JP6230545B2 - 皮膚の色素沈着に影響するマイクロｒｎａ分子の使用 - Google Patents

Description

本発明は、皮膚の色素沈着に影響を及ぼすため、すなわち皮膚の色素脱失または色素沈着のための、マイクロＲＮＡの発現または活性を抑制する化合物の同定および使用に関する。

成熟マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」、本出願においては「ｍｉＲ」とも称する）は、小さな非コードＲＮＡ（長さ約２１ヌクレオチド）である。ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現の転写後調節の主機序としての役割を果たすことがわかった。ヒトにおいて約２０００個のｍｉＲＮＡが記述されている（ｍｉｒＢａｓｅリリース１９）。これらは、タンパク質をコードしているすべての遺伝子のうち６０％超の遺伝子の活性を制御する上で役割を担い、現在まで研究されてきたほとんどすべての細胞プロセスの調節に関与していると予想される（Friedmanら、2009年）。一般に、ｍｉＲＮＡは翻訳の抑制および／またはｍＲＮＡの不安定化／分解によってタンパク質合成を阻害する。ｍｉＲＮＡとＲＮＡとの相互作用は、ｍＲＮＡのコード領域（ＣＤＳ）または５’ＵＴＲにおいて、３’ＵＴＲのレベルでｍｉＲＮＡの「シード」領域（２〜８ヌクレオチドの配列）における不完全な塩基相補性を介して行われる（Fabianら、2010年）。成熟ｍｉＲＮＡには、約１００個までの標的ｍＲＮＡが存在し得る。成熟ｍｉＲＮＡは、ゲノムの様々な染色体上に位置している様々なｍｉＲＮＡ遺伝子から得ることができる。

メラノサイトにおける色素沈着過程は、潜在的にｍｉＲＮＡの標的となり得る多数のタンパク質が関与している。メラノサイト系列におけるｍｉＲＮＡの重要性は、黒色腫の発生においてしか研究されていない。公表された最も新しい例の１つはＣｈｅｎらによるものである。この著者らは、ｍｉＲ−１９３ｂが黒色腫における細胞増殖を抑制し、サイクリンＤ１を制御することを明らかにした（Chenら、2010年）。ダイサー（ｍｉＲＮＡの成熟における鍵酵素）が、インビボにおいてメラニン芽細胞の発生を可能にするのに不可欠であることも明らかになった（Levyら、2010年）。この結果から、ｍｉＲＮＡは少なくともメラニン芽細胞の増殖において重要である。現在までのところ、色素沈着過程におけるｍｉＲＮＡの役割について１つの研究が公表されたにすぎない（Wuら、2008年）。この著者らは、ｍｉＲ−４３４−５Ｐが色素沈着を低減すると報告している。しかし、このｍｉＲ−４３４−５Ｐはヒトの公的データベースには見出されていない。２０１２年８月において、ｍｉＲ−１４５は、メラノソームの輸送に不可欠なタンパク質を標的にすることによってヒトメラノサイトに色素脱失効果を及ぼす（Dynoodtら、2012年）。

ｍｉＲＮＡの大群には、ｈｓａ−ｍｉｒ−３３０、ｈｓａ−ｍｉｒ−７およびｈｓａ−ｍｉｒ−１３７が含まれる。

ｈｓａ−ｍｉｒ−３３０の遺伝子は染色体１９ｑ１３．３２上に位置し、成熟型ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐを生じる。ｍｉＲ−３３０は、ＡＫＴのリン酸化のＥ２Ｆ１媒介性抑制を介してアポトーシスを誘発することによって前立腺癌細胞における腫瘍抑制因子として働く（Leeら、2009年）。

成熟ｈｓａ−ｍｉＲ−７に関しては、ｈｓａ−ｍｉｒ−７−１（Ｃｈｒ．９ｑ２１．３２）、ｈｓａ−ｍｉｒ−７−２（Ｃｈｒ．１５ｑ２６．１）、および／またはｈｓａ−ｍｉｒ−７−３（Ｃｈｒ．１９ｐ１３．３）の３つの遺伝子に由来するものであり得る。ｍｉＲ−７はＥＧＦＲ経路およびＡＫＴ経路を阻害し、グリオブラストーマにおいて阻害される（Kefasら、2008年）。舌のガン腫において、ｍｉＲ−７はＩＧＦ１を標的にする（Jiangら、2010年）。高侵襲性の乳癌細胞におけるｍｉＲ−７の移入は、ＰＡＫ１を低減することによってその乳癌細胞の運動性、浸潤能および腫瘍形成能を阻害することがある（Reddyら、2008年）。

ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７の成熟型はＣｈｒ．１ｐ２１．３上に位置するｈｓａ−ｍｉｒ−１３７の遺伝子に由来する。ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７は、メラノーマ細胞株におけるＭＩＴＦ（Bemisら、2008年）およびカルボキシ末端結合タンパク質１（ＣｔＢＰ１）（Dengら、2011年）を標的にする。さらに、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７は脳癌幹細胞の分化を誘導する（Silberら、2008年）。さらに、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３７のプロモーターのメチル化は、頭頸部扁平上皮癌患者の全生存期間が短いことと関連している（Langevinら、2011年）。

したがって、皮膚色素沈着を制御するのに有用である、すなわち皮膚の色素脱失または色素沈着にとって有用である新規化合物を見出すことが求められている。特に、新規色素脱失化合物が必要とされている。

驚くべきことに、本発明者らは、ヒトマイクロＲＮＡのｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７およびｈｓａ−ｍｉＲ−１３７がメラノサイトへの色素脱失効果を有することを確認した。

したがって、本発明は、ｈｓａ−ｍｉｒ−３３０、ｈｓａ−ｍｉｒ−７、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３７、それらの成熟型およびそれらの前駆体から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの、色素脱失活性成分としての使用に関する。

本発明はまた、色素沈着過度障害を予防および／または治療するための使用のための、ｈｓａ−ｍｉｒ−３３０、ｈｓａ−ｍｉｒ−７、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３７、それらの成熟型およびそれらの前駆体から選択されるマイクロＲＮＡに関する。

ｈｓａ−ｍｉｒ−３３０、ｈｓａ−ｍｉｒ−７、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３７、それらの成熟型およびそれらの前駆体から選択されるマイクロＲＮＡは、１０^−７ｇ／ｍｌから１０^−２ｇ／ｍｌの間の濃度で使用すると色素脱失活性を示すことが好ましい。

「マイクロＲＮＡ前駆体」は、前記マイクロＲＮＡの１つまたは複数の未成熟型、特にそれらの「ヘアピンまたはステムループ」型を意味する。

本発明によるマイクロＲＮＡはヒト由来であることが好ましく、したがってｈｓａ−ｍｉｒ−３３０、ｈｓａ−ｍｉｒ−７、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３７、それらの成熟型およびそれらの前駆体から選択されることが好ましい。

ｈｓａ−ｍｉｒ−３３０は、データベースｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇにおいて番号ＭＩ００００８０３でアクセス可能である。ｈｓａ−ｍｉｒ−３３０の成熟型は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ型（データベースｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇにおいて番号ＭＩＭＡＴ０００４６９３でアクセス可能）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ型（データベースｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇにおいて番号ＭＩＭＡＴ００００７５１でアクセス可能）である。

配列５’−ＵＣＵ ＣＵＧ ＧＧＣ ＣＵＧ ＵＧＵ ＣＵＵ ＡＧＧ Ｃ−３’（配列番号１）の成熟型ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐを使用することが好ましい。

「ｈｓａ−ｍｉＲ−７」は、データベースｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇにおいてそれぞれ番号ＭＩ００００２６３、ＭＩ００００２６４およびＭＩ００００２６５でアクセス可能なｈｓａ−ｍｉｒ−７−１型、ｈｓａ−ｍｉｒ−７−２型およびｈｓａ−ｍｉｒ−７−３型を意味する。

ｈｓａ−ｍｉｒ−７−１の成熟型は、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−５ｐ型（データベースｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇにおいて番号ＭＩＭＡＴ００００２５２でアクセス可能）、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ型（データベースｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇにおいて番号ＭＩＭＡＴ０００４５５３でアクセス可能）である。

ｈｓａ−ｍｉｒ−７−２の成熟型は、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−５ｐ型（データベースｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇにおいて番号ＭＩＭＡＴ００００２５２でアクセス可能）、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２−３ｐ型（データベースｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇにおいて番号ＭＩＭＡＴ０００４５５４でアクセス可能）である。

ｈｓａ−ｍｉｒ−７−３の成熟型は、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−５ｐ型（データベースｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇにおいて番号ＭＩＭＡＴ００００２５２でアクセス可能）である。

また、ｈｓａ−ｍｉｒ−７−１、７−２および７−３は共通の成熟型ｈｓａ−ｍｉＲ−７−５ｐを有するので、配列５’−ＵＧＧ ＡＡＧ ＡＣＵ ＡＧＵ ＧＡＵ ＵＵＵ ＧＵＵ ＧＵ−３’（配列番号２）の成熟型ｈｓａ−ｍｉＲ−７−５ｐを使用することが好ましい。

ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７は、データベースｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇにおいて番号ＭＩ００００４５４でアクセス可能である。

ｈｓａ−ｍｉｒ−１３７の成熟型は、配列５’−ＵＵＡ ＵＵＧ ＣＵＵ ＡＡＧ ＡＡＵ ＡＣＧ ＣＧＵ ＡＧ−３’（配列番号３）のｈｓａ−ｍｉＲ−１３７の型であり、データベースｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇにおいて番号ＭＩＭＡＴ００００４２９でアクセス可能である。

本発明による色素沈着過度障害は、黒皮症（melasma）、肝斑（chloasma）、黒子、老人性黒子、光老化に伴う不規則な色素沈着過度、そばかす、擦過または熱傷または瘢痕または皮膚病または接触アレルギーによる炎症後色素沈着過度、母斑、遺伝性の色素沈着過度、代謝由来または薬剤起因性の色素沈着過度、およびメラノーマから選択されることが好ましい。

本発明はまた、色素脱失化合物を同定するインビトロの方法であって、以下のステップを含む方法にも関する：
ａ．少なくとも１つの被験化合物をメラノサイト試料と接触させるステップ、
ｂ．前記メラノサイトにおいてｈｓａ−ｍｉｒ−３３０、ｈｓａ−ｍｉｒ−７、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３７、それらの成熟型およびそれらの前駆体から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップ、
ｃ．ステップａで処理されたメラノサイトにおいて測定される前記マイクロＲＮＡ、その成熟型および前駆体のうちの少なくとも１つの発現または活性の活性化が、無処置のメラノサイトと比べて、少なくとも２０％である化合物を選択するステップ。

第１の実施形態によれば、ステップｂはステップａの前および後に実施される。この場合、ステップａの前にメラノサイトにおいて測定されたマイクロＲＮＡの発現または色素脱失活性は対照値（すなわち、無処置のメラノサイト）に対応する。したがって、ステップｃは、ステップａで処理されたメラノサイトにおいて測定された少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性の活性化が、ステップａ前の当該メラノサイトと比べて、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％である化合物を選択するステップを含む。

別の実施形態によれば、本方法はメラノサイトの試料を調製する第１のステップａ’を含む。したがって、本発明は好ましくは、色素脱失化合物を同定するインビトロの方法であって、以下のステップを含む方法に関する：
ａ’．少なくとも２つのメラノサイト試料を調製するステップ、
ａ．これら試料の１つを少なくとも１つの被験化合物と接触させるステップ、次いで
ｂ．前記試料において、ｈｓａ−ｍｉｒ−３３０、ｈｓａ−ｍｉｒ−７、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３７、それらの成熟型およびそれらの前駆体から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップ、ならびに
ｃ．ステップａで処理されたメラノサイトにおいて測定された前記マイクロＲＮＡ、その成熟型および前駆体のうちの少なくとも１つの発現または活性の活性化が、無処置のメラノサイトと比べて、少なくとも２０％である化合物を選択するステップ。

この第２の実施形態において、ステップａを経ていないメラノサイトの試料において測定されるマイクロＲＮＡまたは成熟型もしくは前駆体の発現または活性が対照値（すなわち、無処置のメラノサイト）に相当する。

被験化合物は任意のタイプの化合物とすることができる。天然由来のもの、または化学合成で製造したものでもよい。被験化合物は、構造的に明確な化合物、あるいは特徴が明らかになっていない化合物もしくは物質、または化合物の混合物のバンクから得ることができる。特に、植物など植物由来化合物を含む天然化合物から選択することができる。被験化合物は植物由来であることが好ましく、植物抽出物から選択されることが好ましい。

ステップａに従って、被験化合物をメラノサイトの試料と接触させる。

ステップｂに従って、メラノサイトにおいて少なくとも１つのマイクロＲＮＡ、その成熟型または前駆体の発現および／または活性を測定する。「マイクロＲＮＡの発現」はマイクロＲＮＡの生成量を意味する。マイクロＲＮＡの発現とは、該マイクロＲＮＡをコードする遺伝子の転写時及び該マイクロＲＮＡの成熟時の両方を意味する。「マイクロＲＮＡの活性」は、マイクロＲＮＡの色素脱失活性、すなわち皮膚色素沈着を抑制するマイクロＲＮＡの能力、すなわちメラノサイトが産生するメラニンの量を低減するマイクロＲＮＡの能力を意味する。

当業者は、マイクロＲＮＡとハイブリッド形成するｍＲＮＡを検出し、したがってマイクロＲＮＡの活性を決定する定量的または半定量的技法に精通している。ｍＲＮＡと特定のヌクレオチドプローブのハイブリッド形成に基づいた技法は、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）など最も多用されるものである。

当業者は、マイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡとハイブリッド形成するｍＲＮＡを検出する定量的または半定量的技法にも精通している。特に、マイクロＲＮＡの発現はリアルタイムＰＣＲにより測定することができる。マイクロＲＮＡの活性は、標的ｍＲＮＡについてリアルタイムＰＣＲにより測定することができ、または標的タンパク質のレベルをウェスタンブロット法で評価することによって測定することができる。マイクロＲＮＡの発現はリアルタイムＰＣＲにより測定することが好ましい。マイクロＲＮＡの活性は、メラニンの生成量を定量化することによって測定することが好ましい。

次いで、被験化合物で処理した後のマイクロＲＮＡの発現または活性を対照値、すなわち処理前の同じメラノサイトにおいて得られた値、または処理していないメラノサイトの別の試料において得られた値と比較する。

ステップｃに従って、使用することができる化合物は、無処置のメラノサイトに対して、処理されたメラノサイトにおいて測定された少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性の活性化が少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％である化合物である。好ましくは、マイクロＲＮＡの発現または活性の活性化は少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％である。

本発明において定義されたスクリーニング方法によって選択された化合物について、皮膚色素沈着に及ぼす効果の試験を他のインビトロモデルおよび／またはインビボモデルで行うことができる。本発明によれば有用な化合物は、標的とされたマイクロＲＮＡのアクチベーターである。

別の実施形態によれば、本発明は、色素沈着促進（ｐｒｏｐｉｇｍｅｎｔｉｎｇ）化合物を同定するインビトロ方法であって、以下のステップを含む方法に関する：
ａ．少なくとも１つの被験化合物をメラノサイトの試料と接触させるステップ、
ｂ．前記メラノサイトにおいて、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、それらの成熟型の少なくとも１つのインヒビター（例えば、アンタゴｍｉｒ）の発現または活性を測定するステップ、
ｃ．ステップａで処理されたメラノサイトにおいて測定される前記マイクロＲＮＡ、その成熟型および前駆体のうちの少なくとも１つの発現または活性の阻害が、無処置のメラノサイトと比べて、少なくとも２０％である化合物を選択するステップ。

この場合、ステップｃ）において選択された化合物は、マイクロＲＮＡのインヒビターである化合物である。

１２日目におけるタンパク質ライセート中のメラニンのｍｉＣｔｒｌ（ｃｅｌ−ｍｉＲ−２３９ｂ）に対する相対量を示す図である。 ｍｉＲＮＡミメティックによる処理後の色素沈着に関与する遺伝子のｍＲＮＡ発現（１２日目）を示す図である。 処理後のｍｉＲ−３３０−５ｐの発現を示す図である。 処理後のｍｉＲ−１３７の発現を示す図である。 処理後のｍｉＲ−７の発現を示す図である。 処理後のｍｉＲ−３３０−５ｐ発現の有効性を示す図である。

インヒビターは、アンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとすることができる。好ましくは、マイクロＲＮＡのインヒビターはアンチｍｉＲである。アンチｍｉＲは、内因性マイクロＲＮＡを特異的に阻害するｍｉＲのインヒビターである。アンチｍｉＲは、マイクロＲＮＡ分子に特異的に結合し、それらの分子を阻害するように設計された一本鎖核酸である。アンチｍｉＲは、標的ｍｉＲの配列に相補的な核酸配列を有する。これらのインヒビターは、形質移入または電気穿孔法を使用し、ｓｉＲＮＡのために使用される方式と同様の方式で細胞に導入することができる。アンチｍｉＲを使用し、ｍｉＲの機能解析をその活性の負の調節によって行うことが可能である。アンチｍｉＲは市販されており、例えばＡｍｂｉｏｎまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手することができる。

上述のスクリーニング方法を使用して同定されたｍｉＲ、ｍｉＲアクチベーター、またはｍｉＲインヒビターは、生理学的に許容される賦形剤、好ましくは化粧品として許容される媒体、すなわち毒性、不相溶性、不安定性またはアレルギー反応の危険の全くないヒトの皮膚と接触させて使用するのに適した媒体、特に使用者が許容できない不快感（発赤、圧迫感、刺痛など）を引き起こさない媒体と組み合わせて組成物として製剤化することができる。これらの組成物は、例えば経口投与または局所投与することができる。組成物を局所適用することが好ましい。経口経路では、組成物は、徐放用として錠剤、カプセル、糖衣錠、シロップ、懸濁液、溶液、粉末、顆粒、乳濁液、マイクロスフェアもしくはナノスフェアの懸濁液、または脂質もしくは高分子ベシクルの形態をとることができる。局所経路では、組成物はさらに詳細には皮膚および粘膜を治療するためのものであり、軟膏、クリーム、乳濁液、軟膏、粉末、浸透性緩衝液、溶液、ゲル、噴霧剤、ローション、または懸濁液の形態をとることができる。徐放を可能にするマイクロスフェアもしくはナノスフェアの懸濁液、または脂質もしくは高分子ベシクル、または高分子パッチもしくはヒドロゲルの形態をとることもできる。この局所適用向けの組成物は、無水、水性、または乳濁液の形態とすることができる。局所適用向けの組成物は、水中油型、油中水型、または多重エマルション（水／油／水、もしくは油／水／油）エマルションの形態とすることができ、これらは任意選択でマイクロエマルション、もしくはナノエマルション、または水分散液、溶液、水性ゲル、または粉末の形態であってもよい。好ましい変形形態では、組成物はゲル、クリーム、ローションの形態をとる。

組成物の生理学的に許容される賦形剤は、一般的に水を含み、エタノールなどの他の溶媒を場合によっては含む。

本組成物は、顔および／または身体の病変の皮膚用のケア製品および／または清浄用製品として使用されることが好ましく、特に、例えばポンプ式の（pump-action）噴霧ボトル、エアロゾル器もしくは試験管に充填された液体、ゲルもしくはムースの形態、または例えばジャーに充填されたクリームの形態をとることができる。変形形態として、メーキャップ製品、特にファンデーションまたはルースパウダーもしくはコンパクトパウダーの形態をとることができる。

本組成物は、下記から選択される少なくとも１種の化合物など様々な添加物を含むことができる：
− 油類、特にポリジメチルシロキサン（ジメチコン）、ポリアルキルシクロシロキサン（シクロメチコン）およびポリアルキルフェニルシロキサン（フェニルジメチコン）などの揮発性または不揮発性の線状または環式のシリコーン油；フッ素化油などの合成油、安息香酸アルキル、およびポリイソブチレンなどの分枝状炭化水素；植物油、特にダイズ油またはホホバ油、および流動パラフィンなどの鉱油から選択することができる油類；
− ロウ、例えば、オゾケライト、ポリエチレンワックス、蜜ロウまたはカルナウバロウなど；
− シリコーンエラストマー、特に、少なくとも１つの反応性基（特に、水素またはビニル）を含み少なくとも１つのアルキル基（特に、メチル）またはフェニル基を末端位および／または側位に有するポリシロキサンと、有機水素ポリシロキサンなどの有機シリコーンとの触媒の存在下での反応により特に得られるもの；
− 界面活性剤、好ましくは、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、または両性界面活性剤のいずれかの乳化性界面活性剤、特に脂肪酸とグリセロールのエステルなどの、脂肪酸とポリオールとのエステル、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸とポリエチレングリコールとのエステル、およびスクロース脂肪酸エステル；ポリエチレングリコール脂肪アルコールエーテル；アルキルポリグルコシド；変性ポリシロキサン−ポリエーテル；ベタインおよびその誘導体；ポリクオタニウム；アルキル硫酸塩；スルホスクシナート；サルコシナート；アルキルおよびジアルキルリン酸エステル、およびそれらの塩、ならびに脂肪酸の石けん；
− コサーファクタント、例えば、線状脂肪アルコールなど特にセチルアルコールおよびステアリルアルコール；
− 増粘剤および／またはゲル化剤、特に架橋または非架橋の親水性または両親媒性ホモポリマーおよびコポリマー、ＡＭＰＳならびに／あるいはアクリルアミドおよび／またはアクリル酸および／またはアクリル酸の塩もしくはエステルの重合体；キサンタンガムまたはグアーゴム、セルロース誘導体、およびシリコーンゴム（ジメチコノール）；
− 有機フィルター、例えば、ジベンゾイルメタンの誘導体、ケイ皮酸の誘導体、サリチラート、パラ−アミノ安息香酸、β，β’−ジフェニルアクリラート、ベンゾフェノン、ベンジリデン誘導体、フェニルベンゾイミダゾール、トリアジン、フェニルベンゾトリアゾールおよびアントラニル酸誘導体など；
− 無機フィルター、例えば、被覆または非被覆の顔料またはナノ顔料の形態をとる鉱物酸化物、特に二酸化チタンまたは酸化亜鉛を主とするもの；
− 着色剤；
− 保存剤；
− 封鎖材、ＥＤＴＡの塩など；
− 香料；
− およびそれらの混合物：ただし、このリストは包括的ではない。

これらの添加物の例は、特にＣＴＦＡ辞典（International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook、Les cosmetiques, produits de toilette et parfums出版、第11版、2006年）に記述され、それには、スキンケア産業で一般に使用される多種多様な香粧品および医薬品材料が制限されることなく記載されている。これらは、本発明による組成物における追加の材料として使用するのに適している。

組成物は、フィラー、顔料、真珠層（nacre）、リフティング剤（agent tenseur）および重合体、ならびにそれらの混合物など光学的効果を有する化合物を少なくとも１つ含むこともできる。

「フィラー」は無色または白色で鉱物または合成の層状または非層状のものであり、組成物に剛性および／もしくは柔軟性、マット効果ならびに／または一様性を付与するのに適している。フィラーとして、特にタルク、雲母、シリカ、カオリン、ナイロン−１２（Ａｔｏｃｈｅｍ社から販売されているＯｒｇａｓｏｌ（登録商標））などのナイロン（登録商標）の粉末、ポリエチレン粉末、ポリウレタン粉末、ポリスチレン粉末、ポリエステル粉末、Ｔｏｓｈｉｂａ社からＴｏｓｐｅａｒｌ（登録商標）という名称で販売されているものなどシリコーン樹脂のミクロビーズ、ヒドロキシアパタイト、および中空シリカマイクロスフェア（Ｍａｐｒｅｃｏｓ社のＳｉｌｉｃａ Ｂｅａｄｓ（登録商標））を挙げることができる。

「顔料」という用語は、組成物を着色および／または不透明にするよう意図された、媒体に不溶な白色または着色の鉱物または有機の粒子であると理解されたい。顔料は通常のサイズまたはナノメートルの粒子とすることができる。鉱物顔料のうち、二酸化チタン、酸化ジルコニウム、二酸化セリウム、酸化亜鉛、酸化鉄および酸化クロムを挙げることができる。

「真珠層」という用語は、光を反射する虹色の粒子と理解されたい。想定することができる真珠層のうち、真珠などの天然資源、酸化チタン、酸化鉄、天然色素またはオキシ塩化ビスマスで被覆された雲母、および着色雲母チタンを挙げることができる。

水相におけるこれらのフィラーおよび／または顔料および／または真珠層の重量濃度は、組成物の全重量に対して通常０．１％〜２０％、好ましくは０．２％〜７重量％である。

「リフティング剤」は、皮膚を引き締めるのに好適な化合物を意味すると理解されたい。この引き締め効果によって、リフティング剤は皮膚をすべすべにし、ただちにしわおよび線を軽減させ、又はなくすこともある。リフティング剤のうち、天然由来の重合体を特に挙げることができる。「天然由来の重合体」という用語は、植物由来の重合体、外皮に由来する重合体、卵タンパク質および天然由来のラテックスを指す。これらの重合体は親水性であることが好ましい。植物由来の重合体のうち、特にタンパク質およびタンパク質加水分解物を挙げることができ、さらに詳細にはトウモロコシ、ライ麦、コムギ、ソバ、ゴマ、スペルトコムギ、エンドウマメ、インゲンマメ、レンズマメ、ダイズおよびルピナスの抽出物などの穀類、マメ科植物および油料植物の抽出物を挙げることができる。合成重合体は一般にラテックスまたは擬ラテックスの形態をとり、重縮合物タイプまたはラジカル重合により得られた重合体とすることができる。特にポリエステル／ポリウレタンおよびポリエーテル／ポリウレタン分散体を挙げることができる。好ましくは、リフティング剤はＰＶＰ／ジメチコニルアクリラート（dimethiconyl acrylate）のコポリマーおよび親水性ポリウレタンである（ＨＹＤＲＯＭＥＲ社のＡｑｕａｍｅｒｅ Ｓ ２００１（登録商標））。

重合体を溶液として、分散体として、または粒子の形態で使用することも可能であるが、皮膚の光沢が低減し、顔貌がさらに一様になる。記述することができる例としては、シリコーンエラストマー；樹脂粒子、およびそれらの混合物が含まれる。シリコーンエラストマーの例としては、Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ社からＫＳＧ（登録商標）という名称で販売されている製品、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社からＴｒｅｆｉｌ（登録商標）、ＢＹ２９（登録商標）もしくはＥＰＳＸ（登録商標）という名称で販売されている製品、またはＧｒａｎｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社からＧｒａｎｓｉｌ（登録商標）という名称で販売されている製品を挙げることができる。

本発明に従って使用される組成物は、マイクロＲＮＡまたはそのアクチベーターを除く活性剤、特に下記から選択される少なくとも１つの活性成分も含むことができる：
− 増殖因子の産生を刺激する作用剤；
− 抗糖化剤、コラーゲンの合成を増進するまたはその分解を防止する作用剤（抗コラゲナーゼ剤、特にマトリックスメタロプロテアーゼのインヒビター）、エラスチンの合成を増進するまたはその分解を防止する作用剤（抗エラスターゼ剤）；
− インテグリンの合成またはテンシンなど焦点接着の構成要素の合成を刺激する作用剤；
− グリコサミノグリカンもしくはプロテオグリカンの合成を増進するまたはそれらの分解を防止する作用剤（抗プロテオグリカナーゼ剤）；
− 線維芽細胞の増殖を増進する作用剤；
− 色素脱失剤または抗色素沈着剤；
− 抗酸化剤または抗フリーラジカル剤または防汚剤、およびそれらの混合物：ただし、このリストは包括的ではない。

このような作用剤の例は、特に下記である：
− 植物の抽出物、特にコンドラス・クリスプス（Chondrus crispus）、高度好熱菌（Thermus thermophilus）、エンドウ（Pisum sativum）（Ｐｒｏｔｅａｓｙｌ（登録商標）ＴＰ ＬＳ）、ツボクサ（Centella asiatica）、イカダモ属（Scenedesmus）、ワサビノキ（Moringa pterygosperma）、マンサク属（hamamelis）、ヨーロッパグリ（Castanea sativa）、ハイビスカス・サブドリファ（Hibiscus sabdriffa）、チューベローズ（Polianthes tuberosa）、アルガニア・スピノーザ（Argania spinosa）、アロエ・ベラ（aloe vera）、ナルキッスス・タルゼッタ（Narcissus tarzetta）、または甘草（licorice）の抽出物；
− ダイダイ（Citrus aurantium）の精油（ネロリ）；
− グリコール酸、乳酸およびクエン酸などのα−ヒドロキシ酸、およびエステル；
− サリチル酸などのβ−ヒドロキシ酸およびその誘導体；
− 植物性タンパク質（特にダイズまたはヘーゼルナッツ）の加水分解物；
− アシル化オリゴペプチド（特に、ＳＥＤＥＲＭＡ社から商標名Ｍａｘｉｌｉｐ（登録商標）、Ｍａｔｒｉｘｙｌ（登録商標）３０００、Ｂｉｏｐｅｐｔｉｄｅ（登録商標）ＣＬまたはＢｉｏｐｅｐｔｉｄｅ（登録商標）ＥＬで販売されている）；
− 酵母、特に出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）の抽出物；
− 藻類、特にコンブ属の抽出物；
− アスコルビン酸、アスコルビルグルコシド、リン酸アスコルビルマグネシウムまたはリン酸アスコルビルナトリウム、パルミチン酸アスコルビル、テトライソパルミチン酸アスコルビル、ソルビン酸アスコルビル、トコフェロール、酢酸トコフェリルおよびソルビン酸トコフェリルなどのビタミンおよびそれらの誘導体；
− アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、およびそれらの混合物。

変形形態として、またはさらに、本発明に従って使用される組成物は、特にＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ Ｓｅｒｏｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ社／Ｃｏｇｎｉｓ ＦｒａｎｃｅからＰｒｏｔｅａｓｙｌ ＴＰ ＬＳ（登録商標）という名称で販売されているエンドウ（Pisum sativum）の種の抽出物など少なくとも１つのエラスターゼインヒビター（抗エラスターゼ）を含むことができる。

本発明の組成物は、湿潤剤、安定剤、湿気調節剤、ｐＨ調節剤、浸透圧変更剤、またはＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂスクリーン剤などの不活性な添加物またはこれらの添加物の組合せも含むことができる。

次の実施例は本発明を例示するものであって、限定するものではない。

図１：１２日目におけるタンパク質ライセート中のｍｉＣｔｒｌ（ｃｅｌ−ｍｉＲ−２３９ｂ）に対するメラニン相対量を示す図である。
４７０ｎｍのメラニン吸収を測定した。無色素細胞ＸＢ２中のタンパク質ライセートは較正物質として機能する（Ａｂｓ４７０ｎｍ＝０）。試料ｍｉＣｔｒｌ（ｃｅｌ−ｍｉＲ−２３９ｂ）は参照試料として使用される（Ａｂｓ４７０ｎｍ＝１）。メラニンの相対レベルは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ（ｍｉ−３３０）およびｈｓａ−ｍｉＲ−１３７（ｍｉ−１３７）のミメティックで処理された色素沈着ＭＮＴ−１細胞がトランスフェクションコントロール（ｃｅｌ−ｍｉＲ−２３９ｂ）に対して減少していることを示す。メラニン吸収も各ライセート試料中のタンパク質の量に対して正規化されている。

図２：ｍｉＲＮＡミメティックによる処理後の色素沈着に関与する遺伝子のｍＲＮＡ発現（１２日目）を示す図である。
Ｔｙｒ、ＴＹＲＰ１、ＭＬＡＮＡおよびＭＩＴＦ−ＭのｍＲＮＡ発現をＰＣＲ−ｑＲＴ分析により測定した（相対定量法ΔΔＣｔ）。陰性対照（ｃｅｌ−ｍｉＲ−２３９ｂ）で処理されたＭＮＴ−１細胞を較正物質試料として使用した（相対量、ＲＱ＝１）。ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ（ｍｉ−３３０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−７（ｍｉ−７）およびｈｓａ−ｍｉＲ−１３７（ｍｉ−１３７）のミメティックで処理されたＭＮＴ−１細胞のｍＲＮＡ発現は、較正物質試料に対する相対値として記録されている。エラーバーは３つ組の測定の標準偏差を表す。ＭＮＴ−１細胞のｍＲＮＡ ＴＹＲレベルは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７およびｈｓａ−ｍｉＲ−１３７のミメティックで処理すると低下する。ＴＹＲＰ１、ＭＬＡＮＡおよびＭＩＴＦ−ＭのｍＲＮＡレベルは、ｍｉＲ−７によって若干低下し、ｍｉＲ−１３７によってかなり低下するのが明らかである。

図３：処理後のｍｉＲ−３３０−５ｐの発現を示す図である。
対照に比べて、化合物１２，０８５で処理した後のＭＮＴ−１細胞におけるｍｉＲ−３３０−５ｐの発現は４８時間後に２０％超増加する。値は平均値で表され、エラーバーは標準誤差を表す。^＊Ｐ＝０．０２３３（対応のないスチューデントｔ検定）

図４：処理後のｍｉＲ−１３７の発現を示す図である。
対照に比べて、化合物１２，０８０で処理した後のＭＮＴ−１細胞におけるｍｉＲ−１３７の発現は４８時間後に２０％超増加する。値は平均値で表され、エラーバーは標準誤差を表す。^＊Ｐ＝０．００５６（対応のないスチューデントｔ検定）

図５：処理後のｍｉＲ−７の発現を示す図である。
対照に比べて、化合物１２，０９２で処理した後のＭＮＴ−１細胞におけるｍｉＲ−７の発現は４８時間後に２０％超増加する。

図６：処理後のｍｉＲ−３３０−５ｐ発現の有効性を示す図である。
Ａ）チロシナーゼ（ＴＹＲ）の３’ＵＴＲ部分におけるｍｉＲ−３３０−５ｐの結合部位の模式図。ｍｉＲ−３３０−５ｐの結合部位の野生型配列（ＷＴ）を示す。変異型配列（ＭＵＴ）には、５つのヌクレオチド変化が認められる（赤色で示す）。
Ｂ）ルシフェラーゼレポーターの活性の試験は、ｍｉＲ−３３０−５ｐのＴＹＲ ３’ＵＴＲとの結合を明らかにする。Ｌｕ１２０５ヒトメラノーマ細胞に（インサートなし、ＷＴおよびＭＵＴ）様々なルシフェラーゼレポーターベクターをトランスフェクトし、ｍｉＲ−３３０−５ｐのミメティックを２４時間コトランスフェクトする。溶解した細胞から得られたタンパク質抽出物について、ルシフェラーゼ活性を測定する。インサートのないコンストラクトを参照として使用した。値は平均値の形態で表す。エラーバーは標準偏差を表す。（^＊＊Ｐ＜０．００５ マンホイットニーの検定）。

材料および方法
細胞
ヒトメラノーマ色素沈着細胞ＭＮＴ−１（Reishら、１９９５）を、１０％ウシ胎仔血清（＃１０２７０、Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（＃１５１４０、Ｇｉｂｃｏ）および１％Ｌ−グルタミン（＃２５０３０、Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（＃２１８７５、Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃および５％ＣＯ_２で高湿度雰囲気下にて培養した。ＸＢ２マウスケラチノサイト（RheinwaldおよびGreen、1975）を、１０％ウシ胎仔血清（＃１０２７０、Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（＃１５１４０、Ｇｉｂｃｏ）および１％Ｌ−グルタミン（＃２５０３０、Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（＃４１９６５、Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃および５％ＣＯ_２で高湿度雰囲気下にて培養した。

ｍｉＲＮＡのミメティックおよびコウジ酸による処理
−１日目に、ＭＮＴ−１細胞を６ウェルプレート（＃３５３０４６、Ｆａｌｃｏｎ）に１ウェル当たり４×１０^５個播種した。０日目に、５μＬのリポフェクタミン２０００（＃１６６８−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞に５０ｎＭのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉｒ−１３７ ＃Ｃ−３００６０４−０７−００５、ｈｓａ−ｍｉｒ−７ ＃Ｃ−３００５４７−０５−０００５、ｈｓａ−ｍｉｒ−３３０−５ｐ ＃Ｃ−３０１０８２−０１−０００５、陰性対照＃ＮＣ−００２０００−０１−０５、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）のミメティックをトランスフェクトした。１日目に、培地を交換した。３日目に、細胞をトリプシン処理し、１ウェル当たり４×１０^５個の細胞を播種した。４日目に、細胞に５０ｎＭのｍｉＲＮＡのミメティックを再びトランスフェクトした（０日目を参照のこと）。５日目に、培地を交換した。７日目に、細胞をトリプシン処理し、１ウェル当たり４×１０^５個の細胞を播種した。８日目に、細胞に５０ｎＭのｍｉＲＮＡのミメティックをトランスフェクトした（０日目を参照のこと）。９日目に、培地を交換した。１０日目に、細胞をトリプシン処理し、２つに分けた（１枚の６ウェルから２枚の６ウェル）。１２日目に、一方の６ウェルプレートをＲＮＡの溶解に使用し、他方をタンパク質の溶解に使用した。色素脱失の陽性対照として、ＭＮＴ−１細胞を３．５ｍＭのコウジ酸（Ｓｉｇｍａ Ｋ３１２５−５Ｇ）と共に１２日間インキュベートした。細胞は記載のように分布し、コウジ酸を培地と共に４日ごとに新しくした。コウジ酸の阻害率（％）は１０％程度である。

ｍｉＲＮＡインヒビターによる処理
−１日目に、ｈｓａ−ｍｉＲ−７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７およびｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐの阻害による潜在的色素沈着促進効果を調査するために、Ｌｕ１２０５細胞（ヒト無色素メラノーマ細胞株）を６ウェルプレート（＃３５３０４６、Ｆａｌｃｏｎ）に１ウェル当たり４×１０^５個播種した。０日目に、５μＬのリポフェクタミン２０００（＃１６６８−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞に５０ｎＭのｍｉＲＮＡの各インヒビター（＝アンタゴｍｉＲ）（ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７ ＃ＩＨ−３００６０４−０８−０００５、ｈｓａ−ｍｉＲ−７ ＃ＩＨ−３００５４６−０８−０００５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５Ｐ ＃ＩＨ−３０１０８２−０２−０００５、陰性対照＃ＥＮ−００２００５−０１−０５、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）をトランスフェクトした。１日目に、培地を交換した。３日目に、細胞をトリプシン処理し、１ウェル当たり４×１０^５個の細胞を播種した。４日目に、細胞に５０ｎＭのｍｉＲＮＡのインヒビターをもう一度トランスフェクトした（０日目を参照のこと）。５日目に、培地を交換した。７日目に、細胞をトリプシン処理し、１ウェル当たり４×１０^５個の細胞を播種した。８日目に、細胞に５０ｎＭのｍｉＲＮＡのインヒビターをトランスフェクトした（０日目を参照のこと）。９日目に、培地を交換した。１０日目に、細胞をトリプシン処理し、２つに分けた（１枚の６ウェルから２枚の６ウェル）。１２日目に、一方の６ウェルプレートをＲＮＡの溶解に使用し、他方をタンパク質の溶解に使用した。

全ＲＮＡの抽出および逆転写
細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、６ウェルディッシュの１ウェル当たり７００μＬのＱｉａｚｏｌ溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ）を添加した。ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡｓｅを使用することなく、全ＲＮＡを水３０μｌで溶離した。ＮａｎｏＶｕｅ分光光度計（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＲＮＡの濃度を測定した。ＭＬＶ ＲＴ−酵素系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を６０μＬの反応中で使用して、１μｇの全ＲＮＡを逆転写して、対応するｃＤＮＡを産生した。

ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＩＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、リアルタイムＰＣＲを行った（最終反応体積 ２５μＬ：Ｍｉｘ Ｍａｓｔｅｒ ２３μＬ、ｃＤＮＡ ２μＬ）。サーモサイクリング条件（Ｉｃｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏｒａｄ）は以下の通りであった：９５℃で９０秒、さらに９５℃で３０秒、６０℃で６０秒および９５℃で１０秒を４０サイクル。プライマーの濃度および配列を以下の表５に示す：

相対量をΔΔＣｔ比較法で評価した。簡潔に言えば、この方法では、発現を正規化するための試料内で、標的遺伝子の発現量を内在性コントロールＴＢＰと比較する。一群の試料内で、好適な試料を較正物質試料（ｍｉＣｔｒｌ）として選択する。次いで、各試料を指定された参照と比較して、この参照試料に対する標的遺伝子の相対的発現を求める。

メラニン相対濃度の測定
１２日目に、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、６ウェルディッシュのＲＩＰＡタンパク質用溶解バッファー７５μＬ／ウェルに溶解した。タンパク質ライセートを１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管に移し、軽くボルテックスして、溶液をホモジナイズし、その後試験管を氷中に入れ、または−８０℃で貯蔵した。２μＬのタンパク質ライセートを使用して、メラニンの４７０ｎｍにおける吸光度をＮａｎｏＶｕｅ分光光度計（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で測定した。無色素ＸＢ２角化細胞のタンパク質ライセートを較正物質試料として使用した（参照＝０）。メラニンの相対量を検出するために、すべての試料をトランスフェクションコントロール試料（ｍｉＣｔｒｌ）と比較した。試料ｍｉＣｔｒｌの４７０ｎｍにおける吸光度を参照として１と定めた。さらに、ｍｉＣｔｒｌに対する各試料のタンパク質の濃度を考慮して、４７０ｎｍにおけるメラニン吸収を正規化した。

ウェスタンブロット法
プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を含む７５μＬの放射性免疫沈降用バッファー（ＲＩＰＡ）（ＰＢＳ中１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）を使用して、６ウェルプレートからタンパク質を４℃で３０分間抽出した。タンパク質ライセートを１４０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心した。予冷し、氷中に入れておいた１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管に上澄液を移した。タンパク質の濃度をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で決定した。タンパク質（５０μｇ）を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて分離し、ＰｒｏＴｒｏｎニトロセルロースメンブラン（Ｗｈａｔｍａｎ）に１００Ｖ、室温で１時間移した。メンブランを緩衝Ｔｒｉｓ食塩水（ＳＣＴ）中の５の脱脂乳粉末で飽和させた。メンブランを０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ／ＳＣＴ（ＴＴＢＳ）に希釈した一次抗体（下記を参照のこと）で一晩かけてプローブ付し、次いでＴＴＢＳ中で１回５分間の洗浄を３回行った。二次抗体をＴＴＢＳで１：１０，０００に希釈し、室温で１時間適用した。次いで、メンブランを、ＴＴＢＳ中で１回１０分間を３回洗浄し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＷｅｓｔＰｉｃｏ化学発光溶液（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発像させた。

使用された一次抗体は以下の通りである：
ポリクローナルヤギ抗Ｔｙｒ（Ｃ−１９）、ＳＣ−７８３３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、１／１０００に希釈
ポリクローナルヤギ抗Ｔｙｒｐ１（Ｇ−１７）、ＳＣ−１０４４３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、１／２０００に希釈
モノクローナルマウス抗ＭＬＡＮＡ（Ａ１０３）、ＳＣ−２００３２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、１／５００に希釈
ポリクローナルウサギ抗ＭＩＴＦ（Ｓ． Ｓａｕｌｅにより提供）、１／１０００に希釈
モノクローナルマウス抗β−アクチン（ＣＡ−１５）、Ａ５４４１（Ｓｉｇｍａ）、１／７５００

使用された二次抗体は以下の通りである：
− ＩｇＧ抗マウスＨＲＰ、Ｗ４０２Ｂ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１／１００００
− ヤギＨＲＰの抗ＩｇＧ、７０５−０３５−１４７（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、１／１００００
− ＩｇＧ抗ウサギＨＲＰ、ＮＡ９３４（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１／１００００

結果
ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１３７は色素沈着のレベルに影響を及ぼす
ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７のミメティックで１２日間処理したＭＮＴ−１細胞は、陰性対照で処理した細胞に比べて色素沈着レベル全体で有意な低下を示す（写真は示さない）。ＸＢ２ケラチノサイトは無色素細胞の対照として使用する。１２日目のタンパク質ライセートの写真から、ｍｉＲ−７で処理したＭＮＴ−１細胞は、色素沈着全体に対して有意な効果を何ら示さないことが明らかである。色素脱失の陽性対照として、ＭＮＴ−１細胞をコウジ酸で処理した。

メラニンの４７０ｎｍにおける吸光度の測定による相対レベルの定量によって、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐまたはｈｓａ−ｍｉＲ−１３７のミメティックで処理したＭＮＴ−１細胞中におけるメラニンの減少が確認された（図１）。ｃｅｌ−ｍｉＲ−２３９ｂはトランスフェクションコントロールとして使用される。ウェスタンブロット分析によって明らかなように、分子レベルでは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐのミメティックによる処理によってＴＹＲタンパク質の含量が低下した（写真は示さない）。さらに、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐはｍＲＮＡ ＴＹＲのレベルを低減するようである（図２）。ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７のミメティックによる処理によって、タンパク質ＴＹＲＰ１のレベルが若干低下し、ＭＬＡＮＡおよびＭＩＴＦがなくなる（写真は示さない）。ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＭＬＡＮＡおよびＭＩＴＦのｍＲＮＡの発現レベルは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７のミメティックによる処理によって有意に低下するようであった（図２）。

本発明者らは、これらの結果から、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７およびｈｓａ−ｍｉＲ−７に対するアンタゴｍｉＲでＭＮＴ−１細胞を処理すると、色素沈着標的遺伝子の安定化が引き起こされるという結論に達した。この安定化は色素沈着を誘発するはずである。

Ｈｓａ−ｍｉＲ−７はタンパク質ＴＹＲおよびＭＩＴＦの発現を低減する
ｈｓａ−ｍｉＲ−７のミメティックで１２日間処理したＭＮＴ−１細胞は、陰性対照細胞に比べて色素沈着レベル全体で有意な低下を示さない（写真は示さない）。メラニンの４７０ｎｍにおける吸光度の測定による相対レベルの定量によって、ｈｓａ−ｍｉＲ−７のミメティックで処理したＭＮＴ−１細胞中においてメラニンが若干増加していることが示唆されている（図１）。しかし、ウェスタンブロット分析によって明らかなように、分子レベルでは、ｈｓａ−ｍｉＲ−７のミメティックによる処理によってＴＹＲおよびＭＩＴＦのタンパク質発現が低下する（写真は示さない）。さらに、ｍｉＲ−７はＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＭＬＡＮＡおよびｍＲＮＡ ＭＩＴＦ−Ｍのレベルを低減するようである（図２）。

材料および方法
１．化合物
０日目（Ｄ０）に、１５００００個のＭＮＴ−１ヒトメラノーマ細胞を２４ウェルプレートに播種した。Ｄ１に、細胞に以下の化合物で生物学的処理を３つ組にて４８時間行った：

１２，０８０ Ｈ_２Ｏ ０．０８
１２，０８５ ＤＭＳＯ ４．１０^−４
１２，０９２ ＤＭＳＯ １６．１０^−５
１２，０９３ エタノール ４．１０^−４
ここで、
１２，０８０＝アスコルビルグルコシド
１２，０８５＝国際公開第２０１１／０３３２０７号に記載のように調製されたロイコドパクロム
１２，０９２＝国際公開第２００６／１３４２８２号に記載のように調製されたチオクト酸ジアセチルレスベラトリル
１２，０９３＝トラネキサム酸セチル（ＴＸＣ）。

これら化合物を、１０％（ｖ／ｖ）ストック溶液中で新鮮に調製した後、ＲＰＭＩ完全培地（細胞培養条件を参照のこと）中で最終希釈物を得た。これら化合物を含む培地を激しくボルテックスした後、細胞に適用した。さらに、ＭＮＴ−１細胞を、対照として適量のＤＭＳＯ、エタノールおよびＨ_２Ｏを用いて処理した。４８時間後、細胞をＰＢＳですすぎ、７００μＬのＱｉａｚｏｌ溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ）で溶解した後、−８０℃で貯蔵した。ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを抽出し、３０μｌのＨ_２Ｏで溶離した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ技術（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＲＮＡの濃度ならびに２６０／２８０ｎｍおよび２６０／２３０ｎｍの比を測定した。全量２０μｌのｍｉＳｃｒｉｐｔＩＩ系（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。逆転写した後、８０μｌのＨ_２Ｏを２０μｌのｃＤＮＡに添加した。各ｑＲＴ−ＰＣＲ反応では、２μｌの希釈ｃＤＮＡをモデルとして使用した。ｑＲＴ−ＰＣＲは２つ組にて行った。スクリーニングを２回、別々の日に実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲデータの解析では、スクリーニング１回につき９６ウェルプレートのすべてについて平均閾値を算出した。複数の対照試料であるＤＭＳＯ、エタノール（ＥｔＯＨ）およびＨ_２Ｏの平均をとり、対応する化合物の較正試料として使用した（ΔΔＣｔ分析）。ＳＣＡＲＮＡ１７を参照遺伝子として使用した。対照試料のｍｉＲＮＡの発現レベルを１００％とした。少なくとも２０％の上昇または低下を有意とみなした。最後に、ｍｉＲＮＡの発現の潜在的上昇または低下が２０％より有意に大きいかそれとも小さいかを試験するために、対応のないスチューデントｔ検定を使用した。

２．ルシフェラーゼレポーター分析
隣接する塩基を含むＴＹＲ（ＮＭ＿０００３７２）の３’ＵＴＲ（全長３９３ｎｔの３’ＵＴＲの６８〜７５の位置）中のｍｉＲ−３３０−５ｐの予測結合部位は、以下のプライマーを使用して設計され、ｐｍｉｒＧＬＯレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のホタルルシフェラーゼをコードする領域の下流にＰｍｅｌ部位およびＸｂａＩ部位を使用してクローニングした。

プライマーＬＬ２０８６（センス）とプライマーＬＬ２０８７（アンチセンス）とのライゲーションは野生型（ＷＴ）ＴＹＲ ３’ＵＴＲ配列を表し、プライマーＬＬ２０８８（センス）とプライマーＬＬ２０８９（アンチセンス）のライゲーションは３’ＵＴＲ ＴＹＲ領域中のｍｉＲ−３３０−５ｐ部位の変異型結合部位（ＭＵＴ）を表す。コンストラクトを何れも配列決定により確認した。Ｄ０に、２０００００個のＬｕ１２０５細胞を１２ウェルプレートに播種した。Ｄ１に、Ｌｕ１２０５細胞に３０ｎｇのｐｍｉｒＧＬＯ空ベクター（インサートなし）、または３０ｎｇのＷＴコンストラクト、または３０ｎｇのＭＵＴコンストラクトのいずれかをトランスフェクトした。同時に、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞に５０ｎＭのｍｉＲ−３３０−５ｐのミメティック（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）をコトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を回収し、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの両方（ｐｍｉｒＧＬＯベクターに含まれている）を用いてルシフェラーゼ二重アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびルミノメーター（Ｍｉｃｒｏｌｕｍａｔｐｌｕｓ ＬＢ９６Ｖ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分析した。個別の６つのトランスフェクション実験（ｎ＝６）を３つの条件について実施した。ホタルルシフェラーゼの値をウミシイタケルシフェラーゼの値に対して正規化した。相対的ルシフェラーゼ活性を算出し、非挿入の条件を１として確立した。

結果
１．化合物
色素沈着ＭＮＴ−１ヒトメラノーマ細胞を化合物で処理し、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｍｉＲ−１３７およびｍｉＲ−７）の発現を４８時間後に分析した。

ｍｉＲ−３３０−５ｐ． １２，０８５は、処理対照試料に比べて、ＭＮＴ−１細胞におけるｍｉＲ−３３０−５ｐの発現を少なくとも２０％増加させる（図３）。

ｍｉＲ−１３７． １２，０８０は、ＭＮＴ−１細胞におけるｍｉＲ−１３７の発現を２０％誘導することができる（図４）。

ｍｉＲ−７． １２，０９２および１２，０９３は、処理対照試料に比べて、ＭＮＴ−１細胞におけるｍｉＲ−７の発現を少なくとも２０％増加させる（図５）。

２．ルシフェラーゼ分析
チロシナーゼの３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−３３０−５ｐの予測結合部位（ＷＴ）を、ルシフェラーゼレポーターベクターの下流にクローニングした。さらに、ｍｉＲ−３３０−５ｐの変異型結合部位（ＭＵＴ）をクローニングした（図６Ａ）。

機構上、ｍｉＲ−３３０−５ｐはその予想位置において結合し、対応するｍＲＮＡの分解を引き起こす。このｍＲＮＡの分解は、ｍｉＲ−３３０−５ｐの標的を有していない対照に比べてルシフェラーゼ活性が低下しているということに反映されている。結合部位が変異されると、ｍｉＲＮＡはもはや結合することができず、分解は起こらない。

３つのコンストラクトを、ｍｉＲ−３３０−５ｐのミメティックの存在下でＬｕ１２０５ヒトメラノーマ細胞株にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、ＷＴコンストラクトではインサートのない対照に比べてかなり低下した。これは、ｍｉＲ−３３０−５ｐが予測部位に結合し、分解を誘導することを示唆する（図６Ｂ）。ｍｉＲ−３３０−５ｐの変異型結合部位はルシフェラーゼ活性の回復を示す。これは、ｍｉＲ−３３０−５ｐがもはやその予測部位に効果的に結合することができず、したがって分解を誘導できないことを示唆する。

結論として、これらの結果から、ｍｉＲ−３３０−５ｐはその予測部位に直接結合し、
チロシナーゼのｍＲＮＡを分解することが明らかである。

上記の開示によって提供される本願発明の具体例として、以下の発明が挙げられる。
[１] ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０、ｈｓａ−ｍｉＲ−７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、それらの成熟型およびそれらの前駆体から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの、色素脱失活性成分としての使用。
[２] 色素沈着過度障害を予防および／または治療するために使用するための、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０、ｈｓａ−ｍｉＲ−７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、それらの成熟型およびそれらの前駆体から選択されるマイクロＲＮＡ。
[３] 色素沈着過度障害が、黒皮症、肝斑、黒子、老人性黒子、光老化に伴う不規則な色素沈着過度、そばかす、擦過または熱傷または瘢痕または皮膚病または接触アレルギーによる炎症後色素沈着過度、母斑、遺伝性色素沈着過度、代謝由来または薬剤起因性の色素沈着過度、およびメラノーマから選択される、[２]に記載のマイクロＲＮＡ。
[４] マイクロＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２およびｈｓａ−ｍｉＲ−７−３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ならびにそれらの前駆体から選択されることを特徴とする、[１]に記載の使用または[２]もしくは[３]に記載のマイクロＲＮＡ。
[５] 色素脱失化合物を同定するためのインビトロの方法であって、
ａ．少なくとも１つの被験化合物をメラノサイト試料と接触させるステップ、
ｂ．前記メラノサイトにおいてｈｓａ−ｍｉｒ−３３０、ｈｓａ−ｍｉｒ−７、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３７、それらの成熟型およびそれらの前駆体から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップ、
ｃ．ステップａで処理された前記メラノサイトにおいて測定される前記マイクロＲＮＡ、その成熟型および前駆体のうち少なくとも１つの発現または活性の活性化が、無処置のメラノサイトと比べて少なくとも２０％である化合物を選択するステップ
を含む方法。
[６] ステップｂが、ステップａの前および後に実施されることを特徴とする、[５]に記載の方法。
[７] ａ’．少なくとも２つのメラノサイト試料を調製するステップと、
ａ．前記試料の１つを少なくとも１つの被験化合物と接触させるステップと、次いで
ｂ．前記試料において、ｈｓａ−ｍｉｒ−３３０、ｈｓａ−ｍｉｒ−７およびｈｓａ−ｍｉｒ−１３７、それらの成熟型およびそれらの前駆体から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップと、
ｃ．ステップａで処理されたメラノサイトにおいて測定される、前記マイクロＲＮＡ、その成熟型および前駆体のうちの少なくとも１つの発現または活性の活性化が、無処置のメラノサイトと比べて少なくとも２０％である化合物を選択するステップ
とを含むことを特徴とする、[５]に記載の方法。
[８] 前記ｈｓａ−ｍｉｒ−３３０、ｈｓａ−ｍｉｒ−７、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３７、その成熟型および前駆体から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性が、対応するマイクロＲＮＡの定量で測定されることを特徴とする、[５]〜[７]のいずれか一項に記載の方法。
[９] 前記被験化合物が植物抽出物から選択されることを特徴とする、[５]〜[８]のいずれか一項に記載の方法。
[１０] 前記メラノサイトが、メラノーマ系統、好ましくはヒトメラノーマから得られることを特徴とする、[５]〜[９]のいずれか一項に記載の方法。

（参考文献）

Claims (10)

1. ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０、ｈｓａ−ｍｉＲ−７、それらの成熟型およびそれらの前駆体から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡを色素脱失活性成分として含む、化粧品組成物。
2. 前記マイクロＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−７−２−３ｐから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化粧品組成物。
3. ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０、ｈｓａ−ｍｉＲ−７、それらの成熟型およびそれらの前駆体から選択されるマイクロＲＮＡを含む、色素沈着過度障害を予防および／または治療するための組成物であって、
   前記色素沈着過度障害が、黒皮症、肝斑、黒子、老人性黒子、光老化に伴う不規則な色素沈着過度、そばかす、擦過または熱傷または瘢痕または皮膚病または接触アレルギーによる炎症後色素沈着過度、母斑、遺伝性色素沈着過度、および代謝由来または薬剤起因性の色素沈着過度から選択される、組成物。
4. 前記マイクロＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１−３ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−７−２−３ｐから選択されることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
5. 色素脱失化合物を同定するためのインビトロの方法であって、
   ａ．少なくとも１つの被験化合物をメラノサイト試料と接触させるステップ、
   ｂ．前記メラノサイトにおいてｈｓａ−ｍｉｒ−３３０、ｈｓａ−ｍｉｒ−７、それらの成熟型およびそれらの前駆体から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップ、
   ｃ．ステップａで処理された前記メラノサイトにおいて測定される前記マイクロＲＮＡ、その成熟型および前駆体のうち少なくとも１つの発現または活性が、無処置のメラノサイトと比べて少なくとも２０％の増加である化合物を選択するステップ
   を含む方法。
6. ステップｂが、ステップａの前および後に実施されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. ａ’．少なくとも２つのメラノサイト試料を調製するステップと、
   ａ．前記試料の１つを少なくとも１つの被験化合物と接触させるステップと、次いで
   ｂ．前記試料において、ｈｓａ−ｍｉｒ−３３０、ｈｓａ−ｍｉｒ−７、それらの成熟型およびそれらの前駆体から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップと、
   ｃ．ステップａで処理されたメラノサイトにおいて測定される、前記マイクロＲＮＡ、その成熟型および前駆体のうちの少なくとも１つの発現または活性が、無処置のメラノサイトと比べて少なくとも２０％の増加である化合物を選択するステップ
   とを含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
8. 前記ｈｓａ−ｍｉｒ−３３０、ｈｓａ−ｍｉｒ−７、その成熟型および前駆体から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性が、対応するマイクロＲＮＡの定量で測定されることを特徴とする、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記被験化合物が植物抽出物から選択されることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記メラノサイトが、メラノーマ系統から得られることを特徴とする、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。

Images