CN110564767A - 一种减毒病毒载体系统及其在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用及药物使用方法 - Google Patents

一种减毒病毒载体系统及其在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用及药物使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明揭示一种减毒病毒载体系统及其在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用及药物使用方法，该病毒为RNA病毒，其遗传物质在哺乳动物细胞中不具备整合能力，该病毒为弹状病毒科、水疱性口炎病毒属，病毒载体系统结构基因嵌合编码的分子至少包括一种特异性针对免疫检查点分子的抑制剂，该减毒病毒载体系统嵌合表达针对免疫检查点的单链抗体的新型重组表达载体系统，可特异性在肿瘤细胞中完成复制的同时表达外泌结合肿瘤细胞表面分子的特异性抗体，释放肿瘤抗原的同时激活免疫细胞抗肿瘤的特异性免疫应答，同时外泌的单链抗体打破肿瘤微环境的免疫抑制作用，促进CTL细胞对肿瘤细胞的清除，促进机体产生系统性的特异性抗肿瘤免疫记忆反应，控制肿瘤的复发。

Description

一种减毒病毒载体系统及其在制备抗恶性肿瘤的药物中的应 用及药物使用方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域领域，尤其涉及一种减毒病毒载体系统及其在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用及药物使用方法。
背景技术
过去十年里，癌症患者治疗方案的选择范围发生了巨大的变化。随着对肿瘤生长和发展相关驱动突变(driver mutation)的认识、加上这些特定突变靶向分子抑制剂研发工作的开展，一个新的肿瘤治疗领域即精准肿瘤学随之而生，肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。这个生物过程十分复杂，目前仍处于大量的基础研究之中。
上世纪90年代，多个科研小组已经发现了肿瘤抗原(tumor antigens)，T淋巴细胞可以通过主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)依赖性方式识别这些肿瘤抗原。在某些情况下，抗原通常指病毒蛋白、突变的自体抗原(其中一些是驱动致癌基因driver oncogenes)、去阻遏(derepressed)胚胎抗原、过表达的已分化或自体正常蛋白。肿瘤细胞以多种途径产生并释放抗原，例如细胞内激酶，肿瘤细胞原发性坏死，放疗、化疗或靶向治疗的机体反应。除了抗原外，在细胞应激、缺氧、营养物质枯竭和创伤的环境中，死亡的肿瘤细胞也可以释放多种免疫原性的分子，这些分子可以与细胞表面或细胞内受体(例如toll样受体)结合，从而触发先天免疫反应(innate immune responses)。此外，肿瘤微环境中的特异性抗原递呈细胞(antigen-presenting cells，例如树突细胞)可以吞噬死亡的肿瘤细胞和可溶性抗原。CD8+T细胞。为了达到更好的区分效果，T细胞激活还设置了二级信号识别系统，一种由共刺激分子(costimulatory molecule)介导的信号通路。一旦在共刺激分子存在的情况下被激活，T细胞可以循着局部趋化因子的浓度梯度迁移到肿瘤微环境中。T细胞到达肿瘤细胞附近后，T细胞受体可以通过I型MHC-多肽复合物识别肿瘤细胞表面的同源抗原。T细胞可以释放细胞毒性因子(例如granzyme B颗粒酶B和perforins穿孔素)，这些细胞毒性因子可以调控抗原-表达性肿瘤细胞的直接溶解，同时对毗邻的无抗原-表达性肿瘤细胞产生旁观者效应(bystander effect)。有些肿瘤的微环境中存在大量的激活型效应淋巴细胞(effector lymphocytes)，这些肿瘤一般有较好的预后，而且对免疫治疗有较好的治疗响应，尽管存在肿瘤-免疫循环，但是已经成形的肿瘤可能通过多种宿主、肿瘤和免疫机制逃脱宿主的免疫侦测(detection)和清除(eradication)。
此外，有研究报道肿瘤微环境会聚集大量的抑制性免疫细胞，例如调控性CD4+阳性T细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓样抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells)，这些免疫细胞可以抑制激活型效应T细胞的活性。肿瘤细胞以何种方式死亡可能决定了何种免疫反应会被激活。例如，肿瘤细胞凋亡(apoptosis)可能会诱发T细胞耐受(T-celltolerance)，而肿瘤细胞坏死(necrosis)或焦亡(pyroptosis)、程序性细胞死亡可能会诱发激活型肿瘤特异性T细胞反应
虽然经过数10年的新技术新疗法在癌症治疗中的开发研究，若干恶性肿瘤的治愈率目前已得到显著改善，但在过去的数十年中晚期实体瘤患者的结果仍残酷地维持不变，这强调需要新疗法，目前已经投入到实体瘤临床使用的就是肿瘤免疫检查点的抗体，例如PD-1/PD-L1和CTLA4的抗体治疗，这些有效拮抗免疫检查点分子的单克隆抗体的关键点在于单位体积有效产能，除此之外，免疫检查点抗体面临耐药性的问题亟待解决，目前肿瘤免疫治疗的研究进展受到各国关注。衍生出包括T细胞节点抑制剂、溶瘤病毒、嵌合抗原受体T细胞等多种免疫相关的肿瘤治疗策略。众所周知，高效的免疫疗法需要具备以下几大特点：诱导产生持久的临床反应；没有典型的耐药性；诱导产生自体免疫样毒性。临床肿瘤学家需要深入了解肿瘤靶向治疗和肿瘤免疫治疗的临床应用现状，只有这样才能为癌症患者提供高质量的治疗方案。肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。
因此鉴于当下发展迅猛的免疫检查点抗体类产品在临床上遇到的耐药性问题，一些跨国集团开发出溶瘤病毒以及相关产品，有效的解决了此问题，同时会大大降低治疗费用，而且溶瘤病毒疗法的靶向性较强，相较于传统疗法或者一些新疗法，溶瘤病毒疗法副作用更低。2015年安进公司T-vec产品的上市对此肿瘤突破性疗法产生了巨大的推动作用。
一些基因编辑修饰的重组病毒作为一种新的肿瘤治疗制剂，通过病毒对肿瘤细胞的杀伤作用和诱导全身性抗肿瘤免疫反应两种作用机制引发抗肿瘤免疫反应。其具体的分子机制尚不明确，部分已有的研究结果显示机制是病毒在肿瘤细胞中的复制增殖而诱导细胞死亡、与肿瘤细胞抗病毒元件的相互作用、促进内在自发的或特异性抗肿瘤免疫反应等多种作用因素，鉴于这些改造过的病毒载体系统的独特性，国际生物医药巨头公司和科研机构纷纷开展相关的研发计划和临床试验项目。
发明内容
本发明提供一种减毒病毒载体系统及其在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用及药物使用方法，使用非整合、可复制的负链病毒作为载体系统嵌合免疫检查点抗体，用于肿瘤的治疗。
一方面，本发明公开了一种减毒病毒载体系统，所述病毒为RNA病毒，所述病毒的遗传物质在哺乳动物细胞中不具备整合能力，所述病毒为弹状病毒科、水疱性口炎病毒属，所述病毒载体系统结构基因嵌合编码的分子至少包括一种特异性针对免疫检查点分子的抑制剂。
在一些较佳的实施方式中，所述水疱性口炎病毒为减毒的突变株，所述的突变株是M基因第51氨基酸发生M-＞R突变，点突变至少包含病毒M基因1个或多个点突变。
在一些较佳的实施方式中，细胞表面免疫检查点分子的抗体及抗体类似物是单链抗体、单域抗体、双功能单链抗体或多功能单域抗体中的一种或多种，所述抗体及抗体类似物所述的免疫检查点分子在肿瘤细胞表面异常表达。
在一些较佳的实施方式中，所述病毒至少包括水疱性口炎病毒或马拉巴病毒中的一种，或者保留所述水疱性口炎病毒或马拉巴病毒的生物活性的重组水疱性口炎病毒或重组马拉巴病毒。
在一些较佳的实施方式中，所述水疱性口炎病毒选自水疱性口炎病毒印第安纳株、水疱性口炎病毒新泽西株；所述重组水疱性口炎病毒或重组的马拉巴病毒相对于自然的野生型病毒，保持溶瘤和/或减毒的特性。
另一方面，本发明还提供一种减毒病毒载体系统在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用，其包括上述减毒病毒载体系统。
在一些较佳的实施方式中，所述药物中的活性物质还包括氯贝特类、胆碱、蛋氨酸、烟酸类或熊去氧胆酸中的一种或多种。
在一些较佳的实施方式中，所述药物还包括牛痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、甲病毒、细小病毒及肠道病毒株的一种或多种溶瘤病毒或相应的减毒株。
又一方面，本发明还提供一种减毒病毒载体系统在用于杀死异常增生性细胞、诱导促进抗肿瘤免疫反应或消除肿瘤组织微环境免疫抑制的药物中的应用，所述药物至少包括所述减毒病毒载体系统。
在一些较佳的实施方式中，所述异常增生性细胞被包含在患者体内的肿瘤细胞或肿瘤组织相关细胞。
在一些较佳的实施方式中，所述肿瘤细胞是癌细胞，且为转移性癌细胞。
又一方面，本发明还提供一种减毒病毒载体系统制备获得的药物的使用方法，所述使用方法至少包括如下步骤：
施用减毒病毒载体系统病毒制剂以使其能够选择性地在肿瘤细胞中复制；
施用其他免疫检查点抑制剂，所述其他免疫检查点抑制剂为PD-1抗体；
其中，所述减毒病毒载体系统为水疱性口炎病毒系统。
在一些较佳的实施方式中，所述的水疱性口炎病毒减毒病毒制剂中，所述的VSV病毒嵌合的免疫检查点优选是抑制肿瘤细胞靶点PDL1，优选的免疫抑制剂是单链抗体或抗体类似物，所述的免疫检查点分子的抗体优选是单链抗体，所述的抗体类似物包含但不局限于单链抗体、单域抗体、双功能抗体或多功能单域抗体。
在一些较佳的实施方式中，肿瘤细胞表面免疫检查点分子包括表面分子Her2或PDL1，所述细胞表面免疫检查点分子在肿瘤细胞表面上特异性表达，免疫细胞表面免疫检查点分子包括表面分子CTLA4或PD1，所述细胞表面免疫检查点分子在免疫细胞表面上特异性表达。
在一些较佳的实施方式中，所述药物的使用方法在用于个体中癌症时可用于肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌或肝癌的治疗。
在一些较佳的实施方式中，所述药物使用时至少包括肌注，静脉注射或瘤内给药中的一种。
在一些较佳的实施方式中，所述水疱性口炎病毒系统重组子、包含分离的重组水疱性口炎病毒重组子的组合物或疫苗通过包括腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮肤内、瘤内、皮下或鼻内给药中的一种或多种的给药方式而被施用；优选的，所述给药方式的给药途径包括内镜、腔镜、介入、微创、传统手术中的一种或多种，所述免疫检查点抑制剂通过静脉给药或腹腔给药。
在一些较佳的实施方式中，所述方法进一步包括施用第二抗肿瘤疗法，所述第二种抗肿瘤疗法包括化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术疗法中的一种或多种。
在一些较佳的实施方式中，所述肿瘤和/或癌症至少包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌或白血病中的一种或多种。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
本发明通过设计开发能够快速高效嵌合表达人源化的功能性单链抗体的减毒载体系统(VSV-scFV-PDL1)，来填补了国内外在这一需求长期得不到解决的问题。本发明将编码免疫检查点分子PDL1的单链抗体的核苷酸序列通过基因编辑的手段嵌合到修饰过的病毒表达载体中，在特定的真核细胞中重组获得稳定表达嵌合单链抗体的减毒病毒系统，筛选得到能够在瘤体组织中高效表达单链抗体的VSV-scFV-PDL1溶瘤病毒，同时利用该溶瘤病毒进一步在实体瘤模型中对小鼠肿瘤的疗效进行评价，为开发实体瘤的治疗产品提供了新的技术方案和选择；
本发明的涉及到的减毒弹状病毒在世界大多数人中都很少或者不存在特异性血清抗体；
发明中涉及到的减毒弹状病毒生长至高效价，可通过0.22um过滤器来过滤，可以实现规模化生产；
该类病毒及其重组子具有广泛的宿主，能够感染许多不同类型的癌细胞，并且不受特定细胞上的受体的限制；
VSV-M51R重组弹状病毒还具有仅在细胞质完成复制周期，并且不会整合到宿主细胞的遗传物质上，赋予了该系统更加有利的安全性。
本发明实施例中仅实现上述任一技术效果即可。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：VSV-M51R减毒弹状病毒构建示意图；
图2：VSV-M51R和野生型病毒VSV在293T(A)和Vero复制曲线比较。；
图3：VSV-scFv-PD-L1减毒弹状溶瘤病毒构建示意图；
图4：单链抗体在VSV-scFv-PD-L1感染的肿瘤细胞B16和LLC细胞裂解液和上清中的检测；
图5：竞争性酶联吸附反应ELISA检测VSV-scFv-PD-L1感染细胞上清中scFv的含量；
图6：VSV-scFv-PD-L1在小鼠非小细胞肺癌治疗作用，其中A为小鼠非小细胞肺癌模型构建及治疗示意图，B为小鼠非小细胞肺癌大小在各组接种后18天大小的检测，C为小鼠非小细胞肺癌各治疗组的生存率统计；
图7：VSV-scFv-PD-L1在结肠癌模型中治疗作用，其中A为小鼠结肠癌模型构建及治疗示意图，B为小鼠结肠癌大小在各组接种后18天大小的检测，C为小鼠结肠癌模型各治疗组的生存率统计。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例提供一种减毒病毒载体系统，该病毒为RNA病毒，该病毒的遗传物质在哺乳动物细胞中不具备整合能力，该病毒为弹状病毒科、水疱性口炎病毒属，该病毒载体系统结构基因嵌合编码的分子至少包括一种特异性针对免疫检查点分子的抑制剂。
优选的，水疱性口炎病毒为减毒的突变株，所述突变株是M基因第51氨基酸发生M-＞R突变，点突变至少包含病毒M基因1个或多个点突变。
优选的，细胞表面免疫检查点分子的抗体及抗体类似物是单链抗体、单域抗体、双功能单链抗体或多功能单域抗体中的一种或多种，所述抗体及抗体类似物所述的免疫检查点分子在肿瘤细胞表面异常表达。
优选的，所述病毒至少包括水疱性口炎病毒或马拉巴病毒中的一种，或者保留所述水疱性口炎病毒或马拉巴病毒的生物活性的重组水疱性口炎病毒或重组马拉巴病毒。
优选的，所述水疱性口炎病毒选自水疱性口炎病毒印第安纳株、水疱性口炎病毒南希株；所述重组水疱性口炎病毒或重组的马拉巴病毒相对于自然的野生型病毒，保持溶瘤和/或减毒的特性。
本实施例以水疱性口炎病毒系统(VSV-scFv-PD-L1)为例进一步描述其构建过程，具体包括如下步骤：
1、VSV-M51R病毒治疗载体的构建
VSV-M51R载体系统高效嵌合单链抗体的外泌表达，对应的病毒为重组的非节段单股负义链RNA病毒，病毒的RNA无感染性，基因嵌合表达编码免疫球蛋白可变区域的cDNA基因序列。
在本实施例中，通过分子生物学实验手段，我们在M基因51aa构建点突变，把突变M基因通过xbaI和Mlu I酶切位点克隆到含有VSV全长基因组的质粒VSV-XN2，通过反向遗传学手段，在BHK细胞中拯救出VSV-M51R突变弱毒株，图1为VSV-M51R构建示意图。M51R已经被报道与VSV病毒抵抗I型干扰素相关，我们以VSV-M51R感染IFN信号通路正常的293T细胞，发现VSV-M51R病毒与野生型病毒VSV-GFP比较，在不同时间点，复制显著降低1-2个log数量级；但是如图2所示，在IFN信号通路缺陷的Vero细胞中，VSV-M51R病毒和野生VSV-GFP病毒复制无明显差异，表明我们确实得到了VSV减毒株VSV-M51R。
2、嵌合PD-L1单链抗体scFv溶瘤病毒VSV-scFv-PD-L1构建
针对人源的免疫检查点的抗体，例如CTLA4，PD-1，PDL1等在临床治疗中展现了一定的抑制肿瘤生长的效果，但是单克隆抗体的耐药性以及高昂的费用限制了进一步应用和发展。
我们根据商品化的PD-L1的单抗药物Avelumab PD-L1抗体序列，通过计算机模拟和优化，在单链抗体L链和H链之间加上(GGGGS)3的接头序列，得到PD-L1的单链抗体序列(SEQ ID NO：1)，委托基因合成公司合成scFv PD-L1基因片段。通过XhoI和NheI酶切位点，scFv PD-L1基因片段克隆到M基因51位突变VSV基因组G和L基因之间。通过反向遗传学系统，在BHK细胞中拯救出重组病毒VSV-scFv-PD-L1，具体病毒构建示意图参见图3。我们利用VSV-scFv-PD-L1感染肿瘤细胞黑色素瘤细胞B16和非小细胞肺癌LLC，通过蛋白免疫印迹，单链抗体PD-L1在感染细胞裂解液和细胞培养上清中都能够得到表达，如图4所示。进一步通过竞争性酶联吸附实验检测，如图5所示，我们确认PD-L1单链抗体在上清中的浓度约为50ng/mL。
实施例2：
本实施例提供一种减毒病毒载体系统在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用，其包括上述减毒病毒载体系统。
优选的，所述药物中的活性物质还包括氯贝特类、胆碱、蛋氨酸、烟酸类或熊去氧胆酸中的一种或多种。
优选的，所述药物还包括牛痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、甲病毒、细小病毒及肠道病毒株的一种或多种溶瘤病毒或相应的减毒株。
又一方面，本实施例还提供一种减毒病毒载体系统在用于杀死异常增生性细胞、诱导促进抗肿瘤免疫反应或消除肿瘤组织微环境免疫抑制的药物中的应用，所述药物至少包括所述减毒病毒载体系统。
优选的，所述异常增生性细胞被包含在患者体内的肿瘤细胞或肿瘤组织相关细胞。
优选的，所述肿瘤细胞是癌细胞，且为转移性癌细胞。
又一方面，本实施例还提供一种减毒病毒载体系统制备获得的药物的使用方法，所述使用方法至少包括如下步骤：
施用减毒病毒载体系统病毒制剂以使其能够选择性地在肿瘤细胞中复制；
施用其他免疫检查点抑制剂，所述其他免疫检查点抑制剂为PD-1抗体；
其中，所述减毒病毒载体系统为水疱性口炎病毒系统。
优选的，所述的水疱性口炎病毒减毒病毒制剂中，所述的VSV病毒嵌合的免疫检查点优选是抑制肿瘤细胞靶点PDL1，优选的免疫抑制剂是单链抗体或抗体类似物，所述的免疫检查点分子的抗体优选是单链抗体，所述的抗体类似物包含但不局限于单链抗体、单域抗体、双功能抗体或多功能单域抗体。
优选的，肿瘤细胞表面免疫检查点分子包括表面分子Her2或PDL1，所述细胞表面免疫检查点分子在肿瘤细胞表面上特异性表达，免疫细胞表面免疫检查点分子包括表面分子CTLA4或PD1，所述细胞表面免疫检查点分子在免疫细胞表面上特异性表达。
优选的，所述药物的使用方法在用于个体中癌症时可用于肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌或肝癌的治疗。
优选的，所述药物使用时至少包括肌注，静脉注射或瘤内给药中的一种。
优选的，所述水疱性口炎病毒系统重组子、包含分离的重组水疱性口炎病毒重组子的组合物或疫苗通过包括腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮肤内、瘤内、皮下或鼻内给药中的一种或多种的给药方式而被施用；优选的，所述给药方式的给药途径包括内镜、腔镜、介入、微创、传统手术中的一种或多种，所述免疫检查点抑制剂通过静脉给药或腹腔给药。
优选的，所述方法进一步包括施用第二抗肿瘤疗法，所述第二种抗肿瘤疗法包括化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术疗法中的一种或多种。
优选的，所述肿瘤和/或癌症至少包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌或白血病中的一种或多种。
本实施例以溶瘤病毒VSV-scFv-PD-L1在小鼠非小细胞肺癌的治疗为例进行具体描述。
本案例是利用专利中涉及到的VSV-M3系统对实体瘤治疗的效果评价，利用病毒载体系统表达具有功能的特异性抗体结合肿瘤组织中免疫检查点抗原，打破肿瘤局部的免疫抑制作用。具体实施案例中涉及用特定的纯化的重组非节段、负链RNA病毒载体表达的抗体治疗实施。单链抗体与检查点抗原结合，阻断了肿瘤细胞的免疫抑制作用，提高增强了免疫细胞的杀伤活性。
具体技术细节：首先是转移型非小细胞肺癌模型的建立，如图6所示，按每只CB7BL/6皮下接种4.0*10^5(200uL)LLC细胞。每隔1天测量肿瘤大小，按如下公式计算：M12*M2/2(M1：短径，M2：长径)。待每组小鼠肿瘤体积生长超过50mm3后，分别在day8，day10和day12给予107PFU(20ul)的瘤内注射病毒进行治疗，连续观察记录肿瘤体积的变化情况(图6A)。
VSV-scFV-PDL1免疫治疗的药效性能测试，如图6所示连续3次隔天的瘤内注射治疗，VSV-scFV-PDL1和对照病毒VSV-M51R比较，能有效抑制肿瘤的生长趋势，大大延缓小鼠的生命周期，通过分析PBS未接受治疗小鼠组肿瘤大小在接种后第18天为1450mm3，VSV-M51R治疗组大小为880mm3左右，而小鼠接受VSV-scFV-PDL1治疗组大小约为400mm3左右(图6B)。通过小鼠生存曲线，发现VSV-scFV-PDL1治疗组约30％的小鼠肿瘤缩小直至消失，完全缓解，近40％的小鼠肿瘤的生长速度得到有效抑制，部分缓解，最后生存率为60％，大大优于VSV-M51R治疗组(20％)，PBS未治疗组(0％)，如图6C所示。
实施案例3：本实施例以溶瘤病毒VSV-scFv-PD-L1在小鼠节直肠癌的治疗为例进行具体描述。
首先是小鼠结直肠癌模型的建立，如图7A所示，按每只CB7BL/6皮下接种2.0*10^5(200uL)MC38结肠癌细胞。每隔1天测量肿瘤大小，按如下公式计算：M12*M2/2(M1：短径，M2：长径)。待每组小鼠肿瘤体积生长超过50mm3后，分别在day7，day9和day11给予107PFU(20ul)的瘤内注射病毒进行治疗，连续观察记录肿瘤体积的变化情况。
VSV-scFV-PDL1免疫治疗的药效性能测试，如图7B所示，和在小鼠非小细胞肺癌类似，溶瘤病毒荷载PD-L1单链抗体治疗，和对照组病毒VSV-M51R治疗比较，能有效抑制肿瘤组织的生长，在接种后第18天为200mm3大小左右，而VSV-M51R治疗组大小为500mm3左右，PBS组大小约为1500mm3左右(图7B)。对于小鼠40天生存率的统计结果分析，VSV-scFV-PDL1治疗组小鼠能达到66％的存活率，显著高于VSV-M51R组和PBS组(图7C)，说明了PD-L1单链抗体在抗小鼠肿瘤中发挥了重要作用。
本发明通过设计开发能够快速高效嵌合表达人源化的功能性单链抗体的减毒载体系统(VSV-scFV-PDL1)，来填补了国内外在这一需求长期得不到解决的问题。本发明将编码免疫检查点分子PDL1的单链抗体的核苷酸序列通过基因编辑的手段嵌合到修饰过的病毒表达载体中，在特定的真核细胞中重组获得稳定表达嵌合单链抗体的减毒病毒系统，筛选得到能够在瘤体组织中高效表达单链抗体的VSV-scFV-PDL1溶瘤病毒，同时利用该溶瘤病毒进一步在实体瘤模型中对小鼠肿瘤的疗效进行评价，为开发实体瘤的治疗产品提供了新的技术方案和选择；
本发明的涉及到的减毒弹状病毒在世界大多数人中都很少或者不存在特异性血清抗体；
发明中涉及到的减毒弹状病毒生长至高效价，可通过0.22um过滤器来过滤，可以实现规模化生产；
该类病毒及其重组子具有广泛的宿主，能够感染许多不同类型的癌细胞，并且不受特定细胞上的受体的限制；
VSV-M51R重组弹状病毒还具有仅在细胞质完成复制周期，并且不会整合到宿主细胞的遗传物质上，赋予了该系统更加有利的安全性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 董春升
<120> 一种减毒病毒载体系统及其在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用及药物使用方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcagagcg ccctgaccca gcccgccagc gtgagcggca gccccggcca gagcatcacc 60
atcagctgca ccggcaccag cagcgacgtg ggcggctaca actacgtgag ctggtaccag 120
cagcaccccg gcaaggcccc caagctgatg atctacgacg tgagcaacag gcccagcggc 180
gtgagcaaca ggttcagcgg cagcaagagc ggcaacaccg ccagcctgac catcagcggc 240
ctgcaggccg aggacgaggc cgactactac tgcagcagct acaccagcag cagcaccagg 300
gtgttcggca ccggcaccaa ggtgaccgtg ctgggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 360
agcggcggcg gcggcagcga ggtgcagctg ctggagagcg gcggcggcct ggtgcagccc 420
ggcggcagcc tgaggctgag ctgcgccgcc agcggcttca ccttcagcag ctacatcatg 480
atgtgggtga ggcaggcccc cggcaagggc ctggagtggg tgagcagcat ctaccccagc 540
ggcggcatca ccttctacgc cgacaccgtg aagggcaggt tcaccatcag cagggacaac 600
agcaagaaca ccctgtacct gcagatgaac agcctgaggg ccgaggacac cgccgtgtac 660
tactgcgcca ggatcaagct gggcaccgtg accaccgtgg actactgggg ccagggcacc 720
ctggtgaccg tgagcagcca ccaccaccac caccac 756

Claims (19)

1.一种减毒病毒载体系统，其特征在于，所述病毒为RNA病毒，所述病毒的遗传物质在哺乳动物细胞中不具备整合能力，所述病毒为弹状病毒科、水疱性口炎病毒属，所述病毒载体系统结构基因嵌合编码的分子至少包括一种特异性针对免疫检查点分子的抑制剂。
2.根据权利要求1所述的一种减毒病毒载体系统，其特征在于，所述水疱性口炎病毒为减毒的突变株，所述的突变株是M基因第51氨基酸发生M-＞R突变，点突变至少包含病毒M基因1个或多个点突变。
3.根据权利要求2所述的一种减毒病毒载体系统，其特征在于，细胞表面免疫检查点分子的抗体及抗体类似物是单链抗体、单域抗体、双功能单链抗体或多功能单域抗体中的一种或多种，所述抗体及抗体类似物所述的免疫检查点分子在肿瘤细胞表面异常表达。
4.根据权利要求1或2所述的一种减毒病毒载体系统，其中，所述病毒至少包括水疱性口炎病毒或马拉巴病毒中的一种，或者保留所述水疱性口炎病毒或马拉巴病毒的生物活性的重组水疱性口炎病毒或重组马拉巴病毒。
5.根据权利要求4所述的一种减毒病毒载体系统，其特征在于，所述水疱性口炎病毒选自水疱性口炎病毒印第安纳株、水疱性口炎病毒新泽西株；所述重组水疱性口炎病毒或重组的马拉巴病毒相对于自然的野生型病毒，保持溶瘤和/或减毒的特性。
6.一种减毒病毒载体系统在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述药物至少包括如权利要求1～5任意一项所述的一种减毒病毒载体系统。
7.根据权利要求6所述的一种减毒病毒载体系统在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述药物中的活性物质还包括氯贝特类、胆碱、蛋氨酸、烟酸类或熊去氧胆酸中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的一种减毒病毒载体系统在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述药物还包括牛痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、甲病毒、细小病毒及肠道病毒株的一种或多种溶瘤病毒或相应的减毒株。
9.一种减毒病毒载体系统在用于杀死异常增生性细胞、诱导促进抗肿瘤免疫反应或消除肿瘤组织微环境免疫抑制的药物中的应用，其特征在于，所述药物至少包括如权利要求1～5任意一项所述的一种减毒病毒载体系统。
10.根据权利要求9所述的一种减毒病毒载体系统在用于杀死异常增生性细胞、诱导促进抗肿瘤免疫反应或消除肿瘤组织微环境免疫抑制的药物中的应用，其特征在于，所述异常增生性细胞被包含在患者体内的肿瘤细胞或肿瘤组织相关细胞。
11.根据权利要求9所述的一种减毒病毒载体系统在用于制备杀死异常增生性细胞、诱导促进抗肿瘤免疫反应或消除肿瘤组织微环境免疫抑制的药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞是癌细胞，且为转移性癌细胞。
12.一种如权利要求6～11任一项所述的一种减毒病毒载体系统制备获得的药物的使用方法，其特征在于，所述使用方法至少包括如下步骤：
施用减毒病毒载体系统病毒制剂以使其能够选择性地在肿瘤细胞中复制；
施用其他免疫检查点抑制剂，所述其他免疫检查点抑制剂为PD-1抗体；
其中，所述减毒病毒载体系统为水疱性口炎病毒系统。
13.根据权利要求12所述的一种减毒病毒载体系统制备获得的药物的使用方法，其特征在于，所述的水疱性口炎病毒减毒病毒制剂中，所述的VSV病毒嵌合的免疫检查点优选是抑制肿瘤细胞靶点PDL1，优选的免疫抑制剂是单链抗体或抗体类似物，所述的免疫检查点分子的抗体优选是单链抗体，所述的抗体类似物包含但不局限于单链抗体、单域抗体、双功能抗体或多功能单域抗体。
14.根据权利要求13所述的一种减毒病毒载体系统制备获得的药物的使用方法，其特征在于，肿瘤细胞表面免疫检查点分子包括表面分子Her2或PDL1，所述细胞表面免疫检查点分子在肿瘤细胞表面上特异性表达，免疫细胞表面免疫检查点分子包括表面分子CTLA4或PD1，所述细胞表面免疫检查点分子在免疫细胞表面上特异性表达。
15.根据权利要求12所述的一种减毒病毒载体系统制备获得的药物的使用方法，其特征在于，所述药物的使用方法在用于个体中癌症时可用于肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌或肝癌的治疗。
16.根据权利要求12所述的一种减毒病毒载体系统制备获得的药物的使用方法，其特征在于，所述药物使用时至少包括肌注，静脉注射或瘤内给药中的一种。
17.根据权利要求12所述的一种减毒病毒载体系统制备获得的药物的使用方法，其特征在于，所述水疱性口炎病毒系统重组子、包含分离的重组水疱性口炎病毒重组子的组合物或疫苗通过包括腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮肤内、瘤内、皮下或鼻内给药中的一种或多种的给药方式而被施用；优选的，所述给药方式的给药途径包括内镜、腔镜、介入、微创、传统手术中的一种或多种，所述免疫检查点抑制剂通过静脉给药或腹腔给药。
18.根据权利要求12～17任一项所述的种减毒病毒载体系统制备获得的药物的使用方法，其特征在于，所述方法进一步包括施用第二抗肿瘤疗法，所述第二种抗肿瘤疗法包括化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术疗法中的一种或多种。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述肿瘤和/或癌症至少包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌或白血病中的一种或多种。
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