KR101375783B1 - 백반증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GDF-15의 발현을 억제하거나 증가시키는 것을 특징으로 하는 멜라닌의 생성을 조절하는 방법, 및 이를 이용한 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 백반증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 GDF-15를 이용한 멜라닌 생성을 조절하는 방법은, GDF-15의 발현 또는 활성을 억제함으로써 티로시나아제의 활성을 억제하여 멜라닌의 생성을 저해하거나, GDF-15의 발현을 증가시킴으로써 멜라닌의 생성을 증가시켜 피부의 색소관련 질환인 기미나 백반증을 효과적으로 개선할 수 있는 효과가 있다.

Description

백반증 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing and treating vitiligo}

본 발명은 GDF-15의 발현을 억제하거나 증가시키는 것을 특징으로 하는 멜라닌의 생합성을 조절하는 방법, 및 이를 이용한 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 백반증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

피부의 색을 조절하는 기전으로서 멜라닌 생성의 화학적 및 효소적 기초에 대한 지식은 잘 알려져 있다. 멜라닌세포(melanocyte)는 그것들이 분비한 입자인 멜라닌을 생산하는 멜라노좀을 생산하기 위해 배아신경 크레스트(embryonal neural crest)로부터 피부로 이동한다. 멜라닌 생성에서 핵심적 효소는 티로시나제(tyrosinase)이며, 이것은 티로신을 생 고분자 멜라닌으로 전환시키는 반응 케스케이드를 일으킨다. 두 개의 티로시나제-관련 단백질(TRP's)로는 TRP-1과 TRP-2가 알려져 있으며, 이들 단백질은 티로시나제와 약 40%의 동족관계(homology)를 공유하고 멜라닌 생성에 있어서 조절 역할 뿐만 아니라 촉매 활성을 갖는다.

상기 멜라닌은 상기 효소들이 분포하고 있는 멜라노좀(melanosome)이라는 소기관 내에서 일어나고, 멜라닌을 포함하고 있는 멜라노좀은 후에 멜라닌세포 수상돌기(dendrites)를 통해 각질형성세포(keratinocyte)로 전달된다. 이렇게 각질형성세포로 전달된 멜라닌이 실제로 피부색을 결정하는 중요한 요소가 된다.

멜라닌 생성에 관계된 주요 효소가 티로시나제인 것처럼 생성된 멜라노좀을 멜라닌 생성세포의 수상돌기로 이동시키는데도 주요 구성체들이 존재한다. 이들은 MTC(Melanosome transport complex)라고 불리며, 멜라노필린(Melanophilin), Rab27a, 및 미오신(Myosin) 5a 세가지 단백질로 구성되어 있다. 상기 Rab27a는 멜라노좀의 표면에 결합하여 멜라노좀을 인지하고 이동시키는 운반체역할을 하는 단백질로서 말단으로 이동하기 위해서는 세포내 세포골격(cytoskeleton)인 미오신 5a 단백질을 만나야 하며, 중간에서 이 두 단백질을 인지하고 연결시키는 어뎁터(adapter)역할을 하는 것이 바로 멜라노필린(melanophilin)이라는 단백질이다. 이렇게 세 구성체가 만나 복합체(complex)를 이루면, 멜라노좀을 세포 말단으로 정상적으로 이동이 가능하고 궁극에는 각질형성세포로 까지 전달이 가능해진다.

한편, 사람의 신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선에 의한 피부손상 저해에 중요한 역할을 담당하며, 또한, 멜라닌의 과잉 합성 및 축적은 피부에 기미, 주근깨 및 노인성 흑자 등 심각한 미적 문제를 일으킬 뿐만 아니라, 피부노화를 촉진하며 각종 피부암을 유발하기도 한다. 이때, 멜라닌 세포는 그 성장에 미토겐(mitogen)이 요구되는 서서히 성장하는 세포로써, SCF(Grabbe et al., 1994), 기초 섬유아세포 성장 인자(bFGF) (Halaban et al., 1987), 소 뇌하수체 추출물(Wilkins et al., 1985), TPA(Krasagakis et al., 1993), 및 cAMP 자극 작용제를 포함하는 몇 가지 인자들이 in vitro의 사용에서 멜라닌 세포를 증식시킨다는 것이 공지되어 있지만, 임상적으로 사용될 수 있는 미토겐은 매우 드물다.

또한, 멜라닌 세포의 이동(migration)은 백반(vitiligo)의 재색소침착 (repigmentation)을 일으킬 수 있다. 색소침착은 멜라닌 세포가 증식하거나, 또는 멜라닌 생성 (malanogenesis)의 결과일 수 있다(Lan et al., 2005).

상기 멜라닌 세포 이동 또는 멜라닌 생성은 매우 복잡한 과정이며, 서로 다른 클래스(class)의 미토겐이 멜라닌 세포의 성장을 적절하게 자극할 수 있기 때문에, 정상 멜라닌 세포의 성장은 다양한 미토겐을 요구한다 (Abdel-Malek et al., 1992; Eisinger and Marko, 1982; Halaban et al., 1986). 따라서, 이들 미토겐들이 증식 및/또는 멜라닌 생성에 서로 영향을 미치는 것으로 볼 수 있는데, bFGF 또는 TPA 단독으로는 최적의 멜라닌 세포 증식을 유도하지 못하였고, a-MSH 와의 결합(Swope et al., 1995) 또는 CT 및/또는 IBMX와의 결합(Abdel-Malek et al., 1992) 각각이 이들의 미토겐성 효과를 증가시켰다.

한편, 백반증은 멜라노 사이트의 사멸 또는 괴사로 인한 여러 가지 크기 및 형태의 백색반이 피부에 나타나는 후천성 탈색소 질환으로, 전 세계적으로 인구의 약 1%에서 나타나는 비교적 흔한 질환으로, 인종이나 지역에 따른 차이는 없다. 발생 연령은 10~30세에서 가장 많고, 95%의 경우 40세 이전에 발병하고, 환자의 30%에서 가족력이 있다. 이러한, 백반증은 초기에는 탈색 정도가 뚜렷하지 않으나 시간이 경과하면서 뚜렷해지는 경우가 많으며, 정상 피부와의 경계가 뚜렷하지 않을 수도 있으나, 정상 피부색보다 진하면서 뚜렷하게 나타날 수 있고, 드물게는 가려움을 느끼기도 한다. 털이 있는 부위, 특히 머리카락, 눈썹부위에 흰 반점이 나타나는 경우는 흰 털이 자라기도 한다. 또한, 백반증은 피부의 어디에나 발병할 수 있으나, 특히 손가락, 발가락, 무릎, 팔꿈치 등의 뼈가 돌출한 부위, 입주위, 코주위, 눈주위, 겨드랑이, 손목 안쪽 등에서 자주 발생한다. 또한, 백반증은 상처가 쉽게 생기는 부위에서 특히 잘 발생하고, 좌우 대칭적이거나, 신경에 따른 분포를 보이기도 한다. 또한, 백반증은 단순히 피부에 흰 반점이 나타나는 경우 외에 눈의 홍채와 망막의 색소이상을 동반할 수 있으며, 당뇨병, 악성 빈혈, 갑상선 기능 저하 또는 항진, 다운 증후군, 담즙성 간경변, 위암, 아디손병, 원형탈모증, 홍반성 낭창 등의 자가면역질환과 병발할 수 있다.

따라서, 이러한 백반증을 치료하기 위해 그간 많은 연구 및 실험이 있어 왔으며, 그 결과 현재 많이 이용되고 있는 백반증 치료방법에는 소랄렌(psoralen) 자외선 요법, 스테로이드의 국소 및 전신 치료, 외과적 치료 등이 있다. 소랄렌 자외선 요법은 광화학 요법이라 칭하며, 소랄렌을 복용한 후 전신적인 자외선 조사를 하거나 소랄렌을 바른 후 부분적으로 자외선을 조사하는 것이다. 이는 장기적인 치료가 필요하므로 자외선 조사에 의한 피부 노화나 피부암의 발생 위험이 있다. 스테로이드 치료는 병변 부위가 적을 때는 국소 도포나 트리암시놀론을 이용한 국소 주사를 시행하고, 광범위하게 퍼져 있으면 전신 투여를 시행한다. 이 또한 장기적인 치료를 요하므로 피부 및 전신적인 부작용을 유발할 위험이 있다. 또한, 외과적 치료는 수술에 의해 멜라노사이트를 이식하는 방법으로, 피부 이식과 세포 이식으로 나눌 수 있으며, 피부 이식을 위해서는 전층, 중간층 및 표피 이식이 사용되고 있다. 이러한 방법은 항상 사용될 수 있는 방법이 아니고 병변이 수년간 번지지 않은 경우에만 사용할 수 있으며, 가장 일반적으로 사용되고 있는 방법인 스테로이드 외용제를 이용한 치료의 경우, 이를 장기간 사용하게 되면 피부 수축을 포함한 심각한 부작용이 나타나게 되므로, 이를 해결하기 위한 방법이 절실히 필요한 실정이다.

또한, 다른 주된 피부 질환인 기미는 피부의 색소과다침착에 의해 발생하며 미용상의 여러 가지 문제를 야기하는데 이러한 미용상의 문제를 해결하기 위해 다양한 방법 즉, 화학적인 필링, 레이저를 이용한 방법, 아부틴, 코직산 등을 이용한 방법들이 많이 이용되지만, 소비자들의 욕구를 만족시켜 줄만한 효능을 기대하기 어렵거나 또는 부작용이 심하여 큰 문제를 야기하는 경우가 많다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 직접적으로 멜라닌의 생합성을 조절하여 백반증이나 기미같은 질환을 치료하기 위한 연구가 진행되고 있으나 색소침착 등을 개선할 수 있는 획기적인 방법에 대한 보고는 거의 없다.

이처럼 멜라닌의 생성을 조절할 수 있다면 피부 색소 과다침착으로 생기는 기미나 정상적인 피부색을 나타내지 못하는 백반증을 치료할 수 있으므로, 기존 치료를 대체할 수 있는 멜라닌의 생성을 조절할 수 있는 타깃 물질에 대한 연구가 필요하다.

본 발명자는 기존의 기미 또는 백반증 치료를 대체할 수 있는 새로운 색소 형성 과정의 타깃에 대하여 연구하던 중, GDF-15의 발현을 억제하거나 증가시킴으로써 멜라닌의 생성을 조절할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 GDF-15의 발현을 억제하거나 증가시킴으로써 멜라닌의 생성을 조절하는 방법, 및 이를 이용한 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 백반증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 GDF-15(growth differentiation factor-15) 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 GDF-15을 유효성분으로 포함하는 백반증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 GDF-15의 발현을 억제하거나 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는, 멜라닌 생성 조절방법을 제공한다.

본 발명에 따른 GDF-15을 이용한 멜라닌 생성을 조절하는 방법은 GDF-15의 발현 또는 활성을 억제함으로써 티로시나아제의 활성을 억제하여 멜라닌의 생성을 저해하거나, GDF-15의 발현을 증가시킴으로써 멜라닌의 생성을 증가시켜 피부의 색소관련 질환인 기미나 백반증을 효과적으로 개선할 수 있다.

도 1은 SK-MEL-2 인간멜라노마 세포에 히스타민을 0.1, 1 , 10, 20 μM씩 처리한 후, 멜라닌 생성(Melanogenesis) 관련 단백질인 TRP-1, TRP-2, 티로시나아제(tyrosinase)와 GDF-15의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 GDF-15의 유전자를 유전자 특이적 siRNA로 억제시키고, GDF-15 유전자가 효과적으로 억제되는지(a)를 확인하고, 이를 통해 멜라닌의 생성이 억제되는 결과(b)를 나타낸 도이다.
도 3은 GDF-15 유전자 발현 억제에 의하여, 티로시나아제(a), TRP-1, TRP-2의 발현(b)이 감소되는지 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 GDF-15 특이적 siRNA로 형질감염된 SK-MEL-2 인간멜라노마 세포의 이동성 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 GDF-15의 과발현을 유도한 SK-MEL-2 인간멜라노마 세포에서 멜라닌 생합성 증가(a)와 SK-MEL-2 인간멜라노마 세포의 이동성의 증가(b)확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 GDF-15(growth differentiation factor-15)의 발현을 억제하거나 증가시키는 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 조절방법을 제공한다.

상기 GDF-15는 형질전환 성장 인자-β 사이토카인 슈퍼패밀리의 한 구성원으로서, 처음에 대식세포-억제 사이토카인-1(MIC-1)으로서 규명되었고, 후에 태반 형질전환 성장인자-β로서도 명명되었다(Bootcov 1997, Proc Natl Acad Sci 94:11514-11519; Tan 2000, Proc Natl AcadSci 97:109-114). 또한, GDF-15는 정상 멜라닌 세포에 비해 멜라노마에서 과다 발현되어 있고 전이성 멜라노마 조직의 생검에서도 높게 발현되는 것이 최근 보고되었다.

상기 GDF-15의 발현 억제 또는 증가는 GDF 유전자 특이적 발현 또는 활성 억제제를 이용하거나 GDF-15 유전자를 멜라닌 세포에 도입함으로써 과발현을 유도하는 방법을 이용할 수 있으며 유전자 또는 단백질의 발현을 조절하는 당업계에 공지된 방법을 제한없이 이용할 수 있다.

본 발명은 GDF-15(growth differentiation factor-15) 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 기미 예방 또는 개선용 화장료 조성물은 GDF-15의 발현 또는 활성을 억제함으로써 티로시나아제의 활성을 억제하여 멜라닌의 생성을 저해하여 과다색소침착으로 인한 기미를 예방 또는 개선할 수 있다.

상기 GDF-15 발현 억제제는 GDF-15 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA(short interfering RNA) 및 shRNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

상기 GDF-15 활성 억제제는 GDF-15 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체(mimetics), 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

상기 GDF-15 유전자 특이적 siRNA는 바람직하게는 서열번호 1(5'-ACAUGCACGCGCAGAUCAATT-3) 또는 서열번호 2(5'-UUGAUCUGCGCGUGCAUGUTT-3)의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 기미는 주로 뺨, 이마, 코, 턱 등 얼굴의 중심부위에 연한 갈색이나 암갈색 심지어는 검은색의 색소과다침착 병변이 발생하는 것을 말한다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 GDF-15 발현 억제제 또는 활성 억제제 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 본 발명에 따른 GDF-15 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하며, 스킨, 로션, 에센스, 영양 크림, 맛사지 크림 및 클렌징 크림과 같은 각종 크림, 클렌징 폼, 비누, 자외선 차단제 및 팩 등의 기초 화장료 및 파우더, 파운데이션 및 메이크업 베이스를 비롯한 색조 화장료 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 GDF-15 발현 억제제 또는 활성 억제제 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다 이때 조성물의 분포를 용이하게 하기 위하여, 조성 내 활성성분에 대한 희석제, 분산제 또는 운반체로서 작용하는, 화장료 조성물에 허용되는 각종 부형제를 포함할 수도 있다. 수분 이외의 부형제 또는 수분을 포함하는 부형제로는 액체 또는 고체 형태의 피부연화제, 용매, 습윤제, 유지성분, 에몰리언트제, 계면활성제, 유기 및 무기 안료, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, pH 조정제, 향료, 증점제 또는 분말 등을 포함할 수도 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물에서 GDF-15 발현 억제제 또는 활성 억제제는 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.01~5중량%로 함유되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 GDF-15(growth differentiation factor-15)을 유효성분으로 포함하는 백반증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 백반증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 GDF-15를 과발현시킴으로써 멜라닌의 생성을 증가시켜 피부의 색소관련 질환인 백반증을 효과적으로 개선할 수 있다.

상기 백반증은 후천적으로 멜라닌세포가 죽음으로써 피부색이 하얗게 변하는 질환으로 인종과 성별에 차이가 없이 전 세계 인구의 약 1-2%에서 발생되는 비교적 흔한 질환이다. 발생되는 연령이 정해져 있지는 않으나 환자의 반 이상이 20세 이전에 나타나고, 얼굴이나 손과 같이 의복에 의해 가려지지 않는 부위, 사타구니나 겨드랑이 같이 피부가 접히는 부위, 팔꿈치, 무릎 및 손관절 같이 돌출한 뼈 위의 피부, 입이나 코 같이 신체의 구멍 주위에 잘 생긴다. 대개 죄우 대칭으로 나타나나 신경절을 따라 좌우 한쪽에만 있을 수 있고 한곳 또는 몇몇 부위에만 국한되는 경우도 있으며, 드물게는 피부의 거의 대부분이 하얗게 되기도 한다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 GDF-15 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

예를 들어 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 텍스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 액상제제에는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 나이, 성별 체중에 따라 달라질 수 있으나 0.001 내지 100mg/kg으로 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 히스타민에 의한 GDF -15 및 티로시나아제 발현 증가 확인

SK-MEL-2 인간 멜라노마 (human melanoma) 세포는 한국세포주은행 (Korean Cell line Bank)에서 분양받아 사용하였다. 이하, 세포배양을 위하여 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)과 100 units/의 페니실린-스트렙토마이신 (100 units/의 antibiotic-antimycotic)이 포함되어 있는 DMEM(dulbecco's modified eagle's medium)을 사용하였다.

SK-MEL-2 인간멜라노마 세포를 6 웰 플레이트에 배양하고 히스타민을 농도별로 0.1, 1 , 10, 20 μM씩 가하였다. 24시간 후 전체 세포추출액을 준비하여 4-12% SDS-PAGE로 분석하였다. 멜라닌 생성(melanogenesis) 관련 단백질인 TRP-1, TRP-2, 티로시나아제(tyrosinase)와 GDF-15의 발현을 웨스턴 블랏으로 분석하였다.

결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 히스타민을 SK-MEL-2 인간멜라노마 세포에 처리한 결과, 멜라닌 생합성과 관련된 TRP-1, TRP-2, 티로시나아제, GDF-15의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. GDF -15 특이적 siRNA 처리시, 멜라닌생성 억제 확인

히스타민에 의해 GDF-15의 과발현이 유도되고, 멜라닌 생성이 촉진되므로 과발현된 GDF-15의 유전자를 유전자 특이적 siRNA로 억제하는 경우 멜라닌 생성이 억제되는지 여부를 확인하였다. GDF-15 유전자 특이적 siRNA는 하기 표1의 서열을 사용하였다.

GDF-15 특이적 siRNA 서열

서열번호	서열	특징
1	5'-ACAUGCACGCGCAGAUCAATT-3	siRNA for GDF-15
2	5'-UUGAUCUGCGCGUGCAUGUTT-3	siRNA for GDF-15

상기 서열번호 1 및 2를 리포펙타민 RNAiMAX(invitrogen)을 이용하여 SK-MEL-2 인간멜라노마 세포 안으로 도입하였다. 48시간 뒤에 세포 총 추출액에서 멜라닌의 생성량을 측정하였다. 또한 멜라닌 세포에 상기 siRNA를 처리하여 멜라닌 형성과정을 나타내는 수지상세포(dendrocyte)의 형성이 감소되는지 광학현미경을 통해 확인하였다.

결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이 GDF-15 특이적 siRNA를 처리하자 GDF-15의 발현이 효과적으로 억제되었으며(a), 히스타민 처리에 의해 증가되었던 멜라닌의 생성이 감소하였음을 확인하였다(b). 따라서, GDF-15의 발현을 조절함으로써 멜라닌의 생합성을 조절할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 3. GDF -15 특이적 siRNA 처리에 의한, 티로시나아제 활성 억제 및 TRP-1, TRP -2 발현 감소

GDF-15 유전자 발현의 억제에 의하여, 멜라닌 생합성에 관여하는 티로시나아제와 TRP-1, TRP-2 발현도 감소되는지 웨스턴 블랏으로 확인하였다. SK-MEL-2 인간멜라노마 세포를 GDF-15 특이적 si-RNA로 48시간 동안 형질감염시켰다. SK-MEL-2 인간멜라노마 세포에 히스타민을 10mM로 처리하고 24 시간 배양하여 멜라닌의 생합성을 유도하였다. 히스타민 처리 24시간 후, 전체 세포추출액을 얻었으며, 이를 4-12%의 SDS-PAGE로 분석하였다.

결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, GDF-15의 발현을 억제함으로써 멜라닌 생합성에 관여하는 티로시나아제(a)와 이와 관련된 단백질인 TRP-1, TRP-2 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(b)

실시예 4. GDF -15 특이적 siRNA 처리에 의한, 멜라노마 세포의 이동성 감소

SK-MEL-2 인간멜라노마 세포를 GDF-15 특이적 siRNA로 48시간 동안 형질감염시켰다. Boyden Chamber Kit를 사용하여 형질감염된 SK-MEL-2 세포의 이동성을 조사하였다. Lower 챔버의 트렌스웰 삽입부(transwell insert)를 피브로넥틴(fibronectin) 10 mg/ml로 코팅하고 SK-MEL-2 인간멜라노마 세포들을 웰 당 5X10⁴ 개 가한 후 히스타민 10mM을 처리하였다. SK-MEL-2 세포 배양 후 삽입부의 바닥에 붙어 있는 세포들을 Diff-quick으로 고정하고 4 개 이상의 부위에서 무작위적으로 세포의 수를 세었다.

결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 히스타민 처리에 의해 유도된 SK-MEL-2 인간 멜라노마 세포의 이동성 증가는 GDF-15 특이적 siRNA를 처리함에 의해서 히스타민 처리 이전과 비슷한 수준으로 억제되었다.

실시예 5. GDF -15 과발현 유도에 의한 멜라닌 생합성 증가 및 멜라노마 세포 이동성 증가 확인

SK-MEL-2 인간멜라노마 세포(5 x 10⁴/6 웰) 에 GDF-15 유전자를 가지고 있는 플라스미드를 형질감염시켰다. 형질감염된 SK-MEL-2 인간멜라노마 세포에 히스타민(10 μM)을 가한 후 멜라닌의 생성량을 측정하고 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 SK-MEL-2 세포의 이동성을 확인하였다.

결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이 히스타민을 처리한 세포뿐만 아니라 GDF-15로 형질감염을 시킨 SK-MEL-2 세포에서도 유의성 있는 멜라닌 생성의 증가를 확인할 수 있었다(a). 또한 GDF-15로 형질감염된 SK-MEL-2 세포에서 유의성 있는 SK-MEL-2 세포의 이동성 증가를 확인하였다(b). 따라서, 멜라노마 세포에서 GDF-15의 과발현은 멜라닌 생성을 증가시키고 멜라노마 세포의 이동성을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.

제제예1 . 화장료 제제

1.1 유연화장수(스킨로션) (단위: 중량%)

GDF-15 발현 억제제 또는 활성 억제제 0.1~0.2

부틸렌글리콜 2.0

프로필렌글리콜 2.0

카르복시비닐폴리머 0.1

피이지-12 노닐페닐에테르 0.2

폴리솔베이트 80 0.4

에탄올 10.0

트리에탄올아민 0.1

방부제, 색소, 향료 적량

1.2 영양화장수( 밀크로션 ) (단위: 중량%)

GDF-15 발현 억제제 또는 활성 억제제 0.1~0.2

밀납 4.0

폴리솔베이트 60 1.5

솔비탄세스퀴올레이트 1.5

유동파라핀 0.5

카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0

글리세린 3.0

부틸렌글리콜 3.0

프로필렌글리콜 3.0

카르복시비닐폴리머 0.1

트리에탄올아민 0.2

방부제, 색소, 향료 적량

제제예 2. 약학적 제제

2.1 산제의 제조

GDF-15: 2g

유당: 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2.2 정제의 제조

GDF-15: 100mg

옥수수전분: 100㎎

유 당: 100㎎

스테아르산 마그네슘: 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

2.3 캡슐제의 제조

GDF-15: 100㎎

옥수수전분: 100㎎

유 당: 100㎎

스테아르산 마그네슘: 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (2)

1. GDF-15(growth differentiation factor-15)을 유효성분으로 포함하는 백반증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 GDF-15는 멜라닌의 생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 백반증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   

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