KR101190815B1

KR101190815B1 - 세로토닌을 유효성분으로 포함하는 백반증 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101190815B1
Application number: KR1020100040294A
Authority: KR
Inventors: 이창훈; 이애영; 이혜자; 박미경
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-04-29
Filing date: 2010-04-29
Publication date: 2012-10-12
Also published as: KR20110120739A; WO2011136561A3; WO2011136561A2

Abstract

본 발명은 세로토닌 또는 그 유도체를 유효성분으로 포함하는 백반증 예방 또는 치료용 조성물 및 색소 침착 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 세로토닌은 세로토닌 수용체 2A 를 통해서 멜라닌 생합성의 증가 및 멜라닌 세포의 이동을 촉진시킴으로써 백반증 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 세로토닌 수용체 2A 특이적으로 멜라닌 생합성을 증진시키거나 억제할 수 있는 물질을 개발할 수 있다.

Description

세로토닌을 유효성분으로 포함하는 백반증 치료용 조성물 {A composition for treating vitiligo comprising Serotonin}

본 발명은 백반증의 예방 또는 치료용 조성물 및 색소침착 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 세로토닌 (serotonin)을 유효성분으로 포함하는 백반증 예방 또는 치료용 조성물 및 세로토닌과 세로토닌 수용체 2A를 이용한 색소침착 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

멜라닌 세포는 그 성장에 미토겐 (mitogen)이 요구되는 서서히 성장하는 세포이다. SCF (Grabbe et al., 1994), 기초 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) (Halaban et al., 1987), 소 뇌하수체 추출물 (Wilkins et al., 1985), TPA (Krasagakis et al., 1993) 및 cAMP 자극 작용제를 포함하는 몇 가지 인자들이 인 비트로의 사용에서 멜라닌 세포를 증식시킨다는 것이 공지되어 있지만, 임상적으로 사용될 수 있는 미토겐은 매우 드물다.

멜라닌 세포의 이동 (migration)은 백반 (vitiligo)의 재색소침착 (repigmentation)을 일으킬 수 있지만, 색소침착은 멜라닌 세포가 증식하거나, 또는 멜라닌 생성 (malanogenesis)의 결과일 수 있다 (Lan et al., 2005).

미토겐성 및 멜라닌성 (melanogenic) 작용제를 비교해 보면, 그 메카니즘은 명확하지 않지만, 미토겐이 멜라노겐 (melanogen)으로서 작용할 수 있다는 것을 알 수 있다. 증식 또는 분화 어느 한쪽의 세포 최종 목적지는 조절 단백질들에 대한 세포 표면 수렴에서 개시되는 신호에 의존할 수 있다 (Bohm et al., 1995). 이러한 상황에서는 공통되는 표적이 존재할 수 있다. 사실, ET-1 및 bFGF로부터 멜라닌 세포 증식에서의 Erk 및 CREB의 순차적인 활성화 및 멜라닌 생성에서의 cAMP를 통한 CREB 활성화는 그 예시가 된다 (Tada et al., 2002). MITF 및 CREB 는 분화뿐만 아니라 증식에 대해서도 공통적인 하부 표적 (downstream targets)이 될 수 있다. 그러나 동일한 cAMP 자극 작용제는 미토겐 또는 멜라노겐으로서 작용할 수 있다 (Suzuki et al., 1996). 주요 멜라닌 전구체인 티로신의 높은 농도는 멜라닌 세포의 증식을 억제하지만 멜라닌 생성을 촉진하는데, 이는 티로신의 수준이 증식과 멜라닌성의 최종적으로 분화된 표현형 사이에 스위칭 메카니즘의 한 부분이 될 수 있다는 것을 암시한다는 보고가 있다 (Schwahn et al., 2001).

이상에서 살펴본 바와 같이, 멜라닌 세포 증식 또는 멜라닌 생성은 매우 복잡한 과정이며, 서로 다른 클래스 (class)의 미토겐이 멜라닌 세포의 성장을 적절하게 자극할 수 있기 때문에, 정상 멜라닌 세포의 성장은 다양한 미토겐을 요구한다 (Abdel-Malek et al., 1992; Eisinger and Marko, 1982; Halaban et al., 1986). 따라서, 이들 미토겐들이 증식 및/또는 멜라닌 생성에 서로 영향을 미치는 것으로 생각된다. 사실, bFGF 또는 TPA 단독으로는 최적의 멜라닌 세포 증식을 유도하지 못하였고, α-MSH 와의 결합 (Swope et al., 1995) 또는 CT 및/또는 IBMX와의 결합 (Abdel-Malek et al., 1992) 각각이 이들의 미토겐성 효과를 증가시켰다.

한편, 백반증은 멜라노사이트의 사멸 또는 괴사로 인한 여러 가지 크기 및 형태의 백색반이 피부에 나타나는 후천성 탈색소 질환이다. 전세계적으로 인구의 약 1%에서 나타나는 비교적 흔한 질환으로, 인종이나 지역에 따른 차이는 없다. 발생 연령은 10~30세에서 가장 많고, 95%의 경우 40세 이전에 발병하고, 환자의 30%에서 가족력이 있다.

백반증은 초기에는 탈색 정도가 뚜렷하지 않으나 시간이 경과하면서 뚜렷해지는 경우가 많으며, 정상 피부와의 경계가 뚜렷하지 않을 수도 있으나, 정상 피부색보다 진하면서 뚜렷하게 나타날 수 있다. 드물게는 가려움을 느끼기도 한다. 털이 있는 부위, 특히 머리카락, 눈썹부위에 흰반점이 나타나는 경우는 흰 털이 자라기도 한다. 백반증은 피부의 어디에나 발병할 수 있으나, 특히 손가락, 발가락, 무릎, 팔꿈치 등의 뼈가 돌출한 부위, 입주위, 코주위, 눈주위, 겨드랑이, 손목 안쪽 등에서 자주 발생한다. 상처가 쉽게 생기는 부위에서 특히 잘 발생한다. 백반증은 좌우대칭적이거나, 신경에 따른 분포를 보이기도 한다. 백반증은 단순히 피부에 흰반점이 나타나는 경우 외에 눈의 홍채와 망막의 색소이상을 동반할 수 있으며, 당뇨병, 악성 빈혈, 갑상선 기능 저하 또는 항진, 다운 증후군, 담즙성 간경변, 위암, 아디손병, 원형탈모증, 홍반성 낭창 등의 자가면역질환과 병발할 수 있다.

현재 일반적으로 이용되고 있는 백반증의 치료방법에는 소랄렌 (psoralen) 자외선 요법, 스테로이드의 국소 및 전신 치료, 외과적 치료 등이 있다. 소랄렌 자외선 요법은 광화학 요법이라 칭하며, 소랄렌을 복용한 후 전신적인 자외선 조사를 하거나 소랄렌을 바른 후 부분적으로 자외선을 조사하는 것이다. 이는 장기적인 치료가 필요하므로 자외선 조사에 의한 피부 노화나 피부암의 발생 위험이 있다. 스테로이드 치료는 병변 부위가 적을 때는 국소 도포나 트리암시놀론을 이용한 구소주사를 시행하고, 광범위하게 퍼져 있으면 전신 투여를 시행한다. 이 또한 장기적인 치료를 요하므로 피부 및 전신적인 부작용을 유발할 위험이 있다. 외과적 치료는 수술에 의해 멜라노사이트를 이식하는 방법으로, 피부 이식과 세포 이식으로 나눌 수 있으며, 피부 이식을 위해서는 전층, 증간층 및 표피 이식이 사용되고 있다. 이러한 방법은 항상 사용될 수 있는 방법이 아니고 병변이 수년간 번지지 않은 경우에만 사용할 수 있다.

상기 방법 중 가장 일반적으로 사용되고 있는 방법은 스테로이드 외용제를 이용한 치료인데, 이를 장기간 사용하게 되면 피부 수축을 포함한 부작용이 나타나게 되므로 이를 해결하기 위한 방법이 필요하다.

본 발명자들은 새로운 백반증 치료 약물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 세로토닌이 멜라닌 생합성을 촉진시킨다는 점을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은 백반증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 색소침착 억제제 및 색소침착 억제제를 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 세로토닌 (serotonin) 또는 그 유도체를 유효성분으로 포함하는 백반증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물에는 세로토닌 수용체 2A 효능제가 더 포함될 수 있다.

상기 세로토닌 수용체 2A 효능제는 (±)-2,5-디메톡시-4-이도암페타민 하이드로클로라이드 ((±)-2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine hydrochloride)인 것이 바람직하다.

상기 조성물은 연고제, 겔제, 크림제, 리니먼트제, 로션제 등으로 제형화 될 수 있다.

또한 본 발명은 (a) 세로토닌 또는 세로토닌 수용체 2A 효능제를 세포에 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 처리된 세포에 색소침착 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및 (c) 멜라닌 생합성이 감소되거나 세포의 증식을 억제하는 후보물질을 선별하는 단계; 를 포함하는 색소 침착 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

스크리닝하는 방법에 있어서, 상기 세포는 멜라닌 세포인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 세로토닌 수용체 2A 길항제를 유효성분으로 포함하는 색소침착 억제용 조성물을 제공한다.

상기 세로토닌 수용체 2A 길항제는 케탄세린 (ketanserin) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 의하면 부작용 없이 세로토닌 또는 세로토닌 수용체 2A 를 이용하여 백반증 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 세로토닌 수용체 2A 특이적으로 멜라닌 생합성을 증진시키거나 억제할 수 있는 물질개발이 가능하게 된다.

도 1은 세로토닌을 멜라노마 세포주와 멜라닌 세포에 처리시, 멜라닌의 생합성이 증가되는 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 세로토닌을 멜라노마 세포주에 처리시, 세포질 내 멜라닌 침착이 증가되는 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 세로토닌을 멜라닌 세포에 처리시, 세포돌기 형성의 증가 및 세포질내 멜라닌 침착이 증가되는 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 세로토닌을 멜라노마 세포주에 처리시, 멜라노마 세포의 이동이 증가되는 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 세로토닌 효능제 및 길항제를 멜라노마 세포주에 처리시, 세로토닌 수용체 2A가 관여하는 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 세로토닌 또는 그 유도체를 유효성분으로 포함하는 백반증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 세로토닌 (serotonin) 이란, 뇌 시상 하부에서 분비되는 신경 전달물질로, 화학식은 C₁₀H₁₂N₂₀, 분자량은 176.22 이다. 트립토판에서 유도된 화학물질로 5-히드록시트립타민 (5-HT) 이라고도 하며, 이것이 부족할 때는 우울증, 스트레스 증가, 폭식으로 인한 비만, 치매 등을 가져오게 된다.

본 발명의 일 실시예에서는, 세로토닌이 어떤 수용체를 통해서 멜라닌 합성을 촉진시키는지를 알아보기 위해서 세로토닌 수용체 1A, 2A, 3의 효능제를 멜라닌 세포에 처리하여 멜라닌 합성의 증가 여부를 확인하였다. 그 결과, 세로토닌 수용체 2A 효능제를 처리했을 때 멜라닌 생합성이 증가되었으며, 이 결과를 바탕으로 상기 조성물에는 세로토닌 2A 효능제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서는 공지된 세로토닌 2A 효능제라면 그 종류에 제한됨이 없이 사용이 가능하나, 바람직하게는 (±)-2,5-디메톡시-4-이도암페타민 하이드로클로라이드 ((±)-2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine hydrochloride)이다.

또한 본 발명은 세로토닌 수용체 2A 길항제 (antagonist) 를 포함하여 색소침착 억제용 조성물을 제공한다.

세로토닌 수용체 2A 길항제는 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어, 케탄세린 (Ketanserin) 을 포함할 수 있다.

상기 색소 침착 억제용 조성물은 피부 색소 침착 질환의 치료 및 예방용 조성물로 사용될 수 있다.

상기의 '피부 색소 침착 질환' 은 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 치유된 창상 부위에서 발견되는 염증 후 색소 침착이나 피부염의 증상으로 나타나는 과색소 침착 등이 포함된다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 담체를 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며, 여기에 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 백반증 병변에 직접 적용하는 것이 바람직하며, 통상적인 경피 투여용 제제로 제형화될 수 있다. 그러한 제제로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 연고제, 겔제, 크림제, 리니먼트제, 로션제 등이 포함된다.

본 발명의 경피 투여용 제제의 한 양태는 연고제로, 이 제제는 유효성분인 세로토닌과 당업계 공지된 바를 기초로 연고기제, 기타 첨가제 등을 적절히 배합 처리함으로써 제조할 수 있다. 연고기제는 예를 들면, 고급 지방산 또는 그의 에스테르류 (예, 아디프산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 아디프산에스테르, 미리스트산에스테르, 팔미트산에스테르, 세바스산디메틸, 라우르산헥실, 이소옥탄산세틸), 납류 (예, 경랍, 밀랍, 셀레신), 계면활성제 (예, 폴리옥시에틸렌알킬에테르인산에스테르), 고급 알코올(예, 세탄올, 스테아릴 알코올, 세토스테아릴알코올), 실리콘유 (예, 디메틸폴리실록산, 메틸페닐폴리실록산, 글리콜메틸폴리실록산, 실리콘글리콜폴리머), 탄화수소류 (예, 친수와세린, 백색와세린, 정제라놀린, 유동파라핀), 물, 보습제 (예, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 소르비톨), 감염방지제 등에서 적절히 선택하여 이용될 수 있다.

다른 양태는 겔제로, 이 제제는 유효성분인 세로토닌과 당업계 공지된 바를 기초로 겔 기제, 기타 첨가제 등을 적절히 배합 처리함으로써 제조할 수 있다. 겔 기제는 예를 들면, 저급 알코올 (예, 에탄올, 이소프로필알코올), 물, 겔화제 (예, 카르복시비닐중합체, 히드록시에틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산프로필렌글리콜에스테르), 중화제 (예, 트리에탄올아민, 디이소프로판올아민, 수산화나트륨), 계면활성제 (예, 세스퀴올레산소르비탄, 트레올레산소르비탄, 모노올레산소르비탄, 모노스테아르산소르비탄, 모노라우르산소르비탄, 모노스테아르산폴리에틸렌글리콘, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테트, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르), 감염방지제 등을 들 수 있으며, 이 들 중에서 적절히 선택할 수 있다.

또 다른 양태는 크림제로, 이 제제는 유효성분인 세로토닌 당업계 공지된 바를 기초로 크림 기제, 기타 첨가제 등을 적절히 배합 처리함으로써 제조할 수 있다. 크림 기제는 예를 들면, 고급 지방산 에스테르류 (예, 미르스트산에스테르, 팔미트산 에스테르, 세바스산디에틸, 라우르산헥실, 이소옥탄산세틸), 저급 알코올 (예, 에탄올, 이소프로판올), 탄수화물 (예, 유동파라핀, 스쿠알란), 다가알코올 (예, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜), 고급 알코올 (예, 2-헥실데칸올, 세탄올, 2-옥틸도데칸올), 유화제 (예, 폴리옥시에틸렌알킬에테르류, 지방산에스테르류, 폴리에틸렌글리콜지방산에스테르), 방부제 (예, 파라옥시벤조산에스테르), 감염 방지제 등을 들 수 있고, 이들 중에서 적절히 선택할 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 통상적인 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.

상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 유효성분의 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

또한 본 발명의 상기 색소침착 억제용 조성물은 화장료 조성물로서 사용될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 색소침착 억제를 통해 미백용 또는 기미, 주근깨, 흑색점 등의 개선 또는 예방을 위한 화장료로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부 외용제 또는 화장품 등으로 제형화될 수 있다. 상기 피부 외용제는 연고제, 경고제, 스프레이제, 현탁액, 유액, 크림, 젤 등을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서의 세로토닌 길항제 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 추가로 포함될 수 있다.

발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린싱인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 (a) 세로토닌 또는 세로토닌 수용체 2A 효능제를 세포에 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 처리된 세포에 색소침착 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및 (c) 멜라닌 생합성이 감소되거나 세포의 증식을 억제하는 후보물질을 선별하는 단계;

를 포함하는 색소 침착 억제제를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.

이 단계에서 이용될 수 있는 세포는 동물세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포, 가장 바람직하게는 인간의 멜라닌 세포이다. 상기 세포로서, 다양한 형태의 세포가 이용될 수 있다. 예를 들어, 즉시 분리된 세포, 초기 배양 (primary culture)된 세포 또는 암세포화된 세포주를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 초기 배양된 세포, 예컨대, 초기 배양된 멜라닌 세포가 이용된다.

억제제 후보물질을 세포에 처리하는 방법은 세포 배양액에 억제제 후보물질을 첨가하여 적합한 온도에서 항온배양 (incubation)하여 실시할 수 있다.

이 단계에서 세포에 처리될 수 있는 후보물질은, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함한다.

기존에 멜라닌 생합성을 유도하는 물질들은 비특이적으로 다양한 경로에 작용하여 멜라닌 생합성을 증가시켜 다양한 부작용을 야기하였으나, 본 발명의 색소침착 억제제 스크리닝 방법은 세로토닌 수용체 2A만을 조절하여 멜라닌 생합성을 유도한다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 세포배양

B16F10 마우스 멜라노마 (mouse melanoma) 세포 및 SK-MEL-2 인간 멜라노마 (human melanoma) 세포는 한국세포주은행 (Korean Cell line Bank)에서 분양받아 실험에 사용하였다. 세포배양을 위하여 10 % 소 태아 혈청 (fetal bovine serum; FBS)와 100 units/㎖의 페니실린-스트렙토마이신 (100 units/㎖의 antibiotic-antimycotic) 이 포함되어 있는 Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)을 사용하였다.

Melan-a 마우스 멜라닌 (melanocyte) 세포는 동국대학교 이영애교수님으로부터 분양받아 실험에 사용하였다. 세포배양을 위하여 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum; FBS), 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신 (100 units/㎖의 antibiotic-antimycotic), 그리고 200 nM 12-O-Tetradecanoylphorbol-13 -acetate (PMA)가 포함되어 있는 RPMI1640 배지를 이용하였다. 세포배양은 37℃ 의 온도와 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다.

실험예 1. 멜라닌 생합성에 미치는 영향

Melanoma (피부 흑색종) 세포의 배지 조성을 10% FBS 가 들어있는 배지에서 5% FBS 가 들어있는 조건으로 2~3일 배양할 경우 멜라닌 생성이 급격히 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, Melan-a 세포의 배지조성 중 PMA를 제거하고 2~3일 배양할 경우 멜라닌 생성이 급격히 감소되는 것을 관찰할 수 있다. 따라서 이후 모든 실험의 진행은 5% FBS 와 100 units/ml의 항생제-항진균제 (antibiotic-antimycotic)가 포함되어 있는 DMEM 배지에서 수행되었다.

B16F10 세포 및 SK-MEL-2 세포, 그리고 Melan-a 세포를 6 웰 플레이트 (well plate) 에 각각 5×10⁴ 개가 되도록 넣고, 24시간 전배양하였다. 전 배양 후 5% FBS 가 포함되어 있는 성장배지에 약물을 농도별로 처리하고 72 시간 배양해주었다. 배양이 끝난 후, 세포를 2~3회 PBS (phosphate buffered saline)로 세척 후 10% DMSO가 포함되어 있는 1N NaOH 200 ul 에 녹이고 80℃에서 1시간 가열해주었다. 이후 ELISA 판독기 (reader)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정한 후 결과는 대조군의 흡광도 값과 비교하여 백분율로 나타내주었다.

그 결과, B16F10 세포 및 SK-MEL-2 세포에 세로토닌을 농도별 (1, 10, 100 uM)로 처리하여 2~3일 배양하였을 때 농도 의존적으로 세포내 멜라닌 생합성양이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 1의 A, B 참고). 또한, Melan-a 세포에 세로토닌을 농도별 (10, 100 uM)로 처리하여 2~3일 배양하였을 때 농도 의존적으로 세포내 멜라닌 생합성양이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 1의 C, D 참고).

실험예 2. 세포질내 멜라닌 침착 및 세포형태변화에 미치는 영향

잘 분화된 멜라닌 세포는 멜라닌 합성이 활발하여 멜라닌 소체 (melanosome)가 잘 발달되어 있으며, 많은 세포돌기를 가진다 (Yoon et al., 1997).

SK-MEL-2 인간 멜라노마 세포 및 Melan-a 멜라닌세포를 6 웰 플레이트 (well plate) 에 각각 5×10⁴ 개가 되도록 넣고, 24시간 전배양해주었다. 전 배양 후 5% FBS가 포함되어 있는 성장배지에 세로토닌을 농도별 (10, 100, 200 uM)로 처리하고 72시간 배양해주었다. 현미경하 (Real time image system under Zeiss microscope (100배 배율))에서 관찰, 사진 촬영하였다.

그 결과, SK-MEL-2 세포에서는 세로토닌 처리에 의한 세포형태 변화는 관찰되지 않았으나, 세포질내에 멜라닌 생성이 침착되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 2 참고). Melan-a 세포에서는 세로토닌 처리에 의해 세포질 내 멜라닌 침착이 증가되었으며, 세포돌기 형성 또한 증가되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 3 참고).

실험예 3. 세포이동에 미치는 영향

백반증에서 멜라닌 세포 손실의 원인은 명확하지 않으나 많은 연구들이 멜라닌 세포의 소실이 백반증의 원인이라고 추정하고 있다. 이러한 연구들 중에서 멜라닌세포의 접착과 이동 능력의 결여가 백반증의 원인 중 하나라는 보고가 있다 (Morelli et al ., 1993).

세포이동능력을 알아보기 위하여, 트렌스 웰 (transwells)의 뒷면에 피브로넥틴 (fibronectin (10 ug/ml))을 이용하여 코팅 (coating) 하고 24 시간 실온에서 배양해주었다. 다음날, 아래 챔버 (chamber)에 세로토닌을 농도별 (10, 50, 100 uM)로 처리하여 넣고, 위 챔버에 SK-MEL-2 인간 멜라노마 세포를 넣은 후 37℃ 의 온도와 5% CO₂ 조건하에서 5시간 배양해주었다. 배양이 끝난 후, 필터 (filter)의 뒷면으로 이동한 세포를 Diff-quick을 이용하여 고정, 염색해 준 후 현미경하 (Real time image system under Zeiss microscope (100배 배율))에서 관찰, 사진 촬영하였다.

그 결과, SK-MEL-2 인간 멜라노마 세포에 세로토닌을 농도별로 처리하였을 경우 농도 의존적으로 세포이동이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 4 참고).

실험예 4. 세로토닌 수용체 2A 효능제 (agonist) 및 길항제 (antagonist)가 멜라닌 생합성에 미치는 영향

세로토닌이 어떤 수용체를 통하여 멜라닌 생성을 촉진시키는지를 알아보기 위해서 세로토닌 수용체 1A, 2A, 3의 효능제를 SK-MEL-2 멜라노마 세포에 처리하여 멜라닌 생성의 증가 여부를 확인하였다. 사용되는 효능제는 (±)-2,5-디메톡시-4-이도암페타민 하이드로클로라이드 ((±)-2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine hydrochloride; (R)-DOI) 일 수 있으며, 종류는 한정되지 않는다. 그 결과, 세로토닌 수용체 2A 효능제를 처리했을 때 멜라닌 생합성이 증가되었으며 (도 5-A 참고), 농도별 (1, 5, 10, 20 uM)로 처리하였을 때 농도 의존적으로 증가되는 것을 관찰 할 수 있었다 (도 5-B 참고).

또한, 세로토닌 수용체 2A 길항제를 농도별로 처리하여 세로토닌에 의해 증가된 멜라닌 생성양을 줄일 수 있는지를 확인하였다. 사용되는 길항제는 케탄세린 (ketanserin) 일 수 있으나, 그 종류는 한정되지 않는다. 그 결과, 길항제 농도 의존적으로 (1, 5, 10 uM) 세로토닌에 의해 증가된 멜라닌 생성을 줄이는 것을 관찰 할 수 있었다 (도 5-C 참고).

Claims

세로토닌을 유효성분으로 포함하는 백반증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
(±)-2,5-디메톡시-4-이도암페타민 하이드로클로라이드 ((±)-2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine hydrochloride)를 포함하는 세로토닌 수용체 2A 효능제(agonist)를 유효성분으로 포함하는 백반증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 조성물은 연고제, 겔제, 크림제, 리니먼트제, 로션제로 제형화되는 것을 특징으로 하는 백반증 예방 또는 치료용 약학적 조성물
(a) 세로토닌 또는 (±)-2,5-디메톡시-4-이도암페타민 하이드로클로라이드 ((±)-2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine hydrochloride)를 포함하는 세로토닌 수용체 2A 효능제를 세포에 처리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 처리된 세포에 색소침착 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및
(c) 멜라닌 생합성이 감소되거나 세포의 증식을 억제하는 후보물질을 선별하는 단계;
를 포함하는 색소 침착 억제제를 스크리닝 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 세포는 멜라닌 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
케탄세린(ketanserin)을 포함하는 세로토닌 수용체 2A 길항제(antagonist)를 유효성분으로 포함하는 색소침착 억제용 약학적 조성물.
삭제