JP2019043889A

JP2019043889A - メラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤、メラニン産生抑制用化粧料組成物及び美白用化粧料組成物

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Publication number: JP2019043889A
Application number: JP2017168641A
Authority: JP
Inventors: 綾香中島; Ayaka Nakajima; 鈴木　健吾; Kengo Suzuki; 健吾鈴木; 伊藤　智広; Tomohiro Ito; 智広伊藤
Original assignee: Mie University NUC; Euglena Co Ltd
Current assignee: Mie University NUC; Euglena Co Ltd
Priority date: 2017-09-01
Filing date: 2017-09-01
Publication date: 2019-03-22
Anticipated expiration: 2037-09-01
Also published as: JP6324597B1

Abstract

【課題】新規なメラニン産生抑制剤、美白剤、メラニン産生抑制用化粧料組成物及び美白用化粧料組成物を提供する。【解決手段】ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有することを特徴とするメラニン産生抑制剤、美白剤、メラニン産生抑制用化粧料組成物及び美白用化粧料組成物である。【選択図】図２

Description

本発明は、メラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤、メラニン産生抑制用化粧料組成物及び美白用化粧料組成物に関する。

皮膚のシミなどの色素沈着は、ホルモンの異常や紫外線、皮膚局所の炎症が原因となってメラニンが過剰に形成されて皮膚内に沈着するものと考えられている。皮膚の色素沈着の原因となるこのメラニンは、表皮基底層にある色素細胞（メラノサイト）内のメラノソームと呼ばれる小器官において生成される。

皮膚における色素沈着を予防、改善するために美白作用を有する物質、メラニン生成を抑制する物質が用いられている。色素沈着を予防、改善する方法として、例えば、ビタミンＣなどを経口摂取する方法、ビタミンＣ、コウジ酸、ハイドロキノン等を皮膚に局所塗布する方法等がある。ビタミンＣ、コウジ酸、ハイドロキノン等の物質は、メラニン合成に関与する酵素であるチロシナーゼの活性阻害効果を有している。

一方、ｍｉＲＮＡは、細胞内在性の、２０〜２５塩基程度の非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ上のｍｉＲＮＡ遺伝子から、まず数百〜数千塩基程度の長さの一次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）として転写され、次いで、プロセシングを受け、約６０〜７０塩基程度のヘアピン構造を有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとなる。その後、核から細胞質内に移り、更にプロセシングを受けて、２０〜２５塩基程度の二量体（ガイド鎖およびパッセンジャー鎖）の成熟ｍｉＲＮＡとなる。成熟ｍｉＲＮＡは、そのうちのガイド鎖（アンチセンス鎖）がＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ＩｎｄｕｃｅｄＳｉｌｅｎｃｉｎｇＣｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、標的遺伝子のｍＲＮＡに作用することで、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きをすることが知られている。

特許文献１には、ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａが、ともにＤｌｘ５遺伝子の３’非翻訳領域への結合を介して間葉系細胞の分化を抑制すること、ｍｉＲＮＡ−２０８がＥｔｓ１遺伝子を標的にして分化を抑制すること、これらのｍｉＲＮＡの阻害剤が間葉系細胞の分化を促進する分化促進剤として骨粗鬆症等の疾患を予防・治療するための医薬として用いられうることが記載されている。

標的遺伝子の翻訳を阻害する働きを有するｍｉＲＮＡを利用して、メラニンの生成を抑制したり、シミ等の色素沈着を予防、改善したりすることができる医薬品の開発が望まれている。

国際公開第２０１０／０５８８２４号

本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きを有するｍｉＲＮＡを利用した新規なメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤、メラニン産生抑制用化粧料組成物及び美白用化粧料組成物を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ｍｉＲＮＡ−１４１及びｍｉＲＮＡ−２００ａにメラニン生成を抑制する作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
より具体的には、ｍｉＲＮＡ−１４１及びｍｉＲＮＡ−２００ａがメラニン生成において重要な役割を果たす転写因子ＭＩＴＦの遺伝子発現を翻訳レベルで阻害していることを見出し、本発明を完成するに至った。

従って、前記課題は、本発明によれば、ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有するメラニン産生抑制剤により解決される。
本発明のメラニン産生抑制剤は、メラニン生成において重要な役割を果たす転写因子ＭＩＴＦの遺伝子発現を翻訳レベルで阻害するため、メラニンの産生を効果的に抑制することができる。

また、前記課題は、本発明によれば、ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有する美白剤により解決される。
このとき、前記美白剤がシミの予防用又は治療用であるであるとよい。
このとき、前記シミは、雀卵斑、日光性黒子、肝斑又は両側性遅発性太田母斑様色素斑であるとよい。
本発明の美白剤は、メラニン生成において重要な役割を果たす転写因子ＭＩＴＦの遺伝子発現を翻訳レベルで阻害するため、メラニンの産生を効果的に抑制することができ、シミの予防や治療に好適に用いることができる。

また、前記課題は、本発明によれば、ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有するＭＩＴＦの遺伝子発現抑制剤、メラニン産生抑制用化粧料組成物、美白用化粧料組成物により解決される。

本発明によれば、新規なメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤、メラニン産生抑制用化粧料組成物及び美白用化粧料組成物を提供することができる。
本発明のメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤、メラニン産生抑制用化粧料組成物及び美白用化粧料組成物は、メラニン生成において重要な役割を果たす転写因子ＭＩＴＦの遺伝子発現を翻訳レベルで阻害することで、メラニンの産生を効果的に抑制し、シミの予防や治療に好適に用いることができる。

チロシンからメラニンが生成する過程の一部を示した説明図である。試験２において、ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａを導入したマウスメラノーマＢ１６−４Ａ５細胞におけるメラニン生成への影響を調べた結果を示すメラニン量のグラフである（異なるアルファベット間で統計的有意差があることを示している）。試験２において、ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａを導入したマウスメラノーマＢ１６−４Ａ５細胞におけるメラニン生成への影響を調べた結果を示す細胞沈殿物の写真である。ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａの導入によるメラニン生成への影響をＭＩＴＦ、チロシナーゼの発現量（ウエスタンブロッティング）で示す図である。

以下、本発明の実施形態について、図１乃至４を参照しながら説明する。
本実施形態は、ＭＩＴＦ遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡであるｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡを転写可能に保持するＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有するメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤、メラニン産生抑制用化粧料組成物及び美白用化粧料組成物に関するものである。

＜メラノサイトにおけるメラニンの生成＞
皮膚における色素沈着の原因となるメラニンは、メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ、メラノサイト）内の小器官であるメラノソームで生成される。メラニン細胞は、メラニン形成細胞や色素細胞とも呼ばれる。
図１にメラニン生成のプロセスを示すように、メラニンはアミノ酸であるチロシンから作られる。このプロセスでは、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク−１（ＴＲＰ−１）、チロシナーゼ関連タンパク−２（ＴＲＰ−２）などの酵素が関わっている。これらの酵素の生成には色素細胞特異的転写因子である小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）が関わっている。

小眼球症関連転写因子（以下、ＭＩＴＦという。Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａａｓｓｏｃｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）は、メラノサイトの分化・増殖を制御するマスター転写因子であり、メラニン合成酵素であるチロシナーゼ、チロシナーゼのアミノ酸配列と４０％の類似性を持つＴＲＰ−１やＴＲＰ−２／ドーパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）に対して特異的に発現を促進する。

紫外線やα−メラノサイト刺激ホルモン（以下、α−ＭＳＨという。α−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ）によって刺激を受けると、メラニン合成酵素であるチロシナーゼが活性化されて、メラノサイト中のチロシンを基質として酵素反応によってドーパに変換する。チロシナーゼは、更にドーパにも作用し、ドーパクロム、インドールキノン（インドール−５，６−キノン）に変換し、酸化重合反応で次第に黒くなり、メラニン色素が生成する。

＜メラニンの過剰産生に起因する色素斑＞
メラニンの過剰産生に起因する皮膚の色素斑（いわゆるシミ）は、皮膚の色素異常を伴う疾患に起因して生じる。
ここで、皮膚の色素異常を伴う疾患とは、例えば、老人性色素斑、雀卵斑、肝斑、両側性遅発性太田母斑様色素斑、色素性母斑、青色母斑、太田母斑、後天性真皮メラノサイトーシス、色素沈着型接触皮膚炎、アジソン病、その他色素沈着等を含むが、これらに限定されない。

老人性色素斑は、日光性黒子、日光黒子、日光性色素斑などとも呼ばれる。紫外線が表皮細胞に作用することで、メラノサイト増殖及び分化促進因子の分泌が促される。また、紫外線はメラノサイトに直接作用することで、メラノサイト活性化因子に対する受容体の発現を向上させる。老人性色素斑は、紫外線によるメラノサイトの増加及びメラニン合成の促進が長年繰り返されることで生じる色素斑である。日本人では、年齢の進行（加齢）とともに老人性色素斑が認められる頻度が増え、６０歳代になると、ほぼ全ての人に老人性色素斑が認められる。

雀卵斑、いわゆるソバカスは、両頬から鼻にかけての部位に出現する点状色素斑であり、遺伝性が強いことが知られている。雀卵斑は３歳頃から出現し始め、思春期頃に最も顕著なものとなる。雀卵斑では、メラニン産生が促進されている。

肝斑は、３０歳代の女性に多く発生する色素斑であり、左右対称性の扁平な褐色斑が頬や口周囲及び前額部に生じる。肝斑では、表皮基底層のメラノサイトのメラニン産生が促進されている。肝斑の原因としては、紫外線が挙げられるが、妊娠時、閉経時、月経不順などにより発症が増えるため、女性ホルモンが関与しているとされている。

両側性遅発性太田母斑様色素斑は、顔面に青みがかった茶褐色の色素斑がいくつかまとまって出現する後天性の皮膚疾患であり、後天性真皮メラノサイトーシス（ＡｃｑｕｉｒｅｄＤｅｒｍａｌＭｅｌａｎｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＡＤＭ）とも呼ばれる。両側性遅発性太田母斑様色素斑では、メラニン色素を生成するメラノサイトが、表皮よりも深い真皮層にあることを特徴とし、２０〜３０歳代から中年の女性に多く見られ、特に日本人や中国人に多い疾患である。

＜ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ＞
本発明の実施形態に係るメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤は、ＭＩＴＦ遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡであるｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡを転写可能に保持するＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有する。

本明細書では、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡにおいて、最終的に標的となる遺伝子のｍＲＮＡと対合するｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖（又は当該アンチセンスセンス鎖を含むＲＮＡ領域）をガイド鎖と表現し、前記アンチセンス鎖に対するセンス鎖（又は当該センス鎖を含むＲＮＡ領域）をパッセンジャー鎖というものとする。

（ｍｉＲＮＡ）
ＭＩＴＦ遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡとは、当該非翻訳領域に結合してＭＩＴＦ遺伝子の翻訳を抑制する作用を有する１本鎖ＲＮＡ（二本鎖ｍｉＲＮＡのガイド鎖に相当する。）を意味している。そのようなＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ−１４１およびｍｉＲＮＡ−２００ａであり、その成熟配列はそれぞれ以下に示すとおりであり（配列番号１〜４）、マウス、ヒト等で保存されている。

（ヒト）
ｍｉＲＮＡ−１４１：５’−ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＡＧＡＵＧＧ−３’（配列番号１）
ｍｉＲＮＡ−２００ａ：５’−ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＣＧＡＵＧＵ−３’（配列番号２）
（マウス）
ｍｉＲＮＡ−１４１：５’−ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＡＧＡＵＧＧ−３’（配列番号３）
ｍｉＲＮＡ−２００ａ：５’−ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＣＧＡＵＧＵ−３’（配列番号４）

これらのｍｉＲＮＡは、その塩基配列に基づき、従来公知の手法を用いて、天然物から単離することにより、化学的に合成することにより、あるいはｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで遺伝子工学的に生産させることができる。また、これらのｍｉＲＮＡは、内在性の成熟型ｍｉＲＮＡを模倣するように合成された類縁体であってもよい。そのような類縁体は、例えば、Ａｍｂｉｏｎ社などから入手可能であり、一本鎖であってもよいし、相補鎖を備える二本鎖であってもよい。

ここで、表１に示すように、ｍｉＲＮＡ−１４１及びｍｉＲＮＡ−２００ａ（配列番号１〜４）は、標的遺伝子であるＭＩＴＦ遺伝子の３’非翻訳領域に結合することによってＭＩＦＴの遺伝子発現を翻訳レベルで阻害することが予想される。

（ｍｉＲＮＡ前駆体）
ｍｉＲＮＡ前駆体（ｍｉＲＮＡ−１４１の前駆体、ｍｉＲＮＡ−２００ａの前駆体）としては、例えば、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。その具体例としては、例えば、マウス及びヒトに関し、以下の表１に示すｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡがそれぞれ挙げられる。これらのｍｉＲＮＡ前駆体も、従来公知の手法を用いて、天然物から単離することにより、化学的に合成することにより、あるいはｉｎｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏで遺伝子工学的に生産させることができる。さらに、ｍｉＲＮＡ前駆体は、内在性のｍｉＲＮＡ前駆体を模倣するように合成された、ｍｉＲＮＡ前駆体の類縁体であってもよい。ｍｉＲＮＡ前駆体は、一本鎖であってもよいし、相補鎖を備える二本鎖であってもよい。

（ｍｉＲＮＡ等のＤＮＡ構築物）
ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ）及びｍｉＲＮＡ前駆体（ｍｉＲＮＡ−１４１の前駆体、ｍｉＲＮＡ−２００ａの前駆体）をコードするＤＮＡを転写可能に保持するＤＮＡ構築物は、ｉｎｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏでこれらのＲＮＡ鎖を転写可能にコードしたＤＮＡコンストラクトである。たとえば、ｉｎｖｉｔｒｏでｍｉＲＮＡ等を転写可能なコンストラクトは、ウイルスプロモーターの制御下にｍｉＲＮＡ等をコードするＤＮＡを連結したベクターが挙げられる。また、ｉｎｖｉｖｏでｍｉＲＮＡ等を転写可能なコンストラクトは、哺乳類細胞で有効なプロモーターの制御下にｍｉＲＮＡ等をコードするＤＮＡを連結したベクターが挙げられる。このようなｉｎｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏ転写用のベクターは商業的に入手が可能であり、そのプロトコルに従い、ｍｉＲＮＡ等の塩基配列に基づけば、容易にかかるベクターを構築できる。

＜メラニン産生抑制剤＞
本実施形態に係るメラニン産生抑制剤（メラニン生成抑制剤、メラニン産出抑制剤）は、ＭＩＴＦ遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡであるｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡを転写可能に保持するＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分とするメラニン産生抑制剤である。
ここで、「メラニン産生抑制剤」とは、メラノサイトにおけるメラニンの産生を抑制する剤のことをいう。

＜美白剤＞
本実施形態に係るメラニン産生抑制剤は、メラニン産生を抑制する作用を有しているため、美白剤として用いることもできる。
ここで、「美白」とは、皮膚の黒化やシミやソバカスなどの色素斑、具体的にはメラニンの過剰産生による皮膚の色調・色素変化などの色素異常を消失、軽減（治療）及び／又は予防し、皮膚本来の色調を維持又は回復（復活）する作用、例えば肌を白くする作用である。

本実施形態に係るメラニン産生抑制剤又は美白剤を皮膚に用いることにより、美白効果を得ることができ、メラニンの過剰産生に起因する色素斑（例えば老人性色素斑、雀卵斑、肝斑、両側性遅発性太田母斑様色素斑等）の治療を行うこともできる。

「色素斑を治療する」とは、例えば、本実施形態のメラニン産生抑制剤又は美白剤の有効成分であるｍｉＲＮＡを投与する前の状態と比べて、色素斑（老人性色素斑、雀卵斑、肝斑、両側性遅発性太田母斑様色素斑等）の症状が軽減することをいう。

＜遺伝子発現抑制剤＞
本実施形態に係るＭＩＴＦ遺伝子の３’非翻訳領域に結合するｍｉＲＮＡであるｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡを転写可能に保持するＤＮＡ構築物は、ＭＩＴＦ遺伝子の発現を翻訳レベルで阻害するため、ＭＩＴＦの遺伝子発現抑制剤としても用いることができる。

＜用途＞
本実施形態に係るｍｉＲＮＡ−１４１及び／又はｍｉＲＮＡ−２００ａを有効成分として含有するメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤は、メラノサイトにおいてメラニンの産生が促進されて色素斑が生じた患者や、皮膚の色素異常を伴う疾患（老人性色素斑、雀卵斑、肝斑、両側性遅発性太田母斑様色素斑等）の確定診断を受けた患者に投与される。
また、本実施形態のメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤は、化粧料組成物、医薬組成物等の組成物として構成され、色素斑が生じたことを自覚した者や、色素斑が生じる可能性の高い者等に、予防的に投与される。

一般的に、メラノサイトにおけるメラニンの産生は、紫外線への暴露、加齢、遺伝的要因など、様々な要因によって引き起こされることが知られている。
よって、本実施形態のメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤を、紫外線への暴露、加齢、遺伝的要因により、皮膚の色素異常を伴う疾患（老人性色素斑、雀卵斑、肝斑、両側性遅発性太田母斑様色素斑等）に罹患する可能性の高い人（罹患する可能性の高い環境にある人）、例えば、屋外に滞在する時間が長く紫外線への暴露が多い人、加齢が進んだ人、家族が皮膚の色素異常を伴う疾患を罹患している家庭の人に対して投与できる。

また、４０歳以降の年齢のヒトに、特に６０歳または６５歳以上の高齢者にｍｉＲＮＡ−１４１及び／又はｍｉＲＮＡ−２００ａを有効成分として含有するメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤を投与することができる。
３０歳以上のヒト、特に６０歳または６５歳以上の高齢者は、加齢によって老人性色素斑が生じる傾向があるが、ｍｉＲＮＡ−１４１及び／又はｍｉＲＮＡ−２００ａが備える、メラニン産生の抑制作用により、加齢に伴って生じる色素斑を抑制することができる。

さらに、遺伝的要因により発症する可能性が指摘されている皮膚の色素異常を伴う疾患、例えば、雀卵斑、肝斑、両側性遅発性太田母斑様色素斑等に罹患する可能がある人に対して、本実施形態に係るメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤を投与することができる。
具体的には、雀卵斑が発症し始める３歳よりも前の年齢の人、肝斑が発症し始める３０歳よりも前の人（特に、男性よりも肝斑を発症する頻度が高いことが知られている女性）、両側性遅発性太田母斑様色素斑が発症し始める２０歳よりも前の人に対して、本実施形態に係るメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤を投与することができる。

本実施形態のメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤によれば、メラニン生成において重要な役割を果たす転写因子ＭＩＴＦの遺伝子発現を翻訳レベルで阻害することができるため、メラニンの過剰産生が関連する疾病の予防・治療への応用が期待される。

本実施形態に係るメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤を投与する対象は、上記症状又は状態の者や、ヒト以外の動物に限定されるものではない。

また、本実施形態に係るｍｉＲＮＡ−１４１及び／又はｍｉＲＮＡ−２００ａを有効成分として含有するメラニン産生抑制剤、美白剤は、薬理学的に許容され得る添加剤を加え、化粧料組成物、医薬組成物等の組成物等として用いることができる。

（化粧料組成物）
本実施形態に係るメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤は、化粧料組成物として利用することができる。
該化粧料組成物は、あらゆる形態の化粧料に適用することができる。例えば、ローション、乳液、クリーム、美容液などのスキンケア化粧料、ファンデーション、コンシーラー、化粧下地、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナーなどのメイクアップ化粧料、日焼け止め化粧料などに適用することができる。

本実施形態に係る化粧料組成物には、本実施形態に係るメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤に加え、通常化粧料組成物に用いることができる成分を、１種または２種以上自由に選択して配合することが可能である。
例えば、基材、保存剤、乳化剤、着色剤、防腐剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、紫外線吸収剤、香料、防腐防黴剤、体質顔料、着色顔料、アルコール、水などの、化粧品分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。

本実施形態に係る化粧料組成物において、メラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤の含有量は特に限定されず、目的に応じて自由に設定することが可能である。
また、本実施形態に係る化粧料組成物には、ｍｉＲＮＡ−１４１やｍｉＲＮＡ−２００ａなどのｍｉＲＮＡ以外に、メラニン産生抑制作用、美白があることが知られている他の物質を１種以上添加することも可能である。

（医薬組成物）
本実施形態のメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤は、医薬組成物として利用することができる。
本実施形態のメラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤は、医薬の分野では、当該作用を有効に発揮できる量のｍｉＲＮＡと共に、薬学的に許容される担体や添加剤を配合することにより、当該作用を有する医薬組成物が提供される。当該医薬組成物は、医薬品であっても医薬部外品であってもよい。
当該医薬組成物は、外用的に適用されても、また内用的に適用されても良い。従って、当該医薬組成物は、経皮適用剤、経粘膜適用剤、静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射及び／又は腹腔内注射等の注射剤、内服剤等の製剤形態で使用することができる。
当該医薬組成物の剤型としては、適用の形態により、適当に設定できるが、例えば、液剤、懸濁剤などの液状製剤、軟膏剤、またはゲル剤等の半固形剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末剤、散剤などの固形製剤が挙げられる。

本実施形態に係る医薬組成物には、薬学的に許容される添加剤を１種または２種以上自由に選択して含有させることができる。
例えば、本実施形態に係る医薬組成物を経皮的に適用させる場合、例えば、基材、賦形剤、増粘剤、吸収促進剤、界面活性剤、保存剤、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。また、ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）を利用した製剤等にすることもできる。

本実施形態に係る医薬組成物において、メラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤の含有量は特に限定されず、目的に応じて自由に設定することが可能である。
本実施形態に係る医薬組成物には、ｍｉＲＮＡ−１４１やｍｉＲＮＡ−２００ａなどのｍｉＲＮＡ以外に、メラニン産生抑制作用、美白があることが知られている他の物質を１種以上添加することも可能である。

以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の実施例では、ｍｉＲＮＡ−１４１およびｍｉＲＮＡ−２００ａを用い、メラニンの生成に与える影響の検討を行った。

＜試験１細胞へのｍｉＲＮＡの導入＞
ｍｉＲＮＡ−１４１およびｍｉＲＮＡ−２００ａによるα−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）誘導によるメラニン生成の効果を検討するために、マウスメラノーマＢ１６−４Ａ５細胞（理化学研究所）に模擬人工ｍｉＲＮＡ−１４１及びｍｉＲＮＡ−２００ａ（ともにＡｍｂｉｏｎ社製）、標的を有さないｍｉＲＮＡであるｍｉＲＮＡ−ＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ（ｍｉＲＮＡ−ＮＣ）を以下の方法により導入した。

マウスメラノーマＢ１６−４Ａ５細胞を５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％牛胎児血清（以下ＦＢＳ、ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）含有ダルベッコ改変イーグル（以下ＤＭＥＭ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）低グルコース培地にて調整後、１２穴マルチウェルプレート（Ｎｕｎｃ）播種し、一晩９５％空気−５％二酸化炭素環境下にて接着させた。その後、培地を吸引除去し，リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−）、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）にて洗浄後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地を９００μＬ加えた。

細胞へ導入する模擬人工ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、ｍｉＲＮＡ−ＮＣは、ＲＮａｓｅ−ＤＮａｓｅフリーの１．５ｍＬエッペンチューブにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ３μＬ、模擬人工ｍｉＲＮＡ２μＬ（終濃度：２０ｎＭ），およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を９５μＬそれぞれ加え、混液とした。攪拌後、クリーンベンチ内にて３０分間静置した（３０分静置の間、１０分ごとに攪拌）。

導入模擬人工ｍｉＲＮＡ−溶液の準備が整った後、１．５ｍＬエッペンチューブ内の模擬人工ｍｉＲＮＡ−溶液全量を細胞に添加し、９５％空気−５％二酸化炭素環境下にて調製したインキュベーター内にて１２時間細胞へ導入させた。１２時間後、新鮮な１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を交換した。

＜試験２メラニン生成試験＞
模擬人工ｍｉＲＮＡ−を細胞に導入させた細胞または未処理の細胞を培養したウェルに終濃度が２μＭとなるようにα−ＭＳＨ（Ｓｉｇｍａ）を加え、メラニン生成を惹起させた。その後、９５％空気−５％二酸化炭素環境に調整したインキュベーターにて７２時間培養した。
７２時間後、細胞培養をセルスクレーパーにて各ウェルからそれぞれ剥離し、１．５ｍＬエッペンチューブに回収した。細胞懸濁液は、ただちに遠心分離に供し（５６０×ｇ、４℃、１０分）、細胞を沈澱させた。沈澱した細胞にＰＢＳ（−）を用いて２度洗浄した。洗浄後、細胞ペレットに１ＮＮａＯＨを２００μＬ加え５０℃にて１時間細胞を溶解させた。
細胞溶解液を５０μＬずつ９６穴マルチウェルプレートに分注し（一サンプル３ウェル）、４７５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定する。メラニン量は、予め人工メラニンにて作成した標準曲線にて算出し、各サンプルのタンパク質濃度（ＢｉｏｒａｄＤＣ^ＴＭプロテインアッセイキット）にて補正した。

（試験２の結果）
結果を図２に示す。図２は、左から順番に、（１）α−ＭＳＨ処理なし、（２）α−ＭＳＨ処理あり、（３）α−ＭＳＨ処理＋ｍｉＲＮＡ−ＮＣ処理、（４）α−ＭＳＨ処理＋ｍｉＲＮＡ−１４１、（５）α−ＭＳＨ処理＋ｍｉＲＮＡ−２００ａ、（６）α−ＭＳＨ処理＋２００μＭアルブチンの結果である。

図２に示すように、α−ＭＳＨを添加するとマウスメラノーマＢ１６−４Ａ５細胞のメラニン生成が惹起された（図２の（１）及び（２））。
ｍｉＲＮＡ−１４１またはｍｉＲＮＡ−２００ａを導入すると、α−ＭＳＨにより惹起されるマウスメラノーマＢ１６−４Ａ５細胞におけるメラニン生成が抑制されることが確認された（図２の（４）及び（５））。

ｍｉＲＮＡ−１４１またはｍｉＲＮＡ−２００ａによるメラニン生成の抑制作用は、美白剤であるアルブチンと同程度であることが確認された（図２の（６））。
なお、標的を有さないｍｉＲＮＡ−ＮＣを導入した場合、α−ＭＳＨにより惹起されるマウスメラノーマＢ１６−４Ａ５細胞におけるメラニン生成は抑制されることなく、促進された（図２の（３））。

以上の結果は、図３に示す細胞の沈殿物を撮影した写真からも確認された。具体的には、ｍｉＲＮＡ−１４１またはｍｉＲＮＡ−２００ａを導入した場合（図３の（４）及び（５））、メラニン生成を惹起していないとき（図３の（１））や、アルブチンを添加したとき（図３の（６））と同様に白色を呈していた。一方、α−ＭＳＨ処理のみを行った場合（図３の（２））や、標的を有さないｍｉＲＮＡ−ＮＣを導入した場合（図３の（３））は、メラニン生成により黒色を呈していた。

以上のことから、ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａはメラニンの生成を抑制する作用を有することがわかった。

＜試験３標的タンパク質発現解析＞
（３．１．細胞の調整およびメラニン生成刺激後の細胞回収）
試験１にしたがい細胞を調整し培養後、各ウェルに終濃度が２μＭとなるようにα−ＭＳＨを加えた（未処理のウェルには同量のジメチルスルホキシドを加えた）。培養７２時間後にＰＢＳ（−）を用いて細胞を２回洗浄し、２％Ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、２％Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ含有ＲＩＰＡｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．６、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１％ｓｏｄｉｕｍｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ））１００μＬを加えて細胞を溶解した。その後、セルスクレーパーにて剥離し、１．５ｍＬエッペンチューブに回収した。回収した細胞溶解液は、３０分間氷上で保管後、超音波破砕機を用いて細胞を破砕し（１０秒×３回)、１６，２００×ｇ、２０分間、４℃で遠心分離後、上清をサンプル溶液として回収した。サンプル溶液中のタンパク質濃度は、ＢｉｏＲａｄＤＣプロテインアッセイキット（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）により測定した。タンパク濃度を調整したサンプル溶液に１０％メルカプトエタノール含有サンプルバッファー（０．１２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、４％ＳＤＳ、０．００４％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ）を加えて９８℃で５分間加熱し、ＳＤＳ電気泳動供試サンプルとした。

（３．２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
泳動槽に目的とした検出タンパク質に適宜対応した１０−１５％ポリアクリルアミドゲルをそれぞれセットし、泳動バッファー（ＢｉｏＲａｄＴｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅｂｕｆｆｅｒ）を泳動槽の約１／３まで入れた。ゲルの各レーンに１０μＬ（サンプル濃度５−２０μｇ／Ｌａｎｅ）ずつサンプルを、先頭レーンには等量のタンパク質分子量マーカーを、使用しないレーンには等量のＬａｅｍｍｌｉｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒをアプライした。そして１２０Ｖで９０分泳動してサンプルのタンパク質を分離した。泳動後、ガラスプレートからゲルを外し、不要なゲルを切り取り、ブロッティングバッファー（ＢｉｏＲａｄＴｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅｂｕｆｆｅｒ１０％、メタノール２０％、超純水７０％）に浸したろ紙の上に移した。

（３．３．ウエスタンブロッティング）
Ｐｏｌｙｖｉｎｌｉｄｅｎｅｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ膜（以下ＰＶＤＦ膜，ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＵＫＬｔｄ、ＡｍｅｒｓｈａｍＰｌａｃｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）はメタノールに３分間浸し、親水化処理後、ブロッティングバッファーに浸して平衡化した。ブロッティングバッファーをよく染み込ませたスポンジとろ紙のそれぞれ２枚を一組とし、前述３．２.項のＳＤＳ−ＰＡＧＥで得たゲルとＰＶＤＦ膜を挟んだ。泳動槽にセット後、氷水で冷やしながら、６０Ｖで９０分間泳動し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜をケース中で５％Ｓｋｉｍｍｉｌｋ（Ｂｅｃｔｏｎ、ＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ）を含んだ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝化生理食塩水（Ｔ−ＴＢＳ）溶液に浸して６０分間振盪した。Ｔ−ＴＢＳで洗浄後（１０分×３回）、その後、各種一次抗体（ＭＩＴＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、、チロシナーゼ（Ｔｙｒ、ａｂｃａｍ社製）、β−ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製））溶液に浸して、４℃で一晩振盪した。翌日、Ｔ−ＴＢＳで洗浄後（１０分×３回）、５％脱脂粉乳含有Ｔ−ＴＢＳ溶液により希釈した二次抗体（ＥＣＬＡｎｔｉ−ＲａｂｂｉｔＩｇＧ、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｌｉｎｋｅｄｗｈｏｌｅａｎｔｉｂｏｄｙ又はＥＣＬＡｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＩｇＧ、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｌｉｎｋｅｄｗｈｏｌｅａｎｔｉｂｏｄｙ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に浸して６０分間振盪した。その後Ｔ−ＴＢＳで洗浄し（１０分×３回）、ＥＣＬｓｅｌｅｃｔｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、化学発光検出装置（Ｄａｖｉｎｃｈ−ＣｈｅｍｉＣＡＳ−４００ＳＭ和光純薬工業株式会社、大阪）により観察した。

（試験３の結果）
図４に示すように、マウスメラノーマＢ１６−４Ａ５細胞にｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を導入し、メラニン生成刺激後の細胞から細胞溶解液を調製し、ウエスタンブロッティングンに供したところ、ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａを導入した細胞群では、α−ＭＳＨ処理、Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて、メラニン生成に関与するチロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２の発現を調整する転写因子であるＭＩＴＦのタンパク発現を抑制されていた。ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａによるＭＩＴＦのタンパク発現の抑制作用は、α−ＭＳＨ処理を行っていないときに匹敵していた。この結果からｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４１および−２００ａがＭＩＴＦを標的遺伝子としていることが確認された。

また、ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａを導入した細胞群では、α−ＭＳＨ処理、Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて、チロシナーゼの発現が抑制されていた。

以上の結果から、ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａは、メラニン生成に関与するチロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２の発現を調整する転写因子であるＭＩＴＦの発現を抑制することで、メラニンの産生が抑制されていることがわかった。

従って、前記課題は、本発明によれば、ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、ｍｉＲＮＡ−１４１の前駆体、ｍｉＲＮＡ−２００ａの前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有するメラニン産生抑制剤により解決される。
本発明のメラニン産生抑制剤は、メラニン生成において重要な役割を果たす転写因子ＭＩＴＦの遺伝子発現を翻訳レベルで阻害するため、メラニンの産生を効果的に抑制することができる。

また、前記課題は、本発明によれば、ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、ｍｉＲＮＡ−１４１の前駆体、ｍｉＲＮＡ−２００ａの前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有する美白剤により解決される。
このとき、前記美白剤がシミの予防用又は治療用であるであるとよい。
このとき、前記シミは、雀卵斑、日光性黒子、肝斑又は両側性遅発性太田母斑様色素斑であるとよい。
本発明の美白剤は、メラニン生成において重要な役割を果たす転写因子ＭＩＴＦの遺伝子発現を翻訳レベルで阻害するため、メラニンの産生を効果的に抑制することができ、シミの予防や治療に好適に用いることができる。

また、前記課題は、本発明によれば、ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、ｍｉＲＮＡ−１４１の前駆体、ｍｉＲＮＡ−２００ａの前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有するＭＩＴＦの遺伝子発現抑制剤、メラニン産生抑制用化粧料組成物、美白用化粧料組成物により解決される。

（ｍｉＲＮＡ前駆体）
ｍｉＲＮＡ前駆体（ｍｉＲＮＡ−１４１の前駆体、ｍｉＲＮＡ−２００ａの前駆体）としては、例えば、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。その具体例としては、例えば、マウス及びヒトに関し、以下の表２に示すｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡがそれぞれ挙げられる。これらのｍｉＲＮＡ前駆体も、従来公知の手法を用いて、天然物から単離することにより、化学的に合成することにより、あるいはｉｎｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏで遺伝子工学的に生産させることができる。さらに、ｍｉＲＮＡ前駆体は、内在性のｍｉＲＮＡ前駆体を模倣するように合成された、ｍｉＲＮＡ前駆体の類縁体であってもよい。ｍｉＲＮＡ前駆体は、一本鎖であってもよいし、相補鎖を備える二本鎖であってもよい。

Claims

ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有するメラニン産生抑制剤。
ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有する美白剤。
シミの予防用又は治療用であることを特徴とする請求項２記載の美白剤。
前記シミは、雀卵斑、日光性黒子、肝斑又は両側性遅発性太田母斑様色素斑であることを特徴とする請求項３記載の美白剤。
ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有するＭＩＴＦの遺伝子発現抑制剤。
ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有するメラニン産生抑制用化粧料組成物。
ｍｉＲＮＡ−１４１、ｍｉＲＮＡ−２００ａ、その前駆体及びこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される１種または２種以上を有効成分として含有する美白用化粧料組成物。