RU2723324C2 - Рекомбинантные пробиотические бактерии - Google Patents
Рекомбинантные пробиотические бактерии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2723324C2 RU2723324C2 RU2017127991A RU2017127991A RU2723324C2 RU 2723324 C2 RU2723324 C2 RU 2723324C2 RU 2017127991 A RU2017127991 A RU 2017127991A RU 2017127991 A RU2017127991 A RU 2017127991A RU 2723324 C2 RU2723324 C2 RU 2723324C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- factor
- interleukin
- growth factor
- probiotic bacteria
- lactobacillus
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 245
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 title claims abstract description 193
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 title claims abstract description 193
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 title claims abstract description 193
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 98
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 80
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 32
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims abstract description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 275
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 191
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 130
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 120
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 113
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 claims description 105
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 96
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 96
- NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N Nisin Chemical compound N1C(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@@H]([C@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H](N)[C@H](C)CC)CSC[C@@H]1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(NCC(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CS[C@@H]2C)C(=O)N[C@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C)C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@@H](C(N[C@H](CC=4NC=NC=4)C(=O)N[C@H](CS[C@@H]3C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H]([C@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=3NC=NC=3)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(O)=O)=O)CS[C@@H]2C)=O)=O)CS[C@@H]1C NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N 0.000 claims description 86
- 235000010297 nisin Nutrition 0.000 claims description 86
- 108010053775 Nisin Proteins 0.000 claims description 85
- 239000004309 nisin Substances 0.000 claims description 85
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 71
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 71
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 claims description 70
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 claims description 68
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 67
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 64
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 63
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 63
- 101710181549 Interleukin-34 Proteins 0.000 claims description 60
- 102100033499 Interleukin-34 Human genes 0.000 claims description 60
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 57
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 56
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 56
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 52
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 52
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 46
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 46
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 46
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 46
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 claims description 46
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 claims description 45
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 claims description 42
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 claims description 40
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 36
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 36
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 30
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 claims description 26
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 claims description 26
- 108010074461 nisin A Proteins 0.000 claims description 23
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims description 19
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 claims description 19
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 claims description 18
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 claims description 18
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 17
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 17
- 229940098448 fibroblast growth factor 7 Drugs 0.000 claims description 16
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 14
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 13
- 101800001649 Heparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 claims description 12
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 claims description 12
- 102100033762 Proheparin-binding EGF-like growth factor Human genes 0.000 claims description 12
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 claims description 11
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims description 9
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims description 9
- 108010041525 Alanine racemase Proteins 0.000 claims description 8
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 8
- 241000194034 Lactococcus lactis subsp. cremoris Species 0.000 claims description 8
- 235000014962 Streptococcus cremoris Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 206010011985 Decubitus ulcer Diseases 0.000 claims description 7
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 claims description 7
- 108090001047 Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 208000000558 Varicose Ulcer Diseases 0.000 claims description 6
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 6
- 102100039866 CTP synthase 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 108010018956 CTP synthetase Proteins 0.000 claims description 5
- NOQGZXFMHARMLW-UHFFFAOYSA-N Daminozide Chemical compound CN(C)NC(=O)CCC(O)=O NOQGZXFMHARMLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102100028412 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 102000018386 EGF Family of Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010066486 EGF Family of Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 108010075344 Tryptophan synthase Proteins 0.000 claims description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 4
- 229940029303 fibroblast growth factor-1 Drugs 0.000 claims description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 4
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 claims description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 claims description 4
- 108010070255 Aspartate-ammonia ligase Proteins 0.000 claims description 3
- 101100427060 Bacillus spizizenii (strain ATCC 23059 / NRRL B-14472 / W23) thyA1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100492477 Bacillus subtilis (strain 168) asnH gene Proteins 0.000 claims description 3
- 206010056340 Diabetic ulcer Diseases 0.000 claims description 3
- 101100153154 Escherichia phage T5 thy gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 claims description 3
- 101100313751 Rickettsia conorii (strain ATCC VR-613 / Malish 7) thyX gene Proteins 0.000 claims description 3
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims description 3
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 3
- 101150072314 thyA gene Proteins 0.000 claims description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 3
- 108700005443 Microbial Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 claims description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 claims description 2
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 claims description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 2
- 108700042622 nisin Z Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 125000002480 thymidyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000009752 translational inhibition Effects 0.000 claims description 2
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 claims 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 156
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 122
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 86
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 85
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 85
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 71
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 56
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 56
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 52
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 50
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 48
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 47
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 44
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 43
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 35
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 34
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 34
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 26
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 22
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 22
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 21
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 21
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 20
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 20
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 20
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 19
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 19
- 101000916628 Homo sapiens Macrophage colony-stimulating factor 1 Proteins 0.000 description 18
- 102000053925 human CSF1 Human genes 0.000 description 18
- 235000019410 glycyrrhizin Nutrition 0.000 description 17
- 102000000579 Epigen Human genes 0.000 description 16
- 108010016906 Epigen Proteins 0.000 description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 15
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 15
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 15
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 14
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 14
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 14
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 14
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 14
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 13
- 229960001375 lactose Drugs 0.000 description 13
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 13
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 13
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 13
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 13
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 13
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 13
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 12
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 12
- 102100025498 Proepiregulin Human genes 0.000 description 12
- 241000186429 Propionibacterium Species 0.000 description 12
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 12
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 12
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 12
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 11
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 11
- 101800000155 Epiregulin Proteins 0.000 description 11
- 101000938352 Homo sapiens Epigen Proteins 0.000 description 11
- 102100028198 Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Human genes 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 102000043483 human EPGN Human genes 0.000 description 11
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 11
- 102000007299 Amphiregulin Human genes 0.000 description 10
- 108010033760 Amphiregulin Proteins 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 235000021472 generally recognized as safe Nutrition 0.000 description 10
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 10
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 10
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 10
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 10
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 9
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 9
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 9
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 9
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 9
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 9
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010007457 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Proteins 0.000 description 8
- 102000007665 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Human genes 0.000 description 8
- 101000809450 Homo sapiens Amphiregulin Proteins 0.000 description 8
- 101000916644 Homo sapiens Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Proteins 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 8
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 8
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 8
- 101150115929 Usp45 gene Proteins 0.000 description 8
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 102000043494 human AREG Human genes 0.000 description 8
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000203811 Curtobacterium flaccumfaciens Species 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 7
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 7
- 101001033233 Homo sapiens Interleukin-10 Proteins 0.000 description 7
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 7
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 7
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 description 7
- 241000194041 Lactococcus lactis subsp. lactis Species 0.000 description 7
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 7
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 7
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 7
- 235000014969 Streptococcus diacetilactis Nutrition 0.000 description 7
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 7
- -1 VEGF-S Proteins 0.000 description 7
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 102000052620 human IL10 Human genes 0.000 description 7
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 7
- 229940001882 lactobacillus reuteri Drugs 0.000 description 7
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 6
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 6
- 208000008960 Diabetic foot Diseases 0.000 description 6
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 6
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000998132 Homo sapiens Interleukin-34 Proteins 0.000 description 6
- 101001052493 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 1 Proteins 0.000 description 6
- 101001056707 Homo sapiens Proepiregulin Proteins 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 6
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 6
- 241001468194 Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum Species 0.000 description 6
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 6
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 6
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 6
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 102000043415 human EREG Human genes 0.000 description 6
- 102000002580 human interleukin-34 Human genes 0.000 description 6
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 6
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 6
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 6
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 229940072041 transforming growth factor beta 2 Drugs 0.000 description 6
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 5
- 101000876610 Dictyostelium discoideum Extracellular signal-regulated kinase 2 Proteins 0.000 description 5
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 5
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 5
- 208000001034 Frostbite Diseases 0.000 description 5
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101100118545 Holotrichia diomphalia EGF-like gene Proteins 0.000 description 5
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 5
- 101001076430 Homo sapiens Interleukin-13 Proteins 0.000 description 5
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 5
- 241000186715 Lactobacillus alimentarius Species 0.000 description 5
- 240000002605 Lactobacillus helveticus Species 0.000 description 5
- 235000013967 Lactobacillus helveticus Nutrition 0.000 description 5
- 241001647418 Lactobacillus paralimentarius Species 0.000 description 5
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 5
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 5
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 description 5
- 241000186869 Lactobacillus salivarius Species 0.000 description 5
- 102400000401 Latency-associated peptide Human genes 0.000 description 5
- 101800001155 Latency-associated peptide Proteins 0.000 description 5
- 101710127797 Macrophage colony-stimulating factor 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 5
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 5
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 5
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 101150070828 alr gene Proteins 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 5
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 5
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 5
- 102000019207 human interleukin-13 Human genes 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 5
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N (13-methyl-3-oxo-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl) 3-phenylpropanoate Chemical compound CC12CCC(C3CCC(=O)C=C3CC3)C3C1CCC2OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 4
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100301559 Bacillus anthracis repS gene Proteins 0.000 description 4
- 101100247969 Clostridium saccharobutylicum regA gene Proteins 0.000 description 4
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 4
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 4
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 4
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 4
- 101100412434 Escherichia coli (strain K12) repB gene Proteins 0.000 description 4
- 101500025614 Homo sapiens Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 4
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 4
- 241000186713 Lactobacillus amylovorus Species 0.000 description 4
- 241001134659 Lactobacillus curvatus Species 0.000 description 4
- 241001147746 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis Species 0.000 description 4
- 241000500356 Lactobacillus dextrinicus Species 0.000 description 4
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 description 4
- 241000186851 Lactobacillus mali Species 0.000 description 4
- 241000186612 Lactobacillus sakei Species 0.000 description 4
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 4
- 241001468192 Leuconostoc citreum Species 0.000 description 4
- 241000192129 Leuconostoc lactis Species 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 101100114425 Streptococcus agalactiae copG gene Proteins 0.000 description 4
- 241000608350 Streptococcus macedonicus Species 0.000 description 4
- 241000194024 Streptococcus salivarius Species 0.000 description 4
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 4
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 4
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 4
- 229940054346 lactobacillus helveticus Drugs 0.000 description 4
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 4
- 101150044854 repA gene Proteins 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 210000004215 spore Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108010078749 trafermin Proteins 0.000 description 4
- 229950009227 trafermin Drugs 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186018 Bifidobacterium adolescentis Species 0.000 description 3
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000206600 Carnobacterium maltaromaticum Species 0.000 description 3
- 241000186244 Corynebacterium variabile Species 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 241000520130 Enterococcus durans Species 0.000 description 3
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 3
- 101100136641 Escherichia coli (strain K12) pifC gene Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000794104 Homo sapiens Probetacellulin Proteins 0.000 description 3
- 101000655540 Homo sapiens Protransforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 3
- 101500025624 Homo sapiens Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000028630 Lactobacillus acidipiscis Species 0.000 description 3
- 241001647783 Lactobacillus amylolyticus Species 0.000 description 3
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 description 3
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 description 3
- 244000199885 Lactobacillus bulgaricus Species 0.000 description 3
- 235000013960 Lactobacillus bulgaricus Nutrition 0.000 description 3
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 description 3
- 241000186841 Lactobacillus farciminis Species 0.000 description 3
- 241000186839 Lactobacillus fructivorans Species 0.000 description 3
- 241000186606 Lactobacillus gasseri Species 0.000 description 3
- 241000186685 Lactobacillus hilgardii Species 0.000 description 3
- 241001468157 Lactobacillus johnsonii Species 0.000 description 3
- 241000394636 Lactobacillus mucosae Species 0.000 description 3
- 241001643453 Lactobacillus parabuchneri Species 0.000 description 3
- 241000866650 Lactobacillus paraplantarum Species 0.000 description 3
- 241000186684 Lactobacillus pentosus Species 0.000 description 3
- 241001495404 Lactobacillus pontis Species 0.000 description 3
- 241000186868 Lactobacillus sanfranciscensis Species 0.000 description 3
- 235000013864 Lactobacillus sanfrancisco Nutrition 0.000 description 3
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 description 3
- 241000194040 Lactococcus garvieae Species 0.000 description 3
- 241000194037 Lactococcus raffinolactis Species 0.000 description 3
- 241000178948 Lactococcus sp. Species 0.000 description 3
- 244000172809 Leuconostoc cremoris Species 0.000 description 3
- 235000017632 Leuconostoc cremoris Nutrition 0.000 description 3
- 241001627205 Leuconostoc sp. Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 241000191998 Pediococcus acidilactici Species 0.000 description 3
- 102100040990 Platelet-derived growth factor subunit B Human genes 0.000 description 3
- 241000186334 Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii Species 0.000 description 3
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 3
- 101100301564 Staphylococcus aureus repF gene Proteins 0.000 description 3
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 3
- 241000194022 Streptococcus sp. Species 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 102000005497 Thymidylate Synthase Human genes 0.000 description 3
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 3
- 238000002266 amputation Methods 0.000 description 3
- HYNPZTKLUNHGPM-KKERQHFVSA-N becaplermin Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](Cc2cnc[nH]2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(=N)N)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]5CCCN5C(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H]6CCCN6C(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@@H]7CCCN7C(=O)[C@H](Cc8c[nH]c9c8cccc9)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)N HYNPZTKLUNHGPM-KKERQHFVSA-N 0.000 description 3
- 229960004787 becaplermin Drugs 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 3
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 102000043497 human BTC Human genes 0.000 description 3
- 102000043392 human TGFA Human genes 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 3
- 101150009839 lacF gene Proteins 0.000 description 3
- 229940012969 lactobacillus fermentum Drugs 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 3
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 3
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 101150043558 repc gene Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 3
- 229940099456 transforming growth factor beta 1 Drugs 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 3
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- MKNQNPYGAQGARI-UHFFFAOYSA-N 4-(bromomethyl)phenol Chemical compound OC1=CC=C(CBr)C=C1 MKNQNPYGAQGARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186426 Acidipropionibacterium acidipropionici Species 0.000 description 2
- 241000186425 Acidipropionibacterium jensenii Species 0.000 description 2
- 241000186335 Acidipropionibacterium thoenii Species 0.000 description 2
- 102100021723 Arginase-1 Human genes 0.000 description 2
- 101710129000 Arginase-1 Proteins 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 2
- 241000901050 Bifidobacterium animalis subsp. lactis Species 0.000 description 2
- 241000186012 Bifidobacterium breve Species 0.000 description 2
- 241000186020 Bifidobacterium dentium Species 0.000 description 2
- 241000186015 Bifidobacterium longum subsp. infantis Species 0.000 description 2
- 241000186147 Bifidobacterium longum subsp. suis Species 0.000 description 2
- 241000131482 Bifidobacterium sp. Species 0.000 description 2
- 241001464978 Clavibacter insidiosus Species 0.000 description 2
- 241001464977 Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Species 0.000 description 2
- 241001430230 Clavibacter nebraskensis Species 0.000 description 2
- 241001430228 Clavibacter sepedonicus Species 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 2
- 241000427397 Corynebacterium aurimucosum Species 0.000 description 2
- 241000323759 Corynebacterium casei Species 0.000 description 2
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 2
- 241001134763 Corynebacterium flavescens Species 0.000 description 2
- 241001533284 Corynebacterium glucuronolyticum Species 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- 241001517041 Corynebacterium jeikeium Species 0.000 description 2
- 241000158523 Corynebacterium striatum Species 0.000 description 2
- 241000158520 Corynebacterium urealyticum Species 0.000 description 2
- 241000186245 Corynebacterium xerosis Species 0.000 description 2
- 241000186427 Cutibacterium acnes Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000134765 Enterococcus saccharolyticus Species 0.000 description 2
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101000582396 Escherichia phage D108 Repressor c protein Proteins 0.000 description 2
- 101000582397 Escherichia phage Mu Repressor protein c Proteins 0.000 description 2
- 102000004864 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 2
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 2
- 101001076407 Homo sapiens Interleukin-1 receptor antagonist protein Proteins 0.000 description 2
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 description 2
- 101000651018 Homo sapiens Splicing factor, proline- and glutamine-rich Proteins 0.000 description 2
- 101500026551 Homo sapiens Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 2
- 229940119178 Interleukin 1 receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 102000051628 Interleukin-1 receptor antagonist Human genes 0.000 description 2
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- DWPCPZJAHOETAG-IMJSIDKUSA-N L-lanthionine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CSC[C@H](N)C(O)=O DWPCPZJAHOETAG-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000186717 Lactobacillus acetotolerans Species 0.000 description 2
- 241000110061 Lactobacillus acidifarinae Species 0.000 description 2
- 241000186679 Lactobacillus buchneri Species 0.000 description 2
- 241000208559 Lactobacillus cacaonum Species 0.000 description 2
- 241001468197 Lactobacillus collinoides Species 0.000 description 2
- 241000933456 Lactobacillus composti Species 0.000 description 2
- 241000861211 Lactobacillus crustorum Species 0.000 description 2
- 241000186673 Lactobacillus delbrueckii Species 0.000 description 2
- 241001647786 Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii Species 0.000 description 2
- 241000790171 Lactobacillus diolivorans Species 0.000 description 2
- 241000208558 Lactobacillus fabifermentans Species 0.000 description 2
- 241001493843 Lactobacillus frumenti Species 0.000 description 2
- 241000509544 Lactobacillus gallinarum Species 0.000 description 2
- 241000950383 Lactobacillus ghanensis Species 0.000 description 2
- 241000111368 Lactobacillus hammesii Species 0.000 description 2
- 241000925032 Lactobacillus harbinensis Species 0.000 description 2
- 241001468190 Lactobacillus homohiochii Species 0.000 description 2
- 241001195326 Lactobacillus hordei Species 0.000 description 2
- 241001343376 Lactobacillus ingluviei Species 0.000 description 2
- 241001561398 Lactobacillus jensenii Species 0.000 description 2
- 241000108055 Lactobacillus kefiranofaciens Species 0.000 description 2
- 241001407640 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum Species 0.000 description 2
- 241001468191 Lactobacillus kefiri Species 0.000 description 2
- 241000191683 Lactobacillus kisonensis Species 0.000 description 2
- 241000016642 Lactobacillus manihotivorans Species 0.000 description 2
- 241000414465 Lactobacillus mindensis Species 0.000 description 2
- 241001635183 Lactobacillus nagelii Species 0.000 description 2
- 241000468580 Lactobacillus namurensis Species 0.000 description 2
- 241000938545 Lactobacillus nantensis Species 0.000 description 2
- 241001097694 Lactobacillus nodensis Species 0.000 description 2
- 241000908019 Lactobacillus oeni Species 0.000 description 2
- 241000191684 Lactobacillus otakiensis Species 0.000 description 2
- 241000216456 Lactobacillus panis Species 0.000 description 2
- 241001105994 Lactobacillus parabrevis Species 0.000 description 2
- 241000186605 Lactobacillus paracasei Species 0.000 description 2
- 241000218587 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei Species 0.000 description 2
- 241000183331 Lactobacillus paracasei subsp. tolerans Species 0.000 description 2
- 241001643449 Lactobacillus parakefiri Species 0.000 description 2
- 241001448603 Lactobacillus perolens Species 0.000 description 2
- 244000164595 Lactobacillus plantarum subsp plantarum Species 0.000 description 2
- 235000012523 Lactobacillus plantarum subsp plantarum Nutrition 0.000 description 2
- 241000488807 Lactobacillus pobuzihii Species 0.000 description 2
- 241000191682 Lactobacillus rapi Species 0.000 description 2
- 241000254697 Lactobacillus rhamnosus HN001 Species 0.000 description 2
- 241000602084 Lactobacillus rossiae Species 0.000 description 2
- 241001582341 Lactobacillus sakei subsp. carnosus Species 0.000 description 2
- 241001582342 Lactobacillus sakei subsp. sakei Species 0.000 description 2
- 241001424195 Lactobacillus satsumensis Species 0.000 description 2
- 241000915257 Lactobacillus secaliphilus Species 0.000 description 2
- 241000024101 Lactobacillus senmaizukei Species 0.000 description 2
- 241000755777 Lactobacillus siliginis Species 0.000 description 2
- 241001599932 Lactobacillus spicheri Species 0.000 description 2
- 241000751212 Lactobacillus vaccinostercus Species 0.000 description 2
- 241000194038 Lactococcus plantarum Species 0.000 description 2
- 241000192003 Leuconostoc carnosum Species 0.000 description 2
- 241000201465 Leuconostoc gelidum subsp. gasicomitatum Species 0.000 description 2
- 241000054885 Leuconostoc holzapfelii Species 0.000 description 2
- 241000779470 Leuconostoc inhae Species 0.000 description 2
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 2
- 241001468195 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Species 0.000 description 2
- 241001468196 Leuconostoc pseudomesenteroides Species 0.000 description 2
- 108010058398 Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 101100167135 Mus musculus Chil3 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 102400000058 Neuregulin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000556 Neuregulin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101800000675 Neuregulin-2 Proteins 0.000 description 2
- 101800000673 Neuregulin-3 Proteins 0.000 description 2
- 101800002641 Neuregulin-4 Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241000191996 Pediococcus pentosaceus Species 0.000 description 2
- 241000604136 Pediococcus sp. Species 0.000 description 2
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 2
- 102100022668 Pro-neuregulin-2, membrane-bound isoform Human genes 0.000 description 2
- 102100022659 Pro-neuregulin-3, membrane-bound isoform Human genes 0.000 description 2
- 102100022658 Pro-neuregulin-4, membrane-bound isoform Human genes 0.000 description 2
- 241000186428 Propionibacterium freudenreichii Species 0.000 description 2
- 241001521757 Propionibacterium sp. Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001147738 Streptococcus alactolyticus Species 0.000 description 2
- 241001291896 Streptococcus constellatus Species 0.000 description 2
- 241000191981 Streptococcus cristatus Species 0.000 description 2
- 241000194056 Streptococcus iniae Species 0.000 description 2
- 241001617354 Streptococcus lutetiensis Species 0.000 description 2
- 241001501869 Streptococcus pasteurianus Species 0.000 description 2
- 241000252846 Streptococcus phocae Species 0.000 description 2
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 2
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N UTP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 150000001294 alanine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000037365 barrier function of the epidermis Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 description 2
- 208000018631 connective tissue disease Diseases 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- JSRLJPSBLDHEIO-SHYZEUOFSA-N dUMP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 JSRLJPSBLDHEIO-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000019305 fibroblast migration Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 101150050080 hil-4 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 102000057308 human HGF Human genes 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000003407 interleukin 1 receptor blocking agent Substances 0.000 description 2
- 239000006356 lactobacillus kefiranofaciens Substances 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- DWPCPZJAHOETAG-UHFFFAOYSA-N meso-lanthionine Natural products OC(=O)C(N)CSCC(N)C(O)=O DWPCPZJAHOETAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000002864 mononuclear phagocyte Anatomy 0.000 description 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 2
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229940055019 propionibacterium acne Drugs 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 229940116157 regranex Drugs 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 230000005995 skin dysfunction Effects 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 2
- 230000000287 tissue oxygenation Effects 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 210000004981 tumor-associated macrophage Anatomy 0.000 description 2
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N uridine-triphosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 230000037314 wound repair Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-SZSCBOSDSA-N 2-[(1s)-1,2-dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxy-2h-furan-5-one Chemical compound OC[C@H](O)C1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-SZSCBOSDSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- 241000201856 Abiotrophia defectiva Species 0.000 description 1
- 241000248408 Acidipropionibacterium microaerophilum Species 0.000 description 1
- 241000744575 Acidipropionibacterium olivae Species 0.000 description 1
- 241001156739 Actinobacteria <phylum> Species 0.000 description 1
- 241000500353 Aerococcus urinaeequi Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- WSVLPVUVIUVCRA-KPKNDVKVSA-N Alpha-lactose monohydrate Chemical compound O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WSVLPVUVIUVCRA-KPKNDVKVSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 101100067974 Arabidopsis thaliana POP2 gene Proteins 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Natural products OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023927 Asparagine synthetase [glutamine-hydrolyzing] Human genes 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000193815 Atopobium minutum Species 0.000 description 1
- 241000193838 Atopobium parvulum Species 0.000 description 1
- 241000193836 Atopobium rimae Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101100325906 Bacillus subtilis (strain 168) ganA gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241001170035 Bifidobacterium actinocoloniiforme Species 0.000 description 1
- 241001433202 Bifidobacterium aesculapii Species 0.000 description 1
- 241000186014 Bifidobacterium angulatum Species 0.000 description 1
- 241001134770 Bifidobacterium animalis Species 0.000 description 1
- 241000186013 Bifidobacterium asteroides Species 0.000 description 1
- 241000270740 Bifidobacterium biavatii Species 0.000 description 1
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 description 1
- 241001170034 Bifidobacterium bohemicum Species 0.000 description 1
- 241001484815 Bifidobacterium bombi Species 0.000 description 1
- 241001312348 Bifidobacterium boum Species 0.000 description 1
- 241000270851 Bifidobacterium callitrichos Species 0.000 description 1
- 241000186011 Bifidobacterium catenulatum Species 0.000 description 1
- 241001495388 Bifidobacterium choerinum Species 0.000 description 1
- 241000186022 Bifidobacterium coryneforme Species 0.000 description 1
- 241000017153 Bifidobacterium crudilactis Species 0.000 description 1
- 241000186021 Bifidobacterium cuniculi Species 0.000 description 1
- 241000529097 Bifidobacterium faecale Species 0.000 description 1
- 241001312346 Bifidobacterium gallicum Species 0.000 description 1
- 241001312342 Bifidobacterium gallinarum Species 0.000 description 1
- 241000186156 Bifidobacterium indicum Species 0.000 description 1
- 241001089584 Bifidobacterium kashiwanohense Species 0.000 description 1
- 241000186153 Bifidobacterium magnum Species 0.000 description 1
- 241001312344 Bifidobacterium merycicum Species 0.000 description 1
- 241000186150 Bifidobacterium minimum Species 0.000 description 1
- 241000741991 Bifidobacterium mongoliense Species 0.000 description 1
- 241000094800 Bifidobacterium moukalabense Species 0.000 description 1
- 241001134772 Bifidobacterium pseudocatenulatum Species 0.000 description 1
- 241000186148 Bifidobacterium pseudolongum Species 0.000 description 1
- 241000186160 Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum Species 0.000 description 1
- 241001430331 Bifidobacterium pseudolongum subsp. pseudolongum Species 0.000 description 1
- 241001626537 Bifidobacterium psychraerophilum Species 0.000 description 1
- 241001312954 Bifidobacterium pullorum Species 0.000 description 1
- 241000433603 Bifidobacterium reuteri Species 0.000 description 1
- 241001312356 Bifidobacterium ruminantium Species 0.000 description 1
- 241001311520 Bifidobacterium saeculare Species 0.000 description 1
- 241000270732 Bifidobacterium saguini Species 0.000 description 1
- 241000042873 Bifidobacterium scardovii Species 0.000 description 1
- 241000270734 Bifidobacterium stellenboschense Species 0.000 description 1
- 241001302264 Bifidobacterium subtile Species 0.000 description 1
- 241001034431 Bifidobacterium thermacidophilum Species 0.000 description 1
- 241001554901 Bifidobacterium thermacidophilum subsp. porcinum Species 0.000 description 1
- 241001337874 Bifidobacterium thermacidophilum subsp. thermacidophilum Species 0.000 description 1
- 241001468229 Bifidobacterium thermophilum Species 0.000 description 1
- 241001101872 Bifidobacterium tsurumiense Species 0.000 description 1
- 241000194002 Blautia hansenii Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206593 Carnobacterium divergens Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- 101710113593 Chitinase-like protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 241001430226 Clavibacter tessellarius Species 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 241001517050 Corynebacterium accolens Species 0.000 description 1
- 241001517048 Corynebacterium afermentans Species 0.000 description 1
- 241001288670 Corynebacterium afermentans subsp. afermentans Species 0.000 description 1
- 241001288679 Corynebacterium afermentans subsp. lipophilum Species 0.000 description 1
- 241000158508 Corynebacterium amycolatum Species 0.000 description 1
- 241001134827 Corynebacterium aquatimens Species 0.000 description 1
- 241001182440 Corynebacterium aquilae Species 0.000 description 1
- 241000147183 Corynebacterium argentoratense Species 0.000 description 1
- 241001423306 Corynebacterium atypicum Species 0.000 description 1
- 241000168411 Corynebacterium auris Species 0.000 description 1
- 241000422843 Corynebacterium auriscanis Species 0.000 description 1
- 241001508000 Corynebacterium bovis Species 0.000 description 1
- 241000186248 Corynebacterium callunae Species 0.000 description 1
- 241000334677 Corynebacterium camporealensis Species 0.000 description 1
- 241001014386 Corynebacterium canis Species 0.000 description 1
- 241000900546 Corynebacterium capitovis Species 0.000 description 1
- 241000644075 Corynebacterium caspium Species 0.000 description 1
- 241000316904 Corynebacterium ciconiae Species 0.000 description 1
- 241001233907 Corynebacterium confusum Species 0.000 description 1
- 241000520076 Corynebacterium coyleae Species 0.000 description 1
- 241001495432 Corynebacterium cystitidis Species 0.000 description 1
- 241000446654 Corynebacterium deserti Species 0.000 description 1
- 241000272936 Corynebacterium doosanense Species 0.000 description 1
- 241000880909 Corynebacterium durum Species 0.000 description 1
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 1
- 241001670793 Corynebacterium epidermidicanis Species 0.000 description 1
- 241001547340 Corynebacterium falsenii Species 0.000 description 1
- 241000899401 Corynebacterium felinum Species 0.000 description 1
- 241000369160 Corynebacterium frankenforstense Species 0.000 description 1
- 241000521406 Corynebacterium freiburgense Species 0.000 description 1
- 241000940098 Corynebacterium freneyi Species 0.000 description 1
- 241001117273 Corynebacterium glaucum Species 0.000 description 1
- 241000291063 Corynebacterium halotolerans Species 0.000 description 1
- 241000881314 Corynebacterium hansenii Species 0.000 description 1
- 241000015585 Corynebacterium humireducens Species 0.000 description 1
- 241000993880 Corynebacterium ilicis Species 0.000 description 1
- 241000024402 Corynebacterium imitans Species 0.000 description 1
- 241000334646 Corynebacterium kroppenstedtii Species 0.000 description 1
- 241001495430 Corynebacterium kutscheri Species 0.000 description 1
- 241000363697 Corynebacterium lactis Species 0.000 description 1
- 241000334665 Corynebacterium lipophiloflavum Species 0.000 description 1
- 241000095130 Corynebacterium lubricantis Species 0.000 description 1
- 241001517018 Corynebacterium macginleyi Species 0.000 description 1
- 241000778959 Corynebacterium marinum Species 0.000 description 1
- 241001236603 Corynebacterium maris Species 0.000 description 1
- 241000393344 Corynebacterium massiliense Species 0.000 description 1
- 241000334674 Corynebacterium mastitidis Species 0.000 description 1
- 241000158496 Corynebacterium matruchotii Species 0.000 description 1
- 241001518260 Corynebacterium minutissimum Species 0.000 description 1
- 241000577797 Corynebacterium mucifaciens Species 0.000 description 1
- 241001186315 Corynebacterium mustelae Species 0.000 description 1
- 241001518268 Corynebacterium mycetoides Species 0.000 description 1
- 241000959710 Corynebacterium nuruki Species 0.000 description 1
- 241000334676 Corynebacterium phocae Species 0.000 description 1
- 241000622596 Corynebacterium pilbarense Species 0.000 description 1
- 241001495433 Corynebacterium pilosum Species 0.000 description 1
- 241000158499 Corynebacterium propinquum Species 0.000 description 1
- 241001522132 Corynebacterium pseudodiphtheriticum Species 0.000 description 1
- 241000186225 Corynebacterium pseudotuberculosis Species 0.000 description 1
- 241000353352 Corynebacterium pyruviciproducens Species 0.000 description 1
- 241000186246 Corynebacterium renale Species 0.000 description 1
- 241001408068 Corynebacterium resistens Species 0.000 description 1
- 241000024400 Corynebacterium riegelii Species 0.000 description 1
- 241001313296 Corynebacterium simulans Species 0.000 description 1
- 241000334675 Corynebacterium singulare Species 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241001425837 Corynebacterium sphenisci Species 0.000 description 1
- 241001098119 Corynebacterium spheniscorum Species 0.000 description 1
- 241000297296 Corynebacterium sputi Species 0.000 description 1
- 241000186308 Corynebacterium stationis Species 0.000 description 1
- 241001182439 Corynebacterium suicordis Species 0.000 description 1
- 241000334945 Corynebacterium sundsvallense Species 0.000 description 1
- 241000030491 Corynebacterium terpenotabidum Species 0.000 description 1
- 241000960580 Corynebacterium testudinoris Species 0.000 description 1
- 241000895659 Corynebacterium thomssenii Species 0.000 description 1
- 241000393342 Corynebacterium timonense Species 0.000 description 1
- 241001518263 Corynebacterium tuberculostearicum Species 0.000 description 1
- 241000892281 Corynebacterium tuscaniense Species 0.000 description 1
- 241000918600 Corynebacterium ulcerans Species 0.000 description 1
- 241000269824 Corynebacterium ulceribovis Species 0.000 description 1
- 241000586985 Corynebacterium ureicelerivorans Species 0.000 description 1
- 241000737368 Corynebacterium uterequi Species 0.000 description 1
- 241001518266 Corynebacterium vitaeruminis Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 201000007336 Cryptococcosis Diseases 0.000 description 1
- 241000501458 Cultus Species 0.000 description 1
- 241000057744 Curtobacterium flaccumfaciens pv. poinsettiae Species 0.000 description 1
- 241001464975 Cutibacterium granulosum Species 0.000 description 1
- PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 101000777158 Danio rerio Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 45 Proteins 0.000 description 1
- UQBOJOOOTLPNST-UHFFFAOYSA-N Dehydroalanine Chemical compound NC(=C)C(O)=O UQBOJOOOTLPNST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012679 Diabetic neuropathic ulcer Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150039808 Egfr gene Proteins 0.000 description 1
- 241001430190 Eggerthia catenaformis Species 0.000 description 1
- 241000207358 Enterococcus alcedinis Species 0.000 description 1
- 241000032329 Enterococcus aquimarinus Species 0.000 description 1
- 241000580502 Enterococcus asini Species 0.000 description 1
- 241001468179 Enterococcus avium Species 0.000 description 1
- 241001315449 Enterococcus caccae Species 0.000 description 1
- 241000784223 Enterococcus camelliae Species 0.000 description 1
- 241001304086 Enterococcus canintestini Species 0.000 description 1
- 241001522957 Enterococcus casseliflavus Species 0.000 description 1
- 241000178336 Enterococcus cecorum Species 0.000 description 1
- 241000194028 Enterococcus columbae Species 0.000 description 1
- 241001343527 Enterococcus devriesei Species 0.000 description 1
- 241001410057 Enterococcus diestrammenae Species 0.000 description 1
- 241000178337 Enterococcus dispar Species 0.000 description 1
- 241001462445 Enterococcus eurekensis Species 0.000 description 1
- 241000194030 Enterococcus gallinarum Species 0.000 description 1
- 241001026002 Enterococcus italicus Species 0.000 description 1
- 241001235140 Enterococcus malodoratus Species 0.000 description 1
- 241000009792 Enterococcus moraviensis Species 0.000 description 1
- 241000520134 Enterococcus mundtii Species 0.000 description 1
- 241000750231 Enterococcus olivae Species 0.000 description 1
- 241001672794 Enterococcus phoeniculicola Species 0.000 description 1
- 241000783253 Enterococcus plantarum Species 0.000 description 1
- 241000178338 Enterococcus pseudoavium Species 0.000 description 1
- 241001235138 Enterococcus raffinosus Species 0.000 description 1
- 241001617376 Enterococcus ratti Species 0.000 description 1
- 241000268619 Enterococcus rivorum Species 0.000 description 1
- 241000238765 Enterococcus rotai Species 0.000 description 1
- 241001220049 Enterococcus saccharolyticus subsp. saccharolyticus Species 0.000 description 1
- 241000500203 Enterococcus saccharolyticus subsp. taiwanensis Species 0.000 description 1
- 241000339361 Enterococcus silesiacus Species 0.000 description 1
- 241001495410 Enterococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241000194027 Enterococcus sulfureus Species 0.000 description 1
- 241000339090 Enterococcus termitis Species 0.000 description 1
- 241001026958 Enterococcus thailandicus Species 0.000 description 1
- 241000637011 Enterococcus ureilyticus Species 0.000 description 1
- 241000223163 Enterococcus viikkiensis Species 0.000 description 1
- 241000169378 Enterococcus villorum Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000194000 Faecalicoccus pleomorphus Species 0.000 description 1
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 208000003790 Foot Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000186777 Fructobacillus fructosus Species 0.000 description 1
- 241000223723 Fructobacillus pseudoficulneus Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108030000889 Galactoside O-acetyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 241001147749 Gemella morbillorum Species 0.000 description 1
- 241001524188 Glutamicibacter nicotianae Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000201858 Granulicatella adiacens Species 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 108010072039 Histidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101100118549 Homo sapiens EGFR gene Proteins 0.000 description 1
- 101500025952 Homo sapiens Hepatocyte growth factor alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101500025960 Homo sapiens Hepatocyte growth factor beta chain Proteins 0.000 description 1
- 101001052490 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 1
- 101000635958 Homo sapiens Transforming growth factor beta-2 proprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000712663 Homo sapiens Transforming growth factor beta-3 proprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000760243 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 45 Proteins 0.000 description 1
- 101001074035 Homo sapiens Zinc finger protein GLI2 Proteins 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 description 1
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102100025947 Insulin-like growth factor II Human genes 0.000 description 1
- 241000186778 Kandleria vitulina Species 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000116699 Lactobacillus acidophilus NCFM Species 0.000 description 1
- 235000009195 Lactobacillus acidophilus NCFM Nutrition 0.000 description 1
- 241000186716 Lactobacillus agilis Species 0.000 description 1
- 241001507052 Lactobacillus algidus Species 0.000 description 1
- 241000186714 Lactobacillus amylophilus Species 0.000 description 1
- 241000168643 Lactobacillus amylotrophicus Species 0.000 description 1
- 241000186712 Lactobacillus animalis Species 0.000 description 1
- 241000316282 Lactobacillus antri Species 0.000 description 1
- 241001370007 Lactobacillus apinorum Species 0.000 description 1
- 241000905791 Lactobacillus apis Species 0.000 description 1
- 241000954248 Lactobacillus apodemi Species 0.000 description 1
- 241000861652 Lactobacillus aquaticus Species 0.000 description 1
- 241001324861 Lactobacillus aviarius subsp. aviarius Species 0.000 description 1
- 241000159904 Lactobacillus backii Species 0.000 description 1
- 241000186723 Lactobacillus bifermentans Species 0.000 description 1
- 241000632581 Lactobacillus bombi Species 0.000 description 1
- 241000631121 Lactobacillus brantae Species 0.000 description 1
- 241000489238 Lactobacillus camelliae Species 0.000 description 1
- 241000176719 Lactobacillus capillatus Species 0.000 description 1
- 241000902616 Lactobacillus ceti Species 0.000 description 1
- 241001061980 Lactobacillus coleohominis Species 0.000 description 1
- 241000838743 Lactobacillus concavus Species 0.000 description 1
- 241000202368 Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis Species 0.000 description 1
- 241000202367 Lactobacillus coryniformis subsp. torquens Species 0.000 description 1
- 241000707676 Lactobacillus curieae Species 0.000 description 1
- 241001060359 Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus Species 0.000 description 1
- 241001196971 Lactobacillus delbrueckii subsp. jakobsenii Species 0.000 description 1
- 241001670837 Lactobacillus delbrueckii subsp. sunkii Species 0.000 description 1
- 241000976279 Lactobacillus equi Species 0.000 description 1
- 241001305661 Lactobacillus equicursoris Species 0.000 description 1
- 241001026944 Lactobacillus equigenerosi Species 0.000 description 1
- 241000268611 Lactobacillus faecis Species 0.000 description 1
- 241000831741 Lactobacillus farraginis Species 0.000 description 1
- 241001016125 Lactobacillus floricola Species 0.000 description 1
- 241001457879 Lactobacillus florum Species 0.000 description 1
- 241000015236 Lactobacillus fornicalis Species 0.000 description 1
- 241000370757 Lactobacillus fuchuensis Species 0.000 description 1
- 241000859743 Lactobacillus furfuricola Species 0.000 description 1
- 241000319245 Lactobacillus futsaii Species 0.000 description 1
- 241000316283 Lactobacillus gastricus Species 0.000 description 1
- 241000968129 Lactobacillus gigeriorum Species 0.000 description 1
- 241000866684 Lactobacillus graminis Species 0.000 description 1
- 241000383778 Lactobacillus hamsteri Species 0.000 description 1
- 241000914114 Lactobacillus hayakitensis Species 0.000 description 1
- 241000762075 Lactobacillus heilongjiangensis Species 0.000 description 1
- 241001370013 Lactobacillus helsingborgensis Species 0.000 description 1
- 241001147748 Lactobacillus heterohiochii Species 0.000 description 1
- 241001204812 Lactobacillus hokkaidonensis Species 0.000 description 1
- 241000968140 Lactobacillus hominis Species 0.000 description 1
- 241001324870 Lactobacillus iners Species 0.000 description 1
- 241001640457 Lactobacillus intestinalis Species 0.000 description 1
- 241001534330 Lactobacillus iwatensis Species 0.000 description 1
- 241000316281 Lactobacillus kalixensis Species 0.000 description 1
- 241001407638 Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens Species 0.000 description 1
- 241001369794 Lactobacillus kimbladii Species 0.000 description 1
- 241001108870 Lactobacillus kimchicus Species 0.000 description 1
- 241000795439 Lactobacillus kimchiensis Species 0.000 description 1
- 241000674808 Lactobacillus kitasatonis Species 0.000 description 1
- 241001167943 Lactobacillus koreensis Species 0.000 description 1
- 241001370012 Lactobacillus kullabergensis Species 0.000 description 1
- 241001339775 Lactobacillus kunkeei Species 0.000 description 1
- 241001134654 Lactobacillus leichmannii Species 0.000 description 1
- 241000520745 Lactobacillus lindneri Species 0.000 description 1
- 241000751214 Lactobacillus malefermentans Species 0.000 description 1
- 241001370011 Lactobacillus mellifer Species 0.000 description 1
- 241001369797 Lactobacillus mellis Species 0.000 description 1
- 241001369796 Lactobacillus melliventris Species 0.000 description 1
- 241000186871 Lactobacillus murinus Species 0.000 description 1
- 241000645171 Lactobacillus nasuensis Species 0.000 description 1
- 241000962388 Lactobacillus nenjiangensis Species 0.000 description 1
- 241000176718 Lactobacillus odoratitofui Species 0.000 description 1
- 241001150383 Lactobacillus oligofermentans Species 0.000 description 1
- 241000186784 Lactobacillus oris Species 0.000 description 1
- 241000929684 Lactobacillus oryzae Species 0.000 description 1
- 241000024618 Lactobacillus ozensis Species 0.000 description 1
- 241000692795 Lactobacillus pantheris Species 0.000 description 1
- 241000972176 Lactobacillus paracollinoides Species 0.000 description 1
- 241000831743 Lactobacillus parafarraginis Species 0.000 description 1
- 241000351429 Lactobacillus pasteurii Species 0.000 description 1
- 241000442265 Lactobacillus paucivorans Species 0.000 description 1
- 244000150562 Lactobacillus plantarum subsp argentoratensis Species 0.000 description 1
- 235000002054 Lactobacillus plantarum subsp argentoratensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000309833 Lactobacillus porcinae Species 0.000 description 1
- 241000220680 Lactobacillus psittaci Species 0.000 description 1
- 241000692139 Lactobacillus rennini Species 0.000 description 1
- 241000673991 Lactobacillus rodentium Species 0.000 description 1
- 241001438705 Lactobacillus rogosae Species 0.000 description 1
- 241000186870 Lactobacillus ruminis Species 0.000 description 1
- 241000318646 Lactobacillus saerimneri Species 0.000 description 1
- 241000241526 Lactobacillus saniviri Species 0.000 description 1
- 241001609971 Lactobacillus selangorensis Species 0.000 description 1
- 241000241523 Lactobacillus senioris Species 0.000 description 1
- 241000186867 Lactobacillus sharpeae Species 0.000 description 1
- 241000364915 Lactobacillus shenzhenensis Species 0.000 description 1
- 241000769541 Lactobacillus sicerae Species 0.000 description 1
- 241000894443 Lactobacillus silagei Species 0.000 description 1
- 241000962441 Lactobacillus songhuajiangensis Species 0.000 description 1
- 241000758161 Lactobacillus sucicola Species 0.000 description 1
- 241001643448 Lactobacillus suebicus Species 0.000 description 1
- 241000191665 Lactobacillus sunkii Species 0.000 description 1
- 241000390527 Lactobacillus taiwanensis Species 0.000 description 1
- 241000489237 Lactobacillus thailandensis Species 0.000 description 1
- 241000692136 Lactobacillus tucceti Species 0.000 description 1
- 241000316280 Lactobacillus ultunensis Species 0.000 description 1
- 241000908018 Lactobacillus uvarum Species 0.000 description 1
- 241000186783 Lactobacillus vaginalis Species 0.000 description 1
- 241001456524 Lactobacillus versmoldensis Species 0.000 description 1
- 241000692127 Lactobacillus vini Species 0.000 description 1
- 241000617441 Lactobacillus xiangfangensis Species 0.000 description 1
- 241000044168 Lactobacillus yonginensis Species 0.000 description 1
- 241000577554 Lactobacillus zeae Species 0.000 description 1
- 241000110060 Lactobacillus zymae Species 0.000 description 1
- 241000760369 Lactococcus chungangensis Species 0.000 description 1
- 241000500213 Lactococcus formosensis Species 0.000 description 1
- 241000371451 Lactococcus fujiensis Species 0.000 description 1
- 235000013471 Lactococcus lactis subsp hordniae Nutrition 0.000 description 1
- 241001183079 Lactococcus lactis subsp. hordniae Species 0.000 description 1
- 241000118321 Lactococcus lactis subsp. tructae Species 0.000 description 1
- 108700025703 Lactococcus lactis usp45 Proteins 0.000 description 1
- 241000194039 Lactococcus piscium Species 0.000 description 1
- 241001352589 Lactococcus taiwanensis Species 0.000 description 1
- 241000192005 Leuconostoc fallax Species 0.000 description 1
- 241000192131 Leuconostoc gelidum Species 0.000 description 1
- 241001502733 Leuconostoc gelidum subsp. aenigmaticum Species 0.000 description 1
- 241001502734 Leuconostoc gelidum subsp. gelidum Species 0.000 description 1
- 241000965142 Leuconostoc kimchii Species 0.000 description 1
- 241000406209 Leuconostoc mesenteroides subsp. suionicum Species 0.000 description 1
- 241001143168 Leuconostoc miyukkimchii Species 0.000 description 1
- 241000302255 Leuconostoc palmae Species 0.000 description 1
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 101150046652 M2 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004322 M2 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 201000009053 Neurodermatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 241000192134 Oenococcus oeni Species 0.000 description 1
- 241000927555 Olsenella uli Species 0.000 description 1
- 241001311537 Parascardovia denticolens Species 0.000 description 1
- 241000192001 Pediococcus Species 0.000 description 1
- 241000177720 Pediococcus argentinicus Species 0.000 description 1
- 241001331799 Pediococcus cellicola Species 0.000 description 1
- 241001117188 Pediococcus claussenii Species 0.000 description 1
- 241000500340 Pediococcus damnosus Species 0.000 description 1
- 241001331797 Pediococcus ethanolidurans Species 0.000 description 1
- 241000186191 Pediococcus inopinatus Species 0.000 description 1
- 241000529920 Pediococcus parvulus Species 0.000 description 1
- 241000489854 Pediococcus siamensis Species 0.000 description 1
- 241000324734 Pediococcus stilesii Species 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 240000004760 Pimpinella anisum Species 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000009989 Posterior Leukoencephalopathy Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101710181699 Proepiregulin Proteins 0.000 description 1
- 241000519651 Propionibacterium acidifaciens Species 0.000 description 1
- 241000266193 Propionibacterium australiense Species 0.000 description 1
- 241000935970 Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii Species 0.000 description 1
- 241000186340 Propioniferax innocua Species 0.000 description 1
- 241001464976 Propionimicrobium lymphophilum Species 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 241000186336 Pseudopropionibacterium propionicum Species 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000611345 Rathayibacter iranicus Species 0.000 description 1
- 241001467568 Rathayibacter rathayi Species 0.000 description 1
- 241001467570 Rathayibacter tritici Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000187694 Rhodococcus fascians Species 0.000 description 1
- 241000158504 Rhodococcus hoagii Species 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100123851 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HER1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001311541 Scardovia inopinata Species 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 description 1
- 101710201479 Splicing factor, proline- and glutamine-rich Proteins 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000194011 Streptococcus acidominimus Species 0.000 description 1
- 241000194008 Streptococcus anginosus Species 0.000 description 1
- 241000176094 Streptococcus australis Species 0.000 description 1
- 241001364812 Streptococcus castoreus Species 0.000 description 1
- 241001088442 Streptococcus constellatus subsp. constellatus Species 0.000 description 1
- 241000170730 Streptococcus constellatus subsp. viborgensis Species 0.000 description 1
- 241000194043 Streptococcus criceti Species 0.000 description 1
- 241001439113 Streptococcus cuniculi Species 0.000 description 1
- 241001238710 Streptococcus danieliae Species 0.000 description 1
- 241001205347 Streptococcus dentapri Species 0.000 description 1
- 241001073123 Streptococcus dentasini Species 0.000 description 1
- 241000514895 Streptococcus dentirousetti Species 0.000 description 1
- 241000602664 Streptococcus devriesei Species 0.000 description 1
- 241001472859 Streptococcus didelphis Species 0.000 description 1
- 241000193992 Streptococcus downei Species 0.000 description 1
- 241000194042 Streptococcus dysgalactiae Species 0.000 description 1
- 241000422857 Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae Species 0.000 description 1
- 241000264435 Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis Species 0.000 description 1
- 241000009877 Streptococcus entericus Species 0.000 description 1
- 241000194048 Streptococcus equi Species 0.000 description 1
- 241001339231 Streptococcus equi subsp. equi Species 0.000 description 1
- 241001366926 Streptococcus equi subsp. ruminatorum Species 0.000 description 1
- 241000120569 Streptococcus equi subsp. zooepidemicus Species 0.000 description 1
- 241000194049 Streptococcus equinus Species 0.000 description 1
- 241000194050 Streptococcus ferus Species 0.000 description 1
- 241000379946 Streptococcus gallinaceus Species 0.000 description 1
- 241001288016 Streptococcus gallolyticus Species 0.000 description 1
- 241000520162 Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus Species 0.000 description 1
- 241000194026 Streptococcus gordonii Species 0.000 description 1
- 241001364819 Streptococcus halichoeri Species 0.000 description 1
- 241000114457 Streptococcus henryi Species 0.000 description 1
- 241001152524 Streptococcus hongkongensis Species 0.000 description 1
- 241000194047 Streptococcus hyointestinalis Species 0.000 description 1
- 241001345024 Streptococcus hyovaginalis Species 0.000 description 1
- 241001617359 Streptococcus infantarius subsp. infantarius Species 0.000 description 1
- 241000960363 Streptococcus infantis Species 0.000 description 1
- 241000194046 Streptococcus intermedius Species 0.000 description 1
- 241001308339 Streptococcus lactarius Species 0.000 description 1
- 241000536679 Streptococcus loxodontisalivarius Species 0.000 description 1
- 241000194045 Streptococcus macacae Species 0.000 description 1
- 241000134187 Streptococcus marimammalium Species 0.000 description 1
- 241001256220 Streptococcus massiliensis Species 0.000 description 1
- 241000573651 Streptococcus merionis Species 0.000 description 1
- 241000333075 Streptococcus minor Species 0.000 description 1
- 241001134658 Streptococcus mitis Species 0.000 description 1
- 241000508710 Streptococcus moroccensis Species 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 101100380695 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) atpB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000194025 Streptococcus oralis Species 0.000 description 1
- 241000575578 Streptococcus oralis subsp. dentisani Species 0.000 description 1
- 241000782300 Streptococcus oralis subsp. tigurinus Species 0.000 description 1
- 241001073133 Streptococcus orisasini Species 0.000 description 1
- 241000783883 Streptococcus orisuis Species 0.000 description 1
- 241001635315 Streptococcus ovis Species 0.000 description 1
- 241000193991 Streptococcus parasanguinis Species 0.000 description 1
- 241000194055 Streptococcus parauberis Species 0.000 description 1
- 241000960362 Streptococcus peroris Species 0.000 description 1
- 241001507957 Streptococcus phocae subsp. salmonis Species 0.000 description 1
- 241001634041 Streptococcus pluranimalium Species 0.000 description 1
- 241000814304 Streptococcus plurextorum Species 0.000 description 1
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000313511 Streptococcus porci Species 0.000 description 1
- 241000194053 Streptococcus porcinus Species 0.000 description 1
- 241001378063 Streptococcus porcorum Species 0.000 description 1
- 241001403829 Streptococcus pseudopneumoniae Species 0.000 description 1
- 241001400864 Streptococcus pseudoporcinus Species 0.000 description 1
- 241000194052 Streptococcus ratti Species 0.000 description 1
- 241000508709 Streptococcus rifensis Species 0.000 description 1
- 241000377364 Streptococcus rubneri Species 0.000 description 1
- 241001649855 Streptococcus rupicaprae Species 0.000 description 1
- 241000536680 Streptococcus saliviloxodontae Species 0.000 description 1
- 241000194023 Streptococcus sanguinis Species 0.000 description 1
- 241000750138 Streptococcus sinensis Species 0.000 description 1
- 241000193987 Streptococcus sobrinus Species 0.000 description 1
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 description 1
- 241000555264 Streptococcus thoraltensis Species 0.000 description 1
- 241001579696 Streptococcus troglodytae Species 0.000 description 1
- 241000194054 Streptococcus uberis Species 0.000 description 1
- 241001345023 Streptococcus urinalis Species 0.000 description 1
- 241001571934 Streptococcus ursoris Species 0.000 description 1
- 241000194051 Streptococcus vestibularis Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100156073 Sulfurisphaera tokodaii (strain DSM 16993 / JCM 10545 / NBRC 100140 / 7) atpD gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 description 1
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 description 1
- 241000500332 Tetragenococcus halophilus Species 0.000 description 1
- 241001235136 Tetragenococcus solitarius Species 0.000 description 1
- 101100111413 Thermoanaerobacter pseudethanolicus (strain ATCC 33223 / 39E) lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000186064 Trueperella pyogenes Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000204063 Tsukamurella paurometabola Species 0.000 description 1
- 102100024718 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 45 Human genes 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 108010073925 Vascular Endothelial Growth Factor B Proteins 0.000 description 1
- 108010073919 Vascular Endothelial Growth Factor D Proteins 0.000 description 1
- 102100038217 Vascular endothelial growth factor B Human genes 0.000 description 1
- 102100038234 Vascular endothelial growth factor D Human genes 0.000 description 1
- 241000186675 Weissella confusa Species 0.000 description 1
- 241000186838 Weissella halotolerans Species 0.000 description 1
- 241000186837 Weissella kandleri Species 0.000 description 1
- 241000186864 Weissella minor Species 0.000 description 1
- 241000192133 Weissella paramesenteroides Species 0.000 description 1
- 241000186882 Weissella viridescens Species 0.000 description 1
- 102100035558 Zinc finger protein GLI2 Human genes 0.000 description 1
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001645946 [Corynebacterium] beticola Species 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000010398 acute inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 101150105110 atpF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150103189 atpG gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000008003 autocrine effect Effects 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004666 bacterial spore Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 229940118852 bifidobacterium animalis Drugs 0.000 description 1
- 229940002008 bifidobacterium bifidum Drugs 0.000 description 1
- 229940004120 bifidobacterium infantis Drugs 0.000 description 1
- 229940009289 bifidobacterium lactis Drugs 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000009045 body homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 201000002816 chronic venous insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 210000003690 classically activated macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000037319 collagen production Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001944 cysteine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- UJLXYODCHAELLY-XLPZGREQSA-N dTDP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 UJLXYODCHAELLY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000002999 depolarising effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000008846 dynamic interplay Effects 0.000 description 1
- 230000001463 effect on reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000013931 endocrine signaling Effects 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 230000013764 eosinophil chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 102000052833 human CSF1R Human genes 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 1
- 102000057877 human IGF2 Human genes 0.000 description 1
- 102000045373 human MAPK1 Human genes 0.000 description 1
- 102000057397 human MAPK3 Human genes 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 102000053431 human TGFB3 Human genes 0.000 description 1
- 229940068924 human insulin-like growth factor 2 Drugs 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 230000010057 immune-inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940068935 insulin-like growth factor 2 Drugs 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 101150086432 lacA gene Proteins 0.000 description 1
- 229940004208 lactobacillus bulgaricus Drugs 0.000 description 1
- 229960001021 lactose monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000002783 mesonephros Anatomy 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N methyl cyclopropanecarboxylate Chemical compound COC(=O)C1CC1 PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 230000037324 pain perception Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- VYXXMAGSIYIYGD-NWAYQTQBSA-N propan-2-yl 2-[[[(2R)-1-(6-aminopurin-9-yl)propan-2-yl]oxymethyl-(pyrimidine-4-carbonylamino)phosphoryl]amino]-2-methylpropanoate Chemical compound CC(C)OC(=O)C(C)(C)NP(=O)(CO[C@H](C)Cn1cnc2c(N)ncnc12)NC(=O)c1ccncn1 VYXXMAGSIYIYGD-NWAYQTQBSA-N 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000012048 reactive intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 1
- 230000020341 sensory perception of pain Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004215 skin function Effects 0.000 description 1
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 108010043542 streptin Proteins 0.000 description 1
- 229940115920 streptococcus dysgalactiae Drugs 0.000 description 1
- 229940115921 streptococcus equinus Drugs 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 229940115922 streptococcus uberis Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 201000002282 venous insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2026—IL-4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
- C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
- A61K2035/115—Probiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dermatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
Изобретение относится к популяции рекомбинантных пробиотических бактерий для лечения и/или облегчения заживления раны, фармацевтической композиции для лечения и/или облегчения заживления раны, содержащей указанную популяцию, а также способу лечения и/или облегчения заживления раны с использованием указанной композиции или популяции. Предложенная популяция рекомбинантных пробиотических бактерий содержит последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую(ие) первый гетерологичный фактор, последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую(ие) второй гетерологичный фактор, и предпочтительно последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую(ие) третий гетерологичный фактор, где клетки указанной популяции содержат последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую(ие) первый гетерологичный фактор, и/или последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую(ие) второй гетерологичный фактор, и/или предпочтительно последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую(ие) третий гетерологичный фактор. При этом указанный первый фактор, указанный второй фактор и указанный третий фактор функционально различаются. При этом указанный первый фактор представляет собой фактор роста, при этом указанный второй фактор выбран из группы, состоящей из М2-поляризующих факторов, и предпочтительно указанный третий фактор выбран из группы, состоящей из М2-поляризующих факторов и факторов роста. Фармацевтическая композиция для лечения и/или облегчения заживления раны содержит эффективное количество указанной популяции рекомбинантных пробиотических бактерий и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество. Способ лечения и/или облегчения заживления раны включает этап введения указанной популяции рекомбинантных пробиотических бактерий или указанной композиции нуждающемуся в этом индивидууму. Изобретение является эффективным в лечении и/или облегчении заживления ран. 3 н. и 22 з.п. ф-лы, 3 табл., 5 пр., 35 ил.
Description
В соответствии с настоящим изобретением предложены рекомбинантные пробиотические бактерии, в частности для применения при лечении воспалительного нарушения функции кожи, а также способ лечения воспалительного нарушения функции кожи.
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно международной заявке РСТ/ЕР2015/052345, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Макрофаги являются одним из типов лейкоцитов и могут быть обнаружены практически во всех тканях. Макрофаги играют важную роль в неспецифической защите, а также помогают инициировать специфичные защитные механизмы путем привлечения других иммунных клеток, таких как лимфоциты.
Макрофаги существуют в виде резидентных тканеспецифичных макрофагов или происходят из циркулирующих моноцитов крови, которые дифференцируются в макрофаги.
Макрофаги имеют различные состояния активации. Известны два различных по характеру состояния активации: классически активированные макрофаги, которые также обозначаются как M1-поляризованные макрофаги, и активированные иными способами макрофаги, которые также обозначаются как М2-поляризованные макрофаги.
M1-поляризованные макрофаги включают иммунные эффекторные клетки с активным воспалительным фенотипом. M1-поляризованные макрофаги характеризуются высокими уровнями экспрессии провоспалительных цитокинов, выработкой больших количеств реакционноспособных промежуточных радикалов азота и кислорода, усилением ответа, опосредованного Th1-клетками, а также сильной противомикробной и противоопухолевой активностью.
М2-поляризованные макрофаги имеют противовоспалительный фенотип. Как полагают, М2-поляризованные макрофаги участвуют в сдерживании распространения паразитов, а также в усилении ремоделирования тканей и прогрессирования опухоли, помимо этого они обладают иммунорегуляторными функциями. М2-макрофаги также характеризуются эффективной фагоцитарной активностью, высокими уровнями экспрессии поглощающих молекул (скавенджеров).
Мононуклеарные фагоциты в активированном состоянии характеризуются пластичностью и гибкостью. Например, фенотип M1-поляризованных или М2-поляризованных макрофагов можно полностью изменить в условиях in vitro и in vivo.
Макрофаги могут изменять несколько раз профиль секреции цитокинов и хемокинов в зависимости от стимула в их микроокружении. Например, первичные М1-поляризованные макрофаги человека могут быть повторно поляризованы под действием секретируемых факторов, выделяемых их партнерами, в М2-поляризованные макрофаги, и наоборот, в условиях in vitro и in vivo.
Помимо обеспечения первой линии защиты от патогенов мононуклеарные фагоциты вовлечены в ремоделирование и восстановление тканей при гомеостатических состояниях и состояниях при повреждении.
Более того, макрофаги вносят значимый вклад в контроль над воспалением, при этом M1-поляризованные макрофаги вовлечены в инициирование и поддержание воспаления, тогда как М2-поляризованные макрофаги связаны с контролированием процесса хронического воспаления.
Например, макрофаги подвергаются динамическим изменениям на разных этапах заживления ран. M1-поляризованные макрофаги опосредуют повреждение тканей и инициируют воспалительные реакции. Помимо этого, на ранних этапах реакции заживления раны макрофаги, инфильтрующие кожу, проявляют фенотип М2-поляризации и поддерживают образование высоковаскуляризованной, обогащенной клетками грануляционной ткани.
Воспаление можно охарактеризовать как острое воспаление при таких состояниях как сепсис, травма и заживление ран или хроническое воспаление, например, при таких заболеваниях, как ревматоидный артрит, язвенный колит, болезнь Крона и т.д. Многие другие заболевания, такие как рак, различные виды диабета, атеросклероз, болезнь Альцгеймера и ожирение, также связаны с воспалением, контроль над которым нарушен.
Острый воспалительный ответ включает каскад событий, опосредованных большим количеством клеток и молекул, которые обнаруживают проникающие патогены или поврежденные ткани, посылают сигналы и привлекают другие клетки и молекулы, устраняют провоцирующие агенты и, наконец, восстанавливают гомеостаз организма.
При сепсисе и травме такой ответ сопровождается макроскопическими проявлениями, такими как лихорадка и повышенная частота сердечных сокращений. В других тканях воспаление проявляется как покраснение, отек и боль.
Прямая циклическая связь воспаления, которое ведет к повреждению/дисфункции, что в свою очередь вызывает воспаление, может привести к стойкому, нерегулируемому воспалению, которое способствует нарушению функции органов и летальному исходу. Для надлежащего заживления тканей необходим тщательно регулируемый воспалительный ответ.
Восстановление целостности кожи и гомеостаза после повреждений требует сложного и динамичного взаимодействия эпителиальных и мезенхимальных клеток с резидентными тканеспецифичными клетками и привлекаемыми гемопоэтическими клетками для выполнения последовательных этапов реакции заживления воспаления, формирования ткани и созревания. На раннем этапе реакции заживления преобладает воспалительная фаза, которая характеризуется локальной активацией врожденной иммунной системы, что приводит к немедленному притоку нейтрофилов с последующей инфильтрацией моноцитами крови, которые дифференцируются в макрофаги.
Промежуточный этап реакции заживления включает фазу формирования ткани, которая характеризуется развитием грануляционной ткани, заполняющей раневое пространство в дерме. Образование грануляционной ткани включает проникновение эндотелиальных клеток, приводящее к ангиогенезу, приток фибробластов и накопление вспомогательных макрофагов.
Депонирование временного внеклеточного раневого матрикса облегчает адгезию, миграцию и пролиферацию клеток. Помимо этого, сложные эпидермально-мезенхимальные взаимодействия на краю раны стимулируют пролиферацию и миграцию кератиноцитов для восстановления эпидермального барьера.
Образование грануляционной ткани продолжается до тех пор, пока раневое пространство не будет заполнено, и покрывающий эпидермис не будет восстановлен. После того, как образование эпидермального барьера завершено, начинается завершающий этап реакции заживления, который характеризуется созреванием ткани. Во время фазы созревания ткани грануляционная ткань трансформируется в рубцовую ткань.
Во время восстановления кожи врожденный иммунный ответ резидентных клеток, а также привлеченных воспалительных клеток, вовлечен в борьбу с проникающими микробами, способствует очищению раны, но также может поддерживать процесс восстановления, путем высвобождая ряда факторов роста.
Однако из-за высвобождения провоспалительных и цитотоксических медиаторов неконтролируемая активность макрофагов также может нанести ущерб восстановлению тканей.
Несбалансированное воспаление, характеризующееся увеличением количества макрофагов, является признаком ослабленной реакции восстановления при заболеваниях человека, что приводит к образованию незаживающих хронических ран. Дополнительными факторами, которые вовлечены в образование незаживающих хронических ран, являются, например, диабет, заболевания вен или артерий, инфекция и нарушения обмена веществ в пожилом возрасте.
Существуют различные способы лечения хронических ран, включая применение антибиотиков для лечения инфекций, очистку ран, вакуумные повязки и оксигенацию.
Другие способы включают, например, применение факторов роста.
Например, бекаплермин представляет собой рекомбинантный фактор роста тромбоцитов человека ВВ. Бекаплермин продается под торговым названием регранекс (Regranex) и показан для лечения диабетических невропатических язв нижних конечностей, которые распространяются в подкожную ткань или за ее пределы и имеют надлежащее кровоснабжение.
Бекаплермин также показан в качестве вспомогательного средства, но не замещающего препарата, для ухода за язвами стопы, включая первичную хирургическую обработку раны, уменьшение пролежней и борьбу с инфекцией.
Однако в ретроспективном групповом пострегистрационном исследовании у пациентов, которых лечили с использованием трех или более тюбиков геля регранекс, наблюдали повышенную смертность на фоне развития рака.
Другим используемым фактором роста является рекомбинантный фактор роста эпидермиса человека, который продается под торговым названием гель Реген-D (REGEN-D) и применяется для лечения хронических диабетических язв стопы.
Трафермин также представляет собой рекомбинантный фактор роста фибробластов человека 2, который продается под торговым названием «Fiblast Spray». Трафермин используется для лечения пролежневых язв и других язв кожи, включая ожоговые язвы и черные язвы.
После ежедневного применения трафермина или плацебо в течение шести недель пациентами, имеющими хроническую невропатическую диабетическую язву стопы, размер язвы оценивали посредством еженедельного клинического обследования и компьютеризированных визуализирующих методов исследований. Еженедельное уменьшение периметра и площади язв было одинаковым в обеих группах, также как и скорость линейного распространения, начиная с момента включения в исследование и до шестой недели после начала лечения. Процент заживленной области в конце исследования также достоверно не различался. Согласно Richards et al. (1995) местное применение трафермина не имело преимуществ по сравнению с плацебо для лечения хронической невропатической диабетической язвы стопы.
Два заменителя дермы, содержащих эмбриональные клетки человека, которые выделяют различные факторы роста после внесения в пораженную раневую область, также доступны коммерчески.
Заменитель дермы дермаграфт состоит из фибробластов, внеклеточного матрикса и биоабсорбируемого каркаса. Дермаграф производят из фибробластов человека, полученных из донорской крайней плоти новорожденного.
Во время процесса производства, фибробласты человека высевают на биоабсорбируемый полиглактиновый каркас.
Коммерчески доступный заменитель дермы аплиграф содержит два типа клеток, полученных из крайней плоти новорожденного. Живые кератиноциты и фибробласты человека встраивают в раневой коллагеновый матрикс типа 1.
Недостатком вышеупомянутых заменителей дермы является сравнительно высокая цена, обусловленная производственным процессом. Например, материнскую кровь проверяют для выявления присутствия вирусов человека, таких как вирус иммунодефицита 1 и 2, вирус гепатита В, вирус гепатита С, сифилис, Т-лимфотропный вирус человека типа 1 и 2, а также вирус Эпштейна-Барр.
Еще один коммерчески доступный препарат продается под торговой маркой прокурен (Procuren). Прокурен представляет собой состав для заживления ран, полученный из тромбоцитов, предназначенный для лечения незаживающих ран. Прокурен представляет собой аутологичный продукт, полученный из тромбоцитов, который готовят из образца крови пациента.
Однако отсутствует достаточное количество доказательств эффективности продуктов, полученных из аутологичных тромбоцитов, включая аутологичный фактор роста тромбоцитов, для лечения хронических незаживающих ран или лечения других состояний, таких как острые хирургические раны.
Помимо этого, количество факторов роста, обеспечиваемых вышеупомянутыми заменителями дермы, а также продуктами, полученными из аутологичных тромбоцитов, значительно варьирует в зависимости от качества исходного материала.
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы обеспечить альтернативный способ лечения воспалительного нарушения функции кожи, в частности хронического воспалительного нарушения функции кожи, который обеспечивает легкое применение эффективных факторов при хроническом, предпочтительно воспалительном, нарушении функции кожи.
Помимо этого для лечения воспалительного нарушения функции кожи необходимо обеспечить контролируемое количество эффективных факторов, способствующих заживлению.
Задача настоящего изобретения решается путем обеспечения рекомбинантных пробиотических бактерий в соответствии с п. 1, содержащих (а) последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую первый гетерологичный фактор, (а) последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую второй гетерологичный фактор, и предпочтительно (а) последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую третий гетерологичный фактор, при условии, что указанный первый фактор, указанный второй фактор и указанный третий фактор функционально различаются,
при этом указанный первый фактор представляет собой фактор роста, при этом указанный второй фактор выбран из группы, состоящей из М2-поляризующих факторов, и при этом предпочтительно указанный третий фактор выбран из группы, состоящей из М2-поляризующих факторов и факторов роста.
Предпочтительно указанные рекомбинантные пробиотические бактерии по п. 1 содержат по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый гетерологичный фактор, по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй гетерологичный фактор, и по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую третий гетерологичный фактор, при условии, что указанный первый фактор, указанный второй фактор и указанный третий фактор функционально различаются,
при этом указанный первый фактор представляет собой фактор роста, при этом указанный второй фактор выбран из группы, состоящей из М2-поляризующих факторов, и при этом указанный третий фактор выбран из группы, состоящей из М2-поляризующих факторов и факторов роста.
Предпочтительные варианты реализации рекомбинантных пробиотических бактерий раскрыты в зависимых пунктах 2-22 формулы изобретения.
Задача настоящего изобретения дополнительно решается путем обеспечения рекомбинантных пробиотических бактерий в соответствии с п. 17 для применения в лечении воспалительного нарушения функции кожи, предпочтительно хронического воспалительного нарушения функции кожи, причем указанные рекомбинантные пробиотические бактерии содержат:
по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый гетерологичный фактор, и по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй гетерологичный фактор,
при этом указанный первый фактор представляет собой фактор роста, при этом указанный второй фактор выбран из группы, состоящей из М2-поляризующих факторов.
Предпочтительно указанные рекомбинантные пробиотические бактерии по п. 17 содержат по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый гетерологичный фактор, по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй гетерологичный фактор, и по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую третий гетерологичный фактор, при условии, что указанный первый фактор, указанный второй фактор и указанный третий фактор функционально различаются,
при этом указанный первый фактор представляет собой фактор роста, при этом указанный второй фактор выбран из группы, состоящей из М2-поляризующих факторов, и при этом указанный третий фактор выбран из группы, состоящей из М2-поляризующих факторов и факторов роста.
Задача настоящего изобретения дополнительно решается путем обеспечения способа лечения воспалительного нарушения функции кожи, предпочтительно хронического воспалительного нарушения функции кожи, в соответствии с п. 23, при этом указанный способ включает этап введения рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1-22 индивидууму, страдающему указанным нарушением функции кожи.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что рекомбинантные пробиотические бактерии, содержащие вышеуказанные последовательности нуклеиновых кислот, могут быть использованы в лечении воспалительного нарушения функции кожи, предпочтительно хронического воспалительного нарушения функции кожи.
Предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения раскрыты в зависимых пунктах формулы изобретения.
В соответствии с настоящим изобретением термин «функционально отличающийся фактор» или «функционально отличающиеся друг от друга» означает, что соответствующие факторы предпочтительно связываются с различными рецепторами и/или активируют разные вторичные мессенджеры в клетке-мишени. Вторичными мессенджерами являются внутриклеточные сигнальные молекулы, высвобождаемые клеткой, чтобы инициировать физиологические изменения.
В соответствии с настоящим изобретением термин «функциональный аналог» фактора обозначает агент, который связывается с идентичным рецептором (рецепторами), как и соответствующий фактор, и предпочтительно активирует идентичные вторичные мессенджеры в клетке-мишени.
Например, функциональный аналог низина связывается с NisK, который действует как рецептор для зрелой молекулы низина или его функционального аналога, и предпочтительно приводит к последующему фосфорилированию NisR. Фосфорилированный NisR индуцирует транскрипцию с соответствующего промотора низина.
Предпочтительно идентичность аминокислотной последовательности «функционального аналога» указанного первого, второго и третьего гетерологичного фактора составляет по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 93%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере 97%.
В соответствии с настоящим изобретением термин «гетерологичный фактор» означает фактор, предпочтительно белок, который не встречается в природе или не экспрессируется указанными пробиотическими бактериями.
«Функциональный аналог» также может быть обозначен как биологически подобный.
При упоминании «гетерологичного фактора (факторов)» в целом или при упоминании конкретного «гетерологичного фактора (факторов)», таких как, например, ФРФ-2, ИЛ-4, КСФ-1 и т.д., подразумевают, что указанный термин включает их функциональный аналог(аналоги).
Рекомбинантные пробиотические бактерии, содержащие вышеупомянутые последовательности нуклеиновых кислот, способны постоянно и/или в результате индукции вырабатывать уникальную комбинацию соответствующего первого, второго и предпочтительно третьего гетерологичных факторов путем транскрипции и трансляции соответствующих последовательностей нуклеиновых кислот.
Указанная уникальная комбинация факторов включает по меньшей мере один фактор роста и по меньшей мере один М2-поляризующий фактор.
Предпочтительно указанная уникальная комбинация факторов включает фактор роста, первый М2-поляризующий фактор и второй М2-поляризующий фактор, отличный от указанного первого М2-поляризующего фактора. В другом варианте, указанная уникальная комбинация факторов содержит первый фактор роста, М2-поляризующий фактор и второй фактор роста, отличный от указанного первого фактора роста.
Рекомбинантные пробиотические бактерии предпочтительно обеспечивают доставку нескольких из по меньшей мере двух, предпочтительно по меньшей мере трех гетерологичных факторов по п. 1 в пораженную ткань, модулируя тем самым местную иммунную систему и обеспечивая заживление.
Предпочтительно рекомбинантные пробиотические бактерии высвобождают соответствующий первый гетерологичный фактор и второй гетерологичный фактор, а также предпочтительно третий гетерологичный фактор, после применения при указанном воспалительном нарушении функции кожи, предпочтительно указанном хроническом воспалительном нарушении функции кожи.
Помимо этого рекомбинантные пробиотические бактерии, используемые в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно обеспечивают постоянное высвобождение соответствующего первого гетерологичного фактора и второго гетерологичного фактора, а также предпочтительно третьего гетерологичного фактора, после внесения в очаг воспалительного нарушения функции кожи, предпочтительно хронического воспалительного нарушения функции кожи.
Следовательно, в настоящем изобретении предложен значительно улучшенный, более безопасный и экономически эффективный способ лечения субъектов, страдающих указанным воспалительным нарушением функции кожи, предпочтительно указанным хроническим воспалительным нарушением функции кожи.
Предпочтительно соответствующий первый, второй и третий гетерологичные факторы, после высвобождения из бактерий, проявляют биологическую активность, которая поддерживает заживление указанного воспалительного нарушения функции кожи, предпочтительно хронического воспалительного нарушения функции кожи.
Первый гетерологичный фактор представляет собой фактор роста.
Предпочтительно указанный фактор роста выбран из группы, состоящей из факторов роста фибробластов (ФРФ), факторов роста эндотелия сосудов (ФРЭС), эпидермальных факторов роста (ЭФР), инсулиноподобных факторов роста (ИФР), факторов роста тромбоцитов (ФРТ), трансформирующего фактора роста бета (ТФР-бета), фактора роста нервов (ФРН), активинов, их функциональных аналогов, их биологических аналогов и их смесей.
Следует понимать, что функциональные аналоги вышеупомянутых или нижеупомянутых факторов или их биологические аналоги также могут быть использованы в пределах объема настоящего изобретения, как заявлено в формуле изобретения.
Факторы роста фибробластов - это семейство факторов роста, которые участвуют в ангиогенезе, заживлении ран и различных эндокринных путях передачи сигналов.
У человека было выявлено 22 члена семейства ФРФ, ФРФ-1 - ФРФ-14 и ФРФ-16 - ФРФ-23, которые можно применять в настоящем изобретении.
ФРФ-1 - ФРФ-10 связываются с рецепторами факторов роста фибробластов (FGFR).
Фактор роста фибробластов 1 также известен как кислотный фактор роста фибробластов. Фактор роста фибробластов 2 также известен как основный фактор роста фибробластов. Помимо этого, фактор роста фибробластов 7 также известен как фактор роста кератиноцитов (KGF), и фактор роста фибробластов 10 также известен фактор роста кератиноцитов 2 (KGF-2).
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения факторы роста фибробластов выбраны из группы, состоящей из ФРФ-1, ФРФ-2, ФРФ-3, ФРФ-4, ФРФ-5, ФРФ-6, ФРФ-7, ФРФ-8, ФРФ-9, ФРФ-10 и их смесей, более предпочтительно ФРФ-1, ФРФ-2, ФРФ-7, ФРФ-10 и их смесей, более предпочтительно ФРФ-2, ФРФ-7, их функциональных аналогов, их биологических аналогов и их смесей, еще более предпочтительно ФРФ-2.
Например, ФРФ-1 и ФРФ-2 могут стимулировать ангиогенез и являются митогенными для нескольких типов клеток, присутствующих в очаге воспалительного нарушения функции кожи, включая фибробласты и кератиноциты. Помимо этого, ФРФ-7 может стимулировать повторную эпителизацию раны паракринным способом.
Фактор роста фибробластов 2 (ФРФ-2), предпочтительно фактор роста фибробластов человека 2 (чФРФ-2), вовлечен в различные биологические процессы, включая заживление ран и рост опухоли.
мРНК этого гена содержит множественные сайты полиаденилирования и подвергается альтернативной трансляции с кодонов, отличных от AUG, и AUG-старт кодонов, что приводит к образованию пяти различных изоформ с различными свойствами. Изоформы, транслированные с кодонов, отличных от AUG, локализованы в ядре и отвечают за интракринное действие, тогда как AUG-инициированная форма в основном является цитозольной и отвечает за паракринное и аутокринное действие ФРФ-2.
Нуклеиновая последовательность мРНК фактора роста фибробластов человека 2 (чФРФ-2) доступна под номером доступа NCBI NM_002006.4. Соответствующая аминокислотная последовательность AUG-изомера доступна под номером доступа NCBI NP_001997.5, а также под номером доступа UniProt Р09038, версия 182, и также представлена на Фигуре 22а.
Препробелок включает пробелок, который содержит аминокислоты 1-142 препробелка, и зрелый пептид фактора роста фибробластов человека 2, который содержит аминокислоты 143-288 препробелка.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения фактор роста фибробластов 2 содержит одну или по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 26-30, еще более предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 28 представлена на Фигуре 22b.
Инсулиноподобные факторы роста (ИФР) представляют собой белки с высокой степенью сходства с инсулином. Инсулиноподобные факторы роста включают два белка ИФР-1 и ИФР-2, которые могут быть использованы в настоящем изобретении.
Семейство эпидермальных факторов роста (ЭФР) представляет собой белки с очень сходными структурными и функциональными характеристиками и включает такие белки как эпидермальный фактор роста (ЭФР), связывающий гепарин ЭФР-подобный фактор роста (ГС-ЭФР), трансформирующий фактор роста альфа (ТФР-α), амфирегулин (AR), эпирегулин (EPR), эпиген (EPGN), бетацеллюллин (ВТС), нейрегулин-1 (NRG1), нейрегулин-2 (NRG2), нейрегулин-3 (NRG3) и нейрегулин-4 (NRG4), предпочтительно эпидермальный фактор роста (ЭФР), связывающий гепарин ЭФР-подобный фактор роста (ГС-ЭФР), трансформирующий фактор роста-α (ТФР-α), амфирегулин (AR), эпирегулин (EPR), эпиген (EPGN) и бетацеллюлин (ВТС), еще более предпочтительно эпидермальный фактор роста (ЭФР), связывающий гепарин ЭФР-подобный фактор роста (ГС-ЭФР) и трансформирующий фактор роста-α (ТФР-α), которые можно использовать в настоящем изобретении.
Эпидермальный фактор роста (ЭФР), предпочтительно эпидермальный фактор роста человека (чЭФР), стимулирует рост различных эпидермальных и эпителиальных тканей в условиях in vivo и в условиях in vitro и некоторых фибробластов в культуре клеток. Помимо этого, чЭФР оказывает значительное влияние на дифференциацию конкретных клеток в условиях in vivo и является мощным митогенным фактором для множества культивируемых клеток эктодермального и мезодермального происхождения.
Эпидермальный фактор роста человека существует по меньшей мере в трех изоформах, полученных путем альтернативного сплайсинга.
Аминокислотная последовательность препробелка изоформы 1 эпидермального фактора роста человека доступна под номером доступа NCBI NP_001954.1. Соответствующая нуклеиновая последовательность мРНК доступна под номером доступа NCBI NM_001963.2.
Препробелок изоформы 1 содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-22 препробелка, пропептид, который содержит аминокислоты 23-1207 препробелка, и зрелый пептид эпидермального фактора роста человека, который содержит аминокислоты 971-1023 препробелка.
Аминокислотная последовательность препробелка изоформы 2 эпидермального фактора роста человека доступна под номером доступа NCBI NP_001171601.1. Соответствующая нуклеиновая последовательность мРНК доступна под номером доступа NCBI NM_001178130.1. Аминокислотная последовательность препробелка изоформы 3 эпидермального фактора роста человека доступна под номером доступа NCBI NP_001171602.1. Соответствующая нуклеиновая последовательность мРНК доступна под номером доступа NCBI NM_001178131.1. Аминокислотные последовательности изоформ 1 и 3 эпидермального фактора роста человека также доступны под номером доступа UniProt Р01133, версия 180, и также представлены на Фигуре 25а-25с. Аминокислотная последовательность зрелого эпидермального фактора роста человека представлена на Фигуре 25d.
Связывающий гепарин ЭФР-подобный фактор роста (ГС-ЭФР), предпочтительно связывающий гепарин ЭФР-подобный фактор роста человека (чГС-ЭФР) является важным фактором роста при эпителизации, которая необходима для заживления кожной раны. чГС-ЭФР оказывает митогенное действие на кератиноциты и фибробласты, а также влияет на их миграцию. чГС-ЭФР также способствует восстановлению кожи и ангиогенезу, что необходимо для заживления ран. чГС-ЭФР является основным компонентом раневых жидкостей. чГС-ЭФР выделяется макрофагами, моноцитами и кератиноцитами. Помимо этого, связывание чГС-ЭФР с протеогликанами гепарансульфата на клеточной поверхности усиливает его митогенные способности, повышает скорость заживления ран кожи, уменьшает время заживления кожи после трансплантации кожи человека и способствует быстрому заживлению язв, ожогов и эпидермальных расколотых ран.
Аминокислотная последовательность препробелка связывающего гепарин ЭФР-подобного фактора роста человека доступна под номером доступа NCBI NP_001936.1. Соответствующая нуклеиновая последовательность мРНК доступна под номером доступа NCBI NM_001945.2.
Предшественник связывающего гепарин ЭФР-подобного фактора роста человека содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-19 предшественника, пробелок связывающего гепарин ЭФР-подобного фактора роста, который содержит аминокислоты 20-208 предшественника, и зрелый пептид эпидермального фактора роста человека, который содержит аминокислоты 63-148 предшественника.
Аминокислотная последовательность связывающего гепарин ЭФР-подобного фактора роста человека также доступна под номером доступа UniProt Q99075, версия 151, и также представлена на Фигуре 26а. Аминокислотная последовательность зрелого связывающего гепарин ЭФР-подобного фактора роста человека представлена на Фигуре 26b.
Трансформирующий фактор роста-α (ТФР-α), предпочтительно трансформирующий фактор роста-α человека (чТФР-α), может вырабатываться макрофагами, клетками головного мозга и кератиноцитами. чТФР-α индуцирует развитие эпителия. чТФР-α и чЭФР связываются с одним и тем же рецептором, рецептором эпидермального фактора роста (EGFR, ErbB-1, HER1 у человека). Связывание ТФР-α с EGFR может инициировать множество событий пролиферации клеток, включая заживление ран.
Трансформирующий фактор роста-α человека существует в виде по меньшей мере пяти изоформ, полученных путем альтернативного сплайсинга.
Аминокислотная последовательность препробелка изоформы 1 трансформирующего фактора роста альфа человека доступна под номером доступа NCBI NP_003227.1. Соответствующая нуклеиновая последовательность мРНК доступна под номером доступа NCBI NM_003236.2.
Предшественник изоформы 1 трансформирующего фактора роста альфа человека содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-23 предшественника, пробелок изоформы 1 трансформирующего фактора роста альфа, который содержит аминокислоты 24-160 предшественника, и зрелый пептид трансформирующего фактора роста альфа, который содержит аминокислоты 40-89 предшественника.
Аминокислотная последовательность препробелка изоформы 2 трансформирующего фактора роста альфа человека доступна под номером доступа NCBI NP_001093161.1. Соответствующая нуклеиновая последовательность мРНК доступна под номером доступа NCBI NM_001099691.1.
Аминокислотная последовательность препробелка изоформы 3 трансформирующего фактора роста альфа человека доступна под номером доступа NCBI NP_001295087.1. Соответствующая нуклеиновая последовательность мРНК доступна под номером доступа NCBI NM_001308158.1.
Аминокислотная последовательность препробелка изоформы 4 трансформирующего фактора роста альфа человека доступна под номером доступа NCBI NP_001295088.1. Соответствующая нуклеиновая последовательность мРНК доступна под номером доступа NCBI NM_001308159.1.
Аминокислотная последовательность препробелка изоформы 5 трансформирующего фактора роста альфа человека доступна под номером доступа NCBI AAF05090.1. Соответствующая нуклеиновая последовательность мРНК доступна под номером доступа NCBI AF 149097.1.
Аминокислотные последовательности предшественников изоформ 1 и 5 трансформирующего фактора роста альфа человека также доступны под номерами доступа UniProt Р01135, версия 168, и представлены на Фигурах 27а-27е. Аминокислотная последовательность зрелого трансформирующего фактора роста альфа человека представлена на Фигуре 27f.
Амфирегулин (AREG), предпочтительно амфирегулин человека (hAREG), является другим лигандом рецептора ЭФР. Амфирегулин человека является аутокринным фактором роста, а также митогеном для широкого круга клеток-мишеней, включая астроциты, Шванновские клетки и фибробласты. Амфирегулин человека способствует пролиферации эпителиальных клеток.
Аминокислотная последовательность препробелка амфирегулина человека доступна под номером доступа NCBI NP_001648.1. Соответствующая нуклеиновая последовательность мРНК доступна под номером доступа NCBI NM_001657.3.
Предшественник препробелка амфирегулина человека содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-19 препробелка, пропептид, который содержит аминокислоты 20-100 препробелка, и зрелый пептид трансформирующего фактора роста альфа, который содержит аминокислоты 101-187 препробелка.
Аминокислотная последовательность препробелка амфирегулина человека также доступна под номером доступа UniProt P15514, версия 147, и также представлена на Фигуре 28а. Аминокислотная последовательность зрелого амфирегулина человека представлена на Фигуре 28b.
Эпирегулин (EPR), предпочтительно эпирегулин человека (hEPR), является лигандом рецептора ЭФР, который может стимулировать пролиферацию клеток и/или ангиогенез.
Аминокислотная последовательность препробелка эпирегулина человека доступна под номером доступа NCBI NP_001423.1. Соответствующая нуклеиновая последовательность мРНК доступна под номером доступа NCBI NM_001432.1.
Препробелок эпирегулина человека содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-29 препробелка, проэпирегулин, который содержит аминокислоты 30-169 препробелка, и зрелый эпирегулин, который содержит аминокислоты 60-108 препробелка.
Аминокислотная последовательность препробелка эпирегулина человека также доступна под номером доступа UniProt O14944, версия 146, и также представлена на Фигуре 29а. Аминокислотная последовательность зрелого эпирегулина человека представлена на Фигуре 29b.
Эпиген (EPGN), предпочтительно эпиген человека (hEPGN), способствует размножению эпителиальных клеток. Эпиген человека существует в виде по меньшей мере семи изоформ, полученных путем альтернативного сплайсинга.
Аминокислотная последовательность предшественника изоформы 1 эпигена человека доступна под номером доступа NCBI NP_001257918.1. Соответствующая нуклеиновая последовательность мРНК доступна под номером доступа NCBI NM_001270989.1.
Предшественник изоформы 1 эпигена человека содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-22 предшественника, и зрелый эпиген, который содержит аминокислоты 23-154 предшественника.
Аминокислотная последовательность предшественников изоформ 1-7 эпигена человека также доступна под номер доступа UniProt Q6UW88, версия 101, и также представлена на Фигуре 30a-30g. Аминокислотная последовательность зрелого эпигена человека представлена на Фигуре 30h.
Бетацеллюлин (ВТС), предпочтительно бетацеллюлин человека (hBTC), является фактором роста, который также связывается с рецептором эпидермального фактора роста и который синтезируется многими взрослыми тканями и культивируемыми клетками, включая клетки гладких мышц и эпителиальные клетки. Аминокислотная последовательность предшественника пробетацеллюлина человека доступна под номером доступа NCBI NP_001720.1. Соответствующая нуклеиновая последовательность мРНК доступна под номером доступа NCBI NM_001729.1.
Предшественник пробетацеллюлина человека содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-31 предшественника, пробетацеллюлин, который содержит аминокислоты 32-178 предшественника, и зрелый бетацеллюлин, который содержит аминокислоты 32-111 предшественника.
Аминокислотная последовательность предшественника пробетацеллюлина человека также доступна под номером доступа UniProt Р35070, версия 139, и также представлена на Фигуре 31а. Аминокислотная последовательность зрелого бетацеллюлина человека представлена на Фигуре 31b.
Инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1) также называется соматомедин С. Нуклеиновая последовательность мРНК ИФР-1 человека доступна под номером доступа NCBI NM_000618.2. Соответствующая аминокислотная последовательность доступна под номером доступа NCBI NP_000609.1, а также под номером доступа UniProt Р05019, версия 178.
Препробелок содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-21 препробелка, и пептид инсулиноподобного фактора роста 1 человека, который содержит аминокислоты 49-118 препробелка.
Нуклеиновая последовательность мРНК инсулиноподобного фактора роста человека 2 (чИФР-2) доступна под номером доступа NCBI NM_000612.4. Соответствующая аминокислотная последовательность препробелка инсулиноподобного фактора роста человека 2 доступна под номером доступа NCBI NP_000603.1, а также под номером доступа UniProt Р01344, версия 192.
Препробелок содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-24 препробелка, и зрелую цепь инсулиноподобного фактора роста 2, которая содержит аминокислоты 25-91 препробелка.
Семейство факторов роста эндотелия сосудов (ФРЭС) представляет собой группу факторов роста, которая включает ФРЭС-А, ФРЭС-В, ФРЭС-С, ФРЭС-D и плацентарный фактор роста (PGF), которые можно использовать в настоящем изобретении.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения фактор роста эндотелия сосудов представляет собой фактор роста эндотелия сосудов А (ФРЭС-А).
ФРЭС-А может индуцировать ангиогенез, васкулогенез и размножение эндотелиальных клеток.
Нуклеиновая последовательность мРНК фактора роста эндотелия сосудов человека А (чФРЭС-А) доступна под номером доступа NCBI NM_001025366.1. Соответствующая аминокислотная последовательность фактора роста эндотелия сосудов человека А доступна под номером доступа NCBI NP_001020537.2, а также под номером доступа UniProt Р15692, версия 197.
Белок-предшественник фактора роста эндотелия сосудов человека А содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-26 белка-предшественника, а также зрелый фактор роста эндотелия сосудов человека А, который содержит аминокислоты 27-232 белка-предшественника.
Фактор роста тромбоцитов (ФРТ) регулирует размножение и деление клеток. Фактор роста тромбоцитов человека (чФРТ) содержит четыре субъединицы, ФРТ-А, ФРТ-В, ФРТ-С и ФРТ-D, образующие гомо- или гетеродимеры соответствующих субъединиц, которые могут быть использованы в настоящем изобретении.
Предпочтительно фактор роста тромбоцитов представляет собой ФРТ-АА, ФРТ-ВВ, ФРТ-АВ, ФРТ-СС, ФРТ-DD или их смесь.
Более предпочтительно фактор роста тромбоцитов представляет собой димерный белок, состоящий из двух субъединиц ФРТ-А, димерный гликопротеин, состоящий из двух субъединиц ФРТ-В, димерный гликопротеин, состоящий из субъединицы ФРТ-А и субъединицы ФРТ-В или их смесь.
Нуклеиновая последовательность мРНК субъединицы А фактора роста тромбоцитов человека (чФРТ-А) доступна под номером доступа NCBI NM_002607.4. Соответствующая аминокислотная последовательность доступна под номером доступа NCBI NP_002598.4, а также под номером доступа UniProt Р04085, версия 159.
Соответствующий препробелок субъединицы А ФРТ человека кодирует сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-20 препробелка, и зрелую субъединицу А фактора роста тромбоцитов, которая содержит аминокислоты 87-211 препробелка.
Нуклеиновая последовательность мРНК субъединицы В фактора роста тромбоцитов человека (чФРТ) доступна под номером доступа NCBI NM_002608.1. Соответствующая аминокислотная последовательность препробелка субъединицы В фактора роста тромбоцитов человека доступна под номером доступа NCBI NP_002599.1, а также под номером доступа UniProt Р01127, версия 181.
Препробелок субъединицы В ФРТ человека кодирует сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-20 препробелка, и зрелую форму субъединица В фактора роста тромбоцитов человека, которая содержит аминокислоты 82-190 препробелка.
Фактор роста гепатоцитов (ФРГ) представляет собой фактор роста, который секретируется мезенхимными клетками и действует главным образом на эпителиальные клетки и эндотелиальные клетки, а также на гемопоэтические клетки-предшественники, и может быть использован в настоящем изобретении.
ФРГ секретируется в виде единого препробелка и расщепляется сериновой протеиназой на альфа-цепь массой 69 кДа и бета-цепь массой 34 кДа. Аминокислотная последовательность препробелка, а также соответствующей альфа-цепи и бета-цепи, представлена на Фигурах 23а-23с.
Нуклеиновая последовательность мРНК фактора роста гепатоцитов человека (чФРГ) доступна под номером доступа NCBI NM_000601.3. Соответствующая аминокислотная последовательность препробелка фактора роста гепатоцитов человека доступна под номером доступа NCBI NP_000592.3, а также под номером доступа UniProt Р14210, версия 186.
Препробелок содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-31 препробелка, альфа-цепь фактора роста гепатоцитов человека, которая содержит аминокислоты 32-494 препробелка, и бета-цепь фактора роста гепатоцитов человека, которая содержит аминокислоты 495-728 препробелка.
Трансформирующий фактор роста бета (ТФР-бета), предпочтительно трансформирующий фактор роста бета человека (чТФР-бета), представляет собой цитокин, который секретируется многими типами клеток, включая макрофаги.
ТФР-β существует в виде по меньшей мере трех изоформ, ТФР-β1, ТФР-β2 и ТФР-β3, которые могут быть использованы в настоящем изобретении. Аминокислотные последовательности соответствующих белков-предшественников и зрелых белков представлены на Фигурах 21a-21g.
Трансформирующий фактор роста человека β1 представляет собой секретируемый белок, который расщепляется на ассоциированный с латентностью пептид (LAP) и зрелый пептид ТФР-β1. Зрелый пептид может образовывать гомодимер или гетеродимер ТФР-β1 с другими членами семейства ТФР-β.
Нуклеиновая последовательность мРНК предшественника трансформирующего фактора роста β1 человека доступна под номером доступа NCBI NM_000660.4. Соответствующая аминокислотная последовательность доступна под номером доступа NCBI NP_000651.3 или номером доступа UniProt Р01137, версия 199.
Аминокислотная последовательность предшественника ТФР-β1 человека содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-29 белка-предшественника, ассоциированный с латентностью пептид, который содержит аминокислоты 30-278 белка-предшественника, и зрелый трансформирующий фактор роста β1, который содержит аминокислоты 279-390 белка-предшественника.
Трансформирующий фактор рост β2 (ТФР-β2), предпочтительно трансформирующий фактор роста человека β2 (чТФР-β2), представляет собой многофункциональный цитокин, который регулирует пролиферацию, дифференцировку, адгезию и миграцию многих типов клеток.
Были выявлены варианты транскрипта гена трансформирующего фактора роста β2 человека, полученные в результате альтернативного сплайсинга, которые кодируют две различные изоформы.
Нуклеиновая последовательность мРНК предшественника изоформы 1 трансформирующего фактора роста β2 человека доступна под номером доступа NCBI NM_001135599.3. Соответствующая аминокислотная последовательность доступна под номером доступа NCBI NP_001129071.1.
Предшественник изоформы 1 трансформирующего фактора роста β2 человека содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-20 белка-предшественника, ассоциированный с латентностью пептид, который содержит аминокислоты 21-302 белка-предшественника, и зрелый трансформирующий фактор роста β2, который содержит аминокислоты 303-414 белка-предшественника.
Нуклеиновая последовательность мРНК предшественника изоформы 2 трансформирующего фактора роста β2 человека доступна под номером доступа NCBI NM_003238.3. Соответствующая аминокислотная последовательность доступна под номером доступа NCBI NP_003229.1. Белок-предшественник содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-20 белка-предшественника, ассоциированный с латентностью пептид, который содержит аминокислоты 21-302 белка-предшественника, и зрелый пептид ТФР-β2, который содержит аминокислоты 303-414 белка-предшественника.
Аминокислотная последовательность трансформирующего фактора роста β2 дополнительно доступна под номером доступа UniProt Р61812, версия 128.
Трансформирующий фактор роста β3 (ТФР-β3), предпочтительно трансформирующий фактор роста β3 человека (чТФР-β3), представляет собой секретируемый цитокин, который участвует в эмбриогенезе и дифференцировке клеток.
Нуклеиновая последовательность мРНК белка-предшественника трансформирующего фактора роста β3 человека доступна под номером доступа NCBI NM_003239.3. Соответствующая аминокислотная последовательность доступна под номером доступа NCBI NP_003230.1, а также под номером доступа UniProt P10600, версия 170.
Белок-предшественник содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-23 белка-предшественника, ассоциированный с латентностью пептид, который содержит аминокислоты 24-30 белка-предшественника, и зрелый пептид трансформирующего фактора роста β3, который содержит аминокислоты 301-412 белка-предшественника.
Предпочтительно трансформирующий фактор роста β содержит одну или по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 19-25.
Активины представляют собой связанные дисульфидными связями димерные белки, первоначально очищенные из гонадных жидкостей как белки, которые стимулировали высвобождение гипофизарного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Активины обладают широким спектром биологической активности, включая индукцию мезодермы, дифференцировку нейрональных клеток, ремоделирование костной ткани, кроветворение и участие в функционировании репродуктивной системы.
Активины представляют собой гомодимеры или гетеродимеры различных изоформ бета-субъединицы, в то время как ингибины представляют собой гетеродимеры уникальной альфа-субъединицы и одной из различных бета-субъединиц.
Известны четыре бета-субъединицы, бета А, бета В, бета С и бета Е.
Второй гетерологичный фактор выбирают из группы, состоящей из M2-поляризующих факторов.
Предпочтительно М2-поляризующие факторы действуют на неполяризованные макрофаги, M1-поляризованные макрофаги, а также недифференцированные моноциты и другие клетки-предшественники макрофагов.
Также предпочтительно указанные М2-поляризующие факторы индуцируют М2-поляризацию неполяризованных макрофагов, M1-поляризованных макрофагов, а также недифференцированных моноцитов и других клеток-предшественников макрофагов.
Специалисту в данной области техники известно, что макрофаги могут претерпевать специфичную дифференцировку в зависимости от локального микроокружения тканей. По аналогии с поляризацией Т-хелперов типа 1 (TH1) и Т-хелперов типа 2 (TH2) были определены два различных состояния поляризации макрофагов: классически активированный (M1-поляризованный) фенотип макрофагов и активированный иным способом (М2-поляризованный) фенотип макрофагов.
Фенотип М2-поляризованных макрофагов может быть дополнительно разделен на подгруппы: М2а-поляризованный, M2b-поляризованный и М2с-поляризованный фенотип на основании профилей экспрессии генов.
M1-поляризованные и М2-поляризованные макрофаги имеют различные профили экспрессии хемокинов и рецепторов хемокинов.
M1-поляризованные макрофаги предпочтительно секретируют привлекающий TH1-клетки хемокиновый (СХС-мотив) лиганд 9 (CXCL9) и хемокиновый (СХС-мотив) лиганд 10 (CXCL10). М2-поляризованные макрофаги предпочтительно секретируют хемокиновый (СС-мотив) лиганд 17 (CCL17), хемокиновый (СС-мотив) лиганд 22 (CCL22) и хемокиновый (СС-мотив) лиганд 24 (CCL24).
М2-поляризующее действие гетерологичного фактора может быть определено, например, путем приведения неполяризованных макрофагов, M1-поляризованных макрофагов или клеток-предшественников макрофагов, предпочтительно моноцитов, в контакт с по меньшей мере одним М2-поляризующим фактором, с последующим определением экспрессии и/или секреции маркеров М2-поляризации.
Например, линия неполяризованных макрофагов мыши, линия M1-поляризованных макрофагов мыши или линия клеток-предшественников макрофагов мыши, предпочтительно линия моноцитов мыши, может быть приведена в контакт с по меньшей мере одним М2-поляризующим фактором с получением линии М2-поляризованных макрофагов мыши. М2-поляризацию линий макрофагов мыши можно детектировать, например, путем определения экспрессии следующих факторов: аргиназы 1 (ARG1), интерлейкина 10 (ИЛ-10), рецептора маннозы С типа 1 (MRC1) и Ym1, также называемого фактор хемотаксиса эозинофилов, полученный из Т-лимфоцитов (ECF-L) или хитиназаподобного белка 3 (Chil3). M1-поляризацию линий макрофагов мыши можно детектировать, например, путем определения экспрессии и/или высвобождения следующих факторов: фактора некроза опухолей альфа (ФНО-альфа, ФНО-α), интерлейкина 6 (ИЛ-6), хемокинового (СС-мотив) лиганда 2 (CCL2) и хемокинового (СС-мотив) лиганда 4 (CCL4).
Предпочтительно М2-поляризованные макрофаги человека получают из моноцитов человека, которые инкубируют в присутствии по меньшей мере одного М2-поляризующего фактора. М2-поляризацию макрофагов, полученных из моноцитов человека, можно детектировать, например, путем определения экспрессии и/или высвобождения следующих факторов: антагониста рецептора интерлейкина 1 (IL1RA), простагландина Е2 (ПГЕ2), интерлейкина 10 (ИЛ-10) и трансформирующего фактора роста бета (ТФР-β).
Недавно было показано, что макрофаги способны к обратной поляризации от М2 к M1 в условиях in vitro, и наоборот, в ответ на изменения уровней цитокинов в их микроокружении (Davis et al.(2013)). Помимо этого, изменение поляризации является быстрым и происходит на уровне экспрессии генов, белка, метаболита и противомикробной активности.
Макрофаги также представляют собой одну из основных популяций инфильтрирующих лимфоцитов, ассоциированных с солидными опухолями. Ассоциированные с опухолью макрофаги (ТАМ) играют важную роль в противоопухолевом иммунитете и обладают функциями, которые аналогичны функциям М2-поляризованных макрофагов, такой фенотип также обозначается M2d ТАМ поляризация.
Соответствующие факторы, которые необходимы для стимуляции и/или активации соответствующей поляризации (M1, М2а, M2b, М2с и M2d ТАМ), известны специалистам в данной области техники и раскрыты, например, в Нао et al. (2012) или Duluc et al. (2007).
Предпочтительно соответствующие вторые гетерологичные факторы и необязательно третий гетерологичный фактор индуцируют М2-поляризацию после экспрессии в указанных рекомбинантных пробиотических бактериях и высвобождаются из бактерий в очаг воспалительного, предпочтительно хронического воспалительного, нарушения функции кожи.
Противовоспалительные М2-поляризованные макрофаги затем предпочтительно стимулируют ангиогенез, депонирование соединительной ткани и заживление ран, что приводит к улучшению, предпочтительно излечению, указанного воспалительного, предпочтительно хронического воспалительного, нарушения функции кожи, которое лечат.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанный М2-поляризующий фактор выбран из группы, состоящей из М2-поляризующих цитокинов, М2-поляризующих хемокинов и их смесей. Предпочтительно указанный М2-поляризующий фактор индуцирует М2 с поляризацию.
Также предпочтительно указанный М2-поляризующий фактор выбран из группы, состоящей из интерлейкина 4 (ИЛ-4), интерлейкина 10 (ИЛ-10), интерлейкина 13 (ИЛ-13), колониестимулирующего фактора 1 (КСФ-1), интерлейкина 34 (ИЛ-34), их функциональных аналогов, их биологических аналогов, и их смесей, предпочтительно состоящей из интерлейкина 4 (ИЛ-4), интерлейкина 10 (ИЛ-10), интерлейкина 13 (ИЛ-13), колониестимулирующего фактора 1 (КСФ-1), интерлейкина 34 (ИЛ-34), а также их смесей, еще более предпочтительно из колониестимулирующего фактора 1 (КСФ-1), интерлейкина 34 (ИЛ-34), интерлейкина 4 (ИЛ-4), интерлейкина 13 (ИЛ-13), их функциональных аналогов, их биологических аналогов и их смесей, еще более предпочтительно из колониестимулирующего фактора 1 (КСФ-1), интерлейкина 34 (ИЛ-34), интерлейкина 4 (ИЛ-4), интерлейкина 13 (ИЛ-13), а также их смесей.
Интерлейкин 4 (ИЛ-4), предпочтительно интерлейкин 4 человека (чИЛ-4), представляет собой гшейотропный цитокин. Интерлейкин 4 является лигандом рецептора интерлейкина 4. Рецептор интерлейкина 4 также связывается с интерлейкином 13 (ИЛ-13) и может принимать участие во многих перекрывающихся функциях интерлейкина 4 и интерлейкина 13.
Также показано, что интерлейкин 4 (ИЛ-4) способен индуцировать пролиферацию. Помимо этого, интерлейкин 4 (ИЛ-4) индуцирует выработку коллагена.
Нуклеиновая последовательность мРНК предшественника изоформы 1 интерлейкина 4 человека доступна под номером доступа NCBI NM_000589.3. Соответствующая аминокислотная последовательность доступна под номером доступа NCBI NP_000580.1 и представлена на Фигуре 18а.
Нуклеиновая последовательность мРНК предшественника изоформы 2 интерлейкина 4 человека доступна под номером доступа NCBI NM_172348.2. Соответствующая аминокислотная последовательность доступна под номером доступа NCBI NP_758858.1 и представлена на Фигуре 18b.
Аминокислотная последовательность интерлейкина 4 человека также доступна под номером доступа UniProt Р05112, версия 178.
Аминокислотные последовательности содержат сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-24 предшественников изоформы 1 и изоформы 2 интерлейкина 4.
Предпочтительно интерлейкин 4 человека содержит одну или по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 10-14.
Интерлейкин 13 (ИЛ-13), предпочтительно интерлейкин 13 человека (чИЛ-13), представляет собой иммунорегудяторный цитокин, который вырабатывается главным образом активированными TH2 клетками.
Нуклеиновая последовательность мРНК предшественника интерлейкина 13 человека доступна под номером доступа NCBI NM_002188.2. Соответствующая аминокислотная последовательность доступна под номером доступа NCBI NP_002179.2, а также под номером доступа UniProt Р35225, версия 157, и представлена на Фигуре 20а.
Предшественник интерлейкина 13 содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-24 белка-предшественника интерлейкина 13, зарегистрированного под номером доступа UniProt Р35225, версия 157.
Предпочтительно интерлейкин 13 содержит одну или по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 17 и 18.
Интерлейкин 10 (ИЛ-10), предпочтительно интерлейкин 10 человека (чИЛ-10), представляет собой цитокин, который вырабатывается главным образом моноцитами и в меньшей степени лимфоцитами. Интерлейкин 10 оказывает плейотропное действие при иммунной регуляции и воспалении. Например, интерлейкин 10 подавляет экспрессию цитокинов TH1-лимфоцитами.
Нуклеиновая последовательность мРНК предшественника интерлейкина 10 человека доступна под номером доступа NCBI NM_000572.2. Соответствующая аминокислотная последовательность может быть найдена под номером доступа NCBI NP_000563.1, а также под номером доступа UniProt Р22301, версия 156, и представлена на Фигуре 19а.
Аминокислотная последовательность предшественника интерлейкина 10 человека включает сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-18 белка-предшественника интерлейкина 10 человека.
Предпочтительно интерлейкин 10 содержит одну или по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 15-16.
Колониестимулирующий фактор 1 (КСФ-1), который также известен как макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-КСФ), представляет собой цитокин, который контролирует выработку, дифференцировку и функцию макрофагов.
Вследствие альтернативного сплайсинга КСФ-1 человека существует в виде разных изоформ, которые могут быть использованы в настоящем изобретении.
Нуклеиновая последовательность мРНК изоформы 1 КСФ-1 человека, которая также называется предшественником изоформы А макрофагального колониестимулирующего фактора, доступна под номером доступа NCBI NM_000757.5. Соответствующая аминокислотная последовательность доступна под номером доступа NCBI NP_000748.3 и представлена на Фигуре 16а.
Нуклеиновая последовательность мРНК предшественника изоформы 2 КСФ-1 человека, которая также называется предшественником изоформы В макрофагального колониестимулирующего фактора 1 человека, доступна под номером доступа NCBI NM_172210.2. Соответствующая аминокислотная последовательность доступна под номером доступа NCBI NP_757349.1 и представлена на Фигуре 16b.
Нуклеиновая последовательность мРНК предшественника изоформы 3 КСФ-1 человека, которая также называется предшественником изоформы С макрофагального колониестимулирующего фактора 1, доступна под номером доступа NCBI NM_172211.3. Соответствующая аминокислотная последовательность доступна под номером доступа NCBI NP_757350.1 и представлена на Фигуре 16с.
Соответствующие аминокислотные последовательности также доступны под номером доступа UniProt Р09603, версия 158. Изоформа 1 была выбрана в качестве канонической последовательности UniProt.
Соответствующие белковые последовательности предшественника изоформы 1-3 КСФ-1 человека содержат N-концевой сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-32 соответствующих аминокислотных последовательностей.
Активная форма КСФ-1 человека может быть обнаружена во внеклеточном пространстве в виде гомодимера, соединенного дисульфидными связями. Активная форма образуется путем протеолитического расщепления связанного с мембраной предшественника, что приводит к потере N-концевого сигнального пептида.
Предпочтительно колониестимулирующий фактор 1 содержит одну или по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1-6.
Интерлейкин 34 (ИЛ-34) представляет собой цитокин, который также усиливает дифференцировку и жизнеспособность моноцитов и макрофагов.
Вследствие альтернативного сплайсинга интерлейкин 34 человека существует в виде двух изоформ, которые могут быть использованы в настоящем изобретении.
Нуклеиновая последовательность мРНК предшественника изоформы 1 интерлейкина 34 человека доступна под номером доступа NCBI NM_001172772.1. Соответствующая аминокислотная последовательность доступна под номером доступа NCBI NP_001166243.1 и представлена на Фигуре 17а.
Нуклеиновая последовательность мРНК предшественника изоформы 2 интерлейкина 34 человека доступна под номером доступа NCBI NM_001172771.1. Соответствующая аминокислотная последовательность доступна под номером доступа NCBI NP_001166242.1 и представлена на Фигуре 17b.
Соответствующая аминокислотная последовательность также доступна под номером доступа UniProt Q6ZMJ4, версия 80.
Предшественник интерлейкина 34 человека содержит сигнальный пептид, который содержит аминокислоты 1-20 из соответствующих аминокислотных последовательностей белков-предшественников.
Предпочтительно интерлейкин 34 содержит одну или по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 7-9.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанный М2-поляризующий фактор способствует дифференцировке и жизнеспособности моноцитов и макрофагов путем связывания с рецептором колониестимулирующего фактора 1.
Рецептор колониестимулирующего фактора 1 (КСФ-1R), который также известен как рецептор макрофагального колониестимулирующего фактора, представляет собой тирозиновую киназу, которая действует как рецептор клеточной поверхности и играет существенную роль в регуляции выживания, пролиферации и дифференцировки макрофагов и моноцитов.
КСФ-1R способствует, например, высвобождению провоспалительных хемокинов в ответ на связывание лиганда с КСФ-1R и тем самым играет важную роль при врожденном иммунном ответе и воспалительных процессах.
Предпочтительно М2-поляризующий фактор представляет собой по меньшей мере один лиганд рецептора колониестимулирующего фактора 1 (КСФ-1R).
Лиганды КСФ-1R известны специалисту в данной области техники и включают интерлейкин 34 (ИЛ-34) и колониестимулирующий фактор 1 (КСФ-1). Предпочтительно указанный лиганд рецептора колониестимулирующего фактора 1 выбран из группы, состоящей из колониестимулирующего фактора 1 (КСФ-1), интерлейкина 34 (ИЛ-34), их функциональных аналогов и их биологических аналогов.
Также предпочтительно указанный лиганд рецептора колониестимулирующего фактора 1 представляет собой лиганд рецептора колониестимулирующего фактора 1 человека, еще более предпочтительно указанный лиганд выбран из группы, состоящей из колониестимулирующего фактора 1 человека (чКСФ-1), интерлейкина 34 человека (чИЛ-34), их функциональных аналогов и их биологических аналогов.
В другом предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения указанный лиганд рецептора колониестимулирующего фактора 1 представляет собой белок, содержащий одну или по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1-9.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанный первый, второй и/или третий гетерологичные факторы экспрессируются с секреторной сигнальной последовательностью, предпочтительно N-концевым сигнальным пептидом или пропептидом. После экспрессии соответствующего фактора секреторная сигнальная последовательность, предпочтительно N-концевой сигнальный пептид или пропептид, может быть удалена путем посттрансляционной модификации. В другом варианте, указанный первый, второй и/или третий гетерологичные факторы могут быть экспрессированы в зрелой форме, предпочтительно без секреторной сигнальной последовательности, предпочтительно N-концевого сигнального пептида или пропептида.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанные рекомбинантные пробиотические бактерии по п. 1 содержат по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый гетерологичный фактор, по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй гетерологичный фактор, и по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую третий гетерологичный фактор, при условии, что указанный первый фактор, указанный второй фактор и третий фактор функционально различаются,
при этом указанный первый фактор представляет собой фактор роста, при этом указанный второй фактор выбран из группы, состоящей из М2-поляризующих факторов, и при этом указанный третий фактор выбран из группы, состоящей из М2-поляризующих факторов и факторов роста.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанный второй гетерологичный фактор и указанный третий гетерологичный фактор выбраны из группы, состоящей из М2-поляризующих факторов, причем указанный второй фактор и указанный третий фактор представляют собой функционально различные Деполяризующие факторы.
Иными словами, указанный второй гетерологичный фактор представляет собой первый М2-поляризующий фактор и указанный третий гетерологичный фактор представляет собой второй М2-поляризующий фактор, который функционально отличается от указанного первого М2-поляризующего фактора.
Предпочтительно указанный первый М2-поляризующий фактор представляет собой М2-поляризующий фактор, выбранный из группы, состоящей из колониестимулирующего фактора 1 (КСФ-1), интерлейкина 34 (ИЛ-34), интерлейкина 4 (ИЛ-4) и интерлейкина 13 (ИЛ-13), и указанный второй М2-поляризующий фактор представляет собой М2-поляризующий фактор, выбранный из группы, состоящей из колониестимулирующего фактора 1 (КСФ-1), интерлейкина 34 (ИЛ-34), интерлейкина 4 (ИЛ-4), интерлейкина 10 (ИЛ-10) и интерлейкина 13 (ИЛ-13), при условии, что указанный второй М2 поляризующий фактор функционально отличается от указанного первого М2 поляризующего фактора.
Также предпочтительно указанный первый M2-поляризующий фактор представляет собой лиганд рецептора колониестимулирующего фактора 1 (КСФ-1R) и указанный второй М2-поляризующий фактор представляет собой М2-поляризующий фактор, выбранный из группы, состоящей из интерлейкина 4 (ИЛ-4), интерлейкина 10 (ИЛ-10), интерлейкина 13 (ИЛ-13), их функциональных аналогов, их биологических аналогов и их смесей.
Другие предпочтительные комбинации М2-поляризующих факторов включают:
колониестимулирующий фактор 1 и интерлейкин 4,
колониестимулирующий фактор 1 и интерлейкин 13,
колониестимулирующий фактор 1 и интерлейкин 10,
интерлейкин 34 и интерлейкин 4,
интерлейкин 34 и интерлейкин 13,
интерлейкин 34 и интерлейкин 10,
интерлейкин 4 и интерлейкин 10 или
интерлейкин 13 и интерлейкин 10.
Вышеупомянутые дополнительные предпочтительные комбинации М2-поляризующих факторов комбинируют с по меньшей мере одним из указанных выше факторов роста, предпочтительно с фактором роста, выбранным из группы, состоящей из фактора роста фибробластов 1, фактора роста фибробластов 2, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 10, фактора роста гепатоцитов, трансформирующего фактора роста бета (ТФР-бета), эпидермального фактора роста (ЭФР), связывающего гепарин ЭФР-подобного фактора роста (ГС-ЭФР), трансформирующего фактора роста альфа (ТФР-α) и фактора роста тромбоцитов ВВ.
Предпочтительно указанный первый, второй и третий гетерологичные факторы представляют собой комбинацию:
- фактора роста фибробластов 2, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 4,
- фактора роста фибробластов 2, интерлейкина 34 и интерлейкина 4,
- фактора роста фибробластов 2, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 13,
- фактора роста фибробластов 2, интерлейкина 34 и интерлейкина 13,
- фактора роста фибробластов 2, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 10,
- фактора роста фибробластов 2, интерлейкина 34 и интерлейкина 10,
- фактора роста фибробластов 7, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 4,
- фактора роста фибробластов 7, интерлейкина 34 и интерлейкина 4,
- фактора роста фибробластов 7, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 13,
- фактора роста фибробластов 7, интерлейкина 34 и интерлейкина 13,
- фактора роста фибробластов 7, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 10,
- фактора роста фибробластов 7, интерлейкина 34 и интерлейкина 10,
- трансформирующего фактора роста бета, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 4,
- трансформирующего фактора роста бета, интерлейкина 34 и интерлейкина 4,
- трансформирующего фактора роста бета, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 13,
- трансформирующего фактора роста бета, интерлейкина 34 и интерлейкина 13
- трансформирующего фактора роста бета, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 10,
- трансформирующего фактора роста бета, интерлейкина 34 и интерлейкина 10,
- трансформирующего фактора роста альфа, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 4,
- трансформирующего фактора роста альфа, интерлейкина 34 и интерлейкина 4,
- трансформирующего фактора роста альфа, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 13,
- трансформирующего фактора роста альфа, интерлейкина 34 и интерлейкина 13
- трансформирующего фактора роста альфа, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 10,
- трансформирующего фактора роста альфа, интерлейкина 34 и интерлейкина 10
- фактора роста тромбоцитов ВВ, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 4,
- фактора роста тромбоцитов ВВ, интерлейкина 34 и интерлейкина 4,
- фактора роста тромбоцитов ВВ, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 13,
- фактора роста тромбоцитов ВВ, интерлейкина 34 и интерлейкина 13,
- фактора роста тромбоцитов ВВ, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 10, или
- фактора роста тромбоцитов ВВ, интерлейкина 34 и интерлейкина 10.
Также предпочтительно указанный первый, второй и третий гетерологичные факторы представляют собой комбинацию фактора роста фибробластов 2, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 4, их функциональных аналогов и биологических аналогов.
Предпочтительно дополнительная стимуляция М2-поляризации неполяризованных макрофагов, M1-поляризованных макрофагов, а также недифференцированных моноцитов и других клеток-предшественников макрофагов достигается путем высвобождения двух или более М2-поляризующих факторов из пробиотических бактерий согласно настоящему изобретению.
Согласно другому варианту реализации указанный первый фактор представляет собой первый фактор роста, выбранный из группы, состоящей из вышеупомянутых факторов роста, и указанный третий фактор представляет собой второй фактор роста, выбранный из группы, состоящей из вышеуказанных факторов роста, который функционально отличается от указанного первого фактора роста. Предпочтительно указанный второй фактор роста представляет собой трансформирующий фактор роста бета (ТФР-бета).
Другие предпочтительные комбинации факторов роста включают:
- фактор роста фибробластов 1 и трансформирующий фактор роста бета,
- фактор роста фибробластов 2 и трансформирующий фактор роста бета,
- фактор роста фибробластов 7 и трансформирующий фактор роста бета,
- фактор роста фибробластов 10 и трансформирующий фактор роста бета,
- фактор роста тромбоцитов ВВ и трансформирующий фактор роста бета,
- трансформирующий фактор роста альфа и трансформирующий фактор роста бета,
- эпидермальный фактор роста и трансформирующий фактор роста бета,
- связывающий гепарин ЭФР-подобный фактор роста и трансформирующий фактор роста бета,
- фактор роста гепатоцитов и трансформирующий фактор роста бета, или
- фактор роста эндотелия сосудов А и трансформирующий фактор роста бета. Вышеупомянутые дополнительные предпочтительные комбинации факторов роста предпочтительно комбинируют с М2-поляризующим фактором, выбранным из группы, состоящей из колониестимулирующего фактора 1 (КСФ-1), интерлейкина 34 (ИЛ-34), интерлейкина 4 (ИЛ-4), интерлейкина 10 (ИЛ-10), интерлейкина 13 (ИЛ-13), а также их смесей, предпочтительно колониестимулирующего фактора 1 (КСФ-1), интерлейкина 34 (ИЛ-34), интерлейкина 4 (ИЛ-4), интерлейкина 13 (ИЛ-13), а также их смесей.
Рекомбинантные пробиотические бактерии согласно настоящему изобретению предназначены для применения в лечении воспалительного нарушения функции кожи, предпочтительно хронического воспалительного нарушения функции кожи.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанное воспалительное нарушение функции кожи, предпочтительно указанное хроническое воспалительное нарушение функции кожи, представляет собой воспалительное заболевание кожи, предпочтительно хроническое воспалительное заболевание кожи или воспалительное заболевание соединительной ткани, предпочтительно хроническое воспалительное заболевание соединительной ткани. Указанное воспалительное заболевание кожи может включать обморожение, экзему, псориаз, дерматит, язву, рану, красную волчанку, нейродермит и их комбинации, предпочтительно обморожения, дерматит, язву, рану, а также их комбинации, более предпочтительно рану, язву и их комбинации, еще более предпочтительно язву.
Указанное воспалительное, предпочтительно хроническое воспалительное, заболевание кожи также может включать воспалительную, предпочтительно хроническую воспалительную, травму кожи, которая может прогрессировать в хроническое воспалительное состояние.
Обморожение представляет собой медицинское состояние, при котором локализованное поражение кожи и других тканей вызвано охлаждением, и может включать разрушение тканей. Указанное обморожение также может включать ознобыши (ознобление), которые представляют собой поверхностные изъязвления кожи, возникающие в результате воздействия холода и влажности. Повреждение капиллярного русла кожи вызывает покраснение, зуд, воспаление и иногда волдыри. Помимо этого, предпочтительно указанные виды обморожения представляют собой разные типы ознобления.
Указанная рана может представлять собой ожоговую рану, химическую рану, индуцированную облучением рану, ишемическую рану или механическую рану.
Указанная язва может представлять собой пролежневую язву или трофическую язву. Указанная язва также может представлять собой венозную язву, артериальную язву, диабетическую язву или пролежневую язву.
Указанная язва также может находиться на этапе предизъязвления вышеуказанных язв без каких-либо видимых признаков открытой раны кожи. При отсутствии медицинского вмешательства этап предизъязвления может прогрессировать до изъязвления.
Указанная рана также может представлять собой острую рану или хроническую рану, предпочтительно хроническую рану.
Хронические раны известны специалисту в данной области техники и включают, например, хронические венозные язвы, хронические артериальные язвы, хронические диабетические язвы и хронические пролежневые язвы. Хронические раны также могут быть вызваны радиационным отравлением или ишемией. Предпочтительно указанная хроническая рана представляет собой по меньшей мере одну из хронической венозной язвы, хронической артериальной язвы, хронической пролежневой язвы и хронических стадий их предизъязвления, предпочтительно одну из хронической венозной язвы, хронической артериальной язвы и хронической пролежневой язвы.
Хроническая венозная язва обычно возникает на нижних конечностях и составляет приблизительно 70%-90% хронических ран, поражая главным образом пациентов пожилого возраста.
Другой важной причиной хронических ран является диабет. Риск ампутации у пациентов, страдающих сахарным диабетом, выше на 15%, по сравнению с общей популяцией, вследствие хронических язв. Диабет вызывает невропатию, которая ингибирует ноцицепцию и восприятие боли. Следовательно, пациенты могут не заметить небольшие раны на ногах и ступнях, и, следовательно, могут не предотвратить инфекцию или повторное повреждение.
Еще одна проблема заключается в том, что диабет вызывает подавление иммунной системы и повреждение мелких кровеносных сосудов, что приводит к уменьшению оксигенации ткани. Угнетение надлежащей оксигенации тканей значительно увеличивает распространенность хронических ран.
Пролежневые язвы, которые также известны как язвы-пролежни или пролежни, могут возникнуть независимо от наличия диабетического состояния. Пролежневые язвы представляют собой локализованные поражения кожи и/или подкожной клетчатки, которые могут возникнуть над костистыми выступами в результате давления или давления в комбинации со сдвигом или трением.
Диабет является основным эндокринным нарушением обмена веществ, которое поражает все большее количество людей, при этом заболеваемость диабетом уже приблизилась к мировой пандемии. Изъязвление нижних конечностей, например, диабетические язвы стопы, является одним из серьезных долгосрочных осложнений, связанных с диабетом, которое может поддерживаться и усиливаться исходным расстройством регенерации тканей.
В США, ЕС и Японии насчитывается приблизительно 13 миллионов пациентов с хроническими ранами, из которых приблизительно 2,8 миллионов страдают изъязвлением нижних конечностей, таким как диабетические язвы стопы.
Изъязвление нижних конечностей, например, диабетические язвы стопы, с трудом поддается лечению, при этом конкретные стандартные, неинвазивные способы лечения отсутствуют. Изъязвление нижних конечностей нуждается в интенсивной медицинской помощи и крайне изнурительно для пациентов, а также связано со значимой потерей качества жизни.
Примерно у 24% пациентов, страдающих изъязвлением нижних конечностей, потребуется ампутация, что приведет к длительной нетрудоспособности.
Ежегодные расходы на здравоохранение для пациентов, страдающих изъязвлением нижних конечностей, составляют примерно 100 миллиардов долларов США. Помимо этого, пятилетняя смертность среди пациентов, страдающих изъязвлением нижних конечностей, приблизительно на 45% выше, чем этот показатель для многих видов рака.
В настоящее время стандартное терапевтическое лечение хронических ран, включая диабетические раны, такие как изъязвления нижних конечностей, сосредоточено, прежде всего, на борьбе с инфекцией и на усилении повторной васкуляризации. Несмотря на применение перечисленных стратегий, частота ампутаций у пациентов, страдающих изъязвлением нижних конечностей, остается неприемлемо высокой.
Помимо этого, даже в тех случаях, когда основное заболевание или причина изъязвления, например, сахарный диабет или хроническая венозная недостаточность, улучшено и/или излечено, например, путем регулирования уровня сахара в крови или введения лекарственных средств для контроля артериального давления, соответственно, лечение существующих язв по-прежнему может занимать очень много времени.
Следовательно, чтобы решить проблему отсутствия конкретного, неинвазивного способа лечения хронических ран, включая диабетические раны, такие как изъязвление нижних конечностей, крайне необходимы новые стратегии, которые помогут активировать и усилить заживление ран у пациентов, страдающих хроническими ранами.
Предпочтительно, в случае хронической раны, уникальная комбинация факторов, предпочтительно факторов, которые высвобождаются из указанных пробиотических бактерий, позволяет осуществлять перепрограммирование указанной хронической раны в острую рану, которая затем может быть закрыта.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения рекомбинантные пробиотические бактерии должны быть введены местно и/или путем подкожной инъекции, еще более предпочтительно должны быть введены местным путем.
Рекомбинантные пробиотические бактерии предпочтительно должны быть введены местным путем в очаг воспалительного, предпочтительно хронического воспалительного, нарушения функции кожи, подлежащего лечению.
Рекомбинантные пробиотические бактерии могут быть введены местным путем в очаг воспалительного, предпочтительно хронического воспалительного, нарушения функции кожи и/или путем подкожной инъекции в непосредственной близости от очага нарушения функции кожи, предпочтительно по краям или в полость очага воспалительного, предпочтительно хронического воспалительного, нарушения функции кожи.
После применения рекомбинантных пробиотических бактерий согласно настоящему изобретению указанные бактерии экспрессируют указанный первый и второй гетерологичные факторы, предпочтительно указанный первый, второй и третий гетерологичные факторы.
Помимо этого, прогрессирование предизъязвления до открытой раны может быть предотвращено путем местного применения или подкожной инъекции рекомбинантных пробиотических бактерий согласно настоящему изобретению вблизи и/или внутрь очага предизъязвления.
Рекомбинантные пробиотические бактерии предпочтительно получают путем трансформации пробиотических бактерий с использованием по меньшей мере одной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный первый гетерологичный фактор, и по меньшей мере одной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный второй гетерологичный фактор, и предпочтительно по меньшей мере одной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный третий гетерологичный фактор.
Подходящие пробиотические бактерии для получения рекомбинантных пробиотических бактерий согласно настоящему изобретению представляют собой непатогенные бактерии. Предпочтительно непатогенные бактерии представляют собой неинвазивные бактерии. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения рекомбинантные пробиотические бактерии представляют собой грамположительные бактерии, предпочтительно грамположительные неспорообразующие бактерии. Также предпочтительно указанные пробиотические бактерии представляют собой неколонизирующие бактерии, лишенные способности размножаться в желудочно-кишечном тракте.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения рекомбинантные пробиотические бактерии включают грамположительные бактериальные штаммы, пригодные для пищевых продуктов.
В соответствии с предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения рекомбинантные пробиотические бактерии могут быть получены из одного и того же бактериального штамма или смеси различных бактериальных штаммов.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пробиотические бактерии классифицируются как «признанные безопасными» (GRAS) Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пробиотические бактерии имеют статус «квалифицированной презумпции безопасности» (QPS-статус), согласно определению Европейского агентства по безопасности продуктов питания (EFSA). Внедрение подхода «квалифицированной презумпции безопасности» (QPS) для оценки выбранных микроорганизмов описано в EFSA Journal, Vol. 587, 2007, pages 1-16.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения пробиотические бактерии представляют собой непатогенные бактерии, принадлежащие к типу Firmicutes или Actinobacteria. Предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой непатогенные бактерии из по меньшей мере одного рода, выбранного из группы, состоящей из Bifidobacterium, Corynebacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Propionibacterium и Streptococcus.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения пробиотические бактерии представляют собой молочнокислые бактерии (LAB). Молочнокислые бактерии включают филогенетические ветви грамположительных, кислотоустойчивых, обычно неспорообразующих, анаэробных бактерий, которые обладают общими метаболическими и физиологическими характеристиками. Подходящие бактерии вырабатывают молочную кислоту в качестве основного метаболического конечного продукта синтеза углеводов.
Молочнокислые бактерии давно известны и используются, например, при ферментации продуктов питания. Помимо этого, несколько штаммов молочнокислых бактерий вырабатывают белковые бактериоцины.
Помимо этого, молочнокислые бактерии имеют статус общепризнанных как безопасные (GRAS) вследствие их повсеместного присутствия в пищевых продуктах и участия в поддержании здоровой микрофлоры поверхностей слизистых оболочек человека.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения пробиотические бактерии исключают болезнетворные и/или условно-патогенные бактерии.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пробиотические бактерии принадлежат к роду Bifidobacterium sp., включая, но не ограничиваясь перечисленными, Bifidobacterium actinocoloniiforme, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium aesculapii, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium Bifidobacterium animalis, например, Bifidobacterium animalis subsp. animalis или Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium asteroides, Bifidobacterium biavatii, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium bohemicum, Bifidobacterium bombi, Bifidobacterium boum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium callitrichos, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium coryneforme, Bifidobacterium crudilactis, Bifidobacterium cuniculi, Bifidobacterium denticolens, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium faecale, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium gallinarum, Bifidobacterium globosum, Bifidobacterium indicum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium inopinatum, Bifidobacterium kashiwanohense, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, например. Bifidobacterium longum subsp. infantis, Bifidobacterium longum subsp. Longum или Bifidobacterium longum subsp. suis, Bifidobacterium magnum, Bifidobacterium merycicum, Bifidobacterium minimum, Bifidobacterium mongoliense, Bifidobacterium moukalabense, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, например, Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum или Bifidobacterium pseudolongum subsp. pseudolongum, Bifidobacterium psychraerophilum, Bifidobacterium pullorum, Bifidobacterium reuteri, Bifidobacterium ruminantium, Bifidobacterium saeculare, Bifidobacterium saguini, Bifidobacterium scardovii, Bifidobacterium stellenboschense, Bifidobacterium subtile, Bifidobacterium stercoris, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium thermacidophilum, например, Bifidobacterium thermacidophilum subsp. porcinum или Bifidobacterium thermacidophilum subsp. thermacidophilum, Bifidobacterium thermophilum или Bifidobacterium tsurumiense.
Предпочтительно пробиотические бактерии не включают Bifidobacterium dentium.
Предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой бактерии, имеющие статус «квалифицированной презумпции безопасности» (QPS-статус) в роду Bifidobacterium sp., включая, но не ограничиваясь ими, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve или Bifidobacterium bifidum.
Согласно одному варианту реализации пробиотические бактерии принадлежат к роду Corynebacterium sp., включая, но не ограничиваясь ими, Corynebacterium accolens, Corynebacterium afermentans, например, Corynebacterium afermentans subsp. afermentans или Corynebacterium afermentans subsp. lipophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium appendices, Corynebacterium aquatimens, Corynebacterium aquilae, Corynebacterium argentoratense, Corynebacterium atypicum, Corynebacterium aurimucosum, Corynebacterium auris, Corynebacterium auriscanis, Corynebacterium betae, Corynebacterium beticola, Corynebacterium bovis, Corynebacterium callunae, Corynebacterium camporealensis, Corynebacterium canis, Corynebacterium capitovis, Corynebacterium casei, Corynebacterium caspium, Corynebacterium ciconiae, Corynebacterium confusum, Corynebacterium coyleae, Corynebacterium cystitidis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium doosanense, Corynebacterium durum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium epidermidicanis, Corynebacterium equi, Corynebacterium falsenii, Corynebacterium fascians, Corynebacterium felinum, Corynebacterium flaccumfaciens, например, Corynebacterium flaccumfaciens subsp. betae, Corynebacterium flaccumfaciens subsp. flaccumfaciens, Corynebacterium flaccumfaciens subsp. Oortii или Corynebacterium flaccumfaciens subsp. poinsettiae, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium frankenforstense, Corynebacterium freiburgense, Corynebacterium freneyi, Corynebacterium glaucum, Corynebacterium glucuronolyticum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium hansenii, Corynebacterium hoagie, Corynebacterium humireducens, Corynebacterium ilicis, Corynebacterium imitans, Corynebacterium insidiosum, Corynebacterium iranicum, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium lactis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium lipophiloflavum, Corynebacterium liquefaciens, Corynebacterium lubricantis, Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium marinum, Corynebacterium maris, Corynebacterium massiliense, Corynebacterium mastitidis, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium michiganense, например, Corynebacterium michiganense subsp. insidiosum, Corynebacterium michiganense subsp. michiganense, Corynebacterium michiganense subsp. nebraskense, Corynebacterium michiganense subsp. sepedonicum или Corynebacterium michiganense subsp. tessellarius, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium mooreparkense, Corynebacterium mucifaciens, Corynebacterium mustelae, Corynebacterium mycetoides, Corynebacterium nebraskense, Corynebacterium nigricans, Corynebacterium nuruki, Corynebacterium oortii, Corynebacterium paurometabolum, Corynebacterium phocae, Corynebacterium pilbarense, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium poinsettiae, Corynebacterium propinquum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium pyogenes, Corynebacterium pyruviciproducens, Corynebacterium rathayi, Corynebacterium renale, Corynebacterium resistens, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium seminale, Corynebacterium sepedonicum, Corynebacterium simulans, Corynebacterium singulare, Corynebacterium sphenisci, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium sputi, Corynebacterium stationis, Corynebacterium striatum, Corynebacterium suicordis, Corynebacterium sundsvallense, Corynebacterium terpenotabidum, Corynebacterium testudinoris, Corynebacterium thomssenii, Corynebacterium timonense, Corynebacterium tritici, Corynebacterium tuberculostearicum, Corynebacterium tuscaniense, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium ulceribovis, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium ureicelerivorans, Corynebacterium uterequi, Corynebacterium variabile, Corynebacterium vitaeruminis или Corynebacterium xerosis.
Предпочтительно пробиотические бактерии не включают Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium amicolatum, Corynebacterium striatum, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium tenuis, Corynebacterium striatum или Corynebacterium minutissimum.
Предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой бактерии, классифицируемые как «признанные безопасными» (GRAS) в роду Corynebacterium, включая, но не ограничиваясь ими, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium casei, Corynebacterium flavescens или Corynebacterium variabile.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения бактерии включают бактерии рода Enterococcus sp., включая, но не ограничиваясь ими, Enterococcus alcedinis, Enterococcus aquimarinus, Enterococcus asini, Enterococcus avium, Enterococcus caccae, Enterococcus camelliae, Enterococcus canintestini, Enterococcus canis, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus cecorum, Enterococcus columbae, Enterococcus devriesei, Enterococcus diestrammenae, Enterococcus dispar, Enterococcus durans, Enterococcus eurekensis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus flavescens, Enterococcus gallinarum, Enterococcus gilvus, Enterococcus haemoperoxidus, Enterococcus hermanniensis, Enterococcus hirae, Enterococcus italicus, Enterococcus lactis, Enterococcus lemanii, Enterococcus malodoratus, Enterococcus moraviensis, Enterococcus mundtii, Enterococcus olivae, Enterococcus pollens, Enterococcus phoeniculicola, Enterococcus plantarum, Enterococcus porcinus, Enterococcus pseudoavium, Enterococcus quebecensis, Enterococcus raffinosus, Enterococcus ratti, Enterococcus rivorum, Enterococcus rotai, Enterococcus saccharolyticus, например, Enterococcus saccharolyticus subsp. saccharolyticus или Enterococcus saccharolyticus subsp. taiwanensis, Enterococcus saccharominimus, Enterococcus seriolicida, Enterococcus silesiacus, Enterococcus solitarius, Enterococcus sulfureus, Enterococcus termitis, Enterococcus thailandicus, Enterococcus ureilyticus, Enterococcus viikkiensis, Enterococcus villorum или Enterococcus xiangfangensis.
Предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой бактерии, классифицируемые как «признанные безопасными» (GRAS) в роду Enterococcus, включая, но не ограничиваясь ими, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis или Enterococcus faecium.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пробиотические бактерии представляют собой бактерии из рода Lactobacillus sp., включая, но не ограничиваясь ими, Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidifarinae, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylotrophicus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus antri, Lactobacillus apinorum, Lactobacillus apis, Lactobacillus apodemi, Lactobacillus aquaticus, Lactobacillus arizonensis, Lactobacillus aviaries, например, Lactobacillus aviarius subsp. araffinosus или Lactobacillus aviarius subsp. aviarius, Lactobacillus backii, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus bobalius, Lactobacillus bombi, Lactobacillus brantae, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus cacaonum, Lactobacillus camelliae, Lactobacillus capillatus, Lactobacillus carnis, Lactobacillus casei, например, Lactobacillus casei subsp. alactosus, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus или Lactobacillus casei subsp. tolerans, Lactobacillus catenaformis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus ceti, Lactobacillus coleohominis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus composti, Lactobacillus concavus, Lactobacillus confusus, Lactobacillus coryniformis, например, Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis или Lactobacillus coryniformis subsp. torquens, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus crustorum, Lactobacillus curieae, Lactobacillus curvatus, например, Lactobacillus curvatus subsp. curvatus или Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus, Lactobacillus cypricasei, Lactobacillus delbrueckii, например, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus, Lactobacillus delbrueckii subsp. jakobsenii, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis или Lactobacillus delbrueckii subsp. sunkii, Lactobacillus dextrinicus, Lactobacillus diolivorans, Lactobacillus divergens, Lactobacillus durianis, Lactobacillus equi, Lactobacillus equicursoris, Lactobacillus equigenerosi, Lactobacillus fabifermentans, Lactobacillus faecis, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus farraginis, Lactobacillus ferintoshensis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus floricola, Lactobacillus florum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus fructosus, Lactobacillus frumenti, Lactobacillus fuchuensis, Lactobacillus furfuricola, Lactobacillus futsaii, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gastricus, Lactobacillus ghanensis, Lactobacillus gigeriorum, Lactobacillus graminis, Lactobacillus halotolerans, Lactobacillus hammesii, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus harbinensis, Lactobacillus hayakitensis, Lactobacillus heilongjiangensis, Lactobacillus helsingborgensis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus heterohiochii, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus hokkaidonensis, Lactobacillus hominis, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus hordei, Lactobacillus iners, Lactobacillus ingluviei, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus iwatensis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kalixensis, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus kefiranofaciens, например, Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens или Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kimbladii, Lactobacillus kimchicus, Lactobacillus kimchiensis, Lactobacillus kimchii, Lactobacillus kisonensis, Lactobacillus kitasatonis, Lactobacillus koreensis, Lactobacillus kullabergensis, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus mellifer, Lactobacillus mellis, Lactobacillus melliventris, Lactobacillus mindensis, Lactobacillus minor, Lactobacillus minutus, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nantensis, Lactobacillus nasuensis, Lactobacillus nenjiangensis, Lactobacillus nodensis, Lactobacillus odoratitofui, Lactobacillus oeni, Lactobacillus oligofermentans, Lactobacillus oris, Lactobacillus oryzae, Lactobacillus otakiensis, Lactobacillus ozensis, Lactobacillus panis, Lactobacillus pantheris, Lactobacillus parabrevis, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, например, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei или Lactobacillus paracasei subsp. tolerans, Lactobacillus paracollinoides, Lactobacillus parafarraginis, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pasteurii, Lactobacillus paucivorans, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus piscicola, Lactobacillus plantarum, например, Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis или Lactobacillus plantarum subsp. plantarum, Lactobacillus pobuzihii, Lactobacillus pontis, Lactobacillus porcinae, Lactobacillus psittaci, Lactobacillus rapi, Lactobacillus rennini, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rimae, Lactobacillus rodentium, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus saerimneri, Lactobacillus sakei, например, Lactobacillus sakei subsp. carnosus или Lactobacillus sakei subsp. sakei, Lactobacillus salivarius, например, Lactobacillus salivarius subsp. salicinius или Lactobacillus salivarius subsp. salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus saniviri, Lactobacillus satsumensis, Lactobacillus secaliphilus, Lactobacillus selangorensis, Lactobacillus senioris, Lactobacillus senmaizukei, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus shenzhenensis, Lactobacillus sicerae, Lactobacillus silagei, Lactobacillus siliginis, Lactobacillus similes, Lactobacillus sobrius, Lactobacillus songhuajiangensis, Lactobacillus spicheri, Lactobacillus sucicola, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus sunkii, Lactobacillus suntoryeus, Lactobacillus taiwanensis, Lactobacillus thailandensis, Lactobacillus thermotolerans, Lactobacillus trichodes, Lactobacillus tucceti, Lactobacillus uli, Lactobacillus ultunensis, Lactobacillus uvarum, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus versmoldensis, Lactobacillus vini, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus vitulinus, Lactobacillus xiangfangensis, Lactobacillus xylosus, Lactobacillus yamanashiensis, например, Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali или Lactobacillus yamanashiensis subsp. yamanashiensis, Lactobacillus yonginensis, Lactobacillus zeae или Lactobacillus zymae.
Предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой бактерии, классифицируемые как «признанные безопасными» (GRAS) в роду Lactobacillus sp., включая, но не ограничиваясь ими, штамм Lactobacillus acidophilus NP 28, штамм Lactobacillus acidophilus NP51, штамм Lactobacillus subsp. lactis NP7, штамм Lactobacillus reuteri NCIMB 30242, штамм Lactobacillus casei Shirota, штамм Lactobacillus reuteri DSM 17938, штамм Lactobacillus reuteri NCIMB 30242, штамм Lactobacillus acidophilus NCFM, штамм Lactobacillus rhamnosus HN001, штамм Lactobacillus rhamnosus HN001, штамм Lactobacillus reuteri DSM 17938, штамм Lactobacillus casei subsp.rhamnosus GG, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidifarinae, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus cacaonum, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus composti, Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus crustorum, Lactobacillus curvatus subps. curvatus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus dextrinicus, Lactobacillus diolivorans, Lactobacillus fabifermentans, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus frumenti, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus ghanensis, Lactobacillus hammesii, Lactobacillus harbinensis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus hordei, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofadens subsp.kefiranofaciens, Lactobacillus kefiranofadens subsp. kefirgranum, Lactobacillus kimchii, Lactobacillus kisonensis, Lactobacillus mail, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus mindensis, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nantensis, Lactobacillus nodensis, Lactobacillus oeni, Lactobacillus otakiensis, Lactobacillus panis, Lactobacillus parabrevis, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei subsp.paracasei, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus plantarum subsp. plantarum, Lactobacillus pobuzihii, Lactobacillus pontis, Lactobacillus rapi, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus sakei subsp carnosus, Lactobacillus sakei subsp. sakei, Lactobacillus sali varius subsp. salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus satsumensis, Lactobacillus secaliphilus, Lactobacillus senmaizukei, Lactobacillus siliginis, Lactobacillus spicheri, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus sunkii, Lactobacillus tucceti, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus versmoldensis или Lactobacillus yamanashiensis.
Предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой бактерии, имеющие статус «квалифицированной презумпции безопасности» (QPS) в роду Lactobacillus sp., включая, но не ограничиваясь ими, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus aviaries, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus panis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis или Lactobacillus zeae.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пробиотические бактерии принадлежат к роду Lactococcus sp., включая, но не ограничиваясь ими, Lactococcus chungangensis, Lactococcus formosensis, Lactococcus fujiensis, Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, например, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. hordniae, Lactococcus lactis subsp. lactis или Lactococcus lactis subsp. tructae, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis или Lactococcus taiwanensis.
Предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой бактерии, классифицируемые как «признанные безопасными» (GRAS) в роду Lactococcus, включая, но не ограничиваясь ими, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. Lactis и Lactococcus raffinolactis.
Предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой Lactococcus lactis, предпочтительно Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. lactis biovariant diacetylactis или Lactococcus lactis subsp. cremoris, более предпочтительно Lactococcus lactis subsp. cremoris.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пробиотические бактерии принадлежат к роду Leuconostoc sp., включая, но не ограничиваясь ими, Leuconostoc amelibiosum, Leuconostoc argentinum, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc cremoris, Leuconostoc dextranicum, Leuconostoc durionis, Leuconostoc fallax, Leuconostoc ficulneum, Leuconostoc fructosum, Leuconostoc gasicomitatum, Leuconostoc gelidum, например, Leuconostoc gelidum subsp. aenigmaticum, Leuconostoc gelidum subsp. gasicomitatum или Leuconostoc gelidum subsp. gelidum, Leuconostoc holzapfelii, Leuconostoc inhae, Leuconostoc kimchii, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides, например, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicums, Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides или Leuconostoc mesenteroides subsp. suionicum, Leuconostoc miyukkimchii, Leuconostoc oeni, Leuconostoc paramesenteroides, Leuconostoc pseudoficulneum или Leuconostoc pseudomesenteroides.
Предпочтительно бактерии представляют собой бактерии, классифицируемые как «признанные безопасными» (GRAS) в роду Leuconostoc sp., включая, но не ограничиваясь ими, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc fallax, Leuconostoc holzapfelii, Leuconostoc inhae, Leuconostoc kimchii, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicums, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc palmae или Leuconostoc pseudomesenteroides.
Предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой бактерии, имеющие статус «квалифицированной презумпции безопасности» (QPS) в роду Leuconostoc sp., включая, но не ограничиваясь ими, Leuconostoc citreum, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum или Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения бактерии принадлежат роду Pediococcus sp., включая, но не ограничиваясь ими, Pediococcus acidilactici, Pediococcus argentinicus, Pediococcus cellicola, Pediococcus claussenii, Pediococcus damnosus, Pediococcus dextrinicus. Pediococcus ethanolidurans, Pediococcus halophilus, Pediococcus inopinatus, Pediococcus lolii, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus siamensis, Pediococcus stilesii или Pediococcus urinaeequi.
Предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой бактерии, имеющие статус «квалифицированной презумпции безопасности» (QPS) в роду Pediococcus sp., включая, но не ограничиваясь ими, Pediococcus acidilactici, Pediococcus dextrinicus или Pediococcus pentosaceus.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пробиотические бактерии принадлежат к роду Propionibacterium sp., включая, но не ограничиваясь ими, Propionibacterium acidifaciens, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium acnes, Propionibacterium australiense, Propionibacterium avidum, Propionibacterium cyclohexanicum, Propionibacterium damnosum, Propionibacterium freudenreichii, например, Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii или Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium innocuum, Propionibacterium jensenii, Propionibacterium lymphophilum, Propionibacterium microaerophilum, Propionibacterium olivae, Propionibacterium propionicum или Propionibacterium thoenii.
В соответствии с одним вариантом реализации пробиотические бактерии не включают Propionibacterium acnes.
Также предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой бактерии, классифицируемые как «признанные безопасными» (GRAS) в роду Propionibacterium sp., включая, но не ограничиваясь ими, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium freudenreichii subsp. Freudenreichii, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii, Propionibacterium jensenii или Propionibacterium thoenii.
Также предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой Propionibacterium freudenreichii, еще более предпочтительно Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii или Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пробиотические бактерии принадлежат к роду Streptococcus sp., включая, но не ограничиваясь ими, Streptococcus acidominimus, Streptococcus adjacens, Streptococcus agalactiae, Streptococcus alactolyticus, Streptococcus anginosus, Streptococcus australis, Streptococcus bovis, Streptococcus caballi, Streptococcus canis, Streptococcus caprinus, Streptococcus castoreus, Streptococcus cecorum, Streptococcus constellatus, например, Streptococcus constellatus subsp. constellatus, Streptococcus constellatus subsp. pharynges или Streptococcus constellatus subsp. viborgensis, Streptococcus cremoris, Streptococcus criceti, Streptococcus cristatus, Streptococcus cuniculi, Streptococcus danieliae, Streptococcus defectivus, Streptococcus dentapri, Streptococcus dentirousetti, Streptococcus dentasini, Streptococcus dentisani, Streptococcus devriesei, Streptococcus didelphis, Streptococcus difficilis, Streptococcus downei, Streptococcus durans, Streptococcus dysgalactiae, например, Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae или Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis, Streptococcus entericus, Streptococcus equi, например, Streptococcus equi subsp. equi, Streptococcus equi subsp. ruminatorum или Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, Streptococcus equinus, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus ferus, Streptococcus gallinaceus, Streptococcus gallinarum, Streptococcus gallolyticus, например, Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus, Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus или Streptococcus gallolyticus subsp. pasteurianus, Streptococcus garvieae, Streptococcus gordonii, Streptococcus halichoeri, Streptococcus hansenii, Streptococcus henryi, Streptococcus hongkongensis, Streptococcus hyointestinalis, Streptococcus hyovaginalis, Streptococcus ictaluri, Streptococcus infantarius, например. Streptococcus infantarius subsp. coli или Streptococcus infantarius subsp. infantarius, Streptococcus infantis, Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus intestinalis, Streptococcus lactarius, Streptococcus lactis, например, Streptococcus lactis subsp. cremoris, Streptococcus lactis subsp. diacetilactis или Streptococcus lactis subsp. lactis, Streptococcus loxodontisalivarius, Streptococcus lutetiensis, Streptococcus macacae, Streptococcus macedonicus, Streptococcus marimammalium, Streptococcus massiliensis, Streptococcus merionis, Streptococcus minor, Streptococcus mitis, Streptococcus morbillorum, Streptococcus moroccensis, Streptococcus mutans, Streptococcus oligofermentans, Streptococcus oralis, Streptococcus orisasini, Streptococcus orisuis, Streptococcus ovis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus parauberis, Streptococcus parvulus, Streptococcus pasteurianus, Streptococcus peroris, Streptococcus phocae, например, Streptococcus phocae subsp. phocae или Streptococcus phocae subsp. salmonis, Streptococcus plantarum, Streptococcus pleomorphus, Streptococcus pluranimalium, Streptococcus plurextorum, Streptococcus pneumonia, Streptococcus porci, Streptococcus porcinus, Streptococcus porcorum, Streptococcus pseudopneumoniae, Streptococcus pseudoporcinus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus raffinolactis, Streptococcus ratti, Streptococcus rifensis, Streptococcus rubneri, Streptococcus rupicaprae, Streptococcus saccharolyticus, Streptococcus salivarius, например, Streptococcus salivarius subsp. salivarius или Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Streptococcus saliviloxodontae, Streptococcus sanguinis, Streptococcus shiloi, Streptococcus sinensis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus thoraltensis, Streptococcus tigurinus, Streptococcus troglodytae, Streptococcus uberis, Streptococcus urinalis, Streptococcus ursoris, Streptococcus vestibularis или Streptococcus waius.
Предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой бактерии, классифицируемые как «признанные безопасными» (GRAS) в роду Streptococcus sp., включая, но не ограничиваясь ими, штамм Streptococcus thermophilus Th4, Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus, Streptococcus salivarius subsp. salivarius или Streptococrus salivarius subsp. thermophilus.
Предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой бактерии, имеющие статус «квалифицированной презумпции безопасности» (QPS) в роду Streptococcus sp., включая, но не ограничиваясь указанным, Streptococcus thermophilus.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанные пробиотические бактерии не вырабатывают эндотоксины или другие потенциально токсичные вещества. Следовательно, указанные пробиотические бактерии безопасны в использовании и не являются вредными для субъекта после применения.
Предпочтительно указанные пробиотические бактерии не производят споры. Бактериальные споры не являются частью полового цикла, однако представляют собой устойчивые структуры, используемые для выживания в неблагоприятных условиях. Поскольку указанные пробиотические бактерии предпочтительно не производят споры, то указанные рекомбинантные пробиотические бактерии не могут выжить, например, без питательных веществ или в условиях отсутствия ауксотрофных факторов.
Предпочтительно указанные пробиотические бактерии не вырабатывают тельца включения. Тельца включения часто содержат гиперэкспрессированные белки, и агрегация указанных гиперэкспрессированных белков в тельцах включения может быть необратимой.
Поскольку указанные пробиотические бактерии предпочтительно не вырабатывают тельца включения, количество указанного первого, второго и третьего гетерологичных факторов после транскрипции и трансляции соответствующих последовательностей нуклеиновых кислот не уменьшается при внутриклеточном накоплении в тельцах включения.
Также предпочтительно указанные пробиотические бактерии также не вырабатывают внеклеточные протеиназы. Внеклеточные протеиназы могут секретироваться бактериями для разрушения внеклеточных структур, таких как белки, для получения питательных веществ, таких как углерод, азот или сера. Внеклеточные протеиназы также могут действовать в качестве экзотоксина и могут являться примером фактора вирулентности при бактериальном патогенезе.
Из-за отсутствия внеклеточных протеиназ безопасность указанных пробиотических бактерий после применения у субъекта предпочтительно повышается. Помимо этого, указанные пробиотические бактерии предпочтительно не разрушают соответствующий первый, второй и третий гетерологичные факторы после высвобождения из указанных рекомбинантных пробиотических бактерий.
Предпочтительно указанные пробиотические бактерии лишены всех природных плазмид. Вследствие отсутствия всех природных плазмид указанные пробиотические бактерии предпочтительно не обладают устойчивостью к антибиотикам.
Также предпочтительно указанные пробиотические бактерии лишены факторов интеграции хозяина, необходимых для конъюгативной транспозиции.
Природные плазмиды могут быть в целом классифицированы на конъюгативные плазмиды и неконъюгативные плазмиды. Конъюгативные плазмиды содержат набор для переноса генов или TRA-гены, которые способствуют половой конъюгации различных клеток. В сложном процессе конъюгации плазмида может быть передана от одной бактерии к другой посредством половых пилей, кодируемых некоторыми из TRA-генов. Неконъюгативные плазмиды не способны инициировать конъюгацию, следовательно, они могут быть переданы только с помощью факторов хозяина, необходимых для конъюгативной транспозиции, таких как конъюгативные плазмиды.
Вследствие отсутствия факторов интеграции хозяина, необходимых для конъюгативной транспозиции, перенос гена указанной нуклеиновой кислоты(кислот), кодирующей соответствующий первый, второй и третий гетерологичные факторы указанных пробиотических бактерий, к другим микроорганизмам является весьма маловероятным, предпочтительно перенос генов подавлен.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанные рекомбинантные пробиотические бактерии представляют собой молочнокислые бактерии, предпочтительно вида Lactobacillus или Lactococcus. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанный вид Lactococcus представляет собой Lactococcus lactis subsp. cremoris.
Молочнокислые бактерии дополнительно выделяют молочную кислоту в качестве основного метаболического конечного продукта ферментации углеводов. Известно, что молочная кислота стимулирует размножение и пролиферацию эндотелия. Помимо этого, молочная кислота обладает антибактериальным действием, которое уменьшает вероятность бактериальной инфекции в очаге нарушения функции кожи.
Методики трансформации вышеуказанных пробиотических бактерий известны специалисту в данной области техники и описаны, например, в Green and Sambrook (2012): «Molecular cloning: a laboratory manual», 4 изд., Cold Spring Harbour Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY, USA)
После трансформации рекомбинантные пробиотические бактерии содержат по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный первый гетерологичный фактор, и по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный второй гетерологичный фактор, и предпочтительно по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный третий гетерологичный фактор.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный первый гетерологичный фактор, и по меньшей мере одна последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный второй гетерологичный фактор, и предпочтительно по меньшей мере одна последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный третий гетерологичный фактор, расположены в различных субпопуляциях рекомбинантных пробиотических бактерий.
Например, каждая из соответствующих последовательностей нуклеиновых кислот локализована в отдельных субпопуляциях пробиотических бактерий, которые комбинируют для получения рекомбинантных пробиотических бактерий согласно настоящему изобретению.
Соответствующая индивидуальная субпопуляция, содержащая соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, например, может быть получена из одного и того же вида или из различных видов вышеуказанных пробиотических бактерий.
Например, различные виды рекомбинантных пробиотических бактерий, экспрессирующих различные гетерологичные факторы, могут быть использованы для адаптации экспрессии и предпочтительно высвобождения соответствующих гетерологичных факторов из пробиотических бактерий.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения соответствующие последовательности нуклеиновых кислот присутствуют в рекомбинантных пробиотических бактериях в различном количестве копий. Например, рекомбинантные пробиотические бактерии содержат по меньшей мере одну копию соответствующих последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих указанный первый, указанный второй и/или предпочтительно указанный третий фактор.
Количество копий соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты может быть увеличено для усиления экспрессии соответствующего гетерологичного фактора.
Предпочтительно соотношение копий соответствующих последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих указанный первый, указанный второй и/или указанный третий факторы, составляет 1:1:1.
Эффективность трансляции может быть повышена путем обеспечения дополнительных копий последовательности нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется рекомбинантными пробиотическими бактериями.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субпопуляция рекомбинантных пробиотических бактерий содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую два из трех гетерологичных факторов, при этом предпочтительно третий гетерологичный фактор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной во второй субпопуляции рекомбинантных пробиотических бактерий.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие все три гетерологичных фактора, расположены в одной популяции рекомбинантных пробиотических бактерий.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения соответствующие последовательности нуклеиновых кислот расположены на по меньшей мере одной хромосоме и плазмиде указанных рекомбинантных пробиотических бактерий.
Локализация последовательности нуклеиновой кислоты на хромосоме рекомбинантных пробиотических бактерий или на плазмиде указанных рекомбинантных пробиотических бактерий определяет, помимо всего прочего, количество белка, транслируемого бактериями, поскольку уровни экспрессии на плазмиде выше по сравнению с уровнями экспрессии на хромосоме.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая соответствующий гетерологичный фактор, обеспечена на хромосоме бактерий и по меньшей мере одна последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая другой гетерологичный фактор, обеспечена на плазмиде указанных рекомбинантных пробиотических бактерий.
Соответствующая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая третий фактор, затем может быть обеспечена на хромосоме или на плазмиде рекомбинантных пробиотических бактерий.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соответствующие последовательности нуклеиновых кислот обеспечены на отдельных участках хромосомы рекомбинантных пробиотических бактерий или на различных плазмидах указанных рекомбинантных пробиотических бактерий.
Согласно особенно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения все последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие указанные гетерологичные факторы, обеспечены на одной плазмиде, например, каждая из них находится под контролем и функционально соединена с отдельным промотором.
Согласно другому особенно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие соответствующие гетерологичные факторы, расположены в одном опероне, который функционально соединен и находится под контролем одного промотора.
Оперон представляет собой функционирующую единицу ДНК, содержащую кластер генов под контролем одного промотора. Гены транскрибируются вместе с нитями мРНК и транслируются вместе в цитоплазме или подвергаются транс-сплайсингу с образованием моноцистронных мРНК, которые транслируются по отдельности.
Предпочтительно соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие соответствующие гетерологичные факторы, расположенные в указанном отдельном опероне, обеспечены совместно с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими участок связывания рибосомы для инициации трансляции.
Предпочтительно последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие участок связывания рибосомы, расположены в направлении 5'-конца относительно стартового ко дона, который в свою очередь расположен в направлении 5'-конца относительно той же цепи, которая подвергается трансляции. Последовательность предпочтительно является комплементарной 3'-концу рибосомной РНК 16S.
Предпочтительно соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие соответствующие гетерологичные факторы, расположенные в указанном отдельном опероне, обеспечены совместно с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей секреторную сигнальную последовательность на 5'-конце открытой рамки считывания (ОРС) гетерологичного фактора, что приводит к получению гибридного белка, содержащего секреторную сигнальную последовательность и гетерологичный фактор.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения последовательности нуклеиновых кислот находятся под контролем и функционально соединены с конститутивным промотором или индуцируемым промотором, предпочтительно с индуцируемым промотором.
Например, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие соответствующие гетерологичные факторы, могут находиться под контролем и могут быть функционально соединены с отдельными промоторами, которые могут представлять собой конститутивный промотор или индуцируемый промотор, более предпочтительно индуцируемый промотор.
Конститутивный промотор активен в клетке при всех условиях, в то время как индуцируемый промотор становится активным в ответ на конкретный индуктор.
Промотор представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая инициирует транскрипцию конкретного гена. Промоторы расположены вблизи участка начала транскрипции гена, на той же самой нити, а также в направлении 5'-конца ДНК, что и указанный участок, который расположен в направлении 5'-конца той же цепи, которая подвергается транскрипции.
Предпочтительно соответствующий используемый промотор представляет собой аутологичный промотор из пробиотических бактерий, который обеспечивает экспрессию соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соответствующий промотор представляет собой гетерологичный промотор, предпочтительно прокариотический промотор, более предпочтительно промотор из бактерий.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения экспрессия по меньшей мере одной последовательности нуклеиновой кислоты находится под контролем индуцируемого промотора, при этом указанная по меньшей мере одна последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется в присутствии по меньшей мере одного индуктора.
Предпочтительно указанный индуцируемый промотор, который индуцируется под действием индуктора, представляет собой промотор по меньшей мере для одного микробного гена, который кодирует пептид лантибиотика.
Пептиды лантибиотиков известны специалисту в данной области техники. Лантибиотики представляют собой класс пептидов, которые содержат характерную полициклическую тиоэфирную аминокислоту лантионин, а также ненасыщенные аминокислоты, дегидроаланин и 2-аминоизомасляную кислоту.
Лантионин, например, представляет собой моносульфидный аналог цистеина и состоит из двух остатков аланина, которые сшиты посредством тиоэфирной связи между бета-атомами углерода.
Лантибиотики вырабатываются многими грамположительными бактериями.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанный индуцируемый промотор представляет собой промотор низина из Lactococcus lactis, промотор бизина из Bifidobacterium longum, промотор оптилина из Bacillus subtilis, промотор сальваризина из Streptococcus salivarius, промотор эпидермина из Staphylococcus epidermidis, промотор галлидермина из Staphylococcus gallinarum, промотор мутацина из мутированных штаммов Streptococcus, промотор стрептина из Streptococcus pyogenes, промотор стрептококка из Streptococcus pyogenes, промотор лактицина из Lactococcus lactis, промотор эпидермина из Staphylococcis epidermidis, промотор эпиланзина из Staphylococcus epidermidis, промотор рер5 из Staphylococcus epidermidis, промотор lactocins из Lactobacillus sakei, промотор сальварицина из Streptococcus salivarius или Streptococcus pyogenes, промотор плантаризина из Lactobacillus plantarum, промотор термофиллина из стрептококка, промотор бовицина из стрептококка или их комбинации.
Также предпочтительно указанный индуцируемый промотор представляет собой PnisA, PnisZ, PnisQ, PnisF, PnisU или их комбинации из Lactococcus lactis.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения индуктор представляет собой по меньшей мере один пептид лантибиотика или его функциональный аналог, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из низина А, низина Z, низина Q, низина F, низина U, их функциональных аналогов и их смесей.
Система экспрессии генов под контролем низина доступна коммерчески, например, от MoBiTec GmbH (Геттинген, Германия) под торговым названием NICE®, которая была разработана в NIZO Food Research (Эде, Нидерланды).
Низин, который хорошо известен специалистам в данной области техники, представляет собой пептид лантибиотика, содержащий 34 аминокислоты, с широким спектром хозяев. Например, низины из Lactococcus lactis коммерчески доступны от Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Мюнхен, Германия).
Низин широко используется в качестве консерванта в пищевых продуктах. Первоначально низин синтезируется рибосомами в виде предшественника. После последующих ферментативных модификаций модифицированная молекула транслоцируется через цитоплазматическую мембрану и расщепляется с образованием зрелой формы.
Низин индуцирует свою собственную экспрессию. Экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, может быть индуцирована добавлением субингибирующего количества низина, которое предпочтительно находится в диапазоне от 0,01 до 50 нг/мл культуральной среды, еще более предпочтительно от 0,1 до 5 нг/мл культуральной среды, при этом представляющий интерес ген расположен после индуцируемых промоторов системы, индуцируемой низином.
Помимо этого, система NICE была перенесена в другие грамположительные бактерии, например, Leuconostoc lactis, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus zooepidemicus, Enterococcus faecalis или Lactobacillus subtilis.
Индуцируемый промотор низина, который предпочтительно выбран из PnisA, PnisZ, PnisQ, PnisF, PnisU и их комбинаций, может быть интегрирован в хромосому пробиотических бактерий, используемую совместно с по меньшей мере одной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный первый гетерологичный фактор, указанный второй гетерологичный фактор и/или предпочтительно указанный третий гетерологичный фактор.
Предпочтительно указанный индуцируемый промотор представляет собой PnisA.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения соответствующие промоторы вместе с по меньшей мере одной последовательностью нуклеиновой кислоты, обеспечены на плазмиде, которую затем трансформируют в пробиотические бактерии.
Соответствующая последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется в присутствии низина.
Подходящие плазмиды коммерчески доступны, например, от MoBiTec GmbH, (Геттинген, Германия), такие как pNZ8008, pNZ8148, pNZ8149 и pNZ8150.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения гены NisR и NisK также обеспечены на хромосоме или на плазмиде используемых пробиотических бактерий. Соответствующий белок NisR и NisK принадлежит к семейству бактериальных двухкомпонентных систем передачи сигналов. NisK представляет собой гистидиновую протеинкиназу, которая находится в цитоплазматической мембране, где она предпочтительно действует как рецептор для зрелой молекулы низина. После связывания низина с NisK он автофосфорилируется и переносит фосфатную группу на NisR, являющийся регулятором ответа, который активируется после фосфорилирования NisK.
Активированный NisR индуцирует транскрипцию с промотора PnisA, промотора PnisF, промотора PnisZ, промотора PnisQ и/или промотора PnisU.
Соответствующие регуляторы экспрессии генов низина NisR и NisK могут быть обеспечены, например, на хромосоме пробиотических бактерий и/или на плазмиде.
Подходящие плазмиды коммерчески доступны и включают, например, плазмиду pNZ9530 (MoBiTec GmbH, Геттинген, Германия). Плазмида pNZ9530 несет гены NisR и NisK и предпочтительно используется для клонирования в штаммах Lactococcus и в штаммах других родов молочнокислых бактерий, которые не содержат интегрированных в хромосому регуляторных генов. Например, плазмида pMSP3535 была описана Brian et al. (2000) для индуцированной низином экспрессии в Enterococcus faecalis и доступна, например, в AddGene, некоммерческого хранилища плазмид (плазмида №46886).
Последовательность нуклеиновой кислоты плазмиды pMSP3535 доступна под номером доступа NCBI AY303239.1.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения используют пробиотические бактерии, которые содержат регуляторные гены для экспрессии генов, контролируемой низинами, NisR и NisK.
Подходящие штаммы коммерчески доступны, например, от Mobitec GmbH (Геттинген, Германия). Подходящие штаммы включают, например, штамм Lactococcus lactis NZ 9000, штамм Lactococcus lactis NZ9100, штамм Lactococcus lactis NZ3900.
Подходящий штамм также включает штамм Lactococcus lactis NZ3000, который коммерчески доступен, например, от MoBiTec GmbH. Штамм Lactococcus lactis NZ3000 представляет собой штамм, не содержащий NisR и NisK. Штамм Lactococcus lactis NZ3000 может быть использован, когда экспрессия указанной последовательности(ей) нуклеиновой кислоты находится под контролем конститутивного промотора.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения пробиотические бактерии представляют собой штамм Lactococcus lactis NZ3900, который является штаммом, пригодным для применения в пищевых продуктах. Штамм Lactococcus lactis NZ3900 содержит систему отбора плазмиды, которая основана не на устойчивости к антибиотикам, а на способности расти на лактозе.
Штамм Lactococcus lactis NZ3900 не вырабатывает эндотоксины или другие потенциально токсичные вещества. Помимо этого, штамм Lactococcus lactis NZ3900 не вырабатывает тельца включения и не производит споры. Более того штамм Lactococcus lactis NZ3900 не вырабатывает внеклеточные протеиназы.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие соответствующие гетерологичные факторы, модифицированы для повышения экспрессии, секреции и/или стабильности кодируемого гетерологичного фактора.
Подходящие модификации известны специалистам в данной области техники и включают, например, корректировку частоты использования кодонов по меньшей мере одной последовательности нуклеиновой кислоты для используемых пробиотических бактерий.
Например, по меньшей мере одна последовательность нуклеиновой кислоты может быть сконструирована так, чтобы соответствовать профилю частоты использования кодонов применяемых пробиотических бактерий. Помимо этого, в дополнение к общей оптимизации кодонов могут быть использованы таблицы специфичных кодонов, например, таблицы кодонов для высокого уровня экспрессии генов рибосомных белков соответствующих пробиотических бактерий, чтобы дополнительно увеличить трансляцию кодируемых факторов.
Подходящие модификации также включают, например, встраивание последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей секреторную сигнальную последовательность на 5'-конце открытой рамки считывания (ОРС) гетерологичного фактора, чтобы получить гибридный белок, содержащий секреторную сигнальную последовательность и указанный гетерологичный фактор. Секреторная сигнальная последовательность предпочтительно расположена на N-конце соответствующего гетерологичного фактора.
Секреторная сигнальная последовательность предпочтительно направляет вновь синтезированный белок к плазматической мембране. На конце секреторной сигнальной последовательности, предпочтительно сигнального пептида или пропептида, предпочтительно находится участок аминокислотной последовательности, который распознается и отщепляется сигнальной пептидазой с образованием свободной секреторной сигнальной последовательности, предпочтительно сигнального пептида или пропептида, и зрелого гетерологичного фактора, который секретируется во внеклеточное пространство.
У бактерий существуют два основных пути секреции белков через цитоплазматическую мембрану. Общий путь секреции, называемый Sec-путь, катализирует трансмембранную транслокацию белков в их развернутой конформации, после чего они складываются с образованием своей нативной структуры на другой стороне мембраны.
«Двойной аргининовый» (Arg-Arg мотив) путь транслокации, названный Tat-путь, катализирует транслокацию секреторных белков в сложенном состоянии.
Подходящие последовательности сигналов секреции включают, например, сигнальный пептид.
Предпочтительно последовательность сигнала секреции представляет собой нативный сигнальный пептид или пропептид соответствующего гетерологичного фактора, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, который предпочтительно представляет собой предшественник и/или препробелок соответствующего фактора.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанная последовательность сигнала секреции представляет собой гомологичную секреторную последовательность из указанных рекомбинантных пробиотических бактерий, предпочтительно указанная последовательность сигнала секреции представляет собой сигнальную последовательность убиквитин-специфичной пептидазы 45 (Usp 45) Lactococcus sp. Сигнал секреции Usp 45 имеет очень высокую эффективность секреции. Другие сигналы секреции известны специалисту в данной области техники и включают, например, SP310, SPEXP4 и AL9 Lactococcus sp.
Например, нативный сигнальный пептид гетерологичного фактора может быть заменен гомологичной последовательностью сигнала секреции из пробиотических бактерий, используемых для экспрессии указанного гетерологичного фактора.
Последовательность сигнала секреции предпочтительно улучшает эффективность секреции гетерологичного соответствующего фактора. Например, в Lactococcus lactis большинство белков секретируются посредством Sec-пути. Белки синтезируются в качестве предшественников, содержащих зрелый фрагмент белков с N-концевым сигнальным пептидом. Сигнальный пептид направляет белок к цитоплазматической мембране. После отщепления сигнального пептида зрелый белок высвобождается во внеклеточное пространство.
Также предпочтительно секреторный сигнал содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения соответствующий гетерологичный фактор экспрессируется в виде пропептида, содержащего усиливающий секрецию фактор или не содержащего указанный фактор. Пропептид может быть расщеплен протеазами для высвобождения зрелого гетерологичного фактора.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения рекомбинантные пробиотические бактерии содержат по меньшей мере один инактивированный ген, кодирующий ключевой белок, необходимый для жизнеспособности указанных пробиотических бактерий.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения ключевой белок, который необходим для жизнеспособности указанных пробиотических бактерий, представляет собой белок, еще более предпочтительно фермент, необходимый для синтеза органического соединения, необходимого для жизнеспособности указанных пробиотических бактерий.
После инактивации указанного ключевого белка, предпочтительно фермента, соответствующее органическое соединение представляет собой ауксотрофный фактор, который необходим для жизнеспособности рекомбинантных пробиотических бактерий и должен быть восполнен, чтобы поддерживать жизнеспособность рекомбинантных пробиотических бактерий.
Предпочтительно указанный ауксотрофный фактор представляет собой витамин, аминокислоту, нуклеиновую кислоту и/или жирную кислоту.
Например, аминокислоты и нуклеотиды представляют собой биологически важные органические соединения, которые являются предшественниками белков и нуклеиновых кислот, соответственно.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере один ген, необходимый для жизнеспособности пробиотических бактерий, выбран из группы, состоящей из аланинрацемазы (alaR), тимидилатсинтазы (thyA), аспарагинсинтетазы (asnH), СТР-синтазы (pyrG), триптофансинтазы (trbBA) и их комбинаций.
Например, аланинрацемаза представляет собой фермент, который катализирует превращение L-аланина в D-аланин. D-аланин, вырабатываемый под действием аланинрацемазы, используется для синтеза пептидогликанов. Пептид огликан обнаруживается в клеточных стенках всех бактерий.
Специалисту в данной области техники известно, что инактивация гена аланинрацемазы (alaR) у бактерий приводит к зависимости бактерий от внешнего источника D-аланина для поддержания целостности клеточной стенки.
Специалисту в данной области техники известно, что, например, Lactococcus lactis и Lactobacillus plantarum содержат один ген alaR. Инактивация гена влияет на встраивание D-аланина в клеточную стенку.
Бактерия Lactococcus lactis, например, с инактивированным геном аланинрацемазы (alaR) зависит от внешнего источника D-аланина, чтобы иметь возможность синтезировать пептидогликан и включать D-аланин в липотейхоевую кислоту (LTA). Указанные бактерии быстро подвергаются цитолизу при удалении D-аланина, например, в середине фазы экспоненциального размножения.
Штаммы молочнокислых бактерий, дефицитные по аланинрацемазе, могут быть получены, например, способами, известными в данной области техники.
Тимидилатсинтаза представляет собой фермент, который катализирует превращение дезоксиуридинмонофосфата (дУМФ) в монофосфат дезокситимидилата (дТМФ). дТМФ представляет собой один из трех нуклеотидов, образующих тимин (дТМФ, дТДФ и дТТФ). Тимидин входит в состав нуклеиновых оснований в ДНК.
Специалисту в данной области техники известно, что тимидилатсинтаза играет решающую роль на ранних этапах биосинтеза ДНК. Например, повреждение ДНК или делеция участка ДНК может происходить под действием эндогенных факторов и факторов окружающей среды.
Помимо этого, синтез ДНК необходим для пролиферации пробиотических бактерий.
Инактивация гена тимидилатсинтазы (thyA) у бактерий приводит к зависимости бактерий от внешнего источника тимидина для поддержания целостности ДНК.
Аспарагинсинтетаза представляет собой фермент, который синтезирует аминокислоту аспарагин из аспартата. Инактивация гена аспарагинсинтетазы (asnH) приводит к неспособности синтезировать соответствующую аминокислоту, которая становится ауксотрофным фактором.
СТР-синтаза представляет собой фермент, участвующий в синтезе пиримидинов. СТР-синтаза осуществляет взаимное превращение уридин-5'-трифосфата (УТФ) и цитидинтрифосфата (ЦТФ). Инактивация гена СТР-синтазы (pyrG) приводит к тому, что бактерии теряют способность синтезировать цитозиновые нуклеотиды в ходе синтеза de novo, а также с помощью путей синтеза уридина клеточной стенки.
ЦТФ становится ауксотрофным фактором, который должен быть восполнен для синтеза РНК и ДНК.
Триптофансинтаза представляет собой фермент, который катализирует два последних этапа биосинтеза аминокислоты триптофана.
Инактивация гена триптофансинтазы (trpBA) приводит к неспособности бактерий синтезировать соответствующую аминокислоту, которая становится ауксотрофным фактором.
Способы инактивации указанного гена, необходимого для жизнеспособности пробиотических бактерий, известны специалисту в данной области техники и включают удаление гена, мутирование гена, эпигенетическую модификацию указанного гена, опосредованное РНК-интерференцией (RNAi) подавление указанного гена, трансляционное ингибирование указанного гена или их комбинации.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения соответствующий ауксотрофный фактор обеспечивается совместно с указанными пробиотическими бактериями.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанный инактивированный ген, необходимый для жизнеспособности пробиотических бактерий, используется для сдерживания с помощью факторов окружающей среды.
После применения рекомбинантных пробиотических бактерий, содержащих по меньшей мере один инактивированный ген, необходимый для жизнеспособности указанных пробиотических бактерий, соответствующий ауксотрофный фактор должен быть обеспечен извне, например, путем внесения среды или культуральной среды.
В том случае, если рекомбинантные пробиотические бактерии высвобождаются в окружающую среду, ауксотрофный фактор отсутствует, и предпочтительно рекомбинантные пробиотические бактерии погибают.
Помимо этого, применение ауксотрофного фактора, обеспечиваемого извне, позволяет контролировать биосинтез и высвобождение соответствующих гетерологичных факторов.
Предпочтительно по меньшей мере один из указанного первого фактора, указанного второго фактора и указанного третьего фактора представляет собой фактор, который может высвобождаться из указанных рекомбинантных пробиотических бактерий. Также предпочтительно по меньшей мере один из указанного первого фактора, указанного второго фактора и указанного третьего фактора секретируется из указанных рекомбинантных пробиотических бактерий.
Например, у грамположительных бактерий, таких как молочнокислые бактерии, белки, которые секретируются из бактерии, предпочтительно синтезируются в виде предшественника, содержащего N-концевой сигнальный пептид и зрелый фрагмент белка. Предшественники распознаются секреторными молекулярными комплексами бактерий и перемещаются через цитоплазматическую мембрану. Сигнальный пептид затем отщепляется и разрушается, и зрелый белок секретируется из бактерий, например, в супернатант культуры или в область воспалительного нарушения функции кожи.
Например, Lactococcus lactis способны секретировать белки как с низкой молекулярной массой, например, менее 10 кДа, так и с высокой молекулярной массой, например, молекулярной массой более 160 кДа, посредством Sec-зависимого пути.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере один из указанного первого фактора, указанного второго фактора и указанного третьего фактора высвобождается из указанных рекомбинантных пробиотических бактерий через цитоплазматическую мембрану с повышенной проницаемостью.
Например, при использовании низина в качестве индуктора для синтеза белка в указанных рекомбинантных пробиотических бактериях, низин также образует поры в цитоплазматической мембране, через которые по меньшей мере один из указанного первого фактора, указанного второго фактора и указанного третьего фактора высвобождается из пробиотических бактерий.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения цитоплазматическая мембрана указанных рекомбинантных пробиотических бактерий становится более проницаемой вследствие нарушенного синтеза компонентов клеточной стенки.
Например, указанные рекомбинантные пробиотические бактерии содержат инактивированный ген аланинрацемазы (alaR). В отсутствие D-аланина указанные рекомбинантные пробиотические бактерии не могут поддерживать целостность цитоплазматической мембраны, и впоследствии по меньшей мере один из указанного первого фактора, указанного второго фактора и указанного третьего фактора высвобождается из указанных рекомбинантных пробиотических бактерий.
В процессе заживления указанного воспалительного нарушения функции кожи высвобожденный первый гетерологичный фактор, второй гетерологичный фактор и/или третий гетерологичный фактор может подвергаться разложению, например, с помощью протеазного расщепления, что может привести к потере биологической активности указанных гетерологичных факторов.
Разложение или истощение указанных гетерологичных факторов может быть компенсировано замедленным высвобождением указанных гетерологичных факторов из указанных рекомбинантных пробиотических бактерий. Предпочтительно указанные рекомбинантные пробиотические бактерии экспрессируют с постоянным уровнем по меньшей мере один из указанного первого гетерологичного фактора, указанного второго гетерологичного фактора и указанного третьего гетерологичного фактора. Предпочтительно указанные рекомбинантные пробиотические бактерии постоянно высвобождают указанные гетерологичные факторы.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанные пробиотические бактерии представлены в виде фармацевтической композиции для применения в лечении указанного воспалительного нарушения функции кожи.
Предпочтительно указанная фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество, которое также предпочтительно является подходящим для предполагаемого пути введения.
Предпочтительно указанный фармацевтически приемлемый носитель или указанное фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество содержит по меньшей мере один полимерный носитель, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из полисахаридов, сложных полиэфиров, полиметакриламида и их смесей. Например, указанный фармацевтически приемлемый носитель представляет собой гидрогель, который, например, дополнительно обеспечивает оптимальную влажность окружающей среды, чтобы стимулировать заживление раны. Помимо этого, фармацевтически приемлемый носитель способствует адгезии указанных рекомбинантных пробиотических бактерий в очаге указанного воспалительного нарушения функции кожи после нанесения.
Предпочтительно указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно питательное вещество для указанных рекомбинантных пробиотических бактерий, предпочтительно указанное вещество выбрано из группы, состоящей из углеводов, витаминов, минералов, аминокислот, микроэлементов и их смесей.
Также предпочтительно указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит по меньшей мере один компонент для стабилизации по меньшей мере одного из указанного первого фактора, указанного второго фактора и указанного третьего фактора.
Указанное стабилизирующее соединение предпочтительно выбрано из группы, состоящей из противомикробных агентов, криопротекторов, ингибиторов протеаз, восстанавливающих агентов, хелатирующих металл агентов и их смесей.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанные рекомбинантные пробиотические бактерии находятся в растворе, заморожены или высушены, предпочтительно лиофилизированы или высушены распылением.
Предпочтительно указанные рекомбинантные пробиотические бактерии предназначены для применения в растворе, например, в виде указанной фармацевтической композиции.
Согласно другому варианту реализации указанные рекомбинантные пробиотические бактерии заморожены или высушены, предпочтительно лиофилизированы или высушены распылением. Рекомбинантные пробиотические бактерии могут быть восстановлены перед использованием.
После применения рекомбинантные пробиотические бактерии могут быть приведены в контакт с по меньшей мере одним указанным индуктором, предпочтительно для того чтобы индуцировать экспрессию по меньшей мере одного из указанного первого фактора, указанного второго фактора и указанного третьего фактора.
Также предпочтительно по меньшей мере один из указанного первого фактора, указанного второго фактора и указанного третьего фактора высвобождается из указанных бактерий после индукции их экспрессии.
Литературные источники
Brian et al. (2000): «Improved vector for nisin-controlled expression in gram-positive bacteria», plasmid 44 (2), 2000, pages 183 to 190.
Davis et al. (2013): Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in cryptococcus neoformans infection, mbio. 4(3), 2013, e00264-13. doi:10.1128/mBio. 00264-13.
de Ruyter et al. (1996): Functional analysis of promoters in the nisin gene cluster of Lactococcus lactis. J. Bacteriol. 178 (12), 1996, pages 3434 to 3439.
Duluc et al. (2007): Tumor-associated leukemia inhibitory factor and IL-6 skew monocyte differentiation into tumor-associated macrophage-like cells, Blood 110(13), 2007, pages 4319 to 4330.
Hao et al. (2012): Macrophages in tumor microenvironments and the progression of Tumors: Clin. Dev. Immunol. 2012, pages 1 to 11
van Asseldonk et al. (1993): Functional analysis of the Lactococcus lactis usp45 secretion signal in the secretion of a homologous proteinase and a heterologous alpha-amylase. Mol. Gen. Genet. 240 (3), 1993, pages 428-434.
van Asseldonk et al. (1990): Cloning of usp45, a gene encoding a secreted protein from Lactococcus lactis subsp. lactis MG1363. Gene 95 (1), 1990, pages 155 to 160.
Richard et al. (1995): Effect of topical basic fibroblast growth factor on the healing of chronic diabetic neuropathic ulcer of the foot. A pilot, randomized, double-blind, placebo-controlled study; Diabetes Care 18 (1), 1995, page 64 to 69.
Последовательности
SEQ ID NO: 1-3 соответствуют предшественнику изоформ 1-3 КСФ-1 человека, соответственно, включая сигнальный пептид.
SEQ ID NO: 4 соответствует зрелому КСФ-1 человека.
SEQ ID NO: 5 соответствует синтетической конструкции КСФ-1, используемой в примере 1, включая сигнал секреции Usp45 из Lactococcus lactis, который содержит аминокислоты 1-27 указанного белка, и зрелый КСФ-1 человека, который содержит аминокислоты 28-185 указанного белка.
SEQ ID NO: 6 соответствует синтетической конструкции КСФ-1, полученной после секреции из Lactococcus lactis, экспрессирующих рКСФ-1.
SEQ ID NO: 7 и 8 соответствуют предшественнику изоформ 1 и 2 ИЛ-34 человека, соответственно, включая сигнальный пептид.
SEQ ID NO: 9 соответствует зрелому ИЛ-34 человека.
SEQ ID NO: 10 и 11 соответствуют предшественнику изоформ 1 и 2 ИЛ-4 человека, соответственно, включая сигнальный пептид.
SEQ ID NO: 12 соответствует зрелому ИЛ-4 человека.
SEQ ID NO: 13 соответствует синтетической конструкции ИЛ-4 человека, используемой в примере 1, включая сигнал секреции Usp45 из Lactococcus lactis, который содержит аминокислоты 1-27 указанного белка, и зрелый ИЛ-4 человека, который содержит аминокислоты 28-185 указанного белка.
SEQ ID NO: 14 соответствует синтетической конструкции ИЛ-4, полученной после секреции из Lactococcus lactis, экспрессирующих рИЛ-4.
SEQ ID NO: 15 соответствует предшественнику ИЛ-10 человека, включая сигнальный пептид.
SEQ ID NO: 16 соответствует зрелому ИЛ-10 человека.
SEQ ID NO: 17 соответствует предшественнику ИЛ-13 человека, включая сигнальный пептид.
SEQ ID NO: 18 соответствует зрелому ИЛ-13 человека.
SEQ ID NO: 19 соответствует предшественнику ТФР-β1 человека, включая сигнальный пептид.
SEQ ID NO: 20 соответствует зрелому ТФР-β1 человека.
SEQ ID NO: 21 и 22 соответствуют предшественнику изоформы 1 и 2 ТФР-β2 человека, соответственно, включая сигнальный пептид.
SEQ ID NO: 23 соответствует зрелому ТФР-β2 человека.
SEQ ID NO: 24 соответствует препробелку ТФР-β3 человека, включая сигнальный пептид.
SEQ ID NO: 25 соответствует зрелому ТФР-β3 человека.
SEQ ID NO: 26 соответствует препробелку ФРФ-2 человека, включая пропептид.
SEQ ID NO: 27 соответствует зрелому ФРФ-2 человека после секреции (hFGF2-155).
SEQ ID NO: 28 соответствует частичной последовательности зрелого ФРФ-2 человека.
SEQ ID NO: 29 соответствует синтетической конструкции ФРФ-2 человека, использованной в примере 1, включая сигнал секреции Usp45 из Lactococcus lactis, который содержит аминокислоты 1-27 указанного белка, и зрелый ФРФ-2 человека, который соответствует аминокислотам 136-288 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 26.
SEQ ED NO: 30 соответствует варианту чФРФ-2-153 ФРФ-2 человека, использованному в примере 1, после секреции из Lactococcus lactis, экспрессирующих рФРФ.
SEQ ID NO: 31 соответствует ФРГ человека.
SEQ ID NO: 32 соответствует альфа-цепи ФРГ человека.
SEQ ID NO: 33 соответствует бета-цепи ФРГ человека.
SEQ ID NO: 34 соответствует сигналу секреции Usp45 из Lactococcus lactis.
SEQ ID NO: 35 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты плазмиды pNZ8149.
SEQ ID NO: 36-43 соответствуют праймерам, используемым в примерах.
SEQ ID NO: 44 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты промотора низина А из Lactococcus lactis.
SEQ ID NO: 45 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты синтетической конструкции ssUsp45-FGF2-153, содержащей промотор низина А, сигнальную последовательность Usp45 и ген чФРФ-2-153.
SEQ ID NO: 46 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты плазмиды рФРФ-2.
SEQ ID NO: 47 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты синтетической конструкции ssUsp45-hИЛ-4, содержащей промотор низина А, сигнальную последовательность Usp45 и ген чИЛ-4.
SEQ ID NO: 48 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты плазмиды рИЛ-4.
SEQ ID NO: 49 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты синтетической конструкции ssUsp45-чКCФ-1, содержащей промотор низина А, сигнальную последовательность Usp45 и ген чКСФ-1.
SEQ ID NO: 50 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты плазмиды рКСФ-1.
SEQ ID NO: 51-53 соответствуют последовательностям нуклеиновых кислот, обеспечивающим соответствующие участки связывания рибосомы, включая стартовый кодон (ATG) соответствующей открытой рамки считывания, используемой в примерах.
SEQ ID NO: 54 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты 3'-конца рибосомальной РНК 16S (рРНК) из Lactococcus lactis.
SEQ ID NO: 55 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты синтетической конструкции КСФ-RBS1-ФРФ-RBS2-ИЛ-4, представленной на Фигуре 24b. SEQ ID NO: 56 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты синтетической конструкции ФРФ-RBS1-ИЛ-4-RBS2-КСФ, представленной на Фигуре 24с. SEQ ID NO: 57 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты синтетической конструкции ИЛ4-RBS1-КСФ-RBS2-ФРФ, представленной на Фигуре 24d.
SEQ ID NO: 58 соответствует аминокислотной последовательности препробелка изоформы 1 эпидермального фактора роста из Homo sapiens. SEQ ID NO: 59 соответствует аминокислотной последовательности препробелка изоформы 2 эпидермального фактора роста из Homo sapiens. SEQ ID NO: 60 соответствует аминокислотной последовательности препробелка изоформы 3 эпидермального фактора роста из Homo sapiens. SEQ ID NO: 61 соответствует аминокислотной последовательности зрелого эпидермального фактора роста из Homo sapiens. SEQ ID NO: 62 соответствует аминокислотной последовательности предшественника связывающего гепарин ЭФР-подобного фактора роста из Homo sapiens. SEQ ID NO: 63 соответствует аминокислотной последовательности зрелого связывающего гепарин ЭФР-подобного фактора роста из Homo sapiens.
SEQ ID NO: 64 соответствует аминокислотной последовательности препробелка изоформы 1 трансформирующего фактора роста альфа из Homo sapiens. SEQ ID NO: 65 соответствует аминокислотной последовательности препробелка изоформы 2 трансформирующего фактора роста альфа из Homo sapiens. SEQ ID NO: 66 соответствует аминокислотной последовательности препробелка изоформы 3 трансформирующего фактора роста альфа из Homo sapiens. SEQ ID NO: 67 соответствует аминокислотной последовательности препробелка изоформы 4 трансформирующего фактора роста альфа из Homo sapiens. SEQ ID NO: 68 соответствует аминокислотной последовательности препробелка изоформы 5 трансформирующего фактора роста альфа из Homo sapiens. SEQ ID NO: 69 соответствует аминокислотной последовательности зрелого трансформирующего фактора роста альфа из Homo sapiens.
SEQ ID NO: 70 соответствует аминокислотной последовательности препробелка амфирегулина из Homo sapiens. SEQ ID NO: 71 соответствует аминокислотной последовательности зрелого амфирегулина из Homo sapiens.
SEQ ID NO: 72 соответствует аминокислотной последовательности препробелка эпирегулина из Homo sapiens. SEQ ID NO: 73 соответствует аминокислотной последовательности зрелого эпирегулина из Homo sapiens.
SEQ ID NO: 74 соответствует аминокислотной последовательности предшественника изоформы 1 эпигена из Homo sapiens. SEQ ID NO: 75 соответствует аминокислотной последовательности предшественника изоформы 2 эпигена из Homo sapiens. SEQ ID NO: 76 соответствует аминокислотной последовательности предшественника изоформы 3 эпигена из Homo sapiens. SEQ ID NO: 77 соответствует аминокислотной последовательности предшественника изоформы 4 эпигена из Homo sapiens. SEQ ID NO: 78 соответствует аминокислотной последовательности предшественника изоформы 5 эпигена из Homo sapiens. SEQ ID NO: 79 соответствует аминокислотной последовательности предшественника изоформы 6 эпигена из Homo sapiens. SEQ ID NO: 80 соответствует аминокислотной последовательности предшественника изоформы 7 эпигена из Homo sapiens. SEQ ID NO: 81 соответствует аминокислотной последовательности зрелого эпигена из Homo sapiens.
SEQ ID NO: 82 соответствует аминокислотной последовательности предшественника бетацеллюлина из Homo sapiens. SEQ ID NO: 83 соответствует аминокислотной последовательности зрелого бетацеллюлина из Homo sapiens.
Нижеследующие Фигуры и примеры приведены исключительно для иллюстративных целей. Настоящее изобретение не должно быть истолковано, как ограниченное следующими примерами:
Фигуры:
На Фигуре 1 представлены результаты исследования эталонного белка ФРФ-2 человека методом электрофореза в ДСН-ПААГ.
На Фигуре 2 показана карта плазмиды вектора экспрессии pNZ8149. «LacF» обозначает селективный маркер для размножения штамма хозяина NZ3900 в присутствии лактозы; «Pnis» обозначает промотор низина А из оперона низина Lactococcus lactis; «Т» обозначает терминатор; «repC» и «repA» обозначают гены репликации. Последовательность нуклеиновой кислоты также представлена в SEQ ID NO: 35.
На Фигуре 3 представлена последовательность нуклеиновой кислоты промотора низина A L. lactis, который также представлен на SEQ ID NO: 44.
На Фигурах 4а, 4b и 4с представлены значения SignalP 4.1, полученные с использованием аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 5, соответственно.
На Фигурах 5a, 5b и 5c представлены синтезированные вставки, используемые в примере 1, а также соответствующая аминокислотная последовательность. «ФРФ-2-153» обозначает вставку, кодирующую ФРФ-2 человека. «чИЛ-4» обозначает вставку, кодирующую ИЛ-4 человека. «чКСФ-1» обозначает вставку, кодирующую КСФ-1 человека. «PnisA» обозначает промотор низина А из оперона низина Lactococcus lactis. «ssUsp45» обозначает сигнальную последовательность гена Usp45 из Lactococcus lactis. Звездочка обозначает стоп-кодон. Соответствующие последовательности нуклеиновых кислот также представлены в SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 49.
На Фигурах 6а, 6b и 6с представлены результаты исследования потенциальных колоний Lactococcus lactis NZ3900, экспрессирующих рФРФ-2, рИЛ-4 и рКСФ-1, соответственно, методом ПЦР для анализа колоний.
На Фигурах 7а, 7b и 7с представлены карты плазмид, а также последовательности нуклеиновых кислот плазмид рФРФ-2, рИЛ-4 и рКСФ-1, соответственно, для экспрессии и секреции чФРФ-2, чИЛ-4 и чКСФ-1, соответственно, в Lactococcus lactis. «Pnis» обозначает промотор низина А из оперона низина Lactococcus lactis; «Т» обозначает терминатор; «rерС» и «rерА» обозначают гены репликации. Последовательности нуклеиновых кислот плазмид рФРФ-2, рИЛ-4 и рКСФ-1 представлены в SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 50, соответственно.
На Фигуре 8 представлены результаты исследования методом вестерн-блоттинга образцов ферментации Lactococcus, экспрессирующих NZ3900 (рФРФ-2), при различных условиях индукции. «0,5/5» обозначает индукцию при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина; «3/5» обозначает индукцию при OD600=3 с использованием 5 нг/мл низина, «Т» обозначает временную точку, при которой образец был отобран из ферментационной суспензии.
На Фигуре 9 представлены результаты исследования методом электрофореза в ДСН-ПААГ образцов супернатанта (Sup) из опытов с ферментацией в контролируемых условиях после окрашивания Кумасси синим (Coom), и результаты исследования методом вестерн-блоттинга (WB) образцов ферментации Lactococcus, экспрессирующих NZ3900 (рИЛ-4). «0,5/5» обозначает индукцию при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина; «3/5» обозначает индукцию при OD600=3 с использованием 5 нг/мл низина, «Т» обозначает временную точку, при которой образец был отобран из ферментационной суспензии.
На Фигуре 10 представлены результаты исследования методом электрофореза в ДСН-ПААГ образцов супернатанта (Sup) из опытов с ферментацией в контролируемых условиях после окрашивания Кумасси синим (Coom) образцов ферментации Lactococcus, экспрессирующих NZ3900 (рКСФ-1). «0,5/5» обозначает индукцию при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина; «3/5» обозначает индукцию при OD600=3 с использованием 5 нг/мл низина, «Т» обозначает временную точку, при которой образец был отобран из ферментационной суспензии.
На Фигуре 11 представлены результаты исследования методом вестерн-блоттинга (WB) образцов ферментации Lactococcus, экспрессирующих NZ3900 (рКСФ-1). «0,5/5» обозначает индукцию при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина; «3/5» обозначает индукцию при OD600=3 с использованием 5 нг/мл низина, «Т» обозначает временную точку, при которой образец был отобран из ферментационной суспензии.
На Фигуре 12 представлены параметры размножения закисляющих культур для эксперимента с индукцией в условиях, которые напоминают обстоятельства заживления ран.
На Фигуре 13 представлены результаты исследования выработки чФРФ-2 в супернатанте после индукции при рН=5 или OD600=3 методами электрофореза в ДСН-ПААГ и вестерн-блоттинга.
На Фигуре 14а представлены результаты количественного исследования миграции фибробластов человека, описанного в примере 4а, после 72 часов воздействия рекомбинантных пробиотических бактерий, экспрессирующих чФРФ-2 или коммерчески доступного продукта фибласта (Fiblast).
На Фигуре 14b представлены результаты количественного исследования миграции фибробластов человека, описанного в примере 4а, после 72 часов воздействия рекомбинантных пробиотических бактерий, экспрессирующих чИЛ-4, или рекомбинантного ИЛ-4 человека.
На Фигуре 14с представлены результаты исследования индукции фосфорилирования ERK 1+2 в нормальных фибробластах кожи человека (НФКЧ) под действием культуральной среды AUP-10, содержащей 0,4-80 нг/мл ФРФ-2, и под действием рчФРФ-2.
На Фигуре 14d представлены результаты исследования индукции фосфорилирования ERK 1+2 в клетках M-NFS-60 под действием культуральной среды AUP-14, содержащей 0,2-40 нг/мл КСФ-1, и под действием рчКСФ-1.
На Фигуре 14е представлены результаты ингибирования ЛПС-индуцированной выработки мРНК ФНО-альфа в клетках человека ТНР-1, как описано в примере 4с.
На Фигуре 14f представлены результаты исследования индукции экспрессии РНК генов М2 для рецептора маннозы 1 макрофагов (Mrc1) и Kruppel-подобного фактора 4 (KLF4) в макрофагах, полученных из ТНР1, как описано в примере 4d.
На Фигуре 14g представлены результаты оценки влияния AUP-12 и чрИЛ-4 на транскрипционную активность STAT-6 в гибридной линии глиальных клеток человека МО3.13, как описано в примере 4е.
На Фигуре 14h представлены результаты оценки влияния AUP-12 и чрИЛ-4 на транскрипционную активность STAT-6 в клетках мезонефроса человека 293Т, как описано в примере 4е.
На Фигуре 15а представлены результаты экспериментов по заживлению ран, описанных в примере 5.
На Фигуре 15b представлены результаты сравнения статуса заживления ран для контроля, положительного контроля и AUP-16-обработанной ткани после указанных временных точек, описанных в примере 5.
На Фигуре 15с представлены результаты сравнения оставшейся раневой области после 8-го дня и 12-го дня для положительного контроля (группа лечения 17) и AUP-16-обработанной ткани (группа лечения 18), описанных в примере 5.
На Фигуре 16а представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы а макрофагального колониестимулирующего фактора 1 из Homo sapiens. На Фигуре 16b представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы b макрофагального колониестимулирующего фактора 1 из Homo sapiens. На Фигуре 16с представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы с макрофагального колониестимулирующего фактора 1 из Homo sapiens. На Фигуре 16d представлена аминокислотная последовательность зрелого человека макрофагального колониестимулирующего фактора 1.
На Фигуре 17а представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы 1 интерлейкина 34 из Homo sapiens. На Фигуре 17b представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы 2 интерлейкина 34 из Homo sapiens. На Фигуре 17с представлена аминокислотная последовательность интерлейкина 34 из Homo sapiens.
На Фигуре 18а представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы 1 интерлейкина 4 из Homo sapiens. На Фигуре 18b представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы 2 интерлейкина 4 из Homo sapiens. На Фигуре 18с представлена аминокислотная последовательность интерлейкина 4 из Homo sapiens.
На Фигуре 19а представлена аминокислотная последовательность предшественника интерлейкина 10 из Homo sapiens. На Фигуре 19b представлена аминокислотная последовательность интерлейкина 10 из Homo sapiens.
На Фигуре 20а представлена аминокислотная последовательность предшественника интерлейкина 13 из Homo sapiens. На Фигуре 20b представлена аминокислотная последовательность интерлейкина 13 из Homo sapiens.
На Фигуре 21а представлена аминокислотная последовательность предшественника трансформирующего фактора роста бета 1 из Homo sapiens. На Фигуре 21b представлена аминокислотная последовательность трансформирующего фактора роста бета 1 из Homo sapiens. На Фигуре 21с представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы 1 трансформирующего фактора роста бета 2 из Homo sapiens. На Фигуре 21d представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы 2 трансформирующего фактора роста бета 2 из Homo sapiens. На Фигуре 21е представлена аминокислотная последовательность трансформирующего фактора роста бета 2 из Homo sapiens. На Фигуре 21f представлена аминокислотная последовательность препробелка трансформирующего фактора роста бета 3 из Homo sapiens. На Фигуре 21g представлена аминокислотная последовательность трансформирующего фактора роста бета 3 из Homo sapiens.
На Фигуре 22а представлена аминокислотная последовательность предшественника фактора роста фибробластов 2 из Homo sapiens. На Фигуре 22b представлена аминокислотная последовательность фрагмента фактора роста фибробластов 2 из Homo sapiens.
На Фигуре 23а представлена аминокислотная последовательность фактора роста гепатоцитов из Homo sapiens. На Фигуре 23b представлена аминокислотная последовательность альфа-цепи фактора роста гепатоцитов из Homo sapiens. На Фигуре 23с представлена аминокислотная последовательность бета-цепи фактора роста гепатоцитов из Homo sapiens.
На Фигуре 24а показан обзор трех участков связывания рибосомы, используемых в примере 2d. Соответствующие последовательности синтезированных последовательностей ДНК КСФ-RBS1-ФРФ-RBS2-ИЛ-4, ФРФ-RBS1-ИЛ-4-RBS2-КСФ и ИЛ-4-RBS-КСФ-RBS2-ФРФ, используемых в примере 2d, представлены на Фигурах 24b-24d, соответственно, а также приведены в SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57, соответственно. На Фигурах 24e-24g показаны соответствующие гели после электрофореза в ДСН-ПААГ, а также исследования методом вестерн-блоттинга, полученные с использованием конструкций отдельных оперонов, использованных в примере 2d.
На Фигуре 25а представлена аминокислотная последовательность препробелка изоформы 1 эпидермального фактора роста из Homo sapiens. На Фигуре 25b представлена аминокислотная последовательность препробелка изоформы 2 эпидермального фактора роста из Homo sapiens. На Фигуре 25с представлена аминокислотная последовательность препробелка изоформы 3 эпидермального фактора роста из Homo sapiens. На Фигуре 25d представлена аминокислотная последовательность зрелого эпидермального фактора роста из Homo sapiens.
На Фигуре 26а представлена аминокислотная последовательность предшественника связывающего гепарин ЭФР-подобного фактора роста из Homo sapiens. На Фигуре 26b представлена аминокислотная последовательность зрелого связывающего гепарин ЭФР-подобного фактора роста из Homo sapiens.
На Фигуре 27а представлена аминокислотная последовательность препробелка изоформы 1 трансформирующего фактора роста альфа из Homo sapiens. На Фигуре 27b представлена аминокислотная последовательность препробелка изоформы 2 трансформирующего фактора роста альфа из Homo sapiens. На Фигуре 27с представлена аминокислотная последовательность препробелка изоформы 3 трансформирующего фактора роста альфа из Homo sapiens. На Фигуре 27d представлена аминокислотная последовательность препробелка изоформы 4 трансформирующего фактора роста альфа из Homo sapiens. На Фигуре 27е представлена аминокислотная последовательность препробелка изоформы 5 трансформирующего фактора роста альфа из Homo sapiens. На Фигуре 27f представлена аминокислотная последовательность зрелого трансформирующего фактора роста альфа из Homo sapiens.
На Фигуре 28а представлена аминокислотная последовательность препробелка амфирегулина из Homo sapiens. На Фигуре 28b представлена аминокислотная последовательность зрелого амфирегулина из Homo sapiens.
На Фигуре 29а представлена аминокислотная последовательность препробелка эпирегулина из Homo sapiens. На Фигуре 29b представлена аминокислотная последовательность зрелого эпирегулина из Homo sapiens.
На Фигуре 30а представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы 1 эпигена человека из Homo sapiens. На Фигуре 30b представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы 2 эпигена человека из Homo sapiens. На Фигуре 30с представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы 3 эпигена человека из Homo sapiens. На Фигуре 30d представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы 4 эпигена человека из Homo sapiens. На Фигуре 30е представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы 5 эпигена человека из Homo sapiens. На Фигуре 30f представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы 6 эпигена человека из Homo sapiens. На Фигуре 30g представлена аминокислотная последовательность предшественника изоформы 7 эпигена человека из Homo sapiens. На Фигуре 30h представлена аминокислотная последовательность зрелого эпигена из Homo sapiens.
На Фигуре 31а представлена аминокислотная последовательность предшественника бетацеллюлина из Homo sapiens. На Фигуре 31b представлена аминокислотная последовательность зрелого бетацеллюлина из Homo sapiens.
На Фигуре 32а представлена аминокислотная последовательность зрелого фактора роста фибробластов 2 из Homo sapiens. На Фигуре 32b представлена аминокислотная последовательность варианта чФРФ-2-153 фактора роста фибробластов 2, используемого в примерах.
На Фигуре 33 представлена аминокислотная последовательность варианта интерлейкина 4 человека (чИЛ-4), используемого в примерах.
На Фигуре 34 представлена аминокислотная последовательность варианта колониестимулирующего фактора 1 человека (чКСФ-1), используемого в примерах.
На Фигуре 35 представлена аминокислотная последовательность сигнала секреции белка Usp45 Lactococcus, используемого в примерах.
Примеры
1. Общие экспериментальные процедуры:
Если не указано иное, эксперименты в примерах выполняли в соответствии с протоколом производителя аналитических систем. Если не указано иное, указанные химические вещества были получены от Sigma-Aldrich Chemie Gmbh (Мюнхен, Германия), Merck KGaA (Дармштадт, Германия), Thermo Fisher Scientific Inc. (Валтман, Массачусетс, США) или Becton Dickinson and Company (Франклин-Лейке, Нью-Джерси, США).
1.1 Ростовые среды
Для разных целей клетки выращивали в различных средах. Для общих способов клонирования использовали среду М17 (Oxoid Deutschland GmbH, Везел, Германия), содержащую 0,5% глюкозы или лактозы.
Чтобы контролировать отбор колоний, пригодных для применения в пищевых продуктах, использовали среду Elliker, на которой колонии лактококков приобретают желтый цвет при размножении в присутствии лактозы. Желтая окраска представляет собой рН-эффект, который изменяет цвет индикаторного красителя бромкрезолового фиолетового в непосредственной близости от растущей колонии, а также самой колонии.
Состав среды Elliker:
- 20 г/л триптона
- 5 г/л дрожжевого экстракта
- 4 г/л NaCl,
- 1,5 г/л Na-ацетата (не содержащего воды)
- 0,5 г/л L(+)-аскорбиновой кислоты
- 15 г/л агара
рН=6,8
Стерилизация: 15 мин при 121°С.
После стерилизации и охлаждения добавляли 1% лактозы из 20% исходного раствора, стерилизованного путем нагревания и фильтрации, и 0,004% бромкрезолового фиолетового (0,4% раствор, стерилизованный путем фильтрации).
Для различных способов ферментации и других функциональных экспериментов с использованием размножения бактерий использовали среду IM1, не содержащую ингредиентов животного происхождения. Лактоза, единственный оставшийся ингредиент животного происхождения, может быть получена фармацевтической степени чистоты.
Состав среды IM1:
- 5% моногидрата лактозы (Scharlab S.L., Барселона, Испания)
- 1,5% соевого пептона
- 1% дрожжевого экстракта
- 1 мМ MgSO4×7 H2O
- 0,1 мМ MnSO4×4H2O
рН=6,7
Стерилизация: 15 мин при 110°С.
Во время ферментации буфер не добавляли, поскольку рН автоматически регулируется с помощью 2,5 М NaOH. Для культивирования исследуемых культур в условиях подкисления к среде в пробирках добавляли 2% Na-бета-глицерофосфата.
Указанный буфер нейтрализует вырабатываемый лактат и позволяет культуре достичь плотности клеток OD600=4-5.
Исходные растворы готовых конструкций NZ3900 (рФРФ-2), NZ3900 (рИЛ-4) и NZ3900 (рКСФ-1) получали после размножения в среде IM1 с добавлением лактозы и Na-бета-глицерофосфата путем добавления глицерина до конечной концентрации 20%. Исходные растворы хранили при -80°С.
1.2 Индукция выработки белка с использованием системы NICE®
Систему NICE® индуцировали с использованием концентраций низина, находящихся в диапазоне 0,1-10 нг/мл низина. Низин из Lactococcus lactis получали от Sigma (номер продукта N5764).
1.3 Методики молекулярного клонирования
Для молекулярного клонирования использовали стандартные методики, например, описанные в Green and Sambrook (2012): «Molecular cloning: a laboratory manual», 4 изд., Cold Spring Harbour Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY, USA).
Секвенирование нуклеотидных последовательностей, синтез генов и синтез праймеров выполняли в сторонней компании BaseClear (Лейден, Нидерланды).
1.4 Процедуры ферментации
Процедуры ферментации проводили в 0,5 л ферментере Multifors с 6 реакционными сосудами (Infors Benelux, Велп, Нидерланды). Инокуляцию проводили с использованием 1% предварительной культуры, которую вносили в среду IM1; скорость перемешивания составляла 200 оборотов в минуту, и температура инкубации составляла 30°C. В ходе опытов рН контролировали с помощью 2,5 М NaOH. Показатель рН, температуру и добавление NaOH непрерывно контролировали.
Индукцию с использованием низина проводили в различные моменты времени цикла размножения, используя различные количества низина, указанные в разделе результатов. Образцы также отбирали, как указано в разделе результатов.
1.5 Ферментация с использованием системы Cinac
Для мониторинга закисляющих культур использовали блок контроля рН Cinac (AMS France, Фрепийон, Франция) для непрерывного измерения изменений рН. Для того чтобы обеспечить одинаковые значения рН культуры смешивали с помощью магнитной мешалки при 200 об/мин.
1.6 Обработка образцов
Для проведения электрофореза в ДСН-ПААГ и вестерн-блоттинга образцы обрабатывали с получением трех фракций: (i) фракции супернатанта, (ii) общего клеточного экстракта (содержащего свободный от клеток экстракт, фрагменты клеточной стенки и другие твердые частицы), и (iii) свободного от клеток экстракта.
Фракцию супернатанта получали путем смешивания 1 мл супернатанта после ферментации с 150 мкл ТХУ и инкубировали при 4°С в течение не менее 1 ч. Осадок собирали центрифугированием при 20000g. Осадок использовали немедленно или хранили при -20°С; после дополнительного этапа центрифугирования для удаления следов ТХУ осадок повторно суспендировали в 15 мкл 5 мМ Трис-HCl, рН=7,5.
Затем вносили 5 мкл 4× буфера для приготовления образцов (содержащего 75 мМ ДТТ), и суспензию нагревали в течение 20 мин при 70°С. Во всех случаях в гель вносили по 20 мкл образцов.
Общие клеточные экстракты получали следующим образом: осадок из 10 мл образца периодической культуры или 1 мл ферментационной культуры растворяли в 1 мл 5 мМ Трис-HCl, рН=7,5 и переносили в пробирку с гранулами, содержащую 500 мг циркониевых гранул, и замораживали при -20°С до проведения дальнейшей обработки. После оттаивания полученную суспензию встряхивали с использованием шариковой мельницы FastPrep (MP Biomedicals LLP, Санта-Ана, Калифорния, США) 4 раза по 30 секунд при скорости 4 с периодическим охлаждением в течение 1 мин на льду. После осаждения гранул в течение 1 мин по 15 мкл супернатантов смешивали с 5 мкл буфера для загрузки образцов и обрабатывали, как указано выше.
Свободный от клеток экстракт получали путем центрифугирования общего клеточного экстракта в течение 1 мин при 20000g. Последующую подготовку образца для электрофореза в ДСН-ПААГ проводили, как описано выше.
1.7 Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (электрофорез в ДСН-ПААГ)
Электрофорез в ДСН-ПААГ проводили с использованием коммерчески доступной системы NuPAGE (Life Technologies GmbH, Дармштадт, Германия) в соответствии с протоколом производителя.
Эталонный белок ФРФ-2 человека получали от Sigma Aldrich. 50 мкг растворяли в 25 мкл 5 мМ Трис, рН=7,5 до достижения конечной концентрации 2 мкг/мкл. В пробном эксперименте по 5 и 10 мкг вносили в гель для электрофореза в ДСН-ПААГ после смешивания с 4-кратно концентрированным буфером для загрузки с получением 1-кратной концентрации буфера для загрузки.
Как показано на Фигуре 1, анализ полосок на геле указывает на присутствие мономеров, небольшого количества димера и очень небольшого количества тримера чФРФ-2. Дорожки 1 и 4 = маркер SeeBlue; дорожка 2 = 5 мкг ФРФ-2 и дорожка 3 = 10 мкг чФРФ-2. Данный гель исследовали без добавления ДТТ в буфер для загрузки и буфер для геля.
Эталонный белок ИЛ-4 человека получали от R&D systems (Миннеаполис, Миннесота, США). ИЛ-4 человека растворяли в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (5,8 мМ Na2HPO4, 4,2 мМ NaH2PO4, 145 мМ NaCl), чтобы получить конечную концентрацию 100 мкг/мл. В качестве стандарта 1 мкг вносили в каждую дорожку для окрашивания Кумасси синим, и 0,1 мкг для окрашивания серебром и вестерн-блоттинга.
Эталонный белок КСФ-1 человека получали от Abсam PLC (Кембридж, Великобритания). КСФ-1 человека растворяли в стерильной воде с получением конечной концентрации 100 мкг/мл. В качестве стандарта 1 мкг вносили в дорожку для окрашивания Кумасси синим, и 0,1 мкг для окрашивания серебром и вестерн-блоттинга.
1.8 Вестерн-блоттинг
Вестерн-блоттинт белков также проводили с использованием системы NuPAGE (модуль XCell Blot) в соответствии с протоколом LifeTechnologies. Мембрану для блоттинга предварительно вырезали из нитроцеллюлозной мембраны от Thermo Fisher Scientific Inc. В качестве буфера для переноса использовали NuPage Transfer buffer (20×) от Life Technologies. Перенос белков проводили при 35 В в течение 1 ч.
Для детектирования ФРФ-2 человека использовали очищенное моноклональное мышиное антитело к ФРФ-2 человека (BD Transduction laboratories, Гейдельберг, Германия) в разведении 1:250. Вторичное антитело представляло собой конъюгированное с пероксидазой хрена (ПХ) антитело к IgG мыши в разведении 1:10000, полученное от B.V. (Лейден, Нидерланды).
Для детектирования ИЛ-4 человека использовали моноклональное мышиное антитело IgG1 к ИЛ-4 человека от R&D systems (клон №3007) в разведении 1:500. Вторичное антитело представляло собой ПХ-конъюгированное антитело к IgG мыши в разведении 1:10000, полученное от B.V. (Лейден, Нидерланды).
Для детектирования КСФ-1 человека использовали поликлональные антитела кролика к М-КСФ человека от Abсam PLC (клон ab9693) в разведении 1:2000. Вторичное антитело представляло собой ПХ-конъюгированное антитело к IgG кролика в разведении 1:2000, полученное от B.V. (Лейден, Нидерланды).
Вестерн-блоты проявляли с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Pico, полученного от Thermo Fisher Scientific Inc.
1.9 N-концевое секвенирование аминокислотных последовательностей
Для проведения N-концевого секвенирования аминокислотных последовательностей чФРФ-2, чИЛ-4 и чКСФ-1 из супернатанта культур с контролируемой ферментацией полосы из двух дорожек гелей после электрофореза в ДСН-ПААГ, окрашенных Кумасси синим, вырезали и отправляли в Eurosequence (Гронинген, Нидерланды).
Пример 1: Наработка плазмид для экспрессии
1.1 Секвенирование плазмиды pNZ8149
Плазмиду pNZ8149 использовали в качестве вектора для экспрессии фактора роста фибробластов человека 2 (чФРФ-2), интерлейкина 4 (чИЛ-4) и колониестимулирующего фактора человека 1 (чКСФ-1) в L. lactis. Плазмиду pNZ8149 подвергали селекции в клетках-хозяевах с помощью механизма отбора в присутствии определенных питательных веществ на основании размножения L. lactis в присутствии лактозы.
В качестве контроля плазмидную ДНК выделяли и секвенировали (праймеры приведены в таблице 1). Не было обнаружено различий с имеющейся в настоящее время последовательностью. Последовательность pNZ8149 представлена в SEQ ID NO: 35.
1.1.1 Фактор роста фибробластов человека 2 (чФРФ-2)
Зрелая форма чФРФ-2 содержит 155 аминокислот и обозначается далее как чФРФ-2-155. чФРФ-2-155 имеет молекулярную массу 17,3 кДа и ИТ 9,85. Молекула содержит 4 остатка цистеина.
Вариант чФРФ-2, использованный для клонирования и экспрессии в L. lactis, лишен первых двух аминокислот, метионина и аланина, и, следовательно, содержит 153 аминокислоты. Следовательно, в дальнейшем этот вариант обозначают как чФРФ-2-153. чФРФ-2-153 имеет молекулярную массу 17,1 кДа и ИТ 9,85. Этот вариант также содержит четыре остатка цистеина.
Соответствующая аминокислотная последовательность ФРФ-2-155 человека представлена ниже на Фигуре 32а и приведена в последовательности SEQ ID NO: 27:
MAAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK RLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GVREKSDPHI KLQLQAEERG WSIKGVCAN RYLAMKEDGR LLASKCVTDE CFFFERLESN NYNTYRSRKY TSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS
Подчеркнутые аминокислоты обозначают первые две аминокислоты, метионин и аланин, которые отсутствуют в варианте чФРФ-2-153. Аминокислотная последовательность варианта чФРФ-2-153 представлена на Фигуре 32b и приведена в последовательности SEQ ID NO: 30.
Последовательность ФРФ-2-155 представляет собой последовательность зрелого ФРФ-2 человека после секреции. В условиях in vivo указанная последовательность подвергается дальнейшему расщеплению. Однако различные существующие рекомбинантные продукты основаны на последовательности из 155 аминокислот, с добавлением остатка N-концевого метионина или без него.
1.1.2 Интерлейкин 4 человека (чИЛ-4)
Зрелый белок чИЛ-4 содержит 129 аминокислот, которые соответствуют аминокислотам 25-153 в аминокислотной последовательности, доступной под номером NCBI NP_000580.1. Зрелый белок имеет молекулярную массу 14,96 кДа и ИТ 9,36. Молекула содержит 6 остатков цистеина.
Аминокислотная последовательность зрелого ИЛ-4 человека представлена ниже на Фигуре 18с и приведена в последовательности SEQ ID NO: 12:
HKCDITLQEI IKTLNSLTEQ KTLCTELTVT DIFAASKNTT EKETFCRAAT VLRQFYSHHE KDTRCLGATA QQFHRHKQLI RFLKRLDRNL WGLAGLNSCP VKEANQSTLE NFLERLKTIM REKYSKCSS
Вариант чИЛ-4, который используется для клонирования и экспрессии в L. lactis, содержит дополнительный остаток аланина на N-конце зрелого белка и, следовательно, содержит 130 аминокислот. Указанный вариант имеет молекулярную массу 15,03 кДа и ИТ 9,36. Этот вариант также содержит 6 остатков цистеина.
Соответствующая аминокислотная последовательность варианта чИЛ-4 человека, который используется для клонирования и экспрессии, представлена ниже на Фигуре 33 и приведена в последовательности SEQ ID NO: 14:
AHKCDITLQE IIKTLNSLTE QKTLCTELTV TDIFAASKNT TEKETFCRAA TVLRQFYSHH EKDTRCLGAT AQQFHRHKQL IRFLKRLDRN LWGLAGLNSC PVKEANQSTL ENFLERLKTI MREKYSKCSS
Дополнительный остаток аланина на N-конце подчеркнут в указанной выше аминокислотной последовательности.
1.1.3 Колониестимулирующий фактор человека 1 (чКСФ-1)
Аминокислотная последовательность, использованная для экспрессии, получена из последовательности предшественника КСФ-1 человека, содержащей 554 аминокислоты, доступной под номером доступа NCBI NP_000748.3. Использованная последовательность начинается с аминокислоты 33 (Е), которая является первой аминокислотой зрелого чКСФ-1, и заканчивается аминокислотой 181 (Q).
Помимо этого, к С-концу были добавлены дополнительные 9 аминокислот, которые занимают в нативном белке положения 480-488 (GHERQSEGS). Чтобы улучшить эффективность удаления сигнального пептида сигнальной пептидазой к N-концу добавили дополнительный остаток аланина. Полученная аминокислотная последовательность приведена ниже на Фигуре 34 и представлена в последовательности SEQ ID NO: 6:
AEEVSEYCSH MIGSGHLQSL QRLIDSQMET SCQITFEFVD QEQLKDPVCY LKKAFLLVQD IMEDTMRFRD NTPNAIAIVQ LQELSLRLKS CFTKDYEEHD KACVRTFYET PLQLLEKVKN VFNETKNLLD KDWNIFSKNC NNSFAECSSQ GHERQSEGS
Дополнительный остаток аланина на N-конце подчеркнут в указанной выше аминокислотной последовательности. Дополнительные 9 аминокислот, добавленные к С-концу, показаны жирным шрифтом. Белок, кодируемый указанной последовательностью, содержит 159 аминокислот, имеет молекулярную массу 18,5 кДа и ИТ 4,72. Белок содержит 7 остатков цистеина.
1.2 Конструирование плазмиды для экспрессии чФРФ-2, чИЛ-4 и чКСФ-1 в Lactococcus lactis
Цель эксперимента состояла в том, чтобы экспрессировать и секретировать чФРФ-2, чИЛ-4 и чКСФ-1, например, в супернатант ростовой среды L. lactis. Для этого использовали сигналы для транскрипции, трансляции и секреции белков. Сигналы для транскрипции и трансляции присутствовали в системе экспрессии NICE® L. lactis и происходили из промотора низина A L. lactis. Промотор низина A L. lactis представлен на Фигуре 3 и в последовательности SEQ ID NO: 44, и, например, описан в Ruyter et al. (1996).
На Фигуре 3 дополнительно показан -10 элемент и -35 элемент промотора, а также участок связывания рибосомы (RBS). Стартовый кодон ATG соответствующего целевого белка расположен непосредственно после двух остатков цистеина на 3'-конце последовательности.
Сигнал секреции был получен из белка Usp45 Lactococcus, который описан, например, в van Asseldonk et al. (1993) и van Asseldonk et al. (1990).
Сигнал секреции белка Usp45 Lactococcus представлен ниже на Фигуре 35 и приведен в последовательности SEQ ID NO: 34:
MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYA
В клетке существует механизм, который обеспечивает отщепление сигнальной последовательности от белка-мишени после секреции белка. Эта реакция катализируется сигнальной пептидазой, которая имеет определенное предпочтение в отношении некоторых аминокислот в положениях вокруг сайта расщепления.
Для оптимизации сайта расщепления использовали доступную через интернет программу SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).
С помощью указанной программы было установлено, что оптимальное расщепление аминокислотной последовательности чФРФ-2 происходит при удалении первых двух аминокислот чФРФ-2-155, при этом указанный вариант белка чФРФ-2-155 начинается с остатка Ala и содержит 153 аминокислоты (вариант чФРФ-2-153).
Соответствующая аминокислотная последовательность белка-предшественника чФРФ-2-153, используемого для анализа с помощью программы SignalP 4.1, представлена ниже и приведена в последовательности SEQ ID NO: 29:
MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYAAGS ITTLPALPED GGSGAFPPGH FKDPKRLYCK NGGFFLRIHP DGRVDGVREK SDPHIKLQLQ AEERGWSIK GVCANRYLAM KEDGRLLASK CVTDECFFFE RLESNNYNTY RSRKYTSWYV ALKRTGQYKL GSKTGPGQKA ILFLPMSAKS
Подчеркнутые аминокислоты обозначают сигнал секреции белка Usp45 Lactococcus.
С помощью программы SignalP 4.1 было установлено, что оптимальное расщепление аминокислотной последовательности чИЛ-4 происходит при добавлении остатка аланина к N-концу зрелого белка ИЛ-4 с получением белка, содержащего 130 аминокислот.
Соответствующая аминокислотная последовательность белка-предшественника чИЛ-4, используемого для анализа с помощью программы SignalP 4.1, представлена ниже и приведена в последовательности SEQ ID NO: 13:
MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYAAHK CDITLQEIIK TLNSLTEQKT LCTELTVTDI FAASKNTTEK ETFCRAATVL RQFYSHHEKD TRCLGATAQQ FHRHKQLIRF LKRLDRNLWG LAGLNSCPVK EANQSTLENF LERLKTIMRE KYSKCSS
Подчеркнутые аминокислоты обозначают сигнал секреции белка Usp45 Lactococcus.
С помощью программы SignalP 4.1 было установлено, что оптимальное расщепление аминокислотной последовательности чКСФ-1 происходит при добавлении остатка аланина к N-концу зрелого белка чКСФ-1 с получением белка, содержащего 159 аминокислот.
Соответствующая аминокислотная последовательность белка-предшественника чКСФ-1, используемого для анализа с помощью программы SignalP 4.1, представлена ниже и приведена в последовательности SEQ ID NO: 5:
MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYAAEE VSEYCSHMIG SGHLQSLQRL IDSQMETSCQ ITFEFVDQEQ LKDPVCYLKK AFLLVQDIME DTMRFRDNTP NAIAIVQLQE LSLRLKSCFT KDYEEHDKAC VRTFYETPLQ LLEKVKNVFN ETKNLLDKDW NIFSKNCNNS FAECSSQGHE RQSEGS
Подчеркнутые аминокислоты обозначают сигнал секреции белка Usp45 Lactococcus.
На Фигуре 4а представлены показания программы SignalP 4.1, полученные для аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 29, в которой сигнал секреции белка Usp45 гибридизован с N-концом чФРФ-2-153. Полученные значения свидетельствуют о присутствии явного сайта расщепления между аминокислотами 27 и 28 предшественника чФРФ-2-153, также указаны оценки для этого сайта расщепления.
На Фигуре 4b представлены показания программы SignalP 4.1, полученные для аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 13, в которой сигнал секреции белка Usp45 гибридизован с N-концом чИЛ-4. Полученные значения свидетельствуют о присутствии явного сайта расщепления между аминокислотами 27 и 28 предшественника чИЛ-4, также представлены оценки для этого сайта расщепления.
На Фигуре 4с представлены показания программы SignalP 4.1, полученные для аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 5, в которой сигнал секреции белка Usp45 гибридизован с N-концом чКСФ-1. Полученные значения свидетельствуют о присутствии явного сайта расщепления между аминокислотами 27 и 28 предшественника чКСФ-1, также приведены оценки для этого сайта расщепления.
Частота использования кодонов для соответствующих генов, кодирующих чФРФ-2-153, чИЛ-4 и чКСФ-1, была адаптирована для обычной частоты применения кодонов L. lactis. Это стандартная процедура поставщика синтеза генов.
Помимо этого, аналогичную сигнальную последовательность Usp45 использовали для всех трех белков. Следовательно, экспрессия всех трех белков и посттрансляционное отщепление сигнального пептида в одной и той же бактериальной клетке было улучшено.
Синтезировали фрагмент чФРФ-2, который содержал промотор низина А, сигнальную последовательность Usp45 и ген чФРФ-2-153. Нуклеиновая последовательность искусственной конструкции ssUsp45-ФРФ-2-153 приведена в SEQ ID NO: 45 и представлена на Фигуре 5. Частота использования кодонов была оптимизирована для обычной частоты применения кодонов L. lactis.
На Фигуре 5а показана синтезированная вставка, а также соответствующая аминокислотная последовательность, полученная после транскрипции и трансляции. ФРФ-2-153 обозначает вставку, кодирующую ФРФ-2 человека. PnisA обозначает промотор низина А из оперона низина Lactococcus lactis. ssUsp45 обозначает сигнальную последовательность гена Usp45 из Lactococcus lactis. Звездочка обозначает стоп-кодон. Помимо этого, сайты рестрикции, распознаваемые эндонуклеазами BamHI (положение 1-6) и XbaI (положение 751-756), в последовательности нуклеиновой кислоты обозначены подчеркиванием.
Синтезировали фрагмент чИЛ-4, который содержал промотор низина А, сигнальную последовательность Usp45 и ген чИЛ-4. Нуклеиновая последовательность искусственной конструкции ssUsp45-чИЛ-4 приведена в SEQ ID NO: 47 и представлена на Фигуре 5b. Частота использования кодонов была оптимизирована для обычной частоты применения кодонов L. lactis.
На Фигуре 5b показана синтезированная вставка, а также соответствующая аминокислотная последовательность, полученная после транскрипции и трансляции. чИЛ-4 обозначает вставку, кодирующую ИЛ-4 человека. PnisA обозначает промотор низина А из оперона низина Lactococcus lactis. ssUsp45 обозначает сигнальную последовательность гена Usp45 из Lactococcus lactis. Звездочка обозначает стоп-кодон. Помимо этого, сайты рестрикции, распознаваемые эндонуклеазами BamHI (положение 1-6) и XbaI (положение 682-687) в последовательности нуклеиновой кислоты, обозначены подчеркиванием.
Синтезировали фрагмент чКСФ-1, который содержал промотор низина А, сигнальную последовательность Usp45 и ген чКСФ-1. Нуклеиновая последовательность искусственной конструкции ssUsp45-чКСФ-2 приведена в SEQ ID NO: 49 и представлена на Фигуре 5с. Частота использования кодонов была оптимизирована для обычной частоты применения кодонов L. lactis.
На Фигуре 5с показана синтезированная вставка, а также соответствующая аминокислотная последовательность, полученная после транскрипции и трансляции. чКСФ-1 обозначает вставку, кодирующую КСФ-1 человека. PnisA обозначает промотор низина А из оперона низина Lactococcus lactis. ssUsp45 обозначает сигнальную последовательность гена Usp45 из Lactococcus lactis. Звездочка обозначает стоп-кодон. Помимо этого, сайты рестрикции, распознаваемые эндонуклеазами BamHI (положение 1-6) и XbaI (положение 769-774) в последовательности нуклеиновой кислоты, обозначены подчеркиванием.
Готовые продукты синтеза генов получали от BaseClear, каждый в виде фрагмента, клонированного в вектор Е. coli pUC57.
Фрагменты клонировали в плазмиду pNZ8149 путем расщепления плазмиды pUC57, содержащей соответствующие продукты синтеза генов, с использованием ферментов рестрикции BamHI и XbaI. Фрагменты после рестрикции BamHI и XbaI, содержащие соответствующие продукты синтеза гена, выделяли и лигировали в плазмиду pNZ8149, разрезанную с использованием PsuI и XbaI, с получением соответствующих плазмид рФРФ-2, рИЛ-4 и рКСФ-1. Соответствующие эндонуклеазы рестрикции были получены от Thermo Fisher Scientific Inc.
Соответствующую смесь после лигирования трансформировали в штамм L. lactis NZ3900. Проверку плазмиды проводили методом ПЦР для анализа колоний. Соответствующие нуклеиновые последовательности используемых праймеров приведены в таблице 1 ниже. Результаты представлены на Фигурах 6а-6с.
На Фигуре 6а представлены результаты исследования потенциальных колоний штамма L. lactis NZ3900, экспрессирующего рФРФ-2, методом ПЦР для анализа колоний. Дорожка 1: лямбда-ДНК, расщепленная HindIII; дорожка 2: pNZ8149 (пустой вектор), который амплифицировали с использованием праймеров nis2 и seqlacF (ожидаемый размер фрагмента 391 п.н.); дорожки 3 и 4 выделенные колонии, амплифицированные с использованием праймеров nis2 и seqlacF (ожидаемый размер фрагмента 907 п.н.).
На Фигуре 6b представлены результаты исследования потенциальных колоний штамма L. lactis NZ3900, экспрессирующего рИЛ-4, методом ПЦР для анализа колоний. Дорожка 1: лямбда-ДНК, расщепленная HindIII; дорожка 2: pNZ8149 (пустой вектор), который амплифицировали с использованием праймеров nis2 и seqlacF (ожидаемый размер фрагмента 391 п.н.); дорожки 11 и 12 выделенные колонии, амплифицированные с использованием праймеров nis2 и seqlacF (ожидаемый размер фрагмента 838 п.н.).
На Фигуре 6с представлены результаты исследования потенциальных колоний штамма L. lactis NZ3900, экспрессирующего рКСФ-1, методом ПНР для анализа колоний. Дорожка 1: лямбда-ДНК, расщепленная HindIII; дорожка 2: pNZ8149 (пустой вектор), который амплифицировали с использованием праймеров nis2 и seqlacF (ожидаемый размер фрагмента 391 п.н.); дорожка 3: выделенная колония, которую амплифицировали с использованием праймеров nis2 и seqlacF (ожидаемый размер фрагмента 925 п.н.).
На Фигуре 7а показана карта плазмиды и последовательность нуклеиновой кислоты плазмиды рФРФ-2 для экспрессии и секреции чФРФ-2 в Lactococcus lactis. lacF обозначает селективный маркер для размножения штамма-хозяина NZ3900 в присутствии лактозы; PnisA обозначает промотор низина А из оперона низина Lactococcus lactis; ssUSP45 обозначает сигнальную последовательность гена Usp45 L. lactis. Т обозначает терминатор; repC и repA обозначают гены репликации. Последовательность нуклеиновой кислоты плазмиды рФРФ-2 также приведена в SEQ ID NO: 46.
На Фигуре 7b показана карта плазмиды и последовательность нуклеиновой кислоты плазмиды рИЛ-4 для экспрессии и секреции чИЛ-4 в Lactococcus lactis. lacF обозначает селективный маркер для размножения штамма-хозяина NZ3900 в присутствии лактозы; PnisA обозначает промотор низина А из оперона низина Lactococcus lactis; ssUSP45 обозначает сигнальную последовательность гена Usp45 L. lactis. Т обозначает терминатор; repC и repA обозначает гены репликации. Последовательность нуклеиновой кислоты плазмиды рИЛ-4 также приведена в SEQ ID NO: 48.
На Фигуре 7с показана карта плазмиды и последовательность нуклеиновой кислоты плазмиды рКСФ-1 для экспрессии и секреции чКСФ-1 в Lactococcus lactis. lacF обозначает селективный маркер для размножения штамма-хозяина NZ3900 в присутствии лактозы; PnisA обозначает промотор низина А из оперона низина Lactococcus lactis; ssUsp45 обозначает сигнальную последовательность гена Usp45 L. lactis. Т обозначает терминатор; repC и repA обозначают гены репликации. Последовательность нуклеиновой кислоты плазмиды рКСФ-1 также приведена в SEQ ID NO: 50.
Пример 2: Исследование выработки рекомбинантных факторов в Lactococcus lactis
Для того чтобы исследовать выработку и секрецию соответствующих рекомбинантных факторов чФРФ-2, чИЛ-4 или чКСФ-1 из Lactococcus lactis, пять колоний после исходной трансформации отбирали для дальнейшего анализа. Указанные колонии сначала очищали с помощью высевания и выделения одиночной колонии. Пять колоний индивидуально инокулировали в среду M17, содержащую лактозу, выращивали до OD600≈0,5 и индуцировали с использованием 1 нг/мл низина.
Размножение культур прекращали, и культуры собирали через 2 ч после добавления низина. Характеристики и определенная задержка размножения у всех культур были аналогичны после добавления низина (данные не приведены).
а) Выработка чФРФ-2 в L. lactis NZ3900 (рФРФ-2) в контролируемых условиях ферментации
Для того чтобы установить выход культуры NZ3900 (рФРФ-2), проводили эксперименты с ферментацией в контролируемых условиях.
Проводили следующие пять экспериментов с ферментацией:
1. NZ3900 (рФРФ-2) без индукции;
2. NZ3900 (рФРФ-2), индуцированная при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина;
3. NZ3900 (рФРФ-2), индуцированная при OD600=3 с использованием 5 нг/мл низина;
4. NZ3900 (pNZ8149), индуцированная при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина;
5. NZ3900 (pNZ8149), индуцированная при OD600=3 с использованием 5 нг/мл низина.
Образцы отбирали при t=0 (перед индукцией), t=2 часа, t=4 часа и t=6 часов после индукции с указанным количеством низина.
Эксперименты с использованием культур 4 и 5 проводили, чтобы установить влияние 5 нг/мл низина на размножение культуры вследствие активации промотора низина, после которого в данном случае отсутствует ген-мишень. Не наблюдали какого-либо влияния на размножение (данные не приведены).
Исследования методом вестерн-блоттинга проводили с использованием образцов обоих условий индукции. Детектирование чФРФ-2 проводили с использованием антител, описанных выше в пункте 1.8.
На Фигуре 8 представлены дорожки 3 и 4 вестерн-блотов для оценки исходной экспрессии ФРФ-2 без индукции низином.
Помимо этого, на Фигуре 8 показано, что после индукции культуры при OD600=0,5 выработка чФРФ-2 сильно индуцируется и увеличивается на протяжении почти 6 часов после момента индукции.
Полоски чФРФ-2 из геля после электрофореза в ДСН-ПААГ (индукция при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина, моменты времени t=4 и t=6) выделяли и отправляли в Eurosequence BV (Гронинген, Нидерланды) для N-концевого секвенирования аминокислотной последовательности.
После очистки образцов определяли предварительную N-концевую аминокислотную последовательность. Определенная последовательность представляла собой: Ala-Gly-Ser-Ile-Thr-Thr.
Полученная последовательность точно соответствует ожидаемой последовательности после отщепления сигнальной последовательности. Ожидаемая последовательность имеет вид: AGSITTLPAL. Полученные результаты означают, что чФРФ-2 экспрессируется, секретируется и правильно расщепляется в L. lactis.
Супернатант культуры NZ3900 (рФРФ-2), индуцированной при t=0,5 с использованием 5 нг/мл низина, использовали в нижеследующих примерах. Культура была обозначена AUP-10.
b) Выработка чИЛ-4 в L. lactis NZ3900 (рИЛ-4) при ферментации в контролируемых условиях
Для того чтобы установить выход культур NZ3900 (рИЛ-4), проводили эксперименты с ферментацией в контролируемых условиях:
1. NZ3900 (рИЛ-4) без индукции;
2. NZ3900 (рИЛ-4), индуцированная при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина;
3. NZ3900 (рИЛ-4), индуцированная при OD600=3 с использованием 5 нг/мл низина.
Образцы отбирали при t=0 (перед индукцией), t=2 часа, t=4 часа и t=6 часов после индукции с указанным количеством низина.
Выработку чИЛ-4 исследовали во фракции супернатанта и свободного от клеток экстракта с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ в комбинации с вестерн-блоттингом. Детектирование чИЛ-4 проводили с использованием антител, описанных выше в пункте 1.8.
При электрофорезе в ДСН-ПААГ в буфер для приготовления образца и подвижный буфер добавляли ДТТ, чтобы облегчить диссоциацию дисульфидных мостиков. Эти же гели после электрофореза в ДСН-ПААГ также использовали для вестерн-блоттинга для специфичного детектирования чИЛ-4.
При добавлении ДТТ чИЛ-4 образует одну полосу белка в геле, окрашенном Кумасси синим, а также при вестерн-блоттинге (см. Фигуру 9).
Препарат эталонного белка чИЛ-4 также использовали без белка-носителя. Полоса стандартного белка находится на той же высоте, что и белка, который вырабатывается клетками L. lactis NZ3900 (рИЛ-4).
Результаты исследования методом вестерн-блоттинга позволили получить более подробные данные об экспрессии чИЛ-4 в L. lactis NZ3900 (рИЛ-4).
Индукция происходит, когда культуру индуцируют при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина, но не при индукции при OD600=3 с использованием 5 нг/мл низина. Выработка чИЛ-4 продолжается вплоть до по меньшей мере 6 ч. В этот период концентрация ИЛ-4 в супернатанте возрастает.
Полоски чИЛ-4 из геля после электрофореза в ДСН-ПААГ (индукция при OD600 = 0,5 с использованием 5 нг/мл низина, моменты времени t=4 и t=6) выделяли и отправляли в Eurosequence BV для N-концевого секвенирования аминокислотной последовательности.
После очистки образцов определяли предварительную N-концевую аминокислотную последовательность. Определенная последовательность имела вид: Ala-His-Lys-Cys.
Полученная последовательность точно соответствует ожидаемой последовательности после отщепления сигнальной последовательности. Ожидаемая последовательность имела вид: AHKCDITLQE.
Полученные результаты означают, что чИЛ-4 экспрессируется, секретируется и правильно расщепляется в L. lactis.
Супернатант культуры NZ3900 (рИЛ-4), индуцированной при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина, использовали в нижеследующих примерах. Культуру обозначили AUP-12.
с) Выработка чКСФ-1 в L. lactis NZ3900 (рКСФ-1) при ферментации в контролируемых условиях
Для того чтобы установить выход культуры NZ3900 (рКСФ-1), проводили эксперименты с ферментацией в контролируемых условиях. Проводили следующие три эксперимента с ферментацией.
1. NZ3900 (рКСФ-1) без индукции;
2. NZ3900 (рКСФ-1), индуцированная при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина;
3. NZ3900 (рКСФ-1), индуцированная при OD600=3 с использованием 5 нг/мл низина.
Культуру NZ3900 (рКСФ-1) обозначили AUP-14.
Образцы отбирали при t=0 (перед индукцией), t=2 часа, t=4 часа и t=6 часов после индукции с указанным количеством низина.
Выработку чКСФ-1 исследовали во фракции супернатанта и свободного от клеток экстракта с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ в комбинации с вестерн-блоттингом. Детектирование чКСФ-1 проводили с использованием антител, описанных выше в пункте 1.8.
При проведении электрофореза в ДСН-ПААГ в буфер для приготовления образцов и подвижный буфер добавляли ДТТ, чтобы облегчить диссоциацию дисульфидных мостиков. Эти же гели после электрофореза в ДСН-ПААГ также использовали для вестерн-блоттинга для специфичного детектирования чКСФ-1.
Результаты исследования методом вестерн-блоттинга (см. Фигуру 11) указывают на присутствие небольшого количества димера в дорожке с эталонным белком. Помимо этого, гель, окрашенный Кумасси синим (см. Фигуру 10), также свидетельствует о присутствии полосы, размер которой аналогичен таковому для эталонного белка.
В неиндуцированных культурах не удалось детектировать выработку чКСФ-1 в исходных условиях. В культурах, индуцированных при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина, выработка КСФ-1 увеличивается с течением времени вплоть до по меньшей мере 6 ч. Наблюдали лишь небольшое количество продуктов разложения.
Полосы чКСФ-1 из геля после электрофореза в ДСН-ПААГ (индукция при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина, моменты времени t=4 и t=6), выделяли и подвергали N-концевому секвенированию аминокислотной последовательности.
После очистки образцов определяли предварительную N-концевую аминокислотную последовательность. Определенная последовательность имела вид: Ala-Glu-Glu-Val-Ser.
Полученная последовательность точно соответствует ожидаемой последовательности после отщепления сигнальной последовательности. Ожидаемая последовательность имеет вид: AEEVSEYCSH.
Полученные результаты означают, что чКСФ-1 экспрессируется, секретируется и правильно расщепляется в L. lactis.
Супернатант культуры NZ3900 (рКСФ-1), индуцированный при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина, использовали в нижеследующих примерах. Культуру обозначили AUP-14.
d) Выработка чФРФ-2, чИЛ-4 и чКСФ-1 в L. lactis NZ3900 с одного оперона при ферментации в контролируемых условиях
Получали 3 конструкции с использованием 3 из 6 перестановок трех генов (ФРФ-2, ИЛ-4, КСФ-1):
a). чФРФ-2, чИЛ-4, чКСФ-1;
b). чКСФ-1, чФРФ-2, чИЛ-4;
c). чИЛ-4, чКСФ-1, чФРФ-2.
Для конструирования оперонов каждый ген обеспечивали его собственным участком связывания рибосомы для инициации трансляции и собственным сигнальным пептидом для секреции белка. В отношении сигнального пептида ранее было решено использовать одну и ту же сигнальную последовательность (ssUsp45) для всех трех генов. Чтобы избежать больших идентичных нуклеотидных областей на плазмиде в непосредственной близости друг от друга (возможность интра-плазмидой рекомбинации/делеций), один и тот же сигнальный пептид кодировали с помощью различных кодонов на основе вырожденности кодонов и частоты применения кодонов L. lactis.
Для каждого из первых генов 3 конструкций использовали участок связывания рибосомы из гена низина A (nisA). Для двух других генов каждой из 3 конструкций участки связывания рибосомы из гена гаммы-субъединицы АТФ-синтазы (atpG) и гена галактозид-О-ацетилтрансферазы (lacA) выбирали на основе хорошего соответствия 3'-концому рРНК 16S L. lactis, как описано в Bolotin et al. (2001) («The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403», Genome Res. Volume 11, pages 731 to 753). Нуклеотидная последовательность генома L. lactis IL1403 доступна в NCBI под номером доступа АЕ 005176.1.
Обзор всех трех участков связывания рибосомы представлен на Фигуре 24а. Помимо этого последовательности нуклеиновых кислот, обеспечивающие соответствующие участки связывания рибосомы, включая стартовый кодон (ATG) соответствующей открытой рамки считывания, также приведены в SEQ ID NO: 51 в SEQ ID NO: 53.
3'-Конец рРНК 16S L. lactis (5' GGAUCACCUCCUUUCU 3') приведен в SEQ ID NO: 54. На Фигуре 24а рРНК 16S показана как рДНК 16S, в которой урацил (U) был заменен тимидином (Т).
На Фигуре 24а также представлена шестинуклеотидная консенсусная последовательность из последовательности Шайна-Дальгарно (5'-AGGAGG-3'). Последовательность Шайна-Дальгарно представляет собой участок связывания рибосомы в прокариотической иРНК, обычно расположенный приблизительно на 8 оснований левее стартового кодона. Последовательность РНК помогает привлекать рибосомы к мРНК, чтобы инициировать синтез белка, путем совмещения рибосомы со стартовым кодоном.
Три оперона конструировали так, чтобы синтезированные последовательности могли быть клонированы в один этап в плазмиду pNZ8149 с использованием сайтов PsuI и NcoI вектора (BamHI и PsuI совместимы). Помимо этого, сайты MluI вводили перед участками связывания рибосомы перед генами 2 и 3. Соответственно, создание оставшихся трех оперонов можно было осуществлять путем делеции среднего гена и клонирования третьего гена с помощью ПЦР с использованием сайтов NcoI и XbaI плазмиды.
Соответствующие последовательности синтезированных нуклеиновых кислот представлены на Фигурах 24b и 24d и приведены в SEQ ID NO: 55-SEQ ID NO: 57. Частота использования кодонов трех генов была адаптирована для L. lactis.
Экспрессию с каждой из 3 конструкций контролировали с помощью одного промотора низина А, за которым были расположены указанные выше последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белок-предшественник чФРФ-2-153, белок-предшественник чИЛ-4 и белок-предшественник чКСФ-1, полученные в примере 1.
Готовые продукты синтеза генов получали из BaseClear, каждый в виде фрагмента, клонированного в вектор Е. coli pUC57.
Указанные фрагменты клонировали в плазмиду pNZ8149 путем расщепления плазмиды pUC57, содержащей соответствующие продукты синтеза генов, ферментами рестрикции BamHI и NcoI. Фрагменты после рестрикции BamHI/NcoI, содержащие соответствующие продукты синтеза генов, выделяли и лигировали в плазмиду pNZ8149, разрезанную PsuI и NcoI, с получением соответствующих плазмид:
- pC-F-I (содержит фрагмент продукта синтеза гена КСФ-RBS1-ФРФ-RBS2-ИЛ-4 после рестрикции BamHI/NcoI),
- pF-I-C (содержит фрагмент продукта синтеза гена ФРФ-RBS1-ИЛ-4-RBS2-КСФ после рестрикции BamHI/NcoI), и
- pI-C-F (содержит фрагмент продукта синтеза гена ИЛ-4-RBS-КСФ-RBS2-ФРФ после рестрикции BamHI/NcoI).
Соответствующие использованные эндонуклеазы рестрикции получали от Thermo Fisher Scientific Inc.
Соответствующие конструкции трансформировали в L. lactis NZ3900.
По 5 колоний каждой из трех конструкций выращивали при ферментации с регулируемым показателем рН, индуцировали при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина и собирали через 4 часа.
1 мл супернатанта осаждали ТХУ и вносили в одну лунку геля для электрофореза в ДСН-ПААГ. Один гель окрашивали Кумасси синим и другие обрабатывали для проведения вестерн-блоттинга для трех белков-мишеней.
Соответствующие гели после электрофореза в ДСН-ПААГ, а также вестерн-блоты обрабатывали, как описано выше и изображено на Фигурах 24e-24g.
Как можно видеть на Фигуре 24е, конструкция а) pF-I-С (ФРФ-2, чИЛ-4, чКСФ-1) приводила к экспрессии и секреции большого количества ФРФ-2, а также небольшого количества ИЛ-4 и КСФ-1.
Как можно видеть на Фигуре 24f, конструкция b) pC-F-I (чКСФ-1, чФРФ-2, чИЛ-4) приводила к экспрессии и секреции большого количества КСФ-1 и ФРФ-2, а также среднего количества ИЛ-4.
Как можно видеть на Фигуре 24g, конструкция с) pI-C-F (чИЛ-4, чКСФ-1, чФРФ-2) приводила к экспрессии и секреции большого количества ИЛ-4 и незначительно более низкого количества КСФ-1 и ФРФ-2. Гели, окрашенные Кумасси синим, свидетельствовали о наиболее эффективной выработке и индукции всех трех белков.
Три целевых белка могут быть клонированы и экспрессированы с одного оперона с высвобождением соответствующих белков чИЛ-4, чКСФ-1 и чФРФ-2 в супернатант.
Пример 3: Индукция выработки ФРФ-2 в условиях, которые напоминают обстоятельства заживления ран
Физиологические условия в ране отличаются от условий in vitro или условий в ферментере.
В этой связи эксперимент был спроектирован так, чтобы проверить индукцию системы NICE® и, следовательно, выработку чФРФ-2 в условиях, когда штамм NZ3900 не размножается или размножается исключительно с минимальной скоростью. Эти условия имеют место, если показатель рН культуры достиг 5,0, и когда культура переходит в стационарную фазу.
Эксперимент проводили в 200 мл колбах с перемешиванием и контролем рН. В качестве ростовой среды использовали среду IM1 с добавлением 2% масс./об. Na-бета-глицерофосфата и 0,5% масс/об. лактозы. Проводили следующие эксперименты по ферментации:
1. NZ3900 (рФРФ-2) - без индукции;
2. NZ3900 (рФРФ-2) - индукция, когда культура достигает рН=5, с использованием 1 нг/мл низина;
3. NZ3900 (рФРФ-2) - индукция, когда культура достигает рН=5, с использованием 0,1 нг/мл низина;
4. NZ3900 (рФРФ-2) - индукция, когда культура достигает OD600=3, с использованием 1 нг/мл низина;
5. NZ3900 (рФРФ-2) - индукция, когда культура достигает OD600=3, с использованием 0,1 нг/мл низина.
Культуры собирали через 3 часа после индукции. Контрольную культуру собирали в то же самое время, что и культуры, которые были индуцированы при рН 5,0. Результаты представлены на Фигуре 11.
На Фигуре 12 показано, что размножение и динамика изменения рН идентичны во всех пяти культурах и что индукция низином не оказывает влияния на размножение или динамику изменения рН.
Образование чФРФ-2 измеряли в 1 мл супернатанта культуры с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и вестерн-блоттинга. На Фигуре 13 видно, что в условиях подавления размножения клеток или в фазе замедления размножения клеток низин не индуцирует экспрессию генов. По сравнению с выработкой ФРФ-2 в исходных условиях (без индукции) количество ФРФ-2 в супернатанте культур увеличивается лишь незначительно или не увеличивается.
Результаты исследования методом вестерн-блоттинга показали, что чФРФ-2 детектируется в супенатантах всех пяти культур. Помимо этого, детектировали два продукта разложения чФРФ-2.
Полученные результаты означают, что весь ФРФ-2 с сигнальной последовательностью, который вырабатывается в клетке, подвергается расщеплению и секретируется.
Ген ФРФ-2 человека клонировали в вектор экспрессии NICE® пищевого класса для Lactococcus lactis.
Экспрессия гена ФРФ-2 может быть индуцирована добавлением низина. чФРФ-2 секретируется в супернатант в концентрации приблизительно 100-200 нг/мл. Определение N-концевой аминокислотной последовательности секретируемого ФРФ-2 выявило, что белок правильно расщеплен.
Индукция выработки ФРФ-2 приводит к ограниченной задержке размножения, но не остановке размножения.
При контролируемой ферментации выработка ФРФ-2 была индуцирована в широком диапазоне кривой размножения (между OD600=0,5-3). Самый высокий уровень выработки ФРФ-2 наблюдали после индукции при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина.
Плазмида рФРФ-2 является стабильной в течение по меньшей мере 100 поколений в штамме NZ3900 при неселективных условиях, таких как размножение в присутствии глюкозы.
Пример 4а: Количественное исследование миграции фибробластов человека
Биологическую активность ФРФ-2, высвобождаемого из Lactococcus lactis NZ3900 (рФРФ-2), и ИЛ-4, высвобождаемого из Lactococcus lactis NZ3900 (рИЛ-4), в отношении заживления ран оценивали путем измерения миграции нормальных фибробластов кожи человека (НФКЧ) в искусственную зону миграции. Действие исследуемого соединения оценивали с помощью анализа изображения восстановления раны.
Lactococcus lactis NZ3900 (рФРФ-2), описанные в примере 2а, и Lactococcus lactis NZ3900 (рИЛ-4), описанные в примере 2b, индуцировали при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина. Через 6 ч ферментации соответствующие супернатанты культур выделяли, лиофилизировали и хранили при -20°С, как описано выше.
Для проведения последующих исследований из лиофилизированных супернатантов готовили исходные растворы с концентрацией 1 мг/мл путем восстановления порошка раствором трис-HCl (5 мМ, рН=7,6). Исходный раствор AUP-10 получали из супернатанта культуры Lactococcus lactis NZ3900 (рФРФ-2), описанной в примере 2а. Исходный раствор AUP-12 получали из супернатанта культуры Lactococcus lactis NZ3900 (рИЛ-4), описанной в примере 2b.
Исходные растворы разбавляли средой для проведения количественного исследования №1 до конечной концентрации 0,5 нг/мл, 1 нг/мл, 2,5 нг/мл и 5 нг/мл, соответственно, для AUP-10 (ФРФ-2), и до конечной концентрации 0,1 нг/мл, 1 нг/мл, 5 нг/мл и 10 нг/мл, соответственно, для AUP-12 (ИЛ-4).
Указанные концентрации для исходных растворов, а также разведения относятся к общему количеству белка, который присутствует в соответствующем растворе и который в основном соответствует количеству ФРФ-2 и ИЛ-4 в супернатантах культуры Lactococcus lactis NZ3900 (рФРФ-2), описанной в примере 2а, и культуры Lactococcus lactis NZ3900 (рИЛ-4), описанной в примере 2b, соответственно.
Помимо этого рекомбинантный основный ФРФ человека (Fiblast), который был приобретен у Kaken Pharmaceutical Co., Inc (Токио, Япония), разбавляли средой для проведения количественного исследования №1 до конечной концентрации 0,5 нг/мл, 1 нг/мл, 2,5 нг/мл и 5 нг/мл, соответственно.
Рекомбинантный ИЛ-4 человека, который был приобретен у R&D systems (Миннеаполис, Миннесота, США), разбавляли трис-HCl (5 мМ, рН=7,6) до конечной концентрации 0,1 нг/мл, 1 нг/мл, 5 нг/мл и 10 нг/мл, соответственно.
Нормальные фибробласты кожи человека (НФКЧ) были получены от Lonza Group AG (Базель, Швейцария).
Фибробласты высевали в 96-луночные микропланшеты, предназначенные для исследования миграции, и инкубировали в течение 24 часов.
- Условия культивирования: 37°С, 5% СО2.
- Культуральная среда: среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 50 ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 10% фетальной сыворотки теленка (ФСТ) по объему.
Лунки указанных планшетов покрывали раствором коллагена, и прокладку, предотвращающую высевание клеток, помещали в центре лунки, чтобы ограничить высев клеток наружными кольцевыми областями лунки, создавая тем самым искусственную рану (зону миграции). Затем клетки помечали с использованием кальцеина-АМ, полученного от Thermo Fisher Scientific.
Кальцеин-АМ представляет собой проникающий в клетки краситель, который может быть использован для определения жизнеспособности клеток в большинстве эукариотических клеток. В живых клетках после гидролиза сложного ацетоксиметильного эфира внутриклеточными эстеразами нефлуоресцентный кальцеин-АМ превращается во флуоресцентную форму кальцеина с испусканием в зеленой части спектра.
После 30 минут инкубации прокладки удаляли и культуральную среду заменяли средой для проведения количественного исследования №1, содержащей исследуемые соединения (ФРФ-2, Fiblast, ИЛ-4 или рекомбинантный чИЛ-4), или только средой для проведения количественного исследования №1 (контроль) или контрольной средой (10% ФСТ). Клетки затем инкубировали в течение 72 часов. Все экспериментальные условия выполняли при n=5.
Среда для проведения количественного исследования №1: DMEM с добавлением 2 мМ L-глутамина, 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.
Миграцию клеток в зону миграции наблюдали через 0, 24, 48 и 72 часа инкубации с использованием микроскопа NIKON Diaphot 300 (объектив с 4-кратным увеличением), и изображения получали с помощью камеры Nikon DX-1200.
Поверхность искусственной раны измеряли в каждый момент времени и сопоставляли с площадью до миграции, измеренной в Т0 для визуализации и количественной оценки восстановления раны. Действие исследуемых соединений на миграцию клеток сравнивали с необработанным контролем.
Соответствующие применяемые концентрации составили 0,5 нг/мл, 1,0 нг/мл, 2,5 нг/мл и 5,0 нг/мл для чФРФ-2 и 0,1 нг/мл, 1 нг/мл, 5 нг/мл и 10 нг/мл для чИЛ-4. После 72 ч воздействия исследуемых соединений миграцию фибробластов сравнивали с фибробластами, которые инкубировали с ростовой средой (контроль).
Процент восстановления области искусственной раны представлен на Фигурах 14а и 14b.
На Фигуре 14а показано значительное увеличение миграции фибробластов после инкубации с рекомбинантными пробиотическими бактериями, экспрессирующими чФРФ-2. В экспериментальных условиях количественного исследования рекомбинантный основный ФРФ человека (Fiblast,), приобретенный у Kaken Pharmaceutical Co., Inc (Токио, Япония), не модулировал миграцию и пролиферацию НФКЧ.
чФРФ-2, который экспрессируется в рекомбинантных пробиотических бактериях AUP-10, полученных в примере 2а, обладает биологической активностью.
На Фигуре 14b показано, что культуральная среда AUP-12, содержащая 0,1-10 нг/мл чИЛ-4, индуцирует пролиферацию НФКЧ, аналогично рчИЛ-4.
чИЛ-4, который экспрессируется в рекомбинантных пробиотических бактериях AUP-12, полученных в примере 2b, обладает биологической активностью.
Пример 4b: ERK1- и ERK2-фосфорилирование в нормальных фибробластах кожи человека и в лимфобластах мыши
Биологическую активность ФРФ-2, высвобождаемого из Lactococcus lactis NZ3900 (рФРФ-2), дополнительно оценивали путем измерения фосфорилирования киназы, регулируемой внеклеточными сигналами 1 (ERK1), и киназы, регулируемой внеклеточными сигналами 2 (ERK2), в нормальных фибробластах кожи человека (НФКЧ).
Биологическую активность КСФ-1, высвобождаемого из Lactococcus lactis NZ3900 (рКСФ-1), оценивали путем измерения фосфорилирования киназы, регулируемой внеклеточными сигналами 1 (ERK1), и киназы, регулируемой внеклеточными сигналами 2 (ERK2), в линии лимфобластов мыши M-NFS-60.
Исходный раствор AUP-10 получали, как описано выше в примере 4а.
Помимо этого культуру Lactococcus lactis NZ3900 (рКСФ-1), описанную в примере 2с (AUP-14), индуцировали при OD600=0,5 с использованием 5 нг/мл низина. Через 6 ч ферментации супернатант культуры выделяли, лиофилизировали и хранили при -20°С. Для дальнейшего исследования из лиофилизированного супернатанта готовили исходный раствор с концентрацией общего белка 1 мг/мл путем восстановления порошка трис-HCl (5 мМ, рН=7,6) с получением исходного раствора AUP-14.
Исходные растворы дополнительно разбавляли соответствующей средой, не содержащей сыворотки, до конечной концентрации 0,4 нг/мл, 4 нг/мл, 40 нг/мл и 80 нг/мл, соответственно, для AUP-10 (ФРФ-2) и конечной концентрации 0,2 нг/мл, 2 нг/мл, 20 нг/мл и 40 нг/мл, соответственно, для AUP-14 (КСФ-1).
Рекомбинантный основный ФРФ человека от Kaken Pharmaceutical Со. разбавляли средой, не содержащей сыворотки (среда для проведения количественного исследования №1) до конечной концентрации 0,5 нг/мл, 5 нг/мл, 50 нг/мл и 100 нг/мл, соответственно.
Рекомбинантный КСФ-1 человека, который был приобретен у Abcam PLC (Кембридж, Великобритания), разбавляли средой, не содержащей сыворотки (среда для проведения количественного исследования №2) до конечной концентрации 0,2 нг/мл, 2 нг/мл, 20 нг/мл и 40 нг/мл, соответственно.
Нормальные фибробласты кожи человека (НФКЧ) высевали в 96-луночные микропланшеты и инкубировали в течение 24 часов в условиях, описанных выше в примере 4а.
Клетки мыши M-NFS-60 (АТСС® CRL-1838™) получали от LGC Standards GmbH (Везел, Германия). Клетки высевали в 96-луночные микропланшеты и инкубировали в течение 24 часов при следующих условиях:
- Условия культивирования: 37°С.
- Культуральная среда: среда RPMI-1640 (Life Technologies Corporation, Карлсбад, Калифорния, США) с добавлением 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола, 62 нг/мл рекомбинантного макрофагального колониестимулирующего фактора человека (М-КСФ), 50 ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и фетальной сыворотки теленка до конечной концентрации 10% по объему.
- Среда для проведения количественного исследования №2: среда RPMI-1640, дополненная 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.
НФКЧ в фазе экспоненциального размножения инкубировали в среде, не содержащей сыворотки (в среде для количественного исследования №1), в течение 24 часов, переносили в пробирки производства компании Eppendorf (0,5×105 клеток/пробирку) и инкубировали в течение 15 мин при 37°С в среде, не содержащей сыворотки (в среде для количественного исследования №1), в среде, содержащий 0,5 нг/мл, 5 нг/мл, 50 нг/мл и 100 нг/мл рчФРФ-2 или разведения исходного раствора AUP-10 в конечных концентрациях, указанных выше. Затем клетки промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и ресуспендировали в буфере для лизиса.
Клетки мыши M-NFS-60 в фазе экспоненциального размножения инкубировали в среде, не содержащей сыворотки (в среде для количественного исследования №2), в течение 24 часов, переносили в пробирки производства компании Eppendorf (2×106 клеток/пробирку) и инкубировали с Ki-20227 в концентрации 1 мкМ в течение 1 часа. Ингибитор c-fms, Ki-20227, полученный от Abcam PLC, использовали в качестве контроля для оценки специфичности рецептора КСФ-1 (КСФ-1R).
Через 1 ч инкубации с Ki-20227 клетки инкубировали в течение 15 мин при 37°С в среде для количественного исследования №2, содержащей 0,2, 2, 20 и 40 нг/мл рчКСФ-1 или разведения исходного раствора AUPA-14 в конечной концентрации, указанной выше. Затем клетки промывали ФСБ и ресуспендировали в буфере для лизиса.
Буфер для лизиса содержит 0,5% по объему Surfact-Amps NP-40 (Pierce Biotechnology, Рокфорд, Иллинойс, США), 20 мМ Hepes (рН=8,0), 0,35 М NaCl, 0,1 мМ ЭГТА, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ MgCl2, 20% по объему глицерина, 1 мМ ДТТ, 1 мкг/мл лейпептина, 0,5 мкг/мл пепстатина, 0,5 мкг/мл апронитина и 1 мМ фтористого фенилметилсульфонила.
Клетки инкубировали в течение 15 мин на льду, и клеточные белки получали путем центрифугирования. Концентрацию белка определяли с помощью количественного исследования по методу Брэдфорд (Bio-Rad), и 50 мкг белков кипятили в буфере Лэммли и подвергали электрофорезу в 10% полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия. Разделенные белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны (24 В) в течение 30 мин. Блоты блокировали в трис-солевом буферном растворе, содержащем 0,1% твин-20 и 5% обезжиренного сухого молока, экспрессию фосфорилированных форм ERK 1+2 и общее количество ERK 1+2 определяли с использованием следующих специфичных антител.
Для детектирования ERK1 и ERK2 использовали поликлональные антитела кролика к ERK1 и ERK2 человека (цельная антисыворотка, полученная от Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен, Германия, каталожный номер № М5670) в разведении 1:10000. Вторичное антитело представляло собой соединенное с пероксидазой хрена (ПХ) антитело к IgG кролика в разведении 1:10000, полученное от BV (Лейден, Нидерланды).
Для детектирования фосфорилированных форм ERK1 и ERK2 использовали очищенное моноклональное антитело мыши к p-ERK человека (Е-4) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Гейдельберг, Германия, каталожный номер № SC-7383) в разведении 1:1000. p-ERK (Е-4) представляет собой эпитоп мышиного моноклонального антитела, соответствующий последовательности, содержащей фосфорилированный остаток Tyr204 ERK, полученной от человека. Моноклональное антитело детектирует ERK1, фосфорилированную в остатке Tyr 204, и соответственно фосфорилированную форму ERK 2 мыши, крысы и человека.
Вторичное антитело представляло собой соединенное с пероксидазой хрена (ПХ) антитело к IgG мыши в разведении 1:10000, полученное от BV (Лейден, Нидерланды).
Индукцию фосфорилирования ERK1 + 2 количественно оценивали с помощью программного обеспечения ImageJ (Национального института здоровья, Бетесда, Мэриленд, США).
Как следует из Фигуры 14с, культуральная среда AUP-10, содержащая 0,4-80 нг/мл ФРФ-2, индуцирует фосфорилирование ERK 1+2 в НФКЧ, аналогично рчФРФ-2.
Как следует из Фигуры 14d, культуральная среда AUP-14, содержащая 0,2-40 нг/мл КСФ-1, индуцируют фосфорилирование ERK 1+2 в мышиных клетках M-NFS-60, аналогично рчКСФ-1.
Пример 4с: Ингибирование индуцированной липополисахаридом (ЛПС) М1-активации мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК)
Линию клеток человека ТНР-1 (АТСС® TIB-202™) получали от LGC Standards GmbH. Клетки высевали в 96-луночные микропланшеты и инкубировали в течение 24 часов при следующих условиях:
- Условия культивирования: 37°С, 5% СО2.
- Культуральная среда: среда RPMI-1640 (Life Technologies Corporation, Карлсбад, Калифорния, США) с добавлением 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и фетальной сыворотки теленка до конечной концентрации 10% по объему.
- Среда для количественного исследования №2: среда RPMI-1640, дополненная 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.
Линия клеток ТНР1 представляет собой линию моноцитов человека, полученную от пациента с острым моноцитарным лейкозом. Клетки ТНР-1 дифференцировали в макрофаги и поляризовали в соответствии с установленными протоколами. Для поляризации использовали липополисахарид (ЛПС), полученный из Escherichia coli (серотип 026:В6 - получен от Sigma-Aldrich), и гамма-интерферон (ИФН-γ), полученный от U-Cytech (Утрехт, Нидерланды).
В общих чертах, 1 миллион клеток ТНР1 высевали в 6-луночные планшеты в 3 мл среды DMEM с добавлением 100 нг/мл форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА), который получали от Sigma-Aldrich, в течение 24 часов, чтобы вызвать дифференцировку в неполяризованные макрофаги (неполяризованные макрофаги, полученные из ТНР-1).
После дифференцировки неполяризованные макрофаги, полученные из ТНР-1, обрабатывали в течение 48 часов ЛПС (1 мкг/мл) и ИФН-γ (100 Ед/мл) в среде DMEM, чтобы индуцировать M1 фенотип с получением M1-поляризованных макрофагов, полученных из ТНР-1.
Для ингибирования M1-поляризации неполяризованные макрофаги, полученные из ТНР-1, сначала инкубировали с разведениями исходного раствора AUP-12, полученными в примере 4а, или с разведениями исходного раствора рекомбинантного ИЛ-4 человека (рчИЛ-4) в течение 18 часов и затем стимулировали, как описано выше с использованием ЛПС и ИФН-γ в течение дополнительных 48 часов.
Исходный раствор AUP-12 с общей концентрацией белка 1 мг/мл разбавляли до концентрации 0,1%, 1%, 10% и 20% по объему средой DMEM. Исходный раствор рчИЛ-4 разбавляли до концентрации 0,1 нг/мл, 1 нг/мл, 10 нг/мл и 20 нг/мл по объему средой DMEM.
Клетки собирали, и общую РНК экстрагировали с использованием набора для выделения РНК High Pure (Roche Diagnostics). Общую РНК (1 мкг) подвергали обратной транскрипции с использованием набора для синтеза кДНК iScript™ (Bio-Rad; Геркулес, Калифорния, США), и полученную кДНК исследовали методом ПЦР в реальном времени, используя iQTM SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США). ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы детектирования для ПЦР в реальном времени CFX96 (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США). Ген HPRT использовали для стандартизации экспрессии мРНК в каждом образце, и экспрессию генов количественно оценивали с использованием метода 2-ΔΔCt. В качестве маркера M1 поляризации использовали выработку мРНК фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α).
На Фигуре 14е показано ингибирование ЛПС-индуцированной выработки мРНК ФНО-α в клетках ТНР-1 человека.
Как следует из Фигуры 14е, культуральная среда AUP-12 ингибирует ЛПС-индуцированную выработку мРНК ФНО-α в клетках ТНР-1 человека, аналогично рчИЛ-4. Эффективная доза рчИЛ-4 составляет 1-20 нг/мл.
Знак * на Фигуре 14е означает р-значение Р<0,05 по сравнению с ЛПС по отдельности. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение.
Пример 4d: Индукция М2-поляризации в макрофагах, полученных из ТНР1
Чтобы индуцировать М2-поляризацию неполяризованные макрофаги, происходящие из ТНР-1, полученные в примере 4с, инкубировали в течение 18 часов с разведениями исходного раствора AUP-12, полученными в примере 4а, или с разведениями исходного раствора рекомбинантного ИЛ-4 человека (рчИЛ-4) с конечной концентрацией 20 нг/мл.
Исходный раствор AUP-12 с общей концентрацией белка 1 мг/мл разбавляли до концентрации 0,1% и 1% по объему средой DMEM.
Клетки исследовали, как описано выше. После поляризации клетки собирали и экстрагировали общую РНК. Общую РНК подвергали обратной транскрипции, и полученную кДНК исследовали методом ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы детектирования для ПЦР в реальном времени CFX96. Ген HPRT использовали для стандартизации экспрессии мРНК в каждом образце, и экспрессию генов количественно оценивали с использованием метода 2-ΔΔCt. В качестве маркера М2 поляризации использовали макрофагальный рецептор маннозы 1 человека (MRC1) и Kruppel-подобный фактор 4 (KLF4).
На Фигуре 14f показана индукция экспрессии РНК генов М2 для макрофагального рецептора маннозы 1 (MRC1) и Kruppel-подобного фактора 4 (KLF4) в макрофагах, полученных из ТНР1.
Как следует из Фигуры 14f, культуральная среда AUP-12 индуцирует экспрессию РНК генов М2 для макрофагального рецептора маннозы 1 (MRC1) и Kruppel-подобного фактора 4 (KLF4) в макрофагах, полученных из ТНР1, аналогично рчИЛ-4. Эффективная доза рчИЛ-4 составляет 2-20 нг/мл.
Знак * на Фигуре 14f означает р-значение Р<0,05 по сравнению с М0 (М0 = РМА-индуцированные ТНР1) и Mn = не индуцированные ТНР1. ** на Фигуре 14f означает р-значение Р<0,05 по сравнению с Mn = не индуцированные ТНР1. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение.
Пример 4е: Влияние среды AUP-12 на транскрипционную активность STAT-6 в различных клеточных линиях
Для того чтобы определить биологическую активность рекомбинантного ИЛ-4 и AUP-12 в отношении транскрипционной активности STAT6 использовали линии клеток МO3.13 (человека) и НЕК293Т (человека), кратковременно совместно трансфецированные плазмидами, несущими STAT6 и STAT6-Luc (Addgene Inc, Кембридж, Массачусетс, США).
Клетки мезонефроса человека НЕК293Т (АТСС® CRL-3216™) получали от LGC Standards GmbH. Клетки высевали в 96-луночные микропланшеты и инкубировали в течение 24 часов при следующих условиях:
- Условия культивирования: 37°С, 5% СО2.
- Культуральная среда: среда DMEM, дополненная 50 ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и фетальной сывороткой теленка до конечной концентрации 10% по объему.
Гибридную линию глиальных клеток (олигодендроцитов) человека МО3.13 получали от Tebu-Bio GmbH (Оффенбах, Германия). Клетки высевали в 96-луночные микропланшеты и инкубировали в течение 24 часов при следующих условиях:
- Условия культивирования: 37°С.
- Культуральная среда: среда DMEM, дополненная 50 ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и фетальной сывороткой теленка до конечной концентрации 10% по объему.
Трансфекцию плазмидами, несущими STAT6 и STAT6-Luc, выполняли с использованием реагента RotiFect™ (Carl Roth GmbH Co. KG, Карлсруэ, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Клетки обрабатывали в течение 6 часов с использованием 0,1 нг/мл, 1 нг/мл, 10 нг/мл, 20 нг/мл и 100 нг/мл рекомбинантного ИЛ-4 человека (чрИЛ-4) и разведений исходного раствора AUP-12. Исходный раствор AUP-12 разбавляли до концентрации 0,1%, 1%, 10% и 20% по объему средой DMEM.
Затем клетки лизировали в 25 мМ трис-фосфатном буфере, рН=7,8, содержащем 8 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 1% тритона Х-100 и 7% глицерина.
Активность люциферазы измеряли с использованием Autolumat LB 953 (EG&G Бертхолд, США) в соответствии с инструкциями для набора для количественного исследования люциферазы (Promega, Мэдисон, Висконсин, США). Результаты специфичных трансактиваций выражены в виде относительной индукции по сравнению с необработанными клетками.
На Фигуре 14g показана транскрипционная активность STAT-6 для среды AUP-12 и чрИЛ-4 в гибридной линии глиальных клеток человека (МО3.13).
На Фигуре 14h показана транскрипционная активность STAT-6 для среды AUP-12 и чрИЛ-4 в линии клеток мезонефроса человека 293.
Как следует из Фигур 14g и 14h, культуральная среда AUP-12 индуцирует транскрипционную активность STAT-6 в гибридной линии глиальных клеток человека (МО3.13), а также в линии клеток мезонефроса человека 293, аналогично рчИЛ-4. Эффективная доза рчИЛ-4 составляет от 0,1 до 20 нг/мл.
Пример 5: Эксперименты по исследованию закрытия ран
Последствия применения пробиотических бактерий, экспрессирующих ФРФ-2, КСФ- 1 и ИЛ-4 человека по отдельности или в комбинации, при полнослойных эксцизионных ранах у диабетических мышей db/db исследовали в комбинированном фармакокинетическом (ФК)/фармакодинамическом (ФД) исследовании эффективности. Далее бактерии, экспрессирующие ФРФ-2 (AUP-10), ИЛ-4 (AUP-12) и КСФ-1 (AUP14), оценивали по отдельности или в виде трехкомпонентной комбинации (т.е. AUP-10 + AUP-12 + AUP14) и сравнивали их эффективность с положительным контролем (т.е. комбинацией рекомбинантного белка ТФР-альфа + ФРТ-ВВ). Помимо этого бактерии, экспрессирующие ФРФ-2, ИЛ-4 и КСФ-1 в одной бактериальной клетке (AUP-16), оценивали и сравнивали с контрольным носителем (т.е. физиологическим раствором + пленочная повязка или среда IM1 + пленочная повязка) и положительным контролем (ТФР-альфа + ФРТ -ВВ).
Пациенты с сахарным диабетом склонны к нарушению процесса заживления ран, при этом особенно распространенными являются язвы на ногах. Аналогичное медленное заживление ран также характерно для животных с диабетом, включая мышей со спонтанным диабетом (db/db), которых покупали у The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Мэн, США).
В первом исследовании и последующем втором исследовании использовали 99 самцов мышей, страдающих диабетом (название линии BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J, торговый код 00642), в возрасте приблизительно 10 недель.
Рекомбинантные пробиотические бактерии, экспрессирующие ФРФ-2, КСФ-1 или ИЛ-4 человека по отдельности или в виде трехкомпонентной комбинации, а также рекомбинантные пробиотические бактерии, экспрессирующие ФРФ-2, ИЛ-4 и КСФ-1 в одной бактериальной клетке, вносили в раны в день ранения (день 0) и их выживание оценивали через 6 часов после внесения. Для того чтобы облегчить определение выработки ФРФ-2, КСФ-1 и/или ИЛ-4 указанными бактериями, внесенными в раны, из ран отбирали образцы раневой жидкости через 6 часов и 1, 2 и 7 дней. Системную кровь и основные органы собирали через 6 и 24 часа и 7 дней, чтобы облегчить анализ ФК/ФД. Раны, которые обрабатывали только средой IM1, использовали в качестве контролей для определения показателей ФК/ФД в данном исследовании.
Для того чтобы оценить влияние указанных рекомбинантных пробиотических бактерий на процесс заживления ран, бактерии, экспрессирующие ФРФ-2, КСФ-1 и ИЛ-4 человека, а также бактерии, экспрессирующие ФРФ-2, КСФ-1 или ИЛ-4 человека по отдельности, вносили в раны в день ранения (день 0) и затем ежедневно вплоть до 6 дня после ранения. Заживление ран, обработанных указанными рекомбинантными пробиотическими бактериями, сравнивали с заживлением ран, которые обрабатывали только средой IМ1.
Помимо этого рекомбинантный фактор роста тромбоцитов человека ВВ (рч-ФРТ-ВВ) в комбинации с рекомбинантным трансформирующим фактором роста альфа человека (рч-ТФР-α) использовали в качестве «положительного контроля» в данном исследовании. Положительный контроль получали в 0,25% носителе гидроксипропилметилцеллюлозе (ГПМЦ), который готовили путем растворения 0,5 г гидроксипропилметилцеллюлозы, полученной от Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США), в 100 мл дистиллированной воды, с последующим добавлением гидроксида натрия, чтобы довести показатель рН до 7,0.
Комбинация ФРТ-ВВ и ТФР основана на исследовании, проведенном Brown RL et al. (Brown RL, Breeden MP, Greenhalgh DG.: «PDGF and TGF-alpha act synergistically to improve wound healing in the genetically diabetic mouse. J. Surg. Res. 56(6), 1994, pages 562-570). В работе Brown et al. описано, что улучшенное закрытие ран наблюдали при использовании комбинации ФРТ-ВВ и ТФР-альфа по сравнению с лечением с использование факторов роста по отдельности.
Заживление ран исследовали на макроскопическом и гистологическом уровнях. Заживление ран исследовали на макроскопическом уровне для определения (i) начала восстановления кожи, и (ii) закрытия раны.
Закрытие раны и компоненты этого процесса, контракцию раны и повторную эпителизацию раны, определяли на основании цифровых фотографий, сделанных через 0, 4 и 7 дней после ранения. Гистологические оценки формирования грануляционной ткани (глубина) и ширины раны (кранио-каудальная контракция) проводили на обычных окрашенных срезах (гематоксилином и эозином). Указанные гистологические оценки проводили на тканях, собранных на 7-й день после ранения.
Развитие нежелательных явлений контролировали и полностью документировали.
Создание полнослойных экспериментальных ран и применение способов лечения
После экспериментального ранения животных содержали в отдельных клетках (размер клетки 500 см2 с подстилкой из опилок, которые заменяли три раза в неделю) в контролируемых условиях при температуре окружающей среды 23°С с 12-часовым циклом свет/темнота. Животные имели свободный доступ к корму и воде (CRM-P, код продукта 801722, SDS diets, Великобритания). Для акклиматизации к окружающей обстановке перед проведением экспериментов животных содержали в течение 5-7 дней без воздействия внешних факторов, за исключением смены подстилки и восполнения корма и воды. После проведения процедур по обезболиванию животных помещали в теплую окружающую среду и наблюдали до полного восстановления от указанной процедуры. Все животные получили соответствующее обезболивание (бупренорфин) после операции и получили дополнительные обезболивающие препараты по мере необходимости.
Все процедуры на животных проводили в учреждении, имеющем лицензию МВД Великобритании, в соответствии с требованиями лицензии МВД Великобритании (PCD: 50/2505; PPL: 40/3614; PIL: IBCEFDF55; PIL: 134817249). Состояние здоровья животных контролировали ежедневно на протяжении всего исследования.
Животных рандомизировали в группы для получения одной из 18 схем лечения в соответствии с таблицами 2а и 2b.
В 0-й день животных анестезировали (изофлуран + воздух), спинки выбривали и очищали марлей, пропитанной физиологическим раствором. Кожу затем протирали 70% этанолом и вытирали насухо стерильной марлей. Одну стандартизированную полнослойную рану (10,0 мм × 10,0 мм) создавали на коже левого бока каждого подопытного животного.
Раны у животных во всех группах затем перевязывали с использованием бандажа из прозрачной перевязочной пленки Bioclusive (Wound Management Systagenix, Гатвик, Великобритания); после чего животные получали один из видов лечения, описанных ниже (см. таблицу 2а и 2b)), путем инъекции через пленку Bioclusive с использованием иглы 27G.
Для каждого вида лечения соответствующие неиндуцированные рекомбинантные пробиотические бактерии обеспечивали в 10 мл среды IM1 со следующей плотностью клеток (колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл среды):
Схема лечения «комбинация» представляет собой трехкомпонентную комбинацию, полученную из смеси неиндуцированной культуры NZ3900 (рФРФ-2), полученной в примере 2а, неиндуцированной культуры NZ3900 (рКСФ-1), полученной в примере 2с, и неиндуцированной культуры NZ3900 (рИЛ-4), полученной в примере 2b. Смесь имеет общую плотность клеток 3×108 КОЕ/мл.
Перед началом лечения соответствующие неиндуцированные рекомбинантные пробиотические бактерии, обеспеченные в 10 мл среды IМ1, инкубировали при 30°С без встряхивания, и оптическую плотность определяли спектрофотометрически при длине волны 600 нм (OD600).
При OD600=0,5 вносили низин до конечной концентрации 5 нг/мл. После дополнительной инкубации в течение 30 мин при 30°С индуцированную культуру помещали при 10°С. Затем соответствующую индуцированную культуру вводили путем инъекции через пленку Bioclusive с использованием иглы 27G.
Различные виды лечения применяли в соответствии со схемой, описанной в таблице 2а и 2b. Животные в группах лечения 1-9 получили однократную инъекцию объемом 50 мкл в 0-й день. Животные в группах лечения 10-18 получили семь последовательных инъекций, разделенных на однократные инъекции по 50 мкл в сутки в 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 6 день.
Через шесть часов после первого применения лечения раневую жидкость собирали у всех животных в группах 1-4. Раневую жидкость, собранную в группе комбинированного лечения (grp 1), обрабатывали так, чтобы подсчитать КОЕ рекомбинантных пробиотических бактерий. Жидкости, взятые из ран в остальных группах, хранили на льду с добавлением воды до их помещения при температуре -80°С для длительного хранения. После сбора раневых жидкостей всех животных в этих группах умерщвляли (с помощью способа, одобренного МВД Великобритании). Перед умерщвлением животных образцы системной крови отбирали путем сердечной пункции в пробирки с ЭДТА. Одну половину образца крови центрифугировали для получения плазмы; оставшуюся половину хранили при 4°С в течение ночи перед отправкой в Langford Veterinary Services Ldt. (Бристоль, Великобритания), где проводили полный и дифференциальный анализ крови. Посмертные образцы печени, почек, селезенки, сердца, легочной ткани и дренирующих лимфатических узлов собирали у всех животных (плазму крови и ткани помещали в криопробирки, которые быстро замораживали в жидком азоте и затем хранили при -80°С).
Через 24 часа после первого применения лечения раневую жидкость собирали у всех животных в группах 5-9 и хранили, как описано выше. Кровь собирали и хранили, затем животных умерщвляли. Образцы раневой жидкости, цельной крови, плазмы крови и тканей собирали и хранили, как описано выше.
Через день после первого применения различные виды лечения повторно вносили во все раны в группах 10-15 с суточными интервалами вплоть до 6-го дня.
Через 2 дня после первого применения лечения (1 день после второго применения) раневую жидкость собирали у всех животных в группах 10-15 и хранили, как описано выше.
Через 7 дней после первого применения лечения (один день после последнего применения лечения на 6-й день) раневую жидкость собирали у всех животных в группах 10-15 и хранили, как описано выше. Кровь собирали и хранили, затем животных умерщвляли. После умерщвления животных ткани раны и краевые ткани собирали и обрабатывали для гистологического исследования (см. раздел 3.7). Образцы раневой жидкости, цельной крови, плазмы крови и тканей собирали и хранили, как описано выше.
На 4 и 7 день после нанесения ран животных в группах 10-15 повторно анестезировали, их раны оценивали и фотографировали с помощью цифровой камеры вместе с калибровочной/идентификационной пластинкой. На 4-й день аналогичную оценку проводили с повязкой из пленки Bioclusive на ране. На 7-й день перевязочные материалы и некротические ткани удаляли, раны затем очищали с помощью стерильной марли, пропитанной физиологическим раствором, и вытирали сухой стерильной марлей. Раны оценивали и фотографировали с помощью цифровой камеры вместе с калибровочной/идентификационной пластинкой.
Визуализирующее исследование закрытия раны
Программное обеспечение для анализа изображений Image Pro (версия 4.1.0.0, Media Cybernetics, США) использовали для измерения закрытия раны на основании изображений ран в группах 10-15 и 16-18 с течением времени. Для каждой раны в каждый момент времени (дни 4 и 7 для групп 10-15 и дни 4, 7, 8 и 12 для групп 16-18) открытую раневую поверхность измеряли и выражали как % области раны относительно дня 0.
Выживание рекомбинантных пробиотических бактерий через 6 часов после внесения.
Через шесть часов после введения в рану комбинации бактерий, экспрессирующих ФРФ-2, ИЛ-4 и КСФ-1, раневую жидкость экстрагировали, и проводили подсчет бактериальных колониеобразующих единиц (КОЕ). Результаты подсчета КОЕ для 5 ран приведены в таблице 3.
Полученный результат подтверждает, что бактерии являются жизнеспособными в ране и способны к пролиферации после пребывания в ране в течение 6 часов, это свидетельствует о том, что вышеуказанные рекомбинантные пробиотические бактерии могут быть использованы для доставки терапевтических комбинаций белков в раны.
Реакция заживления ран в различных группах лечения
Реакцию заживления ран в различных группах лечения после нанесения раны оценивали путем визуального осмотра через 4 и 7 дней после начала лечения.
Визуальный осмотр невооруженным глазом, а также количественный анализ с помощью программного обеспечения для анализа изображений Image Pro групп 10-15 выявил, что заживление ран имеет место уже через четыре дня после начала лечения. Помимо этого на седьмой день мыши, получавшие трехкомпонентную комбинацию рекомбинантных пробиотических бактерий, экспрессирующих ФРФ-2, ИЛ-4 и КСФ-1 (группы лечения 1, 5 и 10), имели лучшую реакцию заживления (присутствовало накопление розовой/красной грануляционной ткани, а также эпителизация раны) по сравнению с отдельными группами лечения с использованием пробиотических бактерий, экспрессирующих ФРФ-2, (AUP-10), пробиотических бактерий, экспрессирующих ИЛ-4 (AUP-12), и пробиотических бактерий, экспрессирующих КСФ-1 (AUP-14), а также по сравнению с положительным контролем (т.е. ТФР-альфа и ФРТ-ВВ). Результаты представлены на Фигуре 15а.
На Фигуре 15а представлены результаты оценки реакции заживления ран в различных группах лечения.
Отдельные группы лечения имеют сравнимую реакцию заживления ран, которая превосходит реакцию в группах, получавших среду IM1 (группа, получавшая носитель). Полученные результаты выявили синергическое действие комбинации ФРФ-2, ИЛ-4 и КСФ-1 при заживлении ран.
Мыши, которые получали ФРФ-2 (AUP-10), также имели признаки образования грануляционной ткани и васкуляризации, но не эпителизации. Помимо этого, можно отметить проницаемость кровеносных сосудов при использовании пробиотических бактерий, экспрессирующих ФРФ-2 по отдельности. При использовании пробиотических бактерий, экспрессирующих ИЛ-4 (AUP-12), и пробиотических бактерий, экспрессирующих КСФ-1 (AUP-14), в основном наблюдали эпителизацию раны, но не гранулирование, тогда как раны, обработанные трехкомпонентной комбинацией рекомбинантных пробиотических бактерий (AUP-10 + AUP-12 + AUP-14) характеризуются образованием грануляционной ткани, а также эпителизацией раны. Не было обнаружено проницаемости кровеносных сосудов.
Важно знать, что при диабетических язвах стопы (у человека) эпителизация зависит от формирования грануляционной ткани. Без формирования грануляционной ткани эпителизация не может произойти, и рана не закрывается.
В группах 16-18 влияние AUP-16 (рекомбинантные бактерии, экспрессирующие ФРФ-2, ИЛ-4 и КСФ-1 в одной бактериальной клетке) сравнивали с введением носителя (физиологический раствор + повязка) и положительным контролем (т.е. ТФР-альфа + ФРТ-ВВ). В течение 4, 8 и 12 дней культура AUP-16 обеспечивала лучшие результаты в заживлении ран по сравнению с группой положительного контроля (ТФР-альфа + ФРТ-ВВ). Результаты представлены на Фигуре 15b.
Сравнение статуса заживления ран для контроля (группа 16, получавшая физиологический раствор), положительного контроля (группа лечения 17) и ткани, обработанной AUP-16 (группа лечения 18), после нанесения раны и через 4, 8 и 12 дней представлено на Фигуре 15b.
День 0 представляет исходную рану сразу после ранения. Одна и та же рана также показана на 4, 8 и 12 день. Соответствующие фотографии масштабировали аналогичным образом, чтобы визуализировать закрытие раны. Черная полоса на каждой фотографии представляет 1 см.
Сравнение оставшейся раневой области после 8-го дня и 12-го дня для положительного контроля (группа 17) и ткани, обработанной AUP-16 (группа лечения 18), представлено на Фигуре 15с.
Оставшуюся раневую область измеряли на фотографиях ран с помощью программного обеспечения для анализа изображений Image Pro и выражали как % раневой области по сравнению с 0-ым днем.
На 12 день наблюдали почти полное закрытие ран в ранах, обработанных комбинацией (AUP-16). Данный вывод подтверждается тем, что оставшаяся раневая область составляет 1,37% по сравнению с областью раны на 0-й день сразу после нанесения раны.
Помимо этого, как следует из Фигур 15а и 15b, в ранах, обработанных трехкомпонентной комбинацией, а также AUP-16 наблюдали значительное лучшее закрытие раны по сравнению с ранами, обработанными рекомбинантным фактором роста тромбоцитов человека ВВ в комбинации с рекомбинантным трансформирующим фактором роста человека альфа (положительный контроль), в частности на 12-й день.
Было обнаружено, что все бактериальные схемы лечения, исследованные в данном эксперименте, AUP-10, AUP-12 и AUP-14, при применении по отдельности или в виде трехкомпонентной комбинации, а также AUP-16, способствовали восстановлению ран у диабетических мышей db/db, которые являются общепринятой и одной из лучших проверенных животных моделей замедленного заживления ран у человека.
Эксцизионные раны у мышей db/db характеризуются достоверно замедленным закрытием ран, уменьшенным образованием грануляционной ткани, уменьшенной васкуляризацией раневого ложа и заметно сниженной пролиферацией, например, как описано в Michaels et al. (2007) («db/db mice exhibit severe wound-healing impairments compared with other murine diabetic strains in a silicone-splinted excisional wound model», Wound Rep. Reg. 15, pages 665 to 670).
Экспериментальные результаты ясно показывают, что применение рекомбинантных пробиотических бактерий согласно настоящему изобретению обеспечивает значительное улучшение в лечении ран у человека, особенно хронических ран.
Применение рекомбинантных пробиотических бактерий согласно настоящему изобретению индуцирует образование грануляционной ткани, увеличение васкуляризации раневого ложа и усиление пролиферации, что приводит к более эффективному и ускоренному закрытию ран, даже в модели, проявляющей серьезное нарушение процесса заживления ран.
Следовательно, полученные результаты указывают на то, что применение рекомбинантных пробиотических бактерий согласно настоящему изобретению оказывает положительное влияние на воспалительные, предпочтительно хронические воспалительные, нарушения функции кожи, такие как обморожение, экзема, псориаз, дерматит, язва, рана, красная волчанка, нейродермит и их комбинации, предпочтительно дерматит, язва, рана и их комбинации, более предпочтительно язва.
Например, хронические раны, такие как хронические венозные язвы, хронические артериальные язвы, хронические диабетические язвы и хронические пролежни, можно лечить путем применения рекомбинантных пробиотических бактерий согласно настоящему изобретению, поскольку нарушения процесса заживления ран, наблюдаемые при соответствующих хронических ранах, преодолеваются после применения рекомбинантных пробиотических бактерий согласно настоящему изобретению.
Claims (64)
1. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий для лечения и/или облегчения заживления раны, содержащая:
последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую(ие) первый гетерологичный фактор, последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую(ие) второй гетерологичный фактор, и предпочтительно последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую(ие) третий гетерологичный фактор, где клетки указанной популяции содержат последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую(ие) первый гетерологичный фактор, и/или последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую(ие) второй гетерологичный фактор, и/или предпочтительно последовательность(и) нуклеиновой кислоты, кодирующую(ие) третий гетерологичный фактор,
при условии, что указанный первый фактор, указанный второй фактор и указанный третий фактор функционально различаются,
при этом указанный первый фактор представляет собой фактор роста, при этом указанный второй фактор выбран из группы, состоящей из М2-поляризующих факторов, и предпочтительно указанный третий фактор выбран из группы, состоящей из М2-поляризующих факторов и факторов роста, при этом:
указанный М2-поляризующий фактор выбран из группы, состоящей из интерлейкина 4 (ИЛ-4), интерлейкина 10 (ИЛ-10), интерлейкина 13 (ИЛ-13), колониестимулирующего фактора 1 (КСФ-1), интерлейкина 34 (ИЛ-34) и их смесей;
указанный фактор роста выбран из группы, состоящей из факторов роста фибробластов (ФРФ), факторов роста эндотелия сосудов (ФРЭС), эпидермальных факторов роста (ЭФР), связывающего гепарин ЭФР-подобного фактора роста (ГС-ЭФР), трансформирующего фактора роста-α (ТФР-α), инсулиноподобных факторов роста (ИФР), факторов роста тромбоцитов (ФРТ), трансформирующего фактора роста бета (ТФР-бета) и их смесей;
причем экспрессия указанной(ых) последовательности(ей) нуклеиновой кислоты находится под контролем подходящего промотора; и при этом указанные бактерии способны вырабатывать молочную кислоту.
2. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по п. 1, отличающаяся тем, что указанная последовательность(и) нуклеиновой кислоты расположена(ы) по меньшей мере на одной из хромосом и плазмид указанных рекомбинантных пробиотических бактерий.
3. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанный промотор представляет собой конститутивный промотор или индуцируемый промотор.
4. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по п. 3, отличающаяся тем, что экспрессия указанной(ых) последовательности(ей) нуклеиновой кислоты находится под контролем индуцируемого промотора, причем указанная(ые) последовательность(и) нуклеиновой кислоты экспрессируется в присутствии по меньшей мере одного индуктора.
5. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 3 или 4, отличающаяся тем, что указанный индуцируемый промотор, который индуцируется под действием индуктора, представляет собой промотор для микробного гена, который кодирует пептид лантибиотика или его функциональный аналог, где указанный функциональный аналог связывается с рецептором, который идентичен рецептору, который связывает указанный пептид лантибиотика, причем предпочтительно указанный индуцируемый промотор представляет собой PnisA, PnisZ, PnisQ, PnisF, PnisU или их комбинации из Lactococcus lactis.
6. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 4 или 5, отличающаяся тем, что указанный индуктор представляет собой по меньшей мере один пептид лантибиотика или его функциональный аналог, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из низина А, низина Z, низина Q, низина F, низина U, их функциональных аналогов, а также их смесей, где указанный функциональный аналог связывается с рецептором, который идентичен рецептору, который связывает указанный пептид лантибиотика.
7. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что указанные пробиотические бактерии дополнительно содержат по меньшей мере один инактивированный ген, кодирующий значимый белок, необходимый для жизнеспособности указанных пробиотических бактерий.
8. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по п. 7, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один инактивированный ген, необходимый для жизнеспособности указанных пробиотических бактерий, выбран из группы, состоящей из аланинрацемазы (alaR), тимидилатсинтазы (thyA), аспарагинсинтазы (asnH), CTP-синтазы (pyrG), триптофансинтазы (trpBA) и их комбинаций.
9. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 7 или 8, отличающаяся тем, что указанный ген инактивирован делецией указанного гена, мутацией указанного гена, эпигенетической модификацией указанного гена, подавлением экспрессии указанного гена путем РНК-интерференции (RNAi), трансляционным ингибированием указанного гена или их комбинацией.
10. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что по меньшей мере один из указанного первого фактора, указанного второго фактора и указанного третьего фактора имеет возможность высвобождаться из указанных рекомбинантных пробиотических бактерий.
11. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1-10, отличающаяся тем, что указанный фактор роста фибробластов (ФРФ), выбран из группы, состоящей из фактора роста фибробластов 1, фактора роста фибробластов 2, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 10 и их смесей.
12. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1-11, отличающаяся тем, что указанный первый, второй и третий гетерологичные факторы
представляют собой комбинацию:
·фактора роста фибробластов 2, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 4,
· фактора роста фибробластов 2, интерлейкина 34 и интерлейкина 4,
· фактора роста фибробластов 2, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 13,
· фактора роста фибробластов 2, интерлейкина 34 и интерлейкина 13,
· фактора роста фибробластов 2, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 10,
· фактора роста фибробластов 2, интерлейкина 34 и интерлейкина 10,
· фактора роста фибробластов 7, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 4,
· фактора роста фибробластов 7, интерлейкина 34 и интерлейкина 4,
· фактора роста фибробластов 7, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 13,
· фактора роста фибробластов 7, интерлейкина 34 и интерлейкина 13,
· фактора роста фибробластов 7, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 10,
· фактора роста фибробластов 7, интерлейкина 34 и интерлейкина 10,
· трансформирующего фактора роста бета, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 4,
· трансформирующего фактора роста бета, интерлейкина 34 и интерлейкина 4,
· трансформирующего фактора роста бета, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 13,
· трансформирующего фактора роста бета, интерлейкина 34 и интерлейкина 13,
· трансформирующего фактора роста бета, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 10,
· трансформирующего фактора роста бета, интерлейкина 34 и интерлейкина 10,
· трансформирующего фактора роста альфа, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 4,
· трансформирующего фактора роста альфа, интерлейкина 34 и интерлейкина 4,
· трансформирующего фактора роста альфа, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 13,
· трансформирующего фактора роста альфа, интерлейкина 34 и интерлейкина 13,
· трансформирующего фактора роста альфа, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 10,
· трансформирующего фактора роста альфа, интерлейкина 34 и интерлейкина 10,
· фактора роста тромбоцитов ВВ, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 4,
· фактора роста тромбоцитов ВВ, интерлейкина 34 и интерлейкина 4,
· фактора роста тромбоцитов ВВ, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 13,
· фактора роста тромбоцитов ВВ, интерлейкина 34 и интерлейкина 13,
· фактора роста тромбоцитов ВВ, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 10, или
фактора роста тромбоцитов ВВ, интерлейкина 34 и интерлейкина 10.
13. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1-12, отличающаяся тем, что указанный первый, второй и третий гетерологичные факторы представляют собой комбинацию фактора роста фибробластов 2, колониестимулирующего фактора 1 и интерлейкина 4 их функциональных аналогов, где указанные функциональные аналоги связываются с рецепторами, которые идентичны рецепторам, которые связывают соответствующие факторы.
14. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1-13, отличающаяся тем, что указанные рекомбинантные пробиотические бактерии представляют собой молочнокислые бактерии, предпочтительно видов Lactobacillus или Lactococcus.
15. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по п. 14, отличающаяся тем, что указанный вид Lactococcus представляет собой Lactococcus lactis, предпочтительно подвид Lactococcus lactis cremoris.
16. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1-15, отличающаяся тем, что каждая из указанных последовательностей нуклеиновых кислот содержится в отдельной субпопуляции рекомбинантных пробиотических бактерий.
17. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1-15, отличающаяся тем, что первая субпопуляция указанной популяции рекомбинантных пробиотических бактерий содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую два из трех гетерологичных факторов, при этом предпочтительно третий гетерологичный фактор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которую содержит вторая субпопуляция рекомбинантных пробиотических бактерий.
18. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1-15, отличающаяся тем, что указанные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие все три гетерологичных фактора, содержатся в одной популяции рекомбинантных пробиотических бактерий.
19. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1-18, отличающаяся тем, что указанные рекомбинантные пробиотические бактерии обеспечены в виде раствора, в замороженной или высушенной форме, предпочтительно лиофилизованы или высушены распылением.
20. Популяция рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1-19, отличающаяся тем, что указанная популяция рекомбинантных пробиотических бактерий приготовлена для введения местным путем и/или путем подкожной инъекции.
21. Применение популяции рекомбинантных пробиотических бактерий для лечения и/или облегчения заживления раны, причем указанные рекомбинантные пробиотические бактерии представляют собой рекомбинантные пробиотические бактерии популяции по любому из пп. 1-20, и при этом указанная рана представляет собой хроническую рану.
22. Применение по п. 21, отличающееся тем, что указанная хроническая рана представляет собой по меньшей мере одну из хронической венозной язвы, хронической артериальной язвы, хронической диабетической язвы, хронической пролежневой язвы и хронических стадий их предизъязвления.
23. Фармацевтическая композиция для лечения и/или облегчения заживления раны, содержащая эффективное количество популяции рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1-20 и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.
24. Фармацевтическая композиция по п. 23, где указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно питательное вещество для указанных рекомбинантных пробиотических бактерий, предпочтительно, указанное вещество выбрано из
группы, состоящей из углеводов, витаминов, минералов, аминокислот, микроэлементов и их
смесей; и/или указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно соединение для стабилизации по меньшей мере одного из указанного первого фактора, указанного второго фактора и указанного третьего фактора, где указанное стабилизирующее соединение предпочтительно выбрано из группы, состоящей из противомикробных агентов, криопротекторов, ингибиторов протеаз, восстанавливающих агентов, хелатирующих металл агентов и их смесей.
25. Способ лечения и/или облегчения заживления раны, при этом указанный способ включает этап введения популяции рекомбинантных пробиотических бактерий по любому из пп. 1-20 или композиции по п. 23 или 24 нуждающемуся в этом индивидууму, причем указанная рана представляет собой хроническую рану.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EPPCT/EP2015/052345 | 2015-02-04 | ||
PCT/EP2015/052345 WO2016124239A1 (en) | 2015-02-04 | 2015-02-04 | Recombinant probiotic bacteria for use in the treatment of a skin dysfunction |
PCT/EP2015/075484 WO2016124266A1 (en) | 2015-02-04 | 2015-11-02 | Recombinant probiotic bacteria |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2017127991A3 RU2017127991A3 (ru) | 2019-03-04 |
RU2017127991A RU2017127991A (ru) | 2019-03-04 |
RU2723324C2 true RU2723324C2 (ru) | 2020-06-09 |
Family
ID=53039847
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017127991A RU2723324C2 (ru) | 2015-02-04 | 2015-11-02 | Рекомбинантные пробиотические бактерии |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10738315B2 (ru) |
EP (1) | EP3253402B1 (ru) |
JP (1) | JP6726419B2 (ru) |
KR (1) | KR102172228B1 (ru) |
CN (1) | CN107438666B (ru) |
AU (1) | AU2015381262B2 (ru) |
BR (1) | BR112017016772A2 (ru) |
CA (1) | CA2975636C (ru) |
CY (1) | CY1123065T1 (ru) |
DE (1) | DE15821025T8 (ru) |
DK (1) | DK3253402T3 (ru) |
ES (1) | ES2673007T3 (ru) |
HR (1) | HRP20200973T1 (ru) |
HU (1) | HUE050790T2 (ru) |
IL (1) | IL253782B (ru) |
LT (1) | LT3253402T (ru) |
MX (1) | MX2017010150A (ru) |
NZ (1) | NZ734579A (ru) |
PL (1) | PL3253402T3 (ru) |
PT (1) | PT3253402T (ru) |
RS (1) | RS60437B1 (ru) |
RU (1) | RU2723324C2 (ru) |
SG (1) | SG11201706398VA (ru) |
SI (1) | SI3253402T1 (ru) |
TR (1) | TR201808169T3 (ru) |
WO (2) | WO2016124239A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201705812B (ru) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6581208B2 (ja) | 2014-12-23 | 2019-09-25 | イリヤ ファーマ エービー | 創傷治癒の方法 |
KR102348734B1 (ko) | 2016-09-13 | 2022-01-07 | 인트랙슨 액토바이오틱스 엔.브이. | 점막부착성 미생물 |
US11850270B2 (en) | 2017-12-04 | 2023-12-26 | The BioCollective, LLC | Probiotics and methods of use |
AU2019223439A1 (en) * | 2018-02-24 | 2020-09-10 | Clearskin Ltd | Compositions, devices, systems, kits and methods for the treatment of a skin condition |
EP3837993A4 (en) * | 2018-06-19 | 2022-04-20 | Coenbio Co., Ltd. | COMPOSITION FOR IMPROVING INTESTINAL FUNCTION WITH LEUCONOSTOC SP. STRAIN |
WO2019245223A1 (ko) * | 2018-06-19 | 2019-12-26 | (주)코엔바이오 | 류코노스톡속 균주를 포함하는 간 기능 개선용 조성물 |
KR102283127B1 (ko) * | 2018-06-19 | 2021-07-29 | 주식회사 엠디헬스케어 | 류코노스톡속 균주를 포함하는 간 기능 개선용 조성물 |
KR102173168B1 (ko) * | 2018-06-19 | 2020-11-03 | 주식회사 엠디헬스케어 | 류코노스톡속 균주를 포함하는 장 기능 개선용 조성물 |
WO2020031204A1 (en) * | 2018-08-08 | 2020-02-13 | Sree Chitra Tirunal Institute For Medical Science And Technology | Recombinant tgf α for wound healing purposes, and the process thereof |
CN109078171A (zh) * | 2018-09-10 | 2018-12-25 | 因之彩生物科技(武汉)有限公司 | 一种外用组合物及其应用以及外用治疗剂 |
IT201900003115A1 (it) * | 2019-03-04 | 2020-09-04 | Univ Degli Studi Roma La Sapienza | Lattococco ingegnerizzato |
US20220127629A1 (en) * | 2019-03-04 | 2022-04-28 | Celloryx AG | Chloride-Inducible Prokaryotic Expression System |
CN112175890A (zh) * | 2019-07-02 | 2021-01-05 | 深伦生物科技(深圳)有限公司 | 一种以食用菌分泌乙醇脱氢酶的基因工程菌 |
KR102343938B1 (ko) * | 2020-09-02 | 2021-12-28 | 주식회사 비피도 | 재조합 비피도박테리움 비피덤 bgn4를 포함하는 염증 개선용 조성물 |
CN112359049B (zh) * | 2020-12-10 | 2022-01-28 | 昆明理工大学 | 一种岷江百合几丁质酶基因LrCHI2及其应用 |
KR102253283B1 (ko) * | 2020-12-21 | 2021-05-18 | 주식회사 비피도 | 비피도박테리움 비피덤을 이용한 인간 egf 단백질의 생산방법 및 이를 함유하는 조성물 |
JP2024508541A (ja) * | 2021-03-05 | 2024-02-27 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ カリフォルニア | 皮膚プロバイオティクス |
CN114395514B (zh) * | 2022-02-28 | 2023-09-01 | 鲁东大学 | 一株嗜酸乳杆菌、菌剂及其应用 |
CN114957437B (zh) * | 2022-06-06 | 2023-03-21 | 陕西理工大学 | 一种leap-2重组蛋白和一种重组乳酸乳球菌及其应用 |
CN115181710B (zh) * | 2022-09-13 | 2022-11-25 | 北京量化健康科技有限公司 | 一株唾液乳杆菌b12wu及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009114702A2 (en) * | 2008-03-14 | 2009-09-17 | Humanzyme Limited | Recombinant production of authentic human proteins using human cell expression systems |
WO2011150127A2 (en) * | 2010-05-25 | 2011-12-01 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Novel systems, vectors, and methods for delivery of biomolecules to eukaryotic cells |
WO2011159880A1 (en) * | 2010-06-18 | 2011-12-22 | North Carolina State University | Recombinant lactobacillus with decreased lipoteichoic acid to reduce inflammatory responses |
RU2495129C2 (ru) * | 2007-01-12 | 2013-10-10 | Актогеникс Н.В. | ПРОМОТОРЫ Lactococcus И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ: |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2567106A1 (en) | 2004-05-18 | 2005-11-24 | Vib Vzw | Self-containing lactobacillus strain |
US8682619B2 (en) * | 2005-12-14 | 2014-03-25 | The Invention Science Fund I, Llc | Device including altered microorganisms, and methods and systems of use |
EP2164512A2 (en) * | 2007-06-20 | 2010-03-24 | Actogenix N.V. | Methods and compositions for treating mucositis |
WO2010039889A2 (en) | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Novozymes, Inc. | Methods for using positively and negatively selectable genes in a filamentous fungal cell |
DK2362866T3 (en) | 2008-11-11 | 2015-10-12 | Signum Biosciences Inc | Isoprenylforbindelser and their methods |
EP2389357A4 (en) | 2009-01-20 | 2013-01-23 | Signum Biosciences Inc | INFLAMMATORY COMPLEXES |
FR2948868B1 (fr) * | 2009-08-07 | 2011-10-07 | Anthogyr Sa | Piece a main a moyens de connexion electrique |
CN102740867A (zh) | 2010-01-14 | 2012-10-17 | 法国国家健康与医学研究院 | 用于预防和治疗炎症性肠病(ibd)和肠易激综合征(ibs)的重组益生菌 |
CN101892189B (zh) | 2010-07-05 | 2012-07-04 | 浙江大学 | 一种口服免疫阻断猪生长抑素作用的转化子及其应用 |
JP2012019768A (ja) | 2010-07-16 | 2012-02-02 | Osaka Univ | Jmjd3遺伝子改変非ヒト哺乳動物、Jmjd3遺伝子改変骨髄キメラ非ヒト哺乳動物、及びその利用 |
TWI566701B (zh) | 2012-02-01 | 2017-01-21 | 日本農藥股份有限公司 | 芳烷氧基嘧啶衍生物及包含該衍生物作為有效成分的農園藝用殺蟲劑及其使用方法 |
GB201206599D0 (en) * | 2012-04-13 | 2012-05-30 | Univ Manchester | Probiotic bacteria |
TWI613833B (zh) | 2012-11-09 | 2018-02-01 | Sony Corp | 光電變換元件、固體攝像裝置及電子機器 |
US20140142042A1 (en) * | 2012-11-16 | 2014-05-22 | Allergan, Inc. | Skin wound healing and scar reduction with prostaglandin ep4 agonist combinations |
JP2017521059A (ja) | 2014-06-17 | 2017-08-03 | ザイクローブ セラピューティクス, インク.Xycrobe Therapeutics, Inc. | 機械的に位置合わせされた光学的要素及びその製造方法 |
-
2015
- 2015-02-04 WO PCT/EP2015/052345 patent/WO2016124239A1/en active Application Filing
- 2015-11-02 SG SG11201706398VA patent/SG11201706398VA/en unknown
- 2015-11-02 LT LTEP15821025.2T patent/LT3253402T/lt unknown
- 2015-11-02 MX MX2017010150A patent/MX2017010150A/es unknown
- 2015-11-02 PL PL15821025T patent/PL3253402T3/pl unknown
- 2015-11-02 WO PCT/EP2015/075484 patent/WO2016124266A1/en active Application Filing
- 2015-11-02 TR TR2018/08169T patent/TR201808169T3/tr unknown
- 2015-11-02 PT PT158210252T patent/PT3253402T/pt unknown
- 2015-11-02 AU AU2015381262A patent/AU2015381262B2/en active Active
- 2015-11-02 BR BR112017016772-7A patent/BR112017016772A2/pt active Search and Examination
- 2015-11-02 CN CN201580078514.1A patent/CN107438666B/zh active Active
- 2015-11-02 KR KR1020177024852A patent/KR102172228B1/ko active IP Right Grant
- 2015-11-02 DK DK15821025.2T patent/DK3253402T3/da active
- 2015-11-02 RS RS20200690A patent/RS60437B1/sr unknown
- 2015-11-02 US US15/548,558 patent/US10738315B2/en active Active
- 2015-11-02 EP EP15821025.2A patent/EP3253402B1/en active Active
- 2015-11-02 ES ES15821025T patent/ES2673007T3/es active Active
- 2015-11-02 HU HUE15821025A patent/HUE050790T2/hu unknown
- 2015-11-02 RU RU2017127991A patent/RU2723324C2/ru active
- 2015-11-02 JP JP2017559760A patent/JP6726419B2/ja active Active
- 2015-11-02 DE DE15821025.2T patent/DE15821025T8/de active Active
- 2015-11-02 NZ NZ73457915A patent/NZ734579A/en unknown
- 2015-11-02 CA CA2975636A patent/CA2975636C/en active Active
- 2015-11-02 SI SI201531265T patent/SI3253402T1/sl unknown
-
2017
- 2017-08-01 IL IL253782A patent/IL253782B/en unknown
- 2017-08-25 ZA ZA2017/05812A patent/ZA201705812B/en unknown
-
2020
- 2020-06-18 CY CY20201100564T patent/CY1123065T1/el unknown
- 2020-06-19 HR HRP20200973TT patent/HRP20200973T1/hr unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2495129C2 (ru) * | 2007-01-12 | 2013-10-10 | Актогеникс Н.В. | ПРОМОТОРЫ Lactococcus И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ: |
WO2009114702A2 (en) * | 2008-03-14 | 2009-09-17 | Humanzyme Limited | Recombinant production of authentic human proteins using human cell expression systems |
WO2011150127A2 (en) * | 2010-05-25 | 2011-12-01 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Novel systems, vectors, and methods for delivery of biomolecules to eukaryotic cells |
WO2011159880A1 (en) * | 2010-06-18 | 2011-12-22 | North Carolina State University | Recombinant lactobacillus with decreased lipoteichoic acid to reduce inflammatory responses |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
STEIDLER L. et al. Genetically modified Lactococcus lactis: novel tools;for drug delivery // International Journal of Dairy Technology, May 2006, Vol 59, No 2, pp. 140-146. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2723324C2 (ru) | Рекомбинантные пробиотические бактерии | |
AU2015370982B2 (en) | Methods for wound healing | |
US20150216932A1 (en) | Probiotic bacteria as carrier for a helminth-derived immunomodulator for the treatment of inflammatory disorders | |
KR101411839B1 (ko) | Abc 트랜스포터를 통한 egf 분비 재조합 미생물 및 이를 유효성분으로 포함하는 소화기 궤양 개선 또는 치료용 조성물 | |
KR102602358B1 (ko) | 염화물-유도성 원핵생물 발현 시스템 | |
RU2812766C2 (ru) | Хлорид-индуцируемая прокариотическая система экспрессии | |
US20220152127A1 (en) | Engineered lactococcus | |
Singh et al. | Immunomodulatory therapeutic potential of mesenchymal stem cells in COVID-19 pathogenesis | |
김한울 | Mixture of probiotics alleviates the symptoms of atopic dermatitis through recovering immune balance in mice | |
Al-Abdulwahid | Modulation of macrophage and epithelial cell immune defences by probiotic bacteria: immune stimulation versus suppression |