CN111803646A - 一种实体肿瘤联合治疗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种实体肿瘤联合治疗组合物，有效组分至少包括mmp3拮抗物质和溶瘤病毒。本发明用mmp3拮抗物质和溶瘤病毒联合治疗实体肿瘤，可以有效的抑制肿瘤生长并提高生存率。

Description

一种实体肿瘤联合治疗组合物

技术领域

本发明属于癌症治疗技术领域，具体涉及一种实体肿瘤联合治疗组合物。

背景技术

肿瘤是一类严重危害社会公共健康的疾病，据统计2018年全球新增肿瘤患者高达1810万例，死亡患者高达960万例，因此探索新型有效的肿瘤治疗是当下全球研究的热点之一。

目前，肿瘤治疗的方法主要有以下几种：1.手术治疗，手术治疗可以快速精准的切除肿瘤组织以阻止其扩散和转移，目前使用较多。但是手术治疗有一定的局限就是它只对初期的肿瘤有用，对于晚期或已经发生转移的肿瘤来说手术难度大治愈效果差。2.放疗和化疗，放疗和化疗是利用物理和化学药物的方法杀死癌细胞以达到治疗的作用。放疗和化疗可以到达全身各个部位对一些转移的肿瘤也有治疗效果，但是放疗和化疗由于是全身性的给药，所以对健康的细胞和组织的毒副作用相对较大。3.抗体治疗，利用抗体特异性的封闭与肿瘤生长相关的免疫检查点例如PD-1分子，以启动机体抗肿瘤的免疫应答过程来达到抗肿瘤的作用，这种方法虽然有效，但是存在着抗原表位多样，带来了整体有效性不高，药物难以突破血脑屏障和肿瘤微环境等一定的局限性。4.CAR-T细胞治疗，是CAR-T细胞经过修改，可以特异性的表达合成的受体，这些受体会将多克隆T细胞重新定向至表面抗原，以用于随后的肿瘤消除。许多CAR的设计元素都增加了T细胞的持久性和活性。目前，CAR-T细胞在治疗血液瘤效果比较好。但是，在实体肿瘤中CAR-T治疗还未见显著的疗效。5.靶向药物治疗：像常规化学疗法一样，使用可抑制实体肿瘤生长和转移的化合物。但是，靶向实体肿瘤疗法的作用机制不同于普通的化学疗法，它会针对性的干扰参与肿瘤发生的特定蛋白质，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会伤害肿瘤周围的正常组织细胞。但当前肿瘤靶向治疗的共同挑战是缺乏有效的生物标志物，评估新型靶向药物的疗效需要与未来临床试验中对生物标志物的探索相结合。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种实体肿瘤联合治疗组合物。

本发明的另一目的在于提供mmp3拮抗物质和溶瘤病毒共同在制备实体肿瘤治疗组合物中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种实体肿瘤联合治疗组合物，有效组分至少包括mmp3拮抗物质和溶瘤病毒。

本发明的另一技术方案如下：

mmp3拮抗物质和溶瘤病毒共同在制备实体肿瘤治疗组合物中的应用。

本发明的有益效果是：本发明用mmp3拮抗物质和溶瘤病毒联合治疗实体肿瘤，可以有效的抑制肿瘤生长并提高生存率。

附图说明

图1为本发明实施例1中的pLL3.7载体图谱及pLL3.7-shRNA-mmp3质粒验证结果图，其中，(A)pLL3.7质粒空载图谱和酶切位点。(B)pLL3.7-shRNA-mmp3质粒测序结果；(C)pLL3.7-shRNA-mmp3质粒瞬转B16细胞，48h后通过WB验证质粒的下调效果。

图2为本发明实施例1中的pLL3.7-shRNA-mmp3 MC-38稳转细胞株的构建及鉴定图，其中，(A)通过RT-PCR在基因水平上鉴定流式分选后的稳转细胞mmp3的下调效果；(B)通过WB在蛋白水平上鉴定流式分选后的稳转细胞mmp3的下调效果。

图3显示本发明实施例1中肿瘤细胞中mmp3的表达会影响小鼠皮下肿瘤的生长，其中，(A)用正常细胞和下调细胞接种野生型小鼠和mmp3敲除小鼠的具体接种方案；(B)荷瘤小鼠皮下肿瘤生长体积的统计；(C)接种完后的第26天统计比较各组之间的肿瘤体积大小；(D)各组荷瘤小鼠生存率的统计。

图4显示本发明实施例1中慢病毒和VSV^M51R病毒联合使用可以有效的抑制肿瘤生长并提高生存率，其中，(A)慢病毒和VSV^M51R溶瘤病毒治疗荷瘤小鼠皮下肿瘤的具体实施方案；(B)慢病毒和VSV^M51R溶瘤病毒治疗后小鼠皮下肿瘤体积的统计；(C)接种完后的第24天统计比较各组之间的肿瘤体积大小；(D)各组荷瘤小鼠生存率的统计。

图5显示本发明实施例1中iRNA和VSV^M51R病毒联合使用可以有效的抑制肿瘤生长并提高生存率，其中，(A)siRNA转染MC-38细胞48h后通过RT-PCR鉴定siRNA对mmp3表达的下调效果；(B)siRNA转染MC-38细胞48h后通过WB鉴定siRNA对mmp3表达的下调效果；(C)siRNA和VSV^M51R溶瘤病毒治疗小鼠皮下肿瘤的具体实施方案；(D)siRNA和VSV^M51R溶瘤病毒治疗后小鼠皮下肿瘤体积的统计；(E)接种完后的第24天统计比较各组之间的肿瘤体积大小；(F)各组荷瘤小鼠生存率的统计。

图6显示NNGH和VSV^M51R病毒联合使用可以有效的抑制肿瘤生长并提高生存率，其中，(A)mmp3的抑制剂NNGH的化学结构式；(B)通过基质胶侵袭实验鉴定mmp3的抑制剂NNGH对MC-38细胞表达的mmp3抑制情况；(C)NNGH和VSV^M51R溶瘤病毒治疗小鼠皮下肿瘤的具体实施方案；(D)NNGH和VSV^M51R溶瘤病毒治疗后小鼠皮下肿瘤体积的统计；(E)接种完后的第25天统计比较各组之间的肿瘤体积大小；(F)各组荷瘤小鼠生存率的统计。

图7显示本发明实施例1中iRNA和HSV病毒联合使用可以有效的抑制肿瘤生长并提高生存率，其中，(A)siRNA和HSV溶瘤病毒治疗后小鼠皮下肿瘤体积的统计；(B)接种完后的第24天统计比较各组之间的肿瘤体积大小；(C)各组荷瘤小鼠生存率的统计。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

在本发明的一个优选实施方案中，所述mmp3拮抗物质包括shRNA、siRNA和mmp3抑制剂中的至少一种。

进一步优选的，所述mmp3抑制剂包括NNGH。

在本发明的一个优选实施方案中，所述溶瘤病毒为VSV、HSV、腺病毒、痘病毒、呼肠孤病毒或微小RNA病毒。

在本发明的一个优选实施方案中，所述实体肿瘤包括结肠癌、肺癌和乳腺癌。

下述实施例所提及的VSV^M51R是VSV的一种突变体，其M蛋白上第51位氨基酸甲硫氨酸突变为精氨酸或缺失，这种突变体的致病性减弱。

实施例1 shRNA

一、实验方法

1.siRNA文库转染细胞

(1)24孔板每孔中均匀的铺上1.5×10⁵个MC-38细胞。

(2)12小时之后准备转染。

(3)分别取20uM的Simmp3和NC 2.5μL混在100μL的DMEM基培中。另取一管再将2μL的Lipofectamine RNAiMAX混在100μL的DMEM基培中。涡旋振荡3S后室温静置5min。

(4)将上述两个单独的试剂混在一起涡旋振荡3S后室温静置15min。

(5)加入孵育好的质粒和转染试剂并混匀。

(6)7-12h后换为新鲜的完全培养基；

(7)共计培养48h后可以收样验证表达情况。

2.水疱型口炎病毒VSV^M51R的扩增和纯化

(1)大量培养含有VSV^M51R的vero细胞。

(2)去除细胞培养基换取新鲜的2％的完全培养基。

(3)按MOI＝0.1的比例加入待扩增的病毒液，小心混匀。

(4)培养箱中培养至细胞全部裂解死亡后收集上清。

(5)病毒液过0.45um的滤网后加入1/4体积的PEG6000充分混匀后4℃静置过夜。

(6)在过夜病毒液10000rpm 4℃离心60min后收集沉淀并用TNE buffer重悬。

(7)将重悬后的病毒液加入到预铺有2mL 50％蔗糖的水平超离管中。上面再加上2mL的40％的蔗糖溶液。其余的用TNE buffer补齐。

(8)25000rpm 4℃水平超速离心2h 30min。

(9)用注射器小心吸取蔗糖之间的病毒液并用TNE buffer重悬。

(10)进行滴度测定或-80℃保存。

3.mmp3基因的引物设计

在Sigma aldrich公司软件上找到适合的鼠源shRNA-mmp3靶位点，按照shRNA设计原则设计相关的引物，引物序列如表1所示。

表1 mmp3下调质粒的引物序列

4.mmp3基因下调表达质粒的构建

A.shRNA-mmp3的退火

以表1中的序列合成引物，溶于ddH₂O，浓度为100μM。将上下游引物按1∶1混匀，最终浓度为50μM，退火程序：

B.载体酶切及回收

用XhoI和HpaI对pLL3.7空载质粒进行双酶切如下：

37℃酶切2.5h，割胶回收目的条带。

C.pLL3.7-shRNA-mmp3的连接

连接体系如下：

4℃过夜连接。

D.连接体系转化。

E.质粒DNA的小量提取：参照《AXYGEX质粒小量提取试剂盒说明书》。

F.质粒pLL3.7-shRNA-mmp3酶切验证及测序

37℃4h，凝胶对比验证后送公司测序。

5.pLL3.7-shRNA-mmp3质粒的中抽：

(1)取测序正确的质粒小抽前保留的菌液接种到500mL含有氨苄抗性的LB中37℃250rpm摇菌12h以上。

(2)扩增后的菌液进行离心，3000rpm 4℃40min，去上清。

(3)先用5mL的p1吹打沉淀并将其转移到新的离心管中。

(4)再取5mL的p1充分清洗沉淀。

(5)加入10mL的p2到p1中，可见液体变为蓝色。室温静置5min。

(6)加入10mL的p3到上一步的液体中混匀，可见蓝色变为白色。

(7)将上述混合液加入到过滤器中室温静置10min.

(8)将液体用注射器推杆通过过滤器过滤到离心管中。

(9)按比例加入2.5mL的bufferER混匀，冰上静置30min。

(10)用10mL的QBT平衡过滤柱。

(11)将步骤(9)中的混合物转移到过滤柱中，待自然流干。

(12)用30mL的bufferQC洗脱过滤柱两次。

(13)用15mL的buffer QN洗脱质粒。

(14)加入10.5mL的异丙醇到上一步的过滤液中充分混匀，(可见乳白色物质出现)。

(15)10000rpm 4℃离心30min。

(16)缓慢加入5mL的70％的乙醇将沉淀悬浮起来(不要吹散)。

(17)10000rpm 4℃离心10min后小心倒去上清并用马克笔标记沉淀位置，自然晾干(沉淀由乳白色逐渐透明)。

(18)用适量的buffer TE溶解沉淀并进行浓度测定。

6.质粒pLL3.7-shRNA-mmp3表达验证：

(1)12孔板中均匀的铺2.5×10⁵个B16细胞每孔。

(2)12h之后准备转染。

(3)取测序正确的上述pLL3.7-shRNA-mmp3质粒1ug混在100μL的DMEM基培中。另取一管再将1μL的Lungtrans混在100μL的DMEM基培中。涡旋振荡3s后室温静置5min。

(4)将上述两个单独的试剂混在一起涡旋振荡3s后室温静置15min。

(5)将孵育好的质粒和转染试剂加到细胞中。

(6)培养7-12h后换为新鲜的完全培养基。

(7)共计培养48h后可以收样验证表达情况。

7.Western blot样本的制备：

(1)细胞转后48h即可收样，小心去除培养基后用1×PBS洗两遍(动作需轻柔尽量避免将细胞吹起)。

(2)将裂解液加入到细胞上，4℃放置30min，期间晃动几次。

(3)将裂解后的细胞完全转移并按量加入蛋白上样缓冲液。

(4)100℃金属浴10min后将其转移到冰箱中备用。

8.免疫印迹法(Western blot)：

(1)首先根据mmp3的分子量大小选择配置8％的聚丙烯酰胺凝胶。

(2)设计点样顺序后将样品缓慢的加入到孔中，每孔20μL。

(3)首先使用80V跑样，待marker分开后用120V跑样。

(4)marker完全分开后且目的条带位置完全跑开后可停止。

(5)采用湿式转膜法进行转膜，转膜电流为200mA每槽。

(6)转膜完成后用1×PBST配牛奶进行封闭，室温缓慢摇晃2h。

(7)剪出目的条带位置，按比例稀释一抗并孵育，4℃翻转过夜。

(8)1×PBST晃动洗三次后根据一抗孵育合适的二抗，室温翻转1h。

(9)1×PBST晃动洗三次后曝光。

9.pLL3.7-shRNA-mmp3稳定表达细胞株的构建：

病毒包装：

(1)在10cm培养皿中培养293T细胞至密度达到80％。

(2)取测序正确的下调质粒10ug，pVSVG包装质粒3ugΔ8.95ug混在500μL的DMEM基培中。另取一管再将18μL的Lungtrans混在500μL的DMEM基培中。涡旋振荡3s后室温静置5min。

(3)将上述两个单独的试剂混在一起涡旋振荡3S后室温静置15min。

(4)293T细胞中加入孵育好的转染试剂和质粒。

(5)培养7-12h后换为新鲜的完配。

(6)共计培养48h后收取上清并换新鲜完培，之后收取72h的病毒上清并过0.45um滤网。

(7)25000rpm离心2.5h后用1mL的DMEM基培重悬病毒沉淀，在-80℃保存。

稳转构建：

(1)取生长状态良好的MC-38细胞1×10⁵个均匀的铺在6孔板中。

(2)每孔加入500μL浓缩的病毒，再加入1μL的polybiene辅助感染试剂。

(3)3000rpm30℃离心感染90min。

(4)换取新鲜的完全培养基继续培养传代，直至细胞长到2个10cm dish。(在培养的过程中可见细胞带绿色荧光)

(5)由于病毒感染效率问题不能保证每个细胞都被感染，而且质粒可表达GFP绿色荧光所以得进行流式分选，至少进行3次GFP阳性流式分选后可得稳转细胞。

(6)分选后的细胞传代培养供后续实验用。

10.慢病毒滴度检测：参照《吉凯基因慢病毒滴度检测荧光法》

11.基质胶侵袭实验

(1)12孔板每个孔预铺DMEM稀释的25ug的基质胶于37℃孵育1h，之后小心去除胶体上清。

(2)每个小室上层铺入5×10⁴个细胞，小室下层加入600μL完培。

(3)37℃培养48h后小心弃去上层培养基并用PBS洗一遍后用棉签仔细刮掉上层细胞。

(4)70％酒精固定下层细胞5min 0.5％结晶紫染色20min后自然晾干然后直径上取视野，照相。

12.慢病毒shmmp3、Simmp3和mmp3抑制剂联合VSV^M51R病毒对小鼠皮下瘤的治疗方案

以7×10⁵细胞量于右前肢腋下接种建立小鼠结肠癌皮下肿瘤模型，待肿瘤体积直径达到0.5cm后进行分组包括PBS组、VSV^M51R组、Simmp3(Target sequence：GGAGGUUUGAUGAGAAGAA，SEQ ID NO.05)加VSV^M51R组、mmp3抑制剂加VSV^M51R组和慢病毒(提取自上述pLL3.7-shRNA-mmp3稳定表达细胞株的慢病毒)加VSV^M51R组。将3×10⁷PFU的病毒溶于50μLPBS中，抑制剂10Ki每次每只，Simmp30.5nm每次每只和慢病毒1×10⁸PFU的病毒每次每只进行瘤内注射。按计划注射完成后隔天统计皮下肿瘤的体积变化。

二、实验结果

1.mmp3下调质粒的构建及验证

为了构建mmp3下调表达质粒，从Sigma网站上查到shRNA-mmp3的序列，设计了表1的引物，通过退火后与XhoI、HpaI酶切的慢病毒载体pLL3.7连接过夜(载体图谱如图1A)，转化，挑取单菌落，质粒抽提并用XhoI、XbaI酶切验证，送样品至金唯智公司测序，将测序结果与shRNA-mmp3引物比对，比对结果证明下调质粒pLL3.7-shRNA-mmp3构建成功。之后将下调质粒瞬转B16细胞通过WB进行验证，由图1C可知shRNA可以起到明显的下调效果。

2.构建mmp3的下调MC-38细胞稳转株

用脂质体包裹法将pLL3.7-shRNA-mmp3及辅助质粒一起转入到293T细胞中，分别收取48h和72h的慢病毒上清，经过超速离心浓缩后感染MC-38细胞。细胞感染后可见绿色荧光，细胞扩大培养后采用流式分选的方法筛选GFP阳性达90％以上以获得稳转细胞。将稳转细胞株扩大培养，利用RT-PCR，WB从基因和蛋白水平验证mmp3表达是否下调。如图2A和B所示，mmp3稳定下调的MC-38细胞中，mmp3 mRNA水平下调，蛋白水平也下调，由此可知MC-38mmp3下调细胞稳转株构建成功。由图2B可知在蛋白水平上shmmp3-2下调效果更好，所以选用shmmp3-2下调表达的细胞用于后续实验。

3.肿瘤细胞mmp3的表达会影响小鼠皮下肿瘤的生长

接下来使用mmp3下调的肿瘤细胞和mmp3敲除小鼠，研究mmp3分子在小鼠肿瘤模型中的作用。实验分为四组，用WT小鼠和mmp3敲除小鼠分别接种5×10⁵个mmp3下调的细胞和Vector细胞(图3A)。在接种后18天观察到Vector细胞接种的肿瘤，不管是在mmp3敲除组(KO-Vector)还是WT小鼠组(WT-Vector)，它们的大小没有显著的差别；同样在mmp3下调的细胞接种的野生型老鼠(WT-shmmp3)组和敲除老鼠(KO-shmmp3)组中，这两组老鼠皮下肿瘤的大小也没有显著差别，说明小鼠体内的mmp3对于皮下接种肿瘤的生长没有重要影响。但是比较mmp3下调细胞接种的肿瘤组(WT-shmmp3和KO-shmmp3)，和Vector细胞接种的肿瘤组(WT-Vector和KO-Vector)，发现小鼠接种了下调mmp3细胞的肿瘤明显小于Vector细胞接种的肿瘤，并且随着时间的推移甚至更加明显(图3B)。统计分析表明在皮下肿瘤接种后26天，两组下调mmp3细胞接种的与其他Vector组相比，肿瘤体积存在显着差异(图3C)。尽管这四组中的所有小鼠都死亡，但是可以看到这些接种了mmp3下调细胞的小鼠死亡时间有所推迟(图3D)。结果表明在肿瘤细胞而非其他组织中表达的mmp3在肿瘤生长中起重要作用。

4.下调细胞mmp3表达的慢病毒和VSV^M51R病毒联合使用，可以有效的抑制肿瘤生长并提高生存率

对小鼠右前肢腋下接种7×10⁵个MC-38细胞，待肿瘤长至直径在0.5cm左右时进行分组，分为单独病毒治疗组和联合病毒治疗组。之后分别在第7天将1×10⁸pFU的慢病毒，第8天将3×10⁷pFU的VSV^M51R病毒，第10和12天将5×10⁸PFU的慢病毒和3×10⁷PFU的VSV^M51R病毒按图4A的治疗方案注射到肿瘤组织中来进行治疗。在接种后16天肿瘤体积开始出现不同，之后各组之间差距越来越明显，VSV治疗组(VSV^M51R)相比PBS组减少了肿瘤的大小。重要的是VSV^M51R溶瘤病毒治疗加上慢病毒介导的mmp3下调(LV+VSV^M51R)组大大改善肿瘤体积大小，而单独下调mmp3和PBS组比较，没有发现显著的疗效(图4B和3.1C)。在小鼠生存率的统计中可以看见PBS组小鼠死亡的速度最快且在30天时就已经全部死亡，同时单独下调mmp3和PBS组几乎相同。在对小鼠进行VSV^M51R治疗的小鼠死亡较慢且生存时间相对前两组有所延长。最重要的是VSV^M51R溶瘤病毒治疗加上慢病毒介导的mmp3下调组小鼠生存时间明显延长，而且有两只小鼠可以完全治愈(图4D)。

5.下调细胞mmp3表达的siRNA和VSV^M51R病毒联合使用，可以有效的抑制肿瘤生长并提高生存率

考虑到慢病毒介导的mmp3下调在应用中的安全性，使用siRNA代替慢病毒在小鼠肿瘤中下调mmp3。首先在体外使用终浓度为100nm的simmp3和NC转染到24孔板的MC-38细胞中，转染48h后分别提取RNA和准备WB的样品，通过RT-PCR和WB验证mmp3的下调情况。由图5A和B可知siRNA对mmp3在基因水平的下调效率可达到70％左右，WB的结果也可以看出抑制之后mmp3的表达量也几乎没有，这说明siRNA是可用的。

接下来对小鼠右前肢腋下接种7×10⁵个MC-38细胞，待肿瘤长至直径在0.5cm左右时进行分组，分为对照组，单独下调治疗组，单独病毒治疗组和联合病毒治疗组。如图5C在接种后的第八天开始对单独siRNA治疗组每只每次小鼠肿瘤注射0.5ng的siRNA，对单独病毒治疗组每只每次小鼠肿瘤注射3×10⁷PFU的病毒，对联合治疗组每次每只注射0.5ng的siRNA和3×10⁷PFU的病毒。病毒每隔一天注射一次，总计注射3次。siRNA每隔3天注射一次，总计注射4次。

在接种后16天肿瘤体积开始出现不同，之后各组之间差距越来越明显，与之前的结果一致，VSV治疗组(VSV^M51R)相比PBS组减少了肿瘤的大小。同样是VSV^M51R溶瘤病毒治疗加上siRNA介导的mmp3下调(simmp3+VSV^M51R)组大大改善肿瘤体积大小，在第24天时统计相对于其他组均有显著性差异。而单独下调mmp3和PBS组比较，没有发现显著的疗效(图5D和3.2E)。在小鼠生存率的统计中，可以看见PBS组小鼠死亡的速度最快且在33天时就已经全部死亡，同时单独下调mmp3和PBS组小鼠完全死亡的时间点相同。在对小鼠进行VSV^M51R治疗的小鼠死亡较慢且生存时间相对前两组有所延长。最重要的是VSV溶瘤病毒治疗加上siRNA介导的mmp3下调组小鼠生存时间明显延长，而且也有两只小鼠可以完全治愈(图5F)。

从两个实验中获得了一致的实验结果，联合治疗可有效抑制肿瘤生长并且提高生存率。

6.mmp3抑制剂NNGH和VSV^M51R病毒联合抑制肿瘤生长

前面分别用慢病毒和siRNA联合VSV^M51R溶瘤病毒对小鼠结肠癌皮下肿瘤进行联合治疗，都得到了一致的结果，这两种联合治疗都可以显著的抑制小鼠皮下肿瘤的生长并且提高生存率。为了进一步验证上述实验结果，利用能够抑制mmp3功能的抑制剂再联合VSV^M51R溶瘤病毒对皮下肿瘤进行联合治疗。

首先选择已发表过的mmp3抑制剂NNGH，分子结构如图6A所示，以往的研究表明此抑制剂可以抑制mmp3功能，从而影响caspase-12下游的神经元凋亡信号转导过程。首先我们在体外验证抑制剂的效果，在Transwell的24孔板中预铺25ug的基质胶于37℃孵育1h，之后按每孔5×10⁴的细胞量将已经加入终浓度为10kiNNGH的MC-38细胞接种。铺板后48h先刮去上层细胞并用70％酒精浸泡下层细胞5min对细胞进行固定，然后用1×PBS缓慢清洗掉酒精，最后用0.5％的结晶紫进行染色，显微镜下观测膜上细胞的迁移情况。发现NNGH处理过的MC-38，迁移能力减弱，在膜上的细胞数目显著减少(图6B)

接下来对小鼠右前肢腋下接种7×10⁵个MC-38细胞，待肿瘤长至直径在0.5cm左右时进行分组，分为对照组，单独NNGH下调治疗组，单独病毒治疗组和联合病毒治疗组。如图6C在接种后的第9天开始对单独NNGH治疗组每只每次小鼠肿瘤注射50Ki的NNGH，对单独病毒治疗组每只每次小鼠肿瘤注射3×10⁷PFU的病毒，对联合治疗组每次每只注射50Ki的NNGH和3×10⁷PFU的病毒。病毒和抑制剂每隔一天注射一次，病毒总计注射3次，抑制剂总计注射8次。

在接种后17天肿瘤体积开始出现不同，之后各组之间差距越来越明显，与之前的结果一致，VSV治疗组(VSV^M51R)相比PBS组减少了肿瘤的大小。VSV^M51R溶瘤病毒治疗加上NNGH介导的mmp3下调(NNGH+VSV^M51R)大大改善肿瘤体积大小，在第25天时统计相对于其他组均由显著性差异。而单独下调mmp3和PBS组比较几乎相同(图6D和3.3E)。在小鼠生存率的统计中，可以看见PBS组小鼠死亡的速度最快且在33天时就已经全部死亡。同时单独下调mmp3和VSV^M51R治疗组小鼠完全死亡的时间点相同，但在小鼠死亡过程中VSV^M51R治疗组小鼠相对较缓。最重要的是VSV^M51R溶瘤病毒治疗加上NNGH介导的mmp3下调组小鼠生存时间明显延长，而且有一只小鼠可以完全治愈(图6F)。

7.下调细胞mmp3表达的siRNA和HSV病毒联合使用，可以有效的抑制肿瘤生长并提高生存率

实验方法参照上述“5.下调细胞mmp3表达的siRNA和VSV^M51R病毒联合使用，可以有效的抑制肿瘤生长并提高生存率”，将病毒替换成HSV-1，HSV-1的剂量为每次1×10⁷PFU，其余同“5.下调细胞mmp3表达的siRNA和VSV^M51R病毒联合使用，可以有效的抑制肿瘤生长并提高生存率”，具体结果如图7所示，HSV治疗组相比PBS组减少了肿瘤的大小。同样是HSV溶瘤病毒治疗加上siRNA介导的mmp3下调(HSV+Simmp3)组大大改善肿瘤体积大小。而单独下调mmp3和PBS组比较，没有发现显著的疗效。在小鼠生存率的统计中，可以看见Simmp3组小鼠死亡的速度最快且在33天时就已经全部死亡，PBS组小鼠完全死亡的时间点略晚于Simmp3组小苏。在对小鼠进行HSV治疗的小鼠死亡较慢且生存时间相对前两组有所延长。最重要的是HSV治疗加上siRNA介导的mmp3下调组小鼠生存时间明显延长，而且也有小鼠可以完全治愈。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种实体肿瘤联合治疗组合物

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggtggatgc tgtctttgaa ttcaagagat tcaaagacag catccacctt ttttc 55

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgagaaaaa aggtggatgc tgtctttgaa tctcttgaat tcaaagacag catccacca 59

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggaggtttg atgagaagaa ttcaagagat tcttctcatc aaacctcctt ttttc 55

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgagaaaaa aggaggtttg atgagaagaa tctcttgaat tcttctcatc aaacctcca 59

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> Mus musculus

<400> 5

ggagguuuga ugagaagaa 19

Claims (10)

1.一种实体肿瘤联合治疗组合物，其特征在于：有效组分至少包括mmp3拮抗物质和溶瘤病毒。

2.如权利要求1所述的实体肿瘤联合治疗组合物，其特征在于：所述mmp3拮抗物质包括shRNA、siRNA和mmp3抑制剂中的至少一种。

3.如权利要求2所述的实体肿瘤联合治疗组合物，其特征在于：所述mmp3抑制剂包括NNGH。

4.如权利要求1所述的实体肿瘤联合治疗组合物，其特征在于：所述溶瘤病毒为VSV、HSV、腺病毒、痘病毒、呼肠孤病毒或微小RNA病毒。

5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的实体肿瘤联合治疗组合物，其特征在于：所述实体肿瘤包括结肠癌、肺癌和乳腺癌。

6.mmp3拮抗物质和溶瘤病毒共同在制备实体肿瘤治疗组合物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述mmp3拮抗物质包括shRNA、siRNA和mmp3抑制剂中的至少一种。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述mmp3抑制剂包括NNGH。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述溶瘤病毒为VSV、HSV、腺病毒、痘病毒、呼肠孤病毒或微小RNA病毒。

10.如权利要求6至9中任一权利要求所述的应用，其特征在于：所述实体肿瘤包括结肠癌、肺癌和乳腺癌。

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