CN114450407A - 包含抗-间质表皮转化因子抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含间质表皮转化因子结合结构域的嵌合抗原受体及其用途。在利用本发明的包含间质表皮转化因子结合结构域的嵌合抗原受体的情况下，可有用地用作针对与各种间质表皮转化因子的表达相关的疾病的治疗剂。

Description

包含抗-间质表皮转化因子抗体或其抗原结合片段的嵌合抗 原受体及其用途

技术领域

本申请要求于2019年9月26日提交且申请号为第10-2019-0119148号的韩国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

本发明涉及包含间质表皮转化因子(c-Met)结合结构域的嵌合抗原受体及其用途。

背景技术

间质表皮转化因子的激活导致诱导细胞生长、分散(scattering)及运动性(motility)、侵袭(invasion)、防止细胞凋亡、分枝化形态发生(branchingmorphogenesis)及血管新生(angiogenesis)的增加的各种生物学反应。因此，在病理学条件下，间质表皮转化因子的不适当激活可对癌细胞赋予增殖、存活及侵袭/转移能力。当考虑受到间质表皮转化因子激活影响的各种生物学功能及生理学功能时，间质表皮转化因子蛋白成为多用途的治疗靶点。

近来，作为免疫细胞疗法的加强体内免疫细胞或者通过遗传工学改变免疫细胞并放回的过继细胞治疗(adoptive cell therapy)备受关注。尤其，正在积极进行利用基因重组修饰且利用作为人工受体的嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)的研究。

发明内容

技术问题

本发明人为了研发能够有效治疗与间质表皮转化因子表达相关的疾病的嵌合抗原受体及包含其的效应细胞而进行深入研究。结果，制备了与间质表皮转化因子特异性结合的抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体及表达其的T细胞，阐明抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体-T对于与各种间质表皮转化因子表达相关的癌症具有治疗效果，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供编码抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体的核酸分子及包含其的载体。

本发明的再一目的在于，提供包含被上述核酸分子编码的多肽的抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体分子及在细胞表面表达其的效应细胞。

本发明的另一目的在于，提供包含上述效应细胞及药剂学上可接受的载体的药物组合物。

技术方案

根据本发明的一实施方式，本发明提供编码抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体的核酸分子，其包括

间质表皮转化因子结合结构域、跨膜结构域以及胞内信号转导结构域。

在本发明的一实例中，上述间质表皮转化因子结合结构域为与间质表皮转化因子特异性结合的抗体(antibody)或其抗原结合片段(antigen binding fragment thereof)。

在本发明的具体实例中，上述抗体或其抗原结合片段包括：分别包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链互补决定区1(complementaritydetermining region 1of heavy chain，CDRH1)、重链互补决定区2(CDRH2)及重链互补决定区3(CDRH3)；以及分别包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链互补决定区1(complementarity determining region 1of light chain，CDRL1)、轻链互补决定区2(CDRL2)及轻链互补决定区3(CDRL3)。

在本发明的再一具体实例中，上述抗体或其抗原结合片段包括由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的重链可变区(heavy chain variable region，VH)以及由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的轻链可变区(light chain variable region，VL)。

在本发明的另一具体实例中，上述抗体或其抗原结合片段包括由SEQ ID NO:64的氨基酸序列组成的重链可变区以及由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的轻链可变区。

在本发明的还有一具体实例中，上述抗体或其抗原结合片段包括由SEQ ID NO:65的氨基酸序列组成的重链可变区以及由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的轻链可变区。

在本发明的又一具体实例中，上述抗体或其抗原结合片段包括由SEQ ID NO:65的氨基酸序列组成的重链可变区以及由SEQ ID NO:66的氨基酸序列组成的轻链可变区。

在本说明书中，术语“抗体(antibody或Ab)”是指源自与特定抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。上述抗体可以为天然抗体或重组抗体。

上述术语“重组抗体”是指利用重组脱氧核糖核酸(DNA)技术生成的抗体，例如，由动物细胞表达系统表达的抗体。上述术语还指通过编码抗体的合成的脱氧核糖核酸分子的翻译生成的抗体。

上述抗体不仅包括完整的抗体形态，还包括抗体分子的抗原结合片段(antigenbinding fragment)。完整的抗体为具有两个全长轻链及两个全长重链的结构，各个轻链通过二硫键与重链连接。

术语“重链(heavy chain)”是指以其天然存在立体形态存在于抗体分子且通常确定抗体所属的类别的多肽链的2个种类中更大的链。上述“重链”是指包含具有足以向抗原赋予特异性的可变区序列的氨基酸序列的抗体的重链可变区(variable region of heavychain)结构域VH及3个重链恒定区(constant region of heavy chain)结构域CH1、CH2及CH3的全长重链及其片段。重链恒定区具有γ、μ、α、δ及ε类型，亚类具有γ1、γ2、γ3、γ4、α1及α2。

术语“轻链(light chain)”是指以其天然存在立体形态存在于抗体分子的多肽链的2个种类中更小的链。上述“轻链”是指包含具有足以向抗原赋予特异性的可变区序列的氨基酸序列的抗体的轻链可变区(variable region of light chain)结构域VL及轻链恒定区(constant region of light chain)结构域CL的全长轻链及其片段。轻链的恒定区具有κ及λ类型(Cellular and Molecular Immunology,Wonsiewicz,M.J.,Ed.,Chapter 45,pp.41-50,W.B.Saunders Co.Philadelphia,PA(1991)；Nisonoff,A.,Introduction toMolecular Immunology,2nd Ed.,Chapter 4,pp.45-65,sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(1984))。

术语“抗原(antigen或Ag)”是指诱发免疫反应的分子。上述免疫反应可伴随抗体生产或特异性免疫-活性细胞的激活，或者两者兼而有之。

在本说明书中，术语“互补决定区(complementarity determining region，CDR)”是指免疫球蛋白重链及轻链的高变区(hypervariable region)的氨基酸序列(Kabat etal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th Ed.,U.S.Department ofHealth and Human Services,National Institutes of Health(1987))。重链(CDRH1、CDRH2及CDRH3)及轻链(CDRL1、CDRL2及CDRL3)中分别包括3个互补决定区。互补决定区在抗体与抗原或表位结合时提供重要的接触残基。

本发明的抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFV)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键Fvs(sdFV)及抗独特型(抗-Id)抗体以及上述抗体的表位-结合片段等，但并不限定于此。

在本说明书中，术语“骨架(Framework)”或“FR”表示高变区(hypervariableregion，HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由4个FR结构域FR1、FR2、FR3及FR4构成。因此，HVR及FR序列通常在VH(或VL/Vk)中由如下的顺序示出：

(a)，重链骨架区1(Framework region 1of Heavy chain，FRH1)-重链互补决定区1(complementarity determining region 1of Heavy chain)-重链骨架区2-重链互补决定区2-重链骨架区3-重链互补决定区3-重链骨架区4；以及

(b)，轻链骨架区1(Framework region 1of Light chain，FRL1)-轻链互补决定区1-轻链骨架区2-轻链互补决定区2-轻链骨架区3-轻链互补决定区3-轻链骨架区4。

在本说明书中，术语“间质表皮转化因子(mesenchymal-epithelial transitionfactor，c-Met)”为被在细胞表面中表达的Met癌基因(proto-oncogene)编码的受体酪氨酸激酶。在结构上，间质表皮转化因子为由细胞外α亚基(extracellular alpha subunit，50kDa)和跨膜β亚基(transmembrane beta subunit，140kDa)组成的二硫键二聚体。间质表皮转化因子包含用于配体结合的胞外结构域、跨膜部分及参与细胞内结构域中的酪氨酸残基的磷酸化的酪氨酸激酶催化基序(Dean et al.,Nature,4:318(6044):385,1985；Parket al.,PNAS,84(18):6379,1976；Maggiora et al.,J.Cell Physiol.,173:183,1997)。当间质表皮转化因子与作为配体的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)结合时，间质表皮转化因子的胞质酪氨酸残基二聚化且自磷酸化(autophosphorylate)，接着，与介导下游信号通路的各种蛋白质相互作用。间质表皮转化因子激活导致诱导细胞生长、分散及运动性、侵袭、防止细胞凋亡、分枝化形态发生及血管新生的增加的各种生物学反应。在病理学条件下，间质表皮转化因子的不适当激活可对癌细胞赋予增殖、存活及侵袭/转移能力。当考虑受到间质表皮转化因子激活影响的各种生物学功能及生理学功能时，间质表皮转化因子蛋白成为多用途的治疗靶点。

在本说明书中，术语“特异性结合”等是指如抗体或其抗原结合片段、或scFv的其他构建体在生理条件下形成较稳定的抗原和复合物。

在本发明的一实例中，本发明的抗-间质表皮转化因子抗体或抗原结合片段的特异性结合可由至少约1×10^-6M以下(例如，9×10^-7M、8×10^-7M、7×10^-7M、6×10^-7M、5×10^-7M、4×10^-7M、3×10^-7M、2×10^-7M或1×10^-7M)、至少约1×10^-7M以下(例如，9×10^-8M、8×10^-8M、7×10^-8M、6×10^-8M、5×10^-8M、4×10^-8M、3×10^-8M、2×10^-8M或1×10^-8M)、或至少约1×10^-8M以下(例如，9×10^-9M、8×10^-9M、7×10^-9M、6×10^-9M、5×10^-9M、4×10^-9M、3×10^-9M、2×10^-9M或1×10^-9M)的平衡解离常数(K_D越小，表示更紧密的结合)表征。确定两个分子是否特异性结合的方法在本领域周知，例如，包括平衡透析、表面等离子体共振等。但是，与人间质表皮转化因子特异性结合的分离的抗体可示出对于如异种(species)的间质表皮转化因子分子的其他抗原的交叉反应性。

在本说明书中，术语“亲和力(Affinity)”是指分子(例如，抗体)的单结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用总合的强度。除非另有说明，如在本申请中使用，“结合亲和力(binding affinity)”是指反映结合对(例如，抗体及抗原)的成分之间的1∶1相互作用的内在(intrinsic)结合亲和力。分子Y与其伴侣Y的亲和力通常可由解离常数(K_d)示出。可通过包括在本申请中记述的方法在内的本领域公知的常规方法测定亲和力。

并且，在本说明书中，术语“人抗体(human antibody)”具有与源自利用由人或人细胞生成的抗体或人抗体库(repertoires)或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相应的氨基酸序列。人抗体的这种定义排除包含非人抗原结合残基的人源化(humanized)抗体。

在本说明书中，术语“嵌合(chimeric)”抗体是指重链和/或轻链的一部分源自特定来源(source)或种(species)、重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或种的抗体。

在本说明书中，术语“人源化抗体”为包含源自非人(例如，小鼠)抗体的非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(例如，Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原-结合子序列)。在大部分情况下，人源化抗体为受体的互补决定区的残基被具有所需的特异性、亲和力及能力的非人物种(供体抗体)，例如，小鼠、大鼠或兔的互补决定区的残基取代的人免疫球蛋白(受体抗体)。在一部分情况下，上述人免疫球蛋白的Fv骨架区(framework region，FR)残基被相应的非人残基取代。并且，人源化抗体可包含在受体抗体、输入的互补决定区或骨架序列中也未发现的残基。这种修饰为了进一步改善及优化抗体性能而进行。通常，上述人源化抗体包括至少一个可变结构域，以及通常包括两个实质上的所有可变结构域，在上述结构域中，上述互补决定区的全部或实质全部与非人免疫球蛋白的互补决定区相应，上述骨架区的全部或实质全部具有人免疫球蛋白的骨架区的序列。上述人源化抗体包含免疫球蛋白恒定区(Fc region)的至少一部分或实质性人免疫球蛋白的恒定区序列。

如通常的技术人员所认知，本发明的抗-间质表皮转化因子抗体或其抗原结合片段可包含能够特异性识别间质表皮转化因子的范围内的氨基酸序列的变体。例如，为了改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性，可减少抗体的氨基酸序列的变化。这种修饰包括如抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。

这种氨基酸变异基于氨基酸侧链取代体的相对相似性，例如疏水性、亲水性、电荷、大小等进行。通过分析氨基酸侧链取代体的大小、形状及种类可知，精氨酸、赖氨酸及组氨酸均为带正电荷的残基，丙氨酸、甘氨酸及丝氨酸具有相似的大小，苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这种考虑事项，精氨酸、赖氨酸及组氨酸；丙氨酸、甘氨酸及丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸为生物功能等价物。

当引入变异时，可考虑氨基酸的疏水性指数(hydropathic idex)。各个氨基酸根据疏水性和电荷赋予了疏水性指数。异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天门冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)及精氨酸(-4.5)。

当赋予蛋白质相互作用的生物学功能(interactive biological function)时，疏水性氨基酸指数非常重要。由具有相似的疏水性指数的氨基酸取代才能具有相似的生物活性是公知的事实。在参照疏水性指数引入变异的情况下，优选地，在示出±2以内的疏水性指数差异的氨基酸之间进行取代，更优选地，在示出±1以内的疏水性指数差异的氨基酸之间进行取代，更加优选地，在示出±0.5以内的疏水性指数差异的氨基酸之间进行取代。

另外，具有相似的亲水性值(hydrophilicity value)的氨基酸之间的取代导致具有等同生物活性的蛋白质也是公知的事实。如在美国专利第4554101号中所记载，对各个氨基酸残基赋予了如下的亲水性值。精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天门冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。

在参照亲水性值引入变异的情况下，优选地，在示出±2以内的亲水性值差异的氨基酸之间进行取代，更优选地，在示出±1以内的亲水性值差异的氨基酸之间进行取代，更加优选地，在示出±0.5以内的亲水性值差异的氨基酸之间进行取代。

不完全改变分子活性的蛋白质中的氨基酸交换是本领域公知的事实(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常见的交换是氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly之间的交换。

在本发明的一实例中，本发明的抗-间质表皮转化因子抗体或其抗原结合片段包括由上述的具体氨基酸序列限定的抗-间质表皮转化因子抗体或其抗原结合片段(例如，重链可变区及轻链可变区的氨基酸序列，或包括它们的重链互补决定区1至重链互补决定区3及轻链互补决定区1至轻链互补决定区3的氨基酸序列的片段)。

并且，在本发明的一实例中，抗-间质表皮转化因子抗体或其抗原结合片段包含与由上述的具体氨基酸序列限定的抗体或其抗原结合片段的互补决定区、重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列具有至少约60％以上的同源性(例如，60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％或69％)的序列，更优选地，包含具有至少70％以上的同源性(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％)的序列，更加优选地，包含具有至少80％以上(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％)的同源性的序列，最优选地，包含具有90％以上(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同源性的序列。上述70％以上且100％以下的所有整数及其之间的质数均包括在％同源性的本发明的范围内。

在本说明书中，术语“嵌合抗原受体”是指包括至少一个细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域及源自刺激分子的胞内信号转导结构域的重组多肽。

本发明的嵌合抗原受体包含上述的抗-间质表皮转化因子抗体或其抗原结合片段作为细胞外抗原结合结构域。因此，本发明的嵌合抗原受体由抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体(anti-c-Met CAR)、抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体等。

在本发明的实施例中使用的“c-Met CAR-001至c-Met CAR-003”、“pMT-c-Met-CAR”、或“pGemT-c-Met-CAR”等的术语中的“c-Met CAR”为本发明人发明的抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体的代号，指代包含与上述的间质表皮转化因子特异性结合的细胞外抗原结合结构域的嵌合抗原受体。

在本说明书中，术语“刺激分子”示出对于T细胞信号传导途径的至少某些方面的刺激方式中的由提供用于调节TCR复合物的初级活化的(多个)初级细胞质信号传导序列的T细胞表达的分子。更具体地，初级信号例如通过负载肽的MHC分子与TCR/CD3复合物的结合而启动，其包括增殖、活化、分化等，但介导不限于其的T细胞反应。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列(或“初级信号转导结构域”)可包括以基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM周知的信号转导基序。在本发明中，包含特别有用的初级细胞质信号传导序列的ITAM的例包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(还以“ICOS”周知)及CD66d的，但并不局限于此。

在本说明书中，术语“信号转导结构域”是指为了生成第二信使(secondmessenger)或者对上述信使反应来通过预定的信号传导途径调节细胞活性，将信号传导至细胞内来起作用的蛋白质的功能部分。

在本发明的一实例中，上述嵌合抗原受体选择性还包含前导序列(leadersequence，LS)。上述前导序列位于构成嵌合抗原受体的重组多肽的氨基末端(N-terminal)。上述前导序列定位于(localization)嵌合抗原受体的细胞内过程及细胞膜，由此从抗原结合结构域任意切割。

在本发明的具体实例中，上述前导序列可以为CD8α的前导序列、hGM-CSF受体α链(hGM-CSF receptor alpha-chain)的前导序列或3E8抗体的前导序列。

在本发明的更具体实例中，上述前导序列为包括被SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:30的碱基序列编码的氨基酸序列的前导序列。

在本发明的一实例中，上述嵌合抗原受体的间质表皮转化因子结合结构域与跨膜结构域通过铰链区、间隔区或它们的组合相连。

在本发明的具体实例中，上述铰链区、间隔区或它们的组合可以为人IgG1的铰链、IgG4的铰链、IgD的铰链、CD8α的铰链、IgG1的CH3、CD28的胞外结构域或它们的全部或一部分序列的组合。

在本发明的更具体实例中，上述铰链区包括被SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:44的碱基序列编码的氨基酸序列。

在本发明的具体实例中，上述跨膜结构域包括选自由T-细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154的α链、β链或ζ链组成的组中的蛋白质的跨膜结构域。

在本发明的更具体实例中，上述跨膜结构域包括被SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的碱基序列编码的氨基酸序列。

在本发明的一实例中，上述胞内信号转导结构域包括CD3ζ的信号转导结构域。

在本发明的具体实例中，上述CD3ζ的信号转导结构域包括被SEQ ID NO:55、SEQID NO:57或SEQ ID NO:59的碱基序列编码的氨基酸序列。

在本发明的另一实例中，上述胞内信号转导结构域还包括选自由OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)组成的组中的蛋白质的信号转导结构域作为共刺激结构域。即，本发明的嵌合抗原受体可以为包括抗原结合结构域、跨膜结构域、源自刺激分子的胞内信号转导结构域及源自共刺激分子的信号转导结构域的重组多肽。

在本发明的具体实例中，上述共刺激结构域包括被SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:53的碱基序列编码的氨基酸序列。

在本发明的再一实施方式中，本发明提供包含编码上述的嵌合抗原受体的核酸分子的载体。

在本说明书中，术语“核酸(nucleic acids)”具有全面包括脱氧核糖核酸(基因组脱氧核糖核酸(gDNA)及互补脱氧核糖核酸(cDNA))及核糖核酸(RNA)分子的含义，核酸分子中的基本组成单位核甘酸不仅包括天然核甘酸，还包括修饰糖或碱基区域的类似物(analogue)(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman及Peyman,Chemical Reviews,90:543-584(1990))。

在本发明的一实例中，本发明的编码上述嵌合抗原受体多肽的核甘酸序列为编码组成上述嵌合抗原受体分子的氨基酸序列的核甘酸序列即可，并不限定于某一特定核甘酸序列，这对普通技术人员而言是显而易见的。

这是因为，即使发生核苷酸序列的变异，若变异的核甘酸序列以蛋白质形式表达，则在一些情况下，不会导致蛋白质序列的变化。将其称为密码子的简并性。因此，上述核甘酸序列包括：功能上等同的密码子；编码相同的氨基酸的密码子(例如，通过密码子的简并性，对于精氨酸或丝氨酸的密码子为六个)；或者包含编码生物学上等价的氨基酸的密码子的核甘酸序列。

当考虑具有如上所述的生物学等效活性的变异时，可解释为本发明的编码嵌合抗原受体多肽的核酸分子包括记载于序列表中的序列和示出实质同一性(substantialidentity)的序列。上述的实质同一性是指如下的序列，即，比对上述的本发明的序列与任意其他序列来使其最大限度地对应，在分析利用本领域通常利用的算法比对的序列的情况下，示出至少60％以上的同源性(例如，60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％或69％)，更优选地，示出至少70％以上的同源性(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％)，更加优选地，示出至少80％以上(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％)的同源性，最优选地，示出90％以上(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同源性的序列。上述70％以上且100％以下的所有整数及其之间的质数包括在关于％同源性的本发明的范围内。

用于比较序列的比对方法在本领域公知。关于比对的各种方法及算法记载于Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)；Needleman and Wunsch,J.Mol.Bio.48:443(1970)；Pearson and Lipman,Methods in Mol.Biol.24:307-31(1988)；Higgins and Sharp,Gene 73:237-44(1988)；Higgins and Sharp,CABIOS 5:151-3(1989)；Corpet et al.,Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988)；Huang et al.,Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992)and Pearson et al.,Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)。美国国家生物技术信息中心生物大分子序列比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool，BLAST)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10(1990))可在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biological Information，NBCI)等访问，可在互联网上与如blastp、blastn、blastx、tblastn及tblastx的序列分析程序联动来利用。生物大分子序列比对搜索工具可通过美国国家生物技术信息中心网站的生物大分子序列比对搜索工具页面访问。利用该程序的序列同源性比较方法可在美国国家生物技术信息中心网站的生物大分子序列比对搜索工具帮助(help)页面确认。

在本发明的一实例中，上述载体选自由脱氧核糖核酸、核糖核酸、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体组成的组中。

在本发明的一实例中，上述载体为慢病毒载体。在本发明的具体一实例中，上述载体还包含启动子。上述启动子可以为如EF-1启动子，但并不限定于此。

在本发明的另一实例中，上述载体可以为逆转录病毒载体。逆转录病毒提供用于基因传递系统的方便的平台。为了传递基因所选择的基因插入于逆转录病毒载体中并可包装在逆转录病毒颗粒中。接着，重组逆转录病毒可在体内或体外传递至所需的宿主细胞。本领域已知许多逆转录病毒载体，在本发明的具体实例中，上述逆转录病毒载体可以为pMT逆转录病毒载体，其为基于MLV的逆转录病毒载体，但并不限定于此。

将本发明的载体引入至细胞内并表达的方法在本领域周知。载体可通过本领域公知的方法容易引入至宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，载体可通过物理方法、化学方法或生物学方法传递至宿主细胞中。上述物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击(particle bombardment)、显微注射、电穿孔等。上述化学方法包括胶体分散液系统，例如包含大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠及水包油乳液、胶束(micelle)、混合胶束及脂质体的基于脂质的系统。并且，上述生物学方法包括上述的慢病毒、逆转录病毒等的脱氧核糖核酸或核糖核酸载体的使用。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含被上述的核酸分子编码的多肽的抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体分子。

本发明一实施方式的抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体分子通过向细胞内引入上述的核酸分子或包含其的载体并表达来获得。因此，在与上述的核酸分子及包含其的载体重复的范围内，将省略其记载。

根据本发明的还有一实施方式，本发明提供在细胞表面表达上述的抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体分子的效应细胞。

在本发明的一实例中，上述效应细胞选自由树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞及它们的前体细胞组成的组中，但并不限定于此。其中，上述T淋巴细胞选自由炎症性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞组成的组中。

在本发明中，上述效应细胞包括自体细胞或同种细胞群。即，上述效应细胞包括表达本抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体多肽的自体细胞或同种细胞群。

在本说明书中，术语“自体”表示预计再次引入至个体的源自相同个体的任意物质。在本说明书中，术语“同种”示出源自与引入物质的个体相同物种的不同动物的任意物质。

并且，根据本发明的一实例，上述效应细胞包括利用包含编码抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体多肽的核酸分子的载体转染或转导的细胞群。上述转染或转导可不受限地通过如上所述的本领域周知的各种方法进行。

因此，根据本发明的具体实例，本发明的效应细胞传递至如T淋巴细胞或自然杀伤细胞，抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体编码核酸分子利用信使核糖核酸(mRNA)转录，从上述信使核糖核酸翻译抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体多肽来在效应细胞的表面表达。

如在本发明的实施例中所证明，本发明的表达抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体的效应细胞有效杀死癌细胞株A549、PC-3、MCF-7、SKOV3及SK-HEP-1细胞。因此，本发明的表达抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体的效应细胞可有效地用作用于治疗各种癌症的组合物的有效成分。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含表达上述的抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体的效应细胞及药剂学上可接受的载体的用于免疫治疗的药物组合物。

在本说明书中，“免疫治疗(immunotherapy)”是帮助免疫系统摆脱癌症的癌症的治疗方法。免疫治疗分为主动免疫治疗和被动免疫治疗。主动免疫治疗包括：i)癌疫苗疗法(cancer vaccine therapy)，向人体注入癌细胞或通过癌细胞生成的物质来激活免疫系统；ii)免疫调节治疗，通过给药细胞因子(干扰素、白细胞介素等)、生长因子等免疫调节剂(immune-modulating agents)来激活特定白细胞。被动免疫治疗包括与特定癌细胞结合的治疗性抗体(therapeutic antibody)和免疫细胞治疗(immune cell therapy)。免疫细胞治疗具体包括树突状细胞疫苗治疗(dendritic cell vaccine therapy)和嵌合抗原受体-T细胞(chimeric antigen receptor T cell)治疗、自然杀伤细胞治疗(natural killercell therapy)、细胞毒性T淋巴细胞疗法(cytotoxic T lymphocyte therapy)、过继细胞疗法(adoptive cell transfer)等，但并不限定于此。在本发明中，免疫治疗主要指上述的免疫细胞治疗。

本发明的药物组合物包含与靶细胞的间质表皮转化因子抗原结合的抗体或抗原结合片段、或者表达包含其的嵌合抗原受体的效应细胞，因此，可有效诊断或治疗与间质表皮转化因子的表达相关的疾病。

因此，在本发明的一实例中，上述用于免疫治疗的药物组合物为用于治疗与间质表皮转化因子表达相关的疾病的药物组合物。

在本发明中，与上述间质表皮转化因子表达相关的疾病为选自由脑癌(恶性脑瘤)、神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、胸膜间皮瘤、肝癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、大肠癌等组成的组中的疾病，但并不限定于此。

在本发明的一实例中，上述神经胶质瘤为在存在于人体的神经系统的细胞之一的神经胶质细胞中发生的肿瘤。上述神经胶质细胞有作为中央神经胶质细胞的星形胶质细胞(astrocyte)、少突胶质细胞(少突神经胶质，oligodendroglia)及室管膜细胞(ependymalcell)；作为外围神经胶质细胞的雪旺细胞(Schwann’s cell)及被囊细胞(capsularcell)。神经胶质瘤根据构成神经胶质瘤的主要神经胶质细胞的种类包括：i)星形细胞肿瘤(Astrocytic Tumor)(包括胶质母细胞瘤(glioblastoma)；ii)少突神经胶质肿瘤(Oligodendroglial Tumor)；以及iii)室管膜瘤(室管膜细胞瘤，Ependymoma)。

本发明的药物组合物可将上述的嵌合抗原受体-表达效应细胞，例如，将多个嵌合抗原受体-表达效应细胞以与一个以上的药学上可接受的载体或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合包含。上述药物组合物可包含：缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。在本发明的一实例中，上述药物组合物为了静脉内给药而制剂化。

本发明的药物组合物可口服给药或肠胃外给药，例如，可通过静脉内给药、皮下给药、皮内给药、肌内给药、腹腔内给药、胸骨肿瘤内给药、脑内给药、颅内给药、肺内给药及直肠内给药等给药，但并不限定于此。

本发明的包含效应细胞的药物组合物通过皮肤内注射或皮下注射给药至患者。在一实例中，本发明的药物组合物通过静脉内注射给药。在另一实例中，本发明的药物组合物可直接给药至肿瘤、淋巴结或感染部位。

需要本发明的对象体可在移植外周血干细胞后，接受利用高容量化学疗法的标准治疗。在本发明的一实例中，对于需要本发明的对象体，可在移植上述外周血干细胞后或者移植上述外周血干细胞的同时给药本发明的扩增的嵌合抗原受体T细胞。在另一实例中，扩增的细胞可在手术前或手术后给药。

本发明的药物组合物的适合“免疫学有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤移植有效量”或“治疗量”的剂量根据如制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病症、饮食、给药时间、给药途径、代谢速度及反应敏感性的因素确定，普通医师可容易确定及处方杜宇期望的治疗或预防有效的剂量，可通过临床试验确定适当的剂量。在本说明书中，术语“治疗”是指疾病状态的减少、抑制、镇静或根除。在本说明书中，术语“抗肿瘤”包括肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数量的减少、期待寿命的增加、肿瘤细胞增殖的减少、肿瘤细胞存活的减少或与癌症状况相关的各种生理学症状的改善，但并不局限于此。

通常可理解的是，在本申请中记载的包含T细胞的药物组合物能够以10⁴至10⁹细胞/kg体重的剂量给药，在一些情况下，能够以10⁵至10⁶细胞/kg体重(包括上述范围内的所有整数值)的剂量给药。T细胞组合物也能够以上述剂量分多次给药。细胞可在免疫疗法中利用通常周知的注入技术来给药(例如，参照[Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319:1676,1988])。

除上述的有效成分之外，本发明的药物组合物还可与其他药剂学活性药剂及疗法组合来使用。上述“组合”可由同时或共同给药表达。在本申请中记载的嵌合抗原受体-表达效应细胞及至少一个追加的治疗剂可同时给药至相同的组合物中或不同的组合物中，或者可依次给药至相同的组合物中或不同的组合物中。为了依次给药，可先给药在本申请中记载的嵌合抗原受体-表达细胞，追加激动剂可第二次给药，或者可颠倒给药顺序。

可与上述本发明的药物组合物组合使用的治疗剂有本领域公知的一种以上的化学治疗剂、一种以上的靶向治疗剂、PD-1/PD-L1特异性免疫检查点抑制剂，但并不限定于此。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包括向需要治疗的对象体给药表达上述的嵌合抗原受体的效应细胞的步骤的免疫治疗方法。

本发明的作为免疫治疗方法的对象疾病的与间质表皮转化因子表达相关的疾病与药物组合物的治疗对象疾病的治疗对象疾病的定义相同。

在本发明的一实例中，上述对象体为哺乳动物或人类。

本发明的与间质表皮转化因子表达相关的疾病的治疗方法为通常使用表达上述的嵌合抗原受体的效应细胞作为有效成分的方法，因此，为了避免本说明书过于复杂，将省略重复内容的记载。

发明的效果

本发明的目的在于，提供抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体和利用其的药物组合物。在利用本发明的包括间质表皮转化因子结合结构域的嵌合抗原受体的情况下，可有效用作对于与各种间质表皮转化因子的表达相关的疾病的治疗剂。

附图说明

图1为示出本发明的间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001(c-Met-CAR-001)构建体的结构的图。

图2为示出本发明的pBHA-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001(pBHA-c-Met-CAR-001)质粒的结构的图。

图3为示出本发明的pMT-嵌合抗原受体-001(pMT-CAR-001)质粒的结构的图。

图4为示出本发明的pMT-嵌合抗原受体-002(pMT-CAR-002)质粒的结构的图。

图5为示出本发明的pMT-嵌合抗原受体-003(pMT-CAR-003)质粒的结构的图。

图6为示出本发明的间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002聚合酶链式反应(PCR)扩增过程的图。

图7为示出本发明的间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002(c-Met-CAR-002)构建体的结构的图。

图8为示出本发明的间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003(c-Met-CAR-003)聚合酶链式反应扩增过程的图。

图9为示出本发明的间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003构建体的结构的图。

图10为示出本发明的间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004聚合酶链式反应扩增过程的图。

图11为示出本发明的间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004(c-Met-CAR-004)构建体的结构的图。

图12a至图12d为示出本发明的pMT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001、pMT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002、pMT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003及pMT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004质粒的结构的图。

图13a至图13c为通过本发明的抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达T细胞中的CD3ζ的表达确认嵌合抗原受体表达的图。

图14为在本发明的抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达T细胞表面中确认嵌合抗原受体的表达的图。

图15a至图15f为确认作为癌细胞株的A549、PC-3、MCF-7、SKOV3、SK-HEP-1及Jurkat细胞中的间质表皮转化因子表达率的图。

图16a至图16d为示出对于A549癌细胞株的本发明的抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力的图。

图17a至图17d为示出对于PC-3癌细胞株的本发明的抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力的图。

图18a至图18d为示出对于MCF-7癌细胞株的本发明的抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力的图。

图19a至图19d为示出对于SKOV3癌细胞株的本发明的抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力的图。

图20为示出对于SK-HEP-1癌细胞株的本发明的抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力的图。

图21a至图21c为示出对于Jurkat细胞株的本发明的抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力的图。

具体实施方式

以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，根据本发明的主旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对本技术领域的普通技术人员而言是显而易见的。

实施例

在本说明书全文中，当未另行提及时，为了示出特定物质的浓度而使用的“％”如下：固体/固体为(重量/重量)％、固体/液体为(重量/体积)％、液体/液体为(体积/体积)％。

实施例目录

实施例1至实施4：准备抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体(anti-c-Met-Chimeric Antigen Receptor)基因

实施例5.制备pGemT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体载体

实施例6.制备pMT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体逆转录病毒载体

实施例7.制备抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体基因表达T细胞

实施例8.确认体外(In vitro)中的抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力

实施例1.准备间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001基因

实施例1-1.准备抗-间质表皮转化因子scFv(anti-c-Met scFv)抗体基因通过在先专利(申请号10-2018-0140196)获得了本发明的编码间质表皮转化因子特异性抗体的重链可变区和轻链可变区的多核苷酸的碱基序列(表1)。

表1：最终选择的特异性抗-间质表皮转化因子scFv克隆核苷酸序列(Nucleotidesequence of finally selected unique anti-c-Met sc Fv clones)

实施例1-2.准备间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001基因

确保碱基序列，以在本发明的抗-间质表皮转化因子scFv抗体可变重链(variableheavy chain；VH)的5’位点包含BamH I限制酶碱基序列及CD8α的前导序列，在抗-间质表皮转化因子scFv抗体可变轻链(variable light chain；VL)的3’位点包含hCD8α的铰链(Hinge)和TM、作为共刺激结构域的4-1BB及CD3ζ-iso2M(modified CD3ζ-iso2)及Xho I限制酶碱基序列。确保的碱基序列具有BamH I-hCD8αLS-scFv-hCD8αhinge-hCD8αTM-41BB-CD3ζ-iso2M-Xho I的碱基序列(表2)，基于此合成了SEQ ID NO:60的间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001(图1)结构。合成的pBHA-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001(图2)用于确保其他间质表皮转化因子-嵌合抗原受体结构。

表2：前导序列、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因序列

实施例2.准备间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002基因

实施例2-1.准备抗-间质表皮转化因子scFv抗体基因

将通过基因合成确保的pBHA-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001(图2)作为模板，利用引物SEQ ID NO:1(表3)和SEQ ID NO:2(表3)并通过聚合酶链式反应方法扩增并使用。此时，与抗-间质表皮转化因子scFv抗体可变重链的5’位点结合的引物具有人GM-CSF受体α链(Human GM-CSF receptor alpha-chain，hGM-CSF rec.α)的12个碱基序列，与抗-间质表皮转化因子scFv抗体可变轻链的3’位点结合的引物具有铰链的9个碱基序列和hCD28pECD的3个碱基序列，由此，扩增的聚合酶链式反应生成物具有hGM-CSF rec.α-scFv-hinge-hCD28 pECD的碱基序列(表4)。扩增的聚合酶链式反应生成物用于下一聚合酶链式反应扩增过程。

表3：引物的碱基序列信息

实施例2-2.准备人GM-CSF受体α链的信号序列基因

将包含hGM-CSF rec.α的信号序列的pMT-嵌合抗原受体-001质粒(图3)作为模板，利用引物SEQ ID NO:3(表3)和SEQ ID NO:4(表3)并通过聚合酶链式反应方法扩增并使用。此时，与hGM-CSF rec.α的5’位点结合的引物具有BamH I限制酶碱基序列，与hGM-CSF rec.α的3’位点结合的引物具有抗-间质表皮转化因子抗体的可变重链的12个碱基序列，扩增的聚合酶链式反应生成物具有BamHI-hGM-CSF rec.α-scFv的碱基序列(表4)。扩增的生成物用于下一聚合酶链式反应扩增过程。

表4：前导序列、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因序列

实施例2-3.准备铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因

将包含铰链、hCD28的pECD和TM、ICD及hCD3ζ-iso2的pMT-嵌合抗原受体-001质粒(图3)作为模板，利用引物SEQ ID NO:5(表3)和SEQ ID NO:6(表3)并通过聚合酶链式反应方法扩增并使用。此时，与铰链的5’位点结合的引物具有抗-间质表皮转化因子抗体的可变轻链的12个碱基序列，与CD3ζ-iso2的3’位点结合的引物具有Xho I限制酶碱基序列，由此，扩增的聚合酶链式反应生成物具有scFv-Hinge-hCD28 pECD-hCD28 TM-hCD28 ICD-CD3ζ-iso2-XhoI碱基序列(表4)。扩增的生成物用于下一聚合酶链式反应扩增过程。

实施例3.准备间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003基因

实施例3-1.准备抗-间质表皮转化因子scFv抗体基因

将通过基因合成确保的pBHA-cMet-嵌合抗原受体-001(图2)作为模板，利用引物SEQ ID NO:7(表3)和SEQ ID NO:8(表3)并通过聚合酶链式反应方法扩增并使用。此时，与抗-间质表皮转化因子scFv抗体可变重链的5’位点结合的引物具有3E8前导序列的12个碱基序列，与抗-间质表皮转化因子scFv抗体可变轻链的3’位点结合的引物具有与hIgD铰链的12个碱基序列，由此，扩增的聚合酶链式反应生成物具有3E8 LS-scFv-hIgD hinge的碱基序列(表5)。扩增的聚合酶链式反应生成物用于下一聚合酶链式反应扩增过程。

表5：前导序列、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因序列

实施例3-2.准备3E8抗体的前导序列基因

将包含3E8抗体的前导序列的pMT-嵌合抗原受体-002质粒(图4)作为模板，利用引物SEQ ID NO:9(表3)和SEQ ID NO:10(表3)并通过聚合酶链式反应方法扩增并使用。此时，与3E8前导序列的5’位点结合的引物具有BamH I限制酶碱基序列，与3E8前导序列的3’位点结合的引物具有抗-间质表皮转化因子scFv抗体可变重链的12个碱基序列，由此，扩增的聚合酶链式反应生成物具有BamH I-3E8 LS-scFv的碱基序列(表5)。扩增的生成物用于下一聚合酶链式反应扩增过程。

实施例3-3.准备铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因

将包含人IgD的铰链和IgG1的铰链、CH3、CD28的TM和ICD、作为共刺激结构域的OX40及CD3ζ-iso1的pMT-嵌合抗原受体-002质粒(图4)作为模板，利用引物SEQ ID NO:11(表3)和SEQ ID NO:12(表3)并通过聚合酶链式反应方法扩增并使用。此时，与hIgD铰链的5’位点结合的引物具有抗-间质表皮转化因子scFv抗体可变轻链的12个碱基序列，与CD3ζ-iso1的3’位点结合的引物具有Xho I限制酶碱基序列，由此，扩增的聚合酶链式反应生成物具有scFv-IgD hinge-IgG1hinge-CH3-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列(表5)。扩增的聚合酶链式反应生成物用于下一聚合酶链式反应扩增过程。

实施例4.准备间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004基因

实施例4-1.准备抗-间质表皮转化因子scFv抗体基因

将通过基因合成确保的pBHA-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001(图2)作为模板，利用引物SEQ ID NO:7(表3)和SEQ ID NO:8(表3)并通过聚合酶链式反应方法扩增并使用。此时，与抗-间质表皮转化因子scFv抗体可变重链的5’位点结合的引物具有3E8前导序列的12个碱基序列，与抗-间质表皮转化因子scFv抗体可变轻链的3’位点结合的引物具有hIgD铰链的12个碱基序列，由此，扩增的聚合酶链式反应生成物具有3E8 LS-scFv-hinge-hIgD hinge的碱基序列(表6)。扩增的聚合酶链式反应生成物用于下一聚合酶链式反应扩增过程。

表6：前导序列、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因序列

实施例4-2.准备3E8抗体的前导序列基因

将包含3E8抗体的前导序列的pMT-嵌合抗原受体-003质粒(图5)作为模板，利用引物SEQ ID NO:9(表3)和SEQ ID NO:10(表3)并通过聚合酶链式反应方法扩增并使用。此时，与3E8前导序列的5’位点结合的引物具有BamH I限制酶碱基序列，与3E8前导序列的3’位点结合的引物具有抗-间质表皮转化因子scFv抗体可变重链的12个碱基序列，由此，扩增的聚合酶链式反应生成物具有BamH I-3E8 LS-scFv的碱基序列(表6)。扩增的生成物用于下一聚合酶链式反应扩增过程。

实施例4-3.准备铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因

将包含人IgD的铰链和CD28的TM和ICD、作为共刺激结构域的OX40及CD3ζ-iso1的pMT-嵌合抗原受体-003质粒(图5)作为模板，利用引物SEQ ID NO:11(表3)和SEQ ID NO:12(表3)并通过聚合酶链式反应方法扩增并使用。此时，与hIgD铰链的5’位点结合的引物具有抗-间质表皮转化因子scFv抗体可变轻链的12个碱基序列，与CD3ζ-iso1的3’位点结合的引物具有Xho I限制酶碱基序列，由此，扩增的聚合酶链式反应生成物具有scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列(表6)。扩增的聚合酶链式反应生成物用于下一聚合酶链式反应扩增过程。

实施例5.制备pGemT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体载体

实施例5-1.制备pGemT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002载体

将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的BamH I-hGM-CSF rec.α-scFv和hGM-CSFrec.α-scFv-hinge-hCD28 pECD作为模板，利用引物SEQ ID NO:3(表3)和SEQ ID NO:2(表3)并通过重叠延伸-聚合酶链式反应(overlap extension PCR，OE-PCR)方法进行扩增。将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的BamH I-hGM-CSF rec.α-scFv-hinge-hCD28 pECD和scFv-Hinge-hCD28 pECD-hCD28 TM-hCD28ICD-CD3ζ-iso2-Xho I作为模板，利用引物SEQID NO:3(表3)和SEQ ID NO:6(表3)并通过重叠延伸-聚合酶链式反应方法进行扩增(图6)。扩增的聚合酶链式反应生成物具有BamH I-hGM-CSF rec.α-scFv-Hinge-hCD28 pECD-hCD28 TM-hCD28ICD-CD3ζ-iso2-Xho I碱基序列，具有SEQ ID NO:61的间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002的结构(图7)。扩增的聚合酶链式反应生成物与在直链脱氧核糖核酸的两端具有多个T序列的pGemT EASY载体(Promega，WI，USA)连接来获得了构建体pGemT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002，通过序列分析确认了与原始序列相同。为了分析序列，使用了引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14(表3)。

实施例5-2.制备pGemT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003载体

将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的BamH I-3E8 LS-scFv和3E8LS-scFv-hIgD铰链作为模板，利用引物SEQ ID NO:9(表3)和SEQ ID NO:8(表3)并通过重叠延伸-聚合酶链式反应方法进行扩增。将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的BamH I-3E8 LS-scFv-hIgD铰链和scFv-IgD hinge-IgG1 hinge-CH3-CD28TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I作为模板，利用引物SEQ ID NO:9(表3)和SEQ ID NO:12(表3)并通过重叠延伸-聚合酶链式反应方法进行扩增(图8)。扩增的聚合酶链式反应生成物具有BamH I-3E8 LS-scFv-hIgDhinge-IgG1hinge-CH3-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列，具有SEQ IDNO:62的间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003的结构(图9)。扩增的聚合酶链式反应生成物与在直链脱氧核糖核酸的两端具有多个T序列的pGemT EASY载体连接来获得构建体pGemT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003，通过序列分析确认了与原始序列相同。为了序列分析，使用引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14(表3)。

实施例5-3.制备pGemT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004载体

将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的BamH I-3E8 LS-scFv和3E8LS-scFv-hIgD铰链作为模板，利用引物SEQ ID NO:9(表3)和SEQ ID NO:8(表3)并通过重叠延伸-聚合酶链式反应方法进行扩增。将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的BamH I-3E8 LS-scFv-hIgD铰链和scFv-IgD hinge-CD28 TM-CD28ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I作为模板，利用引物SEQ ID NO:9(表3)和SEQ ID NO:12(表3)并通过重叠延伸-聚合酶链式反应方法进行扩增(图10)。扩增的聚合酶链式反应生成物具有BamH I-3E8 LS-scFv-IgD hinge-CD28 TM-CD28ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列，具有SEQ ID NO:63的间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004的结构(图11)。扩增的聚合酶链式反应生成物与直链脱氧核糖核酸的两端具有多个T序列的pGemT EASY载体连接来获得构建体pGemT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004，通过序列分析确认与原始序列相同。为了序列分析，使用引物SEQ ID NO:13和SEQID NO:14(表3)。

实施例6.制备pMT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体逆转录病毒载体

在一种pBHA-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001和三种pGemT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体载体(pGemT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002、pGemT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003、pGemT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004)处理BamH I和Xho I限制酶来获得了脱氧核糖核酸片段。将获得的脱氧核糖核酸片段与预先利用BamHI和Xho I限制酶处理的pMT逆转录病毒载体(美国授权专利第US6451595号)连接来制备了四种pMT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体逆转录病毒载体(pMT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001、pMT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002、pMT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003、pMT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004)(图12a至图12d)。通过上述方法制备的pMT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体逆转录病毒载体在MLV LTR启动子的调节下包含编码间质表皮转化因子-嵌合抗原受体的序列。

实施例7.制备抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体基因表达T细胞

实施例7-1.制备抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体基因表达逆转录病毒

利用质粒脱氧核糖核酸转化法制备用于传递抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体基因的逆转录病毒(Soneoka Y et al.,1995)。利用了TransIT 293转化系统(Mirus BioLLC，WI，USA)，根据制造商的协议执行。前一天，在60mm的培养皿以1×10⁶个接种的293T细胞株，转化4种pMT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体逆转录病毒载体、gag-pol表达载体及RD114 env表达载体后，将细胞培养约48小时。培养完成后，收获所有细胞培养液，利用0.45μm的过滤器过滤后，直到使用之前在-80℃的温度下冷冻保存。所生产的四种抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体逆转录病毒利用逆转录病毒效价集试剂盒(retrovirus titerset kit)(TaKaRa，JAPAN)并通过实时聚合酶链式反应(real-time PCR)测定效价后使用。

实施例7-2.制备抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体基因表达T细胞

针对捐赠的人血，利用SepMate^TM-50(STEMCELL)和Ficoll-Paque PLUS(GEhealthcare，Sweden)获得了单核细胞。针对单核细胞，将包含5％的人血清的AIMV培养基(Invitrogen)用作培养液，并在100mm的培养皿以1×10⁷个接种后，每1mL添加50ng的抗-CD3(OKT3，eBioscience)抗体，从而激活T细胞。为了T细胞的生长，每1mL的培养液添加300U的人IL-2(R&D)来培养。培养48小时后，收获激活的T细胞并用于传递四种抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体逆转录病毒。

在6孔板，每孔添加2mL的以10μg/mL的浓度准备的纤维连接蛋白(retronectin，TaKaRa，Japan)后，在常温条件下反应2小时并涂敷在培养板。反应后去除纤维连接蛋白，每孔添加2mL的包含2.5％的人白蛋白的磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)，在常温条件下反应30分钟并封闭(blocking)。反应后，去除用于封闭的溶液，每孔添加3mL的包含2.5％的1M羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)的汉可氏平衡盐溶液(HBSS)来进行洗涤。利用包含5％的人血清的AIMV培养基以每孔3×10¹⁰拷贝稀释抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体逆转录病毒，并添加4mL后，在2000xg、32℃的条件下，离心分离2小时，并将逆转录病毒固定于纤维连接蛋白。在将要用作对照组的孔中，添加相同量的用于逆转录病毒稀释的培养基。反应后，去除逆转录病毒，以每孔2×10⁶个添加将激活的T细胞后，在1000xg的条件下，离心分离15分钟，从而向T细胞传递抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体逆转录病毒。为了提高传递效率，下一天，再重复一次传递过程，从而共进行两次。传递24小时后，收获所有T细胞，利用包含5％的人血清和300U/mL的人IL-2的AIMV培养基，以每1L 5×10⁵个在T烧瓶传代培养。每隔3天～4天，以每mL 5×10⁵个传代培养，保持不超出每mL 2×10⁶个。

之后，确认传递抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体逆转录病毒的激活T细胞(抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达T)中是否表达抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体。收获2×10⁶个细胞并提取蛋白质，通过Bradford分析法定量提取的蛋白质后，混合4x样品缓冲液(4x sample buffer)(Invitrogen)和二硫苏糖醇(Dithiothreitol)，并在95℃的温度下煮沸5分钟以进行还原处理。通过蛋白质印迹法确认了抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达。用于确认表达的一抗利用小鼠抗-人CD247(BD，CA，USA)附着在CD3ζ，二抗使用山羊抗-小鼠IgG(H+L)-HRP(Thermo，USA)。在四种抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达T细胞中的蛋白质印迹结果，在50KDa～80KDa位置中分别确认条带，从而确认了很好地表达抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体(图13a至图13c)。

确认在抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达T细胞中是否在细胞表面表达抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体。收获5×10⁵个细胞，利用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，添加2.5μg的与嵌合抗原受体的单链可变片段(Single-chain variable Fragment)特异性结合的FITC融合蛋白L(Protein L)(AcroBiosystem，RPL-PF141)，并在4℃的温度下反应30分钟。反应后，利用磷酸盐缓冲液洗涤两次细胞后，利用流式细胞分析法确认抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达。结果，确认了在传递MT-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004逆转录病毒的T细胞的表面表达约57.7％的抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体(图14)。

实施例8.确认体外中的抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力

实施例8-1.确认靶细胞中的间质表皮转化因子表达率

作为人肺癌细胞株的A549以高表达间质表皮转化因子而周知，因此，是适合确认抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力的细胞株。为确认其，在100uL的磷酸盐缓冲液以5×10⁵个准备A549细胞株后，添加1μg的1E4-H4k2抗体后，在4℃的温度下反应30分钟。反应后，利用磷酸盐缓冲液洗涤两次细胞后，添加2uL的山羊抗人IgG-PE(Southern Biotech)，并在4℃的温度下反应30分钟。反应后，利用磷酸盐缓冲液洗涤两次细胞后，利用流式细胞分析法确认间质表皮转化因子表达。结果，在A549癌细胞中确认约83.9％的间质表皮转化因子表达率。利用相同的方法在人前列腺癌细胞株PC-3、人乳腺癌细胞株MCF-7、卵巢癌细胞株SKOV3、人急性T细胞白血病细胞株Jurkat、人肝癌细胞株SK-HEP-1中确认间质表皮转化因子的表达的结果，在PC-3中确认约48.5％的表达率，在MCF-7中确认约66.0％的表达率，在SKOV3中确认约58.0％的表达率，在SK-HEP-1中确认约99.9％的表达率，在Jurkat中确认约2.37％的表达率。

实施例8-2.利用CellTox^TM Green dye确认抗癌活性能力

为了确认对于靶细胞(target细胞，T)的抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达T细胞(effector细胞，E)的抗癌活性能力，使用了CellTox^TM Green dye。CellTox^TMGreen dye为附着于从死细胞释放的脱氧核糖核酸来发出荧光的染料，用于确认抗癌活性能力(cytotoxicity)。在50uL的培养基以1×10⁴个准备靶细胞，添加0.2uL的CellTox^TMGreen dye，并添加于黑色96孔板。在50uL的包含人血清和人IL-2的AIMV培养基以5×10³个、1×10⁴个、5×10⁴个(E∶T比例＝0.5、1、5)准备抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达T细胞，添加至包含靶细胞的孔中，在37℃、CO₂的培养箱中反应24小时。准备向包含CellTox^TM Green dye和靶细胞的培养基的孔中准备仅添加抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达T细胞的组，在反应时间内，排除附着于从死亡的抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达T细胞中释放的脱氧核糖核酸来产生的染料的反应值。并且，准备仅包含靶细胞的孔来校正低对照(low control)(自发脱氧核糖核酸释放(spontaneous DNA release))值，向仅包含靶细胞的孔添加裂解溶液(lysis solution)来校正高对照(high control)(最大脱氧核糖核酸释放(maximum DNA release))值。通过下述式计算对于靶细胞的杀伤能力。

式

细胞毒性(Cytotoxicity)(％)＝{(靶细胞与效应细胞的反应值)-(效应细胞的反应值)}-(低对照)/(高对照-低对照)×100

结果，确认了对于四种间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004表达T细胞的A549癌细胞的抗癌活性能力高于作为不表达抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体的T细胞的对照组(图16)。

利用相同的实验方法确认了对于PC-3癌细胞的杀伤能力。确认对于间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004表达T细胞的PC-3癌细胞的抗癌活性能力高于作为不表达抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体的T细胞的对照组(图17)。尤其，与间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001相比，其他结构的嵌合抗原受体示出更优秀的效果。

利用相同的实验方法确认了对于MCF-7癌细胞的杀伤能力。确认了对于间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004表达T细胞的MCF-7癌细胞的抗癌活性能力高于作为不表达抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体的T细胞的对照组(图18)。

利用相同的实验方法确认了对于SKOV3癌细胞的杀伤能力。确认了对于间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004表达T细胞的SKOV3癌细胞的抗癌活性能力高于作为不表达抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体的T细胞的对照组(图19)。

利用相同的实验方法确认了对于SK-HEP-1的杀伤能力。确认了对于间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004表达T细胞的SK-HEP-1癌细胞的抗癌活性能力高于作为不表达抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体的T细胞的对照组(图20)。

利用相同的实验方法确认了对于Jurkat的杀伤能力。利用低表达间质表皮转化因子的Jurkat确认间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-001、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-002、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-003、间质表皮转化因子-嵌合抗原受体-004表达T细胞的杀伤能力的结果，几乎未观察到对于Jurkat的杀伤能力。由此，确认了抗-间质表皮转化因子-嵌合抗原受体表达T细胞仅对于高表达间质表皮转化因子的细胞具有特异性杀伤能力(图21)。

以上，仅详细记述了本发明的特定部分，对于本技术领域的普通技术人员而言，这种具体记述仅为优选实例，明确的是，本发明的范围并不局限于此。

序列表

<110> Helixmith Co., Ltd

<120> 包含抗-间质表皮转化因子抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体及其用途

<130> PP200039

<150> KR 10-2019-0119148

<151> 2019-09-26

<160> 66

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物: GMCSF rec.a LS+1E4-H4k2 scFv (F)

<400> 1

ctcctgatcc cacaggtgca gctggtg 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物: 1E4-H4k2 scFv +hCD28 pECD+铰链(R)

<400> 2

aattgcggcc gcacgtttga tttccac 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物: AS+BamHI+GMCSF rec.a LS(F)

<400> 3

cgggatccat gcttctcctg gtgacaa 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物: GMCSF rec.a LS+1E4-H4k2 scFv(R)

<400> 4

cagctgcacc tgtgggatca ggaggaa 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物: 1E4-H4k2 scFv+铰链+CD28 pECD(F)

<400> 5

gaaatcaaac gtgcggccgc aattgaa 27

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物: AS+Xho1+CD3-ζ (R)

<400> 6

ccgctcgagt tattagcgag ggggcagg 28

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物: 3E8 LS+1E4-H4k2 scFv(F)

<400> 7

ggtgtccact cccaggtgca gctggtg 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物: 1E4-H4k2 scFv+hIgD 铰链(R)

<400> 8

acctggccag cgacgtttga tttccac 27

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物: BamHI+3E8 VH(F)

<400> 9

ggatccatgg aatggagctg ggtc 24

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物: 1E4-H4k2 scFv+3E8 LS(R)

<400> 10

cagctgcacc tgggagtgga cacctgt 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物: 1E4-H4k2 scFv+hIgD 铰链(F)

<400> 11

gaaatcaaac gtcgctggcc aggttct 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物: XhoI+CD3ζ(R)

<400> 12

ccgctcgagt tagcgagggg gcagggc 27

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物: T7(F)

<400> 13

tatacgactc actataggg 19

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物: SP6(R)

<400> 14

atttaggtga cactatag 18

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRH1 (AA)

<400> 15

Thr His Trp Ile Thr

1 5

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRH2 (AA)

<400> 16

Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn Phe Tyr Gly Pro Ser Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRH3 (AA)

<400> 17

Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr Phe Asp

1 5 10 15

Met

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRL1 (AA)

<400> 18

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Thr Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRL2 (AA)

<400> 19

Ser Ala Ser Thr Leu Glu Ser

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDRL3 (AA)

<400> 20

Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 21

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1E4-H4k2 重链可变区 (AA)

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Thr His

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn Phe Tyr Gly Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Ser Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr

100 105 110

Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 22

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1E4-H4k2 轻链可变区 (AA)

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Thr Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 23

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1E4-H4k2 scFv (AA)

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Thr His

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn Phe Tyr Gly Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Ser Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr

100 105 110

Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Thr Tyr Leu Ala Trp

165 170 175

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala

180 185 190

Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

210 215 220

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

245

<210> 24

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1E4-H4k2 scFv (NA)

<400> 24

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ccggctcctc cgtgaaggtc 60

tcctgccagg gctccggcta ctccttcccc acccactgga tcacctgggt gcgacaggcc 120

cccggccaag gcctggaatg gatgggcacc atcgacccca ccgactccta caacttctac 180

ggccccagct tccagggcag agtgaccatc accgccgact cctccacgtc caccgcctac 240

atggagctgt cctccctgag atctgaggac accgccatgt actactgcgc cagggacggc 300

aactactacg actcccgggg ctactactac gataccttcg acatgtgggg ccagggcacc 360

ctggtcaccg tctcctcagg cggtggagga tctggaggag gcggctctgg ggggggcggc 420

tctgacatcc agatgaccca gtcccccagc tccctgtccg cctccgtggg cgacagagtg 480

accatcacct gtcgggcctc ccagggcatc tccacctacc tggcctggta tcagcagaag 540

cccggcaaag cccccaagct gctgatctac tccgcctcca ccctggaatc cggcgtgccc 600

tccagattct ccggctccgg ctctggcacc gacttcaccc tgaccatctc cagcctgcag 660

cccgaggact ttgccaccta ctactgccag caggccgact ccttccccct gaccttcggc 720

ggaggcacca aggtggaaat caaacgt 747

<210> 25

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hGM-CSF rec.a LS (AA)

<400> 25

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 26

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hGM-CSF rec.a LS (NA)

<400> 26

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atccca 66

<210> 27

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD8a LS (AA)

<400> 27

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 28

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD8a LS (NA)

<400> 28

atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60

ccc 63

<210> 29

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3E8 LS (AA)

<400> 29

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 30

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3E8 LS (NA)

<400> 30

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcc 57

<210> 31

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链 (AA)

<400> 31

Ala Ala Ala

1

<210> 32

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链 (NA)

<400> 32

gcggccgca 9

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hIgG1 铰链 (AA)

<400> 33

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 34

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hIgG1 铰链 (NA)

<400> 34

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gccca 45

<210> 35

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hIgD 铰链 (AA)

<400> 35

Arg Trp Pro Gly Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala

1 5 10 15

Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala

20 25 30

Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys

35 40 45

Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Gly Cys Pro

50 55 60

<210> 36

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hIgD 铰链 (NA)

<400> 36

cgctggccag gttctccaaa ggcacaggcc tcctccgtgc ccactgcaca accccaagca 60

gagggcagcc tcgccaaggc aaccacagcc ccagccacca cccgtaacac aggtagagga 120

ggagaagaga agaagaagga gaaggagaaa gaggaacaag aagagagaga gacaaagaca 180

ccaggttgtc cg 192

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hIgG1 CH3 (AA)

<400> 37

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 38

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hIgG1 CH3 (NA)

<400> 38

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 60

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 300

ctctccctgt ctccgggtaa a 321

<210> 39

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD8a 铰链 (AA)

<400> 39

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 40

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD8a 铰链 (NA)

<400> 40

accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60

tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120

gacttcgcct gcgat 135

<210> 41

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD8a TM (AA)

<400> 41

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 42

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD8a TM (NA)

<400> 42

atctacattt gggcccctct ggctggtact tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc 60

actctttact gt 72

<210> 43

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD28 pECD (AA)

<400> 43

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35

<210> 44

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD28 pECD (NA)

<400> 44

attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60

catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117

<210> 45

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD28 TM (AA)

<400> 45

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 46

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD28 TM (NA)

<400> 46

ttttgggtgc tggtggtggt tgggggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 47

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD28 TM (NA)

<400> 47

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 48

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h4-1BB (AA)

<400> 48

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 49

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h4-1BB (NA)

<400> 49

aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60

actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120

gaactg 126

<210> 50

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD28 ICD (AA)

<400> 50

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 51

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD28 ICD (NA)

<400> 51

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 52

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hOX-40 (AA)

<400> 52

Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His

1 5 10 15

Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln

20 25 30

Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

35 40

<210> 53

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hOX-40 (NA)

<400> 53

gccctgtacc tgctccggag ggaccagagg ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg 60

ggaggcagtt tccggacccc catccaagag gagcaggccg acgcccactc caccctggcc 120

aagatc 126

<210> 54

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD3z iso2M (AA)

<400> 54

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 55

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD3z iso2M (NA)

<400> 55

cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60

tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120

cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180

gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240

agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300

tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336

<210> 56

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD3z iso2 (AA)

<400> 56

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 57

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD3z iso2 (NA)

<400> 57

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 58

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD3z iso1 (AA)

<400> 58

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 59

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCD3z iso1 (NA)

<400> 59

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339

<210> 60

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> c-Met-CAR-001 (NA)

<400> 60

atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60

ccccaggtgc agctggtgca gtctggcgcc gaagtgaaga agcccggctc ctccgtgaag 120

gtctcctgcc agggctccgg ctactccttc cccacccact ggatcacctg ggtgcgacag 180

gcccccggcc aaggcctgga atggatgggc accatcgacc ccaccgactc ctacaacttc 240

tacggcccca gcttccaggg cagagtgacc atcaccgccg actcctccac gtccaccgcc 300

tacatggagc tgtcctccct gagatctgag gacaccgcca tgtactactg cgccagggac 360

ggcaactact acgactcccg gggctactac tacgatacct tcgacatgtg gggccagggc 420

accctggtca ccgtctcctc aggcggtgga ggatctggag gaggcggctc tggggggggc 480

ggctctgaca tccagatgac ccagtccccc agctccctgt ccgcctccgt gggcgacaga 540

gtgaccatca cctgtcgggc ctcccagggc atctccacct acctggcctg gtatcagcag 600

aagcccggca aagcccccaa gctgctgatc tactccgcct ccaccctgga atccggcgtg 660

ccctccagat tctccggctc cggctctggc accgacttca ccctgaccat ctccagcctg 720

cagcccgagg actttgccac ctactactgc cagcaggccg actccttccc cctgaccttc 780

ggcggaggca ccaaggtgga aatcaaacgt accactaccc cagcaccgag gccacccacc 840

ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca 900

gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc 960

cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag 1020

cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact 1080

actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa 1140

ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag 1200

ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga 1260

ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac 1320

aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa 1380

cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg taccagggac tcagcaccgc caccaaggac 1440

acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg ccgcctcgg 1479

<210> 61

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> c-Met-CAR-002 (NA)

<400> 61

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccacagg tgcagctggt gcagtctggc gccgaagtga agaagcccgg ctcctccgtg 120

aaggtctcct gccagggctc cggctactcc ttccccaccc actggatcac ctgggtgcga 180

caggcccccg gccaaggcct ggaatggatg ggcaccatcg accccaccga ctcctacaac 240

ttctacggcc ccagcttcca gggcagagtg accatcaccg ccgactcctc cacgtccacc 300

gcctacatgg agctgtcctc cctgagatct gaggacaccg ccatgtacta ctgcgccagg 360

gacggcaact actacgactc ccggggctac tactacgata ccttcgacat gtggggccag 420

ggcaccctgg tcaccgtctc ctcaggcggt ggaggatctg gaggaggcgg ctctgggggg 480

ggcggctctg acatccagat gacccagtcc cccagctccc tgtccgcctc cgtgggcgac 540

agagtgacca tcacctgtcg ggcctcccag ggcatctcca cctacctggc ctggtatcag 600

cagaagcccg gcaaagcccc caagctgctg atctactccg cctccaccct ggaatccggc 660

gtgccctcca gattctccgg ctccggctct ggcaccgact tcaccctgac catctccagc 720

ctgcagcccg aggactttgc cacctactac tgccagcagg ccgactcctt ccccctgacc 780

ttcggcggag gcaccaaggt ggaaatcaaa cgtgcggccg caattgaagt tatgtatcct 840

cctccttacc tagacaatga gaagagcaat ggaaccatta tccatgtgaa agggaaacac 900

ctttgtccaa gtcccctatt tcccggacct tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt 960

gggggagtcc tggcttgcta tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg 1020

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 1080

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 1140

tccagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1200

ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1260

ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1320

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1380

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1440

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1479

<210> 62

<211> 2031

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> c-Met-CAR-003 (NA)

<400> 62

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcccag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaagcccg gctcctccgt gaaggtctcc 120

tgccagggct ccggctactc cttccccacc cactggatca cctgggtgcg acaggccccc 180

ggccaaggcc tggaatggat gggcaccatc gaccccaccg actcctacaa cttctacggc 240

cccagcttcc agggcagagt gaccatcacc gccgactcct ccacgtccac cgcctacatg 300

gagctgtcct ccctgagatc tgaggacacc gccatgtact actgcgccag ggacggcaac 360

tactacgact cccggggcta ctactacgat accttcgaca tgtggggcca gggcaccctg 420

gtcaccgtct cctcaggcgg tggaggatct ggaggaggcg gctctggggg gggcggctct 480

gacatccaga tgacccagtc ccccagctcc ctgtccgcct ccgtgggcga cagagtgacc 540

atcacctgtc gggcctccca gggcatctcc acctacctgg cctggtatca gcagaagccc 600

ggcaaagccc ccaagctgct gatctactcc gcctccaccc tggaatccgg cgtgccctcc 660

agattctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 720

gaggactttg ccacctacta ctgccagcag gccgactcct tccccctgac cttcggcgga 780

ggcaccaagg tggaaatcaa acgtcgctgg ccaggttctc caaaggcaca ggcctcctcc 840

gtgcccactg cacaacccca agcagagggc agcctcgcca aggcaaccac agccccagcc 900

accacccgta acacaggtag aggaggagaa gagaagaaga aggagaagga gaaagaggaa 960

caagaagaga gagagacaaa gacaccaggt tgtccggagc ccaaatcttg tgacaaaact 1020

cacacatgcc caccgtgccc agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1080

tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1140

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1200

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1260

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1320

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aattttgggt gctggtggtg 1380

gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg 1440

gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc 1500

cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat 1560

cgctccgccc tgtacctgct ccggagggac cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc 1620

cctgggggag gcagtttccg gacccccatc caagaggagc aggccgacgc ccactccacc 1680

ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1740

cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1800

aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccgc agagaaggaa gaaccctcag 1860

gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1920

atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1980

gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg c 2031

<210> 63

<211> 1665

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> c-Met-CAR-004 (NA)

<400> 63

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcccag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaagcccg gctcctccgt gaaggtctcc 120

tgccagggct ccggctactc cttccccacc cactggatca cctgggtgcg acaggccccc 180

ggccaaggcc tggaatggat gggcaccatc gaccccaccg actcctacaa cttctacggc 240

cccagcttcc agggcagagt gaccatcacc gccgactcct ccacgtccac cgcctacatg 300

gagctgtcct ccctgagatc tgaggacacc gccatgtact actgcgccag ggacggcaac 360

tactacgact cccggggcta ctactacgat accttcgaca tgtggggcca gggcaccctg 420

gtcaccgtct cctcaggcgg tggaggatct ggaggaggcg gctctggggg gggcggctct 480

gacatccaga tgacccagtc ccccagctcc ctgtccgcct ccgtgggcga cagagtgacc 540

atcacctgtc gggcctccca gggcatctcc acctacctgg cctggtatca gcagaagccc 600

ggcaaagccc ccaagctgct gatctactcc gcctccaccc tggaatccgg cgtgccctcc 660

agattctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagccc 720

gaggactttg ccacctacta ctgccagcag gccgactcct tccccctgac cttcggcgga 780

ggcaccaagg tggaaatcaa acgtcgctgg ccaggttctc caaaggcaca ggcctcctcc 840

gtgcccactg cacaacccca agcagagggc agcctcgcca aggcaaccac agccccagcc 900

accacccgta acacaggtag aggaggagaa gagaagaaga aggagaagga gaaagaggaa 960

caagaagaga gagagacaaa gacaccaggt tgtccgtttt gggtgctggt ggtggttggt 1020

ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 1080

agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1140

cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1200

gccctgtacc tgctccggag ggaccagagg ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg 1260

ggaggcagtt tccggacccc catccaagag gagcaggccg acgcccactc caccctggcc 1320

aagatcagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1380

cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1440

cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1500

ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1560

ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1620

aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 1665

<210> 64

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1E4-H5k2 重链可变区 (AA)

<400> 64

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Thr His

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn Phe Tyr Gly Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Ser Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr

100 105 110

Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 65

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1E4-H6k2 重链可变区 (AA)

<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Thr His

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Asn Phe Tyr Gly Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr

100 105 110

Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 66

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1E4-H6k0 轻链可变区 (AA)

<400> 66

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Thr Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims (23)

1.核酸分子，其编码抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体，所述抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体包括间质表皮转化因子结合结构域、跨膜结构域及胞内信号转导结构域。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述间质表皮转化因子结合结构域为与抗-间质表皮转化因子特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述抗体或其抗原结合片段包括：

分别包含SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链互补决定区1、重链互补决定区2及重链互补决定区3；以及

分别包含SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链互补决定区1、轻链互补决定区2及轻链互补决定区3。

4.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述抗体或其抗原结合片段包括由SEQ IDNO:21的氨基酸序列组成的重链可变区以及由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的轻链可变区。

5.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述嵌合抗原受体还包含前导序列。

6.根据权利要求5所述的核酸分子，其中所述前导序列为CD8α的前导序列、hGM-CSF受体α链的前导序列或3E8抗体的前导序列。

7.根据权利要求5所述的核酸分子，其中所述前导序列为包含被SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28或SEQ ID NO:30的碱基序列编码的氨基酸序列的前导序列。

8.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述间质表皮转化因子结合结构域与跨膜结构域通过铰链区、间隔区或它们的组合连接。

9.根据权利要求8所述的核酸分子，其中所述铰链区或间隔区为IgG1的铰链、IgG4的铰链、IgD的铰链、CD8α的铰链、IgG1 CH3、CD28的胞外结构域或它们的组合。

10.根据权利要求8所述的核酸分子，其中所述铰链区或间隔区为包含被SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:44的碱基序列编码的氨基酸序列的前导序列。

11.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述嵌合抗原受体包含选自由T-细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154的α链、β链或ζ链组成的组中的蛋白质的跨膜结构域。

12.根据权利要求11所述的核酸分子，其中所述跨膜结构域包含被SEQ ID NO:42、SEQID NO:46或SEQ ID NO:47的碱基序列编码的氨基酸序列。

13.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述胞内信号转导结构域包括CD3ζ的信号转导结构域。

14.根据权利要求13所述的核酸分子，其中所述CD3ζ的信号转导结构域包括被SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:59的碱基序列编码的氨基酸序列。

15.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述胞内信号转导结构域还包括选自由OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1、ICOS及4-1BB组成的组中的蛋白质的信号转导结构域作为共刺激结构域，所述LFA-1为CD11a/CD18，所述ICOS为CD278，所述4-1BB为CD137。

16.根据权利要求15所述的核酸分子，其中所述共刺激结构域为包含被SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:53的碱基序列编码的氨基酸序列的共刺激结构域。

17.载体，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的核酸分子。

18.抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体分子，其包含被根据权利要求1至16中任一项所述的核酸分子编码的多肽。

19.效应细胞，其在细胞表面表达根据权利要求18所述的抗-间质表皮转化因子嵌合抗原受体分子。

20.根据权利要求19所述的效应细胞，其中所述效应细胞选自由树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞及它们的前体细胞组成的组中。

21.用于间质表皮转化因子免疫治疗的药物组合物，其包含根据权利要求19所述的效应细胞及药剂学上可接受的载体。

22.用于治疗与间质表皮转化因子表达相关的疾病的药物组合物，其包含根据权利要求19所述的效应细胞及药剂学上可接受的载体。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述与间质表皮转化因子表达相关的疾病为选自由脑癌、神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、胸膜间皮瘤、肝癌、胃癌、肺癌、卵巢癌及大肠癌组成的组中的疾病。

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