KR101871920B1 - 마이크로 ｒｎａ를 포함하는 조성물 - Google Patents

마이크로 ｒｎａ를 포함하는 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101871920B1
KR101871920B1 KR1020170098819A KR20170098819A KR101871920B1 KR 101871920 B1 KR101871920 B1 KR 101871920B1 KR 1020170098819 A KR1020170098819 A KR 1020170098819A KR 20170098819 A KR20170098819 A KR 20170098819A KR 101871920 B1 KR101871920 B1 KR 101871920B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
expression
mirna
mir
gene
hsa
Prior art date
Application number
KR1020170098819A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170094526A (ko
Inventor
김규한
이태룡
신동욱
심중현
최현정
Original Assignee
(주)아모레퍼시픽
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)아모레퍼시픽 filed Critical (주)아모레퍼시픽
Priority to KR1020170098819A priority Critical patent/KR101871920B1/ko
Publication of KR20170094526A publication Critical patent/KR20170094526A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101871920B1 publication Critical patent/KR101871920B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
    • A61K8/606—Nucleosides; Nucleotides; Nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명의 서열번호 1의 miRNA는 has-miR-1248의 모방체로서, has-miR-1248의 발현에 대한 촉진제로 사용되어 색소형성 유전자인 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질 1, 멜란-A의 발현을 억제하여 피부 미백효과를 제공할 수 있으며, 서열번호 2의 miRNA는 상기 서열번호 1의 miRNA에 대한 안티센스 핵산 분자로서 has-miR-1248의 발현에 대한 억제제로 사용되어 색소형성 유전자인 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질 1, 멜란-A의 발현을 촉진시켜 백모 방지 또는 흑모 생성효능을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 서열번호 1의 miRNA는 has-miR-1248의 발현에 대한 촉진제로 사용되어 진피세포 재생 조절 유전자인 트로포미오신 3과 아그레칸의 발현을 억제하여 우수한 진피세포 재생 효과를 제공할 수 있다.

Description

마이크로 ＲＮＡ를 포함하는 조성물{Composition containing microRNA}
본 발명은 마이크로 RNA(microRNA; 이하 'miRNA'라 함)인 miRNA-1248 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 미백효과 또는 진피세포 재생 기능의 miRNA-1248의 모방체, 또는 백모 방지 또는 흑모 생성 효능을 가지는 miRNA-1248의 저해제, 또는 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
miRNA는 세포 내에 존재하는 20~25핵산(nucleotide) 길이의 작은 RNA(endogenous small RNA)의 일종으로서 단백질을 합성하지 않는 DNA에서 유래된 헤어핀-구조 전사체(hairpin-shaped transcript)로부터 생성된다. miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR(untranslated region)의 상보적인 염기서열에 결합하여 그 mRNA의 번역 억제 또는 불안정화를 유도하고, 궁극적으로 그 표적 mRNA의 단백질 합성을 억제하는 리프레서(repressor) 역할을 하게 된다. 하나의 miRNA는 여러 개의 mRNA를 타겟팅하며, mRNA 역시 여러 개의 miRNA에 의해 조절될 수 있다고 알려져 있다.
현재 miRNA는 발달 시기, 세포사멸사, 지방 신진대사 및 조혈 세포 분화의 조절을 포함하는 여러 생물학적 과정에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려짐에 따라 생명과학분야에서 매우 큰 관심을 받고 있다. 하지만 암 등의 질병이나 발생 과정에서의 miRNA의 기능연구는 상당히 진행된 것에 비해 상대적으로 피부과학에서의 miRNA 역할에 대한 연구는 비교적 적은 상태이다. 최근 miR-203이 각질형성세포(keratinocyte)에서 p63 mRNA를 타겟팅함으로써 분화능력을 억제한다는 보고와 miR-125b가 피부줄기세포의 분화를 억제하며 각질형성세포의 분열을 억제한다는 보고는 있지만, 그 외의 피부관련 특이적 miRNA와 기능에 대해선 거의 알려져 있지 않다. 하지만 miR-203과 miR-125b 외에도 여러 특정 miRNA가 피부에서도 생물학적으로 중요한 역할을 담당할 것으로 충분히 예측이 된다. 또한 miRNA는 생물학적 마커 및 소재 등 다양한 분야에서 응용이 가능하기 때문에 피부에서 miRNA의 연구는 화장품 및 의약산업 등에 다양한 적용이 가능할 것으로 판단된다.
한편, 피부는 크게 표피층(epidermis)과 진피층(dermis)으로 나뉜다. 표피층에는 색소형성세포(melanocyte)가 존재하며, 색소형성세포는 색소(melanin)를 합성하여 피부 고유의 색을 나타나게 한다. 피부 색소를 조절하는 생물학적 인자들은 크게 색소형성세포에서 멜라노솜(melanosome)을 만드는 요소와 멜라노솜(melanosome)을 운반하는 요소로 크게 나뉠 수 있다. 멜라노솜(melanosome)을 만드는 요소에서 가장 잘 알려진 인자는 티로시나아제(tyrosinase, TYR), 티로시나아제 관련 단백질 1(tyrosinase-related protein 1, TYRP1), 도파크롬 타토모라제(dopachrome tautomerase, DCT) 및 멜란-A(melan-A; T 세포에 의해 인식되는 멜라노마 항원) 등이 있으며, 멜라노솜(melanosome) 운반에 관여하는 요소로는 Rab27a 등이 알려져 있으며, 최근엔 PAX3, MITF 등의 전사인자들도 색소조절 과정에 참여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 이들 색소조절 인자들은 피부미백, 흑모색성 그리고 백모방지 등의 중요한 타겟이 된다.
또한, 진피층은 섬유아세포(fibroblast)에서 만들어지는 콜라겐(collagen)으로 채워져 있다. 섬유아세포는 피부에 상처가 났을 때 분열과 그 이동성이 크게 증가되고 세포외 기질(extracellular matrix)을 재합성하게 된다. 이러한 세포재생은 매우 복잡한 과정을 통해 이뤄지게 되는데, 최근 miR-21이 폐(lung)의 섬유아세포의 이러한 세포재생에 관여한다는 논문이 발표되기도 하였다.
본 발명자는 피부의 표피층 및 진피층에서 색소형성, 진피세포 재생 등에 관여하는 마이크로 RNA를 찾는 연구를 진행하였고, 그 결과 hsa-miR-1248이 색소형성에 관련된 유전자 및 섬유아세포의 이동성 및 세포이동성과 관련된 유전자의 발현을 조절함을 밝혔다.
따라서, 본 발명은 miRNA-1248 기능의 모방체(mimic)를 포함하여 미백효과를 가지는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 miRNA-1248 기능의 저해제(inhibitor)를 포함하여 백모 방지 또는 흑모 생성 촉진 효과를 가지는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 miRNA-1248 기능의 모방체(mimic)를 포함하여 진피세포 재생 효과를 가지는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 miRNA를 유효성분으로 함유하는 색소형성 유전자 발현 조절용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 miRNA에 상보적인 염기서열을 갖고, 상기 miRNA에 하이브리드될 수 있는 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자를 유효성분으로 함유하는 색소형성 유전자 발현 조절용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 miRNA를 유효성분으로 함유하는 진피세포 재생 관련 유전자 발현 조절용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 서열번호 1의 miRNA 또는 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자를 세포에 트랜스펙션시키는 단계; (b) 상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질이 색소형성 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 색소형성 유전자 발현을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 서열번호 1의 miRNA를 세포에 트랜스펙션시키는 단계; (b) 상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질이 진피세포의 이동성 조절 관련 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 진피세포의 재생을 촉진하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명이 제공하는 miRNA는 has-miR-1248 발현의 촉진제 또는 저해제로서 사용되어, 색소형성 유전자인 티로시아나제 엔코딩 유전자, 티로시나아제 관련 단백질 1 엔코딩 유전자, 멜란-A 엔코딩 유전자 및 진피세포의 이동성 관련 유전자인 트로포미오신 3 엔코딩 유전자와 아그레칸 엔코딩 유전자의 발현을 조절함으로써 우수한 미백효과, 백모 방지 또는 흑모 생성효과, 및 진피세포 재생 효과를 제공할 수 있다.
도 1은 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산(oligonucleotide)을 세포 내로 주입하여 hsa-miR-1248의 과발현 현상(overexpression)을 유도하고, 실시간(real-time) PCR을 수행하여 티로시나아제 mRNA의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다(TYR: 티로시나아제).
도 2는 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산(oligonucleotide)을 세포 내로 주입하여 hsa-miR-1248의 과발현 현상(overexpression)을 유도하고, 웨스턴 블럿을 수행하여 티로시나아제 단백질의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다(TYR: 티로시나아제).
도 3은 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산(oligonucleotide)을 세포 내로 주입하여 hsa-miR-1248의 과발현 현상(overexpression)을 유도하고, 실시간(real-time) PCR을 수행하여 티로시나아제 관련 단백질 1 mRNA의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다(TYRP1: 티로시나아제 관련 단백질 1).
도 4는 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산(oligonucleotide)을 세포 내로 주입하여 hsa-miR-1248의 과발현 현상(overexpression)을 유도하고, 실시간(real-time) PCR을 수행하여 멜란-A mRNA의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 targetScan(www.targetscan.org) 사이트를 이용하여 hsa-miR-1248의 멜란-A에 대한 결합 가능성을 확인하고, hsa-miR-1248이 멜란-A mRNA 3'-UTR에 결합할 수 있는 부위를 박스로 표시하였다.
도 6은 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산(oligonucleotide)을 세포 내로 주입하여 hsa-miR-1248의 과발현 현상(overexpression)을 유도하고, 상처 치유 분석법(wound-healing assay)을 통하여 상처에 세포들이 재생을 유도하는지를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산(oligonucleotide)을 세포 내로 주입하여 hsa-miR-1248의 과발현 현상(overexpression)을 유도하고, 실시간(real-time) PCR을 수행하여 트로포미오신(tropomyosin) 3 mRNA의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다(TPM3: 트로포미오신 3).
도 8은 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산(oligonucleotide)을 세포 내로 주입하여 hsa-miR-1248의 과발현 현상(overexpression)을 유도하고, 실시간(real-time) PCR을 수행하여 아그레칸 mRNA의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다(ACAN: 아그레칸).
도 9는 targetScan(www.targetscan.org) 사이트를 이용하여 hsa-miR-1248의 트로포미오신 3 mRNA에 대한 결합 가능성을 확인하고, hsa-miR-1248이 트로포미오신 3 mRNA 3'-UTR에 결합할 수 있는 부위를 표시하였다(TPM3: 트로포미오신 3).
도 10은 targetSca(www.targetscan.org) 사이트를 이용하여 hsa-miR-1248의 아그레칸(aggrecan) mRNA에 대한 결합 가능성을 확인하고, hsa-miR-1248이 아그레칸 mRNA 3'-UTR에 결합할 수 있는 부위를 박스로 표시하였다.
본 발명은 하기와 같은 서열번호 1의 hsa-miR-1248 miRNA를 제공하며, 이는 색소형성 유전자의 발현을 조절한다.
5'- accuucuuguauaagcacugugcuaaa -3' (서열번호 1)
본 발명에서 사용되는 miRNA는 상기 서열번호 1의 염기서열을 가지며, ccuucuu를 포함하는 27개의 연속적인 염기서열로 이루어지는 올리고핵산 분자이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 miRNA는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 서열로서, 색소형성 유전자들의 발현을 조절하는 기능을 수행하는 것들을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1의 miRNA는 색소형성 유전자의 발현을 조절하며, 특히 티로시나아제(tyrosinase, TYR) 엔코딩 유전자, 티로시나아제 관련 단백질 1(tyrosinase-related protein 1, TYRP1) 엔코딩 유전자 및 멜란-A(melan-A) 엔코딩 유전자의 발현을 억제한다. 또한, 상기 miRNA는 멜란-A mRNA의 3'-UTR(untranslated region)에 결합 부위를 가지고, 멜란-A mRNA의 3'-UTR에서 909~915번째 핵산 분자를 표적으로 하여, 멜란-A의 발현을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1의 miRNA를 이용하여 hsa-miR-1248의 모방체(mimic)로서 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산 분자(oligonucleotide)를 제작할 수 있다. 또한, hsa-miR-1248의 모방체(mimic)는 서열번호 1의 서열을 포함하여 상기 hsa-miR-1248의 염기서열과 유사한 서열을 갖는 촉진제(stimulator)로서, 색소형성 유전자들의 발현을 조절하는 기능을 수행하는 것들을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 서열번호 1의 miRNA에 상보적인 염기서열을 갖는 안티 센스 핵산 분자로서, 서열번호 1의 miRNA에 하이브리드될 수 있는 것을 특징으로 하는 하기 서열번호 2의 핵산 분자를 제공한다. 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자는 hsa-miR-1248의 저해제(inhibitor)로서 서열번호 1의 miRNA에 하이브리드될 수 있는 것이다. 또한, hsa-miR-1248의 저해제는 하기 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열로서, 서열번호 1의 miRNA에 하이브리드될 수 있는 것들을 포함할 수 있다.
5'- uuuagcacagugcuuauacaagaaggu -3'(서열번호 2)
본 발명에서 사용되는 miRNA는 상기 서열번호 2의 염기서열을 가지며, 27개의 연속적인 염기서열로 이루어지는 올리고핵산 분자이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 miRNA는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열로서, 서열번호 1의 miRNA에 하이브리드될 수 있는 것들을 포함할 수 있으며, 또한 색소형성 유전자들의 발현을 조절, 특히 색소형성 유전자들의 발현을 증가시키는 기능을 수행하는 것들을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기와 같은 서열번호 1의 hsa-miR-1248 miRNA를 제공하며, 이는 진피세포 재생 조절 유전자의 발현을 조절한다.
5'- accuucuuguauaagcacugugcuaaa -3' (서열번호 1)
본 발명에서 사용되는 miRNA는 상기 서열번호 1의 염기서열을 가지며, ccuucuu를 포함하는 27개의 연속적인 염기서열로 이루어지는 올리고핵산 분자이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 miRNA는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 서열로서, 진피세포 재생과 관련된 섬유아세포의 이동성을 조절하는 기능을 수행하는 것들을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1의 miRNA는 섬유아세포의 진피세포 재생을 증가시킬 수 있으며, 특히 이동성 관련 유전자인 트로포미오신 3(tropomyosin 3) 엔코딩 유전자와 아그레칸(aggrecan) 엔코딩 유전자의 발현을 억제한다.
또한, 상기 miRNA는 트로포미오신 3 mRNA의 3'-UTR(untranslated region)에 결합 부위를 가지고, 트로포미오신 3 mRNA의 3'-UTR에서 239~245 번째 핵산 분자를 표적으로 하여, 트로포미오신 3 엔코딩 유전자의 발현을 억제시킬 수 있다. 또한, 상기 miRNA는 아그레칸 mRNA의 3'-UTR(untranslated region)에 결합 부위를 가지고, 아그레칸 mRNA의 3'-UTR에서 118~124번째 핵산 분자를 표적으로 하여, 아그레칸 엔코딩 유전자의 발현을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1의 miRNA를 이용하여 hsa-miR-1248의 모방체(mimic)로서 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산 분자(oligonucleotide)를 제작할 수 있다. 또한, hsa-miR-1248의 모방체(mimic)는 서열번호 1의 서열을 포함하여 상기 hsa-miR-1248의 염기서열과 유사한 서열을 갖는 촉진제(stimulator)로서, 진피세포 재생을 촉진하는 기능을 수행하는 것들을 포함할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 miRNA, 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자, 또는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 포함하는 올리고핵산을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 색소형성 유전자들의 발현을 조절할 수 있으며, 또한 진피세포 재생을 촉진할 수 있다.
본 발명에 있어서, 사용되는 miRNA, 안티센스 핵산 분자 또는 올리고핵산은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001~30.0중량%의 양으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 서열번호 1의 miRNA 또는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 올리고핵산을 포함하는 조성물은 색소형성 유전자, 특히 티로시나아제 엔코딩 유전자, 티로시나아제 관련 단백질 1 엔코딩 유전자 및 멜란-A 엔코딩 유전자의 발현을 억제함으로써 피부 미백 효과를 제공할 수 있다.
또한 서열번호 2의 miRNA 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 올리고핵산을 포함하는 조성물은 색소형성 유전자, 특히 티로시나아제 엔코딩 유전자, 티로시나아제 관련 단백질 1 엔코딩 유전자 및 멜란-A 엔코딩 유전자의 발현을 촉진함으로써 백모 방지 또는 흑모 생성 효과를 제공할 수 있다.
또한, 서열번호 1의 miRNA 또는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 올리고핵산을 포함하는 조성물은 진피세포 재생과 관련된 유전자, 특히 트로포미오신 3 엔코딩 유전자와 아그레칸 엔코딩 유전자의 발현을 억제함으로써 진피세포 재생을 촉진할 수 있다.
본 발명의 조성물은 제형 형태가 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 화장료 조성물 또는 약학 조성물 등의 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 조성물이 화장료 조성물인 경우에는 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우에는 서열번호 1의 miRNA 또는 서열번호 2인 안티센스 핵산 분자, 또는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 포함하는 올리고핵산을 유효성분으로 하고 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태인 주사, 경피 투여 또는 외용 도포용의 비경구 투여제로 제형화할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제재로는 국소 주사용 제제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제 등이 포함된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 유효성분을 제제화하기 위해서는 통상의 방법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 miRNA의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 주사제를 제외한 제재에 대해서는 도포가 필요한 부위(즉, 미백 효과, 백모 방지 또는 흑모 생성 효과, 또는 진피세포 재생 효과를 제공하고자 하는 부위)에 외용 도포하는 식으로 당업자의 수준에서 적용할 수 있고, 주사제의 경우에는 투여가 필요한 피부 부위에 국소적으로 주사할 수 있다.
본 발명의 miRNA는, 변형된 핵산 분자로 이루어질 수도 있다. 예컨대, 2'-O-알킬(예: 메틸, 에틸), 2'-O-알릴, 2'-O-알릴과 같은 2'-치환된 라이보스를 포함하는 핵산 분자를 부분적으로 또는 전체적으로 포함할 수 있다. 또한, 치환된 염기를 갖는 핵산 분자를 부분적으로 또는 전체적으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 일 실시예는, 시험물질에 대한 색소형성 유전자의 발현을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법으로서, (a) 서열번호 1의 miRNA를 세포에 트랜스펙션시키는 단계; (b) 상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질이 색소형성 유전자의 발현을 증가시키는지 또는 억제하는지 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 색소형성 유전자의 발현 조절 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 서열번호 1의 miRNA를 세포에 트랜스펙션시키는 단계에 있어서, 상기 트랜스펙션은 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기 천공법 또는 리포좀 이용법 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 색소형성 유전자의 발현 조절 물질의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 색소형성 유전자의 발현을 조절하는지 여부는 당업계에 널리 공지된 방법인 RT-PCR 또는 ELISA 및 웨스턴블럿(면역블럿(immuno blot))을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 색소형성 유전자의 발현 정도를 이용한 발현 조절 물질 스크리닝은 시험 물질이 색소형성 유전자 을 촉진 혹은 억제하는지를 면역검정법(예를 들어 ELISA 또는 면역블럿)으로 확인하는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 확인 결과, 상기 시험물질이 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질 1, 멜란-A의 발현, 활성 또는 기능을 감소시키는 경우 색소형성 유전자의 발현 억제제로 판정하는 단계를 더 포함하는 색소형성 유전자의 발현 조절 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 확인 결과, 상기 시험물질이 티로시나아제 엔코딩 유전자, 티로시나아제 관련 단백질 1 엔코딩 유전자, 멜란-A 엔코딩 유전자의 발현, 활성 또는 기능을 증가시키는 경우 색소형성 유전자의 발현 촉진제로 판정하는 단계를 더 포함하는 색소형성 유전자의 발현 조절 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 일 실시예는, 시험물질에 대한 진피세포의 재생을 촉진하는 물질을 스크리닝하는 방법으로서, (a) 서열번호 1의 miRNA를 세포에 트랜스펙션시키는 단계; (b) 상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질이 진피세포의 이동성을 증가시키는지 또는 억제하는지 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 진피세포의 재생을 촉진하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 서열번호 1의 miRNA를 세포에 트랜스펙션시키는 단계에 있어서, 상기 트랜스펙션은 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기 천공법 또는 리포좀 이용법 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 진피세포 재생 조절제 스크리닝 방법에 있어서, 상기 진피세포 이동성 조절 여부는 당업계에 널리 공지된 방법인 상처 치유 분석법(wound-healing assay)을 비롯한 이동(migration) 실험법을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포이동성과 관련있는 유전자들의 발현 정도를 이용한 발현 조절 물질 스크리닝은 시험 물질이 트로포미오신 3 엔코딩 유전자와 아그레칸 엔코딩 유전자의 발현을 촉진 혹은 억제하는지를 면역검정법(예를 들어 ELISA 또는 면역블럿)으로 확인하는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 확인 결과, 상기 시험물질이 섬유아세포의 진피세포 재생을 조절하며 세포이동성과 관련있다고 이미 알려진 트로포미오신 3 엔코딩 유전자와 아그레칸 엔코딩 유전자의 발현, 활성 또는 기능을 감소시키는 경우 세포재생을 촉진하는 촉진제로 판정하는 단계를 더 포함하는 진피세포 재생 조절 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 하기 실시예 및 시험예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
[시험예 1] hsa-miR-1248의 모방체(mimic)에 의한 티로시나아제 mRNA 감소
본 발명자들은 hsa-miR-1248의 획득기능적 연구(gain-of-functional study)를 위하여 hsa-miR-1248의 모방체를 이용하였는데, hsa-miR-1248의 모방체는 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산(oligonucleotide)으로서 이를 세포 내로 주입하여 hsa-miR-1248의 과발현 현상(overexpression)을 유도할 수 있다.
흑색종 세포주인 WM266-4에 hsa-miR-1248의 모방체(C-301375-00-0005, miRIDIAN Mimic, Human hsa-miR-1248, Dharmacon, Inc. 제품; 실시예 1)를 농도가 20μM가 되도록 리포좀(liposome)을 이용하여 트랜스펙션하여 세포 안으로 이동시켰다. 대조군은 어떠한 올리고핵산도 넣지 않은 샘플(비교예 1)과 본 발명의 miRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산(CN-001000-01-05, miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control #1, Dharmacon, Inc. 제품) 20μM을 트랜스펙션시킨 샘플(비교예 2)을 이용하였다. 트랜스펙션 후 세포는 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 약 60시간 정도 배양한 다음 트리졸(Trizol) 시약 1ml를 이용하여 RNA를 분리하였다. 트리졸을 이용하여 세포를 녹인 뒤, 원심분리기를 이용하여 상층액을 분리하고, 이소프로판올 0.35ml를 넣어 핵산의 펠렛을 형성시키고, 70% EtOH로 세척한 후 펠렛을 물에 녹여 RNA를 분리하였다. 약 1μg의 RNA를 올리고 디티(oligo dT) 및 역전사 효소(reverse transcripase)를 이용하여 cDNA를 만든 뒤, 티로시나아제 mRNA에 특이적인 프라이머(assay ID: Hs01099965_m1)를 이용하여 Applied biosystems사의 taqman 방식의 실시간 PCR을 95℃에서 10분 반응시키고, 95℃에서 10초, 60℃에서 1분 반응을 약 45번 반복시켜 수행하였다. 티로시나아제 mRNA 발현양은 하우스키핑(house keeping) 유전자인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 mRNA 발현양(assay ID: 4333764F)으로 정규화(normalization)하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1을 보면, 본 발명의 hsa-miR-1248의 모방체를 세포 내로 주입한 경우(실시예 1)에 티로시나아제 mRNA의 발현이 비교예 1 및 2에 비하여 현저하게 억제되었음을 알 수 있다.
[시험예 2] hsa-miR-1248의 모방체(mimic)에 의한 티로시나아제 단백질 감소
본 발명자들은 hsa-miR-1248의 획득기능적 연구(gain-of-functional study)를 위하여 hsa-miR-1248의 모방체를 이용하였는데, hsa-miR-1248의 모방체는 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산(oligonucleotide)으로서 이를 세포 내로 주입하여 hsa-miR-1248의 과발현 현상(overexpression)을 유도할 수 있다.
흑색종 세포주인 WM266-4에 hsa-miR-1248의 모방체(C-301375-00-0005, miRIDIAN Mimic, Human hsa-miR-1248, Dharmacon, Inc. 제품; 실시예 2)를 농도가 20μM가 되도록 리포좀(liposome)을 이용하여 트랜스펙션하여 세포 안으로 이동시켰다. 대조군은 어떠한 올리고핵산도 넣지 않은 샘플(비교예 3)과 본 발명의 miRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산(CN-001000-01-05, miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control #1, Dharmacon, Inc. 제품) 20μM을 트랜스펙션시킨 샘플(비교예 4)을 이용하였다. 트랜스펙션 후 약 60시간 후 RIPA 완충제를 이용하여 세포막을 깨고 원심분리기를 이용하여 단백질이 포함된 상층액을 추출한 뒤, BCA방식을 이용하여 약 10μg그램의 단백질을 정량하였다. 정량한 단백질로 웨스턴 블럿 실험을 수행하며 이 때 티로시나아제에 특이적인 항체(Upstate사의 05-647)를 이용하여 티로시나아제 단백질의 양을 관찰하였다. 티로시나아제 단백질 발현양은 하우스키핑(house keeping) 유전자인 GAPDH의 단백질 발현양으로 정규화(normalization)하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2를 보면, 본 발명의 hsa-miR-1248의 모방체를 세포 내로 주입한 경우(실시예 2)에 티로시나아제 단백질의 발현이 비교예 1 및 2에 비하여 현저하게 억제되었음을 알 수 있다.
[시험예 3] hsa-miR-1248의 모방체(mimic)에 의한 티로시나아제 관련 단백질 1 mRNA 감소
본 발명자들은 hsa-miR-1248의 획득기능적 연구(gain-of-functional study)를 위하여 hsa-miR-1248의 모방체를 이용하였는데, hsa-miR-1248의 모방체는 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산(oligonucleotide)으로서 이를 세포 내로 주입하여 hsa-miR-1248의 과발현 현상(overexpression)을 유도할 수 있다.
흑색종 세포주인 WM266-4에 hsa-miR-1248의 모방체(C-301375-00-0005, miRIDIAN Mimic, Human hsa-miR-1248, Dharmacon, Inc. 제품; 실시예 3)를 농도가 20μM가 되도록 리포좀(liposome)을 이용하여 트랜스펙션하여 세포 안으로 이동시켰다. 대조군은 어떠한 올리고핵산도 넣지 않은 샘플(비교예 5)과 본 발명의 miRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산(CN-001000-01-05, miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control #1, Dharmacon, Inc. 제품) 20μM을 트랜스펙션시킨 샘플(비교예 6)을 이용하였다. 트랜스펙션 후 세포는 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 약 60시간 정도 배양한 다음 트리졸(Trizol) 시약 1ml를 이용하여 RNA를 분리하였다. 트리졸을 이용하여 세포를 녹인 뒤, 원심분리기를 이용하여 상층액을 분리하고, 이소프로판올 0.35ml를 넣어 핵산의 펠렛을 형성시키고, 70% EtOH로 세척한 후 펠렛을 물에 녹여 RNA를 분리하였다. 약 1μg의 RNA를 올리고 디티(oligo dT) 및 역전사 효소(reverse transcripase)를 이용하여 cDNA를 만든 뒤, 티로시나아제 관련 단백질 1 mRNA에 특이적인 프라이머(assay ID: Hs00167051_m1)를 이용하여 Applied biosystems사의 taqman 방식의 실시간 PCR을 95℃에서 10분 반응시키고, 95℃에서 10초, 60℃에서 1분 반응을 약 45번 반복시켜 수행하였다. 티로시나아제 관련 단백질 1 mRNA 발현양은 하우스키핑(house keeping) 유전자인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 mRNA 발현양(assay ID: 4333764F)으로 정규화(normalization)하였으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3을 보면, 본 발명의 hsa-miR-1248의 모방체를 세포 내로 주입한 경우에 티로시나아제 관련 단백질 1 mRNA의 발현이 현저하게 억제되었음을 알 수 있다.
[시험예 4] hsa-miR-1248의 모방체(mimic)에 의한 멜란-A mRNA 감소
본 발명자들은 hsa-miR-1248의 획득기능적 연구(gain-of-functional study)를 위하여 hsa-miR-1248의 모방체를 이용하였는데, hsa-miR-1248의 모방체는 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산(oligonucleotide)으로서 이를 세포 내로 주입하여 hsa-miR-1248의 과발현 현상(overexpression)을 유도할 수 있다.
흑색종 세포주인 WM266-4에 hsa-miR-1248의 모방체(C-301375-00-0005, miRIDIAN Mimic, Human hsa-miR-1248, Dharmacon, Inc. 제품; 실시예 4)를 농도가 20μM가 되도록 리포좀(liposome)을 이용하여 트랜스펙션하여 세포 안으로 이동시켰다. 대조군은 어떠한 올리고핵산도 넣지 않은 샘플(비교예 7)과 본 발명의 miRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산(CN-001000-01-05, miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control #1, Dharmacon, Inc. 제품) 20μM을 트랜스펙션시킨 샘플(비교예 8)을 이용하였다. 트랜스펙션 후 세포는 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 약 60시간 정도 배양한 다음 트리졸(Trizol) 시약 1ml를 이용하여 RNA를 분리하였다. 트리졸을 이용하여 세포를 녹인 뒤, 원심분리기를 이용하여 상층액을 분리하고, 이소프로판올 0.35ml를 넣어 핵산의 펠렛을 형성시키고, 70% EtOH로 세척한 후 펠렛을 물에 녹여 RNA를 분리하였다. 약 1μg의 RNA를 올리고 디티(oligo dT) 및 역전사 효소(reverse transcripase)를 이용하여 cDNA를 만든 뒤, 멜란-A mRNA에 특이적인 프라이머(assay ID: Hs00194133_m1)를 이용하여 Applied biosystems사의 taqman 방식의 실시간 PCR을 95℃에서 10분 반응시키고, 95℃에서 10초, 60℃에서 1분 반응을 약 45번 반복시켜 수행하였다. 티로시나아제 관련 단백질 1 mRNA 발현양은 하우스키핑(house keeping) 유전자인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 mRNA 발현양(assay ID: 4333764F)으로 정규화(normalization)하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4를 보면, 본 발명의 hsa-miR-1248의 모방체를 세포 내로 주입한 경우에 멜란-A mRNA의 발현이 현저하게 억제되었음을 알 수 있다.
[시험예 5] miR-1248에 의한 멜란-A 타겟팅 바이오인포매틱 분석
멜란-A mRNA의 3'-UTR에 상보적으로 결합하는 miRNA를 선택하기 위해 바이오인포매틱 툴을 이용하였다. TargetScan(www.targetscan.org)에서 hsa-miR-1248이 타겟팅할 수 있을 것이라고 예측한 후보들 중에서 hsa-miR-1248는 멜란-A를 타겟팅할 수 있을 거라고 예측하였다. hsa-miR-1248는 성숙한 형태(mature form)의 5'으로부터 2번째에서 7번째까지 서열이 멜란-A mRNA 3'-UTR과 정확히 일치하는 '7-mer'의 결합 형태를 가지는 것으로 추측하였다. 이 결과는 도 5에 나타내었다.
[시험예 6] hsa-miR-1248의 모방체(mimic)에 의한 진피세포 재생 촉진
본 발명자들은 hsa-miR-1248의 획득기능적 연구(gain-of-functional study)를 위하여 hsa-miR-1248의 모방체를 이용하였는데, hsa-miR-1248의 모방체는 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산(oligonucleotide)으로서 이를 세포 내로 주입하여 hsa-miR-1248의 과발현 현상(overexpression)을 유도할 수 있다.
피부 섬유아세포(dermal fibroblast)에 hsa-miR-1248 모방체(C-301375-00-0005, miRIDIAN Mimic, Human hsa-miR-1248, Dharmacon, Inc. 제품; 실시예 5)를 농도가 20μM가 되도록 리포좀(liposome)을 이용하여 트랜스펙션(transfection)하여 세포 안으로 이동시켰다. 대조군은 어떠한 올리고핵산도 넣지 않은 샘플(비교예 9)과 본 발명의 miRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산(CN-001000-01-05, miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control #1, Dharmacon, Inc. 제품) 20μM을 트랜스펙션시킨 샘플(비교예 10)을 이용하였다. 트랜스펙션 후 약 48시간 후 세포가 100% 컨플루언스(confluence)로 자란 후 상처 치유 분석법을 진행하였다. 상처 치유 분석법은 황색 팁(yellow tip)으로 세포 컬쳐 플레이트를 긁어 상처(wound)를 발생시킨 뒤, 세척액(PBS. Welgene 사의 Dulbecco's phosphate buffered saline Cat# LB001-01)으로 세척한 후 다시 세포 배지를 갈아주는 것으로 수행하였다. 상처를 주고 약 48시간 뒤, 상처가 얼마나 좁혀졌는지 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6을 보면, 본 발명의 hsa-miR-1248의 모방체를 세포 내로 주입한 경우에 상처 간격이 훨씬 더 좁게 나타나 진피세포의 재생이 촉진되었음을 알 수 있다.
[시험예 7] hsa-miR-1248의 모방체(mimic)에 의한 트로포미오신 3 mRNA 감소
본 발명자들은 hsa-miR-1248의 획득기능적 연구(gain-of-functional study)를 위하여 hsa-miR-1248의 모방체를 이용하였는데, hsa-miR-1248의 모방체는 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산(oligonucleotide)으로서 이를 세포 내로 주입하여 hsa-miR-1248의 과발현 현상(overexpression)을 유도할 수 있다.
피부 섬유아세포(dermal fibroblast)에 hsa-miR-1248의 모방체(C-301375-00-0005, miRIDIAN Mimic, Human hsa-miR-1248, Dharmacon, Inc. 제품; 실시예 6)를 농도가 20μM가 되도록 리포좀(liposome)을 이용하여 트랜스펙션하여 세포 안으로 이동시켰다. 대조군은 어떠한 올리고핵산도 넣지 않은 샘플(비교예 11)과 본 발명의 miRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산(CN-001000-01-05, miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control #1, Dharmacon, Inc. 제품) 20μM을 트랜스펙션시킨 샘플(비교예 12)을 이용하였다. 트랜스펙션 후 세포는 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 약 60시간 정도 배양한 다음 트리졸(Trizol) 시약 1ml를 이용하여 RNA를 분리하였다. 트리졸을 이용하여 세포를 녹인 뒤, 원심분리기를 이용하여 상층액을 분리하고, 이소프로판올 0.35ml를 넣어 핵산의 펠렛을 형성시키고, 70% EtOH로 세척한 후 펠렛을 물에 녹여 RNA를 분리하였다. 약 1μg의 RNA를 올리고 디티(oligo dT) 및 역전사 효소(reverse transcripase)를 이용하여 cDNA를 만든 뒤, 트로포미오신 3 mRNA에 특이적인 프라이머(assay ID: Hs00383595_m1)를 이용하여 Applied biosystems사의 taqman 방식의 실시간 PCR을 95℃에서 10분 반응시키고, 95℃에서 10초, 60℃에서 1분 반응을 약 45번 반복시켜 수행하였다. 티로시나아제 관련 단백질 1 mRNA 발현양은 하우스키핑(house keeping) 유전자인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 mRNA 발현양(assay ID: 4333764F)으로 정규화(normalization)하였으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7을 보면, 본 발명의 hsa-miR-1248의 모방체를 세포 내로 주입한 경우에 트로포미오신 3 mRNA의 발현이 현저하게 억제되었음을 알 수 있다.
[시험예 8] hsa-miR-1248의 모방체(mimic)에 의한 아그레칸 mRNA 감소
본 발명자들은 hsa-miR-1248의 획득기능적 연구(gain-of-functional study)를 위하여 hsa-miR-1248의 모방체를 이용하였는데, hsa-miR-1248의 모방체는 hsa-miR-1248과 동일한 서열을 갖는 올리고핵산(oligonucleotide)으로서 이를 세포 내로 주입하여 hsa-miR-1248의 과발현 현상(overexpression) 을 유도할 수 있다.
피부 섬유아세포(dermal fibroblast)에 hsa-miR-1248의 모방체(C-301375-00-0005, miRIDIAN Mimic, Human hsa-miR-1248, Dharmacon, Inc. 제품; 실시예 7)를 농도가 20μM가 되도록 리포좀(liposome)을 이용하여 트랜스펙션하여 세포 안으로 이동시켰다. 대조군은 어떠한 올리고핵산도 넣지 않은 샘플(비교예 13)과 본 발명의 miRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산(CN-001000-01-05, miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control #1, Dharmacon, Inc. 제품) 20μM을 트랜스펙션시킨 샘플(비교예 14)을 이용하였다. 트랜스펙션 후 세포는 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 약 60시간 정도 배양한 다음 트리졸(Trizol) 시약 1ml를 이용하여 RNA를 분리하였다. 트리졸을 이용하여 세포를 녹인 뒤, 원심분리기를 이용하여 상층액을 분리하고, 이소프로판올 0.35ml를 넣어 핵산의 펠렛을 형성시키고, 70% EtOH로 세척한 후 펠렛을 물에 녹여 RNA를 분리하였다. 약 1μg의 RNA를 올리고 디티(oligo dT) 및 역전사 효소(reverse transcripase)를 이용하여 cDNA를 만든 뒤, 아그레칸 mRNA에 특이적인 프라이머(assay ID: Hs00153936_m1*)를 이용하여 Applied biosystems사의 taqman 방식의 실시간 PCR을 95℃에서 10분 반응시키고, 95℃에서 10초, 60℃에서 1분 반응을 약 45번 반복시켜 수행하였다. 티로시나아제 관련 단백질 1 mRNA 발현양은 하우스키핑(house keeping) 유전자인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 mRNA 발현양(assay ID: 4333764F)으로 정규화(normalization)하였으며, 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8을 보면, 본 발명의 hsa-miR-1248의 모방체를 세포 내로 주입한 경우에 아그레칸 mRNA의 발현이 현저하게 억제되었음을 알 수 있다.
[시험예 9] miR-1248에 의한 트로포미오신 3 타겟팅 바이오인포매틱 분석
트로포미오신 3 mRNA의 3'-UTR에 상보적으로 결합하는 miRNA를 선택하기 위해 바이오인포매틱 툴을 이용하였다. TargetScan(www.targetscan.org)에서 hsa-miR-1248이 타겟팅할 수 있을 것이라고 예측한 후보들 중에서 hsa-miR-1248은 트로포미오신 3을 타겟팅할 수 있을 거라고 예측하였다. hsa-miR-1248는 성숙한 형태(mature form)의 5'으로부터 2번째에서 7번째까지 서열이 트로포미오신 3 mRNA 3'-UTR과 정확히 일치하는 '7-mer'의 결합 형태를 가지는 것으로 추측하였다. 이 결과는 도 9에 나타내었다.
[시험예 10] miR-1248에 의한 아그레칸 타겟팅 바이오인포매틱 분석
아그레칸 mRNA의 3'-UTR에 상보적으로 결합하는 miRNA를 선택하기 위해 바이오인포매틱 툴을 이용하였다. TargetScan(www.targetscan.org)에서 hsa-miR-1248이 타겟팅할 수 있을 것이라고 예측한 후보들 중에서 hsa-miR-1248는 아그레칸을 타겟팅할 수 있을 거라고 예측하였다. hsa-miR-1248는 성숙한 형태(mature form)의 5'으로부터 2번째에서 7번째까지 서열이 아그레칸 mRNA 3'-UTR과 정확히 일치하는 '7-mer’의 결합 형태를 가지는 것으로 추측하였다. 이 결과는 도 10에 나타내었다.
본 발명에 의한 서열번호 1의 miRNA를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 또는 진피세포 재생 촉진용 조성물은 하기의 제형예와 같이 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[제형예 1] 영양화장수
하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양화장수를 제조할 수 있다.
원료명 함량(중량 %)
글리세린 8.0
부틸렌글리콜 4.0
히알루론산 추출물 5.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
서열번호 1의 miRNA 0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 8.0
스쿠알란 5.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.4
세테아릴 알코올 1.0
방부제 적량
향 적량
색소 적량
트리에탄올아민 0.1
정제수 잔량
[제형예 2] 영양로션
하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양로션을 제조할 수 있다.
원료명 함량(중량 %)
정제수 잔량
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 3.0
유동파라핀 5.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
서열번호 1의 miRNA 3.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
스쿠알란 5.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.4
폴리솔베이트 60 1.5
방부제 적량
향 적량
색소 적량
트리에탄올아민 0.1
[제형예 3] 영양크림
하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조할 수 있다.
원료명 함량(중량 %)
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 3.0
유동파라핀 7.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
서열번호 1의 miRNA 3.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
스쿠알란 5.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.4
폴리솔베이트 60 1.2
방부제 적량
향 적량
색소 적량
트리에탄올아민 0.1
정제수 잔량
[제형예 4] 마사지 크림
하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 마사지 크림을 제조할 수 있다.
원료명 함량(중량 %)
글리세린 8.0
부틸렌글리콜 4.0
유동파라핀 45.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
서열번호 1의 miRNA 1.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
밀납 4.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
세스퀴 올레인산 소르비탄 0.9
바세린 3.0
방부제 적량
향 적량
색소 적량
파라핀 1.5
정제수 잔량
[제형예 5] 팩
하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 팩을 제조할 수 있다.
원료명 함량(중량 %)
글리세린 4.0
폴리비닐알콜 15.0
히알루론산 추출물 5.0
베타글루칸 7.0
알란토인 0.1
서열번호 1의 miRNA 0.5
노닐 페닐에테르 0.4
폴리솔베이트 60 1.2
방부제 적량
향 적량
색소 적량
에탄올 6.0
정제수 잔량
[제형예 6] 연고
하기 표 6에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조할 수 있다.
원료명 함량(중량 %)
글리세린 8.0
부틸렌글리콜 4.0
유동파라핀 15.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
서열번호 1의 miRNA 1.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
스쿠알란 1.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.4
세테아릴 알코올 1.0
방부제 적량
향 적량
색소 적량
밀납 4.0
정제수 잔량
본 발명에 의한 서열번호 2의 miRNA를 유효성분으로 함유하는 백모방지 및 흑모 생성 촉진용 모발용 조성물은 하기의 제형예와 같이 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[제형예 7] 모발 샴푸
하기 표 7에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 모발 샴푸를 제조할 수 있다.
원료명 함량(중량 %)
라우릴황산나트륨액(30%) 20.0
야자유지방산디에탄올아미드 5.0
폴리쿼터늄-10 0.3
프로필렌글리콜 2.0
서열번호 2의 miRNA 0.1
피록톤올아민 0.5
황색203호 적량
파라옥시안식향산에스테르 0.2
조합향 적량
구연산 적량
정제수 잔량
[제형예 8] 모발 컨디셔닝
하기 표 8에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 모발 컨디셔닝을 제조할 수 있다.
원료명 함량(중량 %)
염화세틸트리메틸암모늄(29%) 7.0
염화디스테아릴디메틸암모늄(75%) 4.0
세토스테아릴알콜 3.5
폴리옥시에틸렌스테아릴에테르 1.0
유동파라핀 2.0
프로필렌글리콜 1.5
서열번호 2의 miRNA 0.1
조합향 적량
구연산 적량
정제수 잔량
[제형예 9] 두피 헤어토닉
하기 표 9에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 두피 헤어토닉을 제조할 수 있다.
원료명 함량(중량 %)
멘톨 0.1
D-판테놀 0.6
살리실산 0.05
글리세린 1.0
폴리옥시에틸렌경화피마자유 0.8
초산토코페롤 0.03
조합향 적량
서열번호 2의 miRNA 0.1
에탄올 30.0
정제수 잔량
[제형예 10] 두피 에센스
하기 표 10에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 두피 에센스를 제조할 수 있다.
원료명 함량(중량 %)
에탄올 30.0
폴리솔베이트 60 1.5
글리세린 3.0
카르복시비닐폴리머 0.1
트리에탄올아민 0.2
서열번호 2의 miRNA 0.1
방부제 적량
향료 및 색소 적량
정제수 잔량
[제형예 11] 주사제
하기 표 11에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 주사제를 제조할 수 있다.
원료명 중량비(1ml 당)
염화나트륨 9mg
소듐 카르복시메틸셀룰로오즈 30.0mg
Tween 20 1.0mg
서열번호 2의 miRNA 1mg
주사용 증류수 잔량
[제형예 12] 연고
하기 표 12에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조할 수 있다.
원료명 함량(중량 %)
카프린/카프릴 트리글리세리드 10
액상파라핀 10
솔비탄세스퀴올리에이트 6
옥틸도데세스-25 9
세칠에칠헥사노에이트 10
스쿠알란 1
살리실산 1
글리세린 15
솔비톨 1
서열번호 2의 miRNA 0.1
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량
[제형예 13] 로션
하기 표 13에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 로션을 제조할 수 있다.
원료명 함량(중량 %)
서열번호 2의 miRNA 0.1
밀납 4.0
폴리솔베이트 60 1.5
솔비탄세스퀴올레이트 1.5
유동파라핀 0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 3.0
프로필렌글리콜 3.0
카르복시비닐폴리머 0.1
트리에탄올아민 0.2
방부제, 색소 및 향료 적량
정제수 잔량
[제형예 14] 스프레이
하기 표 14에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 스프레이를 제조할 수 있다.
원료명 함량(중량 %)
서열번호 2의 miRNA 0.1
에탄올 80
Tween 80 5
글리세린 5
초산토코페롤 1
방부제, 색소 및 향료 적량
정제수 잔량
<110> AMOREPACIFIC <120> Composition containing microRNA <130> YPD201104-0047 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-1248 miRNA <400> 1 accuucuugu auaagcacug ugcuaaa 27 <210> 2 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-1248 miRNA <400> 2 uuuagcacag ugcuuauaca agaaggu 27

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 miRNA를 유효성분으로 함유하여 티로시나아제 엔코딩 유전자, 티로시나아제 관련 단백질 1 엔코딩 유전자 및 멜란-A 엔코딩 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 색소형성 유전자 발현을 조절하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 miRNA는 멜란-A mRNA에 결합하여 멜란-A의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 miRNA는 멜란-A mRNA 3'-UTR의 909~915번째 핵산 분자를 표적으로 함을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  6. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 miRNA에 상보적인 염기서열을 갖고, 상기 miRNA에 하이브리드될 수 있는 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자를 유효성분으로 함유하여 티로시나아제 엔코딩 유전자, 티로시나아제 관련 단백질 1 엔코딩 유전자 및 멜란-A 엔코딩 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 색소형성 유전자 발현을 조절하는 백모 방지 또는 흑모 생성 촉진용 화장료 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. (a) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 miRNA, 또는 서열번호 2의 안티센스 핵산 분자를 시험관내에서(in vitro) 세포에 트랜스펙션시키는 단계;
    (b) 상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 시험물질이 색소형성 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지 여부를 확인하는 단계;
    를 포함하는 색소형성 유전자 발현을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 (c) 단계의 확인 결과, 상기 시험물질이 색소형성 유전자의 발현, 활성 또는 기능을 증가시키는 경우는 색소형성 유전자의 발현 촉진제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 색소형성 유전자 발현을 조절하는 물질을 스크리닝 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 (c) 단계의 확인 결과, 상기 시험물질이 색소형성 유전자의 발현, 활성 또는 기능을 감소시키는 경우는 색소형성 유전자의 발현 저해제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 색소형성 유전자 발현을 조절하는 물질을 스크리닝 하는 방법.
KR1020170098819A 2017-08-04 2017-08-04 마이크로 ｒｎａ를 포함하는 조성물 KR101871920B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170098819A KR101871920B1 (ko) 2017-08-04 2017-08-04 마이크로 ｒｎａ를 포함하는 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170098819A KR101871920B1 (ko) 2017-08-04 2017-08-04 마이크로 ｒｎａ를 포함하는 조성물

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110059227A Division KR20120139430A (ko) 2011-06-17 2011-06-17 마이크로 ｒｎａ를 포함하는 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170094526A KR20170094526A (ko) 2017-08-18
KR101871920B1 true KR101871920B1 (ko) 2018-07-02

Family

ID=59753235

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170098819A KR101871920B1 (ko) 2017-08-04 2017-08-04 마이크로 ｒｎａ를 포함하는 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101871920B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100298410A1 (en) 2007-10-04 2010-11-25 Santaris Pharma A/S MICROMIRs

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100298410A1 (en) 2007-10-04 2010-11-25 Santaris Pharma A/S MICROMIRs

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lin Lin 등. J Orthop Res. Vol. 29, No. 10, 페이지 1578-1584

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170094526A (ko) 2017-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101938548B1 (ko) 마이크로 ｒｎａ를 포함하는 색소형성유전자 발현조절용 조성물
US20060165657A1 (en) Method for delivery of cosmetic by topical application
KR101849102B1 (ko) 마이크로 ｒｎａ를 포함하는 색소형성유전자 발현조절용 조성물
KR102692717B1 (ko) Tnfrsf14 억제 물질을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 tnfrsf14 억제 물질의 스크리닝 방법
KR101871920B1 (ko) 마이크로 ｒｎａ를 포함하는 조성물
KR101032271B1 (ko) 피부세포 재생용 조성물, 그 제조 방법, 피부세포 재생 방법 및 화장료 조성물
KR102152637B1 (ko) 케모카인을 함유하는 피부 미백용 조성물
KR102682748B1 (ko) Sh3bp4 억제 물질을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 sh3bp4 억제 물질의 스크리닝 방법
Zhang et al. Use of small RNA as antiaging cosmeceuticals
US9295631B2 (en) Skin lightening composition
KR102187371B1 (ko) FoxQ1 유전자가 과발현된 지방유래 줄기세포 및 이의 용도
KR101800243B1 (ko) 마이크로 ｒｎａ를 포함하는 색소형성유전자 발현조절용 조성물
KR20120139430A (ko) 마이크로 ｒｎａ를 포함하는 조성물
JP6324597B1 (ja) メラニン産生抑制剤、美白剤、遺伝子発現抑制剤、メラニン産生抑制用化粧料組成物及び美白用化粧料組成物
KR101893339B1 (ko) Gdf11을 포함하는 조성물 및 그의 용도
KR102027451B1 (ko) 마이크로 rna 및 이를 사용하는 스크리닝 방법
EP4046635A9 (en) Composition, comprising rip kinase inhibitor, for preventing hair loss or promoting hair regrowth
KR102674715B1 (ko) 줄기세포의 텔로미어의 길이를 신장시키는 방법
KR102011826B1 (ko) 인터루킨 13을 포함하는 피부 외용제 조성물
KR101852440B1 (ko) 듀옥스 2 ｍｉＲＮＡ를 포함하는 피부 세포 분화 조절용 조성물
KR101433910B1 (ko) 미백효과를 갖는 올리고뉴클레오타이드 및 이를 함유하는미백제
KR101986092B1 (ko) 유두진피 섬유아세포의 고순도 분리 방법
CN108602853A (zh) 用于预防和根治性治疗脱发的肽
KR101776000B1 (ko) miR-181a 및 이의 모방체를 포함하는 화장료 조성물
KR20200136737A (ko) Pq1 숙신산을 포함하는 피부 보습, 주름 개선 및 탄력 증진용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right