀을 가지고 있는 각질형성세포의 수를 증가시킴을 알 수 있었다 (도 6).

임신 (Sodhi and Sausker,1988) 과 UV 노출 (Sanchez et al., 1982; Kang et al., 2002) 이 기미의 주요 원인으로 판단되어지므로 본 발명의 일 실시예에서는 H19 RNA의 발현 억제와 에스트로겐을 동시에 처리해주었을 때 와 H19 RNA의 발현 억제와 UV 노출을 동시에 처리해주었을 때 각각 기미 형성에 어떤 영향을 미치는지를 확인해 보았다. H19 RNA 발현 억제와 UV 노출을 동시에 처리해주었을 때만 티로시나제 과발현과 CREB 인산화가 일어났다 (도 7A, 7B).

결론적으로, H19 유전자의 발현 저하는 기미 형성을 촉진시키기에 H19 발현 억제는 기미형성의 새로운 메커니즘이 되며, H19의 발현 조절은 새로운 기미 치료제가 될 수 있음을 본 발명을 통해 규명하였다.

따라서 본 발명은 H19 microRNA 를 유효성분으로 하여 기미 발생을 억제하는 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 H19 microRNA (miRNA)는 모계 각인 (maternal imprinting)되는 비번역 mRNA로 정확한 기능은 알려져 있지 않다.

유전자 H19의 Genbank Accession ID 는 AK123560 이다.

본 발명의 다른 양태는 H19 microRNA 를 유효성분으로 하는 조성물을 포함하는 기미 발생 억제용 약학 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 H19 microRNA 에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가하여 약제학적 단위 투여형으로 제형화되어 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 약제학적 단위 투여형의 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 연고, 겔, 크림, 패취, 분무제 에멀전, 시럽, 에어로졸 등 경구 투여용 제형, 외용제, 멸균 주사용액, 좌제 및 경피 투여용 제제로서 통상적인 방법으로 제형화하여 사용될 수 있다.

또한 기미 억제를 위해 본 발명의 조성물인 microRNA 을 주입할 때 그 기재는 주사제에서 통상적으로 사용되는 어떠한 기재라도 사용 가능하다. 예를 들어, 기재는 증류수, 염화나트륨 염 용액, 염화나트륨 및 무기물염의 혼합물 또는 그와 유사한 혼합물, 만니톨, 락토스, 덱스트란, 글루코스 등의 용액, 글리신, 아르기닌 같은 아미노산 용액, 유기산 용액 또는 염용액 및 글루코스 용액의 혼합 및 이와 유사한 용액 등을 포함한다. 또한, 주사제는 통상의 방법으로 삼투압 조절제, pH 조절제, 참기름이나 콩기름 같은 식물성 기름, 또는 레시친, 비이온성 표면활성제 같은 표면활성제를 상기한 기재에 첨가하여 용액, 현탁액 또는 콜로이드 용액 등으로 제조할 수 있다. 이러한 주사제는 분말형, 동결 건조형 등으로 제조하여 사용하기 바로 전에 용해하여 쓸 수도 있다.

본 발명의 기미 억제용 조성물이 고체상인 경우 필요하면 미리 멸균한 기재에 용해하여 사용하거나, 액상인 경우 별도의 처리 없이 그대로 사용할 수 있다.

본 발명의 기미 억제용 조성물을 환자에 적용함에 있어 유효성분을 기준으로 환자의 기미 부위에 국부적으로 투여할 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 안정된 형태의 외용제로 만들어 나노파티클 (nanoparticle) 또는 마이크로니들링 (microneedling; microneedle therapy system) 을 활용하여 피부 내로 전달될 수 있다. H19 microRNA 유효성분의 피부 침투성을 극대화시키기 위해 마이크로 니들을 이용하여 표피층과 진피층을 직접 관통하는 새로운 통로를 만들어 피부 침투성을 극대화시킬 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별, 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 기미의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다.

또한 본 발명은 H19 microRNA 을 유효성분으로 함유하는 기미 발생 억제용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서의 H19 microRNA 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 부형제를 포함한다. 또한 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 추가로 포함할 수 있다.

발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 모든 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 모발 화장료, 오일 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 파운데이션, 자외선 차단제, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저, 유액, 프레스 파우더, 루스파우더 및 아이섀도의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 부형제 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 벤토나이트, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 부형제 성분으로서 유당, 탈크, 수산화알루미늄, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 부형제 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 부형제 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클린싱인 경우에는 부형제 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 피부의 기미 발생을 억제하고 기미로 인한 과다색소침착이 생기지 않도록 하여 깨끗한 피부를 유지할 수 있게 한다.

도 1은 기미를 가진 환자의 색소침착이 일어난 병변부위와 UV 에 의해 색소침착된 부위에서에서 H19 RNA의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 2는 기미를 가진 환자의 병변 부위와 정상 부위에서 H19 와 IGF2의 RNA 발현양을 나타낸 것이다.
도 3은 기미를 가진 환자의 병변부위와 정상 부위에서 모계 ICR H19 프로모터 지역에 위치한 CpGs 의 메틸화 패턴을 나타낸 것이다.
도 4A는 siRNA 인 Stealth 243과 Stealth 472 를 각질형성세포에 처리했을 때 H19의 발현양을 나타낸 것이다. 도 4B 는 H19 RNA 의 발현을 억제시킨 멜라닌 세포 단일재배 및 혼합 세포 배양에서의 티로시나제 과발현 정도를 확인한 결과이다. 도 4C 는 siRNA 로 H19의 발현이 억제된 각질형성세포에서의 티로시나제 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 5a는 H19 RNA 를 억제시켰을 때 Erk, Akt 및 CREB의 인산화 여부를 나타낸 것이다.
도 5b 는 U0126, LY294002 및 H89를 사용하여 Erk, Akt, PKA 신호 경로를 특이적으로 억제시킨 경우에 티로시나제의 발현 및 CREB 인산화 정도를 나타낸 것이다.
도 6은 H19의 발현을 억제시켰을 때 각질형성세포로 이동된 멜라노좀을 나타낸 것이다.
도 7a 는 H19의 발현억제와 함께 에스트로겐을 처리했을 때 티로시나제의 발현 및 Erk, CREB와 같은 신호 전달 물질의 인산화 정도를 나타낸 것이다. 도 7b 는 H19 발현 억제와 함께 UV를 조사해주었을 때 티로시나제 발현 및 Erk, CREB와 같은 신호 전달 물질의 인산화 정도를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기 구체적인 실험방법 및 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 구체적인 실험방법 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

조직 샘플의 획득과 제작

35세에서 63세 (평균 48세)의 기미를 가진 14명의 여성환자로부터 피부 표본을 회수하였다. 동일 환자의 병변부와 정상부 조직을 각각 생검하여 세트로 조직을 회수하였다. 상기 표본은 RT-PCR 과 실시간 PCR 수행 시 사용하였다.

UV 노출에 의한 색소 침착된 피부 표본을 얻기 위해 3명의 백반증 환자의 정상 피부 조직에 10번 이상 국소적 소라겐 (topical psoralen)을 적용한 후 UVA 를 조사하였다. 모든 환자는 19세에서 35세의 여성이었다. 반복적으로 조사된 세 환자의 복부는 어두운 갈색으로 되었다.

기미를 가진 49세에서 53세의 2명의 여성 환자와 한명의 남성 환자의 피부 표본은 ICR 메틸화의 결정을 위해 회수하였다.

ICR 메틸화 결정

일반적인 페놀-클로로포름 방법에 의하거나 Genomic DNA Extraction kit (iNtRON Biotechnology, 성남, 한국)를 사용하여 피부 샘플에서 DNA를 채취하였다. EZ DNA 메틸레이션-골드 키트 (Zymoresearch Corp., Orange, CA, USA) 를 사용하여 중아황산염 (bisulfite) 을 처리하였다. PCR 산물을 얻기 위해 5㎕의 중황산염이 처리된 DNA와 템플레이트 (template)로 두 번째 증폭에서 얻어진 PCR 산물을 사용하여 PCR 을 수행하였다. 사용된 프라이머 쌍과 반응 조건은 하기와 같다.

<바깥쪽 프라이머>

1133 (59-TGATGGTGGTAGGAAGGGGTTTTTTGTGTT)

1134 (59-CTCCTCCAACACCCCATCTTCCCCTAATTA)

0.75mM의 MgCl_2, 어닐링 온도 (annealing temperature: AT): 57℃

<안쪽 프라이머>

1143 (59-GGTATGGTGTTTTTTGAGGGGAGAT)

1144 (59-CATCCCACCCCCTCCCTCACCCTA)

1 mM의 MgCl_2, AT: 53℃

PCR은 DNA Thermal Cycler 9600 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)으로 진행하였다. bis1 PCR 산물은 GLASSMILK 겔 추출 키트 (Q-BIOgene, Cambrige, UK)를 사용하여 분리해냈다. 각각의 DNA 단편은 TOPT TA Cloning kit (Invitrogen, Frederick, MD, USA)를 사용하여 복제하였고, 3′아데닌이 돌출된 PCR 산물은 PCR2.1-TOPO 벡터에 삽입하였다.

재조합 벡터는 항체 반응 능력이 있는 E.Coli에 형질전환시켰다. 증폭된 DNA는 AccuPrep Plasmid Extraction Kit (Bioneer, Seoul, South Korea)를 사용하여 추출해냈다. DNA의 서열 분석은 Macrogen Co. (Seoul, South Korea)에서 수행하였다.

H19 발현이 억제된 정상인 표피의 멜라닌 세포 배양

표피를 2.4 U/ml 의 디스파제 (dispase; Roche, Mannheim, Germany)를 1시간 동안 처리한 후 진피와 분리하였다. 표피시트에 0.05%의 트립신을 10분 동안 처리하여 개인 표피세포의 현탁물을 얻을 수 있었다. 상기 세포들을 Medium 254 (Cascade Biologics, Portland, OR, USA) 에 현탁시키고, 소 뇌하수체 추출물, 우 태아 혈청, 소 인슐린, 하이드로코르티손 (hydrocortisone), bFGF, 소 트랜스페린 ( Cascade Biologics, Portland, OR, USA), 헤파린 및 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phorbol 12-myristate 13-acetate; Cascade Biologics, Portland, OR, USA)를 첨가하였다. 세포들이 합류되었을 때, 플라스크에서 떼어내고 다른 배양 플라스크로 옮겼다. H19 발현 억제를 위해 6-웰 플레이트에서 배양된 멜라닌 세포에 두 개의 다른 Stealth^TM siRNA (Stealth 243 과 Stealth 472)와 리포펙타민 LTX (Invitrogen), 60nM siRNA 을 사용한 음성 대조군 stealth siRNA (Invitrogen)를 각각 이식하였다. 각 실험은 48시간 배양 후에 이루어졌다.

H19 발현이 억제된 정상인 표피의 각질형성세포 배양

표피를 2.4 U/mL 디스파제 (dispase; #295 825; Roche, Mannheim, Germany)를 1시간 동안 처리한 후 진피와 분리하였다. 표피시트에 0.05%의 트립신을 10분 동안 처리하여 개인 표피세포의 현탁물을 얻을 수 있었다. 상기 세포들을 EpiLife 배지 (#M-EPI-500-CA; Cascade Biologics, Portland, OR, USA) 에 현탁시키고, 소 뇌하수체 추출물, 소 인슐린, 하이드로코르티손 (hydrocortisone), 인간 표피 성장인자 및 소 트랜스페린 (#S-001-5; Cascade Biologics, Portland, OR, USA)을 첨가하였다. 세포들이 합류되었을 때, 플라스크에서 떼어내고 다른 배양 플라스크로 옮겼다. H19 발현 억제를 위해 6-웰 플레이트에서 배양된 각질형성세포에 두 개의 다른 Stealth^TM siRNA (Stealth 243 과 Stealth 472)와 리포펙타민 LTX (Invitrogen), 60nM siRNA을 사용한 음성 대조군 stealth siRNA (Invitrogen)을 각각 이식하였다. 각 실험은 48시간 배양 후에 이루어졌다.

억제제, 에스트로겐 처리, UV 조사 유무에 따라 H19 RNA 발현이 억제된 혼합 세포의 배양

두 개의 다른 stealth siRNA (Stealth 243 과 Stealth 472) 및 리포펙타민 LTX (Invitrogen) 와 60nM siRNA 을 사용한 음성 대조군 stealth siRNA (Invitrogen) 를 6-웰 플레이트에서 배양된 각질형성세포에 이식시켰다. 24시간 동안 H19를 억제시킨 후, 멜라닌 세포를 각질형성세포에 첨가하였다. 혼합된 세포는 억제 실험을 위해 2.5 μM U0126 (MEK 억제제) 15 μM LY294002 (PI3K 억제제) 또는 10 μM H89 (PKA 억제제) 가 포함된 배지에 24시간 동안 배양하였다. 에스트로겐 처리 또는 UV조사 또한 세포의 H19를 억제시키고 24시간 후에 수행하였다.

RT-PCR

트리졸 (Trizol; Invitrogen, Carlsbad, CA., USA) 을 처리하여 각 조건하에 배양된 세포들로부터 총 RNA을 정제하였다. RT-PCR 을 위해 First Strand cDNA Synthesis Kit (AMV; Boehringer Mannheim, Germany)를 사용하여 RNA 역전사를 수행하였다. 인간 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소 (GAPDH) 를 기준으로 사용하였다. H19의 프라이머 서열은 하기와 같았다.

순방향 : 5′- AAAGACACCATCGGAACAGC -3′

역방향 : 5′- AGAGTCGTGGAGGCTTTGAA -3′

GAPDH 의 프라이머 서열은 하기와 같았다.

순방향 : 5′-TCCACTGGCGTCTTCACC-3′

역방향 : 5′-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3′

PCR 증폭은 10 x 반응 버퍼, 2.5 mM MgCl₂, 250mM dNTPs, 100 ng 각각의 PCR primer, 0.5 U Taq DNApolymerase 및 20-50ng DNA로 구성된 40㎕ 반응용액에서 DNA Thermal Cycler 9600 (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 사용하여 94℃에서 1분간, 58℃에서 1분간, 72℃에서 1분간 30번을 수행하였다.

PCR을 통해 얻어진 DNA 단편은 2% 아가로즈 겔 (agarose gel)로 분리하였다.

PCR (Real time-PCR)

Light Cycler real-time PCR (Roche, Mannheim, Germany)을 사용하여 정량적인 실시간 PCR을 수행하였으며, GAPDH 결과와 비교해서 H19 mRNA 레벨을 측정하였다. 사용한 프라이머는 하기와 같았다.

<H19>

순방향 : 5′-ATGACATGGTCCGGTGTGA-3′

역방향 : 5′-AGAAACAGACCCGCTTCTTG-3′

<IGF 2>

순방향 : 5′-CGCGGCTTCTACTTCAGC-3′

역방향 : 5′-CGGGGGTAGCACAGTACG-3′

<GAPDH>

순방향 : 5′-TCCACTGGCGTCTTCACC-3′

역방향 : 5′-GGCAGAGATGATGACCCTTT-3′

웨스턴 블롯 분석

세포들을 50nM Tris-base (pH 7.4), 150mM NaCl, 10mM EDTA, 0.1% 트윈-20 및 프로테아제 억제제들 (0.1mM 페닐메틸설포닐플루이드, 5㎍/ml 아프로티닌 (aprotinin), 5㎍/ml 류펩틴 (leupeptin)) 이 포함된 아이스 균질 버퍼에 균질화시켰다. 추출 단백질 (20㎍)을 10% SDS-PAGE 를 사용하여 용해시키고, 니트로셀루로즈 멤브레인 (nitrocellulse membrane) 으로 이동시켰다. 멤브레인을 anti-phospho-Erk, Erk phospho-Akt, Akt, phospho-CREB, CREB (토끼 항체; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) 또는 티로시나제 (토끼 항체; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 항체로 배양하고, 블록킹 용액에서 1:1000으로 4℃에서 희석시켰다. 항-토끼 또는 항-마우스 호스래디쉬 페록시다아제가 결합된 항체 (Santa Cruz Biotechnology)로 더 배양시켰고, 화학발광 용액 (chemiluminescence solution; Thermo, Rockford, IL, USA)으로 처리하였다. 이미지 판독기 (LAS-3000; Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)로 신호를 포착하였다.

각 레인에 올려진 단백질의 양을 모니터하기 위해 멤브레인을 마우스 모노클론 항-액틴 항체 (Sigma, St. Louis, MO, USA)로 상기 설명한 방법으로 재탐침하였다. 밴드의 밀도로 단백질을 분석하였다.

멜라노좀 (Melanosome) 전이

배양한 세포들을 PBS로 세척하였고, 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정시켰다. 세포들을 0.1% 트리톤 X-100으로 PBS 존재하에 5분간 처리하였고, 3% 소 혈청 알부민으로 1시간 실온에서 전-배양시켰으며, 그 후 두 개의 항체로 2시간 동안 상온에서 배양시켰다; 1:100 항-TRP01 (염소 항-TRP-1 IgG) 항체와 1:200 항-케라틴 14 (마우스 항-케라틴 14 IgG) 세포들을 PBS와 두 개의 항체 (Alexa Fluor 594-labeled donkey anti-goat IgG and Alexa Fluor 488-labeled goat anti-mouse IgG (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)로 상온에서 세척하였다.

염색된 표본들은 이미지 분석시스템 (image analysis system; Dp Manager 2.1; Olympus Optical Co., Japan)을 사용하여 관찰하였다. 플레이트 당 10개의 임의적 필드를 평가하여 멜라닌이 함유된 각질형성세포의 수를 세었다. 색소 이전은 대조군에 대한 비율로 나타냈다. 데이터는 최소 5개의 실험의 평균 ± SEM 으로 나타냈다 (*P,0.05).

통계학적 분석

Student t-test 로 통계적 유의성을 시험하였다. 모든 결과는 반복적인 실험을 통해 mean ± S.E 로 나타내었다.

< 실시예 1> 기미 병변 부위와 UV 노출에 의한 색소침착 부위에서 H19 RNA 발현정도 확인

기미를 가진 8명의 환자들과 UV에 노출된 3명의 환자들의 표피 표본을 채취하여 H19 RNA 발현을 분석하였다. H19 RNA 발현은 기미를 가진 환자의 정상 표피에 비해 색소침착 병변 표피에서 유의적으로 감소하였다 (p = 0.003). 반면에 UV에 노출된 색소침착 표피에서는 H19 RNA 발현 수준이 유사하였다 (도 1).

<실시예 2> H19와 IGF2 RNA 발현사이의 상호적 변화 확인

RT-PCR 을 확인하기 위해 실시간 PCR 을 이용한 정량분석이 수행되었다. 기미가 있는 14명의 모든 환자의 병변 부위에서 H19 RNA 발현은 일관되고 유의적인 감소를 보였다. 그러나 IGF2의 mRNA 발현은 14명의 환자 중 6명의 환자의 병변 부위에서만 증가되었다. IGF2 mRNA 는 병변 부위와 정상 부위 표본사이에서 유의적인 발현 차이가 없었다 (도 2).

기미 병변 부위에서 H19와 IGF2 발현 사이의 상호적 변화는 없었으나, H19 프로모터의 복대립유전자 메틸화에 의한 후생적 침묵이 윌름스 종양 (Wilms tumor)과 이의 근접한 신장에서 발견된 점을 바탕으로 (Frevel et al., 1999), 기미를 가진 3명의 추가적인 환자에 중황산염 유전자 서열분석을 수행하였다. 모계 ICR의 H19 프로모터 지역에 위치한 12CpGs에서의 메틸화 패턴은 병변 부위에서 일관되지 않고 다양하였다 (도 3).

<실시예 3> 티로시나제 (tyrosinase)의 발현양 확인 결과

H19 발현저하는 두 종류의 siRNA, Stealth 243과 Stealth 472 에 의해 수행되었다. 실시간 PCR에서 두 종류의 siRNA 을 감염시킨 각질형성세포 (keratinocyte)에서의 H19 RNA 레벨은 음성 대조군 siRNA을 감염시킨 세포에 비해 유의적으로 낮았다 (각각 p<0.001, p<0.01) (도 4A).

H19 RNA 의 발현을 억제시킨 멜라닌 세포 단일재배는 뚜렷한 티로시나제 과발현을 보이지 않았다 (도 4B). H19로부터 유래된 microRNA 는 인간 각질형성세포에서 검출되기 때문에 (Cai and Cullen, 2007), in vitro 실험에서는 H19 RNA 의 발현이 억제된 정상인 각질형성세포와 정상 멜라닌 세포를 함께 배양한 혼합세포 배양 시스템을 이용하여 수행하였다. 물론 각질형성세포 단일재배에서는 H19 RNA 발현 억제와 상관없이 티로시나제의 발현이 확인되지 않았다 (도 4B). 두 개의 다른 H19 siRNA (Stealth 243, Stealth 472)로부터 나온 결과는 유사하였다.

H19 RNA 발현 억제는 실험기간 동안 (4, 24, 48시간) 혼합세포 배양에서 티로시나제 발현을 증가시켰으며, 배양 48시간일 때 최대 효과가 나타났다.

siRNA가 이식되지 않은 각질형성세포와 멜라닌 세포로 구성된 혼합세포배양액과 음성 대조군 siRNA 로 감염된 각질형성세포와 멜라닌 세포로 구성된 혼합세포배양액 사이에서는 티로시나제 발현레벨의 차이가 없었다. H19 RNA 발현 억제 48시간 후에 티로시나제 과발현은 통계적으로 유의성이 있었다 (p=0.007; 도 4C).

<실시예 4> H19 RNA 발현 억제에 의한 하위 신호경로

H19 RNA 발현 억제가 멜라닌 세포 (melanocyte) 단일배양에서는 Erk, Akt 및 CREB의 인산화를 야기시키지는 않았으나, 혼합세포 배양 (siRNA 가 이식된 각질형성세포와 정상 멜라닌 세포로 구성됨), 각질형성세포 (keratinocyte) 단일배양에서는 인산화시켰다 (도 5a). 두 개의 다른 H19 siRNA인 Stealth 243과 Stealth 472를 사용한 결과는 유사하였다. U0126, LY294002 및 H89를 사용하여 Erk, Akt, PKA 신호 경로를 특이적으로 억제시킨 경우에는 H19 RNA 가 억제된 혼합세포 배양에서 티로시나제 발현과 CREB 인산화가 저하되었다 (도 5b). 티로시나제 발현 저하는 LY294002보다 U0126과 H89 사용시 현저하였다 (도 5b).

<실시예 5> H19 RNA 발현억제에 의한 멜라노좀 전이의 증가

H19 RNA 발현억제에 따른 티로시나제 (tyrosinase) 발현증가는 혼합 세포 배양에서만 발견되었을 뿐, 멜라닌 세포 (melanocyte) 단일배양에서는 발견되지 않았기 때문에 (도 4A), 인근 각질형성세포로 (keratinocyte)의 멜라노좀 (melanosome) 전이가 색소침착을 일으키는 것으로 판단되었다. 따라서 멜라노좀 전이에 대한 H19 RNA 발현 억제의 효과를 실험하였다.

혼합세포 배양의 케라틴 14 (keratin 14)를 포함하는 각질형성세포에서, 멜라노좀 단백질 Trp-1의 항체를 사용하여 멜라노좀을 구별하였다. H19 RNA 발현이 억제되지 않은 경우와 비교해서 H19 RNA 발현이 억제된 많은 각질형성세포에서는 인근 멜라닌 세포부터 멜라노좀이 전이되었으며, 유의적인 차이가 있었다 (p=0.006) (도 6).

<실시예 6> 에스트로겐과 UV 조사에 따른 H19 발현 억제로 유도된 멜라닌 생성 증가여부 확인

임신은 자궁과 난소의 호르몬을 변화시키고 (Sodhi and Sausker, 1988), UV 노출은 기미를 야기시키는 요인으로 생각되어졌다. 따라서 혼합세포배양에서 에스트로겐 또는 UV 노출 존재여부에 따라 H19 RNA 발현 저하 효과를 조사하였다.

H19 RNA 발현 억제여부와 상관없이 0,10,100nM 의 에스트로겐 농도 하에서 티로시나제의 발현은 에스트로겐 농도 의존적으로 증가하였다.

H19 발현 억제와 함께 티로시나제 발현은 에스트로겐 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하였다 (p<0.05). 더욱이, 티로시나제 과발현은 H19 RNA의 발현이 억제되었을 때 더욱 증가하였고, 에스트로겐의 동일 농도하에서 H19 RNA 발현 억제 여부에 따라 티로시나제의 발현은 유의적인 차이가 있었다 (도 7a). 또한 Erk, CREB와 같은 신호 전달 물질의 인산화 또한 티로시나제 과발현과 함께 증가하였다 (도 7a).

전에 시행된 배양 세포의 UV 조사 실험을 바탕으로, 실험시 UV 조사 최적 양을 10mJ로 정하였다. UV 조사는 H19 RNA의 발현이 억제되지 않은 상태에서 티로시나제의 발현을 증가시켰으나, H19 RNA 발현이 억제된 상태에서는 별다른 효과가 발견되지 않았다. Erk 와 CREB 의 인산화도 티로시나제 발현과 유사한 패턴을 보였다 (도 7b).

Claims (7)

1. H19(Genbank Accession ID: AK123560) 마이크로RNA를 유효성분으로 함유하는 기미 생성 억제용 약학적 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 H19(Genbank Accession ID: AK123560) 마이크로RNA는 티로시나제의 발현 증가를 억제시키는 것을 특징으로 하는 기미 생성 억제용 약학적 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 H19 (Genbank Accession ID: AK123560) 마이크로RNA는 멜라노좀의 전이를 감소시키는 것을 특징으로 하는 기미 생성 억제용 약학적 조성물.
   
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 외용제인 것을 특징으로 하는 기미 생성 억제용 약학적 조성물.
   
6. 제 1항에 있어서, 상기 H19(Genbank Accession ID: AK123560) 마이크로RNA는 나노파티클 또는 마이크로니들을 사용하여 피부 내로 전달되는 것을 특징으로 하는 기미 생성 억제용 약학적 조성물.
   
7. H19(Genbank Accession ID: AK123560) 마이크로 RNA를 유효성분으로 포함하는, 기미 발생 억제용 화장료 조성물.

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