CN108707198A

CN108707198A - 识别人c-Met蛋白的人源单链抗体、诊断试剂及其CAR-T细胞制剂

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Publication number: CN108707198A
Application number: CN201810687119.9A
Authority: CN
Inventors: 李永海; 储年生; 李正红
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2018-10-26

Abstract

本发明涉及单链抗体的核苷酸序列和氨基酸序列，其可特异识别人c‑Met蛋白。基于该单链抗体，可获得特异性地识别c‑Met阳性的肿瘤细胞的融合蛋白。体外实验证明此融合蛋白可介导补体依赖的细胞毒作用和抗体依赖的细胞毒作用；当注入到荷瘤小鼠体内，可杀伤肿瘤细胞;基于此单链抗体，构建了识别c‑met的嵌合抗原受体(CAR)，并制备和扩增了CAR‑T细胞。该c‑Met CAR‑T细胞可特异识别c‑Met表达阳性的人源肿瘤细胞并体外有效杀伤；当此c‑Met CAR‑T细胞注入到荷瘤小鼠体内，表现出特异识别c‑Met的，对肿瘤细胞生长抑制的治疗效果。

Description

识别人c-Met蛋白的人源单链抗体、诊断试剂及其CAR-T细胞制剂

【技术领域】

本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及识别人c-Met蛋白的人源单链抗体、诊断试剂以及其CAR-T细胞制剂。

【背景技术】

癌症是威胁人类健康的常见疾病。目前临床上普遍应用的癌症治疗方法包括外科手术及放疗/化疗等。由于这些方法不能精准地区分肿瘤和周围的正常组织。因此，不可避免地对机体造成损失和破坏，引起严重的副反应，特别是一些处于发展晚期及发生转移的肿瘤。人类社会迫切需要更加有效，安全，及特异针对肿瘤组织的治疗手段及方法。

受体酪氨酸激酶c-Met及其唯一的已知配体HGF(hepatocyte growth factor)在细胞的增殖、存活、侵袭、组织发育及器官再生等过程中扮演重要作用。HGF同c-Met可以形成一个紧密复合体，并启动信号转导过程。活性复合体的形成，会导致受体的多聚化、内吞、胞内激酶结构域中多个酪氨酸残基的磷酸化，从而激活多条信号级联通路，并与肿瘤的发展、侵袭及转移密切相关。

尽管HGF/c-met信号通路存在着严格的调控，但在多种类型的恶性肿瘤中均检测到了该信号通路的异常调节。C-MET的异常激活可通过非HGF依赖性机制发生，如met基因的突变、基因扩增及转录水平上调等。C-met的过表达发生于多种类型的实体瘤中，包括脑肿瘤、乳腺癌、大肠癌、胃癌、头颈癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、前列腺癌与软组织癌等。

【发明内容】

为了解决上述技术问题，本发明实施例提供一种特异性识别人c-Met蛋白的人源单链抗体、诊断试剂以及其CAR-T细胞制剂，旨在解决现有技术中，癌症治疗技术手段特异性不佳的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明实施例提供以下技术方案：

一种人源单链抗体，其中，所述人源单链抗体用于特异性识别人c-Met蛋白，包括重链可变区以及轻链可变区；

所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID 1；所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQID 2。

一种人源单链抗体，其中，所述人源单链抗体用于特异性识别人c-Met蛋白，包括重链可变区以及轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID 3；所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID 4。

一种DNA序列，其中，所述DNA序列用于编码人源单链抗体和人IgG Fc的融合蛋白；所述人源单链抗体包括如上所述的人源单链抗体；所述DNA序列为SEQ ID 5。

一种DNA序列，其中，所述DNA序列用于编码人源单链抗体和鼠IgG2a Fc的融合蛋白；所述人源单链抗体包括如上所述的人源单链抗体；所述DNA序列为SEQ ID 7。

一种DNA序列，其中，所述DNA序列用于编码人源单链抗体和兔IgG Fc的融合蛋白；所述人源单链抗体包括如上所述的人源单链抗体；所述DNA序列为SEQ ID 9。

一种诊断试剂，其中，所述诊断试剂包括如上所述的人源单链抗体以及如上所述的DNA序列编码获得的融合蛋白中的一种或者多种。

一种嵌合抗原受体的编码DNA分子，其中，所述嵌合抗原受体包括与c-Met特异性结合的单抗抗体、跨膜结构域以及胞内结构域；所述与c-Met特异性结合的单抗抗体为如上所述的人源单链抗体。

所述的编码DNA分子，其中，所述嵌合抗原受体包括CD8跨膜结构域；所述CD8跨膜结构域的氨基酸序列为SEQ ID 14；所述嵌合抗原受体包括CD137分子结构域以及CD3ζ链结构域；所述CD137分子结构域的氨基酸序列为SEQ ID 16；所述CD3ζ链结构域的氨基酸序列为SEQ ID 18。

一种特异性CAR-T细胞制剂的制备方法，其中，所述方法包括：体外构建如上所述的嵌合抗原受体的编码DNA分子；制备人外周白细胞；体外制备慢病毒载体；使用所述慢病毒载体将所述编码DNA分子转导至人T淋巴细胞；体外扩增转导后的CAR-T细胞。

一种T细胞，其特征在于，所述T细胞应用如上所述的制备方法制备获得。

有益效果：c-Met是较为保守的原癌基因，在许多肿瘤组织上以较高水平表达，如胃癌，肝癌，肺癌，结肠癌，乳腺癌和卵巢癌等，是较好的肿瘤治疗靶点。以c-Met特异性结合的单链抗体为基础，可以制备出相应的单链抗体-Fc融合蛋白(用于肿瘤的诊断)，或者制备出嵌合抗原受体T细胞(用于肿瘤的治疗)。该肿瘤治疗和诊断方式具有显著的特异性，不会产生现有肿瘤治疗手段的问题，具有巨大的社会和经济效益。

【附图说明】

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。

图1为本发明实施例提供的蛋白表达载体的示意图；

图2为本发明实施例提供的纯化蛋白的SDS-PAGE的电泳结果图；

图3为本发明实施例提供的流式分选示意图；

图4为本发明实施例提供的酵母表达的western-bolt结果示意图；

图5为本发明实施例提供的亲和力检测结果示意图；

图6为本发明实施例提供的真核表达载体的示意图；

图7为本发明实施例提供的纯化融合蛋白的SDS-PAGE的电泳结果图

图8为本发明实施例提供的ELISA反应的结果示意图；

图9为本发明实施例提供的纯化融合蛋白的western结果示意图；

图10为本发明实施例提供的流式分析的结果示意图；

图11为本发明实施例提供的免疫荧光的结果示意图；

图12为本发明实施例提供的细胞活性分析的结果示意图；

图13为本发明实施例提供的死亡率分析的结果示意图；

图14为本发明实施例提供的肿瘤生长曲线的结果示意图；

图15为本发明实施例提供的慢病毒载体的示意图；

图16为本发明实施例提供的CAR细胞表达的western验证实验示意图；

图17为本发明实施例提供的体外实验效果的结果示意图；

图18为本发明实施例提供的体内实验效果的结果示意图；

图19为本发明实施例提供的ADCC实验的结果示意图。

序列表中公开了SEQ ID1-SEQ ID18的18个氨基酸或者核苷酸序列：

SEQ ID 1为特异识别c-Met的人源单链抗体的重链可变区的核苷酸序列；

SEQ ID 2为特异识别c-Met的人源单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列；

SEQ ID 3为特异识别c-Met的人源单链抗体的重链可变区的核苷酸序列；

SEQ ID 4为特异识别c-Met的人源单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列。

SEQ ID 5为人c-Met单链抗体和人IgG Fc融合蛋白的核苷酸序列；

SEQ ID 6为人c-Met单链抗体和人IgG Fc融合蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID 7为人c-Met单链抗体和鼠IgG Fc融合蛋白的核苷酸序列；

SEQ ID 8为人c-Met单链抗体和鼠IgG Fc融合蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID 9为人c-Met单链抗体和兔IgG Fc融合蛋白的核苷酸序列；

SEQ ID 10为人c-Met单链抗体和兔IgG Fc融合蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID 11为嵌合抗原受体的核苷酸序列；

SEQ ID 12为嵌合抗原受体的氨基酸序列；

SEQ ID 13为CD8跨膜结构域的核苷酸序列；

SEQ ID 14为CD8跨膜结构域的氨基酸序列；

SEQ ID 15为CD137分子结构域的核苷酸序列；

SEQ ID 16为CD137分子结构域的氨基酸序列；

SEQ ID 17为CD3ζ链结构域的核苷酸序列；

SEQ ID 18为CD3ζ链结构域的氨基酸序列。

【具体实施方式】

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。需要说明的是，当元件被表述“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。当一个元件被表述“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。本说明书所使用的术语“上”、“下”、“内”、“外”、“底部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

此外，下面所描述的本发明不同实施例中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

本发明实施例中，提供了如下的技术方案：

1、运用表达纯化的c-Met蛋白来筛选酵母细胞表面展示的人源单链抗体文库，得到单链抗体的基因。

2、采用酵母表达系统，表达和纯化单链抗体，并进行体外验证。其中，所述单链抗体(Single-chainantibody)即单链抗体可变区片段(Single-chain antibody variablefragment，or ScFv)。其由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽(Linker)连接而成。分子量为27000-30000Da，是亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。

3、采用真核表达系统，表达和纯化单链抗体-Fc融合蛋白。

4、对获得的融合蛋白进行体外实验验证(ELISA实验，融合蛋白对肿瘤细胞的结合实验，补体和抗体依赖的细胞毒实验)。

5、通过动物体内实验验证融合蛋白在体内特异结合肿瘤细胞，并杀伤肿瘤细胞。

6、利用单链抗体基因，构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体，并制备用于T淋巴细胞感染的慢病毒颗粒。

7、感染人T淋巴细胞，并体外扩增T淋巴细胞。

8、体外实验验证CAR-T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤以及对荷瘤动物模型验证CAR-T细胞体内对肿瘤细胞的杀伤。

CAR-T是一种能够表达CAR的T细胞，全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。所述CAR(Chimeric Antigen Receptor)是指嵌合抗原受体，其能够以非MHC限制性方式识别肿瘤细胞表面的抗原。CAR的组成是一个单链抗体(可特异性识别肿瘤细胞表面抗原)，跨膜区(保证单链抗体在T细胞表面表达)，共刺激信号片段(保证CAR-T细胞长期扩增活性，如CD28和CD137)。CDR通过体外转染技术转到患者的T细胞内，使患者的T细胞表达CAR形成CAR-T细胞。经过改造后的T细胞能够非MHC依赖的特异性识别肿瘤表面相关抗原，同时保证处于激活扩增状态，长期对肿瘤细胞产生杀伤，从而达到抑制肿瘤生长、杀伤肿瘤的目的。

以下结合具体实施例，详细描述本发明实施例提供的技术方案。

实施例1：c-Met单链抗体的筛选及验证。

在实施例1中，以c-Met蛋白做为抗原,通过筛选人源单链抗体酵母展示文库来获得c-Met特异的单链抗体。

使用原核表达载体，通过E.coli BL21DE3作为宿主细胞生产c-Met蛋白。完整的c-Met蛋白包含胞外区，跨膜区和胞内区。

胞外区基因扩增，并克隆到如图1所示的载体中。此原核表达载体含有GST结构域，因此表达出c-Met-GST融合蛋白。然后，融合蛋白可以被GST纯化柱进行蛋白纯化。

如图2所示，纯化的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳后，通过考马斯蓝染色呈现单一的蛋白带。纯化后的融合蛋白进一步采用生物素标记。然后，利用标记的c-Met-GST融合蛋白，筛选酵母表面展示的人源单链抗体文库。

筛选酵母表面展示的人源单链抗体文库的过程大致如下：

首先，生物素标记的蛋白与酵母细胞共孵育，随后加入straptavidin标记的磁珠，经过MACS柱纯化。由此，酵母细胞表面表达有c-Met特异的单链抗体，与Streptavidin磁珠结合并经MACS柱得以分离和富集，而未结合的酵母细胞被洗去(其中，MACS柱纯化共计三次)。

然后，进一步采用流式分选的方法，分离抗原特异结合的酵母细胞，通过分离酵母的DNA进而DNA测序，可知单链抗体的DNA序列。对这些分离出的抗原特异结合的酵母细胞，与不同浓度的c-Met-GST融合蛋白孵育及流式检测后，计算出不同单链抗体对抗原的亲和力。流式检测的结果如图3所示。图5为不同单链抗体对抗原的亲和力的曲线图。

根据单链抗体的DNA序列，克隆到酵母表达载体，经过诱导表达出单链抗体，并用His-Nickle柱纯化。利用纯化的单链抗体，通过斑点杂交或ELISA进行验证。结果如图4所示，单链抗体对c-Met-GST蛋白用阳性反应，而对GST蛋白没有反应信号。

实施例2：单链抗体-Fc融合蛋白的表达纯化和特异性验证。

在实施例2中，分子克隆所用限制性内切酶EcoRΙ和KpnΙ以及载体构建所用HiFiDNA assembly master mix购自Neb公司(美国麻省)；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Axygen公司(中国上海)；用于载体构建的感受态细胞Dh5α购自全式金生物技术有限公司(中国北京)；用于蛋白提取的Pro293^TMCD Serum-free Medium购自Lonza公司(美国)；用于蛋白纯化的protein G亲和层析纯化柱购自GE公司(美国)；用于蛋白浓缩的超滤管购自Millipore公司(美国)；用于阳性对照的MET抗体购自CST公司(美国)；羊抗鼠AlexaFluor594购自Jackson公司(美国)；重组人c-met蛋白购自Sino Biological公司；人淋巴细胞分离液购自biosharp公司；CCK-8试剂盒购自Biosharp公司(中国)；乳酸脱氢酶试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；PEI转染试剂购自Polysciences公司(美国)；HRP标记的羊抗鼠抗体购自上海碧云天生物技术有限公司。

293TF细胞系、A549细胞系购自ATCC(美国玛纳斯)，并分别培养于高糖DMEM(Hyclone公司，美国)和RPMI 1640(Hyclone公司，美国)溶液并加入10％的胎牛血清(Gibco,美国)。

采用真核表达系统，以293F细胞为宿主细胞，表达纯化单链抗体-Fc融合蛋白来验证单链抗体。

其中，c-Met的scFv为模板，设计如下引物：

上游：5’-taagtcttgcacttgtcacgaattcGCAGGTGCAGCTGGTGCA-3’，

下游：5’-atctagcggccgcaaggtaccACTTGATTTCCAGCCGGGTTC-3’。

使用HiFi DNA Assembly master mix,将抗c-Met蛋白的单链抗体基因通过EcoRI和KpnI位点插入到pFuse-mFc2(IL2ss)载体中(图6所示)。

由于pFuse载体中包含有CMV启动子，白细胞介素2的信号肽序列(IL2SP)，及鼠IgG2a的Fc段序列。因此，该载体将表达met scFv融合鼠Fc段的融合蛋白，并分泌到细胞培养上清，为随后的protein A亲和柱层析提供了便利。

重组载体转Dh5α感受态细胞，次日挑取3个单克隆菌落，分别小提质粒，并通过酶切及测序验证。酶切和测序结果显示：靶向c-Met的scFv基因从EcoRI和KpnI位点插入到pFuse载体中，碱基数为867bp。

重组载体酶切验证结果如图7所示，其1、2、3泳道于700-1000bp间均可看到有一条约800bp的条带，表明测序结果正确。

验证完成以后，使用重组载体瞬时转染293T细胞，用Pro293CD无血清培养基培养，表达met scFv融合蛋白，此蛋白会分泌到上清，收集上清，上清经0.22um滤器过滤，并通过protein G亲和层析柱和AKTA蛋白层析纯化系统进行蛋白纯化。

将纯化的融合蛋白通过跑SDS-PAGE胶，并用考马斯蓝染色进行验证，可见于55-70kd处，有单一的蛋白条带，表明纯化成功。

同时采用western blot对表达的蛋白产物继续验证：

取5ul未转染的293T细胞上清作为阴性对照，转染的293T细胞上清按照5ul,10ul,15ul的梯度，分别与用5×loading buffer按照4:1的体积混合，95℃变性，加样电泳，转PVDF膜，用5％脱脂奶，在摇床上，室温封闭2h，将HRP-羊抗鼠抗体按照1:1000的比例稀释，4℃孵育过夜，TBST洗后，化学发光法显色。

以上的western结果显示，目的条带于55-70kd之间可见，约60kd(如图8所示)，泳道1未见有条带，泳道2、3、4随着蛋白上样量的增多信号逐渐增强，表明了反应的特异性。

另外，采用ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)实验验证融合蛋白对c-Met的特异识别。

首先，将重组人c-met蛋白包被于ELISA板中(0.07ug/孔)，4℃过夜。次日，加入blocking buffer(1％BSA溶于PBS中)封闭5-10min，washing buffer(PBST)洗，将纯化浓缩的met scFv用blocking buffer按比例稀释，加入ELISA板中，室温孵育3-4h,washingbuffer洗，将HRP-羊抗鼠抗体按照1:250的比例用blocking buffer稀释，室温孵育1-2h,washing buffer洗，TMB显色液37℃孵育10-30min,加入等体积ELISA终止液，于OD450nm处测定吸光度值。

如图9所示，重组人c-Met蛋白能够与Met scFv特异性结合，呈较好的量效关系，随着蛋白浓度的增高，吸光度值呈上升趋势，不同浓度的met scFv对应的OD450nm值与对照组做t检验，差异均有统计学意义，^＊＊p<0.01。

实施例3：单链抗体-Fc融合蛋白的体外功能验证。

在实施例3中，进一步进行融合蛋白的功能验证，包括用流式细胞分析和免疫荧光方法验证融合蛋白特异识别表达在肿瘤细胞表面的c-Met蛋白，及补体依赖的细胞毒，抗体依赖的细胞毒实验。

其中，流式细胞实验用于检测单链抗体-Fc融合蛋白对c-Met的特异识别的过程如下：

根据已发表的文献，用人肺腺癌细胞A549细胞上会表达c-Met蛋白。将商业化的抗met抗体与A549细胞孵育，并结合荧光标记的二抗进行流式染色。结果表明，有荧光信号的迁移，表明A549细胞膜上表达c-Met蛋白，验证了文献的真实性。

然后，使用纯化的单链抗体-Fc融合蛋白与A549细胞孵育30分钟，并加入荧光标记的二抗，结果显示，加入不同浓度的融合蛋白，得到不同的荧光信号，且随着融合蛋白浓度的增高，荧光信号不断增强，表明融合蛋白识别并结合到肿瘤细胞。

进一步地，对单链抗体-Fc融合蛋白预先与c-met蛋白孵育。可以理解，如果单链抗体-Fc融合蛋白能特异识别c-Met蛋白，那么c-Met蛋白结合到单链抗体的抗原表位，从而阻止了单链抗体与其他的c-Met的结合。

一定浓度的单链抗体-Fc融合蛋白，预先与c-Met蛋白结合后，然后再与A549细胞孵育，随后加入荧光染料结合的二抗。

如图10所示，没有检测出明显的荧光信号变化表明c-Met蛋白结合到单链抗体的抗原识别部分，导致单链抗体不能结合其他c-Met蛋白，从而检测不到荧光信号，此结果说明了单链抗体特异结合c-Met蛋白。

而免疫荧光实验的过程如下：

将A549细胞铺于8孔的腔室载玻片中，次日吸弃腔室载玻片中的培养基，用DPBS洗一遍，然后用2％的多聚甲醛室温固定20min,DPBS洗一遍，用1％的BSA(1g的BSA溶于100ml的PBS)室温封闭20min,用PBS洗一遍。

加入购买的met抗体(1：200)作为阳性对照，实验组则加入单链抗体-Fc融合蛋白30ul，室温孵育1h,用PBS洗三遍，加入羊抗鼠荧光二抗Alexafluor594(1:200)，阴性对照组只加入荧光二抗，室温孵育1h,倒置荧光显微镜下拍照。

如图11所示，购买的c-Met抗体作为对照，在A549细胞表面呈现阳性信号，表明c-Met蛋白表达于细胞膜上；相似地，单链抗体-Fc融合蛋白染色结果显示，A549细胞表面呈现红色荧光阳性信号，表明单链抗体-Fc融合蛋白识别表达于细胞膜上的c-Met。

现有研究证实，c-Met所介导的信号传导促进肿瘤细胞的生长。因此，单链抗体特异结合于c-Met，可以阻止c-met所介导的生长信号。

基于以上假设，进一步进行如下的细胞活性实验：

待A549细胞生长至对数期，按照5000个/孔铺于96孔板中，将met scFv分别按照1ug/ml,5ug/ml,10ug/ml,20ug/ml的浓度加入至细胞中，对照组加入与实验组等体积的PBS,并设置空白对照。培养24h后，加入10ul CCK-8试剂，使CCK-8占总体积的10％，继续培养4h，于OD450nm处测定吸光度。细胞活性＝(实验组吸光值/未处理组吸光)值×100％。用CCK-8试剂盒检测met scFv对细胞增值与细胞活性的影响。

如图12所示，随着met scFv的浓度升高，A549细胞活性逐渐降低，met scFv组与对照组比较，差异均有统计学意义，＊p<0.05。

当抗体药物注入到机体内时，可通过体内的免疫系统发挥抗肿瘤的作用，例如，通过补体依赖的细胞毒和抗体依赖的细胞毒作用。由此，利用人血清和外周血细胞，进一步进行如下所述的补体依赖的细胞毒实验和抗体依赖的细胞毒实验。

补体依赖的细胞毒实验(Complement dependent cytotoxicity,CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞毒实验(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)采用乳酸脱氢酶释放试剂盒检测。

首先，将处于生长对数期的A549细胞按照5000个/孔铺于96孔板中，将met scFv分别按照10ug/ml,50ug/ml,100ug/ml,200ug/ml的浓度梯度加入A549细胞中，于37℃孵育1h。从健康志愿者的外周血中分离出新鲜的人外周血淋巴细胞(PBMC)和血清。

CDC实验：

以人血清作为补体来源，按照10％的比例加入靶细胞A549中，使总体为100ul，继续在二氧化碳培养箱中培养4h,用LDH试剂盒检测细胞毒性。

ADCC实验：

PBMC作为效应细胞(E),A549细胞作为靶细胞(T)，按照E/T为10:1和25:1的比例分别作用于A549细胞，于二氧化碳培养箱中培养4h。

通过LDH试剂盒检测细胞毒性，于OD490nm处测定吸光度。其中，细胞毒性＝(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度)×100％。

如图13所示，抗体浓度较高时，细胞的死亡率呈较高水平。met scFv的浓度为200ug/ml时，细胞的死亡率为71.8％，对照组加的是同met scFv对应的同等体积的PBS,排除血清对细胞的影响，实验组和对照组比较差异均有统计学意义，＊p<0.05。

从健康志愿者外周血中分离出PBMC，其中包含NK细胞。NK细胞能够识别与细胞表面抗原(c-met蛋白)结合的抗体(met scFv)的Fc段，并通过抗体介导来杀伤细胞。LDH(乳酸脱氢酶)试剂盒检测LDH的释放量，来评价met scFv在ADCC实验中对A549细胞所起的作用。

将效应细胞(PBMC)同靶细胞A549设置了不同的比例进行实验，按照E/T分别为3/1、10/1、20/1、50/1做ADCC反应，其中met scFv组，每个比例中加入met scFv的量均为50ug/ml,对照组加入同等体积的PBS。

如图19所示，实验组较对照组的吸光度值高，差异均有统计学意义，^＊p<0.05。对照组中，不同比例的E/T值对细胞毒性无明显差异，p>0.05，表明只有PBMC存在时，对A549细胞不起到杀伤作用。实验组中，不同E/T值对应的OD490值，差异均无统计学意义，^＊＊p>0.05。所以，不同的E/T值，在抗体浓度为50ug/ml时，对靶细胞产生的毒性无明显差异。

为了检测ADCC反应中对met scFv是否呈浓度依赖性，可以将met scFv的浓度设置为10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml梯度，与A549细胞预先孵育，然后将PBMC按照E/T为10:1和25:1的比例分别作用于上述A549细胞。

最终的LDH试剂盒检测结果表明，E/T值一定时，OD490值会随着抗体浓度的增高有增高趋势，对比不同的E/T值对细胞毒性的影响，如图19所示，在抗体浓度为200ug/ml时，E/T(25:1)组的OD490值较E/T(10:1)组高，差异有统计学意义，^＊p<0.05。

实施例4：单链抗体-Fc融合蛋白的体内功能验证。

在实施例4中，利用动物模型，体内研究单链抗体对肿瘤的作用。本实施例中，使用人肺癌肿瘤细胞系A549建立动物模型。基于此动物模型，可以进行如下两项体内实验：

1)体内特异性结合治疗实验：荧光标记的单链抗体-Fc融合蛋白腹腔注射荷瘤小鼠，观察融合蛋白在动物体内对肿瘤的特异识别。

2)体内抑制肿瘤生长实验：单链抗体-Fc融合蛋白注射荷瘤小鼠，观察肿瘤体积的变化。

首先，处于指数增长期的人肺腺癌细胞A549，按照1:1的体积比例同基质胶(MatriGel,BD,美国)混匀，按照2×106/只的细胞数量，将细胞-基质胶的混合物注入裸鼠右前肢腋下。待平均体积达到200-300mm3，将成瘤的裸鼠随机分成两组，每组5只。

纯化的met scFv用IRDye 680LT NHS Ester荧光染料标记，腹腔注射荧光标记的met scFv，通过小动物成像仪，分别于0.5h、1h、2h、4h、8h、24h、48h观察荧光抗体的分布情况；单纯的荧光染料作为对照组。

利用小动物成像仪进行肿瘤成像研究，结果显示单纯注射荧光染料的荷瘤小鼠，荧光信号在初期(30min)主要的分布在腹部，随后(2h)，信号在腹部扩散，最后，48h时,荧光信号最弱，瘤体区域始终未见到明显高于其他部位的信号强度，表明荧光染料对瘤体无特异识别能力。然而，注射荧光染料标记的单链抗体-Fc融合蛋白。而在30min时，荧光信号主要分布于腹部，2h后，荧光信号逐渐在腹部扩散，4h时，瘤体区域和腹腔部位有荧光信号存在，随着时间推移，荧光染料不断地被代谢，荧光信号逐渐减弱。

然而，瘤体所在位置信号呈现明显的，较周围组织较强的荧光信号，表明荧光标记的单链抗体-Fc融合蛋白，能够体内识别肿瘤。结合到肿瘤组织的单链抗体因携带了荧光染料从而间接地标记了体内肿瘤的位置。通过以上结果表明，若单链抗体携带其他的标记物，如在临床上广为使用的同位素时，可用于肿瘤的示踪及临床上的肿瘤组织造影等，发挥更大的功能。

在体内成像实验结束后，将荷瘤裸鼠断颈处死，取出瘤体，用石蜡包埋，石蜡切片后脱蜡至水，加入3％H2O2，室温孵育10min，灭活内源性过氧化物酶。

加入山羊血清室温封闭30min后，分别加入购买的兔抗人Met抗体(1∶200)和自制的met scFv，4℃过夜。次日，PBS洗片，对应的加入HRP标记山羊抗兔IgG(1∶200)和HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶200)，室温静止30min。洗涤后，用DAB显色3-5min，用苏木素衬染后封片，显微镜下观察。细胞质和细胞膜呈棕黄色为阳性。表明met scFv可与瘤体细胞表面抗原met蛋白特异性结合。

基于相同的动物模型，定期用游标卡尺测量瘤体的长径(a)和短径(b)，计算瘤体体积(V)。待瘤体平均体积达到400-500mm3，分别腹腔注射单链抗体-Fc融合蛋白，5天一次，总共4次，PBS作为对照。

肿瘤体积的计算公式(V＝a×b2/2),并绘制瘤体生长曲线。如图14所示，注射单链抗体-Fc融合蛋白的小鼠，与注射PBS的小鼠比较，肿瘤生长速度减缓，差异有统计学意义(p<0.05)。表明单链抗体-Fc融合蛋白在体内，可抑制肿瘤细胞的生长。

实施例5：CAR-T细胞的制备和扩增。

c-Met特异单链抗体还可以进一步的应用于构建c-Met特异的CAR-T细胞，作为癌症治疗的有效手段。基于上述实施例获得的c-Met特异单链抗体，本发明实施例包括如下的慢病毒载体构建、慢病毒颗粒转染人T淋巴细胞以及CAR-T细胞的体外扩增三个步骤。

一、慢病毒载体的构建：如图15所示，所述慢病毒载体的DNA元件包括

1)EF1a基因的启动子；

2)采用CD8分子的跨膜区；

3)胞内信号传导结构区，包括41-BB分子和CD3zeta链上的部分序列。

为构建识别c-Met的嵌合抗原受体，c-Met特异的单链抗体序列利用分子克隆技术，通过xbaI和SalI限制性内切酶位点，连接到慢病毒载体中。为更好验证基因的表达，可以同时引入一蛋白标签c-myc,位置在单链抗体基因后及CD8跨膜区之前。

由于此载体含有完整的嵌合抗原受体基因，因此可以通过单链抗体识别肿瘤抗原，进而起始信号传导过程，引起T细胞的活化，进而杀伤肿瘤的作用。相反，若载体仅包含单链抗体和CD8跨膜区，缺失胞内信号传导区，不能引起T细胞的活化。因此，以该缺失胞内信号传导区的载体作为对照(构建的载体通过测序验证序列正确)。

为验证构建的慢病毒载体是否表达目的蛋白，将载体转染到293T细胞，48小时后，细胞进行裂解制备SDS-PAGE上样样本。电泳后，用抗人CD3的抗体，做western blot实验。结果如图16，可见阳性信号，分子量约50-70kD。

为制备用于T细胞转导的慢病毒颗粒，可以采用分子生物学技术，转染慢病毒载体及慢病毒包装载体psPAX2和VSV-G载体到293F细胞，分别于24小时和48小时，收集培养上清，并运用超速离心的方法进行病毒颗粒浓缩。浓缩的病毒颗粒于-80C冻存。

二、CAR-T细胞的制备：

首先，从外周血中分离人T淋巴细胞。该分离过程如下：用抗凝管采集健康人外周血，边采集边摇晃使得外周血与抗凝剂充分混合；将抗凝血缓慢加入装有等体积的淋巴细胞分离液(Ficoll)的50mL离心管中，450g，慢升慢降离心25min，中间不能停止离心；离心结束后，小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层细胞，转入一个新的50mL离心管中，加入PBS，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，保留离心管底部的细胞沉淀；再次加入PBS，160g，慢升慢降离心15min，弃上清；最后加入PBS，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，即得到PBMC细胞。随后，采用CD3磁珠，进一步分离CD3阳性的T淋巴细胞。

然后，将分离的T淋巴细胞用含10％FBS的AIM-V培养基(含IL-2细胞因子)进行培养。为慢病毒转导T淋巴细胞，T细胞预先活化，待细胞激活一段时间后细胞数目达到2-3×107个。取活化的T淋巴细胞，加入100ul浓缩的慢病毒颗粒，同时加入1ug/nl的polybrene,离心2000rpm约1小时后，于CO₂孵箱继续培养2小时。

重悬细胞，加入3倍体积的培养液，离心1700rpm约5分钟，移去上清液后，再加入完全培养基，继续培养。

为扩增病毒修饰的T细胞，可以采用包被抗CD3和抗CD28抗体的磁珠。磁珠的数目与T细胞的比例约为3：1，即1x10⁶T细胞的T细胞，约加入3x10⁶的磁珠。细胞培养每两天换液。采用此方法，CAR-T细胞，在10-12天大约扩增700-800倍，细胞的存活率约90％以上。

为检测CAR在T细胞的表达，CAR-T细胞与抗c-myc抗体孵育，并用荧光标记的二抗染色，采用流式细胞仪观察荧光的迁移。

实施例6：CAR-T细胞的功能验证。

实施例6中的功能验证包括体外功能实验和体内功能实验两项。其中，体外功能实验为CAR-T细胞与肿瘤细胞体外共培养，CAR-T细胞依赖单链抗体识别肿瘤抗原，进而杀伤肿瘤细胞。体内功能实验为CAR-T细胞注射入荷瘤小鼠体内，可以体内观察观察CAR-T细胞对肿瘤的杀伤作用。

一、体外功能实验：

如实施例1中的实验证实，A549细胞可以表达c-met蛋白。因此，将CAR-T细胞与A549细胞共培养，设置效靶比为0.5:1、1:1、5:1、10:1的实验孔，将c-Met BBZ-CAR-T或c-Met dZ-CAR-T细胞与A549细胞共培养，并应用LDH乳酸脱氢酶-细胞毒性检测分析试剂盒(LDH-Cytotoxicity Assay Kit,Biovision)检测遗传修饰前后的T细胞对靶细胞的体外杀伤能力。

具体方法如下：靶细胞铺于96孔板，设培养基背景、体积校正、靶细胞自发LDH释放、靶细胞最大LDH释放、效应细胞自发LDH释放对照孔，实验组孔，每组重复3孔，每个孔的终体积相同且不少于100μL。

250g离心4min，在37℃，5％CO₂孵育至少4h。在离心前45min，向靶细胞最大释放孔加入10×裂解液，体积校正孔加入等量的裂解液。再次离心，从每孔转移50μL上清至新的96孔板中，再加入50μL底物溶液，室温避光孵育30min。

每孔加入50μL终止液，1h内测定D490。细胞毒性(％)＝[(D实验孔―D培养基背景孔)―(D效应细胞自发LDH释放孔―D培养基背景孔)―(D靶细胞自发LDH释放孔―D培养基背景孔)]/[(D靶细胞最大LDH释放孔―D体积校正孔)―(D靶细胞自发LDH释放孔―D培养基背景孔)]×100％。

结果如图17所示，BBZ-CAR-T呈现出剂量依赖性对肿瘤细胞杀伤，而对照组dZ-CAR-T细胞，对肿瘤细胞没有显著杀伤。

利用稳定表达荧光素酶的A549细胞，皮下注入裸鼠。大约12-14天左右，肿瘤可见，从而建立荷瘤小鼠的动物模型。由于A549肿瘤细胞稳定表达荧光素酶，因此，体内注入荧光素底物(D-luciferin)，在荧光素酶作用下，化学发光，从而体内形成的肿瘤组织可被观察。

CAR-T细胞以1x10⁷注射入肿瘤组织，随后，每三天观察并测量肿瘤的体积，包括用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，和根据肿瘤的荧光信号计算肿瘤的体积。肿瘤体积的计算公式：肿瘤体积＝长x宽x1/2宽。连续观察若干天后，处理动物，并取肿瘤组织，做病理切片进行观察。

结果显示，肿瘤组织内注入c-Met BBZ-CAR-T细胞，可见肿瘤体积减少，肿瘤的生长速度明显降低。相反，注入dZ-CAR-T细胞，肿瘤体积随着时间，继续增长(图18)。同样的，通过肿瘤体内成像观察肿瘤体积以后，进一步确证了这一观察结果。另外，肿瘤组织的病理切片也显示，肿瘤组织内有明显的肿瘤坏死，与上述结果相一致。

综上，以上的验证结果表明：c-Met BBZ-CAR-T细胞可在体内识别肿瘤并有效杀伤肿瘤细胞。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明，它们没有在细节中提供；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> Li, Yonghai (李永海)

Chu, Niansheng (储年生)

Li, Zhenghong (李正红)

<120> anti c-Met scFv and its application

<130> N/A

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gacatccaga tgacccagag ccccagcagc gtgagcgcca gcgtgggcga ccgggtgacc 60

atcacctgcc gggccagcca gggcatcaac acctggctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcagcc tgaagagcgg cgtgcccagc 180

cggtttagcg gctctggctc tggcgccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag gccaacagct tccccctgac ctttggcggc 300

ggaacaaagg tggagatcaa g 321

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Thr Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 345

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ctggcgcctc cgtcaaggtg 60

tcctgcgagg ccagcggcta caccttcacc agctacggct tcagctgggt gcggcaggca 120

ccaggccagg gcctcgagtg gatgggctgg atcagcgcca gcaacggcaa cacctactac 180

gcccagaagc tgcagggcag ggtcaccatg accaccgaca ccagcaccag cagcgcctac 240

atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagggtgtac 300

gccgactacg ccgattactg gggccagggc accctggtga ccgtg 345

<210> 4

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Tyr Ala Asp Tyr Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val

115

<210> 5

<211> 1467

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60

gacatccaga tgacccagag ccccagcagc gtgagcgcca gcgtgggcga ccgggtgacc 120

atcacctgcc gggccagcca gggcatcaac acctggctgg cctggtatca gcagaagccc 180

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcagcc tgaagagcgg cgtgcccagc 240

cggtttagcg gctctggctc tggcgccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 300

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag gccaacagct tccccctgac ctttggcggc 360

ggaacaaagg tggagatcaa gggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 420

ggcagcacca agggccaggt gcagctggtg cagagcggag ccgaggtgaa gaagcctggc 480

gcctccgtca aggtgtcctg cgaggccagc ggctacacct tcaccagcta cggcttcagc 540

tgggtgcggc aggcaccagg ccagggcctc gagtggatgg gctggatcag cgccagcaac 600

ggcaacacct actacgccca gaagctgcag ggcagggtca ccatgaccac cgacaccagc 660

accagcagcg cctacatgga actgcggagc ctgagaagcg acgacaccgc cgtgtactac 720

tgcgccaggg tgtacgccga ctacgccgat tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 780

gcggccgcta gatctagcaa gcccacgtgc ccaccccctg aactcctggg gggaccgtct 840

gtcttcatct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcacgcac ccccgaggtc 900

acatgcgtgg tggtggacgt gagccaggat gaccccgagg tgcagttcac atggtacata 960

aacaacgagc aggtgcgcac cgcccggccg ccgctacggg agcagcagtt caacagcacg 1020

atccgcgtgg tcagcaccct ccccatcgcg caccaggact ggctgagggg caaggagttc 1080

aagtgcaaag tccacaacaa ggcactcccg gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1140

agagggcagc ccctggagcc gaaggtctac acaatgggcc ctccccggga ggagctgagc 1200

agcaggtcgg tcagcctgac ctgcatgatc aacggcttct acccttccga catctcggtg 1260

gagtgggaga agaacgggaa ggcagaggac aactacaaga ccacgccggc cgtgctggac 1320

agcgacggct cctacttcct ctacagcaag ctctcagtgc ccacgagtga gtggcagcgg 1380

ggcgacgtct tcacctgctc cgtgatgcac gaggccttgc acaaccacta cacgcagaag 1440

tccatctccc gctctccggg taaatga 1467

<210> 6

<211> 480

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly

35 40 45

Ile Asn Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn

100 105 110

Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

145 150 155 160

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Met Gly Trp Ile Ser Ala Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys

195 200 205

Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Ser Ala

210 215 220

Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Arg Val Tyr Ala Asp Tyr Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Leu Val Thr Val Ala Ala Ala Arg Ser Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro

260 265 270

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro

275 280 285

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

290 295 300

Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile

305 310 315 320

Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln

325 330 335

Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln

340 345 350

Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala

355 360 365

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro

370 375 380

Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser

385 390 395 400

Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser

405 410 415

Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr

420 425 430

Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr

435 440 445

Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe

450 455 460

Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

465 470 475 480

<210> 7

<211> 1467

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60

gacatccaga tgacccagag ccccagcagc gtgagcgcca gcgtgggcga ccgggtgacc 120

atcacctgcc gggccagcca gggcatcaac acctggctgg cctggtatca gcagaagccc 180

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcagcc tgaagagcgg cgtgcccagc 240

cggtttagcg gctctggctc tggcgccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 300

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag gccaacagct tccccctgac ctttggcggc 360

ggaacaaagg tggagatcaa gggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 420

ggcagcacca agggccaggt gcagctggtg cagagcggag ccgaggtgaa gaagcctggc 480

gcctccgtca aggtgtcctg cgaggccagc ggctacacct tcaccagcta cggcttcagc 540

tgggtgcggc aggcaccagg ccagggcctc gagtggatgg gctggatcag cgccagcaac 600

ggcaacacct actacgccca gaagctgcag ggcagggtca ccatgaccac cgacaccagc 660

accagcagcg cctacatgga actgcggagc ctgagaagcg acgacaccgc cgtgtactac 720

tgcgccaggg tgtacgccga ctacgccgat tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 780

gcggccgcta gatctgtgga gtgcccacct tgcccagcac cacctgtggc aggaccttca 840

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctgatga tctccagaac ccctgaggtc 900

acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 960

gacggcatgg aggtgcataa tgccaagaca aagccacggg aggagcagtt caacagcacg 1020

ttccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcgtg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 1080

aagtgcaagg tctccaacaa aggcctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc 1140

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1200

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg 1260

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacacctcc catgctggac 1320

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1380

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 1440

agcctctccc tgtctccggg taaatga 1467

<210> 8

<211> 488

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly

35 40 45

Ile Asn Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn

100 105 110

Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

145 150 155 160

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Met Gly Trp Ile Ser Ala Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys

195 200 205

Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Ser Ala

210 215 220

Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Arg Val Tyr Ala Asp Tyr Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Leu Val Thr Val Ala Ala Ala Arg Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

260 265 270

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

275 280 285

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

290 295 300

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

305 310 315 320

Asp Gly Met Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

325 330 335

Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln

340 345 350

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

355 360 365

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro

370 375 380

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

385 390 395 400

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

405 410 415

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

420 425 430

Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

435 440 445

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

450 455 460

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

465 470 475 480

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485

<210> 9

<211> 1479

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60

gacatccaga tgacccagag ccccagcagc gtgagcgcca gcgtgggcga ccgggtgacc 120

atcacctgcc gggccagcca gggcatcaac acctggctgg cctggtatca gcagaagccc 180

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gccagcagcc tgaagagcgg cgtgcccagc 240

cggtttagcg gctctggctc tggcgccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 300

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag gccaacagct tccccctgac ctttggcggc 360

ggaacaaagg tggagatcaa gggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 420

ggcagcacca agggccaggt gcagctggtg cagagcggag ccgaggtgaa gaagcctggc 480

gcctccgtca aggtgtcctg cgaggccagc ggctacacct tcaccagcta cggcttcagc 540

tgggtgcggc aggcaccagg ccagggcctc gagtggatgg gctggatcag cgccagcaac 600

ggcaacacct actacgccca gaagctgcag ggcagggtca ccatgaccac cgacaccagc 660

accagcagcg cctacatgga actgcggagc ctgagaagcg acgacaccgc cgtgtactac 720

tgcgccaggg tgtacgccga ctacgccgat tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 780

gcggccgcta gatctcctcc actcaaagag tgtcccccat gcgcagctcc agacctcttg 840

ggtggaccat ccgtcttcat cttccctcca aagatcaagg atgtactcat gatctccctg 900

agccctatgg tcacatgtgt ggtggtggat gtgagcgagg atgacccaga cgtccagatc 960

agctggtttg tgaacaacgt ggaagtacac acagctcaga cacaaaccca tagagaggat 1020

tacaacagta ctctccgggt ggtcagtgcc ctccccatcc agcaccagga ctggatgagt 1080

ggcaaggagt tcaaatgcaa ggtcaacaac agagccctcc catcccccat cgagaaaacc 1140

atctcaaaac ccagagggcc agtaagagct ccacaggtat atgtcttgcc tccaccagca 1200

gaagagatga ctaagaaaga gttcagtctg acctgcatga tcacaggctt cttacctgcc 1260

gaaattgctg tggactggac cagcaatggg cgtacagagc aaaactacaa gaacaccgca 1320

acagtcctgg actctgatgg ttcttacttc atgtacagca agctcagagt acaaaagagc 1380

acttgggaaa gaggaagtct tttcgcctgc tcagtggtcc acgagggtct gcacaatcac 1440

cttacgacta agaccatctc ccggtctctg ggtaaatga 1479

<210> 10

<211> 492

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly

35 40 45

Ile Asn Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn

100 105 110

Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

145 150 155 160

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Met Gly Trp Ile Ser Ala Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys

195 200 205

Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Ser Ala

210 215 220

Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Arg Val Tyr Ala Asp Tyr Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Leu Val Thr Val Ala Ala Ala Arg Ser Pro Pro Leu Lys Glu Cys Pro

260 265 270

Pro Cys Ala Ala Pro Asp Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe

275 280 285

Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Met Val

290 295 300

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile

305 310 315 320

Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr

325 330 335

His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro

340 345 350

Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val

355 360 365

Asn Asn Arg Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro

370 375 380

Arg Gly Pro Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Ala

385 390 395 400

Glu Glu Met Thr Lys Lys Glu Phe Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Gly

405 410 415

Phe Leu Pro Ala Glu Ile Ala Val Asp Trp Thr Ser Asn Gly Arg Thr

420 425 430

Glu Gln Asn Tyr Lys Asn Thr Ala Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

435 440 445

Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Gln Lys Ser Thr Trp Glu Arg

450 455 460

Gly Ser Leu Phe Ala Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His

465 470 475 480

Leu Thr Thr Lys Thr Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys

485 490

<210> 11

<211> 1599

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgggatccg acatccagat gacccagagc cccagcagcg tgagcgccag cgtgggcgac 120

cgggtgacca tcacctgccg ggccagccag ggcatcaaca cctggctggc ctggtatcag 180

cagaagcccg gcaaggcccc caagctgctg atctacgccg ccagcagcct gaagagcggc 240

gtgcccagcc ggtttagcgg ctctggctct ggcgccgact tcaccctgac catcagcagc 300

ctgcagcccg aggacttcgc cacctactac tgccagcagg ccaacagctt ccccctgacc 360

tttggcggcg gaacaaaggt ggagatcaag ggcagcacct ccggcagcgg caagcctggc 420

agcggcgagg gcagcaccaa gggccaggtg cagctggtgc agagcggagc cgaggtgaag 480

aagcctggcg cctccgtcaa ggtgtcctgc gaggccagcg gctacacctt caccagctac 540

ggcttcagct gggtgcggca ggcaccaggc cagggcctcg agtggatggg ctggatcagc 600

gccagcaacg gcaacaccta ctacgcccag aagctgcagg gcagggtcac catgaccacc 660

gacaccagca ccagcagcgc ctacatggaa ctgcggagcc tgagaagcga cgacaccgcc 720

gtgtactact gcgccagggt gtacgccgac tacgccgatt actggggcca gggcaccctg 780

gtgaccgtgg ctagcaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 840

gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 900

cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc 960

ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag 1020

aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc 1080

cgcaagcatt accagcccta tgccccacca cgcgacttcg cagcctatcg ctccaaacgg 1140

ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 1200

caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 1260

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 1320

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1380

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1440

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1500

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1560

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 1599

<210> 12

<211> 520

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

20 25 30

Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

35 40 45

Ser Gln Gly Ile Asn Thr Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Lys Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu

115 120 125

Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly

130 135 140

Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

145 150 155 160

Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr

165 170 175

Phe Thr Ser Tyr Gly Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

180 185 190

Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr

195 200 205

Ala Gln Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr

210 215 220

Ser Ser Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala

225 230 235 240

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Tyr Ala Asp Tyr Ala Asp Tyr Trp Gly

245 250 255

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

275 280 285

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

305 310 315 320

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

325 330 335

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

340 345 350

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

355 360 365

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys

370 375 380

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

385 390 395 400

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

405 410 415

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

420 425 430

Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

435 440 445

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

450 455 460

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

465 470 475 480

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

485 490 495

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

500 505 510

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

515 520

<210> 13

<211> 81

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 14

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 15

<211> 126

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 16

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 17

<211> 336

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

Claims

1.一种人源单链抗体，其特征在于，所述人源单链抗体用于特异性识别人c-Met蛋白，包括重链可变区以及轻链可变区；所述重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID 1；所述轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID 2。

2.一种人源单链抗体，其特征在于，所述人源单链抗体用于特异性识别人c-Met蛋白，包括重链可变区以及轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID 3；所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID 4。

3.一种DNA序列，其特征在于，所述DNA序列用于编码人源单链抗体和人IgG Fc的融合蛋白；所述人源单链抗体包括如权利要求1或2所述的人源单链抗体；所述DNA序列为SEQ ID5，所述DNA序列编码的氨基酸序列为SEQ ID 6。

4.一种DNA序列，其特征在于，所述DNA序列用于编码人源单链抗体和鼠IgG2a Fc的融合蛋白；所述人源单链抗体包括如权利要求1或2所述的人源单链抗体；所述DNA序列为SEQID 7，所述DNA序列编码的氨基酸序列为SEQ ID 8。

5.一种DNA序列，其特征在于，所述DNA序列用于编码人源单链抗体和兔IgG Fc的融合蛋白；所述人源单链抗体包括如权利要求1或2所述的人源单链抗体；所述DNA序列为SEQ ID9，所述DNA序列编码的氨基酸序列为SEQ ID 10。

6.一种诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂包括如权利要求1所述的人源单链抗体、如权利要求2所述的人源单链抗体以及如权利要求3-5任一所述的DNA序列编码获得的融合蛋白中的一种或者多种。

7.一种嵌合抗原受体的编码DNA分子，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括与c-Met特异性结合的单抗抗体、跨膜结构域以及胞内结构域；

所述与c-Met特异性结合的单抗抗体为如权利要求1或2所述的人源单链抗体。

8.根据权利要求7所述的编码DNA分子，其特征在于，所述编码DNA分子的DNA序列为SEQID 11，所述编码DNA分子编码的氨基酸序列为SEQ ID 12。

9.根据权利要求7所述的编码DNA分子，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括CD8跨膜结构域；所述CD8跨膜结构域的氨基酸序列为SEQ ID 14；所述嵌合抗原受体包括CD137分子结构域以及CD3ζ链结构域；所述CD137分子结构域的氨基酸序列为SEQ ID 16；所述CD3ζ链结构域的氨基酸序列为SEQ ID 18。

10.一种CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

体外构建如权利要求7所述的嵌合抗原受体的编码DNA分子；

制备人外周白细胞；

体外制备慢病毒载体；

使用所述慢病毒载体将所述编码DNA分子转导至人T淋巴细胞；体外扩增转导后的CAR-T细胞。