JP2019520063A - 抗体の混合物 - Google Patents

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Abstract

本明細書では、任意選択で宿主細胞株により産生される抗体および抗体の混合物；抗体および抗体の混合物をコードする核酸；そのような核酸を含む宿主細胞；抗体、抗体の混合物、または抗体もしくは抗体の混合物をコードする核酸を使用する治療方法が記載されている。また、抗体の混合物を宿主細胞中で産生する方法が記載されている。一局面では、２つの主要抗体種を含む抗体の混合物が提供され、この抗体の混合物は、（ａ）第１の重鎖（ＨＣ１）および第１の軽鎖（ＬＣ１）を含む第１の抗体、ならびに（ｂ）第２の重鎖（ＨＣ２）および第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む第２の抗体を含み、上記第１の抗体および上記第２の抗体は、全長霊長類および／またはヒト化ＩｇＧ抗体である。

Description

本明細書に記載の組成物および方法は、組換え抗体およびそれらの産生方法の分野である。
組換えモノクローナル抗体は、過去２０年間、多種多様な疾患を治療するための非常に成功したクラスの生物学的薬物として台頭している。それらは、小分子に基づく薬物と同時投与してまたは同時投与せずに使用されている。一部の疾患は生物学的に複雑であるため、ある特定の状態の治療には、単一の抗体よりも、１つよりも多くの抗原またはエピトープを標的とする抗体混合物または二重特異性抗体が有効であり得る。例えば、Ｌｉｎｄｚｅｎら、（２０１０年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．１０７巻（２８号）：１２５５０〜１２５６３頁；ＮａｇｏｒｓｅｎおよびＢａｅｕｅｒｌｅ（２０１１年）、Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．３１７巻（９号）：１２５５〜６０頁を参照。
抗体混合物は、２つの異なる結合実体の投薬に柔軟性を与えることが可能である。ＩｇＧ二重特異性抗体の場合、結合実体は同じ分子の一部であり、したがって、２つの結合実体の各々が同じ量で存在するため、こうした柔軟性は当てはまらない。これは、治療レジメンにおいて各結合実体の用量が異なることが望ましい場合、最適ではない可能性がある。例えば、Ｗｏｌｃｈｏｋら（２０１３年）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．３６９巻（２号）：１２２〜１３３頁を参照。同様に、二重特異性抗体中の結合実体は両方とも、同じｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有することになり、一部の状況では最適ではない可能性がある。２つまたはそれよりも多くの個々の抗体の混合物を含む療法薬は、投与される２つの異なる結合実体を含む抗体の異なる用量を可能にすることができ、抗体は、異なる薬物動態学的特性を有することができる。
組換え抗体混合物の製造は、個々の宿主細胞株で各抗体を別々に産生し、産生後に複数の抗体を混合することにより達成することができる。異なる抗体を発現する宿主細胞を混合し共培養することによる複数の抗体の単一バッチ産生は、この手法に対するより安価な代替手法を提供する。Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら（２０１２年）、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．５２６巻：１３９〜４５頁。単一のプロセスを使用して、２つまたはそれよりも多くの抗体を産生するための他の単純で比較的安価な産生プロセスが必要とされている。
Ｌｉｎｄｚｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０１０年）１０７巻（２８号）：１２５５０〜１２５６３頁 ＮａｇｏｒｓｅｎおよびＢａｅｕｅｒｌｅ、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．（２０１１年）３１７巻（９号）：１２５５〜６０頁
本明細書で示されている組成物および方法は、下記のナンバリングされている一連の項目に記載されている。
１．２つの主要抗体種を含む抗体の混合物であって、
（ａ）同じアミノ酸配列を有する第１の重鎖（ＨＣ１）の２つのコピーおよび同じアミノ酸配列を有する第１の軽鎖（ＬＣ１）の２つのコピーを含む第１の抗体、ならびに
（ｂ）同じアミノ酸配列を有する第２の重鎖（ＨＣ２）の２つのコピーおよび同じアミノ酸配列を有する第２の軽鎖（ＬＣ２）の２つのコピーを含む第２の抗体を含み、
第１および第２の抗体が、全長霊長類ＩｇＧ抗体であり、
ＨＣ１およびＨＣ２が、異なるアミノ酸配列を有し、
ＬＣ１およびＬＣ２が、異なるアミノ酸配列を有し、
混合物が、３つ以下の異なる主要種の全長抗体を含み、
混合物が、ＨＣ１、ＨＣ２、ＬＣ１、およびＬＣ２をコードするＤＮＡが導入されている単一の宿主細胞株により産生された、混合物。
２．ＨＣ１およびＨＣ２が、ヒトＩｇＧ ＨＣであり、各々が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のアイソタイプのいずれか１つのものである、項目１に記載の混合物。
３．ＨＣ１および／またはＨＣ２が、少なくとも１つのＬＣパートナー指向性変更を含み、
ＬＣ１および／またはＬＣ２が、それぞれＨＣ１および／もしくはＨＣ２において、ＬＣパートナー指向性変更が行われているアミノ酸と接触するか、またはそれぞれＨＣ１および／もしくはＨＣ２に存在する荷電アミノ酸もしくはシステインと接触するアミノ酸に少なくとも１つのＨＣパートナー指向性変更を含む、項目１または２に記載の混合物。
４．ＨＣ１および／またはＨＣ２が、重鎖（ＨＣ）残基に少なくとも１つのＬＣパートナー指向性変更を含み、ＬＣパートナー指向性変更は、ＨＣ１およびＨＣ２が、ＨＣ１およびＨＣ２アミノ酸配列の両方の同じＨＣ残基に荷電アミノ酸を含むことを引き起こし、ＨＣ１のＨＣ残基の荷電アミノ酸は、ＨＣ２のＨＣ残基の荷電アミノ酸と電荷が逆であり、
ＬＣ１および／またはＬＣ２が、ＨＣ残基と接触する軽鎖（ＬＣ）残基に少なくとも１つのＨＣパートナー指向性変更を含み、ＨＣパートナー指向性変更は、ＬＣ１およびＬＣ２が、ＬＣ１およびＬＣ２アミノ酸配列の両方の同じＬＣ残基に荷電アミノ酸を含むことを引き起こし、ＬＣ１のＬＣ残基の荷電アミノ酸は、ＬＣ２のＬＣ残基の荷電アミノ酸と電荷が逆であり、ＬＣ１のＬＣ残基の荷電アミノ酸は、ＨＣ１のＨＣ残基のアミノ酸と電荷が逆である、項目３に記載の混合物。
５．第１および第２の抗体が、
（ａ）ＨＣ１およびＨＣ２の両方の４４および１０５位ならびにＬＣ１およびＬＣ２の両方の４３および１００位は各々、荷電アミノ酸により占められており、ＨＣ１の４４および１０５位のアミノ酸は各々、ＨＣ２の同じ部位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＬＣ１の４３および１００位のアミノ酸は各々、ＬＣ２の同じ部位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＨＣ１およびＨＣ２の４４位のアミノ酸は、それぞれＬＣ１およびＬＣ２の１００位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＨＣ１およびＨＣ２の１０５位のアミノ酸は、それぞれＬＣ１およびＬＣ２の４３位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット；
（ｂ）ＨＣ１およびＨＣ２の１４７位ならびにＬＣ１およびＬＣ２の１３１位は各々、荷電アミノ酸により占められており、ＨＣ１の１４７位のアミノ酸は、ＨＣ２の１４７位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＬＣ１の１３１位のアミノ酸は、ＬＣ２の１３１位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＨＣ１およびＨＣ２の１４７位のアミノ酸は、それぞれＬＣ１およびＬＣ２の１３１位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット；
（ｃ）ＨＣ１およびＨＣ２の１６８位ならびにＬＣ１およびＬＣ２の１７４位は各々、荷電アミノ酸により占められており、ＨＣ１の１６８位のアミノ酸は、ＨＣ２の１６８位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＬＣ１の１７４位のアミノ酸は、ＬＣ２の１７４位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＨＣ１およびＨＣ２の１６８位のアミノ酸は、それぞれＬＣ１およびＬＣ２の１７４位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット；ならびに
（ｄ）ＨＣ１およびＨＣ２の１８１位ならびにＬＣ１およびＬＣ２の１７８位は各々、荷電アミノ酸により占められており、ＨＣ１の１８１位のアミノ酸は、ＨＣ２の１８１位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＬＣ１の１７８位のアミノ酸は、ＬＣ２の１７８位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＨＣ１およびＨＣ２の１８１位のアミノ酸は、それぞれＬＣ１およびＬＣ２の１７８位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目３または４に記載の混合物。
６．第１および第２の抗体が、
（ａ）ＨＣ１は４４Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ１は１００Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ２は４４Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ２は１００Ｄ／Ｅを含むか、またはＨＣ２は４４Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ２は１００Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ１は４４Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ１は１００Ｄ／Ｅを含む変更のセット；
（ｂ）ＨＣ１は１０５Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ１は４３Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ２は１０５Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ２は４３Ｄ／Ｅを含むか、またはＨＣ２は１０５Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ２は４３Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ１は１０５Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ１は４３Ｄ／Ｅを含む変更のセット；
（ｃ）ＨＣ１は１４７Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ１は１３１Ｅ／Ｄを含み、ＨＣ２は１４７Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ２は１３１Ｒ／Ｋを含むか、またはＨＣ２は１４７Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ２は１３１Ｅ／Ｄを含み、ＨＣ１は１４７Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ１は１３１Ｒ／Ｋを含む変更のセット；
（ｄ）ＨＣ１は１６８Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ１は１７４Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ２は１６８Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ２は１７４Ｄ／Ｅを含むか、またはＨＣ２は１６８Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ２は１７４Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ１は１６８Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ１は１７４Ｄ／Ｅを含む変更のセット；および
（ｅ）ＨＣ１は１８１Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ１は１７８Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ２は１８１Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ２は１７８Ｄ／Ｅを含むか、またはＨＣ２は１８１Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ２は１７８Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ１は１８１Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ１は１７８Ｄ／Ｅを含む変更のセット
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目１から５のいずれか一項に記載の混合物。
７．第１および第２の抗体が、
（ａ）ＨＣ１は４４Ｄおよび１０５Ｒを含み、ＬＣ１は４３Ｄおよび１００Ｒを含み、ＨＣ２は４４Ｒおよび１０５Ｄを含み、ＬＣ２は４３Ｒおよび１００Ｄを含むか、またはＨＣ２は４４Ｄおよび１０５Ｒを含み、ＬＣ２は４３Ｄおよび１００Ｒを含み、ＨＣ１は４４Ｒおよび１０５Ｄを含み、ＬＣ１は４３Ｒおよび１００Ｄを含む変更のセット；
（ｂ）ＨＣ１は１４７Ｒを含み、ＬＣ１は１３１Ｄを含み、ＨＣ２は１４７Ｄを含み、ＬＣ２は１３１Ｒを含むか、またはＨＣ２は１４７Ｒを含み、ＬＣ２は１３１Ｄを含み、ＨＣ１は１４７Ｄを含み、ＬＣ１は１３１Ｒを含む変更のセット；
（ｃ）ＨＣ１は１６８Ｄを含み、ＬＣ１は１７４Ｒを含み、ＨＣ２は１６８Ｒを含み、ＬＣ２は１７４Ｄを含むか、またはＨＣ２は１６８Ｄを含み、ＬＣ２は１７４Ｒを含み、ＨＣ１は１６８Ｒを含み、ＬＣ１は１７４Ｄを含む変更のセット；ならびに
（ｄ）ＨＣ１は１８１Ｄを含み、ＬＣ１は１７８Ｒを含み、ＨＣ２は１８１Ｒを含み、ＬＣ２は１７８Ｄを含むか、またはＨＣ２は１８１Ｄを含み、ＬＣ２は１７８Ｒを含み、ＨＣ１は１８１Ｒを含み、ＬＣ１は１７８Ｄを含む変更のセット
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目６に記載の混合物。
８．第１および第２の抗体が、
（ａ）ＨＣ１はＧ４４ＤおよびＱ１０５Ｒを含み、ＬＣ１はＡ／Ｖ４３ＤおよびＱ／Ｇ１００Ｒを含み、ＨＣ２はＧ４４ＲおよびＱ１０５Ｄを含み、ＬＣ２はＡ／Ｖ４３ＲおよびＱ／Ｇ１００Ｄを含むか、またはＨＣ２はＧ４４ＤおよびＱ１０５Ｒを含み、ＬＣ２はＡ／Ｖ４３ＤおよびＱ／Ｇ１００Ｒを含み、ＨＣ１はＧ４４ＲおよびＱ１０５Ｄを含み、ＬＣ１はＡ／Ｖ４３ＲおよびＱ／Ｇ１００Ｄを含む変更のセット；
（ｂ）ＨＣ１はＫ１４７Ｒを含み、ＬＣ１はＳ１３１Ｄを含み、ＨＣ２はＫ１４７Ｄを含み、ＬＣ２はＳ１３１Ｒを含むか、またはＨＣ２はＫ１４７Ｒを含み、ＬＣ２はＳ１３１Ｄを含み、ＨＣ１はＫ１４７Ｄを含み、ＬＣ１はＳ１３１Ｒを含む変更のセット；
（ｃ）ＨＣ１はＨ１６８Ｄを含み、ＬＣ１はＳ１７４Ｒを含み、ＨＣ２はＨ１６８Ｒを含み、ＬＣ２はＳ１７４Ｄを含むか、またはＨＣ２はＨ１６８Ｄを含み、ＬＣ２はＳ１７４Ｒを含み、ＨＣ１はＨ１６８Ｒを含み、ＬＣ１はＳ１７４Ｄを含む変更のセット；ならびに
（ｄ）ＨＣ１はＳ１８１Ｄを含み、ＬＣ１はＴ１７８Ｒを含み、ＨＣ２はＳ１８１Ｒを含み、ＬＣ２はＴ１７８Ｄを含むか、またはＨＣ２はＳ１８１Ｄを含み、ＬＣ２はＴ１７８Ｒを含み、ＨＣ１はＳ１８１Ｒを含み、ＬＣ１はＴ１７８Ｄを含む変更のセット
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目７に記載の混合物。
９．第１および／または第２の抗体が、
ＨＣ１の１２６ＣおよびＬＣ１の１２１ＣまたはＨＣ２の１２６ＣおよびＬＣ２の１２１Ｃ；
ＨＣ１の１２６ＣおよびＬＣ１の１２４ＣまたはＨＣ２の１２６ＣおよびＬＣ２の１２４Ｃ；
ＨＣ１の１２７ＣおよびＬＣ１の１２１ＣまたはＨＣ２の１２７ＣおよびＬＣ２の１２１Ｃ；
ＨＣ１の１２８ＣおよびＬＣ１の１１８ＣまたはＨＣ２の１２８ＣおよびＬＣ２の１１８Ｃ；
ＨＣ１の１３３ＣおよびＬＣ１の１１７ＣまたはＨＣ２の１３３ＣおよびＬＣ２の１１７Ｃ；
ＨＣ１の１３３ＣおよびＬＣ１の２０９ＣまたはＨＣ２の１３３ＣおよびＬＣ２の２０９Ｃ；
ＨＣ１の１３４ＣおよびＬＣ１の１１６ＣまたはＨＣ２の１３４ＣおよびＬＣ２の１１６Ｃ；
ＨＣ１の１４１ＣおよびＬＣ１の１１６ＣまたはＨＣ２の１４１ＣおよびＬＣ２の１１６Ｃ；
ＨＣ１の１６８ＣおよびＬＣ１の１７４ＣまたはＨＣ２の１６８ＣおよびＬＣ２の１７４Ｃ；
ＨＣ１の１７０ＣおよびＬＣ１の１６２ＣまたはＨＣ２の１７０ＣおよびＬＣ２の１６２Ｃ；
ＨＣ１の１７０ＣおよびＬＣ１の１７６ＣまたはＨＣ２の１７０ＣおよびＬＣ２の１７６Ｃ；
ＨＣ１の１７３ＣおよびＬＣ１の１６０ＣまたはＨＣ２の１７３ＣおよびＬＣ２の１６０Ｃ；
ＨＣ１の１７３ＣおよびＬＣ１の１６２ＣまたはＨＣ２の１７３ＣおよびＬＣ２の１６２Ｃ；ならびに
ＨＣ１の１８３ＣおよびＬＣ１の１７６ＣまたはＨＣ２の１８３ＣおよびＬＣ２の１７６Ｃ
からなる群より選択される変更の対の１つまたは複数を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の混合物。
１０．第１および第２の抗体が、
（１）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７０および１８３位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１６２および１７６位が各々システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７０および１８３位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１６２および１７６位が各々システインにより置換されていること；
（２）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７３および１７０位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１６０および１６２位が各々システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７３および１７０位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１６０および１６２位が各々システインにより置換されていること；
（３）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７３および１８３位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１６０および１７６位が各々システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７３および１８３位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１６０および１７６位が各々システインにより置換されていること；
（４）ＨＣ１およびＨＣ２の１７０位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１６２および１７６位が各々システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１の１７０位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１６２および１７６位が各々システインにより置換されていること；
（５）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７０および１７３位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１６２および１６０位が各々システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７０および１７３位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１６２および１６０位が各々システインにより置換されていること；
（６）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７３および１７０位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１６２および１７６位が各々システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７３および１７０位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１６２および１７６位が各々システインにより置換されていること；
（７）ＨＣ１およびＨＣ２の１７３位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１６２および１６０位が各々システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１の１７３位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１６２および１６０位が各々システインにより置換されていること；
（８）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１８３および１７３位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１７６および１６０位が各々システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１８３および１７３位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１７６および１６０位が各々システインにより置換されていること；
（９）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７０および１７３位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１７６および１６０位が各々システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７０および１７３位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１７６および１６０位が各々システインにより置換されていること；ならびに
（１０）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７０および１８３位ならびにＬＣ１およびＬＣ２の１７６位が各々システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７０および１８３位ならびにＬＣ２およびＬＣ１の１７６位が各々システインにより置換されていること
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目１から９のいずれか一項に記載の混合物。
１１．第１および第２の抗体が、
（１）ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、またはＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
（２）ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含み、ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含むか、またはＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含み、ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含むこと；
（３）ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含み、ＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、またはＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含み、ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
（４）ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、またはＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
（５）ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、またはＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含むこと；
（６）ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、またはＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
（７）ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、またはＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含むこと；
（８）ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含み、ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、またはＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含み、ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含むこと；
（９）ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含み、ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、またはＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含み、ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含むこと；および
（１０）ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含み、ＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、またはＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含み、ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の混合物。
１２．３つの主要抗体種を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の混合物。
１３．２つ以下の主要抗体種を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の混合物。
１４．ＨＣ１および／またはＨＣ２が、ヘテロダイマーに不利な１つまたは複数の変更を含む、項目１３に記載の混合物。
１５．（ａ）（１）ＨＣ１はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ２はＩｇＧ４ ＨＣであり、ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか、もしくは（２）ＨＣ２はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ１はＩｇＧ４ ＨＣであり、ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか；
（ｂ）（１）ＨＣ１およびＨＣ２はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、ＨＣ２は変更Ｋ４０９Ｒを含むか、もしくは（２）ＨＣ１およびＨＣ２はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、ＨＣ１は変更Ｋ４０９Ｒを含むか；
（ｃ）（１）ＨＣ１はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ２はＩｇＧ４ ＨＣであり、ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９０および４００位に含むか、もしくは（２）ＨＣ１はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ２はＩｇＧ４ ＨＣであり、ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９０および４００位に含むか；
（ｄ）（１）ＨＣ１およびＨＣ２はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９０および４００位に含むか、もしくは（２）ＨＣ１およびＨＣ２はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９０および４００位に含むか；
（ｅ）（１）ＨＣ１はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ２はＩｇＧ４ ＨＣであり、ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を３６４および３７０位に含み、ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか、もしくは（２）ＨＣ２はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ１はＩｇＧ４ ＨＣであり、ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を３６４および３７０位に含み、ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか；または
（ｆ）（１）ＨＣ１およびＨＣ２はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を３６４および３７０位に含み、ＨＣ２は変更Ｋ４０９Ｒを含むか、もしくは（２）ＨＣ１およびＨＣ２はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を３６４および３７０位に含み、ＨＣ１は変更Ｋ４０９Ｒを含む、項目１４に記載の混合物。
１６．（ａ）（１）ＨＣ１は、ＩｇＧ１ ＨＣであり、変更Ｄ３９９Ｒ／ＫおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含み、ＨＣ２は、ＩｇＧ４ ＨＣであり、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか、もしくは（２）ＨＣ２は、ＩｇＧ１ ＨＣであり、変更Ｄ３９９Ｒ／ＫおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含み、ＨＣ１は、ＩｇＧ４ ＨＣであり、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか；
（ｂ）ＨＣ１およびＨＣ２は、ＩｇＧ１ ＨＣであり、それらの一方は変更Ｄ３９９Ｒ／ＫおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含み、他方は変更Ｋ４０９Ｒを含むか；
（ｃ）（１）ＨＣ１は、変更Ｎ３９０Ｒ／ＫおよびＳ４００Ｄ／Ｅもしくは変更Ｎ３９０Ｄ／ＥおよびＳ４００Ｒ／Ｋを含むＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ２は、ＩｇＧ４ ＨＣであるか、もしくは（２）ＨＣ１はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ２は、変更Ｎ３９０Ｒ／ＫおよびＳ４００Ｄ／Ｅもしくは変更Ｎ３９０Ｄ／ＥおよびＳ４００Ｒ／Ｋを含むＩｇＧ４ ＨＣであるか；
（ｄ）（１）ＨＣ１およびＨＣ２はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ１は、変更Ｎ３９０Ｒ／ＫおよびＳ４００Ｄ／Ｅもしくは変更Ｎ３９０Ｄ／ＥおよびＳ４００Ｒ／Ｋを含むか、もしくは（２）ＨＣ１およびＨＣ２はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ２は、変更Ｎ３９０Ｒ／ＫおよびＳ４００Ｄ／Ｅもしくは変更Ｎ３９０Ｄ／ＥおよびＳ４００Ｒ／Ｋを含むか；
（ｅ）（１）ＨＣ１はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ２はＩｇＧ４ ＨＣであり、ＨＣ１は、変更Ｓ３６４Ｋ／ＲおよびＫ３７０Ｄ／Ｅを含み、ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか、もしくは（２）ＨＣ２はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ１はＩｇＧ４ ＨＣであり、ＨＣ２は、変更Ｓ３６４Ｋ／ＲおよびＫ３７０Ｄ／Ｅを含み、ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか；または
（ｆ）（１）ＨＣ１およびＨＣ２はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ１は、変更Ｓ３６４Ｋ／ＲおよびＫ３７０Ｄ／Ｅ含み、ＨＣ２は変更Ｋ４０９Ｒを含むか、もしくは（２）ＨＣ１およびＨＣ２はＩｇＧ１ ＨＣであり、ＨＣ２は、変更Ｓ３６４Ｋ／ＲおよびＫ３７０Ｄ／Ｅを含み、ＨＣ１は変更Ｋ４０９Ｒを含む、項目１５に記載の混合物。
１７．ＨＣ１および／またはＨＣ２がＩｇＧ４ ＨＣである場合、ＩｇＧ４ ＨＣが、変更Ｓ２２８Ｐを含む、項目１から１６のいずれか一項に記載の混合物。
１８．第１および第２の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、少なくとも１週間異なる、項目１から１７のいずれか一項に記載の混合物。
１９．第１および第２の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、少なくとも１０日間異なる、項目１８に記載の混合物。
２０．第１および第２の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、少なくとも２週間異なる、項目１９に記載の混合物。
２１．より短いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有する抗体が、変更Ｍ２５２Ａ、Ｍ２５２Ｌ、Ｍ２５２Ｓ、Ｍ２５２Ｒ、Ｒ２５５Ｋ、またはＨ４３５Ｒを含む、項目１８から２０のいずれか一項に記載の混合物。
２２．ＨＣ１が、それぞれ、アミノ酸配列である配列番号２８、２９、および３０を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ＬＣ１が、それぞれ、アミノ酸配列である配列番号２５、２６、および２７を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ＨＣ２が、アミノ酸配列である配列番号３１、３２、および３３を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ＬＣ２が、アミノ酸配列である配列番号３４、３５、および３６を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、項目１から２１のいずれか一項に記載の混合物。
２３．ＨＣ１が、変更４４Ｄおよび１０５Ｒを含む配列番号２０のアミノ酸１〜１２０のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、ＬＣ１が、変更４３Ｄおよび１００Ｒを含む配列番号１９のアミノ酸１〜１０７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＨＣ２が、変更４４Ｒおよび１０５Ｄを含む配列番号２１のアミノ酸１〜１１９のアミノ酸配列を有するＶＨを含み、ＬＣ２が、変更４３Ｒおよび１００Ｄを含む配列番号２２のアミノ酸１〜１０７のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、項目２２に記載の混合物。
２４．（ａ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｂ）第１および第２の抗体は両方ともヒトＨＥＲ２に結合するが、ＨＥＲ２との結合について競合しないか、
（ｃ）第１および第２の抗体の一方はヒトＬＡＧ３に結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｄ）第１および第２の抗体の一方はヒトＧＩＴＲに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｄ）第１および第２の抗体の一方はヒトＶＥＧＦに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｆ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＳＦＲ１ａに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｇ）第１および第２の抗体の一方はヒトＯＸ４０に結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｈ）第１および第２の抗体の一方はヒトＴＩＧＩＴに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｉ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｊ）第１および第２の抗体の一方はヒトＶＥＧＦに結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｋ）第１および第２の抗体の一方はヒトＯＸ４０に結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｌ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＳＦＲ１ａに結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｍ）第１および第２の抗体の一方はヒトＴＩＧＩＴに結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｎ）第１および第２の抗体の一方はヒトＴｉｍ３に結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｏ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒトＶＥＧＦに結合するか、
（ｐ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒト４１ＢＢに結合するか、
（ｑ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＤ２０に結合し、他方はヒトＣＤ３７に結合するか、
（ｒ）第１および第２の抗体の一方はヒトＡＮＧ２に結合し、他方はヒトＶＥＧＦに結合するか、
（ｓ）第１および第２の抗体の一方はヒトＴＮＦに結合し、他方はヒトＩＬ１７ａに結合するか、
（ｔ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＤ３８に結合し、他方はヒトＣＤ１３８に結合するか、
（ｕ）第１および第２の抗体の一方はヒトＥＧＦＲに結合し、他方はヒトＨＥＲ２に結合するか、
（ｖ）第１および第２の抗体の一方はヒトＥＧＦＲに結合し、他方はヒトＨＥＲ３に結合するか、
（ｗ）第１および第２の抗体の一方はヒトＭＥＴに結合し、他方はヒトＶＥＧＦに結合するか、
（ｘ）第１および第２の抗体の一方はヒトＭＥＴに結合し、他方はヒトＥＧＦＲに結合するか、
（ｙ）第１および第２の抗体の一方はヒトＴＳＬＰに結合し、他方はヒトＩＬ３３に結合するか、または
（ｚ）第１および第２の抗体の一方はヒトＩＬ４に結合し、他方はヒトＩＬ１３に結合するか、または
（ａａ）第１および第２の抗体の一方はヒトＰＤ１に結合し、他方はヒトＣＤ９６に結合する、項目１から２３のいずれか一項に記載の混合物。
２５．同じアミノ酸配列を有する２つの霊長類および／またはヒト化ＬＣならびに同じアミノ酸配列を有する２つの霊長類および／またはヒト化ＩｇＧ ＨＣを含む全長抗体であって、
ＨＣが各々、１８１位に荷電アミノ酸を含み、
ＬＣが各々、１７８位に荷電アミノ酸を含み、
ＨＣ１８１位のアミノ酸の電荷が、ＬＣ１７８位のアミノ酸の電荷と逆である全長抗体。
２６．項目１から２４のいずれか一項に記載の抗体の混合物を作製する方法であって、
（ａ）抗体種を発現する宿主細胞株を培養培地中で培養するステップ、および
（ｂ）抗体種を含む混合物を培養培地から回収するステップ
を含む、方法。
２７．宿主細胞株が、哺乳動物細胞株である、項目２６に記載の方法。
２８．宿主細胞株が、ＣＨＯ細胞株である、項目２７に記載の方法。
２９．混合物を、培養培地に存在する他の成分から精製するステップをさらに含む、項目２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
３０．項目１から２４のいずれか一項に記載の抗体の混合物を産生する宿主細胞株。
３１．哺乳動物細胞株である、項目３０に記載の宿主細胞株。
３２．ＣＨＯ細胞株である、項目３１に記載の宿主細胞。
３３．項目１から２５のいずれか一項に記載の抗体または抗体の混合物をコードする核酸または核酸の混合物。
３４．項目３３に記載の核酸または核酸の混合物を含む１つまたは複数のベクター。
３５．各々が哺乳動物発現ベクターである、項目３４に記載のベクター。
３６．各々がウイルスベクターである、項目３４に記載のベクター。
３７．各々が、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、項目３６に記載のベクター。
３８．疾患を治療する方法であって、項目１から２４のいずれか一項に記載の混合物を患者に投与することを含む、方法。
３９．がんを治療する方法であって、項目２４（ａ）に記載の混合物を患者に投与することを含む、方法。
４０．乳がんを治療する方法であって、項目２４（ｂ）に記載の混合物を患者に投与することを含む、方法。
４１．混合物が、３つの主要抗体種を含む、項目４０に記載の方法。
４２．混合物が、最大で３つの主要抗体種を含む、項目４１に記載の方法。
４３．腫瘍を有する患者を治療する方法であって、項目１から２４のいずれか一項に記載の混合物を腫瘍に注射することを含む、方法。
４４．腫瘍を有する患者を治療する方法であって、項目３３の核酸または項目３４から３７のいずれか一項に記載のベクターを、腫瘍に直接投与することを含む、方法。
４５．核酸またはベクターが、腫瘍に注射される、項目４４に記載の方法。
４６．２つの主要抗体種を含む抗体の混合物であって、
（ａ）第１の重鎖（ＨＣ１）および第１の軽鎖（ＬＣ１）を含む第１の抗体、ならびに
（ｂ）第２の重鎖（ＨＣ２）および第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む第２の抗体を含み、
第１および第２の抗体は、全長霊長類および／またはヒト化ＩｇＧ抗体であり、
第１の抗体が、同じ第１のアミノ酸配列を有するＨＣ１の２つの鎖、および同じ第２のアミノ配列を有するＬＣ１の２つの鎖を含み、
第２の抗体が、同じ第３のアミノ酸配列を有するＨＣ２の２つの鎖、および同じ第４のアミノ配列を有するＬＣ２の２つの鎖を含み、
ＨＣ１およびＨＣ２が、異なるアミノ酸配列を有し、
ＬＣ１およびＬＣ２が、異なるアミノ酸配列を有し、
混合物が、１０個以下の異なる主要種の全長ＩｇＧ抗体を含み、
混合物が、ＨＣ１、ＨＣ２、ＬＣ１、およびＬＣ２をコードするＤＮＡが導入されている宿主細胞株により産生された、混合物。
４７．３つ以下の異なる主要種の全長抗体を含む、項目４６に記載の混合物。
４８．ＨＣ１、ＨＣ２、ＬＣ１、およびＬＣ２をコードするＤＮＡが、同時に導入された、項目４７に記載の混合物。
４９．ＨＣ１およびＬＣ１をコードするＤＮＡが、ＨＣ２およびＬＣ２をコードするＤＮＡの前に導入されたか、または
ＨＣ２およびＬＣ２をコードするＤＮＡが、ＨＣ１およびＬＣ１をコードするＤＮＡの前に導入された、項目４７に記載の混合物。
５０．ＨＣ１およびＨＣ２が、ヒトおよび／またはヒト化ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）であり、ＬＣ１およびＬＣ２が、ヒトおよび／またはヒト化軽鎖（ＬＣ）である、項目４６から４９のいずれか一項に記載の混合物。
５１．（ａ）第１および第２の抗体が両方とも、１つまたは複数のパートナー指向性変更を含むか、
（ｂ）第１および第２の抗体が両方とも、１つまたは複数のパートナー指向性変更を含み、第１および第２の抗体のうちの少なくとも１つが、ヘテロダイマーに不利な少なくとも１つの変更を含むか、あるいは
（ｃ）第１の抗体が、１つもしくは複数のパートナー指向性変更を含み、第２の抗体はそれを含まないか、または第２の抗体が、１つもしくは複数のパートナー指向性変更を含み、第１の抗体はそれを含まないかのいずれかである、項目４６から５０のいずれか一項に記載の混合物。
５２．第１の抗体が、ヘテロダイマーに不利な１つもしくは複数の変更を含み、第２の抗体はそれを含まないか、または第２の抗体が、ヘテロダイマーに不利な１つもしくは複数の変更を含み、第１の抗体はそれを含まないかのいずれかである、項目５１（ｃ）に記載の混合物。
５３．（１）第１の抗体が、１つもしくは複数のパートナー指向性変更およびヘテロダイマーに不利な１つもしくは複数の変更を含み、第２の抗体が、パートナー指向性変更もヘテロダイマーに不利な変更も含まないか、または
（２）第２の抗体が、１つもしくは複数のパートナー指向性変更およびヘテロダイマーに不利な１つもしくは複数の変更を含み、第１の抗体が、パートナー指向性変更もヘテロダイマーに不利な変更も含まない、項目５２に記載の混合物。
５４．３つの主要抗体種を含む、項目４６から５１のいずれか一項に記載の混合物。
５５．２つ以下の主要抗体種を含む、項目４６から５１のいずれか一項に記載の混合物。
５６．ＨＣ１および／またはＨＣ２が、ヘテロダイマーに不利な１つまたは複数の変更を含む、項目５５に記載の混合物。
５７．（ａ）（１）ＨＣ１はＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２重鎖（ＨＣ）であり、ＨＣ２はＩｇＧ４ ＨＣであり、ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか、または（２）ＨＣ２はＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、ＨＣ１はＩｇＧ４ ＨＣであり、ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか；あるいは
（ｂ）（１）ＨＣ１およびＨＣ２は各々、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、ＨＣ２は変更Ｋ４０９Ｒを含むか、または（２）ＨＣ１およびＨＣ２は各々、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、ＨＣ１は変更Ｋ４０９Ｒを含む、項目４６から５６のいずれか一項に記載の混合物。
５８．（ａ）（１）ＨＣ１は、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、変更Ｄ３９９Ｒ／ＫおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含み、ＨＣ２は、ＩｇＧ４ ＨＣであり、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか、または（２）ＨＣ２は、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、変更Ｄ３９９Ｒ／ＫおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含み、ＨＣ１は、ＩｇＧ４ ＨＣであり、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか；あるいは
（ｂ）ＨＣ１およびＨＣ２は各々、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ ＨＣであり、それらの一方は変更Ｄ３９９Ｒ／ＫおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含み、他方は変更Ｋ４０９Ｒを含む、項目５７に記載の混合物。
５９．第１の抗体が、ヘテロダイマーに不利な少なくとも１つの変更を含み、第２の抗体が、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか、または第２の抗体が、ヘテロダイマーに不利な少なくとも１つの変更を含み、第１の抗体が、ヘテロダイマーに不利な変更を含まない、項目４６から５１および５４から５６のいずれか一項に記載の混合物。
６０．（ａ）第１の抗体が、少なくとも１つのパートナー指向性変更を含み、第２の抗体はそれを含まず、
（ｂ）（１）第１の抗体が、ヒトおよび／もしくはヒト化ＩｇＧ１抗体であり、ＨＣ１の２２０位のシステインが別のアミノ酸により置換されており、ＬＣ１の２１４位のシステインが別のアミノ酸により置換されているか、または（２）第１の抗体が、ヒトおよび／もしくはヒト化ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４抗体であり、ＨＣ１の１３１位のシステインが別のアミノ酸により置換されており、ＬＣ１の２１４位のシステインが別のアミノ酸により置換されている、項目４６から５９のいずれか一項に記載の混合物。
６１．第１の抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、ＨＣ１に変更Ｃ２２０Ｇ／ＡおよびＬＣ１にＣ２１４Ｓ／Ａ／Ｇを含むか、または
第１の抗体が、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４抗体であり、ＨＣ１に変更Ｃ１３１Ｓ／Ａ／ＧおよびＬＣ１にＣ２１４Ｓ／Ａ／Ｇを含む、項目６０に記載の混合物。
６２．第１の抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、ＨＣ１に変更Ｃ２２０ＧおよびＬＣ１にＣ２１４Ｓを含むか、または
第１の抗体が、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４抗体であり、ＨＣ１に変更Ｃ１３１ＳおよびＬＣ１にＣ２１４Ｓを含む、項目６１に記載の混合物。
６３．第１の抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、
第１の抗体が、第１の対のアミノ酸位置に少なくとも１対のシステイン置換を含み、
第１の対のアミノ酸位置が、第１のＨＣ１位置および第１のＬＣ１位置を含み、
第１のＨＣ１およびＬＣ１位置が、それぞれ、１２６および１２４位；１２８および１１８位；１３３および１１７位；１３３および２０９位；１３４および１１６位；１６８および１７４位；１７０および１６２位；１７０および１７６位；１７３および１６０位；ならびに１８３および１７６位からなる群より選択される、項目６０から６２のいずれかに記載の混合物。
６４．第１のＨＣ１およびＬＣ１位置が、それぞれ、１６８および１７４位；１７３および１６０位；ならびに１７０および１６２位からなる群より選択される、項目６３に記載の混合物。
６５．第１の抗体が、それぞれ第１のＨＣ１および第１のＬＣ１位置とは異なる第２のＨＣ１位置および第２のＬＣ１位置を含む第２の対の位置に第２の対のシステイン置換を含み、
第２のＨＣ１およびＬＣ１位置が、それぞれ、１２６および１２４位；１２８および１１８位；１３３および１１７位；１３３および２０９位；１３４および１１６位；１６８および１７４位；１７０および１６２位；１７０および１７６位；１７３および１６０位；ならびに１８３および１７６位からなる群より選択される、項目６４に記載の混合物。
６６．第１のＨＣ１およびＬＣ１位置が、それぞれ１７３および１６０であり、第２のＨＣ１およびＬＣ１位置が、それぞれ１７０および１６２である、項目６５に記載の混合物。
６７．第１の抗体が、ＩｇＧ４抗体であり、
第１の抗体が、第１の対のアミノ酸位置に少なくとも１対のシステイン置換を含み、
第１の対のアミノ酸位置が、第１のＨＣ１位置および第１のＬＣ１位置を含み、
第１のＨＣ１およびＬＣ１位置が、それぞれ、１２６および１２１位；１２６および１２４位；１２７および１２１位；１２８および１１８位；１６８および１７４位；１７０および１６２位；ならびに１７３および１６２位からなる群より選択される、項目６０から６２のいずれか一項に記載の混合物。
６８．第１の抗体が、それぞれ第１のＨＣ１およびＬＣ１位置とは異なる第２のＨＣ１位置および第２のＬＣ１位置に第２の対のシステイン置換を含み、
第２のＨＣ１およびＬＣ１位置が、それぞれ、１２６および１２１位；１２６および１２４位；１２７および１２１位；１２８および１１８位；１６８および１７４位；１７０および１６２位；ならびに１７３および１６２位からなる群より選択される、項目６７に記載の混合物。
６９．第１の抗体が、ＩｇＧ２抗体であり、
第１の抗体が、第１の対の接触アミノ酸位置に少なくとも１対のシステイン置換を含み、一方の位置がＨＣ１に存在し、他方がＬＣ１に存在する、項目６０から６２のいずれか一項に記載の混合物。
７０．ＨＣ１およびＬＣ１の、第１の対の接触アミノ酸位置が、それぞれ、１７０および１６２ならびに１７３および１６０からなる群より選択される、項目６９に記載の混合物。
７１．第１の抗体が、第２の対の接触アミノ酸位置に第２の対のシステイン置換を含み、第２の対の接触アミノ酸位置の一方の位置がＨＣ１位置に存在し、他方がＬＣ１位置に存在し、第２の対の接触アミノ酸位置のＨＣ１およびＬＣ１位置が各々、第１の対の接触アミノ酸位置のそれぞれＨＣ１およびＬＣ１位置とは異なる、項目６９または７０に記載の混合物。
７２．ＨＣ１およびＬＣ１の、第２の対の接触アミノ酸位置が、それぞれ１７０および１６２ならびに１７３および１６０からなる群より選択される、項目７１に記載の混合物。
７３．第１の抗体が、別のアミノ酸が荷電アミノ酸に置換されている少なくとも１つのパートナー指向性変更を含む、項目４６から７２のいずれか一項に記載の混合物。
７４．第１の抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、
第１の抗体が、アミノ酸の電荷対を含み、
電荷対の１つのアミノ酸が、ＨＣ１に存在し、電荷対の１つのアミノ酸が、ＬＣ１に存在し、
電荷対のアミノ酸のうちの少なくとも１つが、パートナー指向性変更に起因し、
電荷対が、それぞれ、ＨＣ１およびＬＣ１の１４７Ｄ／Ｅおよび１２４Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１２９Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１３１Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１８０Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１６４Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１６７Ｋ／Ｒ；または１６８Ｄ／Ｅおよび１７４Ｋ／Ｒの位置にあるアミノ酸対の１つからなる、項目７３に記載の混合物。
７５．第１の抗体が、ＩｇＧ４抗体であり、
第１の抗体が、アミノ酸の電荷対を含み、
電荷対の１つのアミノ酸が、ＨＣ１に存在し、電荷対の１つのアミノ酸が、ＬＣ１に存在し、
電荷対のアミノ酸のうちの少なくとも１つが、パートナー指向性変更に起因し、
電荷対が、それぞれ、ＨＣ１およびＬＣ１の１３３Ｄ／Ｅおよび１１７Ｋ／Ｒ；１３７Ｋ／Ｒおよび１１４Ｄ／Ｅ；１３７Ｋ／Ｒおよび１１６Ｄ／Ｅ；１４７Ｄ／Ｅおよび１２４Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１２９Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１３１Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１７８Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１８０Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１６４Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１６７Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１７３Ｋ／Ｒ；または１６８Ｄ／Ｅおよび１７４Ｋ／Ｒの位置にあるアミノ酸対の１つからなる、項目７３に記載の混合物。
７６．第１の抗体が、ＩｇＧ２抗体であり、
第１の抗体が、アミノ酸の電荷対を含み、
電荷対の１つのアミノ酸が、ＨＣ１に存在し、電荷対の１つのアミノ酸が、ＬＣ１に存在し、
電荷対のアミノ酸のうちの少なくとも１つが、パートナー指向性変更に起因する、項目７３に記載の混合物。
７７．電荷対が、ＨＣ１の１４７Ｄ／ＥおよびＬＣ１の１３１Ｋ／Ｒからなる、項目７６に記載の混合物。
７８．ＨＣ１および／またはＨＣ２が、ＨＣ残基に少なくとも１つのＬＣパートナー指向性変更を含み、
ＬＣ１および／またはＬＣ２は、それぞれＨＣ１および／もしくはＨＣ２において、ＬＣパートナー指向性変更が行われているＨＣ残基と接触するか、またはそれぞれＨＣ１および／もしくはＨＣ２に存在する荷電アミノ酸もしくはシステインと接触するＬＣ残基に少なくとも１つのＨＣパートナー指向性変更を含む、項目４６から５９のいずれか一項に記載の混合物。
７９．ＬＣパートナー指向性変更は、ＨＣ１およびＨＣ２が、ＨＣ１およびＨＣ２の両方のＨＣ残基に荷電アミノ酸を含むことを引き起こし、
ＨＣ１のＨＣ残基の荷電アミノ酸は、ＨＣ２のＨＣ残基の荷電アミノ酸と電荷が逆であり、
ＨＣパートナー指向性変更は、ＬＣ１およびＬＣ２が、ＬＣ１およびＬＣ２の両方のＬＣ残基に荷電アミノ酸を含むことを引き起こし、
ＬＣ１のＬＣ残基の荷電アミノ酸は、ＬＣ２のＬＣ残基の荷電アミノ酸と電荷が逆であり、
ＬＣ１のＬＣ残基の荷電アミノ酸は、ＨＣ１のＨＣ残基のアミノ酸と電荷が逆である、項目７８に記載の混合物。
８０．第１および第２の抗体が、
（ａ）ＨＣ１およびＨＣ２の両方の４４および１０５位ならびにＬＣ１およびＬＣ２の両方の４３および１００位は各々、荷電アミノ酸により占められており、ＨＣ１の４４および１０５位のアミノ酸は各々、ＨＣ２の同じ部位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＬＣ１の４３および１００位のアミノ酸は各々、ＬＣ２の同じ部位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＨＣ１およびＨＣ２の４４位のアミノ酸は、それぞれＬＣ１およびＬＣ２の１００位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＨＣ１およびＨＣ２の１０５位のアミノ酸は、それぞれＬＣ１およびＬＣ２の４３位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット；
（ｂ）ＨＣ１およびＨＣ２の１４７位ならびにＬＣ１およびＬＣ２の１３１位は各々、荷電アミノ酸により占められており、ＨＣ１の１４７位のアミノ酸は、ＨＣ２の１４７位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＬＣ１の１３１位のアミノ酸は、ＬＣ２の１３１位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＨＣ１およびＨＣ２の１４７位のアミノ酸は、それぞれＬＣ１およびＬＣ２の１３１位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット；
（ｃ）ＨＣ１およびＨＣ２の１６８位ならびにＬＣ１およびＬＣ２の１７４位は各々、荷電アミノ酸により占められており、ＨＣ１の１６８位のアミノ酸は、ＨＣ２の１６８位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＬＣ１の１７４位のアミノ酸は、ＬＣ２の１７４位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＨＣ１およびＨＣ２の１６８位のアミノ酸は、それぞれＬＣ１およびＬＣ２の１７４位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット；ならびに
（ｄ）ＨＣ１およびＨＣ２の１８１位ならびにＬＣ１およびＬＣ２の１７８または１８０位は各々、荷電アミノ酸により占められており、ＨＣ１の１８１位のアミノ酸は、ＨＣ２の１８１位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＬＣ１の１７８または１８０位のアミノ酸は、ＬＣ２の１７８または１８０位のアミノ酸と電荷が逆であり、ＨＣ１およびＨＣ２の１８１位のアミノ酸は、それぞれＬＣ１およびＬＣ２の１７８または１８０位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目７８または７９に記載の混合物。
８１．第１および第２の抗体が、
（ａ）ＨＣ１は４４Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ１は１００Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ２は４４Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ２は１００Ｄ／Ｅを含むか、またはＨＣ２は４４Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ２は１００Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ１は４４Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ１は１００Ｄ／Ｅを含む変更のセット；
（ｂ）ＨＣ１は１０５Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ１は４３Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ２は１０５Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ２は４３Ｄ／Ｅを含むか、またはＨＣ２は１０５Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ２は４３Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ１は１０５Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ１は４３Ｄ／Ｅを含む変更のセット；
（ｃ）ＨＣ１は１４７Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ１は１３１Ｅ／Ｄを含み、ＨＣ２は１４７Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ２は１３１Ｒ／Ｋを含むか、またはＨＣ２は１４７Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ２は１３１Ｅ／Ｄを含み、ＨＣ１は１４７Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ１は１３１Ｒ／Ｋを含む変更のセット；
（ｄ）ＨＣ１は１６８Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ１は１７４Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ２は１６８Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ２は１７４Ｄ／Ｅを含むか、またはＨＣ２は１６８Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ２は１７４Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ１は１６８Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ１は１７４Ｄ／Ｅを含む変更のセット；ならびに
（ｅ）ＨＣ１は１８１Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ１は１７８Ｒ／Ｋもしくは１８０Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ２は１８１Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ２は１７８Ｄ／Ｅもしくは１８０Ｄ／Ｅを含むか、またはＨＣ２は１８１Ｅ／Ｄを含み、ＬＣ２は１７８Ｒ／Ｋもしくは１８０Ｒ／Ｋを含み、ＨＣ１は１８１Ｒ／Ｋを含み、ＬＣ１は１７８Ｄ／Ｅもしくは１８０Ｄ／Ｅを含む変更のセット
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目７８から８０のいずれか一項に記載の混合物。
８２．第１および第２の抗体が、
（ａ）ＨＣ１は４４Ｄおよび１０５Ｒを含み、ＬＣ１は４３Ｄおよび１００Ｒを含み、ＨＣ２は４４Ｒおよび１０５Ｄを含み、ＬＣ２は４３Ｒおよび１００Ｄを含むか、またはＨＣ２は４４Ｄおよび１０５Ｒを含み、ＬＣ２は４３Ｄおよび１００Ｒを含み、ＨＣ１は４４Ｒおよび１０５Ｄを含み、ＬＣ１は４３Ｒおよび１００Ｄを含む変更のセット；
（ｂ）ＨＣ１は１４７Ｒを含み、ＬＣ１は１３１Ｄを含み、ＨＣ２は１４７Ｄを含み、ＬＣ２は１３１Ｒを含むか、またはＨＣ２は１４７Ｒを含み、ＬＣ２は１３１Ｄを含み、ＨＣ１は１４７Ｄを含み、ＬＣ１は１３１Ｒを含む変更のセット；
（ｃ）ＨＣ１は１６８Ｄを含み、ＬＣ１は１７４Ｒを含み、ＨＣ２は１６８Ｒを含み、ＬＣ２は１７４Ｄを含むか、またはＨＣ２は１６８Ｄを含み、ＬＣ２は１７４Ｒを含み、ＨＣ１は１６８Ｒを含み、ＬＣ１は１７４Ｄを含む変更のセット；ならびに
（ｄ）ＨＣ１は１８１Ｄを含み、ＬＣ１は１７８Ｒもしくは１８０Ｒを含み、ＨＣ２は１８１Ｒを含み、ＬＣ２は１７８Ｄもしくは１８０Ｄを含むか、またはＨＣ２は１８１Ｄを含み、ＬＣ２は１７８Ｒもしくは１８０Ｒを含み、ＨＣ１は１８１Ｒを含み、ＬＣ１は１７８Ｄもしくは１７８Ｄを含む変更のセット
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目８１に記載の混合物。
８３．第１および第２の抗体が、
（ａ）ＨＣ１はＧ４４ＤおよびＱ１０５Ｒを含み、ＬＣ１はＡ／Ｖ４３ＤおよびＱ／Ｇ１００Ｒを含み、ＨＣ２はＧ４４ＲおよびＱ１０５Ｄを含み、ＬＣ２はＡ／Ｖ４３ＲおよびＱ／Ｇ１００Ｄを含むか、またはＨＣ２はＧ４４ＤおよびＱ１０５Ｒを含み、ＬＣ２はＡ／Ｖ４３ＤおよびＱ／Ｇ１００Ｒを含み、ＨＣ１はＧ４４ＲおよびＱ１０５Ｄを含み、ＬＣ１はＡ／Ｖ４３ＲおよびＱ／Ｇ１００Ｄを含む変更のセット；
（ｂ）ＨＣ１はＫ１４７Ｒを含み、ＬＣ１はＳ１３１Ｄを含み、ＨＣ２はＫ１４７Ｄを含み、ＬＣ２はＳ１３１Ｒを含むか、またはＨＣ２はＫ１４７Ｒを含み、ＬＣ２はＳ１３１Ｄを含み、ＨＣ１はＫ１４７Ｄを含み、ＬＣ１はＳ１３１Ｒを含む変更のセット；
（ｃ）ＨＣ１はＨ１６８Ｄを含み、ＬＣ１はＳ１７４Ｒを含み、ＨＣ２はＨ１６８Ｒを含み、ＬＣ２はＳ１７４Ｄを含むか、またはＨＣ２はＨ１６８Ｄを含み、ＬＣ２はＳ１７４Ｒを含み、ＨＣ１はＨ１６８Ｒを含み、ＬＣ１はＳ１７４Ｄを含む変更のセット；ならびに
（ｄ）ＨＣ１はＳ１８１Ｄを含み、ＬＣ１はＴ／Ｙ１７８ＲもしくはＴ／Ｓ１８０Ｒを含み、ＨＣ２はＳ１８１Ｒを含み、ＬＣ２はＴ／Ｙ１７８ＤもしくはＴ／Ｓ１８０Ｄを含むか、またはＨＣ２はＳ１８１Ｄを含み、ＬＣ２はＴ／Ｙ１７８ＲもしくはＴ／Ｓ１８０Ｒを含み、ＨＣ１はＳ１８１Ｒを含み、ＬＣ１はＴ／Ｙ１７８ＤもしくはＴ／Ｓ１８０Ｄを含む変更のセット
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目８２に記載の混合物。
８４．第１および／または第２の抗体が、１つまたは複数の対の位置に１つまたは複数の対のシステイン置換を含み、
各対の位置が、１つのＨＣ位置および１つのＬＣ位置を含み、
対の位置のそれぞれＨＣ位置およびＬＣ位置が、１２６および１２１；１２６および１２４；１２７および１２１；１２８および１１８；１３３および１１７；１３３および２０９；１３４および１１６；１４１および１１６；１６８および１７４；１７０および１６２；１７０および１７６；１７３および１６０；１７３および１６２；ならびに１８３および１７６からなる群より選択され、
第１および第２の抗体が、同じ対の位置にシステイン置換を含まない、項目７８から８３のいずれか一項に記載の混合物。
８５．第１および第２の抗体が、
（１）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７０および１８３位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７０および１８３位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されていること；
（２）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７３および１７０位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１６０および１６２位は各々、システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７３および１７０位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１６０および１６２位は各々、システインにより置換されていること；
（３）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７３および１８３位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１６０および１７６位は各々、システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７３および１８３位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１６０および１７６位は各々、システインにより置換されていること；
（４）ＨＣ１およびＨＣ２の１７０位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１の１７０位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されていること；
（５）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７０および１７３位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１６２および１６０位は各々、システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７０および１７３位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１６２および１６０位は各々、システインにより置換されていること；
（６）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７３および１７０位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７３および１７０位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されていること；
（７）ＨＣ１およびＨＣ２の１７３位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１６２および１６０位は各々、システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１の１７３位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１６２および１６０位は各々、システインにより置換されていること；
（８）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１８３および１７３位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１７６および１６０位は各々、システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１８３および１７３位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１７６および１６０位は各々、システインにより置換されていること；
（９）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７０および１７３位ならびにＬＣ１およびＬＣ２のそれぞれ１７６および１６０位は各々、システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７０および１７３位ならびにＬＣ２およびＬＣ１のそれぞれ１７６および１６０位は各々、システインにより置換されていること；
（１０）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７０および１８３位ならびにＬＣ１およびＬＣ２の１７６位は各々、システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７０および１８３位ならびにＬＣ２およびＬＣ１の１７６位は各々、システインにより置換されていること；ならびに
（１１）ＨＣ１およびＨＣ２のそれぞれ１７３および１７０位ならびにＬＣ１およびＬＣ２の両方の１６２位は各々、システインにより置換されているか、またはＨＣ２およびＨＣ１のそれぞれ１７３および１７０位ならびにＬＣ２およびＬＣ１の両方の１６２位は各々、システインにより置換されていること
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目８４に記載の混合物。
８６．第１および第２の抗体が、
（１）ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、またはＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
（２）ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含み、ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含むか、またはＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含み、ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含むこと；
（３）ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含み、ＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、またはＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含み、ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
（４）ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、またはＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
（５）ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、またはＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含むこと；
（６）ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、またはＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
（７）ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、またはＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含むこと；
（８）ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含み、ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、またはＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含み、ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＱ／Ｅ１６０Ｃを含むこと；
（９）ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含み、ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、またはＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含み、ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含むこと；
（１０）ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含み、ＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、またはＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含み、ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；および
（１１）ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含むか、またはＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含むこと
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目８５に記載の混合物。
８７．ＨＣ１および／またはＨＣ２がＩｇＧ４ ＨＣである場合、ＩｇＧ４ ＨＣが、２２８Ｐを含む、項目４６から８６のいずれか一項に記載の混合物。
８８．第１および第２の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、少なくとも１週間異なる、項目４６から８７のいずれか一項に記載の混合物。
８９．第１および第２の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、少なくとも１０日間異なる、項目８８に記載の混合物。
９０．第１および第２の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、少なくとも２週間異なる、項目８９に記載の混合物。
９１．より短いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有する抗体が、Ｍ２５２Ａ、Ｍ２５２Ｌ、Ｍ２５２Ｓ、Ｍ２５２Ｒ、Ｒ２５５Ｋ、またはＨ４３５Ｒの変更のうちの少なくとも１つを含む、項目８８から９０のいずれか一項に記載の混合物。
９２．ＨＣ１が、それぞれ、アミノ酸配列である配列番号２８、２９、および３０を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ＬＣ１が、それぞれ、アミノ酸配列である配列番号２５、２６、および２７を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ＨＣ２が、アミノ酸配列である配列番号３１、３２、および３３を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ＬＣ２が、アミノ酸配列である配列番号３４、３５、および３６を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、項目４６から５９および７８から９１のいずれか一項に記載の混合物。
９３．（ａ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｂ）第１および第２の抗体は両方ともヒトＨＥＲ２に結合するが、ＨＥＲ２との結合について競合しないか、
（ｃ）第１および第２の抗体の一方はヒトＬＡＧ３に結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｄ）第１および第２の抗体の一方はヒトＧＩＴＲに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｄ）第１および第２の抗体の一方はヒトＶＥＧＦに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｆ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＳＦＲ１ａに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｇ）第１および第２の抗体の一方はヒトＯＸ４０に結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｈ）第１および第２の抗体の一方はヒトＴＩＧＩＴに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｉ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｊ）第１および第２の抗体の一方はヒトＶＥＧＦに結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｋ）第１および第２の抗体の一方はヒトＯＸ４０に結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｌ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＳＦＲ１ａに結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｍ）第１および第２の抗体の一方はヒトＴＩＧＩＴに結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｎ）第１および第２の抗体の一方はヒトＴｉｍ３に結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｏ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒトＶＥＧＦに結合するか、
（ｐ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒト４１ＢＢに結合するか、
（ｑ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＤ２０に結合し、他方はヒトＣＤ３７に結合するか、
（ｒ）第１および第２の抗体の一方はヒトＡＮＧ２に結合し、他方はヒトＶＥＧＦに結合するか、
（ｓ）第１および第２の抗体の一方はヒトＴＮＦに結合し、他方はヒトＩＬ１７ａに結合するか、
（ｔ）第１および第２の抗体の一方はヒトＣＤ３８に結合し、他方はヒトＣＤ１３８に結合するか、
（ｕ）第１および第２の抗体の一方はヒトＥＧＦＲに結合し、他方はヒトＨＥＲ２に結合するか、
（ｖ）第１および第２の抗体の一方はヒトＥＧＦＲに結合し、他方はヒトＨＥＲ３に結合するか、
（ｗ）第１および第２の抗体の一方はヒトＭＥＴに結合し、他方はヒトＶＥＧＦに結合するか、
（ｘ）第１および第２の抗体の一方はヒトＭＥＴに結合し、他方はヒトＥＧＦＲに結合するか、
（ｙ）第１および第２の抗体の一方はヒトＴＳＬＰに結合し、他方はヒトＩＬ３３に結合するか、
（ｚ）第１および第２の抗体の一方はヒトＩＬ４に結合し、他方はヒトＩＬ１３に結合するか、
（ａａ）第１および第２の抗体の一方はヒトＰＤ１に結合し、他方はヒトＣＤ９６に結合するか、
（ｂｂ）第１および第２の抗体の一方はヒトＰＤ１に結合し、他方はヒトＳＩＲＰ−アルファに結合するか、または
（ｃｃ）第１および第２の抗体の一方はヒトＰＤ１に結合し、他方はヒトＣＣＲ８に結合する、項目４６から９１のいずれか一項に記載の混合物。
９４．霊長類またはヒト化ＩｇＧ ＣＨ１ドメイン、および霊長類またはヒト化ＣＬドメインを含む抗体であって、
ＣＨ１およびＣＬドメインが、アミノ酸の電荷対を含み、
電荷対の一方のアミノ酸がＣＨ１ドメインに存在し、他方がＣＬドメインに存在し、
（１）ＣＨ１ドメインはＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインであり、電荷対のアミノ酸のＨＣ位置およびＬＣ位置は、それぞれ１８１および１７８ならびに１６８および１７４からなる群より選択されるか、または
（２）ＣＨ１ドメインはＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインであり、電荷対のアミノ酸のＨＣ位置およびＬＣ位置は、それぞれ１８１および１８０ならびに１６８および１７４からなる群より選択される、抗体。
９５．霊長類またはヒト化ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン、および霊長類またはヒト化カッパＣＬドメインを含む抗体であって、
ＣＨ１およびＣＬドメインが、１対の接触システイン残基を含み、
１対の一方のシステインがＣＨ１ドメインに存在し、他方がＣＬドメインに存在し、
１対のシステインのＣＨ１位置およびＣＬ位置が、それぞれ、（１）１６８および１７４、（２）１３３および１１７、（３）１７３および１６０、（４）１７０および１６２、（５）１７０および１７６、（６）１２６および１２４、（７）１２８および１１８、ならびに（８）１３４および１１６からなる群より選択される、抗体。
９６．ＣＨ１ドメインの２２０位およびＣＬドメインの２１４位のシステインの、他のアミノ酸による置換を含む、項目９５に記載の抗体。
９７．霊長類またはヒト化ＩｇＧ４ ＣＨ１ドメイン、および霊長類またはヒト化カッパＣＬドメインを含む抗体であって、
ＣＨ１およびＣＬドメインが、１対の接触システイン残基を含み、
１対の接触システイン残基の一方がＣＨ１残基に存在し、他方がＣＬ残基に存在し、
１対の接触システイン残基のＣＨ１およびＣＬ残基が、それぞれ、（１）１６８および１７４、（２）１７３および１６２、（３）１７０および１６２、（４）１２６および１２４、（５）１２７および１２１、ならびに（６）１２８および１１８からなる群より選択される、抗体。
９８．ＣＨ１ドメインの１３１位およびＣＬドメインの２１４位のシステインの、他のアミノ酸による置換を含む、項目９７に記載の抗体。
９９．霊長類またはヒト化ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン、および霊長類またはヒト化ＣＬドメインを含む抗体であって、
ＣＨ１ドメインの１３１位およびＣＬドメインの２１４位のシステインの、他のアミノ酸による置換を含み、
ＣＨ１およびＣＬドメインが各々、１対の接触システイン残基を生成するシステイン置換を含む、抗体。
１００．１対の接触システイン残基が、それぞれ（１）１７３および１６２位ならびに（２）１７０および１６２位からなる、ＣＨ１およびＣＬドメインの位置の群から選択される、項目９９に記載の抗体。
１０１．ＣＨ１およびＣＬドメインが各々、第２の異なる対の接触システイン残基を生成する第２のシステイン置換を含む、項目９９または１００に記載の抗体。
１０２．第２の対の接触システイン残基が、それぞれ（１）１７３および１６２位ならびに（２）１７０および１６２位からなる、ＣＨ１およびＣＬドメインの位置の群から選択される、項目１０１に記載の抗体。
１０３．全長ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体である、項目９４から１０２のいずれか一項に記載の抗体。
１０４．項目４６から９３のいずれか一項に記載の抗体の混合物を作製する方法であって、
（ａ）抗体の混合物を発現する宿主細胞株を培養培地中で培養するステップ、および
（ｂ）抗体の混合物を細胞塊または培養培地から回収するステップ
を含む、方法。
１０５．宿主細胞株が、哺乳動物細胞株である、項目１０４に記載の方法。
１０６．宿主細胞株が、ＣＨＯ細胞株である、項目１０５に記載の方法。
１０７．抗体の混合物を、細胞塊または培養培地に存在する他の成分から精製するステップをさらに含む、項目１０４から１０６のいずれか一項に記載の方法。
１０８．項目４６から９３のいずれか一項に記載の抗体の混合物を産生する宿主細胞株。
１０９．哺乳動物細胞株である、項目１０８に記載の宿主細胞株。
１１０．ＣＨＯ細胞株である、項目１０９に記載の宿主細胞株。
１１１．項目４６から１０３のいずれか一項に記載の抗体または抗体の混合物をコードする１つまたは複数の核酸。
１１２．項目１１１に記載の核酸を含む１つまたは複数のベクター。
１１３．各々が哺乳動物発現ベクターである、項目１１２に記載のベクター。
１１４．各々がウイルスベクターである、項目１１２に記載のベクター。
１１５．各々が、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、項目１１４に記載のベクター。
１１６．項目１１１から１１５のいずれか一項に記載の核酸および／またはベクターを含む宿主細胞株。
１１７．疾患を治療する方法であって、疾患を有する患者に、項目４６から９３のいずれか一項に記載の抗体の混合物を投与することを含み、疾患が、がん、代謝疾患、感染性疾患、または自己免疫性もしくは炎症性疾患である、方法。
１１８．疾患ががんである、項目１１７に記載の方法。
１１９．疾患を治療する方法であって、疾患を有する患者に、項目９４から１０３のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
１２０．がんを治療する方法であって、項目９３（ａ）に記載の抗体の混合物を患者に投与することを含む、方法。
１２１．乳がんを治療する方法であって、項目９３（ｂ）に記載の抗体の混合物を患者に投与することを含む、方法。
１２２．抗体の混合物が、３つの主要抗体種を含む、項目１２１に記載の方法。
１２３．腫瘍を有する患者を治療する方法であって、腫瘍に、項目４６から１０３のいずれか一項に記載の抗体または抗体の混合物を注射することを含む、方法。
１２４．がん患者を治療する方法であって、患者に、項目１１１から１１５のいずれか一項に記載の核酸および／またはベクターを投与することを含む、方法。
１２５．患者が腫瘍を有し、核酸および／またはベクターが、腫瘍に直接投与される、項目１２４に記載の方法。
１２６．核酸および／またはベクターが、腫瘍に注射される、項目１２５に記載の方法。
図１は、宿主細胞における「ＭａｂＰａｉｒ」の産生に使用される変更を示す。抗体の様々なドメインは、図に示されている。抗体１は、残基４０９がアルギニンとなるように変化されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ３抗体、または４０９位に天然のアルギニンを有するＩｇＧ４抗体である。示されている通り、抗体１は、抗原Ａ（不規則な間隔で配置された四角が密に描かれた丸で示す）に結合する。抗体２は、残基４０９がアスパラギン酸またはグルタミン酸となるように変更され（Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、丸で囲った「−」で示す）、残基３９９がアルギニンまたはリシンとなるように変更された（Ｄ３９９Ｒ／Ｋ、丸で囲った「＋」で示す）ＩｇＧ抗体である。示されている通り、抗体２は、抗原Ｂ（市松模様が密に描かれた丸で示す）に結合する。丸で囲った「＋」および「−」符号で示されている通り、抗体１および抗体２のＶＬおよびＶＨドメインならびにＣＬおよびＣＨ１ドメインにおける荷電残基の対は、抗体１および２の軽鎖が、それらの同族（ｃｏｇｎａｔｅ）重鎖と対合するように駆動する。これらの荷電残基は、抗体の本来のアミノ酸配列に存在することができる、または本来の配列に存在するアミノ酸を荷電アミノ酸に置換することにより導入することができる。さらに、これらの荷電残基は、抗体１の重鎖および抗体２の軽鎖の間ならびに抗体２の重鎖および抗体１の軽鎖の間に斥力を創出する。抗体１および２のＣＨ１／ＣＬ界面内の異なる場所における置換によって導入され得るシステイン残基は、実線によって連接される２個の丸囲みＣで示す。抗体のヒンジドメインに通常存在する追加的なジスルフィド架橋は、実線の水平線で示す。
図２は、１個の宿主細胞における３種の異なる抗体（「３イン１混合物」）の産生に使用される変更を示す。マークは、図１と同様である。示されている通り、抗体１（左）は、抗原Ａに結合するＩｇＧ１抗体であり、抗体２は、抗原Ｂに結合するＩｇＧ１抗体であり、抗体３は、抗原ＡおよびＢの両方に結合する二重特異性抗体である。図１に示す実施形態とは異なり、ヘテロ二量体形成に不利になるＣＨ３ドメインにおける変更は、抗体２に存在しない。
図３は、１個の宿主細胞における抗体のＭａｂＰａｉｒ（パネルＡ）または３イン１混合物（パネルＢ）の産生に使用される代わりの戦略を示す。マークは、図１に示されている通りである。パネルＡ。抗体１は、残基４０９がアルギニンとなるように変化されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ３抗体、または４０９位に天然のアルギニンを有するＩｇＧ４抗体である。示されている通り、抗体１は、抗原Ａに結合する。抗体１は、そのＦａｂ領域、すなわち、ＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬドメインに任意の変更を有さない。ＨＣおよびＬＣの間の天然のジスルフィド架橋は、ＣＨ１ドメインおよびＬＣのカルボキシ末端の間の太線によって示される。抗体２は、残基３９９がアルギニンまたはリシンとなるように変更され（Ｄ３９９Ｒ／Ｋ、丸で囲った「＋」で示す）、残基４０９がアスパラギン酸またはグルタミン酸となるように変更された（Ｋ４０９Ｄ／Ｅ、丸で囲った「−」で示す）ＩｇＧ抗体である。示されている通り、抗体２は、抗原Ｂに結合する。アミノ酸置換により、抗体２は、ＬＣおよびＨＣの間に天然の鎖間ジスルフィド結合を欠くが、ＣＬおよびＣＨ１ドメインの間に２個の新たに導入されたジスルフィド結合を有する（実線によって連接された２個の丸囲みＣで示す）。さらに、導入された電荷対（例えば、ＣＬにおけるＳ１３１Ｋ／ＲおよびＣＨ１におけるＫ１４７Ｄ／Ｅ、またはＣＬにおけるＳ１７４Ｋ／ＲおよびＣＨ１におけるＨ１６８Ｄ／Ｅ）は、丸で囲った「＋」および「−」で示す。パネルＢ。マークは、パネルＡと同様である。パネルＡに示すＣＨ３ドメインにおける変更が存在しないことに留意されたい。抗体３は、抗体１および抗体２のそれぞれに由来するＨＣおよびＬＣを含む二重特異性抗体である。
図４は、２種の全長抗体をコードするＤＮＡがトランスフェクトされた宿主細胞によって潜在的に産生される抗体種を示す。左の丸は、宿主細胞を表す。長い方の曲がった実線および短い方の実線は、第１の抗体のＨＣおよびＬＣを表し、長い方の曲がった破線および短い方の破線は、第２の抗体のＨＣおよびＬＣを表す。これらのポリペプチドは、宿主細胞に導入されたＤＮＡによってコードされる。右の丸の外側に、ある機構によって様々な鎖の無差別な対合が防止されなければ産生され得る、潜在的な抗体種を全て示す。点線の長方形によって取り囲まれた３つの種は、同族ＨＣ／ＬＣ対のみを含有する種である。他の全種は、少なくとも１個の非同族ＨＣ／ＬＣ対を含む。
図５は、ＨＣおよびＬＣの接触残基におけるシステイン置換の存在下で形成された抗体種の解析を示す。実験は、実施例２に記載されている。簡潔に説明すると、変更ありまたはなしのＨＣおよび変更ありまたはなしのカッパＬＣ（ｋＬＣ）をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入し、宿主細胞によって産生された抗体をウエスタンブロッティングによって解析した。下で使用されている命名「ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ」は、変更Ｃ２２０Ｓ（天然のＨＣ／ＬＣジスルフィド架橋を排除する）、Ｄ３９９ＫおよびＫ４０９Ｅを有するＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ４抗体のＨＣを指す。下で使用されている命名「ａＰＤ１（ＩｇＧ４）」は、変更Ｃ１３１Ｓ（天然のＨＣ／ＬＣジスルフィド架橋を排除する）およびＳ２２８Ｐ（ＩｇＧ４ Ｆａｂアーム交換を防止する）を含むＩｇＧ４抗ＰＤ１抗体のＨＣを指す。下で使用されている命名「ａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ」および「ａＰＤ１−ｋＬＣ」は、これらの抗体の同族軽鎖を指し、両方とも、変更Ｃ２１４Ｓ（天然のＨＣ／ＬＣジスルフィド架橋を排除する）を含む。これらのポリペプチドにおける他の変更、例えば、（Ｈ１６８Ｃ）またはさらなる変更なし（ＷＴ）が、このポリペプチド記載に続く括弧内に示されている。レーン１、１３、２３、２４および３４は、この画像においては目に見えないサイズマーカーを含有する。他のレーンは、次のものをコードするＤＮＡを含有するトランスフェクタント由来の試料を含有する：レーン２、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（Ｈ１６８Ｃ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（Ｓ１７４Ｃ）；レーン３、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（Ｋ１３３Ｃ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（Ｉ１１７Ｃ）；レーン４、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（Ｋ１３３Ｃ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（Ｆ２０９Ｃ）；レーン５、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（Ｖ１７３Ｃ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（Ｑ１６０Ｃ）；レーン６、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（Ｆ１７０Ｃ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（Ｓ１６２Ｃ）；レーン７、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（Ｆ１７０Ｃ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（Ｓ１７６Ｃ）；レーン８、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（Ｓ１８３Ｃ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（Ｓ１７６Ｃ）；レーン９、ａＰＤ１（ＩｇＧ４）（Ｈ１６８Ｃ）およびａＰＤ１−ｋＬＣ（Ｓ１７４Ｃ）；レーン１０、ａＰＤ１（ＩｇＧ４）（Ｖ１７３Ｃ）およびａＰＤ１−ｋＬＣ（Ｓ１６２Ｃ）；レーン１１、ａＰＤ１（ＩｇＧ４）（Ｆ１７０Ｃ）およびａＰＤ１−ｋＬＣ（Ｓ１６２Ｃ）；レーン１２、ａＰＤ１（ＩｇＧ４）（Ｓ１８３Ｃ）およびａＰＤ１−ｋＬＣ（Ｓ１７６Ｃ）；レーン１４、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（Ｈ１６８Ｃ）およびａＰＤ１−ｋＬＣ（ＷＴ）；レーン１５、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（Ｋ１３３Ｃ）およびａＰＤ１−ｋＬＣ（ＷＴ）；レーン１６、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（Ｖ１７３Ｃ）およびａＰＤ１−ｋＬＣ（ＷＴ）；レーン１７、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（Ｆ１７０Ｃ）およびａＰＤ１−ｋＬＣ（ＷＴ）；レーン１８、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（Ｓ１８３Ｃ）およびａＰＤ１−ｋＬＣ（ＷＴ）；レーン１９、ａＰＤ１（ＩｇＧ４）（Ｈ１６８Ｃ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（ＷＴ）；レーン２０、ａＰＤ１（ＩｇＧ４）（Ｖ１７３Ｃ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（ＷＴ）；レーン２１、ａＰＤ１（ＩｇＧ４）（Ｆ１７０Ｃ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（ＷＴ）；レーン２２、ａＰＤ１（ＩｇＧ４）（Ｓ１８３Ｃ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（ＷＴ）；レーン２５、ａＰＤ１（ＩｇＧ４）（ＷＴ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（Ｓ１７４Ｃ）；レーン２６、ａＰＤ１（ＩｇＧ４）（ＷＴ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（Ｉ１１７Ｃ）；レーン２７、ａＰＤ１（ＩｇＧ４）（ＷＴ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（Ｆ２０９Ｃ）；レーン２８、ａＰＤ１（ＩｇＧ４）（ＷＴ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（Ｑ１６０Ｃ）；レーン２９、ａＰＤ１（ＩｇＧ４）（ＷＴ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（Ｓ１６２Ｃ）；レーン３０、ａＰＤ１（ＩｇＧ４）（ＷＴ）およびａＣＴＬＡ４−ｋＬＣ（Ｓ１７６Ｃ）；レーン３１、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（ＷＴ）およびａＰＤ１−ｋＬＣ（Ｓ１７４Ｃ）；レーン３２、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（ＷＴ）およびａＰＤ１−ｋＬＣ（Ｓ１６２Ｃ）；ならびにレーン３３、ａＣＴＬＡ４（ＩｇＧ１）ＫＥ（ＷＴ）およびａＰＤ１−ｋＬＣ（Ｓ１７６Ｃ）。左の矢印は、次の通りの様々なバンドを指し示す：上の矢印、ＨＣ−ＬＣ／ＨＣ−ＬＣ、全長抗体；第２の矢印、ＨＣ／ＨＣ−ＬＣ、２個のＨＣおよび１個のＬＣを含有する４分の３抗体；第３の矢印、ＨＣ／ＨＣ、２個のＨＣのみを含有する抗体種；ならびに下の矢印、ＨＣ−ＬＣ、１個のＨＣおよび１個のＬＣを含有する半抗体。
図６は、ＨＣおよびＬＣの接触残基におけるシステイン置換の存在下で形成された抗体種の解析を示す。実験は、実施例２に記載されている。レーン１〜６は、実施例２に記載されているＩｇＧ４抗ＰＤ１抗体のＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡが共トランスフェクトされた細胞由来の細胞上清を含有する。全ての抗ＰＤ１ ＨＣは、Ｓ２２８Ｐを含む。これらの抗体における他の変更は次の通りである：レーン１、野生型（ｗｔ）（ＨＣ）および（ＬＣ）；レーン２、Ｃ１３１Ｓ（ＨＣ）およびＣ２１４Ｓ（ＬＣ）；レーン３、Ｃ１３１ＳとＦ１２６Ｃ（ＨＣ）およびＣ２１４Ｓ ａとＳ１２１Ｃ（ＬＣ）；レーン４、Ｃ１３１ＳとＦ１２６Ｃ（ＨＣ）およびＣ２１４ＳとＱ１２４Ｃ（ＬＣ）；レーン５、Ｃ１３１ＳとＰ１２７Ｃ（ＨＣ）およびＣ２１４ＳとＳ１２１Ｃ（ＬＣ）；ならびにレーン６、Ｃ１３１ＳとＬ１２８Ｃ（ＨＣ）およびＣ２１４ＳとＦ１１８Ｃ（ＬＣ）。レーン７〜１１は、実施例２に記載されているＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ４抗体の野生ｗｔまたは変更されたＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡが共トランスフェクトされた細胞由来の細胞上清を含有する。これらの抗体における変更は次の通りである：レーン７、ｗｔ（ＨＣ）および（ＬＣ）；レーン８、Ｃ２２０Ｓ（ＨＣ）およびＣ２１４Ｓ（ＬＣ）；レーン９、Ｃ２２０ＳとＦ１２６Ｃ（ＨＣ）およびＣ２１４ＳとＱ１２４Ｃ（ＬＣ）；レーン１０、Ｃ２２０ＳとＬ１２８Ｃ（ＨＣ）およびＣ２１４ＳとＦ１１８Ｃ（ＬＣ）；ならびにレーン１１、Ｃ２２０ＳとＳ１３４Ｃ（ＨＣ）およびＣ２１４ＳとＦ１１６Ｃ（ＬＣ）。レーン１２は、ＤＮＡが使用されなかった模擬トランスフェクション由来の細胞上清を含有する。レーン１３および１４は、ＩｇＧ１抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８（アミノ酸配列の配列番号１９および２０を含む）を使用したトランスフェクション由来の細胞上清を含有する。レーン１５および１６は、ＩｇＧ１抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４（配列番号２１および２２のアミノ酸配列を含有する）を使用したトランスフェクション由来の細胞上清を含有する。サイズ（キロダルトン（ｋＤａ）単位）マーカーの位置は、左の、ウエスタンブロットの画像のサイズに示す。
図７は、ＨＣ／ＬＣ対合を評価するための鎖ドロップアウト一過性トランスフェクションを示す。実験は、実施例３に記載されている。５種の試料の各セットは、第１の抗体（抗ＰＤ１抗体）を一緒になってコードする第１の重鎖（ＨＣ１）および第１の軽鎖（ＬＣ１）、ならびに第２の抗体（抗ＣＴＬＡ４抗体）を一緒になってコードする第２の重鎖（ＨＣ２）および第２の軽鎖（ＬＣ２）をコードするＤＮＡの様々な組み合わせを使用したトランスフェクションに由来する。図に示されている通り、組み合わせは次の通りである：１）ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２およびＬＣ２；２）ＨＣ１およびＬＣ１；３）ＨＣ１およびＬＣ２；４）ＨＣ２およびＬＣ２；ならびに５）ＨＣ２およびＬＣ１。５レーンの各セットの上にある命名１８Ａ〜１８Ｄは、これらのレーンにおけるＨＣおよびＬＣが、表２１における命名１８Ａ〜１８Ｄに関して記載されている変更を有することを示す。レーン２１および２２は、トランスフェクション効率をモニターするための対照として含まれる、それぞれ全長抗ＨＥＲ２抗体、４Ｄ５−８（アミノ酸配列の配列番号１９および２０を含む）および２Ｃ４（配列番号２１および２２のアミノ酸配列を含有する）がトランスフェクトされた細胞由来の上清を含有する。
図８は、ＨＣ／ＬＣ対合を評価するための鎖ドロップアウト一過性トランスフェクションを示す。実験は、実施例３に記載されている。レーン１〜２０の下に示されている通り、バリアントの各対について、５種のＤＮＡ組み合わせのセット（図７に関する上述の通り）を宿主細胞にトランスフェクトした。５レーンの各セットの上にある命名１４Ａ〜１４Ｄは、これらのレーンにおけるＨＣおよびＬＣが、表２０におけるこれらの命名に関して記載されている変更を有することを示す。抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８および２Ｃ４をコードするＤＮＡを同時に二連でトランスフェクトしてトランスフェクション効率をモニターし、５−８（４Ｄ５−８）および４（２Ｃ４）と標識されたレーンにおいて、これらのトランスフェクタント由来の細胞上清を解析した。
図９は、ＨＣ／ＬＣ対合を評価するための鎖ドロップアウト一過性トランスフェクションを示す。実験は、実施例３に記載されている。レーン１〜２０の下に示されている通り、バリアントの各対について、５種のＤＮＡ組み合わせのセット（図７に関する上述の通り）を宿主細胞にトランスフェクトした。５レーンの各セットの上にある命名２３Ａ〜２３Ｄは、これらのレーンにおいて解析されるＨＣおよびＬＣが、表２１においてこれらの命名に関して記載されている変更を有することを示す。抗ＰＤ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体をコードするＤＮＡを同時にトランスフェクトしてトランスフェクション効率をモニターし、ａ−ＰＤ１およびａ−ＣＴＬＡ４と標識されたレーンにおいて、これらのトランスフェクタント（ｔｒａｎｆｅｃｔａｎｔ）由来の細胞上清を解析した。
図１０は、接触残基におけるシステイン置換の存在下でのＬＣ／ＨＣ対合を評価するための鎖ドロップアウト一過性トランスフェクションを示す。実験は、実施例３に記載されている。パネルＢおよびＣにおけるレーン２１〜２３は、ＤＮＡを含有しない（レーン２１）、ＩｇＧ１抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８を含有する（アミノ酸配列の配列番号１９および２０を含む；レーン２２）およびＩｇＧ１抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４を含有する（配列番号２１および２２のアミノ酸配列を含有する；レーン２３）対照トランスフェクション由来の細胞上清を含有する。示されている通り、他の全試料は、５種の群にあり、実施例３に説明されている通り、また、図７の記載の通り、ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２およびＬＣ２の様々な組み合わせをコードするＤＮＡを含有するトランスフェクション由来の細胞上清を含有する。ＨＣ１およびＬＣ１は一緒になって、Ｓ２２８Ｐ（ＨＣ１）以外の変更を含まない、実施例２に記載されているＩｇＧ４抗ＰＤ１抗体を構成する。ＨＣ２およびＬＣ２は一緒になって、変更Ｄ３９９ＫおよびＫ４０９Ｒ（ＨＣ）のみを含む、実施例２に記載されているＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ４抗体を構成する。これらの抗体は、さらなる変更を含まない（「ＷＴ」と命名）、または下表に示されている通り、異なるレーンにおいて様々な仕方で変更される。分子量標準の位置は、左に示す。
図１１は、３９２、３７０および３９７位に変更を有するＨＣのヘテロ二量体形成を示す。実施例４に記載されている通り、宿主細胞に、全長野生型ＩｇＧ１ ＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡ、と、下に示されている通りの変更ありまたはなしのＩｇＧ１ Ｆｃ断片をコードするＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクタントの培養培地由来の抗体を、非還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、ブロットした。実施例４に記載されている通りに抗体を検出した。ＨＣ−ＬＣ／ＨＣ−ＬＣホモ二量体（「ＨＣ／ＨＣ」）、ＨＣ−ＬＣ／Ｆｃヘテロ二量体（「ＨＣ／Ｆｃ」）およびＦｃ／Ｆｃ（「Ｆｃ／Ｆｃ」）ホモ二量体の位置を示す。各レーンにおけるＦｃ断片に存在する変更およびＨＣ−ＬＣ／Ｆｃヘテロ二量体のパーセントは次の通りである：１）Ｋ３９２Ａ、４６．９％；２）Ｋ３９２Ｃ、４９．２％；３）Ｋ３９２Ｄ、４２．９％；４）Ｋ３９２Ｅ、４４．１％；５）Ｋ３９２Ｆ、４２．７％；６）Ｋ３９２Ｇ、５０．２％；７）Ｋ３９２Ｈ、４４．０％：８）Ｋ３９２Ｍ、４３．３％；９）Ｋ３９２Ｎ、５０．０％；１０）Ｋ３９２Ｐ、４５．９％；１１）Ｋ３９２Ｑ、４８．１％；１２）Ｋ３９２Ｒ、５０．３％；１３）Ｋ３９２Ｓ、４６．３％；１４）Ｋ３９２Ｔ、５６．３％；１５）Ｋ３９２Ｖ、５４．０％；１６）Ｋ３９２Ｗ、４９．５％；１７）Ｋ３９２Ｙ、４９．６％；１８）ＷＴ、３９．７％；１９）Ｋ３７０Ａ、４７．３％；２０）Ｋ３７０Ｃ、６２．３％；２１）Ｋ３７０Ｄ、４８．８％；２２）Ｋ３７０Ｅ、４５．４％；２３）Ｋ３７０Ｆ、４３．２％；２４）Ｋ３７０Ｇ、５０．７％；２５）Ｋ３７０Ｈ、５５．２％；２６）Ｋ３７０Ｉ、５９．１％；２７）Ｋ３７０Ｌ、６０．６％；２８）Ｋ３７０Ｍ、５５．７％；２９）Ｋ３７０Ｎ、４７．４％；３０）Ｋ３７０Ｐ、５９．３％；３１）Ｋ３７０Ｑ、４９．２％；３２）Ｋ３７０Ｔ、５４．１％；３３）Ｋ３７０Ｖ、５１．９％；３４）Ｋ３７０Ｗ、３９．７％；３５）Ｋ３７０Ｙ、４７．３％；３６）Ｖ３９７Ａ、４６．９％；３７）Ｖ３９７Ｃ、５３．７％；３８）Ｖ３９７Ｄ、５２．２％；３９）Ｖ３９７Ｅ、５７．５％；４０）Ｖ３９７Ｆ、５１．４％；４１）Ｖ３９７Ｇ、５５．３％；４２）Ｖ３９７Ｈ、５５．２％；４３）Ｖ３９７Ｉ、５１．４％；４４）Ｖ３９７Ｋ、６６．５％；４５）Ｖ３９７Ｌ、４８．４％；４６）Ｖ３９７Ｍ、５２．１％；４７）Ｖ３９７Ｎ、５９．４％；４８）Ｖ３９７Ｐ、５６．２％；４９）Ｖ３９７Ｑ、４８．０％；５０）Ｖ３９７Ｒ、６１．９％；５１）Ｖ３９７Ｓ、４８．９％；５２）Ｖ３９７Ｔ、５１．６％；５３）Ｖ３９７Ｗ、４９．５％；および５４）Ｖ３９７Ｙ、４９．１％。
図１２は、３９９および／または４０９位（複数可）に変更を有するＨＣのヘテロ二量体形成を示す。本実験は、実施例４に記載されている。図の実験およびマークは、下表に示されている通り、Ｆｃ断片の様々な変更が３９９および／または４０９位（複数可）にあり、全長ＨＣが野生型ＩｇＧ４ ＨＣであることを除いて、図１１のものと同じである。
図１３は、３９９および／または４０９位における変更ありまたはなしの、Ｆｃ断片とＩｇＧ１またはＩｇＧ４ ＨＣとのヘテロ二量体形成を示す。本実験は、実施例４に記載されている。マークは、図１２と同様である。右の表中の「ＨＣなし」または「Ｆｃなし」は、それぞれＨＣまたはＦｃのいずれかをコードするＤＮＡが、当該レーンにおいてその抗体が可視化されている宿主細胞に導入されなかったことを示す。「Ａｂ１」および「Ａｂ２」は、２種の異なる抗体である。Ａｂ２ ＩｇＧ４およびＡｂ２ ＩｇＧ１は、それぞれＩｇＧ４およびＩｇＧ１形式に同じ可変ドメインを有する。
図１４は、３９９および／または４０９位における変更ありまたはなしの、Ｆｃ断片とＩｇＧ１またはＩｇＧ４ ＨＣとのヘテロ二量体形成を示す。実験は、実施例４に記載されている。マークは、図１３と同様である。
図１５は、精製された抗ＰＤ１抗ＣＴＬＡ４ ＭａｂＰａｉｒ抗体混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。本実験は、実施例５に記載されている。実施例５に記載されている通り、非還元（左）および還元（右）試料を、４〜１５％ＣＲＩＴＥＲＩＯＮ（商標）ＴＧＸ ＳＴＡＩＮ−ＦＲＥＥ（商標）プレキャストＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて泳動し、ブロットし、抗体を検出した。左端のレーンにおいて様々なサイズのタンパク質分子量標準を泳動し、サイズをキロダルトン（ｋＤａ）単位で示す。レーン１および８は、３種の異なる抗体である、２種の異なる抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８および２Ｃ４ならびにこれら２種の抗体のそれぞれに由来する１個のＨＣおよび１個のＬＣを含有する二重特異性抗体を含むことが予想される試料を含有する。レーン２および９は、抗ＣＴＬＡ４ ＩｇＧ１抗体をコードするＤＮＡがトランスフェクトされた細胞由来の試料を含有する。他のレーンは、次の通り、表２１に記載されている抗体混合物をコードするＤＮＡを含有するトランスフェクタント由来の試料を含有する：レーン３および１０、混合物１７Ｂ；レーン４および１１、混合物１７Ｃ；レーン５および１２、混合物１８Ｂ；レーン６および１３、混合物１８Ｃ；ならびにレーン７および１４、混合物１９Ｃ。
図１６は、抗体混合物の非還元および還元試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。本実験は、実施例５に記載されている。上および下パネルの左端のレーンは、分子量標準を含有する。５レーンの各群は、レーンの上に示されている抗体混合物の変動濃度の非還元（上パネル）または還元（下パネル）試料を含有する。これらの抗体混合物は、表２０に記載されている。
図１７は、低ｐＨカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーによる非還元抗体混合物の解析を示す。図は、実施例５に記載されている通りに低ｐＨで泳動したＣＥＸカラム由来のトレース図を示す。横軸は、カラム泳動開始から何分後であるかを示し、縦軸は、カラム流出において検出される２１４ナノメートルにおける吸光度（タンパク質濃度を反映する「ＡＵ」として示す）を示す。示されている通り、上のトレース図は、抗ＣＴＬＡ４抗体に由来し、中央のトレース図は、抗ＰＤ１抗体に由来し、下のトレース図は、変更バージョンの抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ４抗体をコードするＤＮＡがトランスフェクトされた宿主細胞において産生された、１８Ｃバリアント抗体混合物（表２１に記載）に由来する。
図１８は、抗体の精製された抗ＨＥＲ２／抗ＨＥＲ２ １４Ｄ ３イン１混合物由来のＦａｂ断片の質量分析（ＭＳ）解析を示す。バリアント１４Ｄ混合物は、表２０に記載されている。本実験は、実施例５に記載されている。Ｗａｔｅｒｓ ＳＹＮＡＰＴ（商標）Ｇ２ ＭＳシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、パパイン消化によって生成されたＦａｂ断片を解析した。最も顕著なピークの上に、質量（ダルトン単位）を示す。示されている通り、縦軸は、シグナルの強度（毎秒イオンカウント）を示し、横軸は、キロダルトン単位の質量を示す。
図１９は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１ ＭａｂＰａｉｒ抗体混合物のＭＳ解析を示す。これらの実験は、実施例６に記載されている。示されている通り、ｘ軸は、デコンボリューションされた質量を示し、ｙ軸は、所与の質量におけるタンパク質の分量を反映するカウントを示す。パネルＡ。本パネルは、変更なしのＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体の解析を示す。パネルＢ。本パネルは、ＨＣに変更Ｋ１４７Ｄ、Ｆ１７０Ｃ、Ｖ１７３Ｃ、Ｃ２２０Ｇ、Ｒ２５５Ｋ、Ｄ３９９ＲおよびＫ４０９Ｅを、ＬＣにＳ１３１Ｋ、Ｑ１６０Ｃ、Ｓ１６２ＣおよびＣ２１４Ｓを含有する抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体の解析を示す。パネルＣ。本パネルは、実施例２に記載されている無変更バージョンのＩｇＧ４抗ＰＤ１抗体のＭａｂＰａｉｒ混合物、およびパネルＢにおいて解析された操作されたＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体の解析を示す。パネルＤ。本パネルは、パネルＣにおいて解析されたＭａｂＰａｉｒ混合物のより高分解能の解析を示す。示されている通り、曲線下面積（ＡＵＣ）解析を行って、このＭａｂＰａｉｒにおける各抗体の相対量を決定した。
図２０は、抗ＰＤ１／抗ＣＴＬＡ４ ＭａｂＰａｉｒ抗体混合物由来のＦａｂ’断片のＭＳ解析を示す。実験は、実施例６に記載されている。パネルＡ。本パネルは、ＩｇＧ抗体（左）ならびにＩｄｅＳプロテアーゼで消化されたＩｇＧ抗体（左から２番目）ならびに２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）でさらに処理されたＩｇＧ抗体（右）の描画を示す。生成された様々な断片の名称を示す。パネルＢ。本パネルは、図１９のパネルＤにおいて解析された同じＭａｂＰａｉｒのＩｄｅＳプロテアーゼ消化および２−ＭＥＡ／ＥＤＴＡ処理によって生成されたＦａｂ’断片のＭＳ解析を示す。示されている通り、ｘ軸は、デコンボリューションされた質量を示し、ｙ軸は、所与の質量におけるタンパク質の分量を反映するカウントを示す。検出された断片の実際の質量および計算誤差と同様に、同族ＨＣ／ＬＣ対を含有する２個のＦａｂ’断片の予想される質量を示す。
図２１は、操作された抗ＣＴＬＡ４抗体の還元および非還元リシルエンドペプチダーゼ消化物の液体クロマトグラフィーを示す。本実験は、実施例６に記載されている。パネルＡ。本パネルは、図１９、パネルＢにおいて解析された操作された抗ＣＴＬＡ４抗体のリシルエンドペプチダーゼ消化に起因するペプチドの２種の予想されるアミノ酸配列を示す。表７および１１を参照されたい。予想されるジスルフィド結合を線で示す。パネルＢ。本パネルは、実施例６に記載されている操作された抗ＣＴＬＡ４抗体のリシルエンドペプチダーゼ消化の非還元試料のカラムプロファイルを示す。ｘ軸は、クロマトグラフィーの開始からの時間（分単位の取得時間として表現）を示し、ｙ軸は、カラム流出液におけるタンパク質の分量を反映するＵＶ応答を示す。連結された鎖ＡおよびＢ（パネルＡを参照）に対応するピークをその質量によって同定し、「３個のジスルフィドで連結されたペプチド」と標識した矢印で示す。パネルＣ。本パネルは、操作された抗ＣＴＬＡ４抗体のリシルエンドペプチダーゼ消化の還元試料のカラムプロファイルを示す。ｘおよびｙ軸は、パネルＢと同じである。鎖ＡおよびＢ（パネルＡを参照）に対応する新たなピークをそれらの質量によって同定し、示す。
図２２は、操作された抗ＣＴＬＡ４抗体のリシルエンドペプチダーゼ消化に起因するペプチドのモノアイソトピック質量の決定を示す。実験は、実施例６に記載されている。パネルＡ。操作された抗ＣＴＬＡ４抗体の非還元リシルエンドペプチダーゼ消化由来の予想されるジスルフィド連結されたペプチドのＭＳ解析（図２１、パネルＢにおいて「３個のジスルフィドで連結されたペプチド」と標識）。ｘ軸は、質量／電荷比（ｍ／ｚ比）を示し、ｙ軸は、所与の質量のイオンの分量を反映するカウントを示す。パネルＢ。本パネルは、操作された抗ＣＴＬＡ４抗体の還元リシルエンドペプチダーゼ消化由来の鎖Ａペプチド（図２１、パネルＣに示す）のＭＳ解析を示す。パネルＣ。本パネルは、操作された抗ＣＴＬＡ４抗体の還元リシルエンドペプチダーゼ消化由来の鎖Ｂペプチド（図２１、パネルＣに示す）のＭＳ解析を示す。
図２３は、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４ ＭａｂＰａｉｒの質量分析解析を示す。これらの実験は、実施例７に記載されている。示されている通り、ｘ軸は、原子質量単位（ａｍｕ）のデコンボリューションされた質量を示し、ｙ軸は、所与の質量におけるタンパク質の分量を反映するカウントを示す。パネルＡ。本パネルは、実施例７に記載されている操作されたＩｇＧ２および無変更のＩｇＧ４抗体をコードするＤＮＡがトランスフェクトされた細胞によって産生された脱グリコシル抗体の質量分析解析を示す。パネルＢ。本パネルは、実施例７に記載されている操作されたＩｇＧ２および無変更のＩｇＧ４抗体をコードするＤＮＡがトランスフェクトされた細胞によって産生された抗体から生成されたＦａｂ’断片の質量分析解析を示す。
図２４は、抗体混合物の抗ＰＤ１効力を示す。本実験は、実施例８に記載されている。様々な曲線によって表される試料が示されている。横軸は、抗ＰＤ１抗体濃度の対数を示す。抗体混合物の場合、この量は、実施例７で行われる抗体濃度決定に基づいた。縦軸は、相対的ルミネセンス単位の平均±平均の標準誤差を示す（ＲＬＵ±ＳＥＭ）。
図２５は、抗体混合物の抗ＣＴＬＡ４効力を示す。本実験は、実施例９に記載されている。様々な曲線によって表される試料が示されている。横軸および縦軸は、横軸が、抗ＰＤ１抗体濃度の対数ではなく、抗ＣＴＬＡ４抗体濃度の対数を表すことを除いて、図１６と同様に命名されている。
図２６は、抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ１ ＭａｂＰａｉｒにおける抗ＣＴＬＡ４抗体の効力を示す。手順は、実施例１０に記載されている。ｘ軸は、各アッセイで使用した抗ＣＴＬＡ４抗体の濃度を示し、ｙ軸は、ＲＬＵ±ＳＥＭを示す。記号および線は、グラフの左上隅にある説明文に示され、実施例１０に説明されている通りの試料を同定する。右下隅にある単一の黒丸は、無関係のヒトＩｇＧ１抗体由来のデータを表す。
図２７は、乳がん細胞生存度に対する抗ＨＥＲ２抗体混合物の効果を示す。本実験は、実施例１１に記載されている。実験において試料として使用した抗体および抗体混合物は、次の通りに示されている。ＩｇＧ１、対照ＩｇＧ１／κＬＣ抗体；４Ｄ５−８、抗ＨＥＲ抗体４Ｄ５−８；２Ｃ４、抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４；２Ｃ４＋４Ｄ５−８、２種の抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８および２Ｃ４の混合物；ならびに１４Ｄ、１５Ｃ、１３Ｄ、１４Ｃおよび１５Ｄ、表２０に記載されている抗ＨＥＲ２抗体混合物。縦軸は、ＲＬＵ±ＳＥＭを示す。横軸は、ナノモル／リットル（ｎＭ）単位で、試料における抗体または抗体混合物の濃度を示す。示されている通り、上および下パネルは、それぞれＢＴ−４７４細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞を使用した試料由来のデータを含有する。
配列表の簡単な説明
配列表の参照
本願は、２０１７年４月２１日に作成された６４キロバイト（ＫＢ）のサイズを有するＳＢ００１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという標題のファイルにおいて、電子的に提出された配列表を含み、これを参照により本明細書に組み込む。
詳細な説明
本明細書では、抗体の混合物、および限定的な数の、任意選択で２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下の主要種の抗体を含む抗体の混合物を、異なる結合特異性を有する少なくとも２つの異なる抗体、任意選択で全長霊長類ＩｇＧ抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトした宿主細胞、任意選択で単一の宿主細胞株に由来する細胞から産生するための方法が記載されている。一部の実施形態では、少なくとも２つの異なる重鎖（ＨＣ）および少なくとも２つの異なる軽鎖（ＬＣ）をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入することができる。一部の実施形態では、宿主細胞には、異なる結合特異性を有する、少なくとも２つの、しかしながら４つ以下の異なる抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトすることができる。一部の実施形態では、少なくとも２つの、しかしながら４つ以下の異なるＨＣ、および少なくとも２つの、しかしながら４つ以下の異なるＬＣをコードするＤＮＡを、宿主細胞に導入することができる。一部の実施形態では、ＨＣおよびＬＣをコードするトランスフェクトされたＤＮＡの配列はすべて、抗体のアミノ酸配列が、非同族ＨＣ／ＬＣ対合が不利になり、同族ＨＣ／ＬＣ対合が高度に有利になるように変更されるように変異されていてもよい。図１および２を参照。２つの異なるＨＣが宿主細胞に導入される場合、任意選択で、２つの異なるＨＣの一方または両方は、ヘテロダイマー形成が不利になるように変更されていてもよい。一部の実施形態では、１つの重鎖のみが、ヘテロダイマー形成を起こさないように変更されている。２つの異なる抗体のみをコードするＤＮＡが宿主細胞に導入される一部の実施形態では、ＤＮＡによりコードされる抗体の一方のみが、同族ＨＣ／ＬＣ対合が有利になるように１つまたは複数のパートナー指向性変更を含み、他方の抗体は、そのような変更を含まない。図３を参照。また、そのような実施形態では、この変更された抗体は、へテロダイマー形成に不利な１つまたは複数の変更を含んでもよい。図３を参照。一部の実施形態では、抗体の一方は、ヘテロダイマー形成に不利な変更も同族ＨＣ／ＬＣ対合に有利な変更も含まない。図３を参照。一部のさらなる実施形態では、２つの抗体の一方のみが、１つまたは複数のパートナー指向性変更を含み、２つの抗体の一方のみが、ヘテロダイマー形成に不利な１つまたは複数の変更を含む。そのような実施形態では、パートナー指向性変更を含む抗体は、ヘテロダイマー形成に不利な変更を含まなくてもよく、その逆でもよい。あるいは、一方の抗体は変更されなくてもよく、他方は、１つまたは複数のパートナー指向性変更およびヘテロダイマー形成に不利な１つまたは複数の変更を含んでもよい。一部の実施形態では、各ＨＣが主にその同族ＬＣと対合されている２つの主要抗体種のみが宿主細胞により産生され、抗体のほとんどが、同じアミノ酸配列を有する２つの重鎖および同じアミノ酸配列を有する２つの軽鎖を含むテトラマーである（本明細書では「ＭａｂＰａｉｒ」と呼ばれる）。図１および３を参照。他の実施形態では、宿主細胞は、３つの異なる主要種の抗体、つまり、各々が同じアミノ酸配列を有する２つのＨＣおよび同じアミノ酸配列を有する２つのＬＣを含む２つの異なる単一特異性抗体＋２つの異なるＨＣおよび２つの異なるＬＣを含む機能的二重特異性抗体を産生する（本明細書では、抗体の「３イン１混合物」と呼ばれる）。図２および３を参照。本明細書には、以下のものが記載されている：（１）限定的な数の主要種を含む抗体の混合物を、宿主細胞、任意選択で宿主細胞株中で産生するための方法、（２）同族ＨＣ／ＬＣ対合を容易にする変更、および一部の実施形態では、ヘテロダイマーＨＣ／ＨＣ対の形成に不利な変更を含む抗体および抗体の混合物、（３）本明細書に記載のように変更された少なくとも２つの異なるＨＣおよび２つの異なるＬＣをコードするＤＮＡをトランスフェクトした宿主細胞および／または宿主細胞株、（４）１つまたは複数のベクター上にあってもよい、そのような抗体および混合物をコードする核酸、例えばＤＮＡ、ならびに（５）そのような抗体、抗体の混合物、および／またはそれらをコードする核酸を使用する治療方法。
定義
抗体の「３イン１混合物」は、本明細書で意図されている場合、２つの異なるＩｇＧ抗体をコードするＤＮＡが導入されている宿主細胞株中で産生された抗体の混合物を指す。３イン１混合物は、３つの異なる主要種の抗体、すなわち、２つの異なるＩｇＧ抗体＋２つのＩｇＧ抗体の各々に由来する同族ＨＣ／ＬＣ対を含む二重特異性抗体を含む。３イン１混合物は、異なる抗体をコードする異なるＤＮＡが別々に導入されている宿主細胞の別々の集団により産生される抗体の混合物を指すものではない。
「ヘテロダイマーに不利な変更」は、本明細書で意図されている場合、抗体のＣＨ３ドメインアミノ酸配列内の、任意選択でヒト、ヒト化、または霊長類ＣＨ３ドメインアミノ酸配列内の単一アミノ酸の置換、挿入、または欠失であって、抗体の混合物の状況においてヘテロダイマーの形成に不利な置換、挿入、または欠失である。抗体は、ヘテロダイマーに不利な１つよりも多くの変更を含むことができ、ヘテロダイマーに不利な複数の変更は、抗体の混合物中の１つまたは複数の抗体の複数の部位に行われてもよい。ヘテロダイマー形成に不利な単一の変更は、「ヘテロダイマーに不利な変更」とみなされるためには、１つまたは複数の他の変更と対合した際に部分的に有効および／または有効である限り、ヘテロダイマーの排除に完全に有効である必要はなく、またはそれ自体で有効である必要はない。変更としては、野生型配列に存在する残基の荷電残基による置換を挙げることができる。あるいは、置換は、別の「隆起部」に隣接する「隆起部」などの、適切なＨＣ／ＨＣ対合に対する立体的障害を生成してもよい。隆起部またはノブ（ｋｎｏｂ）は、米国特許第８，６７９，７８５号の第１２欄１２行目〜第１３欄２行目に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。１つまたは複数の変更が、ＨＣ／ＨＣヘテロダイマー形成に影響を及ぼすか否かは、実施例４に記載されている方法により決定することができる。そのような実験のデータは、図１１〜１４に示されている。ヘテロダイマーに不利な変更は、「ドメイン界面残基」に行われている。ドメイン界面残基は、米国特許第８，５９２，５６２号の表１および関連する本文で考察されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。そのようなドメイン界面残基は、物理的に接近していると予測される場合、つまり、公知の構造モデルにおいて、２つのアミノ酸のアルファ炭素（Ｃα、つまりアミノ酸のアミノ部分とカルボキシル部分との間にある炭素）間が最大で１２オングストローム（Å）であるか、または一方のアミノ酸の側鎖重原子（水素以外の任意の原子）と他方のアミノ酸の任意の重原子との間が最大で５．５Åである場合、「接触」残基であると言われるか、または互いに「接触している」と言われる。そのような構造は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏにて利用可能）から、またはＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（ＩＭＧＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇにて利用可能）から、オンラインで利用可能である。下記の表４には、ヒトＩｇＧ抗体のＣＨ３／ＣＨ３界面にある接触残基の例が列挙されている。
ヘテロダイマーに不利な変更の例としては、任意選択で、４０９Ｒを含む別のＩｇＧ抗体を含む抗体の混合物の状況では、例えば、霊長類および／またはヒト化ＩｇＧ重鎖のＤ３９９Ｋ／Ｒ＋Ｋ／Ｒ４０９Ｄ／Ｅが挙げられる。下記の表８に示されているように、ヒトＩｇＧ４抗体は、４０９位にアルギニン（Ｒ）を有するが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３抗体は、４０９位にリシン（Ｋ）を有する。特に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３抗体が変更Ｋ４０９Ｒを含む場合、この変更は、ヒトＩｇＧ４ ＨＣの４０９位に天然のＲが存在するため、本明細書で意図されているような「ヘテロダイマーに不利な変更」であるとはみなされない（これは、上記の定義の例外である）。
ＨＣまたはＬＣアミノ酸配列内の「アミノ酸」、「アミノ酸残基」、「残基」、または「位置」は、表５〜１１に示されているようにナンバリングされている位置のアミノ酸を指す。したがって、例えば、２つの異なるＨＣアミノ酸配列が、その２つのＨＣアミノ酸配列の特定の位置に同じまたは異なるアミノ酸を有することは可能である。さらに、「ＨＣ位置」、「ＨＣ残基」、「ＬＣ位置」、または「ＬＣ残基」は、表５〜１１に示されているようにナンバリングされている任意のＨＣまたはＬＣアミノ酸配列における位置のアミノ酸を指す。
「抗体」は、本明細書で意図されている場合、少なくとも１つの重鎖可変（ＶＨ）ドメインまたは軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含むタンパク質である。抗体は、ＶＨおよびＶＬドメインを両方とも含むことが多い。ＶＨおよびＶＬドメインは、例えば、Ｋａｂａｔら、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１−３２４２、１９９１年、ｘｖｉ〜ｘｉｘ頁および１０３〜５３３頁に全詳細が記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。「抗体」としては、抗体の他の考え得る形式の中でも、単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ、これはリンカーにより連結されているＶＨおよびＶＬ領域を含む）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ：Ｆｃ抗体（ＣａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓおよびＣａｐｒａ、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第３版、Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３年の第９章、２８４〜２８６頁に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる）、様々な形式のいずれかの二重特異性抗体および一価抗体、ならびに下記で定義されているような全長ＩｇＧ抗体などの、異なる形式を有する分子が挙げられる。
「二重特異性抗体」は、本明細書で意図されている場合、１つの標的分子に存在してもよく、または２つの別々の標的分子に存在してもよい２つの異なるエピトープに結合する。二重特異性抗体は、全長抗体、ＩｇＧ抗体、または異なる形式を有する抗体であってもよい。
「二価抗体」は、本明細書で意図されている場合、同一であってもよくまたは異なっていてもよい、１つの標的分子に存在してもよく、または２つの別々の標的分子に存在してもよい２つのエピトープに同時に結合することができる。
アミノ酸の「電荷対」は、本明細書で意図されている場合、本明細書で定義されている「接触」アミノ酸残基での逆に荷電したアミノ酸の対である。そのような荷電アミノ酸は、同じポリペプチド鎖に存在してもよく、または異なるポリペプチド鎖に存在してもよい。
「荷電」アミノ酸は、本明細書で意図されている場合、生理学的ｐＨ付近で電荷を有することができる酸性または塩基性のアミノ酸である。それらとしては、生理学的ｐＨで負に荷電される酸性アミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）、ならびに生理学的ｐＨで正に荷電される塩基性アミノ酸であるアルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）が挙げられる。弱塩基性アミノ酸であるヒスチジンは、生理学的ｐＨ付近で部分的に荷電される場合があるが、本明細書では「荷電」アミノ酸の定義内に入らない。混乱を回避するために、正電荷は、本明細書で意図されている場合、負電荷の「逆」であるとみなされる。したがって、例えば、アミノ酸残基ＥおよびＲは、電荷が逆である。
抗体の混合物の状況における「同族」ＨＣは、本明細書で意図されている場合、特定のＬＣがそれと対合して特定の抗原に対する結合部位を形成することが公知のＨＣである。例えば、公知の全長抗体Ｘが抗原Ｘに結合する場合、抗体Ｘ ＨＣは、抗体Ｘを含む抗体の混合物の状況では、数ある抗体の中でも特に、抗体Ｘ ＬＣの同族ＨＣであり、その逆の場合も同じである。さらに、混合物が抗体Ｙも含んでいる場合、抗体Ｙ ＨＣは、抗体Ｘ ＬＣに関して「非同族」であり、その逆の場合も同じである。
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、ＶＨまたはＶＬドメイン内の超可変領域である。各ＶＨおよびＶＬドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲを含む。ＣＤＲは、抗体の表面にループを形成し、抗体の結合特異性を決定する主な要因である。ＣＤＲは、４つのより保存されたフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と呼ばれる）間に、以下のように散在している：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。ＶＨおよびＶＬにおけるＣＤＲの位置は、それぞれ表５および９に示されている。Ｋａｂａｔらは、ＶＨ ＣＤＲの位置を以下のように特定している：ＣＤＲ１は、３１〜３５位に存在し（３５Ａおよび３５Ｂとナンバリングされている挿入を有する場合がある）、ＣＤＲ２は、５０〜６５位に存在し（５２Ａ〜５２Ｃとナンバリングされている挿入を有する場合がある）、ＣＤＲ３は、９５〜１０２位に存在する（１００Ａ〜１００Ｋとナンバリングされている挿入を有する場合がある）。Ｋａｂａｔら、上記、ｘｖｉｉ頁。Ｋａｂａｔらは、ＶＬ ＣＤＲの位置を以下のように特定している：ＣＤＲ１は、２４〜３４位に存在し（２７Ａ〜２７Ｆとナンバリングされている挿入を有する場合がある）、ＣＤＲ２は、５０〜５６位に存在し、ＣＤＲ３は、８９〜９７位に存在する（９５Ａ〜９５Ｆとナンバリングされている挿入を有する場合がある）。
「システイン置換」は、本明細書で意図されている場合、任意の他のアミノ酸がシステインに置換される、タンパク質のアミノ酸置換を指す。
２つまたはそれよりも多くの関連配列内のアミノ酸変更は、本明細書で意図されている場合、以下の場合に「異なる」：（１）変更が、同じである２つのアミノ酸配列内の、または同じクラス（例えば、ＶＨドメイン）に属し、保存されたアミノ酸により共通のナンバリングシステムにアラインメントすることができる２つのアミノ酸配列内の異なる部位で行われる場合、および／あるいは（２）変更が異なる場合、例えば、そうでなければ同じであるかもしくは同じクラスに属する２つのアミノ酸配列内の同じ部位で異なるアミノ酸が置換されている場合、または異なる数のアミノ酸および／もしくは異なるアミノ酸が、そうでなければ同じであるかもしくは同じクラスに属する２つのアミノ酸配列に挿入されているかもしくは欠失されている場合。もちろん、２つまたはそれよりも多くの無関連の配列におけるアミノ酸変更も、互いに「異なる」。２つまたはそれよりも多くの抗体は、本明細書で意図されている場合、抗体に含まれているすべてのポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、本明細書で意図されているように「同じ」でない場合、「異なる」。
２つまたはそれよりも多くのアミノ酸配列は、本明細書で意図されている場合、同じＤＮＡ配列によりコードすることができない場合、「異なる」。したがって、翻訳後修飾によってのみ異なるアミノ酸配列は、本明細書で意図されている場合、「異なる」とは言えない。
「Ｆｃ断片」は、本明細書で意図されている場合、ヒンジドメインの大部分またはすべて、ならびにＨＣに由来するＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。例えば、ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片のアミノ酸配列は、表８に示されている。
「全長抗体」は、本明細書で意図されている場合、（１）各々が少なくともＶＨドメイン、第１の重鎖定常（ＣＨ１）ドメイン、ヒンジドメイン、第２の重鎖定常（ＣＨ２）ドメイン、および第３の重鎖定常（ＣＨ３）ドメインを含む任意のアイソタイプの２つの重鎖、ならびに（２）各々がＶＬおよび軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含む、カッパ（κ）またはラムダ（λ）鎖のいずれであってもよい２つの軽鎖を含む。これらのドメインは、Ｋａｂａｔら、上記、ｘｖ〜ｘｉｘ頁および６４７〜６９９頁に詳細に記載されており、これらの頁は、参照により本明細書に組み込まれる。ＶＨおよびＶＬドメイン（下記の表５および９を参照）には、Ｋａｂａｔら、上記のナンバリングシステムが使用されており、ＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインには、ＥＵシステム（Ｅｄｅｌｍａｎら（１９６９年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６３巻：７８〜８５頁。この文献は、その全体が本明細書に組み込まれる）が使用されている。表６〜８、１０、および１１を参照。
「重鎖（ＨＣ）」は、本明細書で意図されている場合、少なくともＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む。また、これらドメインをすべて含むＨＣは、「全長ＨＣ」と呼ぶことができる。ＩｇＡまたはＩｇＭなどの幾つかのアイソタイプは、ＩｇＭ ＣＨ４ドメインなどの追加の配列を含む場合がある。ＶＨドメイン（下記の表５を参照）には、Ｋａｂａｔら、上記のナンバリングシステムが使用されており、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインには、ＥＵシステム（Ｅｄｅｌｍａｎら（１９６９年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６３巻：７８〜８５頁。この文献は、その全体が本明細書に組み込まれる）が使用されている。下記の表５〜８には、ＨＣアミノ酸配列のより具体的な全体像が提供されている。
表５は、Ｋａｂａｔら（上記）のヒトＶＨアミノ酸配列（Ｉ〜ＩＩＩ）に基づき保存されているアミノ酸を示す。ナンバリングは、Ｋａｂａｔら、上記によるものである。ＣＤＲ内の部位番号は、太字イタリック体で書かれている。それらの後にある文字付き位置番号、例えば、１００Ａは、ＣＤＲの長さが様々であるため、アミノ酸により占められている場合もあり、占められていない場合もある。特定の位置にある単一の太字のアミノ酸は、Ｋａｂａｔら（上記）により記載されているように、３つすべてのクラスのヒトＶＨドメインにおける「不変」アミノ酸を示す。所与の位置におけるアミノ酸が、最も一般的には１つのアミノ酸または２つのアミノ酸のいずれかである目的の部位では、そうしたアミノ酸は、通常の字体で示されている。下線を引いた太字の部位番号は、本明細書で変更すると記載されている位置を示す。アミノ酸が指定されていない位置は、上述の基準を満たさなかった。
表５は、目視による、保存されたアミノ酸が上に示されているように間隔が置かれている任意のＶＨ配列のアラインメントを可能にすることになる多数の保存されたアミノ酸が存在することを示す。あるいは、新規配列を、アラインメントソフトウェア、例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）で利用可能なアラインメントソフトウェア（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇにて利用可能なＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ、またはＣＬＵＳＴＡＬ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓら、（２０１１年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７巻（１号）：５３９頁）を使用して、公知のＶＨ配列とアラインメントすることができる。
下記の表６は、ＣＨ１ドメインのコンセンサスアミノ酸配列を示す。
表６：ナンバリングは、Ｅｄｅｌｍａｎら（上記）によるナンバリングである。番号の下にある太字で示されている単一のアミノ酸は、様々な種に由来するＣＨ１ドメインのアラインメントの、Ｋａｂａｔら（上記）による「不変」残基である。本明細書での変更のために選択された部位（１３１、１３３、１４７、１６８、１７０、１７３、１７６、１８１、および１８３）は、下線を引いた太字で示されている。これら部位では、Ｋａｂａｔら（上記）に報告されている６３個の霊長類ＣＨ１配列で最も一般的な１つまたは２つのアミノ酸は、通常の字体で示されている。アミノ酸が指定されていない位置は、「不変」でなく、変更のためには選択しなかった。
下記の表７は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４アイソタイプのアラインメントヒトＣＨ１ドメインを示す。このアラインメントは、こうした密接に関連するＣＨ１ドメイン間の配列が非常に強く保存されていることを強調する。
表７：それぞれ受託番号Ｊ００２２８、Ｊ００２３０、Ｘ０３６０４、およびＫ０１３１６のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４抗体の代表的なＣＨ１ドメインのアミノ酸配列を、ＩＭＧＴウェブページから取得し、ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェアでアラインメントした。残基は、Ｅｄｅｌｍａｎら、上記のＥＵシステムに従ってナンバリングされている。Ｋａｂａｔら、上記による「不変」残基は、太字で示されている。これら残基は高度に保存されているが、完全に不変ではない。下線が引かれており、太字のイタリック体の残基は、置換がなされた部位であり、下記の実施例に報告されているように試験される。
下記の表８は、４つのヒトＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のアラインメントを示す。このアラインメントは、これらサブクラス間の差異、ならびに高度な配列保存を示す。
１つまたは複数のタンパク質をコードするＤＮＡが導入されている「宿主細胞株」は、例えばトランスフェクションによるＤＮＡの導入後の単一細胞に由来する細胞株を指す。ＤＮＡ導入後のそのようなクローン細胞株を単離するための方法は、当技術分野で周知であり、特定の試料中に１つの細胞しか存在しないことを視覚的に決定することを含んでもよい他の考え得る方法の中でも、限界希釈法が挙げられる。例えば、Ｗｅｗｅｔｚｅｒ（１９９５年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １７９巻（１号）：７１〜７６頁、ＵｎｄｅｒｗｏｏｄおよびＢｅａｎ（１９８８年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．１０７巻（１号）：１１９〜１２８頁を参照。
「ヒト」ヌクレオチドまたはアミノ酸配列または核酸またはタンパク質としては、ヒトに天然で生じるものが挙げられる。多数のヒトヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、例えばＫａｂａｔら、上記に報告されており、この文献には、当技術分野における単語「ヒト」の使用が例示されている。「ヒト」アミノ酸配列またはタンパク質は、本明細書で意図されている場合、「ヒト」アミノ酸配列またはタンパク質が、１００個のアミノ酸当たり１０個よりも多くの、単一アミノ酸の挿入、欠失、および／または置換を含まない限り、天然配列に対して１つまたは複数の挿入、欠失、または置換を含んでもよい。同様に、ヒト核酸（例えば、ＤＮＡ）またはヌクレオチド配列は、３００個のヌクレオチド当たり３０個よりも多くの、単一ヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換を含まない。ＶＨまたはＶＬ配列の特定の場合では、ＣＤＲは、非常に可変であることが予想され、特定のＶＨまたはＶＬアミノ酸配列（またはそれをコードするヌクレオチド配列）が「ヒト」配列であるか否かを決定するためには、ＣＤＲ（またはそれらをコードするヌクレオチド）を、配列の一部とはみなさない。
抗体もしくは抗体ドメインをコードする「ヒト化」ヌクレオチド配列、または抗体もしくは抗体ドメインの「ヒト化」アミノ酸配列は、本明細書で意図されている場合、非ヒト生物に由来するが、抗体の所望の特性、例えば、多数の考え得る所望の特性の中でも、ある特定の抗原とある特定のアビディティで結合することを犠牲にせずに、ヒト配列とできるだけ類似するように操作された配列である。ヒト化のプロセスは、一般的に、定常ドメインをすべて、ヒト定常ドメインに変化させることを含む。可変ドメインでは、元のＣＤＲを使用して、元の可変ドメインにできるだけ類似したヒト抗体配列のＣＤＲを置き換えることができる（このプロセスは、ＣＤＲ移植と呼ばれることが多い）。しかしながら、フレームワーク領域における１つまたは複数の変化も必要とされる場合がある。したがって、ヒト化抗体のアミノ酸配列は、直ぐ上の「ヒト」の定義以内に入る場合もあり、または入らない場合もある。このプロセスは、例えば、ＺｈａｎｇおよびＨｏ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ６巻：３３８７８頁；ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓｒｅｐ３３８７８（２０１６年）ならびにＭｉｅｔｈｅら、ＰＬＯＳ Ｏｎｅ；ｄｏｉ： １０．１３７／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１６１４４６（２０１６年）（ともに参考として本明細書に援用される）に記載されている。
「ＩｇＧ抗体」は、本明細書で意図されている場合、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４アイソタイプサブクラスのヒト、ヒト化、および霊長類抗体を含む、ＩｇＧアイソタイプの、本明細書で定義されているような全長抗体を指す。
用語「アイソタイプ」は、本明細書で意図されている場合、抗体の重鎖定常領域、つまりＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＥクラスのものであるか否か、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４などのそれらのサブクラスのものであるか否かを指す。そのようなアイソタイプは、当技術分野で公知であり、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、第５版、セクション４−１５〜４−１９、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１年（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ２７１０６／にて利用可能）に詳細に記載および説明されている。
「軽鎖（ＬＣ）」は、本明細書で意図されている場合、ＶＬドメイン、およびカッパ（ＣＬκ）またはラムダ（ＣＬλ）ドメインであってもよい軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含む。これらドメインは、それらの例示的なアミノ酸配列と共に、Ｋａｂａｔら、上記、ｘｉｉｉ〜ｌｉｘ頁、１０３〜３０９頁、および６４７〜６６０頁に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。軽鎖について本明細書で使用されているナンバリングシステムは、下記の表９〜１１に例示されているように、ＶＬドメインの場合は、Ｋａｂａｔら、上記に記載されているものであり、ＣＬドメインの場合は、Ｅｄｅｌｍａｎら、上記に記載されているものである。
表９：ナンバリングは、Ｋａｂａｔら（上記）によるものである。太字イタリック体の番号は、ＣＤＲの位置を示す。それらの後にある文字付きの位置番号、例えば２７Ａは、ＣＤＲの長さが様々であるため、アミノ酸により占められている場合もあり、占められていない場合もある。Ｋａｂａｔら（上記）のすべてのヒト軽鎖の不変残基は、太字の文字で示されており、その位置にアミノ酸が見出されることを示す。選択された部位では、その部位に見出される１〜３つの最も一般的なアミノ酸が、通常の字体で示されている。加えて、多数の他のアミノ酸は、カッパまたはラムダＶＬドメインの一部のサブグループ内で不変であるか、または高度に保存されており、それにより、特定のアミノ酸配列をＶＬドメインに分類することを補助し得る。下記の実施例に報告されている、本明細書中で変更のために選択された部位は、太字かつ下線を引いた字体により示されている。アミノ酸が指定されていないか、および／または番号が太字かつ下線を引いた字体で示されていない位置は、上述の基準を満たさない。
表１０：ナンバリングはＥｄｅｌｍａｎら（上記）によるものであり、ＣＬドメインのＫａｂａｔら（上記）のナンバリングと同じである。番号の下にある太字で示されているアミノ酸は、様々な種に由来するカッパおよびラムダＣＬドメインの両方のアラインメントのＫａｂａｔら（上記）による「不変」残基である。選択された部位（１３１、１６０、１６２、１７４、１７６、および１７８）に示されているように、Ｋａｂａｔら（上記）に報告されている１０個のヒトカッパ鎖（上段）および２８個のヒトラムダ鎖（下段）に保存されているアミノ酸は、通常の字体で示されている。２つの異なるアミノ酸のいずれかが、これら部位の１つに見出される場合、例えばＡ／Ｍのように、より一般的なアミノ酸が、より一般的でないものの前に示されている。太字かつ下線を引いた番号は、下記の実施例で報告されているように変更された部位を示す。加えて、多数の他のアミノ酸は、ＣＬκまたはＣＬλドメインの一部のサブグループ内で不変であるか、または高度に保存されており、それにより、特定のアミノ酸配列をＣＬドメインに分類することを補助し得る。アミノ酸が指定されていないか、および／または番号が太字かつ下線を引いた字体で示されていない位置は、上述の基準を満たさない。
表１１：この表のヒトＣＬκドメインのアミノ酸配列は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ）ウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）からのものである。各配列の受託番号は、配列の左側に示されており、配列は、ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／にて利用可能）でアラインメントした。ナンバリングは、Ｅｄｅｌｍａｎら、上記によるものである。太字の残基は、Ｋａｂａｔら、上記による不変残基である。下記の実施例に報告されているように、置換がなされ、得られた抗体が試験された不変部位は、太字かつ下線を引いたアミノ酸により示されている。太字、イタリック、および下線を引いた残基は、下記の実施例に報告されているように、置換がなされ、得られた抗体が試験された他の部位である。
「ＬＣパートナー指向性変更」は、本明細書で意図されている場合、ＶＨまたはＣＨ１アミノ酸配列内のＨＣ／ＬＣ界面での単一アミノ酸の置換、挿入、または欠失であり、任意選択で、変更されたＶＨおよび／またはＣＨ１アミノ酸配列を含むＨＣ、任意選択でヒト、ヒト化、および／または霊長類ＩｇＧ ＨＣが、ＬＣ、任意選択で接触アミノ酸残基に「ＨＣパートナー指向性変更」を含むものにより強力に会合することを引き起こす、天然アミノ酸の荷電アミノ酸またはシステインによる置換である。
同様に、「ＨＣパートナー指向性変更」は、ＶＬまたはＣＬアミノ酸配列内のＨＣ／ＬＣ界面での単一アミノ酸の置換、挿入、または欠失であり、任意選択で、変更されたＶＬまたはＣＬアミノ酸配列を含むＬＣ、任意選択でヒト、ヒト化、および／または霊長類カッパまたはラムダＬＣが、ＨＣ、任意選択で接触アミノ酸残基にＬＣパートナー指向性変更を含むものにより強力に会合することを引き起こす、天然アミノ酸の荷電アミノ酸またはシステインによる置換である。一部の実施形態では、ＨＣパートナー指向性変更およびＬＣパートナー指向性変更の接触対は、上記で定義されている「電荷対」を形成する、逆電荷を有する荷電アミノ酸の置換であってもよい。他の実施形態では、ＨＣまたはＬＣの接触部位の１つに荷電アミノ酸が既に存在し、その結果、同族ＨＣ／ＬＣ対の形成に有利な電荷対を生成するのに、一方の鎖のみの変更しか必要とされない。他の実施形態では、同族ＨＣ／ＬＣ対間にジスルフィド架橋を形成することができるように、システイン残基を接触部位に導入することができる。さらなる実施形態では、ＨＣパートナー指向性変更およびＬＣパートナー指向性変更は、米国特許第８，６７９，７８５号に記載のように、ノブおよびホール（または隆起部および腔）を接触残基に生成する置換または既存のアミノ酸であってもよく、この文献の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。ＨＣは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥアイソタイプのものであってもよく、任意選択で、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のものであってもよい。ＨＣパートナー指向性変更およびＬＣパートナー指向性変更は、ＨＣ／ＬＣ界面の一部を形成する接触アミノ酸位置に行われる。ＣＬおよびＣＨ１ドメインの界面残基としては、米国特許第８，５９２，５６２号の表４および５ならびに第１０欄および第１１欄の関連する本文に説明されているように、４．５Å内にあるものが挙げられ、これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＨ１およびＣＬドメインの接触残基は、下記の表１２に列挙されている。
ＶＨおよびＶＬドメイン間の界面にある接触残基の場合、変更に好適な残基の対、ＶＨに１つおよびＶＬドメインに１つを、以下の基準を使用して選択した：（１）残基が、全長抗体の三次構造に埋没しているかまたは部分的に埋没していること、つまり接近不能であること、（２）残基が、空間的に接近していること、すなわち、公知の構造モデルにおいて、２つのアミノ酸のＣαが約１２Å以内にあるか、または一方のアミノ酸の側鎖重原子（水素以外の任意の原子）と、他方のアミノ酸の任意の重原子との間が最大で５．５Åであること、（３）残基が、高度に保存されているが、完全に不変である必要はないこと、および（４）残基が、相補性決定領域（ＣＤＲ）内に存在しないかまたはそれと相互作用しないこと。そのような接触残基の例としては、限定ではないが、以下のものが挙げられる：４４位（ＶＨ）および１００位（ＶＬ）；３９位（ＶＨ）および３８位（ＶＬ）；ならびに１０５位（ＶＨ）および４３位（ＶＬ）。ＨＣパートナー指向性変更および／またはＬＣパートナー指向性変更によるＨＣ／ＬＣ会合の強さの変化は、少なくとも２つの異なる抗体をコードするＤＮＡが導入されている宿主細胞中の種々の抗体種の相対量を決定することにより測定することができる。実施例５および６に詳細に説明されており、図１８、２０、および２３、パネルＢに示されているように、異なるＨＣ／ＬＣ対合を有する抗体から生じるＦａｂ断片間のサイズ差は、通常、質量分析法（ＭＳ）により区別することができる。種々の抗体種を特定するためのＭＳの使用は、例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２０１４年）、ｍＡｂｓ ６巻：１号、１９７〜２０３頁で考察されており、この文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。多数の異なるバリアントを迅速にスクリーニングするため、特に、予想されるＦａｂ断片のサイズが本質的に同一であるか、または予想されるＦａｂ断片がＭＳ結果に出現せず、したがってパパインに対して固有に感受性である可能性がある場合、実施例３に記載されており、図７〜１０に示されているような鎖ドロップアウト実験を実施した。ＬＣパートナー指向性変更およびＨＣパートナー指向性変更の接触対の例としては、限定ではないが、以下のものが挙げられる：ＨＣのＫ１４７Ｄ／ＥおよびＬＣのＳ１３１Ｒ；ならびにＨＣのＨ１６８Ｄ／ＥおよびＬＣのＳ１７４Ｒ。こうした例により例示されているように、ＬＣパートナー指向性変更およびＨＣパートナー指向性変更の「接触」対は、電荷が逆のアミノ酸を含んでもよい。多数の他の例が、以下の説明および実施例に開示されている。あるいは、ＬＣパートナー指向性変更およびＨＣパートナー指向性変更は、米国特許第８，６７９，７８５号に記載されているような「腔内の隆起部」型の変更であってもよい。こうした種類の変更が記載されているこの特許の部分、特に第１２欄１２行目〜第１４欄５行目は、参照により本明細書に組み込まれる。用語「パートナー指向性変更」は、ＨＣパートナー指向性変更および／またはＬＣパートナー指向性変更を指す。
「ＭａｂＰａｉｒ」は、本明細書で意図されている場合、２つのおよび２つ以下の主要種の抗体を含む抗体の混合物である。ＭａｂＰａｉｒは、２つの異なるＩｇＧ抗体、つまり２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖をコードするＤＮＡが導入されている宿主細胞株（上記で定義されているような）中で産生することができる。また、ＭａｂＰａｉｒは、ＤＮＡが導入された細胞からクローン宿主細胞株を精製しない場合、２つの異なるＩｇＧ抗体をコードするＤＮＡが導入されている細胞集団中で産生することができる。この種の状況の一例は、２つの異なるＩｇＧ抗体をコードするＤＮＡを、例えば２９３細胞またはＥｘｐｉＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトし、その後トランスフェクトした細胞の細胞上清から、細胞により産生された抗体を得ることを含んでもよい。１つよりも多くの宿主細胞株から産生される２つの抗体の混合物は、本明細書で意図されているＭａｂＰａｉｒではない。さらに、細胞の２つの別々の集団から産生された２つの抗体の混合物も、一方の抗体をコードするＤＮＡが一方の細胞集団に導入され、他方の抗体をコードするＤＮＡが、他方の細胞集団に導入されている場合、本明細書で意図されているＭａｂＰａｉｒではない。
抗体の混合物の状況における「主要種」の抗体は、本明細書で意図されている場合、混合物内の抗体の合計量の少なくとも１０％を占める特定の抗体種である。幾つの主要種が抗体の混合物に存在するかを決定するために、実施例５に記載されており、図１７に示されているような低ｐＨ ＣＥＸクロマトグラフィーを実施することができる。抗体混合物中の各種が構成する抗体の合計量のパーセントは、カラム流出物の吸光度のピーク下面積を使用して決定することができる。
抗体の混合物内の「少量種」の抗体は、本明細書で意図されている場合、抗体混合物中の抗体の合計量の１０％未満を構成する。これは、「主要種」の定義に記載されているように、低ｐＨ ＣＥＸクロマトグラフィーにより決定することができる。
「霊長類」ヌクレオチドまたはアミノ酸配列または核酸またはタンパク質は、霊長類に天然で生じる分子および配列を含む。霊長類としては、限定ではないが、原猿（キツネザルを含む）、新世界サル、チンパンジー、ヒト、ゴリラ、オランウータン、テナガザル、および旧世界サルを含む幾つかの科の動物が挙げられる。具体的な霊長類種としては、限定ではないが、とりわけ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）、およびＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）が挙げられる。多数の霊長類ヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、当技術分野で公知であり、例えば、それらは、例えばＫａｂａｔら、上記に報告されている。一般的に、「霊長類」アミノ酸配列は、本明細書で意図されている場合、「霊長類」アミノ酸配列が、１００個のアミノ酸当たり１０個よりも多くの単一アミノ酸の挿入、欠失、および／または置換を含まない限り、天然の霊長類配列に対して１つまたは複数の挿入、欠失、または置換を含むことができる。同様に、霊長類ヌクレオチド配列は、天然の霊長類配列に対する挿入、欠失、または置換を含むことができるが、３００個のヌクレオチド当たり３０個よりも多くの単一ヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換を含まない。ＶＨまたはＶＬ配列の特定の場合では、ＣＤＲは、非常に可変であることが予想され、特定のＶＨまたはＶＬアミノ酸配列（またはそれをコードするヌクレオチド配列）が「霊長類」配列であるか否かを決定するためには、ＣＤＲ（またはそれらをコードするヌクレオチド）を、配列の一部とはみなさない。
本明細書で意図されている場合、２つのアミノ酸配列は、２つの配列が、同じＤＮＡ配列によりコードすることができる場合、「同じ」である。すなわち、翻訳後修飾、例えばカルボキシル末端リシンの除去またはＮ末端グルタミン酸もしくはグルタミン残基の環化の結果としてのみ異なるアミノ酸配列は、本明細書で意図されている場合、「同じ」である。
「標的分子」は、本明細書で意図されている場合、抗体、例えば本明細書に記載の混合物中の抗体が特異的に結合する分子である。一部の実施形態では、標的分子は、「標的タンパク質」、つまり抗体が特異的に結合するタンパク質である。
抗体の混合物およびそれらを産生する方法
本明細書では、抗体をコードするＤＮＡが導入されている宿主細胞中で産生され、異なる結合特異性を有する抗体の混合物が記載されている。抗体は、ヒト、ヒト化、および／または霊長類全長ＩｇＧ抗体であってもよい。また、そのような混合物を産生するための方法が記載されている。混合物中の異なる主要種の抗体の数は、限定されていてもよく、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下の主要種であってもよい。抗体の１つまたは複数のＨＣおよび／またはＬＣは、ＬＣパートナー指向性変更および／またはＨＣパートナー指向性変更を含んでもよい。一部の実施形態では、抗体の１つまたは複数のＨＣは、ヘテロダイマーに不利な１つまたは複数の変更を含んでもよい。一部の実施形態では、混合物中の１つまたは複数の主要種の抗体は、そのような変更を有しなくてもよい。こうした変更は、宿主細胞により産生される主要種の抗体の数を限定する役目を果たすことができる。
抗体の混合物を産生するための方法は、本明細書に記載の抗体の混合物をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入すること、宿主細胞を培養すること、および抗体の混合物を細胞塊または培養培地から回収することを含んでもよい。混合物中の異なる抗体をコードするＤＮＡは、同時にまたは異なる時点で宿主細胞に導入することができる。例えば、第２の抗体をコードするＤＮＡを、以前に宿主細胞集団に導入されたＤＮＡによりコードされている第１の抗体を既に産生している宿主細胞集団に導入することができる。あるいは、両抗体をコードするＤＮＡを、同時に宿主細胞に導入することができる。さらに、複数の抗体をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入した後、抗体を産生するクローン「宿主細胞株」（上記で定義されている）を、ＤＮＡが導入された細胞の集団から単離することができる。あるいは、抗体の混合物は、ＤＮＡが導入された宿主細胞集団により産生することができる。下記に詳細に説明されているように、抗体の変更は、宿主細胞により産生される主要種の抗体の数を限定することができる。混合物は、宿主細胞培養上清または細胞塊から得ることができ、さらに精製することができ、医薬品としての使用に適切なように製剤化することができる。
より詳しくは、異なるエピトープおよび／または標的に結合する少なくとも２つ、３つ、または４つの異なる抗体、任意選択で全長ＩｇＧ抗体をコードするＤＮＡを、宿主細胞に導入することができる。コードされている抗体は各々、同じアミノ酸配列を有する２つのＨＣおよび同じアミノ酸配列を有する２つのＬＣを含んでもよく、コードされている抗体の各々は、他のコードされている１つまたは複数の抗体のＨＣおよびＬＣとアミノ酸配列が異なるＨＣおよびＬＣを両方とも有してもよい。一部の実施形態では、抗体は、各々が同じアミノ酸配列を有する２つの重鎖および同じアミノ酸配列を有する２つの軽鎖を含む２つの全長抗体であってもよい。任意選択で、抗体は、霊長類および／またはヒトおよび／またはヒト化ＩｇＧ抗体である。一部の実施形態では、同族ＨＣ／ＬＣ対の接触部位にある少なくとも１対の逆に荷電した残基、つまり電荷対、またはシステイン残基（これら荷電残基またはシステインのうちの少なくとも１つは、変更に起因する）は、各抗体のＬＣとその同族ＨＣとの間の界面に見出すことができる。他の実施形態では、そのような電荷対および／または接触システイン残基の対は、混合物中の抗体の１つまたは複数に見出すことができるが、混合物中のすべての抗体に存在する必要はない。そのような対を生成するＬＣおよびＨＣの変更は、それぞれＨＣパートナー指向性変更およびＬＣパートナー指向性変更と呼ばれる。各抗体は、ＬＣパートナー指向性変更および／もしくはＨＣパートナー指向性変更の複数の接触対を含んでもよく、またはＬＣパートナー指向性変更および／もしくはＨＣパートナー指向性変更の対を含まなくてもよい。任意選択で、ＣＨ３ドメインには、ヘテロダイマーＨＣ／ＨＣ対の形成に不利な追加の変更が存在してもよい。そのような変更は、抗体の１つまたは複数に存在してもよく、１つまたは複数の抗体には存在しなくてもよい。宿主細胞集団または宿主細胞株を培養することができ、抗体の混合物を、細胞塊および／または培養培地で回収することができる。抗体の混合物は、さらに精製することができ、混合物を、その薬学的使用に適切となるように製剤化することができる。
２つの全長抗体（Ａｂ１およびＡｂ２）のみをコードするＤＮＡが宿主細胞に導入され、各抗体が、存在するとしても少数の非同族ＨＣ／ＬＣ対しか形成されないように、１つまたは複数のＨＣパートナー指向性変更および／またはＬＣパートナー指向性変更を含む実施形態では、２つの（本明細書では「ＭａｂＰａｉｒ」と呼ばれる）または３つの（本明細書では「３イン１混合物」と呼ばれる）のいずれかの主要種の抗体を、宿主細胞により産生することができる。図１〜４を参照。ＨＣがヘテロダイマーＨＣ／ＨＣ対を形成することができる場合、Ａｂ１、Ａｂ２、ならびに各抗体に由来する１つのＨＣおよび１つのＬＣを含む二重特異性抗体を含む３イン１混合物を、宿主細胞により産生することができる。抗体がヘテロダイマーＨＣ／ＨＣ対を形成しない場合（任意選択で、ヘテロダイマー形成に不利な１つまたは複数の変更のため）、Ａｂ１およびＡｂ２を含むＭａｂＰａｉｒ混合物が生じることになる。
２つの全長抗体（Ａｂ１およびＡｂ２）をコードするＤＮＡが宿主細胞に導入される代替戦略では、抗体の１つのみが、１つまたは複数のＨＣパートナー指向性変更および／またはＬＣパートナー指向性変更を含み、抗体のいずれか１つがヘテロダイマーに不利な変更を含むか、または抗体はいずれもヘテロダイマーに不利な変更を含まない。図３を参照。したがって、一部の実施形態では、抗体の一方は、パートナー指向性変更およびヘテロダイマーに不利な変更を含まなくてもよく、他方は、１つまたは複数のパートナー指向性変更および１つまたは複数のヘテロダイマーに不利な変更を含んでもよい。図３、パネルＡを参照。あるいは、抗体の一方は、１つまたは複数のパートナー指向性変更を含んでもよいが、ヘテロダイマーに不利な変更を含まなくてもよく、他方の抗体は、パートナー指向性変更を含まなくてもよいが、１つまたは複数のヘテロダイマーに不利な変更を含んでもよい。さらなる実施形態では、いずれの抗体も、ヘテロダイマーに不利な変更を含まず、１つの抗体のみが、１つまたは複数のパートナー指向性変更を含む。図３、パネルＢを参照。
宿主細胞集団または宿主細胞株により産生された抗体混合物のさらなる精製は、幾つかのステップを含んでもよい。一部の実施形態では、混合物を、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティーカラムに適用し、その後溶出させる。また、下記に記載の低ｐＨ陽イオン交換クロマトグラフィーを含む陽イオンもしくは陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）などの、他のカラムクロマトグラフィーステップを使用することもできる。さらなる精製ステップとしては、多くの可能性の中でも、ダイアフィルトレーションを挙げることができる。
さらに、抗体混合物または抗体混合物をコードする核酸は、意図されたその使用に応じて製剤化することができる。治療剤として使用する場合、抗体混合物は、非経口投与用の、任意選択で注射用の液体として製剤化することができる。他の種類の製剤、例えば、ゲル、ペースト、クリーム、または固形物も可能である。製剤は、例えば、抗体または核酸を、維持、修飾、または保存することができる成分、ならびに／あるいはｐＨ、容量オスモル濃度、粘性、清澄性、匂い、色、無菌性、および／またはｉｎ ｖｉｖｏでの放出もしくは吸収速度などの制御因子を含んでもよい。そのため、そのような製剤に通常使用される任意の緩衝液および／または賦形剤を含んでもよい。そのような成分の例としては、多くの可能性の中でも、緩衝液、抗菌剤、キレート剤、塩、アミノ酸、および糖が挙げられる。製剤化された混合物のｐＨは、約ｐＨ５から約ｐＨ８．５までの、または約ｐＨ６から約ｐＨ８までの範囲内であってもよい。
抗体の結合特異性は、実施例８に記載されているものと類似した結合アッセイにより決定することができる。
２つの抗体が、抗原の特定の結合部位またはエピトープに関して競合するか否かを決定するための方法は、一般的に、下記のステップを含む。まず、ビオチン化抗原を、様々な量の競合抗体（ｍＡｂ２）の存在下でインキュベートする。これら組み合わせを「試料」と呼ぶ。その後、ｍＡｂ２／抗原複合体ならびに未結合のｍＡｂ２および／または抗原を含んでもよい試料を、抗原（ｍＡｂ１）に結合する別の抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートのウェルに添加する。対照として、ｍＡｂ２を用いずにインキュベートしたビオチン化抗原を含む試料を、一部のウェルに添加してもよい。その後、プレートを洗浄して、未結合抗原を除去する。ｍＡｂ１およびｍＡｂ２が競合しない場合、ｍＡｂ１は、ｍＡｂ２／抗原複合体ならびに遊離抗原に結合することができる。この場合、シグナル強度（それは、結合した抗原またはｍＡｂ２／抗原複合体の量に比例する）は、試料中にｍＡｂ２が存在しても低下しない。一部の場合では、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２は完全に競合する場合がある。これは、ｍＡｂ１は遊離抗原とは結合するが、ｍＡｂ２／抗原複合体とは結合しないことを意味する。一部の場合では、競合は生じるが、完全ではない場合がある。そのような場合、ｍＡｂ２／抗原複合体に対するｍＡｂ１の結合は減少するが、完全にはなくならない場合がある。いずれの場合でも、シグナル強度は、試料中にｍＡｂ２／抗原複合体が存在すると、減少することになる。シグナルは、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にカップリングされたストレプトアビジンを添加し、プレートを洗浄し、比色測定により検出することができるＨＲＰの基質を添加することにより検出される。プレートを洗浄し、反応を停止させて、シグナルの飽和を防止する。比色シグナルを検出する。本明細書で意図されている場合、２つの抗体が、本明細書に記載の試験により、抗原に対する結合に関して競合する場合（完全または部分的のいずれでもよい）、２つの抗体は、抗原の同じエピトープに結合すると言われる。
混合物中の抗体のＨＣは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のいずれかを含む）、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤなどの任意のアイソタイプのものであってもよい。ＩｇＧ４ ＨＣが使用される場合、ＨＣは、Ｆａｂアーム交換を防止する変更Ｓ２２８Ｐを含んでもよい。Ｓｉｌｖａら（２０１５年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２９０巻（９号）：５４６２〜５４６９頁。そのような重鎖の配列は、当技術分野で公知である。例えば、Ｋａｂａｔら、上記の６６１〜７２３頁を参照、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｓ２２８Ｐ変更を含むＩｇＧ４抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号２３に提供されている。重鎖は、任意の種、例えば、哺乳動物、ヒト、霊長類、マウス、もしくはラットに由来してもよく、または重鎖は、例えば、ファージディスプレイを使用して、もしくはヒト化プロセスを使用して、人為的に産生することができる。
同様に、２つの異なる軽鎖は、由来が任意の種であってもよく、任意選択で、哺乳動物、例えばヒト、もしくはヒト化、霊長類、マウス、またはラット抗体であってもよいラムダ（λＬＣ）またはカッパ（κＬＣ）鎖であってもよい。また、軽鎖は、例えば、ファージディスプレイまたはヒト化プロセスを使用して、人為的に産生することができる。λＬＣおよびκＬＣのアミノ酸配列の多くの例は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｋａｂａｔら、上記、６４７〜６６０頁に報告されているものであり、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。こうした配列の位置は、表９〜１１に示されており、関連する本文で考察されているように、ＶＬドメインの場合はカバット（Ｋａｂａｔら、上記）ナンバリングシステムに従って、ＣＬドメインの場合はエーデルマン（Ｅｄｅｌｍａｎら、上記）ナンバリングシステムに従って決定される。
重鎖および軽鎖は両方とも、本明細書に記載のような１つまたは複数の変更を含んでもよい。各変更は、単一アミノ酸の置換、挿入、または欠失であってもよい。一部の実施形態では、各変更は、１つのアミノ酸の、別のアミノ酸による置換である。任意選択で、変更は、その部位に元々存在するアミノ酸の、荷電アミノ酸またはシステインによる置換である。一部の実施形態では、置換されるアミノ酸は、任意のアミノ酸であってもよい。一部の実施形態では、システインを、システイン以外のアミノ酸に置換してもよい。システイン以外のアミノ酸は、任意のアミノ酸であってもよいが、一部の実施形態では、セリン、グリシン、またはアラニンであってもよい。一部の実施形態では、元のアミノ酸配列のアミノ酸を置き換えるために使用されるアミノ酸の選択は、限定される。例えば、そのような実施形態では、元のアミノ酸を置き換えるために使用されるアミノ酸は、以下のアミノ酸の１つまたは複数を除く任意のアミノ酸であってもよい：アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）。他の実施形態では、元のアミノ酸は、直ぐ上の列挙されている２０個の群中の任意の他のアミノ酸により置き換えることができる。他の実施形態では、元のアミノ酸に対して、下記に記載の「保存的」アミノ酸置換などの、２つ、３つ、もしくは４つのアミノ酸、および／または類似の特性を有するアミノ酸の群内の任意のアミノ酸のいずれかによる置き換えを行うことができる。例えば、そのような群としては、なかでも、（１）アルギニンおよびリシン、（２）セリンおよびトレオニン、（３）アスパラギン酸およびグルタミン酸、または（４）アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。
当業者であれば、生物中に存在するアミノ酸は、それらの特性により分類することができ、元のアミノ酸を、類似の特性を有するアミノ酸により置き換えることは、「保存的置換」と呼ばれることを認識している。本明細書に記載の変更は、一部の実施形態では、保存的置換を含んでもよい。本明細書で意図されている場合、保存的置換としては、（１）Ａを、Ｖ、Ｌ、またはＩにより置き換えること、（２）Ｒを、Ｋ、Ｑ、またはＮにより置き換えること、（３）ＮをＱにより置き換えること、（４）ＤをＥにより置き換えること、（５）ＣをＳまたはＡにより置き換えること、（６）ＱをＮにより置換すること、（７）ＥをＤにより置き換えること、（８）ＧをＰまたはＡにより置き換えること、（９）ＨをＮ、Ｑ、Ｋ、またはＲにより置き換えること、（１０）ＩをＬ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＦにより置き換えること、（１１）ＬをＩ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＦにより置き換えること、（１２）ＫをＲ、Ｑ、またはＮにより置き換えること、（１３）ＭをＬ、Ｆ、またはＩにより置き換えること、（１４）ＦをＬ、Ｖ、Ｉ、Ａ、またはＹにより置き換えること、（１５）ＰをＡにより置き換えること、（１６）ＳをＴ、Ａ、またはＣにより置き換えること、（１７）ＴをＳにより置き換えること、（１８）ＷをＹまたはＦにより置き換えること、（１９）ＹをＷ、Ｆ、Ｔ、またはＳにより置き換えること、および（２０）Ｖを、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｆ、またはＡにより置き換えることが挙げられる。
配列の特定の部位におけるアミノ酸およびアミノ酸置換は、本明細書では以下のように表記される。配列の元のアミノ酸の後に、重鎖または軽鎖アミノ酸配列の位置番号が続き（表５〜１１に例示されているナンバリングシステムを使用して）、その後には、置き換えとして使用されるアミノ酸が続く。例えば、ＨＣのＫ４０９Ｅは、ＨＣの４０９位に元々存在するリシンが、グルタミン酸に置き換えられていることを意味する。重鎖の４０９位が、２つの異なるアミノ酸、例えばＫまたはＲのいずれかを元々含む場合があり、これらを、２つのアミノ酸、例えばＤまたはＥのいずれかにより置き換えることができる場合、Ｋ／Ｒ４０９Ｄ／Ｅと表記することができる。この命名は、４０９位に元々存在するリシンまたはアルギニンが、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかにより置き換えられていてもよいことを意味する。一部の場合には、元のアミノ酸は規定されていない。例えば、ＨＣの４０９Ｄは、アミノ酸４０９がアスパラギン酸であることを意味することになり、元のアミノ酸の正体は規定されておらず、アスパラギン酸を含む任意のアミノ酸であり得る。同様に、Ｋ４０９の命名は、４０９位の元のアミノ酸が、リシンであること（および変更はないこと）を意味する。
表５〜１１は、ＨＣおよびＬＣの、一部の場合ではヒトまたは霊長類ＨＣおよびＬＣの配列コンセンサスのレベルを例示する。可変領域のアミノ酸配列は、特に相補性決定領域（ＣＤＲ、表５および９では太字イタリック体の番号により示されている）では、様々である。しかしながら、ＣＤＲを取り囲むフレームワーク領域は、より保存されており、高度に保存されたアミノ酸を幾つかの位置に含む。普遍的に保存されたアミノ酸またはほとんど普遍的に保存されたアミノ酸の多くは、例えば、ＶＨの４、３６、３８、および３９位、ならびにＶＬの９８、９９、１０１、１０２位は、非ヒト種に由来するＶＨおよびＶＬ領域でも保存されている。加えて、ＶＨおよびＶＬの多数の他の部位は、すべてのＶＨおよびＶＬにわたってではないが、可変ドメインの特定の群内で高度に保存されている。ＨＣおよびＬＣの定常ドメインは、可変ドメインよりも高い度合いの配列保存を示し、幾つかの高度に保存されたアミノ酸を含む。表６〜８および１０〜１１を参照。当業者であれば、これら高度に保存されたアミノ酸を使用して、ほとんどの免疫グロブリンドメインを、Ｋａｂａｔら、上記に開示されている配列とアラインメントして、Ｋａｂａｔら、上記またはＥｄｅｌｍａｎら、上記のシステムに従って、そうしたＶＨおよびＶＬのナンバリングを割り当てることができる。
本明細書に記載の混合物中の抗体は、ＨＣパートナー指向性変更および／またはＬＣパートナー指向性変更を含んでもよい。ＨＣパートナー指向性変更および／またはＬＣパートナー指向性変更は、各ＬＣがその同族ＨＣと対合し、その逆も同じであることを保証する機能を果たす。そのような変更が存在しない場合、異なるＨＣおよびＬＣを有する２つの異なる全長抗体のみをコードするＤＮＡをトランスフェクトした宿主細胞には、潜在的には、最大１０個の異なる種の抗体が形成される場合がある。図４を参照。もちろん、異なるＨＣおよびＬＣを有し、パートナー指向性変更を欠如する３つまたは４つの異なる全長抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトした宿主細胞では、潜在的に、さらに多くの種が形成される場合がある。しかしながら、同族ＨＣ／ＬＣ対合しか生じなければ、こうした数は、劇的に低減される。ホモダイマーＨＣ／ＨＣ対合しか生じなければ、種の数はさらに低減される。パートナー指向性変更の非存在下では、考え得る種の多くが非同族ＨＣ／ＬＣ対合を有するため、得られる抗体の一部は、いかなるエピトープにも結合しない場合があり、したがって所望の機能を欠如する場合がある。薬学的製品の均質性の要件は非常に厳格であることを考慮すると、そのような複雑な混合物は、治療剤として規制認可を受けられない可能性が高い。
ＨＣパートナー指向性変更およびＬＣパートナー指向性変更は、上記の表１２に列挙されている、ＣＨ１およびＣＬドメインの接触部位に行われてもよく、ならびに／または本明細書で説明されるように、ＶＨおよびＶＬドメインの接触部位に行われてもよい。本明細書に記載の混合物中の抗体は、それらのＨＣおよび／またはＬＣに１つまたは複数のＬＣパートナー指向性変更および／またはＨＣパートナー指向性変更、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個のそのような変更、および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個以下のそのような変更を含んでもよい。一部の実施形態では、混合物中の少なくとも１つの抗体は、そのような変更を欠如してもよい。
一部の実施形態では、こうした変更としては、元々は荷電アミノ酸を有していなかった部位の荷電アミノ酸による置換、または元々は電荷が逆のアミノ酸を含んでいた部位の荷電アミノ酸による置換が挙げられる。２つの異なる全長抗体をコードするＤＮＡが宿主細胞に導入され、２つの抗体のＨＣおよびＬＣが異なる実施形態では、ＬＣパートナー指向性変更およびＨＣパートナー指向性変更は、２つの異なるＬＣおよびＨＣの同じ部位で行われ、（１）２つの異なるＬＣが、同じＬＣ部位に逆に荷電したアミノ酸を有し、（２）２つの異なるＨＣが、ＬＣ部位と接触するＨＣ部位に逆に荷電したアミノ酸を有し、（３）各同族ＬＣ／ＨＣ対合では、ＬＣ部位の荷電アミノ酸が、接触ＨＣ部位のアミノ酸と電荷が逆である状況をもたらすことができる。そのような状況では、同族ＬＣおよびＨＣ間の相互作用は、逆に荷電したアミノ酸間の相互作用により強化され、非同族ＬＣ／ＨＣ対合間の相互作用は、非同族ＨＣ／ＬＣ対の接触部位に位置する同じ電荷を有するアミノ酸の反発により高度に不利になる。図１〜２を参照。他の実施形態では、１つの抗体のみが、同族ＨＣ／ＬＣ対合に有利な電荷対を含む。図３を参照。そのような場合、電荷対のアミノ酸の１つは、逆に荷電したアミノ酸残基が荷電アミノ酸残基に置換されているパートナー指向性変更に起因してもよい。この場合、一部の非同族ＨＣ／ＬＣ対は、反発性電荷相互作用により不利になることが予想される。任意選択でＨＣパートナー指向性変更および／またはＬＣパートナー指向性変更に起因する接触電荷対の例は、限定ではないが、以下のものが挙げられる：４４Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１００Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；４４Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１００Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１０５Ｅ／Ｄ（ＨＣ）および４３Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１０５Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および４３Ｅ／Ｄ（ＬＣ）；１３３Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１１７Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１３３Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１１７Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１３７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１１４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１３７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１１４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１３７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１１６Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１３７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１１６Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１２４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１２４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１２９Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１２９Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１３１Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１３１Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７８Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７８Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１８０Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１８０Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１６４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１６８Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１６４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１６７Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１６８Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１６７Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１６８Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１７０Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１６２Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１７０Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１６２Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１７３Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１６０Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１７３Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１６０Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１７３Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１６２Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１７３Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１６２Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１７５Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１６０Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１７５Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１６０Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１７５Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１８０Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１７５Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１８０Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１７６Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１６０Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１７６Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１６０Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１８１Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７８Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１８１Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７８Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１８３Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７６Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１８３Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７６Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１９０Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１１６Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１９０Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１１６Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１９０Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１３７Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１９０Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１３７Ｒ／Ｋ（ＬＣ）。
例えば、２つの全長抗体（ＨＣ１およびＬＣ１を含む第１の抗体、ならびにＨＣ２およびＬＣ２を含む第２の抗体）をコードするＤＮＡが宿主細胞に導入されている実施形態では、ＨＣ／ＬＣ対の接触部位の対の一方または両方の部位は、荷電アミノ酸を既に含んでもよい。例えば、一部の場合では、ＬＣ１は、荷電アミノ酸を含まない同族ＨＣ１の部位と接触する部位に荷電アミノ酸を含んでもよく、またはその逆でもよい。特定の例では、ヒトＣＬドメインの１６０位は、グルタミン酸（Ｅ）を含んでもよく、ヒトＣＨ１ドメインの接触部位１７３、１７４、および１７５は、一般的にそれぞれＶ、Ｌ、およびＱを含む。この場合、接触ＣＨ１部位の１つ、例えば１７３は、ＣＬドメインの１６０位のＥの電荷と電荷が逆になるように変更されていてもよい。つまり、１７３位は、ＲまたはＫに置換されていてもよい。ＨＣ２の同じ部位は、ＨＣ１のその部位の荷電アミノ酸と電荷が逆の荷電アミノ酸に変更されていてもよく（つまり、この部位は、ＤまたはＥに置換されていてもよい）、ＬＣ２の接触部位は、ＬＣ１の荷電アミノ酸と電荷が逆の荷電アミノ酸に変更することができる（つまり、ＬＣ２の１６０位は、ＲまたはＫに置換されていてもよい）。
同族ＨＣ／ＬＣ対の接触部位の１つまたは複数が、１つまたは複数の荷電アミノ酸を既に含んでいる他のシナリオも、同族ＨＣ／ＬＣ対の接触部位に逆に荷電したアミノ酸を創出することを最終目標として、同様に扱うことができる。一部の実施形態では、接触部位の同じ対は、それらが両抗体に逆に荷電したアミノ酸を含むように変更されていてもよい。但し、ＨＣ部位のアミノ酸の電荷は、ＨＣ１およびＨＣ２で逆であり、ＬＣ部位の電荷も、ＬＣ１およびＬＣ２で逆である。
同様に、例えば、２つの全長抗体（ＨＣ１およびＬＣ１を含む第１の抗体、ならびにＨＣ２およびＬＣ２を含む第２の抗体）をコードするＤＮＡが宿主細胞に導入されている実施形態では、ＨＣ１およびＬＣ１の接触部位が逆に荷電したアミノ酸を含む場合、ＨＣ２およびＬＣ２の同じ部位は、それぞれ、ＨＣ１およびＬＣ１に見出されるアミノ酸と電荷が逆のアミノ酸により置き換えられていてもよい。
２つの異なる全長抗体をコードするＤＮＡが宿主細胞に導入される他の実施形態では、ＬＣパートナー指向性変更およびＨＣパートナー指向性変更は、２つの異なるＬＣおよびＨＣの異なる部位に行われ、（１）一方のＬＣおよびその同族ＨＣが各々、接触部位に逆に荷電したアミノ酸を有し、（２）他方のＬＣおよびその同族ＨＣが各々、第１のＬＣ／ＨＣ対に使用されているものとは異なる接触部位に逆に荷電したアミノ酸を有する状況をもたらすことができる。こうした実施形態では、ＨＣパートナー指向性変更およびＬＣパートナー指向性変更は、同族ＨＣ／ＬＣ対間の相互作用を強化する役目を果たす。
さらに他の実施形態では、本明細書に記載の混合物中の抗体の１つまたは複数は、パートナー指向性変更を含まなくてもよい。そのような実施形態では、混合物中の抗体の別のものが、１つまたは複数のパートナー指向性変更を含んでもよい。
他の実施形態では、ＨＣパートナー指向性変更およびＬＣパートナー指向性変更は、同族ＨＣ／ＬＣ対の接触部位でのシステイン置換によりジスルフィド架橋の生成をもたらすことができる。例えば、２つの異なる全長抗体をコードするＤＮＡが宿主細胞に導入される実施形態では、そのようなＬＣパートナー指向性変更およびＨＣパートナー指向性変更は、２つの異なるＬＣおよびＨＣの異なる部位に行われ、同族ＬＣ／ＨＣ対は、接触部位にシステイン置換を有するが、非同族ＬＣ／ＨＣ対は、接触部位にシステイン置換を有していない状況をもたらすことができる。図１〜３を参照。したがって、２つの異なる同族ＨＣ／ＬＣ対は、ＨＣ／ＬＣ界面の異なる場所にジスルフィド架橋を有することになるが、非同族ＨＣ／ＬＣ対は、置換されたシステイン残基が、架橋の形成に十分な程度に接近しなくなるため、そのようなジスルフィド架橋を有さない。したがって、こうした実施形態では、ＨＣパートナー指向性変更およびＬＣパートナー指向性変更は、同族ＨＣ／ＬＣ対間の相互作用を強化する役目を果たす。他の実施形態では、混合物中の１つまたは複数の抗体は、混合物中のすべての抗体ではないが、同族ＨＣ／ＬＣ対の接触部位にシステインを含んでもよい。接触残基における対のシステイン置換の例としては、例えば、以下の変更の対が挙げられる：１２６Ｃ（ＨＣ）および１２１Ｃ（ＬＣ）；１２６Ｃ（ＨＣ）および１２４Ｃ（ＬＣ）；１２７Ｃ（ＨＣ）および１２１Ｃ（ＬＣ）；１２８Ｃ（ＨＣ）および１１８Ｃ（ＬＣ）；１３３Ｃ（ＨＣ）および１１７Ｃ（ＬＣ）；１３３Ｃ（ＨＣ）および２０９Ｃ（ＬＣ）；１３４Ｃ（ＨＣ）および１１６Ｃ（ＬＣ）；１４１Ｃ（ＨＣ）および１１６Ｃ（ＬＣ）；１６８Ｃ（ＨＣ）および１７４Ｃ（ＬＣ）；１７０Ｃ（ＨＣ）および１６２Ｃ（ＬＣ）；１７０Ｃ（ＨＣ）および１７６Ｃ（ＬＣ）；１７３Ｃ（ＨＣ）および１６０Ｃ（ＬＣ）；１７３Ｃ（ＨＣ）および１６２Ｃ（ＬＣ）；および１８３Ｃ（ＨＣ）および１７６Ｃ（ＬＣ）。
一部の実施形態では、通常、ＨＣとＬＣとの間のジスルフィド架橋の一部を形成する１つまたは複数のシステイン残基が、本明細書に記載の混合物中の抗体のうちの少なくとも１つでは、別のアミノ酸に置き換えられていてもよい。例えば、ヒトＩｇＧ１抗体では、ＨＣの２２０位およびＬＣの２１４位にあるシステインは、ＨＣとＬＣとの間にジスルフィド架橋を形成する。これらアミノ酸を、他のアミノ酸、例えば、セリン、アラニン、またはグリシンにより置き換えて、それによりＨＣ／ＬＣジスルフィド架橋を除去してもよい。類似のまたは異なるパターンのジスルフィド結合形成を有する他のＩｇＧアイソタイプの抗体、つまりＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に、同様の変更を加えることができ、ＨＣ／ＬＣジスルフィド結合形成に参加するシステイン残基を他のアミノ酸により置換することができる。例えば、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体では、１３１位（ＨＣ）および２１４位（ＬＣ）のシステインを、他のアミノ酸により置換してもよい。そのような変更は、非同族対も通常の鎖間ジスルフィド架橋を形成することができないため、同族ＨＣ／ＬＣ対合だけでなく、非同族ＨＣ／ＬＣ対合も弱めることができる。同族ＨＣ／ＬＣ対合は、例えば、パートナー指向性変更を、その通常のジスルフィド架橋を欠如する同族ＨＣ／ＬＣ対に付加することにより、強化することができる。そのようなパートナー指向性変更としては、新しいジスルフィド架橋が生成されるようなＨＣおよび／もしくはＬＣの接触残基でのシステイン置換、ならびに／または電荷対が生成されるようにＨＣおよび／もしくはＬＣの接触残基に荷電アミノ酸を導入する置換を挙げることができる。図３を参照。
異なるＨＣおよびＬＣを有する少なくとも２つだが４つ以下である異なる全長抗体をコードするＤＮＡが宿主細胞に導入されている場合、抗体のＨＣが、ヘテロダイマーの形成に不利な変更を一切含まなければ、一般的に、ヘテロダイマーＨＣ／ＨＣ対合が生じ得る。２つの異なる全長抗体のみをコードするＤＮＡが導入され、同族ＨＣ／ＬＣ対のみを形成することができる場合（ＨＣパートナー指向性変更および／またはＬＣパートナー指向性変更により）、これは、３つの異なる主要抗体種（本明細書では、「３イン１混合物」と呼ばれる）、つまり２つの開始抗体＋開始抗体の各々に由来する同族ＨＣ／ＬＣ対を含む二重特異性抗体の形成に結び付くことになる。図２〜４を参照。異なるエピトープに結合する２つの抗ＨＥＲ２抗体を含む混合物を参照して下記で説明されているように、これは、一部の混合物にとって有利な状況であってもよい。
異なるＨＣおよびＬＣを有する２つの異なる全長抗体をコードするＤＮＡが宿主細胞に導入されている一部の実施形態では、２つの抗体のうちの少なくとも１つのＨＣは、ＨＣ／ＨＣヘテロダイマー対合の形成に不利な１つまたは複数の変更を含んでもよい。本質的にホモダイマーＨＣ／ＨＣ対のみを形成することができ、本質的に同族ＨＣ／ＬＣ対のみを形成することができる場合（ＨＣパートナー指向性変更および／もしくはＬＣパートナー指向性変更により、ならびに／または抗体のうちの少なくとも１つのＨＣ／ＬＣジスルフィド架橋を除去することにより）、これは、２つの異なる主要抗体種（本明細書では「ＭａｂＰａｉｒ」混合物と呼ばれる）、つまり２つの開始全長抗体のみの形成に結び付く。図１および３を参照。医薬品生産プロセスの状況では、これは、２つの異なる抗体から本質的になる薬学的製品を、単一の細胞株で単一の生産プロセスを使用して産生することができるという有利な状況に結び付く。ヘテロダイマーの形成に不利な変更（一部の場合では、元の配列に存在するアミノ酸を含む）の例としては、限定ではないが、以下のものが挙げられる：一方のＨＣに４０９Ｄ／Ｅおよび３９９Ｒ／Ｋ、他方のＨＣは、４０９位にアルギニンを有する（例えば、ヒトＩｇＧ４抗体のように）；一方のＨＣに４０９Ｄ／Ｅ、３９９Ｒ／Ｋ、および３９２Ｄ／Ｌ／Ｙ／Ｍ／Ｗ／Ｉ／Ｖ／Ｆ、他方のＨＣは、４０９位にアルギニンを有する；一方のＨＣに３９２Ｅ／Ｄおよび３９９Ｒ／Ｋ、ならびに他方のＨＣに３９２Ｋ／Ｒおよび３９９Ｄ／Ｅ；一方のＨＣに３９９Ｋ／Ｒ、４０９Ｄ／Ｅ、および３９２Ｄ／Ｅ、ならびに他方のＨＣに３９９Ｄ／Ｅ、４０９Ｋ／Ｒ、および３９２Ｋ／Ｒ；一方のＨＣに３９９Ｋ／Ｒ、４０９Ｄ／Ｅ、３５６Ｋ／Ｒ、および３９２Ｄ／Ｅ、ならびに他方のＨＣに３９９Ｄ／Ｅ、４０９Ｋ／Ｒ、３５６Ｄ／Ｅ、および３９２Ｋ／Ｒ；一方のＨＣに３９９Ｋ／Ｒ、４０９Ｄ／Ｅ、３５７Ｋ／Ｒ、および３９２Ｄ／Ｅ、ならびに他方のＨＣに３９９Ｄ／Ｅ、４０９Ｋ／Ｒ、３５７Ｄ／Ｅ、および３９２Ｋ／Ｒ；一方のＨＣに３９９Ｋ／Ｒ、４０９Ｄ／Ｅ、３５６Ｋ／Ｒ、および４３８Ｄ／Ｅ、ならびに他方のＨＣに３９９Ｄ／Ｅ、４０９Ｋ／Ｒ、３５６Ｄ／Ｅ、および４３８Ｋ／Ｒ；一方のＨＣに３９９Ｋ／Ｒ、４０９Ｄ／Ｅ、３５７Ｋ／Ｒ、および３７０Ｄ／Ｅ、ならびに他方のＨＣに３９９Ｄ／Ｅ、４０９Ｋ／Ｒ、３５７Ｄ／Ｅ、および３７０Ｋ／Ｒ；一方のＨＣに３９９Ｋ／Ｒ、４０９Ｄ／Ｅ、３５６Ｋ／Ｒ、３９２Ｄ／Ｅ、３５７Ｋ／Ｒ、および３７０Ｄ／Ｅ、ならびに他方のＨＣに３９９Ｄ／Ｅ、４０９Ｋ／Ｒ、３５６Ｄ／Ｅ、３９２Ｋ／Ｒ、３５７Ｄ／Ｅ、および３７０Ｋ／Ｒ；一方のＨＣに３９９Ｋ／Ｒ、４０９Ｄ／Ｅ、３５６Ｋ／Ｒ、３９２Ｄ／Ｅ、３５７Ｋ／Ｒ、および４３９Ｄ／Ｅ、ならびに他方のＨＣに３９９Ｄ／Ｅ、４０９Ｋ／Ｒ、３５６Ｄ／Ｅ、３９２Ｋ／Ｒ、３５７Ｄ／Ｅ、および４３９Ｋ／Ｒ；一方のＨＣに３６６Ｙ／Ｗおよび４０７Ｔ／Ａ、ならびに他方のＨＣに３６６Ｔ／Ａおよび４０７Ｙ／Ｗ；一方のＨＣに４０５Ａ／Ｔおよび３９４Ｗ／Ｙ、ならびに他方のＨＣに４０５Ｗ／Ｙおよび３９４Ａ／Ｔ；一方のＨＣに４０７Ｙ／Ｗ、および他方のＨＣに３６６Ｙ／Ｗ；一方のＨＣに３６６Ｙ／Ｗ、４０７Ｔ／Ａ、および４０５Ａ／Ｔ、３９４Ｗ／Ｙ、ならびに他方に３６６Ｔ／Ａ、４０７Ｙ／Ｗ、および４０５Ｙ／Ｗ、および３９４Ａ／Ｔ；ならびに一方のＨＣに３６６Ｗ／Ｙ、３６８Ａ／Ｔ、および４０７Ｖ／Ｔ／Ａ、ならびに他方のＨＣに３６６Ｔ／Ａ／Ｓ、３６８Ｌ、および４０７Ｙ／Ｗ。
さらなる実施形態では、本明細書に記載の混合物中の抗体の１つまたは複数の薬物動態学的特性に影響を及ぼす１つまたは複数の変更を導入することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期または曲線下面積（ＡＵＣ）は、Ｍ２５２Ａ、Ｍ２５２Ｌ、Ｍ２５２Ｓ、Ｍ２５２Ｒ、Ｒ２５５Ｋ、またはＨ４３５Ｒなどの変更により短くすることができる。抗体混合物中の１つまたは複数の抗体の薬物動態学的特性に影響を及ぼす他の変更を導入してもよい。
抗体
本明細書では、本明細書に記載のパートナー指向性変更を含む抗体が記載されている。そのような抗体は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬドメインを含む任意の形式の抗体であってもよい。一部の実施形態では、そのような抗体は、哺乳動物抗体、例えば霊長類、ヒト、および／またはヒト化抗体であってもよいＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であってもよい全長ＩｇＧ抗体であってもよい。こうした抗体としては、例えば、１つまたは複数の電荷対（それらは、パートナー指向性変更に起因してもよい）を、それぞれＨＣおよびＬＣの部位の以下の対：１４７および１３１；１６８および１７４；ならびに１８１および１７８の１つまたは複数に含む、例えば霊長類、ヒト、および／またはヒト化ＣＬおよびＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインを含む抗体が挙げられる。さらなる実施形態としては、１つまたは複数の電荷対（それらは、パートナー指向性変更に起因してもよい）を、それぞれＨＣおよびＬＣの部位の以下の対：１４７および１３１；１６８および１７４；ならびに１８１および１８０の１つまたは複数に含む、例えば霊長類、ヒト、および／またはヒト化ＣＬおよびＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインを含む抗体が挙げられる。さらなる実施形態では、本明細書では、例えば、霊長類、ヒト、および／またはヒト化ＣＬおよびＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインを含む抗体であって、ＣＨ１およびＣＬドメインの接触部位に１つまたは複数の対のシステイン残基を含み、それらシステイン残基のそれぞれＣＨ１位置およびＣＬ位置が、以下の対：１２６および１２４；１２８および１１８；１３３および１１７；１３４および１１６；１６８および１７４；１７０および１６２；１７０および１７６；ならびに１７３および１６０のいずれか１つまたは複数であってもよい、抗体が記載されている。さらに他の実施形態では、本明細書では、例えば、霊長類、ヒト、および／またはヒト化ＣＬおよびＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインを含む抗体であって、ＣＨ１およびＣＬドメインの接触部位に１つまたは複数の対のシステイン残基を含み、それらシステイン残基のそれぞれＣＨ１位置およびＣＬ位置が、残基の以下の対：１２６および１２４；１２７および１２１；１２８および１１８；１６８および１７４；１７０および１６２；ならびに１７３および１６２のいずれか１つまたは複数であってもよい、抗体が記載されている。
さらなる実施形態では、本明細書では、ＨＣとＬＣとを連結する天然ジスルフィド架橋を欠如し、１つまたは複数の新しいジスルフィド架橋を生成することができる１つまたは複数の置換をＨＣおよびＬＣの両方に含むＩｇＧ２抗体、任意選択で、ヒト、霊長類、および／またはヒト化抗体が記載されている。例えば、ヒト、ヒト化、および／または霊長類ＩｇＧ２ ＨＣの１３１位のシステインを、別のアミノ酸、例えばセリン、アラニン、またはグリシンにより置き換えることができ、同族ＬＣの２１４位のシステインを、別のアミノ酸、例えばセリン、アラニン、またはグリシンにより置き換えることができる。これら置換は、ＩｇＧ２ ＨＣとその同族ＬＣとの間の天然ジスルフィド架橋を除去することになる。一方の残基がＩｇＧ２ ＨＣに存在し、他方がＬＣに存在する接触残基の対の各残基にシステイン置換を導入することにより、新しいジスルフィド架橋を生成することができる。例えば、接触残基におけるそのようなシステイン置換の対は、ＨＣのＦ１７０ＣおよびＬＣのＳ１６２Ｃという置換であり、ＨＣのＶ１７３ＣおよびＬＣのＱ１６０Ｃも同様である。接触残基の他の対における他のシステイン置換も使用することができる。この手法は、天然ヒトＩｇＧ２抗体で観察されている、ジスルフィド結合シャッフリングによる複数のＩｇＧ２構造異性体の形成を回避することができる。例えば、Ｌｉｇｈｔｌｅら（２０１０年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９巻：７５３〜７６２頁を参照。複数の構造異性体の形成は、治療剤として使用するための抗体を製造する場合、一般的に均質な調製物が好ましいため、不利となる場合がある。
上記に記載の抗体はいずれも、当技術分野で標準的な方法を使用して作製することができる。例えば、抗体は、（１）任意選択で１つまたは複数の適切なベクター中の、抗体をコードする１つまたは複数のＤＮＡを宿主細胞に導入し、（２）抗体の発現を促進する条件下で宿主細胞を培養し、（３）細胞上清または宿主細胞塊から抗体を得ることにより作製することができる。
抗体および／または抗体の混合物と結合する標的分子
本明細書に記載の混合物中の異なる抗体は、異なるエピトープと結合し、１つまたは複数の標的分子と結合することができる。本明細書に記載の抗体および／または抗体混合物の標的分子、任意選択でタンパク質は、疾患状態における種々の分子の役割に関する知識に照らして選択することができる。一部の実施形態では、疾患はヒト疾患であり、標的分子は、１つまたは複数のヒトタンパク質である。同様に、上記に記載の抗体は、こうした標的分子の１つに結合することができる。
一例では、抗体混合物の標的タンパク質は、免疫系の活性を阻害または遮断するチェックポイントとしての役目を果たす１つまたは複数のタンパク質であってもよい。がんおよび感染は免疫系により認識される場合があり、免疫系は、腫瘍および感染を制御し、除去することさえできるため、免疫系活性の制御または遮断を防止することは、潜在的に、がん細胞の成長を制限するか、または感染、一部の実施形態ではウイルス感染を除去することができる。細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）およびプログラム死１受容体（ＰＤ１）に対するものなどのチェックポイント遮断抗体が治療に有望であることが示されている悪性疾患の数は増え続けている。ＣＴＬＡ４およびＰＤ１は両方とも負の制御因子として機能するが、各々が免疫応答の調節に非冗長的な役割を果たす。ＣＴＬＡ４は、ナイーブおよびメモリーＴ細胞の早期活性化を減弱し、ＰＤ１は、そのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２との相互作用により、主に末梢組織でのＴ細胞活性の調節に関与する。単一の抗体でも、これら標的タンパク質のいずれかに結合することができる。
非小細胞肺がん、腎細胞がん、卵巣がん、膀胱がん、頭頸部がん、および胃がんを含む、チェックポイント遮断抗体の役割が有望である固形腫瘍の種類が急速に拡大していることを指し示す臨床的証拠が蓄積されている。ＣＴＬＡ４またはＰＤ１経路のいずれかの遮断は、複数の腫瘍タイプの成長を阻害するが、全奏効率は依然として低く、現在の選択肢の改善が重要であることを際立たせている。抗ＣＴＬＡ４（イピリムマブ）および抗ＰＤ１（ニボルマブ）経路遮断剤を用いて現在まで探究されている併用チェックポイント遮断は、未治療の黒色腫を有する患者において、イピリムマブ単独またはニボルマブ単独よりも良好な臨床有効性を示している。Ｌａｒｋｉｎら（２０１５年）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．３７３巻：２３〜３４頁。プログラム細胞死１リガンド（ＰＤ−Ｌ１；ＰＤＣＤ１ＬＧ１、ＰＤＣＤ１Ｌ１、Ｂ７Ｈ１、およびＣＤ２７４としても公知）陽性腫瘍を有する黒色腫患者では、ニボルマブ単独による治療を使用した場合の無進行生存は、イピリムマブおよびニボルマブによる治療を使用した場合に観察されたものと本質的に同じであり、イピリムマブ単独による治療を使用した場合に観察されたものよりも高かった。Ｌａｒｋｉｎら、上記。ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍を有する患者では、併用療法は、ニボルマブまたはイピリムマブ単独で観察されたものよりも長い無進行生存をもたらした。Ｌａｒｋｉｎら、上記。これらデータは、２つまたはそれよりも多くの免疫系チェックポイントタンパク質を遮断する２つまたはそれよりも多くの抗体を含む抗がん治療剤に強力な論理的根拠を提供する。別の抗ＰＤ１抗体であるペムブロリズマブ（ｐｒｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）を使用した同様の研究が現在進行中である。そのような混合物は、例えば、ＭａｂＰａｉｒ混合物または３イン１抗体混合物を作製するための、本明細書に記載の方法を使用して作製することができる。
異なる免疫チェックポイント遮断抗体の混合物を作製する状況では、異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を誘発することができるため、抗体のアイソタイプが重要であり得る。５つの免疫グロブリンのアイソタイプのうち、ヒト血清中に最も豊富に存在するものは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。４つのＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４は、定常領域、特にヒンジおよび上部ＣＨ２ドメインが異なる。これら領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または食作用（ＡＤＣＰ）を開始することができるＩｇＧ−Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）ならびに補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を開始することができるＣ１ｑとの結合に関与する。このように、異なるサブクラスは、異なるエフェクター機能を有する。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３抗体は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣを含む強力なエフェクター応答を誘発させることができるが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体が誘発するエフェクター応答はよりいっそうわずかであり、ある特定の場合にのみ誘発されるに過ぎない。可溶性タンパク質抗原および膜タンパク質に対する抗体応答は、主に、ＩｇＧ１抗体の産生を誘導し、それに伴って、ほとんどがＩｇＧ３およびＩｇＧ４である低レベルの他のＩｇＧサブクラスが産生される。Ｆｅｒｒａｎｔｅら（１９９０年）、Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｊ．９巻（補遺８号）：Ｓ１６〜２４頁。
治療用抗体の場合、これまでＩｇＧ１が最も一般的な選択肢である。がん細胞を選択的に根絶するために設計される抗体には、典型的には、強力な補体活性化、およびＡＤＣＣによるエフェクター媒介性細胞死滅を誘発することができるアイソタイプが必要とされる。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は両方ともこうした基準を満たすが、ＩｇＧ３は、半減期がより短く、比較的長いヒンジ領域がタンパク質分解に感受性であり、アロタイプ多型が著しいため、治療用抗体開発には使用されていない。
抗体アイソタイプは、がん治療に使用される抗ＣＴＬＡ４抗体に関する重要な考慮事項であり得る。前臨床データによると、チェックポイント遮断抗ＣＴＬＡ４抗体が、腫瘍内の制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を死滅させることにより、その治療効果の多くを送達し、したがって、ＣＤ８ Ｔ細胞媒介性抗腫瘍免疫を放出することができることが示唆されている。Ｓｉｍｐｓｏｎら（２０１３年）、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２１０巻（９号）：１６９５〜１７１０頁。同様の機序が、ヒト患者で作動する場合がある。最近、イピリムマブ、ヒトＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ４抗体は、ｅｘ ｖｉｖｏでヒトＴｒｅｇのＡＤＣＣ媒介性溶解に結び付くことが示された。Ｒｏｍａｎｏら（２０１５年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．１１２巻（１９号）：６１４０〜６１４５頁。さらに、小規模臨床研究では、イピリムマブに応答する黒色腫患者は、非古典的単球、およびＦｃγＲＩＩＩを発現するより活性化された腫瘍関連マクロファージのベースライン頻度が著しくより高かった。これは、療法後に腫瘍内Ｔｒｅｇの数が低下することと相関し、こうした患者ではＴｒｅｇ欠失が生じることを示唆する。したがって、抗体は、腫瘍内のＴｒｅｇ細胞の強力な死滅を引き起こす場合に、最大の効果を示すことができるため、がん治療に使用される抗ＣＴＬＡ４抗体には、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプが有利であり得る。
抗ＰＤ１抗体に適したＩｇＧアイソタイプは、典型的には、ＩｇＧ４、またはＦｃγＲ相互作用が最小限である変異ＩｇＧ１である。ＰＤ１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージの表面に発現され、免疫応答を負に制御する。ＰＤ１は、これらエフェクター細胞で発現されるため、強力なエフェクター機能を誘発することができるアイソタイプ、つまりＩｇＧ１またはＩｇＧ３を使用することは、それを使用しなかったならばがん細胞を死滅させた可能性がある活性化Ｔ細胞の死滅をもたらす場合があるため、望ましくない場合がある。
したがって、抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ１抗体の混合物を含む抗がん治療剤を作製する場合、上記で説明されているように、２つの結合ドメインの各々でエフェクター機能が異なることが適切であるため、二重特異性抗ＣＴＬＡ４抗ＰＤ１抗体が含まれることは、不適切である場合がある。さらに、制御性Ｔ細胞およびエフェクターＴ細胞を、抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体により物理的近傍に接近させる効果は、予測不能である。単一特異性ＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ４抗体および単一特異性ＩｇＧ４（または修飾ＩｇＧ１）抗ＰＤ１抗体から本質的になる混合物が望ましい場合がある。そのようなＭａｂＰａｉｒ混合物は、本明細書に記載のヘテロダイマーに不利な変更ならびにＬＣパートナー指向性変更およびＨＣパートナー指向性変更を使用して、本明細書に記載のように単一の宿主細胞中で産生され得る。
さらに、免疫チェックポイントタンパク質の他の組み合わせが、抗体のＭａｂＰａｉｒ混合物または３イン１混合物の標的としての役目を果たすことができる。各結合ドメインで異なるアイソタイプが適切である状況では（ＣＴＬＡ４およびＰＤ１の場合のように）、各結合ドメインが、ほとんどのまたはすべての場合で所望の定常領域に付着することになるように、ＭａｂＰａｉｒ混合物が好ましい場合がある。両結合ドメインに同じアイソタイプが適切である場合は、ＭａｂＰａｉｒ混合物または３イン１混合物のいずれかを使用することができる。
別の例では、ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーのタンパク質、つまりＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４は、細胞生存および増殖に重要な役割を果たし、腫瘍形成に関与している。これらタンパク質は、成長、増殖、および生存を含む多数の細胞プロセスを制御するシグナル伝達経路を活性化することができるヘテロダイマーおよびホモダイマーを形成することが可能である。ＨＥＲ２の過剰発現は、ヒト乳がん患者の侵攻性疾患および予後不良に関連する。そのような患者を、ラパチニブ（低分子チロシンキナーゼ阻害剤）を併用してまたは併用せずに、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブと呼ばれるヒト化抗ＨＥＲ２抗体の商標名）などの抗ＨＥＲ２抗体で治療すると、生存が改善される。トラスツズマブは、ＨＥＲ２のドメインＩＶに結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化することによりＨＥＲ２媒介性細胞増殖を阻害し、ｐ９５ＨＥＲ２（ＨＥＲ２の短縮型で構成的に活性な形態）の形成を防止し、リガンド非依存性ＨＥＲ２シグナル伝達を遮断し、ＨＥＲ２媒介性血管新生を阻害する。
ペルツズマブと呼ばれる、異なるヒト化抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブとは異なるエピトープ（ＨＥＲ２のドメインＩＩにある）に結合し、ＨＥＲ３およびＨＥＲ１などの他のＨＥＲファミリーメンバーとのＨＥＲ２二量体化を阻害し、それにより、腫瘍成長および進行に関連する下流シグナル伝達プロセスを阻害する。ペルツズマブおよびトラスツズマブの組み合わせは、いずれか一方の薬剤単独の場合と比較して、強力に増強された抗腫瘍効果を示し、異種移植モデルにおいて腫瘍退縮を誘導する（Ｙａｍａｓｈｉｔａ−Ｋａｓｈｉｍａ（２０１１年）、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７巻（１５号）：５０６０〜５０７０頁；Ｓｃｈｅｕｅｒら（２００９年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９巻：９３３０〜９３３６頁）。これは、いずれか一方の単独療法では達成することができない。この組み合わせの効力増強は、抗ＨＥＲ２トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｍａｂ）単独療法中の腫瘍進行後でも観察された。腫瘍に対するペルツズマブの結合は、トラスツズマブ事前治療により損なわれない。さらに、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｍａｂ）およびペルツズマブは両方とも、ＡＤＣＣを強力に活性化する。抗腫瘍活性の強力な増強は、トラスツズマブおよびペルツズマブの作用機序が異なり、かつ補完的であるためである可能性が高い。潜在的に、ＨＥＲ２タンパク質の１つまたは複数の分子の両エピトープに同時に結合することができる二重特異性抗体は、２つの別々の抗体とは異なり、より高い場合もあり、より低い場合もある活性を有する場合がある。一部の場合では、単一の標的タンパク質の２つの異なるエピトープに結合する二重特異性抗体は、単一の標的タンパク質の２つのエピトープに同時に結合することができない場合がある。したがって、任意選択で二重特異性抗体を含む、異なるエピトープに結合する２つまたはそれよりも多くの抗ＨＥＲ２抗体による治療が、単一抗体による治療よりも有効であり得ると考えることには理由がある。
したがって、本明細書に記載の方法を使用して、２つまたはそれよりも多くの異なる抗ＨＥＲ２抗体を含む混合物を作製することができる。例えば、ＭａｂＰａｉｒ混合物または３イン１抗体混合物を作製することができる。そのような混合物を使用して、乳がん患者のサブセット、つまりＨＥＲ２を過剰発現するがんを有する患者、および恐らくはＨＥＲ２媒介性がんを有する他のがん患者を治療することができる。
さらに、本明細書に記載の方法を使用して、他のがん抗原、つまりがん細胞で過剰表現されるタンパク質に結合する抗体の混合物を作製することができる。こうした場合のほとんどでは、がん細胞の死滅が療法の目的であるため、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ３アイソタイプが望ましい。例えば、混合物中の抗体は、単一のがん抗原の異なるエピトープに結合することができる。あるいは、混合物中の抗体は、がん細胞が複数の異なるがん抗原を発現する場合、異なるがん抗原に結合することができる。いずれの場合でも、混合物は、例えば、標的タンパク質の生物学的な役割に応じて、ＭａｂＰａｉｒまたは３イン１混合物であってもよい。
本明細書に記載されている抗体混合物の標的分子の対の例としては、限定ではないが、ヒトタンパク質であってもよい、以下の標的タンパク質の対（第１の標的タンパク質／第２の標的タンパク質として示される）が挙げられる：ＰＤ１／ＣＴＬＡ４、ＰＤ１／リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、ＰＤ１／グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連遺伝子（ＧＩＴＲ；ＡＩＴＲまたはＴＮＦＲＳＦ１８としても公知）、ＰＤ１／血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＡとしても公知）、ＰＤ１／コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ；ＦＭＳ、ｃ−ＦＭＳ、およびＣＤ１１５としても公知）、ＰＤ１／ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５、およびＣＤ１３４としても公知）、ＰＤ１／Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ＩＴＩＭ ｄｏｍａｉｎｓ（ＴＩＧＩＴ）、ＰＤＬ１／ＣＴＬＡ４、ＰＤＬ１／ＶＥＧＦ、ＰＤＬ１／ＯＸ４０、ＰＤＬ１／ＣＳＦ１Ｒ、ＰＤＬ１／ＴＩＧＩＴ、ＰＤＬ１／Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ３（ＴＩＭ３、ＨＡＶＣＲ２としても公知）、ＣＴＬＡ４／ＶＥＧＦ、ＣＴＬＡ４／４１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９、ＩＬＡ、およびＣＤ１３７としても公知）、膜貫通型４ドメインサブファミリーＡメンバー１（ＣＤ２０；ＭＳ４Ａ１およびＢ１としても公知）／白血球表面抗原ＣＤ３７（ＣＤ３７）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２；ＡＮＧＰＴ２としても公知）／ＶＥＧＦ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ；ＴＮＦＡおよびカケクチン（ｃａｃｈｅｔｉｎ）としても公知）／インターロイキン１７ａ（ＩＬ１７ａ；ＣＴＬＡ８としても公知）、ＣＤ３８抗原（ＣＤ３８）／ＣＤ１３８抗原（ＣＤ１３８；ＳＤＣ１およびＳＹＮＤ１としても公知）、上皮成増殖因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥＲＢＢ１、ＨＥＲ１、およびＳＡ７としても公知）／ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３、ＭＥＴがん原遺伝子（ＭＥＴ；ＨＧＦＲとしても公知）／ＶＥＧＦ、ＭＥＴ／ＥＧＦＲ、胸腺間質性リンホポエチン（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）（ＴＳＬＰ）／インターロイキン３３（ＩＬ３３；Ｃ９ＯＲＦ２６、ＮＦＨＥＶ、およびＩＬ１Ｆ１１としても公知）、インターロイキン４（ＩＬ４；ＢＳＦ１としても公知）／インターロイキン１３（ＩＬ１３）、ＨＥＲ２／ＨＥＲ２、ＰＤ１／ＣＤ９６、ＰＤ１／タンパク質チロシンホスファターゼ非受容体型基質−１（ＳＩＲＰ−アルファ−１、ＰＴＰＮＳ１、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＰＳ１、ＭＹＤ１、およびＭＦＲとしても公知）、およびＰＤ１／ケモカインＣＣモチーフ受容体８（ＣＣＲ８、ケモカイン、ＣＣモチーフ受容体様２（ＣＭＫＢＲＬ２）、ケモカイン受容体様１（ＣＫＲＬ１）、およびＣＭＫＢＲ８としても公知）。単一の抗体でも、これら標的分子のいずれかに結合することができる。
上記で考察されている特定の標的の例は、代表的なものである。本明細書に記載の方法を使用して、任意の標的またはこれら標的の組み合わせに結合する抗体および／または抗体混合物を作製することができる。
抗体および抗体の混合物をコードする核酸およびベクター
本明細書に記載の抗体および抗体の混合物をコードする核酸、例えばＤＮＡが提供される。免疫グロブリンドメイン、例えば、ＶＨ、ＶＬ、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインをコードする多数の核酸配列が、当技術分野で公知である。例えば、Ｋａｂａｔら、上記を参照。当業者であれば、本明細書で提供されている指針を使用して、抗体をコードする公知のまたは新規の核酸配列を組み合わせ、それらを公知の方法で修飾して、本明細書に記載の変更を含む本明細書に記載の抗体および抗体の混合物をコードする核酸を生成することができる。
核酸を修飾する方法は、当技術分野で周知である。修飾核酸を生成するための最も単純明快な方法は、恐らくは、所望の配列を有する核酸を合成することである。幾つかの会社、例えば、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、Ｇｅｎｅｗｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｇｅｎ９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、およびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ；ＩＤＴ）が、このサービスを提供している。また、変異を導入する他の公知の方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した部位特異的変異誘発法を使用することができる。例えば、Ｚｏｌｌｅｒ（１９９１年）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２巻（４号）：５２６〜５３１頁；ＲｅｉｋｏｆｓｋｉおよびＴａｏ（１９９２年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｄｖ．１０巻（４号）：５３５〜５４７頁を参照。例えば、下記の実施例２には、開始ＤＮＡに特定の変異を導入するための市販キットの使用が記載されている。
抗体のＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡを含むＤＮＡベクターは、選択した宿主細胞中での抗体発現に好適な任意のベクターであってもよい。ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択するための、ならびに／または宿主細胞中のベクターを維持および／もしくは増幅するための、選択マーカーを含んでもよい。そのようなマーカーとしては、例えば、（１）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、原核宿主細胞の場合は、アンピシリン、テトラサイクリン、もしくはカナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、（２）細胞の栄養要求欠損を補完する遺伝子、または（３）その作用が、複合もしくは限定培地から利用することができない重要な栄養素を供給する遺伝子が挙げられる。具体的な選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。また、ネオマイシン耐性遺伝子を、原核および真核宿主細胞の両方で選択に使用することができる。哺乳動物細胞では、当技術分野で公知のように、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および／またはプロモーターを持たないチミジンキナーゼ遺伝子を使用することができる。
加えて、ベクターは、ベクターの維持、ならびに／または本明細書に記載の抗体および／もしくは抗体混合物、例えば本明細書に記載の抗体混合物のＨＣおよびＬＣをコードする挿入配列の発現に必要な種々の他の配列エレメントを含むことができる。そのようなエレメントとしては、例えば、複製起点、プロモーター、１つまたは複数のエンハンサー、転写ターミネーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、および外因性配列（本明細書に記載の抗体混合物をコードするＤＮＡなど）のポリリンカー挿入部位が挙げられる。こうした配列エレメントは、所望の宿主細胞中で機能して、ベクターの複製および／または増幅、ならびにベクターに挿入された異種性配列の発現を促進するように選択することができる。そのような配列エレメントは、当技術分野で周知であり、多数の市販ベクターが利用可能である。多数のベクターが、多数の他の会社があるが、特に、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）およびＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含む会社から市販されている。
例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換、微粒子銃、マイクロインジェクション、またはエレクトロポレーションを含む、任意の適切な方法を使用して、２つまたはそれよりも多くの抗体の各々をコードするＤＮＡを宿主細胞の集団に導入することができる。一部の実施形態では、２つの全長ＩｇＧ抗体をコードするＤＮＡが、宿主細胞に導入される。そのような方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｋａｅｓｔｎｅｒら（２０１５年）、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．２５巻：１１７１〜１１７６頁に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、抗体または抗体の混合物をコードする核酸は、１つまたは複数のウイルスベクター上にあってもよい。そのようなウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターが挙げられる。そのような実施形態では、混合物または抗体をコードする核酸を含むこうしたウイルスベクターを、疾患を治療するために患者に投与することができる。がん患者では、抗体の混合物をコードする核酸を含むそのようなウイルスベクターを、多数の可能性の中でも、例えば、注射、吸入（肺がんの場合）、局所投与（皮膚がんの場合）、および／または粘膜（それを通して核酸を吸収させることができる）への投与により、患者の腫瘍またはがん細胞の主要部位に直接投与することができる。
同様に、本明細書に記載の抗体の混合物をコードし、リポソームに封入されていてもよい核酸を、疾患を罹患している患者に投与することができる。
抗体の混合物を産生することができる宿主細胞
抗体をコードするＤＮＡが導入される宿主細胞は、組換えタンパク質の発現に好適な様々な細胞のいずれかであってもよい。それらとしては、例えば、グラム陰性またはグラム陽性原核生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなどの細菌が挙げられる。他の実施形態では、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅなどの種を含む真核細胞、またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓｐｏｄｏｔｅｒａ属の真核生物、または異種性ポリペプチドを発現することが可能な任意の細胞であってもよい。さらなる実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞であってもよい。異種性ポリペプチドの発現に好適な多数の哺乳動物細胞が当技術分野で公知であり、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を含む、様々な供給業者から得ることができる。好適な哺乳動物細胞としては、例えば、以下のものが挙げられる：ＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら、１９８１年、Ｃｅｌｌ ２３巻：１７５頁）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞もしくは無血清培地で増殖するＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯおよび関連細胞株などのそれらの誘導体（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、１９９８年、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８巻：３１頁）、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０）、ＭｃＭａｈａｎら、１９９１年、ＥＭＢＯ Ｊ．１０巻：２８２１頁に記載のアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）に由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株、２９３、２９３ＥＢＮＡ、もしくはＭＳＲ２９３などのヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、ジャーカット細胞、ＨｅｐＧ２／３Ｂ細胞、ＫＢ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、またはＳ４９細胞。また、異種性ポリペプチドの発現が可能な他の哺乳動物細胞タイプを使用することができる。
一部の実施形態では、抗体混合物、例えば、ＭａｂＰａｉｒ、または３イン１混合物は、抗体混合物をコードするＤＮＡが、例えば、トランスフェクションにより導入されている宿主細胞の集団から得ることができる。一部の実施形態では、ＤＮＡが導入されている細胞の集団から単一の細胞が単離される。この細胞を増殖させて、抗体混合物を産生することができる、本明細書で定義されているような「宿主細胞株」を生成する。
治療方法
本明細書に記載の抗体および／もしくは抗体の混合物またはそれらをコードする核酸を使用して、様々な疾患、任意選択でヒト疾患を治療することができる。当業者であれば直ちに理解するように、特定の抗体もしくは抗体の混合物または抗体もしくは混合物をコードする核酸を使用して治療することができる疾患は、他の考え得る要因の中でも、混合物中の各抗体が結合する標的タンパク質の正体、混合物中の各抗体が結合する各標的タンパク質の特定のエピトープ、混合物中の各抗体の相対的な量、各抗体のアイソタイプ、および混合物中の各抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を含む、様々な要因により決定することができる。本明細書に記載の混合物中の１つまたは複数の抗体が結合する標的タンパク質は、治療されている疾患の経過の駆動に直接的または間接的な役割を果たす場合がある。例えば、標的タンパク質は、疾患を駆動する生物学的経路の一部であってもよく、もしくは免疫チェックポイントとしての役目を果たすタンパク質であってもよく、および／または標的タンパク質は、免疫系による破壊のために疾患細胞を標的とする手段としての役目を果たすことができる。他のシナリオも可能である。
一般的な意味では、本明細書に記載の抗体の混合物またはそれらをコードする核酸を使用して、数ある可能性の中でも特に、複数の生物学的経路により駆動される疾患、複数の作用機序を有する分子（例えば、乳がんのＨＥＲ２）により駆動される疾患、または単一の生物学的経路に供給される複数の分子により駆動される疾患を治療することができる。こうした疾患としては、限定ではないが、多くの可能性の中でも、がん、代謝疾患、感染性疾患、および自己免疫性または炎症性疾患が挙げられる。
本明細書に記載の抗体、抗体の混合物、またはそれらをコードする核酸を使用して、例えば、がんを治療することができる。そのような場合、抗体または抗体の混合物を、がん患者に、任意選択で腫瘍に直接投与することができる。当技術分野で公知なように、異なるがんは、様々であり、異なる治療を必要とする。したがって、異なる抗体または抗体の混合物が、異なるがんに好適であり得る。本明細書に記載の抗体の混合物で治療することができるがんとしては、例えば、多数の他のがんもあるが、中でも、溶血性がん、癌腫および肉腫を含む固形腫瘍、乳がん、黒色腫を含む皮膚がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、頭頸部のがん、甲状腺がん、脳がんが挙げられる。
抗体、抗体の混合物、またはそれらをコードする核酸は、例えば、液体、ペースト、もしくはクリーム、または固形物として製剤化することができる。経口投与が可能である。抗体、抗体混合物、または核酸は、非経口注射により投与することができる。例えば、抗体混合物または核酸の注射は、皮下、静脈内、動脈内、病変内（腫瘍またはがんの他の主要部位を含む）、腹腔内、または筋肉内であってもよい。特に皮膚の疾患の場合、例えば、液体、ペースト、またはクリームの局所投与が可能である。鼻腔内、舌下、膣、または直腸内投与などの、粘膜と接触させることによる投与も可能である。あるいは、抗体、抗体混合物、または抗体もしくは抗体混合物をコードする核酸は、吸入剤として投与することができる。
一部の実施形態では、抗体または抗体の混合物をコードする核酸は、１つまたは複数のウイルスベクター上にあってもよい。そのような実施形態では、抗体または抗体の混合物をコードする核酸を含むそうしたウイルスベクターを、多くの可能性の中でも、例えば、経口投与により、または注射（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、腫瘍内、または腹腔内注射を含む）、吸入、局所投与により、および／または粘膜（それを通して核酸を吸収させることができる）への投与により、患者に投与して、疾患を治療することができる。がん患者では、抗体または抗体の混合物をコードする核酸を含むそのようなウイルスベクターを、多数の可能性の中でも、例えば、注射、吸入（肺がんの場合）、局所投与（皮膚がんの場合）、および／または粘膜（それを通して核酸を吸収させることができる）への投与により、患者の腫瘍またはがん細胞の主要部位に直接投与することができる。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターであってもよい。
抗体、抗体の混合物、またはそれらをコードする核酸の投薬および投薬頻度は、当業者であれば、多数の他の考え得る考慮事項があるが、中でも、治療されている状態、抗体または核酸の濃度、抗体の結合特性（親和性およびアビディティなど）、抗体が結合する標的分子のｉｎ ｖｉｖｏ存在量および接近可能性、ならびに抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期に応じて調整することができる。患者に投与される抗体または抗体の混合物の用量は、例えば、約０．００３６ミリグラム（ｍｇ）から約４５０ｍｇまで、約０．００００５１ｍｇ／ｋｇから約６．４ｍｇ／ｋｇまで、または約０．００２ｍｇ／ｍｍ２から約２５０ｍｇ／ｍｍ２までであってもよい。同様に、抗体または抗体混合物をコードする核酸、例えばＤＮＡの投薬は、例えば、患者体重１キログラム当たり、約１０９〜約１０１３コピーの抗体または抗体をコードするＤＮＡであってもよい。投薬は、他の考え得るスケジュールの中でも、毎日、１日おきに、週２回、週１回、１週おきに、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２週ごとに１回、年４回、年２回、９か月ごとに１回、または年１回で行ってもよい。
上記では本発明を一般的な観点で記載し、下記に記載の具体的な実施例は、本発明の範囲を例示するために提供されており、限定するためのものではない。本発明には、本明細書に記載されている本発明の趣旨から逸脱せずに種々の変更および改変を加えることができ、当業者には、そうした変更および改変は明白であることが理解される。そのような変更および改変は、添付の特許請求の範囲を含む、本明細書に記載の本発明の範囲内にある。
（実施例１：ＨＣおよびＬＣパートナー指向性変更の設計）
非同族ＨＣ／ＬＣ対合の防止は、複数の全長抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトした宿主細胞によって産生される抗体の種の数を大幅に限定するであろう。例えば、図４を参照されたい。同族ＬＣ／ＨＣ対のみが形成されることを確実にするために、各ＬＣが、その同族ＨＣとの対合に強く有利になるが、非同族ＨＣに不利になることができるように、ＨＣ／ＬＣアセンブリプロセスの動態を制御する有効な仕方を見出すことが重大な意味を持つ。ＶＨ／ＶＬおよびＣＨ１／ＣＬ界面の両方が、ＨＣ／ＬＣ認識および係合に関与するため（これら全て、その全体を参照により本明細書に組み込む、Ｋｎａｒｒら（１９９５年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７０巻：２７５８９〜２７５９４頁；Ｆｅｉｇｅら（２００９年）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ３４巻：５６９〜５７９頁；Ｒｅｉｔｅｒら（１９９６年）、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４巻：１２３９〜１２４５頁；Ｐｏｔａｐｏｖら（２００４年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．３４２巻：６６５〜６７９頁；Ｒｏｔｈｌｉｓｂｅｒｇｅｒら（２００５年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．３４７巻：７７３〜７８９頁を参照）、下に詳細に説明される通り、同族ＨＣ／ＬＣ対合を強制するように両方の界面を操作した。
既存のＸ線結晶構造を使用して、修飾のためのＶＨ／ＶＬおよびＣＨ１／ＣＬ界面上の残基を同定した。ＨＥＲ２と複合体形成した２種のヒト化ＩｇＧ１抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ断片の共結晶構造が報告された、すなわち、トラスツズマブＦａｂ断片の構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ受託番号１Ｎ８Ｚで検索することにより、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ／にて利用可；参照により本明細書に組み込むＣｈｏら（２００３年）、Ｎａｔｕｒｅ ４２１巻（６９２４号）：７５６〜７６０頁も参照）およびペルツズマブＦａｂ断片の構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ受託番号１Ｓ７８で検索することにより、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ／にて利用可；参照により本明細書に組み込むＦｒａｎｋｌｉｎら（２００４年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５巻（４号）：３１７〜３２８頁も参照）。ヒトＩｇＧ４ Ｆａｂの結晶構造も報告された（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ受託番号１ＢＢＪで検索することにより、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ／にて利用可；参照により本明細書に組み込むＢｒａｄｙら（１９９２年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７巻（１号）：２５３〜２６４頁も参照）。
荷電アミノ酸による置換のための部位としての試験に適するであろうＨＣ／ＬＣ相互作用に関与する残基を選択する目的のため、距離限界判断基準によって決定される物理的接触および溶媒露出面積を考慮した。物理的接触方法を使用して、荷電アミノ酸による置換のための界面残基を、その側鎖重原子、すなわち、水素以外の原子が、第２の鎖における任意の残基の側鎖重原子から指定の限界（５Å）よりも近接して位置する残基として定義した。場合によっては、これは、２個のアミノ酸のα−炭素原子（Ｃα）、すなわち、アミノ酸のカルボキシル基に隣接する位置における炭素が、互いから約１２Åほど遠くにあり得ることを意味することがある。そのような距離は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．（１０１０ Ｓｈｅｒｂｏｏｋｅ Ｓｔ．Ｗｅｓｔ、Ｓｕｉｔｅ＃９１０、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＱＣ、Ｃａｎａｄａ、Ｈ３Ａ ２Ｒ７）から得たＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）ソフトウェアを使用して決定した。第２の方法は、第２の鎖の存在および非存在下における残基の溶媒露出面積（ＡＳＡ）を計算することを含む。例えば、その関連する部分を参照により本明細書に組み込むＬｉｕら（２０１５年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２９０巻（１２号）：７５３５〜７５６２頁を参照されたい。２種の計算の間でＡＳＡにおける差＞１Å２を示す残基を界面残基として同定した。両方の方法が、界面残基の同様のセットを同定した。次の追加的な判断基準をさらに適用して、変異誘発のためのＶＨ／ＶＬ界面残基対を選択した：（１）ＣＤＲになく、任意のＣＤＲ残基と接触しない、（２）ＩｇＧ抗体サブタイプの間で高度に保存されている、および（３）大部分は溶媒非露出である（すなわち、埋没または部分的に埋没している）。
可変ドメインにおいて、特定の可変ドメインが由来する生殖系列配列に関係なく、ＶＨドメインにおけるＧ４４およびＱ１０５は、それぞれＶＬドメインにおけるＱ１００およびＡ４３に空間的に近接している。さらに、これらは、溶媒非露出の、空間的に保存された残基、すなわち、抗体の三次構造内のその空間的な場所が、異なる抗体の間で保存された残基である。したがって、これらの部位を、ＶＨおよびＶＬの間に電荷−電荷相互作用を創出するための置換を行うために選択した。本発明者らは、本明細書においてそのような置換を「電荷対」変更または置換と称する。
電荷対置換に適切となるのに十分に近接した、すなわち、Ｃα原子間が約１２Å未満、および側鎖重原子間が約５Å未満であるＩｇＧ１またはＩｇＧ４ Ｆａｂ断片のＣＨ１／ＣＬ界面における残基が、下表１３および１４に要約されている。接触残基は、残基のα−炭素間の距離と共に、同じ行に示す。
ＣＨ１ドメインの存在により、ＨＣは、全長ＩｇＧのアセンブリのためにＬＣによって係合されるまで、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ、ＧＲＰ７８およびＨＳＰＡ５としても公知）により小胞体（ＥＲ）中に保持される。ＢｉＰは一般に、疎水性残基を認識し、またより低い程度であるが、それを親水性かつ荷電した残基に結合する。Ｋｎａｒｒら（１９９５年）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０巻：２７５８９〜２７５９４頁。したがって、ＨＣ／ＬＣ相互作用の不安定化は、抗体をＥＲ中に保持させ、これにより、培養培地への抗体の分泌を低下させ得る。
ＶＨ／ＶＬおよびＣＨ１／ＣＬ界面三次構造を検討したところ、水素結合およびファンデルワールス相互作用が、これらの界面の重要な部分であることが明らかになった。ＣＨ３／ＣＨ３界面とは異なり、静電的電荷−電荷残基相互作用は、ＬＣおよびＨＣの間で稀である。例えば、ＣＬκ／ＣＨ１界面は、Ｅ／ＤおよびＫ残基が関与する、１個の正−負電荷相互作用を有し、ＣＬλ／ＣＨ１界面は、２個の正−負電荷相互作用を有する。これらの既存の電荷対相互作用は全て、部分的にまたは完全に溶媒曝露した位置が関与し、これは、溶媒分子の干渉により静電相互作用を弱める状況である。
同族ＨＣ／ＬＣ対合を駆動する静電ステアリング効果を利用するために、本発明者らは、ＶＨ／ＶＬおよびＣＨ１／ＣＬ界面を安定に維持することが重要である可能性があり、残基置換が、これらの構造を不安定化し、これにより、抗体発現を減少し得ると仮定した。したがって、本発明者らは、調査のために少なくとも１個の保存された、天然の荷電残基（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の両方のＣＨ１ドメインにおけるＫ１４７およびＨ１６８）を優先的に使用した。本発明者らは、ＣＨ１ドメインにおける保存された荷電残基を、電荷が逆の残基に変化させることが、ＣＨ１／ＣＬ界面の破壊をほとんどまたは全く引き起こさない可能性があると仮定した。
上述の本発明者らの三次構造解析は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の両方のＣＨ１ドメインにおけるＫ１４７が、ＣＬκドメインにおけるＱ１２４、Ｔ１２９、Ｓ１３１およびＴ１８０に接触し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の両方のＣＨ１ドメインにおけるＨ１６８が、ＣＬκドメインにおけるＴ１６４、Ｄ１６７およびＳ１７４に接触することを示した。本発明者らは、逆に荷電した残基の一方が、ストランド−Ｂ、ストランドＤおよびストランドＥを含む、ＣＬおよび／またはＣＨ１ドメインの内側β−シートに位置する場合、ＣＬ／ＣＨ１界面を横切って相互作用するアミノ酸の逆に荷電した対が、最大静電ステアリング効果を有し得ると仮定した。そのような残基の例として、ＣＬκドメインの内側β−シートにおけるＳ１３１、Ｔ１８０、Ｔ１６４およびＳ１７４が挙げられる。本発明者らは、（１）ＣＨ１ドメインの１４７位における残基（置換されていてもされていなくてもよい）との静電相互作用を促進するであろうＣＬκドメインのＳ１３１および／またはＴ１８０における置換、（２）ＣＨ１ドメインの１６８における残基（置換されていてもされていなくてもよい）との静電相互作用を促進するであろうＣＬκドメインのＴ１６４および／またはＳ１７４における置換に着目した。
（実施例２：ＨＣ／ＬＣ界面における付加されたジスルフィド架橋の設計および試験）
本発明者らは、追加的なＨＣ／ＬＣ鎖間ジスルフィド架橋を創出する変更が、同族ＨＣ／ＬＣ対の会合を強化し得ると仮定した。無修飾抗体において、鎖間ジスルフィド結合は溶媒曝露されている一方、鎖内ジスルフィド結合は、各ドメイン内の逆平行β−シート構造の２つの層の間に埋没している、すなわち、溶媒曝露されていない。例えば、ヒンジ領域における鎖間ジスルフィド結合は、ＨＣおよびＬＣの間のジスルフィド結合と同様に、溶媒曝露されている。溶媒曝露されたシステイン残基は、非曝露システイン残基よりも反応性であると考慮される。したがって、システイン置換を行うことにおいて、本発明者らは、部分的にまたは完全に溶媒曝露されたジスルフィド架橋を創出しようと試みた。
導入されたジスルフィド架橋は、ＶＨ／ＶＬ相互作用を安定化することによりＦｖ断片を安定化し、その結果得られるＦｖ断片のより高度な産生および溶解度をもたらすことが示された。Ｒｅｉｔｅｒら（１９９６年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４巻（１０号）：１２３９〜１２４５頁。これらのシステイン置換のために変更された残基は、フレームワーク領域における十分に保存されたアミノ酸、具体的には、それぞれＶＨ残基Ｇ４４およびＱ１０５ならびに接触ＶＬ残基Ｑ１００およびＡ４３であった。
本発明者らは、ＣＨ１およびＣＬドメインにおいて同様のアプローチを試みた。実施例１に記載されている本発明者らの三次構造解析は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４ ＨＣとκＬＣとのＣＨ１／ＣＬ界面に位置する次の残基対が、システインにより置換されている場合に、潜在的にジスルフィド結合を形成するのに十分なほど近接していることを示す。
表１５および１６に表記されている部位の１個または複数の対においてそのＨＣおよびＬＣにシステイン置換を有し、ＨＣおよびＬＣの間に通常存在するジスルフィド架橋を欠く抗体が、ＥＲからのエスケープに十分に安定なＨＣ／ＬＣ対を形成するか決定するために、そのような抗体をコードするＤＮＡ構築物を次の通りに作製した。シグナルペプチド（ＳＰ）と、それに続く抗ＣＴＬＡ４抗体１Ｅ１（「１Ｅ１抗体」）由来のＶＨおよびＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ断片を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ），Ｉｎｃ．（Ｉｏｗａ、ＵＳＡ）により合成した。１Ｅ１抗体のＶＨおよびＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３８のアミノ酸１〜２１６に示す。これを、Ｇｉｂｓｏｎ反応（例えば、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（ＮＥＢ）、バージョン３．３、ＮＥＢカタログ番号＃Ｅ２６１１Ｓ／Ｌ、ＮＥＢ Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡを参照）によって、哺乳動物発現ベクターにおいて、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードする下流ＤＮＡ断片と融合した。ＣＨ３ドメインは、実施例４でより詳細に記述する、置換Ｄ３９９ＫおよびＫ４０９Ｅを含んだ。
ＳＰと、それに続く１Ｅ１抗体由来のＶＬおよびＣＬドメインをコードする第２のＤＮＡ断片を、ＩＤＴ，Ｉｎｃ．によって合成され、Ｇｉｂｓｏｎ反応によって、哺乳動物発現ベクターと融合された。１Ｅ１抗体のＶＬおよびＣＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号４０のアミノ酸１〜２１４に示す。反応混合物をエレクトロポレーションによりコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅに形質転換し、抗生物質カルベニシリン（ｃａｒｂｅｒｎｉｃｉｌｌｉｎ）を含有するＬＢ−寒天プレート上に蒔いた。その結果得られるコロニーを採取し培養し、プラスミドＤＮＡを単離した。ＤＮＡ配列決定によってプラスミドインサート配列を確認した。
アミノ酸置換をコードする変異を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ複数部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ ｎｏ．２１０５１６）を用いた変異誘発反応によって、これらのＤＮＡ構築物に導入した。ＨＣをコードするＤＮＡにおいて、Ｃ２２０Ｓ変更（定常ドメイン変更を記載するためにＥＵナンバリングシステムが本明細書に使用されているため、これは配列番号３８の２２１位におけるシステインのセリンによる置き換えである）をコードする変異を作製した。ＬＣをコードするＤＮＡにおいて、Ｃ２１４Ｓ変更（これは配列番号４０の２１４位におけるシステインのセリンによる置き換えである）をコードする変異を作製した。まとめると、これらの変更は、これらの位置に通常存在するシステイン残基間の天然の鎖間ジスルフィド架橋を完全に排除する。さらに、ＨＣをコードするＤＮＡは、変更Ｆ１２６Ｃ、Ｌ１２８Ｃ、Ｓ１３４Ｃ、Ｈ１６８Ｃ、Ｋ１３３Ｃ、Ｆ１７０Ｃ、Ｖ１７３ＣまたはＳ１８３Ｃをコードするように変異させた。ＥＵナンバリングスキームに従った１２６、１２８、１３４、１６８、１３３、１７０、１７３および１８３位は、それぞれ配列番号３８における１２７、１２９、１３５、１６９、１３４、１７１、１７４および１８４位と等価である。同様に、ＬＣをコードするＤＮＡは、変更Ｆ１１６Ｃ、Ｉ１１７Ｃ、Ｆ１１８Ｃ、Ｑ１２４Ｃ、Ｑ１６０Ｃ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１７４Ｃ、Ｓ１７６ＣまたはＦ２０９Ｃをコードするように変異させた。ＥＵナンバリングに従った１１６、１１７、１１８、１２４、１６０、１６２、１７４、１７６および２０９位は、配列番号４０におけるこれらの同じ位置と等価である。
変更バージョンの抗ＰＤ１抗体をコードするＤＮＡ構築物の第２のセットも同様の様式で作製した。ＳＰと、それに続く抗ＰＤ１ １０２抗体由来のＶＨドメインおよびＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ断片は、ＩＤＴ，Ｉｎｃ．によって合成され、Ｇｉｂｓｏｎ反応によって、哺乳動物発現ベクターにおいて、ヒトＩｇＧ４抗体のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードする下流ＤＮＡ断片と融合された。配列番号２３は、ＣＤＲにおいて、およびＶＨドメインのフレームワーク領域における３個の追加的なアミノ酸においてのみ抗ＰＤ１ １０２抗体ＨＣのものとは異なる、抗ＰＤ１抗体１６１３７のＨＣのアミノ酸配列を提供する。抗ＰＤ１ １０２抗体ＨＣと同様に、抗ＰＤ１抗体１６１３７ ＨＣは、Ｆａｂアーム交換を防止するために、２２８位（ＥＵナンバリングを使用）にプロリンを有する（参照により本明細書に組み込むＳｉｌｖａら（２０１５年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２９０巻（９号）：５４６２〜５４６９頁）。ＳＰと、それに続く抗ＰＤ１ １０２抗体由来のＶＬおよびＣＬドメインをコードする第２のＤＮＡ断片は、ＩＤＴ，Ｉｎｃ．によって合成され、Ｇｉｂｓｏｎ反応によって、哺乳動物発現ベクターと融合された。配列番号２４は、ＣＤＲにおいて、およびＶＬドメインのフレームワーク領域における５個の追加的なアミノ酸においてのみ抗ＰＤ１ １０２抗体ＬＣのものとは異なる、抗ＰＤ１抗体１６１３７のＬＣのアミノ酸配列を提供する。反応混合物をエレクトロポレーションによってコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅに形質転換し、抗生物質カルベニシリンを含有するＬＢ−寒天プレート上に蒔いた。その結果得られるコロニーを採取し培養し、単離されたプラスミドＤＮＡのインサート配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ複数部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ ｎｏ．２１０５１６）を使用して、アミノ酸置換を抗ＰＤ１抗体に導入した。Ｃ１３１（ＨＣ）およびＣ２１４（ＬＣ）の間のジスルフィド架橋を排除するために、変更Ｃ１３１Ｓ（ＨＣ）およびＣ２１４Ｓ（ＬＣ）を有する抗体をコードするＨＣおよびＬＣ ＤＮＡ構築物における変異を作製した。さらに、ＨＣ変更Ｆ１２６Ｃ、Ｐ１２７Ｃ、Ｌ１２８Ｃ、Ｈ１６８Ｃ、Ｆ１７０Ｃ、Ｖ１７３ＣまたはＳ１８３ＣおよびＬＣ変更Ｆ１１８Ｃ、Ｓ１２１Ｃ、Ｑ１２４Ｃ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１７４ＣまたはＳ１７６Ｃを有する抗体をコードするＤＮＡ構築物を作製した。Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐキットを使用することにより、高品質プラスミドＤＮＡ（ＯＤ２６０／２８０＝１．９０〜２．００）を調製した。プラスミドＤＮＡを水に希釈し、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ ＴＵＢＥＳ（登録商標）において混合した。
直ぐ上に記載されている変更された抗体の全ては、Ｃ１３１（ＩｇＧ４ ＨＣ）またはＣ２２０（ＩｇＧ１ ＨＣ）およびＣ２１４（ＬＣ）の間に通常存在するジスルフィド架橋が欠損していたが、ジスルフィド架橋を潜在的に形成し得るＨＣおよびＬＣにシステイン残基の追加的な対を有する。ＨＣ／ＬＣ対をコードする２種のＤＮＡを組み合わせて、ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）にトランスフェクトし、トランスフェクタントによって培養培地へと分泌された抗体をウエスタンブロッティングによって可視化した。トランスフェクタントが、約１５０キロダルトン（ｋＤａ）のサイズの全長抗体を産生した場合、ジスルフィド架橋形成が成功裏のものであると判断した。
より詳細には、ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞に、２４ウェルディープウェルブロックにおいてＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００により、被験抗体をコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。１５０毎分回転数（ｒｐｍ）で３７℃にて４日間、細胞を連続的に振盪した。細胞を１５００ｒｐｍで２０分間スピンダウンすることにより上清を収集した。非還元試料のため、５マイクロリットル（μｌ）の上清および５μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（６５．８ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２６．３％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を７０℃で１０分間加熱した。還元試料のため、５μｌの上清および５μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液を、１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下、７０℃で１０分間加熱した。図５および図６に示すウエスタンブロットにおいて、全試料が非還元であった。処理した試料を、４〜１５％ＣＲＩＴＥＲＩＯＮ（商標）ＴＧＸ ＳＴＡＩＮ−ＦＲＥＥ（商標）プレキャストＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ｃａｔ ｎｏ．５６７−８０８５）のウェルにロードした。４５分間２００Ｖで電気泳動を行った。ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ（登録商標）ＴＵＲＢＯ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてタンパク質をニトロセルロース膜に移し、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）中の３％脱脂乳においてブロッキングした。ニトロセルロース膜を洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートされたポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ０１７０）により抗体を検出した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製のＣＨＥＭＩＤＯＣ（商標）ＸＲＳ＋撮像装置により画像を可視化した。
図５および図６に結果を示す。実施例１に説明されている通り、ＨＣは一般に、ＬＣによって係合されない限り、ＥＲ中に保持される。したがって、導入されたシステイン残基が、ジスルフィド架橋を形成している場合、ＨＣはＬＣによって係合され、したがって、トランスフェクタントが、図５の上矢印および図６の１５０ｋＤａサイズマーカーによって示される約１５０ｋＤａの全長抗体を主に産生することが予想されるであろう。しかし、１個のＨＣおよび１個のＬＣからなる半抗体（７５ｋＤａ；図５の下矢印）、２個の同一ＨＣおよび１個のＬＣを含有する４分の３抗体（１２５ｋＤａ；図５の上から２番目の矢印）ならびに２個のＨＣ（１００ｋＤａ；図５の上から３番目の矢印および図６の１００ｋＤａサイズマーカー）など、他の種がおそらく産生される場合がある。そのような種は、導入されたシステイン残基が、ジスルフィド架橋の形成において完全に有効というわけではない状況で産生され得る。
ＨＣおよびＬＣの両方が、接触部位においてシステインにより置換されない限り、Ｃ１３１（ＩｇＧ４ ＨＣ）またはＣ２２０（ＩｇＧ１ ＨＣ）およびＣ２１４（ＬＣ）に通常存在するシステイン残基（天然の鎖間ジスルフィド架橋を形成する）を欠く抗体は、全長抗体を形成しないことが予想された。天然のジスルフィド架橋を欠き、いかなるシステイン置換も含有しない抗体を使用したデータは、図６、レーン２および８に示す。１００ｋＤａ種（おそらくＨＣ／ＨＣ）のみが検出された。天然のジスルフィド架橋を欠き、そのＨＣにシステイン置換を含有するがそのＬＣには含有しない（または逆もまた同じ）抗体を使用した結果は、図５のレーン１４〜２２およびレーン２５〜３３に示す。予想される通り、これらのＨＣ／ＬＣ組み合わせの大部分は、有意な分量の全長抗体を産生せず、大部分は１００ｋＤａ種（おそらくＨＣ／ＨＣ）を産生した。驚いたことに、これらのＨＣ／ＬＣ組み合わせのうち３種が全長抗体、すなわち、ＣＨ１ドメインにおけるＫ１３３ＣおよびＬＣにおける置換なし（図５、レーン１５）、ならびにＬＣにおけるＩ１１７ＣまたはＦ２０９ＣおよびＨＣ ＣＨ１ドメインにおける置換なし（図５、それぞれレーン２６および２７）を形成した。図５のレーン２〜１２は、ＨＣおよびＬＣの両方が、図５の記載に示されている通り、接触部位においてシステイン置換を含有し、天然のジスルフィド架橋を形成するシステインを欠いた、ＨＣ／ＬＣ組み合わせ由来のデータを示す。これらのＨＣ／ＬＣ組み合わせのうち２種（その両方が、Ｓ１８３Ｃ（ＨＣ）とＳ１７６Ｃ（ＬＣ）を含有した（レーン８および１２））以外の全てが、有意な分量の全長抗体を形成した。同様に、天然のジスルフィド架橋を欠き、接触残基にシステイン置換を含むさらなる試料の解析は、大部分は全長抗体を検出した。図６、レーン３〜６および９〜１１。
よって、これらのデータは、システイン残基の導入された対の全てではないが大部分が、ジスルフィド架橋を形成したことを示唆するが、検出可能な分量の全長に満たない抗体種の存在は、抗体分泌の動態が、導入されたシステイン残基によって影響され得ることを示唆する。具体的には、結果は、ヒトＩｇＧ１抗体において、システイン置換Ｆ１２６Ｃ（ＣＨ１）−Ｑ１２４Ｃ（ＣＬκ）、Ｌ１２８Ｃ（ＣＨ１）−Ｆ１１８Ｃ（ＣＬκ）、Ｓ１３４Ｃ（ＣＨ１）−Ｆ１１６Ｃ（ＣＬκ）、Ｈ１６８Ｃ（ＣＨ１）−Ｓ１７４Ｃ（ＣＬκ）、Ｋ１３３Ｃ（ＣＨ１）−Ｉ１１７Ｃ（ＣＬκ）、Ｋ１３３Ｃ（ＣＨ１）−Ｆ２０９Ｃ（ＣＬκ）、Ｖ１７３Ｃ（ＣＨ１）−Ｑ１６０Ｃ（ＣＬκ）、Ｆ１７０Ｃ（ＣＨ１）−Ｓ１６２Ｃ（ＣＬκ）およびＦ１７０Ｃ（ＣＨ１）−Ｓ１７６Ｃ（ＣＬκ）が、ジスルフィド結合形成を媒介し得ることを示唆する。さらに、結果は、ヒトＩｇＧ４抗体において、システイン置換Ｆ１２６Ｃ（ＣＨ１）−Ｓ１２１Ｃ（Ｃκ）、Ｆ１２６Ｃ（ＣＨ１）−Ｑ１２４Ｃ（Ｃκ）、Ｐ１２７Ｃ（ＣＨ１）−Ｓ１２１Ｃ（Ｃκ）、Ｌ１２８Ｃ（ＣＨ１）−Ｆ１１８Ｃ（Ｃκ）、Ｈ１６８Ｃ（ＣＨ１）−Ｓ１７４Ｃ（Ｃκ）、Ｖ１７３Ｃ（ＣＨ１）−Ｓ１６２Ｃ（Ｃκ）およびＦ１７０Ｃ（ＣＨ１）−Ｓ１６２Ｃ（Ｃκ）が、ジスルフィド結合形成を媒介し得ることを示唆する。
（実施例３：電荷対置換および／またはシステイン置換である、ＬＣおよびＨＣパートナー指向性変更を含有する抗体混合物の試験）
公開された三次構造の解析により、電荷−対またはシステイン置換の作製に適したＨＣおよびＬＣにおけるいくつかの接触残基対の正体を決定し（実施例１および２）、一部のシステイン置換を作製および試験したが、いくつかのそのような置換およびそれらの組み合わせを作製および試験して、同族ＨＣ／ＬＣ対合に対するそれらの効果を決定した。同族ＨＣ／ＬＣ対合の強制における様々なＬＣおよびＨＣパートナー指向性変更の有効性を迅速に評価するために、後述する「鎖ドロップアウト」実験を行った。
実施例２に記載されている方法と同様の方法を使用して、抗体をコードするＤＮＡ構築物を作製した。実施例２において抗ＣＴＬＡ４ １Ｅ１抗体のＨＣについて記載されている通りに、ヒト抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体（「１１１抗体」）のヒトＩｇＧ１ ＨＣをコードするＤＮＡ断片を作製した。１１１抗体のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびにＶＨドメインのフレームワーク領域は、１Ｅ１抗体のＨＣと同じアミノ酸配列を有する。１Ｅ１抗体のＨＣのアミノ酸配列は、配列番号３８に示す。実施例２において抗ＣＴＬＡ４ １Ｅ１抗体について記載されている通りに、ＳＰならびにヒト抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体のＬＣのＶＬおよびＣＬκドメインをコードする別のＤＮＡ断片も作製した。１１１抗体のＣＬドメインおよびＶＬドメインのフレームワーク領域は、その配列を配列番号４０に示す、１Ｅ１抗体のＬＣと同じアミノ酸配列を有する。
抗ＰＤ１ １０２抗体のＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡインサートを含有するベクターの構築は、実施例２に記載されている。
同様の構築を行い、４Ｄ５−８および２Ｃ４と呼ばれる抗ＨＥＲ２抗体の対をコードするＤＮＡを得た。抗体４Ｄ５−８は、その全体を本明細書に組み込むＣａｒｔｅｒら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９巻：４２８５〜４２８９頁に記載されている抗体ｈｕｍＡｂ４Ｄ５−８由来の可変領域、ならびにヒトＩｇＧ１ ＨＣおよびヒトκＬＣ由来の定常領域を含有する。抗体２Ｃ４は、その全体を本明細書に組み込むＡｄａｍｓら（２００６年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５５巻（６号）：７１７〜７２７頁に記載されている抗体ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４由来の可変領域、ならびにヒトＩｇＧ１ ＨＣおよびヒトκＬＣ由来の定常領域を含有する。４Ｄ５−８の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９および２０に示す。２Ｃ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２１および２２に示す。
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ複数部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ｃａｔ ｎｏ．２１０５１６）を用いた変異誘発反応によって、抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ１抗体または２種の抗ＨＥＲ２抗体をコードするＤＮＡにアミノ酸置換を導入した。各ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅプロセスは、所望の変異（複数可）を含むインサートを含有するベクターＤＮＡをもたらし、次いでこれをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。これらの形質転換由来のコロニーを採取し培養して、哺乳動物細胞へのトランスフェクションのためのプラスミドＤＮＡを得た。ＤＮＡ配列決定によって全構築物の配列を確認した。
Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｎ．Ｖ．、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、これらの培養されたコロニー由来のプラスミドＤＮＡを精製した。その結果得られるＤＮＡを水に希釈し、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ ＴＵＢＥＳ（登録商標）において混合した。バリアント対毎に、混合ＤＮＡの５個のチューブのセットを、ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）に一過性にトランスフェクトして、ＨＣ／ＬＣ対合の忠実度をモニターした。チューブ１は、両方の全長抗体をコードするＤＮＡ、例えば、抗ＰＤ１ ＨＣおよびＬＣ（ＨＣ１およびＬＣ１）ならびに抗ＣＴＬＡ４ ＨＣおよびＬＣ（ＨＣ２およびＬＣ２）をコードするＤＮＡを含有した。チューブ２は、１種の抗体（ＨＣ１およびＬＣ１）のみをコードするＤＮＡを含有した。チューブ３は、非同族ＨＣ／ＬＣ対（ＨＣ１およびＬＣ２）をコードするＤＮＡを含有した。チューブ４は、１種の抗体（ＨＣ２およびＬＣ２）のみをコードするＤＮＡを含有した。チューブ５は、非同族ＨＣ／ＬＣ対（ＨＣ２およびＬＣ１）をコードするＤＮＡを含有した。無関係の抗体をコードするＤＮＡを並行してトランスフェクトしして、トランスフェクション効率を評価した。
２４ウェルディープウェルプレートにおいてＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、哺乳動物ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞に上述のＤＮＡをトランスフェクトした。１５０ｒｐｍで３７℃にて４日間、細胞を連続的に振盪した。細胞を１５００ｒｐｍで２０分間スピンダウンすることにより、解析のために上清を収集した。実施例２に説明されている通りに、試料を調製し、電気泳動に付し、ゲルをブロットし、ニトロセルロース膜をブロッキングし、洗浄し、抗体を検出した。
トランスフェクションに使用した哺乳動物ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞は、ＤＮＡを転写し、ｍＲＮＡを翻訳し、抗体を培養培地へと分泌することができる。培養培地における抗体の非還元試料のウエスタンブロッティングを行って、ＨＣ／ＬＣ対合をモニターした。上に説明されている通り、バリアントの各対について上述の５種の異なるＤＮＡ混合物を使用した５種の共トランスフェクションが存在した。初期判断基準（表１７を参照）として、同族ＨＣ／ＬＣ対をコードするＤＮＡを含有するトランスフェクタントによって産生される全長抗体のレベルが、非同族ＨＣ／ＬＣ対をコードするＤＮＡのみを含有するトランスフェクタントによって産生されるレベルよりも高かった場合（すなわち、上述のチューブ３および５）、バリアントの特定の対が成功裏のものであると判断した。最終的に（表２０および２１を参照）、大部分のまたは唯一の同族ＨＣ／ＬＣ対合の強制において、ＬＣ１およびＨＣ１（上述のチューブ２）、ＬＣ２およびＨＣ２（チューブ４）ならびにＬＣ１、ＨＣ１、ＬＣ２およびＨＣ２（チューブ１）をコードするＤＮＡを含有するトランスフェクタント由来の試料が全て、優れたレベルの全長抗体を産生した一方で、ＨＣ１およびＬＣ２（上述のチューブ３）ならびにＨＣ２およびＬＣ１（チューブ５）をコードするＤＮＡを含有するトランスフェクタント由来の試料が、検出可能な全長抗体をほとんどまたは全く産生しなかった場合、特定のバリアント混合物が成功裏のものであると判断した。
そのようなウエスタンブロットの例を図７〜図１０に示す。図７において、レーン２１および２２は、トランスフェクション効率のための対照として含まれた全長抗体である、抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８および２Ｃ４をそれぞれコードするＤＮＡを受け取ったトランスフェクタント由来の試料を示す。被験トランスフェクタントのＤＮＡ含量を、図７のレーン１〜２０の下に示し、試験したバリアントの対の名称を上に示す。バリアントの対における変更の正体を下表２１に記す。図７に示す結果は、バリアント混合物１８Ｂおよび１８Ｃが、同族ＨＣ／ＬＣ対合の強制において、混合物１８Ａおよび１８Ｄよりも有効であったことを示す。非同族１８Ｂまたは１８Ｃ ＨＣ／ＬＣ対のみを含有するトランスフェクタントは、検出可能な全長抗体をほとんどまたは全く産生しなかった（図７、レーン８、１０、１３および１５）が、同族１８Ｂまたは１８Ｃ ＨＣ／ＬＣ対を含有するトランスフェクタントは、検出可能な全長抗体を産生した（図７、レーン６、７、９、１１、１２および１４）。対照的に、同族ＨＣ／ＬＣ対をコードするＤＮＡを含有する１８Ａチューブ１およびチューブ４トランスフェクタントは、相対的に少ない量の全長抗体を産生し、これは、チューブ４トランスフェクタントにおいてサイズが拡散した。図７、レーン１および４。さらに、１個の非同族ＨＣ／ＬＣ対のみをコードするＤＮＡを含有する１８Ｄトランスフェクタントは、少ない量の全長抗体を産生した（図７、レーン１８）が、同族ＨＣ／ＬＣ対をコードするＤＮＡを含有するトランスフェクタントは、相対的に少ない量の全長抗体のみを産生した（図７、レーン１６、１７および１９）。
同様に、バリアント混合物１４Ａ〜１４Ｄのデータ（表２０を参照）を含有するウエスタンブロットを図８に示す。非同族ＨＣ／ＬＣ対（ＬＣ１＋ＨＣ２またはＬＣ２＋ＨＣ１）のみが組み合わされた場合（図８、レーン１３、１５、１８および２０）、検出可能な抗体発現がなかったため、バリアント１４Ｃおよび１４Ｄは、同族ＨＣ／ＬＣ対合のみを示した一方、同族ＨＣ／ＬＣ対（ＬＣ１＋ＨＣ１またはＬＣ２＋ＨＣ２）または全４種の鎖の混合物（ＬＣ１＋ＨＣ１＋ＬＣ２＋ＨＣ２）は、有意な量の全長抗体を産生した（図８、レーン１１、１２、１４、１６、１７および１９）。対照的に、混合物１４Ａおよび１４Ｂは、非同族ＨＣ／ＬＣ対のみを含有するトランスフェクタント由来の試料を含有するいくつかのレーンにおいて、検出可能な全長抗体を示した（図８、レーン５および１０）。
図９において、バリアント対２３Ａ〜２３Ｄに関する同様のデータを示す。抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ４抗体のこれらの対における変更を表２１に示す。レーン１〜２０の下に示されている通り、バリアントの各対について、５種のＤＮＡ組み合わせのセット（上述の通り）を宿主細胞にトランスフェクトした。抗ＰＤ１抗体（「ａ−ＰＤ１」と標識されたレーン）および抗ＣＴＬＡ４抗体（「ａ−ＣＴＬＡ４」と標識されたレーン）をコードするＤＮＡを同時にトランスフェクトして、トランスフェクション効率をモニターした。細胞に、同族または非同族ＨＣ／ＬＣ対をコードするＤＮＡがトランスフェクトされたかに関係なく、バリアント対２３Ａの抗体鎖をコードするＤＮＡを受け取る宿主細胞は、全長抗体をほとんど産生しなかった。図９、レーン１〜５。バリアント対２３Ｂおよび２３Ｃの鎖をコードするＤＮＡを受け取る宿主細胞は、同族対ＨＣ１およびＬＣ１をコードするＤＮＡが宿主細胞に導入された場合、全長抗体をほとんどまたは全く産生せず（図９、レーン７および１２）、非同族対ＨＣ２およびＬＣ１をコードするＤＮＡの存在下で少ないが検出可能な量の全長抗体を産生した（図９、レーン１０および１５）。対照的に、バリアント対２３Ｄの抗体鎖をコードするＤＮＡを受け取る宿主細胞は、同族ＨＣ／ＬＣ対をコードするＤＮＡが存在した場合、有意な量の全長抗体を産生し（図９、レーン１６、１７および１９）、非同族ＨＣ／ＬＣ対をコードするＤＮＡのみが存在した場合、全長抗体をほとんどまたは全く産生しなかった（図９、レーン１８および２０）。
ＶＨおよびＶＬドメインのみにまたはＣＨ１およびＣＬドメインのみに荷電アミノ酸を導入する変更から開始して、次いでＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬにおける変更を組み合わせて、同様の鎖ドロップアウト実験において、バリアントの多くの対を試験した。場合によっては、追加的なジスルフィド架橋を創出する変更を加えた。変更のそのような対の正体およびウエスタンブロットの結果を、表１７〜２１に列記する。
表１７におけるデータは、ＶＨおよびＶＬならびにＣＨ１およびＣＬにおけるある特定の変更が、同族ＨＣ／ＬＣ対合の強制において、他よりも有効であったことを示す。下表１８に報告される通り、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬドメインに荷電アミノ酸を導入する変更の様々な組み合わせを試験するためのさらなる実験のための出発点として、バリアントの１Ｂ対を選択した。
バリアントの６Ｃおよび７Ｂ対に存在する変更から開始して、導入された全グルタミン酸残基をアスパラギン酸に変化させて、これらの変化が、ＨＣ／ＬＣ対合の選択性に対して効果を有するか決定した。これらの変更およびその効果は、表１９に列記されている。
表１９における結果は、バリアントの対におけるＥのＤへの置換は、非同族ＨＣ／ＬＣ対合と比較して、同族ＨＣ／ＬＣ対合をさらに強化したことを示す。本発明者らは、Ｅと比較してＤの分子サイズがより小さいため、ＶＨ／ＶＬおよびＣＨ１／ＣＬ界面を横切る相互作用に対してより破壊的ではない可能性があることを仮定する。
バリアントの１０Ｂ対に存在する変更から開始して、本発明者らは、ＨＣおよびＬＣの間に追加的なジスルフィド架橋を創出するように設計されたさらなる変更を行った。本発明者らは、そのような追加的なジスルフィド架橋が、その多くが所望の高レベル抗体を発現しなかった、同族ＨＣ／ＬＣ対をコードするＤＮＡを含有するトランスフェクタントからの抗体発現を増加することを望んだ。本発明者らは、電荷対変更が、同族ＨＣ／ＬＣ対を何らかの形で不安定化し、ＥＲにおける抗体の保持を引き起こし、追加的なジスルフィド架橋が、同族対を安定化し、これにより、抗体を検出することができる培養培地への抗体の分泌を増加し得ると仮定した。実施例２において報告される通り、これらのシステイン置換を、電荷対置換の非存在下でも試験して、ＨＣ／ＬＣジスルフィド結合を形成するその能力を確かめた。変更のこれらの組み合わせおよびその効果は、下表２０に列記されている。
これらの結果を異なる抗体対へと拡張するために、実施例２に記載されている変更されたＩｇＧ４抗ＰＤ１ １０２抗体、ならびに変更Ｄ３９９ＫおよびＫ４０９Ｅを含有した（ＨＣ／ＨＣヘテロ二量体の形成に不利になる）上述の変更バージョンのＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体を含有する変更された抗体の対を同様の様式で試験した。表２０で報告した鎖ドロップアウト実験において調査した変更の組み合わせのいくつかを使用して、抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ４抗体の変更された対をコードするＤＮＡを作製し、上述の通り鎖ドロップアウトトランスフェクション実験において試験した。これらの結果は、下表２１において列記されている。
これらのデータは、２種の全長ＩｇＧ１抗体を含有する抗ＨＥＲ２抗体混合物における同族ＨＣ／ＬＣ対合の強制において有効であった荷電対およびシステイン対のための同じ部位のいくつかが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４全長抗体の両方を含有する表２１に記載されている混合物においても有効であったことを示す。表２０における１４Ｃおよび１４Ｄを、表２１における１７Ｃおよび１９Ｃと比較されたい。
加えて、バリアント混合物２３Ａ〜２３Ｄは、ジスルフィド結合の付加による明らかな効果を示す。２３Ａ混合物における抗体は、システイン残基が付加されていないが、２３Ｂおよび２３Ｃ混合物における抗体は、抗ＣＴＬＡ４抗体のみに追加的なジスルフィド結合（システイン置換による）を有することが予想されるであろう。２３Ｄ混合物は、混合物における２種の抗体のそれぞれに追加的なジスルフィド結合を有することが予想されるであろう。表２１。これら４種の抗体混合物をコードするＤＮＡは、システイン置換におけるこれらの差を除いて同じ混合物をコードした。表２１。ＨＣおよびＬＣの両方にシステイン置換を有する抗体の発現は、２３Ａ混合物において観察されるものと比較して、２３Ｂおよび２３Ｃ混合物において強い。図９、レーン１および４を、レーン６および９と、ならびにレーン１１および１４と比較されたい。しかし、混合物２３Ｂおよび２３Ｃ由来のトランスフェクタントにおいて、非同族対のある程度の発現が検出可能である。図９、レーン１０および１５。混合物２３Ｄにおいて、同族ＨＣ／ＬＣ対をコードするＤＮＡを含有する全トランスフェクタントにおいて全長抗体の優れた発現が観察され（図９、レーン１６、１７および１９）、非同族対をコードするＤＮＡのみを含有するトランスフェクタントにおいて発現がほとんどまたは全く検出されなかった（図９、レーン１８および２０）。これらのデータは、混合物における抗体へのジスルフィド結合の付加が、発現（ＥＲからのエスケープを可能にするより強いＨＣ／ＬＣ相互作用によるものである可能性がある）および対合の選択性の両方を増加させることを示す。
さらなる実験において、そのうち１種がパートナー指向性変更を含有しない２種のＩｇＧ抗体をコードするＤＮＡを含有する宿主細胞株において２または３種以下の抗体主要種を産生する方法を調査した。被験試料において、抗体の一方は、いかなるパートナー指向性変更も含有せず、他方は、天然のＨＣ／ＬＣジスルフィド結合を欠き（置換Ｃ２２０Ｓ／Ｇ（ＨＣ２）およびＣ２１４Ｓ（ＬＣ２）により）、一部の試料では、２個の潜在的ＨＣ／ＬＣジスルフィド結合を（接触残基におけるシステイン置換により）、また、場合によっては、ＨＣ／ＬＣ電荷対も（接触残基における荷電アミノ酸の置換により）有した。変更Ｓ２２８Ｐ（Ｆａｂアーム交換を防止するための）のみを含むＩｇＧ４抗ＰＤ１ １０２抗体（ＨＣ１およびＬＣ１を含む）と、被験試料では、天然のジスルフィド架橋を欠き、ヘテロ二量体に不利になる変更（ＨＣにおけるＤ３９９ＫおよびＫ４０９Ｅ）と２個のＨＣ／ＬＣジスルフィド架橋を、また、場合によっては、ＨＣ／ＬＣ電荷対も潜在的に創出する変更を含むパートナー指向性変更を含むように操作されているＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ４抗体１１１（ＨＣ２およびＬＣ２を含む）とをコードするＤＮＡを使用して、上に説明されている通りに鎖ドロップアウト実験を行った。試験したシステイン置換は、それぞれＨＣ２およびＬＣ２における変更の次の対を含んだ：Ｈ１６８ＣおよびＳ１７４Ｃ；Ｖ１７３ＣおよびＱ１６０Ｃ；ならびにＦ１７０ＣおよびＳ１６２Ｃ。試験した荷電アミノ酸の置換は、それぞれＨＣ２およびＬＣ２における変更の次の対を含んだ：Ｋ１４７ＤおよびＳ１３１Ｒ／Ｋ；ならびにＨ１６８ＤおよびＳ１７４Ｋ／Ｒ。試料を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、上述の通り検出のためのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロットによってさらに解析した。結果を図１０に示す。
２種の抗体の無変更バージョンの様々な鎖をコードするＤＮＡをトランスフェクトした細胞は、約１５０ｋＤａの全長ＩｇＧ抗体を産生した。図１０、パネルＡ、レーン１〜５。これらのデータは、非同族ＨＣ／ＬＣ対が、そのような対合を防止する変更の非存在下で全長抗体を産生し得ることを示す。操作された抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体（ＨＣ２およびＬＣ２を含む）における天然のジスルフィド結合の排除は、無変更のＩｇＧ４抗ＰＤ１抗体の両方の鎖、すなわち、ＨＣ１およびＬＣ１をコードするＤＮＡを含有しないあらゆるトランスフェクタントにおける全長ＩｇＧ抗体の形成も防止した。図１０、パネルＡ、レーン６〜１０。天然のジスルフィド結合を欠く操作された抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体への２個の新たな潜在的ジスルフィド結合の付加は、ＨＣ２およびＬＣ２をコードするＤＮＡを含有するトランスフェクタントが全長抗体を産生する能力を回復させた一方、非同族対をコードするＤＮＡのみが存在した場合、全長ＩｇＧ抗体の産生を大幅に減少させた。図１０、パネルＡ、レーン１１〜２５。試験したシステイン置換の対の組み合わせのうち、変更Ｆ１７０ＣとＶ１７３Ｃ（ＨＣ２）およびＱ１６０ＣとＳ１６２Ｃ（ＬＣ２）は、同族ＨＣ２／ＬＣ２対の存在下で全長ＩｇＧの最良の発現を（パネルＡにおけるレーン２４をレーン１４および１９と比較）、非同族ＨＣ／ＬＣ対のみの存在下で全長ＩｇＧの最少の発現をもたらした（パネルＡにおけるレーン２３および２５をレーン１３および１５またはレーン１８および２０と比較）。しかし、試験したシステイン置換の対の他の２種の組み合わせは、ほぼ同様に有効であった。図１０、パネルＡのレーン１１〜２０を参照されたい。これらの変更は、次の通りである：Ｈ１６８ＣとＶ１７３Ｃ（ＨＣ２）およびＱ１６０ＣとＳ１７４Ｃ（ＬＣ２）；ならびにＨ１６８ＣとＶ１７０Ｃ（ＨＣ２）およびＳ１６２ＣとＳ１７４Ｃ（ＬＣ２）。よって、これらの結果は、天然のＨＣ／ＬＣジスルフィド架橋の排除ならびにＨＣおよびＬＣの接触残基における２個のシステイン置換対の付加が、同族ＨＣ／ＬＣ対の堅固な発現および非同族対の少ない発現をもたらし得ることを示唆する。
実験の別のセットにおいて、第２の抗体（天然のジスルフィド架橋を欠いた）への、２個のジスルフィド架橋に加えたＨＣ／ＬＣ電荷対の付加の効果を試験した。Ｋ１４７が荷電アミノ酸であるため、本発明者らは、アミノ酸Ｋ１４７（ＨＣ２）およびＳ１３１（ＬＣ２）の保存された（表７および１０を参照）接触対を選択する。本発明者らは、Ｋ１４７Ｄ／Ｅ変更（ＨＣ２）およびＳ１３１Ｋ／Ｒ変更（ＬＣ２）が、ＨＣ１／ＬＣ２対に同じ極性を有し、ＨＣ２／ＬＣ１対に好ましくない相互作用を有する接触アミノ酸の対を創出し、これにより、非同族対の形成をさらに妨害すると仮定した。実施例１に説明される通り、本発明者らは、荷電アミノ酸を異なる荷電アミノ酸に変化させることが、ＨＣ／ＬＣ界面における立体的衝突を引き起こすことなく許容され得るとも仮定した。そのような立体的衝突が発生した場合、これは、抗体を不安定化し得る。変更は、当然ながら、同族ＨＣ２／ＬＣ２対に追加的な電荷対を創出し、これにより、できれば、抗体を不安定化することなくこの同族対の形成に有利になるはずである。
鎖ドロップアウトトランスフェクションを行い、上述の通り非還元条件下でウエスタンブロッティングによって解析した。結果を図１０、パネルＢに示す。予想される通り、ＨＣ１におけるＳ２２８ＰおよびＨＣ２におけるＤ３９９ＫとＫ４０９Ｅを除いて無変更の、２種の抗体の鎖の様々な組み合わせを含有するトランスフェクタントは、同族または非同族ＨＣ／ＬＣ対が存在するかに関係なく、約１５０ｋＤａの全長ＩｇＧ抗体を産生した。図１０、パネルＢ、レーン１〜５。変更Ｃ２２０Ｓ（ＨＣ２）およびＣ２１４Ｓ（ＬＣ２）の存在下で、ＨＣ２およびＬＣ２への２個のシステイン置換対の付加（Ｆ１７０ＣとＶ１７３Ｃ（ＨＣ２）およびＱ１６０ＣとＳ１６２Ｃ（ＬＣ２））は、ＨＣ２およびＬＣ２のみの存在下で全長ＩｇＧの強い発現を（図１０、パネルＢ、レーン９）、非同族対のみ、すなわち、ＨＣ１／ＬＣ２およびＨＣ２／ＬＣ１の存在下で全長ＩｇＧのほとんど検出できない発現をもたらした（図１０、パネルＢ、レーン８および１０）。Ｋ１４７Ｄ（ＨＣ２）、およびＳ１３１ＫまたはＳ１３１Ｒのいずれか（ＬＣ２）のさらなる付加は、非同族対のみの存在下で全長ＩｇＧのあるとしてもさらに少ない発現をもたらした。図１０、パネルＢ、レーン１３、１５、１８および２０。したがって、これらの結果は、パネルＡの結果と組み合わせて、被験電荷対の付加が、ＨＣ２／ＬＣ２対の堅固な発現と、非同族対のあるとしてもごく僅かな発現をもたらしたことを示唆する。
実験の第３のセットにおいて、第２の抗体（天然のジスルフィド架橋を欠き、２個の導入されたジスルフィド架橋を有する）への、任意選択でＫ１４７Ｄ（ＨＣ２）およびＳ１３１Ｋ／Ｒ（ＬＣ２）と共に、異なる電荷対、すなわち、Ｈ１６８Ｄ（ＨＣ２）およびＳ１７４Ｋ／Ｒ（ＬＣ２）の付加の、ＨＣ／ＬＣ対合の効率および特異性に対する効果を試験した。Ｋ１４７Ｄ（ＨＣ２）およびＳ１３１Ｋ／Ｒ（ＬＣ２）と同様に、本発明者らは、Ｈ１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ２）およびＳ１７４Ｋ／Ｒ（ＬＣ２）が、ＨＣ１／ＬＣ２対に同じ電荷極性（ＨＣ１におけるＨ１６８およびＬＣ２におけるＳ１７４Ｋ／Ｒは両方とも正に荷電しているため）およびおそらくＨＣ２／ＬＣ１対合に対するある程度の反発を有する接触アミノ酸の対を創出し、これにより、非同族対合の形成をさらに妨害すると仮定した。加えて、これらの変更は、当然ながら、同族ＨＣ２／ＬＣ２対に追加的な電荷対を創出し、これにより、この同族対を潜在的に安定化するであろう。
鎖ドロップアウトトランスフェクションを行い、上述の通り非還元条件下でウエスタンブロッティングによって解析した。結果を図１０、パネルＣに示す。第２の抗体が、Ｈ１６８Ｄ（ＨＣ２）およびＳ１７４Ｋ（ＬＣ２）（天然のジスルフィド架橋を欠き、接触残基に２個のシステイン置換対を有することに加えて）を含む場合、同族ＨＣ２／ＬＣ２対の発現が堅固である（図１０、パネルＣ、レーン４）一方、非同族ＨＣ／ＬＣ対のあるとしてもごく僅かな発現が検出される（図１０、パネルＣ、レーン３および５）。第２の抗体が、Ｈ１６８Ｄ（ＨＣ２）およびＳ１７４Ｒ（ＬＣ２）を含む場合、同様の結果が得られるが、同族ＨＣ２／ＬＣ２対の発現は、それほど堅固ではない。図１０、パネルＣ、レーン６〜１０。第２の抗体が、Ｈ１６８ＤとＫ１４７Ｄ（ＨＣ２）およびＳ１７４ＫとＳ１３１Ｋ（ＬＣ２）（天然のジスルフィド架橋を欠き、接触残基に２個のシステイン置換対を有することに加えて）を含む場合、ＨＣ２／ＬＣ２の発現が堅固であり（図１０、パネルＣ、レーン１４）、非同族対の発現がほとんどまたは全く観察されず（図１０、パネルＣ、レーン１３および１５）、レーン１３において特に明らかな効果が観察される。この最後の結果は、ＨＣ１／ＬＣ２対が、この状況では、同じ電荷を有する接触アミノ酸の２個の対を含有するという事実によって説明することができる。興味深いことに、第２の抗体が、Ｈ１６８ＤとＫ１４７Ｄ（ＨＣ２）およびＳ１７４ＲとＳ１３１Ｒ（ＬＣ２）（天然のジスルフィド架橋を欠き、接触残基に２個のシステイン置換対を有することに加えて）を含む場合、ＨＣ２／ＬＣ２対の発現は、全く堅固でないが（図１０、パネルＣ、レーン１９をレーン１４と比較）、非同族対の発現は、同様に非常に低い（図１０、パネルＣ、レーン１８および２０）。
総合すると、図１０における結果は、次の結論を示唆する。先ず、２種の異なるＩｇＧ抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトした宿主細胞において、第２の抗体における天然の鎖間ＨＣ／ＬＣジスルフィド架橋の排除は、その全長抗体（ＨＣ２／ＬＣ２）の発現、および第２の抗体のいずれかの鎖（ＨＣ２／ＬＣ１およびＨＣ１／ＬＣ２）を含む非同族対の発現を本質的に防止する。しかし、システイン置換のさらなる付加（第２の抗体に２個の新たなジスルフィド架橋を潜在的に創出する）は、非同族対の発現を実質的に回復させることなく、ＨＣ２／ＬＣ２の発現を回復させる。第２の抗体への１または２個のＨＣ２／ＬＣ２電荷対のさらなる付加は、ＨＣ２／ＬＣ２の発現をさらに増強し、非同族対の発現をさらに減少させる。最後に、リシンとアスパラギン酸を含有するＨＣ２／ＬＣ２電荷対は、アルギニンとアスパラギン酸を含有する電荷対よりも高いＨＣ２／ＬＣ２発現をもたらした。総合すると、これらのデータは、抗体のうち１種のみが、パートナー指向性変更を含む場合であっても、２種の異なるＩｇＧ抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトした宿主細胞が、同族ＨＣ／ＬＣ対を有する抗体を優勢に産生し得ることを示唆する。ヘテロ二量体に不利になる変更の非存在下で、３つの主要抗体種のみが、潜在的に産生され得、ＨＣ１／ＨＣ２ヘテロ二量体に不利になる変更の存在下で、２つの主要抗体種のみが、潜在的に産生され得る。
（実施例４：ＨＣ／ＨＣヘテロ二量体に不利になる変更の同定）
２種の異なる全長抗体をコードするＤＮＡ、すなわち、２種の異なるＨＣおよび２種の異なるＬＣをコードするＤＮＡが、宿主細胞に導入される場合、細胞は、ＨＣおよびＬＣの異なる組み合わせを有する１０種の異なる抗体を潜在的に産生することができた。図４；Ｃａｒｔｅｒ（２００１年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８巻：７〜１５頁。そのような宿主細胞において産生される抗体種の数を低下させるために、２種の異なるＨＣは、排他的ではないにしても大部分は、ＨＣ／ＨＣホモ二量体を形成するように操作され得、ＨＣおよびＬＣは、大部分はまたは唯一同族ＨＣ／ＬＣ対合が発生するように操作され得る。実施例１〜３は、この後者の課題に取り組む。本実施例は、２種の異なるＨＣの間のＨＣ／ＨＣヘテロ二量体形成を完全に排除しないにしてもこれに不利になるように設計されたＨＣにおける様々な変更の作製および試験について記載する。
ヘテロ二量体ＨＣ／ＨＣ対を排除する目標を達成するであろう変更を同定するために、そのＣＨ３ドメインに異なる変更を有する１個のＦｃ断片および１個の同族ＨＣ／ＬＣ対を含むタンパク質の対をコードするＤＮＡのパネルを作製した。これらのＤＮＡを、これらを発現し得る宿主細胞に導入し、宿主細胞によって産生された抗体を、上述の通りＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって解析して、ＤＮＡが導入された宿主細胞によって産生されるＨＣ−ＬＣ／Ｆｃヘテロ二量体、ＨＣ−ＬＣ／ＨＣ−ＬＣホモ二量体およびＦｃ／Ｆｃホモ二量体の相対量を決定した。
実施例２および３に説明されるＰＣＲおよびＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを使用して、Ｆｃ断片、およびＣＨ３ドメインに異なる変更を有するＨＣ／ＬＣ対をコードするＤＮＡ構築物を生成した。Ｆｃ断片ならびに異なる変更を含む全長ＨＣおよびＬＣをコードするその結果得られるＤＮＡを、ＨＥＫ２９３宿主細胞に共トランスフェクトし、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）製のＥＸＰＩ２９３（商標）発現システムを使用して発現させた。宿主細胞によって産生された抗体を含有する馴化培地を、４日間の培養後にトランスフェクタントから収集した。
実施例２および３に説明される通り、非還元条件下のウエスタンブロッティングによって培地における抗体を検出した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製のＩＭＡＧＥ ＬＡＢ（商標）ソフトウェアによるＣＨＥＭＩＤＯＣ（商標）ＸＲＳ＋Ｓｙｓｔｅｍを使用した可視化後に、ＩＭＡＧＥ ＬＡＢ（商標）ソフトウェアを使用して、変更されたタンパク質の様々な対をコードするＤＮＡをトランスフェクトした宿主細胞によって産生されるパーセンテージＨＣ−ＬＣ／Ｆｃヘテロ二量体を計算した。
図１１は、ＬＣおよび野生型ヒトＩｇＧ４ ＨＣと変更されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片（Ｋ３７０（右上パネル）、Ｋ３９２（左上パネル）またはＶ３９７（左下パネル）位に様々な単一の置換を有する）をコードするＤＮＡの対を含有するトランスフェクタントの培養培地から採取された試料のウエスタンブロットを示す。これらの位置のそれぞれは、ＣＨ３／ＣＨ３界面に存在し（例えば、参照により本明細書に組み込むＷＯ２０１５／０１７５４８、８頁の表１を参照）、Ｋ３７０およびＫ３９２も、三次構造において４０９位（これは、ＩｇＧ４においてＲであり、ＩｇＧ１においてＫである）に近接している。Ｖ３９７は、Ｋ３９２に近接している。したがって、特に、一方の重鎖がＩｇＧ４であり、他方がＩｇＧ１である場合、これらの残基が、ＣＨ３ドメイン間の相互作用の強化または弱化における役割を果たし得ることが可能であった。しかし、図１１におけるデータは、３つ全ての部位における置換のいくつかが、本来のアミノ酸をより大きいアミノ酸により置き換えた場合であっても、試験した置換のいずれも、Ｆｃ断片が変更されなかった場合に観察されるものと比較して、ヘテロ二量体のパーセンテージ（「ＨＣ／Ｆｃ」として示す）を実質的に低下させなかったことを示す。図１１のレーン１８を図１１における他の全レーンと比較されたい。
さらなる実験において、ヒトＩｇＧ４ ＨＣ（Ｆａｂアーム交換を防止するために含まれる単一の変更Ｓ２２８Ｐ以外は野生型であった）ならびにＤ３９９および／またはＫ４０９に変更を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片をコードするＤＮＡを含有するトランスフェクタント由来の培養培地を解析した。結果を図１２に示す。ＩｇＧ１ Ｆｃ断片における単一の置換Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｋ４０９ＤおよびＫ４０９Ｅは、ヘテロ二量体形成を増加させた。図１２のレーン１を図１２のレーン２〜５と比較されたい。しかし、ＩｇＧ１ Ｆｃ断片が、Ｄ３９９ＫおよびＫ４０９ＥまたはＤ３９９ＫおよびＫ４０９Ｄを含有した場合、ヘテロ二量体は、トランスフェクタントによって産生された総抗体の５％未満を構成した。図１２、レーン６および７。
図１３に示すデータは、例えばＩｇＧ１ ＨＣではなくＩｇＧ４全長ＨＣの使用が、図１２に示す結果における役割を果たしたかという問いに取り組む。図１３において、レーン１０〜１９は、野生型（レーン１０および１５）または変更された（レーン１１〜１４および１６〜１９）ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片および２種の異なるヒトＩｇＧ４ ＨＣ（一方（Ａｂ１）はレーン１０〜１４、他方（Ａｂ２）はレーン１５〜１９）をコードするＤＮＡを含有するトランスフェクタント由来のデータを示す。Ａｂ２ ＩｇＧ４（レーン１５〜１９）およびＡｂ２ ＩｇＧ１（レーン２０〜２４）由来のデータは、これらの抗体が、それぞれＩｇＧ４またはＩｇＧ１形式で同じ可変ドメインを含有するため、直接的に比較可能である。Ｆｃにおける変更は、図１３の表に示されている通り、Ｄ３９９およびＫ４０９位にあった。変更されたＦｃ断片および全長ヒトＩｇＧ４ ＨＣを産生するトランスフェクタントにおいて、ヘテロ二量体はほとんどまたは全く検出されなかった。図１３、レーン１１〜１４および１６〜１９。対照的に、変更されたＦｃ断片および全長ヒトＩｇＧ１ ＨＣを産生するトランスフェクタント由来の培地においてヘテロ二量体が検出可能である。図１３、レーン２１〜２４。よって、これらのデータは、ＩｇＧ１ ＨＣではなくＩｇＧ４ ＨＣの使用が、最低レベルのヘテロ二量体を得るために重要であることを示す。
表８に示す通り、ヒトＩｇＧ４ ＨＣは、４０９位にアルギニンを有する一方、ヒトＩｇＧ１ ＨＣは、４０９位にリシンを有する。次の実験は、この差が、図１３に観察される効果における役割を果たすか、すなわち、ヒトＩｇＧ４ ＨＣと変更された（Ｄ３９９Ｋ／Ｒ、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ）ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを産生する宿主細胞が、ヒトＩｇＧ１ ＨＣと同じ変更されたＩｇＧ１ Ｆｃを産生する宿主細胞よりも低いレベルのＨＣ−ＬＣ／Ｆｃヘテロ二量体を作製したかに関して調べた。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片およびヒトＨＣとＬＣをコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトした。Ｆｃは、野生型（ＷＴ）であった、または図１４に示されている通りの変更を含有した。示されている通り、ＨＣは、ＷＴ ＩｇＧ１、ＷＴ ＩｇＧ４、またはＩｇＧ１をこの位置においてＩｇＧ４のようにする変更Ｋ４０９Ｒを含有するＩｇＧ１のいずれかであった。図１４におけるデータは、宿主細胞が、Ｄ３９９Ｋ／ＲおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含有するＦｃならびに野生型（ＷＴ）ＩｇＧ４または変更Ｋ４０９Ｒを含有するＩｇＧ１のいずれかであるＨＣを産生している場合、ヘテロ二量体のレベル（「ＨＣ／Ｆｃ」として示す）が最低であったことを示す。図１４におけるレーン２〜５および１２〜１５をレーン７〜１０と比較されたい。Ｄ３９９Ｋ／ＲおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含有するＦｃと共にＷＴ ＩｇＧ１ ＨＣが使用された場合、より高いレベルのヘテロ二量体が観察された。図１４、レーン７〜１０。よって、これらの実験において、検出可能なヘテロ二量体形成を本質的に排除する変更が同定された。
（実施例５：サイズによる抗体混合物の評価）
上述の変更された抗体混合物のいくつかに、抗体の種がどれほど存在するかを決定するために、混合物における抗体のサイズを決定した。先ず、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによってこれらの混合物における全長抗体種のサイズを評価し、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって個々のＨＣおよびＬＣのサイズを評価した。非還元条件下での約１５０ｋＤａ（全長抗体）における、および／または還元条件下での約５０ｋＤａ（ＨＣ）および／または２５ｋＤａ（ＬＣ）における複数のバンドの存在は、混合物が、複数の全長抗体種を含有するという概念を支持するであろう。全長抗体種をさらに分解するために、低ｐＨでカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーを行い、これは、１５０ｋＤ付近のサイズ範囲の種の明らかな分解能をもたらした。加えて、少数の抗体混合物由来のＦａｂ断片のサイズを質量分析（ＭＳ）によって決定し、これは、同族および／または非同族ＨＣ／ＬＣ対を含有する抗体混合物においておそらく形成し得る、異なるＦａｂ断片の大部分に予想される範囲の質量差を区別することができる。
バリアントＭａｂＰａｉｒ １７Ｂ、１７Ｃ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１９Ｃ（表２１を参照）をコードするＤＮＡをトランスフェクトした細胞において産生される全長抗体ならびに個々のＨＣおよびＬＣのサイズを評価するために、これらのＭａｂＰａｉｒの２種の抗体のそれぞれのＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡをＥＸＰＩ２９３（商標）細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後に、振盪しながらの４日間のインキュベーション後に培養上清を収集した。抗体をプロテインＡカラムにより精製し、実施例３に記載されている通りに４〜１５％ＣＲＩＴＥＲＩＯＮ（商標）ＴＧＸ ＳＴＡＩＮ−ＦＲＥＥ（商標）プレキャストＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて解析し、実施例２に記載されている通りにブロットし検出した。結果を図１５に示す。
示されている通り、図１５のレーン１〜７は、非還元試料を含有し、レーン８〜１４は、還元試料を含有する。対照として、レーン１および８は、２種の異なる抗ＨＥＲ２抗体（バリアント１４Ｄとして表２０に記載されている変更を有する４Ｄ５−８および２Ｃ４）と各抗体由来の１個のＨＣおよび１個のＬＣを含有する二重特異性を含有することが予想される抗体混合物を含有する。非還元条件下で、この試料は、約１５０ｋＤａの３本のバンドを示し、３種の異なる抗体の存在を示唆する。さらなる対照として、レーン２および９（ＩｇＧ１と標識）は、非還元条件下で約１５０ｋＤａの単一のバンドを示すＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ４抗体を含有し、この試料が、単一の抗体種を含有することを示唆する。非還元条件下で、ＭａｂＰａｉｒバリアント１７Ｂ、１７Ｃ、１８Ｂおよび１８Ｃは、約１５０ｋＤａの２本のバンドを示し（レーン３〜６）、これらの試料が、２種の抗体種を含有することを示唆した。これらの混合物における抗体のうち１種は、ヘテロ二量体形成に不利になる変更を含有し、したがって、混合物は、ＭａｂＰａｉｒ、すなわち、２種の主要抗体種のみを含有する混合物であると予想されるため、このことは予想と合致する。バリアント１９Ｃは、非還元条件下で１本のバンドのみを示し（レーン７）、複数の抗体種が、この試料において共に移動することを示唆した。
還元された場合、対照試料は、約５０ｋＤａの１本のバンドおよび約２５ｋＤａの２本のバンドを示し（図１５、レーン８）、２種の異なるＨＣが、同じ場所に移動した一方、２種の異なるＬＣが、別々に移動したことを示唆した。還元条件下でのＩｇＧ１対照（レーン９）は、約５０ｋＤａの単一のバンドおよび約２５ｋＤａの単一のバンドを示した。全ての還元ＭａｂＰａｉｒバリアント試料は、５０ＫＤａのサイズにおける単一のバンドおよび約２５ｋＤａの２本のバンドを示し（レーン１０〜１４）、２種の異なるＨＣが、一緒に移動した一方、２種の異なるＬＣが、別々に移動したことを示唆した。よって、図１５におけるデータは、実施例３および４におけるデータならびに下のデータと総合すると、１７Ｂ、１７Ｃ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１９Ｃ混合物が、２種以下の主要抗体種を含有することを強く示唆する。
バリアント抗体混合物１Ａ〜１６Ｄ（表１７〜２０）を設計するための出発点として使用される２種のＩｇＧ１抗ＨＥＲ２抗体は、ヘテロ二量体形成に不利になるいかなる変更も含有しなかったため、これらのバリアント混合物は、宿主細胞によって産生された場合に、３種の異なる主要抗体種、すなわち、２個の同一ＨＣおよび２個の同一ＬＣを含有する２種の異なる単一特異性抗体、ならびに２個の異なるＨＣおよび２個の異なるＬＣを含有する二重特異性抗体を含有し得る。この仮説を試験するために、５種のバリアント３イン１混合物、すなわち、１３Ｄ、１４Ｃ、１４Ｄ、１５Ｂおよび１５Ｃ（表２０および図８を参照）の両方のＨＣおよび両方のＬＣをコードするＤＮＡを、振盪フラスコ内の３０〜５０ミリリットル（ｍｌ）のＥＸＰＩ２９３（商標）細胞にトランスフェクトした。上清を収集し、標準プロテインＡカラムを使用して抗体を精製した。１レーン当たり２００ｎｇから開始した１：２系列希釈における異なる量の精製抗体を、４〜１５％ＣＲＩＴＥＲＩＯＮ（商標）ＴＧＸ ＳＴＡＩＮ−ＦＲＥＥ（商標）プレキャストＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）において解析し、実施例２に記載されている通りにブロットし検出した。非還元条件下で（図１６、上パネル）、全ての精製抗体混合物は、約１５０ｋＤａの３本の別個のバンドを示し、これらの混合物が、３種の異なる抗体を含有することを示唆した。還元条件下で（図１６、下パネル）、全ての精製混合物は、５０ｋＤａ前後の１本のバンドおよび２５ｋＤａ前後の２本のバンドを示し、２種の異なるＨＣが、一緒に移動する一方、２種の異なるＬＣが、別々に移動することを示唆した。
１５０ｋＤ前後のサイズ範囲の全長抗体種のより優れた分解能を得るために、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４ ＭａｂＰａｉｒを含有するバリアント抗体混合物１８Ｃ（表２１に記載）を含有する試料において、低ｐＨカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を行った。この方法は、その全体を本明細書に組み込むＣｈｅｎら（２０１０年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９巻：１１９１〜１２０４頁によって記載されている。簡潔に説明すると、この方法は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを使用した、５０ｍｍガードカラム（ＰＲＯＰＡＣ（商標）ＷＣＸ−１０Ｇ）が先行する、Ｔｈｅｒｍｏ ＰＲＯＰＡＣ（商標）ＷＣＸ−１０弱ＣＥＸカラム、４×２５０ｍｍを用いる。３０分間にわたる１００％緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．２）から１００％緩衝液Ｂ（２０ｍＭ酢酸ナトリウムと２５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ５．２）への直線勾配を用いてクロマトグラフィーを行った。カラムを高塩濃度（１Ｍ塩化ナトリウム）で洗浄し、緩衝液Ａの開始条件へと再平衡化する。試料は、１８．８ｍｇのタンパク質を含有し、２１４ｎｍの吸光度によってカラム流出において抗体を検出した。
結果を図１７に示す。図１７に示されている通り、上２つのトレース図は、実施例３および４に記載されている変更の出発点であった抗ＣＴＬＡ４（上）および抗ＰＤ１（上から２番目）抗体のクロマトグラフィーに起因する。下のトレース図は、バリアント抗体混合物１８Ｃ（表２１を参照）のクロマトグラフィーに起因する。ピークの面積から、ＨＰＬＣシステムの制御にも役立つＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）製のＥＭＰＯＷＥＲ（商標）ソフトウェアを使用して、１８Ｃ混合物における構成成分の相対的パーセンテージを計算した。混合物１８Ｃに起因する下のトレース図において、抗ＰＤ１抗体に対応する早く小さい方のピークは、混合物の２１％を構成し、抗ＣＴＬＡ４抗体に対応する遅く大きい方のピークは、混合物の７９％を構成した。これらのデータは、低ｐＨ ＣＥＸが、異なる全長抗体種間を容易に区別し、混合物における特異的抗体種の相対量の定量化に使用することができることを示す。
非同族ＨＣ／ＬＣ対から同族のものを区別することができるデータを得るために、５種の異なるバリアント抗体混合物（１３Ｄ、１４Ｃ、１４Ｄ、１５Ｃおよび１５Ｄ）をコードするＤＮＡを含有するトランスフェクタントの上清をＭＳによって解析した。混合物をパパイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ ｎｏ．４４９８５）で消化して、Ｆａｂ断片を生成した。ＩｇＧ分子が、システインの存在下でパパインと共にインキュベートされると、ヒンジ領域（一般に、Ｈｉｓ２２４〜Ｔｈｒ２２５の間）における１個または複数のペプチド結合が切断され、同様のサイズ（約５０ｋＤ）の３個の断片を産生する：２個のＦａｂ断片および１個のＦｃ断片。遠心分離によってパパインコーティングされた樹脂からＩｇＧ溶液を単純分離することにより消化を直ちに停止させ、本質的に酵素不含の消化物をもたらすことができるため、固定化された酵素が有利である。ＳＹＮＡＰＴ（商標）Ｇ２ ＭＳシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）において消化産物を解析した。ＭＳの高い分解能を考慮すると、ＦａｂおよびＦｃ断片は容易に区別可能であった。後述する解析は、Ｆａｂ断片の予想される質量付近の質量に着目する。
２種の異なるＨＣ（ＨＣ１およびＨＣ２）および２種の異なるＬＣ（ＬＣ１およびＬＣ２）から、４種の異なるＦａｂ断片のみ、すなわち、ＨＣ１／ＬＣ１ Ｆａｂ、ＨＣ１／ＬＣ２ Ｆａｂ、ＨＣ２／ＬＣ２ ＦａｂおよびＨＣ２／ＬＣ１ Ｆａｂが作製され得る。ほとんどの場合、これらの異なるＦａｂ断片は、ＭＳを使用して分離することができる。下表２２は、１３Ｄ、１４Ｃ、１４Ｄ、１５Ｂおよび１５Ｃ抗体混合物の４種の可能なＦａｂ断片の計算質量を示す。
同族ＨＣ／ＬＣ対のみが１４Ｄ混合物に存在する場合、２個のＦａｂ断片、ＨＣ１／ＬＣ１およびＨＣ２／ＬＣ２ Ｆａｂのみが、パパイン消化から回収されたＦａｂ断片に存在するであろう。図１８は、１４Ｄ抗体混合物由来のＦａｂ断片のＭＳ解析の結果を示す。一方は約４７，８７７ダルトン、他方は約４７，９４２ダルトンの、２種の主要種が検出された。図１８。これらは、ＨＣ１／ＬＣ１ Ｆａｂ（予測サイズ４７，８７５．０７ダルトン）およびＨＣ２／ＬＣ２ Ｆａｂ（予測サイズ４７，９４３．２２ダルトン）である可能性がある。認識可能な分量の非同族ＨＣ／ＬＣ対が混合物に存在した場合には、４８，０８１．４４ダルトンおよび／または４７，７３６．８５ダルトン前後の２種の他のピークが検出されたはずである。そのようなピークは検出されず、ＭＳを使用して実際に検出されるピークから容易に分離できるため、これらのデータは、１４Ｄ混合物における全てではないにしても大部分のＨＣ／ＬＣ対が同族ＨＣ／ＬＣ対であることを強く示唆する。
ＭＳによって解析した４種の他の試料のうち、１３Ｄおよび１５Ｄ混合物は、図１８に示す結果と同様の結果を生じた、すなわち、同族ＨＣ／ＬＣ対由来のＦａｂ断片について計算される質量とほぼ同じ質量において２個の主要ピークのみが観察された。混合物１４Ｃおよび１５Ｃにおいて、１個の主要ピークのみが観察され、これは、これらの混合物のそれぞれにおける同族ＨＣ／ＬＣ対の１種由来のＦａｂ断片について計算される質量とほぼ同じ質量であった。問題の同族対が、上述の鎖ドロップアウト実験において全長抗体を形成したため、本発明者らは、これらの試料における他の同族ＨＣ／ＬＣ対由来のＦａｂ断片が、Ｆａｂ断片の生成に使用したパパインによって消化されたと仮定する。
（実施例６：１種の抗体がパートナー指向性変更を含有しない、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４ ＭａｂＰａｉｒの特徴付け）
上述のデータは、２種の異なるＩｇＧ抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトした単一の宿主細胞株が、２種の主要抗体種のみを産生することが可能であることを示唆する。これらの実験において、一方または両方の抗体が操作されて、この結果を達成した。次の実験は、抗体の一方が、パートナー指向性変更もヘテロ二量体に不利になる変更も含まず、他方の抗体が、１個または複数のパートナー指向性変更およびヘテロ二量体に不利になる１個または複数の変更を含む、ＭａｂＰａｉｒのさらなる特徴付けを目標とした。そのような抗体をコードするＤＮＡを含有するトランスフェクタントにおいて形成される主要種の数を決定するために、次の実験を行った。
ヒトＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体は、操作された抗体を創出するための出発地点として使用した。抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体の定常ドメインおよび可変ドメインのフレームワーク領域のアミノ酸配列は、配列番号３８（ＨＣ）および配列番号４０（ＬＣ）において報告された抗ＣＴＬＡ４抗体１Ｅ１の配列と同一である。次の変更を含む抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体のＨＣをコードするＤＮＡを構築した：Ｋ１４７Ｄ、Ｆ１７０Ｃ、Ｖ１７３Ｃ、Ｃ２２０Ｇ、Ｒ２５５Ｋ、Ｄ３９９ＲおよびＫ４０９Ｅ。一般に、変更Ｒ２５５Ｋを含むＩｇＧ抗体は、この変更がない抗体と比較して、より速く血清から一掃され、変更Ｄ３９９ＲおよびＫ４０９Ｅは、ＨＣ／ＨＣヘテロ二量体形成を不利にする。次の変更を含む抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体の軽鎖をコードする別のＤＮＡを構築した：Ｓ１３１Ｋ、Ｑ１６０Ｃ、Ｓ１６２ＣおよびＣ２１４Ｓ。
実施例２に記載されているこの操作された抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体、無変更の抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体および無変更バージョンのヒト化ＩｇＧ４抗ＰＤ１ １０２抗体をコードするプラスミドＤＮＡを、これらを含有する培養細菌から回収し、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｎ．Ｖ．、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して精製した。１２５ｍＬ振盪フラスコ内でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、哺乳動物ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞に、各抗体を別々にコードするまたは操作された抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体および抗ＰＤ１ １０２抗体を含有する抗体の混合物をコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。３７℃にて４日間、１５０ｒｐｍで細胞を連続的に振盪した。１５００ｒｐｍで２０分間、細胞をスピンダウンすることにより上清を収集し、標準プロテインＡカラムを使用して、上清中の抗体を精製した。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えるＡｇｉｌｅｎｔ ６２２４精密質量飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計を使用したＭＳによって精製抗体を解析した。結果を図１９に示す。
無変更の抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトしたＥＸＰＩ２９３（商標）細胞に起因する脱グリコシル抗体のＭＳ解析は、この抗体が、１４４，８８９．１６ダルトンの予測される質量から７百万分率（ｐｐｍ）以内である、１４４，８９０．１２ダルトンの質量を有することを示した。図１９、パネルＡ。操作された抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトしたＥＸＰＩ２９３（商標）細胞に起因する脱グリコシル抗体のＭＳ解析は、この抗体が、１４４，７７９．００ダルトンの予測される質量から７ｐｐｍ以内である、１４４，７８０．０２ダルトンの質量を有することを示した。図１９、パネルＢ。抗ＰＤ１ １０２抗体および操作された抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体の両方のＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡをトランスフェクトしたＥＸＰＩ２９３（商標）細胞に起因する脱グリコシル抗体のＭＳ解析は、約１４６，０００ダルトンの２個の主要ピークを生じた。１個のＨＣおよび１個のＬＣを含む可能性がある少量の種（７３，２１４．２０ダルトン）も検出された。図１９、パネルＣ。主要ピークの拡大表示は、１４４，７７９．６９ダルトンの１個のピークおよび１４６，４２６．５８ダルトンの別のピークを明らかにした。図１９、パネルＤ。これらの質量は、操作された抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体（１４４，７７９．００ダルトン）および抗ＰＤ１ １０２抗体（１４６，４２６．２０ダルトン）の予測される質量に、それぞれ４．８ｐｐｍおよび２．６ｐｐｍ以内で適合する。したがって、これらのデータは、抗ＰＤ１ １０２抗体および操作された抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体をコードするＤＮＡを含有する宿主細胞において、２種の主要抗体種のみが産生されたことを示した。
抗ＰＤ１ １０２抗体および操作された抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体の両方のＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡでのＥＸＰＩ２９３（商標）細胞のトランスフェクションに起因する精製された抗体対をさらに解析して、同族ＨＣ／ＬＣ対のみが存在することを確認した。抗体の対をＩｄｅＳプロテアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ ｎｏ．Ｖ７５１１、これは、ヒンジ領域の下にある単一の部位においてＩｇＧ抗体を切断し、Ｆ（ａｂ’）２断片ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む断片を生じる）で消化して、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の存在下で２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）でさらに処理した。２−ＭＥＡおよびＥＤＴＡによる処理は、ＨＣ／ＬＣジスルフィド架橋に実質的に影響を与えることなく、ヒンジ領域ジスルフィド架橋を還元する。よって、この処理は、少ない分量のＬＣおよびＦｄ断片をおそらく伴う、Ｆａｂ’ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む断片を生じることが予想される。ＬＣおよびＦｄ断片は、第１または第２の抗体に由来するか否かに応じて、ＬＣ１（抗ＰＤ１）またはＬＣ２（抗ＣＴＬＡ４）およびＦｄ１（抗ＰＤ１）またはＦｄ２（抗ＣＴＬＡ４）と表記される。図２０、パネルＡを参照されたい。潜在的に、Ｆａｂ’断片は、ＬＣ１とＦｄ１、ＬＣ２とＦｄ２、ＬＣ２とＦｄ１、および／またはＬＣ１とＦｄ２を含有し得る。これらのＦａｂ’断片の計算質量を下表に示す。
消化され２−ＭＥＡとＥＤＴＡとで処理された抗体対のＭＳによる解析は、４８，６０５．６８および４９，４５８．９４ダルトンにおけるピークを生じ、これらは、それぞれ計算されるＦｄ２／ＬＣ２質量（３９ｐｐｍ以内）およびＦｄ１／ＬＣ１ Ｆａｂ’質量（２８ｐｐｍ以内）に適合した。図２０、パネルＢ。Ｆａｂ’断片の計算質量の周囲のサイズ範囲で、他のピークは観察されなかった。よって、これらのデータは、観察されるＨＣ／ＬＣ対の両方が同族対であったことを示す。
操作された抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体における２個の新たに導入されたジスルフィド結合の形成を確認するために、５ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ ｎｏ．２３０３０）を含有するｐＨ７．２のリン酸緩衝液において、１００μｇのこの抗体を室温で２時間インキュベートした。ＮＥＭは、遊離チオール、例えば、ジスルフィド架橋の部分ではないシステイン残基をアルキル化することができる。緩衝液交換によって過剰ＮＥＭを除去した後に、リシルエンドペプチダーゼ（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ｃａｔ ｎｏ．１２５−０５０６１、これは、タンパク質をリシン残基のカルボキシル側で切断する）を１：１０（酵素：タンパク質）比で添加し、反応混合物を３７℃で１６時間インキュベートした。次いで、２５ｍＭのＴｒｉｓ−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ ｎｏ．２０４９０）を使用して、室温で３０分間、混合物の半分を還元した。
リシルエンドペプチダーゼ消化産物の液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）解析を次の通りに行った。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｌａｒｉｓ Ｃ１８−Ａカラム（２．０×２５０ｍｍ、５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）において、還元および非還元試料の逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣを行った。５０μｇの試料をカラムに注射し、カラムを最初は９８％移動相Ａ（水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））および２％移動相Ｂ（９０％アセトニトリル（ＡＣＮ）中０．１％ＴＦＡ）に５分間保持した。２〜２２％移動相Ｂ直線勾配で４０分間、続いて２２〜５２％移動相Ｂ直線勾配で１６０分間により分離を達成した。カラム温度および流量を、それぞれ５０℃および０．２ｍＬ／分に維持した。
ＥＳＩ源を備えるＡｇｉｌｅｎｔ ６２２４精密質量ＴＯＦ質量分析計において陽イオンモードで、カラム流出液のオンラインＭＳ解析を行った。乾燥ガス温度、乾燥ガスフローおよびネブライザーを、それぞれ３５０℃、１２Ｌ／分および４０ｐｓｉｇに設定した。キャピラリー、フラグメンター（ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ）、スキマー１およびＯｃｔ ＲＦ Ｖｐｐを、それぞれ４５００Ｖ、２５０Ｖ、６０Ｖおよび７５０Ｖに設定した。４ＧＨｚ高分解能で１００〜３０００のｍ／ｚ範囲で機器を較正した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＭＡＳＳＨＵＮＴＥＲ（登録商標）ＱｕａｌｉｔａｔｉｖｅおよびＢｉｏＣｏｎｆｉｒｍソフトウェアを使用して、ＬＣ／ＭＳ由来のデータを解析した。
還元 対 非還元リシルエンドペプチダーゼ消化物のカラムプロファイルおよび質量解析の比較により、置換されたシステイン残基Ｆ１７０Ｃ（ＨＣ）−Ｓ１６２Ｃ（ＬＣ）およびＶ１７３Ｃ（ＨＣ）−Ｑ１６０Ｃ（ＬＣ）が、変更された抗ＣＴＬＡ４抗体にジスルフィド結合を実際に形成しているか否かを決定した。非還元条件下で、逆相カラムで保持時間１０３．４８分間におけるピークを検出したが（「３個のジスルフィドで連結されたペプチド」と標識、図２１、パネルＢ）、このピークは還元条件下で存在しなかった（図２１、パネルＣ）。予測されるジスルフィド結合が形成される場合、図２１、パネルＡに示す２個のペプチドが、リシルエンドペプチダーゼ消化後に、１個の鎖内および２個の鎖間ジスルフィド結合によって共有結合により連結されるであろう。非還元条件下で１０３．４８分に検出されるピークにおけるペプチドは、９４４１．３５ダルトン（ペプチドは＋５電荷状態であったため、５×１８８９．０７−４＝９４４１．３５）の現実のモノアイソトピック質量を有し、これは、連結されたペプチドの予測されるモノアイソトピック質量、すなわち、９４４１．３７ダルトンから２ｐｐｍしか離れていない。図２２、パネルＡ。還元条件下で、３９．６５および１１３．０５分間の保持時間において２個のピークが観察され（それぞれ鎖Ａおよび鎖Ｂと標識）、これらは、非還元条件下では存在しなかった。図２１、パネルＣ。これら２個のピークは、７３２１．４８ ダルトン（１８３１．１２×４−３＝７３２１．４８）および２１２６．９０ダルトン（１０６３．９５×２−１＝２１２６．９０）の現実のモノアイソトピック質量を有し（図２２、パネルＢおよびＣ）、これらは、それぞれ鎖ＡおよびＢの理論上のモノアイソトピック質量（図２１、パネルＡの）と正確に適合した。
加えて、直ぐ上に議論されているＮＥＭ処理された無変更の抗ＣＴＬＡ４ 対 操作された抗ＣＴＬＡ４抗体の質量解析は、両方が、遊離システイン残基、すなわち、ジスルフィド架橋の部分ではないシステイン残基のほぼ同じパーセンテージを有することを示した。データ図示せず。総合すると、これらのデータは、Ｆ１７０Ｃ（ＨＣ）−Ｓ１６２Ｃ（ＬＣ）およびＶ１７３Ｃ（ＨＣ）−Ｑ１６０Ｃ（ＬＣ）における２個の新たに導入されたシステイン対が、ジスルフィド結合を形成することを示した。
（実施例７：１種の抗体がパートナー指向性変更を含有しない、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４ ＭａｂＰａｉｒの特徴付け）
次の実験を行って、実施例６に記載されているが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４抗体ではなくＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体を含有するＭａｂＰａｉｒなどのＭａｂＰａｉｒの、単一の宿主細胞株において成功裏に作製できるかを決定した。
ヒト定常領域を有するＩｇＧ２抗体のＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡ ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）（他の使用の中でも、Ｇｉｂｓｏｎ反応によるアセンブリに適した二本鎖ＤＮＡ；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）をＩＤＴによって合成した。Ｇｉｂｓｏｎ反応を使用して、これらをアセンブルし、哺乳動物発現ベクターに挿入した。ＨＣは、次の置換を有した：Ｃ１３１Ｓ、Ｋ１４７Ｄ、Ｆ１７０Ｃ、Ｖ１７３Ｃ、Ｄ３９９ＲおよびＫ４０９Ｅ。これらのうち最初の４つを使用して、同族ＨＣ／ＬＣ対合を増強し、非同族ＨＣ／ＬＣ対合を妨害し、最後の２つは、ＨＣ１／ＨＣ２ヘテロ二量体形成に不利になる変更であった。この操作されたＨＣのＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４２に示されている。ＬＣは、置換Ｓ１３１Ｋ、Ｑ１６０Ｃ、Ｓ１６２ＣおよびＣ２１４Ｓを有し、これらは、同族ＨＣ／ＬＣ対合の増強および非同族ＨＣ／ＬＣ対合の妨害に使用された。この操作されたＣＬカッパドメインのアミノ酸配列は、配列番号４４に示されている。
上述のプラスミドＤＮＡをＥＸＰＩ２９３（商標）細胞に一過性にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を培養することにより、この操作されたＩｇＧ２抗体を単独で、または無変更のＩｇＧ４ 抗ＰＤ１ １０２抗体（実施例２に記載）と組み合わせて発現させた。発現された抗体を細胞上清から回収し、プロテインＡカラムを使用して精製した。ＰＮＧａｓｅ Ｆによる脱グリコシル後に、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体の両方をコードするＤＮＡをトランスフェクトした細胞から精製された抗体の質量分析を行った。下表２４において、上述のＩｇＧ２（ＨＣ２およびＬＣ２を含む）およびＩｇＧ４（ＨＣ１およびＬＣ１を含む）抗体のあらゆる可能な同族および非同族ＨＣ／ＬＣ対合に起因する、ＨＣのＣ末端リシン（これは、哺乳動物細胞においてカルボキシルペプチダーゼによって大部分は除去される）を欠く全長脱グリコシルＩｇＧ抗体の計算質量を示す。
実際の質量分析結果を図２３、パネルＡに示す。２個の主ピークが検出された。２個のうち小さい方は、１４３，６６６．７７ダルトンにあり、これは、５０ｐｐｍの誤差で、ＩｇＧ２抗体の計算質量（１４３，６５９．６４ダルトン）に適合する。２個のピークのうち大きい方は、１４６，４２６．８１ダルトンにあり、これは、１８ｐｐｍの誤差で、ＩｇＧ４抗体の予測される質量（１４６，４２４．２０ダルトン）に適合する。２個の主ピークのそれぞれは、僅かにより大きい質量にショルダーピークを伴い、これは、抗体を産生した哺乳動物細胞におけるカルボキシルペプチダーゼによるＨＣ Ｃ末端リシンの不完全な除去によるものと考えられる。図２３、パネルＡを参照されたい。ヘテロ二量体ＨＣ／ＨＣ対合および／または非同族ＨＣ／ＬＣ対合に起因する抗体の計算質量は、１４４，３１４．４３〜１４５，７７１．４１ダルトンの範囲であった。表２４。このサイズ範囲に実質的なピークは観察されず（図２３、パネルＡ）、２種の主要抗体種のみが存在したことを示した。
同族ＨＣ／ＬＣ対のみが存在することを確認するために、精製された抗体はまた、ＩｄｅＳプロテアーゼ、２−ＭＥＡおよびＥＤＴＡで処理して、Ｆａｂ’断片を生成し、その後、実施例６に記載されている通りに質量分析解析により解析した。下表２５は、同族および非同族対を含む、４種の可能なＦｄ／ＬＣ対合に起因するＦａｂ’断片の計算質量を示す。
質量分析由来の実際の結果を図２３パネルＢに示す。主要ピークは、４８，０１７．７４および４８０１５．８７ダルトンに検出され、これらは、Ｆｄ２／ＬＣ２（３９ｐｐｍの誤差で）およびＦｄ１／ＬＣ１（３６ｐｐｍの誤差で）Ｆａｂ’断片の計算質量に適合した。非同族ＨＣ／ＬＣ対合に起因するＦａｂ’断片の予測される質量、すなわち、４８，７３０．８３または４８，７４５．３６ダルトンにおけるまたはその付近に他のピークは検出されなかった。
上述の質量分析結果は、両方ともホモ二量体ＨＣ／ＨＣおよび同族ＨＣ／ＬＣ対合を有する２種の主要抗体種のみが、上述の操作されたＩｇＧ２抗体および無変更のＩｇＧ４抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトした細胞において産生されたことを示す。よって、これらの結果は、ＩｇＧ２抗体における変更が、２種の主要抗体種のみが、操作されたＩｇＧ２抗体および無変更のＩｇＧ４抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトした細胞において産生される状況の創出に十分であったことを強く示唆する。
（実施例８：宿主細胞において産生された抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ４ ＭａｂＰａｉｒ抗体混合物の結合活性を評価するためのＥＬＩＳＡに基づくアッセイ）
次のアッセイを行って、単一の宿主細胞において産生された抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４ ＭａｂＰａｉｒ混合物の抗原結合を評価した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１μｇ／ｍＬの１００μｌを使用して、マイクロタイタープレート（９６ウェル）をビオチン化ヒトＰＤ１（ヘキサ−ヒスチジン（Ｈｉｓ−６）タグを有する細胞外ドメイン）またはビオチン化ヒトＣＴＬＡ４（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを有する細胞外ドメイン）でコーティングした。プレートを１×ＰＢＳＴで３回洗浄し、１時間室温で振盪しつつ、２５０μｌ／ウェルのブロック緩衝液（１×ＰＢＳＴ中３％脱脂乳）でブロッキングした。プレートをさらに３回洗浄し、希釈緩衝液（ＰＢＳＴと０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））に抗体混合物を含有する標準抗体対照試料または被験試料を、２時間室温（ＲＴ）で振盪しつつ、１００μｌ／ウェルで添加した。３回の洗浄後に、希釈緩衝液中１：５０００希釈での１００μｌのＨＲＰコンジュゲートされたロバ抗ヒトＩｇＧを、各ウェルに添加し、プレートを２時間室温で振盪した。３回の洗浄後に、１００μｌの基質を各ウェルに添加し、２０分間振盪しつつ、プレートをインキュベートした。０．１６Ｍ硫酸を添加することにより反応を停止し、プレートをＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）プレートリーダーにおいて４５０ｎｍで読み取った。
被験ＭａｂＰａｉｒ混合物における抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ４抗体の濃度を、それぞれ対照抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ４抗体を使用して作成された検量線から推論した。結果は、ＭａｂＰａｉｒバリアント混合物１７Ｂ、１７Ｃ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｃが、それぞれ１８．０％、１１．８％、２７．２％、２３．４％、２７．２％の抗ＰＤ１抗体、およびそれぞれ８２．０％、８８．２％、７２．８％、７６．６％、７２．８％の抗ＣＴＬＡ４抗体を含んだことを示した。したがって、これらのデータは、これらのバリアント混合物を産生する宿主細胞が、抗ＰＤ１抗体よりも多くの抗ＣＴＬＡ４抗体を産生したことを示した。
（実施例９：抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ４ ＭａｂＰａｉｒ抗体混合物における抗ＰＤ１抗体の効力を評価するためのルシフェラーゼレポーターアッセイ）
次の実験は、ＰＤ１が細胞表面に発現される場合の、ＰＤＬ１およびＰＤ１の相互作用を阻害する、抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ４抗体を含有するＭａｂＰａｉｒ混合物における抗ＰＤ１抗体の能力を試験する。
ＰＤ１およびルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ製）を安定して発現するジャーカット細胞を、２０μｌの容量における４×１０４細胞／ウェルで、９６ウェルプレートの４８ウェルに播種した（周縁効果を回避するために）。１日間のインキュベーション後に、２０μｌ中ＰＤＬ１を安定して発現する５×１０４個のＣＨＯ細胞を、２０μｌの対照抗体またはＭａｂＰａｉｒ混合物と共に、各ウェルに添加した。ＣＨＯ細胞上に発現されたＰＤＬ１は、ジャーカット細胞上のＰＤ１に係合し、ルシフェラーゼの発現を阻害する細胞内シグナル伝達経路を活性化することができる。抗体が、ＰＤ１に結合することによりＰＤ１／ＰＤＬ１係合を防止する場合、ルシフェラーゼ発現は増加する。異なるウェルが、異なる濃度の抗体または混合物を有するように、抗体または混合物の１：３希釈系列を行った。プレートを３７℃で５％ＣＯ２において６時間インキュベートした。ウェル当たり４０μｌのＢＩＯ−ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｇ７９４１）を添加して、細胞を溶解させ、ＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）においてプレートを読み取った。結果を図２４および下表２６に示す。これらのデータは、抗ＰＤ１ならびに抗ＣＴＬＡ４ ＭａｂＰａｉｒ抗体混合物１７Ｂ、１７Ｃ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１９Ｃが、無変更の抗ＰＤ１抗体単独（「抗ＰＤ１」として示す）と比較して、匹敵する効力でＰＤＬ１−ＰＤ１相互作用を遮断したことを示す。
（実施例１０：抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ４ ＭａｂＰａｉｒ抗体混合物における抗ＣＴＬＡ４抗体の効力を評価するためのルシフェラーゼレポーターアッセイ）
次の実験は、ＣＴＬＡ４が細胞表面に発現される場合の、ＣＴＬＡ４とのＣＤ８０および／またはＣＤ８６の相互作用を阻害する、抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ４抗体を含有するＭａｂＰａｉｒ混合物における抗ＣＴＬＡ４抗体の能力を試験する。
ＣＴＬＡ４およびルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ製）を安定して発現するジャーカット細胞を、１５μｌの容量における５×１０４細胞／ウェルで、９６ウェルマイクロタイタープレートの４８ウェルに播種した。１日間のインキュベーション後に、１５μｌにおけるＣＤ８０およびＣＤ８６を発現する５×１０４個のラージ細胞を、１５μｌの対照抗ＣＴＬＡ４抗体またはＭａｂＰａｉｒ混合物と共に、各ウェルに添加した。ラージ細胞上に発現されたＣＤ８０およびＣＤ８６は、ジャーカット細胞上のＣＴＬＡ４に係合し、ルシフェラーゼの発現を阻害する細胞内シグナル伝達経路を活性化することができる。抗体が、ＣＴＬＡ４に結合することによりＣＤ８０および／またはＣＤ８６とのＣＴＬＡ４係合を防止する場合、ルシフェラーゼ発現は増加する。異なるウェルが、異なる濃度の抗体または混合物を有するように、抗体または混合物の１：３希釈系列を行った。プレートを３７℃で５％ＣＯ２において１６時間インキュベートした。ウェル当たり４０μｌのＢＩＯ−ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ ｎｏ．Ｇ７９４１）を添加して、細胞を溶解させ、ＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）においてプレートを読み取った。結果を図２５および下表２７に示す。
これらのデータは、抗ＰＤ１ならびに抗ＣＴＬＡ４ ＭａｂＰａｉｒ混合物１７Ｂ、１７Ｃ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１９Ｃにおける抗ＣＴＬＡ４抗体が、無変更の抗ＣＴＬＡ４抗体単独よりも低い効力ではあるが、ＣＴＬＡ４−ＣＤ８０／８６相互作用を遮断したことを示す。１８Ｃ混合物は、ＭａｂＰａｉｒ抗体混合物の間で最も強力であった。よって、これらのデータは、バリアント混合物における抗ＣＴＬＡ４抗体が、無変更の抗ＣＴＬＡ４抗体単独と比較して減少した活性（約６分の１〜２分の１）を有したことを示すが、変更された抗ＣＴＬＡ４抗体を含有するＭａｂＰａｉｒ混合物は依然として、抗ＣＴＬＡ活性を示した。これらの結果は、これらの抗ＣＴＬＡ４抗体における変更が、その効力に影響を与えた一方、抗ＰＤ１抗体の効力の変化がほとんど観察されなかったことを示唆することができる。
（実施例１１：パートナー指向性変更を欠く抗ＰＤ１抗体も含むＭａｂＰａｉｒの部分である、パートナー指向性変更を含む抗ＣＴＬＡ４抗体の効力を評価するためのルシフェラーゼアッセイ）
本実験は、実施例６に記載されている無変更の抗ＰＤ１ １０２抗体を含むＭａｂＰａｉｒの文脈において、ヘテロ二量体に不利になる変更およびパートナー指向性変更の両方を含む、実施例６に記載されている操作されたＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体の効力を試験した。本質的に実施例１０に記載されている通りにアッセイを行った。対照として、無変更の抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体（ＭａｂＰａｉｒの部分としてではない）および非常に密接に関連している配列を有する別の無変更の抗ＣＴＬＡ４抗体（抗ＣＴＬＡ４ １１０抗体）も試験した。抗ＣＴＬＡ４ １１０抗体の定常ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３８のアミノ酸１１９〜４４８（ＨＣ）および配列番号４０の１０８〜２１４（ＬＣ）に示す抗ＣＴＬＡ４抗体１Ｅ１の配列と同じである。抗ＣＴＬＡ４抗体１１０の可変ドメインのフレームワーク領域のアミノ酸配列は、フレームワーク領域における単一の置換を除いて抗ＣＴＬＡ４抗体１Ｅ１の配列と同じである。結果を図２６に示し、下表２８に要約する。
これらのデータは、ＭａｂＰａｉｒにおける操作された抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体が、変更された抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体単独に匹敵し、無変更の抗ＣＴＬＡ４ １１１または抗ＣＴＬＡ４ １１０抗体単独よりも僅かに高い効力で、ＣＴＬＡ４−ＣＤ８０／８６相互作用を遮断したことを示す。よって、ＭａｂＰａｉｒにおける抗ＰＤ１抗体の存在は、この細胞に基づくアッセイにおいて、変更された抗ＣＴＬＡ４ １１１抗体の効力に実質的に影響を与えなかった。
（実施例１２：ヒト乳がん細胞を死滅させる能力における、３イン１抗ＨＥＲ２抗体混合物 対 ２種の抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせの比較）
次の実験を行って、単独でまたは組み合わせた、混合物の創出のための出発地点であった２種の抗体の組み合わせと比較して、がん細胞を死滅させる様々な３イン１抗体混合物の相対的能力を決定した。
ヒトＨＥＲ２発現乳がん細胞株ＢＴ−４７４およびＳＫ−ＢＲ−３を、１００μＬ／ウェルにて、９６ウェル平底プレートにおいて１．０×１０４細胞／ｍＬで播種した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２において４時間インキュベートした。抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８および２Ｃ４は、バリアント抗体混合物１Ａ〜１６Ｄを作製するための出発点として機能した。実施例３および表１７〜２０。抗体４Ｄ５−８、抗体２Ｃ４、これら２種の抗体の組み合わせ、または３イン１抗体混合物１４Ｄ、１５Ｃ、１３Ｄ、１４Ｃもしくは１５Ｄ（表２０を参照）のうちの１種を、１００μＬの容量において各ウェルに添加した。１３６ｎＭから開始する一連の１：４希釈を行った。陰性対照として、がん細胞の成長に無関係であると考えられるヒトＩｇＧ１／κ抗体を含有する２個の二連のウェルを、試験した最高抗体濃度（１３６ｎＭ）で含めた。９６時間のインキュベーション後に、各ウェルから１００μＬの上清を除去し、１００μＬのＣＥＬＬ ＴＩＴＥＲ ＧＬＯ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｇ７５７２）を添加した。内容物をオービタルシェーカーにおいて２分間混合して、細胞溶解を誘導した。プレートを室温で１０分間インキュベートして、ルミネセンスシグナルを安定化した。ＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）においてウェル当たり１秒間でルミネセンスシグナルを記録した。ルミネセンスシグナルの強度は、細胞生存度の反映である、細胞に存在するＡＴＰの分量に比例する。結果を図２７および下表２９に示す。
ＩｇＧ１／κＬＣ対照抗体（図２７において「ＩｇＧ１」と標識）は、ＢＴ−４７４細胞の生存度に影響を与えなかった。抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４は、ＢＴ−４７４細胞の生存度に対してわずかにネガティブな効果を有した。抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−８は、ＢＴ−４７４細胞生存度に対して有意にネガティブな効果を有し、４Ｄ５−８および２Ｃ４の組み合わせも、ネガティブな効果を有した。抗ＨＥＲ２ ３イン１抗体混合物１４Ｄ、１５Ｃ、１３Ｄ、１４Ｃおよび１５Ｄは全て、４Ｄ５−８ ＋ ２Ｃ４抗体混合物よりも大きい、ＢＴ−４７４細胞生存度に対してネガティブな効果を有し、全３種の抗体構成成分（４Ｄ５−８、２Ｃ４、およびこれらの抗体のそれぞれの半分を含む二重特異性抗体）が、４Ｄ５−８および２Ｃ４のみの組み合わせよりも、ＢＴ−４７４腫瘍細胞成長を阻害することを示唆した。３イン１抗体カクテル試料１５Ｃは、０．２２ｎＭのＩＣ５０を有する、ＢＴ−４７４細胞における最も強力な阻害剤であった。
ＳＫ−ＢＲ−３細胞において、ＩｇＧ１／κＬＣ対照抗体は、細胞生存度に影響を与えなかった。抗体２Ｃ４は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞生存度に小さい効果を有したが、４Ｄ５−８は、はるかにより大きい効果を有した。４Ｄ５−８および２Ｃ４の組み合わせは、２Ｃ４よりも大きい、生存度に対する効果、および４Ｄ５−８よりも低い効果を有した。抗ＨＥＲ２ ３イン１抗体混合物１４Ｄ、１５Ｃ、１３Ｄ、１４Ｃおよび１５Ｄは全て、２Ｃ４ ＋ ４Ｄ５−８の混合物よりも僅かに大きい、細胞生存度に対する効果を有した。これらのデータは、３イン１混合物における抗体種が、一緒に作用して、腫瘍細胞の成長を阻害することを示唆する。
これらのデータは、２種の異なる単一特異性抗ＨＥＲ２抗体と各抗体の半分を含む二重特異性抗体を含有する３イン１混合物が、ＨＥＲ２発現がん細胞の成長を有効に阻害することができることを示唆する。
これらのデータは、２種の異なる単一特異性抗ＨＥＲ２抗体と各抗体の半分を含む二重特異性抗体を含有する３イン１混合物が、ＨＥＲ２発現がん細胞の成長を有効に阻害することができることを示唆する。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
２つの主要抗体種を含む抗体の混合物であって、
（ａ）第１の重鎖（ＨＣ１）および第１の軽鎖（ＬＣ１）を含む第１の抗体、ならびに
（ｂ）第２の重鎖（ＨＣ２）および第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む第２の抗体を含み、
前記第１の抗体および前記第２の抗体は、全長霊長類および／またはヒト化ＩｇＧ抗体であり、
前記第１の抗体が、同じ第１のアミノ酸配列を有する前記ＨＣ１の２つの鎖、および同じ第２のアミノ配列を有する前記ＬＣ１の２つの鎖を含み、
前記第２の抗体が、同じ第３のアミノ酸配列を有する前記ＨＣ２の２つの鎖、および同じ第４のアミノ配列を有する前記ＬＣ２の２つの鎖を含み、
前記ＨＣ１および前記ＨＣ２が、異なるアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣ１および前記ＬＣ２が、異なるアミノ酸配列を有し、
前記混合物が、１０個以下の異なる主要種の全長ＩｇＧ抗体を含み、
前記混合物が、前記ＨＣ１をコードするＤＮＡ、前記ＨＣ２をコードするＤＮＡ、前記ＬＣ１をコードするＤＮＡおよび前記ＬＣ２をコードするＤＮＡが導入されている宿主細胞株により産生された、混合物。
（項目２）
３つ以下の異なる主要種の全長抗体を含む、項目１に記載の混合物。
（項目３）
前記ＨＣ１をコードするＤＮＡ、前記ＨＣ２をコードするＤＮＡ、前記ＬＣ１をコードするＤＮＡおよび前記ＬＣ２をコードするＤＮＡが、同時に導入された、項目２に記載の混合物。
（項目４）
前記ＨＣ１をコードするＤＮＡおよび前記ＬＣ１をコードするＤＮＡが、前記ＨＣ２をコードするＤＮＡおよび前記ＬＣ２をコードするＤＮＡの前に導入されたか、または
前記ＨＣ２をコードするＤＮＡおよび前記ＬＣ２をコードするＤＮＡが、前記ＨＣ１をコードするＤＮＡおよび前記ＬＣ１をコードするＤＮＡの前に導入された、項目２に記載の混合物。
（項目５）
前記ＨＣ１および前記ＨＣ２が、ヒトおよび／またはヒト化ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）であり、前記ＬＣ１および前記ＬＣ２が、ヒトおよび／またはヒト化軽鎖（ＬＣ）である、項目１から４のいずれか一項に記載の混合物。
（項目６）
（ａ）前記第１の抗体および前記第２の抗体が両方とも、１つまたは複数のパートナー指向性変更を含むか、
（ｂ）前記第１の抗体および前記第２の抗体が両方とも、１つまたは複数のパートナー指向性変更を含み、前記第１の抗体および前記第２の抗体のうちの少なくとも１つが、ヘテロダイマーに不利な少なくとも１つの変更を含むか、あるいは
（ｃ）前記第１の抗体が、１つもしくは複数のパートナー指向性変更を含み、前記第２の抗体はそれを含まないか、または前記第２の抗体が、１つもしくは複数のパートナー指向性変更を含み、前記第１の抗体はそれを含まないかのいずれかである、項目１から５のいずれか一項に記載の混合物。
（項目７）
前記第１の抗体が、ヘテロダイマーに不利な１つもしくは複数の変更を含み、前記第２の抗体はそれを含まないか、または前記第２の抗体が、ヘテロダイマーに不利な１つもしくは複数の変更を含み、前記第１の抗体はそれを含まないかのいずれかである、項目６（ｃ）に記載の混合物。
（項目８）
（１）前記第１の抗体が、１つもしくは複数のパートナー指向性変更およびヘテロダイマーに不利な１つもしくは複数の変更を含み、前記第２の抗体が、パートナー指向性変更もヘテロダイマーに不利な変更も含まないか、または
（２）前記第２の抗体が、１つもしくは複数のパートナー指向性変更およびヘテロダイマーに不利な１つもしくは複数の変更を含み、前記第１の抗体が、パートナー指向性変更もヘテロダイマーに不利な変更も含まない、項目７に記載の混合物。
（項目９）
３つの主要抗体種を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の混合物。
（項目１０）
２つ以下の主要抗体種を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の混合物。
（項目１１）
前記ＨＣ１および／または前記ＨＣ２が、ヘテロダイマーに不利な１つまたは複数の変更を含む、項目１０に記載の混合物。
（項目１２）
（ａ）（１）前記ＨＣ１はＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２重鎖（ＨＣ）であり、前記ＨＣ２はＩｇＧ４ ＨＣであり、前記ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、前記ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか、または（２）前記ＨＣ２はＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、前記ＨＣ１はＩｇＧ４ ＨＣであり、前記ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、前記ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか；あるいは
（ｂ）（１）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２は各々、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、前記ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、前記ＨＣ２は変更Ｋ４０９Ｒを含むか、または（２）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２は各々、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、前記ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、前記ＨＣ１は変更Ｋ４０９Ｒを含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の混合物。
（項目１３）
（ａ）（１）前記ＨＣ１は、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、変更Ｄ３９９Ｒ／ＫおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含み、前記ＨＣ２は、ＩｇＧ４ ＨＣであり、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか、または（２）前記ＨＣ２は、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、変更Ｄ３９９Ｒ／ＫおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含み、前記ＨＣ１は、ＩｇＧ４ ＨＣであり、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか；あるいは
（ｂ）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２は各々、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ ＨＣであり、それらの一方は変更Ｄ３９９Ｒ／ＫおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含み、他方は変更Ｋ４０９Ｒを含む、項目１２に記載の混合物。
（項目１４）
前記第１の抗体が、ヘテロダイマーに不利な少なくとも１つの変更を含み、前記第２の抗体が、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか、または前記第２の抗体が、ヘテロダイマーに不利な少なくとも１つの変更を含み、前記第１の抗体が、ヘテロダイマーに不利な変更を含まない、項目１から６および９から１１のいずれか一項に記載の混合物。
（項目１５）
（ａ）前記第１の抗体が、少なくとも１つのパートナー指向性変更を含み、前記第２の抗体はそれを含まず、
（ｂ）（１）前記第１の抗体が、ヒトおよび／もしくはヒト化ＩｇＧ１抗体であり、前記ＨＣ１の２２０位のシステインが別のアミノ酸により置換されており、前記ＬＣ１の２１４位のシステインが別のアミノ酸により置換されているか、または（２）前記第１の抗体が、ヒトおよび／もしくはヒト化ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４抗体であり、前記ＨＣ１の１３１位のシステインが別のアミノ酸により置換されており、前記ＬＣ１の２１４位のシステインが別のアミノ酸により置換されている、項目１から１４のいずれか一項に記載の混合物。
（項目１６）
前記第１の抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、前記ＨＣ１に変更Ｃ２２０Ｇ／Ａおよび前記ＬＣ１にＣ２１４Ｓ／Ａ／Ｇを含むか、または
前記第１の抗体が、ヒトおよび／もしくはヒト化ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４抗体であり、前記ＨＣ１に変更Ｃ１３１Ｓ／Ａ／Ｇおよび前記ＬＣ１にＣ２１４Ｓ／Ａ／Ｇを含む、項目１５に記載の混合物。
（項目１７）
前記第１の抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、前記ＨＣ１に変更Ｃ２２０Ｇおよび前記ＬＣ１にＣ２１４Ｓを含むか、または
前記第１の抗体が、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４抗体であり、前記ＨＣ１に変更Ｃ１３１Ｓおよび前記ＬＣ１にＣ２１４Ｓを含む、項目１６に記載の混合物。
（項目１８）
前記第１の抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、
前記第１の抗体が、第１の対のアミノ酸位置に少なくとも１対のシステイン置換を含み、
前記第１の対のアミノ酸位置が、第１のＨＣ１位置および第１のＬＣ１位置を含み、
前記第１のＨＣ１位置および前記第１のＬＣ１位置が、それぞれ、１２６および１２４位；１２８および１１８位；１３３および１１７位；１３３および２０９位；１３４および１１６位；１６８および１７４位；１７０および１６２位；１７０および１７６位；１７３および１６０位；ならびに１８３および１７６位からなる群より選択される、項目１５から１７のいずれかに記載の混合物。
（項目１９）
前記第１のＨＣ１位置および前記第１のＬＣ１位置が、それぞれ、１６８および１７４位；１７３および１６０位；ならびに１７０および１６２位からなる群より選択される、項目１８に記載の混合物。
（項目２０）
前記第１の抗体が、それぞれ前記第１のＨＣ１位置および前記第１のＬＣ１位置とは異なる第２のＨＣ１位置および第２のＬＣ１位置を含む第２の対の位置に第２の対のシステイン置換を含み、
前記第２のＨＣ１位置および前記第２のＬＣ１位置が、それぞれ、１２６および１２４位；１２８および１１８位；１３３および１１７位；１３３および２０９位；１３４および１１６位；１６８および１７４位；１７０および１６２位；１７０および１７６位；１７３および１６０位；ならびに１８３および１７６位からなる群より選択される、項目１９に記載の混合物。
（項目２１）
前記第１のＨＣ１位置および前記第１のＬＣ１位置が、それぞれ１７３および１６０であり、前記第２のＨＣ１位置および前記第２のＬＣ１位置が、それぞれ１７０および１６２である、項目２０に記載の混合物。
（項目２２）
前記第１の抗体が、ＩｇＧ４抗体であり、
前記第１の抗体が、第１の対のアミノ酸位置に少なくとも１対のシステイン置換を含み、
前記第１の対のアミノ酸位置が、第１のＨＣ１位置および第１のＬＣ１位置を含み、
前記第１のＨＣ１位置および前記第１のＬＣ１位置が、それぞれ、１２６および１２１位；１２６および１２４位；１２７および１２１位；１２８および１１８位；１６８および１７４位；１７０および１６２位；ならびに１７３および１６２位からなる群より選択される、項目１５から１７のいずれか一項に記載の混合物。
（項目２３）
前記第１の抗体が、それぞれ前記第１のＨＣ１位置および前記第１のＬＣ１位置とは異なる第２のＨＣ１位置および第２のＬＣ１位置に第２の対のシステイン置換を含み、
前記第２のＨＣ１位置および前記第２のＬＣ１位置が、それぞれ、１２６および１２１位；１２６および１２４位；１２７および１２１位；１２８および１１８位；１６８および１７４位；１７０および１６２位；ならびに１７３および１６２位からなる群より選択される、項目２２に記載の混合物。
（項目２４）
前記第１の抗体が、ＩｇＧ２抗体であり、
前記第１の抗体が、第１の対の接触アミノ酸位置に少なくとも１対のシステイン置換を含み、一方の位置が前記ＨＣ１に存在し、他方が前記ＬＣ１に存在する、項目１５から１７のいずれか一項に記載の混合物。
（項目２５）
前記ＨＣ１および前記ＬＣ１の、前記第１の対の接触アミノ酸位置が、それぞれ、１７０および１６２ならびに１７３および１６０からなる群より選択される、項目２４に記載の混合物。
（項目２６）
前記第１の抗体が、第２の対の接触アミノ酸位置に第２の対のシステイン置換を含み、前記第２の対の接触アミノ酸位置の一方の位置がＨＣ１位置に存在し、他方がＬＣ１位置に存在し、前記第２の対の接触アミノ酸位置のＨＣ１位置およびＬＣ１位置が各々、前記第１の対の接触アミノ酸位置のそれぞれＨＣ１位置およびＬＣ１位置とは異なる、項目２４または２５に記載の混合物。
（項目２７）
前記ＨＣ１および前記ＬＣ１の、前記第２の対の接触アミノ酸位置が、それぞれ１７０および１６２ならびに１７３および１６０からなる群より選択される、項目２６に記載の混合物。
（項目２８）
前記第１の抗体が、別のアミノ酸が荷電アミノ酸に置換されている少なくとも１つのパートナー指向性変更を含む、項目１から２７のいずれか一項に記載の混合物。
（項目２９）
前記第１の抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、
前記第１の抗体が、アミノ酸の電荷対を含み、
前記電荷対の１つのアミノ酸が、前記ＨＣ１に存在し、前記電荷対の１つのアミノ酸が、前記ＬＣ１に存在し、
前記電荷対のアミノ酸のうちの少なくとも１つが、前記パートナー指向性変更に起因し、
前記電荷対が、それぞれ、前記ＨＣ１および前記ＬＣ１の１４７Ｄ／Ｅおよび１２４Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１２９Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１３１Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１８０Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１６４Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１６７Ｋ／Ｒ；または１６８Ｄ／Ｅおよび１７４Ｋ／Ｒの位置にあるアミノ酸対の１つからなる、項目２８に記載の混合物。
（項目３０）
前記第１の抗体が、ＩｇＧ４抗体であり、
前記第１の抗体が、アミノ酸の電荷対を含み、
前記電荷対の１つのアミノ酸が、前記ＨＣ１に存在し、前記電荷対の１つのアミノ酸が、前記ＬＣ１に存在し、
前記電荷対のアミノ酸のうちの少なくとも１つが、前記パートナー指向性変更に起因し、
前記電荷対が、それぞれ、前記ＨＣ１および前記ＬＣ１の１３３Ｄ／Ｅおよび１１７Ｋ／Ｒ；１３７Ｋ／Ｒおよび１１４Ｄ／Ｅ；１３７Ｋ／Ｒおよび１１６Ｄ／Ｅ；１４７Ｄ／Ｅおよび１２４Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１２９Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１３１Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１７８Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１８０Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１６４Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１６７Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１７３Ｋ／Ｒ；または１６８Ｄ／Ｅおよび１７４Ｋ／Ｒの位置にあるアミノ酸対の１つからなる、項目２８に記載の混合物。
（項目３１）
前記第１の抗体が、ＩｇＧ２抗体であり、
前記第１の抗体が、アミノ酸の電荷対を含み、
前記電荷対の１つのアミノ酸が、前記ＨＣ１に存在し、前記電荷対の１つのアミノ酸が、前記ＬＣ１に存在し、
前記電荷対のアミノ酸のうちの少なくとも１つが、前記パートナー指向性変更に起因する、項目２８に記載の混合物。
（項目３２）
前記電荷対が、前記ＨＣ１の１４７Ｄ／Ｅおよび前記ＬＣ１の１３１Ｋ／Ｒからなる、項目３１に記載の混合物。
（項目３３）
前記ＨＣ１および／または前記ＨＣ２が、ＨＣ残基に少なくとも１つのＬＣパートナー指向性変更を含み、
前記ＬＣ１および／または前記ＬＣ２は、それぞれＨＣ１および／もしくはＨＣ２において、前記ＬＣパートナー指向性変更が行われている前記ＨＣ残基と接触するか、またはそれぞれ前記ＨＣ１および／もしくは前記ＨＣ２に存在する荷電アミノ酸もしくはシステインと接触するＬＣ残基に少なくとも１つのＨＣパートナー指向性変更を含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の混合物。
（項目３４）
前記ＬＣパートナー指向性変更は、前記ＨＣ１および前記ＨＣ２が、前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の両方の前記ＨＣ残基に荷電アミノ酸を含むことを引き起こし、
前記ＨＣ１の前記ＨＣ残基の前記荷電アミノ酸は、前記ＨＣ２の前記ＨＣ残基の前記荷電アミノ酸と電荷が逆であり、
前記ＨＣパートナー指向性変更は、前記ＬＣ１および前記ＬＣ２が、前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の両方の前記ＬＣ残基に荷電アミノ酸を含むことを引き起こし、
前記ＬＣ１の前記ＬＣ残基の前記荷電アミノ酸は、前記ＬＣ２の前記ＬＣ残基の前記荷電アミノ酸と電荷が逆であり、
前記ＬＣ１の前記ＬＣ残基の前記荷電アミノ酸は、前記ＨＣ１の前記ＨＣ残基の前記アミノ酸と電荷が逆である、項目３３に記載の混合物。
（項目３５）
前記第１の抗体および前記第２の抗体が、
（ａ）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の両方の４４および１０５位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の両方の４３および１００位は各々、荷電アミノ酸により占められており、前記ＨＣ１の４４および１０５位のアミノ酸は各々、前記ＨＣ２の同じ部位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＬＣ１の４３および１００位のアミノ酸は各々、前記ＬＣ２の同じ部位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の４４位のアミノ酸は、それぞれ前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１００位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１０５位のアミノ酸は、それぞれ前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の４３位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット；
（ｂ）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１４７位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１３１位は各々、荷電アミノ酸により占められており、前記ＨＣ１の１４７位のアミノ酸は、前記ＨＣ２の１４７位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＬＣ１の１３１位のアミノ酸は、前記ＬＣ２の１３１位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１４７位のアミノ酸は、それぞれ前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１３１位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット；
（ｃ）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１６８位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１７４位は各々、荷電アミノ酸により占められており、前記ＨＣ１の１６８位のアミノ酸は、前記ＨＣ２の１６８位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＬＣ１の１７４位のアミノ酸は、前記ＬＣ２の１７４位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１６８位のアミノ酸は、それぞれ前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１７４位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット；ならびに
（ｄ）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１８１位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１７８または１８０位は各々、荷電アミノ酸により占められており、前記ＨＣ１の１８１位のアミノ酸は、前記ＨＣ２の１８１位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＬＣ１の１７８または１８０位のアミノ酸は、前記ＬＣ２の１７８または１８０位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１８１位のアミノ酸は、それぞれ前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１７８または１８０位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセットからなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目３３または３４に記載の混合物。
（項目３６）
前記第１の抗体および前記第２の抗体が、
（ａ）前記ＨＣ１は４４Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ１は１００Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ２は４４Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ２は１００Ｄ／Ｅを含むか、または前記ＨＣ２は４４Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ２は１００Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ１は４４Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ１は１００Ｄ／Ｅを含む変更のセット；
（ｂ）前記ＨＣ１は１０５Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ１は４３Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ２は１０５Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ２は４３Ｄ／Ｅを含むか、または前記ＨＣ２は１０５Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ２は４３Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ１は１０５Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ１は４３Ｄ／Ｅを含む変更のセット；
（ｃ）前記ＨＣ１は１４７Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ１は１３１Ｅ／Ｄを含み、前記ＨＣ２は１４７Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ２は１３１Ｒ／Ｋを含むか、または前記ＨＣ２は１４７Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ２は１３１Ｅ／Ｄを含み、前記ＨＣ１は１４７Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ１は１３１Ｒ／Ｋを含む変更のセット；
（ｄ）前記ＨＣ１は１６８Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ１は１７４Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ２は１６８Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ２は１７４Ｄ／Ｅを含むか、または前記ＨＣ２は１６８Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ２は１７４Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ１は１６８Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ１は１７４Ｄ／Ｅを含む変更のセット；ならびに
（ｅ）前記ＨＣ１は１８１Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ１は１７８Ｒ／Ｋもしくは１８０Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ２は１８１Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ２は１７８Ｄ／Ｅもしくは１８０Ｄ／Ｅを含むか、または前記ＨＣ２は１８１Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ２は１７８Ｒ／Ｋもしくは１８０Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ１は１８１Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ１は１７８Ｄ／Ｅもしくは１８０Ｄ／Ｅを含む変更のセット
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目３３から３５のいずれか一項に記載の混合物。
（項目３７）
前記第１の抗体および前記第２の抗体が、
（ａ）前記ＨＣ１は４４Ｄおよび１０５Ｒを含み、前記ＬＣ１は４３Ｄおよび１００Ｒを含み、前記ＨＣ２は４４Ｒおよび１０５Ｄを含み、前記ＬＣ２は４３Ｒおよび１００Ｄを含むか、または前記ＨＣ２は４４Ｄおよび１０５Ｒを含み、前記ＬＣ２は４３Ｄおよび１００Ｒを含み、前記ＨＣ１は４４Ｒおよび１０５Ｄを含み、前記ＬＣ１は４３Ｒおよび１００Ｄを含む変更のセット；
（ｂ）前記ＨＣ１は１４７Ｒを含み、前記ＬＣ１は１３１Ｄを含み、前記ＨＣ２は１４７Ｄを含み、前記ＬＣ２は１３１Ｒを含むか、または前記ＨＣ２は１４７Ｒを含み、前記ＬＣ２は１３１Ｄを含み、前記ＨＣ１は１４７Ｄを含み、前記ＬＣ１は１３１Ｒを含む変更のセット；
（ｃ）前記ＨＣ１は１６８Ｄを含み、前記ＬＣ１は１７４Ｒを含み、前記ＨＣ２は１６８Ｒを含み、前記ＬＣ２は１７４Ｄを含むか、または前記ＨＣ２は１６８Ｄを含み、前記ＬＣ２は１７４Ｒを含み、前記ＨＣ１は１６８Ｒを含み、前記ＬＣ１は１７４Ｄを含む変更のセット；ならびに
（ｄ）前記ＨＣ１は１８１Ｄを含み、前記ＬＣ１は１７８Ｒもしくは１８０Ｒを含み、前記ＨＣ２は１８１Ｒを含み、前記ＬＣ２は１７８Ｄもしくは１８０Ｄを含むか、または前記ＨＣ２は１８１Ｄを含み、前記ＬＣ２は１７８Ｒもしくは１８０Ｒを含み、前記ＨＣ１は１８１Ｒを含み、前記ＬＣ１は１７８Ｄもしくは１７８Ｄを含む変更のセット
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目３６に記載の混合物。
（項目３８）
前記第１の抗体および前記第２の抗体が、
（ａ）前記ＨＣ１はＧ４４ＤおよびＱ１０５Ｒを含み、前記ＬＣ１はＡ／Ｖ４３ＤおよびＱ／Ｇ１００Ｒを含み、前記ＨＣ２はＧ４４ＲおよびＱ１０５Ｄを含み、前記ＬＣ２はＡ／Ｖ４３ＲおよびＱ／Ｇ１００Ｄを含むか、または前記ＨＣ２はＧ４４ＤおよびＱ１０５Ｒを含み、前記ＬＣ２はＡ／Ｖ４３ＤおよびＱ／Ｇ１００Ｒを含み、前記ＨＣ１はＧ４４ＲおよびＱ１０５Ｄを含み、前記ＬＣ１はＡ／Ｖ４３ＲおよびＱ／Ｇ１００Ｄを含む変更のセット；
（ｂ）前記ＨＣ１はＫ１４７Ｒを含み、前記ＬＣ１はＳ１３１Ｄを含み、前記ＨＣ２はＫ１４７Ｄを含み、前記ＬＣ２はＳ１３１Ｒを含むか、または前記ＨＣ２はＫ１４７Ｒを含み、前記ＬＣ２はＳ１３１Ｄを含み、前記ＨＣ１はＫ１４７Ｄを含み、前記ＬＣ１はＳ１３１Ｒを含む変更のセット；
（ｃ）前記ＨＣ１はＨ１６８Ｄを含み、前記ＬＣ１はＳ１７４Ｒを含み、前記ＨＣ２はＨ１６８Ｒを含み、前記ＬＣ２はＳ１７４Ｄを含むか、または前記ＨＣ２はＨ１６８Ｄを含み、前記ＬＣ２はＳ１７４Ｒを含み、前記ＨＣ１はＨ１６８Ｒを含み、前記ＬＣ１はＳ１７４Ｄを含む変更のセット；ならびに
（ｄ）前記ＨＣ１はＳ１８１Ｄを含み、前記ＬＣ１はＴ／Ｙ１７８ＲもしくはＴ／Ｓ１８０Ｒを含み、前記ＨＣ２はＳ１８１Ｒを含み、前記ＬＣ２はＴ／Ｙ１７８ＤもしくはＴ／Ｓ１８０Ｄを含むか、または前記ＨＣ２はＳ１８１Ｄを含み、前記ＬＣ２はＴ／Ｙ１７８ＲもしくはＴ／Ｓ１８０Ｒを含み、前記ＨＣ１はＳ１８１Ｒを含み、前記ＬＣ１はＴ／Ｙ１７８ＤもしくはＴ／Ｓ１８０Ｄを含む変更のセット
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目３７に記載の混合物。
（項目３９）
前記第１の抗体および／または前記第２の抗体が、１つまたは複数の対の位置に１つまたは複数の対のシステイン置換を含み、
各対の位置が、１つのＨＣ位置および１つのＬＣ位置を含み、
前記対の位置のそれぞれ前記ＨＣ位置および前記ＬＣ位置が、１２６および１２１；１２６および１２４；１２７および１２１；１２８および１１８；１３３および１１７；１３３および２０９；１３４および１１６；１４１および１１６；１６８および１７４；１７０および１６２；１７０および１７６；１７３および１６０；１７３および１６２；ならびに１８３および１７６からなる群より選択され、
前記第１の抗体および前記第２の抗体が、同じ対の位置にシステイン置換を含まない、
項目３３から３８のいずれか一項に記載の混合物。
（項目４０）
前記第１の抗体および前記第２の抗体が、
（１）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７０および１８３位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７０および１８３位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されていること；
（２）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７３および１７０位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１６０および１６２位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７３および１７０位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１６０および１６２位は各々、システインにより置換されていること；
（３）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７３および１８３位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１６０および１７６位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７３および１８３位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１６０および１７６位は各々、システインにより置換されていること；
（４）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１７０位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１の１７０位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されていること；
（５）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７０および１７３位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１６２および１６０位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７０および１７３位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１６２および１６０位は各々、システインにより置換されていること；
（６）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７３および１７０位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７３および１７０位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されていること；
（７）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１７３位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１６２および１６０位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１の１７３位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１６２および１６０位は各々、システインにより置換されていること；
（８）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１８３および１７３位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１７６および１６０位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１８３および１７３位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１７６および１６０位は各々、システインにより置換されていること；
（９）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７０および１７３位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１７６および１６０位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７０および１７３位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１７６および１６０位は各々、システインにより置換されていること；
（１０）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７０および１８３位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１７６位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７０および１８３位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１の１７６位は各々、システインにより置換されていること；ならびに
（１１）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７３および１７０位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の両方の１６２位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７３および１７０位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１の両方の１６２位は各々、システインにより置換されていることからなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目３９に記載の混合物。
（項目４１）
前記第１の抗体および前記第２の抗体が、
（１）前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
（２）前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含み、前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含み、前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含むこと；
（３）前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含み、前記ＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含み、前記ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
（４）前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
（５）前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含むこと；
（６）前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
（７）前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含むこと；
（８）前記ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含み、前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含み、前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＱ／Ｅ１６０Ｃを含むこと；
（９）前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含み、前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含み、前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含むこと；
（１０）前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含み、前記ＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含み、前記ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；および
（１１）前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含むこと
からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、項目４０に記載の混合物。
（項目４２）
前記ＨＣ１および／または前記ＨＣ２がＩｇＧ４ ＨＣである場合、前記ＩｇＧ４ ＨＣが、２２８Ｐを含む、項目１から４１のいずれか一項に記載の混合物。
（項目４３）
前記第１の抗体および前記第２の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、少なくとも１週間異なる、項目１から４２のいずれか一項に記載の混合物。
（項目４４）
前記第１の抗体および前記第２の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、少なくとも１０日間異なる、項目４３に記載の混合物。
（項目４５）
前記第１の抗体および前記第２の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、少なくとも２週間異なる、項目４４に記載の混合物。
（項目４６）
より短いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有する前記抗体が、Ｍ２５２Ａ、Ｍ２５２Ｌ、Ｍ２５２Ｓ、Ｍ２５２Ｒ、Ｒ２５５Ｋ、またはＨ４３５Ｒの変更のうちの少なくとも１つを含む、項目４３から４５のいずれか一項に記載の混合物。
（項目４７）
前記ＨＣ１が、それぞれ、アミノ酸配列である配列番号２８、２９、および３０を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、前記ＬＣ１が、それぞれ、アミノ酸配列である配列番号２５、２６、および２７を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、前記ＨＣ２が、アミノ酸配列である配列番号３１、３２、および３３を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、前記ＬＣ２が、アミノ酸配列である配列番号３４、３５、および３６を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、項目１から１４および３３から４６のいずれか一項に記載の混合物。
（項目４８）
（ａ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｂ）前記第１の抗体および前記第２の抗体は両方ともヒトＨＥＲ２に結合するが、ＨＥＲ２との結合について競合しないか、
（ｃ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＬＡＧ３に結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｄ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＧＩＴＲに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｄ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＶＥＧＦに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｆ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＳＦＲ１ａに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｇ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＯＸ４０に結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｈ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＴＩＧＩＴに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
（ｉ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｊ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＶＥＧＦに結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｋ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＯＸ４０に結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｌ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＳＦＲ１ａに結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｍ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＴＩＧＩＴに結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｎ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＴｉｍ３に結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
（ｏ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒトＶＥＧＦに結合するか、
（ｐ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒト４１ＢＢに結合するか、
（ｑ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＤ２０に結合し、他方はヒトＣＤ３７に結合するか、
（ｒ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＡＮＧ２に結合し、他方はヒトＶＥＧＦに結合するか、
（ｓ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＴＮＦに結合し、他方はヒトＩＬ１７ａに結合するか、
（ｔ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＤ３８に結合し、他方はヒトＣＤ１３８に結合するか、
（ｕ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＥＧＦＲに結合し、他方はヒトＨＥＲ２に結合するか、
（ｖ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＥＧＦＲに結合し、他方はヒトＨＥＲ３に結合するか、
（ｗ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＭＥＴに結合し、他方はヒトＶＥＧＦに結合するか、
（ｘ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＭＥＴに結合し、他方はヒトＥＧＦＲに結合するか、
（ｙ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＴＳＬＰに結合し、他方はヒトＩＬ３３に結合するか、
（ｚ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＩＬ４に結合し、他方はヒトＩＬ１３に結合するか、
（ａａ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＰＤ１に結合し、他方はヒトＣＤ９６に結合するか、
（ｂｂ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＰＤ１に結合し、他方はヒトＳＩＲＰ−アルファに結合するか、または
（ｃｃ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＰＤ１に結合し、他方はヒトＣＣＲ８に結合する、項目１から４６のいずれか一項に記載の混合物。
（項目４９）
霊長類またはヒト化ＩｇＧ ＣＨ１ドメイン、および霊長類またはヒト化ＣＬドメインを含む抗体であって、
前記ＣＨ１ドメインおよび前記ＣＬドメインが、アミノ酸の電荷対を含み、
前記電荷対の一方のアミノ酸が前記ＣＨ１ドメインに存在し、他方が前記ＣＬドメインに存在し、
（２）前記ＣＨ１ドメインはＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインであり、前記電荷対のアミノ酸のＨＣ位置およびＬＣ位置は、それぞれ１８１および１７８ならびに１６８および１７４からなる群より選択されるか、または
（２）前記ＣＨ１ドメインはＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインであり、前記電荷対のアミノ酸のＨＣ位置およびＬＣ位置は、それぞれ１８１および１８０ならびに１６８および１７４からなる群より選択される、抗体。
（項目５０）
霊長類またはヒト化ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン、および霊長類またはヒト化カッパＣＬドメインを含む抗体であって、
前記ＣＨ１ドメインおよび前記ＣＬドメインが、１対の接触システイン残基を含み、
前記１対の一方のシステインが前記ＣＨ１ドメインに存在し、他方が前記ＣＬドメインに存在し、
前記１対のシステインのＣＨ１位置およびＣＬ位置が、それぞれ、（１）１６８および１７４、（２）１３３および１１７、（３）１７３および１６０、（４）１７０および１６２、（５）１７０および１７６、（６）１２６および１２４、（７）１２８および１１８、ならびに（８）１３４および１１６からなる群より選択される、抗体。
（項目５１）
前記ＣＨ１ドメインの２２０位および前記ＣＬドメインの２１４位のシステインの、他のアミノ酸による置換を含む、項目５０に記載の抗体。
（項目５２）
霊長類またはヒト化ＩｇＧ４ ＣＨ１ドメイン、および霊長類またはヒト化カッパＣＬドメインを含む抗体であって、
前記ＣＨ１ドメインおよび前記ＣＬドメインが、１対の接触システイン残基を含み、
前記１対の接触システイン残基の一方がＣＨ１残基に存在し、他方がＣＬ残基に存在し、
前記１対の接触システイン残基の前記ＣＨ１残基および前記ＣＬ残基が、それぞれ、（１）１６８および１７４、（２）１７３および１６２、（３）１７０および１６２、（４）１２６および１２４、（５）１２７および１２１、ならびに（６）１２８および１１８からなる群より選択される、抗体。
（項目５３）
前記ＣＨ１ドメインの１３１位および前記ＣＬドメインの２１４位のシステインの、他のアミノ酸による置換を含む、項目５２に記載の抗体。
（項目５４）
霊長類またはヒト化ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン、および霊長類またはヒト化ＣＬドメインを含む抗体であって、
前記ＣＨ１ドメインの１３１位および前記ＣＬドメインの２１４位のシステインの、他のアミノ酸による置換を含み、
前記ＣＨ１ドメインおよび前記ＣＬドメインが各々、１対の接触システイン残基を生成するシステイン置換を含む、抗体。
（項目５５）
前記１対の接触システイン残基が、それぞれ（１）１７３および１６２位ならびに（２）１７０および１６２位からなる、前記ＣＨ１ドメインおよび前記ＣＬドメインの位置の群から選択される、項目５４に記載の抗体。
（項目５６）
前記ＣＨ１ドメインおよび前記ＣＬドメインが各々、第２の異なる対の接触システイン残基を生成する第２のシステイン置換を含む、項目５４または５５に記載の抗体。
（項目５７）
前記第２の対の接触システイン残基が、それぞれ（１）１７３および１６２位ならびに（２）１７０および１６２位からなる、前記ＣＨ１ドメインおよび前記ＣＬドメインの位置の群から選択される、項目５６に記載の抗体。
（項目５８）
全長ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体である、項目４９から５７のいずれか一項に記載の抗体。
（項目５９）
項目１から４８のいずれか一項に記載の抗体の混合物を作製する方法であって、
（ａ）前記抗体の混合物を発現する宿主細胞株を培養培地中で培養するステップ、および
（ｂ）前記抗体の混合物を細胞塊または前記培養培地から回収するステップ
を含む、方法。
（項目６０）
前記宿主細胞株が、哺乳動物細胞株である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記宿主細胞株が、ＣＨＯ細胞株である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記抗体の混合物を、前記細胞塊または前記培養培地に存在する他の成分から精製するステップをさらに含む、項目５９から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
項目１から４８のいずれか一項に記載の抗体の混合物を産生する宿主細胞株。
（項目６４）
哺乳動物細胞株である、項目６３に記載の宿主細胞株。
（項目６５）
ＣＨＯ細胞株である、項目６４に記載の宿主細胞株。
（項目６６）
項目１から５８のいずれか一項に記載の抗体または抗体の混合物をコードする１つまたは複数の核酸。
（項目６７）
項目６６に記載の核酸を含む１つまたは複数のベクター。
（項目６８）
各々が哺乳動物発現ベクターである、項目６７に記載のベクター。
（項目６９）
各々がウイルスベクターである、項目６７に記載のベクター。
（項目７０）
各々が、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、項目６９に記載のベクター。
（項目７１）
項目６６から７０のいずれか一項に記載の核酸および／またはベクターを含む宿主細胞株。
（項目７２）
疾患を治療する方法であって、前記疾患を有する患者に、項目１から４８のいずれか一項に記載の抗体の混合物を投与することを含み、前記疾患が、がん、代謝疾患、感染性疾患、または自己免疫性もしくは炎症性疾患である、方法。
（項目７３）
前記疾患ががんである、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
疾患を治療する方法であって、前記疾患を有する患者に、項目４９から５８のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
（項目７５）
がんを治療する方法であって、項目４８（ａ）に記載の抗体の混合物を患者に投与することを含む、方法。
（項目７６）
乳がんを治療する方法であって、項目４８（ｂ）に記載の抗体の混合物を患者に投与することを含む、方法。
（項目７７）
前記抗体の混合物が、３つの主要抗体種を含む、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
腫瘍を有する患者を治療する方法であって、前記腫瘍に、項目１から５８のいずれか一項に記載の抗体または抗体の混合物を注射することを含む、方法。
（項目７９）
がん患者を治療する方法であって、前記患者に、項目６６から７０のいずれか一項に記載の核酸および／またはベクターを投与することを含む、方法。
（項目８０）
前記患者が腫瘍を有し、前記核酸および／または前記ベクターが、前記腫瘍に直接投与される、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記核酸および／または前記ベクターが、前記腫瘍に注射される、項目８０に記載の方法。

Claims (81)

  1. ２つの主要抗体種を含む抗体の混合物であって、
    （ａ）第１の重鎖（ＨＣ１）および第１の軽鎖（ＬＣ１）を含む第１の抗体、ならびに
    （ｂ）第２の重鎖（ＨＣ２）および第２の軽鎖（ＬＣ２）を含む第２の抗体を含み、
    前記第１の抗体および前記第２の抗体は、全長霊長類および／またはヒト化ＩｇＧ抗体であり、
    前記第１の抗体が、同じ第１のアミノ酸配列を有する前記ＨＣ１の２つの鎖、および同じ第２のアミノ配列を有する前記ＬＣ１の２つの鎖を含み、
    前記第２の抗体が、同じ第３のアミノ酸配列を有する前記ＨＣ２の２つの鎖、および同じ第４のアミノ配列を有する前記ＬＣ２の２つの鎖を含み、
    前記ＨＣ１および前記ＨＣ２が、異なるアミノ酸配列を有し、
    前記ＬＣ１および前記ＬＣ２が、異なるアミノ酸配列を有し、
    前記混合物が、１０個以下の異なる主要種の全長ＩｇＧ抗体を含み、
    前記混合物が、前記ＨＣ１をコードするＤＮＡ、前記ＨＣ２をコードするＤＮＡ、前記ＬＣ１をコードするＤＮＡおよび前記ＬＣ２をコードするＤＮＡが導入されている宿主細胞株により産生された、混合物。
  2. ３つ以下の異なる主要種の全長抗体を含む、請求項１に記載の混合物。
  3. 前記ＨＣ１をコードするＤＮＡ、前記ＨＣ２をコードするＤＮＡ、前記ＬＣ１をコードするＤＮＡおよび前記ＬＣ２をコードするＤＮＡが、同時に導入された、請求項２に記載の混合物。
  4. 前記ＨＣ１をコードするＤＮＡおよび前記ＬＣ１をコードするＤＮＡが、前記ＨＣ２をコードするＤＮＡおよび前記ＬＣ２をコードするＤＮＡの前に導入されたか、または
    前記ＨＣ２をコードするＤＮＡおよび前記ＬＣ２をコードするＤＮＡが、前記ＨＣ１をコードするＤＮＡおよび前記ＬＣ１をコードするＤＮＡの前に導入された、請求項２に記載の混合物。
  5. 前記ＨＣ１および前記ＨＣ２が、ヒトおよび／またはヒト化ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）であり、前記ＬＣ１および前記ＬＣ２が、ヒトおよび／またはヒト化軽鎖（ＬＣ）である、請求項１から４のいずれか一項に記載の混合物。
  6. （ａ）前記第１の抗体および前記第２の抗体が両方とも、１つまたは複数のパートナー指向性変更を含むか、
    （ｂ）前記第１の抗体および前記第２の抗体が両方とも、１つまたは複数のパートナー指向性変更を含み、前記第１の抗体および前記第２の抗体のうちの少なくとも１つが、ヘテロダイマーに不利な少なくとも１つの変更を含むか、あるいは
    （ｃ）前記第１の抗体が、１つもしくは複数のパートナー指向性変更を含み、前記第２の抗体はそれを含まないか、または前記第２の抗体が、１つもしくは複数のパートナー指向性変更を含み、前記第１の抗体はそれを含まないかのいずれかである、請求項１から５のいずれか一項に記載の混合物。
  7. 前記第１の抗体が、ヘテロダイマーに不利な１つもしくは複数の変更を含み、前記第２の抗体はそれを含まないか、または前記第２の抗体が、ヘテロダイマーに不利な１つもしくは複数の変更を含み、前記第１の抗体はそれを含まないかのいずれかである、請求項６（ｃ）に記載の混合物。
  8. （１）前記第１の抗体が、１つもしくは複数のパートナー指向性変更およびヘテロダイマーに不利な１つもしくは複数の変更を含み、前記第２の抗体が、パートナー指向性変更もヘテロダイマーに不利な変更も含まないか、または
    （２）前記第２の抗体が、１つもしくは複数のパートナー指向性変更およびヘテロダイマーに不利な１つもしくは複数の変更を含み、前記第１の抗体が、パートナー指向性変更もヘテロダイマーに不利な変更も含まない、請求項７に記載の混合物。
  9. ３つの主要抗体種を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の混合物。
  10. ２つ以下の主要抗体種を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の混合物。
  11. 前記ＨＣ１および／または前記ＨＣ２が、ヘテロダイマーに不利な１つまたは複数の変更を含む、請求項１０に記載の混合物。
  12. （ａ）（１）前記ＨＣ１はＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２重鎖（ＨＣ）であり、前記ＨＣ２はＩｇＧ４ ＨＣであり、前記ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、前記ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか、または（２）前記ＨＣ２はＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、前記ＨＣ１はＩｇＧ４ ＨＣであり、前記ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、前記ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか；あるいは
    （ｂ）（１）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２は各々、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、前記ＨＣ１は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、前記ＨＣ２は変更Ｋ４０９Ｒを含むか、または（２）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２は各々、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、前記ＨＣ２は、ヘテロダイマーに不利な変更を３９９および４０９位に含み、前記ＨＣ１は変更Ｋ４０９Ｒを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の混合物。
  13. （ａ）（１）前記ＨＣ１は、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、変更Ｄ３９９Ｒ／ＫおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含み、前記ＨＣ２は、ＩｇＧ４ ＨＣであり、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか、または（２）前記ＨＣ２は、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ ＨＣであり、変更Ｄ３９９Ｒ／ＫおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含み、前記ＨＣ１は、ＩｇＧ４ ＨＣであり、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか；あるいは
    （ｂ）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２は各々、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ ＨＣであり、それらの一方は変更Ｄ３９９Ｒ／ＫおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含み、他方は変更Ｋ４０９Ｒを含む、請求項１２に記載の混合物。
  14. 前記第１の抗体が、ヘテロダイマーに不利な少なくとも１つの変更を含み、前記第２の抗体が、ヘテロダイマーに不利な変更を含まないか、または前記第２の抗体が、ヘテロダイマーに不利な少なくとも１つの変更を含み、前記第１の抗体が、ヘテロダイマーに不利な変更を含まない、請求項１から６および９から１１のいずれか一項に記載の混合物。
  15. （ａ）前記第１の抗体が、少なくとも１つのパートナー指向性変更を含み、前記第２の抗体はそれを含まず、
    （ｂ）（１）前記第１の抗体が、ヒトおよび／もしくはヒト化ＩｇＧ１抗体であり、前記ＨＣ１の２２０位のシステインが別のアミノ酸により置換されており、前記ＬＣ１の２１４位のシステインが別のアミノ酸により置換されているか、または（２）前記第１の抗体が、ヒトおよび／もしくはヒト化ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４抗体であり、前記ＨＣ１の１３１位のシステインが別のアミノ酸により置換されており、前記ＬＣ１の２１４位のシステインが別のアミノ酸により置換されている、請求項１から１４のいずれか一項に記載の混合物。
  16. 前記第１の抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、前記ＨＣ１に変更Ｃ２２０Ｇ／Ａおよび前記ＬＣ１にＣ２１４Ｓ／Ａ／Ｇを含むか、または
    前記第１の抗体が、ヒトおよび／もしくはヒト化ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４抗体であり、前記ＨＣ１に変更Ｃ１３１Ｓ／Ａ／Ｇおよび前記ＬＣ１にＣ２１４Ｓ／Ａ／Ｇを含む、請求項１５に記載の混合物。
  17. 前記第１の抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、前記ＨＣ１に変更Ｃ２２０Ｇおよび前記ＬＣ１にＣ２１４Ｓを含むか、または
    前記第１の抗体が、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４抗体であり、前記ＨＣ１に変更Ｃ１３１Ｓおよび前記ＬＣ１にＣ２１４Ｓを含む、請求項１６に記載の混合物。
  18. 前記第１の抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、
    前記第１の抗体が、第１の対のアミノ酸位置に少なくとも１対のシステイン置換を含み、
    前記第１の対のアミノ酸位置が、第１のＨＣ１位置および第１のＬＣ１位置を含み、
    前記第１のＨＣ１位置および前記第１のＬＣ１位置が、それぞれ、１２６および１２４位；１２８および１１８位；１３３および１１７位；１３３および２０９位；１３４および１１６位；１６８および１７４位；１７０および１６２位；１７０および１７６位；１７３および１６０位；ならびに１８３および１７６位からなる群より選択される、請求項１５から１７のいずれかに記載の混合物。
  19. 前記第１のＨＣ１位置および前記第１のＬＣ１位置が、それぞれ、１６８および１７４位；１７３および１６０位；ならびに１７０および１６２位からなる群より選択される、請求項１８に記載の混合物。
  20. 前記第１の抗体が、それぞれ前記第１のＨＣ１位置および前記第１のＬＣ１位置とは異なる第２のＨＣ１位置および第２のＬＣ１位置を含む第２の対の位置に第２の対のシステイン置換を含み、
    前記第２のＨＣ１位置および前記第２のＬＣ１位置が、それぞれ、１２６および１２４位；１２８および１１８位；１３３および１１７位；１３３および２０９位；１３４および１１６位；１６８および１７４位；１７０および１６２位；１７０および１７６位；１７３および１６０位；ならびに１８３および１７６位からなる群より選択される、請求項１９に記載の混合物。
  21. 前記第１のＨＣ１位置および前記第１のＬＣ１位置が、それぞれ１７３および１６０であり、前記第２のＨＣ１位置および前記第２のＬＣ１位置が、それぞれ１７０および１６２である、請求項２０に記載の混合物。
  22. 前記第１の抗体が、ＩｇＧ４抗体であり、
    前記第１の抗体が、第１の対のアミノ酸位置に少なくとも１対のシステイン置換を含み、
    前記第１の対のアミノ酸位置が、第１のＨＣ１位置および第１のＬＣ１位置を含み、
    前記第１のＨＣ１位置および前記第１のＬＣ１位置が、それぞれ、１２６および１２１位；１２６および１２４位；１２７および１２１位；１２８および１１８位；１６８および１７４位；１７０および１６２位；ならびに１７３および１６２位からなる群より選択される、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の混合物。
  23. 前記第１の抗体が、それぞれ前記第１のＨＣ１位置および前記第１のＬＣ１位置とは異なる第２のＨＣ１位置および第２のＬＣ１位置に第２の対のシステイン置換を含み、
    前記第２のＨＣ１位置および前記第２のＬＣ１位置が、それぞれ、１２６および１２１位；１２６および１２４位；１２７および１２１位；１２８および１１８位；１６８および１７４位；１７０および１６２位；ならびに１７３および１６２位からなる群より選択される、請求項２２に記載の混合物。
  24. 前記第１の抗体が、ＩｇＧ２抗体であり、
    前記第１の抗体が、第１の対の接触アミノ酸位置に少なくとも１対のシステイン置換を含み、一方の位置が前記ＨＣ１に存在し、他方が前記ＬＣ１に存在する、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の混合物。
  25. 前記ＨＣ１および前記ＬＣ１の、前記第１の対の接触アミノ酸位置が、それぞれ、１７０および１６２ならびに１７３および１６０からなる群より選択される、請求項２４に記載の混合物。
  26. 前記第１の抗体が、第２の対の接触アミノ酸位置に第２の対のシステイン置換を含み、前記第２の対の接触アミノ酸位置の一方の位置がＨＣ１位置に存在し、他方がＬＣ１位置に存在し、前記第２の対の接触アミノ酸位置のＨＣ１位置およびＬＣ１位置が各々、前記第１の対の接触アミノ酸位置のそれぞれＨＣ１位置およびＬＣ１位置とは異なる、請求項２４または２５に記載の混合物。
  27. 前記ＨＣ１および前記ＬＣ１の、前記第２の対の接触アミノ酸位置が、それぞれ１７０および１６２ならびに１７３および１６０からなる群より選択される、請求項２６に記載の混合物。
  28. 前記第１の抗体が、別のアミノ酸が荷電アミノ酸に置換されている少なくとも１つのパートナー指向性変更を含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の混合物。
  29. 前記第１の抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、
    前記第１の抗体が、アミノ酸の電荷対を含み、
    前記電荷対の１つのアミノ酸が、前記ＨＣ１に存在し、前記電荷対の１つのアミノ酸が、前記ＬＣ１に存在し、
    前記電荷対のアミノ酸のうちの少なくとも１つが、前記パートナー指向性変更に起因し、
    前記電荷対が、それぞれ、前記ＨＣ１および前記ＬＣ１の１４７Ｄ／Ｅおよび１２４Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１２９Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１３１Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１８０Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１６４Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１６７Ｋ／Ｒ；または１６８Ｄ／Ｅおよび１７４Ｋ／Ｒの位置にあるアミノ酸対の１つからなる、請求項２８に記載の混合物。
  30. 前記第１の抗体が、ＩｇＧ４抗体であり、
    前記第１の抗体が、アミノ酸の電荷対を含み、
    前記電荷対の１つのアミノ酸が、前記ＨＣ１に存在し、前記電荷対の１つのアミノ酸が、前記ＬＣ１に存在し、
    前記電荷対のアミノ酸のうちの少なくとも１つが、前記パートナー指向性変更に起因し、
    前記電荷対が、それぞれ、前記ＨＣ１および前記ＬＣ１の１３３Ｄ／Ｅおよび１１７Ｋ／Ｒ；１３７Ｋ／Ｒおよび１１４Ｄ／Ｅ；１３７Ｋ／Ｒおよび１１６Ｄ／Ｅ；１４７Ｄ／Ｅおよび１２４Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１２９Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１３１Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１７８Ｋ／Ｒ；１４７Ｄ／Ｅおよび１８０Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１６４Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１６７Ｋ／Ｒ；１６８Ｄ／Ｅおよび１７３Ｋ／Ｒ；または１６８Ｄ／Ｅおよび１７４Ｋ／Ｒの位置にあるアミノ酸対の１つからなる、請求項２８に記載の混合物。
  31. 前記第１の抗体が、ＩｇＧ２抗体であり、
    前記第１の抗体が、アミノ酸の電荷対を含み、
    前記電荷対の１つのアミノ酸が、前記ＨＣ１に存在し、前記電荷対の１つのアミノ酸が、前記ＬＣ１に存在し、
    前記電荷対のアミノ酸のうちの少なくとも１つが、前記パートナー指向性変更に起因する、請求項２８に記載の混合物。
  32. 前記電荷対が、前記ＨＣ１の１４７Ｄ／Ｅおよび前記ＬＣ１の１３１Ｋ／Ｒからなる、請求項３１に記載の混合物。
  33. 前記ＨＣ１および／または前記ＨＣ２が、ＨＣ残基に少なくとも１つのＬＣパートナー指向性変更を含み、
    前記ＬＣ１および／または前記ＬＣ２は、それぞれＨＣ１および／もしくはＨＣ２において、前記ＬＣパートナー指向性変更が行われている前記ＨＣ残基と接触するか、またはそれぞれ前記ＨＣ１および／もしくは前記ＨＣ２に存在する荷電アミノ酸もしくはシステインと接触するＬＣ残基に少なくとも１つのＨＣパートナー指向性変更を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の混合物。
  34. 前記ＬＣパートナー指向性変更は、前記ＨＣ１および前記ＨＣ２が、前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の両方の前記ＨＣ残基に荷電アミノ酸を含むことを引き起こし、
    前記ＨＣ１の前記ＨＣ残基の前記荷電アミノ酸は、前記ＨＣ２の前記ＨＣ残基の前記荷電アミノ酸と電荷が逆であり、
    前記ＨＣパートナー指向性変更は、前記ＬＣ１および前記ＬＣ２が、前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の両方の前記ＬＣ残基に荷電アミノ酸を含むことを引き起こし、
    前記ＬＣ１の前記ＬＣ残基の前記荷電アミノ酸は、前記ＬＣ２の前記ＬＣ残基の前記荷電アミノ酸と電荷が逆であり、
    前記ＬＣ１の前記ＬＣ残基の前記荷電アミノ酸は、前記ＨＣ１の前記ＨＣ残基の前記アミノ酸と電荷が逆である、請求項３３に記載の混合物。
  35. 前記第１の抗体および前記第２の抗体が、
    （ａ）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の両方の４４および１０５位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の両方の４３および１００位は各々、荷電アミノ酸により占められており、前記ＨＣ１の４４および１０５位のアミノ酸は各々、前記ＨＣ２の同じ部位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＬＣ１の４３および１００位のアミノ酸は各々、前記ＬＣ２の同じ部位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の４４位のアミノ酸は、それぞれ前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１００位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１０５位のアミノ酸は、それぞれ前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の４３位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット；
    （ｂ）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１４７位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１３１位は各々、荷電アミノ酸により占められており、前記ＨＣ１の１４７位のアミノ酸は、前記ＨＣ２の１４７位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＬＣ１の１３１位のアミノ酸は、前記ＬＣ２の１３１位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１４７位のアミノ酸は、それぞれ前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１３１位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット；
    （ｃ）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１６８位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１７４位は各々、荷電アミノ酸により占められており、前記ＨＣ１の１６８位のアミノ酸は、前記ＨＣ２の１６８位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＬＣ１の１７４位のアミノ酸は、前記ＬＣ２の１７４位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１６８位のアミノ酸は、それぞれ前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１７４位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット；ならびに
    （ｄ）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１８１位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１７８または１８０位は各々、荷電アミノ酸により占められており、前記ＨＣ１の１８１位のアミノ酸は、前記ＨＣ２の１８１位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＬＣ１の１７８または１８０位のアミノ酸は、前記ＬＣ２の１７８または１８０位のアミノ酸と電荷が逆であり、前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１８１位のアミノ酸は、それぞれ前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１７８または１８０位のアミノ酸と電荷が逆である変更のセット
    からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、請求項３３または３４に記載の混合物。
  36. 前記第１の抗体および前記第２の抗体が、
    （ａ）前記ＨＣ１は４４Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ１は１００Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ２は４４Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ２は１００Ｄ／Ｅを含むか、または前記ＨＣ２は４４Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ２は１００Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ１は４４Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ１は１００Ｄ／Ｅを含む変更のセット；
    （ｂ）前記ＨＣ１は１０５Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ１は４３Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ２は１０５Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ２は４３Ｄ／Ｅを含むか、または前記ＨＣ２は１０５Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ２は４３Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ１は１０５Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ１は４３Ｄ／Ｅを含む変更のセット；
    （ｃ）前記ＨＣ１は１４７Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ１は１３１Ｅ／Ｄを含み、前記ＨＣ２は１４７Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ２は１３１Ｒ／Ｋを含むか、または前記ＨＣ２は１４７Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ２は１３１Ｅ／Ｄを含み、前記ＨＣ１は１４７Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ１は１３１Ｒ／Ｋを含む変更のセット；
    （ｄ）前記ＨＣ１は１６８Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ１は１７４Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ２は１６８Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ２は１７４Ｄ／Ｅを含むか、または前記ＨＣ２は１６８Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ２は１７４Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ１は１６８Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ１は１７４Ｄ／Ｅを含む変更のセット；ならびに
    （ｅ）前記ＨＣ１は１８１Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ１は１７８Ｒ／Ｋもしくは１８０Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ２は１８１Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ２は１７８Ｄ／Ｅもしくは１８０Ｄ／Ｅを含むか、または前記ＨＣ２は１８１Ｅ／Ｄを含み、前記ＬＣ２は１７８Ｒ／Ｋもしくは１８０Ｒ／Ｋを含み、前記ＨＣ１は１８１Ｒ／Ｋを含み、前記ＬＣ１は１７８Ｄ／Ｅもしくは１８０Ｄ／Ｅを含む変更のセット
    からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の混合物。
  37. 前記第１の抗体および前記第２の抗体が、
    （ａ）前記ＨＣ１は４４Ｄおよび１０５Ｒを含み、前記ＬＣ１は４３Ｄおよび１００Ｒを含み、前記ＨＣ２は４４Ｒおよび１０５Ｄを含み、前記ＬＣ２は４３Ｒおよび１００Ｄを含むか、または前記ＨＣ２は４４Ｄおよび１０５Ｒを含み、前記ＬＣ２は４３Ｄおよび１００Ｒを含み、前記ＨＣ１は４４Ｒおよび１０５Ｄを含み、前記ＬＣ１は４３Ｒおよび１００Ｄを含む変更のセット；
    （ｂ）前記ＨＣ１は１４７Ｒを含み、前記ＬＣ１は１３１Ｄを含み、前記ＨＣ２は１４７Ｄを含み、前記ＬＣ２は１３１Ｒを含むか、または前記ＨＣ２は１４７Ｒを含み、前記ＬＣ２は１３１Ｄを含み、前記ＨＣ１は１４７Ｄを含み、前記ＬＣ１は１３１Ｒを含む変更のセット；
    （ｃ）前記ＨＣ１は１６８Ｄを含み、前記ＬＣ１は１７４Ｒを含み、前記ＨＣ２は１６８Ｒを含み、前記ＬＣ２は１７４Ｄを含むか、または前記ＨＣ２は１６８Ｄを含み、前記ＬＣ２は１７４Ｒを含み、前記ＨＣ１は１６８Ｒを含み、前記ＬＣ１は１７４Ｄを含む変更のセット；ならびに
    （ｄ）前記ＨＣ１は１８１Ｄを含み、前記ＬＣ１は１７８Ｒもしくは１８０Ｒを含み、前記ＨＣ２は１８１Ｒを含み、前記ＬＣ２は１７８Ｄもしくは１８０Ｄを含むか、または前記ＨＣ２は１８１Ｄを含み、前記ＬＣ２は１７８Ｒもしくは１８０Ｒを含み、前記ＨＣ１は１８１Ｒを含み、前記ＬＣ１は１７８Ｄもしくは１７８Ｄを含む変更のセット
    からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、請求項３６に記載の混合物。
  38. 前記第１の抗体および前記第２の抗体が、
    （ａ）前記ＨＣ１はＧ４４ＤおよびＱ１０５Ｒを含み、前記ＬＣ１はＡ／Ｖ４３ＤおよびＱ／Ｇ１００Ｒを含み、前記ＨＣ２はＧ４４ＲおよびＱ１０５Ｄを含み、前記ＬＣ２はＡ／Ｖ４３ＲおよびＱ／Ｇ１００Ｄを含むか、または前記ＨＣ２はＧ４４ＤおよびＱ１０５Ｒを含み、前記ＬＣ２はＡ／Ｖ４３ＤおよびＱ／Ｇ１００Ｒを含み、前記ＨＣ１はＧ４４ＲおよびＱ１０５Ｄを含み、前記ＬＣ１はＡ／Ｖ４３ＲおよびＱ／Ｇ１００Ｄを含む変更のセット；
    （ｂ）前記ＨＣ１はＫ１４７Ｒを含み、前記ＬＣ１はＳ１３１Ｄを含み、前記ＨＣ２はＫ１４７Ｄを含み、前記ＬＣ２はＳ１３１Ｒを含むか、または前記ＨＣ２はＫ１４７Ｒを含み、前記ＬＣ２はＳ１３１Ｄを含み、前記ＨＣ１はＫ１４７Ｄを含み、前記ＬＣ１はＳ１３１Ｒを含む変更のセット；
    （ｃ）前記ＨＣ１はＨ１６８Ｄを含み、前記ＬＣ１はＳ１７４Ｒを含み、前記ＨＣ２はＨ１６８Ｒを含み、前記ＬＣ２はＳ１７４Ｄを含むか、または前記ＨＣ２はＨ１６８Ｄを含み、前記ＬＣ２はＳ１７４Ｒを含み、前記ＨＣ１はＨ１６８Ｒを含み、前記ＬＣ１はＳ１７４Ｄを含む変更のセット；ならびに
    （ｄ）前記ＨＣ１はＳ１８１Ｄを含み、前記ＬＣ１はＴ／Ｙ１７８ＲもしくはＴ／Ｓ１８０Ｒを含み、前記ＨＣ２はＳ１８１Ｒを含み、前記ＬＣ２はＴ／Ｙ１７８ＤもしくはＴ／Ｓ１８０Ｄを含むか、または前記ＨＣ２はＳ１８１Ｄを含み、前記ＬＣ２はＴ／Ｙ１７８ＲもしくはＴ／Ｓ１８０Ｒを含み、前記ＨＣ１はＳ１８１Ｒを含み、前記ＬＣ１はＴ／Ｙ１７８ＤもしくはＴ／Ｓ１８０Ｄを含む変更のセット
    からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、請求項３７に記載の混合物。
  39. 前記第１の抗体および／または前記第２の抗体が、１つまたは複数の対の位置に１つまたは複数の対のシステイン置換を含み、
    各対の位置が、１つのＨＣ位置および１つのＬＣ位置を含み、
    前記対の位置のそれぞれ前記ＨＣ位置および前記ＬＣ位置が、１２６および１２１；１２６および１２４；１２７および１２１；１２８および１１８；１３３および１１７；１３３および２０９；１３４および１１６；１４１および１１６；１６８および１７４；１７０および１６２；１７０および１７６；１７３および１６０；１７３および１６２；ならびに１８３および１７６からなる群より選択され、
    前記第１の抗体および前記第２の抗体が、同じ対の位置にシステイン置換を含まない、請求項３３から３８のいずれか一項に記載の混合物。
  40. 前記第１の抗体および前記第２の抗体が、
    （１）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７０および１８３位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７０および１８３位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されていること；
    （２）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７３および１７０位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１６０および１６２位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７３および１７０位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１６０および１６２位は各々、システインにより置換されていること；
    （３）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７３および１８３位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１６０および１７６位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７３および１８３位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１６０および１７６位は各々、システインにより置換されていること；
    （４）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１７０位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１の１７０位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されていること；
    （５）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７０および１７３位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１６２および１６０位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７０および１７３位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１６２および１６０位は各々、システインにより置換されていること；
    （６）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７３および１７０位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７３および１７０位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１６２および１７６位は各々、システインにより置換されていること；
    （７）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２の１７３位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１６２および１６０位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１の１７３位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１６２および１６０位は各々、システインにより置換されていること；
    （８）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１８３および１７３位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１７６および１６０位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１８３および１７３位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１７６および１６０位は各々、システインにより置換されていること；
    （９）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７０および１７３位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２のそれぞれ１７６および１６０位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７０および１７３位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１のそれぞれ１７６および１６０位は各々、システインにより置換されていること；
    （１０）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７０および１８３位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の１７６位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７０および１８３位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１の１７６位は各々、システインにより置換されていること；ならびに
    （１１）前記ＨＣ１および前記ＨＣ２のそれぞれ１７３および１７０位ならびに前記ＬＣ１および前記ＬＣ２の両方の１６２位は各々、システインにより置換されているか、または前記ＨＣ２および前記ＨＣ１のそれぞれ１７３および１７０位ならびに前記ＬＣ２および前記ＬＣ１の両方の１６２位は各々、システインにより置換されていること
    からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、請求項３９に記載の混合物。
  41. 前記第１の抗体および前記第２の抗体が、
    （１）前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
    （２）前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含み、前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含み、前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含むこと；
    （３）前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含み、前記ＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含み、前記ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
    （４）前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
    （５）前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含むこと；
    （６）前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；
    （７）前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含むこと；
    （８）前記ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含み、前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含み、前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＱ／Ｅ１６０Ｃを含むこと；
    （９）前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含み、前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＱ１６０Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含み、前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＱ１６０Ｃを含むこと；
    （１０）前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含み、前記ＨＣ２はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１７６Ｃを含み、前記ＨＣ１はＳ１８３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１７６Ｃを含むこと；および
    （１１）前記ＨＣ１はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ２はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含むか、または前記ＨＣ２はＶ１７３Ｃを含み、前記ＬＣ２はＳ１６２Ｃを含み、前記ＨＣ１はＦ１７０Ｃを含み、前記ＬＣ１はＳ１６２Ｃを含むこと
    からなる群より選択される変更のセットの１つまたは複数を含む、請求項４０に記載の混合物。
  42. 前記ＨＣ１および／または前記ＨＣ２がＩｇＧ４ ＨＣである場合、前記ＩｇＧ４ ＨＣが、２２８Ｐを含む、請求項１から４１のいずれか一項に記載の混合物。
  43. 前記第１の抗体および前記第２の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、少なくとも１週間異なる、請求項１から４２のいずれか一項に記載の混合物。
  44. 前記第１の抗体および前記第２の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、少なくとも１０日間異なる、請求項４３に記載の混合物。
  45. 前記第１の抗体および前記第２の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、少なくとも２週間異なる、請求項４４に記載の混合物。
  46. より短いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有する前記抗体が、Ｍ２５２Ａ、Ｍ２５２Ｌ、Ｍ２５２Ｓ、Ｍ２５２Ｒ、Ｒ２５５Ｋ、またはＨ４３５Ｒの変更のうちの少なくとも１つを含む、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の混合物。
  47. 前記ＨＣ１が、それぞれ、アミノ酸配列である配列番号２８、２９、および３０を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、前記ＬＣ１が、それぞれ、アミノ酸配列である配列番号２５、２６、および２７を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、前記ＨＣ２が、アミノ酸配列である配列番号３１、３２、および３３を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、前記ＬＣ２が、アミノ酸配列である配列番号３４、３５、および３６を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項１から１４および３３から４６のいずれか一項に記載の混合物。
  48. （ａ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
    （ｂ）前記第１の抗体および前記第２の抗体は両方ともヒトＨＥＲ２に結合するが、ＨＥＲ２との結合について競合しないか、
    （ｃ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＬＡＧ３に結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
    （ｄ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＧＩＴＲに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
    （ｄ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＶＥＧＦに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
    （ｆ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＳＦＲ１ａに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
    （ｇ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＯＸ４０に結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
    （ｈ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＴＩＧＩＴに結合し、他方はヒトＰＤ１に結合するか、
    （ｉ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
    （ｊ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＶＥＧＦに結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
    （ｋ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＯＸ４０に結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
    （ｌ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＳＦＲ１ａに結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
    （ｍ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＴＩＧＩＴに結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
    （ｎ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＴｉｍ３に結合し、他方はヒトＰＤＬ１に結合するか、
    （ｏ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒトＶＥＧＦに結合するか、
    （ｐ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＴＬＡ４に結合し、他方はヒト４１ＢＢに結合するか、
    （ｑ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＤ２０に結合し、他方はヒトＣＤ３７に結合するか、
    （ｒ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＡＮＧ２に結合し、他方はヒトＶＥＧＦに結合するか、
    （ｓ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＴＮＦに結合し、他方はヒトＩＬ１７ａに結合するか、
    （ｔ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＣＤ３８に結合し、他方はヒトＣＤ１３８に結合するか、
    （ｕ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＥＧＦＲに結合し、他方はヒトＨＥＲ２に結合するか、
    （ｖ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＥＧＦＲに結合し、他方はヒトＨＥＲ３に結合するか、
    （ｗ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＭＥＴに結合し、他方はヒトＶＥＧＦに結合するか、
    （ｘ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＭＥＴに結合し、他方はヒトＥＧＦＲに結合するか、
    （ｙ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＴＳＬＰに結合し、他方はヒトＩＬ３３に結合するか、
    （ｚ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＩＬ４に結合し、他方はヒトＩＬ１３に結合するか、
    （ａａ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＰＤ１に結合し、他方はヒトＣＤ９６に結合するか、
    （ｂｂ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＰＤ１に結合し、他方はヒトＳＩＲＰ−アルファに結合するか、または
    （ｃｃ）前記第１の抗体および前記第２の抗体の一方はヒトＰＤ１に結合し、他方はヒトＣＣＲ８に結合する、請求項１から４６のいずれか一項に記載の混合物。
  49. 霊長類またはヒト化ＩｇＧ ＣＨ１ドメイン、および霊長類またはヒト化ＣＬドメインを含む抗体であって、
    前記ＣＨ１ドメインおよび前記ＣＬドメインが、アミノ酸の電荷対を含み、
    前記電荷対の一方のアミノ酸が前記ＣＨ１ドメインに存在し、他方が前記ＣＬドメインに存在し、
    （２）前記ＣＨ１ドメインはＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインであり、前記電荷対のアミノ酸のＨＣ位置およびＬＣ位置は、それぞれ１８１および１７８ならびに１６８および１７４からなる群より選択されるか、または
    （２）前記ＣＨ１ドメインはＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインであり、前記電荷対のアミノ酸のＨＣ位置およびＬＣ位置は、それぞれ１８１および１８０ならびに１６８および１７４からなる群より選択される、抗体。
  50. 霊長類またはヒト化ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン、および霊長類またはヒト化カッパＣＬドメインを含む抗体であって、
    前記ＣＨ１ドメインおよび前記ＣＬドメインが、１対の接触システイン残基を含み、
    前記１対の一方のシステインが前記ＣＨ１ドメインに存在し、他方が前記ＣＬドメインに存在し、
    前記１対のシステインのＣＨ１位置およびＣＬ位置が、それぞれ、（１）１６８および１７４、（２）１３３および１１７、（３）１７３および１６０、（４）１７０および１６２、（５）１７０および１７６、（６）１２６および１２４、（７）１２８および１１８、ならびに（８）１３４および１１６からなる群より選択される、抗体。
  51. 前記ＣＨ１ドメインの２２０位および前記ＣＬドメインの２１４位のシステインの、他のアミノ酸による置換を含む、請求項５０に記載の抗体。
  52. 霊長類またはヒト化ＩｇＧ４ ＣＨ１ドメイン、および霊長類またはヒト化カッパＣＬドメインを含む抗体であって、
    前記ＣＨ１ドメインおよび前記ＣＬドメインが、１対の接触システイン残基を含み、
    前記１対の接触システイン残基の一方がＣＨ１残基に存在し、他方がＣＬ残基に存在し、
    前記１対の接触システイン残基の前記ＣＨ１残基および前記ＣＬ残基が、それぞれ、（１）１６８および１７４、（２）１７３および１６２、（３）１７０および１６２、（４）１２６および１２４、（５）１２７および１２１、ならびに（６）１２８および１１８からなる群より選択される、抗体。
  53. 前記ＣＨ１ドメインの１３１位および前記ＣＬドメインの２１４位のシステインの、他のアミノ酸による置換を含む、請求項５２に記載の抗体。
  54. 霊長類またはヒト化ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン、および霊長類またはヒト化ＣＬドメインを含む抗体であって、
    前記ＣＨ１ドメインの１３１位および前記ＣＬドメインの２１４位のシステインの、他のアミノ酸による置換を含み、
    前記ＣＨ１ドメインおよび前記ＣＬドメインが各々、１対の接触システイン残基を生成するシステイン置換を含む、抗体。
  55. 前記１対の接触システイン残基が、それぞれ（１）１７３および１６２位ならびに（２）１７０および１６２位からなる、前記ＣＨ１ドメインおよび前記ＣＬドメインの位置の群から選択される、請求項５４に記載の抗体。
  56. 前記ＣＨ１ドメインおよび前記ＣＬドメインが各々、第２の異なる対の接触システイン残基を生成する第２のシステイン置換を含む、請求項５４または５５に記載の抗体。
  57. 前記第２の対の接触システイン残基が、それぞれ（１）１７３および１６２位ならびに（２）１７０および１６２位からなる、前記ＣＨ１ドメインおよび前記ＣＬドメインの位置の群から選択される、請求項５６に記載の抗体。
  58. 全長ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体である、請求項４９から５７のいずれか一項に記載の抗体。
  59. 請求項１から４８のいずれか一項に記載の抗体の混合物を作製する方法であって、
    （ａ）前記抗体の混合物を発現する宿主細胞株を培養培地中で培養するステップ、および
    （ｂ）前記抗体の混合物を細胞塊または前記培養培地から回収するステップ
    を含む、方法。
  60. 前記宿主細胞株が、哺乳動物細胞株である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記宿主細胞株が、ＣＨＯ細胞株である、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記抗体の混合物を、前記細胞塊または前記培養培地に存在する他の成分から精製するステップをさらに含む、請求項５９から６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 請求項１から４８のいずれか一項に記載の抗体の混合物を産生する宿主細胞株。
  64. 哺乳動物細胞株である、請求項６３に記載の宿主細胞株。
  65. ＣＨＯ細胞株である、請求項６４に記載の宿主細胞株。
  66. 請求項１から５８のいずれか一項に記載の抗体または抗体の混合物をコードする１つまたは複数の核酸。
  67. 請求項６６に記載の核酸を含む１つまたは複数のベクター。
  68. 各々が哺乳動物発現ベクターである、請求項６７に記載のベクター。
  69. 各々がウイルスベクターである、請求項６７に記載のベクター。
  70. 各々が、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項６９に記載のベクター。
  71. 請求項６６から７０のいずれか一項に記載の核酸および／またはベクターを含む宿主細胞株。
  72. 疾患を治療する方法であって、前記疾患を有する患者に、請求項１から４８のいずれか一項に記載の抗体の混合物を投与することを含み、前記疾患が、がん、代謝疾患、感染性疾患、または自己免疫性もしくは炎症性疾患である、方法。
  73. 前記疾患ががんである、請求項７２に記載の方法。
  74. 疾患を治療する方法であって、前記疾患を有する患者に、請求項４９から５８のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
  75. がんを治療する方法であって、請求項４８（ａ）に記載の抗体の混合物を患者に投与することを含む、方法。
  76. 乳がんを治療する方法であって、請求項４８（ｂ）に記載の抗体の混合物を患者に投与することを含む、方法。
  77. 前記抗体の混合物が、３つの主要抗体種を含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 腫瘍を有する患者を治療する方法であって、前記腫瘍に、請求項１から５８のいずれか一項に記載の抗体または抗体の混合物を注射することを含む、方法。
  79. がん患者を治療する方法であって、前記患者に、請求項６６から７０のいずれか一項に記載の核酸および／またはベクターを投与することを含む、方法。
  80. 前記患者が腫瘍を有し、前記核酸および／または前記ベクターが、前記腫瘍に直接投与される、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記核酸および／または前記ベクターが、前記腫瘍に注射される、請求項８０に記載の方法。
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