CN109475627A - 抗体混合物 - Google Patents

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Abstract

本文描述了任选由宿主细胞系产生的抗体和抗体混合物，编码所述抗体和抗体混合物的核酸，含有这种核酸的宿主细胞，以及使用所述抗体、抗体混合物或编码所述抗体或抗体混合物的核酸进行治疗的方法。还描述了在宿主细胞中产生抗体混合物的方法。

Description

抗体混合物
技术领域
本文所述的组合物和方法属于重组抗体及其制备方法的领域。
背景技术
在过去的20年里，重组单克隆抗体已经成为一类非常成功的治疗多种不同疾病的生物药物。它们已经在有和没有共施用小分子类药物的情况下使用。由于一些疾病的生物学复杂性，靶向多于一种抗原或表位的抗体混合物或双特异性抗体在治疗某些病症方面比单一抗体更有效。参见例如Lindzen等人，(2010),Proc.Natl.Acad.Sci.107(28):12550-12563；Nagorsen和Baeuerle(2011),Exp.CellRes.317(9):1255-60。
抗体混合物允许灵活地给药两种不同的结合实体。对于IgG双特异性抗体来说情况并非如此，因为两种结合实体中的每一种都以相同的量存在，这是由于所述结合实体是同一分子的组成部分。在治疗方案中需要不同剂量的每种结合实体的情况下，这可能不是最佳的。参见例如Wolchok等人，(2013),NewEngl.J.Med.369(2):122-133。类似地，两种结合实体将在双特异性抗体中具有相同的体内半衰期，这在一些情况下可能不是最佳的。包括两种或更多种单独抗体的混合物的治疗剂可允许施用不同剂量的包含两种不同结合实体的抗体，并且所述抗体可具有不同的药代动力学性质。
重组抗体混合物的制备可以经由从各个宿主细胞系单独制备每种抗体并在制备后混合多种抗体来完成。通过混合和共培养表达不同抗体的宿主细胞进行的单批次多种抗体制备提供了这种方法的较低成本的替代方案。Rasmussen等人(2012),Arch BiochemBiophys.526:139-45。需要使用单一过程制备两种或更多种抗体的其它简单且相对便宜的制备方法。
发明内容
本文所述的组合物和方法在下面以一系列编号的项目描述。
1.一种包含两种主要抗体种类的抗体混合物，其包括：
(a)第一抗体，所述第一抗体包含具有相同氨基酸序列的第一重链(HC1)的两个拷贝和具有相同氨基酸序列的第一轻链(LC1)的两个拷贝，以及
(b)第二抗体，所述第二抗体包含两个具有相同氨基酸序列第二重链(HC2)的的拷贝和具有相同氨基酸序列的第二轻链(LC2)的两个拷贝，
其中所述第一和第二抗体是全长灵长类IgG抗体，
其中所述HC1和所述HC2具有不同的氨基酸序列，
其中所述LC1和所述LC2具有不同的氨基酸序列，
其中所述混合物包含不超过三种不同主要种类的全长抗体，并且
其中所述混合物是由已经引入了编码HC1、HC2、LC1和LC2的DNA的单一宿主细胞系产生的。
2.根据项目1所述的混合物，其中所述HC1和HC2是人IgG HC，其中它们中的每一者为以下同种型中的任一种：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
3.根据项目1或2所述的混合物，其中
所述HC1和/或HC2含有至少一个LC配偶体定向改变，并且
所述LC1和/或LC2在分别与所述HC1和/或HC2中发生所述LC配偶体定向改变的所述氨基酸接触或者分别与所述HC1和/或HC2中存在的带电氨基酸或半胱氨酸接触的氨基酸处含有至少一个HC配偶体定向改变。
4.根据项目3所述的混合物，
其中所述HC1和/或HC2在重链(HC)残基处包含至少一个LC配偶体定向改变，其中所述LC配偶体定向改变导致所述HC1和HC2在所述HC1和HC2氨基酸序列两者中的相同HC残基处包含带电氨基酸，其中所述HC1中的所述HC残基处的所述带电氨基酸与所述HC2中的所述HC残基处的所述带电氨基酸电荷相反，并且
其中所述LC1和/或LC2在与所述HC残基接触的轻链(LC)残基处包含至少一个HC配偶体定向改变，其中所述HC配偶体定向改变导致所述LC1和LC2在所述LC1和LC2氨基酸序列两者中的相同LC残基处包含带电氨基酸，其中所述LC1中的所述LC残基处的所述带电氨基酸与所述LC2中的所述LC残基处的带电氨基酸电荷相反，并且所述LC1中的所述LC残基处的所述带电氨基酸与所述HC1中的所述HC残基处的所述氨基电荷相反。
5.根据项目3或4所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(a)所述组的改变，其中所述HC1和HC2两者中的位置44和105以及所述LC1和LC2两者中的位置43和100各自由带电氨基酸占据，所述HC1中的位置44和105处的氨基酸与所述HC2中的相同位点处的氨基酸各自电荷相反，所述LC1中的位置43和100处的氨基酸与所述LC2中的相同位点处的氨基酸各自电荷相反，所述HC1和HC2中的位置44处的氨基酸分别与所述LC1和LC2中的位置100处的氨基酸电荷相反，并且所述HC1和HC2中的位置105处的氨基酸分别与所述LC1和LC2中的位置43处的氨基酸电荷相反；
(b)所述组的改变，其中所述HC1和HC2中的位置147和所述LC1和LC2中的位置131各自由带电氨基酸占据，所述HC1中的位置147处的氨基酸与所述HC2中的位置147处的氨基酸电荷相反，所述LC1中的位置131处的氨基酸与所述LC2中的位置131处的氨基酸电荷相反，并且所述HC1和HC2中的位置147处的氨基酸分别与所述LC1和LC2中的位置131处的氨基酸电荷相反；
(c)所述组的改变，其中所述HC1和HC2中的位置168和所述LC1和LC2中的位置174各自由带电氨基酸占据，所述HC1中的位置168处的氨基酸与所述HC2中的位置168处的氨基酸电荷相反，所述LC1中的位置174处的氨基酸与所述LC2中的位置174处的氨基酸电荷相反，并且所述HC1和HC2中的位置168处的氨基酸分别与所述LC1和LC2中的位置174处的氨基酸电荷相反；并且
(d)所述组的改变，其中所述HC1和HC2中的位置181和所述LC1和LC2中的位置178各自由带电氨基酸占据，所述HC1中的位置181处的氨基酸与所述HC2中的位置181处的氨基酸电荷相反，所述LC1中的位置178处的氨基酸与所述LC2中的位置178处的氨基酸电荷相反，并且所述HC1和HC2中的位置181处的氨基酸分别与所述LC1和LC2中的位置178处的氨基酸电荷相反。
6.根据项目1至5中任一项所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(a)所述组的改变，其中所述HC1包含44E/D，所述LC1包含100R/K，所述HC2包含44R/K，并且所述LC2包含100D/E；或者所述HC2包含44E/D，所述LC2包含100R/K，所述HC1包含44R/K，并且所述LC1包含100D/E；
(b)所述组的改变，其中所述HC1包含105E/D，所述LC1包含43R/K，所述HC2包含105R/K，并且所述LC2包含43D/E；或者所述HC2包含105E/D，所述LC2包含43R/K，所述HC1包含105R/K，并且所述LC1包含43D/E；
(c)所述组的改变，其中所述HC1包含147R/K，所述LC1包含131E/D，所述HC2包含147E/D，并且所述LC2包含131R/K；或者所述HC2包含147R/K，所述LC2包含131E/D，所述HC1包含147E/D，并且所述LC1包含131R/K；
(d)所述组的改变，其中所述HC1包含168E/D，所述LC1包含174R/K，所述HC2包含168R/K，并且所述LC2包含174D/E；或者所述HC2包含168E/D，所述LC2包含174R/K，所述HC1包含168R/K，并且所述LC1包含174D/E；并且
(e)所述组的改变，其中所述HC1包含181E/D，所述LC1包含178R/K，所述HC2包含181R/K，并且所述LC2包含178D/E；或者所述HC2包含181E/D，所述LC2包含178R/K，所述HC1包含181R/K，并且所述LC1包含178D/E。
7.根据项目6所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(a)所述组的改变，其中所述HC1包含44D和105R，所述LC1包含43D和100R，所述HC2包含44R和105D，并且所述LC2包含43R和100D；或者所述HC2包含44D和105R，所述LC2包含43D和100R，所述HC1包含44R和105D，并且所述LC1包含43R和100D；
(b)所述组的改变，其中所述HC1包含147R，所述LC1包含131D，所述HC2包含147D，并且所述LC2包含131R；或者所述HC2包含147R，所述LC2包含131D，所述HC1包含147D，并且所述LC1包含131R；
(c)所述组的改变，其中所述HC1包含168D，所述LC1包含174R，所述HC2包含168R，并且所述LC2包含174D；或者所述HC2包含168D，所述LC2包含174R，所述HC1包含168R，并且所述LC1包含174D；并且
(d)所述组的改变，其中所述HC1包含181D，所述LC1包含178R，所述HC2包含181R，并且所述LC2包含178D；或者所述HC2包含181D，所述LC2包含178R，所述HC1包含181R，并且所述LC1包含178D。
8.根据项目7所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(a)所述组的改变，其中所述HC1包含G44D和Q105R，所述LC1包含A/V43D和Q/G100R，所述HC2包含G44R和Q105D，并且所述LC2包含A/V43R和Q/G100D；或者所述HC2包含G44D和Q105R，所述LC2包含A/V43D和Q/G100R，所述HC1包含G44R和Q105D，并且所述LC1包含A/V43R和Q/G100D；
(b)所述组的改变，其中所述HC1包含K147R，所述LC1包含S131D，所述HC2包含K147D，并且所述LC2包含S131R；或者所述HC2包含K147R，所述LC2包含S131D，所述HC1包含K147D，并且所述LC1包含S131R；
(c)所述组的改变，其中所述HC1包含H168D，所述LC1包含S174R，所述HC2包含H168R，并且所述LC2包含S174D；或者所述HC2包含H168D，所述LC2包含S174R，所述HC1包含H168R，并且所述LC1包含S174D；并且
(d)所述组的改变，其中所述HC1包含S181D，所述LC1包含T178R，所述HC2包含S181R，并且所述LC2包含T178D；或者所述HC2包含S181D，所述LC2包含T178R，所述HC1包含S181R，并且所述LC1包含T178D。
9.根据项目1至8中任一项所述的混合物，其中所述第一和/或第二抗体包含选自由以下组成的组的一对或多对改变：
所述HC1中的126C和所述LC1中的121C，或所述HC2中的126C和所述LC2中的121C；
所述HC1中的126C和所述LC1中的124C，或所述HC2中的126C和所述LC2中的124C；
所述HC1中的127C和所述LC1中的121C，或所述HC2中的127C和所述LC2中的121C；
所述HC1中的128C和所述LC1中的118C，或所述HC2中的128C和所述LC2中的118C；
所述HC1中的133C和所述LC1中的117C，或所述HC2中的133C和所述LC2中的117C；
所述HC1中的133C和所述LC1中的209C，或所述HC2中的133C和所述LC2中的209C；
所述HC1中的134C和所述LC1中的116C，或所述HC2中的134C和所述LC2中的116C；
所述HC1中的141C和所述LC1中的116C，或所述HC2中的141C和所述LC2中的116C；
所述HC1中的168C和所述LC1中的174C，或所述HC2中的168C和所述LC2中的174C；
所述HC1中的170C和所述LC1中的162C，或所述HC2中的170C和所述LC2中的162C；
所述HC1中的170C和所述LC1中的176C，或所述HC2中的170C和所述LC2中的176C；
所述HC1中的173C和所述LC1中的160C，或所述HC2中的173C和所述LC2中的160C；
所述HC1中的173C和所述LC1中的162C，或所述HC2中的173C和所述LC2中的162C；并且
所述HC1中的183C和所述LC1中的176C，或所述HC2中的183C和所述LC2中的176C。
10.根据项目1至9中任一项所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(1)分别在所述HC1和HC2中的位置170和183以及分别在所述LC1和LC2中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和HC1中的位置170和183以及分别在所述LC2和LC1中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；
(2)分别在所述HC1和HC2中的位置173和170以及分别在所述LC1和LC2中的位置160和162各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和HC1中的位置173和170以及分别在所述LC2和LC1中的位置160和162各自被半胱氨酸取代；
(3)分别在所述HC1和HC2中的位置173和183以及分别在所述LC1和LC2中的位置160和176各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和HC1中的位置173和183以及分别在所述LC2和LC1中的位置160和176各自被半胱氨酸取代；
(4)在所述HC1和HC2中的位置170以及分别在所述LC1和LC2中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；或者所述HC2和HC1中的位置170以及分别在所述LC2和LC1中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；
(5)分别在所述HC1和HC2中的位置170和173以及分别在所述LC1和LC2中的位置162和160各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和HC1中的位置170和173以及分别在所述LC2和LC1中的位置162和160各自被半胱氨酸取代；
(6)分别在所述HC1和HC2中的位置173和170以及分别在所述LC1和LC2中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和HC1中的位置173和170以及分别在所述LC2和LC1中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；
(7)在所述HC1和HC2中的位置173以及分别在所述LC1和LC2中的位置162和160各自被半胱氨酸取代；或者所述HC2和HC1中的位置173以及分别在所述LC2和LC1中的位置162和160各自被半胱氨酸取代；
(8)分别在所述HC1和HC2中的位置183和173以及分别在所述LC1和LC2中的位置176和160各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和HC1中的位置183和173以及分别在所述LC2和LC1中的位置176和160各自被半胱氨酸取代；
(9)分别在所述HC1和HC2中的位置170和173以及分别在所述LC1和LC2中的位置176和160各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和HC1中的位置170和173以及分别在所述LC2和LC1中的位置176和160各自被半胱氨酸取代；并且
(10)分别在所述HC1和HC2中的位置170和183以及在所述LC1和LC2中的位置176各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和HC1中的位置170和183以及在所述LC2和LC1中的位置176各自被半胱氨酸取代。
11.根据项目1至10中任一项所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(1)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含S183C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含S183C，并且所述LC1包含S176C；
(2)所述HC1包含V173C，所述LC1包含Q160C，所述HC2包含F170C，并且所述LC2包含S162C；或者所述HC2包含V173C，所述LC2包含Q160C，所述HC1包含F170C，并且所述LC1包含S162C；
(3)所述HC1包含V173C，所述LC1包含Q160C，所述HC2包含S183C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含V173C，所述LC2包含Q160C，所述HC1包含S183C，并且所述LC1包含S176C；
(4)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含F170C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含F170C，并且所述LC1包含S176C；
(5)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含V173C，并且所述LC2包含Q160C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含V173C，并且所述LC1包含Q160C；
(6)所述HC1包含V173C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含F170C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含V173C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含F170C，并且所述LC1包含S176C；
(7)所述HC1包含V173C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含V173C，并且所述LC2包含Q160C；或者所述HC2包含V173C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含V173C，并且所述LC1包含Q160C；
(8)所述HC1包含S183C，所述LC1包含S176C，所述HC2包含V173C，并且所述LC2包含Q160C；或者所述HC2包含S183C，所述LC2包含S176C，所述HC1包含V173C，并且所述LC1包含Q160C；
(9)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S176C，所述HC2包含V173C，并且所述LC2包含Q160C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S176C，所述HC1包含V173C，并且所述LC1包含Q160C；并且
(10)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S176C，所述HC2包含S183C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S176C，所述HC1包含S183C，并且所述LC1包含S176C。
12.根据项目1至11中任一项所述的混合物，其包含三种主要抗体种类。
13.根据项目1至11中任一项所述的混合物，其包含不超过两种主要抗体种类。
14.根据项目13所述的混合物，
其中所述HC1和/或HC2含有一种或多种不利于异源二聚体的改变。
15.根据项目14所述的混合物，其中
(a)(1)所述HC1是IgG1HC，所述HC2是IgG4HC，所述HC1在位置399和409处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC2不含有不利于异源二聚体的改变；或者(2)所述HC2是IgG1HC，所述HC1是IgG4HC，所述HC2在位置399和409处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC1不含有不利于异源二聚体的改变；
(b)(1)所述HC1和HC2是IgG1HC，所述HC1在位置399和409处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC2包含改变K409R；或者(2)所述HC1和HC2是IgG1HC，所述HC2在位置399和409处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC1包含改变K409R；
(c)(1)所述HC1是IgG1HC，所述HC2是IgG4HC，并且所述HC1在位置390和400处包含不利于异源二聚体的改变；或者(2)所述HC1是IgG1HC，所述HC2是IgG4HC，并且所述HC2在位置390和400处包含不利于异源二聚体的改变；
(d)(1)所述HC1和HC2是IgG1HC，并且所述HC1在位置390和400处包含不利于异源二聚体的改变；或者(2)所述HC1和HC2是IgG1HC，并且所述HC2在位置390和400处包含不利于异源二聚体的改变；
(e)(1)所述HC1是IgG1HC，所述HC2是IgG4HC，所述HC1在位置364和370处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC2不含有不利于异源二聚体的改变；或者(2)所述HC2是IgG1HC，所述HC1是IgG4HC，所述HC2在位置364和370处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC1不含有不利于异源二聚体的改变；或者
(f)(1)所述HC1和HC2是IgG1HC，所述HC1在位置364和370处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC2包含改变K409R；或者(2)所述HC1和HC2是IgG1HC，所述HC2在位置364和370处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC1包含改变K409R。
16.根据项目15所述的混合物，其中
(a)(1)所述HC1是IgG1HC并且包含改变D399R/K和K409D/E，并且所述HC2是不含有不利于异源二聚体的改变的IgG4HC，或者(2)所述HC2是IgG1HC并且包含改变D399R/K和K409D/E，并且所述HC1是不含有不利于异源二聚体的改变的IgG4HC；
(b)所述HC1和HC2是IgG1HC，并且它们中的一者包含改变D399R/K和K409D/E，而另一者包含改变K409R；
(c)(1)所述HC1是包含改变N390R/K和S400D/E或改变N390D/E和S400R/K的IgG1HC，并且所述HC2是IgG4HC；或者(2)所述HC1是IgG1HC，并且所述HC2是包含改变N390R/K和S400D/E或改变N390D/E和S400R/K的IgG4HC；
(d)(1)所述HC1和HC2是IgG1HC，并且所述HC1包含改变N390R/K和S400D/E或改变N390D/E和S400R/K；或者(2)所述HC1和HC2是IgG1HC，并且所述HC2包含所述改变N390R/K和S400D/E或所述改变N390D/E和S400R/K；
(e)(1)所述HC1是IgG1HC，所述HC2是IgG4HC，所述HC1包含所述改变S364K/R和K370D/E，并且所述HC2不含有不利于异源二聚体的改变；或者(2)所述HC2是IgG1HC，所述HC1是IgG4HC，所述HC2包含改变S364K/R和K370D/E，并且所述HC1不含有不利于异源二聚体的改变；或者
(f)(1)所述HC1和HC2是IgG1HC，所述HC1包含改变S364K/R和K370D/E，并且所述HC2包含改变K409R；或者(2)所述HC1和HC2是IgG1HC，所述HC2包含改变S364K/R和K370D/E，并且所述HC1包含改变K409R。
17.根据项目1至16中任一项所述的混合物，其中如果所述HC1和/或HC2是IgG4HC，则所述IgG4HC包含所述改变S228P。
18.根据项目1至17中任一项所述的混合物，其中所述第一和第二抗体的体内半衰期相差至少一周。
19.根据项目18所述的混合物，其中所述第一和第二抗体的体内半衰期相差至少十天。
20.根据项目19所述的混合物，其中所述第一和第二抗体的体内半衰期相差至少两周。
21.根据项目18至20中任一项所述的混合物，其中具有较短体内半衰期的抗体含有改变M252A、M252L、M252S、M252R、R255K或H435R。
22.根据项目1至21中任一项所述的混合物，其中
所述HC1包含分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的CDR1、CDR2和CDR3，所述LC1包含分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQID NO:27的CDR1、CDR2和CDR3，所述HC2包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的CDR1、CDR2和CDR3，并且所述LC2包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:34、SEQID NO:35和SEQ ID NO:36的CDR1、CDR2和CDR3。
23.根据项目22所述的混合物，其中
所述HC1包含具有包含改变44D和105R的SEQ ID NO:20的氨基酸1-120的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，所述LC1包含具有包含改变43D和100R的SEQ ID NO:19的氨基酸1-107的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)，所述HC2包含具有包含改变44R和105D的SEQID NO:21的氨基酸1-119的氨基酸序列的VH，并且所述LC2包含具有包含改变43R和100D的SEQ ID NO:22的氨基酸1-107的氨基酸序列的VL。
24.根据项目1至23中任一项所述的混合物，其中
(a)所述第一和第二抗体中的一者与人CTLA4结合，并且另一者与人PD1结合，
(b)所述第一和第二抗体两者都与人HER2结合，但是它们不竞争与HER2结合，
(c)所述第一和第二抗体中的一者与人LAG3结合，并且另一者与人PD1结合，
(d)所述第一和第二抗体中的一者与人GITR结合，并且另一者与人PD1结合，
(d)所述第一和第二抗体中的一者与人VEGF结合，并且另一者与人PD1结合，
(f)所述第一和第二抗体中的一者与人CSFR1a结合，并且另一者与人PD1结合，
(g)所述第一和第二抗体中的一者与人OX40结合，并且另一者与人PD1结合，
(h)所述第一和第二抗体中的一者与人TIGIT结合，并且另一者与人PD1结合，
(i)所述第一和第二抗体中的一者与人CTLA4结合，并且另一者与人PDL1结合，
(j)所述第一和第二抗体中的一者与人VEGF结合，并且另一者与人PDL1结合，
(k)所述第一和第二抗体中的一者与人OX40结合，并且另一者与人PDL1结合，
(l)所述第一和第二抗体中的一者与人CSFR1a结合，并且另一者与人PDL1结合，
(m)所述第一和第二抗体中的一者与人TIGIT结合，并且另一者与人PDL1结合，
(n)所述第一和第二抗体中的一者与人Tim3结合，并且另一者与人PDL1结合，
(o)所述第一和第二抗体中的一者与人CTLA4结合，并且另一者与人VEGF结合，
(p)所述第一和第二抗体中的一者与人CTLA4结合，并且另一者与人41BB结合，
(q)所述第一和第二抗体中的一者与人CD20结合，并且另一者与人CD37结合，
(r)所述第一和第二抗体中的一者与人ANG2结合，并且另一者与人VEGF结合，
(s)所述第一和第二抗体中的一者与人TNF结合，并且另一者与人IL17a结合，
(t)所述第一和第二抗体中的一者与人CD38结合，并且另一者与人CD138结合，
(u)所述第一和第二抗体中的一者与人EGFR结合，并且另一者与人HER2结合，
(v)所述第一和第二抗体中的一者与人EGFR结合，并且另一者与人HER3结合，
(w)所述第一和第二抗体中的一者与人MET结合，并且另一者与人VEGF结合
(x)所述第一和第二抗体中的一者与人MET结合，并且另一者与人EGFR结合，
(y)所述第一和第二抗体中的一者与人TSLP结合，并且另一者与人IL33结合，或者
(z)所述第一和第二抗体中的一者与人IL4结合，并且另一者与人IL13结合，或者
(aa)所述第一和第二抗体中的一者与人PD1结合，并且另一者与人CD96结合。
25.一种全长抗体，其包含两个具有相同氨基酸序列的灵长类和/或人源化LC和两个具有相同氨基酸序列的灵长类和/或人源化IgG HC，
其中所述HC各自在位置181处包含带电氨基酸，
其中所述LC各自在位置178处包含带电氨基酸，并且
其中所述HC的位置181处的所述氨基酸的电荷与所述LC的位置178处的所述氨基酸的电荷相反。
26.一种制备根据项目1至24中任一项所述的抗体混合物的方法，其包括以下步骤：
(a)在培养基中培养表达所述抗体种类的宿主细胞系，以及
(b)从所述培养基中回收包含所述抗体种类的混合物。
27.根据项目26所述的方法，其中所述宿主细胞系是哺乳动物细胞系。
28.根据项目27所述的方法，其中所述宿主细胞系是CHO细胞系。
29.根据项目26至28中任一项所述的方法，其还包括从存在于所述培养基中的其它组分纯化所述混合物的步骤。
30.一种宿主细胞系，其产生根据项目1至24中任一项所述的抗体混合物。
31.根据项目30所述的宿主细胞系，其是哺乳动物细胞系。
32.根据项目31所述的宿主细胞，其是CHO细胞系。
33.一种核酸或核酸混合物，其编码根据项目1至25中任一项所述的抗体或抗体混合物。
34.一种或多种载体，其含有根据项目33所述的核酸或核酸混合物。
35.根据项目34所述的载体，所述载体中的每一个是哺乳动物表达载体。
36.根据项目34所述的载体，所述载体中的每一个是病毒载体。
37.根据项目36所述的载体，所述载体中的每一个是腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、改良安卡拉痘苗病毒(MVA)载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体或痘病毒载体。
38.一种治疗疾病的方法，其包括向患者施用根据项目1至24中任一项所述的混合物。
39.一种治疗癌症的方法，其包括向患者施用根据项目24(a)所述的混合物。
40.一种治疗乳腺癌的方法，其包括向患者施用根据项目24(b)所述的混合物。
41.根据项目40所述的方法，其中所述混合物包含三种主要抗体种类。
42.根据项目41所述的方法，其中所述混合物包含至多三种主要抗体种类。
43.一种治疗患有肿瘤的患者的方法，其包括将根据项目1至24中任一项所述的混合物注射到所述肿瘤中。
44.一种治疗患有肿瘤的患者的方法，其包括直接向所述肿瘤施用根据项目33所述的核酸或根据项目34至37中任一项所述的载体。
45.根据项目44所述的方法，其中将所述核酸或所述载体注射到所述肿瘤中。
46.一种包含两种主要抗体种类的抗体混合物，其包括：
(a)包含第一重链(HC1)和第一轻链(LC1)的第一抗体，以及
(b)包含第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)的第二抗体，
其中所述第一和第二抗体是全长灵长类和/或人源化IgG抗体，
其中所述第一抗体包含两条具有相同第一氨基酸序列的HC1链和两条具有相同第二氨基酸序列的LC1链，
其中所述第二抗体包含两条具有相同第三氨基酸序列的HC2链和两条具有相同第四氨基酸序列的LC2链，
其中所述HC1和所述HC2具有不同的氨基酸序列，
其中所述LC1和所述LC2具有不同的氨基酸序列，
其中所述混合物包含不超过十种不同主要种类的全长IgG抗体，并且
其中所述混合物已经由已引入了编码HC1、HC2、LC1和LC2的DNA的宿主细胞系产生。
47.根据项目46所述的混合物，其中所述混合物包含不超过三种不同主要种类的全长抗体。
48.根据项目47所述的混合物，其中同时引入编码所述HC1、HC2、LC1和LC2的所述DNA。
49.根据项目47所述的混合物，其中
编码所述HC1和LC1的所述DNA在编码所述HC2和LC2的所述DNA之前被引入，或者
编码所述HC2和LC2的所述DNA在编码所述HC1和LC1的所述DNA之前被引入。
50.根据项目46至49中任一项所述的混合物，其中所述HC1和HC2是人和/或人源化IgG重链(HC)，并且所述LC1和LC2是人和/或人源化轻链(LC)。
51.根据项目46至50中任一项所述的混合物，其中
(a)所述第一和第二抗体两者均包含一个或多个配偶体定向改变；
(b)所述第一和第二抗体两者均包含一个或多个配偶体定向改变，并且所述第一和第二抗体中的至少一者包含至少一个不利于异源二聚体的改变；或者
(c)所述第一抗体包含一个或多个配偶体定向改变并且所述第二抗体不包含配偶体定向改变，或者反之亦然。
52.根据项目51(c)所述的混合物，其中所述第一抗体包含一个或多个不利于异源二聚体的改变并且所述第二抗体不包含不利于异源二聚体的改变，或者反之亦然。
53.根据项目52所述的混合物，其中
(1)所述第一抗体包含一个或多个配偶体定向改变和一个或多个不利于异源二聚体的改变并且所述第二抗体不包含配偶体定向改变或不利于异源二聚体的改变，或者
(2)所述第二抗体包含一个或多个配偶体定向改变和一个或多个不利于异源二聚体的改变并且所述第一抗体不包含配偶体定向改变或不利于异源二聚体的改变。
54.根据项目46至51中任一项所述的混合物，其包含三种主要抗体种类。
55.根据项目46至51中任一项所述的混合物，其包含不超过两种主要抗体种类。
56.根据项目55所述的混合物，其中所述HC1和/或所述HC2含有一种或多种不利于异二聚体的改变。
57.根据项目46至56中任一项所述的混合物，其中
(a)(1)所述HC1是IgG1或IgG2重链(HC)，所述HC2是IgG4HC，所述HC1在位置399和409处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC2不含有不利于异源二聚体的改变；或者(2)所述HC2是IgG1或IgG2HC，所述HC1是IgG4HC，所述HC2在位置399和409处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC1不包含不利于异源二聚体的改变；或者
(b)(1)所述HC1和HC2各自是IgG1或IgG2HC，所述HC1在位置399和409处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC2包含改变K409R；或者(2)所述HC1和HC2各自是IgG1或IgG2HC，所述HC2在位置399和409处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC1包含所述改变K409R。
58.根据项目57所述的混合物，其中
(a)(1)所述HC1是IgG1或IgG2HC并且包含改变D399R/K和K409D/E，并且所述HC2是IgG4HC并且不包含不利于异源二聚体的改变，或者(2)所述HC2是IgG1或IgG2HC并且包含改变D399R/K和K409D/E，并且所述HC1是IgG4HC并且不包含不利于异源二聚体的改变；或者
(b)所述HC1和HC2各自是IgG1或IgG2HC，并且它们中的一者包含改变D399R/K和K409D/E，而另一者包含改变K409R。
59.根据项目46至51和54至56中任一项所述的混合物，其中所述第一抗体包含至少一个不利于异二聚体的改变，并且所述第二抗体不含有不利于异源二聚体的改变，或反之亦然。
60.根据项目46至59中任一项所述的混合物，其中
(a)所述第一抗体包含至少一个配偶体定向改变并且所述第二抗体不包含配偶体定向改变；并且
(b)(1)所述第一抗体是人和/或人源化IgG1抗体，所述HC1中的位置220处的所述半胱氨酸被另一种氨基酸取代，并且所述LC1中的位置214处的所述半胱氨酸被另一种氨基酸取代，或者(2)所述第一抗体是人和/或人源化IgG2或IgG4抗体，所述HC1中的位置131处的所述半胱氨酸被另一种氨基酸取代，并且所述LC1中的位置214处的所述半胱氨酸被另一种氨基酸取代。
61.根据项目60所述的混合物，其中
所述第一抗体是IgG1抗体，并且其包含在所述HC1中的改变C220G/A和在所述LC1中的改变C214S/A/G；或者
所述第一抗体是IgG2或IgG4抗体，并且其包含在所述HC1中的改变C131S/A/G和在所述LC1中的改变C214S/A/G。
62.根据项目61所述的混合物，其中
所述第一抗体是IgG1抗体，并且其包含在所述HC1中的改变C220G和在所述LC1中的改变C214S；或者
所述第一抗体是IgG2或IgG4抗体，其包含在所述HC1中的改变C131S和在所述LC1中的改变C214S。
63.根据项目60至62中任一项所述的混合物，
其中所述第一抗体是IgG1抗体；
其中所述第一抗体在第一对氨基酸位置处包含至少一对半胱氨酸取代；
其中所述第一对氨基酸位置包括第一HC1位置和第一LC1位置；并且
其中所述第一HC1和LC1位置分别选自由以下组成的组：位置126和124；位置128和118；位置133和117；位置133和209；位置134和116；位置168和174；位置170和162；位置170和176；位置173和160；以及位置183和176。
64.根据项目63所述的混合物，
其中所述第一HC1和LC1位置分别选自由以下组成的组：位置168和174；位置173和160；以及位置170和162。
65.根据项目64所述的混合物，其中
所述第一抗体包含在第二对位置处的第二对半胱氨酸取代，所述第二对位置包括第二HC1和第二LC1位置，所述第二HC1和第二LC1位置分别不同于所述第一HC1和第一LC1位置，并且
所述第二HC1和LC1位置分别选自由以下组成的组：位置126和124；位置128和118；位置133和117；位置133和209；位置134和116；位置168和174；位置170和162；位置170和176；位置173和160；以及位置183和176。
66.根据项目65所述的混合物，其中所述第一HC1和LC1位置分别为173和160，并且所述第二HC1和LC1位置分别为170和162。
67.根据项目60至62中任一项所述的混合物，
其中所述第一抗体是IgG4抗体；
其中所述第一抗体在第一对氨基酸位置处包含至少一对半胱氨酸取代；
其中所述第一对氨基酸位置包括第一HC1位置和第一LC1位置；并且
其中所述第一HC1和LC1位置分别选自由以下组成的组：位置126和121；位置126和124；位置127和121；位置128和118；位置168和174；位置170和162；以及位置173和162。
68.根据项目67所述的混合物，其中
所述第一抗体在第二HC1位置和第二LC1位置处包含第二对半胱氨酸取代，所述第二HC1位置和第二LC1位置分别不同于所述第一HC1和LC1位置，并且
所述第二HC1和LC1位置分别选自由以下组成的组：位置126和121；位置126和124；位置127和121；位置128和118；位置168和174；位置170和162；以及位置173和162。
69.根据项目60至62中任一项所述的混合物，
其中所述第一抗体是IgG2抗体；
其中所述第一抗体在第一对接触氨基酸位置处包含至少一对半胱氨酸取代，其中一个位置在所述HC1中并且另一个位置在所述LC1中。
70.根据项目69所述的混合物，其中所述HC1和LC1中的所述第一对接触氨基酸位置分别选自由以下组成的组：170和162；以及173和160。
71.根据项目69或70所述的混合物，其中所述第一抗体在第二对接触氨基酸位置处包含第二对半胱氨酸取代，其中所述第二对接触氨基酸位置中的一个位置是HC1位置而另一个位置是LC1位置，并且其中所述第二对接触氨基酸位置中的所述HC1和LC1位置各自分别与所述第一对接触氨基酸位置中的所述HC1和LC1位置不同。
72.根据项目71所述的混合物，其中所述HC1和LC1中的所述第二对接触氨基酸位置分别选自由以下组成的组：170和162；以及173和160。
73.根据项目46至72中任一项所述的混合物，其中所述第一抗体包含至少一个配偶体定向改变，其中带电氨基酸取代另一种氨基酸。
74.根据项目73所述的混合物，
其中所述第一抗体是IgG1抗体，
其中所述第一抗体包含氨基酸的电荷对，
其中所述电荷对中的一个氨基酸在所述HC1中，并且所述电荷对中的一个氨基酸在所述LC1中，
其中所述电荷对中的至少一个氨基酸由所述配偶体定向改变造成；并且
其中所述电荷对由分别在所述HC1和LC1中的以下位置处的以下氨基酸对中的一个组成：147D/E和124K/R；147D/E和129K/R；147D/E和131K/R；147D/E和180K/R；168D/E和164K/R；168D/E和167K/R；或者168D/E和174K/R。
75.根据项目73所述的混合物，
其中所述第一抗体是IgG4抗体，
其中所述第一抗体包含氨基酸的电荷对，
其中所述电荷对中的一个氨基酸在所述HC1中，并且所述电荷对中的一个氨基酸在所述LC1中，
其中所述电荷对中的至少一个氨基酸由所述配偶体定向改变造成；并且
其中所述电荷对由分别在所述HC1和LC1中的以下位置处的以下氨基酸对中的一个组成：133D/E和117K/R；137K/R和114D/E；137K/R和116D/E；147D/E和124K/R；147D/E和129K/R；147D/E和131K/R；147D/E和178K/R；147D/E和180K/R；168D/E和164K/R；168D/E和167K/R；168D/E和173K/R；或者168D/E和174K/R。
76.根据项目73所述的混合物，
其中所述第一抗体是IgG2抗体，
其中所述第一抗体包含氨基酸的电荷对，
其中所述电荷对中的一个氨基酸在所述HC1中，并且所述电荷对中的一个氨基酸在所述LC1中，
其中所述电荷对中的至少一个氨基酸由所述配偶体定向改变造成。
77.根据项目76所述的混合物，其中所述电荷对由所述HC1中的147D/E和所述LC1中的131K/R组成。
78.根据项目46至59中任一项所述的混合物，其中
所述HC1和/或所述HC2在HC残基处含有至少一个LC配偶体定向改变，并且
所述LC1和/或所述LC2在分别与HC1和/或HC2中发生所述LC配偶体定向改变的所述HC残基接触或分别与所述HC1和/或所述HC2中存在的带电氨基酸或半胱氨酸接触的LC残基处含有至少一个HC配偶体定向改变。
79.根据项目78所述的混合物，其中
所述LC配偶体定向改变导致所述HC1和所述HC2在所述HC1和所述HC2两者中的所述HC残基处包含带电氨基酸，
所述HC1中的所述HC残基处的所述带电氨基酸与所述HC2中的所述HC残基处的所述带电氨基酸电荷相反，
所述HC配偶体定向改变导致所述LC1和所述LC2在所述LC1和所述LC2两者中的所述LC残基处包含带电氨基酸，
所述LC1中的所述LC残基处的所述带电氨基酸与所述LC2中的所述LC残基处的所述带电氨基酸电荷相反，并且
所述LC1中的所述LC残基处的所述带电氨基酸与所述HC1中的所述HC残基处的所述氨基酸电荷相反。
80.根据项目78或79所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(a)所述组的改变，其中所述HC1和所述HC2两者中的位置44和105以及所述LC1和所述LC2两者中的位置43和100各自由带电氨基酸占据，所述HC1中的位置44和105处的氨基酸与所述HC2中的相同位点处的氨基酸各自电荷相反，所述LC1中的位置43和100处的氨基酸与所述LC2中的相同位点处的氨基酸各自电荷相反，所述HC1和所述HC2中的位置44处的氨基酸分别与所述LC1和所述LC2中的位置100处的氨基酸电荷相反，并且所述HC1和所述HC2中的位置105处的氨基酸分别与所述LC1和所述LC2中的位置43处的氨基酸电荷相反；
(b)所述组的改变，其中所述HC1和所述HC2中的位置147和所述LC1和所述LC2中的位置131各自由带电氨基酸占据，所述HC1中的位置147处的氨基酸与所述HC2中的位置147处的氨基酸电荷相反，所述LC1中的位置131处的氨基酸与所述LC2中的位置131处的氨基酸电荷相反，并且所述HC1和所述HC2中的位置147处的氨基酸分别与所述LC1和所述LC2中的位置131处的氨基酸电荷相反；
(c)所述组的改变，其中所述HC1和所述HC2中的位置168和所述LC1和所述LC2中的位置174各自由带电氨基酸占据，所述HC1中的位置168处的氨基酸与所述HC2中的位置168处的氨基酸电荷相反，所述LC1中的位置174处的氨基酸与所述LC2中的位置174处的氨基酸电荷相反，并且所述HC1和所述HC2中的位置168处的氨基酸分别与所述LC1和所述LC2中的位置174处的氨基酸电荷相反；并且
(d)所述组的改变，其中所述HC1和所述HC2中的位置181和所述LC1和所述LC2中的位置178或180各自由带电氨基酸占据，所述HC1中的位置181处的氨基酸与所述HC2中的位置181处的氨基酸电荷相反，所述LC1中的位置178或180处的氨基酸与所述LC2中的位置178或180处的氨基酸电荷相反，并且所述HC1和所述HC2中的位置181处的氨基酸分别与所述LC1和所述LC2中的位置178或180处的氨基酸电荷相反。
81.根据项目78至80中任一项所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(a)所述组的改变，其中所述HC1包含44E/D，所述LC1包含100R/K，所述HC2包含44R/K，并且所述LC2包含100D/E；或者所述HC2包含44E/D，所述LC2包含100R/K，所述HC1包含44R/K，并且所述LC1包含100D/E；
(b)所述组的改变，其中所述HC1包含105E/D，所述LC1包含43R/K，所述HC2包含105R/K，并且所述LC2包含43D/E；或者所述HC2包含105E/D，所述LC2包含43R/K，所述HC1包含105R/K，并且所述LC1包含43D/E；
(c)所述组的改变，其中所述HC1包含147R/K，所述LC1包含131E/D，所述HC2包含147E/D，并且所述LC2包含131R/K；或者所述HC2包含147R/K，所述LC2包含131E/D，所述HC1包含147E/D，并且所述LC1包含131R/K；
(d)所述组的改变，其中所述HC1包含168E/D，所述LC1包含174R/K，所述HC2包含168R/K，并且所述LC2包含174D/E；或者所述HC2包含168E/D，所述LC2包含174R/K，所述HC1包含168R/K，并且所述LC1包含174D/E；并且
(e)所述组的改变，其中所述HC1包含181E/D，所述LC1包含178R/K或180R/K，所述HC2包含181R/K，并且所述LC2包含178D/E或180D/E；或者所述HC2包含181E/D，所述LC2包含178R/K或180R/K，所述HC1包含181R/K，并且所述LC1包含178D/E或180D/E。
82.根据项目81所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(a)所述组的改变，其中所述HC1包含44D和105R，所述LC1包含43D和100R，所述HC2包含44R和105D，并且所述LC2包含43R和100D；或者所述HC2包含44D和105R，所述LC2包含43D和100R，所述HC1包含44R和105D，并且所述LC1包含43R和100D；
(b)所述组的改变，其中所述HC1包含147R，所述LC1包含131D，所述HC2包含147D，并且所述LC2包含131R；或者所述HC2包含147R，所述LC2包含131D，所述HC1包含147D，并且所述LC1包含131R；
(c)所述组的改变，其中所述HC1包含168D，所述LC1包含174R，所述HC2包含168R，并且所述LC2包含174D；或者所述HC2包含168D，所述LC2包含174R，所述HC1包含168R，并且所述LC1包含174D；并且
(d)所述组的改变，其中所述HC1包含181D，所述LC1包含178R或180R，所述HC2包含181R，并且所述LC2包含178D或180D；或者所述HC2包含181D，所述LC2包含178R或180R，所述HC1包含181R，并且所述LC1包含178D或178D。
83.根据项目82所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(a)所述组的改变，其中所述HC1包含G44D和Q105R，所述LC1包含A/V43D和Q/G100R，所述HC2包含G44R和Q105D，并且所述LC2包含A/V43R和Q/G100D；或者所述HC2包含G44D和Q105R，所述LC2包含A/V43D和Q/G100R，所述HC1包含G44R和Q105D，并且所述LC1包含A/V43R和Q/G100D。
(b)所述组的改变，其中所述HC1包含K147R，所述LC1包含S131D，所述HC2包含K147D，并且所述LC2包含S131R；或者所述HC2包含K147R，所述LC2包含S131D，所述HC1包含K147D，并且所述LC1包含S131R；
(c)所述组的改变，其中所述HC1包含H168D，所述LC1包含S174R，所述HC2包含H168R，并且所述LC2包含S174D；或者所述HC2包含H168D，所述LC2包含S174R，所述HC1包含H168R，并且所述LC1包含S174D；并且
(d)所述组的改变，其中所述HC1包含S181D，所述LC1包含T/Y178R或T/S180R，所述HC2包含S181R，并且所述LC2包含T/Y178D或T/S180D；或者所述HC2包含S181D，所述LC2包含T/Y178R或T/S180R，所述HC1包含S181R，并且所述LC1包含T/Y178D或T/S180D。
84.根据项目78至83中任一项所述的混合物，
其中所述第一和/或第二抗体在一对或多对位置处包含一对或多对半胱氨酸取代；
其中每对位置包括一个HC位置和一个LC位置；
其中所述对位置中的所述HC和LC位置分别选自由以下组成的组：126和121；126和124；127和121；128和118；133和117；133和209；134和116；141和116；168和174；170和162；170和176；173和160；173和162；以及183和176；并且
其中所述第一和第二抗体在所述相同对位置处不包含半胱氨酸取代。
85.根据项目84所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(1)分别在所述HC1和所述HC2中的位置170和183以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置170和183以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；
(2)分别在所述HC1和所述HC2中的位置173和170以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置160和162各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置173和170以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置160和162各自被半胱氨酸取代；
(3)分别在所述HC1和所述HC2中的位置173和183以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置160和176各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置173和183以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置160和176各自被半胱氨酸取代；
(4)在所述HC1和所述HC2中的位置170以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；或者所述HC2和所述HC1中的位置170以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；
(5)分别在所述HC1和所述HC2中的位置170和173以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置162和160各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置170和173以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置162和160各自被半胱氨酸取代；
(6)分别在所述HC1和所述HC2中的位置173和170以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置173和170以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；
(7)在所述HC1和所述HC2中的位置173以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置162和160各自被半胱氨酸取代；或者所述HC2和所述HC1中的位置173以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置162和160各自被半胱氨酸取代；
(8)分别在所述HC1和所述HC2中的位置183和173以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置176和160各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置183和173以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置176和160各自被半胱氨酸取代；
(9)分别在所述HC1和所述HC2中的位置170和173以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置176和160各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置170和173以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置176和160各自被半胱氨酸取代；
(10)分别在所述HC1和所述HC2中的位置170和183以及在所述LC1和所述LC2中的位置176各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置170和183以及在所述LC2和所述LC1中的位置176各自被半胱氨酸取代；并且
(11)分别在所述HC1和所述HC2中的位置173和170以及在所述LC1和所述LC2两者中的位置162各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置173和170以及在所述LC2和所述LC1两者中的位置162各自被半胱氨酸取代。
86.根据项目85所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(1)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含S183C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含S183C，并且所述LC1包含S176C；
(2)所述HC1包含V173C，所述LC1包含Q160C，所述HC2包含F170C，并且所述LC2包含S162C；或者所述HC2包含V173C，所述LC2包含Q160C，所述HC1包含F170C，并且所述LC1包含S162C；
(3)所述HC1包含V173C，所述LC1包含Q160C，所述HC2包含S183C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含V173C，所述LC2包含Q160C，所述HC1包含S183C，并且所述LC1包含S176C；
(4)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含F170C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含F170C，并且所述LC1包含S176C；
(5)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含V173C，并且所述LC2包含Q160C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含V173C，并且所述LC1包含Q160C；
(6)所述HC1包含V173C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含F170C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含V173C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含F170C，并且所述LC1包含S176C；
(7)所述HC1包含V173C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含V173C，并且所述LC2包含Q160C；或者所述HC2包含V173C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含V173C，并且所述LC1包含Q160C；
(8)所述HC1包含S183C，所述LC1包含S176C，所述HC2包含V173C，并且所述LC2包含Q160C；或者所述HC2包含S183C，所述LC2包含S176C，所述HC1包含V173C，并且所述LC1包含Q/E160C；
(9)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S176C，所述HC2包含V173C，并且所述LC2包含Q160C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S176C，所述HC1包含V173C，并且所述LC1包含Q160C；
(10)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S176C，所述HC2包含S183C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S176C，所述HC1包含S183C，并且所述LC1包含S176C；并且
(11)所述HC1包含V173C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含F170C，并且所述LC2包含S162C；或者所述HC2包含V173C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含F170C，并且所述LC1包含S162C。
87.根据项目46至86中任一项所述的混合物，其中如果所述HC1和/或所述HC2是IgG4HC，则所述IgG4HC包含228P。
88.根据项目46至87中任一项所述的混合物，其中所述第一和第二抗体的体内半衰期相差至少一周。
89.根据项目88所述的混合物，其中所述第一和第二抗体的体内半衰期相差至少十天。
90.根据项目89所述的混合物，其中所述第一和第二抗体的体内半衰期相差至少两周。
91.根据项目88至90中任一项所述的混合物，其中所述具有较短体内半衰期的抗体包含以下改变中的至少一种：M252A、M252L、M252S、M252R、R255K或H435R。
92.根据项目46至59和78至91中任一项所述的混合物，其中
所述HC1包含分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的CDR1、CDR2和CDR3，所述LC1包含分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQID NO:27的CDR1、CDR2和CDR3，所述HC2包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的CDR1、CDR2和CDR3，并且所述LC2包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:34、SEQID NO:35和SEQ ID NO:36的CDR1、CDR2和CDR3。
93.根据项目46至91中任一项所述的混合物，其中
(a)所述第一和第二抗体中的一者与人CTLA4结合，并且另一者与人PD1结合，
(b)所述第一和第二抗体两者都与人HER2结合，但是它们不竞争与HER2结合，
(c)所述第一和第二抗体中的一者与人LAG3结合，并且另一者与人PD1结合，
(d)所述第一和第二抗体中的一者与人GITR结合，并且另一者与人PD1结合，
(d)所述第一和第二抗体中的一者与人VEGF结合，并且另一者与人PD1结合，
(f)所述第一和第二抗体中的一者与人CSFR1a结合，并且另一者与人PD1结合，
(g)所述第一和第二抗体中的一者与人OX40结合，并且另一者与人PD1结合，
(h)所述第一和第二抗体中的一者与人TIGIT结合，并且另一者与人PD1结合，
(i)所述第一和第二抗体中的一者与人CTLA4结合，并且另一者与人PDL1结合，
(j)所述第一和第二抗体中的一者与人VEGF结合，并且另一者与人PDL1结合，
(k)所述第一和第二抗体中的一者与人OX40结合，并且另一者与人PDL1结合，
(l)所述第一和第二抗体中的一者与人CSFR1a结合，并且另一者与人PDL1结合，
(m)所述第一和第二抗体中的一者与人TIGIT结合，并且另一者与人PDL1结合，
(n)所述第一和第二抗体中的一者与人Tim3结合，并且另一者与人PDL1结合，
(o)所述第一和第二抗体中的一者与人CTLA4结合，并且另一者与人VEGF结合，
(p)所述第一和第二抗体中的一者与人CTLA4结合，并且另一者与人41BB结合，
(q)所述第一和第二抗体中的一者与人CD20结合，并且另一者与人CD37结合，
(r)所述第一和第二抗体中的一者与人ANG2结合，并且另一者与人VEGF结合，
(s)所述第一和第二抗体中的一者与人TNF结合，并且另一者与人IL17a结合，
(t)所述第一和第二抗体中的一者与人CD38结合，并且另一者与人CD138结合，
(u)所述第一和第二抗体中的一者与人EGFR结合，并且另一者与人HER2结合，
(v)所述第一和第二抗体中的一者与人EGFR结合，并且另一者与人HER3结合，
(w)所述第一和第二抗体中的一者与人MET结合，并且另一者与人VEGF结合
(x)所述第一和第二抗体中的一者与人MET结合，并且另一者与人EGFR结合，
(y)所述第一和第二抗体中的一者与人TSLP结合，并且另一者与人IL33结合，
(z)所述第一和第二抗体中的一者与人IL4结合，并且另一者与人IL13结合，
(aa)所述第一和第二抗体中的一者与人PD1结合，并且另一者与人CD96结合，
(bb)所述第一和第二抗体中的一者与人PD1结合，并且另一者与人SIRP-α结合，或者
(cc)所述第一和第二抗体中的一者与人PD1结合，并且另一者与人CCR8结合。
94.一种包含灵长类或人源化IgG CH1结构域和灵长类或人源化CL结构域的抗体，
其中所述CH1和CL结构域包含氨基酸的电荷对，
其中所述电荷对中的一个氨基酸在所述CH1结构域中，而另一个氨基酸在所述CL结构域中，并且
其中
(1)所述CH1结构域是IgG1CH1结构域，并且所述电荷对的所述氨基酸的所述HC和LC位置分别选自由以下组成的组：181和178；以及168和174；或者
(2)所述CH1结构域是IgG4CH1结构域，并且所述电荷对的所述氨基酸的所述HC和LC位置分别选自由以下组成的组：181和180；以及168和174。
95.一种包含灵长类或人源化IgG1CH1结构域和灵长类或人源化κCL结构域的抗体，
其中所述CH1和CL结构域包含一对接触半胱氨酸残基，
其中所述对中的一个半胱氨酸位于所述CH1结构域中，而另一个半胱氨酸位于所述CL结构域中，并且
其中所述半胱氨酸对的所述CH1和CL位置分别选自由以下组成的组：(1)168和174；(2)133和117；(3)173和160；(4)170和162；(5)170和176；(6)126和124；(7)128和118；以及(8)134和116。
96.根据项目95所述的抗体，其中所述抗体包含用其它氨基酸对所述CH1结构域中的位置220处和所述CL结构域中的位置214处的所述半胱氨酸的取代。
97.一种包含灵长类或人源化IgG4CH1结构域和灵长类或人源化κCL结构域的抗体，
其中所述CH1和CL结构域包含一对接触半胱氨酸残基，
其中所述一对接触半胱氨酸残基中的一个在CH1残基处，而另一个在CL残基处，并且
其中所述一对接触半胱氨酸残基的所述CH1和CL残基分别选自由以下组成的组：(1)168和174；(2)173和162；(3)170和162；(4)126和124；(5)127和121；以及(6)128和118。
98.根据项目97所述的抗体，其中所述抗体包含用其它氨基酸对所述CH1结构域中的位置131处和所述CL结构域中的位置214处的所述半胱氨酸的取代。
99.一种包含灵长类或人源化IgG2CH1结构域和灵长类或人源化CL结构域的抗体，
其中所述抗体包含用其它氨基酸对所述CH1结构域中的位置131处和所述CL结构域中的位置214处的所述半胱氨酸的取代，并且
其中所述CH1和CL结构域各自包含半胱氨酸取代，所述半胱氨酸取代产生一对接触半胱氨酸残基。
100.根据项目99所述的抗体，其中所述一对接触半胱氨酸残基分别选自所述CH1和CL结构域中由以下组成的位置的组：(1)位置173和162；以及(2)位置170和162。
101.根据项目99或100所述的抗体，其中所述CH1和CL结构域各自包含第二半胱氨酸取代，所述第二半胱氨酸取代产生不同的第二对接触半胱氨酸残基。
102.根据项目101所述的抗体，其中所述第二对接触半胱氨酸残基分别选自所述CH1和CL结构域中由以下组成的位置的组：(1)位置173和162；以及(2)位置170和162。
103.根据项目94至102中任一项所述的抗体，其中所述抗体是全长人或人源化IgG抗体。
104.一种制备根据项目46至93中任一项所述的抗体混合物的方法，其包括以下步骤：
(a)在培养基中培养表达所述抗体混合物的宿主细胞系，以及
(b)从细胞团或所述培养基中回收所述抗体混合物。
105.根据项目104所述的方法，其中所述宿主细胞系是哺乳动物细胞系。
106.根据项目105所述的方法，其中所述宿主细胞系是CHO细胞系。
107.根据项目104至106中任一项所述的方法，还包括从存在于所述细胞团或所述培养基中的其它组分中纯化所述抗体混合物的步骤。
108.一种宿主细胞系，其产生根据项目46至93中任一项所述的抗体混合物。
109.根据项目108所述的宿主细胞系，其是哺乳动物细胞系。
110.根据项目109所述的宿主细胞系，其是CHO细胞系。
111.一种或多种核酸，其编码根据项目46至103中任一项所述的抗体或抗体混合物。
112.一种或多种载体，其含有根据项目111所述的核酸。
113.根据项目112所述的载体，所述载体中的每一个是哺乳动物表达载体。
114.根据项目112所述的载体，所述载体中的每一个是病毒载体。
115.根据项目114所述的载体，所述载体中的每一个是腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、改良安卡拉痘苗病毒(MVA)载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体或痘病毒载体。
116.一种宿主细胞系，其含有根据项目111至115中任一项所述的核酸和/或载体。
117.一种治疗疾病的方法，其包括向患有所述疾病的患者施用根据项目46至93中任一项所述的抗体混合物，其中所述疾病是癌症、代谢疾病、传染病、或自身免疫疾病或炎性疾病。
118.根据项目117所述的方法，其中所述疾病是癌症。
119.一种治疗疾病的方法，其包括向患有所述疾病的患者施用根据项目94至103中任一项所述的抗体。
120.一种治疗癌症的方法，其包括向患者施用根据项目93(a)所述的抗体混合物。
121.一种治疗乳腺癌的方法，其包括向患者施用根据项目93(b)所述的抗体混合物。
122.根据项目121所述的方法，其中所述抗体混合物包含三种主要抗体种类。
123.一种治疗患有肿瘤的患者的方法，其包括将根据项目46至103中任一项所述的抗体或抗体混合物注射到所述肿瘤中。
124.一种治疗癌症患者的方法，其包括向所述患者施用根据项目111至115中任一项所述的核酸和/或载体。
125.根据项目124所述的方法，其中所述患者患有肿瘤并且将所述核酸和/或载体直接施用于所述肿瘤。
126.根据项目125所述的方法，其中将所述核酸和/或所述载体注射到所述肿瘤中。
附图说明
图1：用于在宿主细胞中产生“MabPair”的改变。图中指示了抗体的各种结构域。抗体1是IgG1抗体、IgG2抗体或IgG3抗体，其中残基409已经变为精氨酸；或者IgG4抗体，所述IgG4抗体在位置409处具有天然存在的精氨酸。如所指出的那样，抗体1与抗原A结合(由填充有不规则间隔的正方形的圆圈指示)。抗体2是IgG抗体，在所述抗体中残基409已经变为天冬氨酸或谷氨酸(K409D/E，用带圆圈的“-”指示)，并且残基399已经变为精氨酸或赖氨酸(D399R/K，用带圆圈的“+”指示)。如所指出的那样，抗体2与抗原B结合(由填充有棋盘图案的圆圈指示)。如带圆圈的“+”和“-”符号所指示，抗体1和抗体2的VL和VH结构域以及CL和CH1结构域中的带电残基对驱动抗体1和2的轻链与它们的同源重链配对。这些带电残基可以存在于抗体的原始氨基酸序列中，或者可以通过用带电氨基酸取代所述原始序列中存在的氨基酸来引入。此外，这些带电残基在抗体1的重链与抗体2的轻链之间以及在抗体2的重链与抗体1的轻链之间产生排斥力。可以通过在抗体1和2的CH1/CL界面内的不同位置处的取代引入的半胱氨酸残基由以实线连接的两个表示。通常存在于所述抗体的铰链结构域中的额外二硫桥由水平实线表示。
图2：用于在一个宿主细胞中产生三种不同抗体(“3合1混合物”)的改变。标记如图1所示。如所指出的那样，抗体1(左侧)是与抗原A结合的IgG1抗体，抗体2是与抗原B结合的IgG1抗体，并且抗体3是与抗原A和B两者结合的双特异性抗体。与图1中所示的实施方案不同，抗体2中的CH3结构域中不存在不利于异源二聚体形成的改变。
图3：用于在一个宿主细胞中产生抗体的MabPair(图A)或3合1混合物(图B)的替代策略。标记如图1所示。图A.抗体1是IgG1抗体、IgG2抗体或IgG3抗体，其中残基409已经变为精氨酸；或者IgG4抗体，所述IgG4抗体在位置409处具有天然存在的精氨酸。如所指出的那样，抗体1与抗原A结合。抗体1在其Fab区中，即VH-CH1结构域和VL-CL结构域中不具有任何改变。HC与LC之间天然存在的二硫桥由CH1结构域与LC的羧基末端之间的粗实线表示。抗体2是IgG抗体，在所述抗体中残基399已变为精氨酸或赖氨酸(D399R/K，用带圆圈的“+”表示)，并且残基409已变为天冬氨酸或谷氨酸(K409D/E，用带圆圈的“-”表示)。如所指出的那样，抗体2与抗原B结合。由于氨基酸取代，抗体2缺乏在LC与HC之间天然存在的链间二硫键，而是在CL结构域与CH1结构域之间具有两个新引入的二硫键(由以实线连接的两个表示)。此外，引入的电荷对(例如，CL中的S131K/R和CH1中的K147D/E，或者CL中的S174K/R和CH1中的H168D/E)由带圆圈的“+”和“-”表示。图B.标记如图A所示。应注意，不存在图A中示出的CH3结构域中的改变。抗体3是双特异性抗体，所述双特异性抗体包含来自抗体1和抗体2中的每一者的HC和LC。
图4：可能由用编码两种全长抗体的DNA转染的宿主细胞产生的抗体种类。左侧的圆圈代表宿主细胞。较长的弯曲实线和较短的实线代表第一抗体的HC和LC，并且较长的弯曲虚线和较短的虚线代表第二抗体的HC和LC。这些多肽由已引入宿主细胞的DNA编码。在右侧的圆圈外面示出了如果不通过某种机制阻止各种链的混杂配对而可能产生的所有潜在抗体种类。由虚线矩形包围的三种物质是仅包含同源HC/LC对的物质。所有其它物质包括至少一个非同源HC/LC对。
图5：对HC和LC中的接触残基处存在半胱氨酸取代的情况下形成的抗体种类的分析。实验在实施例2中描述。简而言之，将编码具有或不具有改变的HC和具有或不具有改变的κLC(κLC)的DNA引入宿主细胞中，并通过蛋白质印迹法分析由宿主细胞产生的抗体。以下使用的名称“aCTLA4(IgG1)KE”是指具有改变C220S(其消除天然存在的HC/LC二硫桥)、D399K和K409E的IgG1抗-CTLA4抗体的HC。以下使用的名称“aPD1(IgG4)”是指包含改变C131S(其消除天然存在的HC/LC二硫桥)和S228P(其阻止IgG4Fab臂交换)的IgG4抗PD1抗体的HC。以下使用的名称“aCTLA4-κLC”和“aPD1-κLC”是指这些抗体的同源轻链，并且都包含改变C214S(其消除天然存在的HC/LC二硫桥)。这些多肽中的其它改变如(H168C)或没有另外的改变(WT)在以下多肽描述中以括号指示。泳道1、13、23、24和34含有在该图像中不可见的尺寸标记物。其它泳道含有来自含有编码以下的DNA的转染子的样品：泳道2，aCTLA4(IgG1)KE(H168C)和aCTLA4-κLC(S174C)；泳道3，aCTLA4(IgG1)KE(K133C)和aCTLA4-κLC(I117C)；泳道4，aCTLA4(IgG1)KE(K133C)和aCTLA4-κLC(F209C)；泳道5，aCTLA4(IgG1)KE(V173C)和aCTLA4-κLC(Q160C)；泳道6，aCTLA4(IgG1)KE(F170C)和aCTLA4-κLC(S162C)；泳道7，aCTLA4(IgG1)KE(F170C)和aCTLA4-κLC(S176C)；泳道8，aCTLA4(IgG1)KE(S183C)和aCTLA4-κLC(S176C)；泳道9，aPD1(IgG4)(H168C)和aPD1-κLC(S174C)；泳道10，aPD1(IgG4)(V173C)和aPD1-κLC(S162C)；泳道11，aPD1(IgG4)(F170C)和aPD1-κLC(S162C)；泳道12，aPD1(IgG4)(S183C)和aPD1-κLC(S176C)；泳道14，aCTLA4(IgG1)KE(H168C)和aPD1-κLC(WT)；泳道15，aCTLA4(IgG1)KE(K133C)和aPD1-κLC(WT)；泳道16，aCTLA4(IgG1)KE(V173C)和aPD1-κLC(WT)；泳道17，aCTLA4(IgG1)KE(F170C)和aPD1-κLC(WT)；泳道18，aCTLA4(IgG1)KE(S183C)和aPD1-κLC(WT)；泳道19，aPD1(IgG4)(H168C)和aCTLA4-κLC(WT)；泳道20，aPD1(IgG4)(V173C)和aCTLA4-κLC(WT)；泳道21，aPD1(IgG4)(F170C)和aCTLA4-κLC(WT)；泳道22，aPD1(IgG4)(S183C)和aCTLA4-κLC(WT)；泳道25，aPD1(IgG4)(WT)和aCTLA4-κLC(S174C)；泳道26，aPD1(IgG4)(WT)和aCTLA4-κLC(I117C)；泳道27，aPD1(IgG4)(WT)和aCTLA4-κLC(F209C)；泳道28，aPD1(IgG4)(WT)和aCTLA4-κLC(Q160C)；泳道29，aPD1(IgG4)(WT)和aCTLA4-κLC(S162C)；泳道30，aPD1(IgG4)(WT)和aCTLA4-κLC(S176C)；泳道31，aCTLA4(IgG1)KE(WT)和aPD1-κLC(S174C)；泳道32，aCTLA4(IgG1)KE(WT)和aPD1-κLC(S162C)；以及泳道33，aCT LA4(IgG1)KE(WT)和aPD1-κLC(S176C)。如下所述，左侧的箭头指向各个条带：顶部箭头，HC-LC/HC-LC，全长抗体；第二箭头，HC/HC-LC，含有两个HC和一个LC的四分之三抗体；第三箭头，HC/HC，仅含有两个HC的抗体种类；并且底部箭头，HC-LC，含有一个HC和一个LC的半抗体。
图6：对HC和LC中的接触残基处存在半胱氨酸取代的情况下形成的抗体种类的分析。实验在实施例2中描述。泳道1-6含有来自用编码实施例2中所述的IgG4抗PD1抗体的HC和LC的DNA共转染的细胞的细胞上清液。所有抗PD1HC包含S228P。这些抗体的其它改变如下：泳道1，野生型(wt)(HC)和(LC)；泳道2，C131S(HC)和C214S(LC)；泳道3，C131S加F126C(HC)和C214S加S121C(LC)；泳道4，C131S加F126C(HC)和C214S加Q124C(LC)；泳道5，C131S加P127C(HC)和C214S加S121C(LC)；并且泳道6，C131S加L128C(HC)和C214S加F118C(LC)。泳道7-11含有来自用编码实施例2中所述的IgG1抗CTLA4抗体的野生wt或改变的HC和LC的DNA共转染的细胞的细胞上清液。这些抗体中的改变如下：泳道7，wt(HC)和(LC)；泳道8，C220S(HC)和C214S(LC)；泳道9，C220S加F126C(HC)和C214S加Q124C(LC)；泳道10，C220S加L128C(HC)和C214S加F118C(LC)；并且泳道11，C220S加S134C(HC)和C214S加F116C(LC)。泳道12含有来自没有使用DNA的模拟转染的细胞上清液。泳道13和14含有来自使用IgG1抗HER2抗体4D5-8(包含氨基酸序列SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20)的转染物的细胞上清液。泳道15和16含有来自使用IgG1抗HER2抗体2C4(含有氨基酸序列SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22)的转染物的细胞上清液。尺寸(以千道尔顿(kDa)计)标记物的位置在蛋白质印迹图像的左侧尺寸上指示。
图7：用于评估HC/LC配对的链脱扣(drop-out)瞬时转染。实验在实施例3中描述。每组五个样品来自使用编码第一重链(HC1)和第一轻链(LC1)的DNA(它们一起编码第一抗体(抗PD1抗体))和编码第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)的DNA(它们一起编码第二抗体(抗CTLA4抗体))的各种组合的转染。如图所示，组合如下：1)HC1、LC1、HC2和LC2；2)HC1和LC1；3)HC1和LC2；4)HC2和LC2；以及5)HC2和LC1。每组五个泳道上方的名称18A-18D表示这些泳道中的HC和LC具有关于表21中的名称18A-18D所述的改变。泳道21和22含有来自分别用全长抗HER2抗体4D5-8(含有氨基酸序列SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20)和2C4(其含有氨基酸序列SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22)转染的细胞的上清液，被包括作为对照来监测转染效率。
图8：用于评估HC/LC配对的链脱扣瞬时转染。实验在实施例3中描述。如泳道1-20下方所示，对于每对变体，将一组五种DNA组合(如上文关于图7所述)转染到宿主细胞中。每组五个泳道上方的名称14A-14D表示这些泳道中的HC和LC具有关于表20中的这些名称所述的改变。一式两份地同时转染编码抗HER2抗体4D5-8和2C4的DNA以监测转染效率，并在标记为5-8(4D5-8)和4(2C4)的泳道中分析来自这些转染子的细胞上清液。
图9：用于评估HC/LC配对的链脱扣瞬时转染。实验在实施例3中描述。如泳道1-20下方所示，对于每对变体，将一组五种DNA组合(如上文关于图7所述)转染到宿主细胞中。每组五个泳道上方的名称23A-23D表示这些泳道中分析的HC和LC具有关于表21中的这些名称所述的改变。同时转染编码抗PD1抗体和抗CTLA4抗体的DNA以监测转染效率，并在标记为a-PD1和a-CTLA4的泳道中分析来自这些转染子的细胞上清液。
图10：用于评估在接触残基处存在半胱氨酸取代的情况下的LC/HC配对的链脱扣瞬时转染。实验在实施例3中描述。图B和图C中的泳道21-23含有来自不含DNA(泳道21)、含有IgG1抗HER2抗体4D5-8(包含氨基酸序列SEQ ID NO.19和SEQ ID NO:20；泳道22)和含有IgG1抗HER2抗体2C4(其含有氨基酸序列SEQ ID NO.21和SEQ ID NO:22；泳道23)的对照转染的细胞上清液。如所指出的，所有其它样品是五个一组并含有来自含有编码HC1、LC1、HC2和LC2的各种组合的DNA的转染物的细胞上清液，如实施例3和图7的描述中所解释的。HC1和LC1一起构成实施例2中所述的不包含除S228P(HC1)以外的改变的IgG4的抗PD1抗体。HC2和LC2一起构成实施例2中所述的仅包含改变D399K和K409R(HC)的IgG1抗CTLA4抗体。如下表所示，这些抗体不包含另外的改变(命名为“WT”)或者在不同的泳道中以各种方式改变。分子量标准品的位置在左侧指示。
表1.图A所示样品中的抗体链的改变
*空白框表示不存在列在框上方标题中的链。
表2.图B所示样品中的抗体链的改变
*空白框表示不存在列在框上方标题中的链
表3.图C所示样品中的抗体链的改变
*空白框表示不存在列在框上方标题中的链
图11：在位置392、370和397处具有改变的HC的异源二聚体形成。如实施例4中所述，用编码全长野生型IgG1HC和LC的DNA加上编码具有或没有如下所示改变的IgG1Fc片段的DNA转染宿主细胞。将来自转染子培养基的抗体在非还原条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并进行印迹。如实施例4中所述检测抗体。指示了HC-LC/HC-LC同源二聚体(“HC/HC”)、HC-LC/Fc异源二聚体(“HC/Fc”)和Fc/Fc(“Fc/Fc”)同源二聚体的位置。Fc片段中存在的改变和每个泳道中的HC-LC/Fc异源二聚体百分比如下：1)K392A，46.9％；2)K392C，49.2％；3)K392D，42.9％；4)K392E，44.1％；5)K392F，42.7％；6)K392G，50.2％；7)K392H,44.0％：8)K392M，43.3％；9)K392N，50.0％；10)K392P，45.9％；11)K392Q，48.1％；12)K392R，50.3％；13)K392S，46.3％；14)K392T，56.3％；15)K392V，54.0％；16)K392W，49.5％；17)K392Y，49.6％；18)WT，39.7％；19)K370A，47.3％；20)K370C，62.3％；21)K370D，48.8％；22)K370E，45.4％；23)K370F，43.2％；24)K370G，50.7％；25)K370H，55.2％；26)K370I，59.1％；27)K370L，60.6％；28)K370M，55.7％；29)K370N，47.4％；30)K370P，59.3％；31)K370Q，49.2％；32)K370T，54.1％；33)K370V，51.9％；34)K370W，39.7％；35)K370Y，47.3％；36)V397A，46.9％；37)V397C，53.7％；38)V397D，52.2％；39)V397E，57.5％；40)V397F，51.4％；41)V397G，55.3％；42)V397H，55.2％；43)V397I，51.4％；44)V397K，66.5％；45)V397L，48.4％；46)V397M，52.1％；47)V397N，59.4％；48)V397P，56.2％；49)V397Q，48.0％；50)V397R，61.9％；51)V397S，48.9％；52)V397T，51.6％；53)V397W，49.5％；以及54)V397Y，49.1％。
图12：在位置399和/或409处具有改变的HC的异源二聚体形成。本实验在实施例4中描述。本图中的实验和标记与图11中的相同，不同之处在于如下表所示，Fc片段的各种改变在位置399和/或409处，并且全长HC是野生型IgG4HC。
图13：IgG1或IgG4HC的异源二聚体形成，其中Fc片段在位置399和/或409处具有或不具有改变。本实验在实施例4中描述。标记如图12所示。右侧表中的“无HC”或“无Fc”分别表示编码HC或Fc的DNA未被引入其抗体在该泳道中被可视化的宿主细胞中。“Ab1”和“Ab2”是两种不同的抗体。Ab2IgG4和Ab2IgG1分别具有呈IgG4形式和IgG1形式的相同可变结构域。
图14：IgG1或IgG4HC的异源二聚体形成，其中Fc片段在位置399和/或409处具有或不具有改变。实验在实施例4中描述。标记如图13所示。
图15：对纯化的抗PD1抗CTLA4MabPair抗体混合物的SDS-PAGE分析。本实验在实施例5中描述。将非还原(左)和还原(右)样品在4-15％CRITERIONTM TGX STAIN-FREETM预制SDS-PAGE凝胶中运行并进行印迹，并且如实施例5中所述检测抗体。将各尺寸的蛋白质分子量标准品在最左边的泳道中运行，并且指示了以千道尔顿(kDa)计的尺寸。泳道1和8含有预期包含三种不同抗体的样品，所述三种不同抗体为两种不同的抗HER2抗体4D5-8和2C4以及含有来自这两种抗体中的每一种的一个HC和一个LC的双特异性抗体。泳道2和9含有来自用编码抗CTLA4IgG1抗体的DNA转染的细胞的样品。其它泳道含有来自含有编码表21中所述的抗体混合物的DNA的转染子的样品，如下所述：泳道3和10，混合物17B；泳道4和11，混合物17C；泳道5和12，混合物18B；泳道6和13，混合物18C；以及泳道7和14，混合物19C。
图16：对非还原和还原的抗体混合物样品的SDS-PAGE分析。本实验在实施例5中描述。顶部图和底部图中的最左侧泳道含有分子量标准品。每组五个泳道含有不同浓度的泳道上方所指示的非还原(顶部图)或还原(底部图)的抗体混合物样品。这些抗体混合物描述于表20中。
图17：通过低pH阳离子交换(CEX)色谱法分析非还原的抗体混合物。该图示出了来自如实施例5中所述在低pH下运行的CEX柱的描记线。横轴表示在柱运行开始后的分钟数，而纵轴表示在214纳米处在柱流出物中检测到的吸光度(表示为“AU”，其反映蛋白质浓度)。如上所述，上部描记线来自抗CTLA4抗体，中间描记线来自抗PD1抗体，并且底部描记线来自18C变体抗体混合物(描述于表21中)，所述18C变体抗体混合物在用编码抗PD1抗体和抗CTLA4抗体的改变形式的DNA转染的宿主细胞中产生。
图18：对来自纯化的抗HER2/抗HER2 14D 3合1抗体混合物的Fab片段的质谱(MS)分析。变体14D混合物描述于表20中。本实验在实施例5中描述。使用Waters SYNAPTTM G2MS系统(Waters Corporation,Milford,MA,USA)分析通过木瓜蛋白酶消化产生的Fab片段。在最突出的峰上方标示了质量(以道尔顿为单位)。如图所示，纵轴示出信号的强度(每秒离子计数)，而横轴示出以千道尔顿计的质量。
图19：抗CTLA4、抗PD1MabPair抗体混合物的MS分析。这些实验在实施例6中描述。如图所示，x轴示出解卷积质量，并且y轴示出计数，所述计数反映给定质量下的蛋白定量。图A.该图示出了对没有改变的IgG1抗-CTLA4 111抗体的分析。图B.该图示出了对含有在HC中的改变K147D、F170C、V173C、C220G、R255K、D399R和K409E以及在LC中的改变S131K、Q160C、S162C和C214S的抗CTLA4 111抗体的分析。图C.该图示出了对实施例2中所述的未改变形式的IgG4抗PD1抗体与图B中分析的工程化IgG1抗CTLA4 111抗体的MabPair混合物的分析。图D.该图示出了对在图C中分析的MabPair混合物的更高分辨率分析。如所指出的，进行曲线下面积(AUC)分析以确定该MabPair中每种抗体的相对量。
图20：来自抗PD1/抗CTLA4MabPair抗体混合物的Fab'片段的MS分析。所述实验在实施例6中描述。图A.该图示出了IgG抗体(在左侧)和用IdeS蛋白酶消化的IgG抗体(左起第二个)，以及进一步用2-巯基乙胺(2-MEA)和乙二胺四乙酸(EDTA)处理的IgG抗体(在右侧)的图。标示了所生成的各种片段的名称。图B.该图示出了通过对图19的图D中所分析的相同MabPair进行IdeS蛋白酶消化和2-MEA/EDTA处理产生的Fab’片段的MS分析。如图所示，x轴示出解卷积质量，并且y轴示出计数，所述计数反映给定质量下的蛋白定量。标示了含有同源HC/LC对的两个Fab'片段的预期质量，以及检测到的所述片段的实际质量和计算误差。
图21：工程化抗CTLA4抗体的还原和非还原赖氨酰内肽酶消化物的液相色谱。本实验在实施例6中描述。图A.该图示出了通过对图19的图B中分析的工程化抗CTLA4抗体进行赖氨酰内肽酶消化产生的肽中的两种的预期氨基酸序列。参见表7和表11。预期的二硫键用线表示。图B.该图示出了实施例6中所述的工程化的抗CTLA4抗体的赖氨酰内肽酶消化的非还原样品的柱谱。x轴示出自色谱开始以来的时间(表示为采集时间，以分钟计)，并且y轴示出UV响应，UV响应反映了柱流出物中蛋白质的定量。对应于连接的链A和B的峰(参见图A)通过其质量识别，并由具有标记“3个二硫键连接的肽”的箭头指示。图C.该图示出了工程化抗CTLA4抗体的赖氨酰内肽酶消化的还原样品的柱谱。X轴和y轴与图B中的相同。对应于链A和B的新峰(参见图A)通过它们的质量识别并且指示。
图22：测定由对工程化抗CTLA4抗体进行赖氨酰内肽酶消化产生的肽的单一同位素质量。实验在实施例6中描述。图A.来自对工程化抗CTLA4抗体的非还原赖氨酰内肽酶消化的预期二硫键连接的肽(在图21的图B中标记为“3个二硫键连接的肽”)的MS分析。x轴示出质荷比(m/z比)，并且y轴示出计数，所述计数反映了给定质量的离子定量。图B.该图示出了对来源于工程化抗CTLA4抗体的还原赖氨酰内肽酶消化的链A肽(在图21的图C中指示)的MS分析。图C.该图示出了对来源于工程化抗CTLA4抗体的还原赖氨酰内肽酶消化的链B肽(在图21的图C中指示)的MS分析。
图23：对IgG2/IgG4MabPair的质谱分析。这些实验在实施例7中描述。如所示，x轴示出以原子质量单位(amu)计的解卷积质量，并且y轴示出计数，所述计数反映了给定质量下的蛋白质定量。图A.该图示出了由用编码实施例7中所述的工程化IgG2和未改变的IgG4抗体的DNA转染的细胞产生的去糖基化抗体的质谱分析。图B.该图示出了从由用编码实施例7中所述的工程化IgG2和未改变的IgG4抗体的DNA转染的细胞产生的抗体生成的Fab'片段的质谱分析。
图24：抗体混合物的抗PD1效力。本实验在实施例8中描述。指示了由各种曲线表示的样品。横轴指示抗PD1抗体浓度的对数。在抗体混合物的情况下，该量是基于实施例7中进行的抗体浓度测定。纵轴指示相对发光单位的平均值加或减所述平均值的标准误差(RLU±SEM)。
图25：抗体混合物的抗CTLA4效力。本实验在实施例9中描述。指示了由各种曲线表示的样品。横轴和纵轴如图16中所示，不同之处在于横轴表示抗CTLA4抗体浓度的对数而不是抗PD1抗体浓度的对数。
图26：抗CTLA4/抗PD1MabPair中抗CTLA4抗体的效力。程序在实施例10中描述。x轴示出每次测定中使用的抗CTLA4抗体的浓度，并且y轴示出RLU±SEM。符号和线条标识在图表左上角的图例中指示并在实施例10中说明的样品。右下角的单个实心圆表示来自无关的人IgG1抗体的数据。
图27：抗HER2抗体混合物对乳腺癌细胞活力的影响。本实验在实施例11中描述。在实验中用作样品的抗体和抗体混合物如下所示。IgG1，对照IgG1/κLC抗体；4D5-8，抗HER抗体4D5-8；2C4，抗HER2抗体2C4；2C4+4D5-8，两种抗HER2抗体4D5-8和2C4的混合物；以及14D、15C、13D、14C和15D，所述抗HER2抗体混合物在表20中描述。纵轴指示RLU±SEM。横轴指示样品中抗体或抗体混合物的浓度，以纳摩尔/升(nM)计。如图所示，顶部图和底部图分别含有来自使用BT-474细胞和SK-BR-3细胞的样品的数据。
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具体实施方式
本文描述了抗体混合物和生产抗体混合物的方法，所述抗体混合物含有来自已经用编码至少两种具有不同结合特异性的不同抗体(任选地为全长灵长类IgG抗体)的DNA转染的宿主细胞(任选地为来自单一宿主细胞系的细胞)的有限数量的主要抗体种类，任选地不超过两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种。在一些实施方案中，可以将编码至少两种不同重链(HC)和至少两种不同轻链(LC)的DNA引入宿主细胞中。在一些实施方案中，宿主细胞可以用编码至少两种但不超过四种具有不同结合特异性的不同抗体的DNA转染。在一些实施方案中，可以将编码至少两种但不多于四种不同HC和至少两种但不多于四种不同LC的DNA引入宿主细胞中。在一些实施方案中，可以使编码HC和LC的所有转染DNA的序列突变，从而改变抗体的氨基酸序列，使得不利于非同源HC/LC配对，并且非常有利于同源HC/LC配对。参见图1和图2。在将两种不同的HC引入宿主细胞的情况下，可任选地改变两种不同HC中的一种或两种，使得不利于异源二聚体的形成。在一些实施方案中，仅改变一条重链以阻止异源二聚体形成。在一些实施方案中，在将仅编码两种不同抗体的DNA引入宿主细胞的情况下，由所述DNA编码的抗体中的仅一种包含一个或多个配偶体定向改变，使得有利于同源HC/LC配对，而另一种抗体不包含此类改变。参见图3。在此类实施方案中，该改变的抗体还可包含一个或多个不利于异源二聚体形成的改变。参见图3。在一些实施方案中，所述抗体中的一种不包含不利于异源二聚体形成的改变或有利于同源HC/LC配对的改变。参见图3。在一些其它实施方案中，两种抗体中仅一种包含一个或多个配偶体定向改变，并且两种抗体中仅一种包含一个或多个不利于异源二聚体形成的改变。在此类实施方案中，包含所述配偶体定向改变的抗体可以不包含所述不利于异源二聚体形成的改变，并且反之亦然。或者，一种抗体可以是未改变的，而另一种抗体可以包含一个或多个配偶体定向改变和一个或多个不利于异源二聚体形成的改变。在一些实施方案中，宿主细胞仅产生两种主要抗体种类，其中每种HC主要与其同源LC配对，并且大多数抗体是含有两条具有相同氨基酸序列的重链和两条具有相同氨基酸序列的轻链的四聚体(在本文中称为“MabPair”)。参见图1和图3。在其它实施方案中，宿主细胞产生三种不同的主要抗体种类，两种各自包含两条具有相同氨基酸序列的HC和两条具有相同氨基酸序列的LC的不同单特异性抗体加上包含两条不同HC和两条不同LC的功能性双特异性抗体(在本文中称为抗体的“3合1混合物”)。参见图2和图3。本文描述了(1)在宿主细胞中，任选地在宿主细胞系中产生包含有限数量的主要物质的抗体混合物的方法，(2)抗体和抗体混合物，所述抗体和抗体混合物包含有助于同源HC/LC配对的改变，并且在一些实施方案包含不利于形成异源二聚体HC/HC对的改变，(3)用编码如本文所述改变的至少两条不同HC和两条不同LC的DNA转染的宿主细胞和/或宿主细胞系，(4)编码此类抗体及混合物的核酸，例如DNA，所述核酸可以携带在一个或多个载体上，以及(5)使用此类抗体、抗体混合物和/或编码它们的核酸进行治疗的方法。
定义
如本文所述，抗体的“3合1混合物”是指在已经引入了编码两种不同IgG抗体的DNA的宿主细胞系中制备的抗体混合物。3合1混合物包含三种不同的主要抗体种类，即两种不同的IgG抗体加上一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含来自两种IgG抗体中的每一种的同源HC/LC对。3合1混合物不是指由已经单独引入了编码不同抗体的不同DNA的单独宿主细胞群制备的抗体的混合物。
如本文所述，“不利于异源二聚体的改变”是对抗体的CH3结构域氨基酸序列(任选地是人、人源化或灵长类CH3结构域氨基酸序列)内的单个氨基酸的取代、插入或缺失，其中所述取代、插入或缺失不利于抗体混合物情境中的异源二聚体形成。抗体可以包含多于一个不利于异源二聚体的改变，并且多个不利于异源二聚体的改变可以发生在抗体混合物中的一种或多种抗体的多个位点处。不利于异源二聚体形成的单一改变不需要完全有效地消除异源二聚体，或者不需要本身有效地被认为是“不利于异源二聚体的改变”，只要它在与一种或多种其它改变配对时是部分有效和/或有效的即可。所述改变可包括用带电残基取代野生型序列中存在的残基。或者，取代可以产生对正确的HC/HC配对的空间障碍，诸如邻接另一个“突起”的“突起”。在美国专利8,679,785，第12栏第12行至第13栏第2行中描述了突起或球状突起，该专利以引用方式并入本文。一个或多个改变是否对HC/HC异源二聚体形成具有影响可以通过实施例4中所述的方法确定。来自此类实验的数据示出在图11至图14中。不利于异源二聚体的改变发生在“结构域界面残基”处。结构域界面残基在美国专利8,592,562的表1和所附文本中论述，该专利以引用方式并入本文。此类结构域界面残基被称为“接触”残基或被称为如果被预测为物理上接近就“接触”彼此，物理上接近即在α碳(Cα，即氨基酸的氨基与羧基部分之间的碳)之间最多12埃处，或者根据已知的结构模型在一个氨基酸的侧链重原子(除氢之外的任何原子)与另一个氨基酸的任何重原子之间至多处。此类结构可在网上获得，例如通过蛋白质数据库(可得自http://www.rcsb.org/ pdb/home/home.do)或者通过 (IMGT；可得自http:// www.imgt.org)。在下表4中，列出了人IgG抗体中CH3/CH3界面处的接触残基的实例。
表4：人IgG CH3/CH3界面处的接触残基
*编号是根据Edelman等人，(1969),Proc.Natl.Acad.Sci.USA63:78-85，该文献的全部内容以引用方式并入本文
不利于异源二聚体的改变的实例包括例如任选地在抗体混合物包含另一包含409R的IgG抗体的情境下，在灵长类和/或人源化的IgG重链中的D399K/R加上K/R409D/E。如下表8中所示，人IgG4抗体在位置409处具有精氨酸(R)，而人IgG1、IgG2和IgG3抗体在位置409处具有赖氨酸(K)。如本文所述，在IgG1、IgG2或IgG3抗体包含改变K409R的特定情况下，该改变不被认为是“不利于异源二聚体的改变”(这是上述定义的例外)，因为在人IgG4HC中的位置409处具有天然存在的R。
HC或LC氨基酸序列内的“氨基酸”、“氨基酸残基”、“残基”、或“位置”是指在如表5至表11中所示编号的位置处的氨基酸。因此，例如，两个不同的HC氨基酸序列可能在所述两个HC氨基酸序列中的特定位置处具有相同或不同的氨基酸。此外，“HC位置”、“HC残基”、“LC位置”或“LC残基”是指在任何HC或LC氨基酸序列中于表5至表11中所示编号的位置处的氨基酸。
如本文所述的“抗体”是含有至少一个重链可变(VH)结构域或轻链可变(VL)结构域的蛋白质。抗体通常含有VH结构域和VL结构域两者。VH结构域和VL结构域详细描述于例如Kabat等人，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,第5版，美国国家卫生研究院公共卫生署，健康和人类服务工作部门，NIH公开号91-3242，1991,第xvi-xix页和第103-533页，该文献以引用方式并入本文。“抗体”包括具有不同形式的分子，诸如单链Fv抗体(scFv，其含有通过接头连接的VH区和VL区)、Fab、F(ab)2、Fab’、scFv:Fc抗体(如在Carayannopoulos和Capra，第9章FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY，3.sup.rd ed.，Paul编辑，Raven Press，New York，1993，第284-286页中所述，该文献以引用方式并入本文)、各种形式的双特异性抗体和单价抗体，以及如下定义的全长和IgG抗体，以及其它可能形式的抗体。
如本文所述，“双特异性抗体”结合至两种不同表位，所述抗体可以驻留在一个靶分子上或在两个单独的靶分子上。双特异性抗体可以是全长抗体、IgG抗体或具有不同形式的抗体。
如本文所述，“二价抗体”可以同时结合至两个可以相同或不同的表位，并且可以驻留在一个靶分子上或两个单独的靶分子上。
如本文所述，氨基酸的“电荷对”是如本文所定义在“接触”氨基酸残基处的一对带相反电荷的氨基酸。这种带电氨基酸可以在相同的多肽链上或不同的多肽链上。
如本文所述，“带电”氨基酸是可以在近生理pH下具有电荷的酸性或碱性氨基酸。这些氨基酸包括在生理pH下带负电荷的酸性氨基酸谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)，以及在生理pH下带正电荷的碱性氨基酸精氨酸(R)和赖氨酸(K)。可以在接近生理pH下部分带电的弱碱性氨基酸组氨酸不在本文“带电”氨基酸的定义范围内。为了避免混淆，正电荷被认为是与负电荷“相反”，如本文所述。因此，例如，氨基酸残基E和R的电荷相反。
如本文所述，在抗体混合物情境下的“同源”HC是这样的HC，特定LC已知与所述HC配对以形成特定抗原的结合位点。例如，在抗体混合物包含抗体X以及其它抗体的情况下，如果已知的全长抗体X与抗原X结合，则抗体X HC是抗体X LC的同源HC，并且反之亦然。另外，如果混合物还包含抗体Y，则抗体Y HC是与抗体X LC“非同源”的，并且反之亦然。
“互补决定区”(CDR)是VH结构域或VL结构域内的高变区。每个VH结构域和VL结构域含有称为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR。CDR在抗体表面形成环，并且主要负责确定抗体的结合特异性。CDR散布在四个更保守的框架区域(称为FR1、FR2、FR3和FR4)之间，如下所示：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。VH和VL中的CDR位置分别在表5和表9中示出。Kabat等人将VH CDR定位如下：CDR1在位置31-35处(可能的插入编号为35A和35B)；CDR2在位置50-65处(可能的插入编号为52A-52C)；并且CDR3在位置95-102处(可能的插入编号为100A-100K)。Kabat等人，出处同上，在xvii处。Kabat等人将VL CDR定位如下：CDR1在位置24-34处(可能的插入编号为27A-27F)；CDR2在位置50-56处；并且CDR3在位置89-97(可能的插入编号为95A-95F)。
如本文所述的“半胱氨酸取代”是指这样的蛋白质中氨基酸取代，在所述氨基酸取代中半胱氨酸被任何其它氨基酸取代。
两个或更多个相关序列内的氨基酸改变“不同”是指(1)如果它们存在于两个相同氨基酸序列中或属于同一类(例如，VH结构域)的两个氨基酸序列中的不同位点处并且可以通过保守氨基酸与共同编号系统比对，和/或(2)如果改变不同，例如在两个其它方面相同或属于同一类的氨基酸序列内的相同位点处用不同的氨基酸取代，或者向两个其它方面相同或属于同一类的氨基酸序列插入不同数量的氨基酸和/或不同氨基酸或从两个其它方面相同或属于同一类的氨基酸序列缺失不同数量的氨基酸和/或不同氨基酸。当然，两个或更多个不相关序列中的氨基酸改变也彼此“不同”。如本文所述，两个或更多个抗体“不同”是指如果如本文所述，包含在所述抗体中的所有多肽链的氨基酸序列不是“相同”的。
如本文所述，两个或更多个氨基酸序列是“不同”的是指如果它们不能由相同的DNA序列编码。因此，仅由于翻译后修饰而不同的氨基酸序列与本文所述“不同”。
如本文所述，“Fc片段”包含来自HC的大部分或全部铰链结构域加上CH2和CH3结构域。例如，人IgG Fc片段的氨基酸序列示于表8中。
如本文所述，“全长抗体”包含(1)任何同种型的两条重链，所述两条重链各自包含至少VH结构域、第一重链恒定(CH1)结构域、铰链结构域、第二重链恒定(CH2)结构域和第三重链恒定(CH3)结构域，以及(2)两条轻链，所述轻链可以是各自包含VL结构域和轻链恒定(CL)结构域的κ或λ链。这些结构域详细描述于Kabat等人，出处同上第xv-xix页和第647-699页，这些页以引用方式并入本文。Kabat等人，出处同上的编号系统用于VH结构域和VL结构域(参见以下表5和表9)，并且EU系统(Edelman等人，(1969),Proc.Natl.Acad.Sci.USA63:78-85，该文献的全部内容以引用方式并入本文)用于CL、CH1、铰链、CH2和CH3结构域。参见表6至表8、表10和表11。
如本文所述，“重链(HC)”包含至少VH、CH1、铰链、CH2、和CH3结构域。包括所有这些结构域的HC也可以称为“全长HC”。一些同种型如IgA或IgM可含有其它序列，诸如IgM CH4结构域。Kabat等人，出处同上的编号系统用于VH结构域(参见下表5)，并且EU系统(Edelman等人，(1969),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63:78-85，该文献的全部内容以引用方式并入本文)用于CH1、铰链、CH2和CH3结构域。以下表5至表8提供了HC氨基酸序列的更具体图片。
表5：人VH的共有序列
表5显示了基于Kabat等人，出处同上中的人VH氨基酸序列(I-III)的保守氨基酸。编号是根据Kabat等人，出处同上。CDR中的位点编号以粗斜体写出。后面跟有字母的位置编号，例如100A，由于CDR的不同长度而可以或可以不填充有氨基酸。特定位置处的单一粗体指示如Kabat等人(出处同上)所述的所有三类人VH结构域中的“不变”氨基酸。在所关注的位点处，在给定位置处的氨基酸最常见地是一种氨基酸或两种氨基酸中的任一者的情况下，这些氨基酸以纯文本表示。带下划线的粗体位点编号指示在此被描述为改变的位置。没有指定氨基酸的位置不符合上述标准。
表5显示存在许多保守氨基酸，所述保守氨基酸允许任何VH序列与如上所示肉眼可见隔开的保守氨基酸进行比对。可替代地，可以使用比对软件将新颖的序列与已知的VH序列进行比对，所述比对软件为例如在上可得的比对软件(例如，IMGT/DomainGapAlign，该软件在http://www.imgt.org处可得，或者CLUSTAL Omega(Sievers等人，(2011),Molecular Systems Biology 7(1):539)。
下表6显示了CH1结构域的共有氨基酸序列。
表6：CH1共有序列
表6：编号是根据Edelman等人(出处同上)的编号。编号下方以粗体显示的单一氨基酸是根据Kabat等人(出处同上)，根据多种物质的CH1结构域比对的“不变”残基。在此选择进行改变的位点(131、133、147、168、170、173、176、181和183)以带下划线的粗体显示。在这些位点处，在Kabat等人(出处同上)中报道的63种灵长类CH1序列中最常见的一种或两种氨基酸以纯文本示出。没有指定氨基酸的位置不是“不变的”并且不被选择用于改变。
下表7显示了IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型的比对人CH1结构域。这种比对突出了这些密切相关的CH1结构域之间非常强的序列保守性。
表7：人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4CH1结构域的比对
表7：人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体的代表性CH1结构域的氨基酸序列分别从IMGT网页，登录号J00228、J00230、X03604和K01316获得，并使用CLUSTALW软件进行比对。残基根据Edelman等人，出处同上的EU系统编号。根据Kabat等人，出处同上的“不变”残基以粗体示出。这些残基是高度保守的，但不是完全不变的。加下划线和粗斜体的残基是已经如下面的实施例中所报道进行取代和测试的位点。
下表8显示了四种人IgG亚型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的人IgG Fc区的比对。这种比对显示了这些亚型之间的差异，以及高序列保守性。
表8：人IgG Fc区的氨基酸序列
已经引入了编码一种或多种蛋白质的DNA的“宿主细胞系”是指在例如通过转染引入所述DNA后来源于单个细胞的细胞系。用于在引入DNA后分离此类克隆细胞系的方法是本领域熟知的，并且包括有限稀释，以及可包括在视觉上确定特定样品中仅一个细胞存在的其它可能方法。参见例如Wewetzer(1995),J.Immunol.Methods179(1):71-76，Underwood和Bean(1988),J.Immunol.Meth.107(1):119-128。
“人”核苷酸序列或氨基酸序列或核酸或蛋白质包括人中天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列或核酸或蛋白质。许多人核苷酸和氨基酸序报告于例如Kabat等人，出处同上中，该文献说明了在本领域中字词“人”的使用。如本文所述，“人”氨基酸序列或蛋白质可以含有相对于天然存在的序列的一个或多个插入、缺失或取代，前提条件是“人”氨基酸序列或蛋白质不包含每100个氨基酸中单个氨基酸的多于10个插入、缺失和/或取代。类似地，人核酸(例如，DNA)或核苷酸序列不包含每300个核苷酸中单个核苷酸的多于30个插入、缺失和/或取代。在VH序列或VL序列的特定情况下，预期CDR变化极大，并且出于确定特定VH或VL氨基酸序列(或编码它的核苷酸序列)是否是“人”序列的目的，CDR(或编码它们的核苷酸)不被认为是所述序列的一部分。
如本文所述，编码抗体或抗体结构域或抗体或抗体结构域的“人源化”氨基酸序列的“人源化”核苷酸序列是这样的序列，所述序列起源于非人生物体但经工程化以尽可能类似于人序列且尽可能不牺牲抗体的所需特性，例如以一定的亲合力结合至某种抗原，以及许多可能的所需特性。人源化过程通常涉及将所有恒定结构域改变为人恒定结构域。在可变结构域中，原始CDR可用于替代与原始可变结构域尽可能相似的人抗体序列的CDR(通常称为CDR移植的过程)。然而，也可能需要框架区域中的一个或多个更改。因此，人源化抗体的氨基酸序列可能或可能不落入上文刚刚所述的“人”定义内。该过程在例如Zhang和Ho,Scientific Reports 6:33878；doi:10.1038/srep33878(2016)以及Miethe等人PLOS One；doi:10.137/journal.pone.0161446(2016)中描述，这两个文献以引用方式并入本文。
如本文所述，“IgG抗体”是指如本文所定义的IgG同种型的全长抗体，包括IgG1、IgG2、IgG2和IgG4同种型亚型的人、人源化和灵长类抗体。
如本文所述，术语“同种型”是指在抗体中的重链恒定区，即CH1、铰链、CH2、和CH3结构域，是否是IgG，IgD，IgM，IgA或IgE型或其亚型，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。此类同种型在本领域中是已知的，并且在例如Janeway等人，所述Immune System in Health andDisease,第5版，小节4-15至4-19，Garland Science,New York,2001(在http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK27106/处可得)中描述和说明。
如本文所述，“轻链(LC)”包含VL结构域和轻链恒定(CL)结构域，所述结构域可以是κ(CLκ)或λ(CLλ)结构域。这些结构域，包括它们的示例性氨基酸序列在内，描述于Kabat等人，出处同上，第xiii-lix页，第103-309页，和第647-660页中，该文献以引用方式并入本文。本文用于轻链的编号系统是在Kabat等人，出处同上中描述的用于VL结构域的编号系统和在Edelman等人，出处同上中描述的用于CL结构域的编号系统，如下文表9至表11所示。
表9：人VL结构域的共有序列
表9：编号是根据Kabat等人(出处同上)的。粗斜体的编号指示CDR的位置。后面跟有字母的位置编号，例如27A，由于CDR的不同长度而可以或可以不填充有氨基酸。在Kabat等人(出处同上)中的所有人轻链的不变残基显示为粗体字母，以指示在该位置处存在的氨基酸。在选定的位点处，在该位点处存在的一至三种最常见的氨基酸以纯文本形式显示。此外，许多其它氨基酸在κ或λVL结构域的一些亚组内是不变的或高度保守的，这可以帮助将特定氨基酸序列分类为VL结构域。如下文实施例中所报道的，在此被选择进行改变的位点用加下划线的粗体类型指示。没有氨基酸被指定和/或编号没有用加下划线的粗体类型示出的位置不符合上述标准。
表10：CL结构域的共有序列和编号
表10：编号是根据Edelman等人(出处同上)的，所述编号与Kabat等人(出处同上)中用于CL结构域的编号相同。编号下方以粗体显示的氨基酸是根据Kabat等人(出处同上)，根据来自多种物质的κ和λCL结构域的比对的“不变”残基。如在选定位点(131、160、162、174、176和178)处所示，在Kabat等人(出处同上)中报道的十种人κ链(顶部)和28种人λ链(下部)中保守的氨基酸以纯文本示出。在这些位点中的一个位点处存在两种不同氨基酸中的任一种的情况下，更常见的氨基酸在较不常见的氨基酸之前显示，例如e.g.,A/M。加下划 线的粗体编号指示如下面实施例中报道的那样改变的位点。此外，许多其它氨基酸在CLκ或CLλ结构域的一些亚组内是不变的或高度保守的，这可以帮助将特定氨基酸序列分类为CL结构域。没有氨基酸被指定和/或编号没有用加下划线的粗体类型示出的位置不符合上述标准。
表11：人κ链CL结构域的比对
表11：此表中人CLκ结构域的氨基酸序列来自 (IMGT)网页(http://www.imgt.org)。每个序列的登录号被示出在序列的左侧，并且用CLUSTALW软件(在http://www.genome.jp/tools/clustalw/处可得)比对所述序列。编号是根据Edelman等人，出处同上。粗体残基是根据Kabat等人，出处同上的不变残基。进行取代并且所得抗体如以下实施例中所报告的那样进行测试的不变位点由粗体且加下划线的氨基酸指示。粗体、斜体且加下划线的残基是进行取代并且所得抗体如以下实施例中所报告的那样进行测试的其它位点。
如本文所述，“LC配偶体定向改变”是在VH或CH1氨基酸序列内的HC/LC界面处的单个氨基酸的取代、插入或缺失，任选地是用带电氨基酸或半胱氨酸取代天然存在的氨基酸，这致使含有改变的VH和/或CH1氨基酸序列的HC(任选地人、人源化和/或灵长类IgG HC)与LC(任选地在接触氨基酸残基处含有“HC配偶体定向改变”的LC)更强地缔合。
类似地，“HC配偶体定向改变”是在VL或CL氨基酸序列内的HC/LC界面处的单个氨基酸的取代、插入或缺失，任选地是用带电氨基酸或半胱氨酸取代天然存在的氨基酸，这致使含有改变的VL和/或CL氨基酸序列的LC(任选地人、人源化和/或灵长类κ或λLC)与HC(任选地在接触氨基酸残基处含有“LC配偶体定向改变”的HC)更强地缔合。在一些实施方案中，HC配偶体定向改变和LC配偶体定向改变的接触对可以是具有相反电荷的带电氨基酸取代，所述取代形成如上文所定义的“电荷对”。在其它实施方案中，带电氨基酸已经存在于HC或LC的接触位点中的一者处，使得仅需要改变一条链来产生有利于形成同源HC/LC对的电荷对。在其它实施方案中，可以在接触位点处引入半胱氨酸残基，使得可以在同源HC/LC对之间形成二硫桥。在其它实施方案中，HC配偶体定向改变和LC配偶体定向改变可以是在接触残基处产生球状突起和孔(或突起和空腔)的取代或预先存在的氨基酸，如美国专利8,679,785中所述，该专利的相关部分以引用方式并入本文。HC可以是IgG、IgA、IgD、IgM或IgE同种型，任选地IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。HC配偶体定向改变和LC配偶体定向改变发生在形成HC/LC界面一部分的接触氨基酸位置处。CL和CH1结构域中的界面残基包括内的界面残基，如在美国专利8,592,562的表4和表5以及第10栏和第11栏中的所附文本中所解释的，所有这些内容都以引用方式并入本文。CH1和CL结构域中的接触残基编目在下表12中。
表12：CH1与CL之间的接触残基
在接触残基在VH结构域与VL结构域之间的界面上的情况下，使用以下标准选择适用于改变的残基对，所述残基对中的一个残基在VH中而另一个残基在VL结构域中：(1)残基被内埋或部分内埋，即在全长抗体的三级结构中不可接近，(2)残基在空间上接近，即两个氨基酸的Cα在约内，或者根据已知的结构模型在一个氨基酸的侧链重原子(除氢之外的任何原子)与另一个氨基酸的任何重原子之间存在至多(3)残基是高度保守的，尽管它们不需要是完全不变的，以及(4)残基不在互补决定区(CDR)中或与互补决定区相互作用。此类接触残基的实例包括但不限于以下：位置44(VH)和位置100(VL)；位置39(VH)和位置38(VL)；以及位置105(VH)和位置43(VL)。由于HC配偶体定向改变和/或LC配偶体定向改变引起的HC/LC缔合强度的变化可以通过测定已经引入了编码至少两种不同抗体的DNA的宿主细胞中的各种抗体种类的相对量来测量。如在实施例5和实施例6中详细解释并在图18、图20和图23的图B中所示，由具有不同HC/LC配对的抗体产生的Fab片段之间的尺寸差异通常可以通过质谱法(MS)来区分。使用MS鉴定各种抗体种类在例如Thompson等人(2014),mAbs 6:1,197-203中论述，该文献的全部内容并入本文。为了快速筛选许多不同的变体，进行如实施例3中所述和图7至图10中所示的链脱扣实验，特别是在预期Fab片段尺寸基本上相同或预期Fab片段在MS结果中不出现并且因此可能对木瓜蛋白酶特别敏感的情况下。LC配偶体定向改变和HC配偶体定向改变的接触对的实例包括但不限于以下：HC中的K147D/E和LC中的S131R；以及HC中的H168D/E和LC中的S174R。由于这些实例说明LC配偶体定向改变和HC配偶体定向改变的“接触”对可以包括电荷相反的氨基酸。在下面的描述和实施例中公开了许多其它实例。或者，LC配偶体定向改变和HC配偶体定向改变可以是如美国专利8,679,785中所述的“空腔中突起”型改变。该专利的描述这些类型的改变的各部分，尤其是第12栏第12行至第14栏第5行，以引用方式并入本文。术语“配偶体定向改变”是指HC配偶体定向改变和/或LC配偶体定向改变。
如本文所述，“MabPair”是包含两种并且不超过两种主要抗体种类的抗体混合物。可以在已经引入了编码两种不同IgG抗体(即，两条不同重链和两条不同轻链)的DNA的宿主细胞系(如上文所定义)中制备MabPair。也可以在已经引入了编码两种不同IgG抗体的DNA的细胞群中制备MabPair，其中克隆宿主细胞系不是从引入了所述DNA的细胞中纯化的。这种情况的一个实例可以包括将编码两种不同IgG抗体的DNA瞬时转染到例如293或ExpiCHO细胞中，以及随后从转染细胞的细胞上清液中获得由所述细胞产生的抗体。由多于一种宿主细胞系制备的两种抗体的混合物不是如本文所述的MabPair。此外，从两个单独的细胞群制备的两种抗体的混合物(其中编码一种抗体的DNA已经被引入一个细胞群中，并且编码另一种抗体的DNA已被引入另一个细胞群中)也不是如本文所述的MabPair。
如本文所述，抗体混合物情境中的“主要种类”的抗体是构成混合物中的抗体总量的至少10％的特定抗体种类。为了确定抗体混合物中有多少主要物质，可以进行如实施例5中所述和图17中所示的低pHCEX色谱法。抗体混合物中的每种物质占抗体总量的百分比可以使用柱流出物的吸光度峰下面积来确定。
如本文所述，抗体混合物中的“次要种类”的抗体占抗体混合物中抗体总量的少于10％。这可以通过低pH CEX色谱法测定，如在“主要物质”的定义中所述。
“灵长类”核苷酸或氨基酸序列或核酸或蛋白质包括在灵长类中天然存在的分子和序列。灵长类包括来自许多家族的动物，包括但不限于原猴类(包括狐猴)、新世界猴、黑猩猩、人，大猩猩、猩猩、长臂猿和旧世界猴。具体灵长类物种包括但不限于智人(Homosapiens)、猕猴(Macaca mulata)(恒河猴)、食蟹猴(Macaca fascicularis)和黑猩猩(Pantroglodytes)，以及其它许多灵长类动物。许多灵长类核苷酸和氨基酸序列是本领域已知的，例如在例如Kabat等人，出处同上中报道的灵长类核苷酸和氨基酸序列。通常，如本文所述，“灵长类”氨基酸序列可以含有相对于天然存在的灵长类序列的一个或多个插入、缺失或取代，前提条件是“灵长类”氨基酸序列不包含每100个氨基酸中单个氨基酸的多于10个插入、缺失和/或取代。类似地，灵长类核苷酸序列可以含有相对于天然存在的灵长类动物序列的插入、缺失或取代，但是不包含每300个核苷酸中单个核苷酸的多于30个插入、缺失和/或取代。在VH序列或VL序列的特定情况下，预期CDR变化极大，并且出于确定特定VH或VL氨基酸序列(或编码它的核苷酸序列)是否是“灵长类”序列的目的，CDR(或编码它们的核苷酸)不被认为是所述序列的一部分。
如本文所述，两个氨基酸序列是“相同”的是指如果这两个序列可以由相同的DNA序列编码。也就是说，如本文所述，仅由于翻译后修饰(例如，消除羧基末端赖氨酸或N末端谷氨酸或谷氨酰胺残基的环化)而不同的氨基酸序列是“相同”的。
如本文所述，“靶分子”是指抗体(例如，在本文所述的混合物中的抗体)特异性结合的分子。在一些实施方案中，靶分子是“靶蛋白”，即抗体特异性结合的蛋白质。
抗体混合物及其制备方法
本文描述了具有不同结合特异性的抗体的混合物，所述抗体混合物是在已经引入了编码抗体的DNA的宿主细胞中产生的。抗体可以是人、人源化和/或灵长类全长IgG抗体。还描述了制备此类混合物的方法。混合物中的不同主要抗体种类的数量可以被限制为例如不超过2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种主要种类。抗体中的一种或多种的HC和/或LC可包含LC配偶体定向改变和/或HC配偶体定向改变。在一些实施方案中，抗体中的一种或多种的HC可包含一个或多个不利异源二聚体的改变。在一些实施方案中，混合物中的一种或多种主要抗体种类可以没有这种改变。这些改变可用于限制宿主细胞产生的主要抗体种类的数量。
产生抗体混合物的方法可包括将编码本文所述抗体混合物的DNA引入宿主细胞，培养所述宿主细胞，以及从细胞团或培养基中回收所述抗体混合物。编码混合物中的不同抗体的DNA可以同时或在不同时间引入宿主细胞。例如，可以将编码第二抗体的DNA引入宿主细胞群中，所述宿主细胞群已经产生由先前引入所述宿主细胞群的DNA编码的第一抗体。或者，可以将编码两种抗体的DNA同时引入宿主细胞中。此外，在将编码多种抗体的DNA引入宿主细胞后，可以从引入了所述DNA的细胞群中分离产生所述抗体的克隆“宿主细胞系”(如上文所定义)。或者，抗体混合物可以由引入了DNA的宿主细胞群产生。如下文详细解释的，抗体中的改变可以限制由宿主细胞产生的主要抗体种类的数量。该混合物可以从宿主细胞培养上清液或细胞团获得，可以进一步纯化，并且可以适当地配制用作药物。
更具体地，可以将编码至少两种、三种或四种结合不同表位和/或靶标的不同抗体(任选地全长IgG抗体)的DNA引入宿主细胞中。所编码的抗体可各自包含两条具有相同氨基酸序列的HC和两条具有相同氨基酸序列的LC，并且所编码的抗体中的每一种可具有的HC和LC与所编码的另一种或多种抗体的HC和LC的氨基酸序列不同。在一些实施方案中，抗体可以是两种全长抗体，所述两种全长抗体各自包含两条具有相同氨基酸序列的重链和两条具有相同氨基酸序列的轻链。任选地，抗体是灵长类和/或人和/或人源化IgG抗体。在一些实施方案中，在同源HC/LC对中的接触位点处的至少一对带相反电荷的残基，即电荷对或半胱氨酸残基(其中来自改变的至少一个这些带电残基或半胱氨酸结果)可以在每种抗体的LC与其同源HC之间的界面中找到。在其它实施方案中，这种电荷对和/或接触半胱氨酸残基对可以存在于混合物中的一种或多种抗体中，而不需要存在于混合物中的所有抗体中。LC和HC中产生这种配对的改变分别称为HC配偶体定向改变和LC配偶体定向改变。每种抗体可以包含LC配偶体定向改变和/或HC配偶体定向改变的多个接触对，或者可以不包含成对的LC配偶体定向改变和/或HC配偶体定向改变。任选地，CH3结构域中可能存在不利于异源二聚HC/HC对形成的另外改变。此类改变可以存在于抗体中的一种或多种中，并且可以不存在于一种或多种抗体中。可以培养宿主细胞群或宿主细胞系，并且可以在细胞团和/或培养基中回收抗体混合物。可以进一步纯化抗体混合物，并且可以将所述混合物配制成适用于其药物用途。
在仅编码两种全长抗体(Ab1和Ab2)的DNA被引入宿主细胞并且每种抗体包含一种或多种HC配偶体定向改变和/或LC配偶体定向改变的实施方案中，使得形成很少(如果有的话)的非同源HC/LC对，则可以由所述宿主细胞产生两种(在本文中称为“MabPair”)或三种(在本文中称为“3合1混合物”)主要抗体种类。参见图1至图4。如果HC可以形成异源二聚HC/HC对，则可以由所述宿主细胞产生包含Ab1、Ab2和包含来自每种抗体的一条HC和一条LC的双特异性抗体的3合1混合物。如果抗体不形成异源二聚HC/HC对(任选地，由于一种或多种不利于异源二聚体形成的改变)，则将产生包含Ab1和Ab2的MabPair混合物。
在编码两种全长抗体(Ab1和Ab2)的DNA被引入宿主细胞中的替代策略中，所述抗体中只有一种抗体包含一种或多种HC配偶体定向改变和/或LC配偶体定向改变，并且所述抗体中的任一者或没有任何一者包含不利于异源二聚体的改变。参见图3。因此，在一些实施方案中，所述抗体中的一种可以不包含配偶体定向改变并且不包含不利于异源二聚体的改变，并且另一种可以包含一个或多个配偶体定向改变和一个或多个不利异源二聚体的改变。参见图3中的图A。或者，所述抗体中的一种可以包含一个或多个配偶体定向改变但不包含不利于异源二聚体的改变，而另一种抗体可以不包含配偶体定向改变但可以包含一个或多个不利于异源二聚体的改变。在另一实施方案中，两种抗体均不包含不利于异源二聚体的改变，并且仅一种抗体包含一个或多个配偶体定向改变。参见图3中的图B。
由宿主细胞群或宿主细胞系制备的抗体混合物的进一步纯化可涉及许多步骤。在一些实施方案中，将混合物施加到蛋白A或蛋白G亲和柱上，随后洗脱。也可以使用其它柱色谱步骤，诸如阳离子或阴离子交换色谱，包括如下所述的低pH阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、反相色谱或疏水相互作用色谱(HIC)。进一步的纯化步骤可包括渗滤以及许多可能方法。
此外，抗体混合物或编码抗体混合物的核酸可以经配制用于其预期用途。为了用作治疗剂，可以将抗体混合物配制成用于肠胃外给药，任选地用于注射的液体。其它种类的剂型例如凝胶剂、糊剂、霜剂，或固体也是可能的。制剂可以包含可以例如维持、修饰或保存抗体或核酸和/或控制因子(诸如pH、渗透压、粘度、透明度、气味、颜色、无菌性和/或体内释放或吸收速率)的成分。因此，制剂可包含通常用于此类制剂中的任何缓冲剂和/或赋形剂。这些成分的实例包括缓冲剂、抗微生物剂、螯合剂、盐、氨基酸和糖，以及许多可能的试剂。所配制的混合物的pH可以在约pH 5至约pH 8.5或约pH 6至约pH 8的范围内。
抗体的结合特异性可以通过类似于实施例8中所描述的结合测定来确定。
确定两种抗体是否竞争抗原上的特定结合位点或表位的方法通常包括以下步骤。首先，在不同量的竞争抗体(mAb2)存在下孵育生物素酰化的抗原。这些组合称为“样品”。然后将可以包含mAb2/抗原复合物以及未结合的mAb2和/或抗原的样品添加到微量滴定板中涂有另一种结合所述抗原的抗体(mAb1)的孔中。作为对照，可以在一些孔中添加包含在没有mAb2的情况下孵育的生物素酰化抗原的样品。然后洗涤平板以除去未结合的抗原。如果mAb1和mAb2不竞争，则mAb1可以与mAb2/抗原复合物以及游离抗原结合。在这种情况下，信号强度(与结合的抗原或mAb2/抗原复合物的量成比例)不会因样品中mAb2的存在而减弱。在一些情况下，mAb1和mAb2可以完全竞争，这意味着mAb1将结合游离抗原，但不结合mAb2/抗原复合物。在一些情况下，竞争可能会发生但不太完整。在这种情况下，mAb1与mAb2/抗原复合物的结合可以减少而不是完全不存在。在任一情况下，信号强度将因样品中mAb2/抗原复合物的存在而降低。通过以下步骤来检测信号：添加与辣根过氧化物酶(HRP)耦合的链霉抗生物素蛋白，洗涤平板，以及添加可通过比色测量检测到的HRP底物。洗涤平板，并停止反应以防止信号饱和。检测比色信号。如本文所述，如果通过本文所述的测试两种抗体竞争(完全或部分地竞争)与抗原结合，则据称它们与抗原上的相同表位结合。
混合物中抗体的HC可以是任何同种型，诸如IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA、IgM、IgE或IgD。当使用IgG4HC时，HC可以包含改变S228P，所述改变S228P阻止Fab臂交换。Silva等人(2015),J.Biol.Chem.290(9):5462-5469。这种重链的序列是本领域中已知的。参见例如Kabat等人，出处同上，在第661-723页处，该文献以引用方式并入本文。SEQ IDNO:23中提供了含有S228P改变的IgG4抗体的重链的氨基酸序列。重链可以来自任何物种，例如哺乳动物、人、灵长类动物、小鼠、或大鼠，或者重链可以例如使用噬菌体展示或使用人源化过程人工地产生。
类似地，两条不同的轻链可以是λ(λLC)或κ(κLC)链，所述链可以来自任何物种，并且任选地可以是哺乳动物，例如人或人源化抗体、灵长类抗体、鼠或大鼠抗体。轻链也可以人工地产生，例如使用噬菌体展示或人源化过程。λLC链和κLC链的氨基酸序列的许多实例是本领域中已知的，例如在Kabat等人，出处同上，第647-660页中报道的氨基酸序列，该文献以引用方式并入本文。这些序列中的位置是根据用于VL结构域的Kabat(Kabat等人，出处同上)编号系统和用于CL结构域的Edelman(Edelman等人，出处同上)编号系统确定的，如表9至表11所示和在随附文本中论述的。
重链和轻链均可含有如本文所述的一种或多种改变。每种改变可以是单个氨基酸的取代、插入或缺失。在一些实施方案中，每种改变是一种氨基酸被另一种氨基酸取代。任选地，改变是用带电氨基酸或半胱氨酸取代原始存在于该位点的氨基酸。在一些实施方案中，被取代的氨基酸可以是任何氨基酸。在一些实施方案中，除半胱氨酸之外的氨基酸可以取代半胱氨酸。除半胱氨酸之外的氨基酸可以是任何氨基酸，虽然在一些实施方案中所述氨基酸可以是丝氨酸、甘氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，用于替代原始氨基酸序列中的氨基酸的氨基酸选择是有限的。例如，在此类实施方案中，用于替代原始氨基酸的氨基酸可以是除以下氨基酸中的一种或多种之外的任何氨基酸：丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)。在其它实施方案中，原始氨基酸可以用上面刚刚叙述的二十种氨基酸组中的任何另一氨基酸替代。在其它实施方案中，原始氨基酸可以用具有相似特性的氨基酸组中的两种、三种或四种氨基酸和/或任何氨基酸替代，诸如下文所述的“保守”氨基酸取代。例如，此类组包括(1)精氨酸和赖氨酸，(2)丝氨酸和苏氨酸，(3)天冬氨酸和谷氨酸，或(4)天冬酰胺和谷氨酰胺等。
本领域的技术人员知道，存在于活生物中的氨基酸可以根据它们的特性进行分组，并且使用具有相似特性的氨基酸替代原始氨基酸被称为“保守取代”。在一些实施方案中，本文所述的改变可包括保守取代。如本文所述，保守取代包括以下替代：(1)用V、L或I取代A，(2)用K、Q或N取代R，(3)用Q取代N，(4)用E取代D，(5)用S或A取代C，(6)用N取代Q，(7)用D取代E，(8)用P或A取代G，(9)用N、Q、K或R取代H，(10)用L、V、M、A或F取代I，(11)用I、V、M、A或F取代L，(12)用R、Q或N取代K，(13)用L、F或I取代M，(14)用L、V、I、A或Y取代F，(15)用A取代P，(16)用T、A或C取代S，(17)用S取代T，(18)用Y或F取代W，(19)用W、F、T或S取代Y，以及(20)用I、M、L、F或A取代V。
序列中特定位点处的氨基酸和氨基酸取代在本文中表示如下。序列中的原始氨基酸之后接有重链或轻链氨基酸序列中的位置编号(使用表5至表11中所示的编号系统)，之后接有用作替代的氨基酸。例如，HC中的K409E意指最初存在于HC中的位置409处的赖氨酸被谷氨酸取代。如果重链中的位置409可原始包含两种不同氨基酸(例如，K或R)中的任一者，并且这些氨基酸可用两种氨基酸(例如，D或E)中的任一者替代，则这可以表示为K/R409D/E。该名称意指原始存在于位置409处的赖氨酸或精氨酸可以用天冬氨酸或谷氨酸替代。在一些情况下，未定义原始氨基酸。例如，HC中的409D意指氨基酸409是天冬氨酸，并且原始氨基酸的身份未定义并且可以是任何氨基酸，包括天冬氨酸。类似地，名称K409意谓位置409处的原始氨基酸是赖氨酸(并且没有改变)。
表5至表11说明了在一些情况下在人或灵长类HC和LC中，HC和LC之间的序列共有水平。可变区的氨基酸序列不同，特别是在互补决定区(CDR，其在表5和表9中以粗斜体数字显示)中不同。然而，围绕CDR的框架区更加保守并且在许多位置处含有高度保守的氨基酸。许多普遍保守或几乎普遍保守的氨基酸，例如VH中的位置4、36、38和39和VL中的位置98、99、101、102在来自非人物种的VH区和VL区中也是保守的。此外，VH和VL中的许多其它位点是在可变结构域的特定组内高度保守的，尽管不是在所有VH和VL中都是高度保守的。HC和LC中的恒定结构域显示出比可变结构域更高程度的序列保守性并且含有许多高度保守的氨基酸。参见表6至表8和表10至表11。使用这些高度保守的氨基酸，本领域的技术人员将能够将大部分免疫球蛋白结构域与Kabat等人，出处同上中公开的序列进行比对以根据Kabat等人，出处同上或Edelman等人，出处同上的系统来分配这些VH和VL的编号。
本文所述混合物中的抗体可包含HC配偶体定向改变和/或LC配偶体定向改变。HC配偶体定向改变和/或LC配偶体定向改变起到确保每个LC与其同源HC配对并且反之亦然的功能。在没有此类改变的情况下，在用编码仅两种具有不同HC和LC的不同全长抗体的DNA转染的宿主细胞中可能形成至多十种不同种类的抗体。参见图4。当然，在用编码三种或四种具有不同的HC和LC并且缺乏配偶体定向改变的不同全长抗体的DNA转染的宿主细胞中可能形成更多的种类。然而，如果仅发生同源HC/LC配对，则这些数字将大大减小。如果仅发生同源二聚HC/HC配对，则种类的数量将进一步减少。由于在没有配偶体定向改变的情况下许多可能的种类将具有非同源HC/LC配对，因此一些所得抗体可能不与任何表位结合并且可能因此缺乏所需功能。鉴于对药品均匀性的非常严格的要求，这种复杂的混合物不太可能获得监管部门的批准而用作治疗剂。
如本文所解释的，HC配偶体定向改变和LC配偶体定向改变可发生在上表12中列出的CH1结构域和CL结构域中的接触位点处和/或在如下文说明的VH结构域和VL结构域中的接触位点处。本文所述混合物中的抗体可在其HC和/或LC中包含一个或多个LC配偶体定向改变和/或HC配偶体定向改变，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个此类改变和/或不超过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、或20个此类改变。在一些实施方案中，混合物中的至少一种抗体可以缺乏此类改变。
在一些实施方案中，这些改变包括在原始不具有带电氨基酸的位点处进行带电氨基酸取代，或者在原始含有带相反电荷的氨基酸的位点处进行带电氨基酸取代。在编码两种不同全长抗体(其中这两种抗体的HC和LC不同)的DNA被引入宿主细胞的实施方案中，LC配偶体定向改变和HC配偶体定向改变可以发生在所述两种不同LC和HC中的相同位点处，从而导致以下情况：(1)两种不同的LC在相同的LC位点处具有带相反电荷的氨基酸，(2)两种不同的HC在接触LC位点的HC位点处具有带相反电荷的氨基酸，以及(3)对于每个同源LC/HC配对，LC位点处的带电氨基酸与接触HC位点处的氨基酸电荷相反。在这种情况下，同源LC与HC之间的相互作用因带相反电荷的氨基酸之间的相互作用而得到加强，并且由于位于非同源HC/LC对中的接触位点处的具有相同电荷的氨基酸的排斥，而非常不利于非同源LC/HC配对之间的相互作用。参见图1至图2。在其它实施方案中，仅一种抗体包含有利于同源HC/LC配对的电荷对。参见图3。在这种情况下，电荷对中的氨基酸中的一个氨基酸可以由配偶体定向改变产生，其中带电氨基酸残取代带相反电荷的氨基酸残基。在这种情况下，由于排斥电荷相互作用，预计将不利于一些非同源HC/LC配对。任选地由HC配偶体定向改变和/或LC配偶体定向改变产生的接触电荷对的实例包括但不限于以下：44D/E(HC)和100R/K(LC)；44R/K(HC)和100D/E(LC)；105E/D(HC)和43R/K(LC)；105R/K(HC)和43E/D(LC)；133R/K(HC)和117D/E(LC)；133D/E(HC)和117R/K(LC)；137R/K(HC)和114D/E(LC)；137D/E(HC)和114R/K(LC)；137R/K(HC)和116D/E(LC)；137D/E(HC)和116R/K(LC)；147R/K(HC)和124D/E(LC)；147D/E(HC)和124R/K(LC)；147R/K(HC)和129D/E(LC)；147D/E(HC)和129R/K(LC)；147R/K(HC)和131D/E(LC)；147D/E(HC)和131R/K(LC)；147R/K(HC)和178D/E(LC)；147D/E(HC)和178R/K(LC)；147R/K(HC)和180D/E(LC)；147D/E(HC)和180R/K(LC)；168D/E(HC)和164R/K(LC)；168R/K(HC)和164D/E(LC)；168D/E(HC)和167R/K(LC)；168R/K(HC)和167D/E(LC)；168D/E(HC)和174R/K(LC)；168R/K(HC)和174D/E(LC)；170D/E(HC)和162R/K(LC)；170R/K(HC)和162D/E(LC)；173D/E(HC)和160R/K(LC)；173R/K(HC)和160D/E(LC)；173D/E(HC)和162R/K(LC)；173R/K(HC)和162D/E(LC)；175D/E(HC)和160R/K(LC)；175R/K(HC)和160D/E(LC)；175D/E(HC)和180R/K(LC)；175R/K(HC)和180D/E(LC)；176D/E(HC)和160R/K(LC)；176R/K(HC)和160D/E(LC)；181R/K(HC)和178D/E(LC)；181D/E(HC)和178R/K(LC)；183R/K(HC)和176D/E(LC)；183D/E(HC)和176R/K(LC)；190R/K(HC)和116D/E(LC)；190D/E(HC)和116R/K(LC)；190R/K(HC)和137D/E(LC)；190D/E(HC)和137R/K(LC)。
在例如编码两种全长抗体(包含HC1和LC1的第一抗体和包含HC2和LC2的第二抗体)的DNA被引入宿主细胞的实施方案中，在HC/LC对的一对接触位点中的一个或两个位点可能已含有带电氨基酸。例如，在一些情况下，LC1可以在与同源HC1中不包含带电氨基酸的位点接触的位点处包含带电氨基酸，或反之亦然。在一个具体实例中，人CL结构域中的位置160可包含谷氨酸(E)，而人CH1结构域中的接触位点173、174和175通常分别包含V、L和Q。在这种情况下，接触CH1位点中的一个位点，例如173可以被改变为使得其与CL结构域中的位置160中的E电荷相反，即位置173可以用R或K取代。HC2中的相同位点可以被改变为与HC1中的所述位点处的带电荷氨基酸电荷相反的带电氨基酸(即，该位点可以用D或E取代)，并且LC2中的接触位点可以被改变为与LC1中的带电氨基酸电荷相反的带电氨基酸(即，LC2中的位置160可以用R或K取代)。
同源HC/LC对中的一个或多个接触位点已经包含一个或多个带电氨基酸的其它情况可以类似地处理，最终目标是在同源HC/LC对中的接触位点处产生带相反电荷的氨基酸。在一些实施方案中，可以改变同一对接触位点，使得它们在两种抗体中包含带相反电荷的氨基酸，前提条件是HC位点处的氨基酸的电荷在HC1和HC2中是相反的，并且LC位点处的电荷在HC1和HC2中也是相反的。
类似地，例如在编码两种全长抗体(包含HC1和LC1的第一抗体和包含HC2和LC2的第二抗体)的DNA已被引入宿主细胞的实施方案中，如果HC1和LC1中的接触位点包含带相反电荷的氨基酸，则HC2和LC2中的相同位点可以分别用与HC1和LC1中存在的氨基酸电荷相反的氨基酸替代。
在将编码两种不同全长抗体的DNA引入宿主细胞的其它实施方案中，LC配偶体定向改变和HC配偶体定向改变可以发生在两种不同LC和HC中的不同位点处，从而导致以下情况：(1)一种LC及其同源HC各自在接触位点处具有带相反电荷的氨基酸，并且(2)另一种LC及其同源HC各自在与第一LC/HC对中使用的接触位点不同的接触位点处具有带相反电荷的氨基酸。在这些实施方案中，HC配偶体定向改变和LC配偶体定向改变用于加强同源HC/LC对之间的相互作用。
在其它实施方案中，如本文所述的混合物中的一种或多种抗体可以不包含配偶体定向改变。在此类实施方案中，混合物中的另一种抗体可包含一个或多个配偶体定向改变。
在其它实施方案中，由于在同源HC/LC对中的接触位点处的半胱氨酸取代，HC配偶体定向改变和LC配偶体定向改变可导致二硫桥的产生。在例如将编码两种不同全长抗体的DNA引入宿主细胞的实施方案中，这种LC配偶体定向改变和HC配偶体定向改变可以在两种不同的LC和HC中的不同位点处发生，从而导致以下情况：同源LC/HC对在接触位点处具有半胱氨酸取代，而非同源LC/HC对在接触位点处不具有半胱氨酸取代。参见图1至图3。因此，两种不同的同源HC/LC对将在HC/LC界面的不同位置处具有二硫桥，而非同源HC/LC对将不具有这种二硫桥，因为取代的半胱氨酸残基不够接近而不能形成二硫桥。因此，在这些实施方案中，HC配偶体定向改变和LC配偶体定向改变用于加强同源HC/LC对之间的相互作用。在其它实施方案中，混合物中的一种或多种抗体，而不是混合物中的所有抗体，可以在同源HC/LC对中的接触位点处包含半胱氨酸。接触残基处的半胱氨酸取代对的实例包括例如以下成对的改变：126C(HC)和121C(LC)；126C(HC)和124C(LC)；127C(HC)和121C(LC)；128C(HC)和118C(LC)；133C(HC)和117C(LC)；133C(HC)和209C(LC)；134C(HC)和116C(LC)；141C(HC)和116C(LC)；168C(HC)和174C(LC)；170C(HC)和162C(LC)；170C(HC)和176C(LC)；173C(HC)和160C(LC)；173C(HC)和162C(LC)；以及183C(HC)和176C(LC)。
在一些实施方案中，通常形成HC与LC之间的二硫桥的一部分的一个或多个半胱氨酸残基可以用本文所述的混合物中的至少一种抗体中的另一种氨基酸替代。例如，在人IgG1抗体中，HC中的位置220处和LC中的位置214处的半胱氨酸在HC与LC之间形成二硫桥。这些氨基酸可以用其它氨基酸(例如丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸)替代，从而消除HC/LC二硫桥。类似的改变可以在其它IgG同种型(即，IgG2、IgG3或IgG4)抗体中以相似或不同的二硫键形成模式进行，其中参与HC/LC二硫键形成的半胱氨酸残基可以用其它氨基酸取代。例如，在人IgG2和IgG4抗体中，位置131(HC)和位置214(LC)处的半胱氨酸可以用其它氨基酸取代。此类改变可以削弱非同源HC/LC配对以及同源HC/LC配对，因为非同源对也将不能形成通常的链间二硫桥。同源HC/LC配对可以通过例如添加配偶体定向改变到缺乏通常二硫桥的同源HC/LC对中来加强。此类配偶体定向改变可包括在HC和/或LC中的接触残基处进行半胱氨酸取代以产生新的二硫桥，和/或在HC和/或LC中的接触残基处进行引入带电氨基酸的取代以产生电荷对。参见图3。
在编码至少两种且不超过四种具有不同HC和LC的不同全长抗体的DNA被引入宿主细胞的情况下，如果抗体的HC不含有任何不利于异源二聚体的形成的改变，则通常可以发生异源二聚HC/HC配对。如果已经引入了编码仅两种不同全长抗体的DNA并且只能形成同源HC/LC对(由于HC配偶体定向改变和/或LC配偶体定向改变)，则这将导致形成三种不同的主要抗体种类(本文称为“3合1混合物”)，即两种起始抗体加上包含来自每种起始抗体的同源HC/LC对的双特异性抗体。参见图2至图4。如下文参考含有两种结合不同表位的抗HER2抗体的混合物所解释的，这对于一些混合物可能是有利的情况。
在编码两种具有不同HC和LC的不同全长抗体的DNA已被引入宿主细胞的一些实施方案中，两种抗体中的至少一种的HC可以包含一个或多个不利于HC/HC异源二聚配对形成的改变。如果基本上只有同源二聚HC/HC对可以形成并且基本上只有同源HC/LC对可以形成(由于HC配偶体定向改变和/或LC配偶体定向改变和/或所述抗体中的至少一种抗体中HC/LC二硫桥的消除)，则这将导致形成仅两种不同的主要抗体种类(本文称为“MabPair”混合物)，即两种起始全长抗体。参见图1和图3。在药物生产过程的情境下，这导致以下有利的情况：可以使用单一生产方法在单一细胞系中生产基本上由两种不同抗体组成的药物产品。不利于异源二聚体形成的改变(包括在一些情况下存在于原始序列中的氨基酸)的实例包括但不限于以下：一条HC中为409D/E加上399R/K，其中另一条HC在位置409处具有精氨酸(例如，在人IgG 4抗体中)；一条HC中为409D/E、399R/K加上392D/L/Y/M/W/I/V/F，其中另一条HC在位置409处具有精氨酸；一条HC中为392E/D加上399R/K，并且另一条HC中为392K/R加上399D/E；一条HC中为399K/R、409D/E加上392D/E，并且另一条HC中为399D/E、409K/R加上392K/R；一条HC中为399K/R、409D/E、356K/R加上392D/E，并且另一条HC中为399D/E、409K/R、356D/E加上392K/R；一条HC中为399K/R、409D/E、357K/R加上392D/E，并且另一条HC中为399D/E、409K/R、357D/E加上392K/R；一条HC中为399K/R、409D/E、356K/R加上438D/E，并且另一条HC中为399D/E、409K/R、356D/E加上438K/R；一条HC中为399K/R、409D/E、357K/R加上370D/E，并且另一条HC中为399D/E、409K/R、357D/E加上370K/R；一条HC中为399K/R、409D/E、356K/R、392D/E、357K/R加上370D/E，并且另一条HC中为399D/E、409K/R、356D/E、392K/R、357D/E加上370K/R；一条HC中为399K/R、409D/E、356K/R、392D/E、357K/R加上439D/E，并且另一条HC中为399D/E、409K/R、356D/E、392K/R、357D/E加上439K/R；一条HC中为366Y/W加上407T/A，并且另一条HC中为366T/A加上407Y/W；一条HC中为405A/T加上394W/Y，并且另一条HC中为405W/Y加上394A/T；一条HC中为407Y/W，并且另一条HC中为366Y/W；一条HC中为366Y/W、407T/A加上405A/T、394W/Y，并且另一条HC中为366T/A、407Y/W加上405Y/W加上394A/T；以及一条HC中为366W/Y、368A/T加上407V/T/A，并且另一条HC中为366T/A/S、368L加上407Y/W。
在其它实施方案中，可以引入影响如本文所述的混合物中的一种或多种抗体的药代动力学特性的一种或多种改变。例如，体内半衰期或曲线下面积(AUC)可以通过改变如M252A、M252L、M252S、M252R、R255K或H435R而缩短。可以引入影响抗体混合物中一种或多种抗体的药代动力学特性的其它改变。
抗体
本文描述了包含本文所述的配偶体定向改变的抗体。此类抗体可以是包含VH、CH1、VL和CL结构域的任何形式的抗体。在一些实施方案中，此类抗体可以是全长IgG抗体，所述全长IgG抗体可以是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体，所述全长IgG抗体可以是哺乳动物抗体，例如，灵长类抗体、人抗体和/或人源化抗体。这些抗体包括例如这样的抗体，所述抗体包含例如灵长类、人和/或人源化CL和IgG1CH1结构域，所述结构域分别在HC和LC中的以下位点对中的一个或多个位点对处包含一个或多个电荷对(其可由配偶体定向改变产生)：147和131；168和174；以及181和178。其它实施方案包括这样的抗体，所述抗体包含例如灵长类、人和/或人源化CL和IgG4CH1结构域，所述结构域分别在HC和LC中的以下位点对中的一个或多个位点对处包含一个或多个电荷对(其可由配偶体定向改变产生)：147和131；168和174；以及181和180。在其它实施方案中，本文描述了包含例如灵长类、人和/或人源化CL和IgG1CH1结构域的抗体，其中所述抗体在CH1结构域和CL结构域中的接触位点处包含一对或多对半胱氨酸残基，其中这些半胱氨酸残基分别的CH1和CL位置可以为以下对中的任何一个或多个对：126和124；128和118；133和117；134和116；168和174；170和162；170和176；以及173和160。在其它实施方案中，本文描述了包含例如灵长类、人和/或人源化CL和IgG4CH1结构域的抗体，其中所述抗体在CH1结构域和CL结构域中的接触位点处包含一对或多对半胱氨酸残基，其中这些半胱氨酸残基分别的CH1和CL位置可以为以下残基对中的任何一个或多个残基对：126和124；127和121；128和118；168和174；170和162；以及173和162；
在另一个实施方案中，本文描述了IgG2抗体，任选地是人、灵长类和/或人源化抗体，所述抗体缺乏连接HC和LC的天然存在的二硫桥并且在HC和LC两者中都含有可产生一个或多个新的二硫桥的一个或多个取代。例如，在人、人源化和/或灵长类IgG2HC中的位置131处的半胱氨酸可以用另一种氨基酸(例如，丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸)替代，并且同源LC中的位置214处的半胱氨酸可以用另一种氨基酸(例如，丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸)替代。这些取代将消除IgG2HC与其同源LC之间天然存在的二硫桥。通过在一对接触残基的每个残基处引入半胱氨酸取代可以产生新的二硫桥，其中一个残基在IgG2HC中，而另一个残基在LC中。例如，HC中的取代F170C和LC中的S162C是在接触残基处的这样一对半胱氨酸取代，HC中的V173C和LC中的Q160C也是如此。也可以使用其它接触残基对处的其它半胱氨酸取代。该方法可以避免由于已经在天然人IgG2抗体中观察到的二硫键改组而形成多种IgG2结构异构体。参见例如Lightle等人(2010),Protein Science 19:753-762。当制备用作治疗剂的抗体时，多种结构异构体的形成可能是不利的，因为通常均相制备物是优选的。
可以使用本领域中的标准方法制备上述抗体中的任何抗体。例如，可以通过以下方式制备抗体：(1)将编码抗体的一种或多种DNA，任选地在一种或多种适当的载体中，引入宿主细胞，(2)在有利于所述抗体表达的条件下培养宿主细胞，以及(3)从细胞上清液或宿主细胞团中获得所述抗体。
由抗体和/或抗体混合物结合的靶分子
本文所述混合物中的不同抗体结合不同的表位并且可结合一种或多种靶分子。可以根据各种分子在疾病状态中的作用的了解来选择本文所述的抗体和/或抗体混合物的靶分子，任选地蛋白质。在一些实施方案中，所述疾病是人疾病，并且靶分子是一种或多种人蛋白质。类似地，上述抗体可以与这些靶分子中的一种结合。
在一个实例中，抗体混合物的靶蛋白可以是一种或多种用作抑制或阻断免疫系统活性的检查点的蛋白质。由于免疫系统可以识别癌症和感染并且免疫系统可以调节甚至消除肿瘤和感染，因此阻止调节或阻断免疫系统活性能够潜在地限制癌细胞的生长或消除感染，在一些实施方案中消除病毒感染。检查点阻断抗体，诸如针对细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)和程序性死亡1受体(PD1)的抗体，已经在治疗扩大的恶性肿瘤列表中显示出前景。虽然CTLA4和PD1均用作负调节因子，但它们各自在调控免疫应答中起非冗余作用。CTLA4使稚T细胞和记忆T细胞的早期活化衰减，并且PD1主要经由与其配体、PD-L1和PD-L2相互作用来参与调控外周组织中的T细胞活性。单个抗体也可以与这些靶蛋白中的任一靶蛋白结合。
越来越多的临床证据表明，检查点阻断抗体在快速扩展的实体肿瘤谱中的作用有前景，所述实体肿瘤谱包括非小细胞肺癌、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈癌和胃癌。虽然阻断CTLA4或PD1途径抑制多种肿瘤类型的生长，但总体应答率仍然很低，强调了改进现有选择的重要性。迄今为止，在具有未治疗的黑素瘤的患者中，用抗-CTLA4(伊匹单抗)和抗-PD1(纳武单抗)途径阻断剂研究的联合检查点阻断已显示出比单独使用伊匹单抗或单独使用纳武单抗更好的临床效力。Larkin等人(2015),New Engl.J.Med.373:23-34。在具有程序性细胞死亡1配体(PD-L1；也称为PDCD1LG1、PDCD1L1、B7H1和CD274)阳性肿瘤的黑素瘤患者中，单独用纳武单抗治疗的无疾病进展生存期与使用纳武单抗加上伊匹单抗治疗观察到的无疾病进展生存期基本上相同，并且高于单独用伊匹单抗治疗观察到的无疾病进展生存期。Larkin等人，出处同上。在患有PD-L1阴性肿瘤的患者中，联合治疗导致比单独用纳武单抗或伊匹单抗时观察到的更长的无疾病进展生存期。Larkin等人，出处同上。这些数据为包括阻断两种或更多种免疫系统检查点蛋白的两种或更多种抗体的抗癌治疗提供了强有力的理论基础。目前正在进行使用另一种抗PD1抗体帕姆单抗(prembrolizumab)的类似研究。此类混合物可以通过使用本文所述的方法制备例如MabPair混合物或3合1抗体混合物来制备。
在制备不同免疫检查点阻断抗体的混合物的情境下，抗体的同种型可能是重要的，因为不同的同种型可以引发不同的效应子功能。在五种免疫球蛋白同种型中，免疫球蛋白G(IgG)在人血清中最丰富。四种IgG亚型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区不同，特别是在它们的铰链和上部CH2结构域中。这些区域参与与IgG-Fc受体(FcγR)的结合，这可以启动抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或吞噬作用(ADCP)和C1q，C1q可以启动补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，不同的亚型具有不同的效应子功能。IgG1和IgG3抗体可以引发有效的效应子应答，包括ADCC、ADCP和CDC，而IgG2和IgG4抗体引发更微妙的效应子应答并且仅在某些情况下如此做。对可溶性蛋白质抗原和膜蛋白的抗体应答主要诱导IgG1抗体的产生，伴随着较低水平的其它IgG亚型，主要是IgG3和IgG4的产生。Ferrante等人(1990),Pediatr.Infect.Dis.J.9(增刊8):S16–24。
对于治疗性抗体，IgG1是迄今为止最流行的选择。设计用于选择性根除癌细胞的抗体通常需要能够引发有效补体激活和效应子介导的ADCC细胞杀伤的同种型。虽然IgG1和IgG3都符合这些标准，但IgG3尚未用于治疗性抗体开发，可能是因为半衰期较短、相对长的铰链区对蛋白水解的敏感性以及广泛的同种异型多态性。
抗体同种型可以是用于治疗癌症的抗CTLA4抗体的重要考虑因素。临床前数据表明，检查点阻断抗CTLA4抗体可通过杀伤肿瘤内的调节性T(Treg)细胞而提供其大部分疗效，从而释放CD8T细胞介导的抗肿瘤免疫。Simpson等人(2013),J Exp Med.210(9):1695-1710。类似的机制可能在人患者中起作用。伊匹单抗是一种人IgG1抗CTLA4抗体，其最近被证实导致ADCC介导的人Treg离体裂解。Romano等人(2015),Proc.Natl.Acad.Sci.112(19):6140-6145。此外，在一项小型临床研究中，对伊匹单抗有响应的黑色素瘤患者具有显著更高的非经典单核细胞基线频率和更活化的表达FcγRIII的肿瘤相关巨噬细胞，这与治疗后较低的肿瘤内Treg数量相关，表明在这些患者中发生了Treg缺失。因此，IgG1或IgG3同种型可能有利于用于治疗癌症的抗CTLA4抗体，因为如果抗体引起对肿瘤内Treg细胞的有效杀伤，则抗体可能具有最大效果。
抗PD-1抗体的所选IgG同种型通常是IgG4或具有最小的FcγR相互作用的突变IgG1。PD1在活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞的表面上表达，并负调节免疫应答。由于PD1在这些效应细胞上表达，可能不期望使用能够引起强烈的效应子功能的同种型，即IgG1或IgG3，因为这可能会导致杀伤本来可以杀伤癌细胞的活化T细胞。
因此，在制备含有抗CTLA4抗体和抗PD1抗体的混合物的抗癌治疗剂时，包含双特异性抗CTLA4抗PD1抗体可能是不合适的，因为如上所述，不同的效应子功能适用于所述两个结合结构域中的每一者。此外，借助于抗PD1和抗CTLA4双特异性抗体使调节性T细胞和效应T细胞物理上紧密接近的效果是不可预测的。可能需要基本上由单特异性IgG1抗CTLA4抗体和单特异性IgG4(或经修饰的IgG1)抗PD1抗体组成的混合物。此类MabPair混合物可以使用本文所述的不利于异源二聚体的改变和LC配偶体定向改变和HC配偶体定向改变，在如本文所述的单个宿主细胞中制备。
此外，免疫检查点蛋白的其它组合可以用作抗体的MabPair混合物或3合1混合物的靶标。在不同同种型适合于每个结合结构域的情况下(如在CTLA4和PD1的情况下)，MabPair混合物可为优选的，使得在大多数或所有情况下每个结合结构域将附着于所需的恒定区。在相同同种型适用于两个结合域的情况下，可以使用MabPair混合物或3合1混合物。
在另一个实例中，人表皮生长因子受体(HER)蛋白家族，即HER1、HER2、HER3和HER4，在细胞存活和增殖中起重要作用并且已经与肿瘤发生有关。这些蛋白质能够形成异源二聚体和同源二聚体，所述异源二聚体和同源二聚体可以激活调节许多细胞过程(包括生长、增殖和存活)的信号转导途径。HER2的过表达与人乳腺癌患者的侵袭性疾病和不良预后相关。用抗HER2抗体，如(被称为曲妥单抗的人源化抗HER2抗体的商标名)治疗此类患者，无论是否使用拉帕替尼(lapatinib)(小分子酪氨酸激酶抑制剂)，都可以提高生存期。曲妥单抗结合HER2的结构域IV并通过激活抗体依赖性细胞毒性(ADCC)抑制HER2介导的细胞增殖，从而阻止p95HER2(HER2的截短和组成型活性形式)的形成、阻断配体非依赖性HER2信号传导、并抑制HER2-介导的血管生成。
被称为帕妥珠单抗的不同人源化抗HER2抗体结合与曲妥单抗不同的表位(在HER2的结构域II中)并抑制HER2与诸如HER3和HER1之类的其它HER家族成员的二聚化，从而抑制与肿瘤生长和进展相关的下游信号传导过程。帕妥珠单抗与曲妥单抗的组合与任一单独药剂相比具有强烈增强的抗肿瘤效应，并且在异种移植模型中诱导肿瘤消退(Yamashita-Kashima(2011),Clin.Cancer Res.17(15):5060-5070；Scheuer等人(2009),Cancer Res69:9330-9336)，这是任一单一疗法无法实现的。在抗HER2曲妥单抗单药治疗期间，在肿瘤进展后也观察到了该组合的增强效力。曲妥单抗预处理不会损害帕妥珠单抗与肿瘤的结合。此外，曲妥单抗和帕妥珠单抗均有效激活ADCC。强烈增强的抗肿瘤活性可能是由于曲妥单抗和帕妥珠单抗的作用机制不同且互补。潜在地，可以同时结合一个或多个HER2蛋白分子上的两个表位的双特异性抗体可能具有与两种单独抗体不同的活性，可能为更大或更小的活性。在一些情况下，与单个靶蛋白上的两个不同表位结合的双特异性抗体可能不能同时结合单个靶蛋白上的所述两个表位。因此，有理由相信用两种或更多种结合不同表位的抗HER2抗体(任选地包括双特异性抗体)进行治疗可以比用单一抗体进行治疗更有效。
因此，本文所述的方法可用于制备含有两种或更多种不同抗HER2抗体的混合物。例如，可以制备MabPair混合物或3合1抗体混合物。此类混合物可以用于治疗乳腺癌患者的子集，即那些患有过表达HER2的癌症的患者，以及患有HER2介导的癌症的可能其它癌症患者。
此外，本文描述的方法可用于制备结合其它癌抗原(即在癌细胞上过表达的蛋白质)的抗体的混合物。在大多数情况下，IgG1和/或IgG3同种型将是所需的，因为杀伤癌细胞是治疗目标。例如，混合物中的抗体可以结合单个癌抗原上的不同表位。或者，如果癌细胞表达多种不同的癌抗原，则混合物中的抗体可以结合不同的癌抗原。在任一情况下，混合物可以是例如MabPair混合物或3合1混合物，具体取决于靶蛋白的生物学作用。
本文所述的抗体混合物的靶分子对的实例包括但不限于以下靶蛋白对(显示为第一靶蛋白/第二靶蛋白)，所述靶蛋白可以是人蛋白：PD1/CTLA4、PD1/淋巴细胞激活基因3(LAG3)、PD1/糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关基因(GITR；也称为AITR或TNFRSF18)、PD1/血管内皮生长因子A(VEGF；也称为VEGFA)、PD1/集落刺激因子1受体(CSF1R；也称为FMS，c-FMS和CD115)、PD1/OX40(也称为TNFRSF4、ACT35和CD134)、PD1/具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、PDL1/CTLA4、PDL1/VEGF、PDL1/OX40、PDL1/CSF1R、PDL1/TIGIT、PDL1/含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的蛋白3(TIM3，也称为HAVCR2)、CTLA4/VEGF、CTLA4/41BB(也称为TNFRSF9、ILA和CD137)、跨膜4结构域亚家族A成员1(CD20；也被称为MS4A1和B1)/白细胞表面抗原CD37(CD37)、血管生成素2(ANG2；也称为ANGPT2)/VEGF、肿瘤坏死因子(TNF；也称为TNFA和恶液质素(cachetin))/白细胞介素17a(IL17a；也称为CTLA8)、CD38抗原(CD38)/CD138抗原(CD138；也称为SDC1和SYND1)、表皮生长因子受体(EGFR；也称为ERBB1、HER1和SA7)/HER2、EGFR/HER3、MET原癌基因(MET；也称为HGFR)/VEGF、MET/EGFR、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)/白细胞介素33(IL33；也称为C9ORF26、NFHEV和IL1F11)、白细胞介素4(IL4；也称为BSF1)/白细胞介素13(IL13)、HER2/HER2、PD1/CD96、PD1/蛋白质-酪氨酸磷酸酶、非受体型底物-1(也称为SIRP-α-1、PTPNS1、SIRPA、SHPS1、MYD1和MFR)、以及PD1/趋化因子CC基序受体8(也称为CCR8趋化因子CC基序受体样2(CMKBRL2)、趋化因子受体样1(CKRL1)和CMKBR8)。单一抗体也可以与这些靶分子中的任一靶分子结合。
上面论述的特定靶标的示例是示例性的。可以使用本文描述的方法制备结合任何靶标或这些靶标的组合的抗体和/或抗体混合物。
编码抗体和抗体混合物的核酸和载体
本发明提供了编码本文所述的抗体和抗体混合物的核酸，例如DNA。编码免疫球蛋白结构域(例如VH、VL、铰链、CH1、CH2和CH3结构域)的许多核酸序列是本领域中已知的。参见例如Kabat等人，出处同上。使用本文提供的指导，本领域技术人员可以组合编码抗体的已知或新型核酸序列并通过已知方法对所述核酸序列进行修饰，以产生编码本文所述抗体和抗体混合物的核酸，所述核酸包含本文所述的改变。
修饰核酸的方法是本领域中熟知的。用于产生修饰的核酸的可能最直接的方法是合成具有所需序列的核酸。许多公司，例如DNA 2.0(Menlo Park,Calif.,USA)、BlueHeron(Bothell,Washington)、Ge newiz(South Plainfield,New Jersey)、Gen9(Cambridge,Massachus etts)和Integrated DNA Technologies(Coralville,Iowa；IDT)提供这种服务。也可以采用其它已知的引入突变的方法，例如使用聚合酶链式反应(PCR)的定点诱变。参见例如Zoller(1991),Curr.Opin.Biotechnol.2(4):526-531；Reikofski和Tao(1992),Biotechnol.Adv.10(4):535-547。例如，下面的实施例2描述了使用商业试剂盒将特定突变引入起始D NA中。
含有编码抗体的HC和LC的DNA的DNA载体可以是适用于在所选宿主细胞中表达抗体的任何载体。载体可包括用于选择含有载体的宿主细胞和/或用于在宿主细胞中维持和/或扩增载体的选择标记。此类标记包括例如(1)赋予原核宿主细胞对抗生素或其它毒素(例如，氨苄青霉素、四环素或卡那霉素)的抗性的基因，(2)补充细胞的营养缺陷的基因，或(3)这样的基因，所述基因的运行供应无法从复杂或限定的培养基中获得的关键营养素。特异性选择标记包括卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。新霉素抗性基因也可用于原核和真核宿主细胞的选择。如本领域中已知的，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因和/或无启动子的胸苷激酶基因可用于哺乳动物细胞中。
另外，载体可以含有维持载体和/或表达编码本文所述的抗体/或抗体混合物(例如，本文所述的抗体混合物的HC和LC)的插入序列所必须的各种其它序列元件。此类元件包括例如复制起点、启动子、一个或多个增强子、转录终止子、核糖体结合位点、多腺苷酸化位点，以及外源序列(诸如编码本文所述的抗体混合物的DNA)的多接头插入位点。这些序列元件可经选择以在所需宿主细胞中起作用，从而促进载体的复制和/或扩增以及插入所述载体中的异源序列的表达。此类序列元件在本领域中是熟知的，并且可以在大批商购可得的载体中获得。许多载体可从包括Promega Corporation(Madison,WI,USA)和AgilentTechnologies(Santa Clara,CA,USA)以及许多其它公司在内的公司商购获得。
可以使用任何合适的方法将编码两种或更多种抗体中的每一种抗体的DNA引入宿主细胞群中，所述方法包括例如转染、转导、转化、用微粒轰击，显微注射或电穿孔。在一些实施方案中，将编码两种全长IgG抗体的DNA引入宿主细胞中。此类方法是在本领域中已知的，并且在例如Kaestner等人(2015),Bioorg.Med.Chem.Lett.25:1171-1176中描述，该文献以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，编码抗体或抗体混合物的核酸可以携带在一种或多种病毒载体上。此类病毒载体的实例包括腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、改良安卡拉痘苗病毒(MVA)载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体或痘病毒载体。在此类实施方案中，可以将这些含有编码所述混合物或抗体的核酸的病毒载体施用于患者以治疗疾病。在癌症患者中，可以将含有编码抗体混合物的核酸的此类病毒载体直接施用于患者的肿瘤或癌细胞主要部位，例如通过注射、吸入(用于肺癌)、局部施用(用于皮肤癌)和/或施用于粘膜(透过粘膜可以吸收核酸)以及许多可能的途径。
类似地，编码如本文所述的抗体混合物的核酸可以被包封在脂质体中，可以施用于患有疾病的患者。
可以产生抗体混合物的宿主细胞
引入了编码抗体的DNA的宿主细胞可以是适用于表达重组蛋白的多种细胞中的任一种。这些细胞包括例如革兰氏阴性或革兰氏阳性原核细胞，例如细菌，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)。在其它实施方案中，宿主细胞可以是真核细胞，包括诸如以下物种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或克鲁维酵母属真核细胞、假丝酵母、夜蛾(Spodotera)，或能够表达异源多肽的任何细胞。在其它实施方案中，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。适于表达异源多肽的许多哺乳动物细胞是本领域中已知的，并且可以从包括例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)在内的各种供应商获得。合适的哺乳动物细胞包括例如COS-7系(ATCC CRL1651)(Gluzman等人，1981,Cell 23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或它们的衍生物如在无血清培养基中生长的Veggie CHO和相关细胞系(Rasmussen等人，1998,Cytotechnology 28:31)、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞(例如，ATCC CRL 10)、如由McMahan等人，1991,EMBO J.10:2821所述来源于非洲绿猴肾细胞系CVI的CVI/EBNA细胞系(ATCC CCL 70)、人胚肾(HEK)细胞如293、293EBNA或MSR 293、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、HL-60细胞、U937细胞、HaK细胞、Jurkat细胞、HepG2/3B细胞、KB细胞、NIH 3T3细胞或S49细胞。也可以使用能够表达异源多肽的其它哺乳动物细胞类型。
在一些实施方案中，抗体混合物，例如MabPair混合物或3合1混合物，可以从已经例如通过转染引入了编码抗体混合物的DNA的宿主细胞群中获得。在一些实施方案中，从已引入了所述DNA的细胞群中分离单个细胞。使该细胞繁殖以产生如本文所定义的可产生抗体混合物的“宿主细胞系”。
治疗方法
本文所述的抗体和/或抗体混合物或编码它们的核酸可用于治疗多种疾病，任选的人疾病。如本领域的技术人员将容易理解的，特定抗体或抗体混合物或编码所述抗体或混合物的核酸可用于治疗的疾病可通过多种因素确定，包括所述混合物中的每种抗体结合的靶蛋白的身份、由所述混合物中的每种抗体结合的每种靶蛋白上的特定表位、所述混合物中每种抗体的相对量、每种抗体的同种型，以及所述混合物中每种抗体的体内半衰期，以及其它可能的因素。由如本文所述的混合物中的一种或多种抗体结合的靶蛋白可起直接或间接驱动治疗疾病的过程的作用。例如，靶蛋白可以是驱动疾病的生物途径的一部分或者是用作免疫检查点的蛋白质，和/或靶蛋白可以用作靶向疾病细胞以由免疫系统破坏的手段。其它情况也是可能的。
在一般意义上，本文所述的抗体混合物或编码它们的核酸可用于治疗由多种生物途径驱动的疾病、由具有多种作用机制的分子(例如乳腺癌中的HER2)驱动的疾病、或由被馈送进入单一生物途径的多种分子驱动的疾病，以及其它可能的疾病。这些疾病包括但不限于癌症、代谢疾病、传染疾病和自身免疫疾病或炎性疾病，以及许多可能的疾病。
本文所述的抗体、抗体混合物或编码它们的核酸可以例如用于治疗癌症。在这种情况下，所述抗体或抗体混合物可以施用于癌症患者，任选地直接施用于肿瘤。如本领域所知，不同的癌症是不同的并且需要不同的治疗。因此，不同的抗体或抗体混合物可适用于不同的癌症。可用本文所述的抗体混合物治疗的癌症包括例如溶血性癌症、包括癌和恶性毒瘤在内的实体瘤、乳腺癌、包括黑素瘤的皮肤癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、头颈癌、甲状腺癌、脑癌，以及许多其它癌症。
抗体、抗体混合物或编码它们的核酸可以配制成例如液体，糊剂或霜剂、或固体。口服给药是可能的。抗体、抗体混合物、或核酸可经由肠胃外注射施用。例如，抗体混合物或核酸的注射可以是皮下、静脉内、动脉内、病灶内(包括进入肿瘤或其它主要癌症部位)、腹膜或肌内注射。例如液体、糊剂或霜剂的局部给药是可能的，尤其是对于皮肤疾病。通过与粘膜接触给药也是可能的，诸如通过鼻内、舌下、阴道或直肠给药。或者，抗体、抗体混合物或编码抗体或抗体混合物的核酸可以作为吸入剂施用。
在一些实施方案中，编码抗体或抗体混合物的核酸可以携带在一种或多种病毒载体上。在此类实施方案中，这些含有编码所述抗体或抗体混合物的核酸的病毒载体可以施用于患者以治疗疾病，例如通过口服给药或通过注射(包括例如皮下、肌内、静脉内，肿瘤内或腹膜内注射)、吸入，局部给药和/或通过施用于粘膜(透过粘膜可以吸收核酸)以及许多可能途径。在癌症患者中，可以将含有编码抗体或抗体混合物的核酸的此类病毒载体直接施用于患者的肿瘤或癌细胞主要部位，例如通过注射、吸入(用于肺癌)、局部施用(用于皮肤癌)和/或施用于粘膜(透过粘膜可以吸收核酸)以及许多可能的途径。病毒载体可以是例如腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、改良安卡拉痘苗病毒(MVA)载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体或痘病毒载体。
本领域技术人员可以根据所治疗的病症、抗体或核酸的浓度、抗体的结合特性(亲和力和亲合力)、抗体结合的靶分子的体内丰度和可及性、以及抗体的体内半衰期等许多其它可能的考虑因素来调节抗体、抗体混合物或编码它们的核酸的剂量和给药频率。施用于患者的抗体或抗体混合物的剂量可以是例如约0.0036毫克(mg)至约450mg、约0.000051mg/kg至约6.4mg/kg，或约0.002mg/mm2至约250mg/mm2。类似地，编码抗体或抗体混合物的核酸(例如，DNA)的剂量可以是例如每千克患者体重约109至约1013个拷贝的编码抗体或抗体的DNA。给药可以每天、每隔一天、每周两次、每周一次、每隔一周、每3周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周、每11周或每12周一次、每年4次，每年两次，每九个月一次、或每年一次，以及以其它可能的时间安排发生。
已经在上面概括地描述了本发明，提供下面描述的具体实施例是为了例示而不是限制本发明的范围。应当理解，可以对本发明进行各种改变和修改，这些改变和修改符合本文所述的本发明的精神，并且对于本领域技术人员来说是显而易见的。此类改变和修改在本文所述发明的范围内，包括在所附权利要求书中的范围内。
实施例
实施例1：设计HC配偶体定向改变和LC配偶体定向改变
阻止非同源HC/LC配对将极大地限制由用编码多个全长抗体的DNA转染的宿主细胞产生的抗体种类数。参见例如图4。为了确保只有同源LC/HC对形成，关键是要找到控制HC/LC组装过程的动力学，使得每个LC强烈有利于与其同源HC配对而不利于与非同源HC配对的有效途径。由于VH/VL界面和CH1/CL界面都参与HC/LC识别和接合(参见Knarr等人(1995),J.Biol.Chem.270:27589-27594；Feige等人(2009),Mol.Cell 34:569-579；Reiter等人(1996),Nat.Biotechnol.14:1239-1245；Potapov等人(2004),J.Mol.Biol.342:665-679；Rothli sberger等人(2005),J.Mol.Biol.347:773-789，所有这些文献的全部内容以引用方式并入本文)，所以这两个界面都经工程化以迫使同源H C/LC配对，如下文详细解释的那样。
使用现有的X射线晶体结构识别VH/VL界面和CH1/CL界面上的残基以进行修饰。与HER2复合的两种人源化IgG1抗HER2Fab片段的共晶体结构已被报道，即曲妥单抗的Fab片段的结构(可在http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/处通过检索蛋白质数据库登录号1N8Z获得；同样参见Cho等人，(2003),Nature 421(6924):756-760，该文献以引用方式并入本文)和帕妥珠单抗Fab片段的结构(可http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/处通过检索蛋白质数据库登录号1S78获得；同样参见Franklin等人(2004),Cancer Cell 5(4):317-328，该文献以引用方式并入本文)。还已经报道了人IgG4Fab的晶体结构(可在http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/处通过检索蛋白质数据库登录号1BBJ获得；同样参见Brady等人(1992),J.Mol.Biol.,227(1):253-264，该文献以引用方式并入本文)。为了选择HC/LC相互作用中涉及的适合测试作为带电氨基酸取代位点的残基，考虑了由距离限制标准和溶剂可及表面积确定的物理接触。使用物理接触方法，用于供带电氨基酸取代的界面残基被定义为这样的残基，所述残基的侧链重原子(即除氢之外的原子)定位为距第二链中任何残基的侧链重原子的距离比指定极限更近。在一些情况下，这可能意味着两个氨基酸的α碳原子(Cα)，即在氨基酸的羧基基团附近的位置处的碳，可以彼此远离达约使用从Chemical Computing Group Inc.(1010Sherbooke St.West,Suite#910,Montreal,QC,Canada,H3A 2R7)获得的分子操作环境(Molecular Operating Environment,MOE)软件确定此类距离。第二种方法涉及计算在存在和不存在第二链的情况下残基的溶剂可及表面积(ASA)。参见例如Liu等人(2015),J.Biol.Chem.290(12):7535-7562，该文献的相关部分以引用方式并入本文。在两次计算之间显示的ASA差异的残基被鉴定为界面残基。两种方法都鉴定出了相似的界面残基组。进一步应用以下附加标准来选择用于诱变的VH/VL界面残基对：(1)它们不在CDR中并且不与任何CDR残基接触，(2)它们在各种IgG抗体亚型中是高度保守的，并且(3)它们大部分是溶剂不可及的(即内埋或部分内埋的)。
在可变结构域中，VH结构域中的G44和Q105分别在空间上接近VL结构域中的Q100和A43，而不管特定可变结构域所来源的种系序列。此外，这些残基是溶剂不可及的、在空间上保守的残基，即在不同抗体中在抗体三级结构中的空间位置的残基是保守的残基。因此，这些位点被选择用于进行取代以在VH与VL之间产生电荷-电荷相互作用。在本文中我们将此类取代称为“电荷对”改变或取代。
IgG1或IgG4Fab片段的CH1/CL界面处足够接近(即Cα原子之间小于约并且侧链重原子之间小于约)、适用于电荷对取代的残基汇总在以下表13和表14中。接触残基与残基的α碳之间的距离一起显示在同一行。
表13：IgG1CH1/CLκ界面处的接触残基
*免疫球蛋白结构中各种链和转角的位置是在本领域中已知的，并在例如Wang(2013),Protein Cell.4(8):569-572中说明，该文献的相关部分以引用方式并入本文。
@编号是根据Edelman等人，出处同上的，如在表6(CH1)和表10(CL)中所示。
表14：IgG4CH1/CLκ界面处的接触残基
*免疫球蛋白结构中各种链和转角的位置在例如Wang(2013),Protein Cell.4(8):569-572中说明。
@编号是根据Edelman等人，出处同上的，如在表6(CH1)和表10(CL)中所示。
由于存在CH1结构域，所以HC由免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP，也称为GRP78和HSPA5)保留在内质网(ER)中，直到它们被LC接合而用于组装全长IgG。BiP通常识别并结合疏水性残基，并且在更小程度上结合亲水性和带电残基。Knarr等人(1995),J Biol Chem270:27589-27594。因此，HC/LC相互作用的去稳定化可导致抗体保留在ER中，从而减少培养基中的抗体分泌。
对VH/VL界面和CH1/CL界面三级结构的检查表明，氢键和范德华相互作用是这些界面的重要部分。与CH3/CH3界面不同，LC与HC之间很少有静电荷-电荷残基相互作用。例如，CLκ/CH1界面具有一个且CLλ/CH1界面具有两个涉及E/D和K残基的正负电荷相互作用。所有这些现有的电荷对相互作用涉及部分或完全暴露于溶剂的位置，这种情况由于溶剂分子的干扰而削弱了静电相互作用。
为了利用静电转向效应来驱动同源HC/LC配对，我们假设保持VH/VL和CH1/CL界面稳定可能是重要的并且残基取代可能使这些结构不稳定从而减少抗体表达。因此，我们优先使用至少一个保守的、天然存在的带电残基(例如，IgG1和IgG4两者的CH1结构域中的K147和H168)进行探索。我们假设将CH1结构域中的保守带电残基改变为具有相反电荷的残基可能导致对CH1/CL界面具有很少或没有破坏。
我们对上面描述的三级结构的分析表明，在IgG1和IgG4两者的CH1结构域中的K147接触CLκ结构域中的Q124、T129、S131和T180，并且在IgG1和IgG4两者的CH1结构域中的H168接触CLκ结构域中的T164、D167和S174。我们假设如果带相反电荷的残基中的一个位于包含链B、链D和链E的CL和/或CH1结构域的内部β折叠上，则在CL/CH1界面上相互作用的带相反电荷的氨基酸对可以具有最大的静电转向效应。此类残基的实例包括CLκ结构域的内部β折叠上的S131、T180、T164和S174。我们聚焦(1)在CLκ结构域中的S131和/或T180处的取代将促进与CH1结构域中的位置147处的残基(其可能有取代或可能没有取代)的静电相互作用，(2)在CLκ结构域中T164和/或S174处的取代将促进与CH1结构域中位置168处的残基(其可能有取代或可能没有取代)的静电相互作用。
实施例2：设计和测试HC/LC界面中添加的二硫桥
我们假设产生额外HC/LC链间二硫桥的改变可能会加强同源HC/LC对的缔合。在未修饰的抗体中，链间二硫键是暴露于溶剂的，而链内二硫键包埋在每个结构域内的两层反向平行的β折叠结构之间，即不暴露于溶剂。例如，铰链区中的链间二硫键是暴露于溶剂的，HC与LC之间的二硫键也是如此。暴露于溶剂的半胱氨酸残基被认为比未暴露的半胱氨酸残基更具反应性。因此，在进行半胱氨酸取代时，我们试图产生部分或完全暴露于溶剂的二硫桥。
已显示引入的二硫桥通过使VH/VL相互作用稳定来稳定Fv片段，从而导致所得Fv片段具有更高产量和溶解度。Reiter等人(1996),Nature Biotechnol.14(10):1239-1245。进行这些半胱氨酸取代的改变残基是框架区中的良好保守的氨基酸，特别是VH残基G44和Q105以及分别接触的VL残基Q100和A43。
我们已经在CH1和CL结构域中尝试了类似的方法。我们对实施例1中描述的三级结构的分析表明，以下位于人IgG1或IgG 4HC与κLC的CH1/CL界面上的残基对足够接近，使得如果被半胱氨酸取代，则有可能形成二硫键。
表15：适用于半胱氨酸取代的IgG1CH1/CLκ界面残基
*免疫球蛋白结构中各种链和转角的位置在例如Wang(2013),Protein Cell.4(8):569-572中说明。
@编号是根据Edelman等人，出处同上的，如在表6(CH1)和表10(CL)中所示。
表16：适用于半胱氨酸取代的IgG4CH1/CLκ界面残基
*免疫球蛋白结构中各种链和转角的位置在例如Wang(2013),Protein Cell.4(8):569-572中说明。
@编号是根据Edelman等人，出处同上的，如在表6(CH1)和表10(CL)中所示。
为了确定在HC和LC中于表15和表16中列出的一对或多对位点处具有半胱氨酸取代并且缺乏在HC与LC之间通常存在的二硫桥的抗体是否将形成稳定到足以从ER逃逸的HC/LC对，如下制备编码此类抗体的DNA构建体。由Integrated DNA Technologies(IDT),Inc.(Iowa,USA)合成编码信号肽(SP)接着是来自抗CTLA4抗体1E1(“1E1抗体”)的VH结构域和CH1结构域的DNA片段。1E1抗体的VH结构域和CH1结构域的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:38的氨基酸1-216中。它通过Gibson反应(参见例如GibsonMaster MixInstruction Manual,New England Biolabs Inc.(NEB)，第3.3版，NEB目录号#E2611S/L,NEB Inc.Ipswich,MA,USA)与编码人IgG1抗体的铰链、CH2和CH3结构域的下游DNA片段在哺乳动物表达载体中融合。CH3结构域包含取代D399K和K409E，所述取代在实施例4中更详细地论述。
由IDT,Inc.合成编码SP接着是来自1E1抗体的VL构域和CL结构域的第二DNA片段，并将所述第二DNA片段通过Gibson反应与哺乳动物表达载体融合。1E1抗体的VL结构域和CL结构域的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:40的氨基酸1-214中。通过电穿孔将反应混合物转化到感受态的大肠杆菌(E.coli)XL1Blue内，并在含有抗生素羧苄青霉素的LB琼脂平板上铺平板。将所得菌落挑取和培养，并分离质粒DNA。通过DNA测序确认质粒插入序列。
通过使用QuikChange Lightning多位点定向诱变试剂盒(AgilentTechnologies，目录号210516)进行诱变反应将编码氨基酸取代的突变引入这些DNA构建体中。在编码HC的DNA中，进行编码C220S改变(其是用丝氨酸替代SEQ ID NO:38中的位置221处的半胱氨酸，因为EU编号系统在本文中用于描述恒定结构域改变)的突变。在编码LC的DNA中进行编码C214S改变(其是用丝氨酸替代SEQ ID NO:40中的位置214处的半胱氨酸)的突变。这些改变一起完全消除了通常存在于这些位置的半胱氨酸残基之间的天然存在的链间二硫桥。此外，使编码HC的DNA突变成编码改变F126C、L128C、S134C、H168C、K133C、F170C、V173C或S183C。根据EU编号方案的位置126、128、134、168、133、170、173和183分别等同于SEQ ID NO:38中的位置127、129、135、169、134、171、174和184。类似地，使编码LC的DNA突变成编码改变F116C、I117C、F118C、Q124C、Q160C、S162C、S174C、S176C、或F209C。根据EU编号的位置116、117、118、124、160、162、174、176和209等同于SEQ ID NO:40中的这些相同位置。
编码抗PD1抗体的改变形式的第二组DNA构建体也以类似方式制备。由IDT,Inc.合成编码SP接着是来自抗PD1 102抗体的VH结构域和IgG4CH1结构域的DNA片段，并通过Gibson反应将所述DNA片段与编码人IgG4抗体的铰链、CH2和CH3结构域的下游DNA片段在哺乳动物表达载体中融合。SEQ ID NO:23提供了抗PD1抗体16137的HC的氨基酸序列，所述氨基酸序列与抗PD1 102抗体的HC的氨基酸序列的不同之处仅在CDR中和VH结构域的框架区中的三个额外氨基酸处。与抗PD1 102抗体HC一样，抗PD1抗体16137HC在位置228处具有脯氨酸(使用EU编号)以防止Fab臂交换(Silva等人(2015),J.Biol.Chem.290(9):5462-5469，该文献以引用方式并入本文))。由IDT,Inc.合成编码SP接着是来自抗PD1 102抗体的VL构域和CL结构域的第二DNA片段，并将所述第二DNA片段通过Gibson反应与哺乳动物表达载体融合。SEQ ID NO:24提供了抗PD1抗体16137的LC的氨基酸序列，所述氨基酸序列与抗PD1102抗体的LC的氨基酸序列的不同之处仅在CDR中和VL结构域的框架区中的五个额外氨基酸处。通过电穿孔将反应混合物转化到感受态的大肠杆菌XL1Blue内，并在含有抗生素羧苄青霉素的LB琼脂平板上铺平板。将所得菌落挑取和进行培养，并且通过DNA测序确认分离的质粒DNA的插入序列。
使用QuikChange Lightning多位点定向诱变试剂盒(Agilent Technologies，目录号210516)将氨基酸取代引入抗PD1抗体内。为了消除C131(HC)与C214(LC)之间的二硫桥，在编码抗体的HC和LC DNA构建体中进行具有改变C131S(HC)和C214S(LC)的突变。此外，制备编码具有HC改变F126C、P127C、L128C、H168C、F170C、V173C或S183C和LC改变F118C、S121C、Q124C、S162C、S174C或S176C的抗体的DNA构建体。使用Qiagen Midi-prep试剂盒制备高质量的质粒DNA(OD260/280＝1.90～2.00)。将质粒DNA在水中稀释并在EPPENDORF中混合。
上面刚刚描述的所有改变的抗体都缺少通常存在于C131(IgG4HC)或C220(IgG1HC)与C214(LC)之间的二硫桥，但在HC与LC中具有可能潜在地形成二硫桥的另外一对半胱氨酸残基。组合编码HC/LC对的两种DNA以转染EXPI293TM细胞(ThermoFisherScientific Inc.,Waltham,MA,USA)，并通过蛋白质印迹可视化由转染子分泌到培养基中的抗体。如果转染子产生尺寸为约150千道尔顿(kDa)的全长抗体，则判定二硫桥形成是成功的。
更详细地，使用2000在24孔深孔块中用编码测试抗体的质粒DNA转染EXPI293TM细胞。将细胞以150转/分钟(rpm)在37℃连续振荡4天。通过将细胞以1500rpm离心(spinning down)20分钟来收获上清液。对于非还原的样品，将5微升(μl)的上清液和5μl的2X Laemmli样品缓冲液(65.8mM Tris-HCl(pH 6.8)、2.1％十二烷基硫酸钠(SDS)、26.3％(w/v)甘油、0.01％溴酚蓝)在70℃加热100分钟。对于还原的样品，将5μl的上清液和5μl的2X Laemmli样品缓冲液在100mM二硫苏糖醇(DTT)的存在下于70℃加热10分钟。在图5和图6中示出的蛋白质印迹中，所有样品均是非还原的。将处理过的样品装载到4-15％CRITERIONTM TGX STAIN-FREETM预制SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA，目录号567-8085)的孔内。在200V下电泳运行45分钟。使用TRANS-TURBOTM转移系统(Bio-Rad Laboratories,Inc.)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并在具有0.05％20的1X磷酸盐缓冲盐水(PBST)中以3％脱脂牛奶封闭。洗涤硝酸纤维素膜，并用HRP缀合的多克隆山羊抗人IgG(Fc特异性)(Sigma-Aldrich Corporation,St.Louis,MO,目录号A0170)检测抗体。使用来自Bio-Rad Laboratories,Inc.的CHEMIDOCTMXRS+成像仪使图像可视化。
结果示出于图5和图6中。如实施例1中所解释的，HC除非与LC接合，否则通常保留在ER中。因此，如果引入的半胱氨酸残基形成二硫桥，则可以预期HC将与LC接合，并且因此转染子将主要产生约150kDa的全长抗体，如图5中的顶部箭头和图6中的150kDa尺寸标记所示。然而，可能会产生其它种类，诸如由1条HC和1条LC组成的半抗体(75kDa；图5中的底部箭头)、含有2条相同HC和1条LC的四分之三抗体(125kDa；图5顶部的第二箭头)以及2条HC(100kDa；图5顶部的第三箭头和图6中的100kDa尺寸标记)。这些种类可能在引入的半胱氨酸残基不能完全有效地形成二硫桥的情况下产生。
预计缺乏通常存在于C131(IgG4HC)或C220(IgG1HC)与C214(LC)处的半胱氨酸残基(其形成天然存在的链间二硫桥)的抗体不会形成全长抗体，除非HC和LC两者都在接触位点处被半胱氨酸取代。使用缺乏天然存在的二硫桥并且不含任何半胱氨酸取代的抗体的数据示出在图6的泳道2和8中。仅检测到100kDa的物质(可能是HC/HC)。使用缺乏天然存在的二硫桥并且在HC中含有半胱氨酸取代但在LC中不含有半胱氨酸取代或反之亦然的抗体的结果示出在图5的泳道14至22和泳道25至33中。可以预知，这些HC/LC组合中的大多数不产生大量的全长抗体，主要产生100kDa的物质(可能是HC/HC)。出人意料的是，这些HC/LC组合中的三种HC/LC组合形成了全长抗体，即CH1结构域中的K133C并且在LC中没有取代(图5，泳道15)和在LC中的I117C或F209C并且在HC CH1结构域中没有取代(图5，分别为泳道26和27)。图5的泳道2至12示出了来自这样的HC/LC组合的数据，其中HC和LC都在如图5的说明中所示的接触位点处含有半胱氨酸取代并且缺乏形成天然存在的二硫桥的半胱氨酸。这些HC/LC组合中除了两种(这两种HC/LC组合都含有S183C(HC)加上S176C(LC)(泳道8和12))之外的所有HC/LC组合都形成了大量的全长抗体。类似地，对缺乏天然存在的二硫桥并且在接触残基处包含半胱氨酸取代的其它样品的分析主要检测到了全长抗体。图6中的泳道3至6和泳道9至11。
因此，这些数据表明所引入的半胱氨酸残基对中的大多数但不是全部确实形成二硫桥，尽管存在可检测量的小于全长的抗体种类表明抗体分泌的动力学可能受到引入的半胱氨酸残基的影响。具体地，结果表明，在人IgG1抗体中，半胱氨酸取代F126C(CH1)–Q124C(CLκ)、L128C(CH1)–F118C(CLκ)、S134C(CH1)–F116C(CLκ)、H168C(CH1)–S174C(CLκ)、K133C(CH1)–I117C(CLκ)、K133C(CH1)–F209C(CLκ)、V173C(CH1)–Q160C(CLκ)、F170C(CH1)–S162C(CLκ)以及F170C(CH1)–S176C(CLκ)可以介导二硫键形成。此外，结果表明，在人IgG4抗体中，半胱氨酸取代F126C(CH1)-S121C(Cκ)、F126C(CH1)-Q124C(Cκ)、P127C(CH1)-S121C(Cκ)、L128C(CH1)-F118C(Cκ)、H168C(CH1)-S174C(Cκ)、V173C(CH1)-S162C(Cκ)和F170C(CH1)-S162C(Cκ)可以介导二硫键形成。
实施例3：测试含有LC配偶体定向改变和HC配偶体定向改变的抗体混合物，所述LC配偶体定向改变和HC配偶体定向改变是电荷对取代和/或半胱氨酸取代
已经通过对已公布的三级结构进行分析确定了HC和LC中适用于进行电荷对取代或半胱氨酸取代(实施例1和实施例2)的许多残基接触对的身份，并且已经进行并测试了一些半胱氨酸取代，进行并测试了一些此类取代及其组合来确定它们对同源HC/LC配对的影响。为了快速评估各种LC配偶体定向改变和HC配偶体定向改变在迫使进行同源HC/LC配对中的效力，进行如下所述的“链脱扣”实验。
使用与实施例2中描述的方法类似的方法制备编码抗体的DNA构建体。如实施例2中关于抗CTLA4 1E1抗体的HC所述地制备编码人抗CTLA4 111抗体(“111抗体”)的人IgG1HC的DNA片段。111抗体的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域以及VH结构域的框架区具有与1E1抗体的HC的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域以及VH结构域的框架区相同的氨基酸序列。1E1抗体的HC的氨基酸序列在SEQ ID NO:38中提供。编码SP以及人抗CTLA4 111抗体的LC的VL结构域和CLκ结构域的另一种DNA片段也如实施例2中关于抗CTLA4 1E1抗体所述地制备。111抗体的CL结构域以及VL结构域的框架区具有与1E1抗体的LC的CL结构域以及VL结构域的框架区相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列的序列在SEQID NO:40中提供。
在实施例2中描述了含有编码抗PD1 102抗体的HC和LC的DNA插入物的载体的构造。
制备类似的构造以获得编码被称为4D5-8和2C4的一对抗HER2抗体的DNA。抗体4D5-8含有来自在Carter等人(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-4289中描述的抗体humAb4D5-8的可变区，该文献的全部内容以引用方式并入本文；以及来自人IgG1HC和人κLC的恒定区。抗体2C4含有来自在Adams等人(2006),Cancer Immunol.Immunother.55(6):717-727中描述的抗体rhuMAb 2C4的可变区，该文献的全部内容以引用方式并入本文；以及来自人IgG1HC和人κLC的恒定区。4D5-8的轻链和重链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中提供。2C4的重链和轻链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中提供。
使用QuikChange Lightning多位点定向诱变试剂盒(Agilent Technologies,Santa Clara,California，目录号210516)通过诱变反应将氨基酸取代引入编码抗CTLA4和抗PD1抗体或两种抗HER2抗体的DNA中。每次QuikChange过程产生含有包含所需突变的插入物的载体DNA，然后将所述载体DNA转化到大肠杆菌XL1-Blue细胞中。将来自这些转化的菌落挑取和培养来获得质粒DNA以供转染到哺乳动物细胞中。通过DNA测序确认所有构建体的序列。
使用Midi-prep试剂盒(Qiagen N.V.,the Netherlands)纯化来自这些培养菌落的质粒DNA。将所得DNA在水中稀释并在EPPENDORF中混合。对于每种变体对，将一组5管混合DNA瞬时转染到EXPI293TM细胞(ThermoFisher Scientific Inc.)内以监测HC/LC配对的保真度。管1含有编码两种全长抗体的DNA，例如编码抗PD-1HC和LC(HC1和LC1)和抗CTLA4HC和LC(HC2和LC2))的DNA。管2含有编码仅一种抗体(HC1和LC1)的DNA。管3含有编码非同源HC/LC对(HC1和LC2)的DNA。管4含有编码仅一种抗体(HC2和LC2)的DNA。管5含有编码非同源HC/LC对(HC2和LC1)的DNA。平行转染编码无关抗体的DNA以评估转染效率。
使用2000(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)在24孔深孔板中用上述DNA转染哺乳动物EXPI293TM细胞。将细胞以150rpm在37℃连续振荡4天。通过将细胞以1500rpm离心20分钟来收获上清液以供分析。制备样品并进行电泳，进行凝胶印迹，封闭并洗涤硝酸纤维素膜，并如实施例2中所述检测抗体。
用于转染的哺乳动物EXPI293TM细胞可以转录DNA、翻译mRNA并将抗体分泌到培养基中。对培养基中非还原的抗体样品进行蛋白质印迹以监测HC/LC配对。如上所述，对于每对变体，使用上述五种不同的DNA混合物进行五次共转染。作为初始标准(参见表17)，如果由含有编码同源HC/LC对的DNA的转染子产生的全长抗体水平高于由仅含有编码非同源HC/LC对的DNA(即，上述管3和管5)的转染子产生的水平，则判定特定的变体对是成功的。最终(参见表20和表21)，如果来自含有编码LC1和HC1的DNA(上述管2)、编码LC2和HC2的DNA(管4)以及编码LC1、HC1、LC2和HC2的DNA(管1)的转染子的样品都产生良好水平的全长抗体，而来自含有编码HC1和LC2的DNA(上述管3)和编码HC2和LC1的DNA(管5)的转染子的样品产生很少或没有产生可检测的全长抗体，则可以判定特定的变体混合物成功地迫使大部分进行或仅进行同源HC/LC配对。
这种蛋白质印迹的实例示出在图7至图10中。在图7中，泳道21和22分别示出来自接收了编码抗HER2抗体4D5-8和2C4的DNA的转染子的样品，4D5-8和2C4是被包括作为转染效率对照的全长抗体。测试转染子的DNA含量示出在图7的泳道1至20下方，并且所测试的变体对的名称在上方标示。变体对中的改变的身份在下表21中说明。图7中示出的结果表明，变体混合物18B和18C在迫使进行同源HC/LC配对方面比混合物18A和18D更有效。仅含有非同源18B或18C HC/LC对的转染子产生很少或没有产生可检测的全长抗体(图7，泳道8、10、13和15)，而含有同源18B或18C HC/LC对的转染子产生可检测到的全长抗体(图7，泳道6、7、9、11、12和14)。相比之下，含有编码同源HC/LC对的DNA的18A管1和管4转染子产生相对少量的全长抗体，所述全长抗体在管4的转染子中尺寸弥散(diffuse in size)。图7中的泳道1和泳道4。此外，含有仅编码一种非同源HC/LC对的DNA的18D转染子产生少量的全长抗体(图7，泳道18)，而含有编码同源HC/LC对的DNA的转染子仅产生相对更少量的全长抗体(图7，泳道16、17和19)。
类似地，包含变体混合物14A至14D(参见表20)的数据的蛋白印迹示出于图8中。变体14C和14D仅表现出同源HC/LC配对，因为当仅组合非同源HC/LC对(LC1+HC2或LC2+HC1)时，没有可检测到的抗体表达(图8，泳道13、15、18和20)，而同源HC/LC对(LC1+HC1或LC2+HC2)或所有四种链的混合物(LC1+HC1+LC2+HC2)产生大量全长抗体(图8，泳道11、12、14、16、17和19)。相比之下，在一些含有来自仅含有非同源HC/LC对的转染子的样品的泳道(图8，泳道5和10)中混合物14A和14B确实示出可检测的全长抗体。
在图9中，示出了变体对23A-23D的类似数据。这些抗PD1和抗CTLA4抗体对中的改变显示在表21中。如泳道1-20下方所示，对于每对变体，将一组五种DNA组合(如上文所述)转染到宿主细胞中。将编码抗PD1抗体的DNA(标记为“a-PD1”的泳道)和编码抗CTLA4抗体的DNA(标记为“a-CTLA4”的泳道)同时转染以监测转染效率。已接收编码变体对23A的抗体链的DNA的宿主细胞产生很少的全长抗体，而无论所述细胞是用编码同源HC/LC对的DNA还是编码非同源HC/LC对的DNA转染。图9中的泳道1至5。当编码同源对HC1和LC1的DNA被引入宿主细胞时，已接收编码变体对23B和23C的链的DNA的宿主细胞产生很少或没有产生全长抗体(图9，泳道7和12)，并且在编码非同源对HC2和LC1的DNA存在下产生少量但可检测到量的全长抗体(图9，泳道10和15)。相比之下，当编码同源HC/LC对的DNA存在时，已接收编码变体对23D的抗体链的DNA的宿主细胞产生大量全长抗体(图9，泳道16、17和19)，而当仅存在编码非同源HC/LC对的DNA时，产生很少或没有产生全长抗体(图9，泳道18和20)。
在类似的链脱扣实验中测试了许多对变体，开始仅在VH结构域和VL结构域中或仅在CH1结构域和CL结构域中进行引入带电氨基酸的改变，然后组合VH、CH1、VL和CL中的改变。在一些情况下，添加了产生额外二硫桥的改变。此类改变对的身份和蛋白印迹的结果在表17至表21中编目。
表17：链脱扣实验中测试的电荷对改变
#该列提供了经改变的变体抗体的特定对的名称。
*“Y”表示这样的变体对，在所述变体对中含有编码同源HC/LC对的DNA的转染子具有稳健的全长抗体表达，并且比仅含有编码非同源HC/LC对的DNA的转染子产生更多的全长抗体。此类行以粗体显示。“N”表示不符合该标准。
表17中的数据表明，VH和VL以及CH1和CL中的某些改变在迫使进行同源HC/LC配对方面比其它改变更有效。选择1B变体对作为起点以进行进一步的实验来测试在VH、CH1、VL和CL结构域中引入带电氨基酸的改变的各种组合，如下表18所报告。
表18：链脱扣实验中测试的电荷对改变
*“Y”表示这样的变体对，在所述变体对中含有编码同源HC/LC对的DNA的转染子与含有仅编码非同源HC/LC对的DNA的转染子的差异与在1B变体对中观察到的相比更明显(其中前者显示全长抗体的表达，而后者显示很少或没有表达)。此类行以粗体显示。“N”表示不符合该标准。
#该列提供了经改变的抗体的特定对的名称。
从6C和7B变体对中存在的改变开始，将所有已经引入的谷氨酸残基改变为天冬氨酸，以确定这些改变是否会对HC/LC配对的选择性产生影响。表19列出了这些改变以及它们的影响。
表19：在链脱扣实验中测试的E至D取代
*“Y”表示这样的变体对，在所述变体对中含有编码同源HC/LC对的DNA的转染子与含有仅编码非同源HC/LC对的DNA的转染子的差异与在6C和7B变体对中观察到的相比更明显(其中前者显示全长抗体的表达，而后者显示很少或没有表达)。此类行以粗体显示。“N”表示不符合该标准。
#该列提供了经改变的变体抗体的特定对的名称。
表19中的结果表明，与非同源HC/LC配对相比，变体对中D取代E进一步增强了同源HC/LC配对。我们假设D与E相比分子尺寸更小可能对VH/VL和CH1/CL界面上的相互作用的破坏性更小。
从10B变体对中存在的改变开始，我们进行了进一步的改变，所述进一步的改变被设计用于在HC与LC之间产生额外的二硫桥。我们希望此类额外的二硫桥将增加含有编码同源HC/LC对的DNA的转染子的抗体表达，所述转染子中的许多不表达所需的高水平抗体。我们假设电荷对的改变在某种程度上使同源HC/LC对失去稳定性，从而导致抗体保留在ER中，并且额外的二硫桥可以使同源对稳定，从而增加培养基中的抗体分泌，在所述培养基中可以检测所述抗体。如实施例2中所报道的，还已经在没有电荷对取代的情况下测试了这些半胱氨酸取代，以确定它们形成HC/LC二硫键的能力。这些改变组合以及它们的影响列于下表20中。
表20：在链脱扣实验中测试的电荷对加半胱氨酸对
*“Y”表示宿主细胞(1)当存在编码一种或两种同源HC/LC对的DNA时产生易检测量的全长抗体；并且(2)当仅存在编码非同源HC/LC对的DNA时，产生很少或没有产生全长抗体。此类行为粗体。“N”表示并非所有这些标准都不符合。
#该列提供了经改变的变体抗体的特定对的名称。
&图8中所示的数据。
为了将这些结果扩展到不同的抗体对，以类似方式测试含有实施例2中所述的改变的IgG4抗PD1 102抗体和上述IgG1抗CTLA4 111抗体的改变形式(其含有改变D399K和K409E(以不利于HC/HC异源二聚体形成))的改变抗体对。使用在表20中报道的链脱扣实验中探索的改变组合中的一些制备编码改变的抗PD1和抗CTLA4抗体对的DNA，并如上所述在链脱扣转染实验中进行测试。这些结果列于下表21中。
表21：链脱扣实验中测试的改变
*“Y”表示宿主细胞(1)当存在编码一种或两种同源HC/LC对的DNA时产生易检测量的全长抗体；并且(2)当仅存在编码非同源HC/LC对的DNA时，产生很少或没有产生全长抗体。此类行以粗体显示。“N”表示并非所有这些标准都不符合。
@来自这些变体的数据在图9中示出。
&来自这些变体的数据在图7中示出。
#该列提供了经改变的变体抗体的特定对的名称。
这些数据表明，在含有两种全长IgG1抗体的抗HER2抗体混合物中有效迫使进行同源HC/LC配对的带电对和半胱氨酸对的一些相同位点在表21中所述的含有IgG1全长抗体和IgG4全长抗体两者的混合物中也是有效的。比较表20中的14C和14D与表21中的17C和19C。
此外，变体混合物23A至23D因添加二硫键而显示出明显效果。23A混合物中的抗体没有添加半胱氨酸残基，而将预期23B和23C混合物中的抗体仅在抗CTLA4抗体中具有额外的二硫键(由于半胱氨酸取代)。将预期23D混合物在混合物中的两种抗体中的每一种中具有额外的二硫键。表21.编码这四种抗体混合物的DNA编码除了这些半胱氨酸取代差异外相同的混合物。表21.在HC和LC两者中具有半胱氨酸取代的抗体的表达在23B和23C混合物中比在23A混合物中观察到的强。图9，比较泳道1和4与泳道6和9以及泳道11和14。然而，在来自混合物23B和23C的转染子中可检测到非同源对的一些表达。图9中的泳道10和泳道15。在混合物23D中，在含有编码同源HC/LC对的DNA的所有转染子中观察到了全长抗体的良好表达(图9，泳道16、17和19)，并且在仅含有编码非同源对的DNA的转染子中检测到很少或没有表达(图9，泳道18和20)。这些数据表明，向混合物中的抗体添加二硫键增加了表达(可能是由于允许从ER逃逸的更强HC/LC相互作用)和配对的选择性。
在进一步的实验中，研究了在含有编码两种IgG抗体(所述两种IgG抗体中的一种IgG抗体不含有配偶体定向改变)的DNA的宿主细胞系中产生不超过两种或三种主要抗体种类的方法。在测试样品中，抗体中的一种不含有任何配偶体定向改变并且另一种缺乏天然存在的HC/LC二硫键(由于取代C220S/G(HC2)和C214S(LC2))，并且在一些样品中具有两个潜在的HC/LC二硫键(由于接触残基处的半胱氨酸取代)，并且在一些情况下还具有HC/LC电荷对(由于接触残基处的带电氨基酸取代)。如上所述使用编码仅包含改变S228P(为防止Fab臂交换)的IgG4抗PD1 102抗体(包含HC1和LC1)和IgG1抗CTLA 4抗体111(包含HC2和LC2)的DNA进行链脱扣实验，所述IgG1抗CTLA 4抗体111在测试样品中经工程化以缺乏天然存在的二硫桥并且包含不利于异源二聚体的改变(HC中的D399K和K409E)加上配偶体定向改变(包括可能产生两个HC/LC二硫桥的改变)，并且在某些情况下还包含HC/LC电荷对。所测试的半胱氨酸取代包括分别在HC2和LC2中的以下改变对：H168C和S174C；V173C和Q160C；以及F170C和S162C。所测试的带电氨基酸取代包括分别在HC2和LC2中的以下改变对：K147D和S131R/K；以及H168D和S174K/R。将样品在非还原条件下进行SDS-PAGE，并使用如上所述用于检测的山羊抗人IgG Fc特异性多克隆抗体通过蛋白质印迹进一步分析。结果在图10中示出。
用编码两种抗体的未改变形式的各链的DNA转染的细胞产生约150kDa的全长IgG抗体。图10的图A，泳道1-5。这些数据表明，非同源HC/LC对可以在没有阻止这种配对的改变的情况下产生全长抗体。在工程化的抗CTLA4 111抗体(包含HC2和LC2)中消除天然存在的二硫键阻止在任何不含有编码未改变的IgG4抗PD1抗体的两条链(即HC1和LC1)的DNA的转染子中形成全长IgG抗体。图10的图A，泳道6-10。向缺乏天然存在的二硫键的工程化抗CTLA4 111抗体中添加两个新的潜在二硫键恢复了含有编码HC2和LC2的DNA的转染子产生全长抗体，而在仅存在编码非同源对的DNA时大大减少了全长IgG抗体的产生的能力。图10的图A，泳道11-25。在所测试的半胱氨酸取代对的组合中，改变F170C加上V173C(HC2)和Q160C加上S162C(LC2)在同源HC2/LC2对存在下导致全长IgG的最佳表达(比较图A中的泳道24与泳道14和19)，并且仅存在非同源HC/LC对的情况下导致全长IgG的最低表达(比较图A中的泳道23和25与泳道13和15或泳道18和20)。然而，所测试的半胱氨酸取代对的另外两种组合几乎同样有效。参见图10中图A的泳道11-20。这些改变如下：H168C加上V173C(HC2)和Q160C加上S174C(LC2)；以及H168C加上V170C(HC2)和S162C加上S174C(LC2)。因此，这些结果表明，消除天然存在的HC/LC二硫桥并在HC和LC中的接触残基处添加两对半胱氨酸取代可以导致同源HC/LC对的稳健表达并且几乎不表达非同源对。
在另一组实验中，测试除了两个二硫桥之外还向第二抗体(其缺乏天然存在的二硫桥)添加HC/LC电荷对的效果。我们选择了氨基酸K147(HC2)和S131(LC2)的保守(参见表7和表10)接触对，因为K147是带电氨基酸。我们假设K147D/E改变(HC2)和S131K/R改变(LC2)将在HC1/LC2对中产生具有相同极性并且在HC2/LC1对中具有不利的相互作用的接触氨基酸对，因此进一步阻碍了非同源对的形成。如实施例1中所解释的，我们还假设可以容忍将带电氨基酸改变为不同的带电氨基酸，而不会在HC/LC界面中引起空间位阻。如果发生这种空间位阻，它可能使抗体失去稳定性。所述改变当然将在同源HC2/LC2对中产生额外的电荷对，因此有希望将有利于形成该同源对而不会使抗体失去稳定性。
如上所述在非还原条件下进行链脱扣转染并通过蛋白质印迹进行分析。结果示出在图10的图B中。如所预期的，含有两种抗体的链的各种组合的转染子，除了在HC1中的S228P和在HC2中的D399K加上K409E之外未改变，产生约150kDa的全长IgG抗体，而无论是否存在同源或非同源HC/LC对。图10的图B，泳道1-5。在存在改变C220S(HC2)和C214S(LC2)的情况下，向HC2和LC2添加两对半胱氨酸取代(F170C加上V173C(HC2)和Q160C加上S162C(LC2))在仅存在HC2和LC2时导致全长IgG的强表达(图10的图B，泳道9)，并且在仅存在非同源对(即HC1/LC2和HC2/LC1)时导致几乎不可检测到全长IgG的表达(图10的图B，泳道8和10)。进一步添加K147D(HC2)以及S131K或S131R(LC2)导致在仅存在非同源对的情况下甚至更少(如果有的话)的全长IgG表达。图10的图B，泳道13、15、18和20。因此，这些结果与图A中的结果组合在一起表明，添加所测试的电荷对导致HC2/LC2对的稳健表达，以及很少(如果有的话)的非同源对表达。
在第三组实验中，测试了向第二抗体(缺乏天然存在的二硫桥并且具有两个引入的二硫桥)中添加一不同电荷对(即，H168D(HC2)和S174K/R(LC2))以及任选地K147D(HC2)和S131K/R(LC2)对HC/LC配对的效率和特异性的影响。与K147D(HC2)和S131K/R(LC2)一样，我们假设H168D/E(HC2)和S174K/R(LC2)将在HC1/LC2对中产生具有相同电荷极性的接触氨基酸对(因为HC1中的H168和LC2中的S174K/R都是带正电的)并且可能对HC2/LC1配对有一些排斥，因此进一步阻止非同源配对的形成。此外，这些改变当然将在同源HC2/LC2对中产生额外的电荷对，因此可能使该同源对稳定。
如上所述在非还原条件下进行链脱扣转染并通过蛋白质印迹进行分析。结果示出在图10的图C中。当第二抗体(除了缺乏天然存在的二硫桥并且在接触残基处具有两对半胱氨酸取代之外)还包含H168D(HC2)和S174K(LC2)时，同源HC2/LC2对的表达是稳健的(图10的图C，泳道4)，而检测到很少(如果有的话)的非同源HC/LC对表达(图10的图C，泳道3和5)。当第二抗体包含H168D(HC2)和S174R(LC2)时获得了类似的结果，尽管同源HC2/LC2对的表达不那么稳健。图10的图C，泳道6-10。当第二抗体(除了缺乏天然存在的二硫桥并且在接触残基处具有两对半胱氨酸取代之外)还包含H168D加上K147D(HC2)和S174K加上S131K(LC2)时，HC2/LC2的表达是稳健的(图10的图C，泳道14)，并且观察到很少或没有非同源对的表达(图10的图C，泳道13和15)，这种效应在泳道13中特别清楚。该最后的结果可以通过以下事实来解释：在这种情况下，HC1/LC2对将含有具有相同电荷的两对接触氨基酸。有趣的是，当第二抗体(除了缺乏天然存在的二硫桥并且在接触残基处具有两对半胱氨酸取代之外)还包含H168D加上K147D(HC2)和S174R加上S131R(LC2)时，HC2/LC2对的表达不太稳健(比较图10的图C中的泳道19与泳道14)，虽然非同源对的表达类似地非常低(图10的图C，泳道18和20)。
总的来说，图10中的结果表明了以下结论。首先，在用编码两种不同IgG抗体的DNA转染的宿主细胞中，消除所述抗体的第二抗体中天然存在的链间HC/LC二硫桥基本上阻止了该全长抗体(HC2/LC2)的表达，以及包含所述第二抗体的任一链的非同源对(HC2/LC1和HC1/LC2)的表达。然而，进一步添加半胱氨酸取代(可能在第二抗体中产生两个新的二硫桥)恢复了HC2/LC2的表达，而基本上不恢复非同源对的表达。向第二抗体进一步添加一个或两个HC2/LC2电荷对进一步增强了表达HC2/LC2并进一步降低了非同源对的表达。最后，含有赖氨酸加天冬氨酸的HC2/LC2电荷对比含有精氨酸加天冬氨酸的电荷对导致更高的HC2/LC2的表达。总的来说，这些数据表明，用编码两种不同IgG抗体的DNA转染的宿主细胞可以主要产生具有同源HC/LC对的抗体，甚至当所述抗体中只有一种包含配偶体定向改变时也如此。在不存在不利异源二聚体的改变的情况下，可能仅潜在地产生三种主要的抗体种类，并且在存在不利于HC1/HC2异源二聚体的改变的情况下可能仅潜在地产生两种主要的抗体种类。
实施例4：鉴别不利于HC/HC异源二聚体的改变
当编码两种不同全长抗体的DNA(即，编码两条不同的HC和两条不同的LC的DNA)被引入宿主细胞中时，所述细胞可以潜在地产生具有HC和LC的不同组合的十种不同抗体。图4；Carter(2001),J.Immunol.Methods 248:7-15。为了减少在这种宿主细胞中产生的抗体种类的数量，可以对所述两条不同的HC进行工程化，使得它们主要形成(如果不是仅形成的话)HC/HC同源二聚体，并且HC和LC可以经工程化以使得大部分发生或仅发生同源HC/LC配对。实施例1至3解决了该后一个问题。本实施例描述了制备和测试HC中的各种被设计成不利于(如果不是完全消除的话)在两条不同的HC之间形成HC/HC异源二聚体的改变。
为了鉴定将实现消除异源二聚HC/HC对的目标的改变，制备了一组编码蛋白质对的DNA，所述蛋白质对包含一个Fc片段和一个同源HC/LC对，所述Fc片段和同源HC/LC对在它们的CH3结构域中具有不同的改变。将这些DNA引入可以表达它们的宿主细胞中，并如上所述通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析由所述宿主细胞产生的抗体，以确定由引入了所述DNA的宿主细胞产生的HC-LC/Fc异源二聚体、HC-LC/HC-LC同源二聚体以及Fc/Fc同源二聚体的相对量。
如实施例2和3中所说明，使用PCR和Gibson组装产生编码在CH3结构域中具有不同改变的Fc片段和HC/LC对的DNA构建体。将所得的编码包含不同改变的Fc片段和全长HC和LC的DNA共转染到HEK293宿主细胞中，并使用来自ThermoFisher Scientific(Waltham,MA,USA)的EXPI293TM表达系统进行表达。在培养四天后从转染子收获含有由宿主细胞产生的抗体的条件培养基。
如实施例2和3中所述，在非还原条件下通过蛋白质印迹检测培养基中的抗体。在使用来自Bio-Rad Laboratories,Inc.的装有IMAGE LABTM软件的CHEMIDOCTM XRS+系统进行可视化之后，使用IMAGE LABTM软件计算由用编码各种改变蛋白质对的DNA转染的宿主细胞产生的HC-LC/Fc异源二聚体的百分比。
图11示出了取自转染子的培养基的样品的蛋白质印迹，所述转染子含有编码LC和野生型人IgG4HC加上在位置K370(右上方的图)、K392(左上方的图)或V397(左下方的图)处具有各种单一取代的改变的人IgG1Fc片段的DNA对。这些位置中的每一个位于CH3/CH3界面处(参见例如WO 2015/017548第8页的表1，该专利以引用方式并入本文)，并且K370和K392也接近三级结构中的位置409(其为IgG4中的R和IgG1中的K)。V397接近K392。因此，可能的是，这些残基可能起增强或削弱CH3结构域之间的相互作用的作用，尤其是在一条重链是IgG4而另一条重链是IgG1的情况下。然而，图11中的数据表明，所测试的取代中没有一种取代与当Fc片段未改变时观察到的相比显著降低了异源二聚体(表示为“HC/Fc”)的百分比，即使所有三个位点处的一些取代用较大的氨基酸替代原始氨基酸也是如此。比较图11中的泳道18与图11中的所有其它泳道。
在进一步的实验中，分析来自转染子的培养基，所述转染子含有编码人IgG4HC(其除了包含单一改变S228P以阻止Fab臂交换外是野生型的)和在D399和/或K409处具有改变的人IgG1Fc片段的DNA。结果在图12中示出。IgG1Fc片段中的单个取代D399K、D399R、K409D和K409E增加了异源二聚体形成。比较图12中的泳道1与图12中的泳道2至5。然而，当IgG1Fc片段含有D399K和K409E或D399K和K409D时，异源二聚体占由转染子产生的总抗体的少于5％。图12中的泳道6和泳道7。
图13中示出的数据解决了使用IgG4全长HC而不是例如IgG1HC是否在图12中示出的结果中起作用的问题。在图13中，泳道10至19显示了来自含有编码野生型(泳道10和15)或改变的(泳道11至14和16至19)人IgG1Fc片段和两种不同的人IgG4HC(一种(Ab1)在泳道10至14中，并且另一种(Ab2)在泳道15至19中)的DNA的转染子的数据。来自Ab2IgG4(泳道15至19)和Ab2IgG1(泳道20至24)的数据直接可比较，因为这些抗体分别含有IgG4或IgG1形式的相同可变结构域。如图13中的表所示，Fc中的改变在位置D399和K409处。在产生改变的Fc片段和全长人IgG4HC的转染子中很少或没有异源二聚体被检测到。图13中的泳道11至14和泳道16至19。相比之下，在来自产生改变的Fc片段和全长人IgG1HC的转染子的培养基中可检测到异源二聚体。图13中的泳道21至24。因此，这些数据表明使用IgG4HC而不是IgG1HC对于获得最低水平的异源二聚体是重要的。
如表8中所示，人IgG4HC在位置409处具有精氨酸，而人IgG1HC在位置409处具有赖氨酸。以下实验研究了这种差异是否在图13中观察到的效应中起作用，所述效应即产生人IgG4HC加上改变的(D399K/R、K409E/D)人IgG1Fc的宿主细胞与产生人IgG1HC加上相同改变的IgG1Fc的宿主细胞相比产生更低水平的HC-LC/Fc异源二聚体。用编码人IgG1Fc片段和人HC加LC的DNA转染宿主细胞。Fc是野生型(WT)或含有如图14中所示的改变。如图所示，HC是WTIgG1、WTIgG4或含有改变K409R的IgG1，所述改变K409R使IgG1在该位置处类似IgG4。图14中的数据显示，当宿主细胞产生含有D399K/R和K409D/E的Fc以及是野生型(WT)IgG4或含有改变K409R的IgG1的HC时，异源二聚体(表示为“HC/Fc”)的水平最低。比较图14中的泳道2至5和12至15与泳道7至10。当WTIgG1HC与含有D399K/R和K409D/E的Fc一起使用时，观察到了更高水平的异源二聚体。图14中的泳道7至10。因此，在这些实验中已经鉴定出了基本上消除可检测的异源二聚体形成的改变。
实施例5：按尺寸评估抗体混合物
为了确定上述一些改变的抗体混合物中存在多少种类的抗体，测定了混合物中各抗体的尺寸。首先，在非还原条件下通过SDS-PAGE评估这些混合物中全长抗体种类的尺寸，并在还原条件下通过SDS-PAGE评估各个HC和LC的尺寸。在非还原条件下在约150kDa(全长抗体)处和/或在还原条件下在约50kDa(HC)和/或25kDa(LC)处存在多个条带将支持混合物含有多种全长抗体种类的概念。为了进一步分辨全长抗体种类，在低pH下进行阳离子交换(CEX)色谱，这提供了对在150kD附近的尺寸范围内的种类的清晰分辨率。此外，通过质谱法(MS)测定来自少量抗体混合物的Fab片段的尺寸，这可以在针对含有同源和/或非同源HC/LC对的抗体混合物中可能形成的大多数不同Fab片段所预期的范围内区分质量差异。
为了评估在用编码变体MabPair 17B、MabPair 17C、MabPair18B、MabPair 18C和MabPair 19C(参见表21)的DNA转染的细胞中产生的全长抗体和单独HC和LC的尺寸，用编码具有这些MabPair的两种抗体中的每一种的HC和LC的DNA转染EXPI293TM细胞。转染后，在振荡孵育4天后收获培养上清液。将抗体用蛋白A柱纯化，如实施例3所述在4-15％CRITERIONTMTGX STAIN-FREETM预制SDS-PAGE凝胶中进行分析，并且如实施例2中所述进行印迹和检测。结果在图15中示出。
如图所示，图15的泳道1至7含有非还原样品，并且泳道8至14含有还原样品。作为对照，泳道1和8含有抗体混合物，所述抗体混合物预期含有两种不同抗HER2抗体(4D5-8和2C4，所述抗体具有在表20中描述为变体14D的改变)加上含有来自每种抗体的一种HC和一种LC的双特异性抗体。在非还原条件下，该样品显示出三条约150kDa的条带，表明存在三种不同的抗体。作为进一步的对照，泳道2和9(标记为IgG1)含有IgG1抗CTLA4抗体，所述抗体在非还原条件下显示约150kDa单条带，表明该样品含有单一抗体种类。在非还原条件下，MabPair变体17B、17C、18B和18C显示出两条约150kDa的条带(泳道3至6)，表明这些样品含有两种抗体种类。这是符合预期的，因为这些混合物中的抗体中的一种含有不利于异源二聚体形成的改变，并且因此混合物将预期是MabPair，即仅包含两种主要抗体种类的混合物。变体19C在非还原条件下仅显示一条条带(泳道7)，表明在该样品中多种抗体种类共迁移。
当被还原时，对照样品显示一条约50kDa的条带和两条约25kDa的条带(图15，泳道8)，表明两种不同的HC在相同位置迁移，而两种不同的LC分开迁移。还原条件下的IgG1对照(泳道9)显示约50kDa单条带和约25kDa单条带。所有还原的MabPair变体样品显示尺寸为50KDa的单条带和两条约25kDa的条带(泳道10至14)，表明两种不同的HC一起迁移，而两种不同的LC分开迁移。因此，图15中的数据，当与实施例3和实施例4中的数据以及下面的数据合在一起时，强烈表明17B、17C、18B、18C和19C混合物含有不超过两种主要抗体种类。
由于用作设计变体抗体混合物1A至16D(表17至20)的起点的两种IgG1抗HER2抗体不含有任何不利于异源二聚体形成的改变，因此这些变体混合物在由宿主细胞产生时可含有三种不同的主要抗体种类，即含有两条相同的HC和两条相同的LC的两种不同的单特异性抗体和含有两条不同的HC和两条不同的LC的双特异性抗体。为了测试该假设，在摇瓶中将编码五种变体3合1混合物(即，13D、14C、14D、15B和15C(参见表20和图8)的两种HC和两种LC的DNA转染到30至50毫升(ml)EXPI293TM细胞内。收获上清液，并使用标准蛋白A柱纯化抗体。将不同量的纯化抗体以1:2系列稀释从每泳道200ng开始在4-15％CRITERIONTM TGX STAIN-FREETM预制SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad Laboratories,Inc.)上进行分析，并如实施例2中所述进行印迹和检测。在非还原条件下(图16，顶部图)，所有纯化的抗体混合物显示出约3条不同的约150kDa条带，表明这些混合物含有三种不同的抗体。在还原条件下(图16，底部图)，所有纯化的混合物显示出1条约50kDa的条带和2条约25kDa的条带，表明两种不同的HC一起迁移，而两种不同的LC分开迁移。
为了更好地分辨尺寸范围为约150kD的全长抗体种类，对含有变体抗体混合物18C(在表21中描述)的样品进行低pH阳离子交换色谱(CEX)，所述变体抗体混合物含有抗PD1、抗CTLA4MabPair。该方法由Chen等人(2010),Protein Science,19:1191-1204描述，该文献的全部内容并入本文。简而言之，该方法使用Waters Alliance 2695高效液相色谱(HPLC)系统，采用前面接有50mm保护柱(PROPACTM WCX-10G)的4×250mm Thermo PROPACTM WCX-10弱CEX柱。以从100％缓冲液A(20mM乙酸钠，pH 5.2)至100％缓冲液B(20mM乙酸钠和250mM氯化钠，pH 5.2)的线性梯度运行色谱30分钟。将该柱用高盐(1M氯化钠)洗涤，并重新平衡至缓冲液A的起始条件。样品含有18.8mg的蛋白，并且通过214nm的吸光度检测柱流出物中的抗体。
结果在图17中示出。如图17中所示，顶部的两条迹线来源于抗CTLA4(顶部)和抗PD1(顶部向下第二个)抗体的色谱，所述抗CTLA4抗体和抗PD1抗体是实施例3和实施例4中所述改变的起点。底部迹线来源于变体抗体混合物18C(参见表21)的色谱。使用来自WatersCorporation(Milford,MA,USA)的EMPOWERTM软件根据峰面积计算18C混合物中各组分的相对百分比，所述软件还用于控制HPLC系统。在来源于混合物18C的底部迹线中，对应于抗PD1抗体的较早、较小峰占混合物的21％，而对应于抗CTLA4抗体的较晚、较大峰占混合物的79％。这些数据显示，低pH CEX容易地区分了不同的全长抗体种类，并且可用于定量混合物中特定抗体种类的相对量。
为了获得可以区分同源与非同源HC/LC对的数据，通过MS分析含有编码五种不同变体抗体混合物(13D、14C、14D、15C和15D)的DNA的转染子的上清液。用木瓜蛋白酶(ThermoScientific，目录号44985)消化混合物以产生Fab片段。当IgG分子在半胱氨酸存在下与木瓜蛋白酶一起孵育时，铰链区中的一个或多个肽键(通常在His224至Thr 225之间)断开而产生三个相似尺寸(约50kD)的片段：两个Fab片段和一个Fc片段。固定化酶是有利的，因为可以通过离心简单地使IgG溶液与包被有木瓜蛋白酶的树脂分离而立即停止消化，从而产生基本上无酶的消化物。在SYNAPTTM G2MS系统(Waters Corporation,Milford,MA,USA)上分析消化产物。鉴于MS的高分辨率，Fab片段和Fc片段是易区分的。下面描述的分析聚焦于与Fab片段的预期质量接近的质量。
只有四种不同的Fab片段可以由两种不同的HC(HC1和HC2)和两种不同的LC(LC1和LC2)制成，即HC1/LC1Fab、HC1/LC2Fab、HC2/LC2Fab和HC2/LC1Fab。在大多数情况下，可以使用MS分离这些不同的Fab片段。下表22显示了13D、14C、14D、15B和15C抗体混合物的四种可能Fab片段的计算质量。
表22：Fab片段的计算质量
*这些质量估计未考虑任何潜在的翻译后修饰，诸如糖基化。然而，预测在这些Fab片段中没有N-糖基化。
如果在14D混合物中仅存在同源HC/LC对，则从木瓜蛋白酶消化中回收的Fab片段中将仅存在两种Fab片段，HC1/LC1Fab和HC2/LC2Fab。图18示出了来自14D抗体混合物的Fab片段的MS分析结果。检测到了两种主要种类，一种在约47,877道尔顿处，而另一种在约47,942道尔顿处。图18.这些可能是HC1/LC1Fab(预测尺寸为47,875.07道尔顿)和HC2/LC2Fab(预测尺寸为47,943.22道尔顿)。如果在混合物中已经存在可观量的非同源HC/LC对，则将检测到在约48,081.44道尔顿和/或47,736.85道尔顿处的另外两个峰。由于此类峰未被检测到并且可以容易地与使用MS实际检测到的峰分离，因此这些数据强烈表明14D混合物中的大多数(如果不是全部)HC/LC对是同源HC/LC对。
在通过MS分析的四种其它样品中，13D和15D混合物产生的结果类似于图18中所示的结果，即仅在与来自同源HC/LC对的Fab片段的计算质量几乎相同的质量处观察到两个主峰。在混合物14C和15C中，仅观察到一个主峰，该主峰与来自这些混合物中的每一种中的同源HC/LC对中的一个的Fab片段的计算质量几乎质量相同。我们假设来自这些样品中的另一同源HC/LC对的Fab片段被用于产生Fab片段的木瓜蛋白酶消化，因为所讨论的同源对在上述链脱扣实验中形成全长抗体。
实施例6：IgG1/IgG4MabPair的表征，在所述IgG1/IgG4MabPair中一种抗体不含有配偶体定向改变
上述数据表明，用编码两种不同IgG抗体的DNA转染的单一宿主细胞系可能仅产生两种主要抗体种类。在那些实验中，一种或两种抗体经工程化以实现该结果。以下实验旨在进一步表征这样的MabPair，在所述MabPair中一种抗体不包含配偶体定向改变或不利于异源二聚体的改变，而另一种抗体包含一个或多个配偶体定向改变以及一个或多个不利于异源二聚体的改变。为了确定在含有编码此类抗体的DNA的转染子中形成的主要种类数，进行以下实验。
使用人IgG1抗CTLA4 111抗体作为产生工程化抗体的起始位置。抗CTLA4 111抗体的恒定结构域和可变结构域的框架区的氨基酸序列与在SEQ ID NO:38(HC)和SEQ ID NO:40(LC)中报道的抗CTLA4抗体1E1的氨基酸序列相同。构建编码包含以下改变的抗CTLA4111抗体的HC的DNA：K147D、F170C、V173C、C220G、R255K、D399R和K409E。通常，包含改变R255K的IgG抗体与不含此改变的抗体相比被更快地从血清中清除，并且改变D399R和K409E不利于HC/HC异源二聚体形成。构建另一种编码包含以下改变的抗CTLA4 111抗体轻链的DNA：S131K、Q160C、S162C和C214S。
将编码该工程化抗CTLA4 111抗体、未改变的抗CTLA4 111抗体和实施例2中所述的未改变形式的人源化IgG4抗PD1 102抗体的质粒DNA从含有它们的培养细菌中回收，并使用Midi-prep试剂盒(Qiagen N.V.,the Netherlands)纯化。使用2000(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)在125mL摇瓶中用单独编码每种抗体或编码含有工程化抗CTLA4 111抗体和抗PD1102抗体的抗体混合物的质粒DNA转染哺乳动物EXPI293TM细胞。将细胞以150rpm在37℃连续振荡4天。通过以1500rpm离心细胞20分钟收获上清液，并使用标准蛋白A柱纯化上清液中的抗体。使用配备有电喷雾电离(ESI)源的Agilent 6224精确质量飞行时间(TOF)质谱仪，通过MS分析纯化的抗体。结果示出于图19中。
对从用编码未改变的抗CTLA-4 111抗体的DNA转染的EXPI293TM细胞产生的去糖基化抗体的MS分析表明，该抗体的质量为144,890.12道尔顿，该质量与144,889.16道尔顿的预测质量相差每百万之7(ppm)内。图19的图A.对用编码工程化抗CTLA4 111抗体的DNA转染的EXPI293TM细胞产生的去糖基化抗体的MS分析显示，该抗体的质量为144,780.02道尔顿，该质量与144,779.00道尔顿的预测质量相差7ppm内。图19的图B.对从用编码抗PD-1 102抗体和工程化的抗CTLA4 111抗体的HC和LC的DNA转染的EXPI293TM细胞产生的去糖基化抗体的MS分析得到了两个约146,000道尔顿的主要峰。还检测到少量可能包含一种HC和一种LC的种类(73,214.20道尔顿)。图19的图C.主峰放大图显示出一个峰为144,779.69道尔顿，而另一个峰为146,426.58道尔顿。图19的图D.这些质量符合工程化的抗CTLA4 111抗体的预测质量(144,779.00道尔顿)和抗PD1102抗体的预测质量(146,426.20道尔顿)，分别在4.8ppm和2.6ppm内。因此，这些数据表明，在含有编码抗PD1 102抗体和工程化抗CTLA4 111抗体的DNA的宿主细胞中仅产生两种主要抗体种类。
将从用编码抗PD-1 102抗体和工程化抗CTLA4 111抗体的HC和LC的DNA转染EXPI293TM细胞产生的纯化抗体对进行进一步分析，以确认仅存在同源HC/LC对。将该抗体对用IdeS蛋白酶(Promega，目录号V7511，其在铰链区下方的单个位点切割IgG抗体，从而产生F(ab’)2片段和包含CH2和CH3结构域的片段)消化，并在乙二胺四乙酸(EDTA)存在下用2-巯基乙胺(2-MEA)进一步处理。用2-MEA和EDTA处理减少了铰链区二硫桥，而基本上不影响HC/LC二硫桥。因此，预计该处理将产生Fab'和包含CH2和CH3结构域的片段，可能伴有少量的LC片段和Fd片段。LC片段和Fd片段被命名为LC1(抗PD1)或LC2(抗CTLA4)和Fd1(抗PD1)或Fd2(抗CTLA4)，取决于它们是源自第一抗体还是第二抗体。参见图20中的图A.潜在地，Fab’片段可以含有LC1和Fd1、LC2和Fd2、LC2和Fd1、和/或LC1和Fd2。这些Fab'片段的计算质量显示在下表中。
表23：抗PD1、抗CTLA4抗体对的潜在Fab'片段的计算质量
Fd/LC组合 Fab’的计算质量(道尔顿)
Fd1/LC1 49,460.32
Fd2/LC2 48,607.56
Fd1/LC2 49,272.08
Fd2/LC1 48,795.82
通过MS分析经消化和经2-MEA加EDTA处理的抗体对在48,605.68道尔顿和49,458.94道尔顿处产生峰，所述峰分别符合Fd2/LC2的计算质量(在39ppm内)和Fd1/LC1Fab’的计算质量(在28ppm内)。图20，图B.在Fab'片段的计算质量附近的尺寸范围内没有观察到其它峰。因此，这些数据表明观察到的两种HC/LC对是同源对。
为了确认在工程化抗CTLA4 111抗体中形成了两个新引入的二硫键，将100μg的该抗体在室温下在含有5mM的N-乙基马来酰亚胺(NEM)(ThermoScientific，目录号23030)的pH7.2的磷酸盐缓冲液中孵育2小时。NEM可以将游离硫醇(例如，不是二硫桥的一部分的半胱氨酸残基)烷基化。通过缓冲液交换去除过量的NEM后，以1:10(酶:蛋白质)比率添加赖氨酰内肽酶(Wako Chemicals，目录号125-05061，其切割赖氨酸残基的羧基侧上的蛋白质)，并且将反应混合物在37℃孵育16小时。然后将一半混合物在室温下使用25mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP,ThermoScientific,目录号20490)还原30分钟。
对赖氨酰内肽酶消化产物的液相色谱-质谱(LC-MS)分析如下进行。在AgilentPolaris C18-A柱(2.0×250mm,5μm,Agilent Technologies,Inc.)上进行还原样品和非还原样品的反相(RP)HPLC。将50μg样品注射到柱上，并且首先将柱保持在98％流动相A(0.1％的三氟乙酸(TFA)水溶液)和2％流动相B(0.1％TFA在90％乙腈(ACN)中的溶液)5分钟。使用40分钟的2-22％流动相B线性梯度之后是160分钟的22-52％流动相B线性梯度实现分离。将柱温和流速分别保持在50℃和0.2mL/min。
在配备有ESI源的Agilent 6224精确质量TOF质谱仪上以正离子模式进行对柱流出物的在线MS分析。将干燥气体温度、干燥气体流量和喷雾器分别设定为350℃、12L/min和40psig。将毛细管、裂解器、分离器1和Oct RF Vpp分别设定在4500V、250V、60V和750V。将仪器以4GHz的高分辨率在100至3000的m/z范围中校准。使用AgilentQualitative和BioConfirm软件分析来自LC/MS的数据。
通过比较还原对比非还原赖氨酰内肽酶消化物的柱谱和质量分析，来确定被取代的半胱氨酸残基F170C(HC)-S162C(LC)和V173C(HC)-Q160C(LC)是否实际上在改变的抗CTLA4抗体中形成二硫键。在非还原条件下，在反相柱上103.48分钟的保留时间处检测到了峰(标记为“3个二硫键连接的肽”，图21的图B)，但是该峰在还原条件下不存在(图21的图C)。如果形成了所预测的二硫键，则图21的图A中所示的两个肽将在赖氨酰内肽酶消化后通过一个链内二硫键和两个链间二硫键共价连接。在非还原条件下在103.48分钟处检测到的峰中的肽具有9441.35道尔顿的真实单一同位素质量(5×1889.07-4＝9441.35，因为肽处于+5电荷态)，其与连接肽的预测单一同位素质量(即9441.37道尔顿)仅相差2ppm。图22的图A。在还原条件下，在39.65和113.05分钟的保留时间处观察到了两个峰(分别标记的链A和链B)，这两个峰在非还原条件下不存在。图21的图C.这两个峰的实际单一同位素质量为7321.48道尔顿(1831.12×4-3＝7321.48)和2126.90道尔顿(1063.95×2-1＝2126.90)(图22的图B和C)，它们分别完全符合链A和链B的理论单一同位素质量(图21的图A)。
此外，经NEM处理的未改变的抗CTLA4抗体对比上面刚刚讨论的工程化抗CTLA4抗体的质量分析显示两者都具有大致相同百分比的游离半胱氨酸残基，即不是二硫桥的一部分的半胱氨酸残基。数据未示出。总的来说，这些数据表明在F170C(HC)-S162C(LC)和V173C(HC)-Q160C(LC)处的两个新引入的半胱氨酸对确实形成了二硫键。
实施例7：IgG2/IgG4MabPair的表征，其中一种抗体不含有配偶体定向改变
进行以下实验以确定是否可以在单一宿主细胞系中成功制备如实施例6中所述但含有IgG2和IgG4抗体而不是IgG1和IgG4抗体的MabPair。
通过IDT合成编码具有人恒定区的IgG2抗体的HC和LC的DNA(适合于通过Gibson反应进行组装以及用于其它用途的双链DNA；Integrated DNA Technologies(IDT),Coralville,Iowa)。将它们进行组装并使用Gibson反应插入哺乳动物表达载体中。HC具有以下取代：C131S、K147D、F170C、V173C、D399R、以及K409E。这些中的前四个用于增强同源HC/LC配对并阻止非同源HC/LC配对，并且最后两个是不利于HC1/HC2异源二聚体形成的改变。该工程化HC的CH1、铰链、CH2和CH3结构域的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:42中。LC具有取代S131K、Q160C、S162C和C214S，所述取代用于增强同源HC/LC配对并阻止非同源HC/LC配对。该工程化CLκ结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:44中提供。
这种工程化IgG2抗体，无论是单独的还是与未改变的IgG4抗PD-1 102抗体(在实施例2中描述)组合，都通过用上述质粒DNA瞬时转染EXPI293TM细胞并培养转染的细胞来表达。将表达的抗体从细胞上清液中回收，并使用蛋白A柱纯化。从用编码IgG2抗体和IgG4抗体两者的DNA转染的细胞纯化的抗体的质谱在用糖肽酶F去糖基化后进行。在下表24中，示出了从上述IgG2(包含HC2和LC2)和IgG4(包含HC1和LC1)抗体的所有可能的同源和非同源HC/LC配对产生的缺乏HC的C末端赖氨酸(其大部分由哺乳动物细胞中的羧肽酶去除)的全长去糖基化IgG抗体的计算质量。
表24：IgG抗体的计算质量
链组分* 预测质量
HC1-LC1和HC1-LC1 146,424.20
HC2-LC2和HC2-LC2 143,659.64
HC2-LC1和HC2-LC1 145,116.62
HC1-LC2和HC1-LC2 144,967.22
HC1-LC2和HC2-LC1 145,041.92
HC1-LC1和HC2-LC2 145,041.92
HC1-LC1和HC1-LC2 145,696.71
HC2-LC1和HC2-LC2 144,389.13
HC1-LC1和HC2-LC1 145,771.41
HC1-LC2和HC2-LC2 144,314.43
*HC1和LC1是来自IgG4抗体的HC和LC，并且HC2和LC2是来自IgG2抗体的HC和LC。
实际质谱结果示出在图23的图A中。检测到了两个主峰。所述两个主峰中较小的主峰为143,666.77道尔顿，其符合IgG2抗体的计算质量(143,659.64道尔顿)，误差为50ppm。所述两个主峰中较大的主峰为146,426.81道尔顿，其符合IgG4抗体的预测质量(146,424.20道尔顿)，误差为18ppm。所述两个主峰中的每一个都伴有在稍大质量处的肩峰，据信这是由于在产生抗体的哺乳动物细胞中羧肽酶对HC的C末端赖氨酸的不完全去除。参见图23的图A。由异源二聚HC/HC配对和/或非同源HC/LC配对产生的抗体的计算质量范围为144,314.43至145,771.41道尔顿。表24。在该尺寸范围内没有观察到实质的峰(图23的图A)，表明仅存在两种主要的抗体种类。
为了证实仅存在同源HC/LC对，还用IdeS蛋白酶、2-MEA和EDTA处理纯化的抗体以产生Fab'片段，并且随后如实施例6中所述通过质谱分析进行分析。下表25显示了由包括同源对和非同源对的四种可能的Fd/LC配对产生的Fab'片段的计算质量。
表25：Fab’片段的计算质量
Fd/LC组合* Fab’的计算质量(道尔顿)
Fd1/LC1 49,458.32
Fd2/LC2 48,015.87
Fd1/LC2 48,730.83
Fd2/LC1 48,745.36
*Fd1和LC1来自IgG4抗体，并且Fc2和LC2来自IgG2抗体。
来自质谱仪的实际结果示出在图23的图B中。在48,017.74和48015.87道尔顿处检测到了主峰，所述主峰符合Fd2/LC2Fab’片段的计算质量(误差为39ppm)和Fd1/LC1Fab’片段的计算质量(误差为36ppm)。在从非同源HC/LC配对产生的Fab'片段的预测质量(即48,730.83或48,745.36道尔顿)处或附近没有检测到其它峰。
上述质谱结果表明，在用上述编码工程化IgG2抗体和未改变的IgG4抗体的DNA转染的细胞中仅产生两种具有同源二聚HC/HC配对和同源HC/LC配对的主要抗体种类。因此，这些结果强烈表明，IgG2抗体中的改变足以产生以下情况：在用编码工程化IgG2抗体和未改变的IgG4抗体的DNA转染的细胞中仅产生两种主要抗体种类。
实施例8：用于评估宿主细胞中产生的抗PD1和抗CTLA4MabPair抗体混合物的结合活性的基于ELISA的测定。
进行以下测定以评估在单个宿主细胞中产生的抗PD1、抗CTLA4MabPair混合物的抗原结合。用生物素化的人PD1(具有六聚组氨酸(His-6)标签的细胞外结构域)或生物素化的人CTLA4(具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的细胞外结构域)使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中100μl的1μg/mL溶液包被微量滴定板(96孔)。将平板用1x PBST洗涤三次，并用250μl/孔的封闭缓冲液(3％脱脂牛奶在1X PBST中的溶液)封闭，室温下振荡1小时。将平板再洗涤三次，并且以100μl/孔添加标准抗体对照样品或含有抗体混合物的测试样品在稀释缓冲液(PBST加0.1％牛血清白蛋白(BSA))中的溶液，在室温(RT)下振荡2小时。洗涤3次后，将100μl的HRP缀合的驴抗人IgG以1:5000的稀释度在稀释缓冲液中的溶液添加到各孔中，并将平板在室温下振荡2小时。洗涤三次后，将100μl的底物添加到各孔中，并将平板振荡孵育20分钟。通过添加0.16M的硫酸终止反应，并在(PerkinElmer,Waltham,Massachusetts,USA)读板器中在450nm读板。
所测试的MabPair混合物中抗PD1抗体和抗CTLA4抗体的浓度分别根据使用对照抗PD1和抗CTLA4抗体绘制的标准曲线进行推导。结果表明，MabPair变体混合物17B、17C、18B、18C、19C分别包含18.0％、11.8％、27.2％、23.4％、27.2％的抗PD1抗体，并且分别包含82.0％、88.2％、72.8％、76.6％、72.8％的抗CTLA4抗体。因此，这些数据表明产生这些变体混合物的宿主细胞产生的抗CTLA4抗体比抗PD1抗体更多。
实施例9：用于评估抗PD1和抗CTLA4MabPair抗体混合物中
抗PD1抗体的效力的荧光素酶报告基因测定
以下实验测试含有抗PD1抗体和抗CTLA4抗体的MabPair混合物中抗PD1抗体抑制PDL1与PD1相互作用的能力，其中PD1在细胞表面上表达。
将稳定表达PD1和萤光素酶的Jurkat细胞(来自Promega Corporation,Madison,WI,USA)以4×104个细胞/孔、以20μl的体积接种到96孔板的48个孔中(以避免边缘效应)。在孵育一天后，将20μl的5×104个稳定表达PDL1的CHO细胞添加到各孔中，以及将20μl的对照抗体或MabPair混合物添加到各孔中。在CHO细胞上表达的PDL1可以与Jurkat细胞上的PD1接合，从而激活抑制荧光素酶表达的细胞内信号传导途径。如果抗体通过与PD1结合阻止PD1/PDL1接合，则荧光素酶表达将增加。进行抗体或混合物的1:3系列稀释，使得不同的孔具有不同浓度的抗体或混合物。将平板在37℃于5％CO2中孵育6小时。将BIO-GLOTM荧光素酶试剂(Promega，目录号G7941)以每孔40μl添加以裂解细胞，并在读板器(PerkinElmer)上读板。结果示出在图24和下表26中。这些数据表明，抗PD1和抗CTLA4MabPair抗体混合物17B、17C、18B、18C和19C以与单独的未改变的抗PD1抗体(表示为“抗PD1”)相比相当的效力阻断PDL1-PD1相互作用。
表26：MabPair混合物中抗PD1抗体的效力
*基于实施例8中测定的每种混合物中抗PD1抗体的浓度。
实施例10：用于评估抗PD1和抗CTLA4MabPair抗体混合物中抗CTLA4抗体的效力的荧光素酶报告基因测定
以下实验测试含有抗PD1抗体和抗CTLA4抗体的MabPair混合物中抗CTLA4抗体抑制CD80和/或CD86与CTLA4相互作用的能力，其中CTLA4在细胞表面上表达。
将稳定表达CTLA4和萤光素酶的Jurkat细胞(来自Promega Corporation,Madison,WI,USA)以5×104个细胞/孔、以15μl的体积接种到96孔微量滴定板的48个孔中。在孵育一天后，将15μl的5×104个稳定表达CD80和CD86的Raji细胞添加到各孔中，以及将15μl的对照抗CTLA4抗体或MabPair混合物添加到各孔中。在Raji细胞上表达的CD80和CD86可以与Jurkat细胞上的CTLA4接合，从而激活抑制荧光素酶表达的细胞内信号传导途径。如果抗体通过与CTLA4结合阻止CTLA4与CD80和/或CD86接合，则荧光素酶表达将增加。进行抗体或混合物的1:3系列稀释，使得不同的孔具有不同浓度的抗体或混合物。将平板在37℃于5％CO2中孵育6小时。将BIO-GLOTM荧光素酶试剂(Promega，目录号G7941)以每孔40μl添加以裂解细胞，并在读板器(PerkinElmer)上读板。结果示出在图25和下表27中。
表27：MabPair混合物中抗CTLA4抗体的效力。
*基于实施例8中测定的每种混合物中抗CTLA4抗体的浓度。
这些数据表明，抗PD1和抗CTLA4MabPair混合物17B、17C、18B、18C和19C中的抗CTLA4抗体阻断CTLA4-CD80/86相互作用，尽管其效力低于单独的未改变的抗CTLA4抗体。18C混合物是MabPair抗体混合物中最有效的。因此，尽管这些数据表明变体混合物中的抗CTLA4抗体与单独的未改变的抗CTLA4抗体相比具有降低的活性(约低2-6倍)，但含有改变的抗CTLA4抗体的MabPair混合物仍显示出抗CTLA活性。这些结果可以表明，这些抗CTLA4抗体的改变影响了它们的效力，但是观察到抗PD1抗体的效力几乎没有变化。
实施例11：用于评估包含配偶体定向改变的抗CTLA4抗体的效力的荧光素酶测定，该抗体是还包含缺乏此类改变的抗PD1抗体的MabPair的一部分
该实验在包含实施例6中所述的未改变的抗PD1 102抗体的MabPair的环境下测试了实施例6中所述的工程化IgG1抗CTLA4 111抗体的效力，该工程化IgG1抗CTLA4 111抗体包含不利于异源二聚体的改变和配偶体定向改变。基本上如实施例10中所述进行测定。作为对照，还测试了未改变的抗CTLA4 111抗体(不作为MabPair的一部分)和另一种具有非常密切相关序列的未改变的抗CTLA4抗体(抗CTLA4 110抗体)。抗CTLA4 110抗体的恒定结构域的氨基酸序列与抗CTLA4抗体1E1的氨基酸序列相同，所述氨基酸序列在SEQ ID NO:38(HC)的氨基酸119-448和SEQ ID NO:40(LC)中的氨基酸108-214中提供。抗CTLA4抗体110的可变结构域的框架区的氨基酸序列与抗CTLA4抗体1E1的可变结构域的框架区的氨基酸序列相同，不同之处在于框架区中的单一取代。结果示出在图26中并汇总于下表28中。
表28：在MabPair环境下抗CTLA4抗体的效力
*基于MabPair混合物中抗CTLA4抗体的浓度，所述浓度如实施例8中所述测定。
这些数据表明，MabPair中的工程化抗CTLA4 111抗体以与单独的改变的抗CTLA4111抗体相当并略高于单独的未改变的抗CTLA4111或抗CTLA4 110抗体的效力阻断CTLA4-CD80/86相互作用。因此，在该基于细胞的测定中，MabPair中抗PD1抗体的存在基本上不影响改变的抗CTLA4 111抗体的效力。
实施例12：3合1抗HER2抗体混合物与两种抗HER2抗体的组合在杀伤人乳腺癌细胞的能力方面的比较
进行以下实验以确定与两种抗体的组合相比，各种3合1抗体混合物杀伤癌细胞的相对能力，所述两种抗体是单独或组合地产生所述混合物的起始位置。
以100μL/孔将表达人HER2的乳腺癌细胞系BT-474和SK-BR-3以1.0×104个细胞/mL接种在96孔平底板中。将细胞在37℃于5％CO2中孵育4小时。抗HER2抗体4D5-8和2C4用作制备变体抗体混合物1A-16D的起点。实施例3和表17至20。将抗体4D5-8，抗体2C4，这两种抗体的组合，或3合1抗体混合物14D、15C、13D、14C或15D(参见表20)之一以100μL的体积添加到各孔。从136nM开始进行1:4系列稀释。作为阴性对照，以所测试的最高抗体浓度(136nM)包括含有据信与癌细胞生长无关的人IgG1/κ抗体的两个平行测定孔。孵育96个小时后，从每孔中去除100μL上清液，并添加100μL的CELL TITER试剂(Promega，目录号G7572)。将内容物在定轨摇床上混合2分钟以诱导细胞裂解。将平板在室温下孵育10分钟以使发光信号稳定。在读板器(PerkinElmer,Waltham,Massachusetts,USA)中以每孔1秒记录发光信号。发光信号的强度与细胞中存在的ATP的量成比例，所述ATP的量是细胞活力的反映。结果示出在图27和下表29中。
表29：抗HER2抗体或其混合物抑制癌细胞活力的IC50
IgG1/κLC对照抗体(在图27中标记为“IgG1”)不影响BT-474细胞的活力。抗HER2抗体2C4对BT-474细胞的活力具有轻微的负面影响。抗HER2抗体4D5-8对BT-474细胞的活力具有显著的负面影响，并且4D5-8和2C4的组合也具有负面影响。与4D5-8+2C4抗体混合物相比，抗HER2 3合1抗体混合物14D、15C、13D、14C和15D都对BT-474细胞的活力具有更大的负面影响，表明与仅4D5-8和2C4的组合相比，所有3种抗体组分(4D5-8、2C4，以及包含这些抗体中的每一种的一半的双特异性抗体)更加抑制BT-474肿瘤细胞生长。3合1抗体混合物样品15C是BT-474细胞中最有效的抑制剂，IC50是0.22nM。
在SK-BR-3细胞中，IgG1/κLC对照抗体不影响细胞活力。抗体2C4对SK-BR-3细胞的活力具有小影响，而4D5-8具有更大的影响。4D5-8和2C4的组合对活力的影响大于2C4且影响小于4D5-8。与2C4+4D5-8的混合物相比，抗HER2 3合1抗体混合物14D、15C、13D、14C和15D都对细胞活力具有略大的影响。这些数据表明，3合1混合物中的抗体种类一起作用以抑制肿瘤细胞的生长。
这些数据表明含有两种不同的单特异性抗HER2抗体加上包含每种抗体的一半的双特异性抗体的3合1混合物可以有效地抑制表达HER2的癌细胞的生长。
序列表
<110> Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation
<120> 抗体混合物
<130> SB-001-WO
<150> 62/342,167
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<160> 44
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人VH结构域的共有氨基酸序列
<220>
<221> X
<222> (1)..(16)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> X是丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221> X
<222> (18)..(18)
<223> X是缬氨酸或亮氨酸
<220>
<221> X
<222> (19)..(19)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (20)..(20)
<223> X是缬氨酸或亮氨酸
<220>
<221> X
<222> (21)..(21)
<223> X是丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221> X
<222> (23)..(35)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (36)..(37)
<223> X可以存在也可以不存在，但是如果存在则可以是
活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (39)..(43)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (45)..(45)
<223> X是赖氨酸或谷氨酰胺
<220>
<221> X
<222> (48)..(54)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (55)..(57)
<223> X可以存在也可以不存在，但是如果存在则可以是
活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (58)..(108)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (109)..(119)
<223> X可以存在也可以不存在，但是如果存在则可以是
活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (120)..(132)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Arg Gln Xaa Xaa Gly Xaa Gly Leu Xaa
35 40 45
Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Tyr Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Gln Gly Xaa Xaa Val
115 120 125
Xaa Val Ser Xaa
130
<210> 2
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1结构域的共有氨基酸序列
<220>
<221> X
<222> (1)..(15)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (16)..(16)
<223> X是精氨酸或赖氨酸
<220>
<221> X
<222> (17)..(98)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<400> 2
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Leu Xaa Lys Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa His Xaa Phe Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
50 55 60
Xaa Ser Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa
<210> 3
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 4
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val
<210> 5
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 6
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 7
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 8
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Met Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 9
<211> 279
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
65 70 75 80
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
85 90 95
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp
100 105 110
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
115 120 125
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
130 135 140
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
145 150 155 160
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
165 170 175
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
180 185 190
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
195 200 205
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn
210 215 220
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
225 230 235 240
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser
245 250 255
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser
260 265 270
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275
<210> 10
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 11
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人VL结构域的共有氨基酸序列
<220>
<221> X
<222> (1)..(27)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (28)..(33)
<223> X可以存在也可以不存在，但是如果存在则可以是
活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (34)..(48)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (49)..(49)
<223> X是丙氨酸、丝氨酸或脯氨酸
<220>
<221> X
<222> (51)..(63)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (64)..(64)
<223> X是异亮氨酸或缬氨酸
<220>
<221> X
<222> (66)..(89)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (90)..(90)
<223> X是丙氨酸或甘氨酸
<220>
<221> X
<222> (91)..(91)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (93)..(93)
<223> X是酪氨酸或苯丙氨酸
<220>
<221> X
<222> (94)..(101)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (102)..(102)
<223> X可以存在也可以不存在，但是如果存在则可以是
活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (103)..(104)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (107)..(107)
<223> X是谷氨酰胺或甘氨酸
<220>
<221> X
<222> (110)..(117)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<400> 11
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Pro Xaa Arg Phe Ser Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
115
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CL κ结构域的共有氨基酸序列
<220>
<221> X
<222> (1)..(107)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<400> 12
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Pro Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Val Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Ser Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Ser Xaa Ser Ser Thr Leu Thr Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
100 105
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CL λ结构域的共有氨基酸序列
<220>
<221> X
<222> (1)..(66)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<220>
<221> X
<222> (67)..(67)
<223> X是丙氨酸或甲硫氨酸
<220>
<221> X
<222> (68)..(106)
<223> X是活生物体中常见的任何氨基酸
<400> 13
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Pro Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Val Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Thr Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
100 105
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Gly Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Arg Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 19
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链的氨基酸序列
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 20
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 21
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链的氨基酸序列
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 22
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链的氨基酸序列
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 23
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 工程化抗体重链的氨基酸序列
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Phe Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Tyr Thr Tyr Gly Gly Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 24
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 工程化抗体轻链的氨基酸序列
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Ile Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asn His Tyr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体的轻链CDR1的氨基酸序列
<400> 25
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体的轻链CDR2的氨基酸序列
<400> 26
Ser Ala Ser Phe Leu Trp Ser
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体的轻链CDR3的氨基酸序列
<400> 27
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体的重链CDR1的氨基酸序列
<400> 28
Asp Thr Tyr Ile His
1 5
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体的重链CDR2的氨基酸序列
<400> 29
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体的重链CDR3的氨基酸序列
<400> 30
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体的轻链CDR1的氨基酸序列
<400> 31
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala
1 5 10
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体的轻链CDR1的氨基酸序列
<400> 32
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体的轻链CDR3的氨基酸序列
<400> 33
Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体的重链CDR1的氨基酸序列
<400> 34
Asp Thr Tyr Met Asp
1 5
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体的重链CDR2的氨基酸序列
<400> 35
Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体的重链CDR3的氨基酸序列
<400> 36
Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码工程化抗体重链的核苷酸
序列
<400> 37
caggtgcagc ttgtcgaaag cggtggtggg gtagttgaac cagggcgttc tttacgttta 60
tcttgtgcag cctccggttt caccttcagt tcatacggga tgcactgggt tagacaagct 120
ccaggaaaag gattagaatg ggtagctgtt atttggtaca accctagcga gaaggattac 180
gccgattcag ctaagggtag gtttaccatt agtagagaca atagtaaaaa cactctatat 240
ctacaaatga acagcttgcg tgccgaggat actgcagttt actactgcgc gagggctggt 300
cttctcggtt atttcgacta ctggggtcag gggacattgg taactgtttc aagcgctagc 360
accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320
agcctctccc tgtctccggg taaatga 1347
<210> 38
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 工程化抗体重链的氨基酸序列
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Glu Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asn Pro Ser Glu Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 39
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码工程化抗体轻链的核苷酸
序列
<400> 39
gagattgttc tgacacagag tcctggtaca ttatctttgt cccctggtga aagggcaact 60
ctatcttgta gggcctctca atctattagc agctacttgg cttggtatca acaaaaacca 120
ggtcaagcgc cgagaccatt gatttatggt gtctcctcta gagcaacagg gataccagac 180
agatttagtg gaagcggttc aggtactgat ttcactctaa cgattagccg tttagaacct 240
gaagattttg cagtgtacta ttgtcaacag tacggcatga gcccctttac ctttggtcct 300
ggaactaaag tggatataaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga 645
<210> 40
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 工程化抗体轻链的氨基酸序列
<400> 40
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Val Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Met Ser Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 41
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 42
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 工程化抗体的CH1、铰链、CH2和CH3结构域的氨基酸
序列
<400> 42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Asp Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Cys Pro Ala Cys Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Arg Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Glu
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 工程化人抗体CL κ结构域的氨基酸
序列
<400> 44
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Lys Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Cys Glu Cys Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser
100 105

Claims (81)

1.一种包含两种主要抗体种类的抗体混合物，其包括：
(a)包含第一重链(HC1)和第一轻链(LC1)的第一抗体，以及
(b)包含第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)的第二抗体，
其中所述第一和第二抗体是全长灵长类和/或人源化IgG抗体，
其中所述第一抗体包含两条具有相同第一氨基酸序列的HC1链和两条具有相同第二氨基酸序列的LC1链，
其中所述第二抗体包含两条具有相同第三氨基酸序列的HC2链和两条具有相同第四氨基酸序列的LC2链，
其中所述HC1和所述HC2具有不同的氨基酸序列，
其中所述LC1和所述LC2具有不同的氨基酸序列，
其中所述混合物包含不超过十种不同主要种类的全长IgG抗体，并且
其中所述混合物已经由已引入了编码HC1、HC2、LC1和LC2的DNA的宿主细胞系产生。
2.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物包含不超过三种不同主要种类的全长抗体。
3.根据权利要求2所述的混合物，其中同时引入编码所述HC1、HC2、LC1和LC2的所述DNA。
4.根据权利要求2所述的混合物，其中
编码所述HC1和LC1的所述DNA在编码所述HC2和LC2的所述DNA之前被引入，或者
编码所述HC2和LC2的所述DNA在编码所述HC1和LC1的所述DNA之前被引入。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的混合物，其中所述HC1和HC2是人和/或人源化IgG重链(HC)，并且所述LC1和LC2是人和/或人源化轻链(LC)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的混合物，其中：
(a)所述第一和第二抗体两者均包含一个或多个配偶体定向改变；
(b)所述第一和第二抗体两者均包含一个或多个配偶体定向改变，并且所述第一和第二抗体中的至少一者包含至少一个不利于异源二聚体的改变；或者
(c)所述第一抗体包含一个或多个配偶体定向改变并且所述第二抗体不包含配偶体定向改变，或者反之亦然。
7.根据权利要求6(c)所述的混合物，其中所述第一抗体包含一个或多个不利于异源二聚体的改变并且所述第二抗体不包含不利于异源二聚体的改变，或者反之亦然。
8.根据权利要求7所述的混合物，其中
(1)所述第一抗体包含一个或多个配偶体定向改变和一个或多个不利于异源二聚体的改变并且所述第二抗体不包含配偶体定向改变或不利于异源二聚体的改变，或者
(2)所述第二抗体包含一个或多个配偶体定向改变和一个或多个不利于异源二聚体的改变并且所述第一抗体不包含配偶体定向改变或不利于异源二聚体的改变。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的混合物，其包含三种主要抗体种类。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的混合物，其包含不超过两种主要抗体种类。
11.根据权利要求10所述的混合物，其中所述HC1和/或所述HC2含有一种或多种不利于异二聚体的改变。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的混合物，其中
(a)(1)所述HC1是IgG1或IgG2重链(HC)，所述HC2是IgG4 HC，所述HC1在位置399和409处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC2不含有不利于异源二聚体的改变；或者(2)所述HC2是IgG1或IgG2 HC，所述HC1是IgG4 HC，所述HC2在位置399和409处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC1不包含不利于异源二聚体的改变；或者
(b)(1)所述HC1和HC2各自是IgG1或IgG2 HC，所述HC1在位置399和409处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC2包含改变K409R；或者(2)所述HC1和HC2各自是IgG1或IgG2HC，所述HC2在位置399和409处包含不利于异源二聚体的改变，并且所述HC1包含所述改变K409R。
13.根据权利要求12所述的混合物，其中
(a)(1)所述HC1是IgG1或IgG2 HC并且包含改变D399R/K和K409D/E，并且所述HC2是IgG4 HC并且不包含不利于异源二聚体的改变，或者(2)所述HC2是IgG1或IgG2 HC并且包含改变D399R/K和K409D/E，并且所述HC1是IgG4 HC并且不包含不利于异源二聚体的改变；或者
(b)所述HC1和HC2各自是IgG1或IgG2 HC，并且它们中的一者包含改变D399R/K和K409D/E，而另一者包含改变K409R。
14.根据权利要求1至6和9至11中任一项所述的混合物，其中所述第一抗体包含至少一个不利于异二聚体的改变，并且所述第二抗体不含有不利于异源二聚体的改变，或反之亦然。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的混合物，其中
(a)所述第一抗体包含至少一个配偶体定向改变并且所述第二抗体不包含配偶体定向改变；并且
(b)(1)所述第一抗体是人和/或人源化IgG1抗体，所述HC1中的位置220处的所述半胱氨酸被另一种氨基酸取代，并且所述LC1中的位置214处的所述半胱氨酸被另一种氨基酸取代，或者(2)所述第一抗体是人和/或人源化IgG2或IgG4抗体，所述HC1中的位置131处的所述半胱氨酸被另一种氨基酸取代，并且所述LC1中的位置214处的所述半胱氨酸被另一种氨基酸取代。
16.根据权利要求15所述的混合物，其中
所述第一抗体是IgG1抗体，并且其包含在所述HC1中的改变C220G/A和在所述LC1中的改变C214S/A/G；或者
所述第一抗体是人和/或人源化IgG2或IgG4抗体，并且其包含在所述HC1中的改变C131S/A/G和在所述LC1中的改变C214S/A/G。
17.根据权利要求16所述的混合物，其中
所述第一抗体是IgG1抗体，并且其包含在所述HC1中的改变C220G和在所述LC1中的改变C214S；或者
所述第一抗体是IgG2或IgG4抗体，其包含在所述HC1中的改变C131S和在所述LC1中的改变C214S。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的混合物，
其中所述第一抗体是IgG1抗体；
其中所述第一抗体在第一对氨基酸位置处包含至少一对半胱氨酸取代；
其中所述第一对氨基酸位置包括第一HC1位置和第一LC1位置；并且
其中所述第一HC1和LC1位置分别选自由以下组成的组：位置126和124；位置128和118；位置133和117；位置133和209；位置134和116；位置168和174；位置170和162；位置170和176；位置173和160；以及位置183和176。
19.根据权利要求18所述的混合物，
其中所述第一HC1和LC1位置分别选自由以下组成的组：位置168和174；位置173和160；以及位置170和162。
20.根据权利要求19所述的混合物，其中
所述第一抗体包含在第二对位置处的第二对半胱氨酸取代，所述第二对位置包括第二HC1和第二LC1位置，所述第二HC1和第二LC1位置分别不同于所述第一HC1和第一LC1位置，并且
所述第二HC1和LC1位置分别选自由以下组成的组：位置126和124；位置128和118；位置133和117；位置133和209；位置134和116；位置168和174；位置170和162；位置170和176；位置173和160；以及位置183和176。
21.根据权利要求20所述的混合物，其中所述第一HC1和LC1位置分别为173和160，并且所述第二HC1和LC1位置分别为170和162。
22.根据权利要求15至17中任一项所述的混合物，
其中所述第一抗体是IgG4抗体；
其中所述第一抗体在第一对氨基酸位置处包含至少一对半胱氨酸取代；
其中所述第一对氨基酸位置包括第一HC1位置和第一LC1位置；并且
其中所述第一HC1和LC1位置分别选自由以下组成的组：位置126和121；位置126和124；位置127和121；位置128和118；位置168和174；位置170和162；以及位置173和162。
23.根据权利要求22所述的混合物，其中
所述第一抗体在第二HC1位置和第二LC1位置处包含第二对半胱氨酸取代，所述第二HC1位置和第二LC1位置分别不同于所述第一HC1和第一LC1位置，并且
所述第二HC1和LC1位置分别选自由以下组成的组：位置126和121；位置126和124；位置127和121；位置128和118；位置168和174；位置170和162；以及位置173和162。
24.根据权利要求15至17中任一项所述的混合物，
其中所述第一抗体是IgG2抗体；
其中所述第一抗体在第一对接触氨基酸位置处包含至少一对半胱氨酸取代，其中一个位置在所述HC1中并且另一个位置在所述LC1中。
25.根据权利要求24所述的混合物，其中所述HC1和LC1中的所述第一对接触氨基酸位置分别选自由以下组成的组：170和162；以及173和160。
26.根据权利要求24或25所述的混合物，其中所述第一抗体在第二对接触氨基酸位置处包含第二对半胱氨酸取代，其中所述第二对接触氨基酸位置中的一个位置是HC1位置而另一个位置是LC1位置，并且其中所述第二对接触氨基酸位置中的所述HC1和LC1位置各自分别与所述第一对接触氨基酸位置中的所述HC1和LC1位置不同。
27.根据权利要求26所述的混合物，其中所述HC1和LC1中的所述第二对接触氨基酸位置分别选自由以下组成的组：170和162；以及173和160。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的混合物，其中所述第一抗体包含至少一个配偶体定向改变，其中带电氨基酸取代另一种氨基酸。
29.根据权利要求28所述的混合物，
其中所述第一抗体是IgG1抗体，
其中所述第一抗体包含氨基酸的电荷对，
其中所述电荷对中的一个氨基酸在所述HC1中，并且所述电荷对中的一个氨基酸在所述LC1中，
其中所述电荷对中的至少一个氨基酸由所述配偶体定向改变造成；并且
其中所述电荷对由分别在所述HC1和LC1中的以下位置处的以下氨基酸对中的一个组成：147D/E和124K/R；147D/E和129K/R；147D/E和131K/R；147D/E和180K/R；168D/E和164K/R；168D/E和167K/R；或者168D/E和174K/R。
30.根据权利要求28所述的混合物，
其中所述第一抗体是IgG4抗体，
其中所述第一抗体包含氨基酸的电荷对，
其中所述电荷对中的一个氨基酸在所述HC1中，并且所述电荷对中的一个氨基酸在所述LC1中，
其中所述电荷对中的至少一个氨基酸由所述配偶体定向改变造成；并且
其中所述电荷对由分别在所述HC1和LC1中的以下位置处的以下氨基酸对中的一个组成：133D/E和117K/R；137K/R和114D/E；137K/R和116D/E；147D/E和124K/R；147D/E和129K/R；147D/E和131K/R；147D/E和178K/R；147D/E和180K/R；168D/E和164K/R；168D/E和167K/R；168D/E和173K/R；或者168D/E和174K/R。
31.根据权利要求28所述的混合物，
其中所述第一抗体是IgG2抗体，
其中所述第一抗体包含氨基酸的电荷对，
其中所述电荷对中的一个氨基酸在所述HC1中，并且所述电荷对中的一个氨基酸在所述LC1中，
其中所述电荷对中的至少一个氨基酸由所述配偶体定向改变造成。
32.根据权利要求31所述的混合物，其中所述电荷对由所述HC1中的147D/E和所述LC1中的131K/R组成。
33.根据权利要求1至14中任一项所述的混合物，其中
所述HC1和/或所述HC2在HC残基处含有至少一个LC配偶体定向改变，并且
所述LC1和/或所述LC2在分别与HC1和/或HC2中发生所述LC配偶体定向改变处的所述HC残基接触或分别与所述HC1和/或所述HC2中存在的带电氨基酸或半胱氨酸接触的LC残基处含有至少一个HC配偶体定向改变。
34.根据权利要求33所述的混合物，其中
所述LC配偶体定向改变导致所述HC1和所述HC2在所述HC1和所述HC2两者中的所述HC残基处包含带电氨基酸，
所述HC1中的所述HC残基处的所述带电氨基酸与所述HC2中的所述HC残基处的所述带电氨基酸电荷相反，
所述HC配偶体定向改变导致所述LC1和所述LC2在所述LC1和所述LC2两者中的所述LC残基处包含带电氨基酸，
所述LC1中的所述LC残基处的所述带电氨基酸与所述LC2中的所述LC残基处的所述带电氨基酸电荷相反，并且
所述LC1中的所述LC残基处的所述带电氨基酸与所述HC1中的所述HC残基处的所述氨基酸电荷相反。
35.根据权利要求33或34所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(a)所述组的改变，其中所述HC1和所述HC2两者中的位置44和105以及所述LC1和所述LC2两者中的位置43和100各自由带电氨基酸占据，所述HC1中的位置44和105处的氨基酸与所述HC2中的相同位点处的氨基酸各自电荷相反，所述LC1中的位置43和100处的氨基酸与所述LC2中的相同位点处的氨基酸各自电荷相反，所述HC1和所述HC2中的位置44处的氨基酸分别与所述LC1和所述LC2中的位置100处的氨基酸电荷相反，并且所述HC1和所述HC2中的位置105处的氨基酸分别与所述LC1和所述LC2中的位置43处的氨基酸电荷相反；
(b)所述组的改变，其中所述HC1和所述HC2中的位置147和所述LC1和所述LC2中的位置131各自由带电氨基酸占据，所述HC1中的位置147处的氨基酸与所述HC2中的位置147处的氨基酸电荷相反，所述LC1中的位置131处的氨基酸与所述LC2中的位置131处的氨基酸电荷相反，并且所述HC1和所述HC2中的位置147处的氨基酸分别与所述LC1和所述LC2中的位置131处的氨基酸电荷相反；
(c)所述组的改变，其中所述HC1和所述HC2中的位置168和所述LC1和所述LC2中的位置174各自由带电氨基酸占据，所述HC1中的位置168处的氨基酸与所述HC2中的位置168处的氨基酸电荷相反，所述LC1中的位置174处的氨基酸与所述LC2中的位置174处的氨基酸电荷相反，并且所述HC1和所述HC2中的位置168处的氨基酸分别与所述LC1和所述LC2中的位置174处的氨基酸电荷相反；并且
(d)所述组的改变，其中所述HC1和所述HC2中的位置181和所述LC1和所述LC2中的位置178或180各自由带电氨基酸占据，所述HC1中的位置181处的氨基酸与所述HC2中的位置181处的氨基酸电荷相反，所述LC1中的位置178或180处的氨基酸与所述LC2中的位置178或180处的氨基酸电荷相反，并且所述HC1和所述HC2中的位置181处的氨基酸分别与所述LC1和所述LC2中的位置178或180处的氨基酸电荷相反。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(a)所述组的改变，其中所述HC1包含44E/D，所述LC1包含100R/K，所述HC2包含44R/K，并且所述LC2包含100D/E；或者所述HC2包含44E/D，所述LC2包含100R/K，所述HC1包含44R/K，并且所述LC1包含100D/E；
(b)所述组的改变，其中所述HC1包含105E/D，所述LC1包含43R/K，所述HC2包含105R/K，并且所述LC2包含43D/E；或者所述HC2包含105E/D，所述LC2包含43R/K，所述HC1包含105R/K，并且所述LC1包含43D/E；
(c)所述组的改变，其中所述HC1包含147R/K，所述LC1包含131E/D，所述HC2包含147E/D，并且所述LC2包含131R/K；或者所述HC2包含147R/K，所述LC2包含131E/D，所述HC1包含147E/D，并且所述LC1包含131R/K；
(d)所述组的改变，其中所述HC1包含168E/D，所述LC1包含174R/K，所述HC2包含168R/K，并且所述LC2包含174D/E；或者所述HC2包含168E/D，所述LC2包含174R/K，所述HC1包含168R/K，并且所述LC1包含174D/E；并且
(e)所述组的改变，其中所述HC1包含181E/D，所述LC1包含178R/K或180R/K，所述HC2包含181R/K，并且所述LC2包含178D/E或180D/E；或者所述HC2包含181E/D，所述LC2包含178R/K或180R/K，所述HC1包含181R/K，并且所述LC1包含178D/E或180D/E。
37.根据权利要求36所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(a)所述组的改变，其中所述HC1包含44D和105R，所述LC1包含43D和100R，所述HC2包含44R和105D，并且所述LC2包含43R和100D；或者所述HC2包含44D和105R，所述LC2包含43D和100R，所述HC1包含44R和105D，并且所述LC1包含43R和100D；
(b)所述组的改变，其中所述HC1包含147R，所述LC1包含131D，所述HC2包含147D，并且所述LC2包含131R；或者所述HC2包含147R，所述LC2包含131D，所述HC1包含147D，并且所述LC1包含131R；
(c)所述组的改变，其中所述HC1包含168D，所述LC1包含174R，所述HC2包含168R，并且所述LC2包含174D；或者所述HC2包含168D，所述LC2包含174R，所述HC1包含168R，并且所述LC1包含174D；并且
(d)所述组的改变，其中所述HC1包含181D，所述LC1包含178R或180R，所述HC2包含181R，并且所述LC2包含178D或180D；或者所述HC2包含181D，所述LC2包含178R或180R，所述HC1包含181R，并且所述LC1包含178D或178D。
38.根据权利要求37所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(a)所述组的改变，其中所述HC1包含G44D和Q105R，所述LC1包含A/V43D和Q/G100R，所述HC2包含G44R和Q105D，并且所述LC2包含A/V43R和Q/G100D；或者所述HC2包含G44D和Q105R，所述LC2包含A/V43D和Q/G100R，所述HC1包含G44R和Q105D，并且所述LC1包含A/V43R和Q/G100D；
(b)所述组的改变，其中所述HC1包含K147R，所述LC1包含S131D，所述HC2包含K147D，并且所述LC2包含S131R；或者所述HC2包含K147R，所述LC2包含S131D，所述HC1包含K147D，并且所述LC1包含S131R；
(c)所述组的改变，其中所述HC1包含H168D，所述LC1包含S174R，所述HC2包含H168R，并且所述LC2包含S174D；或者所述HC2包含H168D，所述LC2包含S174R，所述HC1包含H168R，并且所述LC1包含S174D；并且
(d)所述组的改变，其中所述HC1包含S181D，所述LC1包含T/Y178R或T/S180R，所述HC2包含S181R，并且所述LC2包含T/Y178D或T/S180D；或者所述HC2包含S181D，所述LC2包含T/Y178R或T/S180R，所述HC1包含S181R，并且所述LC1包含T/Y178D或T/S180D。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的混合物，
其中所述第一和/或第二抗体在一对或多对位置处包含一对或多对半胱氨酸取代；
其中每对位置包括一个HC位置和一个LC位置；
其中所述对位置中的所述HC和LC位置分别选自由以下组成的组：126和121；126和124；127和121；128和118；133和117；133和209；134和116；141和116；168和174；170和162；170和176；173和160；173和162；以及183和176；并且
其中所述第一和第二抗体在所述相同对位置处不包含半胱氨酸取代。
40.根据权利要求39所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(1)分别在所述HC1和所述HC2中的位置170和183以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置170和183以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；
(2)分别在所述HC1和所述HC2中的位置173和170以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置160和162各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置173和170以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置160和162各自被半胱氨酸取代；
(3)分别在所述HC1和所述HC2中的位置173和183以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置160和176各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置173和183以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置160和176各自被半胱氨酸取代；
(4)在所述HC1和所述HC2中的位置170以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；或者所述HC2和所述HC1中的位置170以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；
(5)分别在所述HC1和所述HC2中的位置170和173以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置162和160各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置170和173以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置162和160各自被半胱氨酸取代；
(6)分别在所述HC1和所述HC2中的位置173和170以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置173和170以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置162和176各自被半胱氨酸取代；
(7)在所述HC1和所述HC2中的位置173以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置162和160各自被半胱氨酸取代；或者所述HC2和所述HC1中的位置173以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置162和160各自被半胱氨酸取代；
(8)分别在所述HC1和所述HC2中的位置183和173以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置176和160各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置183和173以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置176和160各自被半胱氨酸取代；
(9)分别在所述HC1和所述HC2中的位置170和173以及分别在所述LC1和所述LC2中的位置176和160各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置170和173以及分别在所述LC2和所述LC1中的位置176和160各自被半胱氨酸取代；
(10)分别在所述HC1和所述HC2中的位置170和183以及在所述LC1和所述LC2中的位置176各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置170和183以及在所述LC2和所述LC1中的位置176各自被半胱氨酸取代；并且
(11)分别在所述HC1和所述HC2中的位置173和170以及在所述LC1和所述LC2两者中的位置162各自被半胱氨酸取代；或者分别在所述HC2和所述HC1中的位置173和170以及在所述LC2和所述LC1两者中的位置162各自被半胱氨酸取代。
41.根据权利要求40所述的混合物，其中所述第一和第二抗体包含选自由以下组成的组的一组或多组改变：
(1)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含S183C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含S183C，并且所述LC1包含S176C；
(2)所述HC1包含V173C，所述LC1包含Q160C，所述HC2包含F170C，并且所述LC2包含S162C；或者所述HC2包含V173C，所述LC2包含Q160C，所述HC1包含F170C，并且所述LC1包含S162C；
(3)所述HC1包含V173C，所述LC1包含Q160C，所述HC2包含S183C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含V173C，所述LC2包含Q160C，所述HC1包含S183C，并且所述LC1包含S176C；
(4)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含F170C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含F170C，并且所述LC1包含S176C；
(5)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含V173C，并且所述LC2包含Q160C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含V173C，并且所述LC1包含Q160C；
(6)所述HC1包含V173C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含F170C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含V173C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含F170C，并且所述LC1包含S176C；
(7)所述HC1包含V173C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含V173C，并且所述LC2包含Q160C；或者所述HC2包含V173C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含V173C，并且所述LC1包含Q160C；
(8)所述HC1包含S183C，所述LC1包含S176C，所述HC2包含V173C，并且所述LC2包含Q160C；或者所述HC2包含S183C，所述LC2包含S176C，所述HC1包含V173C，并且所述LC1包含Q/E160C；
(9)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S176C，所述HC2包含V173C，并且所述LC2包含Q160C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S176C，所述HC1包含V173C，并且所述LC1包含Q160C；
(10)所述HC1包含F170C，所述LC1包含S176C，所述HC2包含S183C，并且所述LC2包含S176C；或者所述HC2包含F170C，所述LC2包含S176C，所述HC1包含S183C，并且所述LC1包含S176C；并且
(11)所述HC1包含V173C，所述LC1包含S162C，所述HC2包含F170C，并且所述LC2包含S162C；或者所述HC2包含V173C，所述LC2包含S162C，所述HC1包含F170C，并且所述LC1包含S162C。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的混合物，其中如果所述HC1和/或所述HC2是IgG4 HC，则所述IgG4 HC包含228P。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的混合物，其中所述第一和第二抗体的体内半衰期相差至少一周。
44.根据权利要求43所述的混合物，其中所述第一和第二抗体的体内半衰期相差至少十天。
45.根据权利要求44所述的混合物，其中所述第一和第二抗体的体内半衰期相差至少两周。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的混合物，其中所述具有较短体内半衰期的抗体包含以下改变中的至少一种：M252A、M252L、M252S、M252R、R255K或H435R。
47.根据权利要求1至14和33至46中任一项所述的混合物，其中
所述HC1包含分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的CDR1、CDR2和CDR3，所述LC1包含分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQID NO:27的CDR1、CDR2和CDR3，所述HC2包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的CDR1、CDR2和CDR3，并且所述LC2包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:34、SEQID NO:35和SEQ ID NO:36的CDR1、CDR2和CDR3。
48.根据权利要求1至46中任一项所述的混合物，其中
(a)所述第一和第二抗体中的一者与人CTLA4结合，并且另一者与人PD1结合，
(b)所述第一和第二抗体两者都与人HER2结合，但是它们不竞争与HER2结合，
(c)所述第一和第二抗体中的一者与人LAG3结合，并且另一者与人PD1结合，
(d)所述第一和第二抗体中的一者与人GITR结合，并且另一者与人PD1结合，
(d)所述第一和第二抗体中的一者与人VEGF结合，并且另一者与人PD1结合，
(f)所述第一和第二抗体中的一者与人CSFR1a结合，并且另一者与人PD1结合，
(g)所述第一和第二抗体中的一者与人OX40结合，并且另一者与人PD1结合，
(h)所述第一和第二抗体中的一者与人TIGIT结合，并且另一者与人PD1结合，
(i)所述第一和第二抗体中的一者与人CTLA4结合，并且另一者与人PDL1结合，
(j)所述第一和第二抗体中的一者与人VEGF结合，并且另一者与人PDL1结合，
(k)所述第一和第二抗体中的一者与人OX40结合，并且另一者与人PDL1结合，
(l)所述第一和第二抗体中的一者与人CSFR1a结合，并且另一者与人PDL1结合，
(m)所述第一和第二抗体中的一者与人TIGIT结合，并且另一者与人PDL1结合，
(n)所述第一和第二抗体中的一者与人Tim3结合，并且另一者与人PDL1结合，
(o)所述第一和第二抗体中的一者与人CTLA4结合，并且另一者与人VEGF结合，
(p)所述第一和第二抗体中的一者与人CTLA4结合，并且另一者与人41BB结合，
(q)所述第一和第二抗体中的一者与人CD20结合，并且另一者与人CD37结合，
(r)所述第一和第二抗体中的一者与人ANG2结合，并且另一者与人VEGF结合，
(s)所述第一和第二抗体中的一者与人TNF结合，并且另一者与人IL17a结合，
(t)所述第一和第二抗体中的一者与人CD38结合，并且另一者与人CD138结合，
(u)所述第一和第二抗体中的一者与人EGFR结合，并且另一者与人HER2结合，
(v)所述第一和第二抗体中的一者与人EGFR结合，并且另一者与人HER3结合，
(w)所述第一和第二抗体中的一者与人MET结合，并且另一者与人VEGF结合
(x)所述第一和第二抗体中的一者与人MET结合，并且另一者与人EGFR结合，
(y)所述第一和第二抗体中的一者与人TSLP结合，并且另一者与人IL33结合，
(z)所述第一和第二抗体中的一者与人IL4结合，并且另一者与人IL13结合，
(aa)所述第一和第二抗体中的一者与人PD1结合，并且另一者与人CD96结合，
(bb)所述第一和第二抗体中的一者与人PD1结合，并且另一者与人SIRP-α结合，或者
(cc)所述第一和第二抗体中的一者与人PD1结合，并且另一者与人CCR8结合。
49.一种包含灵长类或人源化IgG CH1结构域和灵长类或人源化CL结构域的抗体，
其中所述CH1和CL结构域包含氨基酸的电荷对，
其中所述电荷对中的一个氨基酸在所述CH1结构域中，而另一个氨基酸在所述CL结构域中，并且
其中
(1)所述CH1结构域是IgG1 CH1结构域，并且所述电荷对的所述氨基酸的所述HC和LC位置分别选自由以下组成的组：181和178；以及168和174；或者
(2)所述CH1结构域是IgG4 CH1结构域，并且所述电荷对的所述氨基酸的所述HC和LC位置分别选自由以下组成的组：181和180；以及168和174。
50.一种包含灵长类或人源化IgG1 CH1结构域和灵长类或人源化κCL结构域的抗体，
其中所述CH1和CL结构域包含一对接触半胱氨酸残基，
其中所述对中的一个半胱氨酸位于所述CH1结构域中，而另一个半胱氨酸位于所述CL结构域中，并且
其中所述半胱氨酸对的所述CH1和CL位置分别选自由以下组成的组：(1)168和174；(2)133和117；(3)173和160；(4)170和162；(5)170和176；(6)126和124；(7)128和118；以及(8)134和116。
51.根据权利要求50所述的抗体，其中所述抗体包含用其它氨基酸对所述CH1结构域中的位置220处和所述CL结构域中的位置214处的所述半胱氨酸的取代。
52.一种包含灵长类或人源化IgG4 CH1结构域和灵长类或人源化κCL结构域的抗体，
其中所述CH1和CL结构域包含一对接触半胱氨酸残基，
其中所述一对接触半胱氨酸残基中的一个在CH1残基处，而另一个在CL残基处，并且
其中所述一对接触半胱氨酸残基的所述CH1和CL残基分别选自由以下组成的组：(1)168和174；(2)173和162；(3)170和162；(4)126和124；(5)127和121；以及(6)128和118。
53.根据权利要求52所述的抗体，其中所述抗体包含用其它氨基酸对所述CH1结构域中的位置131处和所述CL结构域中的位置214处的所述半胱氨酸的取代。
54.一种包含灵长类或人源化IgG2 CH1结构域和灵长类或人源化CL结构域的抗体，
其中所述抗体包含用其它氨基酸对所述CH1结构域中的位置131处和所述CL结构域中的位置214处的所述半胱氨酸的取代，并且
其中所述CH1和CL结构域各自包含半胱氨酸取代，所述半胱氨酸取代产生一对接触半胱氨酸残基。
55.根据权利要求54所述的抗体，其中所述一对接触半胱氨酸残基分别选自所述CH1和CL结构域中由以下组成的位置的组：(1)位置173和162；以及(2)位置170和162。
56.根据权利要求54或55所述的抗体，其中所述CH1和CL结构域各自包含第二半胱氨酸取代，所述第二半胱氨酸取代产生不同的第二对接触半胱氨酸残基。
57.根据权利要求56所述的抗体，其中所述第二对接触半胱氨酸残基分别选自所述CH1和CL结构域中由以下组成的位置的组：(1)位置173和162；以及(2)位置170和162。
58.根据权利要求49至57中任一项所述的抗体，其中所述抗体是全长人或人源化IgG抗体。
59.一种制备根据权利要求1至48中任一项所述的抗体混合物的方法，其包括以下步骤：
(a)在培养基中培养表达所述抗体混合物的宿主细胞系，以及
(b)从所述细胞团或所述培养基中回收所述抗体混合物。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述宿主细胞系是哺乳动物细胞系。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述宿主细胞系是CHO细胞系。
62.根据权利要求59至61中任一项所述的方法，还包括从存在于所述细胞团或所述培养基中的其它组分中纯化所述抗体混合物的步骤。
63.一种宿主细胞系，其产生根据权利要求1至48中任一项所述的抗体混合物。
64.根据权利要求63所述的宿主细胞系，其是哺乳动物细胞系。
65.根据权利要求64所述的宿主细胞系，其是CHO细胞系。
66.一种或多种核酸，其编码根据权利要求1至58中任一项所述的抗体或抗体混合物。
67.一种或多种载体，其含有根据权利要求66所述的核酸。
68.根据权利要求67所述的载体，所述载体中的每一个是哺乳动物表达载体。
69.根据权利要求67所述的载体，所述载体中的每一个是病毒载体。
70.根据权利要求69所述的载体，所述载体中的每一个是腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、改良安卡拉痘苗病毒(MVA)载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体或痘病毒载体。
71.一种宿主细胞系，其含有根据权利要求66至70中任一项所述的核酸和/或载体。
72.一种治疗疾病的方法，其包括向患有所述疾病的患者施用根据权利要求1至48中任一项所述的抗体混合物，其中所述疾病是癌症、代谢疾病、传染病、或自身免疫疾病或炎性疾病。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述疾病是癌症。
74.一种治疗疾病的方法，其包括向患有所述疾病的患者施用根据权利要求49至58中任一项的抗体。
75.一种治疗癌症的方法，其包括向患者施用根据权利要求48(a)所述的抗体混合物。
76.一种治疗乳腺癌的方法，其包括向患者施用根据权利要求48(b)所述的抗体混合物。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述抗体混合物包含三种主要抗体种类。
78.一种治疗患有肿瘤的患者的方法，其包括将根据权利要求1至58中任一项所述的抗体或抗体混合物注射到所述肿瘤中。
79.一种治疗癌症患者的方法，其包括向所述患者施用根据权利要求66至70中任一项所述的核酸和/或载体。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述患者患有肿瘤并且将所述核酸和/或载体直接施用于所述肿瘤。
81.根据权利要求80所述的方法，其中将所述核酸和/或所述载体注射到所述肿瘤中。
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