KR20200057353A - Endophilin A1 억제제를 포함하는 피부 미백용 조성물 및 피부 미백 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 명세서는 Endophilin A1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 및 피부 미백 물질의 스크리닝 방법이 개시된다. 상기 Endophilin A1 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 미백 효과를 제공할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝 방법에 따르면 Endophilin A1 유전자의 상대적 발현 억제 정도를 확인함으로써, 간편하게 피부 미백 물질을 스크리닝할 수 있다.

Description

Endophilin A1 억제제를 포함하는 피부 미백용 조성물 및 피부 미백 물질의 스크리닝 방법 {A composition for skin whitening comprising Endophilin A1 inhibiting materials and a method for screening skin whitening materials}

본 명세서는 엔도필린 A1(Endophilin A1)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물; 및 피부 미백 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

사람의 피부색을 결정하는 가장 중요한 요인은 인체 내의 멜라노사이트에서 타이로시나제 등의 여러 가지 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌으로서, 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미, 주근깨 및 점 등과 같은 과색소 침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다. 그리고 피부 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는다.

따라서 이러한 멜라닌의 생성을 억제하기 위한 연구가 진행되고 있으며, 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체, 또는 타이로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용되어 오고 있다. 그러나, 이들의 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

US 2013/0331342 A

Endophilin I siRNA (h): sc-35304, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. Endophilin II (A-11): sc-365704, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.

본 발명의 일 측면은 피부 미백과 Endophilin A1 유전자와의 관계를 규명하고자 한다.

본 발명의 일 측면은 Endophilin A1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 측면은 피부 미백 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 측면은 색소 관련 피부 상태 진단을 위한 정보 제공 방법, 키트 또는 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 측면은, 엔도필린 A1(Endophilin A1)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 측면은, 피부 미백 물질을 스크리닝하는 방법으로서, (a) 분리된 피부세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 시험물질을 처리한 피부세포에서 엔도필린 A1(Endophilin A1)의 상대적 발현량을 측정하는 단계;를 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면은 시험대상으로부터 분리된 피부세포에서 Endophilin A1의 발현량을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 Endophilin A1 발현량은 Endophilin A1의 mRNA 또는 Endophilin A1 단백질 발현량인, 색소 관련 피부 상태 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면은, Endophilin A1의 mRNA 또는 Endophilin A1 단백질 검출 시약을 포함하는 색소 관련 피부 상태 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 측면은, Endophilin A1의 mRNA 또는 Endophilin A1 단백질 검출 시약을 포함하는 색소 관련 피부 상태 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따른 신규한 피부 미백 물질 판별 마커인 Endophilin A1의 발현 또는 활성을 억제하였을 때, 멜라닌세포 내의 멜라노솜이 수상돌기 끝으로 이동하지 못하고 핵 주변에서 응집되고, 티로시나제 및 TRP2를 포함하는 멜라닌 생성에 관여하는 인자의 발현량이 감소하며, 직접적으로 멜라닌 생성량이 감소한다. 따라서, 본 발명의 일 측면에 따른 피부 미백용 조성물은 Endophilin A1의 발현 또는 활성을 억제함으로써 우수한 피부 미백 효과가 있다. 또한, 본 발명의 다른 측면에 따른 방법은 피부 미백 물질을 스크리닝하는 방법으로 시험물질이 피부 미백 물질인지를 빠르고 간단하게 판정할 수 있다. 나아가, 본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 피부에 포함된 Endophilin A1 유전자의 검출을 통하여 색소 관련 피부 상태를 빠르고 간단하게 진단할 수 있으며, 이를 통해 피부 미백과 관련된 문제를 조기에 예측 또는 판단하여 대응할 수 있다.

도 1은 Melan-a 멜라닌세포에서 Endophilin A1 또는 Endophilin A2의 발현을 억제하였을 때 멜라노좀 이동 억제 여부를 확인한 도이다. 도 1의 Control은 대조군(siRNA 미처리군), Endophilin 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Endophilin A1 siRNA 처리군, Endophilin 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Endophilin A2 siRNA 처리군을 나타내며, 화살표는 본 발명의 일 실시예에 따른 Endophilin A1 siRNA 처리 시, 멜라노솜이 핵 주변에서 응집된 것을 가리킨다.
도 2는 인간 상피 멜라닌세포에서 Endophilin A1의 발현을 억제하였을 때 멜라노좀 이동 억제 여부를 확인한 도이다.
도 3은 인간 상피 멜라닌세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 Endophilin A1 siRNA를 처리하였을 때 Endophilin A1의 발현이 억제되는지를 확인한 그래프이다. 도 3의 y축은 GAPDH 유전자 발현량을 기준으로 한 Endophilin A1 유전자의 상대적인 발현량을 나타낸다.
도 4는 인간 상피 멜라닌세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 Endophilin A1 siRNA를 처리하였을 때 멜라닌 생성이 억제되는지를 확인한 그래프이다. 도 4의 y축은 BCA 정량법으로 정량한 단백질 농도를 기준으로 하였을 때의 상대적인 멜라닌 생성량을 나타낸다.
도 5는 인간 상피 멜라닌세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 Endophilin A1 siRNA를 각각 48시간, 72시간 동안 처리하였을 때의 티로시나제(Tyrosinase) 및 TRP2의 웨스턴 블랏(Western Blot) 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 명세서에서 "피부"는 생물의 외부를 덮고 있는 기관을 의미하는 것으로서 표피, 진피 및 피하지방층으로 구성되어 있으며 얼굴 또는 몸 전체의 외부를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발을 포함하는 최광의의 개념이다.

본 명세서에서 "유전자의 발현"이라 함은 전사, 번역 및 번역 후 변형 등을 포함하는 최광의의 개념이다.

본 명세서에서 "엔도필린 A1(Endophilin A1)"이라 함은 BAR & SH3(Src homology 3) 도메인을 포함하는 단백질인 엔도필린(Endophilin)을 Endophilin A1, A2, A3, B로 구분할 수 있는데, 이 중 Endophilin A1을 의미하며, Endophilin A1은 단백질 Endophilin A1, 또는 상기 단백질 Endophilin A1을 코딩하는 유전자인 DNA, mRNA 등을 의미할 수 있고, 상기 코딩 유전자는 에스에이치3 도메인 콘테이닝 GRB2 유사 2(SH3 domain containing GRB2 like 2, SH3GL2)일 수 있으며, 본 명세서에서 Endophilin A1 및 SH3GL2는 교환하여 사용될 수 있다. Endophilin의 주요한 역할은 막 리모델링(Membrane remodeling) 및 소수포(Vesicle) 형성인데 특히, Endophilin A1은 시냅스에서 신경전달물질의 재사용(Recycle)을 돕는 것으로 알려져있다. 시냅스에서 Endophilin은 용해(soluble)된 형태로 존재하다가 신경전달물질(neurotransmitter)이 재사용될 때, 원형질막(plasma membrane)에 위치하여 디나민(dynamin)과 결합하여 막의 굽어짐(membrane-bending) 및 분리(scission)에 주요한 역할을 하며 신경전달물질은 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 재사용되는 것으로 알려져 있다(Cell. 2010 29:143(3): 430-441, J Cell Sci 2011 124:133-143). 이에, 본 발명자들은 Endopilin이 멜라닌세포(Melanocyte)에서 멜라노솜(Melanosome)을 수상돌기 끝(Dendrite tip)에 위치시키거나 디나민 복합체(dynamin complex)를 통해 엑소시토시스(exocytosis) 및 각질형성세포 이동(keratinocyte transfer)에 관여하는 등 멜라노솜 이동에 관여하는 것으로 가정하여 연구를 수행한 끝에 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에서 "피부 미백"은 멜라노솜 이동 억제 또는 멜라닌 생성 억제 등 다양한 원인으로 피부세포 내 멜라닌 양을 감소시킴으로써 피부색을 밝게 하고 색소 침착을 방지하며 피부톤을 균일하게 하는 것을 의미한다.

본 발명은 일 관점에서, 엔도필린 A1(Endophilin A1)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 Endophilin A1의 발현 또는 활성 촉진 물질은 Endophilin A1 mRNA의 번역을 억제하는 물질일 수 있으며, 구체적으로 Endophilin A1 mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 Endophilin A1의 발현 또는 활성 억제제는 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상을 유도하는 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 측면에서, Endophilin A1 유전자의 mRNA 발현을 억제하기 위해 상기 Endophilin A1 mRNA의 간섭을 유도하는 RNAi현상을 이용하여 피부 미백 효과를 가져올 수 있다. miRNA는 세포 내에 존재하는 작은 RNA(endogenous small RNA)의 일종으로 단백질을 합성하지 않는 DNA에서 유래되어 헤어핀-구조 전사체(hairpin-shaped transcript)로부터 생성이 된다. miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR의 상보적 서열(sequence)에 결합하여 그 mRNA의 번역 억제 또는 불안정화를 유도하여, 궁극적으로 그 표적 mRNA의 단백질 합성을 억제하는 리프레서(repressor) 역할을 하게 된다. 하나의 miRNA는 여러 개의 mRNA를 타겟팅하며, mRNA 역시 여러 개의 miRNA에 의해 조절될 수 있다고 알려져있다. RNAi 현상을 유도하는 다른 RNA로 19 내지 27 mer 내외의 짧은 RNA인 short interfering RNA(siRNA)가 있으며, 짧은 헤어핀(short hairpin) 구조를 가지는 shRNA가 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열과 85% 이상의 상동성을 가지면서 Endophilin A1 mRNA에 결합할 수 있는 서열;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열로 표시될 수 있다.

구체적으로, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1의 서열 및 상기 서열번호 1에 혼성화 가능한 서열로 표시될 수 있고, 상기 서열번호 1의 서열 및 서열번호 2의 서열로 표시될 수 있으며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열은 혼성화될 수 있다. 또는 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 3의 서열 및 상기 서열번호 3에 혼성화 가능한 서열로 표시될 수 있고, 상기 서열번호 3의 서열 및 서열번호 4의 서열로 표시될 수 있으며, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열은 혼성화될 수 있다. 또는 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5의 서열 및 상기 서열번호 5에 혼성화 가능한 서열로 표시될 수 있고, 상기 서열번호 5의 서열 및 서열번호 6의 서열로 표시될 수 있으며, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 서열은 혼성화될 수 있다. 또는 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 7의 서열 및 상기 서열번호 7에 혼성화 가능한 서열로 표시될 수 있고, 상기 서열번호 7의 서열 및 서열번호 8의 서열로 표시될 수 있으며, 상기 서열번호 7 및 서열번호 8의 서열은 혼성화될 수 있다.

구체적으로 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열과 85% 이상의 상동성을 가지면서 Endophilin A1 mRNA에 결합할 수 있는 서열로 표시될 수 있고, 보다 구체적으로 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열과 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상 또는 98% 이상의 상동성을 가지면서 Endophilin A1 mRNA에 결합할 수 있는 서열로 표시될 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는 리포좀(liposome)에 포집 또는 벡터에 삽입된 형태로 포함될 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 내지 1000 nM일 수 있으며, 구체적으로, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 nM 이상, 2 nM 이상, 4 nM 이상, 6 nM 이상, 8 nM 이상, 10 nM 이상, 12 nM 이상, 14 nM 이상, 16 nM 이상, 18 nM 이상, 20 nM 이상, 22 nM 이상, 24 nM 이상, 26 nM 이상, 28 nM 이상, 30 nM 이상, 32 nM 이상, 34 nM 이상, 36 nM 이상, 38 nM 이상, 40 nM 이상, 42 nM 이상, 44 nM 이상, 46 nM 이상, 48 nM 이상, 50 nM 이상, 52 nM 이상, 54 nM 이상, 56 nM 이상, 58 nM 이상, 60 nM 이상, 70 nM 이상, 80 nM 이상, 90 nM 이상, 100 nM 이상, 200 nM 이상, 300 nM 이상, 400 nM 이상 또는 500 nM 이상일 수 있고, 1000 nM 이하, 900 nM 이하, 800 nM 이하, 700 nM 이하, 600 nM 이하, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 90 nM 이하, 80 nM 이하, 70 nM 이하, 60 nM 이하, 58 nM 이하, 56 nM 이하, 54 nM 이하, 52 nM 이하, 50 nM 이하, 48 nM 이하, 46 nM 이하, 44 nM 이하, 42 nM 이하, 40 nM 이하, 38 nM 이하, 36 nM 이하, 34 nM 이하, 32 nM 이하, 30 nM 이하, 28 nM 이하, 26 nM 이하, 24 nM 이하, 22 nM 이하 또는 10 nM 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 올리고뉴클레오티드의 농도가 상기 범위 내일 때, Endophilin A1의 발현 또는 활성 억제 효과가 우수하며, 피부 미백용 조성물로서 적합하다.

상기 피부 미백용 조성물은 상기 Endophilin A1의 발현 또는 활성 억제제를 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 내지 30 중량%로 포함할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 Endophilin A1의 mRNA 서열은 NCBI Reference Sequence : NM_003026이며, 보다 구체적으로 하기의 서열번호 9의 염기 서열로 표시될 수 있다.

1 agttggcgcc agcatccagg taccgcgcgc cacagcacct gcctgggcgt tcccgcgctt

61 ggggcggggc ttcccgcgtc ccctttaaga ggccgcatca cccgcccttg acgtcagagt

121 gtttctccgc aagagcccgt gtcccgctag gctccgcgcc ctcgcgccca tagccccggc

181 ggcggcacga ccagaggcgg ccaggggagc gcgccgcccc gctcggccct ccagtcccgc

241 tccgccgcct ccctcccgca cagcagccgc cagcgcggcc tcctgcacca tgtcggtggc

301 cggcctcaag aagcagttcc ataaagccac tcagaaagtg agtgagaagg ttggaggagc

361 tgaaggaacc aagctagatg atgacttcaa agagatggaa aggaaagtgg atgtcaccag

421 cagggctgtg atggaaataa tgactaaaac aattgaatac cttcaaccca atccagcttc

481 cagagctaag ctcagcatga tcaacaccat gtcaaaaatc cgtggccagg agaaggggcc

541 aggctatcct caggcagagg cgctgctggc agaggccatg ctcaaatttg gaagagagct

601 tggagatgat tgcaactttg gcccagcact tggtgaggtc ggggaggcca tgcgggaact

661 gtcggaggtc aaagactctt tggacataga agtgaagcag aacttcattg accctcttca

721 gaatcttcat gacaaagatc ttagggaaat tcaacatcat ctaaagaagt tggagggtcg

781 acgcctggat tttgattata agaagaaacg acaaggcaag attccggatg aagagcttcg

841 tcaagctcta gagaaatttg atgagtctaa ggaaattgct gagtcaagca tgttcaatct

901 cttggagatg gatattgaac aagtgagcca gctctctgca cttgtgcaag ctcagctgga

961 gtaccacaag caggcagtcc agatcctgca gcaagtcacg gtcagactgg aagaaagaat

1021 aagacaggct tcatctcagc ctagaaggga atatcaacct aaaccacgaa tgagcctgga

1081 gtttccaact ggagacagta ctcagcccaa tgggggtctc tcccacacag gcactcccaa

1141 accttcaggt gtccaaatgg atcagccctg ctgccgagct ctgtacgact ttgaacctga

1201 aaatgaaggg gagttgggat ttaaagaggg cgatatcatc acactcacta accaaattga

1261 tgagaactgg tatgagggga tgctgcatgg ccattcaggc ttcttcccca tcaattatgt

1321 ggaaattctg gttgccctgc cccattagga tgttatgctg gctggctcgc ctcctcttga

1381 cccagatagt tacggttaac cactgctttg gcaatgctgc ttataacaca tcccaagtgc

1441 aggccgcagt ggtccacgtc atccagcccc accaagtgac tttggttgac ttgtgggctc

1501 ccacaggagt catggtgatg gatgatatcc tcttagcctg gtgggcgtgg catgtgcttt

1561 ttaaaacatc atctgagacc agccagtagt cacagaactg ctgtttacac agttctcagg

1621 aggctgtggt ttcttagaat atgaccatga gccatttcac agaaaaacca tcccaccgaa

1681 gatattgtct atcaccccag gggccatctg aaggtctctt tgcatttctc catgcaaaga

1741 ggagaaagct tttgctttca cactgtccct tcccaaatat gtgagtcatg gaattgtcaa

1801 agtaagcctt ccctcaccag caaattgtct cctgatctga atgaatttgt ctcttaatgc

1861 atccatagaa aagtgttaat tgtgggttca aagcattctc tgcaaatagg catctcagct

1921 cctcacactt atggctattt ctgacgtata gccagttttc ttccctcctt gctattaaag

1981 ccagagcggt aattccaaat tatttttcag taagacagtt aatcagcatt attgtgagag

2041 ggactgaaaa gaaattctcc attatgagga attgggaaga aatctggtat ccaagcttaa

2101 atttcttgct atacagaaac tatgtatgta tttaggctat ttctgaaggg cacagggaag

2161 ggggaacaaa tatcttcact tcagttttat ttgtgaatta catgtttcat gaatccattt

2221 ggcacagaga cacaaggaag aaaacactag taaccatctt tccactagtt catatactga

2281 gaaacagtaa atacctttcc tttccacttt taccctgtgt tctttgaaca tcatttgtgc

2341 agattctgcc ctcaatgagg accaaataaa gatgattttt gtgcttagca gtttaaggta

2401 tatggctgca tatgcaaaac tctttcccaa ttcagtcgct acttttactt ctgccctttc

2461 tatccatcgt cttcattttg tgtgtacagt gctgtgtgta agcttatcag tgtgtttttt

2521 tatttgtatc agtcatgaaa gtcctgttag gtatccagag ttctatttat ctagctgtac

2581 agactctttc agaggtttaa cgtgctgctt ccgatgtgcc acctgcagta gtggatcatg

2641 tggagtgaaa ggcaaatctt actgcttaat gtataaactc tcaccacagg aagcatcgct

2701 gtttccaata aatattgctg aagacagaac caaaaaaaaa aa

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 조성물은 피부 외용제 조성물일 수 있으며, 보다 구체적으로 화장품 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 화장품 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 포말(foam) 또는 에어로졸 조성물의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

일 실시예로서, 상기 화장품 조성물은 상기한 물질 이외에 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 화장품 조성물은 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함할 수 있다. 또한 상기 화장품 조성물은 일 실시예로서, 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한(制汗)제를 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.

일 실시예로서 상기 약학적 조성물은 피부 색소 과침착에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물일 수 있으며, 예를 들면 염증 후 과다색소침착, 기미, 주근깨, 밀크커피색반점, 기타 멜라닌 과다색소침착, 흑색점, 달리 분류되지 않은 백피증, 멜라닌 형성 감소된 기타 장애, 색소성 자색반피부병, 뱀모양 혈관종, 기타 명시된 색소침착의 장애, 철색소침착, 문신색소침착 및 상세불명의 색소침착장애로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료용일 수 있다.

또한, 일 실시예로서 상기 약학적 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 경구, 경피(trandermally), 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다. 일 실시예로서 상기 약학적 조성물은 주사제, 피부 외용 용액제, 현탁제, 유액제, 겔, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 계면 활성제, 부형제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제 또는 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물의 유효 성분은 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 사용 용량은 예를 들어 0.1mg/kg/일 내지 5000mg/kg/일, 보다 구체적으로는 50 mg/kg/일 내지 500 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 실시예로서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물을 포함한다.

상기 건강식품기능 조성물은 다양한 형태의 식품 첨가제 또는 기능성 식품을 포함한다. 상기 조성물을 포함하는 침출차, 액상차, 음료, 발효유, 치즈, 요구르트, 주스, 생균제제 및 건강보조식품 등으로 가공될 수 있으며, 그 외 다양한 식품 첨가제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 Endophilin A1을 이용하여 피부 미백 물질을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 스크리닝 방법은 (a) 분리된 피부세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 시험물질을 처리한 피부세포에서 엔도필린 A1(Endophilin A1)의 상대적 발현량을 측정하는 단계;를 포함할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 피부 세포는 인간, 마우스, 기니아 피그, 돼지, 조류 등에서 유래된 피부 세포일 수 있다. 상기 피부 세포는 멜라닌세포(melanocyte)를 포함할 수 있다. 다른 일 측면에서, 상기 피부 세포는 사람의 정상 멜라닌세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예로, 상기 "상대적 발현량"은 시험물질을 처리하기 전의 피부세포에서의 Endophilin A1의 발현량에 대한 시험물질을 처리한 후 피부세포에서의 Endophilin A1의 발현량을 비교하였을 때 발현이 억제된 정도일 수 있다. 또는, "상대적 발현량"은 시험 물질을 처리한 피부세포에서의 Endophilin A1의 발현량을 시험 물질을 처리하지 않은 피부세포에서의 Endophilin A1의 발현량과 비교하였을 때의 발현이 억제된 정도일 수 있다. 상기 상대적 발현량은 예컨대, mRNA의 상대적 발현량 또는 단백질의 상대적 발현량을 포함할 수 있다.

상기 관점에서, 일 실시예에 따른 상기 (b) 단계는 피부세포에 시험물질의 처리하기 전과 후의 Endophilin A1 발현량을 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 또는, 일 실시예로서 상기 (b) 단계는 시험물질을 처리한 피부세포와 시험물질을 처리하지 않은 멜라닌세포의 Endophilin A1 발현량을 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 일 실시예는 상기 (b) 단계의 상대적 발현량을 측정한 결과 Endophilin A1의 발현량이 감소한 경우, 상기 시험물질을 피부 미백 물질로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 상기 피부 미백 물질로 판정하는 단계는 "상대적 발현량"이 약 10% 이상 감소한 경우, 피부 미백 물질로 판정하는 것을 포함할 수 있다. 즉, 시험물질을 처리하기 전의 피부세포에서의 Endophilin A1의 발현 정도에 대한 시험물질을 처리한 후 피부세포에서의 Endophilin A1의 발현 정도를 비교하였을 때 발현이 약 10% 이상 감소한 경우, 피부 미백 물질로 판정할 수 있다. 또는, 시험 물질을 처리한 피부세포에서의 Endophilin A1의 발현 정도를 시험 물질을 처리하지 않은 피부세포에서의 Endophilin A1의 발현 정도와 비교하였을 때의 발현이 약 10% 이상 감소한 경우, 피부 미백 물질로 판정할 수 있다. 예를 들어, 상기 Endophilin A1의 상대적 발현량의 감소 정도는 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 25% 이상, 26% 이상, 27% 이상, 28% 이상, 29% 이상, 30% 이상, 31% 이상, 32% 이상, 33% 이상, 34% 이상, 35% 이상, 36% 이상, 37% 이상, 38% 이상, 39% 이상, 40% 이상, 41% 이상, 42% 이상, 43% 이상, 44% 이상, 45% 이상, 46% 이상, 47% 이상, 48% 이상, 49% 이상, 50% 이상, 51% 이상, 52% 이상, 53% 이상, 54% 이상, 55% 이상, 56% 이상, 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상 또는 90% 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 발현 정도는 통계적 유의성을 확보한 상태에서 측정된 결과이다. 통계적 유의성이라는 개념은 생물학적 통계분석법을 통하여 유의적인 차이를 보이는 경우로, 정량적인 경우 p value가 0.05 미만으로 차이가 나는 경우를 포함한다.

일 실시예에 따른 상기 (a) 단계에서, 상기 시험물질은 세포의 리포좀(liposome) 또는 백터(vector)에 트렌스펙션시킬 수 있으며, 세포는 멜라닌세포, 즉 멜라노사이트(melanocyte)일 수 있다. 상기 트랜스펙션은 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기 천공법 또는 리포좀 이용법 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 일 실시예로서, 상기 Endophilin A1의 발현 정도는, 공지의 기술, 예컨대, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 엘라이자(ELISA), 웨스턴블럿(Western Blot) 또는 이뮨 블럿(Immune Blot)을 이용하여 확인할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예는 상기 Endophilin A1를 색소 관련 피부 상태 정도를 진단할 수 있는 바이오 마커로서 제공할 수 있으므로, 본 발명의 다른 일 실시예는 이를 이용하여 색소 관련 피부 상태 진단용 조성물 또는 색소 관련 피부 상태 진단용 키트를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 일 실시예는 이를 이용한 색소 관련 피부 상태 진단을 위한 정보 제공 방법 또는 색소 관련 피부 상태 진단방법을 제공할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예는 시험대상으로부터 분리된 피부세포에서 Endophilin A1의 발현량을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 Endophilin A1 발현량은 Endophilin A1의 mRNA 또는 Endophilin A1 단백질 발현량인 색소 관련 피부 상태 진단을 위한 정보 제공 방법 또는 색소 관련 피부 상태 진단방법을 제공할 수 있다.

일 실시예로서 상기 방법들은 상기 시험대상으로부터 분리된 피부세포에서의 Endophilin A1 발현량을 정상대조군 피부세포에서의 Endophilin A1 발현량과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 일 실시예로서 상기 시험대상으로부터 분리된 피부세포 및 정상대조군 피부세포는 멜라닌세포(melanocyte)일 수 있다.

또한, 일 실시예로서 상기 방법들은 상기 시험대상으로부터 분리된 피부 세포에서의 Endophilin A1 발현량이 정상대조군 피부세포에서의 Endophilin A1 발현량보다 높은 경우 색소 관련 피부 상태에 이상이 있는 것으로 정보를 제공하거나, 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 시험대상으로부터 분리된 피부세포에서의 Endophilin A1 발현량이 정상대조군 피부세포에서의 Endophilin A1 발현량보다 약 10% 이상 높은 경우, 색소 관련 피부 상태에 이상이 있는 것으로 판단할 수 있다. 보다 구체적으로, 예를 들어, 상기 시험대상으로부터 분리된 피부세포에서의 Endophilin A1의 발현량이 정상대조군 피부세포에 비하여, 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 25% 이상, 26% 이상, 27% 이상, 28% 이상, 29% 이상, 30% 이상, 31% 이상, 32% 이상, 33% 이상, 34% 이상, 35% 이상, 36% 이상, 37% 이상, 38% 이상, 39% 이상, 40% 이상, 41% 이상, 42% 이상, 43% 이상, 44% 이상, 45% 이상, 46% 이상, 47% 이상, 48% 이상, 49% 이상, 50% 이상, 51% 이상, 52% 이상, 53% 이상, 54% 이상, 55% 이상, 56% 이상, 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상 또는 90% 이상 높은 경우, 색소 관련 피부 상태에 이상이 있는 것으로 판단할 수 있다. 상기 발현량은 통계적 유의성을 확보한 상태에서 측정된 결과이다. 통계적 유의성이라는 개념은 생물학적 통계분석법을 통하여 유의적인 차이를 보이는 경우로, 정량적인 경우 p value가 0.05 미만으로 차이가 나는 경우를 포함한다.

본 발명의 일 실시예는 상기 Endophilin A1의 mRNA 또는 Endophilin A1 단백질 검출 시약을 포함하는 색소 관련 피부 상태 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

또다른 본 발명의 일 실시예는 상기 Endophilin A1의 mRNA 또는 Endophilin A1 단백질 검출 시약을 포함하는 색소 관련 피부 상태 진단용 키트를 제공할 수 있으며, 상기 키트는 상술된 색소 관련 피부 상태 진단을 위한 정보 제공 방법 또는 색소 관련 피부 상태 진단방법이 기재되어 있는 지시서를 더 포함할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 색소 관련 피부 상태 진단용 조성물 또는 색소 관련 피부 상태 진단용 키트에 포함되는 Endophilin A1 mRNA 검출 시약은 Endophilin A1에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 실시예로서 상기 Endophilin A1 단백질 검출 시약은 Endophilin A1에 특이적으로 결합하는 항체 및 프로브 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 "프로브(probe)"란 유전자의 표적 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 또는 폴리뉴클레오티드와 이에 결합된 표지 물질을 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "프라이머(primer)"란 유전자의 표적 부위에 해당하는 특정 영역을 PCR을 이용하여 증폭하기 위하여 사용하는 유전자 특정 영역의 말단에 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그 변이체를 의미한다. 상기 프라이머는 특정 영역 말단과 완전히 상보적일 것을 요구하지 않으며, 상기 말단에 혼성화되어 이중사슬 구조를 형성할 정도로 상보적이라면 사용될 수 있다.

본 명세서에서 "혼성화(hybridization)"란 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다.

혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 뿐 아니라 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.

본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"란 복수개의 뉴클레오티드의 중합체를 의미하는 것으로, 통상적인 의미의 수십개의 뉴클레오티드의 중합체인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 광의의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

이하, 제조예, 실시예, 비교예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 제조예, 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

[ 제조예 ] Endophilin A1의 발현 또는 활성을 억제하는 Endophilin A1 mRNA 서열에 특이적인 siRNA 제조

Endophilin A1의 loss-of-functional study를 위하여 Endophilin A1 mRNA 서열에 특이적인 siRNA를 이용하였는데, 이 때 참고한 데이터베이스는 다음과 같다.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_003026.3

Endophilin A1 siRNA 서열은 하기와 같으며, 하기 서열은 Dharmacon사의 validated siRNA 서열을 구입하여 확보한 것이다.

실시예 1 : Endophilin A1 siRNA #1 서열

Sense: 5'- CAACCUAAACCACGAAUGA -3' (서열번호 1)

Antisense: 5'- UCAUUCGUGGUUUAGGUUG -3' (서열번호 2)

실시예 2 : Endophilin A1 siRNA #2 서열

Sense: 5'- ACAAAGAUCUUAGGGAAAU -3' (서열번호 3)

Antisense: 5'- AUUUCCCUAAGAUCUUUGU -3' (서열번호 4)

실시예 3 : Endophilin A1 siRNA #3 서열

Sense: 5'- GAUAUCAUCACACUCACUA -3' (서열번호 5)

Antisense: 5'- UAGUGAGUGUGAUGAUAUC -3' (서열번호 6)

실시예 4 : Endophilin A1 siRNA #4 서열

Sense: 5'- UAAAGAAGUUGGAGGGUCG -3' (서열번호 7)

Antisense: 5'- CGACCCUCCAACUUCUUUA -3' (서열번호 8)

[ 실험예 1] Melan -a 멜라닌세포에서 Endophilin 발현 억제에 의한 멜라노좀 이동 억제 효과

Endophilin에 속하는 Endophilin A1 및 A2의 발현 억제에 의한 피부 미백 효과를 확인하기 위해, 상기 제조예의 Endophilin A1 siRNA (실시예 1 내지 4) 및 비교예로서 Endophilin A2 siRNA (비교예 1, Dharmacon, On-Target Plus human SH3GL2siRNA)을 이용하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, C57BL/6J(Black, a/a) 마우스로부터 유래된 Melan-a 멜라닌세포(Melanocyte)에 상기 실시예 1 내지 4의 Endophilin A1 siRNA 4종의 혼합물 50nM 및 상기 비교예 1의 Endophilin A2 siRNA 50nM를 각각 Lipofectamin RNAiMAX reagent (Invitrogen)을 사용해 48시간 동안 처리한 뒤, 2% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액으로 15분간 상온에서 고정하였다. 그런 다음, DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 15분씩 3번 씻어낸 뒤, pH 6.8 인산칼륨 버퍼(PotassinM phosphate buffer)로 만든 0.1% DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine) 용액을 처리하여 37℃에서 5시간 동안 배양한 후 염색한 세포를 광학 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과는 도 1과 같다.

도 1에 나타난 바와 같이, 대조군(siRNA 미처리군) 대비 실시예 1 내지 4의 Endophilin A1 siRNA를 처리한 세포에서 멜라노솜(Melanosome)이 수상돌기 끝(Dendrite tip)으로 이동하지 못하고 핵(Nuclear) 주변에서 응집(aggregation)되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 한편, Endophilin A2 siRNA를 처리한 세포에서는 멜라노솜 응집(Melanosome aggregation)을 확인하지 못했다. 이를 통해, Endophilin A1 발현 또는 활성을 억제 시, 멜라닌세포 내의 멜라노솜에서 만들어진 멜라닌이 주변 다른 세포에 전달되지 않는바, Endophilin A1의 발현 또는 활성 억제제는 피부 미백에 효과가 있음을 알 수 있었다.

[ 실험예 2] 인간 상피 멜라닌세포에서 Endophilin 발현 억제에 의한 멜라노좀 이동 억제 효과

Endophilin A1의 발현 억제에 의한 피부 미백 효과를 확인하기 위해, 상기 제조예의 Endophilin A1 siRNA (실시예 1 내지 4)를 이용하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 인간 상피 멜라닌세포(HnMan Epidermal Melanocyte)에 상기 실시예 1 내지 4의 Endophilin A1 siRNA 4종의 혼합물 50 nM를 Lipofectamin RNAiMAX reagent (Invitrogen)를 사용해 48시간 동안 처리한 후, 멜라노솜 마커(Melanosome marker)인 티로시나제(Tyrosinase)를 면역형광염색법을 통해 멜라노솜 이동을 관찰하였다. 상기 면역형광염색법은 구체적으로, 3.5% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 10분간 고정한 뒤, 1차 항체(Anti-Tyrosinase antibody, Millipore)(1 : 1000 dilution)를 처리하고 하룻밤 동안 배양하였다. 그런 다음 2차 항체(Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 594, Invitrogen)(1 : 3000 dilution)를 처리하여 1시간 동안 배양한 다음 형광현미경으로 관찰하였으며, 그 결과는 도 2와 같다.

멜라노솜 마커인 티로시나제 염색을 통해 멜라노솜 이동을 예상할 수 있는데, 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군(siRNA 미처리군)은 멜라노솜이 수상돌기 끝으로이동한 반면, 실시예 1 내지 4의 Endophilin A1 siRNA를 처리한 세포에서는 멜라노솜(Melanosome)이 수상돌기 끝(Dendrite tip)으로 이동하지 못하고 핵(Nuclear) 주변에서 응집(aggregation)되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, Endophilin A1 발현 또는 활성을 억제 시, 멜라닌세포 내의 멜라노솜에서 만들어진 멜라닌이 주변 다른 세포에 전달되지 않는바, Endophilin A1의 발현 또는 활성 억제제는 피부 미백에 효과가 있음을 알 수 있었다.

[ 실험예 3] 인간 상피 멜라닌세포에서 Endophilin A1 siRNA에 의한 Endophilin A1 발현 억제 확인

상기 실험예들을 통해 Endophilin A1 발현 또는 활성 억제 시, 피부 미백 효과가 있음을 확인하였는바, 상기 실험예들에서 사용된 상기 제조예의 Endophilin A1 siRNA (실시예 1 내지 4)의 Endophilin A1 발현 억제 효과를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 인간 상피 멜라닌세포(HnMan Epidermal Melanocyte)에 상기 실시예 1 내지 4의 Endophilin A1 siRNA 4종의 혼합물 50 nM를 Lipofectamin RNAiMAX reagent (Invitrogen)를 사용해 48시간 동안 처리한 후, mRNA 발현량을 확인하기 위해 트리졸(Trizol)로 세포 수확(Cell Harvest)을 진행하였다. 그런 다음, RNA를 분리하고 RT-PCR(reverse transcriptional polymerase chain reaction)을 통해 cDNA를 합성하였다. 이후, 합성된 cDNA을 사용해 Taqman real-time PCR을 수행하여 Endophilin A1 발현량을 측정하였으며, 이 때 상기 Endophilin A1 발현량은 GAPDH 유전자(house-keeping gene)의 발현량을 기준으로 하여 상대적인 양을 측정하였으며, 그 결과는 도 3과 같다. 도 3에서, CTL은 siRNA 미처리군, siNC는 본 발명의 siRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산인 하기 서열번호 10 내지 13(Dharmacon, On-Target Plus Non-Tageting Control Pool)의 siNC의 혼합물을 처리한 군이다.

siNC #1 서열: 5'- UGGUUUACAUGUCGACUAA -3' (서열번호 10)

siNC #2 서열: 5'- UGGUUUACAUGUUGUGUGA -3' (서열번호 11)

siNC #3 서열: 5'- UGGUUUACAUGUUUUCUGA -3' (서열번호 12)

siNC #4 서열: 5'- UGGUUUACAUGUUUUCCUA -3' (서열번호 13)

도 3에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1 내지 4의 Endophilin A1 siRNA를 처리한 세포는 대조군(CTL) 대비 Endophilin A1 발현량이 20% 이하로 줄어드는 것을 확인하였다. 이를 통해, Endophilin A1에 특이적인 siRNA에 의해 Endophilin A1의 발현 억제가 잘 이루어지는 것을 알 수 있었다.

[ 실험예 4] 인간 상피 멜라닌세포에서 Endophilin A1 발현 억제에 의한 멜라닌 생성 억제 확인

상기 실험예들을 통해 Endophilin A1 발현 또는 활성 억제 시, 피부 미백 효과가 있음을 확인하였는바, Endophilin A1 발현 또는 활성 억제에 의해 멜라닌 생성이 억제되는지를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 인간 상피 멜라닌세포(HnMan Epidermal Melanocyte)에 상기 실시예 1 내지 4의 Endophilin A1 siRNA 4종의 혼합물 50 nM를 Lipofectamin RNAiMAX reagent (Invitrogen)를 사용해 72시간 동안 처리한 후, 세포를 트립신을 처리하여 떼어내었다. 그런 다음, RIPA Lysis& Extraction Buffer (Thermo Ficher Scitentific사)를 30μL 처리하여 4℃에서 30 분 동안 둔 뒤, 13000rpm으로 20분간 원심분리기(Centrifuge)로 펠릿(pellet)과 상층액(supernatant)로 분리하고 상기 상층액은 Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Ficher Scitentific사)로 단백질 정량을 실시하고 펠릿은 1N NaOH를 넣고 55℃에서 30분 동안 녹인 후 490nm 흡광도로 측정을 진행하였다. 이후, BCA Protein Assay kit로 정량한 단백질의 농도 대비 상대적인 멜라닌 생성량을 비교 측정하여 도 4에 나타내었다. 도 4에서, CTL은 siRNA 미처리군, siNC는 본 발명의 siRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산인 상기 서열번호 10 내지 13의 올리고핵산(Dharmacon, On-Target Plus Non-Tageting Control Pool) 4종의 혼합물을 처리한 군이다.

도 4에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1 내지 4의 Endophilin A1 siRNA를 처리한 세포는 대조군(CTL) 대비 Endophilin A1 발현량이 약 30% 정도로 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해, Endophilin A1의 발현 또는 활성 억제에 의해 멜라닌 생성 역시 억제되는 것을 알 수 있었다.

[ 실험예 5] 인간 상피 멜라닌세포에서 Endophilin A1 발현 억제에 의한 멜라닌 생성 관여 인자에의 영향 확인

상기 실험예들을 통해 Endophilin A1 발현 또는 활성 억제 시, 피부 미백 효과가 있음을 확인하였는바, Endophilin A1 발현 또는 활성 억제에 의해 멜라닌 생성에 관여하는 인자에 영향을 끼치는지를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 인간 상피 멜라닌세포(HnMan Epidermal Melanocyte)에 상기 실시예 1 내지 4의 Endophilin A1 siRNA 4종의 혼합물 50 nM를 Lipofectamin RNAiMAX reagent (Invitrogen)를 사용해 각각 48시간, 72시간 동안 처리한 후, RIPA Buffer로 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏(Western Blot)을 진행하였다. BSA 정량법으로 단백질을 정량하여 동량의 단백질 10ug을 10% SDS-PAGE 겔을 이용하여 전기영동 한 후, 200mA로 2시간 동안 PVDF(Bio-rad) 막에 블로팅(Blotting)하였다. 이 블롯(blot)을 TBS-T 용액 내 3% BSA으로 1시간 동안 블로킹(Blocking)한 후, 티로시나제(Tyrosinase) 및 TRP2 1차 항체를 4℃에서 하룻밤동안 반응시킨 다음, HRP(Horse radish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 실온에서 2시간 붙인 다음 ECL(enhanced chemilnMicescence, Amersham) 키트를 이용하여 Amersham Imager 600으로 단백질 발현량을 측정하였으며, 도 5에 나타내었다. 도 5에서, CTL은 siRNA 미처리군, siNC는 본 발명의 siRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산인 상기 서열번호 10 내지 13의 올리고핵산(Dharmacon, On-Target Plus Non-Tageting Control Pool) 4종의 혼합물을 처리한 군이다.

도 5에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1 내지 4의 Endophilin A1 siRNA를 72시간 동안 처리한 세포는 대조군(CTL) 대비 티로시나제, TRP2 발현량이 감소하는 것을 확인하였다. 다만, 상기 실시예 1 내지 4의 Endophilin A1 siRNA를 48시간 동안 처리하였을 때, 대조군과 티로시나제, TRP2 발현량은 크게 감소하지 않았으나, 72시간 후에는 대조군에 비해 티로시나제, TRP2 발현량이 감소하였다. 즉, 멜라닌 생성에 관여하는 인자인 티로시나제 및 TRP2의 발현량이 감소한 것으로 보아 Endophilin A1의 발현 또는 활성 억제에 의해 멜라닌 생성도 억제되는 것을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 Endophilin A1의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 조성물은 우수한 피부 미백 효과가 있음을 확인하였다.

본 발명의 일 측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[ 제형예 1] 영양화장수

하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양화장수를 제조할 수 있다.

원료명	함량(중량%)
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
실시예 1 내지 4를 포함하는 리포좀	0.01
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드	5.0
스쿠알란	5.0
솔비타세스퀴올레이트	1.5
세테아릴 알코올	1.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[ 제형예 2] 영양로션

하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양로션을 제조할 수 있다.

원료명	함량(중량%)
정제수	잔량
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	5.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
실시예 1 내지 4를 포함하는 리포좀	0.01
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.5
방부제	적량
향	적량
색소	적량
트리에탄올아민	0.1
계	100

[ 제형예 3] 영양크림

하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조할 수 있다.

원료명	함량(중량%)
글리세린	3.5
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
실시예 1 내지 4를 포함하는 리포좀	0.01
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
트리에탄올아민	0.1
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[ 제형예 4] 주사제

하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 주사제를 제조할 수 있다.

원료명	중량비(1ml 당)
염화나트륨	9.0mg
소듐 카르복시메틸셀룰로오즈	30.0mg
Tween 20	1.0mg
실시예 1 내지 4를 포함하는 리포좀	1.0mg
주사용 증류수	잔량

[ 제형예 5] 연고

하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조할 수 있다.

원료명	함량(중량%)
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	15.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
실시예 1 내지 4	0.01
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	1.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
방부제	적량
향	적량
색소	적량
밀납	4.0
정제수	잔량
계	100

<110> AMOREPACIFIC CORPORATION <120> A composition for skin whitening comprising Endophilin A1 inhibiting materials and a method for screening skin whitening materials <130> 18p481/ind <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endophilin A1 siRNA #1 Sense <400> 1 caaccuaaac cacgaauga 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endophilin A1 siRNA #1 Antisense <400> 2 ucauucgugg uuuagguug 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endophilin A1 siRNA #2 Sense <400> 3 acaaagaucu uagggaaau 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endophilin A1 siRNA #2 Antisense <400> 4 auuucccuaa gaucuuugu 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endophilin A1 siRNA #3 Sense <400> 5 gauaucauca cacucacua 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endophilin A1 siRNA #3 Antisense <400> 6 uagugagugu gaugauauc 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endophilin A1 siRNA #4 Sense <400> 7 uaaagaaguu ggagggucg 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endophilin A1 siRNA #4 Antisense <400> 8 cgacccucca acuucuuua 19 <210> 9 <211> 2742 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endophilin A1 mRNA sequence <400> 9 agttggcgcc agcatccagg taccgcgcgc cacagcacct gcctgggcgt tcccgcgctt 60 ggggcggggc ttcccgcgtc ccctttaaga ggccgcatca cccgcccttg acgtcagagt 120 gtttctccgc aagagcccgt gtcccgctag gctccgcgcc ctcgcgccca tagccccggc 180 ggcggcacga ccagaggcgg ccaggggagc gcgccgcccc gctcggccct ccagtcccgc 240 tccgccgcct ccctcccgca cagcagccgc cagcgcggcc tcctgcacca tgtcggtggc 300 cggcctcaag aagcagttcc ataaagccac tcagaaagtg agtgagaagg ttggaggagc 360 tgaaggaacc aagctagatg atgacttcaa agagatggaa aggaaagtgg atgtcaccag 420 cagggctgtg atggaaataa tgactaaaac aattgaatac cttcaaccca atccagcttc 480 cagagctaag ctcagcatga tcaacaccat gtcaaaaatc cgtggccagg agaaggggcc 540 aggctatcct caggcagagg cgctgctggc agaggccatg ctcaaatttg gaagagagct 600 tggagatgat tgcaactttg gcccagcact tggtgaggtc ggggaggcca tgcgggaact 660 gtcggaggtc aaagactctt tggacataga agtgaagcag aacttcattg accctcttca 720 gaatcttcat gacaaagatc ttagggaaat tcaacatcat ctaaagaagt tggagggtcg 780 acgcctggat tttgattata agaagaaacg acaaggcaag attccggatg aagagcttcg 840 tcaagctcta gagaaatttg atgagtctaa ggaaattgct gagtcaagca tgttcaatct 900 cttggagatg gatattgaac aagtgagcca gctctctgca cttgtgcaag ctcagctgga 960 gtaccacaag caggcagtcc agatcctgca gcaagtcacg gtcagactgg aagaaagaat 1020 aagacaggct tcatctcagc ctagaaggga atatcaacct aaaccacgaa tgagcctgga 1080 gtttccaact ggagacagta ctcagcccaa tgggggtctc tcccacacag gcactcccaa 1140 accttcaggt gtccaaatgg atcagccctg ctgccgagct ctgtacgact ttgaacctga 1200 aaatgaaggg gagttgggat ttaaagaggg cgatatcatc acactcacta accaaattga 1260 tgagaactgg tatgagggga tgctgcatgg ccattcaggc ttcttcccca tcaattatgt 1320 ggaaattctg gttgccctgc cccattagga tgttatgctg gctggctcgc ctcctcttga 1380 cccagatagt tacggttaac cactgctttg gcaatgctgc ttataacaca tcccaagtgc 1440 aggccgcagt ggtccacgtc atccagcccc accaagtgac tttggttgac ttgtgggctc 1500 ccacaggagt catggtgatg gatgatatcc tcttagcctg gtgggcgtgg catgtgcttt 1560 ttaaaacatc atctgagacc agccagtagt cacagaactg ctgtttacac agttctcagg 1620 aggctgtggt ttcttagaat atgaccatga gccatttcac agaaaaacca tcccaccgaa 1680 gatattgtct atcaccccag gggccatctg aaggtctctt tgcatttctc catgcaaaga 1740 ggagaaagct tttgctttca cactgtccct tcccaaatat gtgagtcatg gaattgtcaa 1800 agtaagcctt ccctcaccag caaattgtct cctgatctga atgaatttgt ctcttaatgc 1860 atccatagaa aagtgttaat tgtgggttca aagcattctc tgcaaatagg catctcagct 1920 cctcacactt atggctattt ctgacgtata gccagttttc ttccctcctt gctattaaag 1980 ccagagcggt aattccaaat tatttttcag taagacagtt aatcagcatt attgtgagag 2040 ggactgaaaa gaaattctcc attatgagga attgggaaga aatctggtat ccaagcttaa 2100 atttcttgct atacagaaac tatgtatgta tttaggctat ttctgaaggg cacagggaag 2160 ggggaacaaa tatcttcact tcagttttat ttgtgaatta catgtttcat gaatccattt 2220 ggcacagaga cacaaggaag aaaacactag taaccatctt tccactagtt catatactga 2280 gaaacagtaa atacctttcc tttccacttt taccctgtgt tctttgaaca tcatttgtgc 2340 agattctgcc ctcaatgagg accaaataaa gatgattttt gtgcttagca gtttaaggta 2400 tatggctgca tatgcaaaac tctttcccaa ttcagtcgct acttttactt ctgccctttc 2460 tatccatcgt cttcattttg tgtgtacagt gctgtgtgta agcttatcag tgtgtttttt 2520 tatttgtatc agtcatgaaa gtcctgttag gtatccagag ttctatttat ctagctgtac 2580 agactctttc agaggtttaa cgtgctgctt ccgatgtgcc acctgcagta gtggatcatg 2640 tggagtgaaa ggcaaatctt actgcttaat gtataaactc tcaccacagg aagcatcgct 2700 gtttccaata aatattgctg aagacagaac caaaaaaaaa aa 2742 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siNC #1 <400> 10 ugguuuacau gucgacuaa 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siNC #2 <400> 11 ugguuuacau guuguguga 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siNC #3 <400> 12 ugguuuacau guuuucuga 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siNC #4 <400> 13 ugguuuacau guuuuccua 19

Claims (25)

1. 엔도필린 A1(Endophilin A1)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 Endophilin A1의 발현 또는 활성 억제제는 Endophilin A1 mRNA의 번역을 억제하는 것인, 피부 미백용 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 Endophilin A1의 발현 또는 활성 억제제는 Endophilin A1 mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드인, 피부 미백용 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상인, 피부 미백용 조성물.
5. 제3항에 있어서,
   상기 올리고뉴클레오티드는
   서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열; 및
   상기 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열과 85% 이상의 상동성을 가지면서 Endophilin A1 mRNA에 결합할 수 있는 서열;
   로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열로 표시되는 것인, 피부 미백용 조성물.
6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 올리고뉴클레오티드는 리포좀에 포집된 형태 또는 백터에 삽입된 형태로 포함되는, 피부 미백용 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 올리고뉴클레오티드는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 내지 1000 nM인, 피부 미백용 조성물.
8. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 화장료 조성물인, 피부 미백용 조성물.
9. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 약학적 조성물인, 피부 미백용 조성물.
10. 피부 미백 물질을 스크리닝하는 방법으로서,
    (a) 분리된 피부세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 시험물질을 처리한 피부세포에서 엔도필린 A1(Endophilin A1)의 상대적 발현량을 측정하는 단계;
    를 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 (a)단계의 피부세포는 멜라닌세포(melanocyte)를 포함하는, 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
12. 제10항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 상기 시험물질을 처리한 피부세포에서 Endophilin A1 mRNA의 상대적 발현량을 측정하는 것을 포함하는, 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
13. 제10항에 있어서, 상기 (a) 단계는 피부세포에 시험물질의 처리하기 전과 후의 Endophilin A1 발현량을 비교하는 단계를 포함하는, 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
14. 제10항에 있어서, 상기 (b) 단계는 시험물질을 처리한 피부세포와 시험물질을 처리하지 않은 멜라닌세포의 Endophilin A1 발현량을 비교하는 단계를 포함하는, 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
15. 제10항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 상대적 발현량을 측정한 결과 Endophilin A1의 발현량이 감소한 경우, 상기 시험물질을 피부 미백 물질로 판정하는 단계를 더 포함하는, 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
16. 시험대상으로부터 분리된 피부세포에서 Endophilin A1의 발현량을 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 Endophilin A1 발현량은 Endophilin A1의 mRNA 또는 Endophilin A1 단백질 발현량인,
    색소 관련 피부 상태 진단을 위한 정보 제공 방법.
17. 제16항에 있어서,
    상기 시험대상으로부터 분리된 피부세포에서의 Endophilin A1 발현량을 정상대조군 피부세포에서의 Endophilin A1 발현량과 비교하는 단계를 더 포함하는, 색소 관련 피부 상태 진단을 위한 정보 제공 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 시험대상으로부터 분리된 피부 세포에서의 Endophilin A1 발현량이 정상대조군 피부세포에서의 Endophilin A1 발현량보다 높은 경우 색소 관련 피부 상태에 이상이 있는 것으로 정보를 제공하는 단계를 더 포함하는, 색소 관련 피부 상태 진단을 위한 정보 제공 방법.
19. Endophilin A1의 mRNA 또는 Endophilin A1 단백질 검출 시약을 포함하는 색소 관련 피부 상태 진단용 키트.
20. 제19항에 있어서,
    상기 Endophilin A1의 mRNA 검출 시약은 Endophilin A1 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브 중 하나 이상을 포함하는, 색소 관련 피부 상태 진단용 키트.
21. 제19항에 있어서,
    상기 Endophilin A1의 단백질 검출 시약은 Endophilin A1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 프로브 중 하나 이상을 포함하는, 색소 관련 피부 상태 진단용 키트.
22. 제19항에 있어서,
    제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 방법이 기재되어 있는 지시서를 더 포함하는 색소 관련 피부 상태 진단용 키트.
23. Endophilin A1의 mRNA 또는 Endophilin A1 단백질 검출 시약을 포함하는 색소 관련 피부 상태 진단용 조성물.
24. 제23항에 있어서,
    상기 Endophilin A1의 mRNA 검출 시약은 Endophilin A1 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브 중 하나 이상을 포함하는, 색소 관련 피부 상태 진단용 조성물.
25. 제23항에 있어서,
    상기 Endophilin A1의 단백질 검출 시약은 Endophilin A1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 프로브 중 하나 이상을 포함하는, 색소 관련 피부 상태 진단용 조성물.

Images