CN106008721B - 一种c-Met特异性嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种c‑Met特异性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由人抗c‑Met单链抗体，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。本发明还公开了上述c‑Met特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的淋巴细胞可用于c‑Met基因表达相关肿瘤的治疗。

Description

一种c-Met特异性嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及细胞免疫技术领域，尤其涉及一种c-Met特异性嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
肝癌是威胁人类健康的的恶性肿瘤之一，其中大多数为肝细胞癌(hepatocellμLar carcinoma，HCC)。由于缺乏有效的治疗手段，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。在中国，由于存在严重的乙型肝炎病毒(HBV)感染，肝癌的发病率和死亡率态势尤为严峻。如今随着分子生物学技术及基因工程技术的发展，肝癌的开辟了新的领域。细胞治疗成为继手术治疗、放疗、化疗后的又一新型模式，并展示出良好的前景。其中靶向治疗是针对明确的靶点，设计出相应的药物，药物进入体内，与靶点结合而发挥特异性作用，因而具有毒副作用低，效率高的优点。
肝癌一个有前途的候选靶点是c-met(mesenchymal epithelial transitionfactor)。c-met为肝细胞生长因子受体，具有络氨酸激酶活性，通常表达于多种组织的上皮细胞。c-met在细胞的代谢、分化以及死亡细胞的信号传导过程中起着重要的作用，当c-met和其高亲和力的配体肝细胞生长因子结合，可活化其信号通路，参与胚胎发育、组织损伤修复以及肿瘤的发生和发展。因而，以酪氨酸激酶受体c-met为靶点的抗肿瘤药物已经成为肿瘤研究中非常火热的领域，为人类对抗肿瘤提供了新的路径。
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)主要由三部分构成：胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号转导区。其中胞外抗原结合区通常是由针对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)的单克隆抗体的单链可变区序列(single chainfragment variable，scFv)构成(轻和重链可变区通过铰链区连接形成)。这部分功能是识别肿瘤相关抗原，把CAR-T细胞结合到肿瘤上去。跨膜区通常由CD3、CD28、CD8等二聚体蛋白构成。胞内信号转导区主要为免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-basedactivation motifs，ITAM，通常为CD3ζ或FcεRIγ)。其主要功能是把信号转导给T细胞，提高抗肿瘤及细胞因子分泌能力。CAR通过不断地改进，目前已经发展到了第四代。第一代CAR主要由识别肿瘤相关抗原的scFv和ITAM(通常为CD3ζ)构成，但是由于仅有CD3ζ活化信号，T细胞不能充分增值，且活化的T细胞在体内存活时间短。第二代CAR在一代CAR的基础上加入一个共刺激分子，如CD28、CD134、CD137等等，增强了T细胞激活、增殖，体内维持时间，从而提高抗肿瘤的效应。第三代CAR在二代CAR的基础上再引入一个以上的共刺激分子。第四代CAR(TRUCKS，T cells redirected for universal cytokine killing)主要通过引入IL-12，IL-23，IL-27等细胞因子，召集固有免疫细胞-巨嗜细胞等杀伤TAA阴性的肿瘤细胞。
CAR-T治疗是利用嵌合抗原受体可以特异性地识别肿瘤相关抗原(TAA，tumorassociated antigen)靶点，结合后将信号传到胞内，引起T细胞的激活和增增，清除肿瘤细胞。修饰后的T细胞不受肿瘤微环境的抑制，以非MHC(major histocompatibilitycomplex，主要组织相容性复合体)限制方式抵御肿瘤细胞。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种c-Met特异性嵌合抗原受体。
本发明的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。
本发明的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的应用。
为了实现上述目的，本发明提出的一种c-Met特异性嵌合抗原受体，由人抗c-Met单链抗体，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述人抗c-Met单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述人抗c-Met单链抗体的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述人抗c-Met单链抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。
优选地，所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
优选地，所述人抗c-Met单链抗体的重链分子和轻链分子之间有一个连接肽，其氨基酸序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。
优选地，CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选地，CD137的核酸序列如SEQ ID NO.8所示。
优选地，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成的结构域为T细胞共刺激信号传导结构，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明还提出的上述c-Met特异性嵌合抗原受体在制备治疗c-Met相关肿瘤药物中的应用。
c-Met相关的肿瘤包括肝癌、肠癌、神经胶质瘤等。
本发明根据实验室从全人源抗体库筛选出c-Met抗体Fab(可参见中国发明专利《抗Met人源Fab及其阿霉素偶联物和其制法及应用》，申请号为201110065209.2，公开日为2011年9月7日，公开号为102174106A)，经过密码子优化，基因合成抗c-Met的ScFv序列，并将合成ScFv克隆到pSFG-CD8TM-CD137-CD3ζ中，即构建成c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体，即获得本发明的嵌合抗原受体c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ。
利用嵌合抗原受体与逆转录病毒包装质粒RD114在GP2-293T细胞包装成逆转录病毒，利用该病毒感染T淋巴细胞。利用Elisa检测CAR-T细胞在抗原刺激下IFN-γ的分泌及CCK8法对c-Met阳性的肝癌细胞的杀伤作用。
本发明公布了c-Met特异性的嵌合抗原受体的结构，体外感染T淋巴细胞。修饰后的T淋巴细胞释放IFN-γ等杀伤肿瘤细胞。c-Met特异性的嵌合抗原受体可以用于c-Met相关肿瘤的靶向治疗。
附图说明
图1为本发明实施例1所得c-Met-scFv的重链可变区和轻链可变区的电泳图；其中M为标准标记物，1为c-Met-scFv的重链可变区，2为c-Met-scFv的轻链可变区。
图2为本发明实施例1所得质粒重组的电泳图；其中M为标准标记物，1为c-Met CAR载体，2为经XbaII，BamI逆转录病毒载体CD8TM-CD137-CD3ζ，3为c-Met scFv。
图3为本发明实施例2中采用Western Blotting检测本发明所得c-Met特异性嵌合抗原受体转染293T细胞后的表达，其中1为作为对照的未转染293T细胞，2为转染逆转录病毒CD19CAR质粒的293T细胞，3为转染逆转录病毒c-Met CAR质粒的293T细胞。
图4为Western Blot检测不同的对数生长期肿瘤细胞中c-Met的表达。
图5为本发明所得c-Met特异性嵌合抗原受体修饰的T细胞对肿瘤细胞的杀伤检测。
图6为本发明所得c-Met特异性嵌合抗原受体修饰的T细胞在受到c-Met抗原刺激后IFN-γ的表达。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1：c-Met特异性嵌合抗原受体慢病毒载体的构建
1.本实验室利用基因工程抗体技术，从全人源抗体库筛选出多株具有生物学活性的c-met抗体Fab，并证实具有较高的亲和力和明显的中和作用，可作为CAR-T细胞治疗的候选靶分子和候选ScFv。
利用本实验室筛选的抗c-Met的Fab序列，选出其中VH和VL的序列，用于设计CAR载体中的scFv序列，采用金斯瑞生物技术公司OptimumGeneTM基因设计软件对密码子进行进一步优化，在优化的序列两端分别加上NcoI，SphI酶切位点，优化后的序列由南京金斯瑞生物技术公司完成基因合成，合成后的序列克隆在pUC57载体，质粒命名为c-Met-scFv-pUC57。
2.c-Met-scFv-pUC57质粒用限制性内切酶XbaII和BamI酶切，酶切体系如下。2μgc-Met-scFv-pUC57、1μLXbaI、1μLBamHI、2μL 10×酶切缓冲液，用水补到20μL，37℃水浴中过夜，酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外下切取目的条带，采用DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收目的片段；其结果如图1所示，pUC57-c-Met-ScFv载体经XbaI和BamHI酶切释放目的条带。
用同样的方法XbaI和BamHI酶切pSFG-CD8TM-CD137-CD3ζ载体，用琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。其结果如图2所示，pSFG-CD8TM-CD137-CD3ζ载体经XbaI和BamHI酶切释放目的条带。
将回收后的c-Met-ScFv与酶切载体通过T4DNA连接酶连接，反应体系如下：2μL c-Met-ScFv、2μL载体酶切产物、1μL 10×连接缓冲液、1μL连接酶，用水补到10μL，16℃水浴中过夜。取连接产物加入到DH5α感受态中[参考《分子克隆》第三版中大肠杆菌感受态制备(CaCl2法)]，放置37℃细菌培养箱中过夜培养。挑取单个菌落，扩大培养，提取阳性克隆的质粒，经酶切和测序，将正确的载体命名为c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ。
实施例2：c-Met特异性嵌合抗原受体表达鉴定
参照无内毒素质粒大提试剂盒内(天根生物)的操作说明书提取逆转录病毒载体c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ，提取的质粒，用PI转染试剂转染到人胚肾细胞293T中，48h后，用PBS洗一遍，用细胞蛋白提取试剂(RIPA)裂解细胞，提取转染后的293T细胞的蛋白经10％的SDS-PAGE进行分离后，恒流(300mA，1h)转印至PVDF膜上，用抗CD3ζ(1：1000)抗体孵育，4℃孵育过夜。用PBST洗涤3遍后，用HRP羊抗小鼠的二抗(1：5000)室温孵育1h。加入ECL显色后，用Bio-Rad公司的ChemiDoc XRS System进行成像，其结果如图3所示。
由图3可知：本发明所构建的重组质粒能够检测到目的条带的表达，大小与阳参CD19一致，而未转染的293T细胞没有条带。
实施例3：c-Met特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞的制备
1.含抗c-Met嵌合抗原受体逆转录病毒的包装
用无内毒素质粒大提试剂盒内(天根生物)的操作说明书提取逆转录病毒包装载体RD114和c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ逆转录病毒载体共转染到GP2-293T细胞中，转染后48h收集细胞上清，4000rpm离心10min，去除上清中的细胞及细胞碎片。用0.45μm的滤膜过滤，分装冻存，备用。
2.T淋巴细胞的制备
采取20mL健康志愿者的新鲜抗凝血，用淋巴分离液(GE公司)分立外周血单核细胞(PBMC)。分离后的细胞用CD3和CD28平板刺激48h，用T淋巴细胞培养基GT-T551(TAKARA公司)加3％自身血浆进行诱导，得到T淋巴细胞。
3.CAR-T细胞的制备
用50μg/mL的RetroNectin(TAKARA公司)包被非组织培养板24孔板，每孔加入500μL，4℃过夜。每孔再加入500μL病毒上清，37℃孵育30min。去除病毒上清，再加入500μL病毒上清，37℃孵育30min，除病毒上清，每孔加入1.5mL病毒上清，再加入0.5mL稀释后的T淋巴细胞。从而获得c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζT细胞即c-Met特异性CAR-T细胞。
实施例4：c-Met特异性CAR-T细胞对c-Met相关肿瘤的杀伤作用
1.Western Blotting检测肿瘤细胞中c-Met的表达
选取对数生长期的人黑色素瘤细胞A375、肝癌细胞Hep-G2、人乳腺癌细胞MDA-MB-231，用细胞蛋白提取试剂(RIPA)裂解细胞，提取细胞蛋白，进行Western Blotting检测，其结果如图4所示：人黑色素瘤细胞A375，肝癌细胞Hep-G2检测到c-Met的表达，MDA-MB-231而检测不到c-Met的表达。
2.CAR-T细胞对肿瘤的杀伤力检测
将肿瘤细胞用培养基调整到5×106/mL，每孔50μL，按E：T(效应细胞和靶细胞比)为16：1、8：1、4：1、2：1，分别加入肿瘤细胞2.5×106个、1.25×106个、6.25×105个、3.125×105个；待细胞完全贴壁后，收集T细胞和CAR-T细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，每孔50μL，培养12h。弃上清加入100μL稀释的CCK8，孵育4～6小时，酶标仪检测OD450的吸光值。
上述肿瘤细胞为人黑色素瘤细胞A375、肝癌细胞Hep-G2、人乳腺癌细胞MDA-MB-231。
检测结果如图5所示：CAR-T细胞对c-Met表达的黑色素瘤细胞、肝癌细胞的杀伤率高于c-Met不表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231；c-Met特异性CAR-T细胞对表达c-Met的肿瘤细胞杀伤作用高于T细胞，高于CD19CAR-T细胞。
3.ELISPOT检测CAR-T细胞在受到c-Met抗原刺激后IFN-γ的表达
用无菌包被液稀释IFN-γ抗体后加入ELISPOT(Millipore，Cat.No.MAIPS4510)平板中，每孔100μL，4℃放置过夜。第二天用无菌的包被液将平板洗涤2遍。每孔加入200μL完全培养基，室温封闭1h。洗去含血清的细胞培养液RPMI-1640，用PBS洗三遍。准备c-Met胞外区多肽，稀释在含血清的细胞培养液RPMI-1640，调至终浓度1μg/mL。每孔100μL。调整待检测CAR-T细胞浓度为1×106/mL，每孔加入100μL，37℃，5％CO2放置24h，弃去细胞及培养基，用ELISPOT洗涤液洗涤3遍。每孔加入生物素标记的检测抗体，100μL/孔，4℃放置过夜。再用ELISPOT洗涤液洗涤4遍。每孔加入HRP标记的亲和素，100μL/孔，室温放置45min。用ELISPOT洗涤液洗涤3遍后，用PBS洗涤2遍。每孔加入100μL ACE显色底物，室温显色20-60min。待出现明显集落点后，用无菌水洗涤3遍终止反应。空气中晾干平板，用ELISPOT读板机计算形成的斑点数，其结果如图6所示。由图6可知：CAR-T细胞在特异性c-Met抗原刺激下能够分泌IFN-γ。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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Claims (3)

1.一种c-Met特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码如权利要求1所述c-Met特异性嵌合抗原受体的基因，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求1所述c-Met特异性嵌合抗原受体在制备治疗c-Met相关肿瘤药物中的应用。
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