CN102740867A - 用于预防和治疗炎症性肠病(ibd)和肠易激综合征(ibs)的重组益生菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及炎症性肠病(IBD)和/或肠易激综合征(IBS)的一般治疗领域。因此，本发明涉及选自以下的分子：trappin-2蛋白质或trappin-2蛋白质的活性部分、WAP家族蛋白质成员或WAP家族蛋白质成员的活性部分，或丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白质成员或丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白质成员的活性部分，所述分子是用于治疗肠易激综合征(IBS)。本发明还涉及重组食品级细菌，其包含选自以下的基因：编码trappin-2蛋白质或trappin-2蛋白质的活性部分的基因、编码WAP家族蛋白质成员或WAP家族蛋白质成员的活性部分的基因，或编码丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白质成员或丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白质成员的活性部分的基因。

Description

用于预防和治疗炎症性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的重组益生菌
发明领域：
本发明涉及以下疾病的一般治疗领域：如炎症性肠病(IBD)的消化道炎症性疾病、如囊性纤维化和支气管肺慢性阻塞性疾病(BPCO)的肺部疾病、炎症性关节疾病(诸如骨关节炎)、炎症性泌尿生殖系统疾病，以及如肠易激综合征(IBS)的与慢性内脏疼痛症状相关的疾病。
发明背景：
治疗如IBD的慢性炎症性病症是重大的医学挑战，因为这些病症折磨着数百万人。其在发达国家中的发病率最高并且在过去三十年内不断增加。目前的IBD疗法强烈需要得到改进，高比例(20与40%之间)的患者对于任何形式的治疗都有抗药性，严重的副作用和较高的成本也与目前可利用的药物(糖皮质激素和单克隆抗体疗法)相关。另外，涉及IBD发病的机制尚未完全得到了解，并且用于IBD的更有效治疗或甚至治愈方法的开发取决于对炎症性反应进行调控的更好了解。一些研究已经证明蛋白酶在维持胃肠道(GIT)的慢性炎症性反应中的关键作用[Vergnolle,N.2005；Cenac,N.等,2007;Hyun,E.等,2008；Vergnolle,N.等,2004]。因此，内源性蛋白酶抑制剂对于控制肠道炎症性反应似乎是关键性的。
基于这方面的知识，本发明人提出：递送那些蛋白酶抑制剂至GIT中可用于治疗IBD和/或肠易激综合征(IBS)。
使用益生菌来治疗IBD现在已被提出了好几年，并且不同的研究已经报导经过单独或组合测试的这些益生菌的一些有益效果[Hedin,C.等,2007；Sartor,R.B.2004]。在粘膜层面，使用重组非病原性食品级细菌作为消炎分子的递送载体的策略已经用于递送消炎细胞因子IL-10[Steidler,L.等,2000]。I期临床试验已经证明，口服给予的表达IL-10细胞因子的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株是安全的，因为在那些患者中未发生严重的副作用[Braat,H.等,2006]。然而，在用IL-10重组乳酸乳球菌治疗的克罗恩氏病(Crohn’s disease)患者中疾病活性的降低在某种程度上是有限的。这种有限的效力可由以下事实来解释：报导总是指出IL-10递送对于结肠炎的发病仅具有零散的有益效果[Braat,H.等,2003]。因此，对待由乳酸乳球菌递送的消炎分子的性质的较好选择可大大改善治疗效力。在本文中，本发明人提出使用食品级细菌来表达抗蛋白酶trappin-2并将其递送至消化道中。
发明概述：
本发明是基于以下发现：与现有治疗相比，使用食品级细菌来递送如trappin-2的消炎分子可提供安全性和更好的效率。因此，本发明涉及选自以下的分子：trappin-2蛋白质或trappin-2蛋白质的活性部分、WAP家族蛋白质成员或WAP家族蛋白质成员的活性部分，或丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)家族蛋白质成员或丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白质成员的活性部分，所述分子是用于治疗肠易激综合征(IBS)。
本发明的另一目标涉及重组食品级细菌，其包含选自以下的基因：编码trappin-2蛋白质或trappin-2蛋白质的活性部分的基因、编码WAP家族蛋白质成员或WAP家族蛋白质成员的活性部分的基因，或编码丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白质成员或丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白质成员的活性部分的基因。
本发明的另一个方面涉及包含如上文定义的重组食品级细菌的治疗组合物。
发明详述：
定义：
如本文所使用，WAP家族的术语“trappin-2”(又称为抑弹性酶蛋白、抑弹性酶蛋白特异性抑制剂(ESI)或SKALP，即皮肤抗白细胞蛋白酶)表示在呼吸道中分泌的HNE(人中性粒细胞弹性蛋白酶)和蛋白酶3的低分子量(9.9kDa)抑制剂[Sallenave等，1991和1993]。trappin-2与(A1-Pi)和SLPI一起构成肺中的‘抗弹性蛋白酶防护’的完整部分。人trappin-2基因的示例性序列以入藏登记号S58717寄存在数据库Genbank中。
如本文所使用，用于“乳清酸性蛋白质”的术语“WAP家族”表示含有trappin-2和ps20的蛋白质家族。
如本文所使用，用于丝氨酸蛋白酶抑制剂的术语“丝氨酸蛋白酶抑制剂家族”表示在氨基酸序列和抑制机制方面相似，但是在其针对蛋白分解酶的特异性方面不同的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。这个家族包括α1-抗胰蛋白酶(A1-Pi)、血管紧缩素原、卵白蛋白、抗纤溶酶、α1-抗胰凝乳蛋白酶、甲状腺素结合蛋白、补体1灭活剂、抗凝血酶III、肝素辅因子II、纤溶酶原灭活剂、基因Y蛋白质、胎盘纤溶酶原激活物抑制剂，和大麦Z蛋白质。这个家族不包括分泌白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)[Thierry Moreau等,2008]。丝氨酸蛋白酶抑制因子家族的一些成员可为丝氨酸内肽酶的底物而不是抑制剂，并且一些丝氨酸蛋白酶抑制剂在植物中出现，其功能不详。
如本文所使用，术语“α1-抗胰蛋白酶蛋白质”表示糖蛋白。α1-抗胰蛋白酶也称为α-1蛋白酶抑制剂(A1PI)，因为其为抑制多种蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)。其保护组织免受炎症细胞的酶，尤其弹性蛋白酶的影响。人α1-抗胰蛋白酶基因的示例性序列以入藏登记号NC008290寄存在数据库Genbank中。
如本文所使用，术语“活性部分”表示具有完全蛋白质的活性的蛋白质部分”。例如，trappin-2蛋白质的活性部分表示保存了抑制HNE能力的蛋白质部分，或丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白质的活性部分表示保存了抑制能力的蛋白质部分。
如本文所使用，术语“食品级细菌”表示广泛用于发酵食品中并且具有分别由美国和欧洲共同体的GRAS(通常公认为安全)和QPS(安全资格认定)状态所确认的完善安全特性细菌。此类细菌可安全地用于功能食品或食品添加剂中，并且声称涉及维持良好健康状态和安康或预防疾病。
如本文所使用，术语“益生菌”表示摄入足够数量的活细菌时，可对人的健康发挥有益效果的细菌。其现在广泛被用作食品添加剂，以达到其促进健康的效果。大多数益生菌为乳酸菌(LAB)，其中乳酸杆菌(Lactobacillus)属和双歧杆菌(Bifidobacterium)属的菌株为最广泛使用的益生菌。
如本文所使用，术语“thyA基因”表示编码胸苷酸合成酶的基因，所述胸苷酸合成酶是产生单磷酸胸苷(dTMP)的酶，该单磷酸胸苷随后被磷酸化为用于DNA合成和修复中的三磷酸胸苷。
如本文所使用，术语“肠易激综合征(IBS)”是在胃肠道中造成不适的各种病理学病状的术语。其为一种机能性肠障碍，特征是在不存在任何器官原因的情况下出现慢性腹部疼痛、不适、肿胀和排便习惯变化。
如本文所使用，术语“炎症性肠病(IBD)”是一组结肠和小肠炎症性疾病。IBD的主要类型是克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和憩室炎。
蛋白质和其用途：
本发明的第一目标涉及选自以下的分子：trappin-2蛋白质或trappin-2蛋白质的活性部分、WAP家族蛋白质成员或WAP家族蛋白质成员的活性部分的分子，或选自丝氨酸蛋白酶抑制剂家族或丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的活性部分，所述分子是用于治疗肠易激综合征(IBS)。
在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员是α1-抗胰蛋白酶蛋白质。
在一个优选实施方案中，所述蛋白质部分包含相对所述蛋白质的至少75%一致性、甚至更优选至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的一致性。
通常情况下，所述蛋白质或其蛋白质部分可与消炎剂组合使用。
本发明蛋白质或其蛋白质部分可通过在本领域中本身已知的任何技术来产生，所述技术例如而不限于单独或组合的任何化学、生物、基因或酶促技术。
在知道所需序列的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可通过用于产生蛋白质的标准技术来容易地产生所述蛋白质或蛋白质部分的相关部分。例如，技术人员可使用众所周知的固相方法，优选使用可商购的蛋白质合成仪器(如由Applied Biosystems,Foster City,California制造的仪器)并且遵照制造商说明书来合成。
或者，本发明蛋白质或其蛋白质部分可通过如现在本领域中众所周知的重组DNA技术来合成。例如，这些片段可在将编码所需多肽的DNA序列并入表达载体中并且将此类载体引入要表达所需蛋白质或蛋白质部分的合适真核或原核宿主中之后，以DNA表达产物的形式来获得，所述蛋白质或蛋白质部分可稍后使用众所周知的技术从所述宿主中。
本发明蛋白质或其蛋白质部分可以(例如，纯化)形式使用或含于载体，例如膜或脂质囊泡(例如脂质体)中。
食品级细菌
本发明的另一目标涉及重组食品级细菌，其包含选自以下的基因：编码trappin-2蛋白质或trappin-2蛋白质的活性部分的基因、编码WAP家族蛋白质成员或WAP家族蛋白质成员的活性部分的基因，或编码丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白质成员或丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白质成员的活性部分的基因。
在一个优选实施方案中，根据本发明的食品级细菌是益生菌。
在一个优选实施方案中，根据本发明的益生菌包含有缺陷的营养缺陷型基因，由此，所述细菌的存活严格依赖于特定化合物的存在。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的营养缺陷型基因是编码胸苷酸合成酶的thyA基因。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的营养缺陷型基因是丙氨酸消旋酶(alr)基因(Bron等，2002)。
根据本发明的益生菌的thyA基因的灭活使得其对于胃肠道(GIT)中不存在的胸苷呈营养缺陷型。此重组thyA突变体能够递送其目标蛋白质但是不能存活并因此继续留存在GIT中，从而限制其播散并且向重组细菌赋予所要求的生物防范作用。可用alr基因获得相似的结果。
在另一个优选实施方案中，将选定的基因插入thyA基因中。
优选地，重组基因位于染色体中的thyA基因座位中，因而通过基因破坏来灭活。如本文所使用，术语“基因破坏”表示通过插入DNA片段来破坏、通过缺失基因或其部分来破坏，以及由另一DNA片段替换基因或其部分来破坏，并且通过重组DNA技术，而非通过自发突变来诱导破坏。优选地，破坏是由另一功能基因替换基因或其部分。优选地，缺陷型重组thyA基因是非回复突变基因。
如本文所使用，术语“非回复突变体”表示回复频率低于10-8，优选回复频率低于10-10，甚至更优选，回复频率低于10-12，甚至更优选，回复频率低于10-14，最优选地，回复频率是使用本领域技术人员已知的常规方法不可检测的。
在一个优选实施方案中，根据本发明的基因编码α1-抗胰蛋白酶蛋白质，或丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的另一个成员，如抗纤溶酶、α1-抗胰凝乳蛋白酶。
在一个优选实施方案中，根据本发明的食品级细菌菌株是乳酸乳球菌菌株或干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)菌株或乳酸乳球菌htrA菌株[Poquet等，2000]或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)菌株的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株。
在一个优选实施方案中，根据本发明的食品级细菌菌株是干酪乳杆菌菌株。
在最优选实施方案中，根据本发明的基因编码trappin-2。
事实上，本发明人证明：trappin-2天然地表达于人结肠粘膜中，并且主要表达于肠道上皮细胞中(Motta等)，而与健康受试者相比，患有IBD的患者显示组织中的trappin-2下调(Motta等)。
此外，本发明人证明：在结肠炎的不同模型中，trappin-2过度表达具有针对结肠炎发病的保护作用(在组成型表达和瞬间表达中)。此外，结肠炎模型中的trappin-2过度表达能够完全抑制与结肠炎相关的弹性蛋白酶和胰蛋白酶样活性的增加。
最后，小鼠中的trappin-2过度表达还能够显著抑制结肠炎诱导的促炎症性细胞因子和趋化因子(IL-6、Il-17A、TNF-α、干扰素-γ、MCP-1和KC)的增加。
所有这些结果有利于递送trappin-2和来自WAP或丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的其它蛋白酶，所述其它蛋白酶具有用以治疗IBD的相似性质。如以下结果显示，食品级细菌是递送此类型的蛋白酶至消化道的最安全和有效的方法。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的基因编码α1-抗胰蛋白酶蛋白质。
事实上，α1-抗胰蛋白酶蛋白质抑制与IBD(如结肠炎)相关的胰蛋白酶样活性，因而具有与trappin-2相似的效果。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的食品级细菌菌株是干酪乳杆菌菌株，其包含编码trappin-2的基因。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的食品级细菌菌株是干酪乳杆菌菌株，其包含插入thyA基因中的编码trappin-2的基因。
在另一个实施方案中，根据本发明的食品级细菌适用治疗肠道炎症性病状。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的食品级细菌适用于治疗IBD和/或IBS。
炎症性病状可选自IBD、IBS、炎症性肺病、炎症性关节疾病或炎症性泌尿生殖系统疾病。
组合物
本发明的另一目标涉及包含根据本发明的食品级细菌的治疗组合物。
在一个优选实施方案中，根据本发明的治疗组合物欲粘膜施用于受试者。
在另一优选施用中，根据本发明的治疗组合物欲口部施用于受试者。例如，组合物可呈悬浮液、片剂、药丸、胶囊、颗粒或粉末形式。
在液体治疗组合物中，根据本发明的食品级细菌可自由并不受固定地存在于悬浮液中。悬浮液具有确保益生菌的生理条件的组成，以使得尤其是细胞内的渗透压力不会导致溶菌。
在固体治疗组合物中，根据本发明的食品级细菌可以自由、优选冻干形式，或以固定形式存在。例如，根据本发明的食品级细菌可封闭于为细胞提供保护的凝胶基质中。
欲进行口部施用并且含有固定或非固定形式的根据本发明的食品级细菌的固体治疗组合物优选具备对于胃液有抵抗力的包衣。因而，确保治疗组合物中含有的食品级细菌可不受阻碍并且不被损坏地通过胃并且食品级细菌的释放首先在上肠道区域中发生。
在本发明的另一个方面，治疗组合物含有足够菌落形成单位(CFU)的能够形成根据本发明的蛋白质的食品级细菌，以使得根据患者通过来多次施用治疗组合物，从而治愈IBD或IBS状态，停止IBD或IBS进展，且/或可减轻IBD或IBS症状。根据本发明，尤其提供治疗组合物，其含有1×108-1×1011，优选1×109-1×1010CFU的根据本发明的食品级细菌。
在本发明的另一个优选实施方案中，含有食品级细菌的治疗组合物在直肠内施用。直肠施用优选以栓剂、灌肠剂或发泡体形式来进行。直肠内施用尤其适合于影响下肠道部分(例如结肠)的慢性炎症性肠道疾病。鼻内施用也适合于治疗慢性肺病，例如囊性纤维化和BPCO。
在另一个方面，本发明涉及包含根据本发明的食品级细菌的食品组合物。
在一个优选实施方案中，根据本发明的食品组合物欲口部施用于受试者。例如，组合物可呈悬浮液、片剂、药丸、胶囊、颗粒、粉末或乳酪形式。
在一个优选实施方案中，食品组合物可含有1×108-1×1011，优选1×109-1×1010CFU的根据本发明的食品级细菌。
在一个优选实施方案中，食品组合物可以1010个细菌的每日剂量施用于患者。
本发明进一步通过以下附图和实施例来说明。然而，这些实施例和附图无论如何不应理解为对本发明范围的限制。
附图：
图1：来自小鼠的结肠组织的重量差异(A)、肉眼观察的得分(B)、壁厚(C)和髓过氧物酶(MPO)活性(D)，所述小鼠饮用了其饮用瓶中的水或水+DSS(3%)，并且每天接受以野生型乳酸乳球菌，或表达抑弹性酶蛋白或IL-10的重组乳酸乳球菌菌株的口服治疗7天。记录与接受DSS的PBS治疗的小鼠相比的显著差异：*为p<0.05，**为p<0.01并且***为p<0.005。记录与野生型乳酸乳球菌治疗的小鼠相比的显著差异：ψ为p<0.05，ψψ为p<0.01并且ψψψ为p<0.05。记录PBS+DSS组与PBS-水组之间的显著差异：#为p<0.05，##为p<0.01并且###为p<0.005。记录与IL-10重组乳酸乳球菌组相比的显著差异：ω为p<0.05，ωω为p<0.01并且ωωω为p<0.005。
图2：来自小鼠的结肠腔洗涤液的胰蛋白酶样活性(A)和弹性蛋白酶活性(B)，所述小鼠饮用了其饮用瓶中的水或水+DSS(3%)，并且每天接受以野生型乳酸乳球菌，或表达抑弹性酶蛋白或IL-10的重组乳酸乳球菌菌株的口服治疗7天ε是指不可检测到的水平。记录与接受DSS的PBS治疗的小鼠相比的显著差异：*为p<0.05，**为p<0.01。记录与野生型乳酸乳球菌治疗小鼠相比的显著差异：ψ为p<0.05。记录PBS+DSS组与PBS-水组之间的显著差异：#为p<0.05，##为p<0.01并且###为p<0.005。
图3：来自小鼠的结肠组织的肉眼观察的得分(A)、壁厚(B)，和髓过氧物酶(MPO)活性(C)，所述小鼠饮用了其饮用瓶中的水或水+DSS(3%)，并且每天接受以野生型干酪乳杆菌，或表达抑弹性酶蛋白的重组干酪乳杆菌菌株的口服治疗7天。记录与接受DSS的PBS治疗的小鼠相比的显著差异：*为p<0.05，**为p<0.01并且***为p<0.005。记录与野生型干酪乳杆菌治疗小鼠相比的显著差异：ψ为p<0.05，ψψ为p<0.01并且ψψψ为p<0.005。
图4：来自小鼠的结肠腔洗涤液的胰蛋白酶样活性(A)和弹性蛋白酶活性(B)，所述小鼠饮用了其饮用瓶中的水或水+DSS(3%)，并且每天接受以野生型干酪乳杆菌，或表达抑弹性酶蛋白的重组干酪乳杆菌菌株的口服治疗7天。记录与接受DSS的PBS治疗小鼠相比的显著差异：*为p<0.05，并且记录与野生型干酪乳杆菌治疗小鼠相比的显著差异：ψ为p<0.05并且ψψ为p<0.01。
图5：来自小鼠的结肠组织中检测到的RANTES(A)、INFα(B)、IL-6(C)、MCP-1(D)、KC(E)、INFγ(F)和IL-17(G)的蛋白质浓度，所述小鼠饮用了其饮用瓶中获得水或水+DSS(3%)，并且每天接受以野生型干酪乳杆菌，或表达抑弹性酶蛋白的重组干酪乳杆菌经口治疗7天。ε是指不可检测到的水平。记录与接受DSS的PBS治疗小鼠相比的显著差异：*为p<0.05，**为p<0.01并且***为p<0.005。ψ显示：与用野生型乳酸乳球菌治疗小鼠相比的显著差异为p<0.05。记录PBS+DSS组与PBS-水组之间的显著差异：#为p<0.05，##为p<0.01并且###为p<0.005。
图6：来自小鼠的结肠组织中检测到的IL-2(A)、IL-4(B)、IL-5(C)、IL-10(D)和IL-13(E)的蛋白质浓度，所述小鼠饮用了其饮用瓶中的水或水+DSS(10%)，并且每天接受以野生型干酪乳杆菌，或表达抑弹性酶蛋白的重组干酪乳杆菌的口服治疗7天。记录与接受DSS的PBS治疗小鼠相比的显著差异：*为p<0.05并且**为p<0.01。记录与野生型干酪乳杆菌治疗小鼠相比的显著差异：ψ为p<0.05并且ψψ为p<0.01。
图7：小鼠的疼痛行为总数(A)或腹部收缩和舔舐、伸展和挤压行为的次数(B)，所述小鼠结肠内接受了PBS(n=5)，或芥子油(乙醇70%中的0.01%(v/v))，并且在先前7天中接受了口服管饲的PBS(n=8)、野生型乳酸乳球菌(n=8)，或表达抑弹性酶蛋白(n=8)或IL-10(n=5)的重组乳酸乳球菌的预治疗。记录与接受芥子油的PBS治疗的小鼠相比的显著差异：*为p<0.05，**为p<0.01并且***p<0.005。ψ显示：与用野生型乳酸乳球菌治疗小鼠相比的显著差异为p<0.05。
图8：由乳酸乳球菌wt和htrA菌株分泌的抑弹性酶蛋白。以抗抑弹性酶蛋白抗体对于野生型(wt)或htrA(htrA)菌株的细胞(C)和上清液(S)提取物执行的蛋白质印迹实验。通过乳酸链球菌素从wt或htrA菌株的指数期培养物来诱导抑弹性酶蛋白产生(两种菌株都含有可通过添加乳酸链球菌素来诱导抑弹性酶蛋白基因表达的表达载体)。
图9：乳酸乳球菌wt和htrA突变菌株在DSS 5%诱导的结肠炎模型中的保护效果。评估了用水(阴性对照)或用DSS 5%治疗的10只小鼠的不同组中的肉眼观察的(A)、组织损伤(B)和MPO活性(C)。两个第一对照组i)用水治疗并且口部馈入PBS(阴性对照组)并且ii)用DSS5%治疗并且口部馈入PBS(阳性对照组)。其它组全部用DSS 5%和wt菌株(WT)、表达抑弹性酶蛋白的wt菌株(抑弹性酶蛋白)和表达抑弹性酶蛋白的htrA突变菌株(抑弹性酶蛋白+)来治疗。
图10：干酪乳球菌wt菌株和表达SOD，表达抑弹性酶蛋白和表达IL-10的干酪乳球菌菌株在DSS 5%诱导结肠炎模型中的保护效果。评估了用水(阴性对照)或用DSS 5%治疗的10只小鼠的不同组中的肉眼观察的(A)、组织损伤(B)和MPO活性(C)。两个第一对照组i)用水治疗并且口部馈入PBS(阴性对照组)并且ii)用DSS 5%治疗并且口部馈入PBS(阳性对照组)。其它组全部用DSS 5%和干酪乳球菌wt菌株(WT)或表达过氧化物歧化酶(SOD)、抑弹性酶蛋白(抑弹性酶蛋白)或IL-10的干酪乳球菌菌株来治疗。*和**指示数据与通过干酪乳球菌wt获得的数据显著不同(P<0.05)。
图11：来自小鼠的结肠组织中的髓过氧物酶(MPO)活性(D)。测量来自小鼠的结肠组织中的髓过氧物酶(MPO)活性(D)，所述小鼠饮用了其饮用瓶中的水或水+DSS(3%)，并且每天接受以i)WT乳酸乳球菌、重组乳酸乳球菌和表达抑弹性酶蛋白或IL-10的乳酸乳球菌htrA菌株和以ii)干酪乳球菌wt菌株和表达SOD，表达抑弹性酶蛋白和表达IL-10的干酪乳球菌菌株的口服治疗7天。*和**指示数据与通过干酪乳球菌wt获得的数据显著不同(P<0.05)。
图12：抑弹性酶蛋白基因在EDTA可诱导启动子的控制下得以表达的乳酸乳球菌WT菌株中的抑弹性酶蛋白释放[Llull D和PoquetI.2004；EP 1 537 215和FR 98 16462]。表达抑弹性酶蛋白的乳酸乳球菌WT菌株在存在(+)或不存在(-)EDTA、螯合剂的情况下生长过夜(在此建构物中，抑弹性酶蛋白基因表达由可通过添加EDTA来诱导的乳球菌启动子来控制：在染色体上，此启动子控制编码对于锌具有特异性的ABC吸收系统的基因的表达，并且在可通过添加EDTA来模拟的锌饥饿条件来进行遏制)。然后，将蛋白质提取并且在细胞组分(C)与上清液组分(S)之间进行分级并且使用抗抑弹性酶蛋白抗体来进行蛋白质印迹实验。
实施例：
材料和方法
重组乳酸细菌(乳酸乳球菌和干酪乳杆菌)中的抑弹性酶蛋白的克隆
抑弹性酶蛋白在乳酸细菌中的克隆和表达
编码抑弹性酶蛋白的基因从质粒DK6-抑弹性酶蛋白(14)PCR扩增。所用的引物序列是：5’正向抑弹性酶蛋白(CCAATGCATCAGCAGCTGTCACGGGAGTTCC)(S E Q I D N°1)和3’反向抑弹性酶蛋白(GGACTAGTCCTCACTGGGGAACGAAACA GGCC)(SEQIDN°2)。引物经过设计以消除编码信号肽(SP)的抑弹性酶蛋白区域的第一密码子并且替换为Usp45蛋白质(PSusp45)的SP，所述Usp45蛋白质主要从乳酸乳球菌分泌。为了实现这一目标，将PCR产物消化、纯化，并且在pSEC，即乳酸乳球菌分泌载体中克隆。在所得到的质粒pSEC:抑弹性酶蛋白中，抑弹性酶蛋白与编码RBS和PSusp45的DNA片段同框融合。盒(cassette)的表达由活性取决于所用乳酸链球菌素浓度的可诱导启动子PnisA来控制。然后，将此质粒引入乳酸乳球菌菌株中，所述菌株具有乳酸链球菌素调控基因nisR和nisK(乳酸乳球菌NZ9000)，从而产生重组菌株：NZ(pSEC:抑弹性酶蛋白)。所用工具(复制子、启动子、RBS和SP)在如干酪乳杆菌和植物乳杆菌的乳杆菌菌株中发挥功能。选择这两种菌株(各自在其染色体上具有基因nisRK)是因为其在消化道中的持久性能力(多达4天，与乳酸乳球菌中的24至48hr形成对比。另外，我们最近已证明干酪乳杆菌BL23菌株在DSS诱导的结肠炎模型中具有消炎性质[Rochat等，2007]。因此，我们对具有弱持久性(乳酸乳球菌)和强持久性(植物乳杆菌)的非免疫调节性菌株以及强持久性(干酪乳杆菌)的免疫调节性菌株进行处理，使得我们可评价将所用菌株的内在消炎效果与过度表达分子的消炎效果组合的可行性。
为了诱导PnisA启动子，将乳酸乳球菌重组菌株培养至OD600=～04-0.6并且然后用10ng/ml的乳酸链球菌素(Sigma)在1h期间进行诱导。然后如下测试此诱导的功能性：将NZ(pSEC:抑弹性酶蛋白)培养物(最终OD600=~1)分离成球团和上清液并且抑弹性酶蛋白含量通过ELISA和/或蛋白质印迹来测量。
动物
C57B 16小鼠(6-8周龄)从Janvier(St Quentin Fallavier)获得并且在12h光/暗循环下保持于室温下并且可自由采食食物和水，例外是在诱导结肠炎之前一天，使其禁食12h。所有程序由机构动物护理委员会和兽医服务部门批准。
诱导结肠炎和研究设计
通过用葡聚糖硫酸钠(DSS)的治疗来诱导结肠炎症。详细来说，将DSS溶解于饮用水(3或5%wt/vol)中并且动物自由饮用此溶液7天。测量DSS治疗组中的水消耗量并且与饮用水的原始小鼠组相比：未观察到饮用水和饮用DSS的小鼠之间所消耗液体的体积的差异。小鼠每天以100μl的5.109菌落形成单位(cfu)的野生型、抑弹性酶蛋白重组乳酸乳球菌或干酪乳杆菌，或单独细菌培养基来口服治疗。第一次治疗起始于将DSS加入饮用水的同时并且最后一次治疗在处死当天(第7天)。在诱导结肠炎之后每天测量体重和存活率。将DSS加入其饮用水之后第7天，将小鼠处死并且收获结肠以测量炎症的若干参数：肉眼观察的得分、肠厚度、髓过氧物酶(MPO)活性、蛋白质分解活性、细胞因子表达。
炎症参数的测量
肉眼观察的损伤如前所述(5’15’16)来评估。简单地说，在观察到以下现象时，给予以下参数得分1：出血、浮肿、缩窄、溃疡、粪便有血、粘液和腹泻。取决于患病区域长度，红斑最大得分为2(0：不存在，1：小于1cm，2：大于1cm)。粘连基于其严重程度来得分(0：不存在，1：中度，2：严重)。
在处死时收获的结肠组织中，如前所述(5’15’16)来测量作为粒细胞浸润指标的MPO。使组织样品在0.5%十六烷基三甲基溴化铵的磷酸盐缓冲液(pH 6)溶液中匀浆化，并且在13 000X G下离心2min。将上清液加入含有1%过氧化氢和邻联大茴香胺盐酸盐(O-dianisidinedihydrochloride)的缓冲液。在450nm下读取酶溶液的光密度读数2min。
为了测量细胞因子和趋化因子蛋白质，将处死时收获的冷冻结肠样品使用polytron在4℃下，在补充有抗蛋白酶(Roche Diagnostics,Meylan,France)混合物的500μL的细胞溶解缓冲液(20mM Tris-Hcl，pH 7.5，150mM NaCl，1mM Na2EDTA，1mM EGTA，1%TritonX-100，2.5mM焦磷酸钠，1mMβ-甘油磷酸盐，1mM Na3VO4，1μg/ml亮肽素；Cell Signalling,Sigma)中匀浆化30s。在离心(10000Xg，10min，4℃)之后，将上清液在QIAshredder管柱(Qiagen，France)上过滤，并且将50微升此均浆使用荧光细胞分选仪FACSCalibur上的细胞计数球珠阵列来用于同时计量细胞因子和趋化因子。将原始数值相对于组织重量进行标准化(平均30至50mg)并且细胞因子浓度借助于
Figure BDA00001849282700161
软件而从标准曲线外推。根据制造商的信息，只考虑高于细胞因子检测限度的数值。
结肠组织和管腔洗涤液中的丝氨酸蛋白酶活性
如前所述(17)，在处死后，将整个结肠切除并且将1ml PBS注入并经由内腔洗涤两次。测量那些肠腔洗涤液中的蛋白质分解活性(胰蛋白酶样和弹性蛋白酶活性)。胰蛋白酶样和弹性蛋白酶样活性分别使用甲苯磺酰基-Gly-Pro-Arg-对硝基苯胺(150μM，Sigma)和MeO-琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Val-对硝基苯胺(100μM，Sigma，Saint QuentinFallavier，France)作为底物来测量。将样品(20μl用于胰蛋白酶活性或10μl用于弹性蛋白酶活性)重新悬浮于其各自的缓冲液中：对于胰蛋白酶活性来说为100mM Tris/HCl，1mM CaCl2，pH=8，而对于弹性蛋白酶活性来说为50mM Tris-HCl，500mM NaCl，0.1% TritonX100。在37℃下用微板阅读仪NOVOstarTM(BMG Labtech，France)对405nm下的吸光率变化进行30分钟测定。将活性与来自猪胰腺的胰蛋白酶(Sigma)或人中性粒细胞弹性蛋白酶(Sigma)的已知标准稀释液相比较。肠腔洗涤液中的蛋白质浓度使用微板(BCA
Figure BDA00001849282700162
Pierce,Thermo Scientific,Courtaboeuf，France)上的二喹啉甲酸的比色计量进行测定并且用于将各样品中的蛋白质分解活性标准化。
诱导和测量响应于芥子油的内脏疼痛行为
在30℃下在没有振荡的情况下，将乳酸乳球菌的三种菌株(乳酸乳球菌wt、乳酸乳球菌-抑弹性酶蛋白、乳酸乳球菌-IL-10)在补充有葡萄糖(0.5%)补充有氯霉素(10μg/mL)的M17培养基(Oxoid)中进行培养。将来自过夜培养物的细菌在1/50(v/v)的新鲜培养基中生长直到OD600=0.4至0.6为止。然后，将细菌用所添加的使得能够进行重组蛋白表达的乳酸链球菌素(1ng/mL)再培养一小时。细菌通过在450g下离心来收获并且以无菌PBS洗涤。将球团以5×1010cfu/mL的最终浓度重新悬浮于无菌PBS中。将4至8只小鼠的多个组通过胃内施用，每天以100μL(5×109cfu)的细菌悬浮液来治疗7天。在第8天，通过结肠内注入向小鼠施用50μL的PBS或芥子油(乙醇70%中的0.01%(v/v))，这是在轻微异氟醚麻醉下执行。然后，将疼痛相关行为反应(腹部凹陷、舔舐腹部、伸展，和抵靠地面挤压下腹部)的次数计数20min。
统计资料
各组之间的比较使用学生双尾t测试伴以邦费罗尼(Bonferroni)校正来进行。数据表示为平均值±SEM，并且小于0.05的P值被认为具有显著性。
结是
表达抑弹性酶蛋白的重组乳酸乳球菌对小鼠中DSS结肠炎的发病具有保护作用
如所预料，与引用水的对照小鼠相比，在所有小鼠组中，DSS诱导的结肠炎(5%DSS)造成严重的重量损失。没有一种乳酸细菌治疗可显著改良这种重量损失(图1A)。饮用水中的DSS还造成结肠组织的肉眼观察的损伤，壁厚增加和MPO活性增加(图1B、图1C、图1D)。用野生型乳酸乳球菌治疗的小鼠不显示结肠壁厚和MPO活性的显著减小，与单独DSS治疗小鼠相比，在这一组中只观察到肉眼观察的损伤得分的轻微减少。相比之下，用表达抑弹性酶蛋白的重组乳酸乳球菌治疗的小鼠在诱导DSS结肠炎之后显示显著降低的肉眼观察的损伤得分和结肠壁厚的显著更小增加，但是MPO活性与单独DSS组没有不同(图1B、图1C、图1D)。另外，用表达IL-10细胞因子的重组乳酸乳球菌治疗的小鼠在诱导DSS结肠炎之后显示降低的肉眼观察的损伤得分和MPO活性，但是与单独DSS相比，壁厚未通过这一治疗得到改善(图1B、图1C、图1D)。在非发炎小鼠中，与原始对照小鼠相比，没有一种治疗可以改善炎症参数。
DSS诱导的胰蛋白酶样活性的增加在用表达抑弹性酶蛋白的重组乳酸乳球菌治疗的小鼠中显著降低，但是在用野生型乳酸乳球菌或表达IL-10的重组乳酸乳球菌治疗的小鼠中未改变(图2A)。只有用表达抑弹性酶蛋白的重组乳酸乳球菌治疗能够显著降低DSS诱导的弹性蛋白酶活性增加(图2B)。
表达抑弹性酶蛋白的重组干酪乳杆菌对小鼠中的DSS结肠炎发病具有保护作用
虽然用野生型干酪乳杆菌治疗小鼠显著降低诱导DSS结肠炎之后观察到的肉眼观察的得分，但是与单独DSS相比，这一治疗未能降低壁厚和MPO活性增加(图3A、图3B、图3C)。相比之下，用表达抑弹性酶蛋白的重组干酪乳杆菌治疗显著降低炎症的所有参数：肉眼观察的损伤得分、结肠壁厚和MPO活性(图3A、图3B、图3C)。
与用野生型干酪乳杆菌治疗的小鼠相比，在用表达抑弹性酶蛋白的重组干酪乳杆菌治疗的小鼠中，DSS诱导的胰蛋白酶样活性增加显著降低(图4A)。与用野生型干酪乳杆菌治疗的发炎(结肠炎)小鼠相比，或甚至与用PBS治疗的发炎小鼠相比，在用表达抑弹性酶蛋白的重组干酪乳杆菌治疗的患有结肠炎(DSS)的小鼠中，弹性蛋白酶活性水平也显著降低(图4B)。
在观察时间点(开始DSS治疗之后7天)，趋化因子RANTES的蛋白质表达未因DSS结肠炎而显著增加。野生型或分泌抑弹性酶蛋白的干酪乳杆菌未能改良DSS治疗小鼠中的RANTES表达水平(图5A)。在DSS诱导结肠炎之后7天，TNFα、IL-6、MCP1、KC、INFγ和IL-17A全部因DSS结肠炎而显著增加(图5B至图5G)。用表达抑弹性酶蛋白的重组干酪乳杆菌治疗小鼠显著降低了IL-6、MCP1、KC和IL-17的蛋白质表达(图5C、图5D、图5E、图5G)，但是未能降低其它促炎症性细胞因子如TNFα和INFγ的表达水平(图5B和图5F)。值得关注的是，虽然DSS结肠炎未引起细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IL-13的任何增加(图6A至图6E)，但是用抑弹性酶蛋白的干酪乳杆菌重组体治疗小鼠显著提高了那些细胞因子的表达，但是这只在结肠炎情形中(DSS治疗之后)发生。Th2细胞因子响应于抑弹性酶蛋白的干酪乳杆菌重组体的这一增加可至少部分地解释此重组细菌的消炎效果。在发炎(DSS)或非发炎小鼠中，IL2、IL-4、IL-5、IL-10和IL-13水平都没有因任何其它治疗而得到改善(图6A至图6E)。
表达抑弹性酶蛋白的重组乳酸乳球菌减少内脏疼痛行为
结肠内施用芥子油造成疼痛行为次数显著增加：腹部凹陷次数和如舔舐、伸展，和抵靠地面挤压的综合疼痛行为次数(图7A和图7B)。将所有行为在一起考虑，用野生型、IL-10重组体或分泌抑弹性酶蛋白的乳酸乳球菌来治疗没有效果(图7A)。只考虑综合疼痛行为，抑弹性酶蛋白，而不是IL-10-重组乳酸乳球菌或野生型显著降低了疼痛行为次数(图7B)。此外，与PBS治疗或野生型乳酸乳球菌治疗相比，只有表达抑弹性酶蛋白的重组乳酸乳球菌诱导疼痛行为次数的显著减少(图7B)。
htrA菌株的结果
乳酸乳球菌只表达一种称为htrA的持家(housekeeping)细胞外蛋白酶，其使所有未折叠的输出蛋白质降解(Poquet等，2000和专利申请US 6,994,997和FR2787810)。构建htrA基因的经过灭活的乳酸乳球菌突变菌株并且其允许增加乳酸乳球菌中的多种异源分泌蛋白质的产生率(Poquet等，2000和Miyoshi等，2002)。根据本发明，在htrA突变体中克隆抑弹性酶蛋白表达组件。htrA突变体和野生型(wt)菌株中的抑弹性酶蛋白产生水平通过蛋白质印迹实验来比较(图8)。与wt菌株相比，观察到htrA突变体上清液中的分泌抑弹性酶蛋白显著增加。因此，htrA菌株允许抑弹性酶蛋白的较高产生和释放水平。
然后在DSS诱导结肠炎模型中测试这两种菌株，并且在活体内证实与wt菌株相比，htrA突变体可更好地保护小鼠免受结肠炎损伤(图9A、图9B和图9C)。
比较结果
在DSS 5%诱导结肠炎模型中并行评估产生IL-10、过氧化物歧化酶(SOD)和抑弹性酶蛋白的干酪乳球菌菌株的保护效果。应注意，与乳酸乳球菌相比，干酪乳球菌具有两个主要差异：i)在GIT中的较高持久性和ii)内在消炎性质(Rochat等，2007；Watterlot等，2010)。如图10A/B/C中所示，可通过产生抑弹性酶蛋白的干酪乳球菌菌株来获得对于三种标准(肉眼观察的，组织学的和MPO活性)的最佳保护效果，接着用产生SOD的干酪乳球菌菌株来获得对于三种标准的最佳保护效果。产生IL-10的干酪乳球菌菌株只能提供不良的效果。
此外，与两种乳酸乳球菌菌株(wt乳酸乳球菌和htrA菌株)相比，产生抑弹性酶蛋白的干酪乳球菌菌株提供更好的保护(图11)。
考虑到抑弹性酶蛋白具有活体外和活体内抗细菌活性的事实[SimpsonAJ等，1999]，这些结果非常令人惊喜。因此，本领域技术人员将预期细菌宿主产生的效果不佳或根本不产生效果。相反，本发明人获得的结果显示益生菌很好地产生抑弹性酶蛋白，因此具有治疗效果。
此外，活体外和活体内研究(包括临床研究)显示缺乏宿主抗微生物防护在结肠疾病中可能是有害的[Salzman NH等，2003和Bevins CL等，2009]。
因此，与IL-10相比，抑弹性酶蛋白的多效抗菌/消炎活性使得其成为具备潜质的候选治疗分子。
EDTA诱导乳酸乳球菌中的由启动子锌(PZn)zitR控制的表达
在用1mM EDTA诱导1h之后，通过蛋白质印迹分析来测试乳酸乳球菌中的由PZn zitR起动的抑弹性酶蛋白的产生[Llull D和Poquet I.2004]。未经过诱导的培养物样品、细胞球团(C)和上清液(S)产生很低水平的抑弹性酶蛋白以及分泌，而经过诱导的培养物产生较高水平的表达和分泌(图12)。
参考文献：
本申请全文中，各种参考文献描述本发明所涉及的技术现状。这些参考文献的公开内容以引用方式并入本公开中。
Bevins CL,Stange EF,Wehkamp J.Decreased Paneth cell defensinexpression in ileal Crohn's disease is independent of inflammation,butlinked to the NOD2 1007fs genotype.Gut.2009年6月;58(6):882-3。
Braat,H.,M.P.Peppelenbosch和D.W.Hommes.2003.Interleukin-10-based therapy for inflammatory bowel disease.Expert.Opin.Biol.Ther.3:725-731。
Braat,H.,P.Rottiers,D.W.Hommes,N.Huyghebaert,E.Remaut,J.P.Remon,S.J.van Deventer，S.Neirynck,M.P.Peppelenbosch和L.Steidler.2006.A phase I trial with transgenic bacteria expressinginterleukin-10 in Crohn's disease.Clin.Gastroenterol.Hepatol.4:754-759。
Bron Peter A.,Marcos G.Benchimol,Jolanda Lambert,EmmanuellePalumbo,Marie Deghorain,Jean Delcour,Willem M.de Vos,MichielKleerebezem和Pascal Hols.Use of the air Gene as a Food-GradeSelection Marker in Lactic Acid Bacteria.Environmental Microbiology,2002年11月,第5663-5670页。
Cenac,N.,C.N.Andrews,M.Holzhausen,K.Chapman,G.Cottrell,P.Andrade-Gordon,M.Steinhoff，G.Barbara,P.Beck,N.W.Bunnett,K.A.Sharkey,J.G.Ferraz,E.Shaffer和N.Vergnolle.2007.Role forprotease activity in visceral pain in irritable bowel syndrome.J.Clin.Invest 117:636-647。
Hedin,C.,K.Whelan和J.O.Lindsay.2007.Evidence for the use ofprobiotics and prebiotics in inflammatory bowel disease:a review ofclinical trials.Proc.Nutr.Soc.66:307-315.Sallenave,J.-M.Biol.Chem.Hoppe-Seyler 372(1991),第13-21页。
Hyun,E.,P.Andrade-Gordon,M.Steinhoff和N.Vergnolle.2008.Protease-activated receptor-2 activation:a major actor in intestinalinflammation.Gut 57:1222-1229。
Llull D.和I.Poquet.New Expression System Tightly Controlled byZinc Availability in Lactococcus lactis.Environmental Microbiology,2004年9月,第5398-5406页。
Motta Jean-Paul,Laurent Magne,Delphyne Descamps,CorinneRolland,Camila Squarzoni-Dale,Perrine Rousset,Laurence Martin,Nicolas Cenac,Viviane Balloy,Michel Huerre,Dieter Jenne,JulienWartelle,Azzaq Belaaouaj,Emmanuel Masl,Jean-Pierre Vinel,LaurentAlric,Michel Chignard,Nathalie Vergnolle,Jean-Michel Sallenave.Modifying the protease,anti-protease pattern by elafin over-expressionprotects mice from colitis.Gastroenterology 2011,In Press。
Poquet I,Saint V，Seznec E,Simoes N,Bolotin A,Gruss A.HtrA isthe unique surface housekeeping protease in Lactococcus lactis and isrequired for natural protein processing.Mol Microbiol.2000年3月;35(5):1042-51。
Sallenave J.-M,Silva A.,Marsden M.E.和Ryle A.P.Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.8(1993),第126-133页。
Sallenave JM.Secretory leukocyte protease inhibitor andelafin/trappin-2:versatile mucosal antimicrobials and regulators ofimmunity.Am J Respir Cell Mol Biol.2010年6月;42(6):635-43。Epub2010年4月15日.Review。
Sartor,R.B.2004.Therapeutic manipulation of the enteric microflorain inflammatory bowel diseases:antibiotics,probiotics,and prebio tics.Gastroenterology 126:1620-1633。
Salzman NH,Ghosh D,Huttner KM,Paterson Y，Bevins CL.Protection against enteric salmonellosis in transgenic mice expressing ahuman intestinal defensin.Nature.2003年4月3日;422(6931):522-6。
Simpson AJ,Maxwell Al,Govan JR,Haslett C,Sallenave JM.Elafin(elastase-specific inhibitor)has anti-microbial activity againstgram-positive and gram-negative respiratory pathogens.FEBS Lett.1999年6月11日;452(3):309-13。
Steidler,L.,W.Hans,L.Schotte,S.Neirynck,F.Obermeier，W.Falk,W.Fiers和E.Remaut.2000.Treatment of murine colitis by Lactococcuslactis secreting interleukin-10.Science 289:1352-1355。
Thierry Moreau,Kevin Baranger,Sebastien Dade,SandrineDallet-Choisy,Nicolas Guyot,Marie-Louise Zani.Multifaceted roles ofhuman elafin and secretory leukocyte proteinase inhibitor(SLPI),twoserine protease inhibitors ofthe chelonianin family.Biochimie 90(2008)284e295。
Vergnolle,N.2005.Clinical relevance of proteinase-activatedreceptors in the gut.Gut 54:867-874。
Vergnolle,N.,L.Cellars,A.Mencarelli,G.Rizzo,S.Swaminathan,P.Beck,M.Steinhoff，P.Andrade-Gordon,N.W.Bunnett,M.D.Hollenberg,J.L.Wallace,G.Cirino和S.Fiorucci.2004.A role for proteinase-activatedreceptor-1 in inflammatory bowel diseases.J Clin Invest 114:1444-1456。

Claims (14)

1.一种选自以下的分子：trappin-2蛋白质或所述trappin-2蛋白质的活性部分、WAP家族蛋白质成员或所述WAP家族蛋白质成员的活性部分，或丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员或所述丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员的活性部分，所述分子是用于治疗肠易激综合征(IBS)。
2.根据权利要求1所述的分子，其由经过基因工程化的宿主细胞来表达。
3.一种重组食品级细菌，其包含选自以下的基因：编码trappin-2蛋白质或所述trappin-2蛋白质的活性部分的基因、编码WAP家族蛋白质成员或所述WAP家族蛋白质成员的活性部分的基因，或编码丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白质成员或所述丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白质成员的活性部分的基因。
4.根据权利要求3所述的细菌，其中所述食品级细菌是益生菌。
5.根据权利要求3或4所述的益生菌，其中所述细菌包含有缺陷的营养缺陷型基因，由此，所述细菌的存活严格地依赖于特定化合物的存在。
6.根据权利要求5所述的益生菌，其中所述有缺陷的营养缺陷型基因是thyA基因。
7.根据权利要求4所述的益生菌，其中所选定的基因被插入所述thyA基因中。
8.根据权利要求3至5所述的益生菌，其中编码所述WAP或丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白质的所述基因是trappin-2或α1-抗胰蛋白酶蛋白质。
9.根据权利要求3至6中任一项所述的食品级细菌，其选自乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌。
10.根据权利要求中3至9任一项所述的食品级细菌，其用于治疗炎症性病状。
11.根据权利要求10所述的食品级细菌，其中所述炎症性病状选自炎症性肠病、肠易激综合征、炎症性肺病、炎症性关节疾病或炎症性泌尿生殖系统疾病。
12.一种治疗组合物，其包含根据权利要求3至9中任一项所述的食品级细菌。
13.一种食品组合物，其包含根据权利要求3至9中任一项所述的食品级细菌。
14.根据权利要求10和11中任一项所述的组合物，其中所述组合物欲口部施用于受试者。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105106246A (zh) * 2015-08-20 2015-12-02 江南大学 一种植物乳杆菌zs2058及其用途
CN109310719A (zh) * 2016-06-08 2019-02-05 索发股份公司 益生菌的新医学应用
CN110331148A (zh) * 2019-08-20 2019-10-15 华中农业大学 一种编码IFNα蛋白的基因、重组载体pELSH-IFNα、重组干酪乳杆菌及应用
CN113684162A (zh) * 2021-06-03 2021-11-23 江南大学 一种表达小鼠防御素mBD14基因的重组植物乳杆菌及其应用

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
US8771669B1 (en) 2010-02-09 2014-07-08 David Gordon Bermudes Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria
FR2990699B1 (fr) 2012-05-21 2016-02-05 Agronomique Inst Nat Rech Cassettes d'expression procaryotes regulees par le stress
WO2013188529A1 (en) * 2012-06-15 2013-12-19 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of isolated bacterial amyloids for treatment of inflammatory disorders or diseases of the epithelium
EP2706067A1 (en) * 2012-09-06 2014-03-12 Humboldt-Universität zu Berlin Probiotic bacteria as carrier for a helminth-derived immunomodulator for the treatment of inflammatory disorders
BR112015009975A2 (pt) 2012-11-01 2017-07-11 Academisch Ziekenhuis Groningen métodos e composições para a estimulação das bactérias benéficas no trato gastrointestinal
US9593339B1 (en) 2013-02-14 2017-03-14 David Gordon Bermudes Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment
EP2769732A1 (en) 2013-02-22 2014-08-27 Sanofi Serpins: methods of therapeutic beta-cell regeneration and function
WO2014128257A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Sanofi Serpins: methods of therapeutic beta-cell regeneration and function
EP2851086A1 (en) 2013-09-20 2015-03-25 Sanofi Serpins: methods of therapeutic ß-cell regeneration and function
BR112015020819A2 (pt) 2013-03-05 2017-07-18 Academisch Ziekenhuis Groningen uso de faecalibacterium prausnitzii htf-f (dsm 26943) para supressão de inflamação
US9737592B1 (en) 2014-02-14 2017-08-22 David Gordon Bermudes Topical and orally administered protease inhibitors and bacterial vectors for the treatment of disorders and methods of treatment
WO2015168534A1 (en) * 2014-05-02 2015-11-05 Novogy, Inc. Therapeutic treatment of gastrointestinal microbial imbalances through competitive microbe displacement
KR101787543B1 (ko) 2014-08-22 2017-10-19 샘표식품 주식회사 발효배양 산삼을 포함하는 항염증 조성물
WO2016124239A1 (en) * 2015-02-04 2016-08-11 Aurealis Oy Recombinant probiotic bacteria for use in the treatment of a skin dysfunction
WO2017053349A1 (en) * 2015-09-21 2017-03-30 Vithera Pharmaceuticals, Inc. Treatment of disease with lactic acid bacteria having stably integrated trappin-2
US10829563B2 (en) 2016-06-16 2020-11-10 INSERM (Institute National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method of screening a candidate compound for activity as an elastase 2A (ELA2A) inhibitor
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
EP4051379A4 (en) * 2019-10-29 2023-12-13 The Regents of the University of California THERAPEUTIC APPROACH FOR THE TREATMENT OF AN INFLAMMATORY ABDOMINAL CONDITION
KR20210129516A (ko) * 2020-04-20 2021-10-28 주식회사 리비옴 혈관 작동성 장 펩티드를 발현하는 미생물, 및 그의 용도
CN111617099B (zh) * 2020-06-16 2022-12-20 青岛农业大学 一种无抗高细胞亲和性结肠炎修复剂与应用方法
WO2022049273A1 (en) * 2020-09-07 2022-03-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of treatment of inflammatory bowel diseases

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5734014A (en) * 1992-08-11 1998-03-31 Tsumura & Co. Elafin derivative
IT1270123B (it) * 1994-10-05 1997-04-28 Dompe Spa Composizioni farmaceutiche contenenti microorganismi ingegnerizzati e loro uso per terapia
JPH10127292A (ja) * 1996-10-31 1998-05-19 Tsumura & Co エラフィン類発現ベクターおよびこれを利用したエラフィン類の製造法
FR2787810B1 (fr) 1998-12-24 2002-10-31 Inst Nat De La Rech Agronomique Inra Bacteries a gram positif depourvues d'activite proteasique htra, et leurs utilisations
DE10101793A1 (de) * 2001-01-17 2002-08-01 Manfred Nilius Verwendung von SLPI zur Behandlung chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen
EP1227152A1 (en) * 2001-01-30 2002-07-31 Société des Produits Nestlé S.A. Bacterial strain and genome of bifidobacterium
US7780961B2 (en) * 2001-05-03 2010-08-24 Actogenix N.V. Self-containing Lactococcus strain
DE60319822T2 (de) * 2002-06-19 2009-06-04 Actogenix Nv Verfahren und mittel zur erhöhung der darmabsorption
FR2843973B1 (fr) 2002-08-30 2006-07-07 Agronomique Inst Nat Rech Cassettes d'expression procaryotes regulees par le zinc
EP1560935A2 (en) * 2002-11-15 2005-08-10 VIB vzw Self-containing lactobacillus strain
KR20110027823A (ko) * 2004-03-24 2011-03-16 트리패스 이미징, 인코포레이티드 자궁경부 질환의 검사 방법 및 조성물
WO2005111194A1 (en) * 2004-05-18 2005-11-24 Vib Vzw Self-containing lactobacillus strain

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEAN-MICHEL SALLENAVE, ET AL.: ""Elafin Is Protective Against the Development of Colitis in IBD Murine Models"", 《GASTROENTEROLOGY》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105106246A (zh) * 2015-08-20 2015-12-02 江南大学 一种植物乳杆菌zs2058及其用途
CN109310719A (zh) * 2016-06-08 2019-02-05 索发股份公司 益生菌的新医学应用
CN110331148A (zh) * 2019-08-20 2019-10-15 华中农业大学 一种编码IFNα蛋白的基因、重组载体pELSH-IFNα、重组干酪乳杆菌及应用
CN110331148B (zh) * 2019-08-20 2021-05-04 华中农业大学 一种编码IFNα蛋白的基因、重组载体pELSH-IFNα、重组干酪乳杆菌及应用
CN113684162A (zh) * 2021-06-03 2021-11-23 江南大学 一种表达小鼠防御素mBD14基因的重组植物乳杆菌及其应用
CN113684162B (zh) * 2021-06-03 2024-02-27 江南大学 一种表达小鼠防御素mBD14基因的重组植物乳杆菌及其应用

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Publication number Publication date
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