JP7373242B2 - 抗ｃ－ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、及びその用途 - Google Patents
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Description
本特許出願は、２０１９年９月２６日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０１９－０１１９１４８号に対して優先権を主張し、該特許出願の開示事項は、本明細書に参照によって組み込まれる。
本発明は、ｃ－Ｍｅｔ結合ドメインを含むキメラ抗原受容体、及びその用途に関する。
ｃ－Ｍｅｔの活性化は、細胞成長、分散（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）及び運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）、侵襲（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、細胞死滅からの保護、分枝形態形成（ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び新生血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の増加を誘導する様々な生物学的反応を招く。このため、病理学的条件下でｃ－Ｍｅｔの不適切な活性化は癌細胞に増殖、生存及び侵襲／転移能力を付与することがある。ｃ－Ｍｅｔ活性に影響を受ける様々な生物学的、生理学的機能を考慮する時、ｃ－Ｍｅｔタンパク質は多用途の治療標的とされた。
近年、免疫細胞療法として、体内の免疫細胞を強化させるか或いは遺伝工学的に変形させて再び入れる養子的細胞治療（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）への関心が高まりつつある。特に、遺伝子組換え修飾を用いた人工受容体であるキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）を用いた研究が活発に行われている。
本発明者らは、ｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患を効果的に治療できるキメラ抗原受容体及びこれを含むエフェクター細胞を開発しようと鋭意研究努力した。その結果、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗ｃ－Ｍｅｔ ＣＡＲ及びこれを発現させるＴ細胞を作製し、抗ｃ－Ｍｅｔ ＣＡＲ－Ｔが、様々なｃ－Ｍｅｔ発現に関連した癌腫に対して治療効果があることを究明し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体をエンコードする核酸分子及びこれを含むベクターを提供することである。
本発明の他の目的は、前記核酸分子によってエンコードされるポリペプチドを含む抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体分子及びこれを細胞表面に発現させるエフェクター細胞を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記エフェクター細胞及び薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供することである。
本発明の一態様によれば、本発明は、次を含む抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体をエンコードする核酸分子を提供する：
ｃ－Ｍｅｔ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内信号伝達ドメイン。
本発明の一具現例において、前記ｃ－Ｍｅｔ結合ドメインは、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）又はその抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｔｈｅｒｅｏｆ）である。
本発明の具体的な具現例において、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５、１６、１７のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ，ＣＤＲＨ１）、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）；及び、配列番号１８、１９、２０のアミノ酸配列をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ，ＣＤＲＬ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含むものである、核酸分子。
本発明の他の具体的な具現例において、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＨ）；及び、配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＬ）を含むものである、核酸分子。
本発明の他の具体的な具現例において、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６４のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＨ）；及び、配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＬ）を含むものである、核酸分子。
本発明の他の具体的な具現例において、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６５のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＨ）；及び、配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＬ）を含むものである、核酸分子。
本発明の他の具体的な具現例において、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６５のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＨ）；及び、配列番号６６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＬ）を含むものである、核酸分子。
本明細書において、用語“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ又はＡｂ）”とは、特定の抗原に特異的に結合するイムノグロブリン分子に由来するタンパク質、又はポリペプチド配列を意味する。前記抗体は、天然抗体又は組換え抗体であってよい。
前記用語“組換え抗体”とは、組換えＤＮＡ技術を用いて生成された抗体、例えば、動物細胞発現システムによって発現した抗体を意味する。或いは、前記用語は、抗体をエンコードする合成されたＤＮＡ分子の翻訳によって生成された抗体を意味する。
前記抗体は、完全な抗体形態の他、抗体分子の抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）も含む。完全な抗体は、２本の全長の軽鎖及び２本の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。
用語“重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）”は、その天然発生立体形態で抗体分子に存在し、抗体の属するクラスを一般に決定する、ポリペプチド鎖の２種類のうち相対的に大きいものを意味する。前記“重鎖”とは、抗原に特異性を付与するための十分の可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）ドメインＶＨ、及び３個の重鎖定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片のいずれをも意味する。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。
用語“軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）”は、その天然発生立体形態で抗体分子に存在するポリペプチド鎖の２種類のうち相対的に小さいものを意味する。前記“軽鎖”とは、抗原に特異性を付与するための十分の可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）ドメインＶＬ、及び軽鎖定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片のいずれをも意味する。軽鎖の定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｏｎｓｉｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｊ．，Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ４５，ｐｐ．４１－５０，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９１）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ４，ｐｐ．４５－６５，ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４））。
用語“抗原（ａｎｔｉｇｅｎ又はＡｇ）”は、免疫反応を誘発する分子を意味する。前記免疫反応は、抗体生産、又は特異的免疫適格細胞の活性化、又は両方を伴うことができる。
本明細書において、用語“ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）”は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））。重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）にはそれぞれ３個のＣＤＲが含まれている。ＣＤＲは、抗体が抗原又はエピトープに結合する際に主要な接触残基を提供する。
本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、並びにこれら抗体のエピトープ－結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。
本明細書において、用語“フレームワーク（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）”又は“ＦＲ”は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を表す。可変ドメインのＦＲは、一般に４個のＦＲドメインＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又は、ＶＬ／Ｖｋ）において次の順序で表される：
（ａ）ＦＲＨ１（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）－ＣＤＲＨ１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）－ＦＲＨ２－ＣＤＲＨ２－ＦＲＨ３－ＣＤＲＨ３－ＦＲＨ４；及び
（ｂ）ＦＲＬ１（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）－ＣＤＲＬ１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）－ＦＲＬ２－ＣＤＲＬ２－ＦＲＬ３－ＣＤＲＬ３－ＦＲＬ４。
本明細書において、用語“ｃ－Ｍｅｔ（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ－ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）”は、細胞表面で発現するＭｅｔ原発癌遺伝子（ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ）によってエンコードされる受容体チロシンキナーゼである。構造的に、ｃ－Ｍｅｔは、細胞外アルファサブユニット（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ，５０ｋＤａ）と膜貫通ベータサブユニット（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ，１４０ｋＤａ）で構成されたジスルフィド結合した離合体である。ｃ－Ｍｅｔは、リガンド結合のための細胞外ドメイン、膜貫通部分、及び細胞内ドメイン内のチロシン残基のリン酸化に関与するチロシンキナーゼ触媒モチーフを含む（Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４：３１８（６０４４）：３８５，１９８５；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８４（１８）：６３７９，１９７６；Ｍａｇｇｉｏｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１７３：１８３，１９９７）。ｃ－ＭｅｔがリガンドであるＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）に結合すると、ｃ－Ｍｅｔの細胞質チロシン残基が二量化され、自己リン酸化され（ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅ）、続いて、下位信号伝達経路を媒介する様々なタンパク質と相互作用する。ｃ－Ｍｅｔ活性化は、細胞成長、分散（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）及び運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）、侵襲（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、細胞死滅からの保護、分枝形態形成（ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び新生血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の増加を誘導する様々な生物学的反応を招く。病理学的条件下でｃ－Ｍｅｔの不適切な活性化は癌細胞に増殖、生存及び侵襲／転移能力を付与することがある。ｃ－Ｍｅｔ活性に影響を受ける様々な生物学的、生理学的機能を考慮する時、ｃ－Ｍｅｔタンパク質は多用途の治療標的とされた。
本明細書において、用語“特異的に結合する”又はそれと類似の表現は、抗体又はその抗原結合断片、又はｓｃＦｖのような他の構成物が生理的条件下で比較的安定した抗原と複合体を形成するということを意味する。
本発明の一具現例において、本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又は抗原結合断片の特異的結合は、少なくとも約１×１０－６Ｍ以下（例えば、９×１０－７Ｍ、８×１０－７Ｍ、７×１０－７Ｍ、６×１０－７Ｍ、５×１０－７Ｍ、４×１０－７Ｍ、３×１０－７Ｍ、２×１０－７Ｍ、又は１×１０－７Ｍ）、少なくとも約１×１０－７Ｍ以下（例えば、９×１０－８Ｍ、８×１０－８Ｍ、７×１０－８Ｍ、６×１０－８Ｍ、５×１０－８Ｍ、４×１０－８Ｍ、３×１０－８Ｍ、２×１０－８Ｍ、又は１×１０－８Ｍ）、又は少なくとも約１×１０－８Ｍ以下（例えば、９×１０－９Ｍ、８×１０－９Ｍ、７×１０－９Ｍ、６×１０－９Ｍ、５×１０－９Ｍ、４×１０－９Ｍ、３×１０－９Ｍ、２×１０－９Ｍ、又は１×１０－９Ｍ）の平衡解離定数（小さいＫＤであるほど強固な結合を示す。）と特性化されてよい。２個の分子が特異的に結合するか否かを決定する方法は、当業界によく知られており、例えば、平衡透析、表面プラスモン共鳴などを含む。ただし、ヒトｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する分離された抗体は、他の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）のｃ－Ｍｅｔ分子のような他の抗原に対する交差反応性を示すことができる。
本明細書において、用語“親和度（Ａｆｆｉｎｉｔｙ）”は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）間の非共有相互作用の総和の強度を意味する。別に断らない限り、本願に使われているように、“結合親和力（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）”は、結合対（例えば、抗体及び抗原）の構成員間の１：１相互作用を反映する内因性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）結合親和力を表す。分子ＹとそのパートナーＹの親和度は、一般に、解離定数（Ｋｄ）で示すことができる。親和度は、本願に記述されたものを含めて当業界に公知の通常の方法によって測定されてよい。
また、本明細書において、用語“ヒト抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は、ヒト又はヒト細胞によって生成された抗体、又はヒト抗体レパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ）又は他のヒト抗体エンコーディング配列を利用する非ヒト根源に由来する抗体のアミノ酸配列に相応するアミノ酸配列を保有する。ヒト抗体のこのような定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を排除する。
本明細書において、用語“キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）”抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の根源（ｓｏｕｒｃｅ）又は種（ｓｐｅｃｉｅｓ）に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の他部が、異なる根源又は種に由来する抗体を意味する。
本明細書において、用語“ヒト化抗体”とは、非ヒト（例えば、マウス）抗体の非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖又は断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合下位配列）である。大部分の場合に、ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、目的とする特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（供与者抗体）、例えば、マウス、ラット又はウサギのＣＤＲの残基に代替されたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。一部の場合に、前記ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ，ＦＲ）残基は、相応する非ヒト残基に代替される。また、ヒト化抗体は、受容者抗体からも又は取り込まれたＣＤＲ又はフレームワーク配列からも発見されない残基を含むことができる。このような変形は、抗体性能をさらに改善及び最適化するためになされる。一般に、前記ヒト化された抗体は、少なくとも１個、及び典型的に２個の実質的に全ての可変ドメインを含んでよく、前記ドメインにおいて前記ＣＤＲ領域の全部又は実質的全部は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相応し、前記ＦＲ領域の全部又は実質的全部は、ヒト免疫グロブリンのＦＲ領域の配列を有する。前記ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ）の少なくとも一部又は実質的なヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ）配列を含む。
本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片は、通常の技術者が認知しているように、ｃ－Ｍｅｔを特異的に認識できる範囲内でアミノ酸配列の変異体を含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他生物学的特性を改善させるために抗体のアミノ酸配列に変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。
このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形態及び種類に対する分析によって、アルギニン、リジン及びヒスチジンはいずれも陽電荷を帯びている残基であり；アラニン、グリシン及びセリンは類似の大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似の形態を有する、ということがわかる。したがって、このような考慮事項に基づき、アルギニン、リジン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、生物学的に機能均等物であるといえる。
変異を導入するに当たって、アミノ酸の疎水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｄｅｘ）が考慮されてよい。それぞれのアミノ酸は、疎水性と電荷によって疎水性インデックスが与えられている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスタイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；及び、アルギニン（－４．５）。
タンパク質の相互的な生物学的機能（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を付与する上で疎水性アミノ酸インデックスは非常に重要である。類似の疎水性インデックスを有するアミノ酸に置換してこそ類似の生物学的活性が保有できるということは公知の事実である。疎水性インデックスを参照して変異を導入させる場合に、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、より好ましくは±０．５以内の疎水性インデックス差を示すアミノ酸間の置換を行う。
一方、類似の親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ ｖａｌｕｅ）を有するアミノ酸間の置換が、均等な生物学的活性を有するタンパク質を招くということもよく知られている。米国特許第４，５５４，１０１号に開示されているように、次の親水性値がそれぞれのアミノ酸残基に与えられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。
親水性値を参照して変異を導入させる場合に、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、さらに好ましくは±０．５以内の親水性値差を示すアミノ酸間の置換を行う。
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質におけるアミノ酸交換は、当該分野に公知されている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も一般的に起きる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。
本発明の一具現例において、本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片は、上述した具体的なアミノ酸配列に限定された抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片（例えば、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列、又はそれらのＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１～ＣＤＲＬ３を含むアミノ酸配列の断片）を含む。
また、本発明の一具現例において、抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片は、上述した具体的なアミノ酸配列に限る抗体又はその抗原結合断片のＣＤＲ、重鎖可変領域、又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも約６０％以上の相同性（例えば、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、又は６９％）、より好ましくは、少なくとも７０％以上の相同性（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、又は７９％）、さらに好ましくは、少なくとも８０％以上（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％）の相同性、最も好ましくは９０％以上（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の相同性を有する配列を含む。前記７０％以上～１００％以下の範囲の全ての整数及び小数は、％相同性と関連して本発明の範囲内に含まれる。
本明細書において、用語“キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）”は、少なくとも一つの細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び刺激分子に由来する細胞内信号伝達ドメインを含む組換えポリペプチドを意味する。
本発明のキメラ抗原受容体は、上述した抗ｃ－Ｍｅｔ抗体又はその抗原結合断片を細胞外抗原結合ドメインとして含む。したがって、本発明のキメラ抗原受容体は、抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体（ａｎｔｉ－ｃ－Ｍｅｔ ＣＡＲ）、抗ｃ－Ｍｅｔ ＣＡＲなどと表現される。
本発明の実施例において使われる“ｃ－Ｍｅｔ ＣＡＲ－００１～ｃ－Ｍｅｔ ＣＡＲ－００３”、“ｐＭＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ”、又は“ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ”などの用語中の“ｃ－Ｍｅｔ ＣＡＲ”は、本発明者らが発明した抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体のコード名であり、上述したｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体のことを指す。
本明細書において、用語“刺激分子”とは、Ｔ細胞信号伝達経路の少なくともいくつかの側面に対する刺激方式においてＴＣＲ複合体の１次活性化を調節する１次細胞質信号伝達配列を提供するＴ細胞によって発現する分子のことを指す。より具体的に、１次信号は、例えば、ペプチドにロードれたＭＨＣ分子とＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって開始され、これは増殖、活性化、分化などを含むが、これに制限されないＴ細胞反応を媒介する。刺激方式で働く１次細胞質信号伝達配列（又は、“１次信号伝達ドメイン”）は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭと知られた信号伝達モチーフを含むことができる。本発明において、特に有用な１次細胞質信号伝達配列を含むＩＴＡＭの例は、ＴＣＲのゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（“ＩＣＯＳ”とも知られている。）及びＣＤ６６ｄに由来するものを含むが、これに制限されない。
本明細書において、用語“信号伝達ドメイン”は、第２メッセンジャー（ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）を生成するか又は前記メッセンジャーに反応して定められた信号伝達経路を通じた細胞活性を調節するために情報を細胞内に伝達することによって作用するタンパク質の機能性部分を意味する。
本発明の一具現例において、前記キメラ抗原受容体は、リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＬＳ）を選択的にさらに含む。前記リーダー配列は、キメラ抗原受容体を構成する組換えポリペプチドのアミノ末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）に位置する。前記リーダー配列は、キメラ抗原受容体の細胞内プロセス及び細胞膜に局在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）されながら抗原結合ドメインから任意に切断される。
本発明の具体的な具現例において、前記リーダー配列は、ＣＤ８アルファ（ＣＤ８ ａｌｐｈａ）のリーダー配列、ｈＧＭ－ＣＳＦ受容体アルファ鎖（ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎ）のリーダー配列、又は３Ｅ８抗体のリーダー配列であってよい。
本発明のより具体的な具現例において、前記リーダー配列は、配列番号２６、２８又は３０の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むリーダー配列である。
本発明の一具現例において、前記キメラ抗原受容体のｃ－Ｍｅｔ結合ドメイン及び膜貫通ドメインは、ヒンジ領域、スぺーサ領域、又はそれらの組合せによって連結される。
本発明の具体的な具現例において、前記ヒンジ領域、スぺーサ領域、又はそれらの組合せは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＩｇＧ４のヒンジ、ＩｇＤのヒンジ、ＣＤ８アルファのヒンジ、ＩｇＧ１のＣＨ３、ＣＤ２８の細胞外ドメイン又はそれらの全部又は一部の配列の組合せであってよい。
本発明のより具体的な具現例において、前記ヒンジ領域は、配列番号３２、３４、３６、３８、４０又は４４の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含む。
本発明の具体的な具現例において、前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４のアルファ、ベータ又はのゼータ鎖からなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。
本発明のより具体的な具現例において、前記膜貫通ドメインは、配列番号４２、４６又は４７の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含む。
本発明の一具現例において、前記細胞内信号伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの信号伝達ドメインを含む。
本発明の具体的な具現例において、前記ＣＤ３ゼータの信号伝達ドメインは、配列番号５５、５７又は５９の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含む。
本発明の他の具現例において、前記細胞内信号伝達ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選ばれるタンパク質の信号伝達ドメインを共同刺激ドメインとしてさらに含む。すなわち、本発明のキメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、刺激分子に由来する細胞内信号伝達ドメイン及び共同刺激分子に由来する信号伝達ドメインを含む組換えポリペプチドであってよい。
本発明の具体的な具現例において、前記共同刺激ドメインは、配列番号４９、５１又は５３の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含む。
本発明の他の態様において、本発明は、上述したキメラ抗原受容体をエンコードする核酸分子を含むベクターを提供する。
本明細書において、用語“核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）”は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドの他、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３－５８４（１９９０））。
本発明の一具現例において、本発明の前記キメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列は、前記キメラ抗原受容体分子を構成するアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列であればよく、如何なる特定ヌクレオチド配列にも限定されないということは、当業者に明らかである。
これは、ヌクレオチド配列の変異が発生しても、変異されたヌクレオチド配列をタンパク質として発現させると、タンパク質配列において変化をもたらさない場合もあるためである。これをコドンの縮退性という。したがって、前記ヌクレオチド配列は、機能的に均等なコドン又は同一のアミノ酸をエンコードするコドン（例えば、コドンの縮退性により、アルギニン又はセリンに対するコドンは６個である。）、又は生物学的に均等なアミノ酸をエンコードするコドンを含むヌクレオチド配列を含む。
上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本発明のキメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコードする核酸分子は、配列目録に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。上述の実質的な同一性は、上述した本発明の配列と任意の他の配列とを極力対応するようにアラインし、当業界で一般に利用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも６０％以上の相同性（例えば、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、又は６９％）、より好ましくは、少なくとも７０％以上の相同性（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、又は７９％）、さらに好ましくは、少なくとも８０％以上（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％）の相同性、最も好ましくは、９０％以上（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の相同性を示す配列を意味する。前記７０％以上～１００％以下の範囲の全ての整数及び小数は、％相同性と関連して本発明の範囲内に含まれる。
配列比較のためのアラインメント方法は、当業界に公知されている。アラインメントに対する様々な方法及びアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４８：４４３（１９７０）；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：２３７－４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１－９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．８：１５５－６５（１９９２） ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１（１９９４）に開示されている。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０（１９９０））は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などから接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して利用可能である。ＢＬＡＳＴは、ｎｃｂｉウェブサイトのＢＬＡＳＴページから接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｎｃｂｉウェブサイトのＢＬＡＳＴ ｈｅｌｐページから確認できる。
本発明の一具現例において、前記ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター又はレトロウイルスベクターからなる群から選ばれる。
本発明の一具現例において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。本発明の具体的な一具現例において、前記ベクターは、プロモーターをさらに含む。前記プロモーターは、例えば、ＥＦ－１プロモーターであってよいが、これに限定されるものではない。
本発明の他の具現例において、前記ベクターは、レトロウイルスベクターであってよい。レトロウイルスは、遺伝子伝達システムのための便利なプラットホームを提供する。遺伝子伝達のために選択された遺伝子は、レトロウイルスベクター内に挿入され、レトロウイルス粒子内にパッケージングされてよい。次いで、組み換えられたレトロウイルスは、インビボ、又はインビトロで目的とする宿主細胞に伝達されてよい。多くのレトロウイルスベクターが関連技術分野に知られており、本発明の具体的な具現例において、前記レトロウイルスベクターは、ＭＬＶベースのレトロウイルスベクターであるｐＭＴレトロウイルスベクターであるが、これに限定されるものではない。
本発明のベクターを細胞内に導入し、発現させる方法は、関連技術分野によく知られている。ベクターは、当業界に公知された方法によって宿主細胞、例えば哺乳動物、バクテリア、酵母、又は昆虫細胞内に容易に導入されてよい。例えば、ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞内に伝達されてよい。前記物理的手段は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、微細注入、電気穿孔などを含む。前記化学的手段は、コロイド分散液システム、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ、及び水中油エマルジョン、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、混合されたミセル、及びリポソームを含む脂質ベースのシステムを含む。また、前記生物学的手段は、上述したレンチウイルス、レトロウイルスなど、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターの使用を含む。
本発明の他の態様によれば、本発明は、上述した核酸分子によってエンコードされるポリペプチドを含む抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体分子を提供する。
本発明の一態様による抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体分子は、上述した核酸分子、又はこれを含むベクターを細胞内に導入し発現させることによって得られる。したがって、上述した核酸分子及びそれを含むベクターと重複する範囲内では、その記載を省略する。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、上述した抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体分子を細胞表面に発現させるエフェクター細胞を提供する。
本発明の一具現例において、前記エフェクター細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、大食細胞及びそれらの前駆細胞からなる群から選ばれるが、これに限定されるものではない。ここで、前記Ｔリンパ球は、炎症性Ｔリンパ球、細胞毒性Ｔリンパ球、調節Ｔリンパ球又はヘルパーＴリンパ球からなる群から選ばれる。
本発明において、前記エフェクター細胞は、自己細胞又は同種細胞の集団を含む。すなわち、前記エフェクター細胞は、本抗ｃ－Ｍｅｔ ＣＡＲポリペプチドを発現させる自己細胞又は同種細胞の集団を含む。
本明細書において、用語“自己”とは、個体に再導入される予定である、同じ個体に由来する任意の物質のことを指す。本明細書において、用語“同種”とは、物質が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の物質のことを指す。
また、本発明の一具現例によれば、前記エフェクター細胞は、抗ｃ－Ｍｅｔ ＣＡＲポリペプチドをエンコードする核酸分子を含むベクターで形質感染又は形質導入された細胞の集団を含む。前記形質感染又は形質導入は、上述したように、当業界に知られた様々な手段によって制限なくなされてよい。
したがって、本発明の具体的な具現例によれば、本発明のエフェクター細胞、例えば、Ｔリンパ球、又はナチュラルキラー細胞に伝達され、抗ｃ－Ｍｅｔ ＣＡＲエンコーディング核酸分子は、ｍＲＮＡに転写され、該ｍＲＮＡから抗ｃ－Ｍｅｔ ＣＡＲポリペプチドが翻訳されてエフェクター細胞の表面に発現する。
本発明の実施例から立証されたように、本発明の抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体を発現させるエフェクター細胞は、癌細胞株であるＡ５４９、ＰＣ－３、ＭＣＦ－７、ＳＫＯＶ３、及びＳＫ－ＨＥＰ－１細胞を効果的に死滅させる。したがって、本発明の抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体を発現させるエフェクター細胞は、様々な癌腫に対する治療用組成物の有効成分として有用に使用可能である。
本発明の他の態様によれば、本発明は、上述した抗ｃ－Ｍｅｔ ＣＡＲを発現させるエフェクター細胞及び薬剤学的に許容される担体を含む免疫治療用薬剤学的組成物を提供する。
本明細書において、“免疫治療（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）”とは、兔疫体系が癌を除去するように助ける癌の治療方法のことを指す。免疫治療は、能動的免疫治療と受動的免疫治療とに区別される。能動的免疫治療は、ｉ）癌細胞又は癌細胞によって生成された物質を人体に注入して兔疫体系を活性化させる癌ワクチン治療（ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）、ｉｉ）サイトカイン（インターフェロン、インターロイキンなど）、成長因子などの免疫調節剤（ｉｍｍｕｎｅ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）を投与して特定の白血球を活性化させる免疫調節治療を含む。受動的免疫治療は、特定の癌細胞に結合する治療的抗体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と免疫細胞治療（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）を含む。免疫細胞治療は、具体的に、樹状細胞ワクチン治療（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）とＣＡＲ－Ｔ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ）治療、ＮＫ細胞治療（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）、ＣＴＬ治療（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｔｈｅｒａｐｙ）、養子細胞転移（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）などを含むが、これに限定されるものではない。本発明において、免疫治療は、主に、上述の免疫細胞治療を意味する。
本発明の薬剤学的組成物は、標的細胞のｃ－Ｍｅｔ抗原に結合する抗体又は抗原結合断片、又はこれを含むキメラ抗原受容体を発現させるエフェクター細胞を含むので、ｃ－Ｍｅｔの発現に関連した疾患の診断又は治療に効果的である。
したがって、本発明の一具現例において、前記免疫治療用薬剤学的組成物は、ｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患の治療用薬剤学的組成物である。
本発明において、前記ｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患は、脳癌（悪性脳腫瘍）、神経膠腫、乳癌、膵癌、胸膜中皮腫、肝癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、大腸癌などからなる群から選ばれる疾病であるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具現例において、前記神経膠腫は、人体の神経系に存在する細胞の一つである神経膠細胞で発生する腫瘍である。前記神経膠細胞は、中枢神経膠細胞である星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、乏突起膠細胞（稀突起膠細胞、ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａ）、及び脳室膜細胞（ｅｐｅｎｄｙｍａｌ ｃｅｌｌ）と；末梢神経膠細胞であるシュワン細胞（Ｓｃｈｗａｎｎ’ｓ ｃｅｌｌ）、及び神経節膠細胞（ｃａｐｓｕｌａｒ ｃｅｌｌ）がある。神経膠腫は、神経膠腫を構成する主な神経膠細胞の種類によって、ｉ）星状細胞腫（Ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ Ｔｕｍｏｒ）（膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）を含む。）、ｉｉ）乏突起膠腫（Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａｌ Ｔｕｍｏｒ）、及びｉｉｉ）上衣細胞腫（脳室膜細胞腫，Ｅｐｅｎｄｙｍｏｍａ）を含む。
本発明の薬剤学的組成物は、上述したＣＡＲ発現エフェクター細胞、例えば、複数のＣＡＲ発現エフェクター細胞を一つ以上の製薬上又は生理学上に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて含むことができる。前記薬剤学的組成物は、緩衝剤、例えば、中性緩衝塩水、ホスフェート緩衝塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチド又はアミノ酸、例えば、グリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び、防腐剤を含むことができる。本発明の一具現例において、前記薬剤学的組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、例えば、静脈内投与、皮下投与、血内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、胸骨腫瘍内投与、脳内投与、頭蓋骨内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できるが、これに限定されるものではない。
本発明のエフェクター細胞を含む薬剤学的組成物は、皮膚内又は皮下注射によって患者に投与される。一具現例において、本発明の薬剤学的組成物は、静脈内注射によって投与される。他の具現例において、本発明の薬剤学的組成物は、腫瘍、リンパ節、又は感染部位内に直接投与されてよい。
本発明を必要とする対象体は、末梢血液幹細胞移植後に高容量化学療法を用いた標準治療を受けることができる。本発明の一具現例において、本発明を必要とする対象体は、前記末梢血液幹細胞移植後に又は移植と同時に、本発明の拡張されたＣＡＲ Ｔ細胞が投与されてよい。他の具現例において、拡張された細胞は、手術以前又は手術以後に投与される。
本発明の薬剤学的組成物の“免疫学的有効量”、“抗腫瘍有効量”、“腫瘍抑制有効量”、又は“治療量”に適合する投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって決定され、熟練した普通の医師は所望する治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方でき、適切な投与量は臨床試験によって決定されるであろう。本明細書において用語“治療”とは、疾患状態の減少、抑制、鎮静又は根絶を意味する。本明細書において用語“抗腫瘍”は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移の数の減少、期待寿命の増加、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存の減少、又は癌的病態に関連した様々な生理学的症状の改善を含むが、これに制限されない。
本願に記載のＴ細胞を含む薬剤学的組成物は、一般に、１０４～１０９細胞／ｋｇ体重、場合によっては１０５～１０６細胞／ｋｇ体重（前記範囲内の全ての整数値を含む。）の投与量で投与可能であるといえよう。Ｔ細胞組成物は、また、上記の投与量を、回数を分けて投与できる。細胞は、免疫療法に一般に知られた注入技術を用いて投与できる（例えば［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８］参照）。
本発明の薬剤学的組成物は、また、上述した有効成分の他、別の薬剤学的活性薬剤及び療法との組合せで使用されてもよい。前記“組合せ”は、同時又は併用投与と表現されてもよい。本願に記載のＣＡＲ発現エフェクター細胞及び少なくとも一つの追加の治療剤は同時に、同一の組成物内に又は別個の組成物内に、又は順次に投与されてよい。順次投与のために、本願に記載のＣＡＲ発現細胞がまず投与され、続いて追加の作用剤が投与されてもよく、その逆の投与順序も可能である。
前記本発明の薬剤学的組成物との組合せで使用可能な治療剤には、当業界に公知の１以上の化学治療剤、１以上の標的治療剤、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１特異的な免疫関門抑制剤があるが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記のキメラ抗原受容体を発現させるエフェクター細胞を、治療が必要な対象体に投与する段階を含む免疫治療方法を提供する。
本発明の免疫治療方法の対象疾病であるｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患は、薬剤学的組成物の治療対象疾病と関連して定義した通りである。
本発明の一具現例において、前記対象体は、哺乳動物又はヒトである。
本発明のｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患の治療方法は、有効成分として上述のキメラ抗原受容体を発現させるエフェクター細胞を共通に使用する方法であるので、重複する内容については、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
本発明は、抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体とこれを用いた薬剤学的組成物を提供することを目的とする。本発明のｃ－Ｍｅｔ結合ドメインを含むキメラ抗原受容体を用いる場合に、様々なｃ－Ｍｅｔの発現に関連した疾患に対する治療剤として有用に使用可能である。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
実施例
本明細書全体を通じて、特定物質の濃度を示すために使われる“％”は、別に断りのない限り、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、そして液体／液体は（体積／体積）％である。
本明細書全体を通じて、特定物質の濃度を示すために使われる“％”は、別に断りのない限り、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、そして液体／液体は（体積／体積）％である。
実施例の目次
実施例１～４：抗ｃ－Ｍｅｔ－キメラ抗原受容体遺伝子の準備
実施例５．ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲベクターの製造
実施例６．ｐＭＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルスベクターの製造
実施例７．抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞の製造
実施例８．生体外（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗癌活性能の確認
実施例１～４：抗ｃ－Ｍｅｔ－キメラ抗原受容体遺伝子の準備
実施例５．ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲベクターの製造
実施例６．ｐＭＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルスベクターの製造
実施例７．抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞の製造
実施例８．生体外（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗癌活性能の確認
実施例１．ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１遺伝子の準備
実施例１－１．抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体遺伝子の準備
本発明のｃ－Ｍｅｔ特異的抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域をエンコードするポリヌクレオチドの塩基配列を、先行の特許（出願番号１０－２０１８－０１４０１９６）から確保した（表１）。
実施例１－１．抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体遺伝子の準備
本発明のｃ－Ｍｅｔ特異的抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域をエンコードするポリヌクレオチドの塩基配列を、先行の特許（出願番号１０－２０１８－０１４０１９６）から確保した（表１）。
実施例１－２．ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１遺伝子の準備
本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ；ＶＨ）の５’部位には、ＢａｍＨ Ｉ制限酵素塩基配列及びＣＤ８アルファのリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＬＳ）を含み、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ；ＶＬ）の３’部位には、ｈＣＤ８アルファのヒンジとＴＭ、共同刺激ドメインである４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ－ｉｓｏ２Ｍ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２）及びＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を含むように塩基配列を確保した。確保された塩基配列は、ＢａｍＨ Ｉ－ｈＣＤ８αＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＣＤ８α ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ８αＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２Ｍ－Ｘｈｏ Ｉの塩基配列（表２）を有し、これに基づいて配列番号６０のｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１（図１）構造を合成した。合成されたｐＢＨＡ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１（図２）は、他のｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ構造を確保するために使用した。
本発明の抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ；ＶＨ）の５’部位には、ＢａｍＨ Ｉ制限酵素塩基配列及びＣＤ８アルファのリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＬＳ）を含み、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ；ＶＬ）の３’部位には、ｈＣＤ８アルファのヒンジとＴＭ、共同刺激ドメインである４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ－ｉｓｏ２Ｍ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２）及びＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を含むように塩基配列を確保した。確保された塩基配列は、ＢａｍＨ Ｉ－ｈＣＤ８αＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＣＤ８α ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ８αＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２Ｍ－Ｘｈｏ Ｉの塩基配列（表２）を有し、これに基づいて配列番号６０のｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１（図１）構造を合成した。合成されたｐＢＨＡ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１（図２）は、他のｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ構造を確保するために使用した。
実施例２．ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００２遺伝子の準備
実施例２－１．抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体遺伝子の準備
遺伝子合成を用いて確保されたｐＢＨＡ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１（図２）を鋳型とし、プライマー配列番号１（表３）と配列番号２（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の５’部位に結合するプライマーがｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α（Ｈｕｍａｎ ＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎ，ヒトＧＭ－ＣＳＦ受容体アルファ鎖）の１２個塩基配列を有し、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の３’部位に結合するプライマーがヒンジの９個塩基配列とｈＣＤ２８ ｐＥＣＤの３個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ ｐＥＣＤの塩基配列を有する（表４）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
実施例２－１．抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体遺伝子の準備
遺伝子合成を用いて確保されたｐＢＨＡ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１（図２）を鋳型とし、プライマー配列番号１（表３）と配列番号２（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の５’部位に結合するプライマーがｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α（Ｈｕｍａｎ ＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎ，ヒトＧＭ－ＣＳＦ受容体アルファ鎖）の１２個塩基配列を有し、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の３’部位に結合するプライマーがヒンジの９個塩基配列とｈＣＤ２８ ｐＥＣＤの３個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ ｐＥＣＤの塩基配列を有する（表４）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
実施例２－２．ｈＧＭ－ＣＳＦ受容体アルファ鎖（ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎ）の信号配列遺伝子の準備
ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．αの信号配列を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００１プラスミド（図３）を鋳型とし、プライマー配列番号３（表３）と配列番号４（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．αの５’部位に結合するプライマーがＢａｍＨ Ｉ制限酵素塩基配列を有し、ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．αの３’部位に結合するプライマーが抗ｃ－Ｍｅｔ抗体の可変重鎖（ＶＨ）の１２個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨＩ－ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－ｓｃＦｖの塩基配列を有する（表４）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．αの信号配列を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００１プラスミド（図３）を鋳型とし、プライマー配列番号３（表３）と配列番号４（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．αの５’部位に結合するプライマーがＢａｍＨ Ｉ制限酵素塩基配列を有し、ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．αの３’部位に結合するプライマーが抗ｃ－Ｍｅｔ抗体の可変重鎖（ＶＨ）の１２個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨＩ－ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－ｓｃＦｖの塩基配列を有する（表４）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
実施例２－３．ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子の準備
ヒンジ、ｈＣＤ２８のｐＥＣＤとＴＭ、ＩＣＤ及びｈＣＤ３ζ－ｉｓｏ２を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００１プラスミド（図３）を鋳型とし、プライマー配列番号５（表３）と配列番号６（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ヒンジの５’部位に結合するプライマーが抗ｃ－Ｍｅｔ抗体の可変軽鎖（ＶＬ）の１２個塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２の３’部位に結合するプライマーがＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ｓｃＦｖ－ ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ ｐＥＣＤ－ｈＣＤ２８ ＴＭ－ｈＣＤ２８ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２－ＸｈｏＩ塩基配列を有する（表４）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
ヒンジ、ｈＣＤ２８のｐＥＣＤとＴＭ、ＩＣＤ及びｈＣＤ３ζ－ｉｓｏ２を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００１プラスミド（図３）を鋳型とし、プライマー配列番号５（表３）と配列番号６（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ヒンジの５’部位に結合するプライマーが抗ｃ－Ｍｅｔ抗体の可変軽鎖（ＶＬ）の１２個塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２の３’部位に結合するプライマーがＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ｓｃＦｖ－ ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ ｐＥＣＤ－ｈＣＤ２８ ＴＭ－ｈＣＤ２８ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２－ＸｈｏＩ塩基配列を有する（表４）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
実施例３．ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００３遺伝子の準備
実施例３－１．抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体遺伝子の準備
遺伝子合成を用いて確保されたｐＢＨＡ－ｃＭｅｔ－ＣＡＲ－００１（図２）を鋳型とし、プライマー配列番号７（表３）と配列番号８（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の５’部位に結合するプライマーが３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の１２個塩基配列を有し、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の３’部位に結合するプライマーがｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅの１２個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅの塩基配列を有する（表５）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
実施例３－１．抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体遺伝子の準備
遺伝子合成を用いて確保されたｐＢＨＡ－ｃＭｅｔ－ＣＡＲ－００１（図２）を鋳型とし、プライマー配列番号７（表３）と配列番号８（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の５’部位に結合するプライマーが３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の１２個塩基配列を有し、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の３’部位に結合するプライマーがｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅの１２個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅの塩基配列を有する（表５）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
実施例３－２．３Ｅ８抗体のリーダー配列（ＬＳ）遺伝子の準備
３Ｅ８抗体のリーダー配列（ＬＳ）を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００２プラスミド（図４）を鋳型とし、プライマー配列番号９（表３）と配列番号１０（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーがＢａｍＨ Ｉ制限酵素塩基配列を有し、３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の３’部位に結合するプライマーが抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の１２個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖの塩基配列を有する（表５）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
３Ｅ８抗体のリーダー配列（ＬＳ）を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００２プラスミド（図４）を鋳型とし、プライマー配列番号９（表３）と配列番号１０（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーがＢａｍＨ Ｉ制限酵素塩基配列を有し、３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の３’部位に結合するプライマーが抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の１２個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖの塩基配列を有する（表５）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
実施例３－３．ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子の準備
ヒトＩｇＤのヒンジとＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ３、ＣＤ２８のＴＭとＩＣＤ、共同刺激ドメインであるＯＸ４０及びＣＤ３ζ－ｉｓｏ１を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００２プラスミド（図４）を鋳型とし、プライマー配列番号１１（表３）と配列番号１２（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ｈＩｇＤヒンジの５’部位に結合するプライマーが抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の１２個塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の３’部位に結合するプライマーがＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＨ３－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有する（表５）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
ヒトＩｇＤのヒンジとＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ３、ＣＤ２８のＴＭとＩＣＤ、共同刺激ドメインであるＯＸ４０及びＣＤ３ζ－ｉｓｏ１を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００２プラスミド（図４）を鋳型とし、プライマー配列番号１１（表３）と配列番号１２（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ｈＩｇＤヒンジの５’部位に結合するプライマーが抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の１２個塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の３’部位に結合するプライマーがＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＨ３－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有する（表５）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
実施例４．ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００４遺伝子の準備
実施例４－１．抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体遺伝子の準備
遺伝子合成を用いて確保されたｐＢＨＡ－ｃＭｅｔ－ＣＡＲ－００１（図２）を鋳型とし、プライマー配列番号７（表３）と配列番号８（表３）を用いてＰＣＲ方法を増幅して使用した。このとき、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の５’部位に結合するプライマーが３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の１２個塩基配列を有し、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の３’部位に結合するプライマーがｈＩｇＤヒンジの１２個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＩｇＤヒンジの塩基配列を有する（表６）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
実施例４－１．抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体遺伝子の準備
遺伝子合成を用いて確保されたｐＢＨＡ－ｃＭｅｔ－ＣＡＲ－００１（図２）を鋳型とし、プライマー配列番号７（表３）と配列番号８（表３）を用いてＰＣＲ方法を増幅して使用した。このとき、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の５’部位に結合するプライマーが３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の１２個塩基配列を有し、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の３’部位に結合するプライマーがｈＩｇＤヒンジの１２個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＩｇＤヒンジの塩基配列を有する（表６）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
実施例４－２．３Ｅ８抗体のリーダー配列（ＬＳ）遺伝子の準備
３Ｅ８抗体のリーダー配列（ＬＳ）を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００３プラスミド（図５）を鋳型とし、プライマー配列番号９（表３）と配列番号１０（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーがＢａｍＨ Ｉ制限酵素塩基配列を有し、３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の３’部位に結合するプライマーが抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の１２個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖの塩基配列を有する（表６）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
３Ｅ８抗体のリーダー配列（ＬＳ）を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００３プラスミド（図５）を鋳型とし、プライマー配列番号９（表３）と配列番号１０（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の５’部位に結合するプライマーがＢａｍＨ Ｉ制限酵素塩基配列を有し、３Ｅ８リーダー配列（ＬＳ）の３’部位に結合するプライマーが抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変重鎖（ＶＨ）の１２個塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖの塩基配列を有する（表６）。増幅した生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
実施例４－３．ヒンジ、ＴＭ、ＩＣＤ、共同刺激ドメイン及びＣＤ３ζ遺伝子の準備
ヒトＩｇＤのヒンジとＣＤ２８のＴＭとＩＣＤ、共同刺激ドメインであるＯＸ４０及びＣＤ３ζ－ｉｓｏ１を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００３プラスミド（図５）を鋳型とし、プライマー配列番号１１（表３）と配列番号１２（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ｈＩｇＤヒンジの５’部位に結合するプライマーが抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の１２個塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の３’部位に結合するプライマーがＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有する（表６）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
ヒトＩｇＤのヒンジとＣＤ２８のＴＭとＩＣＤ、共同刺激ドメインであるＯＸ４０及びＣＤ３ζ－ｉｓｏ１を含むｐＭＴ－ＣＡＲ－００３プラスミド（図５）を鋳型とし、プライマー配列番号１１（表３）と配列番号１２（表３）を用いてＰＣＲ方法で増幅して使用した。このとき、ｈＩｇＤヒンジの５’部位に結合するプライマーが抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ抗体可変軽鎖（ＶＬ）の１２個塩基配列を有し、ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１の３’部位に結合するプライマーがＸｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ生成物は、ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有する（表６）。増幅したＰＣＲ生成物は次のＰＣＲ増幅過程に使用した。
実施例５．ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲベクターの製造
実施例５－１．ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００２ベクターの製造
増幅したＰＣＲ生成物であるＢａｍＨ Ｉ－ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－ｓｃＦｖとｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ ｐＥＣＤを鋳型とし、プライマー配列番号３（表３）と配列番号２（表３）を用いてＯＥ－ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）方法で増幅した。増幅したＰＣＲ生成物であるＢａｍＨ Ｉ－ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ ｐＥＣＤとｓｃＦｖ－ ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ ｐＥＣＤ－ｈＣＤ２８ ＴＭ－ｈＣＤ２８ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２－Ｘｈｏ Ｉを鋳型とし、プライマー配列番号３（表３）と配列番号６（表３）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図６）。増幅されたＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨ Ｉ－ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－ｓｃＦｖ－ ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ ｐＥＣＤ－ｈＣＤ２８ ＴＭ－ｈＣＤ２８ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、配列番号６１のｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００２の構造を有することになる（図７）。増幅したＰＣＲ生成物は、直線形ＤＮＡの両端に多重Ｔ配列を有するｐＧｅｍＴ ＥＡＳＹベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）に結紮し、構造物ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００２が得られたし、配列分析を用いて原本配列と同一であることを確認した。配列分析のためにプライマー配列番号１３と１４（表３）を使用した。
実施例５－１．ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００２ベクターの製造
増幅したＰＣＲ生成物であるＢａｍＨ Ｉ－ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－ｓｃＦｖとｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ ｐＥＣＤを鋳型とし、プライマー配列番号３（表３）と配列番号２（表３）を用いてＯＥ－ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）方法で増幅した。増幅したＰＣＲ生成物であるＢａｍＨ Ｉ－ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－ｓｃＦｖ－ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ ｐＥＣＤとｓｃＦｖ－ ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ ｐＥＣＤ－ｈＣＤ２８ ＴＭ－ｈＣＤ２８ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２－Ｘｈｏ Ｉを鋳型とし、プライマー配列番号３（表３）と配列番号６（表３）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図６）。増幅されたＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨ Ｉ－ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃ．α－ｓｃＦｖ－ ｈｉｎｇｅ－ｈＣＤ２８ ｐＥＣＤ－ｈＣＤ２８ ＴＭ－ｈＣＤ２８ ＩＣＤ－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ２－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、配列番号６１のｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００２の構造を有することになる（図７）。増幅したＰＣＲ生成物は、直線形ＤＮＡの両端に多重Ｔ配列を有するｐＧｅｍＴ ＥＡＳＹベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）に結紮し、構造物ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００２が得られたし、配列分析を用いて原本配列と同一であることを確認した。配列分析のためにプライマー配列番号１３と１４（表３）を使用した。
実施例５－２．ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００３ベクターの製造
増幅したＰＣＲ生成物であるＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖと３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤヒンジを鋳型とし、プライマー配列番号９（表３）と配列番号８（表３）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した。増幅したＰＣＲ生成物であるＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅとｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＨ３－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉを鋳型とし、プライマー配列番号９（表３）と配列番号１２（表３）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図８）。増幅されたＰＣＲ生成物はＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＨ３－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、配列番号６２のｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００３の構造を有することになる（図９）。増幅したＰＣＲ生成物は、直線形ＤＮＡの両端に多重Ｔ配列を有するｐＧｅｍＴ ＥＡＳＹベクターに結紮し、構造物ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００３が得られたし、配列分析を用いて原本配列と同一であることを確認した。配列分析のためにプライマー配列番号１３と１４（表３）を使用した。
増幅したＰＣＲ生成物であるＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖと３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤヒンジを鋳型とし、プライマー配列番号９（表３）と配列番号８（表３）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した。増幅したＰＣＲ生成物であるＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅとｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＨ３－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉを鋳型とし、プライマー配列番号９（表３）と配列番号１２（表３）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図８）。増幅されたＰＣＲ生成物はＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ－ＣＨ３－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、配列番号６２のｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００３の構造を有することになる（図９）。増幅したＰＣＲ生成物は、直線形ＤＮＡの両端に多重Ｔ配列を有するｐＧｅｍＴ ＥＡＳＹベクターに結紮し、構造物ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００３が得られたし、配列分析を用いて原本配列と同一であることを確認した。配列分析のためにプライマー配列番号１３と１４（表３）を使用した。
実施例５－３．ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００４ベクターの製造
増幅したＰＣＲ生成物であるＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖと３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅを鋳型とし、プライマー配列番号９（表３）と配列番号８（表３）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した。増幅したＰＣＲ生成物であるＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅとｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉを鋳型とし、プライマー配列番号９（表３）と配列番号１２（表３）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図１０）。増幅されたＰＣＲ生成物はＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、配列番号６３のｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００４の構造を有することになる（図１１）。増幅したＰＣＲ生成物は、直線形ＤＮＡの両端に多重Ｔ配列を有するｐＧｅｍＴ ＥＡＳＹベクターに結紮し、構造物ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００４が得られたし、配列分析を用いて原本配列と同一であることを確認した。配列分析のためにプライマー配列番号１３と１４（表３）を使用した。
増幅したＰＣＲ生成物であるＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖと３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅを鋳型とし、プライマー配列番号９（表３）と配列番号８（表３）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した。増幅したＰＣＲ生成物であるＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ｈＩｇＤ ｈｉｎｇｅとｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉを鋳型とし、プライマー配列番号９（表３）と配列番号１２（表３）を用いてＯＥ－ＰＣＲ方法で増幅した（図１０）。増幅されたＰＣＲ生成物はＢａｍＨ Ｉ－３Ｅ８ ＬＳ－ｓｃＦｖ－ＩｇＤ ｈｉｎｇｅ－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ ＩＣＤ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ－ｉｓｏ１－Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有し、配列番号６３のｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００４の構造を有することになる（図１１）。増幅したＰＣＲ生成物は、直線形ＤＮＡの両端に多重Ｔ配列を有するｐＧｅｍＴ ＥＡＳＹベクターに結紮し、構造物ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００４が得られたし、配列分析を用いて原本配列と同一であることを確認した。配列分析のためにプライマー配列番号１３と１４（表３）を使用した。
実施例６．ｐＭＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルスベクターの製造
１種のｐＢＨＡ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１と３種のｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲベクター（ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００２、ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００３、ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００４）にＢａｍＨ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素処理してＤＮＡ切片を得た。得られたＤＮＡ切片を、あらかじめＢａｍＨ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素で処理されたｐＭＴレトロウイルスベクター（米国登録特許第ＵＳ６，４５１，５９５号）に結紮し、４種のｐＭＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルスベクター（ｐＭＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１、－００２、－００３、－００４）を作製した（図１２Ａ～図１２Ｄ）。こうに製造されたｐＭＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルスベクターは、ＭＬＶ ＬＴＲプロモーターの調節下でｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲをエンコードする配列を含む。
１種のｐＢＨＡ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１と３種のｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲベクター（ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００２、ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００３、ｐＧｅｍＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００４）にＢａｍＨ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素処理してＤＮＡ切片を得た。得られたＤＮＡ切片を、あらかじめＢａｍＨ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素で処理されたｐＭＴレトロウイルスベクター（米国登録特許第ＵＳ６，４５１，５９５号）に結紮し、４種のｐＭＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルスベクター（ｐＭＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１、－００２、－００３、－００４）を作製した（図１２Ａ～図１２Ｄ）。こうに製造されたｐＭＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルスベクターは、ＭＬＶ ＬＴＲプロモーターの調節下でｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲをエンコードする配列を含む。
実施例７．Ａｎｔｉ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞の製造
実施例７－１．Ａｎｔｉ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ遺伝子発現レトロウイルスの製造
Ａｎｔｉ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ遺伝子の伝達のためのレトロウイルスは、プラスミドＤＮＡ形質転換法を用いて作製した（Ｓｏｎｅｏｋａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ＴｒａｎｓＩＴ ２９３形質転換システム（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用い、メーカーのプロトコルに従って行った。前日に６０ｍｍ皿に１×１０６個で播種した２９３Ｔ細胞株に、４種のｐＭＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルスベクター、ｇａｇ－ｐｏｌ発現ベクター及びＲＤ１１４ ｅｎｖ発現ベクターを形質転換後に、細胞を約４８時間培養した。培養完了後に細胞培養液を全て収穫し、０．４５μｍフィルターを用いて濾過した後、使用するまで－８０℃に冷凍保管した。生産された４種の抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルスは、レトロウイルスタイターセットキット（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｔｉｔｅｒ ｓｅｔ ｋｉｔ）（ＴａＫａＲａ，ＪＡＰＡＮ）を用いて実時間ＰＣＲで力価測定後に使用した。
実施例７－１．Ａｎｔｉ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ遺伝子発現レトロウイルスの製造
Ａｎｔｉ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ遺伝子の伝達のためのレトロウイルスは、プラスミドＤＮＡ形質転換法を用いて作製した（Ｓｏｎｅｏｋａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ＴｒａｎｓＩＴ ２９３形質転換システム（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用い、メーカーのプロトコルに従って行った。前日に６０ｍｍ皿に１×１０６個で播種した２９３Ｔ細胞株に、４種のｐＭＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルスベクター、ｇａｇ－ｐｏｌ発現ベクター及びＲＤ１１４ ｅｎｖ発現ベクターを形質転換後に、細胞を約４８時間培養した。培養完了後に細胞培養液を全て収穫し、０．４５μｍフィルターを用いて濾過した後、使用するまで－８０℃に冷凍保管した。生産された４種の抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルスは、レトロウイルスタイターセットキット（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｔｉｔｅｒ ｓｅｔ ｋｉｔ）（ＴａＫａＲａ，ＪＡＰＡＮ）を用いて実時間ＰＣＲで力価測定後に使用した。
実施例７－２．抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ遺伝子発現Ｔ細胞の製造
ドナーのヒト血液からＳｅｐＭａｔｅ（商標）－５０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）とＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて単核細胞を得た。単核細胞は、５％ヒト血清が含まれたＡＩＭＶ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培養液として使用し、１００ｍｍ皿に１×１０７個で分注した後、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体を、ｍＬ当たりに５０ｎｇ添加してＴ細胞を活性化させた。Ｔ細胞の成長のために、培養液にヒトＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ）をｍＬ当たりに３００Ｕ添加して培養した。４８時間培養後に、活性化されたＴ細胞を収穫し、４種の抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルス伝達に使用した。
ドナーのヒト血液からＳｅｐＭａｔｅ（商標）－５０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）とＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて単核細胞を得た。単核細胞は、５％ヒト血清が含まれたＡＩＭＶ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培養液として使用し、１００ｍｍ皿に１×１０７個で分注した後、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体を、ｍＬ当たりに５０ｎｇ添加してＴ細胞を活性化させた。Ｔ細胞の成長のために、培養液にヒトＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ）をｍＬ当たりに３００Ｕ添加して培養した。４８時間培養後に、活性化されたＴ細胞を収穫し、４種の抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルス伝達に使用した。
６ウェルプレートに１０ｕｇ／ｍＬ濃度で準備したレトロネクチン（ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ，ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）をウェル当たりに２ｍＬ添加した後、常温で２時間反応させてプレートにコートした。反応後にレトロネクチンは除去し、２．５％ヒトアルブミン含有ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）をウェル当たりに２ｍＬ添加し、常温で３０分反応させてブロッキングした。反応後、ブロッキングに使用した溶液を除去し、１Ｍ ＨＥＰＥＳが２．５％含まれたＨＢＳＳをウェル当たりに３ｍＬ添加して洗浄した。抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルスをウェル当たりに３×１０１０ｃｏｐｉｅｓで５％ヒト血清含有のＡＩＭＶ培地に希釈し、４ｍＬ添加後に２０００ｘｇ、３２℃条件で２時間遠心分離し、レトロウイルスをレトロネクチンに固定した。対照群として使用するウェルには、レトロウイルス希釈に使用した培地を同量添加した。反応後、レトロウイルスを除去し、活性化されたＴ細胞をウェル当たりに２×１０６個で添加後に１０００ｘｇで１５分間遠心分離し、Ｔ細胞に抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルスを伝達した。伝達効率を高めるために翌日に伝達過程を１回さらに反復し、合計２回行った。伝達２４時間後にＴ細胞を全て収穫し、５％ヒト血清と３００Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ－２が含まれたＡＩＭＶ培地を用いてｍＬ当たりに５×１０５個でＴフラスコに継代培養した。３～４日間隔でｍＬ当たりに５×１０５個で継代培養し、ｍＬ当たりに２×１０個を超えないように維持した。
次に、抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲレトロウイルスを伝達した活性化Ｔ細胞（抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ）において抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲが発現するか確認しようとした。２×１０６個の細胞を収穫してタンパク質を抽出し、抽出されたタンパク質はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）分析法で定量後に、４ｘサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とジチオトレイトールを混ぜて９５℃で５分間沸かして還元処理した。ウェスタンブロット方法で抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現を確認した。発現確認に使用した１次抗体はマウス抗ヒトＣＤ２４７（ＢＤ，ＣＡ，ＵＳＡ）であって、ＣＤ３ζに付着させ、２次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳＡ）を使用した。４種の抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞でウェスタンブロットした結果、５０～８０ＫＤａ位置でそれぞれバンドが確認され、抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲがよく発現していることを確認した（図１３Ａ～図１３Ｃ）。
抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔにおいて細胞表面に抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲが発現するか確認しようとした。５×１０５個の細胞を収穫し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で２回洗浄後に、ＣＡＲの単鎖可変断片（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）に特異的に結合するＦＩＴＣ融合されたＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＲＰＬ－ＰＦ１４１）を２．５ｕｇ添加し、４℃で３０分間反応させた。反応後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、流動細胞分析法を用いて抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現を確認した。その結果、ＭＴ－ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００４レトロウイルスを伝達したＴ細胞の表面で抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲが約５７．７％発現していることを確認した（図１４）。
実施例８．生体外（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗癌活性能の確認
実施例８－１．ターゲット細胞におけるｃ－Ｍｅｔ発現率の確認
ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９は、ｃ－Ｍｅｔを高く発現するものと知られており、抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗癌活性能を確認するのに適した細胞株である。そのために、Ａ５４９細胞株をＰＢＳ １００ｕＬに５×１０５個で準備し、１Ｅ４－Ｈ４ｋ２抗体を１ｕｇ添加した後、４℃で３０分間反応した。反応後に細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を２ｕＬ添加し、４℃で３０分間反応した。反応後に細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、流動細胞分析法を用いてｃ－Ｍｅｔ発現を確認した。その結果、Ａ５４９癌細胞から約８３．９％のｃ－Ｍｅｔ発現率を確認した。同一の方法を用いてヒト前立腺癌細胞株であるＰＣ－３とヒト乳癌細胞株であるＭＣＦ－７、卵巣癌細胞株であるＳＫＯＶ３、ヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株であるＪｕｒｋａｔ、ヒト肝癌細胞株であるＳＫ－ＨＥＰ－１からｃ－Ｍｅｔの発現を確認した結果、ＰＣ－３では約４８．５％、ＭＣＦ－７では約６６．０％、ＳＫＯＶ３では約５８．０％、ＳＫ－ＨＥＰ－１では約９９．９％、Ｊｕｒｋａｔでは約２．３７％の発現率を確認した。
実施例８－１．ターゲット細胞におけるｃ－Ｍｅｔ発現率の確認
ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９は、ｃ－Ｍｅｔを高く発現するものと知られており、抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗癌活性能を確認するのに適した細胞株である。そのために、Ａ５４９細胞株をＰＢＳ １００ｕＬに５×１０５個で準備し、１Ｅ４－Ｈ４ｋ２抗体を１ｕｇ添加した後、４℃で３０分間反応した。反応後に細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を２ｕＬ添加し、４℃で３０分間反応した。反応後に細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、流動細胞分析法を用いてｃ－Ｍｅｔ発現を確認した。その結果、Ａ５４９癌細胞から約８３．９％のｃ－Ｍｅｔ発現率を確認した。同一の方法を用いてヒト前立腺癌細胞株であるＰＣ－３とヒト乳癌細胞株であるＭＣＦ－７、卵巣癌細胞株であるＳＫＯＶ３、ヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株であるＪｕｒｋａｔ、ヒト肝癌細胞株であるＳＫ－ＨＥＰ－１からｃ－Ｍｅｔの発現を確認した結果、ＰＣ－３では約４８．５％、ＭＣＦ－７では約６６．０％、ＳＫＯＶ３では約５８．０％、ＳＫ－ＨＥＰ－１では約９９．９％、Ｊｕｒｋａｔでは約２．３７％の発現率を確認した。
実施例８－２．ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）グリーン色素を用いた抗癌活性能の確認
ターゲット細胞（ｔａｒｇｅｔ細胞，Ｔ）に対する抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞，Ｅ）の抗癌活性能を確認するために、ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）グリーン色素を使用した。ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）グリーン色素は、死んだ細胞から放出されるＤＮＡに付着して蛍光を示す染料であり、抗癌活性能（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を確認するために用いられる。ターゲット細胞を培養培地５０ｕＬに１×１０４個で準備し、ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）グリーン色素を０．２ｕＬ添加し、黒色９６ウェルプレートに添加した。抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、ヒト血清とヒトＩＬ－２が含まれたＡＩＭＶ培地５０ｕＬに、５×１０３個、１×１０４個、５×１０４個（Ｅ：Ｔ比率＝０．５、１、５）で準備し、ターゲット細胞を含んでいるウェルに添加して３７℃、ＣＯ２培養器で２４時間反応させた。ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）グリーン色素とターゲット細胞の培養培地を含んでいるウェルに、抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のみを添加した群を準備し、反応時間の間に死ぬ抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞から放出されるＤＮＡに付着して発生する染料の反応値を除外させた。また、ターゲット細胞のみを含んでいるウェルを準備し、ロー制御（Ｈｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌ）（自発的（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）ＤＮＡ放出）値を補正し、ターゲット細胞のみを含んでいるウェルに溶菌液（ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加してハイ制御（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）（最大ＤＮＡ放出）値を補正した。ターゲット細胞に対する殺傷能は、下の式で計算した。
ターゲット細胞（ｔａｒｇｅｔ細胞，Ｔ）に対する抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞，Ｅ）の抗癌活性能を確認するために、ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）グリーン色素を使用した。ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）グリーン色素は、死んだ細胞から放出されるＤＮＡに付着して蛍光を示す染料であり、抗癌活性能（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を確認するために用いられる。ターゲット細胞を培養培地５０ｕＬに１×１０４個で準備し、ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）グリーン色素を０．２ｕＬ添加し、黒色９６ウェルプレートに添加した。抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、ヒト血清とヒトＩＬ－２が含まれたＡＩＭＶ培地５０ｕＬに、５×１０３個、１×１０４個、５×１０４個（Ｅ：Ｔ比率＝０．５、１、５）で準備し、ターゲット細胞を含んでいるウェルに添加して３７℃、ＣＯ２培養器で２４時間反応させた。ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）グリーン色素とターゲット細胞の培養培地を含んでいるウェルに、抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞のみを添加した群を準備し、反応時間の間に死ぬ抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞から放出されるＤＮＡに付着して発生する染料の反応値を除外させた。また、ターゲット細胞のみを含んでいるウェルを準備し、ロー制御（Ｈｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌ）（自発的（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）ＤＮＡ放出）値を補正し、ターゲット細胞のみを含んでいるウェルに溶菌液（ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加してハイ制御（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）（最大ＤＮＡ放出）値を補正した。ターゲット細胞に対する殺傷能は、下の式で計算した。
式
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（％）＝｛（Ｔａｒｇｅｔ細胞とＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞の反応値）－（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞の反応値）｝－（Ｌｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌ）／（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｒｏｌ－Ｌｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌ）×１００
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（％）＝｛（Ｔａｒｇｅｔ細胞とＥｆｆｅｃｔｏｒ細胞の反応値）－（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞の反応値）｝－（Ｌｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌ）／（Ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｒｏｌ－Ｌｏｗ ｃｏｎｔｒｏｌ）×１００
その結果、４種のｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１、－００２、－００３、－００４発現Ｔ細胞のＡ５４９癌細胞に対する抗癌活性能は、抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲを発現させないＴ細胞である対照群に比べて高いことを確認した（図１６）。
同一の実験方法を用いてＰＣ－３癌細胞に対する殺傷能を確認した。ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１、－００２、－００３、－００４発現Ｔ細胞のＰＣ－３癌細胞に対する抗癌活性能は、抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲを発現させないＴ細胞である対照群に比べて高いことを確認した（図１７）。特に、ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１に比べて他の構造のＣＡＲがより優れたな効果を示した。
同一の実験方法を用いてＭＣＦ－７癌細胞に対する殺傷能を確認した。ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１、－００２、－００３、－００４発現Ｔ細胞のＭＣＦ－７癌細胞に対する抗癌活性能は、抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲを発現させないＴ細胞である対照群に比べて高いことを確認した（図１８）。
同一の実験方法を用いてＳＫＯＶ３癌細胞に対する殺傷能を確認した。ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１、－００２、－００３、－００４発現Ｔ細胞のＳＫＯＶ３癌細胞に対する抗癌活性能は、抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲを発現させないＴ細胞である対照群に比べて高いことを確認した（図１９）。
同一の実験方法を用いてＳＫ－ＨＥＰ－１に対する殺傷能を確認した。ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１、－００２、－００３、－００４発現Ｔ細胞のＳＫ－ＨＥＰ－１癌細胞に対する抗癌活性能は、抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲを発現させないＴ細胞である対照群に比べて高いことを確認した（図２０）。
同一の実験方法を用いてＪｕｒｋａｔに対する殺傷能を確認した。ｃ－Ｍｅｔを低く発現するＪｕｒｋａｔを用いてｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ－００１、－００２、－００３、－００４発現Ｔ細胞の殺傷能を確認した結果、Ｊｕｒｋａｔに対する殺傷能はほとんど観察されなかった。このことから、抗ｃ－Ｍｅｔ－ＣＡＲ発現Ｔ細胞が、ｃ－Ｍｅｔを高く発現させる細胞に対してのみ特異的に殺傷能を有することを確認した（図２１）。
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、それらの具体的な記述は単に好ましい具現例に過ぎず、それらに本発明の範囲が制限されないという点は明らかである。
本発明の態様は以下を含む。
＜１＞
次を含む抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体をエンコードする核酸分子：ｃ－Ｍｅｔ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内信号伝達ドメイン。
＜２＞
前記ｃ－Ｍｅｔ結合ドメインは、抗ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である、＜１＞に記載の核酸分子。
＜３＞
前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５～配列番号１７のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ，ＣＤＲＨ１）、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）；及び、配列番号１８～配列番号２０のアミノ酸配列をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ，ＣＤＲＬ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜４＞
前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＨ）；及び、配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ
ｒｅｇｉｏｎ，ＶＬ）を含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜５＞
前記キメラ抗原受容体は、リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＬＳ）をさらに含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜６＞
前記リーダー配列は、ＣＤ８アルファのリーダー配列、ｈＧＭ－ＣＳＦ受容体アルファ鎖（ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎ）のリーダー配列、又は３Ｅ８抗体のリーダー配列である、＜５＞に記載の核酸分子。
＜７＞
前記リーダー配列は、配列番号２６、２８又は３０の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むリーダー配列である、＜５＞に記載の核酸分子。
＜８＞
前記ｃ－Ｍｅｔ結合ドメイン及び膜貫通ドメインは、ヒンジ領域、スぺーサ領域、又は
それらの組合せによって連結されるものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜９＞
前記ヒンジ領域又はスぺーサ領域は、ＩｇＧ１のヒンジ、ＩｇＧ４のヒンジ、ＩｇＤのヒンジ、ＣＤ８アルファのヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ３、ＣＤ２８の細胞外ドメイン又はそれらの組合せである、＜８＞に記載の核酸分子。
＜１＞０＞
前記ヒンジ領域又はスペース領域は、配列番号３２、３４、３６、３８、４０又は４４の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むリーダー配列である、＜８＞に記載の核酸分子。
＜１１＞
前記キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４のアルファ、ベータ又はゼータ鎖からなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、＜１＞に記載の核酸分子。
＜１２＞
前記膜貫通ドメインは、配列番号４２、４６又は４７の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むものである、＜１１＞に記載の核酸分子。
＜１３＞
前記細胞内信号伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの信号伝達ドメインを含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜１４＞
前記ＣＤ３ゼータの信号伝達ドメインは、配列番号５５、５７又は５９の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むものである、＜１３＞に記載の核酸分子。
＜１５＞
前記細胞内信号伝達ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選ばれるタンパク質の信号伝達ドメインを共同刺激ドメインとしてさらに含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜１６＞
前記共同刺激ドメインは、配列番号４９、５１又は５３の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含む共同刺激ドメインである、＜１５＞に記載の核酸分子。
＜１７＞
＜１＞～＜１６＞のいずれか一項の核酸分子を含むベクター。
＜１８＞
＜１＞～＜１６＞のいずれか一項の核酸分子によってエンコードされるポリペプチドを含む抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体分子。
＜１９＞
＜１８＞の抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体分子を細胞表面に発現させるエフェクター細胞。
＜２０＞
前記エフェクター細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、大食細胞及びそれらの前駆細胞からなる群から選ばれるものである、＞９に記載のエフェクター細胞。
＜２１＞
＜１９＞のエフェクター細胞及び薬剤学的に許容される担体を含む、ｃ－Ｍｅｔ免疫治療用薬剤学的組成物。
＜２２＞
＜１９＞のエフェクター細胞及び薬剤学的に許容される担体を含む、ｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患の治療用薬剤学的組成物。
＜２３＞
前記ｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患は、脳癌、神経膠腫、乳癌、膵癌、胸膜中皮腫、肝癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、及び大腸癌からなる群から選ばれる疾病である、＜２２＞に記載の薬剤学的組成物。
本発明の態様は以下を含む。
＜１＞
次を含む抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体をエンコードする核酸分子：ｃ－Ｍｅｔ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内信号伝達ドメイン。
＜２＞
前記ｃ－Ｍｅｔ結合ドメインは、抗ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である、＜１＞に記載の核酸分子。
＜３＞
前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５～配列番号１７のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ，ＣＤＲＨ１）、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）；及び、配列番号１８～配列番号２０のアミノ酸配列をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域１（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ，ＣＤＲＬ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜４＞
前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＨ）；及び、配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ
ｒｅｇｉｏｎ，ＶＬ）を含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜５＞
前記キメラ抗原受容体は、リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＬＳ）をさらに含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜６＞
前記リーダー配列は、ＣＤ８アルファのリーダー配列、ｈＧＭ－ＣＳＦ受容体アルファ鎖（ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎ）のリーダー配列、又は３Ｅ８抗体のリーダー配列である、＜５＞に記載の核酸分子。
＜７＞
前記リーダー配列は、配列番号２６、２８又は３０の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むリーダー配列である、＜５＞に記載の核酸分子。
＜８＞
前記ｃ－Ｍｅｔ結合ドメイン及び膜貫通ドメインは、ヒンジ領域、スぺーサ領域、又は
それらの組合せによって連結されるものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜９＞
前記ヒンジ領域又はスぺーサ領域は、ＩｇＧ１のヒンジ、ＩｇＧ４のヒンジ、ＩｇＤのヒンジ、ＣＤ８アルファのヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ３、ＣＤ２８の細胞外ドメイン又はそれらの組合せである、＜８＞に記載の核酸分子。
＜１＞０＞
前記ヒンジ領域又はスペース領域は、配列番号３２、３４、３６、３８、４０又は４４の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むリーダー配列である、＜８＞に記載の核酸分子。
＜１１＞
前記キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４のアルファ、ベータ又はゼータ鎖からなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、＜１＞に記載の核酸分子。
＜１２＞
前記膜貫通ドメインは、配列番号４２、４６又は４７の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むものである、＜１１＞に記載の核酸分子。
＜１３＞
前記細胞内信号伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの信号伝達ドメインを含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜１４＞
前記ＣＤ３ゼータの信号伝達ドメインは、配列番号５５、５７又は５９の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むものである、＜１３＞に記載の核酸分子。
＜１５＞
前記細胞内信号伝達ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選ばれるタンパク質の信号伝達ドメインを共同刺激ドメインとしてさらに含むものである、＜１＞に記載の核酸分子。
＜１６＞
前記共同刺激ドメインは、配列番号４９、５１又は５３の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含む共同刺激ドメインである、＜１５＞に記載の核酸分子。
＜１７＞
＜１＞～＜１６＞のいずれか一項の核酸分子を含むベクター。
＜１８＞
＜１＞～＜１６＞のいずれか一項の核酸分子によってエンコードされるポリペプチドを含む抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体分子。
＜１９＞
＜１８＞の抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体分子を細胞表面に発現させるエフェクター細胞。
＜２０＞
前記エフェクター細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、大食細胞及びそれらの前駆細胞からなる群から選ばれるものである、＞９に記載のエフェクター細胞。
＜２１＞
＜１９＞のエフェクター細胞及び薬剤学的に許容される担体を含む、ｃ－Ｍｅｔ免疫治療用薬剤学的組成物。
＜２２＞
＜１９＞のエフェクター細胞及び薬剤学的に許容される担体を含む、ｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患の治療用薬剤学的組成物。
＜２３＞
前記ｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患は、脳癌、神経膠腫、乳癌、膵癌、胸膜中皮腫、肝癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、及び大腸癌からなる群から選ばれる疾病である、＜２２＞に記載の薬剤学的組成物。
Claims (20)
- ｃ－Ｍｅｔ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内信号伝達ドメインを含む抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体をエンコードする核酸分子であって、
前記ｃ－Ｍｅｔ結合ドメインは、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であり、前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＨ）；及び、配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＶＬ）を含む、前記核酸分子。 - 前記キメラ抗原受容体は、リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＬＳ）をさらに含むものである、請求項１に記載の核酸分子。
- 前記リーダー配列は、ＣＤ８アルファのリーダー配列、ｈＧＭ－ＣＳＦ受容体アルファ鎖（ｈＧＭ－ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎ）のリーダー配列、又は３Ｅ８抗体のリーダー配列である、請求項２に記載の核酸分子。
- 前記リーダー配列は、配列番号２６、２８又は３０の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むリーダー配列である、請求項２に記載の核酸分子。
- 前記ｃ－Ｍｅｔ結合ドメイン及び膜貫通ドメインは、ヒンジ領域、スぺーサ領域、又はそれらの組合せによって連結されるものである、請求項１に記載の核酸分子。
- 前記ヒンジ領域又はスぺーサ領域は、ＩｇＧ１のヒンジ、ＩｇＧ４のヒンジ、ＩｇＤのヒンジ、ＣＤ８アルファのヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ３、ＣＤ２８の細胞外ドメイン又はそれらの組合せである、請求項５に記載の核酸分子。
- 前記ヒンジ領域又はスペース領域は、配列番号３２、３４、３６、３８、４０又は４４の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の核酸分子。
- 前記キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の核酸分子。
- 前記膜貫通ドメインは、配列番号４２、４６又は４７の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むものである、請求項８に記載の核酸分子。
- 前記細胞内信号伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの信号伝達ドメインを含むものである、請求項１に記載の核酸分子。
- 前記ＣＤ３ゼータの信号伝達ドメインは、配列番号５５、５７又は５９の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むものである、請求項１０に記載の核酸分子。
- 前記細胞内信号伝達ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及びＣＤ１３７からなる群から選ばれるタンパク質の信号伝達ドメインを共同刺激ドメインとしてさらに含むものである、請求項１に記載の核酸分子。
- 前記共同刺激ドメインは、配列番号４９、５１又は５３の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含む共同刺激ドメインである、請求項１２に記載の核酸分子。
- 請求項１～１３のいずれか一項の核酸分子を含むベクター。
- 請求項１～１３のいずれか一項の核酸分子によってエンコードされるポリペプチドを含む抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体分子。
- 請求項１５の抗ｃ－Ｍｅｔキメラ抗原受容体分子を細胞表面に発現させるエフェクター細胞。
- 前記エフェクター細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、大食細胞及びそれらの前駆細胞からなる群から選ばれるものである、請求項１６に記載のエフェクター細胞。
- 請求項１６のエフェクター細胞及び薬剤学的に許容される担体を含む、ｃ－Ｍｅｔ免疫治療用薬剤学的組成物。
- 請求項１６のエフェクター細胞及び薬剤学的に許容される担体を含む、ｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患の治療用薬剤学的組成物。
- 前記ｃ－Ｍｅｔ発現に関連した疾患は、脳癌、神経膠腫、乳癌、膵癌、胸膜中皮腫、肝癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、及び大腸癌からなる群から選ばれる疾病である、請求項１９に記載の薬剤学的組成物。
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