KR102602358B1 - 염화물-유도성 원핵생물 발현 시스템 - Google Patents

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하리타 사마라나야케
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Abstract

본 발명은 재조합 박테리아, 재조합 플라스미드, 약제학적 조성물 및 키트 뿐만 아니라 재조합 박테리아를 재구성하기 위한 염화물 이온을 포함하는 재구성 배지의 사용에 관한 것이다.

Description

염화물-유도성 원핵생물 발현 시스템
본 발명은 재조합 박테리아, 재조합 플라스미드, 약제학적 조성물 및 키트 뿐만 아니라 재조합 박테리아를 재구성하기 위한 염화물 이온을 포함하는 재구성 배지의 사용에 관한 것이다.
생물약제학 또는 생물학적 치료제는 예를 들면 재조합 DNA 기술과 관련된 생물학적 공정 수단에 의해 제조되는 광범위한 의약용 생물학적 제품을 의미한다.
생물약제학 또는 생물학적 치료제는 예를 들면 치료될 주체의 폴리펩타이드와 동일 또는 거의 동일한 폴리펩타이드, 예를 들어 혈액-생성 자극 단백질 에리트로포이에틴, 생합성 인간 인슐린 및 이의 유사체, 또는 모노클로날 항체를 포함하고, 이는 표적 mRNA 분자를 중화함으로써 유전자 발현 또는 번역을 조절하도록 설계된 RNA 분자뿐만 아니라 특정 세포 유형, 특정 폴리펩타이드 또는 내인성 항원과 같은 임의의 주어진 표적에 대항하거나 차단하도록 특별히 만들어진 것이다.
생물약제는 효과적인 치료법이 없는 몇몇 질병과 기존 치료법이 분명히 부적절했던 질병을 포함하여 많은 질병의 처치를 위한 주요 치료 옵션을 추가하여 의약의 많은 의료 분야에 지대한 영향을 미친다.
그러나, 생물약제의 출현은 또한 복잡한 규제 문제와 심각한 약리경제적 문제를 야기했고, 왜냐하면 생물학적 치료법의 비용이 기존 약물에 비해 극적으로 높기 때문이다. 이 요인은 많은 생물학적 약물이 남은 생애 동안 만성 질환의 처치 또는 처치할 수 없는 암의 처치에 사용되기 때문에 특히 관련이 있다.
게다가, 생물약제는 특히 대상체에 적용된 후, 예를 들면 프로테아제 또는 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 제한된 안정성의 단점을 종종 갖는다. 생물약제 분자의 부분적 또는 완전한 분해는 대상체에게 투여한 후 생물약제의 반감기를 상당히 감소시킨다.
대상체에게 생물약제를 직접 적용하는 대신, 대상체에게 충분한 양의 각 생물약제를 제공하기 위해 대체 적용 방식이 종종 필요하다.
예를 들면, 폴리펩타이드와 같은 생물약제는 각각의 폴리펩타이드를 분비하는 자가 또는 이종 세포에 의해 제공되거나 유전자 전달 방법, 예를 들면 바이러스 벡터를 사용함으로써 필요한 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 표적 조직으로 전달함으로써 제공될 수 있다.
상업적으로 이용 가능한 예시는 병든 상처 부위에 도포한 후 다양한 성장 인자를 분비하는 인간 배아 세포를 함유하는 진피 대체물이다.
진피 대체물 Dermagraft는 섬유아세포, 세포외 기질 및 생체 흡수성 지지체로 구성된다. Dermagraft는 기증된 신생아 포피 조직에서 추출한 인간 섬유아세포로부터 제조된다. 제조 과정에서 인간 섬유아세포는 생체 흡수성 폴리갈락틴 스캐폴드에 파종된다.
상업적으로 이용 가능한 진피 대체물 Apligraf는 신생아 포피에서 유래된 두 가지 유형의 세포를 포함한다. 살아있는 인간 각질세포와 섬유아세포는 상처 유형 1 콜라겐 기질에 박혀 있다.
앞서 언급한 진피 대체물의 단점은 제조 과정에서 발생하는 비교적 높은 가격이다. 또한, 진피 대체물에 사용되는 각 세포는 면역 결핍 바이러스 1형 및 2형, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 매독, 인간 T-림프자극성 1형 및 2형과 같은 인간 바이러스 뿐만 아니라 pstein Barr 바이러스 감염의 증거에 대해 테스트되어야 한다.
상업적으로 이용 가능한 또 다른 예시는 voretigene neparvovec-rzyl(LUXTURNA)이다. LUXTURNA는 망막하 주사용 아데노 관련 바이러스 벡터 기반 유전자 치료제의 현탁액이며, 망막색소상피세포 65kDa 단백질(RPE65)을 암호화하는 유전자의 정상 카피를 생물학적 활성 RPE65의 감소 또는 부재 수준의 사람의 망막 세포에 전달하도록 설계되었다.
바이러스 제품 또는 다른 바이러스 벡터 기반 유전자 치료제의 단점은 높은 제조 비용과 생산 규모를 확장하는 데 한계가 있다는 것이다.
예를 들면, WO 9714806 A2는 생물학적 활성 폴리펩타이드의 비-침습성 박테리아에 의한 대상체로의 전달을 기술한다.
WO 9611277 A1은 대상체에게 치료 화합물의 전달을 위한 매개체로서 미생물의 사용에 관한 것이다.
WO 2011160062 A2는 장 점막에서 치료 유효량의 인터루킨 27(IL-27) 또는 이의 변이체 또는 단편을 제자리에서 생성할 수 있는 재조합 미생물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 염증성 장 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
US 2013209407 A는 비뇨생식기 및/또는 위장 점막에 집락화할 수 있고 이종 항균 폴리펩타이드를 분비함으로써 병원체의 감염성 및/또는 질병 유발 활성을 차단할 수 있는 E. coli의 공생 균주에 관한 것이다.
이종 폴리펩타이드에 대한 여러 발현 시스템은 유도성 또는 구성적 프로모터를 사용하는 박테리아에 알려져 있다.
구성적 프로모터는 바람직하게는 원하는 이종 폴리펩타이드의 바람직하게는 높은 수준의 생산을 허용하는 모든 상황에서 세포에서 활성이지만, 이는 또한 대사 부담을 상당히 증가시켜 사용되는 박테리아의 생존 및/또는 성장 속도를 감소시킬 수 있다. 이것은 다시 제조 공정의 발효 동안 박테리아 수율에 직접적인 영향을 미칠 수 있다. 대사 부담이 높을수록 발효 과정에서 수율이 낮아질 수 있다.
대조적으로, 조절된, 바람직하게는 유도 가능한 프로모터가 활성화되거나 프로모터 활성이 특정 유도제에 대한 반응으로 향상된다. 각각의 조절된, 바람직하게는 유도 가능한 프로모터의 제어 하에 원하는 이종 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 박테리아에 유도제의 적용 시, 프로모터가 활성화되고 각각의 이종 폴리펩타이드를 암호화하는 관심 핵산이 발현된다. 이는 바람직하게는 재조합 박테리아의 제조 동안 유리하다. 대사 부담이 최소화되기 때문에 재조합 박테리아의 더 높은 수율이 달성될 수 있다.
널리 사용되는 제어 유전자 발현 시스템은 예를 들어 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)의 니신 제어 유전자 발현 시스템(NICE)이다.
통상의 기술자에게 잘 알려진 니신은 여러 L. 락티스 균주에 의해 생산된 광범위한 숙주 스펙트럼을 갖는 34 아미노산 란티바이오틱 폴리펩타이드이다. 니신은 식품의 방부제로서 널리 사용된다. 처음에는 니신이 전구체로서 리보솜으로 합성된다. 이어지는 효소 변형 후 변형된 분자는 세포질 막을 가로질러 전위되어 성숙한 형태로 처리된다.
관심 있는 핵산 서열의 발현은 관심 있는 유전자가 니신 시스템의 유도성 프로모터 PnisA 뒤에 위치할 때 니신의 첨가에 의해 유도될 수 있다.
니신 제어 유전자 발현 시스템은 바람직하게는 높은 단백질 수율을 제공하지만, 이는 외부 유도제에 의존한다. 니신의 첨가는 대상체에 대한 투여에 사용될 때 비용이 많이 들고, 이는 제약 등급의 니신을 제공해야 하므로 추가적인 규제 문제가 발생한다.
니신은 폴리펩타이드이기 때문에 프로테아제에 의해 분해되기 쉽다. 따라서, 니신 프로모터의 제어 하에 관심 핵산 서열을 발현하는 재조합 박테리아를 대상체에게 투여한 후, 관심 핵산 서열의 연속적인 발현을 의도한다면 바람직하게는 니신을 반복적으로 공급해야 한다.
관심 핵산 서열의 연속적인 발현을 위한 니신 첨가의 요건은 각각의 재조합 박테리아의 적용 가능한 투여 경로를 추가로 제한한다.
예를 들면, 니신 프로모터의 제어 하에 관심 핵산 서열을 발현하는 재조합 박테리아의 전신 투여는 각각의 관심 핵산 서열의 발현을 유도하는 대상체 내 니신의 농도를 달성하기 위해 추가로 대상체에 니신의 상당한 양을 잠재적으로 투여할 필요성을 요구한다. 게다가, 니신의 독성 프로파일과 제약 등급 니신의 이용 가능성의 필요를 고려해야 한다.
본 발명의 목적은 독립적으로 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체인 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 발현을 허용하는 박테리아 발현 시스템을 제공하는 것이며, 여기서 이종 폴리펩타이드는 적어도 하나의 진핵생물 폴리펩타이드, 적어도 하나의 이의 단편 또는 이들의 조합을, 대상체에 투여하기 전에 사용된 각각의 재조합 박테리아의 생존력에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 포함한다.
박테리아 발현 시스템은 적어도 대상체에게 투여 시 각각의 이종 인자의 유도 가능한 발현을 제공해야 한다.
박테리아 발현 시스템은 또한 독립적으로 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체이고, 이종 폴리펩타이드가 적어도 하나의 진핵 폴리펩타이드, 적어도 하나의 이의 단편 또는 조합을 포함하는 적어도 하나의 유익한 인자를 대상체에게, 바람직하게는 장기간에 걸쳐, 추가 유도제를 공급할 필요 없이 용이한 투여를 제공해야 한다.
게다가, 박테리아 발현 시스템은 의약에 사용되는 각각의 유익한 인자의 제어된 양을 제공해야 한다.
본 발명의 목적은 다음을 포함하는 청구항 1에 따른 재조합 박테리아를 제공함으로써 해결된다:
a) 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 여기서 상기 이종 인자는 독립적으로 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체이고,
b) 상기 염화물-유도성 프로모터의 활성을 조절하는 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자,
여기서 상기 이종성 폴리펩타이드는 적어도 하나의 진핵생물 폴리펩타이드, 적어도 하나의 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 의약에 사용된다.
재조합 박테리아의 바람직한 구현예는 종속항 3 내지 13, 15, 또는 17 내지 23 중 어느 하나에 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 다음을 포함하는 청구항 2에 따른 재조합 핵산을 제공함으로써 추가로 해결된다:
a) 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 여기서 상기 이종 인자는 독립적으로 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체이고,
b) 상기 염화물-유도성 프로모터의 활성을 조절하는 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자,
여기서 상기 이종 폴리펩타이드는 진핵생물 폴리펩타이드, 적어도 하나의 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 핵산, 바람직하게 플라스미드는 본 발명의 재조합 박테리아의 제조 방법에 사용된다.
재조합 핵산의 바람직한 구현예는 종속항 4 내지 11, 또는 14 내지 16 중 어느 하나에 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 제1항, 제3항 내지 제13항, 제15항 또는 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 재조합 박테리아 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제24항에 따른 약제학적 조성물을 제공함으로써 추가로 해결된다.
바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 의약, 바람직하게는 만성 염증성 상처 또는 퇴행성 상태의 처치, 또는 종양, 바람직하게는 악성 종양의 처치에 사용된다.
약제학적 조성물의 바람직한 구현예는 종속항 제27항 또는 제28항 중 어느 하나에 개시되어 있다.
본 발명의 목적은, 다음을 포함하는 의약에서 사용을 위한 청구항 제25항에 따른 키트에 의해 추가로 해결된다:
a) 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터의 제어 하에 적어도 하나의 이종 인자를 발현할 수 있는, 제1항, 제3항 내지 제13항, 제15항 또는 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 재조합 박테리아; 및
b) 염화물 이온을 포함하는 적어도 하나의 유도제.
키트의 바람직한 구현예는 종속항 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 다음을 포함하는 청구항 제26항에 따른 의료 장치에 의해 추가로 해결된다:
a) 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터의 제어 하에 하나 이상의 이종 인자를 발현할 수 있는, 제1항, 제3항 내지 제13항, 제15항 또는 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항의 재조합 박테리아.
키트의 바람직한 구현예는 종속항 제28항에 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 제1항, 제3항 내지 제13항, 제15항 또는 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 재조합 박테리아를 재구성하기 위해 염화물 이온을 포함하는 제31항에 따른 재구성 배지의 사용에 의해 추가로 해결된다.
본 발명자들은 외인성 유도제의 추가 투여 없이 적절한 예방 및/또는 치료 인자를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하기 위해, 상기 언급된 핵산 서열을 포함하는 재조합 박테리아가 의약, 바람직하게는 만성 염증성 상처 또는 퇴행성 상태의 처치, 또는 종양, 바람직하게는 악성 종양의 처치에 사용될 수 있음을 알아냈다.
본 발명자들은 추가로, 대상체의 세포외 조직 환경 또는 체액이 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 발현을 개시 및/또는 유지하기 위해 충분히 높은 농도의 염화물 이온을 제공한다는 것을 알아냈다.
적합한 체액은 예를 들면, 세포외액, 예를 들어 간질액, 혈관내액, 예를 들어 혈액, 혈장 및 혈청, 뇌척수액, 복막액, 소변, 눈물 및 림프액이다.
게다가, 호중구 및 단핵구와 같은 일부 식세포 포유동물 세포의 세포내 유체는 바람직하게는 원핵생물의 염화물 유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 발현을 개시 및/또는 유지하기에 충분히 높은 휴지 세포내 염화물 이온 농도를 갖는다.
그러나, 다른 포유동물 세포의 세포내 유체에서 세포내 염화물 이온 농도는 단백질 생산에 불충분한 것이 바람직하고, 따라서 본 발명의 재조합 박테리아가 이들 세포의 세포질로 진입한다면 세포 내부의 염화물 농도는 안전상의 특징으로서, 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 발현의 개시 및/또는 유지를 방지할 것이다.
이러한 발견은 적어도 하나의 이종 인자를 생산하도록 유전적으로 조작된 박테리아, 더욱 바람직하게는 비병원성 락트산 박테리아를 기반으로 하는 바람직하게는 단일 약제학적 실체로서 설계될 수 있는 재조합 박테리아의 제공을 가능하게 한다.
본 발명에 따르면 용어 "이종 인자"는 사용된 상기 박테리아에서 자연적으로 발생하거나 사용된 상기 박테리아에 의해 발현되지 않는 인자, 바람직하게는 폴리펩타이드 또는 이의 복합체를 의미한다.
일반적으로 "이종 인자"를 언급할 때 또는 특정 "이종 인자", 예를 들어 FGF-2, IL-4, CSF-1 등을 언급할 때, 이 용어는 이들의 기능적 유사체도 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명에 따르면, 인자의 "기능적 유사체"라는 용어는 각각의 인자로서 동일한 수용체에 결합하고 바람직하게는 표적 세포에서 동일한 2차 메신저를 활성화시키는 작용제를 의미한다.
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 이종 인자의 "기능적 유사체"는 각각의 이종 인자가 폴리펩타이드 또는 이의 복합체인 경우 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 93%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%의 아미노산 서열의 서열 동일성을 갖는다.
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 이종 인자의 "기능적 유사체"는 각각의 이종 인자가 리보핵산인 경우 리보핵산 서열의 서열 동일성이 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 93%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%의 리보핵산 서열의 서열 동일성을 갖는다.
"기능적 유사체"는 또한 바이오시밀러로 명명될 수 있다.
염화물 이온에 의한 유도 시, 상기 언급된 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 재조합 박테리아는 적어도 하나의 핵산 서열을 전사하고 바람직하게는 번역함으로써 적어도 하나의 이종 인자를 생산할 수 있다.
염화물 이온의 존재 하에, 본 발명의 재조합 박테리아는 바람직하게는 청구항 1에 언급된 바와 같은 적어도 하나의 이종 인자를 대상체, 예를 들면 병든 조직에 전달할 수 있어 유익한 효과를 매개 및/또는 치유를 가능하게 할 수 있다 주제의. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 대상체에 투여 후 적어도 하나의 이종 인자를 방출한다.
염화물 이온의 존재 하에, 본 발명의 재조합 박테리아는 바람직하게는, 추가로 바람직하게는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된 후, 적어도 하나의 이종 인자의 일정한 방출을 추가로 제공한다.
따라서, 바람직하게는 만성 염증성 상처 또는 퇴행성 상태, 또는 종양, 바람직하게는 악성 종양과 같은 의학적 질환으로 고통받는 대상체에 대해 훨씬 개선되고 안전하며 비용 효율적인 처치 옵션을 사용할 수 있습니다.
바람직하게는, 적어도 하나의 이종 인자는 박테리아로부터 방출된 후 상기 대상체의 치유를 지원 및/또는 의학적 질환의 악화를 방지하는 적어도 하나의 생물학적 활성 기능을 발휘한다.
게다가, 적어도 하나의 이종 인자는 박테리아로부터 방출된 후, 예방 및/또는 치료 효과, 예를 들면 국소 또는 전신 대사에 영향을 미치는 측분비 및/또는 내분비 활성을 발휘 및/또는 신체의 세포의 활성을 조절 및/또는 신체의 세포의 생존, 성장 및 분화에 영향 및/또는 면역 조절에 영향 또는 상해 및/또는 감염에 대한 급성기 염증 반응의 유도에 의해 가질 수 있다.
본 발명의 재조합 박테리아는 다음을 포함한다:
a) 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 여기서 상기 이종 인자는 독립적으로 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체이고,
b) 상기 염화물-유도성 프로모터의 활성을 조절하는 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자,
여기서 상기 이종성 폴리펩타이드는 적어도 하나의 진핵생물 폴리펩타이드, 적어도 하나의 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함한다.
용어 "원핵생물 프로모터"는 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 바람직하게는 RNA 폴리머라제 및/또는 RNA 폴리머라제를 모집하는 적어도 하나의 전사 인자에 대한 결합 부위를 제공함으로써 특정 유전자의 전사 개시를 제어하는 핵산 서열을 지칭한다.
원핵생물 프로모터는 바람직하게는 유전자의 전사 개시면 부근, 더욱 바람직하게는 전사될 동일 가닥의 5' 영역을 향하는 유전자의 동일한 가닥 및 상류에 위치한다.
"기능적으로 커플링된"이라는 용어는 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 전사가 바람직하게는 각각의 원핵생물 프로모터에 의해 개시되고 제어됨을 의미한다.
적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 전사를 바람직하게 개시하고 제어하기 위해 본 발명에 따라 사용되는 원핵생물 프로모터는 염화물 이온에 의해 유도될 수 있는 원핵생물 프로모터이다.
더욱 바람직하게는, 상기 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터의 활성은 대상체에 적용된 후 재구성 배지 또는 체액과 같은 재조합 박테리아의 환경에서 염화물 이온의 농도에 의존한다.
상기 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터의 "활성"이라는 용어는 바람직하게는 상기 프로모터에 기능적으로 커플링된 적어도 하나의 핵산 서열로부터 발현되는 적어도 하나의 이종 인자의 양을 지칭한다.
바람직하게는, 상기 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터의 "활성"이라는 용어는 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 전사로부터 수득된 단백질의 양을 지칭한다.
바람직하게는, 적어도 하나의 이종 인자는 특히 mRNA의 번역에 의해 전사된 mRNA로부터 후속적으로 생성된다.
바람직하게는 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 전사를 개시하고 제어하기 위해 본 발명에 따라 사용되는 프로모터의 활성은 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자에 의해 추가로 제어된다.
용어 "조절 유전자"는 통상의 기술자에게 공지되어 있고 하나 이상의 다른 유전자의 발현을 조절하는 데 관여하는 핵산 서열, 바람직하게는 유전자를 지칭한다. 바람직하게는 조절 유전자를 암호화하는 조절 서열은 바람직하게는 조절될 유전자의 전사 개시 부위에 대한 5'에 배열된다. 조절 서열은 또한 전사 시작 부위에 대한 3' 또는 염색체 상의 먼 부위에 배열될 수 있다.
조절 유전자는 바람직하게는 오페론 내에, 그에 인접하거나, 멀리 떨어져, 더욱 바람직하게는 동일한 박테리아 세포에 위치할 수 있다.
바람직한 구현예에서 조절 유전자는 조절 단백질, 예를 들어 억제 단백질 또는 활성화 단백질을 암호화하며, 여기서 더욱 바람직하게는 상기 조절 단백질의 발현은 개별 원핵생물 프로모터에 의해 개시되고 조절되며, 적어도 하나의 구성적 프로모터 또는 조절된, 바람직하게는 유도성 프로모터로부터 선택된다.
추가로 바람직하게는 상기 조절 단백질의 발현은 구성적 원핵생물 프로모터에 의해 조절되고, 이에 의해 본 발명의 재조합 박테리아는 상기 염화물-유도성 프로모터의 활성을 조절하기에 충분한 양의 조절 단백질을 세포간으로 제공할 수 있다.
억제인자 단백질은 바람직하게는 오퍼레이터 또는 프로모터에 결합하여 RNA 폴리머라제가 RNA를 전사하는 것을 방지한다. 적어도 하나의 유도제는 바람직하게는 억제인자 단백질이 모양을 변화시키거나 그렇지 않으면 DNA에 결합할 수 없게 되어 RNA 폴리머라제가 전사를 시작 및/또는 계속하도록 할 수 있다.
GadR과 같은 활성화 단백질은 바람직하게는 조절 단백질에 의해 제어되는 프로모터 근처의 DNA 분자 상의 부위에 결합하고 전사를 허용하고/하거나 전사 속도를 향상시킨다.
본 발명에 따르면, 상기 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 상기 염화물-유도성 프로모터의 활성을 제어하는 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자는 각각 본 발명의 재조합 박테리아의 동일한 박테리아 세포, 바람직하게는 각각의 박테리아 세포에서 위치한다.
바람직하게는, 상기 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 상기 염화물-유도성 프로모터의 활성을 조절하는 하나 이상의 이종 인자 및 상기 하나 이상의 원핵생물 조절 유전자를 암호화하는 상기 하나 이상의 핵산 서열은 각각 독립적으로 상기 재조합 박테리아의 동일한 박테리아 세포의 염색체 및/또는 적어도 하나의 플라스미드에 위치한다.
예를 들면, 상기 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 상기 적어도 하나의 핵산 서열은 본 발명의 재조합 박테리아의 적어도 하나의 박테리아 세포에서 염색체 및/또는 플라스미드 중 적어도 하나에 위치한다. 그로부터 독립적으로, 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자는 바람직하게는 상기 재조합 박테리아의 동일한 박테리아 세포의 염색체 및/또는 플라스미드 중 적어도 하나에 위치한다.
바람직하게는, 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 상기 염화물-유도성 프로모터의 활성을 조절하는 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자는 각각 염색체 및/또는 플라스미드 중 적어도 하나인 동일한 재조합 핵산 분자 상에 위치한다.
더욱 바람직하게는, 상기 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 적어도 하나의 이종 인자 및 상기 염화물-유도성 프로모터의 활성을 조절하는 상기 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자를 암호화하는 상기 적어도 하나의 핵산 서열은 적어도 둘 모두는 재조합 핵산 상에, 더욱 바람직하게는 본 발명의 재조합 플라스미드 상에 위치한다.
본 발명의 재조합 핵산, 바람직하게는 재조합 플라스미드는 다음을 포함한다:
a) 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 여기서 상기 이종 인자는 독립적으로 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체이고,
b) 상기 염화물-유도성 프로모터의 활성을 조절하는 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자,
여기서 상기 이종 폴리펩타이드는 진핵생물 폴리펩타이드, 적어도 하나의 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함한다.
용어 "플라스미드"는 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 염색체 DNA로부터 물리적으로 분리되고 독립적으로 복제할 수 있는 박테리아 세포 내의 바람직하게는 원형, 더욱 바람직하게는 이중 가닥 DNA 분자를 지칭한다.
즉, 본 발명의 재조합 핵산은 다음을 포함하는 바람직하게는 원형, 더욱 바람직하게는 이중 가닥 DNA 분자이다:
a) 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 여기서 상기 이종 인자는 독립적으로 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체이고,
b) 상기 염화물-유도성 프로모터의 활성을 조절하는 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자,
여기서 상기 이종 폴리펩타이드는 진핵생물 폴리펩타이드, 적어도 하나의 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명의 재조합 박테리아는 바람직하게는 본 발명의 재조합 핵산, 바람직하게는 재조합 플라스미드의 적어도 하나의 카피를 포함한다.
원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링된 적어도 하나의 핵산 서열은 적어도 하나의 이종 인자를 암호화한다.
바람직하게는, 적어도 하나의 핵산 서열은 각각이 사용된 상기 박테리아에서 자연적으로 발생하거나 사용된 상기 박테리아에 의해 발현되지 않는 하나 이상의 인자를 암호화한다.
추가로 바람직하게는, 적어도 하나의 핵산 서열은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 인자를 암호화하며, 각각은 사용된 상기 박테리아에서 자연적으로 발생하거나 사용된 상기 박테리아에 의해 발현되지 않고 독립적으로 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체, 바람직하게는 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체이다.
용어 "복합체"는 "서브유닛"으로 명명될 수 있고 바람직하게는 수소 결합, 이온성 상호작용, 반 데르 발스 힘 및/또는 소수성 결합 및/또는 펩타이드 결합, 예를 들면 이황화 결합이 아닌 적어도 하나의 공유 단백질-단백질 결합과 같은 적어도 하나의 비공유 단백질-단백질 상호작용에 의해 결합되거나 연결된 2 이상의 폴리펩타이드 사슬의 단백질 복합체를 의미한다.
다량체 단백질 복합체의 서브유닛은 동종다량체 단백질 복합체에서와 같이 동일하거나 이종다량체 단백질 복합체에서와 같이 상이할 수 있다.
바람직하게는, 이종 폴리펩타이드의 복합체는 본 발명의 재조합 박테리아로부터 적어도 하나의 이종 폴리펩타이드의 방출 전 및/또는 후에 형성된다.
예를 들면, 본 발명의 재조합 박테리아는 하나의 이종 폴리펩타이드를 발현하고, 이는 박테리아로부터 방출된 후 2 이상의 동일한 서브유닛을 갖는 동종다량체 단백질 복합체를 형성한다.
대안적으로, 본 발명의 재조합 박테리아는 서로 상이하고 박테리아로부터 방출된 후 2 이상의 상이한 서브유닛을 갖는 이종다량체 단백질 복합체를 형성하는 2 이상의 이종 폴리펩타이드를 발현한다.
바람직하게는, 적어도 하나의 이종 인자는 바람직하게는 본 발명의 재조합 박테리아를 상기 대상체에 적용한 후에 대상체에서 치료 및/또는 예방 효과를 갖는다.
본 발명의 추가의 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 이종 인자는 각각 하나 이상의 진핵생물 폴리펩타이드, 적어도 하나의 이의 단편 또는 그의 조합을 포함하거나 이로 이루어진 이종성 폴리펩타이드 또는 그의 복합체이다.
더욱 바람직하게는, 용어 "진핵생물 폴리펩타이드의 단편"은 상기 진핵생물 폴리펩타이드의 생물학적 활성 단편을 지칭한다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 대상체에 적용된 후, 적어도 하나의 이종 폴리펩타이드 또는 그의 복합체를 발현한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 적어도 하나의 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체를 주변 환경, 예를 들면 적용 부위 및/또는 상기 대상체의 체액으로 방출, 바람직하게는 분비한다.
적어도 하나의 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체는 예를 들면 세포 성장, 증식 및/또는 세포 분화를 자극하거나 억제함으로써, 아폽토시스를 유도하거나 억제함으로써, 면역 시스템을 활성화 또는 억제함으로써, 대사를 조절함으로써, 세포의 이동을 조절함으로써, 및/또는 생산 및/또는 대상체의 이종 인자의 방출을 조절함으로써 자체로 생물학적 효과를 대상체의 적어도 하나의 세포에 대해 가질 수 있고, 바람직하게는 본 발명의 재조합 박테리아를 상기 대상체에 적용한 후, 바람직하게는 본 발명의 재조합 박테리아로부터 방출 후, 더욱 바람직하게는 분비 후에 대상에서 치료 및/또는 예방 효과를 매개한다.
대상체에서 치료 및/또는 예방 효과는 또한 대상체에 존재하는 적어도 하나의 내인성 또는 외인성 표적 분자, 예를 들어 박테리아 항원, 바이러스 항원, 종양 항원 및/또는 내인성 폴리펩타이드에 적어도 하나의 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체를 결합시킴으로써 또한 매개될 수 있다.
예를 들면, 적어도 하나의 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체는 항체 및/또는 적어도 하나의 이의 생물학적 활성 단편이며, 이는 본 발명의 재조합 박테리아를 대상체에 적용한 후 박테리아로부터 방출되고, 이어서 적어도 하나의 표적 분자, 바람직하게는 박테리아 세포, 예를 들어 박테리아 세포 또는 바이러스의 부분, 또는 외인성 항원 또는 폴리펩타이드에 결합되고, 그렇지 않으면 과민성 면역 반응과 같은 유해한 효과를 매개할 수 있다.
대상체에 존재하는 적어도 하나의 표적 분자에 결합함으로써, 적어도 하나의 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체는 바람직하게는 상기 대상체에서 상기 분자의 양을 감소시키고/시키거나 상기 대상체에서 상기 분자의 생물학적 활성을 감소 및/또는 방지하고, 예를 들면, 상기 분자의 효소 활성을 감소 또는 억제함으로써 및/또는 내인성 수용체에 대한 상기 분자의 결합을 감소 또는 억제함으로써.
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 이종 인자는 이종 폴리펩타이드, 바람직하게는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 7개의 아미노산이 펩타이드 결합에 의해 연결된 적어도 하나의 이의 단편, 및/또는 이의 복합체이다.
적합한 폴리펩타이드의 예시는 국소적으로 및/또는 전신적으로 작용할 수 있는 진핵생물 종, 바람직하게는 포유동물 종, 더욱 바람직하게는 인간으로부터의 폴리펩타이드, 이의 전구체, 이의 단편 및 이들의 조합을 포함한다.
추가로 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 이종 폴리펩타이드는 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 효소, 폴리펩타이드 호르몬, 뉴로펩타이드, 항체, 세포 표면 수용체, 가용성 수용체, 수용체 리간드, 인트라바디로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이는 또한 진핵생물 종, 바람직하게는 포유동물 종, 더욱 바람직하게는 인간으로부터의 세포내 항체, 보조인자, 전사 인자, 부착 분자, 종양 항원, 이의 전구체, 바람직하게는 생물학적으로 활성의, 이의 단편 및 이들의 조합으로 명명될 수 있다.
적합한 종양 항원은 통상의 기술자에게 알려져 있고, 바람직하게는 Cheever, M.A. et al. (2009) (“The Prioritization of Cancer Antigens: A National Cancer Institute Pilot Project for the Acceleration of Translational Research”, Clin. Cancer Res. 15(17), pages 5323 to 5337; DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-09-0737)에 개시되어 있다.
물론, 상기 또는 하기에 언급된 폴리펩타이드 또는 이의 바이오시밀러의 기능적 유사체는 또한 청구된 바와 같이 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있다.
성장 인자는 바람직하게는 세포 성장, 증식, 치유 및/또는 세포 분화를 자극할 수 있는 폴리펩타이드다.
바람직하게는, 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 표피 성장 인자(EGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-베타), 신경 성장 인자(NGF), 액티빈, 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
섬유아세포 성장 인자는 혈관 신생, 상처 치유 및 다양한 내분비 신호 전달 경로에 관여하는 성장 인자 계열이다. 인간에서 FGF 계열의 22 멤버, 즉 FGF-1 내지 FGF-14 및 FGF-16 내지 FGF-23이 확인되었으며, 이는 본 발명에서 사용될 수 있다. FGF-1 내지 FGF-10은 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR)에 결합한다.
바람직한 구현예에서, 섬유아세포 성장 인자는 FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF- 9, FGF-10 및 이들의 혼합물, 더욱 바람직하게는 FGF-1, FGF-2, FGF-7, FGF-10 및 이들의 혼합물, 더욱 바람직하게는 FGF-2, FGF-7, 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러, 및 이들의 혼합물, 더욱 바람직하게는 FGF-2로 이루어지는 군에서 선택된다.
예를 들어, FGF-1 및 FGF-2는 혈관신생을 자극할 수 있으며 섬유아세포 및 각질세포를 포함하여 염증성 피부 기능장애 부위에 존재하는 여러 세포 유형에 대해 유사분열을 유발한다. 또한, FGF-7은 측분비 방식으로 상처 재상피화를 자극할 수 있다.
인간 섬유아세포 성장 인자 2(hFGF-2) mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_002006.4로 입수 가능하다. AUG 이성질체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001997.5 및 UniProt 수탁 번호 P09038 - 버전 182로 이용 가능하다.
전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 142에 걸쳐 있는 프로펩타이드 및 전구체의 아미노산 143 내지 288에 걸쳐 있는 성숙한 인간 섬유아세포 성장 인자 2 펩타이드를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 섬유아세포 성장 인자 2는 서열번호 5 내지 7의 아미노산 서열 중 하나 또는 적어도 하나를 포함한다. 서열번호 5 내지 7의 아미노산 서열은 각각 도 5a 내지 5c에 도시되어 있다.
인슐린 유사 성장 인자(IGF)는 인슐린에 대해 높은 서열 유사성을 갖는 단백질이다. 인슐린 유사 성장 인자는 IGF-1 및 IGF-2의 2가지 단백질을 포함하며, 이들은 본 발명에서 사용될 수 있다.
표피 성장 인자(EGF) 계열은 매우 유사한 구조적 및 기능적 특성을 갖는 단백질이며, 표피 성장 인자(EGF), 헤파린-결합 EGF 유사 성장 인자(HB-EGF), 형질전환 성장 인자- α (TGF-α), 암피레귤린(AR), 에피레귤린(EPR), 에피겐(EPGN), 베타셀룰린(BTC), 뉴레귤린-1(NRG1), 뉴레귤린-2(NRG2), 뉴레귤린-3(NRG3) 및 뉴레귤린-4( NRG4), 바람직하게는 표피 성장 인자(EGF), 헤파린-결합 EGF 유사 성장 인자(HB-EGF), 형질전환 성장 인자-α(TGF-α), 암피레귤린(AR), 에피레귤린(EPR), 에피겐(EPGN) 및 베타셀룰린(BTC), 더욱 바람직하게는 표피 성장 인자(EGF), 헤파린-결합 EGF 유사 성장 인자(HB-EGF) 및 형질전환 성장 인자-α(TGF-α)를 포함할 수 있고, 이는 본 발명에서 사용될 수 있다.
형질전환 성장인자-α(TGF-α), 바람직하게는 인간 형질전환 성장인자-α(hTGF-α)는 대식세포, 뇌 세포 및 각질세포에서 생산될 수 있다. hTGF-α는 상피 발달을 유도한다. hTGF-α 및 hEGF는 동일한 수용체, 표피 성장 인자 수용체(인간의 EGFR; ErbB-1; HER1)에 결합한다. TGF-α가 EGFR에 결합하면 상처 치유를 포함하는 여러 세포 증식 이벤트를 개시할 수 있다.
인간 형질전환 성장 인자-α는 선택적 스플라이싱에 의해 생산된 적어도 5개의 동형체에 존재한다.
인간 형질전환 성장 인자 알파 동형체 1 전구체의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_003227.1로 입수 가능하다. mRNA의 각 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_003236.2로 입수 가능하다.
인간 형질전환 성장 인자 알파 동형체 1의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 23에 걸쳐 있는 신호 펩타이드, 전구체의 아미노산 24 내지 160에 걸쳐 있는 원형질전환 성장 인자 알파 동형체 1 및 전구체의 아미노산 40 내지 89에 걸쳐 있는 성숙 형질전환 성장 인자 펩타이드를 포함한다.
인간 형질전환 성장 인자 알파 동형체 2 전구체의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001093161.1로 입수 가능하다. mRNA의 각 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001099691.1로 입수 가능하다.
인간 형질전환 성장 인자 알파 동형체 3 전구체의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001295087.1로 입수 가능하다. mRNA의 각 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001308158.1로 입수 가능하다.
인간 형질전환 성장 인자 알파 동형체 4 전구체의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001295088.1로 입수 가능하다. mRNA의 각 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001308159.1로 입수 가능하다.
인간 형질전환 성장 인자 알파 동형 5 전구체의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 AAF05090.1로 입수 가능하다. mRNA의 각 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 AF149097.1로 입수 가능하다.
암피레귤린(AREG), 바람직하게는 인간 암피레귤린(hAREG)은 EGF 수용체의 또 다른 리간드이다. 인간 암피레귤린은 성상교세포, 슈반 세포 및 섬유아세포를 포함하는 광범위한 표적 세포에 대한 자가분비 성장 인자 및 미토겐이다. 인간 암피레귤린은 상피 세포의 성장을 촉진한다.
인간 암피레귤린 전구체의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001648.1로 입수 가능하다. mRNA의 각 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001657.3으로 입수 가능하다.
에피레귤린(EPR), 바람직하게는 인간 에피레귤린(hEPR)은 세포 증식 및/또는 혈관신생을 자극할 수 있는 EGF 수용체의 리간드이다.
인간 에피레귤린 전구체의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001423.1로 입수 가능하다. mRNA의 각 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001432.1로 입수 가능하다.
에피겐(EPGN), 바람직하게는 인간 에피겐(hEPGN)은 상피 세포의 성장을 촉진한다. 인간 에피겐은 선택적 스플라이싱에 의해 생산된 적어도 7개의 동형체로 존재한다.
인간 에피겐 동형체 1 전구체의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001257918.1로 입수 가능하다. mRNA의 각 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001270989.1로 입수 가능하다.
인간 에피겐 동형체 1 내지 7 전구체의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 Q6UW88 - 버전 101로도 입수 가능하다.
베타셀룰린(BTC), 바람직하게는 인간 베타셀룰린(hBTC)은 또한 표피 성장 인자 수용체에 결합하는 성장 인자이며, 평활근 세포 및 상피 세포를 포함하는 많은 배양 세포에서 및 광범위한 성인 조직에 의해 합성된다. 인간 프로베타셀룰린 전구체의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001720.1로 입수 가능하다. mRNA의 각 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001729.1로 입수 가능하다.
인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)은 또한 소마토메딘 C라고 한다. 인간 IGF-1 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000618.2로 입수 가능하다. 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000609.1 및 UniProt 수탁 번호 P05019 - 버전 178로 입수 가능하다.
인간 인슐린 유사 성장 인자 2(hIGF-2)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000612.4로 입수 가능하다. 인간 인슐린 유사 성장 인자 2 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000603.1 및 UniProt 수탁 번호 P01344 - 버전 192로 입수 가능하다.
혈관 내피 성장 인자(VEGF) 계열은 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 태반 성장 인자(PGF)를 포함하는 성장인자의 군이며, 이는 본 발명에서 사용할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 혈관 내피 성장 인자는 혈관 내피 성장 인자 A(VEGF-A)이다. VEGF-A는 혈관신생, 맥관형성 및 내피 세포 성장을 유도할 수 있다.
인간 혈관 내피 성장 인자 A(hVEGF-A)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001025366.1로 입수 가능하다. 인간 혈관 내피 성장 인자 A의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001020537.2 및 UniProt 수탁 번호 P15692 - 버전 197로 입수 가능하다.
혈소판 유래 성장 인자(PDGF)는 세포 성장 및 분열을 조절한다. 인간 혈소판 유래 성장 인자(hPDGF)는 PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C 및 PDGF-D의 4가지 서브유닛을 가지며, 이들은 각각의 서브유닛의 동종이량체 또는 이종이량체를 형성하며, 이들은 본 발명에서 사용될 수 있다.
바람직하게는, 혈소판 유래 성장인자는 PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, PDGF-DD 또는 이들의 혼합물이다.
더욱 바람직하게는, 혈소판 유래 성장 인자는 2개의 PDGF-A 서브유닛으로 구성된 이량체성 단백질, 2개의 PDGF-B 서브유닛으로 구성된 이량체성 단백질, PDGF-A 서브유닛 및 PDGF-B 서브유닛으로 구성된 이량체성 단백질, 또는 이들의 혼합물이다.
인간 혈소판 유래 성장 인자 서브유닛 A(hPDGF-A)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_002607.4로 입수 가능하다. 각각의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_002598.4 및 UniProt 수탁 번호 P04085 - 버전 159로 입수 가능하다.
인간 혈소판 유래 성장 인자 서브유닛 B(hPDGF)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_002608.1로 입수 가능하다. 인간 혈소판 유래 성장 인자 서브유닛 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_002599.1 및 UniProt 수탁 번호 P01127 - 버전 181로 입수 가능하다.
HGF(Hepatocyte growth factor)는 간엽세포에 의해 분비되는 성장인자이고, 주로 상피세포 및 내피세포 뿐만 아니라 조혈전구세포에도 작용하며, 본 발명에서 사용될 수 있다.
인간 간세포 성장 인자(hHGF) mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000601.3으로 입수 가능하다. 인간 간세포 성장 인자 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000592.3 및 UniProt 수탁 번호 P14210 - 버전 186으로 입수 가능하다.
형질전환 성장인자 β(TGF-β), 바람직하게는 인간 형질전환 성장인자 β(hTGF-β)는 대식세포를 포함하는 많은 세포 유형에 의해 분비되는 사이토카인이다.
TGF-β는 적어도 3가지의 동형체, TGF-β1, TFG-β2 및 TGF-β3으로 존재하며, 이는 본 발명에서 사용될 수 있다.
인간 형질전환 성장인자 β1은 잠복기 연관 펩타이드(LAP)와 성숙한 TGF-β1 펩타이드로 절단되는 분비 단백질이다. 성숙한 펩타이드는 다른 TGF-β 패밀리 구성원과 TGF-β1 동종이량체 또는 이종이량체를 형성할 수 있다.
인간 형질전환 성장인자 β1 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁번호 NM_000660.4로 얻을 수 있다. 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000651.3 또는 UniProt 수탁 번호 P01137 - 버전 199로 입수 가능하다.
형질전환 성장 인자 β2(TGF-β2), 바람직하게는 인간 형질전환 성장 인자 β2(hTGF-β2)는 많은 세포 유형의 증식, 분화, 부착 및 이동을 조절하는 다기능 사이토카인이다.
대안적으로, 인간 형질전환 성장 인자 β2 유전자의 스플라이싱된 전사체 변이체가 확인되었으며, 이는 2개의 상이한 동형체를 암호화한다.
인간 형질전환 성장 인자 베타 2 동형체 1 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001135599.3으로 입수 가능하다. 각각의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001129071.1로 입수 가능하다.
인간 형질전환 성장 인자 β2 동형체 2 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_003238.3으로 입수 가능하다. 각각의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_003229.1로 입수 가능하다. 형질전환 성장 인자 β2의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P61812 - 버전 128로 추가로 입수 가능하다.
형질전환 성장 인자 β3(TGF-β3), 바람직하게는 인간 형질전환 성장 인자 β3(hTGF-β3)는 배발생 및 세포 분화에 관여하는 분비된 사이토카인이다.
인간 형질전환 성장인자 β3 전구체 단백질 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁번호 NM_003239.3으로 입수 가능하다. 해당 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_003230.1 및 UniProt 수탁 번호 P10600 - 버전 170으로 입수 가능하다.
액티빈은 원래 뇌하수체 여포 자극 호르몬(FSH) 방출을 자극하는 단백질로서 생식선 액에서 정제된 이황화 결합 이량체 단백질이다. 액티빈 단백질은 중배엽 유도, 신경 세포 분화, 뼈 리모델링, 조혈 및 생식 생리학에서의 역할을 포함하는 광범위한 생물학적 활성을 가지고 있다.
액티빈은 다양한 베타 서브유닛 동형체의 동종이량체 또는 이종이량체이고, 인히빈은 고유한 알파 서브유닛 및 4가지 베타 서브유닛, 베타 A, 베타 B, 베타 C 및 베타 E 중 하나의 이종이량체이다.
사이토카인은 바람직하게는 면역조절제로서 자가분비 신호전달, 측분비 신호전달 및 내분비 신호전달에 관여하는 폴리펩타이드이다.
바람직하게는, 사이토카인은 인터페론, 인터루킨, 림포카인, 종양 괴사 인자, 집락 자극 인자, 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 인터페론, 더욱 바람직하게는 인간 인터페론은 인터페론 알파(IFN-α), 인터페론 베타(IFN-β), 인터페론 엡실론(IFN-ε), 인터페론 카파(IFN-κ), 인터페론 감마(IFN-γ), 인터페론 오메가(IFN-ω), 인터페론 람다(IFN-λ), 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
인터페론 알파, 바람직하게는 인간 인터페론 알파는 바람직하게는 인터페론 알파-1(IFN-α1), 인터페론 알파-2(IFN-α2), 인터페론 알파-4(IFN-α4), 인터페론 알파-5(IFN-α5), 인터페론 알파-6(IFN-α6), 인터페론 알파-7(IFN-α7), 인터페론 알파-8(IFN-α8), 인터페론 알파-10(IFN-α10), 인터페론 알파-13(IFN-α13), 인터페론 알파-14(IFN-α14), 인터페론 알파-16(IFN-α16), 인터페론 알파-17(IFN-α17), 인터페론 알파-21(IFN-α21), 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러 및 이들의 혼합물, 바람직하게는 인터페론 알파-2(IFN-α2), 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
인간 인터페론 알파 1(IFN-α1)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_024013.2로 입수 가능하다. 인간 인터페론 알파 13(IFN-α13)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_006900.3으로 입수 가능하다.
인간 인터페론 알파-1 및 알파-13은 동일한 단백질 서열을 갖는다. 인간 인터페론 알파-1/13 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_076918.1 및 NP_008831.3 및 UniProt 수탁 번호 P01562 - 버전 180으로 입수 가능하다.
인간 인터페론 알파-1/13의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 23에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 24 내지 189에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 알파-2를 포함한다.
인간 인터페론 알파 2(IFN-α2)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000605.3으로 입수 가능하다. 인간 인터페론 알파-2 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000596.2 및 UniProt 수탁 번호 P01563 - 버전 176으로 입수 가능하다.
인간 인터페론 알파-2의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 23에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 24 내지 188에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 알파-2를 포함한다.
더욱 바람직하게는, 인터페론 알파-2는 도 14a 내지 14c에 각각 도시된 서열번호 28 내지 30의 아미노산 서열 중 하나 또는 적어도 하나를 포함한다.
인간 인터페론 알파 4(IFN-α4)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_021068.2로 입수 가능하다. 인간 인터페론 알파-4 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_066546.1 및 UniProt 수탁 번호 P05014 - 버전 168로 입수 가능하다.
인간 인터페론 알파-4의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 23에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 24 내지 189에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 알파-4를 포함한다.
인간 인터페론 알파 5(IFN-α5)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_002169.2로 입수 가능하다. 인간 인터페론 알파-5 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_002160.1 및 UniProt 수탁 번호 P01569 - 버전 158로 입수 가능하다.
인간 인터페론 알파-5의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 21에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 22 내지 189에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 알파-5를 포함한다.
인간 인터페론 알파 6(IFN-α6)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_021002.2로 입수 가능하다. 인간 인터페론 알파-6 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_066282.1 및 UniProt 수탁 번호 P05013 - 버전 158로 입수 가능하다.
인간 인터페론 알파-6의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 20에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 21 내지 189에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 알파-6을 포함한다.
인간 인터페론 알파 7(IFN-α7)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_021057.2로 입수 가능하다. 인간 인터페론 알파-7 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_066401.2 및 UniProt 등록 번호 P01567 - 버전 160으로 입수 가능하다.
인간 인터페론 알파-7의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 23에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 24 내지 189에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 알파-7을 포함한다.
인간 인터페론 알파 8(IFN-α8)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_002170.3으로 입수 가능하다. 인간 인터페론 알파-8 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_002161.2 및 UniProt 수탁 번호 P32881 - 버전 157로 입수 가능하다.
인간 인터페론 알파-8의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 23에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 24 내지 189에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 알파-8을 포함한다.
인간 인터페론 알파 10(IFN-α10) mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_002171.2로 입수 가능하다. 인간 인터페론 알파-10 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_002162.1 및 UniProt 수탁 번호 P01566 - 버전 160으로 입수 가능하다.
인간 인터페론 알파-10의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 23에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 24 내지 189에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 알파-10을 포함한다.
인간 인터페론 알파 14(IFN-α14)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_002172.2로 입수 가능하다. 인간 인터페론 알파-14 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_002163.2 및 UniProt 수탁 번호 P01570 - 버전 172로 입수 가능하다.
인간 인터페론 알파-14의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 23에 걸쳐 있는 시그널 펩타이드와 전구체의 아미노산 24 내지 189에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 알파-14를 포함한다.
인간 인터페론 알파 16(IFN-α16)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_002173.3으로 입수 가능하다. 인간 인터페론 알파-16 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_002164.1 및 UniProt 수탁 번호 P05015 - 버전 161로 입수 가능하다.
인간 인터페론 알파-16의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 23에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 24 내지 189에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 알파-16을 포함한다.
인간 인터페론 알파 17(IFN-α17)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_021268.2로 입수 가능하다. 인간 인터페론 알파-17 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_067091.1 및 UniProt 수탁 번호 P01571 - 버전 162로 입수 가능하다.
인간 인터페론 알파-17의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 23에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 24 내지 189에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 알파-17을 포함한다.
인간 인터페론 알파 21(IFN-α21)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_002175.2로 입수 가능하다. 인간 인터페론 알파-21 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_002166.2 및 UniProt 수탁 번호 P01568 - 버전 171로 입수 가능하다.
인간 인터페론 알파-21의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 23에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 24 내지 189에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 알파-21을 포함한다.
인간 인터페론 베타 1(IFN-β1)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_002176.3으로 입수 가능하다. 인간 인터페론 베타 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_002167.1 및 UniProt 수탁 번호 P01574 - 버전 196으로 입수 가능하다.
인간 인터페론 베타의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 21에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 22 내지 187에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 베타를 포함한다.
인간 인터페론 감마(IFN-γ)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000619.2로 입수 가능하다. 인간 인터페론 감마 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000610.2 및 UniProt 수탁 번호 P01579 - 버전 205로 입수 가능하다.
인간 인터페론 감마의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 23에 걸쳐 있는 신호 펩타이드, 및 전구체의 아미노산 24 내지 161에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 감마, 및 전구체의 아미노산 162 내지 166에 걸쳐 있는 프로펩타이드를 포함한다.
인간 인터페론 카파(IFN-κ)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_020124.2로 입수 가능하다. 인간 인터페론 카파 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_064509.2 및 UniProt 수탁 번호 Q9P0W0 - 버전 120으로 입수 가능하다.
인간 인터페론 카파의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 27에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 28 내지 207에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 감마를 포함한다.
인간 인터페론 입실론(IFN-ε)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_176891.4로 입수 가능하다. 인간 인터페론 입실론 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_795372.1 및 UniProt 수탁 번호 Q86WN2 - 버전 124로 입수 가능하다.
인간 인터페론 입실론의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 21에 걸쳐 있는 신호 펩타이드 및 전구체의 아미노산 22 내지 208에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 입실론을 포함한다.
인간 인터페론 오메가 1(IFN-ω1)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_002177.2로 입수 가능하다. 인간 인터페론 오메가 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_002168.1 및 UniProt 수탁 번호 P05000 - 버전 165로 제공된다.
인간 인터페론 오메가의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 21에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 22 내지 195에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 오메가를 포함한다.
인간 인터페론 람다(IFN-λ)는 바람직하게 인터페론 람다-1(IFN-λ1), 인터페론 람다-2(IFN-λ2), 인터페론 람다-3(IFN-λ3), 인터페론 람다-4(IFN-λ4), 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
인간 인터페론 람다 1(IFN-λ1) mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_172140.1로 입수 가능하다. 인간 인터페론 람다-1 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_742152.1 및 UniProt 수탁 번호 Q8IU54 - 버전 125로 입수 가능하다.
인간 인터페론 람다-1의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 19에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 20 내지 200에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 람다-1을 포함한다.
인간 인터페론 람다 2(IFN-λ2)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_172138.1로 입수 가능하다. 인간 인터페론 람다-2 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_742150.1 및 UniProt 수탁 번호 Q8IZJ0 - 버전 105로 입수 가능하다.
인간 인터페론 람다-2 전구체의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 25에 걸쳐 있는 신호 펩타이드 및 전구체의 아미노산 26 내지 200에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 람다-2를 포함한다.
인간 인터페론 람다 3(IFN-λ3)의 mRNA의 핵산 서열은 2개의 전사체 변이체를 포함한다. 인간 인터페론 람다 3 전사체 변이체 1의 mRNA의 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001346937.1로 입수 가능하다. 인간 인터페론 람다 3 전사체 변이체 2의 mRNA의 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_172139.3으로 입수 가능하다.
인간 인터페론 람다-3 동형체 1 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001333866.1로 입수 가능하다. 인간 인터페론 람다-3 동형체 2 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_742151.2 및 UniProt 수탁 번호 Q8IZI9 - 버전 113으로 입수 가능하다.
인간 인터페론 람다-3 동형체 2의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 21에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 22 내지 196에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 람다-3을 포함한다.
인간 인터페론 람다 4(IFN-λ4)의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001276254.2로 입수 가능하다. 인간 인터페론 람다-4 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001263183.2 및 UniProt 수탁 번호 K9M1U5 - 버전 24로 입수 가능하다.
인간 인터페론 람다-4의 전구체는 전구체의 아미노산 1 내지 21에 걸쳐 있는 신호 펩타이드와 전구체의 아미노산 22 내지 179에 걸쳐 있는 성숙한 인터페론 람다-4를 포함한다.
바람직하게는, 인터루킨, 더욱 바람직하게는 인간 인터루킨은 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-11(IL-11), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-13(IL-13), 인터루킨-14(IL-14), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-16(IL-16), 인터루킨-17(IL-17), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-19(IL-19), 인터루킨-20(IL-20), 인터루킨-21(IL-21), 인터루킨-22(IL-22), 인터루킨-23(IL-23), 인터루킨-24(IL-24), 인터루킨-25(IL-25), 인터루킨-26(IL-26), 인터루킨-27(IL-27), 인터루킨-28(IL-28), 인터루킨-29(IL-29), 인터루킨-30(IL-30), 인터루킨-31(IL-31), 인터루킨-32(IL-32), 인터루킨-33(IL-33), 인터루킨 34(IL-34), 인터루킨-36 알파(IL-36α), 인터루킨-36 베타(IL-36β), 인터루킨-36 감마(IL-36γ) , 인터루킨-37(IL-37), 카디오트로핀 유사 사이토카인 인자 1(CLCF1), 모양체 신경영양 인자(CNTF), 백혈병 억제 인자(LIF), 온코스타틴-M(OSM), 인터루킨 수용체 길항제 단백질, 인터루킨 결합 단백질, 이들의 기능성 유사체, 이들의 바이오시밀러 및 이들의 혼합물, 바람직하게는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-18(IL-18), 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 인터루킨-1(IL-1), 더욱 바람직하게는 인간 인터루킨-1은 인터루킨-1 알파(IL-1α), 인터루킨-1 베타(IL-1β), 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다.
인간 인터루킨-1 알파(IL-1α) 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000575.4로 입수 가능하다. 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000566.3으로 입수 가능하다.
인간 인터루킨-1 알파 전구체의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P01583 - 버전 1908로도 입수 가능하다. 아미노산 서열은 인터루킨-1 알파 전구체의 아미노산 1 내지 112에 걸쳐 있는 프로펩타이드 및 전구체의 아미노산 113 내지 271에 걸쳐 있는 성숙한 인터루킨-1 알파를 포함한다.
인간 인터루킨-2 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000586.3으로 입수 가능하다. 각각의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000577.2로 입수 가능하다.
인간 인터루킨-2 전구체의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P60568 - 버전 161로도 입수 가능하다. 아미노산 서열은 인터루킨-2 전구체의 아미노산 1 내지 20에 걸쳐 있는 신호 펩타이드 및 전구체의 아미노산 21 내지 153에 걸쳐 있는 성숙한 인터루킨-2를 포함한다.
인간 인터루킨-3 전구체 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000586.3으로 입수 가능하다. 각각의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000577.2로 입수 가능하다.
인간 인터루킨-3 전구체의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P08700-버전 177로도 입수 가능하다. 아미노산 서열은 인터루킨-3 전구체의 아미노산 1 내지 19에 걸쳐 있는 신호 펩타이드 및 전구체의 아미노산 20 내지 152에 걸쳐 있는 성숙한 인터루킨 3을 포함한다.
인터루킨-4(IL-4), 바람직하게는 인간 인터루킨-4(hIL-4)는 다면발현성 사이토카인이다. 인터루킨-4는 인터루킨-4 수용체에 대한 리간드이다.
인간 인터루킨-4 동형체 1 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000589.3으로 입수 가능하다. 인터루킨-4 동형체 1 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000580.1로 입수 가능하다.
인간 인터루킨-4 동형체 2 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_172348.2로 입수 가능하다. 인터루킨-4 동형체 2 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_758858.1로 입수 가능하다.
인간 인터루킨-4 전구체의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P05112-버전 178로도 입수 가능하다. 아미노산 서열은 인터루킨 4 동형체 1 및 동형체 2 전구체의 아미노산 1 내지 24에 걸쳐 있는 신호 펩타이드를 포함한다.
바람직하게는, 인터루킨-4는 도 6a 내지 6c에 각각 도시된 서열번호 8 내지 10의 아미노산 서열 중 하나 또는 적어도 하나를 포함한다.
인간 인터루킨-5 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000879.2로 입수 가능하다. 각각의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000870.1로 입수 가능하다.
인간 인터루킨-5 전구체의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P05113-버전 189로도 입수 가능하다. 아미노산 서열은 인터루킨-5 전구체의 아미노산 1 내지 19에 걸쳐 있는 신호 펩타이드 및 전구체의 아미노산 20 내지 134에 걸쳐 있는 성숙한 인터루킨-5를 포함한다.
인간 인터루킨-6 전구체의 전사체 변이체 1의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000600.4로 입수 가능하다. 인터루킨-6 동형체 1 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000591.1로 입수 가능하다.
인간 인터루킨-6 전구체의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P05231-버전 212로도 입수 가능하다. 아미노산 서열은 인터루킨-6 전구체의 아미노산 1 내지 29에 걸쳐 있는 신호 펩타이드 및 전구체의 아미노산 30 내지 212에 걸쳐 있는 성숙한 인터루킨-6을 포함한다.
인간 인터루킨-7 전구체의 전사체 변이체 1의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000880.3으로 입수 가능하다. 인터루킨-7 동형체 1 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000871.1로 입수 가능하다.
인간 인터루킨-7 전구체의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P05231-버전 212로도 입수 가능하다. 인간 인터루킨-7 동형체 1 전구체의 아미노산 서열은 동??에 1 전구체의 아미노산 1 내지 25에 걸쳐 있는 신호 펩타이드 및 동형체 1 전구체의 아미노산 26 내지 177에 걸쳐 있는 성숙한 인터루킨-7을 포함한다.
인간 인터루킨-8 전구체의 전사체 변이체 1의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000584.3으로 입수 가능하다. 인터루킨-8 동혀체 1 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000575.1로 입수 가능하다.
인간 인터루킨-8 전구체의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P10145-버전 210으로도 입수 가능하다. 인간 인터루킨-8 동형체 1 전구체의 아미노산 서열은 동형체 1 전구체의 아미노산 1 내지 20에 걸쳐 있는 신호 펩타이드를 포함한다. 99개 아미노산의 전구체 펩타이드는 분할을 거쳐 여러 활성 IL8 동형체를 생산한다.
바람직하게는 성숙한 인간 인터루킨-8은 인터루킨-8 동형체 1 전구체의 아미노산 31 내지 99를 포함한다.
인터루킨-9(IL-9), 바람직하게는 인간 인터루킨-9(hIL-9)는 다양한 세포에서 생산된다. 인간 인터루킨-9 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000590.1로 찾을 수 있다. 각각의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000581.1 및 UniProt 수탁 번호 P15248-버전 153에서 찾을 수 있다.
인간 인터루킨-9 전구체의 아미노산 서열은 인간 인터루킨-9 전구체 단백질의 아미노산 1 내지 18에 걸쳐 있는 신호 펩타이드 및 전구체의 아미노산 19 내지 144에 걸쳐 있는 성숙한 인터루킨-9를 포함한다.
인터루킨-10(IL-10), 바람직하게는 인간 인터루킨-10(hIL-10)은 주로 단핵구에 의해 생산되는 사이토카인이다. 인간 인터루킨-10 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000572.2로 찾을 수 있다. 각각의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000563.1 및 UniProt 수탁 번호 P22301-버전 156에서 찾을 수 있다.
인간 인터루킨-10 전구체의 아미노산 서열은 인간 인터루킨-10 전구체 단백질의 아미노산 1 내지 18에 걸쳐 있는 신호 펩타이드를 포함한다.
인터루킨-12는 p35로도 명명된 인터루킨-12 서브유닛 알파(IL-12A) 및 p40으로도 명명된 인터루킨-12 서브유닛 베타(IL-12B)의 2 개의 개별 유전자에 의해 암호화된 이종이량체 사이토카인이다. "p70"으로 지칭되는 활성 이종이량체 및 p40의 동종이량체가 단백질 합성 후에 형성된다.
인간 인터루킨-12 서브유닛 알파 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000882.4(변이체 1), NM_001354582.1(변이체 2) 및 NM_001354583.1(변이체 3)으로 입수 가능한 3개의 전사체 변이체를 포함한다.
인간 인터루킨-12 서브유닛 알파 전구체 동형체 1, 2 및 3의 각 아미노산 서열은 각각 NCBI 수탁 번호 NP_000873.2, NP_001341511.1 및 NP_001341512.1 및 UniProt 수탁 번호 P29459-버전 170으로 입수 가능하다.
인간 인터루킨-12 서브유닛 알파 동형체 1 전구체는 NCBI 참조 서열: NP_000873.2 하에 기탁된 전구체 단백질의 아미노산 1 내지 56에 걸쳐 있는 신호 펩타이드를 포함한다.
인간 IL12A 변이체 2 및 3에는 변이체 1에 비해 대체 프레임 내 엑손이 없다. 생성된 동형체 2 및 3은 N- 및 C-말단이 동일하지만 동형체 1에 비해 더 짧다.
마우스 인터루킨-12 서브유닛 알파 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001159424.2(변이체 1) 및 NM_008351.3(변이체 2)으로 입수 가능한 2개의 전사체 변이체를 포함한다.
마우스 인터루킨-12 서브유닛 알파 전구체 동형체 1 및 2의 각 아미노산 서열은 각각 NCBI 수탁 번호 NP_001152896.1 및 NP_032377.1 및 UniProt 수탁 번호 P43431-버전 140으로 입수 가능하다.
마우스 인터루킨-12 서브유닛 알파 동형체 2 전구체는 NCBI 참조 서열: NP_032377.1 하에 기탁된 전구체 단백질의 아미노산 1 내지 22에 걸쳐 있는 신호 펩타이드를 포함한다.
바람직하게는, 인터루킨-12 서브유닛 알파는 도 13b 및 서열번호 25에 도시된 성숙한 마우스 인터루킨-12 서브유닛 알파 동형체 2의 아미노산 서열을 포함한다.
인간 인터루킨-12 서브유닛 베타 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_002187.2로 입수 가능하다. 각각의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_002178.2 및 UniProt 수탁 번호 P29460 - 버전 210으로 입수 가능하다.
인간 인터루킨-12 서브유닛 베타 전구체 전구체는 NCBI 참조 서열 NP_002178.2 하에 기탁된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 22에 걸쳐 있는 신호 펩타이드를 포함한다.
마우스 인터루킨-12 서브유닛 베타 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001303244.1로 입수 가능하다. 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001290173.1 및 UniProt 수탁 번호 P43432-버전 163으로 입수 가능하다.
마우스 인터루킨-12 서브유닛 베타 전구체 전구체는 NCBI 참조 서열 NP_001290173.1 하에 기탁된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 22에 걸쳐 있는 신호 펩타이드를 포함한다.
바람직하게는, 인터루킨-12 서브유닛 베타는 도 13a 및 서열번호 24에 도시된 성숙한 마우스 인터루킨-12 서브유닛 베타의 아미노산 서열을 포함한다.
더욱 바람직하게는, 인터루킨-12는 바람직하게는 링커 서열에 의해 연결되고, 더욱 바람직하게는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 성숙한 형태의 인터루킨-12 서브유닛 알파 및 성숙한 형태의 인터루킨-12 서브유닛 베타를 포함하는 재조합 융합 단백질로서 발현된다.
더욱 바람직하게는, 인터루킨-12는 각각 도 13c 및 13d에 도시된 서열번호 26 내지 27의 아미노산 서열 중 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 재조합 융합 단백질로서 발현된다.
인터루킨-13(IL-13), 바람직하게는 인간 인터루킨-13(hIL-13)은 면역 조절 사이토카인이다. 인간 인터루킨-13 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_002188.2로 입수 가능하다. 각각의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_002179.2 및 UniProt 수탁 번호 P35225-버전 157로 입수 가능하다.
인터루킨-13 전구체는 UniProt 등록 번호 P35225-버전 157로 기탁된 인터루킨-13 전구체 단백질의 아미노산 1 내지 24에 걸쳐 있는 신호 펩타이드를 포함한다.
인터루킨-18(IL-18)은 IL-1 슈퍼패밀리에 속하는 사이토카인이며 예를 들면 대식세포에 의해 생산된다.
인간 인터루킨-18(hIL-18) 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001562.4(변이체 1) 및 NM_001243211.1(변이체 2)로 입수 가능한 2개의 전사체 변이체를 포함한다.
전사체 변형체 1은 우세하고 더 긴 전사체를 나타내며, 더 긴 hIL-18 동형체 1을 암호화한다.
Delta3pro-IL-18로도 알려진 전사체 변이체 2는 변형체 1에 비해 프레임 내 코딩 엑손이 없다. 암호화된 hIL-18 동형체 2는 hIL-18 동형체 1과 비교하여 더 짧고 단백질 분해 활성화에 내성이 있을 수 있다.
인간 인터루킨-18 전구체 동형체 1 및 2의 각 아미노산 서열은 각각 NCBI 수탁 번호 NP_001553.1 및 NP_001230140.1 및 UniProt 수탁 번호 Q14116-버전 1174로 입수 가능하다.
인간 인터루킨-18 동형체 1 전구체는 NCBI 참조 서열: NP_001553.1 하에 기탁된 전구체 단백질의 아미노산 1 내지 36에 걸쳐 있고 카스파제 1(CASP1) 또는 카스파제 4(CASP4)에 의해 생체내에서 처리되어 활성 형태를 생성하는 프로펩타이드를 포함한다.
바람직하게는, 인터루킨-18은 도 10a 내지 10c에 각각 도시된 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열 중 하나 또는 적어도 하나를 포함한다.
인터루킨-34(IL-34)는 단핵구와 대식세포의 분화 및 생존력을 또한 촉진하는 사이토카인이다. 선택적 스플라이싱으로 인해 인간 인터루킨-34는 2개의 동형체로 존재하며, 이는 본 발명에서 사용될 수 있다.
인간 인터루킨-34 동형체 1 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001172772.1로 입수 가능하다. 해당 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001166243.1로 입수 가능하다.
인간 인터루킨-34 동형체 2 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_001172771.1로 입수 가능하다. 해당 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001166242.1로 입수 가능하다.
각각의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 Q6ZMJ4-버전 80으로도 입수 가능하다. 인간 인터루킨-34 전구체는 전구체 단백질의 각 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 20에 걸쳐 있는 신호 펩타이드를 포함한다.
인터루킨 수용체 길항제 단백질은 바람직하게는 인터루킨-1 수용체 길항제 단백질(IL-1RA), 인터루킨-36 수용체 길항제 단백질(IL-36RA) 및 이들의 혼합물로부터 선택된다.
적합한 인터루킨 결합 단백질은 바람직하게는 인터루킨-18 결합 단백질(IL-18BP)이다.
집락-자극 인자는 바람직하게는 증식, 치유 및/또는 세포 분화를 자극할 수 있는 폴리펩타이드이다.
바람직하게는, 집락-자극 인자는 집락-자극 인자 1(CSF-1), 과립구 대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF), 과립구 집락-자극 인자(G-CSF), 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러 및 이들의 혼합물, 바람직하게는 집락-자극 인자 1(CSF-1), 과립구 대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF), 과립구 집락-자극 인자(G-CSF), 에리트로포이에틴, 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
대식세포 집락-자극 인자(M-CSF)라고도 알려진 집락 자극 인자-1(CSF-1)은 대식세포의 생산, 분화 및 기능을 제어하는 사이토카인이다.
선택적 스플라이싱으로 인해 인간 CSF-1은 상이한 동형체로 존재하며, 이는 본 발명에서 사용될 수 있다.
대식세포 집락-자극 인자 1 동형체 A 전구체로도 명명되는 인간 CSF-1 동형 1의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000757.5로 입수 가능하다. 해당 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000748.3으로 입수 가능하다.
인간 대식세포 집락-자극 인자 1 동형체 B 전구체로도 명명되는 인간 CSF-1 동형체 2 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_172210.2로 입수 가능하다. 해당 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_757349.1로 입수 가능하다.
대식세포 집락-자극 인자 1 동형체 C 전구체로도 명명되는 인간 CSF-1 동형체 3 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_172211.3으로 입수 가능하다. 해당 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_757350.1로 입수 가능하다.
각각의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P09603-버전 158로도 입수 가능하다. 동형체 1은 표준 UniProt 서열로 선택되었다.
인간 CSF-1 전구체 동형체 1 내지 3의 각각의 단백질 서열은 각각의 아미노산 서열의 아미노산 번호 1 내지 아미노산 번호 32에 걸쳐 있는 N-말단 신호 펩타이드를 포함한다.
인간 CSF-1의 활성 형태는 이황화 결합 동종이량체로서 세포외에서 발견될 수 있다. 활성 형태는 N-말단 신호 펩타이드의 손실을 초래하는 막 결합 전구체의 단백질 분해성 절단에 의해 생산된다.
바람직하게는, 집락 자극 인자 1은 도 7a(도 7aa 및 도 7ab에 나누어 기재) 내지 7c에 각각 도시된 서열 번호 11 내지 13의 아미노산 서열 중 하나 또는 적어도 하나를 포함한다.
과립구-대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF)는 집락-자극 인자 2(CSF-2)로도 알려져 있다.
인간 과립구-대식세포 집락-자극 인자 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000758.3으로 입수 가능하다. GM-CSF 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000749.2로 입수 가능하다.
인간 GM-CSF 전구체의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P04141-버전 180으로도 입수 가능하다. 인간 GM-CSF 전구체의 아미노산 서열은 전구체의 아미노산 1 내지 17에 걸쳐 있는 신호 펩타이드 및 GM-CSF 전구체의 아미노산 18 내지 144에 걸쳐 있는 성숙한 GM-CSF를 포함한다.
바람직하게는, 과립구-대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF)는 도 11a 내지 11c에 각각 도시되어 있는 서열 번호 19 내지 21의 아미노산 서열 중 하나 또는 적어도 하나를 포함한다.
과립구-집락 자극 인자(G-CSF 또는 GCSF)는 집락-자극 인자 3(CSF 3)으로도 알려져 있다.
인간에서 바람직하게는 동형체 1 및 동형체 2로 명명된 2개의 상이한 G-CSF 폴리펩타이드가 mRNA의 차등 스플라이싱에 의해 동일한 유전자로부터 합성된다. 2개의 폴리펩타이드는 3개의 아미노산의 존재 또는 부존재에 따라 상이하다. 발현 연구는 둘 다 바람직하게는 G-CSF 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.
G-CSF 동형체 a 전구체로도 명명되는 인간 G-CSF 동형체 1 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000759.3으로 입수 가능하다. 해당 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000750.1로 입수 가능하다.
G-CSF 동형체 b 전구체로도 명명되는 인간 G-CSF 동형체 2 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_172219.2로 입수 가능하다. 해당 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_757373.1로 입수 가능하다.
인간 G-CSF의 각각의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P09919-버전 193으로도 입수 가능하다. 동형체 1은 표준 UniProt 서열로부터 선택되었다.
인간 G-CSF 전구체 동형체 1 내지 2의 각각의 단백질 서열은 각각의 아미노산 서열의 아미노산 번호 1 내지 아미노산 번호 29에 걸쳐 있는 N-말단 신호 펩타이드를 포함한다.
적혈구생성인자(EPO)는 골수에서 적혈구 생성(적혈구생성)을 자극한다.
인간 에리트로포이에틴 전구체의 mRNA의 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000799.3으로 입수 가능하다. 에리트로포이에틴 전구체의 각 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000790.2로 입수 가능하다.
인간 에리트로포이에틴 전구체의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P01588-버전 183으로도 입수 가능하다. 인간 에리트로포이에틴 전구체의 아미노산 서열은 전구체의 아미노산 1 내지 27에 걸쳐 있는 신호 펩타이드 및 전구체의 아미노산 28 내지 193에 걸쳐 있는 성숙한 에리트로포이에틴을 포함한다.
케모카인은 바람직하게는 염증 부위로의 다양한 백혈구 동원을 제어하는 화학주성 폴리펩타이드의 그룹이다. 각각의 폴리펩타이드 서열의 상동성 및 처음 2개의 시스테인 사이의 아미노산 수에 기초하여 케모카인은 C, CC, CXC 및 CX3C 하위 그룹으로 세분될 수 있습니다.
바람직하게는, 케모카인은 CCL1 내지 CCL28, CXCL1 내지 CXCL17, XCL1, XCL2, CX3CL1, 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
폴리펩타이드 호르몬의 예시는 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예를 들면 코르티코트로핀 방출 호르몬, 섬 아밀로이드 폴리펩타이드, 위 억제 폴리펩타이드, 그렐린, 글루카곤 유사 펩타이드-1, 성장 호르몬 방출 호르몬, 식욕 조절 호르몬, 인슐린, 렙틴, 모틸린, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬, 유로코르틴, 췌장 폴리펩타이드, 소마토스타틴, 나트륨 이뇨 펩타이드, 성장 호르몬, 프로락틴, 칼시토닌, 황체 형성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 혈관 활성 장 폴리펩타이드, 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러 및 이들의 혼합물을 포함한다.
신경펩타이드의 예시는 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예를 들면 아구티 관련 단백질(AgRP), 가스트린 방출 펩타이드(GRP), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP), 코카인 및 암페타민 조절 전사체 펩타이드(CART), 다이노르핀, 엔돌핀, 엔테로스타틴, 갈라닌 펩타이드(GAL), 갈라닌 유사 펩타이드(GALP), 하이포크레틴/오렉신, 멜라닌 농축 호르몬(MCH), 뉴로메딘, 뉴로펩타이드 B, 뉴로펩타이드 K, 뉴로펩타이드 S, 뉴로펩타이드 W, 뉴로펩타이드 Y, 뉴로텐신, 옥시토신, 프로락틴 방출 펩타이드, 프로-오피오멜라노코르틴 및 이들로부터 유래된 멜라노코르틴, 아포지단백질 A-IV, 옥신토모듈린, 가스트린-방출 펩타이드, 포도당 의존성 인슐린영양성 폴리펩타이드, 오르파닌 FQ, 엔케팔린, 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러 및 이들의 혼합물을 포함한다.
효소의 예시는 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들면 조직 플라스미노겐 활성화제, 유로키나제, 또는 인자 VII-활성화 프로테아제와 같은 다른 효소를 포함하는 진핵 혈전용해 효소를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 항체는 전체 크기 항체 또는 Fab, 융합 단백질 또는 다량체 단백질과 같은 그의 기능적 단편일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "기능성"은 여전히 그의 의도된 기능, 즉 항원 결합을 발휘할 수 있는 항체 단편을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 용어 항체는 이에 제한되는 것은 아니나, 통상적인 항체, 키메라 항체, dAb, 이중특이성 항체, 삼중특이성 항체, 다중특이성 항체, 이가 항체, 삼가 항체, 다가 항체, VHH, 나노바디, Fab, Fab', F(ab')2 scFv, Fv, dAb, Fd, 디아바디, 트리아바디, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체, 단일 항체 가변 도메인을 포함한다.
현재 맥락에서, 용어 "항체"는 천연 또는 부분적으로 또는 전체적으로 조작된 면역글로불린을 설명하는 데 사용된다. 항체는 다양한 방식으로 변형될 수 있으므로 용어 "항체"는 항체 단편, 유도체, 기능적 등가물 및 항체의 상동체뿐만 아니라 천연 또는 전체적으로 또는 부분적으로 조작된 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩타이드 포함하는 단일 사슬 항체, 이기능성 항체, 2가 항체, VHH, 나노바디, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dAb, Fd, 디아바디, 트리아바디 및 낙타류 항체를 커버한다. 따라서, 다른 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인 또는 등가물을 포함하는 키메라 분자가 포함된다. 이 용어는 또한 결합 도메인, 예를 들면 항체 모방체이거나 또는 결합 도메인에 상동체인 결합 도메인을 갖는 임의의 폴리펩타이드 또는 단백질을 커버한다.
항체의 예시는 면역글로불린 동형체 및 IgG(IgG1, lgG2a, lgG2b, lgG3, lgG4), IgA, IgD, IgM 및 IgE를 포함하는 이의 동형 서브클래스이다. 따라서 통상의 기술자는 본 발명이 VHH, 나노바디 Fab, scFv, Fv, dAb, Fd, 디아바디 및 트리아바디와 같은 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편에 관한 것임을 이해할 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 그람 양성 박테리아 또는 재조합 핵산에 관한 것으로, 여기서 하나의 외인성 유전자가 항체 또는 그의 기능적 단편의 경쇄(VL)를 암호화하고, 또 다른 외인성 유전자가 항체 또는 그의 기능적 단편의 중쇄를 암호화하며, 더욱 바람직하게는 여기서 기능적 단편은 Fab이다. 한 구현예에서, VL 또는 그의 기능적 단편을 암호화하는 외인성 유전자는 VH 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 외인성 유전자의 3' 말단에 전사적으로 커플링된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 박테리아는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 이종 인자를 발현하며, 각각은 사용된 상기 박테리아에서 자연적으로 발생하지 않거나 이에 의해 발현되지 않고 독립적으로 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체, 바람직하게는 이종 폴리펩타이드 또는 이의 복합체이다.
예를 들면, 본 발명의 재조합 박테리아가 2, 3, 4개 이상의 이종 인자를 발현하는 경우, 각각의 이종 인자 각각의 발현은 개별 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터 또는 단일 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터, 더욱 바람직하게는 단일 오페론으로부터 상기 이종 인자의 발현을 조절하는 것에 의해 조절된다.
예를 들면, 각각의 이종 인자를 암호화하는 각각의 핵산 서열은 각각 재조합 박테리아의 개별 하위 집단에 위치할 수 있으며, 이들은 조합되어 본 발명의 재조합 박테리아를 얻을 수 있다.
각각의 핵산 서열을 포함하는 각각의 개별 하위 집단은 예를 들면, 동일한 종 또는 상이한 종의 박테리아로부터 유래할 수 있다.
예를 들면, 상이한 이종 인자를 발현하는 상이한 종의 재조합 박테리아를 사용하여 재조합 박테리아로부터 각각의 이종 인자의 발현 및 바람직하게는 방출을 조정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 각각의 핵산 서열은 다양한 수의 카피로 재조합 박테리아에 존재한다. 예를 들면, 재조합 박테리아는 박테리아 세포당 상기 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 각각의 핵산 서열의 적어도 하나의 카피를 포함한다.
재조합 박테리아의 바람직하게는 각각의 박테리아 세포에 존재하는 각각의 핵산 서열의 카피의 수는 각각의 이종 인자의 발현을 향상시키기 위해 독립적으로 증가될 수 있다.
예를 들면, 2개 이상의 이종 인자가 재조합 박테리아에 의해 발현되는 경우, 상기 이종 인자를 암호화하는 각각의 핵산 서열의 다양한 비율의 카피가 재조합 박테리아의 박테리아 세포에 존재할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 적어도 하나, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 이종 인자를 암호화하는 핵산 서열은 재조합 박테리아의 한 집단에 위치한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 각각의 핵산 서열은 상기 재조합 박테리아의 염색체 및 플라스미드 중 적어도 하나에 위치한다.
재조합 박테리아의 염색체 또는 상기 재조합 박테리아의 플라스미드 상의 핵산 서열의 위치시키는 것은 특히 박테리아에 의해 번역되는 단백질의 양을 결정하며, 그 이유는 플라스미드 상의 발현 수준이 염색체 상의 발현 수준에 비해 높기 때문이다.
본 발명의 추가의 바람직한 구현예에서, 각각의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 박테리아의 염색체 상에 제공되고 또 다른 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 상기 재조합 박테리아의 플라스미드 상에 제공된다.
본 발명의 대안적인 구현예에서, 각각의 핵산 서열은 재조합 박테리아의 염색체의 개별 부분 또는 상기 재조합 박테리아의 상이한 플라스미드 상에 제공된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 적어도 하나, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 이종 인자를 암호화하는 모든 핵산 서열은 단일 재조합 핵산, 바람직하게는 재조합 플라스미드 상에 제공된다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 재조합 핵산, 바람직하게는 재조합 플라스미드는 각각이 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 인자를 암호화하는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함하며, 이들 각각은 사용된 박테라에어서 자연적으로 발생하지 않거나 발현되지 않고, 독립적으로 이종 폴리펩타이드 또는 이들의 복합체이다.
본 발명의 또 다른 특정 바람직한 구현예에서, 적어도 하나, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열은 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자에 의해 활성이 조절되는 단일 원핵생물의 염화물 유도성 프로모터에 작동적으로 연결되고 이에 의해 조절되는 단일 오페론 상에 위치한다.
더욱 바람직하게는 상기 염화물-유도성 프로모터 및 상기 적어도 하나의 조절 유전자는 염화물-유도성 유전자 발현 카세트에 배열되고, 여기서 상기 염화물-유도성 프로모터는 상기 적어도 하나의 조절 유전자의 하류에 배열되고, 상기 염화물-유도성 유전자 발현은 카세트는 추가로 바람직하게는 단일 오페론에 위치하는 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 전사를 제어한다.
오페론은 단일 프로모터의 제어 하에 있는 유전자 클러스터를 포함하는 DNA의 기능 단위이다. 유전자는 mRNA 가닥에서 함께 전사되고 세포질에서 함께 번역된다.
바람직하게는, 상기 단일 오페론에 위치한 각각의 이종 인자를 암호화하는 각각의 핵산 서열은 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위를 암호화하는 핵산 서열이 제공된다.
바람직하게는, 리보솜 결합 부위를 암호화하는 핵산 서열은 전사될 동일한 가닥의 5' 영역을 향하는 시작 코돈의 상류에 위치한다. 서열은 바람직하게는 16S 리보솜 RNA의 3' 말단에 상보적이다.
바람직하게는, 상기 단일 오페론에 위치한 각각의 이종 인자를 암호화하는 각각의 핵산 서열은 분비 신호 서열 및 이종 인자를 포함하는 융합 단백질을 생성하는 이종 인자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 5'-말단에서 분비 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열이 제공된다.
본 발명의 재조합 박테리아 또는 본 발명의 재조합 플라스미드의 바람직한 구현예에서, 상기 염화물-유도성 프로모터 및/또는 상기 적어도 하나의 조절 유전자는 각각 독립적으로 동일한 박테리아 종으로부터 유래한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 염화물-유도성 프로모터는 분류학적 목 락토바실레스(Lactobacillales), 바람직하게는 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)의 박테리아 종으로부터의 PgadC이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 조절 유전자는 분류학적 목 락토바실레스, 바람직하게는 락토코쿠스 락티스의 박테리아 종으로부터의 GadR을 암호화하고, 바람직하게는 GenBank 기탁 번호 AAC46186.1 하에 입수 가능한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다.
더욱 바람직하게는, 분류학적 목 락토바실레스(Lactobacillales), 바람직하게는 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)의 박테리아 종으로부터의 GadR을 추가로 바람직하게 암호화하는 상기 조절 유전자의 발현은 구성적 프로모터에 의해 조절된다.
바람직하게는, 락토코쿠스 락티스 양성 조절자 GadR(gadR), GadC(gadC) 및 글루타메이트 데카르복실라제(gadB)를 암호화하는 핵산 서열은 GenBank 수탁 번호 AAC46187.1로 입수 가능하다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 염화물-유도성 유전자 발현 카세트는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 이는 또한 도 2b(도 2ba 및 도 2bb에 나누어 기재)에 도시되어 있고, 추가로 바람직하게는 단일 오페론에 위치하는 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 전사를 조절한다.
본 발명의 재조합 박테리아는 바람직하게는 박테리아를 전환시킴으로써 얻어지고, 바람직하게는 분류학적 피르미쿠테스 문, 분류학적 악티노박테리아 문 또는 분류학적 프로테오박테리아 문으로부터 선택되고, 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 연결된 적어도 하나의 핵산 서열 및 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 것과 함께 얻어지고, 상기 이종 인자는 독립적으로 이종 폴리펩타이드, 또는 이의 복합체이고, 상기 이종 폴리펩타이드는 적어도 하나의 진핵생물 폴리펩타이드, 적어도 하나의 이의 단편 또는 이들의 조합, 및 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자를 포함하며, 이는 상기 염화물-유도성 촉진제의 활성을 조절한다.
프로테오박테리아는 대장균(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 비브리오(Vibrio), 헬리코박터(Helicobacter), 예르시니아(Yersinia), 레지오넬라(Legionellales)와 같은 널리 알려진 박테리아 속을 포함하는 그람 음성 박테리아의 주요 문이다.
본 발명의 재조합 박테리아를 얻기에 적합한 박테리아는 바람직하게는 비병원성 박테리아이다. 바람직하게는, 비병원성 박테리아는 비침습성 박테리아이다.
추가의 바람직한 구현예에서, 재조합 박테리아는 그람 양성 박테리아, 바람직하게는 그람 양성 비-포자 형성 박테리아이다. 더욱 바람직하게는, 상기 박테리아는 인간 위장관에서 집락화하는 능력이 결여된 비-집락화 박테리아이다.
추가의 바람직한 구현예에서, 재조합 박테리아는 그람 양성 식품 등급 박테리아 균주, 바람직하게는 통성의 혐기성 박테리아 균주를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 재조합 박테리아는 동일한 박테리아 균주 또는 상이한 박테리아 균주의 혼합물로부터 유래할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 박테리아는 미국 식품의약국(FDA)에 의해 "일반적으로 안전한 것으로 인정"(GRAS)되는 것으로 분류된다.
다른 구현예에서, 박테리아는 유럽 식품 안전청(EFSA)에 의해 정의된 바와 같이 "안정 추정 인정"(QPS-상태)을 갖는다. 선택된 미생물 평가를 위한 QPS(Qualified Presumption of Safety) 접근 방식의 도입은 EFSA Journal, Vol. 587, 2007, 1-16페이지에 기재되어 있다.
추가의 바람직한 구현예에서, 박테리아는 분류학적 문 퍼미큐티스 또는 액티노박테리아에 속하는 비-병원성 박테리아이다. 바람직하게는, 박테리아는 비피도박테리움, 코리네박테리움, 엔테로코커스, 락토바실러스, 락토코쿠스, 류코노스톡, 페디오코커스, 프로피오니박테리움 및 스트렙토코커스로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 속으로부터의 비병원성 박테리아이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 재조합 박테리아는 유산균(LAB)이다. 유산균은 일반적인 대사 및 생리학적 특성을 공유하는 그람 양성, 내산성, 일반적으로 포자를 형성하지 않고 호흡하지 않는 박테리아의 군집입니다. 이 박테리아는 탄수화물 분해의 주요 대사 최종 산물로서 락트산을 생산한다.
락트산 박테리아는 예를 들면 식품 발효에 알려져 있으며, 사용된다. 또한, 단백질성 박테리오신은 여러 락트산 박테리아 균주에 의해 생산된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 박테리아를 수득하기 위해 사용되는 박테리아는 병원성 및/또는 기회성 박테리아를 제외한다.
다른 구현예에서, 박테리아는 이에 한정되는 것은 아니나, 비피도박테리움 에스피.(Bifidobacterium sp.) 속으로부터 유래한 것으로, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 비피도박테리움 악티노콜로니이포름(actinocoloniiforme), 비피도박테리움 아돌레센티스(adolescentis), 비피도박테리움 아에스쿨라피이(aesculapii), 비피도박테리움 안굴라툼(angulatum), 비피도박테리움 비피도박테리움 애니멀리스(animalis), 예를 들어 비피도박테리움 애니멀리스 서브에스피. 애니멀리스 또는 비피도박테리움 애니멀리스 서브에스피. 락티스, 비피도박테리움 아스테로이데스(asteroides), 비피도박테리움 비아바티이(biavatii), 비피도박테리움 비피둠(bifidum), 비피도박테리움 보헤미쿰(bohemicum), 비피도박테리움 봄비(bombi), 비피도박테리움 보움(boum), 비피도박테리움 브리브(breve), 비피도박테리움 칼리트리초스(callitrichos), 비피도박테리움 카테눌라툼(catenulatum), 비피도박테리움 초에리눔(choerinum), 비피도박테리움 코리네포르메(coryneforme), 비피도박테리움 크루딜락티스(crudilactis), 비피도박테리움 쿠니쿨리(cuniculi), 비피도박테리움 덴티콜렌스(denticolens), 비피도박테리움 덴티움(dentium), 비피도박테리움 파에칼레(faecale), 비피도박테리움 갈리쿰(gallicum), 비피도박테리움 갈리나룸(gallinarum), 비피도박테리움 글로보숨(globosum), 비피도박테리움 인디쿰(indicum), 비피도박테리움 인판티스(infantis), 비피도박테리움 이노피나툼(inopinatum), 비피도박테리움 카시와노헨스(kashiwanohense), 비피도박테리움 락티스(lactis), 비피도박테리움 롱검(longum), 예를 들어 비피도박테리움 롱검 서브에스피. 인판티스, 비피도박테리움 롱검 서브에스피. 롱검, 또는 비피도박테리움 롱검 서브에스피. 수이스(suis), 비피도박테리움 매그넘(magnum), 비피도박테리움 메리시쿰(merycicum), 비피도박테리움 미니멈(minimum), 비피도박테리움 몽골리엔스(mongoliense), 비피도박테리움 모우칼라벤스(moukalabense), 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(pseudocatenulatum), 비피도박테리움 슈도롱검(pseudolongum), 예를 들어 비피도박테리움 슈도롱검 서브에스피. 글로보숨(globosum) 또는 비피도박테리움 슈도롱검 서브에스피. 슈도롱검, 비피도박테리움 사이크라에로필룸(psychraerophilum), 비피도박테리움 풀로룸(pullorum), 비피도박테리움 루테리(reuteri), 비피도박테리움 루미난티움(ruminantium), 비피도박테리움 사에쿨라레(saeculare), 비피도박테리움 사구이니(saguini), 비피도박테리움 스카르도비이(scardovii), 비피도박테리움 스텔렌보스첸스(stellenboschense), 비피도박테리움 서브타일(subtile), 비피도박테리움 스테르코리스(stercoris), 비피도박테리움 수이스, 비피도박테리움 테르마시도필룸(thermacidophilum), 예를 들어 비피도박테리움 테르마시도필룸 서브에스피. 포르시눔(porcinum) 또는 비피도박테리움 테르마시도필룸 서브에스피. 테르마시도필룸, 비피도박테리움 써모필룸(thermophilum), 또는 비피도박테리움 트수루미엔스(tsurumiense)를 포함한다.
바람직하게는, 박테리아는 비피도박테리움 덴티움이 아니다.
바람직하게는, 박테리아는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 애니멀리스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 브리브, 또는 비피도박테리움 비피둠을 포함하는 비피도박테리움 에스피. 속에서 "안전 추정 인정" (QPS) 상태를 갖는 박테리아다.
한 구현예에서, 박테리아는 코리네박테리움 에스피.(Corynebacterium sp.) 속으로부터 유래하며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 코리네박테리움 아콜렌스(accolens), 코리네박테리움 아페르멘탄스(afermentans), 예를 들어 코리네박테리움 아페르멘탄스 서브에스피. 아페르멘탄스 또는 코리네박테리움 아페르멘탄스 서브에스피. 리포필룸(lipophilum), 코리네박테리움 암모니아게네스(ammoniagenes), 코리네박테리움 아미콜라툼(amycolatum), 코리네박테리움 아펜디세스(appendices), 코리네박테리움 아쿠아티멘스(aquatimens), 코리네박테리움 아쿠일라에(aquilae), 코리네박테리움 아르겐토라텐스(argentoratense), 코리네박테리움 아티피쿰(atypicum), 코리네박테리움 오리무코숨(aurimucosum), 코리네박테리움 아우리스(auris), 코리네박테리움 아우리스카니스(auriscanis), 코리네박테리움 베타에(betae), 코리네박테리움 베티콜라(beticola), 코리네박테리움 보비스(bovis), 코리네박테리움 칼루나에(callunae), 코리네박테리움 캄포레알렌시스(camporealensis), 코리네박테리움 카니스(canis), 코리네박테리움 카피토비스(capitovis), 코리네박테리움 카세이(casei), 코리네박테리움 카스피움(caspium), 코리네박테리움 시코니아에(ciconiae), 코리네박테리움 콘푸숨(confusum), 코리네박테리움 코일리아에(coyleae), 코리네박테리움 시스티티디스(cystitidis), 코리네박테리움 데세르티(deserti), 코리네박테리움 디프테리아에(diphtheriae), 코리네박테리움 도오사넨스(doosanense), 코리네박테리움 두룸(durum), 코리네박테리움 에피시엔스(efficiens), 코리네박테리움 에피데르미디카니스(epidermidicanis), 코리네박테리움 에쿠이(equi), 코리네박테리움 팔세니이(falsenii), 코리네박테리움 파스시안스(fascians), 코리네박테리움 펠리눔(felinum), 코리네박테리움 플라큠파시엔스(flaccumfaciens), 예를 들어 코리네박테리움 플라큠파시엔스 서브에스피. 베타에, 코리네박테리움 플라큠파시엔스 서브에스피. 플라큠파시엔스, 코리네박테리움 플라큠파시엔스 서브에스피. 오오르티이이(oortii), 또는 코리네박테리움 플라큠파시엔스 서브에스피. 포인세티아에(poinsettiae), 코리네박테리움 플라베센스(flavescens), 코리네박테리움 프란켄포르스텐스(frankenforstense), 코리네박테리움 프레이부르겐스(freiburgense), 코리네박테리움 프레네이이(freneyi), 코리네박테리움 글라우쿰(glaucum), 코리네박테리움 글루쿠로놀라이티쿰(glucuronolyticum), 코리네박테리움 글루타미쿰(glutamicum), 코리네박테리움 할로톨러란스(halotolerans), 코리네박테리움 한세니이(hansenii), 코리네박테리움 호아기(hoagie), 코리네박테리움 휴미레두센스(humireducens), 코리네박테리움 일리시스(ilicis), 코리네박테리움 이미탄스(imitans), 코리네박테리움 인시디오숨(insidiosum), 코리네박테리움 이라니쿰(iranicum), 코리네박테리움 제이케이움(jeikeium), 코리네박테리움 크로펜스테드티이(kroppenstedtii), 코리네박테리움 쿠체리(kutscheri), 코리네박테리움 락티스, 코리네박테리움 릴리움(lilium), 코리네박테리움 리포필로플라붐(lipophiloflavum), 코리네박테리움 리퀘파시엔스(liquefaciens), 코리네박테리움 루브리칸티스(lubricantis), 코리네박테리움 맥긴레이이(macginleyi), 코리네박테리움 마리눔(marinum), 코리네박테리움 마리스(maris), 코리네박테리움 마실리엔스(massiliense), 코리네박테리움 마스티티디스(mastitidis), 코리네박테리움 마트루초티이(matruchotii), 코리네박테리움 미시가넨스(michiganense), 예를 들어 코리네박테리움 미시가넨스 서브에스피. 인시디오숨(insidiosum), 코리네박테리움 미시가넨스 서브에스피. 미시가넨스, 코리네박테리움 미시가넨스 서브에스피. 네브라스켄스(nebraskense), 코리네박테리움 미시가넨스 서브에스피. 세페도니쿰(sepedonicum), 또는 코리네박테리움 미시가넨스 서브에스피. 테셀라리우스(tessellarius), 코리네박테리움 미누티시뭄(minutissimum), 코리네박테리움 무레파르켄스(mooreparkense), 코리네박테리움 무시파시엔스(mucifaciens), 코리네박테리움 무스텔라에(mustelae), 코리네박테리움 마이세토이데스(mycetoides), 코리네박테리움 네브라스켄스, 코리네박테리움 니그리칸스(nigricans), 코리네박테리움 누루키(nuruki), 코리네박테리움 오오르티이이, 코리네박테리움 파우로메타볼룸(paurometabolum), 코리네박테리움 포카에(phocae), 코리네박테리움 필바렌스(pilbarense), 코리네박테리움 필로숨(pilosum), 코리네박테리움 포인세티아에, 코리네박테리움 프로핀큠(propinquum), 코리네박테리움 슈도디프테리티쿰(pseudodiphtheriticum), 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스(pseudotuberculosis), 코리네박테리움 피오게네스(pyogenes), 코리네박테리움 피루비시프로듀센스(pyruviciproducens), 코리네박테리움 라타이이(rathayi), 코리네박테리움 레날레(renale), 코리네박테리움 레시스텐스(resistens), 코리네박테리움 리에겔리이(riegelii), 코리네박테리움 세미날레(seminale), 코리네박테리움 세페도니쿰, 코리네박테리움 시물란스(simulans), 코리네박테리움 싱글라레(singulare), 코리네박테리움 스페니스시(sphenisci), 코리네박테리움 스페니스코룸(spheniscorum), 코리네박테리움 스푸티(sputi), 코리네박테리움 스타티오니스(stationis), 코리네박테리움 스트리아툼(striatum), 코리네박테리움 수이코르디스(suicordis), 코리네박테리움 선드스발렌스(sundsvallense), 코리네박테리움 테르페노타비둠(terpenotabidum), 코리네박테리움 테스투디노리스(testudinoris), 코리네박테리움 톰스세니이(thomssenii), 코리네박테리움 티모넨스(timonense), 코리네박테리움 트리티시(tritici), 코리네박테리움 투베르쿨로스테아리쿰(tuberculostearicum), 코리네박테리움 투스카니엔스(tuscaniense), 코리네박테리움 울세란스(ulcerans), 코리네박테리움 울세리보비스(ulceribovis), 코리네박테리움 우레알리티쿰(urealyticum), 코리네박테리움 우레이셀레리보란스(ureicelerivorans), 코리네박테리움 우테레퀴(uterequi), 코리네박테리움 바리아빌레(variabile), 코리네박테리움 비타에루미니스(vitaeruminis), 또는 코리네박테리움 제로시스(xerosis)를 포함한다.
바람직하게는, 박테리아는 코리네박테리움 디프테리아에, 코리네박테리움 아미콜라툼(amicolatum), 코리네박테리움 스트리아툼, 코리네박테리움 제이케이움, 코리네박테리움 우레알리티쿰, 코리네박테리움 제로시스, 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스, 코리네박테리움 테누이스(tenuis), 코리네박테리움 스트리아툼, 또는 코리네박테리움 미누티시뭄이 아니다.
바람직하게는, 박테리아는 코리네박테리움 속에서 "일반적으로 안전한 것으로 인정"(GRAS)되는 것으로 분류되는 박테리아이며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만 코리네박테리움 암모니아게네스, 코리네박테리움 카세이, 코리네박테리움 플라베센스, 또는 코리네박테리움 바리아빌레를 포함한다.
다른 구현예에서, 박테리아는 엔테로코쿠스 에스피.(Enterococcus sp.) 속으로부터 유래하며 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 엔테로코쿠스 알세디니스(alcedinis), 엔테로코쿠스 아퀴마리누스(aquimarinus), 엔테로코쿠스 아시니(asini), 엔테로코쿠스 아비움(avium), 엔테로코쿠스 카카에(caccae), 엔테로코쿠스 카멜리아에(camelliae), 엔테로코쿠스 카닌테스티니(canintestini), 엔테로코쿠스 카니스(canis), 엔테로코쿠스 카셀리플라부스(casseliflavus), 엔테로코쿠스 세코룸(cecorum), 엔테로코쿠스 콜룸바에(columbae), 엔테로코쿠스 데브리에세이(devriesei), 엔테로코쿠스 디에스트람메나에(diestrammenae), 엔테로코쿠스 디스파르(dispar), 엔테로코쿠스 두란스(durans), 엔테로코쿠스 유레켄시스(eurekensis), 엔테로코쿠스 파에칼리스(faecalis), 엔테로코쿠스 파에시움(faecium), 엔테로코쿠스 플라베센스, 엔테로코쿠스 갈리나룸, 엔테로코쿠스 길부스(gilvus), 엔테로코쿠스 하에모페록시두스(haemoperoxidus), 엔테로코쿠스 헤르만니엔시스(hermanniensis), 엔테로코쿠스 히라에(hirae), 엔테로코쿠스 이탈리쿠스(italicus), 엔테로코쿠스 락티스, 엔테로코쿠스 레마니이(lemanii), 엔테로코쿠스 말로도라투스(malodoratus), 엔테로코쿠스 모라비엔시스(moraviensis), 엔테로코쿠스 문드티이이(mundtii), 엔테로코쿠스 올리바에(olivae), 엔테로코쿠스 팔렌스(pallens), 엔테로코쿠스 포에니쿨리콜라, 엔테로코쿠스 플란타룸(plantarum), 엔테로코쿠스 포르시누스(porcinus), 엔테로코쿠스 슈도아비움, 엔테로코쿠스 퀘베센시스(quebecensis), 엔테로코쿠스 라피노수스(raffinosus), 엔테로코쿠스 라티(ratti), 엔테로코쿠스 리보룸(rivorum), 엔테로코쿠스 로타이(rotai), 엔테로코쿠스 사카롤리티쿠스(saccharolyticus), 예를 들어 엔테로코쿠스 사카롤리티쿠스 서브에스피. 사카롤리티쿠스 또는 엔테로코쿠스 사카롤리티쿠스 서브에스피. 타이와넨시스(taiwanensis), 엔테로코쿠스 사카로미니무스(saccharominimus), 엔테로코쿠스 세리올리시다(seriolicida), 엔테로코쿠스 실레시아쿠스(silesiacus), 엔테로코쿠스 솔리타리우스(solitarius), 엔테로코쿠스 술푸레우스(sulfureus), 엔테로코쿠스 테르미티스(termitis), 엔테로코쿠스 타일란디쿠스(thailandicus), 엔테로코쿠스 우레일리티쿠스(ureilyticus), 엔테로코쿠스 비이키엔시스(viikkiensis), 엔테로코쿠스 빌로룸(villorum), 또는 엔테로코쿠스 시앙팡겐시스(xiangfangensis)를 포함한다.
바람직하게는, 박테리아는 "일반적으로 안전한 것으로 인정" (GRAS)되는 것으로 분류되는 엔테로코쿠스 속의 박테리아이며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만 엔테로코쿠스 두란스, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 또는 엔테로코쿠스 파에시움을 포함한다
또 다른 구현예에서, 박테리아는 락토바실루스 에스피.(Lactobacillus sp.) 속으로부터 유래하며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 락토바실루스 아세토톨러란스(acetotolerans), 락토바실루스 애시디파리나에(acidifarinae), 락토바실루스 애시디피스시스(acidipiscis), 락토바실루스 애시도필루스(acidophilus), 락토바실루스 아길리스(agilis), 락토바실루스 알기두스(algidus), 락토바실루스 알리멘타리우스(alimentarius), 락토바실루스 아밀로리티쿠스(amylolyticus), 락토바실루스 아밀로필루스, 락토바실루스 아밀로트로피쿠스(amylotrophicus), 락토바실루스 아밀로보루스(amylovorus), 락토바실루스 애니멀리스, 락토바실루스 안트리(antri), 락토바실루스 아피노룸(apinorum), 락토바실루스 아피스(apis), 락토바실루스 아포데미(apodemi), 락토바실루스 아쿠아티쿠스(aquaticus), 락토바실루스 아리조넨시스(arizonensis), 락토바실루스 아비아리에스(aviaries), 예를 들어 락토바실루스 아비아리우스 서브에스피. 아라피노수스 또는 락토바실루스 아비아리우스 서브에스피. 아비아리우스, 락토바실루스 박키이(backii), 락토바실루스 바바리쿠스(bavaricus), 락토바실루스 비페르멘탄스(bifermentans), 락토바실루스 보발리우스(bobalius), 락토바실루스 봄비, 락토바실루스 브란타에(brantae), 락토바실루스 브레비스(brevis), 락토바실루스 부크네리(buchneri), 락토바실루스 불가리쿠스(bulgaricus), 락토바실루스 카카오눔(cacaonum), 락토바실루스 카멜리아에, 락토바실루스 카필라투스(capillatus), 락토바실루스 카르니스(carnis), 락토바실루스 카세이(casei), 예를 들어 락토바실루스 카세이 서브에스피. 알락토수스(alactosus), 락토바실루스 카세이 서브에스피. 카세이, 락토바실루스 카세이 서브에스피. 슈도플란타룸, 락토바실루스 카세이 서브에스피. 람노수스(rhamnosus), 또는 락토바실루스 카세이 서브에스피. 톨러란스(tolerans), 락토바실루스 카테나포르미스(catenaformis), 락토바실루스 셀로비오수스(cellobiosus), 락토바실루스 세티(ceti), 락토바실루스 콜레오호미니스(coleohominis), 락토바실루스 콜리노이데스(collinoides), 락토바실루스 콤포스티(composti), 락토바실루스 콘카부스(concavus), 락토바실루스 콘푸수스(confusus), 락토바실루스 코리니포르미스(coryniformis), 예를 들어 락토바실루스 코리니포르미스 서브에스피. 코리니포르미스 또는 락토바실루스 코리니포르미스 서브에스피. 토르쿠엔스(torquens), 락토바실루스 크리스파투스(crispatus), 락토바실루스 크루스토룸(crustorum), 락토바실루스 쿠리에아에(curieae), 락토바실루스 쿠르바투스(curvatus), 예를 들어 락토바실루스 쿠르바투스 서브에스피. 쿠르바투스 또는 락토바실루스 쿠르바투스 서브에스피. 멜리비오수스(melibiosus), 락토바실루스 시프리카세이(cypricasei), 락토바실루스 델브루엑키이(delbrueckii), 예를 들어 락토바실루스 델브루엑키이 서브에스피. 불가리쿠스, 락토바실루스 델브루엑키이 서브에스피. 델브루엑키이, 락토바실루스 델브루엑키이 서브에스피. 인디쿠스(indicus), 락토바실루스 델브루엑키이 서브에스피. 자코브세니이(jakobsenii), 락토바실루스 델브루엑키이 서브에스피. 락티스, 또는 락토바실루스 델브루엑키이 서브에스피. 선키이(sunkii), 락토바실루스 덱스트리니쿠스(dextrinicus), 락토바실루스 디올리보란스(diolivorans), 락토바실루스 디베르겐스(divergens), 락토바실루스 두리아니스(durianis), 락토바실루스 에쿠이(equi), 락토바실루스 에쿠이쿠르소리스(equicursoris), 락토바실루스 에쿠이게네로시(equigenerosi), 락토바실루스 파비페르멘탄스(fabifermentans), 락토바실루스 파에시스(faecis), 락토바실루스 파르시미니스(farciminis), 락토바실루스 파라기니스(farraginis), 락토바실루스 페린토쉔시스(ferintoshensis), 락토바실루스 페르멘툼(fermentum), 락토바실루스 플로리콜라(floricola), 락토바실루스 플로룸(florum), 락토바실루스 포르니칼리스(fornicalis), 락토바실루스 프룩티보란스(fructivorans), 락토바실루스 프룩토수스(fructosus), 락토바실루스 프루멘티(frumenti), 락토바실루스 푸슈엔시스(fuchuensis), 락토바실루스 푸르푸리콜라(furfuricola), 락토바실루스 푸트사이이(futsaii), 락토바실루스 갈리나룸(gallinarum), 락토바실루스 가세리(gasseri), 락토바실루스 가스트리쿠스(gastricus), 락토바실루스 가넨시스(ghanensis), 락토바실루스 기게리오룸(gigeriorum), 락토바실루스 그라미니스(graminis), 락토바실루스 할로톨러란스(halotolerans), 락토바실루스 함메시이(hammesii), 락토바실루스 함스테리(hamsteri), 락토바실루스 하르비넨시스(harbinensis), 락토바실루스 하야키텐시스(hayakitensis), 락토바실루스 헤일롱지이안겐시스(heilongjiangensis), 락토바실루스 헬싱보르겐시스(helsingborgensis), 락토바실루스 헬벡티쿠스(helveticus), 락토바실루스 헤테로히오치이(heterohiochii), 락토바실루스 힐가르디이(hilgardii), 락토바실루스 혹카이도넨시스(hokkaidonensis), 락토바실루스 호미니스(hominis), 락토바실루스 호모히오치이(homohiochii), 락토바실루스 호르데이(hordei), 락토바실루스 이너스(iners), 락토바실루스 인글루비에이(ingluviei), 락토바실루스 인테스티날리스(intestinalis), 락토바실루스 이와텐시스(iwatensis), 락토바실루스 젠세니이(jensenii), 락토바실루스 존소니이(johnsonii), 락토바실루스 칼릭센시스(kalixensis), 락토바실루스 칸들레리(kandleri), 락토바실루스 케피라노파시엔스(kefiranofaciens), 예를 들어 락토바실루스 케피라노파시엔스 서브에스피. 케피라노파시엔스 또는 락토바실루스 케피라노파시엔스 서브에스피. 케피르그라눔(kefirgranum), 락토바실루스 케피리(kefiri), 락토바실루스 케피르그라눔, 락토바실루스 킴블라디이(kimbladii), 락토바실루스 킴치쿠스(kimchicus), 락토바실루스 킴치엔시스(kimchiensis), 락토바실루스 킴치이(kimchii), 락토바실루스 키소넨시스(kisonensis), 락토바실루스 키타사토니스(kitasatonis), 락토바실루스 코레엔시스(koreensis), 락토바실루스 쿨라베르겐시스(kullabergensis), 락토바실루스 쿤케에이(kunkeei), 락토바실루스 락티스, 락토바실루스 레이크만니이(leichmannii), 락토바실루스 린드네리(lindneri), 락토바실루스 말레페르멘탄스(malefermentans), 락토바실루스 말리(mali), 락토바실루스 말타로미쿠스(maltaromicus), 락토바실루스 만니호티보란스(manihotivorans), 락토바실루스 멜리퍼(mellifer), 락토바실루스 멜리스(mellis), 락토바실루스 멜리벤트리스(melliventris), 락토바실루스 민덴시스(mindensis), 락토바실루스 미노르(minor), 락토바실루스 미누투스(minutus), 락토바실루스 무코사에(mucosae), 락토바실루스 무리누스(murinus), 락토바실루스 나겔리이(nagelii), 락토바실루스 나무렌시스(namurensis), 락토바실루스 난텐시스(nantensis), 락토바실루스 나수엔시스(nasuensis), 락토바실루스 넨지안겐시스(nenjiangensis), 락토바실루스 노덴시스(nodensis), 락토바실루스 오도라티토푸이(odoratitofui), 락토바실루스 오에니(oeni), 락토바실루스 올리고페르멘탄스(oligofermentans), 락토바실루스 오리스(oris), 락토바실루스 오리자에(oryzae), 락토바실루스 오타키엔시스(otakiensis), 락토바실루스 오젠시스(ozensis), 락토바실루스 파니스(panis), 락토바실루스 판테리스(pantheris), 락토바실루스 파라브레비스(parabrevis), 락토바실루스 파라부크네리(parabuchneri), 락토바실루스 파라카세이(paracasei), 예를 들어 락토바실루스 파라카세이 서브에스피. 파라카세이 또는 락토바실루스 파라카세이 서브에스피. 톨러란스, 락토바실루스 파라콜리노이데스(paracollinoides), 락토바실루스 파라파라기니스(parafarraginis), 락토바실루스 파라케피리(parakefiri), 락토바실루스 파랄리멘타리우스(paralimentarius), 락토바실루스 파라플란타룸(paraplantarum), 락토바실루스 파스테우리이(pasteurii), 락토바실루스 파우시보란스(paucivorans), 락토바실루스 펜토수스(pentosus), 락토바실루스 페롤렌스(perolens), 락토바실루스 피스시콜라(piscicola), 락토바실루스 플란타룸, 예를 들어 락토바실루스 플란타룸 서브에스피. 아르겐토라텐시스(argentoratensis) 또는 락토바실루스 플란타룸 서브에스피. 플란타룸, 락토바실루스 포부지히이(pobuzihii), 락토바실루스 폰티스(pontis), 락토바실루스 포르시나에(porcinae), 락토바실루스 프시타시(psittaci), 락토바실루스 라피(rapi), 락토바실루스 렌니니(rennini), 락토바실루스 루테리(reuteri), 락토바실루스 람노수스(rhamnosus), 락토바실루스 리마에(rimae), 락토바실루스 로덴티움(rodentium), 락토바실루스 로고사에(rogosae), 락토바실루스 로시아에(rossiae), 락토바실루스 루미니스(ruminis), 락토바실루스 사에림네리(saerimneri), 락토바실루스 사케이(sakei), 예를 들어 락토바실루스 사케이 서브에스피. 카르노수스(carnosus) 또는 락토바실루스 사케이 서브에스피. 사케이(sakei), 락토바실루스 살리바리우스(salivarius), 예를 들어 락토바실루스 살리바리우스 서브에스피. 살리시니우스(salicinius) 또는 락토바실루스 살리바리우스 서브에스피. 살리바리우스, 락토바실루스 샌프란시센시스(sanfranciscensis), 락토바실루스 사니비리(saniviri), 락토바실루스 사트수멘시스(satsumensis), 락토바실루스 세칼리필루스(secaliphilus), 락토바실루스 셀란고렌시스(selangorensis), 락토바실루스 세니오리스(senioris), 락토바실루스 센마이주케이(senmaizukei), 락토바실루스 샤르페아에(sharpeae), 락토바실루스 쉔즈헤넨시스(shenzhenensis), 락토바실루스 시세라에(sicerae), 락토바실루스 실라게이(silagei), 락토바실루스 실리기니스(siliginis), 락토바실루스 시밀레스(similes), 락토바실루스 소브리우스(sobrius), 락토바실루스 송후아지안겐시스(songhuajiangensis), 락토바실루스 스피쉐리(spicheri), 락토바실루스 수시콜라(sucicola), 락토바실루스 슈비쿠스(suebicus), 락토바실루스 선키이(sunkii), 락토바실루스 선토리에우스(suntoryeus), 락토바실루스 타이와넨시스(taiwanensis), 락토바실루스 타일란덴시스(thailandensis), 락토바실루스 써모톨러란스(thermotolerans), 락토바실루스 트리초데스(trichodes), 락토바실루스 투세티(tucceti), 락토바실루스 울리(uli), 락토바실루스 울투넨시스(ultunensis), 락토바실루스 우바룸(uvarum), 락토바실루스 백시노스테르쿠스(vaccinostercus), 락토바실루스 바기날리스(vaginalis), 락토바실루스 베르스몰덴시스(versmoldensis), 락토바실루스 비니(vini), 락토바실루스 비리데스센스(viridescens), 락토바실루스 비툴리누스(vitulinus), 락토바실루스 시앙팡겐시스, 락토바실루스 자일로수스(xylosus), 락토바실루스 야마나시엔시스(yamanashiensis), 예를 들어 락토바실루스 야마나시엔시스 서브에스피. 말리 또는 락토바실루스 야마나시엔시스 서브에스피. 야마나시엔시스, 락토바실루스 욘기넨시스(yonginensis), 락토바실루스 제아에(zeae), 또는 락토바실루스 지마에(zymae)를 포함한다.
바람직하게는, 박테리아는 "일반적으로 안전한 것으로 인정" (GRAS)되는 것으로써 락토바실루스 에스피. 속으로 분류되는 박테리아이며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 락토바실루스 애시도필루스 균주 NP 28, 락토바실루스 애시도필루스 균주 NP51, 락토바실루스 서브에스피. 락티스 균주 NP7, 락토바실루스 루테리 균주 NCIMB 30242, 락토바실루스 카세이 균주 Shirota, 락토바실루스 루테리 균주 DSM 17938, 락토바실루스 루테리 균주 NCIMB 30242, 락토바실루스 애시도필루스 균주 NCFM, 락토바실루스 람노수스 균주 HN001, 락토바실루스 람노수스 균주 HN001, 락토바실루스 루테리 균주 DSM 17938, 락토바실루스 카세이 서브에스피. 람노수스 균주 GG, 락토바실루스 애시도필루스, 락토바실루스 락티스, 락토바실루스 아세토톨러란스, 락토바실루스 애시디파리나에, 락토바실루스 애시디피스시스, 락토바실루스 애시도필루스, 락토바실루스 알리멘타리우스, 락토바실루스 아밀로리티쿠스, 락토바실루스 아밀로보루스, 락토바실루스 브레비스, 락토바실루스 부크네리, 락토바실루스 카카오눔, 락토바실루스 카세이 서브에스피. 카세이, 락토바실루스 콜리노이데스, 락토바실루스 콤포스티, 락토바실루스 코리니포르미스 서브에스피. 코리니포르미스, 락토바실루스 크리스파투스, 락토바실루스 크루스토룸, 락토바실루스 쿠르바투스 서브피에스. 쿠르바투스, 락토바실루스 델브루엑키이 서브에스피. 불가리쿠스, 락토바실루스 델브루엑키이 서브에스피. 델브루엑키이, 락토바실루스 델브루엑키이 서브에스피. 락티스, 락토바실루스 덱스트리니쿠스, 락토바실루스 디올리보란스, 락토바실루스 파비페르멘탄스, 락토바실루스 파르시미니스, 락토바실루스 페르멘툼, 락토바실루스 프룩티보란스, 락토바실루스 프루멘티, 락토바실루스 가세리, 락토바실루스 가넨시스, 락토바실루스 함메시이, 락토바실루스 하르비넨시스, 락토바실루스 헬벡티쿠스, 락토바실루스 힐가르디이, 락토바실루스 호모히오치이, 락토바실루스 호르데이, 락토바실루스 젠세니이, 락토바실루스 존소니이, 락토바실루스 케피리, 락토바실루스 케피라노파덴스(kefiranofadens) 서브에스피. 케피라노파시엔스, 락토바실루스 케피라노파덴스 서브에스피. 케피르그라눔, 락토바실루스 킴치이, 락토바실루스 키소넨시스, 락토바실루스 마일(mail), 락토바실루스 만니호티보란스, 락토바실루스 민덴시스, 락토바실루스 무코사에, 락토바실루스 나겔리이, 락토바실루스 나무렌시스, 락토바실루스 난텐시스, 락토바실루스 노덴시스, 락토바실루스 오에니, 락토바실루스 오타키엔시스, 락토바실루스 파니스, 락토바실루스 파라브레비스, 락토바실루스 파라부크네리, 락토바실루스 파라카세이 서브에스피. 파라카세이, 락토바실루스 파라케피리, 락토바실루스 파랄리멘타리우스, 락토바실루스 파라플란타룸, 락토바실루스 펜토수스, 락토바실루스 페롤렌스, 락토바실루스 플란타룸 서브에스피. 플란타룸, 락토바실루스 포부지히이, 락토바실루스 폰티스, 락토바실루스 라피, 락토바실루스 루테리, 락토바실루스 람노수스, 락토바실루스 로시아에, 락토바실루스 사케이 서브에스피 카르노수스, 락토바실루스 사케이 서브에스피. 사케이, 락토바실루스 살리 바리우스(sali varius) 서브에스피. 살리바리우스, 락토바실루스 샌프란시센시스, 락토바실루스 사트수멘시스, 락토바실루스 세칼리필루스, 락토바실루스 센마이주케이, 락토바실루스 실리기니스, 락토바실루스 스피쉐리, 락토바실루스 슈비쿠스, 락토바실루스 선키이, 락토바실루스 투세티, 락토바실루스 백시노스테르쿠스, 락토바실루스 베르스몰덴시스, 또는 락토바실루스 야마나시엔시스(yamanashiensis)를 포함한다.
바람직하게는, 박테리아는 락토바실루스 에스피. 속의 "안전 추정 인정" (QPS) 상태를 갖는 박테리아이며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 락토바실루스 애시도필루스, 락토바실루스 아밀로리티쿠스, 락토바실루스 아밀로보루스, 락토바실루스 알리멘타리우스, 락토바실루스 아비아리에스, 락토바실루스 브레비스, 락토바실루스 부크네리, 락토바실루스 카세이, 락토바실루스 크리스파투스, 락토바실루스 쿠르바투스, 락토바실루스 델브루엑키이, 락토바실루스 파르시미니스, 락토바실루스 페르멘툼, 락토바실루스 갈리나룸, 락토바실루스 가세리, 락토바실루스 헬벡티쿠스, 락토바실루스 힐가르디이, 락토바실루스 존소니이, 락토바실루스 케피라노파시엔스, 락토바실루스 케피리, 락토바실루스 무코사에, 락토바실루스 파니스, 락토바실루스 파라카세이, 락토바실루스 파라플란타룸, 락토바실루스 펜토수스, 락토바실루스 플란타룸, 락토바실루스 폰티스, 락토바실루스 루테리, 락토바실루스 람노수스, 락토바실루스 사케이, 락토바실루스 살리바리우스, 락토바실루스 샌프란시센시스, 또는 락토바실루스 제아에를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 박테리아는 락토코쿠스 에스피. 속으로부터 유래하며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만 락토코쿠스 춘간겐시스(chungangensis), 락토코쿠스 포르모센시스(formosensis), 락토코쿠스 푸지엔시스(fujiensis), 락토코쿠스 가르비에아에(garvieae), 락토코쿠스 락티스, 예를 들어 락토코쿠스 락티스 서브에스피. 크레모리스(Lactococcus lactis subsp. cremoris), 락토코쿠스 락티스 서브에스피. 호르드니아에(hordniae), 락토코쿠스 락티스 서브에스피. 락티스, 또는 락토코쿠스 락티스 서브에스피. 트루크타에(tructae), 락토코쿠스 피스시움(piscium), 락토코쿠스 플란타룸, 락토코쿠스 라피놀락티스, 또는 락토코쿠스 타이와넨시스를 포함한다.
바람직하게는, 박테리아는 "일반적으로 안전한 것으로 인정" (GRAS)되는 것으로서 락토코쿠스 속으로 분류되는 박테리아이며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 락토코쿠스 락티스 서브에스피. 크레모리스, 락토코쿠스 락티스 서브에스피. 락티스, 및 락토코쿠스 라피놀락티스를 포함한다.
바람직하게는, 박테리아는 락토코쿠스 락티스, 바람직하게는 락토코쿠스 락티스 서브에스피. 락티스, 락토코쿠스 락티스 서브에스피. 락티스 생체변이 디아세틸락티스(diacetylactis), 또는 락토코쿠스 락티스 서브에스피. 크레모리스, 더 바람직하게는 락토코쿠스 락티스 서브에스피. 크레모리스를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 박테리아는 류코노스톡(Leuconostoc) 에스피. 속에서 유래되며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 류코노스톡 아멜리비오숨(amelibiosum), 류코노스톡 아르겐티눔(argentinum), 류코노스톡 카르노숨(carnosum), 류코노스톡 시트레움(citreum), 류코노스톡 크레모리스(cremoris), 류코노스톡 덱스트라니쿰(dextranicum), 류코노스톡 두리오니스(durionis), 류코노스톡 팔락스(fallax), 류코노스톡 피쿨네움(ficulneum), 류코노스톡 프룩토숨(fructosum), 류코노스톡 가시코미타툼(gasicomitatum), 류코노스톡 겔리둠(gelidum), 예를 들어 류코노스톡 겔리둠 서브에스피. 아에니그마티쿰(aenigmaticum), 류코노스톡 겔리둠 서브에스피. 가시코미타툼, 또는 류코노스톡 겔리둠 서브에스피. 겔리둠, 류코노스톡 홀자프펠리이(holzapfelii), 류코노스톡 인하에(inhae), 류코노스톡 킴치이, 류코노스톡 락티스, 류코노스톡 메센테로이데스(mesenteroides), 예를 들어 류코노스톡 메센테로이데스 서브에스피. 크레모리스, 류코노스톡 메센테로이데스 서브에스피. 덱스트라니쿰스, 류코노스톡 메센테로이데스 서브에스피. 메센테로이데스, 또는 류코노스톡 메센테로이데스 서브에스피. 수이오니쿰(suionicum), 류코노스톡 미육김치이(miyukkkimchii), 류코노스톡 오에니, 류코노스톡 파라메센테로이데스, 류코노스톡 슈도피쿨네움, 또는 류코노스톡 슈도메센테로이데스를 포함한다.
바람직하게는, 박테리아는 "일반적으로 안전한 것으로 인정" (GRAS)되는 것으로써 류코노스톡 에스피. 속으로 분류되는 박테리아이며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 류코노스톡 카르노숨, 류코노스톡 시트레움, 류코노스톡 팔락스, 류코노스톡 홀자프펠리이, 류코노스톡 인하에, 류코노스톡 킴치이, 류코노스톡 락티스, 류코노스톡 메센테로이데스 서브에스피. 크레모리스, 류코노스톡 메센테로이데스 서브에스피. 덱스트라니쿰스, 류코노스톡 메센테로이데스 서브에스피. 메센테로이데스, 류코노스톡 팔마에(palmae), 또는 류코노스톡 슈도메센테로이데스를 포함한다.
바람직하게는, 박테리아는 류코노스톡 에스피. 속의 "안전 추정 인정" (QPS) 상태를 갖는 박테리아이며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 류코노스톡 시트레움, 류코노스톡 락티스, 류코노스톡 메센테로이데스 서브에스피. 크레모리스, 류코노스톡 메센테로이데스 서브에스피. 덱스트라니쿰, 또는 류코노스톡 메센테로이데스 서브에스피. 메센테로이데스를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 박테리아는 페디오코쿠스(Pediococcus) 에스피. 속으로부터 유래되며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 페디오코쿠스 애시딜락티시(acidilactici), 페디오코쿠스 아르겐티니쿠스(argentinicus), 페디오코쿠스 셀리콜라(cellicola), 페디오코쿠스 클라우스세니이(claussenii), 페디오코쿠스 담노수스(damnosus), 페디오코쿠스 덱스트리니쿠스. 페디오코쿠스 에타놀리두란스(ethanolidurans), 페디오코쿠스 할로필루스(halophilus), 페디오코쿠스 이노피나투스(inopinatus), 페디오코쿠스 롤리이(lolii), 페디오코쿠스 파르불루스(parvulus), 페디오코쿠스 펜토사세우스(pentosaceus), 페디오코쿠스 시아멘시스(siamensis), 페디오코쿠스 스틸레시이(stilesii), 또는 페디오코쿠스 우리나에에쿠이(urinaeequi)를 포함한다.
바람직하게는, 박테리아는 페디오코쿠스 에스피. 속의 "안전 추정 인정" (QPS) 상태를 갖는 박테리아이며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 페디오코쿠스 애시딜락티시, 페디오코쿠스 덱스트리니쿠스, 또는 페디오코쿠스 펜토사세우스를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 박테리아는 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 에스피. 속으로부터 유래되며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 프로피오니박테리움 애시디파시엔스(acidifaciens), 프로피오니박테리움 애시디프로피오니시(acidipropionici), 프로피오니박테리움 아크네스(acnes), 프로피오니박테리움 오스트랄리엔스(australiense), 프로피오니박테리움 아비둠(avidum), 프로피오니박테리움 시클로헥사니쿰(cyclohexanicum), 프로피오니박테리움 담노숨(damnosum), 프로피오니박테리움 프레우덴레이치이(freudenreichii), 예를 들어 프로피오니박테리움 프레우덴레이치이 서브에스피. 프레우덴레이치이 또는 프로피오니박테리움 프레우덴레이치이 서브에스피. 쉐르만니이(shermanii), 프로피오니박테리움 그라눌로섬(granulosum), 프로피오니박테리움 인노쿠움(innocuum), 프로피오니박테리움 젠세니이(jensenii), 프로피오니박테리움 림포필룸(lymphophilum), 프로피오니박테리움 마이크로아에로필룸(microaerophilum), 프로피오니박테리움 올리바에(olivae), 프로피오니박테리움 프로피오니쿰(propionicum), 또는 프로피오니박테리움 토에니이(thoenii)를 포함한다.
구현예에 따라, 박테리아는 프로피오니박테리움 아크네스가 아니다.
더 바람직하게는, 박테리아는 "일반적으로 안전한 것으로 인정" (GRAS)되는 것으로써 프로피오니박테리움 에스피. 속으로 분류되는 박테리아이며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만 프로피오니박테리움 애시디프로피오니시, 프로피오니박테리움 프레우덴레이치이 서브에스피. 프레우덴레이치이, 프로피오니박테리움 프레우덴레이치이 서브에스피. 쉐르만니이, 프로피오니박테리움 젠세니이, 또는 프로피오니박테리움 토에니이를 포함한다.
더 바람직하게는, 박테리아는 프로피오니박테리움 프레우덴레이치이, 더 바람직하게는 프로피오니박테리움 프레우덴레이치이 서브에스피. 프레우덴레이치이 또는 프로피오니박테리움 프레우덴레이치이 서브에스피. 쉐르만니이이다.
또 다른 구현예에서, 박테리아는 스트렙토코쿠스 에스피. 속으로부터 유래되며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 스트렙토코쿠스 애시도미니무스(acidominimus), 스트렙토코쿠스 어드자센스(adjacens), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(agalactiae), 스트렙토코쿠스 알락토라이티쿠스(alactolyticus), 스트렙토코쿠스 안기노수스(anginosus), 스트렙토코쿠스 오스트랄리스(australis), 스트렙토코쿠스 보비스(bovis), 스트렙토코쿠스 카발리(caballi), 스트렙토코쿠스 카니스(canis), 스트렙토코쿠스 카프리누스(caprinus), 스트렙토코쿠스 카스토레우스(castoreus), 스트렙토코쿠스 세코룸(cecorum), 스트렙토코쿠스 콘스텔라투스(constellatus), 예를 들어 스트렙토코쿠스 콘스텔라투스 서브에스피. 콘스텔라투스, 스트렙토코쿠스 콘스텔라투스 서브에스피. 파린게스(pharynges), 또는 스트렙토코쿠스 콘스텔라투스 서브에스피. 비보르겐시스(viborgensis), 스트렙토코쿠스 크레모리스, 스트렙토코쿠스 크리세티(criceti), 스트렙토코쿠스 크리스타투스(cristatus), 스트렙토코쿠스 쿠니쿨리, 스트렙토코쿠스 다니엘리아에(danieliae), 스트렙토코쿠스 데펙티부스(defectivus), 스트렙토코쿠스 덴타프리(dentapri), 스트렙토코쿠스 덴티로우셋티(dentirousetti), 스트렙토코쿠스 덴타시니(dentasini), 스트렙토코쿠스 덴티사니(dentisani), 스트렙토코쿠스 데브리에세이(devriesei), 스트렙토코쿠스 디델피스(didelphis), 스트렙토코쿠스 디피실리스(difficilis), 스트렙토코쿠스 다우네이(downei), 스트렙토코쿠스 두란스(durans), 스트렙토코쿠스 디스갈락티아에(dysgalactiae), 예를 들어 스트렙토코쿠스 디스갈락티아에 서브에스피. 디스갈락티아에 또는 스트렙토코쿠스 디스갈락티아에 서브에스피. 에쿠이시밀리스(equisimilis), 스트렙토코쿠스 엔테리쿠스(entericus), 스트렙토코쿠스 에쿠이, 예를 들어 스트렙토코쿠스 에쿠이 서브에스피. 에쿠이, 스트렙토코쿠스 에쿠이 서브에스피. 루미나토룸(ruminatorum), 또는 스트렙토코쿠스 에쿠이 서브에스피. 주에피데미쿠스(zooepidemicus), 스트렙토코쿠스 에쿠이누스(equinus), 스트렙토코쿠스 파에칼리스, 스트렙토코쿠스 파에시움, 스트렙토코쿠스 페루스(ferus), 스트렙토코쿠스 갈리나세우스(gallinaceus), 스트렙토코쿠스 갈리나룸(gallinarum), 스트렙토코쿠스 갈로라이티쿠스(gallolyticus), 예를 들어 스트렙토코쿠스 갈로라이티쿠스 서브에스피. 갈로라이티쿠스, 스트렙토코쿠스 갈로라이티쿠스 서브에스피. 마세도니쿠스(macedonicus), 또는 스트렙토코쿠스 갈로라이티쿠스 서브에스피. 파스테우리아누스(pasteurianus), 스트렙토코쿠스 가르비에아에(garvieae), 스트렙토코쿠스 고르도니이(gordonii), 스트렙토코쿠스 할리초에리(halichoeri), 스트렙토코쿠스 한세니이, 스트렙토코쿠스 헨리이(henryi), 스트렙토코쿠스 홍콩겐시스(hongkongensis), 스트렙토코쿠스 히요인테스티날리스(hyointestinalis), 스트렙토코쿠스 히요바기날리스(hyovaginalis), 스트렙토코쿠스 익탈루리(ictaluri), 스트렙토코쿠스 인판타리우스(infantarius), 예를 들어 스트렙토코쿠스 인판타리우스 서브에스피. 콜라이 또는 스트렙토코쿠스 인판타리우스 서브에스피. 인판타리우스, 스트렙토코쿠스 인판티스, 스트렙토코쿠스 이니아에, 스트렙토코쿠스 인터메디우스(intermedius), 스트렙토코쿠스 인테스티날리스, 스트렙토코쿠스 락타리우스(lactarius), 스트렙토코쿠스 락티스, 예를 들어 스트렙토코쿠스 락티스 서브에스피. 크레모리스, 스트렙토코쿠스 락티스 서브에스피. 디아세틸락티스(diacetilactis), 또는 스트렙토코쿠스 락티스 서브에스피. 락티스, 스트렙토코쿠스 록소돈티살리바리우스(loxodontisalivarius), 스트렙토코쿠스 루테티엔시스(lutetiensis), 스트렙토코쿠스 마카카에(macacae), 스트렙토코쿠스 마세도니쿠스, 스트렙토코쿠스 마리맘말리움(marimammalium), 스트렙토코쿠스 마실리엔시스(massiliensis), 스트렙토코쿠스 메리오니스(merionis), 스트렙토코쿠스 미노르(minor), 스트렙토코쿠스 미티스(mitis), 스트렙토코쿠스 모르빌로룸(morbillorum), 스트렙토코쿠스 모로센시스(moroccensis), 스트렙토코쿠스 무탄스(mutans), 스트렙토코쿠스 올리고페르멘탄스, 스트렙토코쿠스 오랄리스(oralis), 스트렙토코쿠스 오리사시니(orisasini), 스트렙토코쿠스 오리수이스(orisuis), 스트렙토코쿠스 오비스(ovis), 스트렙토코쿠스 파라산구이니스(parasanguinis), 스트렙토코쿠스 파라우베리스(parauberis), 스트렙토코쿠스 파르불루스(parvulus), 스트렙토코쿠스 파스테우리아누스(pasteurianus), 스트렙토코쿠스 페로리스(peroris), 스트렙토코쿠스 포카에(phocae), 예를 들어 스트렙토코쿠스 포카에 서브에스피. 포카에 또는 스트렙토코쿠스 포카에 서브에스피. 살모니스(salmonis), 스트렙토코쿠스 플란타룸(plantarum), 스트렙토코쿠스 플레오모르푸스(pleomorphus), 스트렙토코쿠스 플루라니말리움(pluranimalium), 스트렙토코쿠스 플루렉스토룸(plurextorum), 스트렙토코쿠스 프뉴모니아(pneumonia), 스트렙토코쿠스 포르시(porci), 스트렙토코쿠스 포르시누스(porcinus), 스트렙토코쿠스 포르코룸(porcorum), 스트렙토코쿠스 슈도프뉴모니아에(pseudopneumoniae), 스트렙토코쿠스 슈도포르시누스(pseudoporcinus), 스트렙토코쿠스 피오게네스(pyogenes), 스트렙토코쿠스 라피놀락티스(raffinolactis), 스트렙토코쿠스 라티(ratti), 스트렙토코쿠스 리펜시스(rifensis), 스트렙토코쿠스 루브네리(rubneri), 스트렙토코쿠스 루피카프라에(rupicaprae), 스트렙토코쿠스 사카롤리티쿠스(saccharolyticus), 스트렙토코쿠스 살리바리우스(salivarius), 예를 들어 스트렙토코쿠스 살리바리우스 서브에스피. 살리바리우스 또는 스트렙토코쿠스 살리바리우스 서브에스피. 써모필루스(thermophilus), 스트렙토코쿠스 살리빌록소돈타에(saliviloxodontae), 스트렙토코쿠스 상귀니스(sanguinis), 스트렙토코쿠스 쉴로이(shiloi), 스트렙토코쿠스 시넨시스(sinensis), 스트렙토코쿠스 소브리누스(sobrinus,), 스트렙토코쿠스 수이스(suis), 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코쿠스 토랄텐시스(thoraltensis), 스트렙토코쿠스 티구리누스(tigurinus), 스트렙토코쿠스 트로글로디타에(troglodytae), 스트렙토코쿠스 우베리스(uberis), 스트렙토코쿠스 우리날리스(urinalis), 스트렙토코쿠스 우르소리스(ursoris), 스트렙토코쿠스 베스티불라리스(vestibularis), 또는 스트렙토코쿠스 와이어스(waius)를 포함한다.
바람직하게는, 박테리아는 "일반적으로 안전한 것으로 인정" (GRAS)되는 것으로서 스트렙토코쿠스 에스피. 속으로 분류되며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 스트렙토코쿠스 써모필루스 균주 Th4, 스트렙토코쿠스 갈로라이티쿠스 서브에스피. 마세도니쿠스, 스트렙토코쿠스 살리바리우스 서브에스피. 살리바리우스, 또는 스트렙토코크루스 살리바리우스 서브에스피. 써모필루스를 포함한다.
바람직하게는, 박테리아는 스트렙토코쿠스 에스피. 속의 "안전 추정 인정" (QPS) 상태를 갖는 세균이며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 스트렙토코쿠스 써모필루스를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 박테리아는 내 독소 또는 잠재적으로 다른 독성 물질을 생산하지 않는다. 따라서, 상기 박테리아는 사용하기에 안전하고 적용 후에 대상체에게 해롭지 않다.
바람직하게는, 상기 박테리아는 포자를 생산하지 않는다. 세균 포자는 성주기의 일부가 아니지만 바람직하지 않은 조건에서 생존을 위해 사용되는 내성 구조이다. 상기 재조합 박테리아는 바람직하게는 포자를 생산하지 않기 때문에, 상기 재조합 박테리아는 예를 들어 영양분 없이 또는 영양 요구성 인자가 결핍된 경우 생존할 수 없다.
바람직하게는, 상기 박테리아는 봉입체를 생산하지 않는다. 봉입체는 종종 과잉 발현된 단백질을 함유하고, 봉입체 내의 상기 과잉 발현된 단백질의 응집은 비가역적일 수 있다.
상기 본 발명의 재조합 박테리아를 수득하기 위해 사용되는 박테리아는 바람직하게는 봉입체를 생산하지 않기 때문에, 각각의 핵산 서열을 전사 및 바람직하게는 번역한 후의 상기 적어도 하나의 이종 인자의 양은 봉입체 내에서의 세포내 축적에 의해 감소되지 않는다.
더 바람직하게는, 상기 박테리아는 세포외 프로테인나아제를 또한 생산하지 않는다. 세포외 프로테인나아제는 박테리아로부터 분비되어 단백질과 같은 세포외 구조를 파괴하여 탄소, 질소 또는 황과 같은 영양분을 생성할 수 있다. 세포외 프로테인나아제는 또한 외독소로 작용할 수 있으며 세균 발병기전에서 병독성 인자의 예가 될 수 있다.
세포외 프로테인나아제의 부재로 인하여 대상체에게 적용 후 상기 박테리아의 안전성은 바람직하게는 증가된다. 게다가, 상기 박테리아는 바람직하게는 상기 재조합 박테리아로부터 방출된 후 상기 적어도 하나의 이종 인자를 분해하지 않는다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 재조합 박테리아는 락트산 박테리아, 바람직하게는 락토바실루스 또는 락토코쿠스 종이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 락토코쿠스 종은 락토코쿠스 락티스 서브에스피. 크레모리스이다.
락트산 박테리아는 탄수화물 발효의 주요 대사 최종 산물로서 락트산을 추가로 방출한다. 락트산은 또한 내피 성장 및 증식을 자극하는 것으로도 알려져 있다. 게다가, 락트산은 피부 기능장애의 부위에서 세균 감염의 가능성을 감소시키는 항균 효과를 갖는다.
상술한 박테리아를 형질전환시키는 기술은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 Green and Sambrook(2012): "Molecular cloning: a laboratory manual", fourth edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY, USA).에 기술되어 있다.
형질전환 후, 재조합 박테리아는 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 결합되고 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열로서, 상기 이종 인자는 독립적으로 이종 폴리펩타이드 또는 그의 복합체인 것 및 상기 염화물-유도성 프로모터의 활성을 조절하는 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자, 여기서 상기 이종 폴리펩타이드는 적어도 하나의 진핵 폴리펩타이드, 적어도 하나의 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 포함한다.
더욱 바람직하게는, 재조합 박테리아는 형질전환 후에 본 발명의 재조합 플라스미드의 적어도 하나의 카피를 포함한다.
본 발명의 재조합 박테리아를 수득하기에 적합한 균주는 예를 들어 MoBiTec GmbH(Gottingen, Germany) 또는 NIZO food research BV(Ede, NL)에서 상업적으로 입수 가능하다. 적합한 균주는 예를 들어 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) 균주 NZ1330이며, 이는 바람직하게는 항생제 내성에 기초하지 않는 플라스미드 선택 시스템을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 각각의 이종 인자를 암호화하는 핵산 서열은 암호화된 적어도 하나의 이종 인자의 발현, 분비 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 변형된다.
적합한 변형은 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예를 들어 적어도 하나의 핵산 서열의 코돈 사용을 사용된 박테리아에 적응시키는 것을 포함한다.
예를 들어, 적어도 하나의 핵산 서열은 사용된 박테리아의 코돈 사용 패턴에 맞도록 설계될 수 있다. 게다가, 일반적인 코돈 최적화에 더하여, 각각의 박테리아의 고도로 발현된 리보솜 단백질 유전자에 대한 코돈 표와 같은 특정 코돈 표를 사용하여 암호화된 적어도 하나의 이종 인자의 번역을 추가로 증가시킬 수 있다.
적합한 변형은 또한 예를 들어 분비 신호 서열 및 이종 인자를 포함하는 융합 단백질을 생성하는 이종 인자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 5'-말단에서 분비 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열의 혼입을 포함한다. 분비 신호 서열은 바람직하게는 각 이종 인자의 N-말단 측에 배열된다.
분비 신호 서열은 바람직하게는 새롭게 합성된 단백질을 원형질 막으로 향하게 한다. 분비 신호 서열, 바람직하게는 신호 펩타이드 또는 프로펩타이드의 말단에는 바람직하게는, 유리 분비 신호 서열, 바람직하게는 신호 펩타이드를 생성하기 위해 신호 펩티다아제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산의 스트레치, 및 세포외로 분비되는 성숙한 이종 인자가 있다.
적합한 분비 신호 서열은 예를 들어 신호 펩타이드를 포함한다.
바람직하게는, 분비 신호 서열은 바람직하게는 각각의 인자의 전구체인 핵산 서열에 의해 암호화되는 각각의 이종 인자의 천연 신호 펩타이드다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 분비 신호 서열은 상기 재조합 박테리아로부터의 상동성 분비 서열이고, 바람직하게는 상기 분비 신호 서열은 락토코쿠스 에스피.(Lactococcus sp.)의 미지의 분비 단백질 45(Usp 45) 신호 서열이다. Usp45 분비 신호는 매우 높은 분비 효율을 갖는다. 다른 분비 신호는 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예를 들어 락토코쿠스 에스피.의 PrtP, SlpA, SP310, SPEXP4 및 AL9를 포함한다.
락토코쿠스 락티스 서브에스피. 크레모리스 MG1363의 Usp45 단백질의 아미노산 서열은 예를 들어 GenBank 수탁 번호 CAL99070.1로 입수 가능하다. 신호 서열은 GenBank 수탁 번호 CAL99070.1로 기탁된 서열의 아미노산 1 내지 27에 걸쳐 있다.
예를 들어, 이종 인자의 천연 신호 펩타이드는 상기 적어도 하나의 이종 인자를 발현하는 데 사용되는 재조합 박테리아로부터의 동종 분비 신호 서열에 의해 대체될 수 있다.
분비 신호 서열은 바람직하게는 각각의 이종 인자의 분비 효율을 향상시킨다. 예를 들어, 락토코쿠스 락티스에서 대부분의 단백질은 Sec-pathway를 통해 분비된다. 단백질은 N-말단 신호 펩타이드를 갖는 단백질의 성숙한 부분을 함유하는 전구체로서 합성된다. 신호 펩타이드는 단백질을 세포질막으로 표적화하여 단백질의 분비를 촉진한다. 신호 펩타이드의 절단 후, 성숙한 단백질은 세포외로 방출된다.
더욱 바람직하게는, 분비 신호는 도 3에 또한 도시된 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 이종 인자, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 이종 인자는 분비 증진 인자가 있거나 없는 프로펩타이드로서 발현된다. 프로펩타이드는 프로테아제에 의해 절단되어 적어도 하나의 이종 인자, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 이종 인자의 성숙한 형태를 방출할 수 있다.
바람직하게는, 적어도 하나의 이종 인자, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 이종 인자는 상기 재조합 박테리아로부터 방출될 수 있다.
예를 들어, 락트산 박테리아와 같은 그람 양성 박테리아에서, 박테리아로부터 분비되는 단백질은 바람직하게는 N-말단 신호 펩타이드 및 단백질의 성숙 부분을 함유하는 전구체로서 합성된다. 전구체는 박테리아의 분비기구에 의해 인식되고 세포질 막을 통해 전위 된다. 그 후, 신호 펩타이드는 절단 및 분해되고, 성숙한 단백질은 예를 들어, 배양 상청액 또는 염증성 피부 기능 장애 영역으로 박테리아로부터 분비된다.
예를 들어, 락토코쿠스 락티스는 예를 들어 10 kDa보다 작은 저 분자 질량, 내지 예를 들어 160 kDa 초과 분자량의 고 분자 질량 범위의 단백질을 Sec-의존 경로를 통해 분비할 수 있다.
대안적으로, 적어도 하나의 이종 인자, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 이종 인자는 누출 세포질 막을 통해 상기 재조합 박테리아로부터 방출된다.
예를 들어, 상기 재조합 박테리아의 세포질 막은 세포벽 성분의 손상된 합성으로 인해 누출된다.
바람직하게는, 상기 재조합 박테리아는 불활성화된 알라닌 라세마아제(alaR) 유전자를 포함한다. D-알라닌의 부재 시, 상기 재조합 박테리아는 세포질 막의 완전성을 유지할 수 없고, 후속적으로 상기 적어도 하나의 이종 인자, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 이종 인자가 상기 재조합 박테리아로부터 방출된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 박테리아는 상기 박테리아의 생존력에 필요한 필수 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 불활성화된 유전자를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 재조합 박테리아의 생존력에 필요한 필수 단백질은 상기 재조합 박테리아의 생존력에 필요한 유기 화합물의 합성에 필요한 단백질, 더 바람직하게는 효소이다.
상기 필수 단백질, 바람직하게는 효소의 불활성화 후, 각각의 유기 화합물은 재조합 박테리아의 생존력에 필요한 영양 요구성 인자이며, 재조합 박테리아의 생존력을 유지하기 위해 보충 되어야하는 것이다.
바람직하게는, 상기 영양 요구성 인자는 비타민, 아미노산, 핵산, 및/또는 지방산이다.
예를 들어, 아미노산 및 뉴클레오티드는 각각 단백질 및 핵산의 전구체인 생물학적으로 중요한 유기 화합물이다.
바람직하게는, 상기 박테리아의 생존력에 필요한 필수 단백질을 암호화하는 상기 유전자는 본 발명에 따른 재조합 핵산 및/또는 재조합 플라스미드 상에 제공된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 재조합 박테리아의 생존력에 필요한 하나 이상의 유전자는 알라닌 라세마아제(alaR), 티미딜레이트 신타아제(thyA), 아스파라긴 신타아제(asnH), CTP 신타아제(pyrG), 트립토판 신타아제(trbBA), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
예를 들어, 알라닌 라세마아제는 L-알라닌의 L- 및 D-알라닌으로의 라세미화를 촉매촉진하는 효소이다. 알라닌 라세마아제에 의해 생산된 D-알라닌은 펩티도글리칸 합성에 사용된다. 펩티도글리칸은 모든 박테리아의 세포벽에서 발견된다.
박테리아에서 알라닌 라세마아제 (alaR) 유전자를 불활성화시키는 것은 세포 벽 완전성을 유지하기 위해 D-알라닌의 외부원을 사용하는 박테리아의 필요성을 초래한다는 것은 통상의 기술자에게 알려져 있다.
예를 들어, 락토코쿠스 락티스 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이 단일 alr 유전자를 함유한다는 것은 통상의 기술자에게 알려져 있다. 유전자의 불활성화는 D-알라닌이 세포벽으로 통합되는 효과를 발휘한다.
예를 들어, 불활성화된 알라닌 라세마아제 (alaR) 유전자가 있는 락토코쿠스 락티스 박테리아는 펩티도글리칸을 합성하고 리포테이코산(LTA)에 D-알라닌을 혼입시킬수 있는 D-알라닌의 외부 공급에 의존한다. 이들 박테리아는 D-알라닌이 제거될 때, 예를 들어 중간 기하급수적으로 성장할 때 신속하게 용해된다.
알라닌 라세마아제가 결핍된 락트산 박테리아의 균주는 예를 들어 당해 분야에 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다.
티미딜레이트 신타아제는 데옥시우리딘 모노포스페이트(dUMP)의 데옥시티미딜레이트 모노포스페이트 (dTMP)로의 전환을 촉매촉진하는 효소이다. dTPM은 티민(dTMP, dTDP 및 dTTP)을 형성하는 3종의 뉴클레오티드 중 하나이다. 티미딘은 DNA 중의 핵산이다.
티미딜레이트 신타아제가 DNA 생합성의 초기 단계에서 중요한 역할을 한다는 것은 통상의 기술자에게 알려져 있다. 게다가, 박테리아의 증식을 위해 DNA를 합성할 필요가 있다.
박테리아에서 티미딜레이트 신타아제(thyA) 유전자의 불활성화는 DNA 완전성을 유지하기 위해 박테리아가 외부의 티미딘 원을 사용할 필요성을 초래한다.
아스파라긴 신테타아제는 아스파르테이트로부터 아미노산 아스파라긴을 생성하는 효소이다. 아스파라긴 신테타아제(asnH) 유전자의 불활성화는 영양 요구성 인자가 되는 각각의 아미노산을 합성할 수 없게 한다.
CTP-신타아제는 피리미딘 합성에 포함된 효소이다. CTP 신타아제는 우리딘-5'-트리포스페이트(UTP)와 시티딘-5'-트리포스페이트(CTP)를 상호전환한다. CTP-신타아제(pyrG) 유전자의 불활성화는 세균이 드 노보(de novo) 합성 뿐만 아니라 우리딘 세포벽 경로로부터 시토신 뉴클레오티드를 합성할 수 없게 만든다.
CTP는 영양 요구성 인자가 되며, RNA 및 DNA의 합성을 위해 보충되어야 한다.
트립토판 신타아제는 아미노산 트립토판의 생합성에서 최종 두 단계를 촉매촉진하는 효소이다.
트립토판 신타아제(trpBA) 유전자의 불활성화는 박테리아가 영양 요구성 인자가 되는 각각의 아미노산을 합성할 수 없게 한다.
박테리아의 생존력에 필요한 상기 유전자의 불활성화 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 유전자의 결실, 유전자의 돌연변이, 상기 유전자의 RNA 간섭(RNAi) 매개된 유전자 침묵, 상기 유전자의 번역 억제, 또는 이의 조합을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 각각의 영양 요구성 인자는 상기 재조합 박테리아와 함께 제공된다.
본 발명의 추가의 바람직한 구현예에서, 재조합 박테리아의 생존력을 위해 필요한 상기 불활성화된 유전자는 환경 봉쇄(environmental containment)를 위해 사용된다.
상기 박테리아의 생존력에 필요한 적어도 하나의 불활성화된 유전자를 포함하는 재조합 박테리아의 적용 후, 각각의 영양 요구성 인자는 예를 들어, 재구성 배지, 적용 배지 또는 성장 배지와 함께 외부적으로 제공되어야 한다.
재조합 박테리아가 환경으로 방출되는 경우, 영양 요구성 인자는 결손되고, 바람직하게는 재조합 박테리아가 사멸한다.
게다가, 외부적으로 보충된 영양 요구성 인자의 적용은 각각의 이종 인자의 생합성 및 방출의 조절을 가능하게 한다.
추가로 바람직하게는, 상기 박테리아의 생존력에 필요한 필수 단백질을 암호화하는 상기 유전자는 알라닌 라세마아제(alaR), 티미딜레이트 신타아제(thyA), 아스파라긴 신타아제(asnH), CTP 신타아제(pyrG), 트립토판 신타아제(trbBA), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 바람직하게는 선택되고, 본 발명에 따른 재조합 핵산 및/또는 재조합 플라스미드에 제공된다.
이에 의해, 본 발명에 따른 재조합 핵산 및/또는 재조합 플라스미드를 유지하기 위한 선별 압력을 달성할 수 있으므로, 생체 내 성장 중에도 재조합 박테리아에서 본 발명에 따른 재조합 핵산 및/또는 재조합 플라스미드를 유지하기 위한 매우 안정적인 시스템, 바람직하게는 외부에서 보충된 영양 요구성 인자의 부재 하에 제공될 수 있다.
바람직하게는 알라닌 라세마아제(alaR), 티미딜레이트 신타아제(thyA), 아스파라긴 신타아제(asnH), CTP 신타아제(pyrG), 트립토판 신타아제(trbBA), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 본 발명에 따른 재조합 핵산 및/또는 재조합 플라스미드 상의 상기 박테리아의 생존력에 필요한 필수 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 발현은 영양요구성 상보성을 허용할 뿐만 아니라 각각의 박테리아에서 본 발명에 따른 재조합 핵산 및/또는 재조합 플라스미드의 존재를 위한 검출 마커로서 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 재조합 박테리아는 의약에 사용되며, 더욱 바람직하게는 만성 염증성 상처 또는 퇴행성 상태의 처치에 사용되거나 종양, 바람직하게는 악성 종양의 처치에 사용된다.
본 발명의 재조합 박테리아를 대상체에게 투여하는 동안, 방출된 적어도 하나의 이종 인자, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 이종 인자는 예를 들어 프로테이나제 절단에 의해 분해될 수 있으며, 이는 상기 이종 인자의 생물학적 활성의 손실을 초래할 수 있다.
상기 이종 인자의 분해 또는 고갈은 염화물 이온의 존재 하에서 본 발명의 상기 재조합 박테리아로부터 적어도 하나의 이종 인자, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 이종 인자의 지속 방출에 의해 보상될 수 있다.
바람직하게는, 상기 재조합 박테리아는 적어도 하나의 이종 인자, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 이종 인자를 일정한 방식으로 발현한다. 바람직하게는, 상기 재조합 박테리아는 상기 이종 인자를 지속적으로 방출한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 재조합 박테리아 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 박테리아는 의약에 사용하기 위한, 더욱 바람직하게는 만성 염증성 상처 또는 퇴행성 상태의 처치에 사용하거나 종양, 바람직하게는 악성 종양의 처치에 사용하기 위한 약제학 조성물로 제공된다.
부형제는 약물의 활성 성분과 함께 제형화된 물질이며, 장기간 안정화의 목적을 위해 포함되며, 소량의 강력한 활성 성분을 함유하는 고체 제형을 벌크업하며(따라서 종종 "팽창제", "충전제" 또는 "희석제"라고도 함), 또는 약물 흡수 촉진, 점도 감소 또는 용해도 향상과 같이 최종 투여 형태의 활성 성분에 치료적 향상을 부여하기 위해 포함된다.
용어 "부형제"는 바람직하게는 또한 적어도 하나의 희석제를 포함한다.
부형제는 또한 예상되는 품질 수명에 대한 변성 또는 응집 방지와 같은 시험관내 안정성을 돕는 것에 추가로 분말 유동성 또는 붙지 않는 특성을 촉진함으로써 관련 활성 물질의 취급을 돕기 위해 및/또는 동결 및 해동 동안 재조합 박테리아의 박테리아 세포의 생존력에 기여하기 위해 제조 공정에서 유용할 수 있다.
바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하며, 이는 더욱 바람직하게는 의도된 투여 경로에 적합하다.
바람직하게는, 상기 약제학적으로 허용되는 부형제는 통상의 기술자에게 알려져 있으며 바람직하게는 다당류, 폴리에스테르, 폴리메타크릴아미드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중합체 담체를 포함한다. 예를 들어, 상기 약제학적으로 허용되는 부형제는 예를 들어 상처 치유를 촉진하기 위한 최적의 수분 환경을 추가로 제공하는 하이드로겔이다. 또한, 약제학적으로 허용되는 부형제는 적용 후, 바람직하게는 만성 염증성 상처 또는 퇴행성 상태, 또는 종양, 바람직하게는 악성 종양의 부위에 상기 재조합 박테리아의 부착을 보조한다.
바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 바람직하게는 탄수화물, 비타민, 미네랄, 아미노산, 미량 원소 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 재조합 박테리아를 위한 적어도 하나의 영양소를 추가로 포함한다.
더욱 바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 본 발명의 적어도 하나, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 이종 인자 및/또는 재조합 박테리아를 안정화시키기 위한 적어도 하나의 성분을 추가로 포함한다. 상기 안정화 화합물은 바람직하게는 금속 양이온, 바람직하게는 Mg2+, Ca2+ 및 이들의 혼합물과 같은 2가 금속 양이온, 항미생물제, 동결보호제, 프로테아제 억제제, 환원제, 금속 킬레이터 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 박테리아는 의약의 용도, 더욱 바람직하게는 만성 염증성 상처 또는 퇴행성 상태의 처치, 또는 종양, 바람직하게는 악성 종양의 처치를 위한 본 발명에 따른 키트의 형태로 제공되고, 여기서 상기 재조합 박테리아는 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터의 제어 하에 적어도 하나의 이종 인자를 발현할 수 있고, 여기서 키트는 염화물 이온을 포함하는 적어도 하나의 유도제를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 키트는 의약에서 개별, 순차적 또는 동시 사용, 더욱 바람직하게는, 바람직하게는 만성인 염증성 상처 또는 퇴행성 상태의 처치, 또는 종양, 바람직하게는 악성 종양의 치료에 사용하기 위한 조합 제제로 제공된다.
바람직하게는, 염화물 이온을 포함하는 유도제는 액체, 바람직하게는 염화물 이온을 포함하는 배양 배지의 형태로 제공되며, 더욱 바람직하게는 전술한 약제학적으로 허용되는 부형제 중 하나 이상과 함께 제공된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 박테리아는 의약에 사용하기 위한, 더욱 바람직하게는 만성 염증 상처 또는 퇴행성 상태의 처치, 또는 종양, 바람직하게는 악성 종양의 처치에 사용하기 위한 본 발명의 의료 장치의 형태로 제공되고, 여기서 상기 재조합 박테리아는 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터의 제어 하에 적어도 하나의 이종 인자를 발현할 수 있다.
적합한 의료 장치는 바람직하게는 상기 재조합 박테리아, 예를 들어 세포 캡슐화 시스템 및/또는 마이크로비드를 제공하기 위한 적어도 하나의 지지체 및/또는 용기를 추가로 포함한다.
적합한 의료 장치는 바람직하게는 스텐트, 임플란트, 흡입기, 캡슐화 시스템 또는 의료용 드레싱이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 및/또는 키트 및/또는 의료 장치는 용해되거나, 동결되거나 또는 건조된, 바람직하게는 동결 건조 또는 분무 건조된 상기 재조합 박테리아를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 재조합 박테리아는 대상체에게 재조합 박테리아 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 키트를 투여하기 전에 염화물 이온을 포함하는 액체, 바람직하게는 배양 배지에서 재구성된다.
본 발명의 재조합 박테리아는 바람직하게는 적어도 하나, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 이종 인자의 발현을 유도하기 위해 상기 적어도 하나의 유도제와 접촉될 수 있다.
또한, 바람직하게는, 발현 유도 후, 적어도 하나, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 이종 인자가 상기 박테리아로부터 방출된다.
바람직하게는, 상기 적어도 하나, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 이종 인자는 분비 신호 서열, 바람직하게는 N-말단 신호 펩타이드로 발현된다. 각각의 인자의 발현 후, 분비 신호 서열, 바람직하게는 N-말단 신호 펩타이드가 제거될 수 있다. 대안적으로, 상기 제1, 제2 및/또는 제3 이종 인자는 바람직하게는 분비 신호 서열, 바람직하게는 N-말단 신호 펩타이드 없이 성숙한 형태로 발현될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 박테리아를 재구성하기 위해 사용되는 염화물 이온을 포함하는 재구성 배지는 용액 또는 분산액, 예를 들어 에멀젼, 현탁액, 겔, 바람직하게는 하이드로겔 또는 콜로이드 용액의 형태일 수 있다.
바람직하게는 재구성 배지는 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터의 제어 하에 적어도 하나의 이종 인자의 발현을 개시하기에 충분한 양의 염화물 이온을 포함한다.
겔, 바람직하게는 하이드로겔을 수득하기 위한 적합한 중합체는 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 천연 및/또는 합성 중합체를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 대상체에서 질병, 예컨대 바람직하게는 만성 염증성 상처 또는 퇴행성 상태, 또는 종양, 바람직하게는 악성 종양을 처치 및/또는 경감시키기 위한 유효량으로 제공된다.
바람직하게는 본 발명에 따른 약제학적 조성물 및/또는 키트 및/또는 의료 장치는 본 발명의 유효량의 재조합 박테리아를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 박테리아 및/또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물 및/또는 키트 및/또는 의료 장치는 염증성 상처, 바람직하게는 만성 염증성 상처의 처치에 사용된다.
바람직한 구현예에서, 상기 염증성, 바람직하게는 만성 염증성 상처는 바람직하게는 동상, 피부염, 궤양 및 이들의 조합을 포함하고, 더욱 바람직하게는 궤양을 포함한다.
상기 염증성 상처는 또한 만성 염증 상태로 진행될 수 있는 염증성 피부 외상을 포함할 수 있다.
동상은 동결로 인해 피부 및 기타 조직에 국소적인 손상이 야기되고 조직 파괴를 포함할 수 있는 의학적 상태이다. 상기 동상은 또한 추위와 습함에 노출된 것으로부터 초래된 피부의 표면 궤양인 동창(perniones)이 될 수 있다. 피부의 모세 혈관계 손상은 발적, 가려움, 염증 및 때때로 수포를 유발한다. 더 바람직하게는 상기 동상은 동창이다.
만성 염증성 상처는 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예를 들어 만성 정맥 궤양, 만성 동맥 궤양, 만성 당뇨병성 궤양 및 만성 압력 궤양을 포함한다. 바람직하게는 상기 만성 상처는 만성 정맥 궤양, 만성 동맥 궤양, 만성 압력 궤양 및 이들의 만성 전궤양 단계, 바람직하게는 만성 정맥 궤양, 만성 동맥 궤양 및 만성 압력 궤양 중 적어도 하나를 포함한다.
만성 상처는 다양한 형태와 유병률로 발생한다. 만성 상처는 급성 상처와 비교하여 일정한 단계와 예측 가능한 시간 내에 치유되지 않는다. 1-3개월 이내에 치유되지 않거나 초기 처치에 반응하지 않는 상처는 일반적으로 만성으로 분류된다. 급성 상처에서는 분자의 생산과 분해 사이의 정확한 균형과 미세 환경에서 면역 세포의 활성화 수준이 균형을 이루어 잘 제어되고 단계적인 치유 과정이 이루어진다. 만성 상처에서는 이 균형이 상실되어 국부 면역 체계의 저하 및 비정상적인 활성화가 발생한다. 일반적으로 만성 상처는 상처 치유 과정의 하나 이상의 단계, 예를 들어 염증 단계에 남아 있다. 이러한 유형의 상처를 만성 염증성 상처라고 한다.
만성 상처는 일반적으로 종양, 당뇨병(DFU 발생), 순환 불량(VLU 발생), 수술 및 화상과 같은 다양한 기저 질환 및 의학적 상태의 결과이다. 허혈(즉, 사지의 산소 부족), 박테리아 감염 및 집락화, 단백질 분해 효소의 증가 및 염증은 치유되지 않는 상처의 일반적인 근본적인 병태생리학적 원인입니다.
상기 궤양은 욕창 궤양 또는 하퇴 궤양일 수 있다. 상기 궤양은 또한 정맥 궤양, 동맥 궤양, 당뇨병성 궤양 또는 압력 궤양일 수 있다. 상기 궤양은 또한 개방된 피부 상처의 가시적 징후 없이 상기 언급된 궤양의 전궤양 단계일 수 있다. 의학적 개입이 없으면 궤양 전 단계가 궤양으로 진행될 수 있다.
만성 정맥 궤양은 일반적으로 다리에 발생할 수 있으며 만성 상처의 약 70~90%를 차지하며 주로 노인 환자에게 영향을 미친다.
만성 염증성 상처의 또 다른 주요 원인은 당뇨병이다. 당뇨병으로 고통받는 환자는 만성 궤양으로 인해 일반 인구보다 절단 위험이 15% 더 높다. 당뇨병은 통각과 통증의 인식을 억제하는 신경병증을 유발한다. 따라서 환자는 다리와 발의 작은 상처를 알아차리지 못하여 감염이나 반복적인 부상을 예방하지 못할 수 있다.
또 다른 문제는 당뇨병이 면역 손상을 일으키고 작은 혈관에 손상을 주어 조직의 산소 공급을 감소시킨다는 것이다. 조직의 적절한 산소 공급을 방지하면 만성 염증성 상처의 유병률이 크게 증가합니다.
욕창 또는 와창(bed sore)으로도 알려진 압력 궤양은 당뇨가 있거나 없는 상태에서 발생할 수 있다. 압력 궤양은 압력, 또는 전단 또는 마찰과 조합한 압력의 결과로서 뼈 융기 위에서 발생할 수 있는 피부 및/또는 하방 조직에의 국소화된 손상이다.
현재, 하지 궤양형성과 같은 당뇨병 상처를 포함한 만성 상처의 표준 치료 관리는 주로 감염을 조절하고 혈관 재생을 촉진시키는 것에 중점을 두고 있다. 이러한 전략에도 불구하고, 절단율은 하지 궤양형성을 앓고 있는 환자에서 용납할 수 없을 정도로 높다.
게다가, 진성 당뇨병(diabetes mellitus) 또는 만성 정맥 기능 부전과 같은 궤양형성의 근본적인 질환 상태 또는 원인이 예를 들어 혈당치를 조절하거나 또는 혈압 약제를 투여함에 의해 각기 개선 및/또는 처치되는 경우, 기존의 궤양은 여전히 치유하는 데 매우 오랜 시간이 걸릴 수 있다.
따라서 하지 궤양형성과 같은 당뇨병 상처를 포함하는 만성 상처의 확정적인 비침습 치료의 부족한 점을 극복하기 위하여, 만성 상처를 앓고 있는 환자의 상처 치유를 재활성화하고 촉진시키는 새로운 전략이 시급히 필요하다.
바람직하게는, 염증성 상처, 바람직하게는 만성 염증성 상처의 경우, 바람직하게는 상기 박테리아로부터 방출된 인자의 독특한 조합이 후속하여 상처 봉합을 진행하는 급성 상처로의 상기 만성 상처의 재프로그램 화를 허용한다.
바람직한 구현예에서, 염증성 상처, 바람직하게는 만성 염증성 상처의 경우, 재조합 박테리아는 전신, 국소 및/또는 피하 주사, 더 바람직하게는 국소로 투여된다.
재조합 박테리아는 바람직하게는 처치될 염증성, 바람직하게는 만성 염증성 상처에 국소적으로 투여되어야 한다.
재조합 박테리아는 염증성, 바람직하게 만성 염증성 상처에 국소로 투여되며 및/또는 상처 부근, 바람직하게는 염증성, 바람직하게는 만성 염증성 상처의 가장자리 또는 공동 내로 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 재조합 박테리아를 궤양형성 전단계의 부위에 및/또는 부위 안에 국소 적용 또는 피하 주사함에 의해 궤양형성 전단계가 열린 상처로 진행하는 것을 방지할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 종양, 바람직하게는 악성 종양의 경우, 재조합 박테리아는 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주사에 의해, 또는 국소적으로, 바람직하게는 종양내 주사 및/또는 복강내 주사에 의해 투여된다.
재조합 박테리아는 바람직하게는 종양 내로의 종양내 주사 및/또는 종양 부근으로의 주사 및/또는 본 발명의 재조합 박테리아의 복강내 주사에 의해 종양, 바람직하게는 악성 종양에 투여된다.
바람직한 구현예에서, 청구항 1에 따른 상기 재조합 박테리아는 제1 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 제2 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 및 제3 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고, 단 상기 제1 인자, 상기 제2 인자 및 상기 제3 인자는 기능적으로 서로 상이하며, 여기서, 상기 제1 인자는 성장 인자이고, 상기 제2 인자는 M2-분극 인자로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 제3 인자는 M2-분극 인자 및 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 상기 제2 이종 인자 및 상기 제3 이종 인자는 M2-분극 인자로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 제2 인자 및 상기 제3 인자는 기능적으로 상이한 M2-분극 인자이다.
즉, 상기 제2 이종 인자는 제1 M2-분극 인자이고 상기 제3 이종 인자는 상기 제1 M2-분극 인자와 기능적으로 상이한 제2 M2-분극 인자이다.
바람직하게는, 상기 제1 M2-분극 인자는 집락 자극 인자-1(CSF-1), 인터루킨 34(IL-34), 인터루킨 4(IL-4), 및 인터루킨 13(IL-13)으로 이루어진 군으로부터 선택된 M2-분극 인자이고, 상기 제2 M2-분극 인자는 집락 자극 인자-1(CSF-1), 인터루킨 34(IL-34), 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 10(IL-10), 및 인터루킨 13(IL-13)로 이루어진 군에서 선택되는 M2-분극 인자이며, 단 상기 제2 M2-분극 인자는 상기 제1 M2-분극 인자와 기능적으로 상이하다.
더욱 바람직하게는, 상기 제1 M2-분극 인자는 집락 자극 인자-1 수용체(CSF1R) 리간드이고, 상기 제2 M2-분극 인자는 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 10(IL-10), 인터루킨 13(IL-13), 이들의 기능적 유사체, 이들의 바이오시밀러 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 M2-분극 인자이다.
M2-분극 인자의 더 바람직한 조합은 다음과 같다:
* 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-4,
* 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-13,
* 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-10,
* 인터루킨-34 및 인터루킨-4,
* 인터루킨-34 및 인터루킨-13,
* 인터루킨-34 및 인터루킨-10,
* 인터루킨-4 및 인터루킨-10, 또는
* 인터루킨-13 및 인터루킨-10.
M2-분극 인자의 상기 언급된 추가의 바람직한 조합은 상기 언급된 성장 인자 중 적어도 하나, 바람직하게는 섬유아세포 성장 인자 1, 섬유아세포 성장 인자 2, 섬유아세포 성장 인자 7, 섬유아세포 성장인자 10, 간세포 성장인자, 형질전환 성장인자 베타(TGF-베타), 표피 성장인자(EGF), 헤파린 결합 EGF 유사 성장인자(HB-EGF), 형질전환 성장인자-α(TGF-α) 및 혈소판 유래 성장 인자 BB로 이루어진 군으로부터 선택된 성장 인자와 함께 조합된다.
바람직하게는, 상기 제1, 제2 및 제3 이종 인자는 다음 조합이다.
* 섬유아세포 성장 인자 2, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-4,
* 섬유아세포 성장 인자 2, 인터루킨-34 및 인터루킨-4,
* 섬유아세포 성장 인자 2, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-13,
* 섬유아세포 성장 인자 2, 인터루킨-34 및 인터루킨-13,
* 섬유아세포 성장 인자 2, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-10,
* 섬유아세포 성장 인자 2, 인터루킨-34 및 인터루킨-10,
* 섬유아세포 성장 인자 7, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-4,
* 섬유아세포 성장 인자 7, 인터루킨-34 및 인터루킨-4,
* 섬유아세포 성장 인자 7, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-13,
* 섬유아세포 성장 인자 7, 인터루킨-34 및 인터루킨-13,
* 섬유아세포 성장 인자 7, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-10,
* 섬유아세포 성장 인자 7, 인터루킨-34 및 인터루킨-10,
* 형질전환 성장 인자 베타, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-4,
* 형질전환 성장 인자 베타, 인터루킨-34 및 인터루킨-4,
* 형질전환 성장 인자 베타, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-13,
* 형질전환 성장 인자 베타, 인터루킨-34 및 인터루킨-13
* 형질전환 성장 인자 베타, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-10,
* 형질전환 성장 인자 베타, 인터루킨-34 및 인터루킨-10,
* 형질전환 성장 인자 알파, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-4,
* 형질전환 성장 인자 알파, 인터루킨-34 및 인터루킨-4,
* 형질전환 성장 인자 알파, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-13,
* 형질전환 성장 인자 알파, 인터루킨-34 및 인터루킨-13
* 형질전환 성장 인자 알파, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-10,
* 형질전환 성장 인자 알파, 인터루킨-34 및 인터루킨 10
* 혈소판 유래 성장 인자 BB, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-4,
* 혈소판 유래 성장 인자 BB, 인터루킨-34 및 인터루킨-4,
* 혈소판 유래 성장 인자 BB, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-13,
* 혈소판 유래 성장 인자 BB, 인터루킨-34 및 인터루킨-13
* 혈소판 유래 성장 인자 BB, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-10, 또는
* 혈소판 유래 성장 인자 BB, 인터루킨-34 및 인터루킨-10.
더욱 바람직하게는, 상기 제1, 제2 및 제3 이종 인자는 섬유아세포 성장 인자 2, 집락 자극 인자-1 및 인터루킨-4, 이들의 기능적 유사체, 및 이들의 바이오시밀러의 조합이다.
바람직하게는, 본 발명의 프로바이오틱 세균으로부터의 2종 이상의 M2-분극 인자의 방출에 의해, 분극되지 않은 대식세포, M1-분극된 대식세포뿐만 아니라 미분화된 단핵구, 및 다른 대식세포 선조 세포의 M2 분극이 더욱 촉진된다.
대안적 구현예에서, 상기 제1 인자는 상기 언급된 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 성장 인자이고, 상기 제3 인자는 상기 언급된 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 성장 인자이며, 상기 제1 성장 인자와 기능적으로 상이하다. 바람직하게는, 상기 제2 성장 인자는 형질전환 성장 인자 베타(TGF-베타)이다.
성장 인자의 추가 바람직한 조합은 다음과 같다.
* 섬유아세포 성장 인자 1 및 형질전환 성장 인자 베타,
* 섬유아세포 성장 인자 2 및 형질전환 성장 인자 베타,
* 섬유아세포 성장 인자 7 및 형질전환 성장 인자 베타,
* 섬유아세포 성장 인자 10 및 형질전환 성장 인자 베타,
* 혈소판 유래 성장 인자 BB 및 형질전환 성장 인자 베타,
* 형질전환 성장 인자 알파 및 형질전환 성장 인자 베타,
* 표피 성장 인자 및 형질전환 성장 인자 베타,
* 헤파린 결합 EGF 유사 성장 인자 및 형질전환 성장 인자 베타,
* 간세포 성장 인자 및 형질전환 성장 인자 베타, 또는
* 혈관 내피 성장 인자 A 및 형질전환 성장 인자 베타.
상술한 더 바람직한 성장 인자의 조합은 바람직하게는 집락 자극 인자-1 (CSF-1), 인터루킨 34(IL-34), 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 10(IL-10), 인터루킨 13 (IL-13), 및 이의 혼합물, 바람직하게는 집락 자극 인자-1 (CSF-1), 인터루킨 34(IL-34), 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 13(IL-13), 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 M2-분극 인자와 결합된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 박테리아 및/또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물 및/또는 키트 및/또는 의료 장치는 종양, 바람직하게는 악성 종양, 더욱 바람직하게는 복막암, 더욱 바람직하게는 복막 암종증, 더욱 바람직하게는 전이성 난소암, 결장직장암, 췌장암, 위암, 간세포 암종, 담낭 암종, 신세포 암종, 이행 세포 암종, 자궁내막 자궁경부암 및/또는 유방암, 폐암 및 악성 흑색종과 같은 복부 외 질환의 처치에 사용된다.
종양은 생리적 기능이 없고 통제되지 않는 일반적으로 급속한 세포 증식으로 인해 발생하는 세포/조직의 비정상적 성장이다. 종양은 양성일 수도 있고 악성일 수도 있다. 다른 유형의 종양은 그들을 형성하는 세포 유형에 따라 명명된다. 고형 종양의 예는 육종, 암종 및 림프종이다.
복막암은 두 가지 범주로 나눌 수 있다. 원발성 종양은 복막 내에서 시작되는 원발성 복막암, 및 다른 곳에서 시작되는 임의의 종양의 복강내 파종으로 정의되는 복막 암종증(PC),
복막암종증은 가장 흔한 미만성 복막 질환 중 하나이며 난소암(46%)이 가장 흔한 원인이며, 결장직장암(31%), 췌장암, 위암 및 간세포암, 담낭을 포함한 기타 악성 종양이 그 뒤를 잇는다. 암종, 신세포암종, 이행세포암종, 자궁내막암, 자궁경부암 및 미지의 원발성. 유방암, 폐암 및 악성 흑색종과 같은 복부 외 상태는 혈행성 확산을 통한 복강과 관련될 수 있다(Singh, S. et al. "Peritoneal Carcinomatosis: Pictorial Review of Computer Tomography Findings", International Journal of Advanced Research(2016)), Volume 4, Issue 7, pages 735 to 748; doi:10.21474/IJAR01/936).
재발성 결장직장암(CRC) 환자의 10%-35%와 재발성 위암(GC) 환자의 최대 50%에서 종양 재발은 복강에 국한된다(Coccolini, F. et al., World J Gastroenterol. 2013; 19(41): pages 6979 to 6994, doi: 10.3748/wjg.v19.i41.6979).
복막 전이는 또한 예를 들어 흉막 중피종, 유방 및 폐와 같은 복막 외 암의 원격 전이로 인해 형성될 수 있다. 횡격막 또는 복부 림프관에 종양 세포가 있으면 림프 배수가 막히고 복막액 유출이 감소하여 암종증 및/또는 복수가 형성된다.
면역계는 바람직하게는 암의 병태생리학에서 중요한 역할을 한다. 많은 종양은 다양한 유형의 면역 세포에 심하게 침투되어 있다. 그러나 종양 내에서 이러한 세포의 구성은 다를 수 있다. 세포독성 T 세포 및 T 조절 세포와 같은 적응 면역계의 세포와 대식세포, 수지상 세포 및 자연 살해(NK) 세포와 같은 선천성 면역계의 세포가 모두 질병의 진행에서 핵심 역할을 한다. 이러한 면역 세포는 종양 성장, 침습 및 전이와 관련이 있는 것으로 보인다.
특히, 종양 성장은 대식세포의 모집 및 축적과 병행되어 왔으며, 여기서 이들 세포는 원발성 종양에서 종양 성장 및 암세포의 전파를 지원하는 기능을 획득한다. 또한, 질병 진행에 따른 대식세포의 수 증가 및 불량한 예후 사이의 엄격한 상관 관계를 보여주는 임상 증거가 있다. 대식세포는 다양한 사이토카인(Th1 및 Th2 관련 사이토카인)을 광범위하게 생산할 수 있기 때문에 면역 미세환경의 조정에서 핵심 역할을 한다.
대식세포는 M1(고전적으로 활성화됨) 또는 M2(대체적으로 활성화됨) 표현형으로 나눌 수 있다. M1 대식세포는 전염증성 표현형을 나타내며 IL-1, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ와 같은 전염증성 사이토카인의 발현을 특징으로 한다. 단핵구는 지질다당류(LPS) 및 인터페론 γ(INF-γ)와 같은 박테리아 성분에 의해 M1 유형 대식세포로 분화될 수 있다.
대조적으로, M2 대식세포는 IL-10, TGF-β 및 VEGF와 같은 Th2 반응을 촉진하는 면역억제 표현형 방출 인자를 가지고 있다.
종양 관련 대식세포(TAM's)라고도 하는 종양의 대식세포는 종종 M2 표현형의 전형적인 많은 유전자를 발현한다. 종양 및 기질 세포에 의해 분비되는 화학 유인 물질은 단핵구를 종양 조직으로 모집하고 M2 종양 관련 대식세포로 분화하도록 유도하여 종양 성장 및 전이를 지원한다.
본 발명의 재조합 박테리아를 종양에 투여한 후, 재조합 박테리아는 치료 단백질을 생성하고 종양 환경으로 방출한다.
바람직하게는, 방출된 치료 단백질은 이들 면역 세포를 TH1 면역 반응으로 향상시키고 구동시키며, 그 결과 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 생산이 감소된다.
연구에 따르면 대식세포에서 VEGF와 그 수용체의 발현은 면역 체계와 주변 미세 환경을 조절하는 역할을 한다. 특히 M2 종양 관련 대식세포는 다량의 VEGF를 발현하여 혈관신생 및 면역조절을 지원한다.
VEGF는 또한 수지상 세포의 분화를 억제하는 것으로 설명되었다. 대조적으로, 또한 VEGF는 T 세포 발달을 억제하여 종양 유발 면역 억제에 기여하는 것으로 나타났다.
VEGF 생성의 감소는 바람직하게는 면역억제 및 혈관신생을 방지함으로써 항종양 효과를 추가로 뒷받침한다.
바람직한 구현예에서, 청구항 1에 따른 상기 재조합 박테리아는 바람직하게는 글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 단백질(GITR), 4-1BB로도 알려져 있는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9(TNFRSF9), 분화 클러스터 40(CD40), CD134 또는 OX40 수용체로도 알려져 있는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 구성원 4(TNFRSF4), 및 이들의 조합, 공동 자극 수용체 활성화제, 면역 체크 포인트 억제제, 예를 들어 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4), 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1), 프로그램된 사멸-리간드 1(PD- 1L), 프로그램된 사멸-리간드 2(PD-1L2), 및 이들의 조합, 키메라 항원 수용체, 예컨대 CAR-T, 및 이들의 조합, 전구약물 활성화 효소, 예컨대 HSV-tk, 시티신 데아미나제 및 이들의 조합, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 유인 수용체 리간드, 항체, 가용성 수용체, 유인 수용체, 및 이들의 조합, 바람직하게는 과립구-대식세포-집락-자극 인자(GM-CSF), 인터페론 알파, 바람직하게는 인터페론 알파 2(IFNA2), 인터페론 베타, 인터페론 감마, 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-17(IL-17), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-21(IL-21), 인터루킨-23(IL -23), 인터루킨-24(IL-24), 인터루킨-32(IL-32), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다.
서열
서열번호 1은 발현 플라스미드 pAUC1010의 핵산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 1에 도시되어 있다. 서열번호 2는 실시예에서 사용된 PgadC 프로모터의 핵산 서열에 상응하고 이는 또한 도 2b(도 2ba 및 도 2bb에 나누어 기재)에 도시되어 있다. 서열번호 3은 L. lactis의 Usp45 신호 서열의 아미노산 서열에 해당하며, 이는 또한 도 3에 도시되어 있다. 서열번호 4는 L. lactis의 16S RNA의 3' 말단에 해당하며, 이는 또한 도 4에 도시되어 있다.
서열번호 5는 hFGF-2-155의 성숙한 형태의 아미노산 서열에 해당하며, 이는 또한 도 5a에 도시되어 있다. 서열번호 6은 실시예에서 사용된 hFGF-2-153 변이체의 아미노산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 5b에 도시되어 있다. 서열번호 7은 실시예에서 사용된 재조합 hFGF-2-153 전구체 단백질의 아미노산 서열에 해당하며, 이는 또한 도 5c에 도시되어 있다.
서열번호 8은 hIL-4의 성숙한 형태의 아미노산 서열에 해당하며, 이는 또한 도 6a에 도시되어 있다. 서열번호 9는 실시예에서 사용된 hIL-4 변이체의 아미노산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 6b에 도시되어 있다. 서열번호 10은 실시예에서 사용된 재조합 hIL-4 전구체 단백질의 아미노산 서열에 해당하며, 이는 또한 도 6c에 도시되어 있다.
서열번호 11은 hCSF1의 성숙한 형태의 아미노산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 7a(도 7aa 및 도 7ab에 나누어 기재)에 도시되어 있다. 서열번호 12는 실시예에서 사용된 hCSF1 변이체의 아미노산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 7b에 도시되어 있다. 서열번호 13은 실시예에서 사용된 재조합 hCSF1 전구체 단백질의 아미노산 서열에 해당하며, 이는 또한 도 7c에 도시되어 있다.
서열번호 14는 실시예에서 사용된 합성 CFI 구성체의 핵산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 8b(도 8ba 내지 도 8be에 나누어 기재)에 도시되어 있다. 서열번호 15는 실시예에서 사용된 발현 플라스미드 pC-CFI의 핵산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 9b(도 9ba 내지 도 9bh에 나누어 기재)에 도시되어 있다.
서열번호 16은 mIL-18의 성숙한 형태의 아미노산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 10a에 도시되어 있다. 서열번호 17은 실시예에서 사용된 mIL-18 변이체의 아미노산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 10b에 도시되어 있다. 서열번호 18은 실시예에서 사용된 재조합 mIL-18 전구체 단백질의 아미노산 서열에 해당하며, 이는 또한 도 10c에 도시되어 있다.
서열번호 19는 mGM-CSF의 성숙한 형태의 아미노산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 10a에 도시되어 있다. 서열번호 20은 실시예에서 사용된 mGM-CSF 변이체의 아미노산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 10b에 도시되어 있다. 서열번호 21은 실시예에서 사용된 재조합 mGM-CSF 전구체 단백질의 아미노산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 10c에 도시되어 있다.
서열번호 22는 실시예에서 사용된 합성 mEG 구성체의 핵산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 12b에 도시되어 있다. 서열번호 23은 실시예에서 사용된 발현 플라스미드 pC-mEG의 핵산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 12c(도 12ca 내지 도 12ci에 나누어 기재)에 도시되어 있다.
서열번호 24는 mIL-12 베타의 성숙한 형태의 아미노산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 13a에 도시되어 있다. 서열 번호 25는 mIL-12 알파 동형체 2의 성숙한 형태의 아미노산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 13b에 도시되어 있다. SEQ ID No.26은 실시예에서 사용된 재조합 마우스 인터루킨-12 융합 단백질의 성숙한 형태의 아미노산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 13c에 도시되어 있다. SEQ ID No.27은 실시예에서 사용된 재조합 마우스 인터루킨-12 전구체 단백질의 아미노산 서열에 해당하며, 이는 또한 도 13d에 도시되어 있다.
서열번호 28은 마우스 인터페론 알파-2의 성숙한 형태의 아미노산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 14a에 도시되어 있다. 서열번호 29는 실시예에서 사용된 마우스 인터페론 알파-2 변이체의 아미노산 서열에 상응하고, 이는 또한 도 14b에 나타나 있다. 서열번호 30은 실시예에 사용된 재조합 마우스 인터페론 알파-2 전구체 단백질의 아미노산 서열에 해당하며, 이는 또한 도 14c에 도시되어 있다.
서열번호 31은 실시예에서 사용된 합성 mTEA 구성체의 핵산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 15a(도 15aa 내지 도 15ah에 나누어 기재)에 도시되어 있다. 서열번호 32는 실시예에서 사용된 발현 플라스미드 pC-mTEA의 핵산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 15c에 도시되어 있다.
서열번호 33은 실시예에서 사용된 합성 mGTE 구성체의 핵산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 16a(도 16aa 내지 도 16ah에 나누어 기재)에 도시되어 있다. 서열번호 34는 실시예에서 사용된 발현 플라스미드 pC-mGTE의 핵산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 16c(도 16ca 내지 도 16cl에 나누어 기재)에 도시되어 있다.
서열번호 35는 실시예에서 사용된 합성 mCherry 구성체의 핵산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 17b(도 17ba 내지 도 17bd에 나누어 기재)에 도시되어 있다. 서열번호 36은 실시예에서 사용된 발현 플라스미드 pC-mCherry의 핵산 서열에 상응하며, 이는 또한 도 18b(도 18ba 내지 도 18bh에 나누어 기재)에 도시되어 있다.
다음 도면과 실시예는 설명 목적으로만 제공된다. 본 발명은 하기 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다:
도면:
도면에서는 하기 약어가 사용된다: "alr"은 d-알라닌의 부재 하에 숙주 균주의 성장에 사용되는 알라닌 라세마아제 유전자를 나타내고; "T"는 종결자 서열을 나타내고; "-35" 및 "-10"은 각각 프로모터의 -35 요소 및 -10 요소를 나타내고; "IR"은 역반복을 의미하고; "repC" 및 "repA"는 박테리아 세포에서 플라스미드 복제에 필요한 원핵생물 유전자이고, "gadR"은 gadR 유전자를 나타내고, "RBS"는 표시된 유전자의 리보솜 결합 부위, 예를 들어 ATP 합성효소 서브유닛 감마(atpG) 및/또는 갈락토시드 O-아세틸트랜스퍼라제(lacA) 유전자를 나타내고; "ssUsp45"는 Usp45 분비 신호를 나타낸다.
도 1a는 발현 플라미드 pAUC1010의 플라스미드 지도를 나타낸다. 상응하는 핵산 서열은 도 1b(도 1ba 내지 도 1bf에 나누어 기재)에 도시되어 있다.
도 2a는 조절 요소를 포함하는 염화물-유도성 프로모터 PgadC의 개략도를 나타낸다. 상응하는 핵산 서열은 조절 요소, gadR 유전자 및 리보솜 결합 부위(RBS) 및 gadC 유전자의 개시 코돈을 포함하는 PgadC 프로모터 영역을 포함하며, 도 2b(도 2ba 및 도 2bb에 나누어 기재)에 도시되어 있다.
도 3은 락토코쿠스 단백질 Usp45의 분비 신호의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 4는 L. lactis의 16S rRNA의 3' 말단의 핵산 서열을 나타낸다.
도 5a는 인간 FGF-2-155의 성숙한 형태의 아미노산 서열을 나타낸다. 실시예에서 사용된 hFGF2-153의 변이체의 아미노산 서열은 도 5b에 도시되어 있다. 실시예에 사용된 재조합 hFGF-2-153 전구체 단백질의 아미노산 서열은 도 5c에 나타낸다.
도 6a는 인간 IL-4의 성숙한 형태의 아미노산 서열을 나타낸다. 실시예에서 사용된 hIL-4 변이체의 아미노산 서열은 도 6b에 도시되어 있다. 실시예에서 사용된 재조합 hIL-4 전구체 단백질의 아미노산 서열은 도 6c에 도시되어 있다.
도 7a(도 7aa 및 도 7ab에 나누어 기재)는 인간 CSF-1의 성숙한 형태의 아미노산 서열을 나타낸다. 실시예에서 사용된 hCSF-1 변이체의 아미노산 서열은 도 7b에 도시되어 있다. 실시예에서 사용된 재조합 hCSF-1 전구체 단백질의 아미노산 서열은 도 7c에 도시되어 있다.
도 8a는 실시예에서 사용된 새롭게(de novo) 합성된 CFI 구성체의 개략도를 나타낸다. 새롭게 합성된 CFI 구성체의 해당 핵산 서열은 도 8b(도 8ba 내지 도 8be에 나누어 기재)에 도시되어 있다. pC-CFI로 명명된 발현 플라스미드의 핵산 서열은 도 9b(도 9ba 내지 도 9bh에 나누어 기재)에 도시되어 있다. 발현 플라스미드 pC-CFI의 개략도는 도 9a에 도시되어 있다.
도 10a는 마우스 IL-18의 성숙한 형태의 아미노산 서열을 나타낸다. 실시예에서 사용된 mIL-18 변이체의 아미노산 서열은 도 10b에 도시되어 있다. 실시예에서 사용된 재조합 mIL-18 전구체 단백질의 아미노산 서열은 도 10c에 도시되어 있다.
도 11a는 마우스 GM-CSF의 성숙한 형태의 아미노산 서열을 나타낸다. 실시예에서 사용된 mGM-CSF 변이체의 아미노산 서열은 도 11b에 도시되어 있다. 실시예에 사용된 재조합 mGM-CSF 전구체 단백질의 아미노산 서열은 도 11c에 도시되어 있다.
도 12a(도 12aa 내지 도 12ad에 나누어 기재)는 실시예에서 사용된 합성 mEG 구성체의 핵산 서열을 나타낸다. pC-mEG로 명명된 발현 플라스미드의 핵산 서열은 도 12c(도 12ca 내지 도 12ci에 나누어 기재)에 도시되어 있고, 실시예에서 사용된 상응하는 발현 플라스미드 pC-mEG의 개략도는 도 12b에 도시되어 있다.
도 13a는 마우스 IL-12 서브유닛 베타의 성숙한 형태의 아미노산 서열을 나타낸다. 성숙한 인터루킨-12 서브유닛 알파 동형체 2의 아미노산 서열은 도 13b에 도시되어 있다. 실시예에 사용된 재조합 인터루킨-12 융합 단백질의 성숙한 형태의 아미노산 서열은 도 13c에 도시되어 있다. 실시예에 사용된 재조합 mIL-12 전구체 단백질의 아미노산 서열은 도 13d에 도시되어 있다.
도 14a는 성숙한 마우스 INFα2의 아미노산 서열을 나타낸다. 실시예에서 사용된 mIFNa2 변이체의 아미노산 서열은 도 14b에 도시되어 있다. 실시예에 사용된 합성 mIFNa2 전구체 단백질의 아미노산 서열은 도 14c에 도시되어 있다.
도 15a(도 15aa 내지 도 15ah에 나누어 기재)는 실시예에서 사용된 합성 mTEA 구성체의 핵산 서열을 나타낸다. pC-mTEA로 명명된 발현 플라스미드의 핵산 서열은 도 15c(도 15ca 내지 도 15cl에 나누어 기재)에 도시되어 있다. 발현 플라스미드 pC-mTEA의 개략도는 도 15b에 도시되어 있다.
도 16a(도 16aa 내지 도 16ah에 나누어 기재)는 실시예에서 사용된 합성 mGTE 구성체의 핵산 서열을 나타낸다. pC-mGTE로 명명된 발현 플라스미드의 핵산 서열은 도 16c(도 16ca 내지 도 16cl에 나누어 기재)에 도시되어 있다. 실시예에서 사용된 상응하는 발현 플라스미드 pC-mEG의 개략도는 도 16b에 도시되어 있다.
도 17a는 실시예에서 사용된 합성 mCherry 구성체의 개략도를 나타낸다. 합성 mCherry 구성체의 상응하는 핵산 서열은 도 17b(도 17ba 내지 도 17bd에 나누어 기재)에 도시되어 있다.
실시예에서 사용된 pC-mCherry로 명명된 발현 플라스미드의 핵산 서열은 도 18b(도 18ba 내지 도 18bh에 나누어 기재)에 도시되어 있다. 발현 플라스미드 pC-mCherry의 개략도는 도 18a에 도시되어 있다.
도 19a는 각각은 실시예 3에서 표시된 시점(T)에서 파장 600nm에서의 광학 밀도(OD600)를 측정하여 결정된, 100mM NaCl("L. lactis NZ1330::pC-mCherry + NaCl")이 있는 mCherry 유전자의 발현 유도 후 및 유도 없이("L. lactis NZ1330::pC-mCherry + mq") L. lactis NZ1330의 성장 곡선의 비교를 나타낸다.
도 19b는 실시예 3에서 기술된 조건 하에서 표시된 시점 분에서 측정된 인공 단위로, 100mM NaCl("NZ1330::pC-mCherry + NaCl")이 있는 mCherry 유전자의 발현 유도 후 및 유도 없이("NZ1330) L. lactis NZ1330(pC-mCherry)에서 L. lactis NZ1330 (pC-mCherry)로부터 수득된 mCherry 형광의 비교를 나타낸다.
도 20a는 실시예 1.4에서 수득된 발현 플라스미드 pC-CFI로부터 인간 CSF-1, 인간 FGF-2 및 인간 IL-4를 발현하는 AUP1602-C로 명명된 재조합 박테리아의 웨스턴 블롯 분석을 나타내고, "항-CSF-1", "항-FGF-2" 및 "항-IL-4"는 각각 인간 CSF-1, 인간 FGF-2 및 인간 IL-4의 발현을 검출하기 위해 실시예 3에서 사용된 1차 항체를 나타낸다.
도 20b 및 도 20c는 실시예 1.7에서 수득된 발현 플라스미드 pC-mGTE로부터 마우스 IL-12, 마우스 IL-18 및 마우스 GM-CSF를 발현하는 AUP5563-C로 명명된 재조합 박테리아의 웨스턴 블롯 분석을 나타내며, "항-GM-CSF" 및 "항-IL-18"은 각각 마우스 GM-CSF 및 마우스 IL-18의 발현을 검출하기 위해 실시예 3에서 사용된 1차 항체를 나타낸다.
도 20d는 실시예 1.6에서 수득된 발현 플라스미드 pC-mTEA로부터 마우스 IL-12, 마우스 IL-18 및 마우스 IFNa를 발현하는 AUP555m-C 및 실시예 1.7.에서 수득된 발현 플라스미드 pC-mGTE로부터 마우스 IL-12, 마우스 IL-18 및 마우스 GM-CSF를 발현하는 AUP5563-C로 명명된 재조합 박테리아의 웨스턴 블롯 분석을 나타내고, "항-IL-12"는 마우스 IL-12의 발현을 검출하기 위해 실시예 3에서 사용된 1차 항체를 나타낸다.
도 21은 실시예 4에 기술된 조건하에서 AUC1000(pC-mCherry) 구성체("PGAD-mCherry") 및 발현 플라스미드가 없는 대조군 박테리아("L. lactis(대조군)")를 함유하는 재조합 L. 락티스의 i.t. 주사 이후 48시간의 종양 유발 BALB/c 마우스의 형광 이미지를 나타내고, 파란색 원은 종양의 위치를 나타낸다.
도 22는 실시예 5에 기재된 상처 봉합 실험의 모든 처리 그룹에 대한 평균 상처 면적 백분율을 나타낸다.
도 23은 실시예 5에 기재된 상처 봉합 실험의 모든 처리 그룹에 대한 평균 상처 수축 백분율을 나타낸다.
도 24는 실시예 5에 기술된 상처 봉합 실험의 1일째에 각 처리 그룹에 대해 반응하는 상처의 %를 나타낸다.
도 25a 내지 도 27b는 실시예 5에 기재된 상처 봉합 실험에서 처리된 마우스의 상처액에서 인간 FGF-2, 인간 IL-4 및 인간 CSF-1의 검출의 실시예 6에 기재된 결과를 나타낸다.
도 28a 내지 도 28c는 표시된 시점에서 비히클-처리된 대조군 마우스, AUP5563-C4로 처리된 마우스 및 항-m-CTLA-4-처리된 대조군 마우스의 상대적 종양 부피의 실시예 7에 기재된 결과를 나타낸다.
도 29는 실시예 3에서 각각 수득된 약물 AUP2059(mIL18/mGM-CSF) 및 AUP5551-C(mIL12/mIL18/mIFNa2b)의 조합으로 실시예 8에서 처리된 C57BL76 마우스 및 비히클 처리된 대조군 마우스의 생존 곡선을 나타낸다.
실시예:
I) 일반적인 실험 절차
달리 언급되지 않는 한, 실시예는 분석 시스템 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 달리 언급되지 않는 한, 표시되어 있는 화학물질은 시그마-알드리치 케미에 사(Munch, DE), 머크 사(Merck KGaA) (Darmstadt, DE), 써모 피셔 사이언티픽 사(Thermo Fisher Scientific Inc.)(Waltham, MA, US) 또는 벡톤, 디킨슨 앤드 컴패니(Becton, Dickinson and Company) (Franklin Lakes, NJ, US)로부터 시중에서 구입하였다.
1.1 성장 배지
상이한 목적의 세포는 상이한 배지에서 성장시켰다.
일반적인 클로닝 절차에는, 1wt% 글루코오스 또는 락토오스를 함유하는 M17 배지(옥소이드 도이칠란드 사(Oxoid Deutschland GmbH), Wesel, DE)를 각각 사용하였다.
E.coli 균주가 TY 배지에서 성장되었다. 사용된 TY 배지에 대한 레시피는 다음과 같다:
1wt% 트립톤
0.5wt 효모 추출물
0.5wt% NaCl
발효 및 기타 기능적 성장 실험을 위해 동물 유래 성분이 없는 IM1 배지를 사용했다. 유일하게 남은 동물성 원료인 락토오스는 약제학적 품질로 수득될 수 있다.
사용된 IM1 배지에 대한 레시피는 다음과 같다:
1wt% 락토오스
2wt% Na-β-글리세로포스페이트
1.5wt% 소이 펩톤
1wt% 효모 추출물
1 mM MgSO4 x 7H2O
0.1 mM MnSO4 x 4H2O
pH 6.7
살균: 110 ℃ 15분
발효 중에는 2.5M NaOH를 사용하여 pH가 자동으로 조절되기 때문에 완충액(예: Na-β-글리세로포스페이트)이 추가되지 않는다. 이 완충액은 생산된 락테이트를 중화하고 배양물이 OD600 = 10-15의 세포 밀도에 도달하도록 한다.
균주의 성장을 위해 L. 락티스 NZ1330 및 NZ9130 D-알라닌을 배지에 200㎍/mL의 최종 농도로 첨가하였다.
I.2 박테리아 균주
하기 상업적인 박테리아 균주를 사용하였다. 락토코쿠스 락티스 균주 NZ3900 및 NZ1330은 MoBiTec GmbH(Goettingen, DE)에서 수득했다.
L. 락티스 균주 NZ1330은 결실된 알라닌 라세마아제(alr) 암호화 유전자(△alr)를 함유한다. alr 유전자의 결실은 필수 성분 D-알라닌에 대한 영양 요구성을 초래한다. 각각의 균주는 alr 유전자가 플라스미드에 제공되지 않는 한 D-알라닌이 없는 배지에서 성장할 수 없다.
I.3 분자 클로닝 기술
분자 클로닝을 위해, 예를 들어 Green and Sambrook(2012): "Molecular cloning: a lab manual", fourth edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor, NY, US)에 기술된 표준 기술이 사용되었다.
BaseClear(Leiden, NL)에서 다양한 합성 DNA 구성체를 생산했다. 구성체는 E. coli에서 클론뿐만 아니라 정제된 플라스미드로 수득되었다.
플라스미드 DNA는 Birnboim, H.C. 및 Doly, J.(1979)에 따른 표준 DNA 분리를 사용하여 분리되었다. 합성 유전자 구성체는 선택된 제한 효소를 사용하여 이들의 플라스미드로부터 절단되고, 정제되고 각각의 표적 플라스미드에 결찰되었다. Anza T4 리가아제 마스터 믹스(ThermoFischer Scientific Inc.)를 사용하여, 제공된 프로토콜에 따라 결찰을 수행했다.
상이한 결찰 혼합물은 선택된 L. 락티스 균주(L. 락티스 NZ1330 또는 L. 락티스 NZ 9130)에 전기천공함으로써 형질전환되고, 적절한 배지에 플레이팅되었다.
I.4. 균주의 전기-적격 세포(electro-competnet cells)의 제조 및 전기천공
전기-적격 세포는 다음 프로토콜에 따라 준비되었다. L. 락티스 NZ1330 및 NZ9130은 100mL SMGG 배지를 접종하는 데 사용된 10mL SMGG 배지에서 30℃에서 밤새 성장했다.
~0.5의 OD600에 도달할 때까지 세포를 성장시켰다. 세포를 빙냉 세척 완충액으로 3회 세척하고, 1mL 세척 완충액에서 재현탁시켰다. 40μL의 분취량을 -80℃에서 보관했다. 표준 전기천공 절차를 사용하여 세포의 전기-적격 특성을 테스트했다.
이를 위해 40μL 세포를 얼음 위에서 해동하고 빙냉 전기천공 큐벳에서 0.5μL 플라스미드 DNA와 혼합하고 Eporator® - 전기천공기(Eppendorf AG, Hamburg, DE)를 사용하여 2500볼트, 25μF, 200옴을 적용했다.
세포를 4mL SMG17MC 배지에 재현탁하고, 30℃에서 2시간 동안 배양했다.
다양한 양의 배양물을 GSM17-아가에 플레이팅하고 30℃에서 배양했다.
사용된 버퍼:
SMGG-매체: 상업적으로 입수 가능한 M17 매체,
+ 0.5M 수크로오스
+ 0.5wt% 글루코오스
+ 1wt% 글리신
SMG17MC-매체: 상업적으로 입수 가능한 M17 매체
+ 0.5M 수크로오스
+ 0.5wt% 글루코오스
+ 20mM MgCl2
+ 2mM CaCl2
GSM17 아가: Oxoid Deutschland GmbH(Wesel, DE)로부터 수득된 M17-아가
+ 0.5M 수크로오스
+ 0.5wt% 글루코오스
세척 완충액: 0.5M 수크로오스
+ 10wt% 글리세롤
I.5 형질전환체의 선택
형질전환체를 플레이트에서 새로운 플레이트 및 3ml 배지 M17(1% 글루코오스 또는 락토오스로 보충)이 있는 튜브로 옮기고 30℃에서 배양하고 상기 항목 I.3에 설명된 대로 DNA를 분리했다. 선택된 제한 엔도뉴클레아제 및 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 삽입물의 존재 및 방향에 대해 클론을 스크리닝하였다.
양성 클론을 선택하고 배양하여 -80℃에서 보관했다.
I.6 유전자 발현의 배양 및 유도
선택된 클론을 0.5% 글루코오스 또는 락토오스가 보충된 IM1 배지에 접종하고 30℃에서 밤새 성장시켰다. t = 0에서 배양물을 45mL 배지에 1:100으로 접종하고 인큐베이션하였다. OD600=0.5에서 배양물을 NaCl(0mM, 100mM 또는 500mM)의 첨가에 의해 유도된 3개의 개별 15ml 배양물로 분할했다.
3시간의 유전자 유도 후, 세포와 상청액을 원심분리(6,000rpm에서 10분)로 분리하였다.
세포는 추가 처리 전에 -20℃에서 동결되었다. 상층액을 1/3 부피의 TCA(아래 참조)와 혼합하고 -20℃에서 보관했다.
I.7 무세포 추출물의 제조 및 트리클로로아세트산(TCA) 침전
표준 작업 프로토콜에 따른 비드 비팅에 의해 무세포 추출물을 제조하였다. 절차는 50~100 ㎛ 유리 비드 사용을 기반으로 한다. 샘플은 단백질의 단백질 분해 분해를 방지하기 위해 가능한 한 얼음에 보관되었다. 최종 원심분리 단계 후에 무세포 추출물을 수집하여 -20℃에서 보관했다.
TCA 침전은 1부피의 TCA를 4부피의 배양 상청액에 첨가하여 수행하였다. 혼합물을 더 사용할 때까지 -20℃에서 인큐베이션했다. TCA 침전된 단백질을 얻기 위해 1mL 샘플을 채취하고 14,000rpm에서 10분 동안 원심분리했다. 상층액을 따라내고 펠릿을 65-70℃의 스토브에서 건조시켰다. 이어서, 2% β-메르캅토에탄올을 함유하는 SDS-PAGE 샘플 완충액을 첨가하고, 샘플을 100℃에서 10분 동안 배양하여 변성시켰다.
I.8 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 웨스턴 블롯팅
SDS-PAGE(15wt% 러닝 겔)는 본질적으로 Laemmli, U.K.(1970)에 따라 수행되었다. 제조업체의 지침에 따라, 전기영동 후 세포는 Coomassie R-250(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, US)을 사용하여 염색되거나 또는 단백질이 semi-dry blotting system(Owl®, Thermo Fisher Scientific, Inc.) 수단에 의해 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 또는 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전이된다.
PVDF 또는 니트로셀룰로오스 멤브레인은 2wt% 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 0.05wt% Tween 20(TBST)이 포함된 Tris 완충 식염수로 차단한 후 30분 동안 1wt-% BSA를 포함하는 TBST에서 희석된 각 단백질에 대해 발생된 특정 1차 항체로 배양하여 처리되었다.
이어서, 블롯을 TBST로 10분 3회 세척하였다. 세척 후, Santa Cruz Biotechnology, Inc.(Dallas, TX, US, catalog nr. sc-2004)와 같은 염소 유래의 이차 알칼리성 포스파타제 접합된 항-토끼 항체를 적용했다(1:7500 in TBST + 1wt% BSA). 결합되지 않은 항체를 TBST로 세척한 다음(3 x 10분), NBT 및 BCIP를 사용하는 표준 절차에 따라 효소 염색을 수행했다.
충분한 발색 후 물로 헹구어 반응을 종결시킨 후, 멤브레인을 건조시키고 사진 또는 스캔하였다.
대안적으로, 근적외선(NIR) 형광 염료와 접합된 LI-COR, Inc.(Lincoln, NE, US)의 당나귀 항염소 항체 IRDye® 680RD를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용했다. 결합된 이차 항체의 검출은 LI-COR, Inc.의 Odyssey® 이미징 시스템을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 수행되었다.
Carl Roth GmbH + Co. KG(Karlsruhe, DE)에서 얻은 Roti®fair TBST 7.6 정제를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 0.05 wt% Tween 20을 포함하는 트리스 완충 식염수를 제조했다.
각각의 재조합 단백질의 검출을 위해 Abcam PLC(Cambridge, UK), Bio-Rad Laboratories Inc.(Hercules, CA, US) 및 LifeSpan BioSciences, Inc.(Seattle, WA, US)의 다음 1차 항체를 사용했다:
* 항-FGF-2 항체- FGF-2에 대한 토끼 다클론 항체(Abcam PLC, ab126861),
* 항 IL-4 항체 - IL-4에 대한 토끼 다클론 항체(Abcam PLC, ab9622),
* 항-M-CSF 항체 - M-CSF에 대한 토끼 다클론 항체(Abcam PLC, ab9693),
* 항-마우스 GM-CSF 항체 - 마우스 GM-CSF에 대한 토끼 다클론 항체(Bio-Rad Laboratories Inc., AAM16G),
* 항-마우스 IL-18 항체 - 마우스 IL-18에 대한 토끼 다클론 항체(LifeSpan BioSciences, Inc., LS-C147100),
* 항-마우스 IL-12 항체 - IL-12에 대한 염소 항-마우스 항체(Biorad Laboratories Inc., AAM33).
I.9 발효
발효는 0.5-L Multifors 6-발효기 어레이(Infors Benelux, Velp, NL)에서 수행되었다. 접종은 IM-1 배지에서 1% 전배양으로 수행되었다; 교반기 속도는 200rpm이었고 인큐베이션 온도는 30℃였다. 실행 동안 pH는 2.5M NaOH를 사용하여 제어되었다. pH, 온도 및 NaOH의 첨가를 지속적으로 모니터링하였다.
I.10 형광 단백질 측정
상이한 프로모터의 제어하에 mCherry 리포터 유전자를 갖는 착제물을 함유하는 균주를 상기 기재된 바와 같이 성장시키고 처리하였다. mCherry 활성은 Synergy HT(BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, US) 형광 분광 광도계에서 측정되었다.
여기(excitation)는 530 nm에서 수행되었고 방출은 590 nm에서 측정되었으며 120의 게인은 Tauer et al. (2014).에 기재된 바와 같이 적용되었다.
실시예 1 발현 플라스미드의 생성
1.1 플라스미드 pAUC1010의 생성
플라스미드 pAUC1010은 L. 락티스에서 이종 유전자의 발현에 대한 다음 실험에서 사용되었다. 플라스미드 pAUC1010은 de Vos, W.M. (1987) 뿐만 아니라 de Vos, W.M. and Simons, G. (1994)에 기재된 바와 같이, 락토코쿠스 락티스 pSH71의 기본 롤링 서클 플라스미드에 기초한다.
플라스미드 pAUC1010은 NZ1330(Bron, PA et al.(2002), Hols, P. et al.(1999))과 같은 L. 락티스 alr 녹아웃 돌연변이 균주와 함께 사용할 수 있는 선택 마커로서 L. 락티스의 종결자를 포함하는 알라닌 라세마아제(alr) 유전자를 함유한다. 플라스미드는 또한 인공 프로모터 Pcp14(Ruhdal Jensen, P. and Hammer, K. (1998))를 포함한다.
또한, 플라스미드 pAUC1010은 프로모터의 하류에 L. 락티스(Tan, P.S.T. et al.(1992))의 아미노펩티다아제 N(pepN) 유전자의 종결자 서열 및 다중 클로닝 부위(MCS)를 함유한다. 종결자 서열은 전사의 종결을 허용한다.
알라닌 라세마아제에 대한 락토코쿠스 락티스 서브에스피. 크레모리스 alr 유전자의 핵산 서열(EC 5.1.1.1)은 예를 들어 NCBI 수탁 번호 Y18148.2로 입수 가능하다.
락토코쿠스 락티스 서브에스피. 크레모리스의 알라닌 라세마아제의 각 아미노산 서열은, 예를 들어 UniProt 수탁 번호 Q9RLU5 - 버전 99 또는 NCBI 참조 서열 번호 WP_011835506.1에서 찾을 수 있다.
pAUC1010의 핵산 서열은 서열번호 1 및 도 1b(도 1ba 내지 도 1bf에 나누어 기재)에 제공된다.
도 1a는 플라스미드 pAUC1010의 개략도를 보여준다. "alr"은 d-알라닌의 부재 하에 숙주 균주의 성장에 사용되는 알라닌 라세마아제 유전자를 나타내고; "T"는 종결자 서열을 나타내고; "repC" 및 "repA"는 박테리아 세포에서 플라스미드 복제에 필요한 원핵생물 유전자이다.
1.2 염화물 유도 발현 카세트의 생성
다음 실험에서 염화물 유도성 유전자 발현 카세트가 생성되고, L. 락티스 서브에스피. 크레모리스로부터의 PgadC 프로모터가 L. 락티스의 상이한 이종 유전자의 발현을 제어하는데 사용된다.
PgadC 프로모터는 Sanders et al. (1997) 및 Sanders et al. (1998)에 기재된 바와 같이 활성화제 유전자 gadR, 그리고 gadC 유전자의 리보솜 결합 부위 및 시작 코돈과 조합되어 사용되고, 모두 PgadC 프로모터의 하류에 배열된다.
프로모터 PgadC는 Pgad의 양성 조절자인 gadR 단백질에 의해 조절된다. gadR 단백질은 염화물 이온의 존재하에 PgadC 프로모터를 활성화한다.
gadR 유전자 자체의 발현은 염화물 이온에 의해 활성화되지 않고 대신에 핵산 서열을 암호화하는 gadR의 ATG 개시 코돈의 상류에 위치한 리보솜 결합 부위(RBS)와 함께 본 발명에서 사용되는 염화물-유도성 유전자 발현 카세트에 또한 제공된 구성적 프로모터에 의해 제어된다.
gadR 유전자 및 리보솜 결합 부위 및 gadC 유전자의 개시 코돈을 포함하는 PgadC 프로모터의 핵산 서열은 균주 L. 락티스 서브에스피. 크레모리스 MG1363의 게놈 서열로부터 추출된다. 각각의 게놈 서열은 예를 들어 NCBI 수탁 번호 NC_009004.1로 입수 가능하다.
PgadC 프로모터 영역, gadR 유전자 및 gadC 유전자의 리보솜 결합 부위 및 개시 코돈을 포함하는 염화물-유도성 프로모터의 핵산 서열은 서열번호 2 및 도 2b(도 2ba 및 도 2bb에 나누어 기재)에 제공된다. gadC의 ATG 개시 코돈은 밑줄과 굵은 대문자로 도 2b(도 2ba 및 도 2bb에 나누어 기재)에 표시된다.
조절 요소를 포함하는 염화물 유도성 프로모터의 개략도가 도 2a에 도시되어 있다.
본 발명의 재조합 박테리아에 의해 발현되는 적어도 하나의 단백질을 암호화하는 각각의 표적 유전자 또는 유전자들은 gadC의 ATG 개시 코돈에 부착되었다. 또한, 본 발명의 재조합 박테리아에 의해 발현되는 각 단백질을 암호화하는 유전자에는 발현 숙주 유래의 단백질 분비를 위한 분비 신호가 제공되었다.
분비 신호는 바람직하게는 예를 들어 문헌 van Asseldonk et al.(1993) 및 van Asseldonk et al.(1990)에 기재된 락토코쿠스 단백질 Usp45에서 유래한다. 락토코쿠스 단백질 Usp45의 분비 신호의 아미노산 서열은 도 3 및 서열번호 3에 나타내었다.
세포에는 단백질이 분비된 후 이 신호 서열이 표적 단백질에서 절단되도록 하는 메커니즘이 존재한다. 이 반응은 절단 부위 주변의 위치에서 특정 아미노산에 대해 특정한 선호도를 갖는 신호 펩티다아제에 의해 촉매촉진된다.
본 발명의 재조합 박테리아에 의해 발현될 적어도 하나의 단백질은 각각의 전구체 단백질의 N-말단에서, 바람직하게는 락토코쿠스 단백질 Usp45의 각각의 분비 신호를 포함하는 재조합 전구체 단백질로서 발현되었다.
본 발명의 재조합 박테리아에 의해 발현될 적어도 하나의 단백질을 암호화하는 각각의 유전자 및/또는 유전자들에 대한 코돈 사용은 L. 락티스의 일반적인 코돈 사용에 적응되었다.
또한, 하나 이상의 단백질이 본 발명의 재조합 박테리아에 의해 발현되는 경우 동일한 Usp45 신호 펩타이드 서열이 각각의 단백질에 대해 사용되었다.
플라스미드 내 재조합/결실을 초래할 수 있는 근접한 플라스미드 상의 큰 동일한 뉴클레오티드 영역을 피하기 위해, 동일한 신호 펩타이드가 L. 락티스의 코돈 변성 및 코돈 사용에 기초하여 상이한 코돈에 의해 암호화되었다.
또한, 성숙한 단백질을 생성하는 합성 전구체 단백질에서 신호 펩타이드가 절단되는 절단 부위를 최적화하기 위해 웹 기반 프로그램 SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ )를 사용하였다.
또한, 하나 이상의 단백질이 본 발명의 재조합 박테리아에 의해 발현되는 경우, 바람직하게는 적어도 하나의 오페론에서, 단백질 발현을 개선하기 위해 각각의 유전자 각각에 리보솜 결합 부위(RBS)가 제공되었다.
바람직하게는, 핵산 서열 gadC 유전자의 리보솜 결합 부위를 암호화하는 2개 이상의 단백질을 포함하는 오페론의 제1 유전자를 사용하였다. 오페론의 다른 유전자의 경우 내인성 L. 락티스 유전자의 리보솜 결합 부위, 예를 들어 ATP 합성효소 서브유닛 감마(atpG) 유전자 및/또는 갈락토사이드 O-아세틸트랜스퍼라제(lacA) 유전자가 사용되었다.
적합한 리보솜 결합 부위는 예를 들어 문헌 Bolotin et al.(2001)에 기재된 바와 같이, 알려진 L. 락티스 핵산 서열, 예를 들어 L. 락티스 서브에스피. 락티스 IL1403 게놈, 이는 수탁 번호 AE005176.1로 입수 가능한 것 또는 L. 락티스 서브에스피. 크레모리스 MG1363 게놈, 이는 NCBI 수탁 번호 NC_009004.1로 입수 가능한 것으로부터 L.락티스의 16S rRNA의 3`말단과의 양호한 적합성에 기초하여 선택될 수 있다.
L. 락티스(5' GGAUCACCUCCUUUCU 3')의 16S rRNA의 3' 말단이 서열 번호 4 및 도 4에 도시되어 있다.
본 발명의 재조합 박테리아에 의해 발현될 적어도 하나의 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열 뿐만 아니라 염화물-유도성 프로모터를 포함하는 합성 핵산 구성체를 새로 합성하고, 상기 개략된 바와 같이, 적절한 박테리아 균주, 바람직하게는 L. lactis로 형질전환된 각각의 발현 플라스미드 내로 결찰시켰다.
다음 발현 플라스미드가 생성되었다.
1.3 mCherry의 발현을 위한 발현 플라스미드의 생성
PgadC의 제어 하에 mCherry 유전자를 함유하는 상이한 구성체가 준비되었다. mCherry는 Beilharz K, et al.(2015)에 의해 처음 기술된 형광 단백질이다.
mCherry 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI 승격 번호 KJ908190.1로 입수 가능하다. 상응하는 아미노산 서열은 NCBI 상승 번호 AIL28759.1로 입수 가능하다.
mCherry 코딩 서열은 PgadC 프로모터에 융합되었다. 각 인서트의 개략도가 도 17a에 도시되어 있다.
합성 mCherry 구성체의 핵산 서열은 도 17b(도 17ba 내지 도 17bd에 나누어 기재) 및 서열번호 33에 도시되어 있다. 합성 mCherry 구성체의 도식적 표현은 도 17a에 도시되어 있다.
완성된 유전자 합성 산물은 E. coli 벡터 pUC57에 클로닝된 단편으로 BaseClear로부터 수득했다.
각각의 유전자 합성 생산물을 갖는 pUC57 플라스미드는 제한 효소 SphI 및 BglII과 함께 분해되었다. 각각의 유전자 합성 생산물을 함유하는 SphI 및 BglII 단편을 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 분리하고, SphI 및 BglII 절단 플라스미드 pAUC1010으로 연결하여 pC-mCherry로 명명된 발현 플라스미드를 생성했다.
pC-mCherry로 명명된 발현 플라스미드의 핵산 서열은 도 18b(도 18ba 내지 도 18bh에 나누어 기재) 및 서열번호 34에 도시되어 있다. 발현 플라스미드 pC-mCherry의 개략도는 도 18a에 도시되어 있다.
1.4 단일 오페론으로부터 hFGF-2, hIL-4 및 hCSF-1 발현용 발현 플라스미드 생성
L. 락티스 NZ1330에서 인간 섬유아세포 성장 인자 2(hFGF-2), 인간 인터루킨 4(hIL-4) 및 인간 집락 자극 인자 1(hCSF-1)을 발현하기 위해 다음 핵산 서열을 생성하였다.
1.4.1 인간 섬유아세포 성장 인자 2(hFGF-2)
hFGF-2의 발현에 사용되는 아미노산 서열은 NCBI 수탁번호 NP_001997.5로 입수 가능한 인간 FGF-2 전구체의 288 아미노산 서열로부터 유래된다.
hFGF-2의 성숙한 형태는 155개 아미노산을 함유하고 다음과 같이 hFGF-2-155로 명명된다. 분자량은 17.3 kDa이고 pI는 9.85이다. 분자는 4개의 시스테인 잔기를 함유한다.
L. 락티스에서 발현되는 hFGF-2 변이체는 처음 2개의 아미노산인 메티오닌과 알라닌이 부족하고 153개 아미노산을 함유한다. 따라서, 이 변이체는 다음과 같이 hFGF-2-153으로 명명되었다. hFGF-2-153의 분자량은 17.1 kDa이고 pI는 9.85이다. 이 변이체는 4개의 시스테인 잔기를 포함한다.
인간 FGF-2-155의 상응하는 아미노산 서열은 도 5a 및 서열번호 5에 도시되어 있다. 도 5a에서 밑줄 친 아미노산은 변이체 hFGF2-153에서 누락된 처음 2개의 아미노산 메티오닌 및 알라닌을 나타낸다. hFGF2-153 변이체의 아미노산 서열은 도 5b 및 서열번호 6에 도시되어 있다.
FGF-2-155의 서열은 분비 후 성숙한 인간 FGF-2 서열이다. 생체 내에서 이 서열은 추가로 처리된다. 그러나 기존의 다양한 재조합 생산물은 N-말단 메티오닌 잔기가 있거나 없는 이 155 아미노산 서열을 사용했다.
예를 들어, hFGF2를 발현하고 성장 배지의 상청액으로 분비하기 위해, 신호 펩타이드를 전술한 바와 같이 N-말단에 첨가하여 재조합 hFGF-2-153 전구체 단백질을 생성하였다.
재조합 hFGF-2-153 전구체 단백질의 각 아미노산 서열은 도 5c 및 서열번호 7에 나타내었다. 도 5c에서 밑줄 친 아미노산은 락토코쿠스 단백질 Usp45의 분비 신호를 나타낸다.
1.4.2 인간 인터루킨-4(hIL-4)
hIL-4의 성숙한 단백질은 129개 아미노산을 함유하고 있으며, 이는 NCBI 수탁 번호 NP_000580.1로 입수 가능한 아미노산 서열의 25~153 아미노산에 해당한다. 성숙한 단백질의 분자량은 14.96 kDa이고 pI는 9.36이다. 분자는 6개의 시스테인 잔기를 함유한다.
성숙한 hIL-4의 아미노산 서열은 도 6a 및 서열번호 8에 도시되어 있다.
L. 락티스에서 발현되는 hIL-4 변이체는 성숙한 단백질의 N-말단에서 알라닌 잔기를 추가로 함유하고 있고, 따라서 130개의 아미노산을 함유한다. 분자량은 15.03 kDa이고 pI는 9.36이다. 이 변이체는 또한 6개의 시스테인 잔기를 함유한다.
발현될 인간 hIL-4 변이체의 상응하는 아미노산 서열은 도 6b 및 서열번호 9에 도시되어 있다. 도 6b에 도시된 밑줄친 아미노산은 아미노산 서열의 N-말단에 있는 추가 알라닌 잔기를 나타낸다.
예를 들어, hIL4를 발현하고 성장 배지의 상청액으로 분비하기 위해, 신호 펩타이드를 전술한 바와 같이 N-말단에 첨가하여 재조합 hIL-4 전구체 단백질을 생성하였다. 재조합 hIL-4 전구체 단백질의 각 아미노산 서열은 도 6c 및 서열번호 10에 도시되어 있다. 도 6c에서 밑줄 친 아미노산은 락토코쿠스 단백질 Usp45의 분비 신호를 나타낸다.
1.4.3 인간 집락 자극 인자 1(hCSF1)
발현에 사용된 hCSF1의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000748.3으로 입수 가능한 인간 CSF1 전구체 동형체 a의 554 아미노산 서열로부터 유래된다.
hCSF1의 성숙한 형태는 전구체의 아미노산 33 내지 450에 걸쳐 있다. 아미노산 서열은 도 7a(도 7aa 및 도 7ab에 나누어 기재) 및 서열번호 11에 도시되어 있다.
발현될 아미노산 서열은 성숙한 hCSF1의 첫 번째 아미노산인 아미노산 33(E)에서 시작하여 아미노산 181(Q)에서 끝난다.
또한, 천연 단백질 위치 480 - 488(GHERQSEGS)을 차지하는 C-말단에 추가로 9개의 아미노산이 추가되었다. 신호 펩티다아제에 의한 신호 펩타이드의 제거를 개선하기 위해 추가 알라닌 잔기를 N-말단에 첨가하였다. 생성된 아미노산 서열은 도 7b 및 서열 번호 12에 도시되어 있다.
도 7b의 N-말단에 있는 추가 알라닌 잔기는 밑줄이 그어져 있다. C-말단에 추가된 추가 9개 아미노산은 도 7b에 굵게 표시되어 있다. 이 서열에 의해 암호화된 단백질은 159개의 아미노산을 함유하고, 18.5kDa의 분자량 및 4.72의 pI를 갖는다. 단백질은 7개의 시스테인 잔기를 함유한다.
예를 들어, hCSF1을 발현하고 성장 배지의 상청액으로 분비하기 위해, 신호 펩타이드를 전술한 바와 같이 N-말단에 첨가하여 재조합 hCSF1 전구체 단백질을 생성하였다. 합성 hCSF1 전구체 단백질의 각 아미노산 서열은 도 7c 및 서열번호 13에 나타나 있다. 도 7c에서 밑줄 친 아미노산은 락토코쿠스 단백질 Usp45의 분비 신호를 나타낸다.
1.4.4 발현 구조의 생성
도 5c 및 서열번호 7에 나타낸 합성 hFGF-2-153 전구체 단백질, 도 6c 및 서열번호 10에 나타낸 합성 hIL-4 전구체 단백질 및 도 7c 및 서열번호 13에 나타낸 합성 hCSF1 전구체 단백질의 아미노산 서열은 상응하는 핵산 서열로 번역되어, 코돈 사용이 L. 락티스의 일반적인 코돈 사용에 맞게 조정되었다.
3개의 유전자(FGF2, IL4, CSF1)의 6개 순열 중 2개를 사용하여 2개의 구성체를 만들었다:
a) hCSF1, hFGF2, hIL4(CFI)
b) hIL4, hCSF1, hFGF2(ICF)
오페론의 설계를 위해 각 유전자에는 번역 개시를 위한 자체 리보솜 결합 부위와 단백질 분비를 위한 자체 신호 펩타이드가 제공되었으며, 이는 L. 락티스의 코돈 변성 및 코돈 사용을 기반으로 상이한 코돈으로 코딩된 동일한 신호 서열(ssUsp45)을 사용한다.
2개의 구성체의 첫 번째 유전자 각각에 대해 gadC 유전자의 리보솜 결합 부위가 사용되었다. 2개의 구성체 각각의 다른 2개의 유전자에 대해 ATP 합성효소 서브유닛 감마(atpG) 유전자 및 갈락토사이드 O-아세틸트랜스퍼라제(lacA) 유전자의 리보솜 결합 부위가 사용되었다.
새롭게(de novo) 합성된 CFI 구성체의 핵산 서열은 도 8b(도 8ba 내지 도 8be에 나누어 기재) 및 서열번호 14에 도시되어 있다. 새롭게 합성된 CFI 구성체의 개략도는 도 8a에 도시되어 있다.
완성된 유전자 합성 산물은 E. coli 벡터 pUC57에 클로닝된 단편으로서 BaseClear에서 각각 얻었다.
각각의 유전자 합성 생산물을 갖는 pUC57 플라스미드를 각각 New England Biolabs(Ipswich, MA, US)로부터 입수한 제한 효소 SphI 및 BglII로 분해하였다. 각각의 유전자 합성 생산물을 함유하는 SphI 및 BglII 단편을 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 분리하고, SphI 및 BglII 절단 플라스미드 pAUC1010에 결찰시켜 pC-CFI로 명명된 발현 플라스미드를 생성하였다.
pC-CFI로 명명된 발현 플라스미드의 핵산 서열은 도 9b(도 9ba 내지 도 9bh에 나누어 기재) 및 서열번호 15에 도시되어 있다. 발현 플라스미드 pC-CFI의 개략도는 도 9a에 도시되어 있다.
1.5 단일 오페론으로부터 mIL-18 및 mGM-CSF의 발현을 위한 발현 플라스미드 생성
L. 락티스 NZ1330에서 마우스 인터루킨 18(mIL18) 및 마우스 과립구-대식세포 집락 자극 인자(mGM-CSF)를 발현하기 위해 다음 핵산 서열을 생성했다.
1.5.1 마우스 인터루킨-18(mIL-18)
mIL-18의 성숙한 단백질은 157개의 아미노산을 함유하며, 이는 NCBI 수탁 번호 NP_032386.1로 입수 가능한 마우스 인터루킨-18 동형체 a 전구체의 아미노산 서열의 아미노산 36 내지 192에 해당한다.
성숙한 마우스 IL-18의 아미노산 서열은 도 10a 및 서열번호 16에 도시되어 있다.
L. 락티스에서 발현될 mIL-18 변이체는 성숙한 단백질의 N-말단에 추가 알라닌 잔기를 함유한다. 발현될 마우스 IL-18 변이체의 상응하는 아미노산 서열은 도 10b 및 서열번호 도 17에 도시되어 있다. 도 10b에서 밑줄친 아미노산은 아미노산 서열의 N-말단에 있는 추가 알라닌 잔기를 나타낸다.
예를 들어, mIL-18을 발현하고 성장 배지의 상층액으로 분비하기 위해, 신호 펩타이드를 전술한 바와 같이 N-말단에 첨가하여 합성 mIL-18 전구체 단백질을 생성하였다. 합성 mIL-18 전구체 단백질의 각각의 아미노산 서열은 도 10c 및 서열번호 18에 나타나 있다. 도 10c에서 밑줄 친 아미노산은 락토코쿠스 단백질 Usp45의 분비 신호를 나타낸다.
1.5.2 마우스 과립구-대식세포 집락 자극 인자(mGM-CSF)
성숙한 mGM-CSF는 129개의 아미노산을 함유하며, 이는 NCBI 참조 서열: NP_034099.2에 따라 제공되는 마우스 과립구-대식세포 집락 자극 인자 전구체의 아미노산 서열의 아미노산 18 내지 141에 해당한다.
성숙한 마우스 GM-CSF의 아미노산 서열은 도 11a 및 서열번호 19에 도시되어 있다.
L. 락티스에서 발현될 mGM-CSF 변이체는 신호 펩타이드의 절단을 최적화하기 위해 N-말단에서 세린을 대체하는 성숙 단백질의 N-말단에 추가 알라닌 잔기를 함유한다. 발현될 마우스 GM-CSF 변이체의 상응하는 아미노산 서열은 도 11b 및 서열번호 20에 도시되어 있다. 도 11b에서 밑줄 친 아미노산은 아미노산 서열의 N-말단에서 추가 알라닌 잔기를 나타낸다.
예를 들어, mGM-CSF를 발현하고 성장 배지의 상층액으로 분비하기 위해, 신호 펩타이드를 전술한 바와 같이 N-말단에 첨가하여 재조합 mGM-CSF 전구체 단백질을 생성하였다. 합성 mGM-CSF 전구체 단백질의 각각의 아미노산 서열은 도 11c 및 서열번호 21에 도시되어 있다. 도 11c에서 밑줄친 아미노산은 락토코쿠스 단백질 Usp45의 분비 신호를 나타낸다.
1.5.3 발현 구조의 생성
도 10c 및 서열번호 18에 나타낸 재조합 mIL-18 전구체 단백질의 아미노산 서열 및 도 11c 및 서열번호 21에 나타낸 재조합 mGM-CSF 전구체 단백질의 아미노산 서열을 상응하는 핵산 서열로 번역함으로써, 코돈 사용은 L. 락티스의 일반적인 코돈 사용에 맞게 조정되었다.
오페론의 설계를 위해 각각의 전구체 단백질을 암호화하는 두 유전자 각각은 번역 개시를 위한 자체 리보솜 결합 부위 및 단백질 분비를 위한 자체 신호 펩타이드가 제공되었으며, 이는 위에서 설명한 대로 L. 락티스의 코돈 변성 및 코돈 사용을 기반으로 상이한 코돈에 의해 코딩된 동일한 신호 서열(ssUsp45)을 사용한다.
오페론의 첫 번째 유전자(mIL-18)에 대해 gadC 유전자의 리보솜 결합 부위를 사용하였다. 두 번째 유전자(mGM-CSF)의 경우 ATP 합성효소 서브유닛 감마(atpG) 유전자의 리보솜 결합 부위가 사용되었다.
합성 mEG 구성체의 핵산 서열은 도 12a(도 12aa 내지 도 12ad에 나누어 기재) 및 서열번호 22에 도시되어 있다.
완성된 유전자 합성 산물은 E. coli 벡터 pUC57에 클로닝된 단편으로서 BaseClear에서 수득했다.
각각의 유전자 합성 생산물을 갖는 pUC57 플라스미드를 각각 New England Biolabs(Ipswich, MA, US)로부터 입수한 제한 효소 SphI 및 BglII로 분해하였다. 각각의 유전자 합성 생성물을 함유하는 SphI 및 BglII 단편을 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 분리하고, SphI 및 BglII 절단 플라스미드 pAUC1010으로 결찰시켜 pC-mEG로 명명된 발현 플라스미드를 생성하였다.
pC-mEG로 명명된 발현 플라스미드의 핵산 서열은 도 12c(도 12ca 내지 도 12ci에 나누어 기재) 및 서열번호 23에 도시되어 있다. 발현 플라스미드 pC-mEG의 개략도는 도 12b에 도시되어 있다.
1.6 단일 오페론으로부터 mIL-12, mIL-18 및 mIFNa의 발현을 위한 발현 플라스미드의 생성
L. 락티스 NZ1330에서 마우스 인터루킨 12(mIL-12), 마우스 인터루킨 18(mIL-18) 및 마우스 인터페론 알파-2(mIFNa)를 발현하기 위해 다음 핵산 서열을 생성했다.
1.6.1 마우스 인터루킨-12(mIL-12)
인터루킨-12(IL-12)는 IL-12A(p35) 및 IL-12B(p40)라는 두 개의 개별 유전자에 의해 암호화된 이종이량체 사이토카인이다.
L. 락티스에서 발현될 mIL-12 변이체는 융합 단백질의 N-말단 부분을 형성하는 성숙한 인터루킨-12 서브유닛 베타 및 융합 단백질의 C-말단 부분을 형성하는 성숙 인터루킨-12 서브유닛 알파의 융합 단백질로 설계되었으며, 이것은 둘 다 펩타이드 링커에 의해 분리된다.
마우스 인터루킨-12 서브유닛 베타의 성숙한 단백질은 NCBI 수탁 번호 NP_001290173.1 하에 입수 가능한 마우스 인터루킨-12 서브유닛 베타 전구체의 아미노산 서열의 아미노산 23 내지 335에 해당하는 313개의 아미노산을 함유한다.
성숙한 인터루킨-12 서브유닛 베타의 아미노산 서열은 도 13a 및 서열번호 24에 도시되어 있다.
마우스 인터루킨 12 서브유닛 알파는 적어도 두 개의 동형체 1 및 2에서 존재한다. 암호화된 동형체 2는 동형체 1에 비해 N-말단에서 더 짧다.
NCBI 수탁 번호 NP_001152896.1로 입수 가능한 마우스 인터루킨 12 서브유닛 알파 동형체 1 전구체의 아미노산 서열.
하기 실시예에서 발현에 사용된 아미노산 서열인 마우스 인터루킨-12 서브유닛 알파 동형체 2의 성숙한 단백질은 NCBI 수탁 번호 NP_032377.1로 입수 가능한 마우스 인터루킨 12 서브유닛 알파 동형체 2 전구체의 아미노산 서열의 23 내지 215 아미노산에 해당하는 199개의 아미노산을 함유한다.
성숙한 인터루킨-12 서브유닛 알파 동형체 2의 아미노산 서열은 도 13b 및 서열 번호 25에 도시되어 있다.
재조합 인터루킨-12 융합 단백질의 성숙한 형태의 아미노산 서열은 도 13c 및 서열번호 26에 도시되어 있다. 또한, 추가로 2개의 아미노산(알라닌 및 아스파르트산)이 재조합 융합 단백질의 N-말단에 추가되었고, 이는 도 13c에 밑줄로 표시되었다. 2개의 IL.12 서브유닛을 분리하는 링커 서열은 도 13c에 굵은 글자로 표시되어 있다.
mIL-12 융합 단백질을, 예를 들어, 성장 배지의 상층액으로 발현 및 분비하기 위해, 상술한 바와 같이 신호 펩타이드를 N-말단에 첨가하여 재조합 mIL-12 전구체 단백질을 생성하였다.
재조합 mIL-12 융합 단백질 전구체의 각 아미노산 서열은 도 13d 및 서열번호 27에 제시되어 있다. 도 13d에 도시된 밑줄친 아미노산은 락토코쿠스 단백질 Usp45의 분비 신호를 표시한다.
1.6.2 마우스 인터루킨-18(mIL-18)
L. 락티스에서 발현되는 mIL-18 변이체의 아미노산 서열은 도 10b 및 서열번호 17에 도시되어 있다. 재조합 mIL-18 전구체 단백질의 각 아미노산 서열은 도 10c에 및 서열번호 18에 도시되어 있다. 도 10c에서 밑줄 친 아미노산은 락토코쿠스 단백질 Usp45의 분비 신호를 나타낸다.
1.6.3 마우스 인터페론 알파-2(mIFNa2)
mIFNa2의 성숙한 형태는 167개의 아미노산을 함유하며, 이는 NCBI 참조 서열: NP_034633.2에 따라 입수 가능한 마우스 인터페론 알파-2 전구체의 아미노산 서열의 아미노산 24 내지 190에 해당한다.
성숙한 마우스 INFα2의 아미노산 서열은 도 14a 및 서열번호 28에 도시되어 있다.
L. 락티스에서 발현되는 mIFNa2 변이체는 신호 펩타이드의 절단을 최적화하기 위해 성숙 단백질의 N-말단에 추가 알라닌 잔기를 함유한다. 발현될 재조합 마우스 INFα2 변이체의 상응하는 아미노산 서열은 도 14b 및 서열번호 29에 도시되어 있다. 도 14b에서 밑줄 친 아미노산은 아미노산 서열의 N-말단에 있는 추가 알라닌 잔기를 나타낸다.
예를 들어, mIFNa2를 발현하고 성장 배지의 상층액으로 분비하기 위해, 신호 펩타이드를 전술한 바와 같이 N-말단에 첨가하여 재조합 mIFNa2 전구체 단백질을 생성하였다. 합성 mIFNa2 전구체 단백질의 각각의 아미노산 서열은 도 14c 및 서열번호 30에 도시되어 있다. 도 14c에서 밑줄친 아미노산은 락토코쿠스 단백질 Usp45의 분비 신호를 나타낸다.
1.6.4 발현 구성체의 생성
도 13d 및 서열번호 27에 나타낸 재조합 mIL-12 단백질 전구체의 아미노산 서열, 도 10c 및 서열번호 18에 나타낸 재조합 mIL-18 전구체 단백질의 아미노산 서열 및 도 14c 및 서열번호 30에 나타낸 재조합 mIFNa2 전구체 단백질의 아미노산 서열은 상응하는 핵산 서열로 번역되었고, 이에 의해 코돈 사용은 L. 락티스의 일반적인 코돈 사용에 적응되었다.
오페론의 설계를 위해 각각의 전구체 단백질을 암호화하는 3개의 유전자 각각은 번역 개시를 위한 자체 리보솜 결합 부위 및 단백질 분비를 위한 자체 신호 펩타이드가 제공되었으며, 이는 위에서 설명한 대로 L. 락티스의 코돈 변성 및 코돈 사용을 기반으로 상이한 코돈에 의해 코딩된 동일한 신호 서열 (ssUsp45)을 사용한다.
오페론의 첫 번째 유전자(mIL-12)의 경우 gadC 유전자의 리보솜 결합 부위를 사용하였다. 두 번째 유전자(mIL-18)의 경우 ATP 합성효소 서브유닛 감마(atpG) 유전자의 리보솜 결합 부위 및 세 번째 유전자(mIFNa2)의 경우 갈락토사이드 O-아세틸트랜스퍼라제(lacA) 유전자의 리보솜 결합 부위가 사용되었다.
합성 mTEA 구성체의 핵산 서열은 도 15 및 서열번호 31에 도시되어 있다.
완성된 유전자 합성 생산물은 E. coli 벡터 pUC57에 클로닝된 단편으로서 BaseClear에서 얻었다.
유전자 합성 생산물을 갖는 pUC57 플라스미드를 제한 효소 SphI 및 BglII로 분해하였다. 각각의 유전자 합성 생산물을 함유하는 SphI 및 BglII 단편을 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 분리하고, SphI 및 BglII 절단 플라스미드 pAUC1010에 결찰시켜 pC-mTEA로 명명된 발현 플라스미드를 생성하였다.
pC-mTEA로 명명된 발현 플라스미드의 핵산 서열은 도 16b 및 서열번호 32에 도시되어 있다. 발현 플라스미드 pC-mTEA의 개략도는 도 16a(도 16aa 내지 도 16ah에 나누어 기재)에 도시되어 있다.
1.7. 단일 오페론으로부터 mGM-CSF, mIL-12 및 mIL-18의 발현을 위한 발현 플라스미드의 생성
L. 락티스 NZ1330에서 마우스 과립구-대식세포 집락-자극 인자(mGM-CSF), 마우스 인터루킨-12(mIL-12) 및 마우스 인터루킨-18(mIL-18)을 발현하기 위해 다음 핵산 서열을 생성하였다.
1.7.1 마우스 과립구-대식세포 집락-자극 인자(mGM-CSF)
L. 락티스에서 발현될 mGM-CSF 변이체는 도 11b 및 서열번호 20에 도시되어 있다. 도 11b에서 밑줄친 아미노산은 아미노산 서열의 N-말단에 있는 추가 알라닌 잔기를 나타낸다 상기 항목 1.5.2에서 설명한 바와 같이. 합성 mGM-CSF 전구체 단백질의 각각의 아미노산 서열은 도 11c 및 서열번호 21에 도시되어 있다. 도 11c에서 밑줄친 아미노산은 락토코쿠스 단백질 Usp45의 분비 신호를 나타낸다.
1.7.2 마우스 인터루킨-12(mIL-12)
L. 락티스에서 발현될 mIL-12 변이체는 융합 단백질의 N-말단 부분을 형성하는 성숙한 인터루킨-12 서브유닛 베타 및 융합 단백질의 C-말단 부분을 형성하는 성숙 인터루킨-12 서브유닛 알파로 설계되었으며, 둘 다 상기 항목 1.6.1에서 설명한 바와 같이 펩타이드 링커에 의해 분리된다. 재조합 mIL-12 융합 단백질 전구체의 각 아미노산 서열은 도 13d 및 서열번호 27에 도시되어 있다. 도 13d에서 밑줄친 아미노산은 락토코쿠스 단백질 Usp45의 분비 신호를 나타낸다.
1.7.3 마우스 인터루킨-18(mIL-18)
L. 락티스에서 발현되는 mIL-18 변이체의 아미노산 서열은 도 10b 및 서열번호 17에 도시되어 있다. 재조합 mIL-18 전구체 단백질의 각 아미노산 서열은 도 10c에 도시되어 있다. 도 10c에서 밑줄친 아미노산은 락토코쿠스 단백질 Usp45의 분비 신호를 나타낸다.
1.7.4 발현 구성체의 생성
도 11c 및 서열번호 21에 나타낸 재조합 mGM-CSF 전구체 단백질의 아미노산 서열 및 도 13d 및 서열번호 27에 나타낸 재조합 mIL-12 융합 단백질 전구체의 아미노산 서열은 상응하는 핵산 서열로 번역되었고, 이에 의해 코돈 사용은 L. 락티스의 일반적인 코돈 사용에 적응되었다.
오페론의 설계를 위해 각각의 전구체 단백질을 암호화하는 두 유전자 각각은 번역 개시를 위한 자체 리보솜 결합 부위 및 단백질 분비를 위한 자체 신호 펩타이드가 제고오디었으며, 이는 위에서 설명한 대로 L. 락티스의 코돈 변성 및 코돈 사용을 기반으로 상이한 코돈에 의해 코딩된 동일한 신호 서열 (ssUsp45)을 사용한다.
오페론의 첫 번째 유전자(mGM-CSF)의 경우 gadC 유전자의 리보솜 결합 부위가 사용되었다. 두 번째 유전자(mIL-12)의 경우 ATP 합성효소 서브유닛 감마(atpG) 유전자의 리보솜 결합 부위 및 세 번째 유전자(mIL-18)의 경우 갈락토사이드 O-아세틸트랜스퍼라제(lacA) 유전자의 리보솜 결합 부위가 사용되었다.
합성 mGTE 구성체의 핵산 서열은 도 16a(도 16aa 내지 도 16ah에 나누어 기재) 및 서열번호 33에 도시되어 있다.
완성된 유전자 합성 생산물은 E. coli 벡터 pUC57에 클로닝된 단편으로서 BaseClear에서 얻었다.
각각의 유전자 합성 생산물을 갖는 pUC57 플라스미드를 각각 New England Biolabs(Ipswich, MA, US)로부터 입수한 제한 효소 SphI 및 BglII로 분해하였다. 각각의 유전자 합성 생산물을 함유하는 SphI 및 BglII 단편을 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 분리하고, SphI 및 BglII 절단 플라스미드 pAUC1010에 결찰시켜 pC-mGTE로 명명된 발현 플라스미드를 생성시켰다.
pC-mGTE로 명명된 발현 플라스미드의 핵산 서열은 도 16c(도 16ca 내지 도 16cl에 나누어 기재) 및 서열번호 34에 도시되어 있다. 발현 플라스미드 pC-mGTE의 개략도는 도 16b에 도시되어 있다.
실시예 2: 재조합 박테리아의 생성
실시예 2에서 수득된 발현 플라스미드를 상기 개략된 바와 같이 전기천공 수단에 의해 L. 락티스 균주에서 형질전환시켰다. 하기 실시예에서 사용한 각각의 L. 락티스 균주를 하기 표 1에 정리하였다.
추가 테스트를 위해 대략 1x1011 집락 형성 단위(CFU)/ml의 세포 밀도를 갖는 각각의 재조합 박테리아의 스톡을 20wt%의 최종 농도까지 글리세롤을 첨가하여 락토오스 및 Na-베타-글리세로포스페이트를 포함하는 IM1 또는 CDM3 배지에서 성장시킨 후 제조하였다. 스톡은 -80°C에서 보관되었다.
CDM3 배지의 조성은 Zhang, G. 및 Block, DE("Using high-efficiency nonlinear Experimental design methods for optimization of Lactococcus lactis Fermentation in chemically defined media", Biotechnol. Prog. 2009, 25( 6): 1587-1597 페이지, doi: 10.1002/btpr.277)에 기재된 ZMB3 배지에 기초하였다.
실시예 3 시험관내 Pgad 프로모터의 활성 측정
유도 연구를 위해 IM1 배지를 표 1에 표시된 각각의 L. 락티스 NZ1330 균주의 성장에 사용했다. IM1 배지는 하기에 기술된 바와 같이 다음 실험에서 보충되었다:
2wt% β-글리세로포스페이트(Sigma, 카탈로그 번호 50020-500G)
1.5wt% 소이 펩톤(BD, 카탈로그 번호 211906)
1wt% 효모 추출물(BD, 카탈로그 번호 212750)
1mM MgSO4.7H2O(Merck, 카탈로그 번호 1058860500)
0.1mM MgSO4.7H2O(Sigma, 카탈로그 번호 M-7634)
3wt% 글루코오스(Natural Spices B.V., 카탈로그 번호 ES212)
pH 제어 발효를 위해 3.5M NH3OH를 염기 첨가에 사용했다.
유도 프로토콜
세포 은행의 냉동 스톡을 사용하여 3% 글루코오스가 보충된 IM1-배지 50ml를 접종한 다음 30°C에서 16시간 동안 인큐베이션했다(전배양). 이러한 밤새 배양물을 사용하여 3% 글루코오스가 있는 IM1 배지, pH 6.5, 30°C에서 사전 조립된 100ml 발효기(1vol% 접종물)를 접종했다. 배양물을 자기 교반을 사용하여 200rpm의 연속 속도로 혼합하였다.
각 유전자의 발현은 OD600 = 0.5에서 100mM NaCl로 유도하였다. 대조군 세포는 NaCl을 추가로 첨가하지 않은 배지에서 배양하였고, 따라서 각 유전자의 발현이 유도되지 않았다.
L. 락티스 NZ1330의 생존력에 대한 이종 유전자의 염화물 유도 발현의 영향은 Pgad의 제어 하에 mCherry를 발현하는 NaCl-유도 L. 락티스 NZ1330의 성장 곡선과 유도되지 않은 대조군을 비교함으로써 평가되었다.
배양물은 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 및 6시간에서 샘플링되었다. 이 샘플은 OD600 측정 및 mCherry 활성 측정에 사용되었다. 박테리아의 성장은 유도된 박테리아 세포 또는 유도되지 않은 대조군의 600 nm에서의 광학 밀도(OD600)를 측정함으로써 모니터링했다. 각각의 성장 곡선의 비교는 그림 19a에 나와 있다.
mCherry 형광 활성은 Synergy HT 형광 분광 광도계(Biotek, Winooski, Vermont, United States)를 사용하여 측정되었다. 여기는 530 nm에서 행되고, 방출은 590 nm에서 측정되고, 120의 게인이 적용되었다.
결과는 도 19b에 나와 있다. 도 19b에서 볼 수 있는 바와 같이, 100mM NaCl 첨가에 의한 mCherry 유전자 발현의 유도는 형광의 유의한 증가를 가져왔고, 이는 L. 락티스 NZ1330에서 이종 유전자의 염화물 유도 발현에 의해 생성된 mCherry 단백질의 증가된 양에 상응한다. mCherry 단백질 발현의 증가량은 mCherry 유전자 발현 유도 후 각 박테리아의 생존력에 유의한 영향을 미치지 않았고, 이는 도 19a에서 볼 수 있다.
AUP-1602-C로 명명된 재조합 균주로부터의 FGF-2, IL-4 및 CSF-1의 염화물 유도 발현은 각각의 배양물의 14000g에서 10분 동안 +4℃에서 원심분리에 의해 수득된 1 ml 상청액의 TCA 침전물로부터 상기 지시된 프로토콜을 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 결정되었다.
상업적으로 입수 가능한 재조합 인간 CSF-1 단백질(Abcam PLC, 5ng), 재조합 인간 FGF-2 단백질(R&D Systems, 7.5ng) 및 재조합 인간 IL-4 단백질(Sigma Aldrich, 5ng)의 정제된 제제는 다음과 같이 양성 대조군 표준으로서 사용되었다. 사용된 각 1차 항체는 상기에서 표시되어 있다. 2차 항체로서 New England BioLabs(카탈로그 번호 #7074) 항토끼 IgG, HRP 연결 항체를 사용하였다.
각각의 웨스턴 블롯은 도 20a에 도시되어 있다. 도 20a에서 볼 수 있는 바와 같이, 3개의 모든 재조합 단백질은 AUP-1602-C에 의해 발현되었고 상청액으로 방출되었다.
AUP5563-C로 명명된 재조합 균주로부터의 GM-CSF의 염화물-유도된 발현은 각 배양물의 14000g에서 10분 동안 +4℃에서 원심분리에 의해 수득된 1ml 상청액의 TCA 침전물로부터 상기 지시된 프로토콜을 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 결정되었다. 상업적으로 입수 가능한 재조합 마우스 GM-CSF 단백질(Sigma Aldrich)의 정제된 제제를 양성 대조군 표준으로 사용하였다.
각각의 웨스턴 블롯은 도 20b에 도시되어 있다. 도 20b에서 볼 수 있는 바와 같이 GM-CSF는 AUP5563-C에 의해 발현되고 상층액으로 방출된다.
AUP5563-C로 명명된 재조합 균주로부터의 IL-18의 염화물-유도 발현은 각 배양물의 14000g에서 10분 동안 +4℃에서 원심분리에 의해 수득된 1ml 상청액의 TCA 침전물로부터 상기 지시된 프로토콜을 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 결정되었다. 상업적으로 입수 가능한 재조합 마우스 IL-18 단백질(R&D Systems)의 정제된 제제를 양성 대조군 표준으로 사용하였다.
각각의 웨스턴 블롯은 도 20c에 도시되어 있다. 도 20c에서 볼 수 있는 바와 같이 IL-18은 AUP5563-C에 의해 발현되어 상층액으로 방출된다.
AUP5551m-C 및 AUP5563-C로 명명된 재조합 균주로부터의 IL-12의 염화물 유도 발현은 14000g에서 10분 동안 +4℃에서 원심분리에 의해 수득된 1ml 상청액의 TCA 침전물에서 상기 지시된프로토콜을 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 결정되었다. 상업적으로 입수 가능한 재조합 마우스 IL-12 단백질(R&D Systems)의 정제된 제제를 양성 대조군 표준으로 사용하였다.
각각의 웨스턴 블롯은 도 20d에 도시되어 있다. 도 20d에서 볼 수 있는 바와 같이 IL-12는 AUP5551m-C와 AUP5563-C로 발현되어 상등액으로 방출된다.
실시예 4 생체내 Pgad 프로모터의 활성 측정
생체 내 Pgad 프로모터 시스템의 활성은 염화물 유도성 mCherry 구성체를 사용하고 종양 내(intratumoral; i.t.) 주사 후 제자리에서 형광 신호를 측정하여 평가했다.
마우스 CT26은 Mus musculus의 N-nitroso-N-methylurethane-(NNMU) 유도된 미분화 결장암 세포주이다. 이를 클로닝하여 LGC Standards GmbH에서 상업적으로 입수할 수 있는 CT26.WT(ATCC® CRL-2638™)로 명명된 세포주를 생성했다.
CT26.WT 세포는 BALB/c 마우스에 접종될 때 치명적인 종양을 유발할 수 있다.
Wang, M. et al.(1995)에 따르면, CT26 세포를 피하로 접종한 BALB/c 마우스는 103개 세포에서 80% 빈도 및 104개 세포에서 100% 빈도로 치명적인 종양을 발생시켰다. 마우스에 104개 세포를 정맥 주사했을 때 폐 전이가 발생했다. The Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)에서 상업적으로 입수한 BALB/cJ 마우스(유전자형: A/A Tyrp1b/Tyrp1b Tyrc/Tyrc, 스톡 코드 000651)를 이 연구에 사용했다.
BALB/c 마우스에 다음 절차에 따라 CT26.WT 세포를 접종했다:
0.1 ml PBS 중 1x10-5개의 종양 세포를 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양이 ~100 - 200 mm3의 평균 부피에 도달했을 때 처치를 시작했으며, 그 후 마우스를 그룹 간에 균일한 평균 종양 부피를 갖도록 이들의 처치 그룹에 할당했다.
pC-mCherry 구성체를 함유하는 L. 락티스 NZ1330의 단일 종양내 주사 후, 종양 보유 마우스는 IVIS Spectrum CT(여기 필터: 535-570 nm/방출 필터: 580-680 nm)를 사용하여 영상화되었다. 동물은 L. 락티스 NZ1330(pC-mCherry) 박테리아 또는 대조군 박테리아, 즉 mCherry 플라스미드가 없는 L. 락티스 NZ1330의 i.t. 주사 후 48시간에 이미지화되었다. 이미지 획득의 기간 및 비닝(민감도)은 존재하는 병변의 강도에 따라 다르며 Living Image 4.3.1 소프트웨어(PerkinElmer, Inc., Waltham, MS, US)를 사용하여 캡처 및 처리되었다.
결과는 도 21에 나타내며, 이는 L. lactis NZ1330(pC-mCherry) 박테리아 및 대조군 박테리아의 i.t. 주입 후 48시간 후의 형광 이미징을 나타낸다. 검은색 원은 종양의 위치를 *?*나타낸다. 더 높은 mCherry 활동은 검은색 영역으로 표시된다.
도 21에서 볼 수 있는 바와 같이, 실시예 3에서 수득되고 PgadC 프로모터 시스템의 제어 하에 mCherry 단백질을 발현하는 2x1010 CFU/ml 재조합 박테리아의 단일 50㎕ 종양내 주사는 종양 환경에서 각 박테리아의 충분한 국재화 및 생존을 위해 제공되었다.
결과는 본 발명의 재조합 박테리아가 적어도 하나의 치료 단백질을 발현 및 분비하기에 충분히 오랫동안 종양 환경에서 생존할 수 있고, 이에 의해 종양 환경의 선천성 및/또는 후천성 면역계의 세포에 영향을 주어 항- 종양 반을 달성한다.
또한, 종양 환경 내의 염화물 농도는 본 발명의 재조합 박테리아에 의해 발현될 각각의 적어도 하나의 치료 단백질의 발현을 제공하기에 충분히 높다.
실시예 5: 상처 봉합 실험
당뇨병 환자는 상처 치유가 잘 되지 않는 경향이 있으며 특히 발 궤양이 만연하다. 이러한 상처 치유 지연은 The Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, US)에서 상업적으로 입수한 자발적 당뇨병(db/db) 마우스를 포함한 당뇨병 동물에게도 적용된다.
모두 수컷 및 대략 10주령인 60마리의 당뇨병 마우스(균주 이름 BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J - 스톡 코드 00642)가 첫 번째 연구에 사용되었다.
PgadC 프로모터의 제어하에 인간 FGF-2, CSF1 및 IL-4의 조합을 각각 발현하는 박테리아를 db/db 당뇨병 마우스의 전층 절제 상처에 적용한 결과를 조합된 약동학(PK)/약력학(PD) - 효능 연구에서 실험하였다.
여기에서 단일 박테리아 세포에서 FGF-2, IL-4 및 CSF-1을 발현하는 실시예 3에서 수득한 AUP16-C로 명명된 재조합 박테리아를 평가하고 비히클 처리와 비교하였다. 적용에 사용된 각 비히클의 구성은 다음과 같이 요약된다.
비히클 1: 0.9% 식염수 중 5% 덱스트로스.
비히클 2: 5% 덱스트로스 + 0.9% 식염수 + 200mM Na 아세테이트(pH 6.5)
비히클 3: 5% 덱스트로스 + 2.5% 식염수
비히클 4: 5% 덱스트로스 + 2.5% 식염수 + 200mM Na 아세테이트(pH 6.5)
비히클 5: 10% 덱스트로스 + 0.9% 식염수
비히클 6: 10% 덱스트로스 + 0.9% 식염수 + 200mM Na 아세테이트(pH 6.5)
동물을 표 2에 따른 7가지 처치 요법 중 하나로 무작위 배정하였다.
단일 세균 세포에서 FGF-2, IL-4 및 CSF-1을 발현하는 재조합 세균을 상처가 난 날(0일) 상처에 적용하고 적용 6시간 후에 이들의 생존을 조사하였다.
상처에 적용된 박테리아에 의한 FGF-2, CSF-1 및/또는 IL-4의 생성을 결정하기 위해, 6시간 및 1, 2 및 7일 후 상처에서 상처액 샘플을 채취하였다. PK/PD 분석을 용이하게 하기 위해 6 및 24시간 및 7일 후에 전신 혈액 및 주요 장기를 수확하였다. 비히클 1만 받은 상처는 이 연구의 PK/PD 구성요소에 대한 대조군으로 사용되었다.
이들 재조합 박테리아가 상처 치유 과정에 미치는 영향을 조사하기 위해, 인간 FGF-2, CSF-1 및 IL-4를 발현하는 박테리아를 상처가 난 날(0일) 및 그 후 상처후 6일까지 매일 상처에 적용하였다. 이러한 재조합 박테리아를 받은 상처의 치유는 신선한 비히클 1에만 노출된 유사한 상처의 치유와 비교되었다.
상처 치유는 거시적 및 조직학적 수준 모두에서 연구되었다. 상처 치유는 신진피 회복 반응의 개시, 상처 수축 및 상처 봉합의 관점에서 거시적 수준에서 연구되었다.
상처 봉합 및 그 구성요소인 상처 수축 및 상처 재상피화는 상처 후 0, 4 및 7일에 촬영된 디지털 사진으로부터 결정되었다. 육아 조직 형성(깊이) 및 상처 너비(두개-미부 수축)의 조직학적 평가를 일상적인(H&E) 염색 섹션에서 수행했다. 이러한 조직학적 평가는 상처 후 7일째에 수확된 조직에 대해 수행되었다.
부작용의 발생을 모니터링하고 완전히 문서화했다.
전층 실험 상처의 생성 및 치료제의 적용
모든 마우스는 이소플루오란과 공기를 사용하여 마취되었고, 그들의 등쪽 옆구리 피부가 잘리고 깨끗하게 했다. 척추에서 약 10mm 떨어진 왼쪽 옆구리에 단일 표준화된 전층 상처(10mm x 10mm)가 생성되었다. 그런 다음 각 상처를 식별 플레이트와 보정 규칙으로 촬영했다.
그런 다음 모든 상처를 투명 필름 드레싱 Tegaderm® Film(3M Deutschland GmbH, Neuss, DE)으로 드레싱했다. 그런 다음 동물을 가온 환경(34°C)에서 회복시켰다. 이후 동물을 제지하고 표 2에 기재된 처치 중 하나를 투여했으며, 각각은 27게이지 바늘을 사용하여 Tegaderm® 필름을 통해 주사하여 적용했다.
처치는 상처후 6일까지 매일 상처에 다시 비슷하게 적용되었고, 따라서 각각의 상처는 7번의 적용을 받았다. 적용된 약제의 과도한 축적 및 과도한 상처 부위 수화에 대해 모든 상처를 면밀히 모니터링했다. 상처 후 4, 6 및 8일에 흡인에 의해 과잉 생성물/유체를 제거하였고, 여기서 4 및 6일은 재적용 전, 및 8일은 드레싱 제거 전에 제거하였다.
상처후 4일, 8일, 12일 및 16일에 모든 동물을 재마취하고, 필름 드레싱과 유리 잔해를 부드럽게 제거하고, 멸균 식염수에 적신 거즈를 사용하여 상처를 세척했다. 그런 다음 상처를 촬영하고, Bioclusive® 필름 드레싱으로 재드레싱(위와 같이)하고 동물을 따뜻한 환경(34°C)에서 회복시켰다.
상처 직후 및 이어서 4, 8, 12일에 필름 드레싱 제거 및 상처 세척 후 보정/식별 플레이트와 함께 모든 상처를 디지털 방식으로 촬영했다.
모든 동물은 상처 사진 촬영 후 20일째에 종료되었다. 영국 내무부 'Schedule 1' 준수 방법으로 종료되었다.
상처 봉합의 이미지 분석
각 상처는 손상 직후 및 이어서 4, 8, 12, 16 및 20일에 식별/보정 플레이트와 함께 디지털 방식으로 촬영되었으며 열린 상처 면적을 측정하고 0일에 대한 상처 면적 %로 표시했다.
Image Pro Plus 이미지 분석 소프트웨어(버전 4.1.0.0, Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, US)를 사용하여 각 평가 지점에서 촬영한 스케일링된 상처 이미지로부터 상처 봉합을 계산했다.
각 처치 그룹에 대한 결과는 표 3 및 도 22에 요약되어 있다.
주어진 시점에서 주어진 상처에 대해, 상처 봉합은 손상 직후(즉, 0일) 초기 상처 면적에 대해 남아 있는 상처 면적의 백분율로 표현되었다. 표 3은 모든 처치 그룹에 대한 남아 있는 상처 면적의 평균 백분율을 나타낸다.
표 3에 나타낸 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, 전달 비히클에 관계없이 AUP1602-C 박테리아를 받은 모든 그룹은 모든 시점에서 대조군(0.9% 식염수 중 5% 덱스트로스)보다 훨씬 더 빠르게 봉합되는 것을 알아냈다.
상처 수축
수축은 상처의 "몸" 내 육아 조직의 압축으로 인한 상처 가장자리의 구심 운동이다.
이 과정을 주도하는 "압축력"은 섬유아세포 계통의 세포에 있는 것으로 생각된다. 이 연구에서 % 수축은 다음과 같이 계산되었다:
모든 처치 그룹에 대한 상처 수축 평균 백분율 데이터는 표 4 및 도 23에 기재되어 있다.
표 4에서 알 수 있듯이 AUP1602-C 박테리아를 받은 모든 그룹은 전달 비히클과 상관없이 모든 시점에서 대조군(0.9% 식염수 중 5% 덱스트로스)보다 훨씬 더 빠르게 수축하는 것으로 나타났다(p≤0.007).
비당뇨병 마우스의 상처는 수축에 의해 주로 닫히는 반면, 당뇨병 마우스의 상처는 수축 능력이 현저히 감소하는데, 이는 아마도 육아 조직 형성이 빈곤하기 때문일 것이다. 결과적으로, 당뇨병 동물의 상처는 비당뇨병 동물의 상처보다 더 큰 정도로 재상피화에 의해 닫히는 경향이 있다. 수축 과정을 주도하는 힘은 피부 상처의 신진피 구획을 채우는 섬유아세포의 활동에서 파생되는 것으로 생각된다.
AUP1602-C 적용 후 강화된 수축의 관찰은 육아 조직 기능의 개선을 분명히 시사한다. 이는 차례로 형성되는 육아 조직의 양의 증가, 형성 속도의 증가 및/또는 조직의 수축 능력 증가로 설명될 수 있다.
상처 치유 개시(신진피 조직 생성)
상처는 이들의 "치유" 상태를 확립하기 위해 8일까지 매일 시각적으로 평가한 다음 격일로 평가했다. 각 상처는 "신진피 조직 생성 활성"을 나타내는지 여부, 즉 상처가 진피 치유 과정을 시작했는지 여부에 대해 점수를 매겼다. 각각의 상처는 2명의 독립적인 관찰자에 의해 평가되었고 "신진피 조직 생성 활성"을 나타내는 상처의 백분율은 각 평가 지점에서 처리 그룹 간에 비교되었다.
각 처치 그룹에 대해 매일 반응하는 상처의 수를 표 5에 나타내었다.
각 치료 그룹에 대해 1일차에 반응한 상처의 %가 도 24에 표시되어 있다. 치유 반응은 상처후 1일에 투여한 첫 날에 이어서 사용된 전달 비히클에 관계없이 AUP1602-C를 받은 대부분의 상처에서 명백했다.
상처 후 1일째에 AUP1602-C(Veh 2), AUP1602-C(Veh 3) 및 AUP1602-C(Veh 6) 처치 그룹에서 상처의 100%가 치유 반응을 시작한 것으로 나타났으며, AUP1602-C(Veh 4)의 경우 88%, AUP1602-C(Veh 1)의 경우 80%, 그리고 AUP1602-C(Veh 5)의 경우 75%이다.
이러한 처치 그룹 간에는 유의한 차이가 발견되지 않았다(Fisher Exact Test).
AUP1602-C를 받은 상처의 100%는 상처 후 2일째에 치유 반응을 나타내는 것을 알아냈다.
비히클 1만 받은 상처(0.9% 식염수 중 5% 덱스트로스)는 20일 연구 기간 동안 치유 반응을 나타내지 않았다.
평가된 모든 시점에서 비히클 대조군과 비교하여 모든 AUP1602-C 처치 그룹에서 훨씬 더 많은 비율의 상처가 반응한 것을 알아냈다(p≤0.001, Fisher Exact Test).
비히클 1 대조군(0.9% 식염수 중 5% 덱스트로스 단독), 즉 AUP 박테리아를 받은 상처의 100%와 비교하여 제형에 관계없이 AUP1602-C 박테리아를 받은 상처의 훨씬 더 많은 비율이 '신진피 조직 형성'을 시작했다. 반면, 비히클 1 단독으로 받은 상처는 반응하지 않는 것으로 나타났다.
모든 제형 비히클의 경우 AUP1602-C 처치는 적용 후 매우 초기에 상처 베드에서 반응을 시작했다(1 내지 2일 이내).
혈관신생 반응
4일 및 8일 상처 이미지를 시각적으로 평가하여 혈관신생 수준을 정량화했다. 모든 그룹에 대한 4일차 및 8일차의 혈관신생 반응에 대한 평균 점수는 표 6에 나와 있다. 점수는 2명의 독립적인 관찰자로부터 평균을 냈다.
AUP1602-C를 포함하는 모든 처치는 4일 및 8일에 관찰될 때 비히클 1 단독보다 혈관신생에 대해 유의하게 더 높은 점수를 받았다(p≤0.002).
비히클에 관계없이 AUP1602-C 박테리아를 받은 상처는 4일 및 8일 평가 시점 둘 다에서 비히클 1 대조군(0.9% 식염수 중 5% 덱스트로스 단독)과 비교하여 유의하게 증가된 혈관신생을 입증하였다.
이 실험에서 조사된 모든 박테리아 치료 요법은 비히클에 관계없이 당뇨병성 db/db 마우스에서 상처 복구를 촉진하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 널리 인정되고 인간의 상처 치유 지연에 대한 가장 검증된 동물 모델 중 하나이다.
db/db 마우스의 절개 상처는 예를 들어 Michaels et al. (2007) ("db/db mice exhibit severe wound-healing impairments compared with other murine diabetic strains in a silicone-splinted excisional wound model”, Wound Rep. Reg. 15, pages 665 to 670)에 기재된 바와 같이, 상처 봉합에서 통계적으로 유의한 지연, 감소된 육아 조직 형성, 감소된 상처층 혈관성 및 현저하게 감소된 증식을 나타낸다.
실험 결과는 본 발명의 재조합 박테리아의 적용이 인간의 상처, 특히 만성 상처의 처치에 상당한 개선을 제공한다는 것을 명백히 나타낸다.
본 발명의 재조합 박테리아의 적용은 육아 조직 형성, 증가된 상처층 혈관성 및 증식을 유도하여 심각한 상처 치유 장애를 나타내는 모델에서도 개선되고 가속화된 상처 봉합을 유도한다.
따라서, 이들 결과는 염증성, 바람직하게는 만성 염증성 피부 기능장애, 예컨대 동상, 습진, 건선, 피부염, 궤양, 상처, 홍반성 루푸스, 신경피부염 및 이들의 조합, 바람직하게는 피부염, 궤양, 상처 및 이들의 조합, 추가로 바람직하게는 궤양이 본 발명의 재조합 박테리아의 적용으로부터 이익 얻는 것을 나타낸다.
예를 들어, 바람직하게는 인간 FGF-2, 인간 IL-4 및 인간 CSF-1을 발현하는 본 발명의 재조합 박테리아의 적용 후에 각 만성 상처에서 관찰되는 상처 치유 장애가 극복되기 때문에, 만성 정맥 궤양, 만성 동맥 궤양, 만성 당뇨병성 궤양, 만성 압력 궤양과 같은 만성 상처 본 발명의 재조합 박테리아의 적용에 의해 처치될 수 있다.
실시예 6: 상처액에서 인간 FGF-2, 인간 IL-4 및 인간 CSF-1의 검출.
실시예 5에서와 같이, 모두 수컷 및 대략 10주령의 연령의 당뇨병 마우스(균주 이름 BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J - 스톡 코드 00642)가 이 후속 연구에 사용되었다.
db/db 당뇨병 마우스의 전층 절제 상처에 PgadC 프로모터의 제어하에 각각 인간 FGF2, CSF1 및 IL4의 조합을 발현하는 박테리아를 적용한 후 각각의 재조합 단백질의 검출을 조사하였다. 여기에서 단일 박테리아 세포에서 FGF-2, IL-4 및 CSF-1을 발현하는 실시예 3에서 수득한 AUP16-C로 명명된 재조합 박테리아를 비히클의 조성에 대해 평가하였다. 적용에 사용된 각 비히클의 구성은 다음과 같이 요약된다:
비히클 1: 0.9% 식염수 중 5% 덱스트로스
비히클 4: 2.5% 식염수 중 5% 덱스트로스
+ 200mM Na 아세테이트(pH 6.5)
비히클 7: 2.5% 식염수 중 5% 덱스트로스
+ 200mM Na 아세테이트
+ 50mM L-글루타민산(pH 6.0)
상처액 샘플은 제조업체의 프로토콜에 따라 0.5% SDS가 포함된 Sigma-Aldrich에서 상업적으로 입수 가능한 5kDa 차단 농축기(Vivaspin® 샘플 농축기)로 준비되었다.
상기 I.8 항목에서 설명한 바와 같이, 샘플을 SDS PAGE 겔에서 분리하고 니트로셀룰로스에 블로팅했다.
재조합 단백질의 검출은 하기 항체를 사용하여 수행하였다:
인간 FGF-2의 검출을 위해 정제된 마우스 항-인간 FGF-2 단일클론 항체(BD Transduction Laboratories, Heidelberg, DE)를 1:250의 희석도로 사용하였다. 두 번째 항체는 Bioke B.V.(Leiden, NL)에서 수득한 1:10,000 희석액의 홀스래디쉬 과산화효소(HRP)-연결된 항체 항-마우스 IgG였다.
인간 IL-4의 검출을 위해 R&D 시스템의 모노클로날 마우스 항-인간 IL-4 IgG1(클론 #3007)을 1:500의 희석도로 사용했다. 두 번째 항체는 Bioke B.V.(Leiden, NL)에서 수득한 1:10,000 희석액의 HRP 연결된 항체 항-마우스 IgG였다.
인간 CSF-1의 검출을 위해 Abcam PLC(클론 ab9693)의 인간 MCSF에 대한 토끼 폴리클로날 항체를 1:2,000의 희석도로 사용했다. 두 번째 항체는 Bioke B.V.(Leiden, NL)에서 수득한 1:2,000 희석액의 HRP 연결된 항토끼 IgG 항체였다.
상처액에서 각각의 재조합 단백질의 양은 각각의 참조 단백질과 비교하여 결정되었다.
인간 FGF-2 참조 단백질은 Sigma Aldrich로부터 입수하였고, 5mM Tris pH 7.5에 용해시켜 100㎍/㎕의 최종 농도를 제공하였다. 참조로서 총 10 mg, 3.3 ng, 1.1 ng, 0.37 ng 및 0.12 ng을 웨스턴 블롯에 대해 서로 다른 레인에 적용했습니다. 결과는 도 25a 및 25b에 나타냈다.
인간 IL-4 참조 단백질은 R&D 시스템(미국 미네소타주 미니애폴리스)에서 수득했다. 인간 IL-4를 PBS(5.8mM Na2HPO4, 4.2mM NaH2PO4, 145mM NaCl)에 용해시켜 100㎍/mL의 최종 농도를 얻었다. 참조로서 총 10 mg, 3.3 ng, 1.1 ng, 0.37 ng 및 0.12 ng을 웨스턴 블롯에 대해 서로 다른 레인에 적용했다. 결과는 도 26a 및 26b에 나타냈다.
인간 CSF-1 참조 단백질은 Abcam PLC(Cambridge, GB)로부터 수득했다. 인간 CSF-1을 멸균수에 용해시켜 최종 농도가 100㎍/mL이 되도록 하였다. 참조로서 총 10 mg, 3.3 ng, 1.1 ng, 0.37 ng 및 0.12 ng을 웨스턴 블롯에 대해 서로 다른 레인에 적용했다. 결과는 도 27a 및 27b에 나와 있습니다.
생체 내에서 PgadC 시스템을 사용하는 재조합 박테리아는 인간 FGF-2, 인간 IL-4 및 인간 CSF-1을 적절하게 발현하고 세 가지 표적 단백질 모두 상처액에서 검출될 수 있었다.
PgadC 프로모터 시스템이 있는 AUP1602-C는 β-갈락토시다아제 또는 니신과 같은 외부 유도제 및/또는 부형제의 추가 투여의 필요성 없이 각 재조합 박테리아의 국소 적용 후 생체 내 조건에서 충분한 양의 각 표적 단백질을 생성했다.
실시예 7 생체내 암종 세포 성장의 억제
성공적인 면역 요법의 전제 조건은 완전히 기능하는 면역 체계의 존재이다. 거기에서 종양의 면역원성은 면역요법에 대한 반응을 예측하는 지배적인 특징으로 간주된다.
항암제 및/또는 치료제의 특성을 평가하기 위해 개발된 다양한 마우스 모델 중에서, 공통 유전자 모델은 유전적으로 동일한 뮤린 균주의 종양이 있는 마우스입니다. 이러한 모델은 면역치료제 및/또는 항혈관신생제 및 치료 요법을 테스트하기 위한 온전한 면역 및 미세환경 시스템을 제공한다.
각각의 뮤린 모델을 생성하기 위해 사용된 배경 마우스 균주는 BALB/c 마우스에서 확립된 종양이 일반적으로 예를 들어 C57BL/6 마우스에서 확립된 종양보다 더 면역원성이 있는 종양 면역원성에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
게다가, Lechner, M.G. et al.(2013)에 의해 수행된 뮤린 고형 종양 모델에 대한 연구는 다양한 세포주 중에서 CT26, RENCA 및 4T1 종양이 유의하게 감소된 종양 성장 및 증가된 생존을 포함하여 면역 치료 요법에 대해 가장 큰 양성 반응을 보였다는 것을 입증했다.
따라서, CT26 세포를 BALB/C 마우스와 함께 사용할 세포주로서 선택하여 생체내 AUP5563-C4 투여의 효능을 초기에 평가하였다.
IL-12, IL-18 및 GM-CSF를 발현하는 AUP5563-C4의 효능 연구는 피하 뮤린 CT-26 암 모델의 처치에서 박테리아 제제 AUP5563-C4의 종양 내 투여 효과를 평가하기 위해 수행되었다.
실시예 4에서 전술한 바와 같이, CT26.WT 세포는 27 게이지 바늘로 마우스의 왼쪽 옆구리에 0.1 ml PBS 중 1 x 105개의 CT26.WT 세포를 피하 주사함으로써 BALB/c 마우스에서 치명적인 종양을 유도하는 데 사용되었다.
체중, 투여량 및 임상 상태와 관련된 모든 의견은 연구 관리 소프트웨어인 StudyDirector(StudyLog Systems, Inc., San Francisco, CA, US)를 사용하여 실시간으로 캡처되었다.
종양은 치료 동안 일주일에 3번 측정되었고 겉보기 종양 부피는 공식을 사용하여 추정되었다.
V = 0.5 x(길이 x 너비2),
여기서 V는 종양 부피, L은 종양 길이, 및 W는 종양 너비를 나타낸다. 예를 들어 Tomayko, M. 및 Reynolds, C.(1989)에 기술된 바와 같이 전자 캘리퍼스를 사용하여 종양을 2차원으로 측정한다.
마우스를 처치 그룹에 무작위로 할당했다. 종양의 평균 부피가 50~100 mm3에 도달했을 때 처치를 시작했다. 마우스는 그룹 사이에 균일한 평균 종양 부피를 갖도록 이들의 처치 그룹 1 내지 3에 할당되었다. 처치 기간은 최대 2주였다. 처치 그룹은 표 7에 요약되어 있다.
AUP5563-C4(1x108 CFU)를 2주 동안 매주 3회 종양내(i.t.) 주사한 후 효능을 평가했다.
비히클 처리 그룹은 음성 대조군 및 양성 대조군 항-CTLA-4 처리된 마우스로서 제공되었다. 모노클로날 항-마우스 CTLA-4 항체, 클론 9D9는 Bio X Cell(West Lebanon, NH, US)에서 수득했으며, 이는 면역 체계를 하향 조절하는 단백질 수용체인 마우스 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4)에 대항하는 것이다.
결과는 도 11에 요약되어 있다. 도 28a 내지 28c는 각각 (a) 식염수(음성 대조군), (b) AUP5563-C4 및 (c) 마우스 항-CTLA4(양성 대조군)의 종양내(i.t.) 투여 후 종양 성장의 평가를 보여준다.
도 28a 및 28b에서 볼 수 있는 바와 같이 AUP5563-C4(1x108 CFU)를 2주 동안 매주 3회 i.t. 주사하면 비히클 처리된 대조군 마우스와 비교하여 종양 성장이 상당히 감소했다.
AUP5563-C4(1x108 CFU)를 2주 동안 매주 3회 투여하면 양성 대조군으로서 사용된 항-m-CTLA-4 항체를 이용한 처치와 비교하여 종양 성장이 감소했다.
결과는 AUP5563-C4의 i.t. 투여는 면역관문억제제 항-CTLA4와 유사한 효능을 보였다.
식염수(음성 대조군)를 종양 내 주사한 종양은 정상적으로 성장했다.
실시예 8 마우스에서 복강내 종양의 치료
Pgad 프로모터의 제어 하에 적어도 하나의 치료 단백질을 발현하는 본 발명의 재조합 박테리아의 복강내 투여 후의 타당성 및 효능을 평가하기 위해, B16-F1 세포를 C57BL/6 마우스에 복강내 접종하고 1차 종말점으로서 생존을 측정하였다.
Fu, Q. et al.(2016)에 의해 기술된 바와 같이, C57BL/6 마우스가 높은 종양 섭취율을 갖는 B16-F1 세포의 동계 숙주이기 때문에 B16 흑색종 세포가 종양 접종을 위해 선택되었다.
게다가, Lesinski, G.B. et al(2003)에 의해 기술된 바와 같이, 이 모델은 면역 처치 요법에 반응하는 것으로 나타났다.
C57BL/6 마우스에 마우스 B16-F1 세포를 접종하는 것은 아무 처치 없이 이식 후 20일 전에 마우스를 죽일 수 있는 악성 종양의 발생을 야기한다.
마우스 B16-F1(KCLB no 80007)은 한국세포주은행에서 구입하였다. 세포를 96-웰 마이크로플레이트에 접종하고 다음 조건에서 24시간 동안 인큐베이션했다.
* 배양 조건: 37°C.
* 배양 배지: 페니실린 50U/ml, 스트렙토마이신 50μg/ml 및 소태아 혈청이 최종 농도 10% 부피로 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)(Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, US).
B16-F1 세포는 전이 및 고형 종양 형성 연구를 위해 잘 알려진 모델입니다.
본 연구에서는 Orient Bio Inc.(경기도, KR)에서 상업적으로 구입한 총 66마리의 C57BL/6N 마우스를 사용하였다.
1 x 105 B16F1 세포를 복강내(i.p.) 주사(0일)에 의해 각각의 개별 C57BL/6 마우스에 접종하였다. 비히클(0.9% 식염수 중 5% 덱스트로스) 또는 AUP2059/AUP5551-C(1:1) 처치를 0일째부터 최대 5주까지 주 3회(0일과 35일 사이에 최대 15회 투여) 복강 내(주사당 300μl) 투여했다.
동물을 표 8에 따른 6가지 처치 요법 중 하나에 무작위로 배정하였다.
처치는 실시예 3에서 각각 수득된 의약품 AUP2059(mIL18/mGM-CSF) 및 AUP5551-C(mIL12/mIL18/mIFNa2b)의 조합의 투여에 의해 수행되었다.
재조합 박테리아는 300μl 용량당 2x105, 2x106, 2x107 또는 2x108 CFU의 총량으로 CFU/mL를 기준으로 1:1 비율로 혼합되었다.
처치는 AUP2059(mIL18/mGM-CSF) 및 AUP5551-C2(mIL12/mIL18/mIFNa2b)의 1:1 조합을 Dai Han Pharm(대한, KR)에서 수득한 상업용 0.9% 식염수 용액 중 5% 덱스트로스를 i.p 주사하여 투여했다.
B16F1 세포의 접종 후 0일째에 투여를 개시하였다.
비히클 처치와 비교한 평균 생존 시간은 도 29에 요약되어 있다.
도 29에서 볼 수 있는 바와 같이, AUP2059(mIL18/mGM-CSF) 및 AUP5551-C2(mIL12/mIL18/mIFNa2b)의 조합 처치는 비히클 처리된 마우스와 비교하여 생존 시간의 유의한 증가를 유도한다.
동계 암 세포 이식은 19일까지 모든 동물이 사망한 비히클 처리 대조군에서 빠른 사망률을 유도했다.
이에 비해 AUP5551 -C2 및 AUP2059를 조합한 처치는 용량 의존적으로 생쥐의 생존을 증가시켰다. 평균 28.3일, 중앙값 28일로 생존이 70% 이상 향상됐다. 이러한 결과는 본 발명의 재조합 박테리아의 투여, 예를 들어, AUP5551-C2와 AUP2059의 조합은 복강내(IP) 종양이 있는 동계 마우스에서 종양 성장을 지연시키는 데 매우 효과적임을 나타낸다..
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SEQUENCE LISTING <110> Aurealis Pharma AG <120> Chloride-inducible prokaryotic expression system <130> 56002WO/AW/MC/ <160> 36 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 3201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid pAUC1010 <400> 1 agatctcatg acggagttta ttcttgacac aggtatggac ttatgatata ataaaacagt 60 actctgcagg catgcggtac cactagttct agagagctca agctttcttt gaaccaaaat 120 tagaaaacca aggcttgaaa cgttcaattg aaatggcaat taaacaaatt acagcacgtg 180 ttgctttgat tgatagccaa aaagcagcag ttgataaagc aattactgat attgctgaaa 240 aattgtaatt tataaataaa aatcaccttt tagaggtggt ttttttattt ataaattatt 300 cgtttgattt cgctttcgat agaacaatca aatcgtttct gagacgtttt agcgtttatt 360 tcgtttagtt atcggcataa tcgttaaaac aggcgttatc gtagcgtaaa agcccttgag 420 cgtagcgtgg ctttgcagcg aagatgttgt ctgttagatt atgaaagccg atgactgaat 480 gaaataataa gcgcagcgtc cttctatttc ggttggagga ggctcaaggg agtttgaggg 540 aatgaaattc cctcatgggt ttgattttaa aaattgcttg caattttgcc gagcggtagc 600 gctggaaaat ttttgaaaaa aatttggaat ttggaaaaaa atggggggaa 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growth factor 2 (hFGF-2) <400> 5 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 6 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant hFGF-2 variant <400> 6 Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys 20 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Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys 65 70 75 80 Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val 85 90 95 Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu 100 105 110 Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe 115 120 125 Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys 130 135 140 Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu 145 150 155 160 Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met 165 170 175 Ser Ala Lys Ser 180 <210> 8 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> mature form of human interleukin 4 (hIL-4) <400> 8 His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser 1 5 10 15 Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile 20 25 30 Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala 35 40 45 Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg 50 55 60 Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile 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Sequence <220> <223> recombinant hIL-4 precursor protein <400> 10 Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Ala His Lys Cys Asp 20 25 30 Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln 35 40 45 Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser 50 55 60 Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu 65 70 75 80 Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala 85 90 95 Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys 100 105 110 Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro 115 120 125 Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu 130 135 140 Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 145 150 155 <210> 11 <211> 418 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> mature form of human colony stimmulating factor 1 (CSF-1) <400> 11 Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu 1 5 10 15 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recombinant variant of mGM-CSF <400> 20 Ala Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His 1 5 10 15 Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val 20 25 30 Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe Ser Phe Lys 35 40 45 Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu 50 55 60 Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser 65 70 75 80 Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp Cys Glu Thr 85 90 95 Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu 100 105 110 Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Gly Gln Lys 115 120 125 <210> 21 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant mGM-CSF precursor protein <400> 21 Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Ala Ala Pro Thr Arg 20 25 30 Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His Val Glu Ala Ile Lys 35 40 45 Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val 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catggaaaat gtatgatgag ttttgagcgt 420 atagatttga tgttagaaga aatgcaagtt ccgttatctg agtacgaatt gattgtaaat 480 aattttatgc cgaatttcca agaatttttt atattagaat tggaaaaagc tgaatttagc 540 caaaatcgag ataaaataaa agagttgtat tctgaggtca aagaaacggg gaatcattta 600 ctgacggtta ccgtgaaaac gaagcttggg aatataagtc agacagaagt taaagaaatt 660 gaagcttatc tttgcaatat tgaagagtgg ggatattttg aacttacttt attttatttt 720 gtatctgatt atctcaatgt caatcaatta gaattgctgc tttttaattt tgataaaaga 780 tgtgaaaatt actgtagagt cttaaaatat agaaggagac tattgcaaat agcctataaa 840 agtgttgcga tatacgcggc taaaggagaa agaaaaaaag ccgaaaatat tttagaaatg 900 actaaaaaat atcgaactgt gggagtcgat ttatattcag aagtattaag acatcttgct 960 agagctatca ttatttttaa ttttgaaaat gcagagattg gggaagaaaa aataaattat 1020 gctcttgaga ttttggaaga atttggagga aagaagataa aagaattcta tcagaataaa 1080 atggaaaagt atttgaaaag gtcaatttag tctcttttga gctgttgctt taaagcaaca 1140 gctcaaaaga gattttcttt attctagagc atatactaga gggtgaagat aggttgtctg 1200 aagcattata acttgtcttt taaaaaattc aatcataaat ataaggaggt atgatgaaga 1260 aaaagattat tagtgcaatt ttaatgtcaa cggtcatctt aagcgctgct gccccattgt 1320 caggtgttta tgcagcaaat tttggtagat tacattgtac aacagcagta atacgtaata 1380 ttaatgatca agttttattt gttgataaaa gacaacctgt ttttgaagat atgactgata 1440 ttgatcaatc tgcatctgaa ccacaaacta gattaataat ttatatgtat aaagatagtg 1500 aagttagagg attagctgta acattaagtg ttaaagatag taaaatgagt acattatcat 1560 gtaaaaacaa aataatttca tttgaagaaa tggacccacc tgaaaatatt gatgatattc 1620 aatcagattt aattttcttt caaaaacgtg ttccaggtca taacaaaatg gaatttgaat 1680 ctagtttata tgaaggtcac tttttagctt gtcaaaaaga agatgatgct tttaaattaa 1740 ttttaaagaa aaaagatgaa aatggagata aatcagttat gtttacatta actaatttac 1800 atcaatcata ataaacgcgt attaataagg aggctaacta atgaaaaaga aaatcatttc 1860 agcgattttg atgtcaacgg ttattttaag cgcagcagct ccattatctg gagtttatgc 1920 agccccaaca cgtagtccaa taacagtaac tagaccttgg aaacatgttg aagcaattaa 1980 agaagcatta aatttattag atgatatgcc agtaacatta aatgaagaag ttgaagtagt 2040 aagtaatgaa tttagtttta aaaaattaac atgtgttcaa 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aaaatcgaga taaaataaaa gagttgtatt ctgaggtcaa agaaacgggg aatcatttac 600 tgacggttac cgtgaaaacg aagcttggga atataagtca gacagaagtt aaagaaattg 660 aagcttatct ttgcaatatt gaagagtggg gatattttga acttacttta ttttattttg 720 tatctgatta tctcaatgtc aatcaattag aattgctgct ttttaatttt gataaaagat 780 gtgaaaatta ctgtagagtc ttaaaatata gaaggagact attgcaaata gcctataaaa 840 gtgttgcgat atacgcggct aaaggagaaa gaaaaaaagc cgaaaatatt ttagaaatga 900 ctaaaaaata tcgaactgtg ggagtcgatt tatattcaga agtattaaga catcttgcta 960 gagctatcat tatttttaat tttgaaaatg cagagattgg ggaagaaaaa ataaattatg 1020 ctcttgagat tttggaagaa tttggaggaa agaagataaa agaattctat cagaataaaa 1080 tggaaaagta tttgaaaagg tcaatttagt ctcttttgag ctgttgcttt aaagcaacag 1140 ctcaaaagag attttcttta ttctagagca tatactagag ggtgaagata ggttgtctga 1200 agcattataa cttgtctttt aaaaaattca atcataaata taaggaggta tgatgaagaa 1260 aaagattatt agtgcaattt taatgtcaac ggtcatctta agcgctgctg ccccattgtc 1320 aggtgtttat gcagcaaatt ttggtagatt acattgtaca acagcagtaa tacgtaatat 1380 taatgatcaa 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tacaaagtga tacactaatt ttataaaatt atttgattgg agttttttaa 3120 atggtgattt cagaatcgaa aaaaagagtt atgatttctc tgacaaaaga gcaagataaa 3180 aaattaacag atatggcgaa acaaaaagat ttttcaaaat ctgcggttgc ggcgttagct 3240 atagaagaat atgcaagaaa ggaatcagaa caaaaaaaat aagcgaaagc tcgcgttttt 3300 agaaggatac gagttttcgc tacttgtttt tgataaggta attatatcat ggctattaaa 3360 aatactaaag ctagaaattt tggattttta ttatatcctg actcaattcc taatgattgg 3420 aaagaaaaat tagagagttt gggcgtatct atggctgtca gtcctttaca cgatatggac 3480 gaaaaaaaag ataaagatac atggaatagt agtgatgtta tacgaaatgg aaagcactat 3540 aaaaaaccac actatcacgt tatatatatt gcacgaaatc ctgtaacaat agaaagcgtt 3600 aggaacaaga ttaagcgaaa attggggaat agttcagttg ctcatgttga gatacttgat 3660 tatatcaaag gttcatatga atatttgact catgaatcaa aggacgctat tgctaagaat 3720 aaacatatat acgacaaaaa agatattttg aacattaatg attttgatat tgaccgctat 3780 ataacacttg atgaaagcca aaaaagagaa ttgaagaatt tacttttaga tatagtggat 3840 gactataatt tggtaaatac aaaagattta atggctttta ttcgccttag gggagcggag 3900 tttggaattt taaatacgaa tgatgtaaaa gatattgttt caacaaactc tagcgccttt 3960 agattatggt ttgagggcaa ttatcagtgt ggatatagag caagttatgc aaaggttctt 4020 gatgctgaaa cgggggaaat aaaatgacaa acaaagaaaa agagttattt gctgaaaatg 4080 aggaattaaa aaaagaaatt aaggacttaa aagagcgtat tgaaagatac agagaaatgg 4140 aagttgaatt aagtacaaca atagatttat tgagaggagg gattattgaa taaataaaag 4200 cccccctgac gaaagtcgac atggtcgatg tctagatgct taaactagag aaaggtttaa 4260 aagatgaaaa cttcaccaca tcgtaatact tcagctattg ttgatttaaa agcgattaga 4320 aataatattg aaaaatttaa aaagcatatt aaccctaatg cagagatttg gccagcagtg 4380 aaagcagatg cttatggtca tggctcgatt gaggtttcta aagcggtgag cgatttggta 4440 ggtggttttt gtgtatcaaa cctagatgag gcaattgaat tacgaaatca tctggtgact 4500 aaaccgattt tagttttatc cggaattgtt ccagaagatg ttgatattgc agctgccctt 4560 aatattagtc ttactgcccc gagtttagaa tggttgaaat tggttgttca agaagaagca 4620 gaactttcag atttaaaaat tcatattggt gtagattctg gtatgggtcg gattggtatt 4680 cgtgatgttg aagaagctaa tcagatgatt gaacttgctg ataaatatgc gattaatttt 4740 gaaggaattt tcactcattt tgcgactgcg gatatggctg atgaaacaaa atttaaaaat 4800 caacaggcaa gatttaacaa aattatggcc ggattatcac gtcaaccaaa atttatacac 4860 tcaactaata cggccgctgc tttatggcat aaggaacaag ttcaagctat tgaacgttta 4920 gggatttcaa tgtatggctt gaatccaagt ggtaaaactt tggaacttcc ttttgaaatt 4980 gaacccgctc tctctttagt ttctgaattg actcatataa aaaaaatagc tgcaggtgaa 5040 acggttggtt atggtgcaac ttatgagacg agtgaagaaa cttggattgg aactgttcca 5100 attggttacg ctgacgggtg gacccgtcaa atgcaaggtt tcaaagtgct tgttgatgga 5160 aagttttgtg agattgttgg tcgagtttgt atggatcaaa tgatgataaa acttgataag 5220 tcttaccctt tgggaacgaa ggtcactttg attggtcgag ataaggctaa tgaaatcacg 5280 acaacagacg ttgctgattg gcgtggaacg attaattatg aagtgctttg cttactttct 5340 gatagaatca aaagaatcta taaataaaat taaaaaaact gtatttttac agtttttttg 5400 ttttctgtta aaagcagatg ataacctcac ta 5432 <210> 24 <211> 312 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> mature form of mouse interleukin 12 (mIL-12) subunit beta <400> 24 Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Val Asp Trp 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tgttataaac 240 cttaaaaaaa taaaaataat agtttggggg atgttaaaga tgtataaaaa atatggagat 300 tgttttaaaa agttgcgaaa ccaaaagaat ttagggttat catactttag taaacttgga 360 atagaccgtt caaatatatc tagatttgaa catggaaaat gtatgatgag ttttgagcgt 420 atagatttga tgttagaaga aatgcaagtt ccgttatctg agtacgaatt gattgtaaat 480 aattttatgc cgaatttcca agaatttttt atattagaat tggaaaaagc tgaatttagc 540 caaaatcgag ataaaataaa agagttgtat tctgaggtca aagaaacggg gaatcattta 600 ctgacggtta ccgtgaaaac gaagcttggg aatataagtc agacagaagt taaagaaatt 660 gaagcttatc tttgcaatat tgaagagtgg ggatattttg aacttacttt attttatttt 720 gtatctgatt atctcaatgt caatcaatta gaattgctgc tttttaattt tgataaaaga 780 tgtgaaaatt actgtagagt cttaaaatat agaaggagac tattgcaaat agcctataaa 840 agtgttgcga tatacgcggc taaaggagaa agaaaaaaag ccgaaaatat tttagaaatg 900 actaaaaaat atcgaactgt gggagtcgat ttatattcag aagtattaag acatcttgct 960 agagctatca ttatttttaa ttttgaaaat gcagagattg gggaagaaaa aataaattat 1020 gctcttgaga ttttggaaga atttggagga aagaagataa aagaattcta tcagaataaa 1080 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acaaatatga aaattatagt acatctttct ttattcgtga cattattaaa cctgatccac 1980 ctaaaaattt acaaatgaaa cctttaaaaa atagtcaagt tgaagttagt tgggaatatc 2040 cagattcatg gtcaacacca cattcatatt tttcattaaa attctttgtt agaattcaac 2100 gtaaaaaaga aaaaatgaaa gaaactgaag aaggttgtaa ccaaaaaggt gcatttttag 2160 ttgaaaaaac tagtactgaa gttcaatgta aaggtggtaa tgtatgtgtt caagctcaag 2220 atcgatatta taattctagt tgttcaaaat gggcatgtgt tccatgtaga gttcgtagtg 2280 gaggaggtgg aagtggtgga ggtggttcag gtggtggagg ttcacgtgta attccagttt 2340 caggacctgc tcgatgttta agtcaatctc gaaatttatt aaaaactaca gatgatatgg 2400 ttaaaactgc tagagaaaaa ttaaaacatt atagttgtac agctgaagat attgatcatg 2460 aagatattac acgtgatcaa acttcaacac ttaaaacatg tttaccactt gaattacata 2520 aaaatgaatc ttgtttagct actagagaaa ctagtagtac aactagaggt tcttgtttgc 2580 ctccacaaaa aacatcatta atgatgacat tatgtttagg ttctatttat gaagatttga 2640 aaatgtatca aactgaattt caagcaatta atgctgcttt acaaaatcat aatcatcaac 2700 aaattatttt agataaaggt atgttagttg caattgatga attaatgcaa tctttaaatc 2760 ataatggtga aactcttaga caaaaaccac ctgttggaga agcagaccct tatcgagtga 2820 aaatgaaatt atgtatcttg ttgcacgctt tttcaacacg ggtagtcaca attaatcgtg 2880 taatgggata tttgagtagt gcataataaa cgcgtattaa taaggaggct aactaatgaa 2940 aaagaaaatc atttcagcga ttttgatgtc aacggttatt ttaagcgcag cagctccatt 3000 atctggagtt tatgcagcaa attttggtag attacattgt acaacagcag taatacgtaa 3060 tattaatgat caagttttat ttgttgataa aagacaacct gtttttgaag atatgactga 3120 tattgatcaa tctgcatctg aaccacaaac tagattaata atttatatgt ataaagatag 3180 tgaagttaga ggattagctg taacattaag tgttaaagat agtaaaatga gtacattatc 3240 atgtaaaaac aaaataattt catttgaaga aatggaccca cctgaaaata ttgatgatat 3300 tcaatcagat ttaattttct ttcaaaaacg tgttccaggt cataacaaaa tggaatttga 3360 atctagttta tatgaaggtc actttttagc ttgtcaaaaa gaagatgatg cttttaaatt 3420 aattttaaag aaaaaagatg aaaatggaga taaatcagtt atgtttacat taactaattt 3480 acatcaatca taataaacgc gtgaaattta ggaggtagtc caaatgaaaa aaaagattat 3540 ctcagctatt ttaatgtcta cagtgatact ttctgctgca gccccgttgt caggtgttta 3600 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gttataaacc 240 ttaaaaaaat aaaaataata gtttggggga tgttaaagat gtataaaaaa tatggagatt 300 gttttaaaaa gttgcgaaac caaaagaatt tagggttatc atactttagt aaacttggaa 360 tagaccgttc aaatatatct agatttgaac atggaaaatg tatgatgagt tttgagcgta 420 tagatttgat gttagaagaa atgcaagttc cgttatctga gtacgaattg attgtaaata 480 attttatgcc gaatttccaa gaatttttta tattagaatt ggaaaaagct gaatttagcc 540 aaaatcgaga taaaataaaa gagttgtatt ctgaggtcaa agaaacgggg aatcatttac 600 tgacggttac cgtgaaaacg aagcttggga atataagtca gacagaagtt aaagaaattg 660 aagcttatct ttgcaatatt gaagagtggg gatattttga acttacttta ttttattttg 720 tatctgatta tctcaatgtc aatcaattag aattgctgct ttttaatttt gataaaagat 780 gtgaaaatta ctgtagagtc ttaaaatata gaaggagact attgcaaata gcctataaaa 840 gtgttgcgat atacgcggct aaaggagaaa gaaaaaaagc cgaaaatatt ttagaaatga 900 ctaaaaaata tcgaactgtg ggagtcgatt tatattcaga agtattaaga catcttgcta 960 gagctatcat tatttttaat tttgaaaatg cagagattgg ggaagaaaaa ataaattatg 1020 ctcttgagat tttggaagaa tttggaggaa agaagataaa agaattctat cagaataaaa 1080 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caacttacaa agcgaaaaag ccggttcagc ttccaggtgc ttacaacgta aacatcaaac 1860 ttgatattac aagccacaat gaagattata cgattgttga acaatatgaa cgcgctgaag 1920 gccgtcattc aactggcgga atggatgagc tttacaaata ataagcatgc 1970 <210> 36 <211> 5096 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid pC-mCherry <400> 36 gatctgagcg ttgtataagc ttttatgtct ttctatatca acttttaata gaaatataaa 60 gtaatataaa tgtttttata ataaattatg tgagatatat ttttttgtcc gtactggtat 120 agatttgacg attaagtctt aaataagtta taatctcaat tgcgtaattt cttaaataca 180 gaaataacaa ctacattggt agactgatta aaaagtgtac ttgatgaact gttataaacc 240 ttaaaaaaat aaaaataata gtttggggga tgttaaagat gtataaaaaa tatggagatt 300 gttttaaaaa gttgcgaaac caaaagaatt tagggttatc atactttagt aaacttggaa 360 tagaccgttc aaatatatct agatttgaac atggaaaatg tatgatgagt tttgagcgta 420 tagatttgat gttagaagaa atgcaagttc cgttatctga gtacgaattg attgtaaata 480 attttatgcc gaatttccaa gaatttttta tattagaatt ggaaaaagct gaatttagcc 540 aaaatcgaga taaaataaaa gagttgtatt ctgaggtcaa agaaacgggg aatcatttac 600 tgacggttac cgtgaaaacg aagcttggga atataagtca gacagaagtt aaagaaattg 660 aagcttatct ttgcaatatt gaagagtggg gatattttga acttacttta ttttattttg 720 tatctgatta tctcaatgtc aatcaattag aattgctgct ttttaatttt gataaaagat 780 gtgaaaatta ctgtagagtc ttaaaatata gaaggagact attgcaaata gcctataaaa 840 gtgttgcgat atacgcggct aaaggagaaa gaaaaaaagc cgaaaatatt ttagaaatga 900 ctaaaaaata tcgaactgtg ggagtcgatt tatattcaga agtattaaga catcttgcta 960 gagctatcat tatttttaat tttgaaaatg cagagattgg ggaagaaaaa ataaattatg 1020 ctcttgagat tttggaagaa tttggaggaa agaagataaa agaattctat cagaataaaa 1080 tggaaaagta tttgaaaagg tcaatttagt ctcttttgag ctgttgcttt aaagcaacag 1140 ctcaaaagag attttcttta ttctagagca tatactagag ggtgaagata ggttgtctga 1200 agcattataa cttgtctttt aaaaaattca atcataaata taaggaggta tgatgagcaa 1260 aggagaagaa gataacatgg caatcatcaa agaatttatg cgtttcaaag ttcacatgga 1320 aggttctgta aacggacacg aatttgaaat tgaaggtgaa ggtgaaggcc gtccttatga 1380 aggaacacaa acggcaaagc tgaaagtaac aaaaggcgga ccgcttccgt ttgcatggga 1440 tatcctttct ccgcaattca tgtacggttc aaaagcatac gtgaagcatc cggctgatat 1500 tcctgattat ttgaagctgt cattccctga aggcttcaaa tgggagcgtg tgatgaactt 1560 tgaagatggc ggtgttgtta ctgttactca agattcaagc cttcaagacg gtgaatttat 1620 ttacaaagtg aagctgcgcg gaacaaactt cccatctgac ggacctgtca tgcaaaagaa 1680 aacaatgggc tgggaagcaa gctctgaacg catgtatcca gaggacggtg ctttaaaagg 1740 agaaatcaaa cagcgtttga agctgaaaga cggcggacac tatgacgctg aagtgaaaac 1800 aacttacaaa gcgaaaaagc cggttcagct tccaggtgct tacaacgtaa acatcaaact 1860 tgatattaca agccacaatg aagattatac gattgttgaa caatatgaac gcgctgaagg 1920 ccgtcattca actggcggaa tggatgagct ttacaaataa taagcatgcg gtaccactag 1980 ttctagagag ctcaagcttt ctttgaacca aaattagaaa accaaggctt gaaacgttca 2040 attgaaatgg caattaaaca aattacagca cgtgttgctt tgattgatag ccaaaaagca 2100 gcagttgata aagcaattac tgatattgct gaaaaattgt aatttataaa taaaaatcac 2160 cttttagagg tggttttttt atttataaat tattcgtttg atttcgcttt cgatagaaca 2220 atcaaatcgt ttctgagacg ttttagcgtt tatttcgttt agttatcggc ataatcgtta 2280 aaacaggcgt tatcgtagcg taaaagccct tgagcgtagc gtggctttgc agcgaagatg 2340 ttgtctgtta gattatgaaa gccgatgact gaatgaaata ataagcgcag cgtccttcta 2400 tttcggttgg aggaggctca agggagtttg agggaatgaa attccctcat gggtttgatt 2460 ttaaaaattg cttgcaattt tgccgagcgg tagcgctgga aaatttttga aaaaaatttg 2520 gaatttggaa aaaaatgggg ggaaaggaag cgaattttgc ttccgtacta cgacccccca 2580 ttaagtgccg agtgccaatt tttgtgccaa aaacgctcta tcccaactgg ctcaagggtt 2640 tgaggggttt ttcaatcgcc aacgaatcgc caacgttttc gccaacgttt tttataaatc 2700 tatatttaag tagctttatt tttgttttta tgattacaaa gtgatacact aattttataa 2760 aattatttga ttggagtttt ttaaatggtg atttcagaat cgaaaaaaag agttatgatt 2820 tctctgacaa aagagcaaga taaaaaatta acagatatgg cgaaacaaaa agatttttca 2880 aaatctgcgg ttgcggcgtt agctatagaa gaatatgcaa gaaaggaatc agaacaaaaa 2940 aaataagcga aagctcgcgt ttttagaagg atacgagttt tcgctacttg tttttgataa 3000 ggtaattata tcatggctat taaaaatact aaagctagaa attttggatt tttattatat 3060 cctgactcaa ttcctaatga ttggaaagaa aaattagaga gtttgggcgt atctatggct 3120 gtcagtcctt 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Claims (42)

  1. a) 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 재조합 박테리아를 대상체에 적용 후 대상체에서 종양의 치료 또는 예방 효과를 갖는 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 상기 이종 인자는 이종 폴리펩타이드 또는 이종 폴리펩타이드의 복합체인 것; 및
    b) 상기 염화물-유도성 프로모터의 활성을 조절하는, 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자;
    를 포함하며,
    상기 이종 폴리펩타이드는 적어도 하나의 진핵생물 폴리펩타이드, 적어도 하나의 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 이종 인자는 진핵생물 종으로부터의 폴리펩타이드 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 효소, 신경펩타이드, 항체, 이들의 전구체, 이들의 단편 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 성장 인자, 사이토카인, 및 케모카인은 과립구-대식세포-집락-자극 인자(GM-CSF), 인터페론 알파, 인터페론 알파 2(IFNA2), 인터페론 베타, 인터페론 감마, 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-17(IL-17), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-21(IL-21), 인터루킨-23(IL -23), 인터루킨-24(IL-24), 인터루킨-32(IL-32), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 박테리아.
  2. a) 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 대상체에서 종양의 치료 또는 예방 효과를 갖는 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열, 상기 이종 인자는 이종 폴리펩타이드 또는 이종 폴리펩타이드의 복합체인 것; 및
    b) 상기 염화물-유도성 프로모터의 활성을 조절하는, 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자;
    를 포함하며,
    상기 이종 폴리펩타이드는 진핵생물 폴리펩타이드, 적어도 하나의 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 이종 인자는 진핵생물 종으로부터의 폴리펩타이드 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 효소, 신경펩타이드, 항체, 이들의 전구체, 이들의 단편 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 성장 인자, 사이토카인, 케모카인은 과립구-대식세포-집락-자극 인자(GM-CSF), 인터페론 알파, 인터페론 알파 2(IFNA2), 인터페론 베타, 인터페론 감마, 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-17(IL-17), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-21(IL-21), 인터루킨-23(IL -23), 인터루킨-24(IL-24), 인터루킨-32(IL-32), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 핵산.
  3. 제 1 항에 있어서,
    원핵생물의 염화물-유도성 프로모터에 기능적으로 커플링되고 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 상기 적어도 하나의 핵산 서열 또는 상기 염화물-유도성 프로모터의 활성을 조절하는 상기 적어도 하나의 원핵생물 조절 유전자는 각각 상기 재조합 박테리아의 염색체 또는 적어도 하나의 플라스미드에 위치하는, 재조합 박테리아.
  4. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 염화물-유도성 프로모터 또는 상기 적어도 하나의 조절 유전자는 각각, 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아 종인, 재조합 박테리아.
  5. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 염화물-유도성 프로모터는 분류학적 목 락토바실레스(Lactobacillales)의 박테리아 종으로부터의 PgadC인, 재조합 박테리아.
  6. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 조절 유전자는 분류학적 목 락토바실레스의 박테리아 종으로부터의 gadR을 암호화하는, 재조합 박테리아.
  7. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 염화물-유도성 프로모터 및 상기 적어도 하나의 조절 유전자는 염화물-유도성 유전자 발현 카세트에 배열되고, 상기 염화물-유도성 프로모터는 상기 적어도 하나의 조절 유전자의 하류에 배열되고, 상기 염화물-유도성 유전자 발현 카세트는 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 전사를 조절하는, 재조합 박테리아.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 염화물-유도성 유전자 발현 카세트는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 전사를 조절하는, 재조합 박테리아.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    재조합 박테리아의 생존력에 필요한 필수 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 불활성화된 유전자를 추가로 포함하는, 재조합 박테리아.
  12. 제 11 항에 있어서,
    필수 단백질을 암호화하는 상기 유전자는 상기 유전자의 결실, 상기 유전자의 돌연변이, 상기 유전자의 RNA 간섭(RNAi) 매개 유전자 침묵, 상기 유전자의 번역 억제, 또는 이들의 조합에 의해 불활성화되는, 재조합 박테리아.
  13. 제 2 항에 있어서,
    재조합 박테리아의 생존력에 필요한 필수 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 추가로 포함하는, 재조합 핵산.
  14. 제 11 항에 있어서,
    생존력에 필요한 상기 적어도 하나의 유전자는 알라닌 라세마아제(alaR), 티미딜레이트 신타아제(thyA), 아스파라긴 신타아제(asnH), CTP 신타아제(pyrG), 트립토판 신타아제(trbBA), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 박테리아.
  15. 제 2 항 또는 제 13 항에 있어서,
    상기 재조합 핵산은 플라스미드의 형태인, 재조합 핵산.
  16. 제 1 항에 있어서,
    제 2 항의 적어도 하나의 재조합 핵산을 포함하는, 재조합 박테리아.
  17. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는 비병원성 박테리아인, 재조합 박테리아.
  18. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는 락트산 박테리아인, 재조합 박테리아.
  19. 삭제
  20. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    의약에 사용하기 위한, 재조합 박테리아.
  21. 삭제
  22. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    종양의 처치에 사용하기 위한, 재조합 박테리아.
  23. 제 1 항 또는 제 3 항의 재조합 박테리아 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 종양의 처치에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  24. a) 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터의 조절 하에 적어도 하나의 이종 인자를 발현할 수 있는, 제 1 항 또는 제 3 항의 재조합 박테리아; 및
    b) 염화물 이온을 포함하는 적어도 하나의 유도제;
    를 포함하는, 의약에 사용하기 위한 키트.
  25. a) 원핵생물의 염화물-유도성 프로모터의 제어 하에 하나 이상의 이종 인자를 발현할 수 있는, 제 1 항 또는 제 3 항의 재조합 박테리아; 및
    b) 상기 재조합 박테리아를 제공하기 위한 적어도 하나의 지지체 또는 용기를 포함하는 의료 장치.
  26. 제 23 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는 용해되거나, 동결되거나, 또는 건조된, 종양의 처치에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 제 24 항에 있어서,
    상기 키트는 종양의 처치에서 개별, 순차적 또는 동시 사용을 위한 조합 제제로서 제공되는 키트.
  30. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 염화물-유도성 프로모터는 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)의 박테리아 종으로부터의 PgadC인, 재조합 박테리아.
  31. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 조절 유전자는 락토코쿠스 락티스의 박테리아 종으로부터의 gadR을 암호화하는, 재조합 박테리아.
  32. 제 2 항에 있어서,
    상기 염화물-유도성 프로모터 및 상기 적어도 하나의 조절 유전자는 염화물-유도성 유전자 발현 카세트에 배열되고, 상기 염화물-유도성 프로모터는 상기 적어도 하나의 조절 유전자의 하류에 배열되고, 상기 염화물-유도성 유전자 발현 카세트는 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 전사를 조절하며,
    상기 염화물-유도성 유전자 발현 카세트는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 적어도 하나의 이종 인자를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열의 전사를 조절하는, 재조합 핵산.
  33. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 인자는 포유동물 종으로부터의 폴리펩타이드 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 효소, 신경펩타이드, 항체, 이들의 전구체, 이들의 단편 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 박테리아.
  34. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 인자는 인간으로부터의 폴리펩타이드 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 효소, 신경펩타이드, 항체, 이들의 전구체, 이들의 단편 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 박테리아.
  35. 삭제
  36. 제 13 항에 있어서,
    생존력에 필요한 상기 적어도 하나의 유전자는 알라닌 라세마아제(alaR), 티미딜레이트 신타아제(thyA), 아스파라긴 신타아제(asnH), CTP 신타아제(pyrG), 트립토판 신타아제(trbBA), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 핵산.
  37. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는 락토바실러스 또는 락토코쿠스 종인, 재조합 박테리아.
  38. 제 37 항에 있어서,
    상기 락토코쿠스 종은 락토코쿠스 락티스인 재조합 박테리아.
  39. 제 37 항에 있어서,
    상기 락토코쿠스 종은 락토코쿠스 락티스 아종 크레모리스인 재조합 박테리아.
  40. 제 23 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는 동결 건조 또는 분무 건조된, 종양의 처치에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  41. 제 24 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는 용해되거나, 동결되거나, 또는 건조된, 키트.
  42. 제 25 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는 용해되거나, 동결되거나, 또는 건조된, 의료 장치.
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