JP6726419B2 - 組換え型プロバイオティクス細菌 - Google Patents

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Description

本発明は、特には炎症性皮膚機能不全の処置において使用するための組換え型プロバイオティクス細菌、さらには、炎症性皮膚機能不全を処置するための方法を対象とする。
本出願は、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５２３４５の優先権を請求する。
マクロファージは、本質的にすべての組織において見出され得る白血球の１種である。マクロファージは、非特異的防御において重要な役割を果たし、リンパ球などの他の免疫細胞を動員することによって、特異的防御機構を開始する助けともなる。
マクロファージは、弾性組織特異的マクロファージとして存在するか、またはマクロファージに分化する循環血液単球に由来する。
マクロファージは、様々な活性化状態を提示する。２つの対照的な活性化状態は、Ｍ１分極化マクロファージとも呼ばれる典型的な活性化マクロファージ、およびＭ２分極化マクロファージとも呼ばれる別の活性化マクロファージとして公知である。
Ｍ１分極化マクロファージは、活性な炎症性表現型を有する免疫エフェクター細胞を含む。Ｍ１分極化マクロファージは、高レベルの炎症誘発性サイトカインの発現、反応性窒素および酸素中間体の高い産生、Ｔｈ１応答の促進、ならびに強力な殺菌性および殺腫瘍活性によって特徴づけられる。
Ｍ２分極化マクロファージは、抗炎症性表現型である。Ｍ２分極化マクロファージは、寄生虫保持ならびに組織リモデリングの促進および腫瘍進行に関係しており、かつ免疫調節機能を有すると考えられている。Ｍ２マクロファージはまた、効率的な食細胞活性、捕捉分子の高い発現によって特徴づけられる。
可塑性および柔軟性は、単核食細胞の活性化状態の特徴である。例えば、Ｍ１分極化またはＭ２分極化マクロファージの表現型は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで逆転され得る。
マクロファージは、微小環境における刺激、サイトカインおよびケモカインの分泌パターンに応じて、複数回変化し得る。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ヒト一次Ｍ１分極化マクロファージは、それら自身のカウンターパートからの分泌因子によって、Ｍ２分極化マクロファージへと再分極化され得、逆も同様である。
病原体に対する第一線の防御を提示することに加えて、単核食細胞は、ホメオスタティック状態および損傷を受けた状態にある組織のリモデリングおよび修復に寄与する。
さらに、マクロファージは、炎症の制御に対する必須の寄与物質であり、その際、Ｍ１分極化マクロファージは、炎症の開始および持続に関与し、Ｍ２分極化マクロファージは、慢性炎症の制御と関連する。
例えば、マクロファージは、創傷治癒の様々なフェーズの間に、ダイナミックな変化を受ける。Ｍ１分極化マクロファージは、組織損傷を媒介し、炎症応答を開始する。さらに、創傷の修復応答の初期段階の間に、皮膚浸潤性マクロファージは、Ｍ２分極化表現型を示し、高度に血管新生された細胞性肉芽組織の形成をサポートする。
炎症は、敗血症、外傷、および創傷治癒などの状況では、急性炎症として、または例えば、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病などの疾患では、慢性炎症として特徴づけられ得る。癌、糖尿病、動脈硬化症、アルツハイマー、および肥満などの多くの他の疾患も、調節解除された炎症と関連している。
急性炎症応答は、侵入病原体または損傷組織の位置を決定し、他の細胞および分子に警告し、それらを動員し、損傷物質を消去し、最後に、身体を平衡まで回復させる細胞および分子の大きなアレイによって媒介される事象のカスケードを伴う。
敗血症および外傷では、この応答は、熱および心拍数の上昇などの肉眼的症状発現を随伴する。他の組織では、炎症は、発赤、腫脹、および疼痛として症状発現する。
炎症に至る損傷／機能不全をもたらす炎症のフィードフォワードループは、臓器機能不全および死亡を促進する持続性の調節解除された炎症をもたらし得る。適正な組織治癒には、良好に調節された炎症応答が必要である。
傷害後の皮膚の完全性およびホメオスターシスの回復は、修復応答：炎症、組織形成、および成熟の連続的なフェーズを達成するために、組織常在の造血細胞および動員された造血細胞と一緒に、上皮および間葉細胞の複雑でダイナミックな相互作用を必要とする。修復応答の初期段階では、炎症フェーズが優勢であり、これは、先天免疫系が局所活性化して、好中球の即時の流入、その後に続く、マクロファージに分化する血液単球の侵襲が生じることによって特徴づけられる。
修復応答の中間段階は、組織形成のフェーズを包含し、これは、皮膚創傷空間を再充填する肉芽組織の発生によって特徴づけられる。肉芽組織形成は、血管新生をもたらす内皮細胞の侵襲、線維芽細胞の流入、および追加のマクロファージの蓄積を包含する。
暫定的な細胞外創傷マトリックスの堆積は、細胞の接着、遊走、および増殖を促進する。さらに、創傷周辺部では、複雑な表皮−間葉相互作用が、角化細胞の増殖および遊走を刺激して、表皮バリアを回復させる。
創傷空間が再充填され、被覆する表皮が回復するまで、肉芽組織形成は続く。表皮バリアが完成すると、修復応答は、後期段階に入り、これは、組織成熟によって特徴づけられる。組織成熟のフェーズの間に、肉芽組織は、瘢痕組織に変化する。
皮膚の修復の間、常在細胞、さらには、動員された炎症性細胞の先天免疫応答は、侵襲性の微生物と戦い、壊死組織切除に寄与するが、多種多様な増殖因子の放出による修復プロセスもサポートし得る。
しかしながら、炎症誘発性および細胞傷害性メディエーターの放出によって、マクロファージの制御から逸脱した活性は、組織修復にとって有害でもあり得る。
マクロファージの数の上昇によって特徴づけられるアンバランスな炎症は、ヒト疾患において、修復応答の減弱の顕著な特徴であり、非治癒性慢性創傷の形成をもたらす。非治癒性慢性創傷に寄与する追加の因子は、例えば、糖尿病、静脈または動脈疾患、感染、および高齢者における代謝不全である。
慢性創傷を処置するために、感染を処置するための抗生物質の使用、壊死組織切除、陰圧補助閉鎖、および酸素付加を包含する様々な方法が存在する。
さらなる方法には、例えば、増殖因子の適用が包含される。
例えば、ベカプレルミンは、組換え型ヒト血小板由来増殖因子ＢＢである。ベカプレルミンは、商品名Ｒｅｇｒａｎｅｘで販売されており、皮下組織内に、またはそれを越えて伸長し、十分な血液供給を有する下肢糖尿病性神経障害性潰瘍の処置に適応とされる。
ベカプレルミンはさらに、初期の高度創面清掃術、圧力放出、および感染制御を包含する足部潰瘍の治療実施に対する補助剤として（代替としてではない）適応とされる。
しかしながら、市販後の後向きコホート研究において、悪性腫瘍に次ぐ死亡率の上昇が、３本以上のチューブのＲｅｇｒａｎｅｘジェルで処置された患者において観察された。
使用される別の増殖因子は、商品名ＲＥＧＥＮ−Ｄジェルで販売されており、慢性糖尿病性足部潰瘍を処置するために使用される組換え型ヒト表皮増殖因子である。
さらに、トラフェルミンは、商品名「Ｆｉｂｌａｓｔ Ｓｐｒａｙ」で販売されているヒト線維芽細胞増殖因子２の組換え型である。トラフェルミンは、圧迫潰瘍、ならびに熱傷潰瘍および黒色潰瘍を包含する他の皮膚潰瘍を処置するために使用される。
足部潰瘍の慢性糖尿病性神経障害性潰瘍に罹患している患者に対して、６週間にわたってトラフェルミンまたはプラセボを毎日適用した後に、週１回の臨床検査およびコンピュータ写真によって、サイズが評価された。潰瘍の外周および面積の週ごとの低減は、両方の群で同一であり、処置のエントリーから６週目まで、直線的な進行速度も同様であった。さらに、研究の終了時での治癒面積のパーセンテージが、有意に異なることはなかった。Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）によれば、足の慢性神経障害性糖尿病性潰瘍の治癒について、トラフェルミンの局所適用は、プラセボを上回る利点を有さなかった。
罹患創傷面に適用した後に、様々な増殖因子を分泌するヒト胚細胞を含有する２種の皮膚代替物も市販されている。
皮膚代替物Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔは、線維芽細胞、細胞外マトリックス、および生体吸収性スキャフォールドから構成される。Ｄｅｒｍａｇｒａｆは、寄付された新生児包皮組織に由来するヒト線維芽細胞から製造される。
製造プロセス中に、ヒト線維芽細胞は、生体吸収性ポリグラクチンスキャフォールド上に播種される。
市販の皮膚代替物Ａｐｌｉｇｒａｆは、新生児包皮に由来する２種の細胞種を含有する。生きたヒト角化細胞および線維芽細胞が、創傷１型コラーゲンマトリックスに包埋される。
上述の皮膚代替物の欠点は、製造プロセスから生じる相当する高価格である。例えば、母体血液は、免疫不全ウイルス１および２型、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、梅毒、ヒトＴリンパ好性ウイルス１および２型、さらには、エプスタインバールウイルスなどのヒトウイルスでの感染の証拠について検査される。
さらなる市販品が、商品名Ｐｒｏｃｕｒｅｎで販売されている。Ｐｒｏｃｕｒｅｎは、非治癒性創傷を処置するための血小板由来創傷治癒配合物である。Ｐｒｏｃｕｒｅｎは、患者の血液サンプルから調製される自己血小板由来産物である。
しかしながら、慢性非治癒性創傷を処置するための、または急性外科的創傷などの他の状態を処置するための、自己血小板由来増殖因子を包含する自己血小板由来産物の有効性に関する証拠は十分に存在しない。
さらに、上述の皮膚代替物、さらには、自己血小板由来産物によって供給される増殖因子の量は、出発物質の品質に応じて、著しく変動する。
本発明の目的は、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全に対して有益な因子を容易に適用することができる、炎症性皮膚機能不全、特に、慢性炎症性皮膚機能不全の代替処置を可能にすることである。
さらに、治癒をサポートする有益な因子を制御量で、炎症性皮膚機能不全を処置するために提供すべきである。
本発明の目的は、第１の異種因子をコードする核酸配列（複数可）、第２の異種因子をコードする核酸配列（複数可）、および好ましくは第３の異種因子をコードする核酸配列（複数可）を含むが、ただし、第１の因子、第２の因子、および第３の因子は、相互に機能的に異なり、その際、第１の因子は、増殖因子であり、第２の因子は、Ｍ２分極化因子からなる群から選択され、好ましくは、第３の因子は、Ｍ２分極化因子および増殖因子からなる群から選択されることを条件とする、請求項１に記載の組換え型プロバイオティクス細菌を提供することによって解決される。
好ましくは、請求項１に記載の組換え型プロバイオティクス細菌は、第１の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列、第２の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列、および第３の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むが、ただし、第１の因子、第２の因子、および第３の因子は、相互に機能的に異なり、その際、第１の因子は、増殖因子であり、第２の因子は、Ｍ２分極化因子からなる群から選択され、第３の因子は、Ｍ２分極化因子および増殖因子からなる群から選択されることを条件とする。
組換え型プロバイオティクス細菌の好ましい実施形態は、従属請求項２〜２２において開示されている。
本発明の目的はさらに、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全の処置において使用するための、請求項１７に記載の組換え型プロバイオティクス細菌を提供することによって解決され、その組換え型プロバイオティクス細菌は、第１の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列、および第２の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、その際、第１の因子は、増殖因子であり、第２の因子は、Ｍ２分極化因子からなる群から選択される。
好ましくは、請求項１７に記載の組換え型プロバイオティクス細菌は、第１の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列、第２の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列、および第３の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むが、ただし、第１の因子、第２の因子、および第３の因子は、相互に機能的に異なり、その際、第１の因子は、増殖因子であり、第２の因子は、Ｍ２分極化因子からなる群から選択され、第３の因子は、Ｍ２分極化因子および増殖因子からなる群から選択されることを条件とする。
本発明の目的はさらに、請求項２３に記載の、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全を処置するための方法を提供することによって解決され、その方法は、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌を、皮膚機能不全に罹患している個体に投与するステップを含む。
本発明者らは意外にも、上述の核酸配列を含む組換え型プロバイオティクス細菌を、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全の処置において使用することができるであろうことを見い出した。
本発明の好ましい実施形態は、従属請求項において開示されている。
本発明によれば、「機能的に異なる因子」または「相互に機能的に異なる」という用語は、個々の因子が好ましくは、異なる受容体に結合し、および／または標的細胞において、異なる第２のメッセンジャーを活性化させることを意味する。第２のメッセンジャーは、細胞によって放出されて、生理学的変化を開始させる細胞内シグナル伝達分子である。
本発明によれば、因子の「機能的類似体」という用語は、個々の因子と同一の受容体（複数可）に結合し、かつ好ましくは、標的細胞において、同一の第２のメッセンジャーを活性化させる作用物質を意味する。
例えば、ナイシンの機能的類似体は、成熟ナイシン分子またはその機能的類似体のための受容体として作用し、かつ好ましくは、ＮｉｓＲのその後のリン酸化をもたらすＮｉｓＫに結合する。リン酸化ＮｉｓＲは、個々のナイシンプロモーターからの転写を誘導する。
好ましくは、第１、第２、および第３の異種因子の「機能的類似体」は、少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９３％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％のアミノ酸配列の配列同一性を有する。
本発明によれば、「異種因子」という用語は、使用されるプロバイオティクス細菌内に自然発生していないか、またはそれよって発現されない因子、好ましくはタンパク質を意味する。
「機能的類似体」は、バイオシミラーとも呼ばれ得る。
「異種因子（複数可）」に一般に言及する場合、または例えば、ＦＧＦ−２、ＩＬ−４、ＣＳＦ−１などの具体的な「異種因子（複数可）」に言及する場合、この用語が、その機能的類似体（複数可）も包含することが意図されている。
上述の核酸配列を含む組換え型プロバイオティクス細菌は、常に、および／または誘導されると、個々の核酸配列を転写および翻訳することによって、個々の第１、第２、および、好ましくは第３の異種因子の独特の組合せを産生することができる。
因子のこの独特の組合せは、少なくとも１種の増殖因子、および少なくとも１種のＭ２分極化因子を含む。
好ましくは、因子のこの独特の組合せは、増殖因子、第１のＭ２分極化因子、および第１のＭ２分極化因子とは異なる第２のＭ２分極化因子を含む。別法では、因子のこの独特の組合せは、第１の増殖因子、Ｍ２分極化因子、および第１の増殖因子とは異なる第２の増殖因子を含む。
組換え型プロバイオティクス細菌は、好ましくは、請求項１において列挙したとおりの様々な少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種の異種因子を、罹患組織に送達して、局所免疫系をモジュレートし、治癒を可能にする。
好ましくは、組換え型プロバイオティクス細菌は、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全への適用後に、個々の第１の異種因子および第２の異種因子、および好ましくは第３の異種因子を放出する。
さらに、本発明において使用される組換え型プロバイオティクス細菌は、好ましくは、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全の部位への適用後に、個々の第１の異種因子および第２の異種因子、および好ましくは第３の異種因子のコンスタントな放出を提供する。
それによって、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全に罹患している対象のために、かなり改善され、より安全で、かつより費用対効果の高い処置オプションが利用可能である。
好ましくは、細菌から放出された後の個々の第１、第２、および第３の異種因子は、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全の治癒をサポートする生物学的活性機能を発揮する。
第１の異種因子は、増殖因子である。
好ましくは、増殖因子は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、アクチビン、それらの機能的類似体、それらのバイオシミラー、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
もちろん、上述もしくは下述する因子の機能的類似体またはそれらのバイオシミラーも、特許請求の範囲において記載するとおり、本発明の範囲内で使用することができる。
線維芽細胞増殖因子は、血管新生、創傷治癒、および様々な内分泌シグナル伝達経路に関係する増殖因子のファミリーである。
ヒトでは、ＦＧＦファミリーの２２のメンバー、ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−１４およびＦＧＦ−１６〜ＦＧＦ−２３が同定されており、これらを、本発明において使用することができる。
ＦＧＦ−１からＦＧＦ−１０は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）に結合する。
線維芽細胞増殖因子１は、酸性線維芽細胞増殖因子としても公知である。線維芽細胞増殖因子２は、塩基性線維芽細胞増殖因子としても公知である。さらに、線維芽細胞増殖因子７は、角化細胞成長因子（ＫＧＦ）としても公知であり、線維芽細胞増殖因子１０は、角化細胞成長因子２（ＫＧＦ−２）としても公知である。
好ましい一実施形態では、線維芽細胞増殖因子は、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、およびそれらの混合物、さらに好ましくはＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、およびそれらの混合物、さらに好ましくは、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−７、それらの機能的類似体、それらのバイオシミラー、およびそれらの混合物からなる群から選択され、さらに好ましくは、ＦＧＦ−２である。
例えば、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２は、血管新生を刺激することができ、かつ線維芽細胞および角化細胞を包含する、炎症性皮膚機能不全の部位に存在する複数の細胞種について、分裂促進性である。さらに、ＦＧＦ−７は、パラ分泌的に、創傷の再上皮形成を刺激し得る。
線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）、好ましくはヒト線維芽細胞増殖因子２（ｈＦＧＦ−２）は、創傷治癒および腫瘍増殖を包含する多様な生物学的プロセスに関与している。
この遺伝子のためのｍＲＮＡは、複数のポリアデニル化部位を含有し、他には、非ＡＵＧおよびＡＵＧ開始コドンから翻訳されて、別個の特性を有する５種の異なるアイソフォームをもたらす。非ＡＵＧアイソフォームは、核に局在化されており、かつイントラクライン作用を担っている一方で、ＡＵＧ開始形態は、大部分、細胞質ゾルであり、かつＦＧＦ−２のパラ分泌および自己分泌作用を担っている。
ヒト線維芽細胞増殖因子２（ｈＦＧＦ−２）のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００２００６．４で入手可能である。ＡＵＧ−異性体の個々のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１９９７．５、さらには、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０９０３８−ｖｅｒｓｉｏｎ１８２で入手可能であり、図２２ａにおいても示されている。
プレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸１〜１４２に及ぶプロペプチド、およびプレプロタンパク質のアミノ酸１４３〜２８８に及ぶ成熟ヒト線維芽細胞増殖因子２ペプチドを包含する。
好ましい一実施形態では、線維芽細胞増殖因子２は、配列番号２６〜３０のアミノ酸配列の１つまたは少なくとも１つ、さらに好ましくは配列番号２８のアミノ酸配列を含む。配列番号２８のアミノ酸配列は、図２２ｂにおいて示されている。
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、インスリンと高い配列類似性を有するタンパク質である。インスリン様成長因子は、２種のタンパク質ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を含み、これらを、本発明において使用することができる。
表皮成長因子（ＥＧＦ）のファミリーは、高度に類似する構造的および機能的特徴を有するタンパク質であり、タンパク質の表皮成長因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン（ＡＲ）、エピレグリン（ＥＰＲ）、エピジェン（ＥＰＧＮ）、ベータセルリン（ＢＴＣ）、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）、ニューレグリン−２（ＮＲＧ２）、ニューレグリン−３（ＮＲＧ３）、およびニューレグリン−４（ＮＲＧ４）、好ましくは表皮成長因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン（ＡＲ）、エピレグリン（ＥＰＲ）、エピジェン（ＥＰＧＮ）、およびベータセルリン（ＢＴＣ）、さらに好ましくは表皮成長因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、およびトランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）を含み、これらを、本発明において使用することができる。
表皮成長因子（ＥＧＦ）、好ましくはヒト表皮成長因子（ｈＥＧＦ）は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて様々な表皮および上皮性組織の、かつ細胞培養において一部の線維芽細胞の増殖を刺激する。さらに、ｈＥＧＦは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、特異的な細胞の分化に対して非常に大きな効果を有し、外胚葉および中胚葉由来の両方の様々な培養細胞のための強力な分裂促進因子である。
ヒト表皮成長因子は、選択的スプライシングによって産生される少なくとも３種のアイソフォームで存在する。
ヒト表皮成長因子アイソフォーム１プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１９５４．１で入手可能である。対応するｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１９６３．２で入手可能である。
アイソフォーム１のプレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸１〜２２に及ぶシグナルペプチド、プレプロタンパク質のアミノ酸２３〜１２０７に及ぶプロペプチド、およびプレプロタンパク質のアミノ酸９７１〜１０２３に及ぶ成熟ヒト表皮成長因子ペプチドを包含する。
ヒト表皮成長因子アイソフォーム２プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１１７１６０１．１で入手可能である。対応するｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１１７８１３０．１で入手可能である。ヒト表皮成長因子アイソフォーム３プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１１７１６０２．１で入手可能である。対応するｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１１７８１３１．１で入手可能である。ヒト表皮成長因子アイソフォーム１〜３のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０１１３３−ｖｅｒｓｉｏｎ１８０でも入手可能であり、図２５ａ〜２５ｃにおいても示されている。成熟ヒト表皮成長因子のアミノ酸配列は、図２５ｄにおいて示されている。
ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、好ましくはヒトヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ｈＨＢ−ＥＧＦ）は、皮膚創傷治癒に必要とされる上皮形成において重要な増殖因子である。ｈＨＢ−ＥＧＦは、角質細胞および線維芽細胞に対して、分裂促進性および遊走性作用を有する。ｈＨＢ−ＥＧＦはさらに、創傷治癒に必要な皮膚修復および血管新生を促進する。ｈＨＢ−ＥＧＦは、創傷液の主たる成分である。ｈＨＢ−ＥＧＦは、マクロファージ、単球、および角化細胞によって放出される。さらに、へパラン硫酸プロテオグリカンへのｈＨＢ−ＥＧＦ細胞表面の結合は、皮膚創傷治癒の速度を上げ、ヒト皮膚移植治癒時間を短縮する能力を促進する分裂促進因子を増強し、かつ潰瘍、熱傷、および表皮中間層創傷の迅速な治癒を促進する。
ヒトヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１９３６．１で入手可能である。対応するｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１９４５．２で入手可能である。
ヒトヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子の前駆体は、前駆体のアミノ酸１〜１９に及ぶシグナルペプチド、前駆体のアミノ酸２０〜２０８に及ぶプロヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子、および前駆体のアミノ酸６３〜１４８に及ぶ成熟ヒト表皮成長因子ペプチドを包含する。
ヒトヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ９９０７５−ｖｅｒｓｉｏｎ １５１でも入手可能であり、かつ図２６ａにおいても示されている。成熟ヒトヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子のアミノ酸配列は、図２６ｂにおいて示されている。
トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、好ましくはヒトトランスフォーミング増殖因子−α（ｈＴＧＦ−α）は、マクロファージ、脳細胞、および角化細胞において産生され得る。ｈＴＧＦ−αは、上皮発生を誘導する。ｈＴＧＦ−αおよびｈＥＧＦは、同じ受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ−１；ヒトではＨＥＲ１）に結合する。ＴＧＦ−αがＥＧＦＲに結合すると、これは、創傷治癒を包含する複数の細胞増殖事象を開始させ得る。
ヒトトランスフォーミング増殖因子−αは、選択的スプライシングによって産生される少なくとも５種のアイソフォームで存在する。
ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム１プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００３２２７．１で入手可能である。対応するｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００３２３６．２で入手可能である。
ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム１の前駆体は、前駆体のアミノ酸１〜２３に及ぶシグナルペプチド、前駆体のアミノ酸２４〜１６０に及ぶプロトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム１、および前駆体のアミノ酸４０〜８９に及ぶ成熟トランスフォーミング増殖因子アルファペプチドを包含する。
ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム２プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１０９３１６１．１で入手可能である。対応するｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１０９９６９１．１で入手可能である。
ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム３プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１２９５０８７．１で入手可能である。対応するｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１３０８１５８．１で入手可能である。
ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム４プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１２９５０８８．１で入手可能である。対応するｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１３０８１５９．１で入手可能である。
ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム５プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＦ０５０９０．１で入手可能である。対応するｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＡＦ１４９０９７．１で入手可能である。
ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム１〜５の前駆体のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０１１３５−ｖｅｒｓｉｏｎ １６８でも入手可能であり、図２７ａ〜２７ｅにおいて示されている。成熟ヒトトランスフォーミング増殖因子アルファのアミノ酸配列は、図２７ｆにおいて示されている。
アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、好ましくはヒトアンフィレグリン（ｈＡＲＥＧ）は、ＥＧＦ受容体の別のリガンドである。ヒトアンフィレグリンは、星状細胞、シュバン細胞、および線維芽細胞を包含する幅広い範囲の標的細胞のための自己分泌増殖因子、さらには、分裂促進因子である。ヒトアンフィレグリンは、上皮細胞の増殖を促進する。
ヒトアンフィレグリンプレプロタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１６４８．１で入手可能である。対応するｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１６５７．３で入手可能である。
ヒトアンフィレグリンプレプロタンパク質の前駆体は、プレプロタンパク質のアミノ酸１〜１９に及ぶシグナルペプチド、プレプロタンパク質のアミノ酸２０〜１００に及ぶプロペプチド、およびプレプロタンパク質のアミノ酸１０１〜１８７に及ぶ成熟トランスフォーミング増殖因子アルファペプチドを包含する。
ヒトアンフィレグリンプレプロタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ１５５１４−ｖｅｒｓｉｏｎ １４７でも入手可能であり、かつ図２８ａにおいても示されている。成熟ヒトアンフィレグリンのアミノ酸配列は、図２８ｂにおいて示されている。
エピレグリン（ＥＰＲ）、好ましくはヒトエピレグリン（ｈＥＰＲ）は、細胞増殖および／または血管新生を刺激し得るＥＧＦ受容体のリガンドである。
ヒトエピレグリンプレプロタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１４２３．１で入手可能である。対応するｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１４３２．１で入手可能である。
ヒトエピレグリンのプレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸１〜２９に及ぶシグナルペプチド、プレプロタンパク質のアミノ酸３０〜１６９に及ぶプロエピレグリン、およびプレプロタンパク質のアミノ酸６０〜１０８に及ぶ成熟エピレグリンを包含する。
ヒトエピレグリンプレプロタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｏ１４９４４−ｖｅｒｓｉｏｎ １４６でも入手可能であり、図２９ａにおいても示されている。成熟ヒトエピレグリンのアミノ酸配列は、図２９ｂにおいて示されている。
エピジェン（ＥＰＧＮ）、好ましくはヒトエピジェン（ｈＥＰＧＮ）は、上皮細胞の増殖を促進する。ヒトエピジェンは、選択的スプライシングによって産生される少なくとも７種のアイソフォームで存在する。
ヒトエピジェンアイソフォーム１前駆体のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１２５７９１８．１で入手可能である。対応するｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１２７０９８９．１で入手可能である。
ヒトエピジェンアイソフォーム１前駆体は、前駆体のアミノ酸１〜２２に及ぶシグナルペプチド、および前駆体のアミノ酸２３〜１５４に及ぶ成熟エピレグリンを包含する。
ヒトエピジェンアイソフォーム１〜７前駆体のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ６ＵＷ８８−ｖｅｒｓｉｏｎ １０１でも入手可能であり、かつ図３０ａ〜３０ｇにおいても示されている。成熟ヒトエピジェンのアミノ酸配列は、図３０ｈにおいて示されている。
ベータセルリン（ＢＴＣ）、好ましくはヒトベータセルリン（ｈＢＴＣ）は、上皮成長因子受容体にも結合し、かつ、広範な成体組織によって、かつ平滑筋細胞および上皮細胞を包含する多くの培養細胞において合成される増殖因子である。ヒトプロベータセルリン前駆体のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１７２０．１で入手可能である。対応するｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１７２９．１で入手可能である。
ヒトプロベータセルリンの前駆体は、前駆体のアミノ酸１〜３１に及ぶシグナルペプチド、前駆体のアミノ酸３２〜１７８に及ぶプロベータセルリン、および前駆体のアミノ酸３２〜１１１に及ぶ成熟ベータセルリンを包含する。
ヒトプロベータセルリン前駆体のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ３５０７０−ｖｅｒｓｉｏｎ １３９でも入手可能であり、かつ図３１ａにおいても示されている。成熟ヒトベータセルリンのアミノ酸配列は、図３１ｂにおいて示されている。
インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）は、ソマトメジンＣとも呼ばれる。ヒトＩＧＦ−１のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿０００６１８．２で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０００６０９．１、さらに、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０５０１９−ｖｅｒｓｉｏｎ １７８で入手可能である。
そのプレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸１〜２１に及ぶシグナルペプチド、およびプレプロタンパク質のアミノ酸４９〜１１８に及ぶヒトインスリン様成長因子１ペプチドを包含する。
ヒトインスリン様成長因子２（ｈＩＧＦ−２）のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿０００６１２．４で入手可能である。ヒトインスリン様成長因子２プレプロタンパク質の対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０００６０３．１、さらには、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０１３４４−ｖｅｒｓｉｏｎ １９２で入手可能である。
そのプレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸１〜２４に及ぶシグナルペプチド、およびプレプロタンパク質のアミノ酸２５〜９１に及ぶインスリン様成長因子２の成熟鎖を包含する。
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のファミリーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、および胎盤増殖因子（ＰＧＦ）を包含する増殖因子の群であり、これらを、本発明において使用することができる。
好ましい一実施形態では、血管内皮細胞増殖因子は、血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）である。
ＶＥＧＦ−Ａは、血管新生、脈管形成、および内皮細胞増殖を誘導し得る。
ヒト血管内皮細胞増殖因子Ａ（ｈＶＥＧＦ−Ａ）のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１０２５３６６．１で入手可能である。ヒト血管内皮細胞増殖因子Ａの対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１０２０５３７．２、さらには、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ１５６９２−ｖｅｒｓｉｏｎ １９７で入手可能である。
ヒト血管内皮細胞増殖因子Ａの前駆体タンパク質は、前駆体タンパク質のアミノ酸１〜２６に及ぶシグナルペプチド、さらには、前駆体タンパク質のアミノ酸２７〜２３２に及ぶ成熟ヒト血管内皮細胞増殖因子Ａを包含する。
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、細胞増殖および分化を調節する。ヒト血小板由来増殖因子（ｈＰＤＧＦ）は、個々のサブユニットのホモまたはヘテロ二量体のいずれかを形成する４種のサブユニット、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、およびＰＤＧＦ−Ｄを有し、これらを、本発明において使用することができる。
好ましくは、血小板由来増殖因子は、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、またはそれらの混合物である。
さらに好ましくは、血小板由来増殖因子は、２個のＰＤＧＦ−Ａサブユニットから構成される二量体タンパク質、２個のＰＤＧＦ−Ｂサブユニットから構成される二量体糖タンパク質、１個のＰＤＧＦ−Ａサブユニットおよび１個のＰＤＧＦ−Ｂサブユニットから構成される二量体糖タンパク質、またはそれらの混合物である。
ヒト血小板由来増殖因子サブユニットＡ（ｈＰＤＧＦ−Ａ）のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００２６０７．４で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００２５９８．４、さらには、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０４０８５−ｖｅｒｓｉｏｎ １５９で入手可能である。
ヒトＰＤＧＦ−Ａサブユニットの対応するプレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸１〜２０に及ぶシグナルペプチド、およびプレプロタンパク質のアミノ酸８７〜２１１に及ぶ成熟ヒト血小板由来増殖因子サブユニットＡをコードする。
ヒト血小板由来増殖因子サブユニットＢ（ｈＰＤＧＦ）のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００２６０８．１で入手可能である。ヒト血小板由来増殖因子サブユニットプレプロタンパク質の対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００２５９９．１、さらには、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０１１２７−ｖｅｒｓｉｏｎ １８１で入手可能である。
ヒトＰＤＧＦ−Ｂサブユニットのプレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸１〜２０に及ぶシグナルペプチド、およびプレプロタンパク質のアミノ酸８２〜１９０に及ぶヒト血小板由来増殖因子サブユニットＢの成熟型をコードする。
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、間葉細胞によって分泌され、かつ主に上皮細胞および内皮細胞に対して作用するが、造血前駆細胞に対しても作用する増殖因子であり、本発明において使用することができる。
ＨＧＦは、１つのプレプロタンパク質として分泌され、セリンプロテイナーゼによって、６９ｋＧａアルファ鎖および３４ｋＤａベータ鎖に切断される。プレプロタンパク質、さらには、対応するアルファおよびベータ鎖のアミノ酸配列は、図２３ａ〜２３ｃにおいて示されている。
ヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿０００６０１．３で入手可能である。ヒト肝細胞増殖因子プレプロタンパク質の対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０００５９２．３、さらには、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ１４２１０−ｖｅｒｓｉｏｎ １８６で入手可能である。
そのプレプロタンパク質は、プレプロタンパク質のアミノ酸１〜３１に及ぶシグナルペプチド、プレプロタンパク質のアミノ酸３２〜４９４に及ぶヒト肝細胞増殖因子アルファ鎖、およびプレプロタンパク質のアミノ酸４９５〜７２８に及ぶヒト肝細胞増殖因子ベータ鎖を包含する。
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、好ましくはヒトトランスフォーミング増殖因子β（ｈＴＧＦ−β）は、マクロファージを包含する多くの細胞種によって分泌されるサイトカインである。
ＴＧＦ−βは、少なくとも３種のアイソフォーム、ＴＧＦ−β１、ＴＦＧ−β２、およびＴＧＦ−β３で存在し、これらを、本発明において使用することができる。対応する前駆体タンパク質および成熟タンパク質のアミノ酸配列は、図２１ａ〜２１ｇにおいて示されている。
ヒトトランスフォーミング増殖因子β１は、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）および成熟ＴＧＦ−β１ペプチドへと切断される分泌タンパク質である。成熟ペプチドは、他のＴＧＦ−βファミリーメンバーと共にＴＧＦ−β１ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかを形成し得る。
ヒトトランスフォーミング増殖因子β１前駆体のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿０００６６０．４によって得ることができる。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０００６５１．３またはＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０１１３７−ｖｅｒｓｉｏｎ １９９で入手可能である。
ヒトＴＧＦ−β１前駆体のアミノ酸配列は、前駆体タンパク質のアミノ酸１〜２９に及ぶシグナルペプチド、前駆体タンパク質のアミノ酸３０〜２７８に及ぶ潜在関連ペプチド、および前駆体タンパク質のアミノ酸２７９〜３９０に及ぶ成熟トランスフォーミング増殖因子β１を包含する。
トランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦ−β２）、好ましくはヒトトランスフォーミング増殖因子β２（ｈＴＧＦ−β２）は、多くの細胞種の増殖、分化、接着、および遊走を調節する多機能型サイトカインである。
別に、ヒトトランスフォーミング増殖因子β２遺伝子のスプライシングされた転写変異体が同定されており、それらは、２種の異なるアイソフォームをコードする。
ヒトヒトトランスフォーミング増殖因子ベータ２アイソフォーム１前駆体のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１１３５５９９．３で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１１２９０７１．１で入手可能である。
ヒトトランスフォーミング増殖因子ベータ２アイソフォーム１前駆体は、前駆体タンパク質のアミノ酸１〜２０に及ぶシグナルペプチド、前駆体タンパク質のアミノ酸２１〜３０２に及ぶ潜在関連ペプチド、および前駆体タンパク質のアミノ酸３０３〜４１４に及ぶ成熟トランスフォーミング増殖因子ベータ２を包含する。
ヒトトランスフォーミング増殖因子β２アイソフォーム２前駆体のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００３２３８．３で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００３２２９．１で入手可能である。その前駆体タンパク質は、前駆体タンパク質のアミノ酸１〜２０に及ぶシグナルペプチド、前駆体タンパク質のアミノ酸２１〜３０２に及ぶ潜伏関連ペプチド、および前駆体タンパク質のアミノ酸３０３〜４１４に及ぶ成熟ＴＧＦ−β２ペプチドを包含する。
トランスフォーミング増殖因子β２のアミノ酸配列はさらに、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ６１８１２−ｖｅｒｓｉｏｎ １２８で入手可能である。
トランスフォーミング増殖因子β３（ＴＧＦ−β３）、好ましくはヒトトランスフォーミング増殖因子β３（ｈＴＧＦ−β３）は、胚形成および細胞分化に関係する分泌サイトカインである。
ヒトトランスフォーミング増殖因子β３前駆体タンパク質のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００３２３９．３で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００３２３０．１、さらには、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ１０６００−ｖｅｒｓｉｏｎ １７０で入手可能である。
その前駆体タンパク質は、前駆体タンパク質のアミノ酸１〜２３を包含するシグナルペプチド、前駆体タンパク質のアミノ酸２４〜３０を包含する潜伏関連ペプチド、および前駆体タンパク質のアミノ酸３０１〜４１２に及ぶ成熟トランスフォーミング増殖因子β３ペプチドを包含する。
好ましくは、トランスフォーミング増殖因子βは、配列番号１９〜２５のアミノ酸配列の１つまたは少なくとも１つを含む。
アクチビンは、下垂体卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出を刺激するタンパク質として、生殖腺液から元々は精製されたジスルフィド結合二量体タンパク質である。アクチビンタンパク質は、中胚葉誘導、神経細胞分化、骨リモデリング、造血、および生殖生理における役割を包含する広範な生物学的活性を有する。
アクチビンは、様々なベータサブユニットアイソフォームのホモ二量体またはヘテロ二量体である一方で、インヒビンは、１個の独特のアルファサブユニットおよび様々なベータサブユニットの１個のヘテロ二量体である。
４種のベータサブユニット、ベータＡ、ベータＢ、ベータＣ、およびベータＥが公知である。
第２の異種因子は、Ｍ２分極化因子からなる群から選択される。
好ましくは、Ｍ２分極化因子は、非分極化マクロファージ、Ｍ１分極化マクロファージ、さらには、未分化単球、および他のマクロファージ前駆細胞に対して作用する。
さらに好ましくは、Ｍ２分極化因子は、非分極化マクロファージ、Ｍ１分極化マクロファージ、さらには、未分化単球、および他のマクロファージ前駆細胞のＭ２分極化を誘導する。
マクロファージが、局所組織環境に応じて、特異的な分化を受け得ることは、当業者には公知である。Ｔ−ヘルパー１型（ＴＨ１）およびＴ−ヘルパー２型（ＴＨ２）分極化と同様に、マクロファージの分極化の２つの別個の状態：典型的な活性化（Ｍ１分極化）マクロファージ表現型および別の活性化（Ｍ２分極化）マクロファージ表現型が明らかにされている。
Ｍ２分極化マクロファージ表現型は、遺伝子発現プロファイルに基づき、サブセット：Ｍ２ａ分極化、Ｍ２ｂ分極化、およびＭ２ｃ分極化表現型にさらに区分され得る。
Ｍ１分極化およびＭ２分極化マクロファージは、別個のケモカインおよびケモカイン受容体プロファイルを有する。
Ｍ１分極化マクロファージは好ましくは、ＴＨ１細胞誘引性ケモカインであるケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）およびＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）を分泌する。Ｍ２分極化マクロファージは好ましくは、ケモカインであるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１７（ＣＣＬ１７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン２２（ＣＣＬ２２）、およびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２４（ＣＣＬ２４）を分泌する。
異種因子のＭ２分極化作用は、例えば、非分極化マクロファージ、Ｍ１分極化マクロファージ、またはマクロファージ前駆細胞、好ましくは単球が、少なくとも１種のＭ２分極化因子と接触すること、およびその後で、Ｍ２分極化マーカーの発現および／または分泌を決定することによって決定され得る。
例えば、マウス非分極化マクロファージ細胞系、マウスＭ１分極化マクロファージ細胞系、またはマウスマクロファージ前駆細胞系、好ましくはマウス単球細胞系を、少なくとも１種のＭ２分極化因子と接触させて、マウスＭ２分極化マクロファージ細胞系を生成することができる。マウスマクロファージ細胞系のＭ２分極化は、例えば、次の因子の発現を決定することによって検出され得る：アルギナーゼ１（Ａｒｇ１）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、マンノース受容体Ｃ１型（Ｍｒｃ１）、およびＹｍ１（Ｔリンパ球由来好酸球走化性因子（ＥＣＦ−Ｌ）またはキチナーゼ様タンパク質３（Ｃｈｉｌ３）とも呼ばれる）。マウスマクロファージ細胞系のＭ１分極化は、例えば、次の因子の発現および／または放出を決定することによって検出され得る：腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ、ＴＮＦα）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、およびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４（ＣＣＬ４）。
好ましくはヒトＭ２分極化マクロファージは、少なくとも１種のＭ２分極化因子と共にインキュベートされたヒト単球に由来する。ヒト単球に由来するマクロファージのＭ２分極化は、例えば、次の因子の発現および／または放出を決定することによって検出され得る：インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１ＲＡ）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、およびトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）。
近年、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、サイトカイン環境の変化に応じて、マクロファージは、Ｍ２からＭ１へと逆分極化することができ、その逆も同様であることが実証されている（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３））。さらに、分極化の変化は、迅速であり、遺伝子発現、タンパク質、代謝産物、および殺菌活性のレベルで生じる。
さらに、マクロファージは、固形腫瘍と関連する浸潤性白血球の主たる集団の１つである。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、腫瘍免疫において重要な役割を果たし、Ｍ２ｄ ＴＡＭ分極化とも呼ばれる、Ｍ２分極化と同様の機能を示す。
個々の分極化（Ｍ１、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ、およびＭ２ｄ ＴＡＭ）の刺激および／または活性化に必要なそれぞれの因子は、当業者に公知であり、例えば、Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）またはＤｕｌｕｃ ｅｔ ａｌ．（２００７）において開示されている。
好ましくは、個々の第２の異種因子および、任意選択で、第３の異種因子は、組換え型プロバイオティクス細菌における発現、および細菌から、炎症性、好ましくは、慢性炎症性皮膚機能不全の部位への放出の後に、Ｍ２分極化を誘導する。
次いで、抗炎症性Ｍ２分極化マクロファージは好ましくは、血管新生、結合組織付着、および創傷修復を促進し、これが、処置を受ける炎症性、好ましくは、慢性炎症性皮膚機能不全の改善、好ましくは治癒をもたらす。
好ましい一実施形態では、Ｍ２分極化因子は、Ｍ２分極化サイトカイン、Ｍ２分極化ケモカイン、およびそれらの混合物からなる群から選択される。好ましくは、Ｍ２分極化因子は、Ｍ２ｃ分極化を誘導する。
さらに好ましくは、Ｍ２分極化因子は、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ１）、インターロイキン３４（ＩＬ３４）、それらの機能的類似体、それらのバイオシミラー、およびそれらの混合物、好ましくは、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ１）、インターロイキン３４（ＩＬ３４）、およびそれらの混合物、さらに好ましくは、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ１）、インターロイキン３４（ＩＬ３４）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、それらの機能的類似体、それらのバイオシミラー、およびそれらの混合物、さらに好ましくは、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ１）、インターロイキン３４（ＩＬ３４）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
インターロイキン４（ＩＬ−４）、好ましくはヒトインターロイキン４（ｈＩＬ−４）は、多面発現性サイトカインである。インターロイキン４は、インターロイキン４受容体のリガンドである。インターロイキン４受容体は、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）にも結合し、このことが、インターロイキン４およびインターロイキン１３の多くの重複する機能に寄与し得る。
インターロイキン４（ＩＬ−４）は、増殖誘導特性を有することも示されている。さらに、インターロイキン４（ＩＬ−４）は、コラーゲンの産生を誘導する。
ヒトインターロイキン４アイソフォーム１前駆体のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＰＩ−受入番号ＮＭ＿０００５８９．３で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０００５８０．１で入手可能であり、図１８ａにおいて示されている。
ヒトインターロイキン４アイソフォーム２前駆体のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿１７２３４８．２で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿７５８８５８．１で入手可能であり、図１８ｂにおいて示されている。
ヒトインターロイキン４のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０５１１２−ｖｅｒｓｉｏｎ １７８でも入手可能である。
そのアミノ酸配列は、インターロイキン４アイソフォーム１およびアイソフォーム２前駆体のアミノ酸１〜２４に及ぶシグナルペプチドを含む。
好ましくは、ヒトインターロイキン４は、配列番号１０〜１４のアミノ酸配列の１つまたは少なくとも１つを含む。
インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、好ましくはヒトインターロイキン１３（ｈＩＬ−１３）は、活性化ＴＨ２細胞によって主に産生される免疫調節サイトカインである。
ヒトインターロイキン１３前駆体のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００２１８８．２で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００２１７９．２、さらには、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ３５２２５−ｖｅｒｓｉｏｎ １５７で入手可能であり、図２０ａにおいて示されている。
インターロイキン１３前駆体は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ３５２２５−ｖｅｒｓｉｏｎ １５７で寄託されているインターロイキン１３前駆体タンパク質のアミノ酸１〜２４に及ぶシグナルペプチドを含む。
好ましくは、インターロイキン１３は、配列番号１７および１８のアミノ酸配列の１つまたは少なくとも１つを含む。
インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、好ましくはヒトインターロイキン１０（ｈＩＬ−１０）は、主に単球によって、かつより少ない規模でリンパ球によって産生されるサイトカインである。インターロイキン１０は、免疫調節および炎症において多面発現性作用を有する。例えば、インターロイキン１０は、ＴＨ１サイトカインの発現をダウンレギュレートする。
ヒトインターロイキン１０前駆体のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿０００５７２．２で見い出され得る。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０００５６３．１、さらには、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ２２３０１−ｖｅｒｓｉｏｎ １５６で見い出され得、かつ図１９ａにおいて示されている。
ヒトインターロイキン１０前駆体のアミノ酸配列は、ヒトインターロイキン１０前駆体タンパク質のアミノ酸１〜１８に及ぶシグナルペプチドを包含する。
好ましくは、インターロイキン１０は、配列番号１５〜１６のアミノ酸配列の１つまたは少なくとも１つを含む。
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）としても公知のコロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）は、マクロファージの産生、分化、および機能を制御するサイトカインである。
選択的スプライシングによって、ヒトＣＳＦ−１は、種々のアイソフォームで存在し、これらを、本発明において使用することができる。
マクロファージコロニー刺激因子１アイソフォームＡ前駆体とも呼ばれるヒトＣＳＦ−１アイソフォーム１のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿０００７５７．５で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０００７４８．３で入手可能であり、図１６ａにおいて示されている。
ヒトマクロファージコロニー刺激因子１アイソフォームＢ前駆体とも呼ばれるヒトＣＳＦ−１アイソフォーム２前駆体のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿１７２２１０．２で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿７５７３４９．１で入手可能であり、図１６ｂにおいて示されている。
マクロファージコロニー刺激因子１アイソフォームＣ前駆体とも呼ばれるヒトＣＳＦ−１アイソフォーム３前駆体のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿１７２２１１．３で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿７５７３５０．１で入手可能であり、図１６ｃにおいて示されている。
個々のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０９６０３−ｖｅｒｓｉｏｎ １５８でも入手可能である。アイソフォーム１は、標準ＵｎｉＰｒｏｔ配列として選択されている。
ヒトＣＳＦ−１前駆体アイソフォーム１〜３の個々のタンパク質配列は、個々のアミノ酸配列のアミノ酸番号１からアミノ酸番号３２に及ぶＮ末端シグナルペプチドを包含する。
ヒトＣＳＦ−１の活性型は、ジスルフィド結合ホモ二量体として細胞外で見い出され得る。活性型は、Ｎ末端シグナルペプチドの喪失をもたらす膜結合前駆体のタンパク質分解切断によって産生される。
好ましくは、コロニー刺激因子１は、配列番号１〜６のアミノ酸配列の１つまたは少なくとも１つを含む。
インターロイキン３４（ＩＬ−３４）は、単球およびマクロファージの分化および生存も促進するサイトカインである。
選択的スプライシングによって、ヒトインターロイキン３４は、２種のアイソフォームで存在し、これらを、本発明において使用することができる。
ヒトインターロイキン３４アイソフォーム１前駆体のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１１７２７７２．１で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１１６６２４３．１で入手可能であり、図１７ａにおいて示されている。
ヒトインターロイキン３４アイソフォーム２前駆体のｍＲＮＡの核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００１１７２７７１．１で入手可能である。対応するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１１６６２４２．１で入手可能であり、図１７ｂにおいて示されている。
個々のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ６ＺＭＪ４−ｖｅｒｓｉｏｎ ８０でも入手可能である。
ヒトインターロイキン３４前駆体は、前駆体タンパク質の対応するアミノ酸配列のアミノ酸１〜２０に及ぶシグナルペプチドを包含する。
好ましくは、インターロイキン３４は、配列番号７〜９のアミノ酸配列の１つまたは少なくとも１つを含む。
好ましい一実施形態では、Ｍ２分極化因子は、コロニー刺激因子−１受容体への結合によって、単球およびマクロファージの分化および生存を促進する。
マクロファージコロニー刺激因子受容体としても公知であるコロニー刺激因子−１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）は、細胞表面受容体として作用するチロシンタンパク質キナーゼであり、マクロファージおよび単球の生存、増殖、および分化の調節で必須の役割を果たす。
ＣＳＦ１Ｒは、例えば、ＣＳＦ１Ｒリガンドの結合に応じて、炎症誘発性ケモカインの放出を促進し、それによって、先天免疫で、かつ炎症プロセスにおいて重要な役割を果たす。
好ましくはＭ２分極化因子は、少なくとも１種のコロニー刺激因子−１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）リガンドである。
ＣＳＦ１Ｒリガンドは、当業者に公知であり、それには、インターロイキン３４（ＩＬ−３４）およびコロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）が包含される。好ましくは、コロニー刺激因子−１受容体リガンドは、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、インターロイキン３４（ＩＬ−３４）、それらの機能的類似体、およびそれらのバイオシミラーからなる群から選択される。
さらに好ましくは、コロニー刺激因子−１受容体リガンドは、ヒトコロニー刺激因子−１受容体リガンドであり、さらに好ましくは、ヒトコロニー刺激因子−１（ｈＣＳＦ−１）、ヒトインターロイキン３４（ｈＩＬ−３４）、それらの機能的類似体、およびそれらのバイオシミラーからなる群から選択される。
さらに好ましい一実施形態では、コロニー刺激因子−１受容体リガンドは、配列番号１〜９のアミノ酸配列の１つまたは少なくとも１つを有するタンパク質である。
好ましい一実施形態では、第１、第２、および／または第３の異種因子は、分泌シグナル配列、好ましくはＮ末端シグナルペプチドまたはプロペプチドと共に発現される。個々の因子の発現の後に、分泌シグナル配列、好ましくはＮ末端シグナルペプチドまたはプロペプチドは、翻訳後修飾によって除去され得る。別法では、第１、第２、および／または第３の異種因子は、成熟型で、好ましくは分泌シグナル配列、好ましくはＮ末端シグナルペプチドまたはプロペプチドを伴わずに発現され得るであろう。
好ましい一実施形態では、請求項１に記載の組換え型プロバイオティクス細菌は、第１の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列、第２の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列、および第３の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むが、ただし、第１の因子、第２の因子、および第３の因子が、相互に機能的に異なり、その際、第１の因子は、増殖因子であり、第２の因子は、Ｍ２分極化因子からなる群から選択され、第３の因子は、Ｍ２分極化因子および増殖因子からなる群から選択されることを条件とする。
好ましい一実施形態では、第２の異種因子および第３の異種因子は、Ｍ２分極化因子からなる群から選択され、第２の因子および第３の因子は、機能的に異なるＭ２分極化因子である。
これは、第２の異種因子が、第１のＭ２分極化因子でり、かつ第３の異種因子が、第１のＭ２分極化因子とは機能的に異なる第２のＭ２分極化因子であることを言っている。
好ましくは、第１のＭ２分極化因子は、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、インターロイキン３４（ＩＬ−３４）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、およびインターロイキン１３（ＩＬ−１３）からなる群から選択されるＭ２分極化因子であり、第２のＭ２分極化因子は、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、インターロイキン３４（ＩＬ−３４）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、およびインターロイキン１３（ＩＬ−１３）からなる群から選択されるＭ２分極化因子であるが、ただし、第２のＭ２分極化因子は、第１のＭ２分極化因子とは機能的に異なることを条件とする。
さらに好ましくは、第１のＭ２分極化因子は、コロニー刺激因子−１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）リガンドであり、かつ第２のＭ２分極化因子は、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、それらの機能的類似体、それらのバイオシミラー、およびそれらの混合物からなる群から選択されるＭ２分極化因子である。
Ｍ２分極化因子のさらに好ましい組合せは、下記である：
・コロニー刺激因子−１およびインターロイキン４、
・コロニー刺激因子−１およびインターロイキン１３、
・コロニー刺激因子−１およびインターロイキン１０、
・インターロイキン３４およびインターロイキン４、
・インターロイキン３４およびインターロイキン１３、
・インターロイキン３４およびインターロイキン１０、
・インターロイキン４およびインターロイキン１０、または
・インターロイキン１３およびインターロイキン１０。
Ｍ２分極化因子の上述のさらに好ましい組合せを、上述の増殖因子の少なくとも１種と、好ましくは、線維芽細胞増殖因子１、線維芽細胞増殖因子２、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子１０、肝細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、および血小板由来増殖因子ＢＢからなる群から選択される増殖因子と、組み合わせる。
好ましくは、第１、第２、および第３の異種因子は、下記の組合せである：
・線維芽細胞増殖因子２、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン４、
・線維芽細胞増殖因子２、インターロイキン３４、およびインターロイキン４、
・線維芽細胞増殖因子２、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン１３、
・線維芽細胞増殖因子２、インターロイキン３４、およびインターロイキン１３、
・線維芽細胞増殖因子２、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン１０、
・線維芽細胞増殖因子２、インターロイキン３４、およびインターロイキン１０、
・線維芽細胞増殖因子７、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン４、
・線維芽細胞増殖因子７、インターロイキン３４、およびインターロイキン４、
・線維芽細胞増殖因子７、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン１３、
・線維芽細胞増殖因子７、インターロイキン３４、およびインターロイキン１３、
・線維芽細胞増殖因子７、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン１０、
・線維芽細胞増殖因子７、インターロイキン３４、およびインターロイキン１０、
・トランスフォーミング増殖因子ベータ、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン４、
・トランスフォーミング増殖因子ベータ、インターロイキン３４、およびインターロイキン４、
・トランスフォーミング増殖因子ベータ、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン１３、
・トランスフォーミング増殖因子ベータ、インターロイキン３４、およびインターロイキン１３
・トランスフォーミング増殖因子ベータ、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン１０、
・トランスフォーミング増殖因子ベータ、インターロイキン３４、およびインターロイキン１０、
・トランスフォーミング増殖因子アルファ、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン４、
・トランスフォーミング増殖因子アルファ、インターロイキン３４、およびインターロイキン４、
・トランスフォーミング増殖因子アルファ、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン１３、
・トランスフォーミング増殖因子アルファ、インターロイキン３４、およびインターロイキン１３
・トランスフォーミング増殖因子アルファ、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン１０、
・トランスフォーミング増殖因子アルファ、インターロイキン３４、およびインターロイキン１０
・血小板由来増殖因子ＢＢ、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン４、
・血小板由来増殖因子ＢＢ、インターロイキン３４、およびインターロイキン４、
・血小板由来増殖因子ＢＢ、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン１３、
・血小板由来増殖因子ＢＢ、インターロイキン３４、およびインターロイキン１３
・血小板由来増殖因子ＢＢ、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン１０、または
・血小板由来増殖因子ＢＢ、インターロイキン３４、およびインターロイキン１０。
さらに好ましくは、第１、第２、および第３の異種因子は、線維芽細胞増殖因子２、コロニー刺激因子−１、およびインターロイキン４、それらの機能的類似体、およびそれらのバイオシミラーの組合せである。
好ましくは、本発明のプロバイオティクス細菌から２種以上のＭ２分極化因子が放出されることによって、非分極化マクロファージ、Ｍ１分極化マクロファージ、さらには未分化単球、および他のマクロファージ前駆細胞のＭ２分極化がさらに促進される。
代替の一実施形態では、第１の因子は、上述の増殖因子からなる群から選択される第１の増殖因子であり、第３の因子は、上述の増殖因子からなる群から選択され、かつ第１の増殖因子とは機能的に異なる第２の増殖因子である。好ましくは、第２の増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）である。
増殖因子のさらに好ましい組み合わせは、下記である：
・線維芽細胞増殖因子１およびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・線維芽細胞増殖因子２およびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・線維芽細胞増殖因子７およびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・線維芽細胞増殖因子１０およびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・血小板由来増殖因子ＢＢおよびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・トランスフォーミング増殖因子アルファおよびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・表皮成長因子およびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子ベータ、
・肝細胞増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子ベータ、または
・血管内皮細胞増殖因子Ａおよびトランスフォーミング増殖因子ベータ。
増殖因子の上述のさらに好ましい組合せを、好ましくは、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、インターロイキン３４（ＩＬ−３４）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、およびそれらの混合物、好ましくは、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、インターロイキン３４（ＩＬ−３４）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、およびそれらの混合物からなる群から選択されるＭ２分極化因子と組み合わせる。
本発明の組換え型プロバイオティクス細菌は、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全の処置において使用され得る。
好ましい一実施形態では、炎症性皮膚機能不全、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全は、炎症性皮膚疾患、好ましくは慢性炎症性皮膚疾患、または炎症性結合組織疾患、好ましくは、慢性炎症性結合組織疾患である。炎症性皮膚疾患は、凍傷、湿疹、乾癬、皮膚炎、潰瘍、創傷、エリテマトーデス、神経皮膚炎、およびそれらの組合せ、好ましくは凍傷、皮膚炎、潰瘍、創傷、およびそれらの組合せ、さらに好ましくは創傷、潰瘍、およびそれらの組合せ、さらに好ましくは潰瘍であり得る。
炎症性、好ましくは慢性炎症性皮膚疾患にはまた、慢性炎症状態に進行することがある炎症性、好ましくは慢性炎症性皮膚外傷が包含され得る。
凍傷は、凍結によって、限局性損傷が皮膚および他の組織に生じていて、組織破壊を伴い得る医学的状態である。凍傷は、寒冷および湿気に対する曝露から生じる皮膚の表在性潰瘍である凍瘡（しもやけ）であってもよい。皮膚内の毛細血管床の損傷は、発赤、掻痒、炎症、および時には水疱をもたらす。さらに好ましくは、凍傷は、凍瘡である。
創傷は、熱傷、化学的創傷、放射線誘導性創傷、虚血性創傷、または機械的創傷であってよい。
潰瘍は、褥瘡性潰瘍または下腿潰瘍であってよい。潰瘍は、静脈性潰瘍、動脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、または圧迫潰瘍であってもよい。
潰瘍は、開放皮膚創傷の何らかの可視徴候を伴わない上述の潰瘍の前潰瘍段階であってもよい。医学的介入がなければ、前潰瘍段階は、潰瘍に進行することがある。
創傷は、急性創傷または慢性創傷、好ましくは慢性創傷であってもよい。
慢性創傷は当業者に公知であり、それには、例えば、慢性静脈性潰瘍、慢性動脈性潰瘍、慢性糖尿病性潰瘍、および慢性圧迫潰瘍が包含される。慢性創傷は、放射線被毒または虚血に起因してもよい。好ましくは慢性創傷は、慢性静脈性潰瘍、慢性動脈性潰瘍、慢性圧迫潰瘍、およびそれらの慢性前潰瘍段階、好ましくは、慢性静脈性潰瘍、慢性動脈性潰瘍、および慢性圧迫潰瘍の少なくとも１つである。
慢性静脈性潰瘍は、通常、肢で起こり得て、慢性創傷の約７０％〜９０％を占め、多くは高齢患者が罹患する。
慢性創傷の別の主な原因は、糖尿病である。糖尿病に罹患している患者は、慢性潰瘍によって、一般の個体群よりも、１５％高い切断のリスクを有する。糖尿病は、侵害受容および疼痛の知覚を阻害する神経障害をもたらす。したがって、患者は、肢および足への小さな創傷に気づくことができず、ゆえに、感染または繰り返しの損傷を防ぐことができない。
さらなる問題は、糖尿病が、免疫低下および小血管の損傷の原因となり、その結果、組織の酸素付加が低減することである。組織の適正な酸素付加が妨げられると、慢性損傷の有病率が著しく上昇する。
褥瘡性潰瘍または床ずれとしても公知である圧迫潰瘍は、糖尿病状態があってもなくても起こり得る。圧迫潰瘍は、圧迫、またはずれもしくは摩擦と組み合わさった圧迫の結果として、骨の隆起部の上で起こり得る皮膚および／またはその下にある組織に対する限局性外傷である。
糖尿病は、割合が拡大していて、世界的な汎流行性状態に近づいている主要な内分泌代謝障害である。下肢潰瘍、例えば、糖尿病性足部潰瘍は、組織再生の根本的な失敗によって持続および増幅され得る、糖尿病と関連する重篤な長期合併症の１つである。
米国、ＥＵ、および日本には、約１３００万人の慢性創傷患者がおり、そのうち約２８０万人が、糖尿病性足部潰瘍などの下肢潰瘍に罹患している。
下肢潰瘍、例えば、糖尿病性足部潰瘍は、処置が困難であり、確定した常用の非侵襲性治療は存在しない。下肢潰瘍は、多くの医学的手当てを必要とし、生活の質のかなりの喪失と関連して、患者を極端に衰弱させる。
下肢潰瘍に罹患している患者のおよそ２４％は、長期身体障害をもたらす切断を必要とすることとなる。
下肢潰瘍に罹患している患者に対する年間医療費は、１０００億アメリカドルの範囲である。さらに、下肢潰瘍に罹患している患者の５年死亡率は約４５％であり、これは、多くの癌の５年死亡率よりも高い。
現在、下肢潰瘍などの糖尿病性創傷を包含する慢性創傷の標準治療管理は、主に、感染の制御および血管再生の促進に焦点が当てられている。これらのストラテジーにも関わらず、切断率は、下肢潰瘍に罹患している患者では、許容しがたいほどに高いままである。
さらに、糖尿病または慢性静脈不全などの、潰瘍の根底にある疾患状態または原因が、それぞれ、例えば、血糖値の制御または血圧薬の投与によって改善および／または処置されている場合、既存の潰瘍は、治癒に非常に長期間かかることがある。
したがって、下肢潰瘍などの糖尿病性創傷を包含する慢性創傷の確定的な非侵襲性処置が存在しないことを克服するために、慢性創傷に罹患している患者において創傷治癒を再活性化および促進するための新たなストラテジーが至急必要とされている。
好ましくは、慢性創傷の場合には、好ましくはプロバイオティクス細菌から放出される因子の独特の組合せは、慢性創傷を、後で創口閉鎖を施される急性創傷へと再プログラミングすることを可能にする。
好ましい一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌は、局所で、および／または皮下注射によって、さらに好ましくは局所で投与されることができる。
組換え型プロバイオティクス細菌は、好ましくは、処置を受ける炎症性、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全部に、局所投与することができる。
組換え型プロバイオティクス細菌は、炎症性、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全に局所で、および／または皮膚機能不全の付近に、好ましくは、炎症性、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全の周縁もしくは空隙部に皮下注射によって投与することができる。
本発明の組換え型プロバイオティクス細菌の適用後に、細菌は、第１および第２の異種因子、好ましくは第１、第２、および第３の異種因子を発現する。
さらに、前潰瘍の部位への、および／またはその中への本発明の組換え型プロバイオティクス細菌の局所適用または皮下注射によって、前潰瘍から開放創傷への進行を回避することができる。
組換え型プロバイオティクス細菌を、好ましくは、プロバイオティクス細菌を、第１の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列および第２の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列および、好ましくは第３の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列で形質転換することによって得る。
本発明の組換え型プロバイオティクス細菌を得るために適したプロバイオティクス細菌は、非病原細菌である。好ましくは、非病原細菌は、非侵襲性細菌である。さらに好ましい一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌は、グラム陽性菌、好ましくはグラム陽性非胞子形成性細菌である。さらに好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ヒト胃腸管内で増殖する能力を欠いた非コロニー形成性細菌である。
さらに好ましい一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌は、グラム陽性食品グレード菌株を含む。
本発明の好ましい一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌は、同じ菌株または異なる菌株の混合物に由来してよい。
別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）と分類される。
別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、欧州食品安全機関（ＥＦＳＡ）によって定義されるとおりの「安全性適格推定」（ＱＰＳステータス）を有する。選択された微生物の評価のために安全性適格推定（ＱＰＳ）アプローチを導入することは、ＥＦＳＡ Ｊｏｕｒｎａｌ、Ｖｏｌ．５８７、２００７、１〜１６頁において記載されている。
さらに好ましい一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、ファーミキューテス門または放線菌門に属する非病原細菌である。好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ビフィドバクテリウム、コリネバクテリウム、エンテロコッカス、ラクトバシラス、ラクトコッカス、リューコノストック、ペジオコッカス、プロピオニバクテリウム、およびストレプトコッカスからなる群から選択される少なくとも１つの属からの非病原細菌である。
別の好ましい実施形態では、プロバイオティクス細菌は、乳酸細菌（ＬＡＢ）である。乳酸細菌は、共通の代謝および生理学的特徴を共有するグラム陽性、耐酸性、一般に非胞子形成性、非呼吸細菌の分岐群である。これらの細菌は、炭水化物形成の主な代謝最終産物として、乳酸を産生する。
乳酸細菌は、以前から公知であり、例えば、食品発酵において使用されている。さらに、タンパク質性のバクテリオシンは、複数種の乳酸細菌株によって産生される。
さらに、乳酸細菌は一般に、食品におけるそれらの広範な出現、およびヒト粘膜表面の健全なミクロフローラに対するそれらの寄与によって、安全（ＧＲＡＳ）ステータスと認識されている。
さらに好ましい一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、病原性および／または日和見細菌を排除する。
別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、ビフィドバクテリウム属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｔｉｎｏｃｏｌｏｎｉｉｆｏｒｍｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｓｃｕｌａｐｉｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｇｕｌａｔｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ａｎｉｍａｌｉｓもしくはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉａｖａｔｉｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｈｅｍｉｃｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｍｂｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈｏｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｏｅｒｉｎｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｕｎｉｃｕｌｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｃｏｌｅｎｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃａｌｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｃｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｏｐｉｎａｔｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｓｈｉｗａｎｏｈｅｎｓｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｌｏｎｇｕｍ、もしくはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｒｙｃｉｃｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｉｍｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｅｎｓｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｕｋａｌａｂｅｎｓｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｇｌｏｂｏｓｕｍもしくはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｕｌｌｏｒｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｅｃｕｌａｒｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｇｕｉｎｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃａｒｄｏｖｉｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｅｌｌｅｎｂｏｓｃｈｅｎｓｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｂｔｉｌｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｐｏｒｃｉｎｕｍもしくはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｓｕｒｕｍｉｅｎｓｅが包含される。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍではない。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ビフィドバクテリウム属種において「安全性適格推定」（ＱＰＳ）ステータスを有する細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍが包含される。
一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、コリネバクテリウム属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓもしくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｌｉｐｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｐｐｅｎｄｉｃｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｑｕａｔｉｍｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｑｕｉｌａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｒｇｅｎｔｏｒａｔｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｔｙｐｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒｉｍｕｃｏｓｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒｉｓｃａｎｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｅｔａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｅｔｉｃｏｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｍｐｏｒｅａｌｅｎｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｐｉｔｏｖｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｅｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｐｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｉｃｏｎｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｎｆｕｓｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｙｌｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｙｓｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｏｓａｎｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｕｒｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｃａｎｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｑｕｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｌｓｅｎｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｓｃｉａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｅｌｉｎｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ、例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｂｅｔａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｏｏｒｔｉｉ、もしくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒａｎｋｅｎｆｏｒｓｔｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｉｂｕｒｇｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｎｅｙｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｏａｇｉｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｌｉｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｒａｎｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｉｋｅｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋｕｔｓｃｈｅｒｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｐｏｐｈｉｌｏｆｌａｖｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｂｒｉｃａｎｔｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｃｇｉｎｌｅｙｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｓｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ、例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ ｓｕｂｓｐ．ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ ｓｕｂｓｐ．ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｍ、もしくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ ｓｕｂｓｐ．ｔｅｓｓｅｌｌａｒｉｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｐａｒｋｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｃｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｙｃｅｔｏｉｄｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｒｕｋｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｏｒｔｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｏｃａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｉｌｂａｒｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｉｌｏｓｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｐｉｎｑｕｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｔｈａｙｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｎａｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｓｉｓｔｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｉｅｇｅｌｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｅｍｉｎａｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｈｅｎｉｓｃｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｈｅｎｉｓｃｏｒｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｕｔｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｉｃｏｒｄｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｎｄｓｖａｌｌｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｒｐｅｎｏｔａｂｉｄｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｍｓｓｅｎｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｉｍｏｎｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｔｅａｒｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｓｃａｎｉｅｎｓｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒｉｂｏｖｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｒｅｉｃｅｌｅｒｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｔｅｒｅｑｕｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔａｅｒｕｍｉｎｉｓ、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓが包含される。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｉｃｏｌａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｉｋｅｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｎｕｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍではない。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、コリネバクテリウム属において「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）と分類される細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｅｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅが包含される。
別の実施形態では、細菌は、エンテロコッカス属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｃｅｄｉｎｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｑｕｉｍａｒｉｎｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｓｉｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｃｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｍｅｌｌｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｎｉｎｔｅｓｔｉｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｎｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｌｕｍｂａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｖｒｉｅｓｅｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｅｓｔｒａｍｍｅｎａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｓｐａｒ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｅｕｒｅｋｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇｉｌｖｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｐｅｒｏｘｉｄｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｒｍａｎｎｉｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｅｍａｎｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｌｏｄｏｒａｔｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｒａｖｉｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｎｄｔｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｏｌｉｖａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｌｌｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｕｌｉｃｏｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｏｒｃｉｎｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｏａｖｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｑｕｅｂｅｃｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒｉｖｏｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｒｏｔａｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓもしくはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｃｃｈａｒｏｍｉｎｉｍｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｒｉｏｌｉｃｉｄａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｌｅｓｉａｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｌｉｔａｒｉｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｅｒｍｉｔｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｉｋｋｉｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｌｌｏｒｕｍ、またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｘｉａｎｇｆａｎｇｅｎｓｉｓが包含される。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、エンテロコッカス属において「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）と分類される細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍが包含される。
別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、ラクトバシラス属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｅｔｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｉｆａｒｉｎａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｉｐｉｓｃｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｇｉｄｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｐｉｎｏｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｐｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｐｏｄｅｍｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｉｚｏｎｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉａｒｉｅｓ、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｒａｆｆｉｎｏｓｕｓもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｖｉａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｖａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｂａｌｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｍｂｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒａｎｔａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｃａｏｎｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｍｅｌｌｉａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｐｉｌｌａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｒｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ａｌａｃｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、もしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｔｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｅｏｈｏｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｍｐｏｓｔｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｃａｖｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｆｕｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｕｓｔｏｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｉｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｕｒｖａｔｕｓもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｅｌｉｂｉｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｙｐｒｉｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｊａｋｏｂｓｅｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、もしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｎｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉａｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｑｕｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｑｕｉｃｕｒｓｏｒｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｑｕｉｇｅｎｅｒｏｓｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｅｃｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｒａｇｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｉｎｔｏｓｈｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌｏｒｉｃｏｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌｏｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｏｒｎｉｃａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｍｅｎｔｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｃｈｕｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｒｆｕｒｉｃｏｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｔｓａｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｔｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｈａｎｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｉｇｅｒｉｏｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｍｍｅｓｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｍｓｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｒｂｉｎｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｙａｋｉｔｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｓｉｎｇｂｏｒｇｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｈｉｏｃｈｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｋｋａｉｄｏｎｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｍｏｈｉｏｃｈｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｄｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｇｌｕｖｉｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｗａｔｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｌｉｘｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｉｍｂｌａｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｉｍｃｈｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｉｍｃｈｉｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｉｍｃｈｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｉｓｏｎｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｉｔａｓａｔｏｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｕｌｌａｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｕｎｋｅｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｔａｒｏｍｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｉｖｅｎｔｒｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｉｎｄｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｉｎｏｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｉｎｕｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｏｓａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｇｅｌｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｍｕｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｎｔｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｓｕｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｅｎｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｏｄｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｄｏｒａｔｉｔｏｆｕｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｅｎｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｌｉｇｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｒｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｔａｋｉｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｚｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｔｈｅｒｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｒｏｌｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｉｓｃｉｃｏｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ｓｕｂｓｐ．ａｒｇｅｎｔｏｒａｔｅｎｓｉｓもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｂｕｚｉｈｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｒｃｉｎａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒａｐｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｎｎｉｎｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｉｍａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｇｏｓａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｅｒｉｍｎｅｒｉ
、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｃａｒｎｏｓｕｓもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｓａｌｉｃｉｎｉｕｓもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｉｖｉｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｔｓｕｍｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌａｎｇｏｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｎｉｏｒｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｎｍａｉｚｕｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｈａｒｐｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｈｅｎｚｈｅｎｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｃｅｒａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｌａｇｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｌｉｇｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｍｉｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｂｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｏｎｇｈｕａｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｉｃｈｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｉｃｏｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｅｂｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｎｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｎｔｏｒｙｅｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｄｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｕｃｃｅｔｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｕｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｕｌｔｕｎｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｕｖａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｃｃｉｎｏｓｔｅｒｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｍｏｌｄｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｉａｎｇｆａｎｇｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｍａｌｉもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｙｏｎｇｉｎｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｙｍａｅが包含される。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ラクトバシラス属種において「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）と分類される細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＮＰ２８、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＮＰ５１、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ株ＮＰ７、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ株ＮＣＩＭＢ３０２４２、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ株Ｓｈｉｒｏｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ株ＤＳＭ１７９３８、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ株ＮＣＩＭＢ３０２４２、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株ＮＣＦＭ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ株ＨＮ００１、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ株ＨＮ００１、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ株ＤＳＭ１７９３８、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ株ＧＧ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｅｔｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｉｆａｒｉｎａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｉｐｉｓｃｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｃａｏｎｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｍｐｏｓｔｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｕｓｔｏｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ ｓｕｂｐｓ．ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｍｅｎｔｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｈａｎｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｍｍｅｓｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｒｂｉｎｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｍｏｈｉｏｃｈｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｒｄｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｄｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｄｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｉｍｃｈｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｉｓｏｎｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｉｌ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｉｎｄｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｏｓａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｇｅｌｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｍｕｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｎｔｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｏｄｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｅｎｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｔａｋｉｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｒｏｌｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｂｕｚｉｈｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒａｐｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ｓｕｂｓｐ ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉ ｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｔｓｕｍｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｎｍａｉｚｕｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｌｉｇｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｉｃｈｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｅｂｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｎｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｕｃｃｅｔｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｃｃｉｎｏｓｔｅｒｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｍｏｌｄｅｎｓｉｓ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓが包含される。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ラクトバシラス属種において「安全性適格推定」（ＱＰＳ）ステータスを有する細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉａｒｉｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｏｓａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅが包含される。
別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、ラクトコッカス属種に由来し、それは、これらだけに限定されないが、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｈｕｎｇａｎｇｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｏｒｍｏｓｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｊｉｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｒｄｎｉａｅ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、もしくはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｔｒｕｃｔａｅ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｉｓｃｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓが包含される。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ラクトコッカス属において「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）と分類される細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓが包含される。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、好ましくはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ ｂｉｏｖａｒｉａｎｔ ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、さらに好ましくはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓである。
別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、リューコノストック属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ａｍｅｌｉｂｉｏｓｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ａｒｇｅｎｔｉｎｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃａｒｎｏｓｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｄｕｒｉｏｎｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｆａｌｌａｘ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｆｉｃｕｌｎｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｆｒｕｃｔｏｓｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇａｓｉｃｏｍｉｔａｔｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ、例えば、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ ｓｕｂｓｐ．ａｅｎｉｇｍａｔｉｃｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｇａｓｉｃｏｍｉｔａｔｕｍ、もしくはＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｇｅｌｉｄｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｈｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｉｎｈａｅ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｋｉｍｃｈｉｉ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｌａｃｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、例えば、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、もしくはＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｉｏｎｉｃｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｉｙｕｋｋｉｍｃｈｉｉ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｏｅｎｉ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐａｒａｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｆｉｃｕｌｎｅｕｍ、またはＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓが包含される。
好ましくは、細菌は、リューコノストック属種において「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）と分類される細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃａｒｎｏｓｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｆａｌｌａｘ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｈｏｌｚａｐｆｅｌｉｉ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｉｎｈａｅ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｋｉｍｃｈｉｉ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｌａｃｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐａｌｍａｅ、またはＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓが包含される。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、リューコノストック属種において「安全性適格推定」（ＱＰＳ）ステータスを有する細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｌａｃｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ、またはＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓが包含される。
別の実施形態では、細菌は、ペジオコッカス属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｒｇｅｎｔｉｎｉｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｌｉｃｏｌａ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｍｎｏｓｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ．Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｅｔｈａｎｏｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｌｏｌｉｉ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｒｖｕｌｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｔｉｌｅｓｉｉ、またはＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｉｎａｅｅｑｕｉが包含される。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ペジオコッカス属種において「安全性適格推定」（ＱＰＳ）ステータスを有する細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ、またはＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓが包含される。
別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、プロピオニバクテリウム属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｉｃｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｎｏｓｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ、例えば、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉもしくはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｙｍｐｈｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｌｉｖａｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、またはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉが包含される。
一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓではない。
さらに好ましくは、プロバイオティクス細菌は、プロピオニバクテリウム属種において「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）と分類される細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．Ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｎｓｅｎｉｉ、またはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉが包含される。
さらに好ましくは、プロバイオティクス細菌は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ、さらに好ましくは、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉまたはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉである。
別の実施形態では、プロバイオティクス細菌は、ストレプトコッカス属種に由来し、それには、これらだけに限定されないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｏｍｉｎｉｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｄｊａｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｂａｌｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｒｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｔｏｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｃｏｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｐｈａｒｙｎｇｅｓ、もしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｖｉｂｏｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｓｔａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｎｉｅｌｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｆｅｃｔｉｖｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｔａｐｒｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｔｉｒｏｕｓｅｔｔｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｔａｓｉｎｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｔｉｓａｎｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｖｒｉｅｓｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｄｅｌｐｈｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ ｓｕｂｓｐ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ ｓｕｂｓｐ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｔｅｒｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．ｒｕｍｉｎａｔｏｒｕｍ、もしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ、もしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｉｃｈｏｅｒｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｎｒｙｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｏｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｃｔａｌｕｒｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｏｌｉもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｉａｃｅｔｉｌａｃｔｉｓ、もしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｏｘｏｄｏｎｔｉｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｔｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｍａｍｍａｌｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｅｒｉｏｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｎｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｒｂｉｌｌｏｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｒｏｃｃｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｌｉｇｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒｉｓａｓｉｎｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒｉｓｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｒｖｕｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｒｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｈｏｃａｅ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｈｏｃａｅ ｓｕｂｓｐ．ｐｈｏｃａｅもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｈｏｃａｅ ｓｕｂｓｐ．ｓａｌｍｏｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｒａｎｉｍａｌｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｒｅｘｔｏｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｏｒｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｏｒｃｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｏｒｃｏｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒｉｆｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｎｅｒｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｐｉｃａｐｒａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓもしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖｉｌｏｘｏｄｏｎｔａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｈｉｌｏｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｏｒａｌｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｉｇｕｒｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｉｎａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｓｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｉｕｓが包含される。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ストレプトコッカス属種において「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）と分類される細菌であり、それには、これらだけに限定されないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｔｈ４、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｒｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが包含される。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、ストレプトコッカス属種において「安全性適格推定」（ＱＰＳ）ステータスを有する細菌であり、それには、これだけに限定されないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが包含される。
好ましい一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、内毒素または他の潜在的な毒性物質を産生しない。それによって、プロバイオティクス細菌は、使用するために安全であり、かつ適用後に対象に有害であることはない。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、胞子を産生しない。細菌胞子は、性周期の一部ではないが、好ましくない条件下で生存するために使用される耐性構造である。プロバイオティクス細菌は、好ましくは胞子を産生しないので、組換え型プロバイオティクス細菌は、例えば、栄養素がないか、または栄養要求因子が喪失していると生存することができない。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、封入体を産生しない。封入体は、多くの場合に、過剰発現されたタンパク質を含有し、封入体内での過剰発現されたタンパク質の凝集は、不可逆的であり得る。
プロバイオティクス細菌は、好ましくは、封入体を産生しないので、個々の核酸配列を転写および翻訳した後の第１、第２、および第３の異種因子の量は、封入体内での細胞内蓄積によって減少しない。
さらに好ましくは、プロバイオティクス細菌は、細胞外プロテイナーゼも産生しない。細胞外プロテイナーゼは、タンパク質などの細胞外構造を破壊して、炭素、窒素、または硫黄などの栄養素を生成するために細菌から分泌され得る。細胞外プロテイナーゼは、外毒素としても作用し、細菌性病原における病原性因子の一例であり得る。
細胞外プロテイナーゼが存在しないことによって、対象に適用した後のプロバイオティクス細菌の安全性は好ましくは上昇する。さらに、プロバイオティクス細菌は、好ましくは、組換え型プロバイオティクス細菌から放出された後の個々の第１、第２、および第３の異種因子を分解しない。
好ましくは、プロバイオティクス細菌は、天然起源のプラスミドをすべて欠いている。天然起源のプラスミドがすべて存在しないことによって、プロバイオティクス細菌は、好ましくは抗生物質耐性を有さない。
さらに好ましくは、プロバイオティクス細菌は、接合転移に必要な宿主因子を欠いている。
天然起源のプラスミドは、接合性プラスミドおよび非接合性プラスミドに広く分類することができる。接合性プラスミドは、異なる細胞間での性接合を促進するトランスファーまたはｔｒａ遺伝子のセットを含有する。接合の複雑なプロセスにおいて、プラスミドは、ｔｒａ遺伝子のいくつかによってコードされる性線毛を介して、一方の細菌から他方へと移入され得る。非接合性プラスミドは、接合を開始することは不可能であり、したがって、それは、接合性プラスミドなどの接合転移に必要とされる宿主因子の補助があって初めて移入され得る。
接合転移に必要な宿主因子が存在しないことによって、プロバイオティクス細菌から他の微生物への、個々の第１、第２、および第３の異種因子をコードする核酸（複数可）の遺伝子転移は、ほとんど起こり得ず、好ましくは遺伝子転移は抑制される。
さらに好ましい一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌は、乳酸細菌、好ましくはラクトバシラスまたはラクトコッカス種である。さらに好ましい一実施形態では、ラクトコッカス種は、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓである。
乳酸細菌はさらに、炭水化物発酵の主たる代謝最終生成物として乳酸を放出する。乳酸は、内皮成長および増殖も刺激することが公知である。さらに、乳酸は、皮膚機能不全の部位での細菌感染の確率を低下させる抗菌効果を有する。
上述のプロバイオティクス細菌を形質転換するための技術は、当業者に公知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）において記載されている。
形質転換の後に、組換え型プロバイオティクス細菌は、第１の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列および第２の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列、および好ましくは第３の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。
一実施形態では、第１の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列および第２の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列、好ましくは、および第３の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列は、組換え型プロバイオティクス細菌の異なる亜集団内に位置する。
例えば、個々の核酸配列は、プロバイオティクス細菌の別々の亜集団内にそれぞれ位置し、それらを組み合わせて、本発明の組換え型プロバイオティクス細菌を得る。
個々の核酸配列を含む個々の個別の亜集団は、例えば、上述のプロバイオティクス細菌の同じ種に、または異なる種に由来してよい。
例えば、異なる異種因子を発現する組換え型プロバイオティクス細菌の異なる種を使用して、プロバイオティクス細菌からの個々の異種因子の発現および、好ましくは放出を適合させることができる。
本発明の好ましい一実施形態では、個々の核酸配列は、様々なコピー数で組換え型プロバイオティクス細菌中に存在する。例えば、組換え型プロバイオティクス細菌は、第１、第２、および／または好ましくは第３の因子をコードする個々の核酸配列の少なくとも１つのコピーを含む。
個々の異種因子の発現を増強するために、個々の核酸配列のコピーの数を増加させることができる。
好ましくは、第１、第２、および／または第３の因子をコードする個々の核酸配列のコピーの比は、１：１：１である。
組換え型プロバイオティクス細菌によって転写される核酸配列の追加のコピーを用意することによって、翻訳効率を増強することができる。
本発明のさらなる一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌の亜集団は、３種の異種因子のうちの２種をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、その際、好ましくは、第３の異種因子は、組換え型プロバイオティクス細菌の第２の亜集団内に位置する核酸配列によってコードされる。
好ましい一実施形態では、３種すべての異種因子をコードする核酸配列が、組換え型プロバイオティクス細菌の１つの集団内に位置する。
さらに好ましい一実施形態では、個々の核酸配列は、組換え型プロバイオティクス細菌の染色体およびプラスミドの少なくとも１つの上に位置する。
組換え型プロバイオティクス細菌の染色体上に、または組換え型プロバイオティクス細菌のプラスミド上に核酸配列を位置させることで、なかんずく、細菌によって翻訳されるタンパク質の量を決定するが、それというのも、プラスミド上での発現レベルは、染色体上での発現レベルと比較して高いためである。
本発明のさらに好ましい一実施形態では、個々の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列を、細菌の染色体上に用意し、かつ別の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列を、組換え型プロバイオティクス細菌のプラスミド上に用意する。
次いで、第３の因子をコードする個々の核酸配列を、組換え型プロバイオティクス細菌の染色体上に、またはプラスミド上に用意してよい。
本発明の代替の一実施形態では、個々の核酸配列を、組換え型プロバイオティクス細菌の染色体の個別の部分上に、または組換え型プロバイオティクス細菌の異なるプラスミド上に用意する。
本発明の特に好ましい一実施形態では、異種因子をコードするすべての核酸配列を、例えば、それぞれ制御されていて、別個のプロモーターに機能的に連結されている単一プラスミド上に用意する。
本発明の別の特に好ましい一実施形態では、個々の異種因子をコードする個々の核酸配列は、単一のプロモーターに動作的に結合していて、かつそれによって制御される単一のオペロン内に位置する。
オペロンは、単一のプロモーターの制御下の一群の遺伝子を含有するＤＮＡの機能性ユニットである。遺伝子は、ｍＲＮＡストランドにおいて一緒に転写され、細胞質において一緒に翻訳されるか、またはトランススプライシングを受けて、別々に翻訳される単シストロン性ｍＲＮＡを作製する。
好ましくは、単一のオペロン内に位置する個々の異種因子をコードする個々の核酸配列に、翻訳開始のためのリボソーム結合部位をコードする核酸配列を用意する。
好ましくは、リボソーム結合部位をコードする核酸配列は、転写されるべき同じストランドの５’領域の方向で開始コドンの上流に位置する。その配列は好ましくは、１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端に相補的である。
好ましくは、単一のオペロン中に位置する個々の異種因子をコードする個々の核酸配列に、分泌シグナル配列をコードする核酸配列を、異種因子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’末端で用意して、分泌シグナル配列および異種因子を含む融合タンパク質を生じさせる。
さらに好ましい一実施形態では、核酸配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、好ましくは誘導性プロモーターによって制御され、かつそれに機能的に連結されている。
例えば、個々の異種因子をコードする核酸配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれか、さらに好ましくは誘導性プロモーターであり得る個別のプロモーターによって制御され、かつそれに機能的に連結されてよい。
構成的プロモーターは、あらゆる状況において細胞内で活性である一方で、誘導性プロモーターは、特異的誘導因子に応じて活性になる。
プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸配列である。プロモーターは、遺伝子の転写開始側近くに、同じストランド上で、かつ転写されるべき同じストランドの５’領域の方向でＤＮＡの上流に位置する。
好ましくは、使用される個々のプロモーターは、個々の核酸配列を発現するプロバイオティクス細菌からの自己プロモーターである。
別法では、個々のプロモーターは、異種プロモーター、好ましくは原核プロモーター、さらに好ましくは細菌からのプロモーターである。
さらに好ましい一実施形態では、少なくとも１つの核酸配列の発現は、誘導性プロモーターによって制御され、その際、少なくとも１つの核酸配列は、少なくとも１種の誘導因子の存在下で、発現可能である。
好ましくは、誘導因子によって誘導可能である誘導性プロモーターは、ランチビオティクスペプチドをコードする少なくとも１つの微生物遺伝子のためのプロモーターである。
ランチビオティクスペプチドは、当業者に公知である。ランチビオティクスは、特徴的な多環式チオエーテルアミノ酸であるランチオニン、さらには、不飽和アミノ酸であるデヒドロアラニンおよび２−アミノイソ酪酸を含有するペプチドの群である。
ランチオニンは、例えば、システインの一硫化物類似体であり、チオエーテル結合によって、そのベータ−炭素原子で架橋されている２個のアラニン残基から構成される。
ランチビオティクスは、グラム陽性菌の多数によって産生される。
好ましい一実施形態では、誘導性プロモーターは、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓからのナイシンプロモーター、ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍからのビシンプロモーター、ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓからのオプチリンプロモーター、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓからのサルバリジンプロモーター、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからのエピデルミンプロモーター、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍからのガリデルミンプロモーター、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓからのミュータシンプロモーター、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのストレプチンプロモーター、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのストレプトコカイナムプロモーター、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓからのラクチシンプロモーター、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからのエピデルミンプロモーター、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからのエピランジンプロモーター、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからのｐｅｐ５プロモーター、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉからのラクトシン−ｓプロモーター、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓもしくはｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのサルバリシンプロモーター、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍからのプランタリジンプロモーター、ストレプトコッカスからのテルモフィリンプロモーター、ストレプトコッカスからのボビシンプロモーター、またはそれらの組合せである。
さらに好ましくは、誘導性プロモーターは、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのＰｎｉｓＡ、ＰｎｉｓＺ、ＰｎｉｓＱ、ＰｎｉｓＦ、ＰｎｉｓＵ、またはそれらの組合せである。
好ましい一実施形態では、誘導因子は、好ましくは、ナイシンＡ、ナイシンＺ、ナイシンＱ、ナイシンＦ、ナイシンＵ、それらの機能的類似体、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種のランチビオティクスペプチドまたはその機能的類似体である。
ナイシン制御される遺伝子発現系は、例えば、ＭｏＢｉＴｅｃ ＧｍｂＨ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から、商品名ＮＩＣＥ（登録商標）で市販されており、これは、ＮＩＺＯ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｅｄｅ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で開発された。
当業者に周知であるナイシンは、広範な宿主スペクトルを有する３４アミノ酸ランチビオティクスペプチドである。例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓからのナイシンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている。
ナイシンは、食品において防腐剤として広く使用されている。最初は、ナイシンは、前駆体としてリボソームで合成される。その後の酵素による修飾の後に、修飾された分子は、細胞膜を通過して透過し、その成熟型にプロセシングされる。
ナイシンは、それ自体の発現を誘導する。目的の遺伝子が、ナイシン系の誘導性プロモーターの後に続いて配置されている場合、目的の核酸配列の発現を、好ましくは０．０１〜５０ｎｇ／培養培地ｍｌ、さらに好ましくは０．１〜５ｎｇ／培養培地ｍｌである阻害以下量のナイシンを添加することによって誘導することができる。
さらに、ＮＩＣＥシステムは、他のグラム陽性菌、例えば、ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｌａｃｔｉｓ、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、またはｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに移入されている。
好ましくは、ＰｎｉｓＡ、ＰｎｉｓＺ、ＰｎｉｓＱ、ＰｎｉｓＦ、ＰｎｉｓＵ、およびそれらの組合せから選択される誘導性ナイシンプロモーターを、第１の異種因子、第２の異種因子、および／または好ましくは第３の異種因子をコードする少なくとも１つの核酸配列と一緒に、使用されるプロバイオティクス細菌の染色体に組み込むことができる。
好ましくは、誘導性プロモーターは、ＰｎｉｓＡである。
別法では、個々のプロモーターを、少なくとも１つの核酸配列と一緒に、プラスミド上に用意し、次いで、これを、プロバイオティクス細菌に形質転換する。
個々の核酸配列は、ナイシンの存在下で発現可能である。
ｐＮＺ８００８、ｐＮＺ８１４８、ｐＮＺ８１４９、およびｐＮＺ８１５０などの適切なプラスミドは、例えば、ＭｏＢｉＴｅｃ ＧｍｂＨ、（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている。
さらに好ましい一実施形態では、遺伝子ＮｉｓＲおよびＮｉｓＫをまた、使用されるプロバイオティクス細菌の染色体またはプラスミド上に用意する。個々のタンパク質ＮｉｓＲおよびＮｉｓＫは、細菌二成分シグナル伝達系のファミリーに属する。ＮｉｓＫは、細胞膜内に定住するヒスチジンプロテインキナーゼであり、好ましくは、成熟ナイシン分子のための受容体として作用する。ＮｉｓＫにナイシンが結合すると、自己リン酸化し、リン酸基を、ＮｉｓＫによってリン酸化されると活性化される応答調節因子であるＮｉｓＲに移入する。
活性化されたＮｉｓＲは、ＰｎｉｓＡプロモーター、ＰｎｉｓＦプロモーター、ＰｎｉｓＺプロモーター、ＰｎｉｓＱプロモーター、および／またはＰｎｉｓＵプロモーターからの転写を誘導する。
ナイシン遺伝子ＮｉｓＲおよびＮｉｓＫの発現の個々の調節因子を、例えば、プロバイオティクス細菌の染色体上に、および／またはプラスミド上に用意することができる。
適切なプラスミドは、市販されており、それには例えば、プラスミドｐＮＺ９５３０（ＭｏＢｉＴｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が包含される。プラスミドｐＮＺ９５３０は、ＮｉｓＲおよびＮｉｓＫ遺伝子を担持し、好ましくは、ラクトコッカス株において、かつ染色体に組み込まれた調節遺伝子を有さない他の乳酸細菌属の株においてクローニングするために使用される。例えば、ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓにおけるナイシン誘導発現では、プラスミドｐＭＳＰ３５３５が、Ｂｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）によって記載されており、これは、例えば、ＡｄｄＧｅｎｅ、非営利プラスミドレポジトリ（プラスミド番号４６８８６）から入手可能である。
プラスミドｐＭＳＰ３５３５の核酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＡＹ３０３２３９．１で入手可能である。
さらに好ましい一実施形態では、ナイシン制御される遺伝子発現のための調節遺伝子のＮｉｓＲおよびＮｉｓＫを含有するプロバイオティクス細菌を使用する。
適切な株は、例えば、ＭｏＢｉＴｅｃ ＧｍｂＨ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている。適切な株は、例えば、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＮＺ９０００、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＮＺ９１００、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＮＺ３９００である。
適切な株はまた、例えば、ＭｏＢｉＴｅｃ ＧｍｂＨから市販されているｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＮＺ３０００である。ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＮＺ３０００は、ＮｉｓＲおよびＮｉｓＫを含まない株である。核酸配列（複数可）の発現が、構成的プロモーターによって制御される場合に、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＮＺ３０００を使用することができる。
さらに好ましい一実施形態では、プロバイオティクス細菌は、食品グレードの株であるｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＮＺ３９００である。ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＮＺ３９００は、抗生物質耐性には基づかないが、ラクトースで増殖する能力に基づくプラスミド選択系を包含する。
ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＮＺ３９００は、内毒素または他の潜在的な毒性物質を産生しない。さらに、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＮＺ３９００は、封入体を産生せず、かつ胞子を産生しない。さらに、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＮＺ３９００は、細胞外プロテイナーゼを産生しない。
さらに好ましい一実施形態では、コードされる異種因子の発現、分泌、および／または安定性を増大させるために、個々の異種因子をコードする核酸配列を修飾する。
適切な修飾は、当業者に公知であり、それには、例えば、少なくとも１つの核酸配列のコドン使用を、使用されるプロバイオティクス細菌に適合させることが包含される。
例えば、少なくとも１つの核酸配列を、使用されるプロバイオティクス細菌のコドン使用パターンにフィットするように設計することができる。さらに、一般的なコドン最適化に加えて、コードされる因子の翻訳をさらに増大させるために、個々のプロバイオティクス細菌の高度に発現されるリボソームタンパク質遺伝子のためのコドン表などの特異的なコドン表を使用することができる。
適切な修飾には、例えば、分泌シグナル配列をコードする核酸配列を、異種因子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’末端に導入して、分泌シグナル配列および異種因子を含む融合タンパク質を生じさせることも包含される。分泌シグナル配列は好ましくは、個々の異種因子のＮ末端側にアレンジされる。
分泌シグナル配列は好ましくは、新たに合成されたタンパク質を形質膜へと向ける。遊離分泌シグナル配列、好ましくはシグナルペプチドまたはプロペプチド、および細胞外に分泌される成熟異種因子を生成するために、分泌シグナル配列、好ましくはシグナルペプチドまたはプロペプチドの末端に、好ましくは、シグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸のストレッチが存在する。
細菌では、細胞膜を通過してタンパク質を分泌するために、２つの主な経路が存在する。Ｓｅｃ経路と呼ばれる一般的な分泌経路は、タンパク質の膜貫通輸送を、その折り畳まれていない構造で触媒するが、すぐにそれは、膜の向こう側で、その天然構造へと折り畳まれる。
Ｔａｔ経路と呼ばれるツインアルギニン透過経路は、分泌タンパク質の透過を、その折り畳まれた状態で触媒する。
適切な分泌シグナル配列は、例えば、シグナルペプチドを包含する。
好ましくは、分泌シグナル配列は、好ましくは個々の因子の前駆体および／またはプレプロタンパク質である核酸配列によってコードされる個々の異種因子の天然のシグナルペプチドまたはプロペプチドである。
さらに好ましい一実施形態では、分泌シグナル配列は、組換え型プロバイオティクス細菌からの相同する分泌配列であり、好ましくは、分泌シグナル配列は、ラクトコッカス種のユビキチン特異的ペプチダーゼ４５（Ｕｓｐ４５）シグナル配列である。Ｕｓｐ４５分泌シグナルは、非常に高い分泌効率を有する。他の分泌シグナルは、当業者に公知であり、それには、例えば、ラクトコッカス種のＳＰ３１０、ＳＰＥＸＰ４、およびＡＬ９が包含される。
例えば、異種因子の天然のシグナルペプチドを、異種因子を発現するために使用されるプロバイオティクス細菌からの相同する分泌シグナル配列によって置き換えることができる。
分泌シグナル配列は好ましくは、個々の異種因子の分泌効率を改善する。例えば、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓでは、大部分のタンパク質は、Ｓｅｃ経路によって分泌される。タンパク質は、タンパク質の成熟部分をＮ末端シグナルペプチドと共に含有する前駆体として合成される。そのシグナルペプチドは、タンパク質を細胞膜へと向ける。シグナルペプチドの切断の後に、成熟タンパク質は、細胞外に放出される。
さらに好ましくは、分泌シグナルは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
さらに好ましい一実施形態では、個々の異種因子は、分泌増強因子を伴って、または伴わずに、プロペプチドとして発現される。プロペプチドは、プロテアーゼによって切断されて、成熟異種因子を放出し得る。
さらに好ましい一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌は、プロバイオティクス細菌の生存に必要な必須タンパク質をコードする少なくとも１つの不活性化遺伝子を含む。
好ましい一実施形態では、プロバイオティクス細菌の生存に必要な必須タンパク質は、プロバイオティクス細菌の生存に必要な有機化合物の合成に必要なタンパク質、さらに好ましくは、酵素である。
必須タンパク質、好ましくは酵素の不活性化の後では、個々の有機化合物は、組換え型プロバイオティクス細菌の生存に必要とされ、かつ組換え型プロバイオティクス細菌の生存を持続させるために補充されるべき栄養素要求因子である。
好ましくは、栄養素要求因子は、ビタミン、アミノ酸、核酸、および／または脂肪酸である。
例えば、アミノ酸およびヌクレオチドは、生物学的に重要な有機化合物であり、これらは、それぞれタンパク質および核酸への前駆体である。
さらに好ましい一実施形態では、プロバイオティクス細菌の生存に必要な少なくとも１つの遺伝子は、アラニンラセマーゼ（ａｌａＲ）、チミジル酸シンターゼ（ｔｈｙＡ）、アスパラギンシンターゼ（ａｓｎＨ）、ＣＴＰシンターゼ（ｐｙｒＧ）、トリプトファンシンターゼ（ｔｒｂＢＡ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
例えば、アラニンラセマーゼは、Ｌ−アラニンからＤ−アラニンへの変換を触媒する酵素である。アラニンラセマーゼによって産生されたＤ−アラニンは、ペプチドグリカン合成のために使用される。ペプチドグリカンは、あらゆる細菌の細胞壁に見られる。
細菌においてアラニンラセマーゼ（ａｌａＲ）遺伝子を不活性化させると、細胞壁の完全性を維持するために、Ｄ−アラニンの外部供給源の使用を細菌が必要とするようになることは、当業者には公知である。
例えば、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓおよびｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍが単一のａｌａＲ遺伝子を含有することは、当業者に公知である。その遺伝子の不活性化は、細胞壁へのＤ−アラニンの導入をもたらす。
例えば、不活性化されたアラニンラセマーゼ（ａｌａＲ）遺伝子を有するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ細菌は、ペプチドグリカンの合成が可能であるために、かつリポテイコ酸（ＬＴＡ）にＤ−アラニンを導入することが可能であるために、Ｄ−アラニンの外部供給に依存している。この細菌は、Ｄ−アラニンが除去されると、例えば、中間指数増殖期に迅速に溶解する。
乳酸細菌のアラニンラセマーゼ欠失株は、例えば、当技術分野で公知の方法によって生成することができるであろう。
チミジル酸シンターゼは、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）からデオキシチミジレート一リン酸（ｄＴＭＰ）への変換を触媒する酵素である。ｄＴＰＭは、チミンを形成する３種のヌクレオチド（ｄＴＭＰ、ｄＴＤＰ、およびｄＴＴＰ）の１つである。チミジンは、ＤＮＡ中の核酸である。
チミジル酸シンターゼがＤＮＡ生合成の初期段階において重要な役割を果たすことは、当業者に公知である。例えば、ＤＮＡ損傷または欠失は、内因性および環境因子の結果として、毎日生じる。
さらに、プロバイオティクス細菌の増殖のために、ＤＮＡを合成することが必要である。
細菌においてチミジル酸シンターゼ（ｔｈｙＡ）遺伝子を不活性化させると、細菌は、ＤＮＡの完全性を維持するために、チミジンの外部供給源を使用することが必要となる。
アスパラギンシンテターゼは、アスパルテートからアミノ酸であるアスパラギンを生成する酵素である。アスパラギンシンテターゼ（ａｓｎＨ）遺伝子を不活性化させると、対応するアミノ酸を合成することができなくなり、それは栄養素要求因子になる。
ＣＴＰ−シンターゼは、ピリミジン合成に関係する酵素である。ＣＴＰシンターゼは、ウリジン−５’−三リン酸（ＵＴＰ）およびシチジン三リン酸（ＣＴＰ）を相互変換する。ＣＴＰ−シンターゼ（ｐｙｒＧ）遺伝子を不活性化させると、細菌は、デノボ合成、さらには、ウリジン細胞壁経路の両方からのシトシンヌクレオチドの合成をすることができなくなる。
ＣＴＰは、ＲＮＡおよびＤＮＡの合成のために補充されなければならない栄養素要求因子になる。
トリプトファンシンターゼは、アミノ酸であるトリプトファンの生合成における最後の２つのステップを触媒する酵素である。
トリプトファンシンターゼ（ｔｒｐＢＡ）遺伝子を不活性化させると、細菌は、対応するアミノ酸を合成することができなくなり、それは、栄養素要求因子となる。
プロバイオティクス細菌の生存に必要な遺伝子を不活性化させるための方法は、当業者に公知であり、それには、遺伝子の欠失、遺伝子の変異、遺伝子のエピジェネティック修飾、遺伝子のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）媒介性遺伝子サイレンシング、遺伝子の翻訳阻害、またはそれらの組合せが包含される。
さらに好ましい一実施形態では、個々の栄養素要求因子を、プロバイオティクス細菌と一緒に用意する。
本発明のさらに好ましい一実施形態では、プロバイオティクス細菌の生存に必要な不活性化遺伝子を、環境保持のために使用する。
プロバイオティクス細菌の生存に必要な少なくとも１つの不活性化遺伝子を含む組換え型プロバイオティクス細菌を適用した後に、個々の栄養素要求因子を外部から、例えば、適用培地または増殖培地に提供すべきである。
組換え型プロバイオティクス細菌が環境に放出される場合、栄養素要求因子は失われていて、好ましくは、組換え型プロバイオティクス細菌は死滅する。
さらに、外部から補充された栄養素要求因子の適用によって、個々の異種因子の生合成および放出の制御が可能となる。
好ましくは、第１の因子、第２の因子、および第３の因子の少なくとも１種が、組換え型プロバイオティクス細菌から放出され得る。さらに好ましくは、第１の因子、第２の因子、および第３の因子の少なくとも１種は、組換え型プロバイオティクス細菌から分泌される。
例えば、乳酸細菌などのグラム陽性菌では、細菌から分泌されるタンパク質は、好ましくは、Ｎ末端シグナルペプチドおよびそのタンパク質の成熟部分を含有する前駆体として合成される。前駆体は、細菌の分泌機構によって認識され、細胞膜を通過して移行される。次いで、シグナルペプチドが切断され、分解され、成熟タンパク質が、細菌から、例えば、培養上清へ、または炎症性皮膚機能不全の領域に分泌される。
例えば、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓは、Ｓｅｃ依存経路によって、低分子質量、例えば、１０ｋＤａ未満から、高分子質量、例えば、１６０ｋＤａ超の分子量の範囲のタンパク質を分泌することができる。
別法では、第１の因子、第２の因子、および第３の因子の少なくとも１種が、漏出性細胞膜を介して、組換え型プロバイオティクス細菌から放出される。
例えば、組換え型プロバイオティクス細菌におけるタンパク質合成のための誘導因子として、ナイシンを使用する場合、ナイシンはまた、細胞膜内に空孔を形成し、その空孔を介して、第１の因子、第２の因子、および第３の因子の少なくとも１種が、プロバイオティクス細菌から放出される。
別法では、組換え型プロバイオティクス細菌の細胞膜は、細胞壁成分の合成の損傷によって、漏出性になる。
例えば、組換え型プロバイオティクス細菌は、不活性化アラニンラセマーゼ（ａｌａＲ）遺伝子を含む。Ｄ−アラニンの非存在下では、組換え型プロバイオティクス細菌は、細胞膜の完全性を維持することができず、後で、第１の因子、第２の因子、および第３の因子の少なくとも１種が、組換え型プロバイオティクス細菌から放出される。
炎症性皮膚機能不全の治癒プロセス中に、放出された第１の異種因子、第２の異種因子、および／または第３の異種因子が、例えば、プロテアーゼ切断によって分解を受け得、これが、異種因子の生物学的活性の喪失をもたらすことがある。
異種因子の分解または減少は、組換え型プロバイオティクス細菌からの異種因子の持続放出によって補償され得る。好ましくは、組換え型プロバイオティクス細菌は、第１の異種因子、第２の異種因子、および第３の異種因子の少なくとも１種を絶えず発現する。好ましくは、組換え型プロバイオティクス細菌は、これらの異種因子を絶えず放出する。
好ましい一実施形態では、プロバイオティクス細菌を、炎症性皮膚機能不全の処置において使用するための医薬組成物中に提供する。
好ましくは、医薬組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される担体または賦形剤を含み、これらはさらに好ましくは、意図されている投与経路に適している。
好ましくは、薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤は、好ましくは、多糖、ポリエステル、ポリメタクリルアミド、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種のポリマー担体を含む。例えば、薬学的に許容される担体は、ヒドロゲルであり、これは、例えば追加的に、創傷治癒を促進するために最適な水分環境を提供する。さらに、薬学的に許容される担体は、適用後に、炎症性皮膚機能不全の部位への組換え型プロバイオティクス細菌の付着を補助する。
好ましくは、医薬組成物はさらに、好ましくは、炭水化物、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、微量元素、およびそれらの混合物からなる群から選択される、組換え型プロバイオティクス細菌のための少なくとも１種の栄養素を含む。
さらに好ましくは、医薬組成物はさらに、第１の因子、第２の因子、および第３の因子の少なくとも１種を安定化させるための少なくとも１種の成分を含む。
その安定化化合物は好ましくは、抗微生物剤、凍結保護物質、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、金属キレート剤、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
さらに好ましい一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌は、溶液であるか、凍結または乾燥、好ましくは凍結乾燥、または噴霧乾燥されている。
好ましくは、組換え型プロバイオティクス細菌は、溶液で、例えば、医薬組成物の形態で適用されるはずである。
代替の一実施形態では、組換え型プロバイオティクス細菌を凍結または乾燥させ、好ましくは、凍結乾燥または噴霧乾燥させる。組換え型プロバイオティクス細菌は、使用前に再構成されてもよいであろう。
適用後に、組換え型プロバイオティクス細菌は、好ましくは、第１の因子、第２の因子、および第３の因子の少なくとも１種の発現を誘導する少なくとも１種の誘導因子と接触するであろう。
さらに好ましくは、発現の誘導後に、第１の因子、第２の因子、および第３の因子の少なくとも１種が、細菌から放出される。
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配列
配列番号１〜３は、シグナルペプチドを包含する、それぞれヒトＣＳＦ−１アイソフォーム１〜３前駆体に対応する。
配列番号４は、成熟ヒトＣＳＦ−１に対応する。
配列番号５は、タンパク質のアミノ酸１〜２７に及ぶＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５分泌シグナル、およびタンパク質のアミノ酸２８〜１８５に及ぶ成熟ヒトＣＳＦ−１を包含する、実施例１において使用されるＣＳＦ−１の合成コンストラクトに対応する。
配列番号６は、ｐＣＳＦ１を発現するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓから分泌された後に生成されるＣＳＦ−１の合成コンストラクトに対応する。
配列番号７および８は、シグナルペプチドを包含する、それぞれヒトＩＬ−３４アイソフォーム１および２前駆体に対応する。
配列番号９は、成熟ヒトＩＬ−３４に対応する。
配列番号１０および１１は、シグナルペプチドを包含する、それぞれヒトＩＬ−４アイソフォーム１および２前駆体に対応する。
配列番号１２は、成熟ヒトＩＬ−４に対応する。
配列番号１３は、タンパク質のアミノ酸１〜２７に及ぶＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５分泌シグナル、およびタンパク質のアミノ酸２８〜１８５に及ぶ成熟ヒトＩＬ−４を包含する、実施例１において使用されるヒトＩＬ−４の合成コンストラクトに対応する。
配列番号１４は、ｐＩＬ４を発現するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓから分泌された後に生成されるＩＬ−４の合成コンストラクトに対応する。
配列番号１５は、シグナルペプチドを包含するヒトＩＬ−１０前駆体に対応する。
配列番号１６は、成熟ヒトＩＬ−１０に対応する。
配列番号１７は、シグナルペプチドを包含するヒトＩＬ−１３前駆体に対応する。
配列番号１８は、成熟ヒトＩＬ−１３に対応する。
配列番号１９は、シグナルペプチドを包含するヒトＴＧＦ−β１前駆体に対応する。
配列番号２０は、成熟ヒトＴＧＦ−β１に対応する。
配列番号２１および２２は、シグナルペプチドを包含する、それぞれヒトＴＧＦ−β２アイソフォーム１および２前駆体に対応する。
配列番号２３は、成熟ヒトＴＧＦ−β２に対応する。
配列番号２４は、シグナルペプチドを包含するヒトＴＧＦ−β３プレプロタンパク質に対応する。
配列番号２５は、成熟ヒトＴＧＦ−β３に対応する。
配列番号２６は、プロペプチドを包含するヒトＦＧＦ−２プレプロタンパク質に対応する。
配列番号２７は、分泌後の成熟ヒトＦＧＦ−２（ｈＦＧＦ２−１５５）に対応する。
配列番号２８は、成熟ヒトＦＧＦ−２の部分配列に対応する。
配列番号２９は、タンパク質のアミノ酸１〜２７に及ぶＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５分泌シグナル、および配列番号２６のアミノ酸１３６〜２８８に対応する成熟ヒトＦＧＦ−２を包含する、実施例１において使用されるヒトＦＧＦ−２の合成コンストラクトに対応する。
配列番号３０は、ｐＦＧＦを発現するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓから分泌された後の、実施例１において使用されるヒトＦＧＦ−２変異体ｈＦＧＦ２−１５３に対応する。
配列番号３１は、ヒトＨＧＦに対応する。
配列番号３２は、ヒトＨＧＦアルファ鎖に対応する。
配列番号３３は、ヒトＨＧＦベータ鎖に対応する。
配列番号３４は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５分泌シグナルに対応する。
配列番号３５は、プラスミドｐＮＺ８１４９の核酸配列に対応する。
配列番号３６〜４３は、実施例において使用されるプライマーに対応する。
配列番号４４は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのナイシンＡプロモーターの核酸配列に対応する。
配列番号４５は、ナイシンＡプロモーター、Ｕｓｐ４５シグナル配列、およびｈＦＧＦ２−１５３遺伝子を含有する合成コンストラクトｓｓＵｓｐ４５−ＦＧＦ２−１５３の核酸配列に対応する。
配列番号４６は、プラスミドｐＦＧＦ２の核酸配列に対応する。
配列番号４７は、ナイシンＡプロモーター、Ｕｓｐ４５シグナル配列、およびｈＩＬ４遺伝子を含有する合成コンストラクトｓｓＵｓｐ４５−ｈＩＬ４の核酸配列に対応する。
配列番号４８は、プラスミドｐＩＬ４の核酸配列に対応する。
配列番号４９は、ナイシンＡプロモーター、Ｕｓｐ４５シグナル配列、およびｈＣＳＦ１遺伝子を含有する合成コンストラクトｓｓＵｓｐ４５−ｈＣＳＦ１の核酸配列に対応する。
配列番号５０は、プラスミドｐＣＳＦ１の核酸配列に対応する。
配列番号５１〜配列番号５３は、実施例において使用される個々のオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）を包含する、個々のリボソーム結合部位を提供する核酸配列に対応する。
配列番号５４は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓの１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の３’末端の核酸配列に対応する。
配列番号５５は、図２４ｂにおいて示されている合成コンストラクトＣＳＦ−ＲＢＳ１−ＦＧＦ−ＲＢＳ２−ＩＬ４の核酸配列に対応する。配列番号５６は、図２４ｃにおいて示されている合成コンストラクトＦＧＦ−ＲＢＳ１−ＩＬ４−ＲＢＳ２−ＣＳＦの核酸配列に対応する。配列番号５７は、図２４ｄにおいて示されている合成コンストラクトＩＬ４−ＲＢＳ１−ＣＳＦ−ＲＢＳ２−ＦＧＦの核酸配列に対応する。
配列番号５８は、ホモサピエンスからの表皮成長因子アイソフォーム１プレプロタンパク質のアミノ酸配列に対応する。配列番号５９は、ホモサピエンスからの表皮成長因子アイソフォーム２プレプロタンパク質のアミノ酸配列に対応する。配列番号６０は、ホモサピエンスからの表皮成長因子アイソフォーム３プレプロタンパク質のアミノ酸配列に対応する。配列番号６１は、ホモサピエンスからの成熟表皮成長因子のアミノ酸配列に対応する。配列番号６２は、ホモサピエンスからのヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子前駆体のアミノ酸配列に対応する。配列番号６３は、ホモサピエンスからの成熟ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子のアミノ酸配列に対応する。
配列番号６４は、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム１プレプロタンパク質のアミノ酸配列に対応する。配列番号６５は、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム２プレプロタンパク質のアミノ酸配列に対応する。配列番号６６は、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム３プレプロタンパク質のアミノ酸配列に対応する。配列番号６７は、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム４プレプロタンパク質のアミノ酸配列に対応する。配列番号６８は、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム５プレプロタンパク質のアミノ酸配列に対応する。配列番号６９は、ホモサピエンスからの成熟トランスフォーミング増殖因子アルファのアミノ酸配列に対応する。
配列番号７０は、ホモサピエンスからのアンフィレグリンプレプロタンパク質のアミノ酸配列に対応する。配列番号７１は、ホモサピエンスからの成熟アンフィレグリンのアミノ酸配列に対応する。
配列番号７２は、ホモサピエンスからのエピレグリンプレプロタンパク質のアミノ酸配列に対応する。配列番号７３は、ホモサピエンスからの成熟エピレグリンのアミノ酸配列に対応する。
配列番号７４は、ホモサピエンスからのエピジェンアイソフォーム１前駆体のアミノ酸配列に対応する。配列番号７５は、ホモサピエンスからのエピジェンアイソフォーム２前駆体のアミノ酸配列に対応する。配列番号７６は、ホモサピエンスからのエピジェンアイソフォーム３前駆体のアミノ酸配列に対応する。配列番号７７は、ホモサピエンスからのエピジェンアイソフォーム４前駆体のアミノ酸配列に対応する。配列番号７８は、ホモサピエンスからのエピジェンアイソフォーム５前駆体のアミノ酸配列に対応する。配列番号７９は、ホモサピエンスからのエピジェンアイソフォーム６前駆体のアミノ酸配列に対応する。配列番号８０は、ホモサピエンスからのエピジェンアイソフォーム７前駆体のアミノ酸配列に対応する。配列番号８１は、ホモサピエンスからの成熟エピジェンのアミノ酸配列に対応する。
配列番号８２は、ホモサピエンスからのベータセルリン前駆体のアミノ酸配列に対応する。配列番号８３は、ホモサピエンスからの成熟ベータセルリンのアミノ酸配列に対応する。
下記の図および実施例は、単に例示を目的として与えられている。本発明は、次の実施例に限定されると解釈されるべきではない：
図１には、ヒトＦＧＦ２基準タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥが示されている。
図２には、発現ベクターｐＮＺ８１４９のプラスミドマップが示されている。「ｌａｃＦ」は、ラクトースでの宿主株ＮＺ３９００の増殖の選択マーカーであり；「Ｐｎｉｓ」は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのナイシンオペロンのナイシンＡプロモーターであり；「Ｔ」は、ターミネーターであり；「ｒｅｐＣ」および「ｒｅｐＡ」は、複製遺伝子である。核酸配列は、配列番号３５においても示されている。
図３には、配列番号４４においても示されているＬ．ｌａｃｔｉｓのナイシンＡプロモーターの核酸配列が示されている。
図４ａ、４ｂ、および４ｃには、それぞれ配列番号２９、配列番号１３、および配列番号５において示されているアミノ酸配列で得られるＳｉｇｎａｌＰ４．１の読出しが示されている。
図５ａ、５ｂ、および５ｃには、実施例１において使用される合成インサート、さらには、対応するアミノ酸配列が示されている。「ＦＧＦ２−１５３」は、ヒトＦＧＦ−２をコードするインサートを示している。「ｈＩＬ４」は、ヒトＩＬ４をコードするインサートを示している。「ｈＣＳＦ１」は、ヒトＣＳＦ１をコードするインサートを示している。「ＰｎｉｓＡ」は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓナイシンオペロンのナイシンＡプロモーターを示している。「ｓｓＵｓｐ４５」は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｕｓｐ４５遺伝子のシグナル配列を示している。アスタリスクは、停止コドンを示している。個々の核酸配列は、配列番号４５、配列番号４７、および配列番号４９においても示されている。
図６ａ、６ｂ、および６ｃには、それぞれｐＦＧＦ２、ｐＩＬ４、およびｐＣＳＦ１を有するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００の潜在的なコロニーのコロニーＰＣＲ分析の結果が示されている。
図７ａ、７ｂ、および７ｃには、プラスミドマップ、さらには、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓにおいてそれぞれｈＦＧＦ２、ｈＩＬ４、およびｈＣＳＦ１を発現および分泌するための、それぞれプラスミドｐＦＧＦ２、ｐＩＬ４、およびｐＣＳＦ１の核酸配列が示されている。「Ｐｎｉｓ」は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのナイシンオペロンのナイシンＡプロモーターであり；「Ｔ」は、ターミネーターであり；「ｒｅｐＣ」および「ｒｅｐＡ」は、複製遺伝子である。プラスミドｐＦＧＦ２、ｐＩＬ４、およびｐＣＳＦ１の核酸配列は、それぞれ配列番号４６、配列番号４８、および配列番号５０において示されている。
図８には、種々の誘導条件下でＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）を発現するラクトコッカスの発酵サンプルのウェスタンブロット分析が示されている。「０．５／５」は、ＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬでの誘導を示しており；「３／５」は、ＯＤ６００＝３でナイシン５ｎｇ／ｍＬでの誘導を示しており、「Ｔ」は、発酵物からサンプルが採取された時点を示している。
図９には、ＮＺ３９００（ｐＩＬ４）を発現するラクトコッカスの発酵サンプルの、クーマシー（Ｃｏｏｍ）染色後の制御発酵操作からの上清（Ｓｕｐ）サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウェスタンブロット（ＷＢ）分析が示されている。０．５／５」は、ＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬでの誘導を示しており；「３／５」は、ＯＤ６００＝３でナイシン５ｎｇ／ｍＬでの誘導を示しており、「Ｔ」は、発酵物からサンプルが採取された時点を示している。
図１０には、ＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１）を発現するラクトコッカスの発酵サンプルの、クーマシー（Ｃｏｏｍ）染色後の制御発酵操作からの上清（Ｓｕｐ）サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が示されている。０．５／５」は、ＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬでの誘導を示しており；「３／５」は、ＯＤ６００＝３でナイシン５ｎｇ／ｍＬでの誘導を示しており、「Ｔ」は、発酵物からサンプルが採取された時点を示している。
図１１には、ＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１）を発現するラクトコッカスの発酵サンプルのウェスタンブロット（ＷＢ）分析が示されている。０．５／５」は、ＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬでの誘導を示しており；「３／５」は、ＯＤ６００＝３でナイシン５ｎｇ／ｍＬでの誘導を示しており、「Ｔ」は、発酵物からサンプルが採取された時点を示している。
図１２には、創傷治癒状況に類似する条件下での誘導実験で、酸性化培養物の増殖が示されている。
図１３には、ｐＨ５またはＯＤ６００＝３での誘導後の上清におけるｈＦＧＦ２産生のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析が示されている。
図１４ａには、実施例４ａにおいて記載されている、ｈＦＧＦ２を発現する組換え型プロバイオティクス細菌または市販品Ｆｉｂｌａｓｔでの７２時間曝露後のヒト線維芽細胞遊走アッセイの結果が示されている。
図１４ｂには、実施例４ａにおいて記載されている、ｈＩＬ４または組換え型ヒトＩＬ４を発現する組換え型プロバイオティクス細菌での７２時間曝露後のヒト線維芽細胞遊走アッセイの結果が示されている。
図１４ｃには、０．４〜８０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有するＡＵＰ−１０培養培地による、およびｒｈＦＧＦ２による、ＮＨＤＦ細胞におけるＥＲＫ１＋２リン酸化の誘導の結果が示されている。
図１４ｄには、０．２〜４０ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ１を含有するＡＵＰ−１４培養培地による、およびｒｈＣＳＦ１による、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞におけるＥＲＫ１＋２リン酸化の誘導の結果が示されている。
図１４ｅには、実施例４ｃにおいて記載されている、ヒトＴＨＰ−１細胞におけるＬＰＳ誘発性ＴＮＦアルファｍＲＮＡ産生の阻害が示されている。
図１４ｆには、実施例４ｄにおいて記載されているとおりの、ＴＨＰ１由来マクロファージにおけるマクロファージマンノース受容体１（Ｍｒｃ１）およびクルッペル様因子４（ＫＬＦ４）のためのＭ２遺伝子のＲＮＡ発現の誘導が示されている。
図１４ｇには、実施例４ｅにおいて記載されているとおりの、ヒトＧｌｉａｌ Ｈｙｂｒｉｄ細胞系ＭＯ３．１３におけるＡＵＰ−１２およびｒｈＩＬ−４のＳＴＡＴ−６転写活性が示されている。
図１４ｈには、実施例４ｅにおいて記載されているとおりの、ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞におけるＡＵＰ−１２およびｒｈＩＬ−４のＳＴＡＴ−６転写活性が示されている。
図１５ａには、実施例５において記載されている、創傷治癒実験の結果が示されている。
図１５ｂには、実施例５において記載されている表示時点後での、対照、陽性対照、およびＡＵＰ−１６処置組織の創傷治癒状態の比較が示されている。
図１５ｃには、実施例５において記載されている、陽性対照（処置群１７）およびＡＵＰ−１６処置組織（処置群１８）の８日目および１２日目の後の残存創傷面積の比較が示されている。
図１６ａには、ホモサピエンスからのマクロファージコロニー刺激因子１アイソフォームａ前駆体のアミノ酸配列が示されている。図１６ｂには、ホモサピエンスからのマクロファージコロニー刺激因子１アイソフォームｂ前駆体のアミノ酸配列が示されている。図１６ｃには、ホモサピエンスからのマクロファージコロニー刺激因子１アイソフォームｃ前駆体のアミノ酸配列が示されている。図１６ｄには、成熟ヒトマクロファージコロニー刺激因子１のアミノ酸配列が示されている。
図１７ａには、ホモサピエンスからのインターロイキン−３４アイソフォーム１前駆体のアミノ酸配列が示されている。図１７ｂには、ホモサピエンスからのインターロイキン−３４アイソフォーム２前駆体のアミノ酸配列が示されている。図１７ｃには、ホモサピエンスからのインターロイキン−３４のアミノ酸配列が示されている。
図１８ａには、ホモサピエンスからのインターロイキン−４アイソフォーム１前駆体のアミノ酸配列が示されている。図１８ｂには、ホモサピエンスからのインターロイキン−４アイソフォーム２前駆体のアミノ酸配列が示されている。図１８ｃには、ホモサピエンスからのインターロイキン−４のアミノ酸配列が示されている。
図１９ａには、ホモサピエンスからのインターロイキン−１０前駆体のアミノ酸配列が示されている。図１９ｂには、ホモサピエンスからのインターロイキン−１０のアミノ酸配列が示されている。
図２０ａには、ホモサピエンスからのインターロイキン−１３前駆体のアミノ酸配列が示されている。図２０ｂには、ホモサピエンスからのインターロイキン−１３のアミノ酸配列が示されている。
図２１ａには、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子ベータ−１前駆体のアミノ酸配列が示されている。図２１ｂには、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子ベータ−１のアミノ酸配列が示されている。図２１ｃには、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子ベータ−２アイソフォーム１前駆体のアミノ酸配列が示されている。図２１ｄには、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子ベータ−２アイソフォーム２前駆体のアミノ酸配列が示されている。図２１ｅには、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子ベータ−２のアミノ酸配列が示されている。図２１ｆには、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子ベータ−３プレプロタンパク質のアミノ酸配列が示されている。図２１ｇには、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子ベータ−３のアミノ酸配列が示されている。
図２２ａには、ホモサピエンスからの線維芽細胞増殖因子２前駆体のアミノ酸配列が示されている。図２２ｂには、ホモサピエンスからの線維芽細胞増殖因子２の断片のアミノ酸配列が示されている。
図２３ａ：ホモサピエンスからの肝細胞増殖因子のアミノ酸配列。図２３ｂ：ホモサピエンスからの肝細胞増殖因子アルファ鎖のアミノ酸配列。図２３ｃ：ホモサピエンスからの肝細胞増殖因子ベータ鎖のアミノ酸配列。
図２４ａには、実施例２ｄにおいて使用される３種のリボソーム結合部位の概観が示されている。実施例２ｄにおいて使用される合成されたＤＮＡ配列ＣＳＦ−ＲＢＳ１−ＦＧＦ−ＲＢＳ２−ＩＬ４、ＦＧＦ−ＲＢＳ１−ＩＬ４−ＲＢＳ２−ＣＳＦ、およびＩＬ４−ＲＢＳ−ＣＳＦ−ＲＢＳ２−ＦＧＦの個々の配列が、それぞれ図２４ｂ〜２４ｄにおいて、さらには、それぞれ配列番号５５、配列番号５６、および配列番号５７において示されている。図２４ｅ〜２４ｇには、実施例２ｄ）において使用される単一オペロンコンストラクトで得られた個々のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、さらには、ウェスタンブロットが示されている。
図２５ａには、ホモサピエンスからの表皮成長因子アイソフォーム１プレプロタンパク質のアミノ酸配列が示されている。図２５ｂには、ホモサピエンスからの表皮成長因子アイソフォーム２プレプロタンパク質のアミノ酸配列が示されている。図２５ｃには、ホモサピエンスからの表皮成長因子アイソフォーム３プレプロタンパク質のアミノ酸配列が示されている。図２５ｄには、ホモサピエンスからの成熟表皮成長因子のアミノ酸配列が示されている。
図２６ａには、ホモサピエンスからのヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子前駆体のアミノ酸配列が示されている。図２６ｂには、ホモサピエンスからの成熟ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子のアミノ酸配列が示されている。
図２７ａには、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム１プレプロタンパク質のアミノ酸配列が示されている。図２７ｂには、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム２プレプロタンパク質のアミノ酸配列が示されている。図２７ｃには、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム３プレプロタンパク質のアミノ酸配列が示されている。図２７ｄには、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム４プレプロタンパク質のアミノ酸配列が示されている。図２７ｅには、ホモサピエンスからのトランスフォーミング増殖因子アルファアイソフォーム５プレプロタンパク質のアミノ酸配列が示されている。図２７ｆには、ホモサピエンスからの成熟トランスフォーミング増殖因子アルファのアミノ酸配列が示されている。
図２８ａには、ホモサピエンスからのアンフィレグリンプレプロタンパク質のアミノ酸配列が示されている。図２８ｂには、ホモサピエンスからの成熟アンフィレグリンのアミノ酸配列が示されている。
図２９ａには、ホモサピエンスからのエピレグリンプレプロタンパク質のアミノ酸配列が示されている。図２９ｂには、ホモサピエンスからの成熟エピレグリンのアミノ酸配列が示されている。
図３０ａには、ホモサピエンスからのヒトエピジェンアイソフォーム１前駆体のアミノ酸配列が示されている。図３０ｂには、ホモサピエンスからのヒトエピジェンアイソフォーム２前駆体のアミノ酸配列が示されている。図３０ｃには、ホモサピエンスからのヒトエピジェンアイソフォーム３前駆体のアミノ酸配列が示されている。図３０ｄには、ホモサピエンスからのヒトエピジェンアイソフォーム４前駆体のアミノ酸配列が示されている。図３０ｅには、ホモサピエンスからのヒトエピジェンアイソフォーム５前駆体のアミノ酸配列が示されている。図３０ｆには、ホモサピエンスからのヒトエピジェンアイソフォーム６前駆体のアミノ酸配列が示されている。図３０ｇには、ホモサピエンスからのヒトエピジェンアイソフォーム７前駆体のアミノ酸配列が示されている。図３０ｈには、ホモサピエンスからの成熟エピジェンのアミノ酸配列が示されている。
図３１ａには、ホモサピエンスからのベータセルリン前駆体のアミノ酸配列が示されている。図３１ｂには、ホモサピエンスからの成熟ベータセルリンのアミノ酸配列が示されている。
図３２ａには、ホモサピエンスからの成熟線維芽細胞増殖因子２のアミノ酸配列が示されている。図３２ｂには、実施例において使用される線維芽細胞増殖因子２変異体ｈＦＧＦ２−１５３のアミノ酸配列が示されている。
図３３には、実施例において使用されるヒトインターロイキン４（ｈＩＬ−４）変異体のアミノ酸配列が示されている。
図３４には、実施例において使用されるヒトコロニー刺激因子１（ｈＣＳＦ−１）変異体のアミノ酸配列が示されている。
図３５には、実施例において使用されるラクトコッカスタンパク質Ｕｓｐ４５の分泌シグナルのアミノ酸配列が示されている。
１．一般実験手順：
別段に述べない限り、実施例を、分析系の製造者のプロトコルに従って実施した。別段に述べない限り、表示の薬品を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ Ｇｍｂｈ（Ｍｕｎｉｃｈ、ＤＥ）、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ＤＥ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）、またはＢｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）から商業的に入手した。
１．１ 増殖培地
種々の目的のために、細胞を異なる培地において増殖させた。一般クローニング手順では、０．５％グルコースまたはラクトースを含有するＭ１７培地（Ｏｘｏｉｄ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、Ｗｅｓｅｌ、ＤＥ）を使用した。
食品グレード選択をモニターするために、Ｅｌｌｉｋｅｒ培地を使用したが、その培地の上では、ラクトコッカスのコロニーは、ラクトースで増殖する場合に、黄色に着色する。黄色の着色は、増殖中のコロニーの周辺にあるインジケーター色素ブロモクレゾールパープルおよびコロニー自体の色を変化させるｐＨ作用である。
Ｅｌｌｉｋｅｒ培地の配合は、次のとおりである：
２０ｇ／Ｌ トリプトン
５ｇ／Ｌ 酵母抽出物
４ｇ／Ｌ ＮａＣｌ
１．５ｇ／Ｌ 酢酸Ｎａ（水非含有）
０．５ｇ／Ｌ Ｌ（＋）アスコルビン酸
１５ｇ／Ｌ 寒天
ｐＨ ６．８
滅菌：１２１℃で１５分間。
滅菌および冷却後に、１％ラクトースを２０％熱滅菌またはフィルター滅菌ストックから、かつ０．００４％ブロモクレゾールパープル（０．４％ストック溶液、フィルター滅菌）を添加した。
発酵および他の機能的増殖実験のために、動物由来成分を含有しないＩＭ１培地を使用した。唯一の残存動物由来成分であるラクトースは、医薬品品質で入手することができる。
ＩＭ１培地の配合は、次のとおりである：
５％ ラクトース一水和物（Ｓｃｈａｒｌａｂ Ｓ．Ｌ．、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、ＥＳ）
１．５％ ダイズペプトン
１％ 酵母抽出物
１ｍＭ ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ
０．１ｍＭ ＭｎＳＯ４×４Ｈ２Ｏ
ｐＨ６．７
滅菌：１１０℃で１５分間
発酵中には、２．５Ｍ ＮａＯＨを使用して自動的にｐＨを調節したので、緩衝液を添加しない。試験管培養物を酸性化するために、２％ベータ−グリセロリン酸Ｎａを培地に添加した。
この緩衝液は、産生された乳酸を中和し、培養がＯＤ６００＝４〜５の細胞密度に達するようにする。
ラクトースおよびベータ−グリセロリン酸Ｎａを含むＩＭ１培地中で増殖させた後に、グリセロールを２０％の最終濃度まで添加することによって、最終コンストラクトＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）、ＮＺ３９００（ｐＩＬ４）、およびＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１）のストックを調製した。ストックは−８０℃で貯蔵した。
１．２ ＮＩＣＥシステムを使用するタンパク質産生の誘導
ナイシンを０．１〜１０ｎｇ／ｍｌのナイシン濃度で使用して、ＮＩＣＥシステムを誘導した。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓからのナイシンは、Ｓｉｇｍａ（製品番号Ｎ５７６４）から入手した。
１．３ 分子クローニング技術
分子クローニングのために、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）において記載されているとおりの標準的な技術を使用した。
ヌクレオチド配列決定、遺伝子合成、およびプライマー合成は、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ、ＮＬ）に外注した。
１．４ 発酵
発酵を０．５Ｌ Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓ ６−発酵槽アレイ（Ｉｎｆｏｒｓ Ｂｅｎｅｌｕｘ、Ｖｅｌｐ、ＮＬ）内で実施した。接種を１％予備培養物で、ＩＭ−１培地中で実施した；スターラー速度は、２００ｒｐｍであり、インキュベーション温度は３０℃とした。操作中に、２．５Ｍ ＮａＯＨを使用してｐＨを制御した。ｐＨ、温度、およびＮａＯＨの添加を連続的にモニターした。
ナイシンでの誘導を、結果のセクションにおいて示されているとおり、種々の増殖サイクル時点で、種々の量のナイシンで実施した。同じく、結果のセクションにおいて示されているとおり、サンプルを採取した。
１．５ Ｃｉｎａｃ発酵
酸性化培養物をモニターするために、Ｃｉｎａｃ ｐＨモニタリングユニット（ＡＭＳ Ｆｒａｎｃｅ、Ｆｒｅｐｉｌｌｉｏｎ、ＦＲ）を使用して、ｐＨ変化を継続的に測定した。均一なｐＨを保証するために、培養物をマグネチックスターラーを用いて２００ｒｐｍで混合した。
１．６ サンプル処置
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングのために、サンプルを処理して、３つの画分を生成した：（ｉ）上清画分、（ｉｉ）全細胞抽出物（無細胞抽出物、細胞壁断片、および他の微粒子状物を含有）、および（ｉｉｉ）無細胞抽出物。
上清画分を、発酵上清１ｍＬをＴＣＡ１５０μＬと混合することによって調製し、４℃で少なくとも１時間にわたってインキュベートした。沈澱物を２０，０００×ｇでの遠心分離によって収集した。痕跡量のＴＣＡを除去するための追加の遠心分離ステップの後に、ペレットをすぐに使用するか、または−２０℃で貯蔵し、これを、５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１５μＬ中に再懸濁させた。
次いで、４倍サンプル緩衝液５μＬ（７５ｍＭ ＤＴＴを含有）を添加し、懸濁液を２０分間にわたって７０℃で加熱した。すべての場合に、２０μＬの体積をゲルにアプライした。
全細胞抽出物は次のとおりに調製した：バッチ培養物のサンプル１０ｍＬまたは発酵培養物１ｍｌのペレットを５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１ｍＬに溶解させ、ジルコニウムビーズ５００ｍｇを備えたビーズビーティングチューブに移し、さらに処理するまで、−２０℃で凍結させた。解凍後に、この懸濁液をＦａｓｔＰｒｅｐ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ ＬＬＰ、Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ、ＵＳＡ）ビーズビーターで、氷上で間欠的に１分間にわたって冷却しながら、４×３０秒にわたって、スピード４で振盪した。ビーズを１分間にわたって沈降させた後に、上清１５μＬをローディングバッファー５μＬと混合し、上述のとおりに処理した。
無細胞抽出物は、全細胞抽出物を１分間にわたって、２０，０００×ｇで遠心分離することによって調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためのさらなる調製は、上記のとおり実施した。
１．７ ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、市販のＮｕＰａｇｅシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ＤＥ）で、製造者のプロトコルに従って実施した。
ヒトＦＧＦ２基準タンパク質は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。５０μｇを５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）２５μｌに溶解させて、２μｇ／μｌの最終濃度を得た。試験操作では、５および１０μｇを、４倍濃縮ローディングバッファーと混合して１倍ローディングバッファー濃度を生じさせた後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにアプライした。
図１において示されているとおり、ゲルは、ｈＦＧＦ２の単量体、少量の二量体、および非常に少量の三量体を示している。レーン１および４＝ＳｅｅＢｌｕｅマーカー；レーン＝２５μｇのＦＧＦ２、およびレーン３＝１０μｇのｈＦＧＦ２。このゲルは、ローディングバッファーおよびゲル緩衝液にＤＴＴを添加せずに泳動させた。
ヒトＩＬ４基準タンパク質を、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）から入手した。ヒトＩＬ４をＰＢＳ（５．８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、４．２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１４５ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解させて、１００μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。基準として、１μｇをレーンごとにクーマシー染色のために、かつ０．１μｇを銀染色およびウェスタンブロットのために適用した。
ヒトＣＳＦ１基準タンパク質を、Ａｂｃａｍ ＰＬＣ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＧＢ）から入手した。ヒトＣＳＦ１を滅菌水に溶解させて、１００μｇ／ｍＬの最終濃度を得た。基準として、１μｇをレーンごとにクーマシー染色のために、かつ０．１μｇを銀染色およびウェスタンブロットのために適用した。
１．８ ウェスタンブロット
タンパク質ブロッティングも、ＮｕＰａｇｅシステム（ＸＣｅｌｌ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ）を使用して、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのプロトコルに従って実施した。ブロッティング膜は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．製の、プレカットされたニトロセルロース膜であった。転写緩衝液は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＮｕＰａｇｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ緩衝液（２０倍）であった。タンパク質の転写を、３５Ｖで１時間にわたって実施した。
ヒトＦＧＦ２の検出のために、精製マウス抗ヒトＦＧＦ２モノクローナル抗体（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＤＥ）を１：２５０の希釈度で使用した。二次抗体は、Ｂｉｏｋｅ Ｂ．Ｖ．（Ｌｅｉｄｅｎ、ＮＬ）から入手した、１：１０，０００の希釈度のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体抗マウスＩｇＧであった。
ヒトＩＬ４の検出のために、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ製のモノクローナルマウス抗ヒトＩＬ４ ＩｇＧ１（クローン＃３００７）を１：５００の希釈度で使用した。二次抗体は、Ｂｉｏｋｅ Ｂ．Ｖ．（Ｌｅｉｄｅｎ、ＮＬ）から入手した、１：１０，０００の希釈度のＨＲＰ結合抗体抗マウスＩｇＧであった。
ヒトＣＳＦ１の検出のために、Ａｂｃａｍ ＰＬＣ製のヒトＭＣＳＦに対するウサギポリクローナル抗体（クローンａｂ９６９３）を１：２，０００の希釈度で使用した。二次抗体は、Ｂｉｏｋｅ Ｂ．Ｖ．（Ｌｅｉｄｅｎ、ＮＬ）から入手した、１：２，０００の希釈度のＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ抗体であった。
ウェスタンブロットを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．から入手したＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質で展開した。
１．９ Ｎ末端アミノ酸配列決定
制御発酵培養物の上清からのｈＦＧＦ２、ｈＩＬ４、およびｈＣＳＦ１のＮ末端アミノ酸配列決定のために、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの２つのレーンのバンドを切り取り、Ｅｕｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、ＮＬ）に送付した。
実施例１：発現プラスミドの作製
１．１ プラスミドｐＮＺ８１４９の配列決定
プラスミドｐＮＺ８１４９を、Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおいてヒト線維芽細胞増殖因子２（ｈＦＧＦ２）、ヒトインターロイキン４（ｈＩＬ４）、およびヒトコロニー刺激因子１（ｈＣＳＦ１）を発現させるためのベクターとして使用した。プラスミドｐＮＺ８１４９を、ラクトースでの増殖に基づく食品グレード機構によって、宿主細胞において選択する。
基準を目的として、プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定した（プライマーについては、表１を参照されたい）。現在入手可能な配列と関連して、相違は見い出されなかった。ｐＮＺ８１４９の配列は、配列番号３５において提供されている。
１．１．１ ヒト線維芽細胞増殖因子２（ｈＦＧＦ−２）
ｈＦＧＦ−２の成熟型は、１５５アミノ酸を含有し、以下では、ｈＦＧＦ２−１５５と呼ばれる。これは、１７．３ｋＤａの分子量および９．８５のｐＩを有する。この分子は、４個のシステイン残基を含有する。
Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおけるクローニングおよび発現のために使用されるｈＦＧＦ−２変異体は、最初の２個のアミノ酸、メチオニンおよびアラニンを欠失しており、したがって、１５３アミノ酸を含有する。したがって、この変異体は、以下では、ｈＦＧＦ２−１５３と呼ばれる。ｈＦＧＦ２−１５３は、１７．１ｋＤａの分子量および９．８５のｐＩを有する。この変異体も、４個のシステイン残基を含有する。
ヒトＦＧＦ２−１５５の対応するアミノ酸配列は、下記、図３２ａ、および配列番号２７において示されている：
下線が付されたアミノ酸は、変異体ｈＦＧＦ２−１５３では欠失している最初の２個のアミノ酸、メチオニンおよびアラニンを示している。変異体ｈＦＧＦ２−１５３のアミノ酸配列は、図３２ｂおよび配列番号３０において示されている。
ＦＧＦ２−１５５の配列は、分泌後の成熟ヒトＦＧＦ２配列である。ｉｎ ｖｉｖｏで、この配列はさらにプロセシングされる。しかしながら、様々な既存の組換え型産物が、Ｎ末端メチオニン残基を有する、または有さないこの１５５アミノ酸配列を使用している。
１．１．２ ヒトインターロイキン４（ｈＩＬ−４）
ｈＩＬ−４の成熟タンパク質は、１２９アミノ酸を含有し、これは、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０００５８０．１で入手可能なアミノ酸配列のアミノ酸２５〜１５３に対応する。その成熟タンパク質は、１４．９６ｋＤａの分子量および９．３６のｐＩを有する。その分子は、６個のシステイン残基を含有する。
成熟ヒトＩＬ−４のアミノ酸配列は、下記、図１８ｃ、および配列番号１２において示されている：
Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおけるクローニングおよび発現のために使用されるｈＩＬ−４変異体は、成熟タンパク質のＮ末端に追加のアラニン残基を含有し、したがって、１３０アミノ酸を含有する。それは、１５．０３ｋＤａの分子量および９．３６のｐＩを有する。この変異体も、６個のシステイン残基を含有する。
クローニングおよび発現のために使用されるヒトｈＩＬ−４変異体の対応するアミノ酸配列は、下記、図３３、および配列番号１４において示されている：
上記のアミノ酸配列において、Ｎ末端の追加のアラニン残基には、下線が付されている。
１．１．３ ヒトコロニー刺激因子１（ｈＣＳＦ１）
発現のために使用されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０００７４８．３で入手可能なヒトＣＳＦ１前駆体の５５４アミノ酸配列に由来する。使用される配列は、成熟ｈＣＳＦ１の第１のアミノ酸であるアミノ酸３３（Ｅ）で始まり、アミノ酸１８１（Ｑ）で終了する。
さらに、天然タンパク質では４８０〜４８８位（ＧＨＥＲＱＳＥＧＳ）を占める追加の９個のアミノ酸が、Ｃ末端に付加されている。シグナルペプチダーゼによるシグナルペプチドの除去を改善するために、追加のアラニン残基が、Ｎ末端に付加された。得られたアミノ酸配列は、下記、図３４、および配列番号６において示されている：
Ｎ末端の追加のアラニン残基には、上記のアミノ酸配列において下線が付されている。Ｃ末端に付加された追加の９個のアミノ酸は、太字で示されている。この配列によってコードされるタンパク質は、１５９アミノ酸を含有し、１８．５ｋＤａの分子量および４．７２のｐＩを有する。そのタンパク質は、７個のシステイン残基を含有する。
１．２ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓにおいてｈＦＧＦ２、ｈＩＬ４、およびｈＣＳＦ１を発現するためのプラスミドの構築
Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおいては、目的は、ｈＦＧＦ２、ｈＩＬ４、およびｈＣＳＦ１を発現させ、かつ例えば、増殖培地の上清へと分泌させることであった。そのために、転写、翻訳およびタンパク質分泌のためのシグナルを使用した。転写および翻訳のためのシグナルは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓのＮＩＣＥ発現システムに存在し、Ｌ．ｌａｃｔｉｓのナイシンＡプロモーターに由来していた。Ｌ．ｌａｃｔｉｓのナイシンＡプロモーターは、図３および配列番号４４に示されており、かつ例えば、ｄｅ Ｒｕｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）において記載されている。
図３はさらに、プロモーターの−１０エレメントおよび−３５エレメント、さらには、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を示している。個々の標的タンパク質のＡＴＧ開始コドンは、配列の３’末端の２個のシステイン残基の直後である。
分泌シグナルは、ラクトコッカスタンパク質Ｕｓｐ４５に由来し、これは、例えば、ｖａｎ Ａｓｓｅｌｄｏｎｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３）およびｖａｎ Ａｓｓｅｌｄｏｎｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０）において記載されている。
ラクトコッカスタンパク質Ｕｓｐ４５の分泌シグナルは、下記、図３５、および配列番号３４において示されている：
ＭＫＫＫＩＩＳＡＩＬ ＭＳＴＶＩＬＳＡＡＡ ＰＬＳＧＶＹＡ
細胞には、タンパク質の分泌後に、このシグナル配列を標的タンパク質から切断除去することを保証する機構が存在する。この反応は、切断部位の周りの位置にある特定のアミノ酸に対して特異的な優先を有するシグナルペプチダーゼによって触媒される。
切断部位を最適化するために、ウェブ上のプログラムＳｉｇｎａｌＰ４．１（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）を使用した。
ｈＦＧＦ２のアミノ酸配列について、このプログラムは、ｈＦＧＦ２−１５５の最初の２個のアミノ酸が除去されて、Ａｌａ残基で始まり、かつ１５３アミノ酸の全長のｈＦＧＦ２−１５５タンパク質（変異体ｈＦＧＦ２−１５３）が残ると、最適な切断が生じることを示した。
プログラムＳｉｇｎａｌＰ４．１で分析するために使用されたｈＦＧＦ２−１５３前駆体タンパク質の対応するアミノ酸配列は、下記および配列番号２９において示されている：
下線が付されたアミノ酸は、ラクトコッカスタンパク質Ｕｓｐ４５の分泌シグナルを示している。
ｈＩＬ４のアミノ酸配列について、このプログラムは、アラニン残基が成熟ＩＬ４タンパク質のＮ末端に付加されて、１３０アミノ酸のタンパク質が生じると、最適な切断が生じることを示した。
プログラムＳｉｇｎａｌＰ４．１で分析するために使用されたｈＩＬ４前駆体タンパク質の対応するアミノ酸配列は、下記および配列番号１３において示されている：
下線が付されたアミノ酸は、ラクトコッカスタンパク質Ｕｓｐ４５の分泌シグナルを示している。
ｈＣＳＦ１のアミノ酸配列について、このプログラムは、アラニン残基が成熟ｈＣＳＦ１タンパク質のＮ末端に付加されて、１５９アミノ酸のタンパク質が生じると、最適な切断が生じることを示した。
プログラムＳｉｇｎａｌＰ４．１で分析するために使用されたｈＣＳＦ１前駆体タンパク質の対応するアミノ酸配列は、下記および配列番号５において示されている：
下線が付されたアミノ酸は、ラクトコッカスタンパク質Ｕｓｐ４５の分泌シグナルを示している。
図４ａは、配列番号２９において示されている、Ｕｓｐ４５タンパク質の分泌シグナルがｈＦＧＦ２−１５３のＮ末端に融合しているアミノ酸配列で得られたＳｉｇｎａｌＰ４．１の読出しを示している。その読出しは、ｈＦＧＦ２−１５３前駆体のアミノ酸２７と２８との間での明確な切断部位およびこの切断部位でのスコアを示している。
図４ｂは、配列番号１３において示されている、Ｕｓｐ４５タンパク質の分泌シグナルがｈＩＬ４のＮ末端に融合しているアミノ酸配列で得られたＳｉｇｎａｌＰ４．１の読出しを示している。その読出しは、ｈＩＬ４前駆体のアミノ酸２７と２８との間での明確な切断部位およびこの切断部位でのスコアを示している。
図４ｃは、配列番号５において示されている、Ｕｓｐ４５タンパク質の分泌シグナルがｈＣＳＦ１のＮ末端に融合しているアミノ酸配列で得られたＳｉｇｎａｌＰ４．１の読出しを示している。その読出しは、ｈＣＳＦ１前駆体のアミノ酸２７と２８との間での明確な切断部位およびこの切断部位でのスコアを示している。
ｈＦＧＦ２−１５３、ｈＩＬ４、およびｈＣＳＦ１をコードする個々の遺伝子でのコドン使用を、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの一般コドン使用に対して適合させた。これは、遺伝子合成の供給業者の常套的な手順である。
さらに、同じＵｓｐ４５シグナル配列を、３種すべてのタンパク質のために使用した。それによって、同じ細菌細胞における３種すべてのタンパク質の発現およびシグナルペプチドの翻訳後プロセシングが改善された。
ｈＦＧＦ２では、ナイシンＡプロモーター、Ｕｓｐ４５シグナル配列、およびｈＦＧＦ２−１５３遺伝子を含有する断片が合成された。人工コンストラクトｓｓＵｓｐ４５−ＦＧＦ２−１５３の核酸配列は、配列番号４５および図５ａにおいて示されている。コドン使用を、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの一般コドン使用に対して最適化した。
図５ａは、合成されたインサート、さらには、転写および翻訳後に得られた対応するアミノ酸配列を示している。ＦＧＦ２−１５３は、ヒトＦＧＦ−２をコードするインサートを示している。ＰｎｉｓＡは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓナイシンオペロンのナイシンＡプロモーターを示している。ｓｓＵｓｐ４５は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｕｓｐ４５遺伝子のシグナル配列を示している。アスタリスクは、停止コドンを示している。さらに、その核酸配列において、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（１〜６位）およびＸｂａＩ（７５１〜７５６位）のための制限認識部位が、下線によって示されている。
ｈＩＬ４では、ナイシンＡプロモーター、Ｕｓｐ４５シグナル配列、およびｈＩＬ４遺伝子を含有する断片が合成された。人工コンストラクトｓｓＵｓｐ４５−ｈＩＬ４の核酸配列は、配列番号４７および図５ｂにおいて示されている。コドン使用を、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの一般コドン使用に対して最適化した。
図５ｂは、合成されたインサート、さらには、転写および翻訳後に得られた対応するアミノ酸配列を示している。ｈＩＬ４は、ヒトＩＬ４をコードするインサートを示している。ＰｎｉｓＡは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓナイシンオペロンのナイシンＡプロモーターを示している。ｓｓＵｓｐ４５は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｕｓｐ４５遺伝子のシグナル配列を示している。アスタリスクは、停止コドンを示している。さらに、その核酸配列において、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（１〜６位）およびＸｂａＩ（６８２〜６８７位）のための制限認識部位が、下線によって示されている。
ｈＣＳＦ１では、ナイシンＡプロモーター、Ｕｓｐ４５シグナル配列、およびｈＣＳＦ１遺伝子を含有する断片が合成された。人工コンストラクトｓｓＵｓｐ４５−ｈＣＳＦ２の核酸配列は、配列番号４９および図５ｃにおいて示されている。コドン使用を、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの一般コドン使用に対して最適化した。
図５ｃは、合成されたインサート、さらには、転写および翻訳後に得られた対応するアミノ酸配列を示している。ｈＣＳＦ１は、ヒトＣＳＦ１をコードするインサートを示している。ＰｎｉｓＡは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓナイシンオペロンのナイシンＡプロモーターを示している。ｓｓＵｓｐ４５は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのｕｓｐ４５遺伝子のシグナル配列を示している。アスタリスクは、停止コドンを示している。さらに、その核酸配列において、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（１〜６位）およびＸｂａＩ（７６９〜７７４位）のための制限認識部位が、下線によって示されている。
完成遺伝子合成産物を、ＢａｓｅＣｌｅａｒから、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉベクターｐＵＣ５７においてクローニングされた断片として得た。
個々の遺伝子合成産物を含むｐＵＣ５７プラスミドを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化することによって、断片をプラスミドｐＮＺ８１４９にクローニングした。個々の遺伝子合成産物を含有するＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ断片を単離し、ＰｓｕＩおよびＸｂａＩ切断プラスミドｐＮＺ８１４９にライゲートして、個々のプラスミドｐＦＧＦ２、ｐＩＬ４、およびｐＣＳＦ１を生じさせた。個々の制限エンドヌクレアーゼは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．から入手した。
個々のライゲーションミックスを、株Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００に形質転換した。プラスミドの検証を、コロニーＰＣＲ分析によって実施した。個々の使用されるプライマーの核酸配列は、下記の表１において示されている。結果は、図６ａ〜６ｃにおいて示されている。
図６ａは、ｐＦＧＦ２を含むＬ．ｌａｃｔｉｓ株ＮＺ３９００の潜在的なコロニーのコロニーＰＣＲ分析の結果を示している。レーン１：ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたラムダＤＮＡ；レーン２：プライマーｎｉｓ２およびｓｅｑｌａｃＦで増幅されたｐＮＺ８１４９（エンプティベクター）（予測断片サイズ３９１ｂｐ）；レーン３および４：プライマーｎｉｓ２およびｓｅｑｌａｃＦで増幅された単離コロニー（予測断片サイズ９０７ｂｐ）。
図６ｂは、ｐＩＬ４を含むＬ．ｌａｃｔｉｓ株ＮＺ３９００の潜在的なコロニーのコロニーＰＣＲ分析の結果を示している。レーン１：ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたラムダＤＮＡ；レーン２：プライマーｎｉｓ２およびｓｅｑｌａｃＦで増幅されたｐＮＺ８１４９（エンプティベクター）（予測断片サイズ３９１ｂｐ）；レーン１１および１２：プライマーｎｉｓ２およびｓｅｑｌａｃＦで増幅された単離コロニー（予測断片サイズ８３８ｂｐ）。
図６ｃは、ｐＣＳＦ１を含むＬ．ｌａｃｔｉｓ株ＮＺ３９００の潜在的なコロニーのコロニーＰＣＲ分析の結果を示している。レーン１：ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたラムダＤＮＡ；レーン２：プライマーｎｉｓ２およびｓｅｑｌａｃＦで増幅されたｐＮＺ８１４９（エンプティベクター）（予測断片サイズ３９１ｂｐ）；レーン３：プライマーｎｉｓ２およびｓｅｑｌａｃＦで増幅された単離コロニー（予測断片サイズ９２５ｂｐ）。
表１：使用されたプライマー
プライマー 配列 配列番号
ｓｅｑｌａｃＦ ５’ＴＧＴＧＡＴＴＣＡＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＧ３’ ３６
ｓｅｑ２Ｆ ５’ＣＧＴＧＧＣＴＴＴＧＣＡＧＣＧＡＡＧＡＴＧ３’ ３７
ｓｅｑ３Ｆ ５’ＧＡＣＴＣＡＡＴＴＣＣＴＡＡＴＧＡＴＴＧＧ３’ ３８
ｓｅｑ４Ｆ ５’ＴＣＡＧＴＧＴＧＧＡＴＡＴＡＧＡＧＣＡＡＧ３’ ３９
ｓｅｑ６Ｒ ５’ＣＴＧＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＴＧＣＣ３’ ４０
ｓｅｑ７Ｒ ５’ＴＴＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧ３’ ４１
ｓｅｑ８Ｒ ５’ＧＴＡＴＣＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＴＧ３’ ４２
ｎｉｓ２ ５’ＣＡＡＴＴＧＡＡＣＧＴＴＴＣＡＡＧＣＣＴＴＧＧ３’４３
図７ａは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓにおいてｈＦＧＦ２を発現および分泌させるためのプラスミドｐＦＧＦ２のプラスミドマップおよび核酸配列を示している。ｌａｃＦは、ラクトースでの宿主株ＮＺ３９００の増殖についての選択マーカーを示し；ＰｎｉｓＡは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのナイシンオペロンのナイシンＡプロモーターを示し；ｓｓＵＳＰ４５は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓのｕｓｐ４５遺伝子のシグナル配列を示す。Ｔは、ターミネーターを示し；ｒｅｐＣおよびｒｅｐＡは、複製遺伝子を示す。プラスミドｐＦＧＦ２の核酸配列は、配列番号４６においても示されている。
図７ｂは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓにおいてｈＩＬ４を発現および分泌させるためのプラスミドｐＩＬ４のプラスミドマップおよび核酸配列を示している。ｌａｃＦは、ラクトースでの宿主株ＮＺ３９００の増殖についての選択マーカーを示し；ＰｎｉｓＡは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのナイシンオペロンのナイシンＡプロモーターを示し；ｓｓＵＳＰ４５は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓのｕｓｐ４５遺伝子のシグナル配列を示す。Ｔは、ターミネーターを示し；ｒｅｐＣおよびｒｅｐＡは、複製遺伝子を示す。プラスミドｐＩＬ４の核酸配列は、配列番号４８においても示されている。
図７ｃは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓにおいてｈＣＳＦ１を発現および分泌させるためのプラスミドｐＣＳＦ１のプラスミドマップおよび核酸配列を示している。ｌａｃＦは、ラクトースでの宿主株ＮＺ３９００の増殖についての選択マーカーを示し；ＰｎｉｓＡは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのナイシンオペロンのナイシンＡプロモーターを示し；ｓｓＵＳＰ４５は、Ｌ．ａｃｔｉｓのｕｓｐ４５遺伝子のシグナル配列を示す。Ｔは、ターミネーターを示し；ｒｅｐＣおよびｒｅｐＡは、複製遺伝子を示す。プラスミドｐＣＳＦ１の核酸配列は、配列番号５０においても示されている。
実施例２：Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓにおける組換え型因子の産生の試験
個々の組換え型因子ｈＦＧＦ２、ｈＩＬ４、またはｈＣＳＦ１がＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓにおいて産生され、かつそこから分泌されるかどうかを試験するために、当初形質転換物の５つのコロニーをさらなる分析のために選択した。これらのコロニーを初めに、平板培養および単一コロニー単離によって精製した。５つのコロニーを個別に、Ｍ１７ラクトース培地に接種し、ＯＤ６００≒０．５まで増殖させ、ナイシン１ｎｇ／ｍｌで誘導した。
ナイシンの添加から２時間後に、培養を終了し、採取した。すべての培養が、ナイシンの添加後に同じ挙動、および一定量の増殖遅滞を示した（データは示さず）。
ａ）制御発酵条件下でのＬ．ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）におけるｈＦＧＦ２の産生
ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）培養物の収穫を立証するために、制御発酵操作を実施した。
次の５つの発酵操作を実施した：
１．ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）を誘導しない
２．ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）をＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導
３．ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）をＯＤ６００＝３でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導
４．ＮＺ３９００（ｐＮＺ８１４９）をＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導
５．ＮＺ３９００（ｐＮＺ８１４９）をＯＤ６００＝３でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導
サンプルを、ｔ＝０（誘導前）、指示量のナイシンで誘導した後のｔ＝２時間、ｔ＝４時間、およびｔ＝６時間目に採取した。
この場合、標的遺伝子が続かないナイシンプロモーターの活性化によって、ナイシン５ｎｇ／ｍＬが、培養物の増殖に対して作用を有するかどうかを立証するために、培養４および５を行った。増殖に対する作用は観察されなかった（データは示さず）。
ウェスタンブロットを、両方の誘導条件のサンプルで実施した。ｈＦＧＦ２の検出を、項目１．８において上記した抗体で行った。
図８は、ウェスタンブロットのレーン３および４において、ナイシンによって誘導されなかったＦＧＦ２の基線発現を示している。
さらに、図８は、ＯＤ６００＝０．５で培養物を誘導した後に、ｈＦＧＦ２産生が、誘導の瞬間から６時間後まで、著しく誘導され、増大することを示している。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのｈＦＧＦ２バンド（ＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導、時点ｔ＝４およびｔ＝６）を単離し、Ｎ末端アミノ酸配列決定のために、Ｅｕｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂ．Ｖ．（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、ＮＬ）に送付した。
サンプルのクリーンアップの後に、暫定的なＮ末端アミノ酸配列を決定した。決定された配列は：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒである。
この配列は、シグナル配列が切断除去された後の予測配列と正確にマッチする。予測配列は：ＡＧＳＩＴＴＬＰＡＬである。このことは、ｈＦＧＦ２が、Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおいて発現され、分泌され、かつ正確にプロセシングされることを意味する。
ＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導されたＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）の培養上清を、次の実施例において使用した。その培養物をＡＵＰ−１０と呼んだ。
ｂ）制御発酵条件下でのＬ．ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＩＬ４）におけるｈＩＬ４の産生
ＮＺ３９００（ｐＩＬ４）培養物の収穫を立証するために、次の発酵操作で制御発酵操作を実施した：
１．ＮＺ３９００（ｐＩＬ４）を誘導しない
２．ＮＺ３９００（ｐＩＬ４）をＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導
３．ＮＺ３９００（ｐＩＬ４）をＯＤ６００＝３でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導
サンプルを、ｔ＝０（誘導前）、指示量のナイシンで誘導した後のｔ＝２時間、ｔ＝４時間、およびｔ＝６時間目に採取した。
ｈＩＬ４の産生を、上清画分および無細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ウエスタンブロッティングと組み合わせて分析した。ｈＩＬ４の検出を、項目１．８において上記した抗体で行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に、ジスルフィド架橋の分離を促進するために、ＤＴＴをサンプル緩衝液および泳動緩衝液に添加した。これらの同じＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、ｈＩＬ４の特異的検出のためのウェスタンブロットを操作するためにも使用した。
ＤＴＴの添加の作用は、クーマシー染色ゲルおよびウェスタンブロットにおいて、ｈＩＬ４が単一のタンパク質バンドを形成することである（図９を参照されたい）。
さらに、ｈＩＬ４基準タンパク質調製物を、担体タンパク質を用いずに使用した。基準タンパク質バンドは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＩＬ４）細胞によって産生されたタンパク質と同じ高さである。
ウェスタンブロットは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＩＬ４）におけるｈＩＬ４の発現についてのさらなる詳細を示している。
培養をＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導したときには、誘導は生じるが、ＯＤ６００＝３でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導したときには、生じない。ｈＩＬ４の産生は、少なくとも６時間まで続く。この期間中に、上清中のＩＬ４濃度が上昇する。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのｈＩＬ４バンド（ＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導、時点ｔ＝４およびｔ＝６）を単離し、Ｎ末端アミノ酸配列決定のために、Ｅｕｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂ．Ｖ．に送付した。
サンプルのクリーンアップの後に、暫定的なＮ末端アミノ酸配列を決定した。決定された配列は：Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓである。
この配列は、シグナル配列が切断除去された後の予測配列と正確にマッチする。予測配列は：ＡＨＫＣＤＩＴＬＱＥである。
このことは、ｈＩＬ４が、Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおいて発現され、分泌され、かつ正確にプロセシングされることを意味する。ＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導されたＮＺ３９００（ｐＩＬ４）の培養上清を、次の実施例において使用した。その培養物をＡＵＰ−１２と呼んだ。
ｃ）制御発酵条件下でのＬ．ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１）におけるｈＣＳＦ１の産生
ＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１）培養物の収穫を立証するために、制御発酵操作を実施した。次の３つの発酵を実施した。
１．ＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１）を誘導しない
２．ＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１）をＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導
３．ＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１）をＯＤ６００＝３でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導
ＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１）培養物をＡＵＰ−１４と呼んだ。
サンプルを、ｔ＝０（誘導前）、指示量のナイシンで誘導した後のｔ＝２時間、ｔ＝４時間、およびｔ＝６時間目に採取した。
ｈＣＳＦ１の産生を、上清画分および無細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ウエスタンブロッティングと組み合わせて分析した。ｈＣＳＦ１の検出を、項目１．８において上記した抗体で行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に、ジスルフィド架橋の分離を促進するために、ＤＴＴをサンプル緩衝液および泳動緩衝液に添加した。これらの同じＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、ｈＣＳＦ１の特異的検出のためのウェスタンブロットを操作するためにも使用した。
ウェスタンブロット（図１１を参照されたい）において、基準タンパク質を含むレーンは、少量の二量体をなお示す。さらに、クーマシー染色されたゲル（図１０を参照されたい）も、基準タンパク質と同じサイズのバンドを示す。
非誘導培養物では、いずれの基線産生もほとんど検出することができない。ＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導された培養物では、ＣＳＦ１産生は、少なくとも６時間まで、経時的に上昇する。少量の分解産物のみが観察され得た。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのｈＣＳＦ１バンド（ＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導、時点ｔ＝４およびｔ＝６）を単離し、Ｎ末端アミノ酸配列決定に掛けた。
サンプルのクリーンアップの後に、暫定的なＮ末端アミノ酸配列を決定した。決定された配列は：Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒである。
この配列は、シグナル配列が切断除去された後の予測配列と正確にマッチする。予測配列は：ＡＥＥＶＳＥＹＣＳＨである。
このことは、ｈＣＳＦ１が、Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおいて発現され、分泌され、かつ正確にプロセシングされることを意味する。
ＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導されたＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１）の培養上清を、次の実施例において使用した。その培養物をＡＵＰ−１４と呼んだ。
ｄ）制御発酵条件下での単一オペロンからのＬ．ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００におけるｈＦＧＦ２、ｈＩＬ４およびｈＣＳＦ１の産生
３つのコンストラクトを、３つの遺伝子（ＦＧＦ２、ＩＬ４、ＣＳＦ１）の６つの順列のうちの３つで作製した：
ａ）ｈＦＧＦ２、ｈＩＬ４、ｈＣＳＦ１、
ｂ）ｈＣＳＦ１、ｈＦＧＦ２、ｈＩＬ４、
ｃ）ｈＩＬ４、ｈＣＳＦ１、ｈＦＧＦ２。
オペロンを設計するために、各遺伝子に、翻訳開始のためのそれ自体のリボソーム結合部位、およびタンパク質分泌のためのそれ自体のシグナルペプチドを用意した。シグナルペプチドに関連して、３つすべての遺伝子のために、同じシグナル配列（ｓｓＵｓｐ４５）を使用することを先行して決定していた。プラスミド上のすぐそばで、大きな同じヌクレオチド領域を回避するために（プラスミド内組換え／欠失の可能性）、同じシグナルペプチドを、Ｌ．ｌａｃｔｉｓのコドン変性およびコドン使用に基づき異なるコドンによってコードした。
３つのコンストラクトの第１の遺伝子のそれぞれについて、ナイシンＡ（ｎｉｓＡ）遺伝子のリボソーム結合部位を使用した。３つのコンストラクトのそれぞれ他の２つの遺伝子について、Ｂｏｌｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）（「Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．Ｖｏｌｕｍｅ １１、７３１〜７５３頁）において記載されているとおり、ＡＴＰシンターゼサブユニットガンマ（ａｔｐＧ）遺伝子およびガラクトシドＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ｌａｃＡ）遺伝子のリボソーム結合部位を、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端との良好なフィットに基づき選択した。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３ゲノムのヌクレオチド配列は、受入番号ＡＥ００５１７６．１で、ＮＣＢＩから入手可能である。
３種すべてのリボソーム結合部位の概観は、図２４ａにおいて提供されている。さらに、個々のオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）を包含する個々のリボソーム結合部位を提供する核酸配列は、配列番号５１〜配列番号５３においても示されている。
Ｌ．ｌａｃｔｉｓの１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端（５’ＧＧＡＵＣＡＣＣＵＣＣＵＵＵＣＵ３’）は、配列番号５４において示されている。図２４ａでは、１６Ｓ ｒＲＮＡは、ウラシル（Ｕ）がチミジン（Ｔ）に置き換えられた１６Ｓ ｒＤＮＡとして示されている。
図２４ａは、シャイン−ダルガノ配列（５’ＡＧＧＡＧＧ３’）の６塩基コンセンサス配列も示している。シャイン−ダルガノ配列は、一般に、開始コドンの約８塩基上流に位置する原核メッセンジャーＲＮＡにおけるリボソーム結合部位である。そのＲＮＡ配列は、リボソームをｍＲＮＡに動員して、リボソームを開始コドンとアラインさせることによって、タンパク質合成の開始を援助する。
ベクターのＰｓｕＩおよびＮｃｏＩ部位を使用して、合成された配列を１ステップでプラスミドｐＮＺ８１４９にクローニングすることができるように（ＢａｍＨＩおよびＰｓｕＩが適合性である）、３つのオペロンを設計した。さらに、ＭｌｕＩ部位を、遺伝子２および３の前のリボソーム結合部位の前に導入した。それによって、中央の遺伝子の欠失、ならびにプラスミドのＮｃｏＩおよびＸｂａＩ部位を使用するＰＣＲによる第３の遺伝子のクローニングによって、残りの３つのオペロンの作製が可能になった。
合成された核酸の個々の配列は、図２４ｂ〜２４ｄにおいて、かつ配列番号５５〜配列番号５７において示されている。３つの遺伝子のコドン使用は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓに適合されている。
３つのコンストラクトからの発現はそれぞれ、単一のナイシンＡプロモーターによって制御され、それに、実施例１で得られたｈＦＧＦ２−１５３前駆体タンパク質、ｈＩＬ４前駆体タンパク質、およびｈＣＳＦ１前駆体タンパク質をコードする上記で示された核酸配列が続く。
完成遺伝子合成産物を、ＢａｓｅＣｌｅａｒから、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉベクターｐＵＣ５７においてクローニングされた断片として得た。
個々の遺伝子合成産物を含有するｐＵＣ５７プラスミドを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化することによって、断片をプラスミドｐＮＺ８１４９にクローニングした。個々の遺伝子合成産物を含有するＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩ断片を単離し、ＰｓｕＩおよびＮｃｏＩ切断プラスミドｐＮＺ８１４９にライゲートして、個々のプラスミドを生じさせた
・ｐＣ−Ｆ−Ｉ（ＣＳＦ−ＲＢＳ１−ＦＧＦ−ＲＢＳ２−ＩＬ４遺伝子合成産物のＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩ断片を含有）、
・ｐＦ−Ｉ−Ｃ（ＦＧＦ−ＲＢＳ１−ＩＬ４−ＲＢＳ２−ＣＳＦ遺伝子合成産物のＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩ断片を含有）、および
・ｐＩ−Ｃ−Ｆ（ＩＬ４−ＲＢＳ−ＣＳＦ−ＲＢＳ２−ＦＧＦ遺伝子合成産物のＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩ断片を含有）。
使用された個々の制限エンドヌクレアーゼは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．から入手した。
個々のコンストラクトを、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００に形質転換した。
３つのコンストラクトの各５つのコロニーを、ｐＨ調節された発酵操作で増殖させ、かつＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍｌで誘導し、４時間後に採取した。
上清１ｍｌをＴＣＡで沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの１つのウェルにアプライした。１つのゲルは、クーマシーブルーで染色し、他は、３種の標的タンパク質のためのウェスタンブロットとしてであった。
個々のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、さらには、ウェスタンブロットを、上記で概説したとおりに処理し、それらは、図２４ｅ〜２４ｇにおいて示されている。
図２４ｅから分かり得るとおり、コンストラクトａ）ｐＦ−Ｉ−Ｃ（ＦＧＦ２、ｈＩＬ４、ｈＣＳＦ１）は、多量のＦＧＦ２、少量のＩＬ４、さらには少量のＣＳＦ１の発現および分泌をもたらした。
図２４ｆから分かり得るとおり、コンストラクトｂ）ｐＣ−Ｆ−Ｉ（ｈＣＳＦ１、ｈＦＧＦ２、ｈＩＬ４）は、多量のＣＳＦ１およびＦＧＦ２、さらには中程度のＩＬ４の発現および分泌をもたらした。
図２４ｇから分かり得るとおり、コンストラクトｃ）ｐＩ−Ｃ−Ｆ（ｈＩＬ４、ｈＣＳＦ１、ｈＦＧＦ２）は、多量のＩＬ４およびやや少ないＣＳＦ１およびＦＧＦ２の発現および分泌をもたらした。クーマシー染色されたゲルは、３種すべてのタンパク質の最高の産生および誘導を示した。
３種の標的タンパク質を、オペロン構造にクローニングし、そこから発現させて、上清への個々のタンパク質ｈＩＬ４、ｈＣＳＦ１、およびｈＦＧＦ２の放出をもたらすことができる。
実施例３：創傷治癒状況に類似する条件下でのＦＧＦ２産物の誘導
創傷における生理学的条件は、試験管または発酵槽における条件とは異なる。
したがって、株ＮＺ３９００が増殖しないか、またはわずかしか増殖しない条件下でのＮＩＣＥシステムの誘導、およびしたがって、ｈＦＧＦ２の産生を試験するための実験を設定した。培養物のｐＨが５．０に達しているとき、および培養物が固定相になっているときに、これらの条件は存在する。
実験を、２００ｍＬボトル内で、撹拌およびｐＨモニタリングしながら実施した。増殖培地として、２％ｗ／ｖのベータ−グリセロリン酸Ｎａおよび０．５％ｗ／ｖのラクトースを含むＩＭ１培地を使用した。次の発酵を実施した：
１．ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）−誘導なし
２．ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）−培養物がｐＨ＝５に達したらナイシン１ｎｇ／ｍＬで誘導
３．ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）−培養物がｐＨ＝５に達したらナイシン０．１ｎｇ／ｍＬで誘導
４．ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）−培養物がＯＤ６００＝３に達したらナイシン１ｎｇ／ｍＬで誘導
５．ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）−培養物がＯＤ６００＝３に達したらナイシン０．１ｎｇ／ｍＬで誘導。
培養物を、誘導から３時間後に採取した。対照培養物を、ｐＨ５．０で誘導された培養物と同時に採取した。結果は、図１１において示されている。
図１２は、増殖およびｐＨ展開が５つすべての培養物で同一であること、およびナイシンでの誘導が、増殖またはｐＨ展開のいずれにも作用を有さないことを示している。
ｈＦＧＦ２の形成を、培養上清１ｍｌにおいて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを使用して測定した。図１３は、細胞が増殖しないか、または増殖の減速相にある条件下では、ナイシンが遺伝子発現を誘導しないことを示している。ＦＧＦ２のバックグラウンド産生（誘導なし）に対して、培養上清物中のＦＧＦ２の量は、ほとんど上昇しないか、または上昇しない。
ウェスタンブロット分析は、ｈＦＧＦ２が、５つすべての培養物の培養上清において検出可能であることを示している。さらに、ｈＦＧＦ２の２種の分解生成物が検出可能である。
これは、細胞において産生されるシグナル配列を有するすべてのＦＧＦ２が、プロセシングおよび分泌されることを意味している。
ヒトＦＧＦ２のための遺伝子を、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのための食品グレードＮＩＣＥ発現ベクターにクローニングしておいた。
ＦＧＦ２遺伝子の発現は、ナイシンの添加によって誘導することができる。ｈＦＧＦ２は、約１００〜２００ｎｇ／ｍＬで上清に分泌される。分泌されたＦＧＦ２のＮ末端アミノ酸配列の決定は、そのタンパク質が正確にプロセシングされていることを示している。
ＦＧＦ２の産生の誘導は、限定的な増殖遅滞をもたらしたが、増殖を停止させることはない。
制御発酵では、ＦＧＦ２産生を、増殖曲線の幅広いウィンドウで誘導している（ＯＤ６００＝０．５〜３の間）。ＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍｌで誘導した後に、最高のＦＧＦ２産生が観察されている。
プラスミドｐＦＧＦ２は、株ＮＺ３９００において少なくとも１００世代にわたって、また、グルコースでの増殖などの非選択的条件下で、安定している。
実施例４ａ：ヒト線維芽細胞遊走アッセイ
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）から放出されたＦＧＦ２およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＩＬ４）から放出されたＩＬ４の、創傷治癒に対する生物学的活性を、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）から人工遊走帯域への遊走を測定することによって評価した。創傷回復の画像分析を使用して、試験化合物の作用を評価した。
実施例２ａからのＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）および実施例２ｂからのＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＩＬ４）を、それぞれ、ＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導した。６時間の発酵の後に、上記のとおり、個々の培養上清を単離し、凍結乾燥させ、−２０℃で貯蔵した。
さらに試験するために、凍結乾燥させた上清からのストック溶液を、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、トリスＨＣｌ（５ｍＭ、ｐＨ７．６）で粉末を再構成することによって調製した。ＡＵＰ−１０ストック溶液を、実施例２ａからのＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）の培養上清から得た。ＡＵＰ−１２ストック溶液を、実施例２ｂからのＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＩＬ４）の培養上清から得た。
ストック溶液を、アッセイ培地ｎ°１で、ＡＵＰ−１０（ＦＧＦ２）ではそれぞれ０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、および５ｎｇ／ｍｌの最終濃度に、ＡＵＰ−１２（ＩＬ４）ではそれぞれ０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、および１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。
ストック溶液、さらには、希釈液での指示濃度は、個々の溶液中に存在し、かつ主に、それぞれ実施例２ａからのＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）および実施例２ｂからのＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＩＬ４）の培養上清へのＦＧＦ２およびＩＬ４の量に対応する、タンパク質の全量に関する。
さらに、Ｋａｋｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｉｎｃ（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）から購入した組換え型ヒトｂＦＧＦ（Ｆｉｂｌａｓｔ）を、アッセイ培地ｎ°１で、それぞれ０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、および５ｎｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。
Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）から購入した組換え型ヒトＩＬ４を、トリスＨＣｌ（５ｍＭ、ｐＨ７．６）で、それぞれ０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、および１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ ＡＧ（Ｂａｓｅｌ、ＣＨ）から入手した。
線維芽細胞を遊走分析専用の９６ウェルマイクロプレートに播種し、２４時間にわたってインキュベートした。
・培養条件：３７℃、５％ＣＯ２。
・培養培地：Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、およびウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０体積％を補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）。
これらのプレートにおいて、ウェルを、コラーゲン溶液でコーティングし、細胞播種をウェルの外環領域に限定して、人工創傷部（遊走帯域）を作るために、細胞播種ストッパーをウェルの中心部に設置した。次いで、細胞を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手したカルセイン−ＡＭを使用して標識した。
カルセイン−ＡＭは、多くの真核細胞において細胞生存性を決定するために使用することができる細胞浸透性色素である。生細胞では、非蛍光カルセインＡＭは、細胞内エステラーゼによるアセトキシメチルエステル加水分解の後に、緑色蛍光カルセインに変換される。
インキュベーションの３０分後に、ストッパーを取り外し、培養培地を、試験化合物（ＦＧＦ２、Ｆｉｂｌａｓｔ、ＩＬ４、または組換え型ｈＩＬ４）を含有するアッセイ培地ｎ°１、またはアッセイ培地ｎ°１のみ（対照）、または基準（１０％のＦＣＳ）に交換した。次いで、細胞を７２時間にわたってインキュベートした。すべての実験条件をｎ＝５で行った。
・アッセイ培地ｎ°１：Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを補充されたＤＭＥＭ。
ＮＩＫＯＮ Ｄｉａｐｈｏｔ ３００顕微鏡（レンズ×４）を使用して、遊走帯域への細胞遊走をインキュベーションの０、２４、４８、および７２時間後に観察し、イメージを、ＮＩＫＯＮ ＤＸ−１２００カメラを使用して撮影した。
創傷回復を可視化および定量化するために、人工創傷部の表面を各時点で測定し、Ｔ０に測定された遊走前面積と比較した。細胞遊走に対する試験化合物の作用を、未処置対照と比較した。
適用された個々の濃度は、ｈＦＧＦ２では０．５ｎｇ／ｍｌ、１．０ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、および５．０ｎｇ／ｍｌ、ｈＩＬ４では０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、および１０ｎｇ／ｍｌであった。７２時間の曝露の後に、線維芽細胞の遊走を、増殖培地（対照）でインキュベートされた線維芽細胞と比較した。
人工創傷部の面積の回復％が、図１４ａおよび１４ｂにおいて示されている。
図１４ａは、ｈＦＧＦ２発現性組換え型プロバイオティクス細菌と共にインキュベートした後の、遊走性維芽細胞の有意な増加を示している。このアッセイの実験条件下で、Ｋａｋｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｉｎｃ（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）から購入した組換え型ヒトｂＦＧＦ（Ｆｉｂｌａｓｔ）は、ＮＨＤＦ遊走および増殖をモジュレートしなかった。
実施例２ａで得られた組換え型プロバイオティクス細菌ＡＵＰ−１０において発現されたｈＦＧＦ２は、生物学的活性を有する。
図１４ｂは、０．１〜１０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ４を含有するＡＵＰ−１２培養培地が、ｒｈＩＬ４と同様に、ＮＨＤＦ増殖を誘導することを示している。
実施例２ｂで得られた組換え型プロバイオティクス細菌ＡＵＰ−１２において発現されたｈＩＬ４は、生物学的活性を有する。
実施例４ｂ：正常ヒト皮膚線維芽細胞およびマウスリンパ芽球におけるＥＲＫ１−およびＥＲＫ２−リン酸化
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）における細胞外シグナル調節キナーゼ１（ＥＲＫ１）および細胞外シグナル調節キナーゼ２（ＥＲＫ２）のリン酸化を測定することによって、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）から放出されるＦＧＦ２の生物学的活性をさらに評価した。
マウスリンパ芽球Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞における細胞外シグナル調節キナーゼ１（ＥＲＫ１）および細胞外シグナル調節キナーゼ２（ＥＲＫ２）のリン酸化を測定することによって、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１）から放出されるＣＳＦ１の生物学的活性を評価した。
実施例４ａにおいて上記したとおりに、ＡＵＰ−１０ストック溶液を調製した。
さらに、実施例２ｃからのＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１）（ＡＵＰ−１４）を、ＯＤ６００＝０．５でナイシン５ｎｇ／ｍＬで誘導した。６時間の発酵の後に、培養上清を単離し、凍結乾燥させ、−２０℃で貯蔵した。さらに試験するために、凍結乾燥させた上清からのストック溶液を、全タンパク質１ｍｇ／ｍｌの濃度で、トリスＨＣｌ（５ｍＭ、ｐＨ７．６）で粉末を再構成することによって調製して、ＡＵＰ−１４ストック溶液を得た。
ストック溶液を、個々の無血清培地で、ＡＵＰ−１０（ＦＧＦ２）ではそれぞれ０．４ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、および８０ｎｇ／ｍｌの最終濃度に、ＡＵＰ−１４（ＣＳＦ１）ではそれぞれ０．２ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、および４０ｎｇ／ｍｌの最終濃度にさらに希釈した。
Ｋａｋｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．からの組換え型ヒトｂＦＧＦを、無血清培地（アッセイ培地ｎ°１）で、それぞれ０．５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。
Ａｂｃａｍ ＰＬＣ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＧＢ）から購入した組換え型ヒトＣＳＦ１を、無血清培地（アッセイ培地ｎ°２）で、それぞれ０．２ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、および４０ｎｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を９６ウェルマイクロプレートに播種し、実施例４ａにおいて上記した条件下で２４時間にわたってインキュベートした。
マウスＭ−ＮＦＳ−６０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１８３８（商標））を、ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＧｍｂＨ（Ｗｅｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。その細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種し、次の条件下で２４時間にわたってインキュベートした：
・培養条件：３７℃。
・培養培地：０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、６２ｎｇ／ｍｌヒト組換え型マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、および１０体積％の最終濃度までのウシ胎児血清を補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）。
・アッセイ培地ｎ°２：０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地。
指数増殖性ＮＨＤＦを、無血清培地（アッセイ培地ｎ°１）中で２４時間にわたってインキュベートし、エッペンドルフ管に移し（０．５×１０５細胞／管）、１５分間にわたって、３７℃で、０．５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ２、または上記で指示されているとおりの最終濃度のＡＵＰ−１０ストック溶液の希釈液を含有する無血清培地（アッセイ培地ｎ°１）中でインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液中に再懸濁させた。
指数増殖性マウスＭ−ＮＦＳ−６０細胞を、無血清培地（アッセイ培地ｎ°２）中で２４時間にわたってインキュベートし、エッペンドルフ管に移し（２×１０６細胞／管）、１μＭの濃度のＫｉ−２０２２７と共に１時間にわたってインキュベートした。Ａｂｃａｍ ＰＬＣから入手したｃ−ｆｍｓ阻害薬Ｋｉ−２０２２７が、ＣＳＦ−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）特異性のための対照として包含された。
Ｋｉ−２０２２７と共に１時間にわたってプレインキュベートした後に、細胞を１５分間にわたって、３７℃で、０．２、２、２０、および４０ｎｇ／ｍｌのｒｈＣＳＦ１、または上記で指示されているとおりの最終濃度のＡＵＰ−１４ストック溶液の希釈液を含有するアッセイ培地ｎ°２中でインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液中に再懸濁させた。
溶解緩衝液の配合は、次のとおりである：０．５体積％Ｓｕｒｆａｃｔ−Ａｍｐｓ ＮＰ−４０（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８．０）、０．３５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０体積％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、０．５μｇ／ｍｌペプスタチン、０．５μｇ／ｍｌアプロニチン、および１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド。
細胞を、１５分間にわたって氷中でそれぞれインキュベートし、細胞タンパク質を遠心分離によって得た。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって決定し、５０μｇのタンパク質をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で沸騰させ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動させた。分離タンパク質を、ニトロセルロース膜（２４Ｖ）に３０分間にわたって移した。ブロットを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および５％脱脂粉乳を含有するトリス緩衝生理食塩水溶液中でブロックし、リン酸化ＥＲＫ１＋２および全ＥＲＫ１＋２の発現を、下記の特異的抗体を使用して決定した。
ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の検出では、ウサギ抗ヒトＥＲＫ１およびＥＲＫ２ポリクローナル抗体（全抗血清、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手、製品番号Ｍ５６７０）を１：１００００の希釈率で使用した。二次抗体は、Ｂｉｏｋｅ Ｂ．Ｖ．（Ｌｅｉｄｅｎ、ＮＬ）から入手した１：１０，０００の希釈率のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体抗ウサギＩｇＧであった。
リン酸化ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の検出では、精製マウス抗ヒトｐ−ＥＲＫ（Ｅ−４）モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、製品番号ｓｃ−７３８３）を１：１０００の希釈率で使用した。ｐ−ＥＲＫ（Ｅ−４）は、ヒト由来のＴｙｒ２０４リン酸化ＥＲＫを含有する配列に対応するマウスモノクローナル抗体エピトープである。そのモノクローナル抗体は、マウス、ラット、およびヒト由来の、Ｔｙｒ２０４でリン酸化したＥＲＫ１および対応するリン酸化ＥＲＫ２を検出する。
二次抗体は、Ｂｉｏｋｅ Ｂ．Ｖ．（Ｌｅｉｄｅｎ、ＮＬ）から入手した１：１０，０００の希釈率のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体抗マウスＩｇＧであった。
ＥＲＫ１＋２リン酸化の誘導を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して定量化した。
図１４ｃから分かり得るとおり、０．４〜８０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有するＡＵＰ−１０培養培地は、ｒｈＦＧＦ２と同様に、ＮＨＤＦにおいてＥＲＫ１＋２リン酸化を誘導する。
図１４ｄから分かり得るとおり、０．２〜４０ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ１を含有するＡＵＰ−１４培養培地は、ｒｈＣＳＦ１と同様に、マウスＭ−ＮＦＳ−６０細胞においてＥＲＫ１＋２リン酸化を誘導する。
実施例４ｃ：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のリポ多糖（ＬＰＳ）誘導Ｍ１−活性化の阻害
ヒトＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−２０２（商標））を、ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＧｍｂＨから入手した。その細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種し、次の条件下で２４時間にわたってインキュベートした：
・培養条件：３７℃、５％ＣＯ２。
・培養培地：０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、および１０体積％の最終濃度までのウシ胎児血清を補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）。
・アッセイ培地ｎ°２：０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地。
ＴＨＰ１は、急性単球性白血病患者に由来するヒト単球性細胞系である。確立されたプロトコルに従って、ＴＨＰ−１細胞をマクロファージ細胞に分化させ、分極化させた。Ｅｓｃｈｅｒｉａ ｃｏｌｉ由来リポ多糖（ＬＰＳ）（抗原型０２６：Ｂ６−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）およびＵ−Ｃｙｔｅｃｈ（Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手したインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を分極化のために使用した。
簡単には、１００万ＴＨＰ１細胞を、６ウェルプレート内で、ＤＭＥＭ培地３ｍＬ＋１００ｎｇ／ｍＬホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）中で２４時間にわたって平板培養して、非分極化マクロファージ（非分極化ＴＨＰ−１由来マクロファージ）への分化を誘導した。
分化の後に、非分極化ＴＨＰ−１由来マクロファージを、ＤＭＥＭ培地中で４８時間にわたって、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）と共に処理し、Ｍ１表現型を誘導して、Ｍ１分極化ＴＨＰ−１由来マクロファージを作製した。
Ｍ１分極化を阻害するために、非分極化ＴＨＰ−１マクロファージを初めに、実施例４ａにおいて得たＡＵＰ−１２ストック溶液の希釈液と共に、または組換え型ヒトＩＬ４（ｒｈＩＬ４）のストック溶液の希釈液と共に、１８時間にわたってインキュベートし、次いで、上記のとおり、ＬＰＳおよびＩＦＮ−γで、さらに４８時間にわたって刺激した。
１ｍｇ／ｍｌの全タンパク質濃度を有するＡＵＰ−１２ストック溶液を、ＤＭＥＭ培地で、０．１％、１％、１０％、および２０体積％の濃度に希釈した。ｒｈＩＬ４のストック溶液を、ＤＭＥＭ培地で、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、および２０ｎｇ／ｍｌ（体積）の濃度に希釈した。
細胞を収集し、全ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して抽出した。全ＲＮＡ（１μｇ）を、ｉＳｃｒｉｐｔＴＭ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してレトロ転写し、生成されたｃＤＮＡを、ｉＱＴＭ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してリアルタイムＰＣＲによって分析した。リアルタイムＰＣＲは、ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して行った。ＨＰＲＴ遺伝子を使用して、各サンプル中のｍＲＮＡ発現を基準化し、遺伝子発現を、２−ΔΔＣｔ法を使用して定量化した。Ｍ１分極化のためのマーカーは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）ｍＲＮＡの産生とした。
図１４ｅは、ヒトＴＨＰ−１細胞におけるＬＰＳ誘導ＴＮＦアルファｍＲＮＡ産生の阻害を示している。
図１４ｅから分かり得るとおり、ＡＵＰ−１２培養培地は、ｒｈＩＬ４と同様に、ヒトＴＨＰ−１細胞におけるＬＰＳ誘導ＴＮＦアルファｍＲＮＡ産生を阻害する。ｒｈＩＬ４の有効な用量は、１〜２０ｎｇ／ｍｌの間である。
図１４ｅにおける＊は、ＬＰＳのみと比較した場合のｐ値Ｐ＜０．０５を意味する。エラーバーは、標準偏差を表す。
実施例４ｄ：Ｔｈｐ１由来マクロファージにおけるＭ２分極化の誘導
Ｍ２分極化を誘導するために、実施例４ｃにおいて得た非分極化ＴＨＰ−１由来マクロファージを、実施例４ａで得たＡＵＰ−１２ストック溶液の希釈液と共に、または２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度を有する組換え型ヒトＩＬ４（ｒｈＩＬ４）のストック溶液の希釈液と共に、１８時間にわたってインキュベートした。
１ｍｇ／ｍｌの全タンパク質濃度を有するＡＵＰ−１２ストック溶液を、ＤＭＥＭ培地で、０．１％および１体積％の濃度に希釈した。
細胞を、上記のとおりに分析した。分極化の後に、細胞を収集し、全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡをレトロ転写し、生成されたｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲによって分析した。リアルタイムＰＣＲは、ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して行った。ＨＰＲＴ遺伝子を使用して、各サンプル中のｍＲＮＡ発現を基準化し、遺伝子発現を、２−ΔΔＣｔ法を使用して定量化した。Ｍ２分極化のためのマーカーは、マクロファージマンノース受容体１（Ｍｒｃ１）およびクルッペル様因子４（ＫＬＦ４）とした。
図１４ｆは、ＴＨＰ１由来マクロファージにおけるマクロファージマンノース受容体１（Ｍｒｃ１）およびクルッペル様因子４（ＫＬＦ４）についてのＭ２遺伝子のＲＮＡ発現の誘導を示している。
図１４ｆから分かり得るとおり、ＡＵＰ−１２培養培地は、ｒｈＩＬ４と同様に、ＴＨＰ１由来マクロファージにおいて、マクロファージマンノース受容体１（Ｍｒｃ１）およびクルッペル様因子４（ＫＬＦ４）についてのＭ２遺伝子のＲＮＡ発現を誘導する。ｒｈＩＬ４の有効な用量は、２〜２０ｎｇ／ｍｌの間である。
図１４ｆにおける＊は、Ｍ０（Ｍ０＝ＰＭＡ誘導ＴＨＰ１）およびＭｎ＝非誘導ＴＨＰ１と比較した場合のｐ値Ｐ＜０．０５を意味する。図１４ｆにおける＊＊は、Ｍｎ＝非誘導ＴＨＰ１と比較した場合のｐ値Ｐ＜０．０５を意味する。エラーバーは、標準偏差を表す。
実施例４ｅ：様々な細胞系におけるＡＵＰ−１２のＳＴＡＴ−６転写活性
ＳＴＡＴ６転写活性に対する組換え型ＩＬ−４およびＡＵＰ−１２の生物学的活性を決定するために、ＳＴＡＴ−６およびＳＴＡＴ６−Ｌｕｃプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｉｎｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）が一過的同時遺伝子導入されたＭＯ３．１３（ヒト）およびＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト）細胞を使用した。
ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−３２１６（商標））を、ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＧｍｂＨから入手した。その細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種し、次の条件下で２４時間にわたってインキュベートした：
・培養条件：３７℃、５％ＣＯ２。
・培養培地：ＤＭＥＭ培地、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、および１０体積％の最終濃度までのウシ胎児血清。
ヒトＧｌｉａｌ（Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｉｃ）Ｈｙｂｒｉｄ細胞系ＭＯ３．１３を、ｔｅｂｕ−ｂｉｏ ＧｍｂＨ（Ｏｆｆｅｎｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。その細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種し、次の条件下で２４時間にわたってインキュベートした：
・培養条件：３７℃。
・培養培地：ＤＭＥＭ培地、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、および１０体積％の最終濃度までのウシ胎児血清。
ＳＴＡＴ−６およびＳＴＡＴ６−Ｌｕｃプラスミドでのトランスフェクションを、ＲｏｔｉＦｅｃｔ（商標）試薬（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ．ＫＧ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、製造者の推奨に従って行った。細胞を、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌの組換え型ヒトＩＬ４（ｒｈＩＬ−４）、ならびにＡＵＰ−１２ストック溶液の希釈液で６時間にわたって処理した。ＡＵＰ−１２ストック溶液は、ＤＭＥＭ培地で、０．１％、１％、１０％、および２０体積％の濃度に希釈した。
次いで、細胞を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−リン酸ｐＨ７．８、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および７％グリセロール中で溶解させた。
ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）の指示に従って、Ａｕｔｏｌｕｍａｔ ＬＢ ９５３（ＥＧ＆Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、ＵＳＡ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。特異的トランス活性化の結果が、未処理細胞に対する誘導倍数として表される。
図１４ｇは、ヒトＧｌｉａｌ Ｈｙｂｒｉｄ細胞系（ＭＯ３．１３）におけるＡＵＰ−１２およびｒｈＩＬ−４のＳＴＡＴ−６転写活性を示している。
図１４ｈは、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞におけるＡＵＰ−１２およびｒｈＩＬ−４のＳＴＡＴ−６転写活性を示している。
図１４ｇおよび１４ｈから分かり得るとおり、ＡＵＰ−１２培養培地は、ｒｈＩＬ４と同様に、ヒトＧｌｉａｌ Ｈｙｂｒｉｄ細胞系（ＭＯ３．１３）において、さらには、４ ヒト胎児由来腎臓２９３細胞において、ＳＴＡＴ−６転写活性を誘導する。ｒｈＩＬ４の有効な用量は、０，１〜２０ｎｇ／ｍｌの間である。
実施例５：創口閉鎖実験
ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスの全層切採創傷に、ヒトＦＧＦ−２、ＣＳＦ−１、およびＩＬ−４を単独で、または組み合わせで発現するプロバイオティクス細菌を適用した結果を、組合せ薬物動態（ＰＫ）／薬力学（ＰＤ）的有効性研究において試験した。その際、ＦＧＦ２（ＡＵＰ−１０）、ＩＬ４（ＡＵＰ−１２）、およびＣＳＦ１（ＡＵＰ−１４）を発現する細菌を、単独で、または３パートの組合せ（すなわち、ＡＵＰ−１０＋ＡＵＰ−１２＋ＡＵＰ１４）として組み合せて評価し、有効性に関して、陽性対照（すなわち、組換え型タンパク質ＴＧＦ−アルファ＋ＰＤＧＦ−ＢＢの組合せ）と比較した。さらに、単一細菌細胞においてＦＧＦ２、ＩＬ４、およびＣＳＦ１を発現する細菌（ＡＵＰ−１６）を評価し、ビヒクル処置（すなわち、生理食塩水＋フィルム包帯またはＩＭ１培地＋フィルム包帯）および陽性対照（ＴＧＦ−アルファ＋ＰＤＧＦ−ＢＢ）と比較した。
糖尿病の患者は、創傷治癒の障害を受けやすく、その際、足部潰瘍が特に頻繁である。創傷治癒におけるこの遅延は、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から商業的に入手した自然発症糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスを包含する糖尿病動物にも及ぶ。
すべて雄で、約１０週齢の９９匹の糖尿病マウス（系統名ＢＫＳ．Ｃｇ−Ｄｏｃｋ７ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊ−Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｄｅ ００６４２）を、第１の研究、およびその後の第２の研究において使用した。
ヒトＦＧＦ−２、ＣＳＦ−１、またはＩＬ−４を単独で、または３パートの組合せとして発現する組換え型プロバイオティクス細菌、さらには、単一細菌細胞においてＦＧＦ２、ＩＬ４、およびＣＳＦ１を発現する組換え型プロバイオティクス細菌を創傷日（０日）に適用し、その生存を適用から６時間後に検査した。創傷に適用された細菌によるＦＧＦ−２、ＣＳＦ−１、および／またはＩＬ−４の産生の決定を容易にするために、創傷液サンプルを、６時間、ならびに１、２、および７日間の後に創傷から採取した。ＰＫ／ＰＤ分析を容易にするために、全身血液および主要な臓器を６および２４時間、ならびに７日間後に採取した。ＩＭ１培地のみを与えられた創傷を、この研究のＰＫ／ＰＤコンポーネントのための対照として使用した。
創傷治癒のプロセスに対するこれらの組換え型プロバイオティクス細菌の影響を検査するために、ヒトＦＧＦ−２、ＣＳＦ−１、およびＩＬ−４を発現する細菌、さらには、ヒトＦＧＦ−２、ＣＳＦ−１、またはＩＬ−４のみを発現する細菌を、創傷日（０日）に、その後、創傷後６日目まで毎日創傷に適用した。これらの組換え型プロバイオティクス細菌を与えられた創傷の治癒を、新鮮なＩＭ１培地のみに曝露された同様の創傷の治癒と比較した。
さらに、組換え型ヒトトランスフォーミング増殖因子−アルファ（ｒｈ−ＴＧＦ−α）と組み合わせた組換え型ヒト血小板由来増殖因子−ＢＢ（ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ）を、この研究における「陽性対照」として使用した。その陽性対照を、０．２５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）ビヒクル中で調製したが、これは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から入手した０．５ｇのヒドロキシプロピルメチルセルロースを蒸留水１００ｍｌに溶かし、かつ水酸化ナトリウムを添加してｐＨを７．０までにすることによって調製した。
ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＴＧＦの組合せは、Ｂｒｏｗｎ ＲＬ ｅｔ ａｌ．（Ｂｒｏｗｎ ＲＬ、Ｂｒｅｅｄｅｎ ＭＰ、Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ ＤＧ．：“ＰＤＧＦ ａｎｄ ＴＧＦ−ａｌｐｈａ ａｃｔ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｏｕｓｅ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５６（６）、１９９４、５６２〜５７０頁）によって行われた研究に基づく。Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．は、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＴＧＦ−アルファの組合せを用いると、それらの個別の増殖因子での処置と比較して、創口閉鎖の改善が観察されたと記載している。
創傷治癒を肉眼および組織学的レベルの両方で研究した。創傷治癒を、肉眼レベルでは、（ｉ）新皮膚修復応答の開始、および（ｉｉ）創口閉鎖の点において研究した。
創口閉鎖、およびその構成要素である創傷収縮および創傷再上皮化を、創傷後の創傷後０、４、および７日目に撮影されたデジタル写真から決定した。肉芽組織形成（深さ）および創傷幅（頭尾収縮）の組織学的評価を、常套的な（Ｈ＆Ｅ）染色された切片で行った。これらの組織学的評価を、創傷後７日目に採取した組織で行った。
有害作用の発生をモニターし、すべて記録した。
全層実験創傷の作製および処置の適用
実験用創傷の後に、動物を、個別ケージ（ケージサイズ５００ｃｍ２、週に３回交換されるおがくず床敷を装備）内で、２３℃の周囲温度に維持された環境で、１２時間明暗サイクルで飼育した。動物に、飼料（ＣＲＭ−Ｐ、製品コード８０１７２２、ＳＤＳ ｄｉｅｔｓ、ＵＫ）および水を自由に与えた。動物をその周囲に順応させるために、実験前に、床敷を交換し、そして飼料および水の供給を補充することを除いては、邪魔せずに、動物を５〜７日間にわたって飼育した。すべての麻酔イベントの後に、動物を温かい環境に置き、処置から完全に回復するまで、モニターした。すべての動物が、外科手術後に、適切な無痛薬（ブプレノルフィン）を投与され、かつ必要ならば、追加の鎮痛薬が投与された。
すべての動物処置を、ＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅが認可した施設において、ＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｌｉｃｅｎｃｅｓ（ＰＣＤ：５０／２５０５；ＰＰＬ：４０／３６１４；ＰＩＬ：ＩＢＣＥＦＤＦ５５；ＰＩＬ：Ｉ３４８１７２４９）のもとで実施した。動物の健康を、研究を通じて毎日モニターした。
動物を、表２ａおよび２ｂに従って、１８の処置レジームの１つに無作為化した。
０日目に、動物に麻酔を掛け（イソフルオランおよび空気）、背部を剃毛し、生理食塩水浸漬ガーゼで清浄化した。次いで、皮膚を７０％ＥｔＯＨで消毒し、滅菌ガーゼで水分を拭き取った。単一の標準化全層創傷（１０．０ｍｍ×１０．０ｍｍ）を、各実験動物の左背側横腹部の皮膚において作製した。
次いで、すべての群の動物における創傷に、透明フィルム包帯Ｂｉｏｃｌｕｓｉｖｅ（Ｓｙｓｔａｇｅｎｉｘ Ｗｏｕｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ、Ｇａｔｗｉｃｋ、ＵＫ）の周囲バンドで包帯をし；その後、動物に、２７ゲージ針を使用して、Ｂｉｏｃｌｕｓｉｖｅフィルムを介した注射によって適用される下記の処置の１つを投与した（表２ａおよび２ｂを参照されたい）。
各処置のために、次の細胞密度（培地ｍｌ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ））を有するＩＭ１培地１０ｍｌ中で、個々の非誘導組換え型プロバイオティクス細菌を与えた。
名称 サンプル ＣＦＵ／ｍｌ
ＡＵＰ−１０ 実施例２ａにおいて得た非誘導ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２） ３×１０８
ＡＵＰ−１４ 実施例２ｃにおいて得た非誘導ＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１） ３×１０８
ＡＵＰ−１２ 実施例２ｂにおいて得た非誘導ＮＺ３９００（ｐＩＬ４） ３×１０８
組合せ 実施例２ａにおいて得た非誘導ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２） １×１０８
実施例２ｃにおいて得た非誘導ＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１） １×１０８
実施例２ｂにおいて得た非誘導ＮＺ３９００（ｐＩＬ４） １×１０８
ＡＵＰ−１６ 実施例２ｄにおいて得た非誘導ＮＺ３９００（ｐＣ−Ｆ−Ｉ）細胞
３×１０８
処置スキーム「組合せ」は、実施例２ａにおいて得た非誘導ＮＺ３９００（ｐＦＧＦ２）、実施例２ｃにおいて得た非誘導ＮＺ３９００（ｐＣＳＦ１）、および実施例２ｂにおいて得た非誘導ＮＺ３９００（ｐＩＬ４）の混合物から生じている３パートの組合せを表す。その混合物は、３×１０８ＣＦＵ／ｍｌの全細胞密度を有する。
処置を適用する前に、ＩＭ１培地１０ｍｌ中に与えられている個々の非誘導組換え型プロバイオティクス細菌を、振盪せずに３０℃でインキュベートし、光学密度を６００ｎｍの波長で、分光測光法で決定した（ＯＤ６００）。
０．５のＯＤ６００で、ナイシンを５ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。３０分間にわたる３０℃での追加のインキュベーションの後に、誘導された培養物を１０℃にした。続いて、個々の誘導された培養物を、２７ゲージ針を使用して、Ｂｉｏｃｌｕｓｉｖｅフィルムを介した注射によって適用した。
表２ａおよび２ｂにおいて記載のスキームに従って、処置を適用した。処置群１〜９の動物には、０日目に５０μｌの単回適用を与えた。処置群１０〜１８の動物には、０、１、２、３、４、５、および６日目に、１日当たり５０μｌの単回適用として分割された７回の連続適用を与えた。
処置の１回目の適用から６時間後に、創傷液を群１〜４のすべての動物から採取した。組合せ群（群１）から採取された創傷液を、組換え型プロバイオティクス細菌のＣＦＵ算定を可能にするような手法で処理した。残りの群の創傷から採取された液体を、長期貯蔵のために−８０℃にする前に、湿った氷の上に保持した。創傷液の収集の後に、これらの群のすべての動物をターミネートさせた（ＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅによって承認された方法による）。ターミネーションの前に、全身血液を心臓穿刺によってＥＤＴＡ処理された管に採取した。血液サンプルの半分を遠心分離して、血漿を取り出し；残りの半分を、４℃で終夜保持し、その後、全血球および鑑別血球計算が行われるＬａｎｇｆｏｒｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｌｄｔ．（Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）に送付した。肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺組織、および排出リンパ節の死後サンプルをすべての動物から採取した（血漿および組織をクライオバイアルに入れ、これを液体窒素内でスナップ凍結し、その後、これらを−８０℃で貯蔵した）。
処置の１回目の適用から２４時間後に、創傷液を群５〜９のすべての動物から採取し、上記のとおりに貯蔵した。血液を収集および貯蔵し、次いで、動物をターミネートさせた。創傷液、全血、血漿、および組織サンプルを上記のとおりに採取および貯蔵した。
１回目の適用の１日後に、かつその後は６日目まで１日間隔で、処置を群１０〜１５のすべての創傷に再適用した。
処置の１回目の適用から２日後（２回目の適用から１日後）に、創傷液を群１０〜１５のすべての動物から採取し、上記のとおりに貯蔵した。
処置の１回目の適用から７日後（６日目での処置の最終適用から１日後）に、創傷液を群１０〜１５のすべての動物から採取し、上記のとおりに貯蔵した。血液を収集および貯蔵し、次いで、動物をターミネートさせた。ターミネーションの後に、創傷および辺縁組織を採取し、組織学的調査のために処理した（セクション３．７を参照されたい）。創傷液、全血、血漿、および組織サンプルを上記のとおりに採取および貯蔵した。
創傷後４および７日目に、群１０〜１５の動物に再び麻酔を掛け、それらの創傷を評価し、校正／識別プレートと一緒にデジタル撮影した。４日目には、これを、所定のＢｉｏｃｌｕｓｉｖｅフィルム包帯と共に行った。７日目には、包帯およびいずれの遊離デブリも除去し、次いで、創傷を、生理食塩水浸漬滅菌ガーゼを使用して清浄化し、滅菌ガーゼで水分を拭き取った。創傷を評価し、校正／識別プレートと一緒にデジタル撮影した。
創口閉鎖のイメージ分析
Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏイメージ分析ソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ４．１．０．０、Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、ＵＳＡ）を使用して、群１０〜１５および１６〜１８の創傷のイメージから、創口閉鎖を経時的に測定した。各時点での各創傷について（群１０〜１５では４および７日目、群１６〜１８では４、７、８、および１２日目）、開放創傷面積を測定し、０日目に対する創傷面積％に関して表した。
適用後６時間後の組換え型プロバイオティクス細菌の生存
ＦＧＦ２、ＩＬ４、およびＣＳＦ１の組合せを発現する細菌を創傷に導入してから６時間後に、創傷液を抽出し、細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）算定を行った。５つの創傷からのＣＦＵ算定の結果は、表３において与えられている。
その結果によって、細菌が創傷内で生存可能であり、かつ６時間にわたって創傷内に存在した後も増殖することがなお可能であったことが確認され、このことは、上述の組換え型プロバイオティクス細菌を、治療用タンパク質組合せを創傷に送達するために使用することができるという事実を強調している。
種々の処置群における創傷治癒応答
創傷後に対する種々の処置群における創傷治癒応答を、処置開始から４および７日後に外観検査によって評価した。
群１０〜１５の肉眼による外観検査、さらには、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏイメージ分析ソフトウェアによる定量的分析は、創傷治癒が、処置開始から早くも４日後に生じていることを明らかにしている。さらに、７日目には、ＦＧＦ２、ＩＬ４、およびＣＳＦ１を発現する組換え型プロバイオティクス細菌の３パートの組合せで処置されたマウス（処置群１、５、および１０）は、ＦＧＦ２発現性プロバイオティクス細菌（ＡＵＰ−１０）、ＩＬ４発現性プロバイオティクス細菌（ＡＵＰ−１２）、およびＣＳＦ１発現性プロバイオティクス細菌（ＡＵＰ−１４）の個別の処置群と比較して、さらには、陽性対照（すなわち、ＴＧＦ−アルファおよびＰＤＧＦ−ＢＢ）と比較して、優れた治癒応答を実証している（ピンク色／赤色肉芽組織堆積、さらには、創傷の上皮形成を実証している）。結果は、図１５ａにおいて示されている。
図１５ａは、種々の処置群における創傷治癒応答を示している。
個別処置群は、ＩＭ１培地処置群（ビヒクル処置群）よりも優れている比較可能な治癒応答を示す。結果は、創傷治癒においてＦＧＦ２、ＩＬ４、およびＣＳＦ１を組み合わせることの相乗効果を示した。
ＦＧＦ２（ＡＵＰ−１０）処置マウスはさらに、肉芽組織形成、さらに、血管新生を示したが、上皮形成は示さなかった。ＦＧＦ２発現性プロバイオティクス細菌を単独で使用した場合、血管からの漏出が存在することも分かり得る。ＩＬ４発現性プロバイオティクス細菌（ＡＵＰ−１２）およびＣＳＦ１発現性プロバイオティクス細菌（ＡＵＰ−１４）は、主に創傷の上皮形成を示したが、肉芽化は示さなかったのに対して、組換え型プロバイオティクス細菌の３パートの組合せ（ＡＵＰ−１０＋ＡＵＰ−１２＋ＡＵＰ−１４）で処置された創傷は、肉芽組織形成、さらには、創傷の上皮形成を実証している。血管からの漏出は見られ得ない。
糖尿病性足部潰瘍（ヒトにおける）において、上皮形成が肉芽組織形成に依存していることが公知であることは重要である。肉芽組織形成がなければ、上皮形成は起こり得ず、創口は閉鎖しない。
群１６〜１８では、ＡＵＰ−１６（単一の細菌細胞においてＦＧＦ２、ＩＬ４、およびＣＳＦ１を発現する組換え型細菌）を、ビヒクル処置（生理食塩水＋包帯）および陽性対照（すなわち、ＴＧＦ−アルファ＋ＰＤＧＦ−ＢＢ）と比較した。４、８、および１２日間を通じて、ＡＵＰ−１６は、陽性対照群（ＴＧＦ−アルファ＋ＰＤＧＦ−ＢＢ）と比較して、創傷治癒において優位性を実証した。結果は、図１５ｂにおいて示されている。
創傷後ならびに４、８、および１２日後での対照（生理食塩水処置群１６）、陽性対照（処置群１７）、およびＡＵＰ−１６処置組織（処置群１８）の創傷治癒状態の比較は、図１５ｂにおいて示されている。
０日目は、創傷直後の元の創傷を表している。同じ創傷が、４、８、および１２日目にも示されている。個々の写真は、創口閉鎖を可視化するために、ほぼ等倍とした。各写真における黒色のバーは、１ｃｍを表している。
陽性対照（処置群１７）およびＡＵＰ−１６処置組織（処置群１８）の８日および１２日後の残存創傷面積の比較が、図１５ｃにおいて示されている。
残存創傷面積を、創傷のイメージにおいて、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏイメージ分析ソフトウェアで測定し、０日目に対する創傷面積％に関して表した。
１２日目に、組合せ（ＡＵＰ−１６）で処置された創傷では、創傷のほぼ完全な閉鎖が観察された。これは、創傷直後の０日目での創傷面積に対して、１，３７％の残存創傷面積によって反映される。
さらに、図１５ａおよび１５ｂから、特に１２日目に、組換え型ヒトトランスフォーミング増殖因子−アルファと組み合わせた組換え型ヒト血小板由来増殖因子−ＢＢ（陽性対照）で処置された創傷と比較して、３パートの組合せ、さらにはＡＵＰ−１６で処置された創傷では、有意に良好な創口閉鎖が観察されたことが分かり得る。
この実験において調査されたすべての細菌処置レジーム（ＡＵＰ−１０、ＡＵＰ−１２、およびＡＵＰ−１４を単独で、または３パートの組合せ、さらには、ＡＵＰ−１６として適用）は、広く許容されていて、ヒトにおける創傷治癒の遅延の最良の有効動物モデルの１つである糖尿病性ｄｂ／ｄｂマウスにおける創傷修復を促進することが見出された。
例えば、Ｍｉｃｈａｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）（「ｄｂ／ｄｂ ｍｉｃｅ ｅｘｈｉｂｉｔ ｓｅｖｅｒｅ ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｍｕｒｉｎｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ａ ｓｉｌｉｃｏｎｅ−ｓｐｌｉｎｔｅｄ ｅｘｃｉｓｉｏｎａｌ ｗｏｕｎｄ ｍｏｄｅｌ」、Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐ．Ｒｅｇ．１５、６６５〜６７０頁）において記載されているとおり、ｄｂ／ｄｂマウスにおける切採創傷は、創口閉鎖における統計学的に有意な遅延、肉芽組織形成の減少、創傷床血管分布の低下、および増殖の著しい減少を示す。
実験結果は、本発明の組換え型プロバイオティクス細菌の適用が、ヒトにおける創傷、特に慢性創傷の処置において、有意な改善をもたらすことを明らかに示している。
本発明の組換え型プロバイオティクス細菌の適用は、肉芽組織形成、創傷床血管分布および増殖の増大を誘導し、したがって、重篤な創傷治癒障害を示すモデルにおいても、創口閉鎖の改善および加速をもたらす。
したがって、これらの結果は、凍傷、湿疹、乾癬、皮膚炎、潰瘍、創傷、エリテマトーデス、神経皮膚炎、およびそれらの組合せ、好ましくは皮膚炎、潰瘍、創傷、およびそれらの組合せ、さらに好ましくは潰瘍などの、炎症性、好ましくは慢性炎症性皮膚機能不全が、本発明の組換え型プロバイオティクス細菌の適用から利益を受けることを示している。
個々の慢性創傷において観察される創傷治癒障害が、本発明の組換え型プロバイオティクス細菌の適用後に克服されるので、例えば、慢性静脈性潰瘍、慢性動脈性潰瘍、慢性糖尿病性潰瘍、および慢性圧迫潰瘍などの慢性創傷は、本発明の組換え型プロバイオティクス細菌の適用によって処置することができる。

Claims (26)

  1. 組換え型プロバイオティクス細菌であって、
    第１の異種因子をコードする核酸配列（複数可）、第２の異種因子をコードする核酸配列（複数可）、および第３の異種因子をコードする核酸配列（複数可）を含むが、ただし、第１の因子、第２の因子、および第３の因子は、相互に機能的に異なり、その際、第１の因子は、増殖因子であり、第２の因子は、Ｍ２分極化因子からなる群から選択され、第３の因子は、Ｍ２分極化因子および増殖因子からなる群から選択されることを条件とし、Ｍ２分極化因子が、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ１）、インターロイキン３４（ＩＬ３４）、およびそれらの混合物からなる群から選択され、増殖因子が、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、組換え型プロバイオティクス細菌。
  2. 核酸配列（複数可）が、組換え型プロバイオティクス細菌の染色体およびプラスミドの少なくとも１つに配置されている、請求項１に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  3. 核酸配列（複数可）の発現が、構成プロモーターまたは誘導性プロモーターによって制御される、請求項１または２のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  4. 核酸配列（複数可）の発現が、誘導性プロモーターによって制御されていて、核酸配列（複数可）が、少なくとも１種の誘導因子の存在下で発現可能である、請求項３に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  5. 誘導因子によって誘導可能である誘導性プロモーターが、ランチビオティクスペプチドをコードする微生物遺伝子のためのプロモーターである、請求項３または４のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  6. 誘導因子が、ランチビオティクスペプチドである、請求項４または５のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  7. プロバイオティクス細菌がさらに、プロバイオティクス細菌の生存に必要な必須タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子であって不活性化されることができる遺伝子を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  8. プロバイオティクス細菌の生存に必要な少なくとも１つの遺伝子であって不活性化されることができる遺伝子が、アラニンラセマーゼ（ａｌａＲ）、チミジル酸シンターゼ（ｔｈｙＡ）、アスパラギンシンターゼ（ａｓｎＨ）、ＣＴＰシンターゼ（ｐｙｒＧ）、トリプトファンシンターゼ（ｔｒｐＢＡ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項７に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  9. 遺伝子が、遺伝子の欠失、遺伝子の変異、遺伝子のエピジェネティック修飾、遺伝子のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）媒介性遺伝子サイレンシング、遺伝子の翻訳阻害、またはそれらの組合せによって不活性化されている、請求項７または８のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  10. 第１の因子、第２の因子、および第３の因子の少なくとも１つが、組換え型プロバイオティクス細菌から放出され得る、請求項１から９のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  11. 組換え型プロバイオティクス細菌が、乳酸細菌である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  12. 組換え型プロバイオティクス細菌が、溶液であるか、凍結または乾燥されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  13. 組換え型プロバイオティクス細菌が、局所で、および／または皮下注射によって投与される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  14. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌である、炎症性皮膚機能不全の処置において使用するための組換え型プロバイオティクス細菌。
  15. 炎症性皮膚機能不全が、炎症性皮膚疾患または炎症性結合組織疾患である、請求項１４に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  16. 炎症性皮膚疾患が、凍傷、湿疹、乾癬、皮膚炎、潰瘍、創傷、エリテマトーデス、神経皮膚炎、またはそれらの組合せである、請求項１５に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  17. 創傷が、熱傷、化学的創傷、放射線誘導性創傷、虚血性創傷、または機械的創傷である、請求項１６に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  18. 潰瘍が褥瘡性潰瘍または下腿潰瘍である、請求項１６に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  19. 請求項１から１８のいずれか一項に記載の組換え型プロバイオティクス細菌を含み、炎症性皮膚機能不全に罹患している個体に投与される、炎症性皮膚機能不全を処置するための剤。
  20. 誘導性プロモーターが、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのＰｎｉｓＡ、ＰｎｉｓＺ、ＰｎｉｓＱ、ＰｎｉｓＦ、ＰｎｉｓＵ、またはそれらの組合せである、請求項５に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  21. ランチビオティクスペプチドが、ナイシンＡ、ナイシンＺ、ナイシンＱ、ナイシンＦ、ナイシンＵ、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項６に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  22. 乳酸細菌が、ラクトバシラスまたはラクトコッカス種である、請求項１１に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  23. ラクトコッカス種が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓである、請求項２２に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  24. Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓが、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｃｒｅｍｏｒｉｓである、請求項２３に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  25. 乾燥が、凍結乾燥または噴霧乾燥である、請求項１２に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
  26. 炎症性皮膚機能不全が、慢性静脈性潰瘍、慢性動脈性潰瘍、慢性圧迫潰瘍、およびそれらの慢性前潰瘍段階から選択される少なくとも１つである慢性創傷である、請求項１４に記載の組換え型プロバイオティクス細菌。
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