CN105384819B

CN105384819B - 一种抗人Delta-like 4人源化抗体及其制备与应用

Info

Publication number: CN105384819B
Application number: CN201510951483.8A
Authority: CN
Inventors: 王旻; 吴旻; 贾雪莲; 许卓斌; 王世静; 王泽根; 张娟; 罗晨
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2015-12-17
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2018-09-21
Anticipated expiration: 2035-12-17
Also published as: CN105384819A

Abstract

本发明提供了一种抗人DLL4（delta‑like 4）人源化单克隆抗体H3L2及其制备方法和应用。本发明利用生物信息学软件设计鼠单克隆抗体基于CDR移植的FR区重要碱基回复突变型人源化抗体，该抗人DLL4人源化抗体重链可变区具有SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。本发明人源化抗体H3L2可以高亲和力的结合人DLL4抗原（KD值2.26×10‑12M），能特异性靶向HUVEC细胞表面的DLL4抗原，阻断DLL4对HUVEC细胞增殖的抑制作用，保留了亲本鼠单克隆抗体的生物学活性。本发明为诊断和治疗以DLL4过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法。

Description

一种抗人Delta-like 4人源化抗体及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种抗人Delta-like 4人源化抗体H3L2及其制备与应用。

背景技术

信号通路

Notch通路是一条保守的信号转导途径，在多种组织和器官的早期发育过程中，对细胞的发育、生长及凋亡起着重要的调控作用。肿瘤干细胞生物学研究发现，Notch信号通路在肿瘤干细胞维持肿瘤的生长中发挥着关键的作用，在许多血液癌和实体瘤中发现了Notch 信号通路的异常激活。血管内皮细胞表达两种Notch受体（Notch-1和Notch-4），以及除了DLL-3外的所有配体。其中DLL4是内皮细胞特异性配体，其介导的Notch-1信号通路对血管生成、发育起重要作用。许多血管生成信号因子（如VEGF）可以激活Notch-1/DLL4信号通路，激活的Notch-1/DLL4信号通路又会负反馈的下调VEGF受体VEGFR2的表达，从而抑制内皮细胞增殖和血管出芽。阻断DLL4介导的Notch-1信号通路则会引起内皮细胞增殖、血管过度出芽，产生管腔发育不完整的无功能血管，达到抑制肿瘤生长的效果。除此之外，还可以抑制肿瘤干细胞的增殖和自我更新，进一步防止肿瘤的生长和复发。

目前，靶向notch信号通路的临床研究药物主要有两大类，阻断γ-分泌酶的小分子抑制剂（GSI）以及靶向notch受体、配体的单克隆抗体。大部分的GSI通过结合γ-分泌酶复合物的活性切割位点，从而竞争性的抑制γ-分泌酶对notch受体的切割，达到阻断notch信号通路的作用。然而GSI对notch的抑制是非选择性的，它可以抑制所有notch受体的切割，引起胃肠道的毒副作用。同样，靶向notch1、notch2受体的单克隆抗体也会引起严重的胃肠道毒副作用。介导肠上皮细胞notch信号通路的配体主要是DLL1和DLL4，选择性的阻断DLL4介导的notch信号通路不仅可以达到抑制肿瘤的作用，还可以提高靶向特异性，减少对正常组织的毒副作用。

抗体人源化手段

鼠源单克隆抗体具有亲和力高、特异性强的优势，但是应用于人体还有很大的缺陷如：1 血清中半衰期短；2 仅有部分不同亚类的抗体能引发效应功能；3 最大的障碍是诱发HAMA反应。目前克服这些困难的首选途径是鼠单克隆抗体的人源化。最早的抗体人源化手段是将鼠单抗的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体，由于这两部分在空间结构上相对独立，其抗原亲和力保持得很好，同时免疫原性也得到了下降，但由于嵌合抗体上还保留着鼠可变区，应用于临床应用时仍可能发生强烈的HAMA反应。在此基础上，进一步将鼠单抗可变区中相对保守的FR区替换成人的FR，仅保留抗原结合部位CDR区，即CDR移植。然而起支架作用的FR不仅提供了CDR的空间构象环境，有时还参加抗体结合位点正确构象的形成。因此，简单的CDR移植往往丧失或降低了原抗体的亲和力。近年发展起来的噬菌体抗体库技术通过PCR扩增人抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，把Fab或单链抗体（ScFv）表达在噬菌体的表面，经过吸附-洗脱-扩增过程筛选并富集特异性抗体。噬菌体抗体库技术筛选的抗体虽然为全人源的，但是相对于鼠源抗体亲和力和特异性仍不高。

立体结构数据和同源性分析表明：在抗原结合、稳定CDR构象、FR折叠这几个方面，构成抗体FR区的残基并不具有相同的重要性。获得抗体重、轻链可变区序列后，应用生物信息学技术模拟出抗体可变区的结构模型，在此基础上分析出对抗体构象维持起重要作用的碱基，选择性的进行回复突变。此方法补偿了完全CDR移植导致的亲和力丧失，是一种更为可靠的人源化手段。

本发明应用生物信息学软件MOE设计基于CDR移植的FR区碱基回复突变人源化抗体，应用MOE模拟鼠抗体Fv区三维结构，并根据其三维结构分析维持CDR区构象必需的经典氨基酸，保留鼠单抗的CDR区，根据FR区的经典氨基酸搜索人Fab sequence database，查找最适FR模板替换鼠单抗FR区，在此基础上选择FR区重要的经典氨基酸进行回复突变。

发明内容

发明目的

本发明提供一种抗人DLL4人源化抗体H3L2及其制备方法和应用。

一种抗人DLL4鼠单克隆抗体可变区的人源化设计，保留鼠单克隆抗体重、轻链可变区的CDR区，利用生物信息学软件将FR区替换为高同源性的人源FR模板，并选择重要碱基进行回复突变，将得到的人源化可变区与人IgG1抗体恒定区，通过基因重组等手段构建成完整的人源化全长抗体（命名为H3L2）。

一种分离的核酸，其特征为编码H3L2抗体。

一种表达载体，含有上述的核酸。

一种重组CHO-S宿主细胞，含上述的表达载体。

一种哺乳动物细胞分泌表达法，用于分泌表达上述人源化抗体。

一种纯化上述抗DLL4人源化抗体的方法。

上述抗体或抗体片段的应用，其特征在于选择性的与人DLL4结合或抑制DLL4与notch受体的结合，阻断其信号通路的转导。

上述抗体或抗体片段或抗体片段的偶联物。

抗DLL4人源化抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。

具体来说

本发明中抗DLL4人源化抗体H3L2由两条相同的重链H3和两条相同的轻链L2组成经典的抗体结构，重链碱基数为1404bp，轻链碱基数为708bp，人源化抗体蛋白分子量约为156KDa，其中人源碱基数占总碱基数的90%。重、轻链恒定区为人IgG1抗体恒定区，抗体可变区的人源化设计在分子建模/药物设计软件MOE上完成：首先将鼠源抗体FR区替换为高同源性的人源模板，得到CDR移植抗体，然而CDR移植抗体丧失了亲本鼠抗体的高亲和力。研究表明[Kettleborough C A, Saldanha J, Heath V J, et al. Humanization of a mousemonoclonal antibody by CDR–grafting: the importance of framework residues onloop conformation[J]. Protein Engineering, 1991, 4(7):773-783.]，FR区某些氨基酸对CDR区构象、抗体亲和力的保持起重要作用，因此在CDR移植抗体的基础上，我们选择了12个FR区重要氨基酸回复突变为鼠源氨基酸以保证其亲和力，得到人源化抗体重、轻链可变区序列。

本发明利用酶切酶连技术，将设计合成的人源化可变区序列克隆到含有人IgG1抗体序列的表达载体，替换其可变区序列，构建成功的表达载体经电穿孔转染CHO-S细胞，经G418筛选、鉴定后得到稳定表达细胞株。取细胞表达上清，低温离心去除细胞碎片并抽滤后采用Protein A柱纯化；Western Blot 鉴定所得H3L2抗体；流式细胞术检测H3L2与HUVEC细胞表面DLL4抗原的结合，SPR实验测定H3L2与人DLL4的亲和力常数；MTT检测H3L2阻断DLL4对HUVEC细胞增殖的抑制作用。一般认为鼠单抗可变区与人抗体恒定区组成的嵌合抗体与鼠单抗的亲和力相当，因此为了方便实验研究，我们选用嵌合抗体作为人源化抗体的阳性对照。

本发明成功构建了人源化抗体重、轻链的真核细胞表达载体H3- pMH3、L2- pMH3、H3-pCA、L2-pCA，筛选得到了稳定表达本发明人源化抗体的CHO-S细胞株，其表达的抗DLL4人源化抗体H3L2保留了鼠单克隆抗体的高亲和力（K_D值约2.26×10^-12M）；能与人脐静脉内皮细胞HUVEC具有高特异性结合；能够阻断DLL4对HUVEC细胞增殖的抑制作用。本发明为诊断和治疗以DLL4过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法。

有益效果

本发明利用生物信息学软件设计基于CDR移植的FR区重要碱基回复突变型人源化抗体可变区，将改造后的人源化抗体可变区与人IgG1型抗体恒定区拼接形成新的人源化全长抗体H3L2，将含有该人源化抗体基因的载体导入哺乳动物细胞表达系统CHO-S细胞中并获得稳定表达细胞株。大量表达并纯化H3L2，经SPR实验验证，H3L2与人DLL4抗原亲和力常数达到2.26×10^-12M，基本上保留了鼠单克隆抗体的高亲和力；H3L2能特异性靶向人DLL4抗原，阻断DLL4对HUVEC细胞增殖的抑制作用，保留了亲本鼠单克隆抗体的生物学活性。

附图说明

图1 是抗DLL4人源化抗体基因的设计。图为鼠单克隆抗体Fv区的三维结构，所标黄色氨基酸为FR人源模板替换后轻、重链中需要回复突变的经典氨基酸。轻链（左）中为4I、47P、48W、50Y、72Y；重链（右）中为27Y、37I、38K、48I、68A、70L、98G。

图2 是抗DLL4人源化抗体与鼠源抗体的氨基酸序列比对结果。Z27506和J00256为重链可变区的人源FR模板，X63399和J00242为轻链可变区的人源FR模板。VH_g/VL_g表示CDR移植抗体的重、轻链可变区。*表示该氨基酸与鼠源抗体对应位点的氨基酸相同。标红色氨基酸为回复突变为鼠源的氨基酸，轻链中为4I、47P、48W、50Y、72Y；重链中为27Y、37I、38K、48I、68A、70L、98G。重链可变区中橙色区域分别为H-CDR1、H-CDR2，红色区域为H-CDR3；轻链可变区中紫色区域分别为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3。 MMGZ01_VH/VL表示抗DLL4鼠源抗体的重、轻链可变区。CDR区的确定参考Kabat抗体注释规则[Wu, T.T., Kabat, E.A.; AnAnalysis of the Sequences of the Variable Regions of Bence-Jones Proteins andMyeloma Light Chains and Their Implications for Antibody Complementarity; J. Exp. Med. 132 (1970) 211–250.].

图3 是表达载体电穿孔转染CHO-S细胞后筛选稳定表达株的结果。图A、B为第二轮筛选96孔板、24孔板的Dot Blot图，图C为T-25细胞培养瓶上清的Western Blot图（a为非还原型，b为还原型），显示正确表达、装配人源化抗体的细胞株。

图4 是SDS-PAGE蛋白质电泳图和Western blot 鉴定人源化抗体图，图A描述SDS-PAGE鉴定细胞发酵表达的人源化抗体经protein A 柱纯化后的结果，图B描述Westernblot 鉴定人源化抗体纯化后的结果，所用抗体为HRP标记的羊抗人IgG（ H+L）。图A和图B中，泳道1、2分别为非还原型的市售抗体Cetuximab（一种抗EGFR人鼠嵌合抗体）和人源化抗体H3L2，泳道3 为蛋白Marker(条带分子量从上到下依次为：250；130；100；70；55；35；25kDa)，泳道4、5为还原型的Cetuximab和人源化抗体H3L2。

图5 是抗原抗体亲和力拟合曲线，显示人源化抗体与DLL4抗原的特异性结合，通过计算可以得到抗原抗体结合的亲和力常数K_D值。图A为阳性对照嵌合抗体c3rd的亲和力拟合曲线，图B为人源化抗体H3L2的亲和力拟合曲线，经计算c3rd的K_D值为2.99×10^-13 M，H3L2的K_D值2.26×10^-12M。

图6 是流式细胞结合图，检测人源化抗体H3L2与HUVEC细胞表面DLL4抗原的结合，阳性对照为鼠单抗可变区与人抗体恒定区组成的嵌合抗体，二抗为FITC偶联的抗人IgG抗体。

图7 是MTT图，显示人源化抗体H3L2阻断DLL4对HUVEC细胞增殖的抑制作用。结果显示，H3L2在浓度78ng/ml时，可以有效地阻断DLL4诱导内皮细胞增殖的抑制，与嵌合抗体的阻断效果相当。

具体实施方式

实施例1 抗DLL4人源化抗体基因的设计与构建。

应用生物信息学软件模拟鼠单克隆抗体Fv区三维结构（图1），并根据其三维结构分析维持CDR区构象必需的经典氨基酸，根据FR区的经典氨基酸搜索人Fab sequencedatabase，查找最适人源FR模板，如图2所示，Z27506和J00256为重链可变区的人源FR模板，X63399和J00242为轻链可变区的人源FR模板。人源模板替换鼠单克隆抗体FR区得到CDR移植抗体（VH_g/VL_g），在此基础上选择FR区重要的经典氨基酸进行回复突变，得到人源化抗体H3L2的重、轻链可变区（表示为VH₃、VL₂）。

所得人源化重链可变区VH₃具有SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，具有SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列；人源化轻链可变区VL₂具有SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列，具有SEQIDNO:8所示的核苷酸序列。人源化重链H3（可变区+恒定区）具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，具有SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列；人源化轻链L2（可变区+恒定区）具有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列，具有SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列。

人工合成SEQ IDNO:7 及SEQ IDNO:8所示的编码核苷酸序列并克隆至pUC57-simple载体中（金斯瑞，南京），利用酶切酶连技术将目的基因克隆至含有人IgG1重、轻链全长基因的表达载体pMH3-H、 pMH3-L、 pCApuro-H 和 pCApuro-L中[Xie W, Li D, ZhangJ, et al. Generation and characterization of a novel human IgG1 antibodyagainst vascular endothelial growth factor receptor 2[J]. Cancer ImmunologyImmunotherapy, 2014, 63(9):877-888.]，替换其可变区，得到含有人源化抗体重、轻链的表达载体:H3-pMH3、L2-pMH3、H3-pCA、L2-pCA。重链对应的酶切位点为EcoRⅠ和NheⅠ，轻链对应的酶切位点为EcoRⅠ和SalⅠ。

实施例2 抗体稳定表达细胞株的筛选。

以上述构建成功的四种载体质粒电穿孔共转染CHO-S细胞，电穿孔转染条件为：160V，15ms。24h后加G418筛选（终浓度为700~1000μg/ml），每2~3天换液，约10天后克隆长成，挑取克隆至96孔板中培养，待细胞长满后取上清做Dot Blot，作用抗体为HRP标记的羊抗人IgG（H+L）。根据Dot Blot结果选取阳性克隆扩大至24孔板中培养后取上清做DotBlot；选取阳性克隆扩大至T-25培养瓶中培养，取上清做Western Blot，选取表达、装配正确的细胞株冻存并进行第二轮筛选，筛选步骤同上。经过两轮筛选得到表达、装配正确的细胞株为我们需要的稳定表达株。

结果见图3。

实施例3 抗体的表达和纯化

将细胞培养上清以0.22μm滤膜抽滤，然后通过蠕动泵载入Protein A层析柱内，上样完毕后，用Binding buffer洗涤柱子至紫外信号线平直。然后用0.1 M pH3.0 醋酸钠缓冲液（Elution buffer）洗脱样品，洗脱5个柱体积。为了中和Elution buffer中的酸性物质，在样品接收管中按100μl/ml洗脱液加入1M pH9.0 Tris；洗脱样品进行SDS-PAGE纯度分析并超滤换液，使用Bio-Tek蛋白微量定量仪对抗体浓度进行测定。

结果见图4。

实施例4 SPR测定抗原抗体亲和力。

应用Biacore X100 作为SPR-依赖的生物传感器来检测人源化抗体与rhDLL4（重组人DLL4）之间的相互作用。参照说明书将rhDLL4 固定至CM5传感芯片上，再往流动池内注入系列浓度的目标蛋白（12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM、0.78125nM、0.39nM、0.195nM、0.098nM），监测目标蛋白与配体之间结合引起的响应值RU，对所获得曲线进行拟合，计算抗rhDll4 mAb与抗原的亲和力。最后用NaOH洗脱再生芯片。

结果见图5。

实施例5 流式细胞术检测抗体与HUVEC细胞表面抗原的结合

HUVEC细胞长至汇合度80～90%，胰酶消化并用PBS重悬，将细胞浓度调整至10⁶个/ml，取250μl已稀释好的细胞与250μl用2%FBS+PBS稀释的人源化抗体及嵌合抗体，4℃避光孵育1h，2%FBS+PBS洗两次，加入已稀释好的FITC标记的抗人IgG抗体250μl，4℃避光孵育1h，流式检测。

结果见图6。

实施例6 MTT检测抗体对HUVEC细胞增殖的促进作用

往96孔板中加入100μl已用碳酸盐缓冲液稀释至1μg/ml的rhDLL4，4℃包被过夜。次日，PBS洗两遍，往每孔中加入4000个人脐静脉内皮细胞，和不同浓度的抗体(20、5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.019μg/ml)，每个浓度3个复孔；同时准备一块没有包被rhDLL4的96孔板，往每孔中加入4000个人脐静脉内皮细胞，和上述不同浓度的抗体，每个浓度3个复孔。于37℃，5% CO2中培养72h，MTT法检测细胞的增殖。

结果见图7。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种抗人Delta-like 4人源化抗体及其制备与应用

<130> 2015

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

20 25 30

Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

35 40 45

Phe Ser Gly Tyr Trp Met Gln Trp Ile Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr

65 70 75 80

Thr Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr

85 90 95

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asn Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210> 2

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Glu Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser

20 25 30

Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser

35 40 45

Ile Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser

50 55 60

Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

100 105 110

Ser Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Val Asp Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile

145 150 155 160

Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser

165 170 175

Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser

180 185 190

Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln

195 200 205

Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser

210 215 220

Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

225 230 235

<210> 3

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Ile Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Gly Asn Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Glu Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 1404

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggaaaccg atacactgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcctgg gtcaactggt 60

caggtccagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 120

tcctgcaagg cttctggata caccttcagc ggctactgga tgcagtggat aaaacaggcc 180

cctggacaag ggcttgagtg gattggagct atttatcctg gagatggtga tactaggtac 240

actcagaagt tcaagggcag agccacgttg accgcggaca aatccacgag cacagcctac 300

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc ggggggtaac 360

ttcttctttg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcctcagc tagcgcctcc 420

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 720

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1140

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380

agcctctccc tgtctccggg taaa 1404

<210> 6

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggaaaccg atacactgct gctgtgggtc ctgctgctgt gggtccccgg atctactggt 60

gaaattgtga tcactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 120

atcacctgca gtgtcagctc aagtataagt tccagctact tgcactggta ccagcagaaa 180

ccagatcagt ctccaaagcc ctggatctat ggcacatcca acctggcttc tggggtcccc 240

tcgaggttca gtggcagtgg atctgggaca gattacaccc tcaccatcaa tagcctggaa 300

gctgaagatg ctgcaacgta ttactgtcaa cagtggagta gttccccgct cacgtttggc 360

caggggacca agctggagat caaagtcgac ggccagccca aggccgcccc ctccgtgacc 420

ctgttccccc cctcctccga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc 480

tccgacttct accccggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgactcctc ccccgtgaag 540

gccggcgtgg agaccaccac cccctccaag cagtccaaca acaagtacgc cgcctcctcc 600

tacctgtccc tgacccccga gcagtggaag tcccaccggt cctactcctg ccaggtgacc 660

cacgagggct ccaccgtgga gaagaccgtg gcccccaccg agtgctcc 708

<210> 7

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caggtccagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggata caccttcagc ggctactgga tgcagtggat aaaacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gattggagct atttatcctg gagatggtga tactaggtac 180

actcagaagt tcaagggcag agccacgttg accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc ggggggtaac 300

ttcttctttg actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcctca 348

<210> 8

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaaattgtga tcactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60

atcacctgca gtgtcagctc aagtataagt tccagctact tgcactggta ccagcagaaa 120

ccagatcagt ctccaaagcc ctggatctat ggcacatcca acctggcttc tggggtcccc 180

tcgaggttca gtggcagtgg atctgggaca gattacaccc tcaccatcaa tagcctggaa 240

gctgaagatg ctgcaacgta ttactgtcaa cagtggagta gttccccgct cacgtttggc 300

caggggacca agctggagat caaa 324

Claims

1.一种抗人Delta-like 4 人源化抗体，其特征在于其具有SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列的重链可变区和SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列的轻链可变区。

2.根据权利要求1所述的一种抗人Delta-like 4 人源化抗体，其特征在于：其具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列的重链和SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列的轻链。

3.一种分离的核酸分子，其特征在于编码要求1或2所述的抗人Delta-like 4 人源化抗体，其中：重链由SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列编码，轻链由SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列编码；重链可变区由SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列编码，轻链可变区由SEQ IDNO:8所示的核苷酸序列编码。

4.一种表达载体，含有权利要求3所述核酸分子。

5.一种重组CHO-s宿主细胞，其特征在于含有权利要求4所述的表达载体。

6.根据权利要求1所述一种抗人Delta-like 4 人源化抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。