CN117651714A - 多特异性和单价IgG分子组装中链配对的静电转向中的平衡电荷分布 - Google Patents

多特异性和单价IgG分子组装中链配对的静电转向中的平衡电荷分布 Download PDF

Info

Publication number
CN117651714A
CN117651714A CN202280043338.8A CN202280043338A CN117651714A CN 117651714 A CN117651714 A CN 117651714A CN 202280043338 A CN202280043338 A CN 202280043338A CN 117651714 A CN117651714 A CN 117651714A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
domain
hinge
amino acid
immunoglobulin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280043338.8A
Other languages
English (en)
Inventor
宫丹阳
B·埃斯蒂斯
王主伦
F·加尔西斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amgen Inc
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of CN117651714A publication Critical patent/CN117651714A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

多特异性抗体，例如双特异性和三特异性抗体的临床潜力显示出用于靶向复杂疾病的巨大希望。然而，那些分子的产生带来了巨大的挑战，特别是在实现不含错误配对的多肽的可接受表达水平方面。当前要求保护的发明涉及多特异性抗原结合蛋白，其通过在异多聚体的CH3区内使工程化电荷重新分布来改善现有的电荷对技术。

Description

多特异性和单价IgG分子组装中链配对的静电转向中的平衡 电荷分布
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年4月20日提交的美国临时专利申请号63/177,325的权益，该临时专利申请通过援引以其全文并入本文。
序列表
本申请含有已以ASCII格式以电子方式提交且特此通过援引以其全文并入的序列表。所述ASCII副本创建于2022年4月15日，名称为A-2745-WO01-SEC_SEQUENCE_LISTING_041522_ST25.txt，并且大小为12千字节。
技术领域
本发明涉及生物药剂学领域。特别地，本发明涉及异多聚体，其通过在免疫球蛋白CH3结构域中插入突变而产生。多特异性抗原结合蛋白通过在异多聚体的CH3区内使工程化电荷重新分布来改善现有的电荷对技术。
背景技术
双特异性抗体被设计用于识别相同或不同靶标中的两个不同表位，代表了新一代的大分子治疗剂。双特异性抗体作为赋予新治疗剂功能(例如在双特异性T细胞接合剂(BiTE)中看到的T细胞和肿瘤细胞的同时结合)的方式越来越受到关注。然而，这些治疗剂比常规的单克隆抗体(mAb)更复杂，并且在开发的每个阶段都带来了另外的挑战。
免疫球蛋白G(IgG)被用作开发双特异性抗体的最常见的支架之一。IgG分子由2条相同的重链(HC)构成，每条重链与一个拷贝的相同的轻链(LC)配对，这些链以对称的“Y”形折叠在一起。野生型(WT)IgG内的HC/HC相互作用经由二硫键在柔性绞链区发生，经由N-连接的聚糖在CH2/CH2'界面发生，以及经由直接蛋白质相互作用在CH3/CH3界面发生。然而，在开发双特异性抗体时，单个细胞中两个不相同的HC的表达通常可导致两个相应的同二聚体的产生。这样的杂质不仅将会影响与安全性和功效相关的产品质量，还会影响生产产量和商品成本。因此，为了驱动组装含异Fc双特异性抗体所需的2种不同的HC的配对，必须工程化特定的异二聚化界面。因此，已经开发了许多工程化方法来增加正确链配对的比率，这些方法包括但不限于“杵-臼”技术、链交换工程化结构域体技术和静电转向。然而，如果要使双特异性抗体产量与单克隆抗体(mAb)的产量相当，则需要进一步改善那些技术。
通过并入电荷对突变(CPM)实现的静电转向现象是目前临床开发中许多双特异性抗体的优选的技术之一。通过在一条链上引入负电荷，并在另一条链上引入正电荷，吸引性静电力驱动异二聚化，而排斥力阻止同二聚体的形成。然而，这样的方法可能产生次优分子，并且可能需要与其他工程化技术组合。
本发明通过在异多聚体的CH3区内使工程化电荷重新分布来改善现有的电荷对技术。
发明内容
在一个方面，本发明涉及分离的异多聚体，其包含异二聚免疫球蛋白CH3结构域，该异二聚免疫球蛋白CH3结构域包含第一免疫球蛋白CH3结构域多肽和第二免疫球蛋白CH3结构域多肽，其中：
(i)该第一免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和K439D/E；并且
(ii)该第二免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D/E、K392D/E和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，(i)该第一免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和K439D；并且
(ii)该第二免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D、K392D/E和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，(i)该第一免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和K439D；并且
(ii)该第二免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D、K392D和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，该异多聚体包含异二聚Fc区，该异二聚Fc区包含第一免疫球蛋白Fc多肽和第二免疫球蛋白Fc多肽，其中该第一免疫球蛋白Fc多肽包含该第一CH3结构域多肽，并且该第二Fc多肽包含该第二CH3结构域多肽。
在某些实施例中，该异多聚体包含含有第一铰链结构域多肽和该第一Fc多肽的第一多肽；以及含有第二铰链结构域多肽和该第二Fc多肽的第二多肽。
在某些实施例中，该异多聚体是双特异性抗体构建体，该双特异性抗体构建体包含第一重链多肽和第一轻链多肽；以及第二重链多肽和第二轻链多肽，
其中该第一重链多肽包含第一VH结构域、第一CH1结构域多肽、第一铰链结构域多肽、和该第一Fc多肽；并且该第二重链多肽包含第二VH结构域、第二CH1结构域多肽、第二铰链结构域多肽、和该第二Fc多肽。
在某些实施例中，该第一抗体轻链和第二抗体轻链是相同的。
在某些实施例中，i)该第一重链多肽包含在位置183处的赖氨酸；
ii)该第一轻链多肽包含在位置176处的谷氨酸；
iii)该第二重链多肽包含在位置183处的谷氨酸；并且
iv)该第二轻链多肽包含在位置176处的赖氨酸；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，i)该第一重链多肽包含在位置183处的谷氨酸；
ii)该第一轻链多肽包含在位置176处的赖氨酸；
iii)该第二重链多肽包含在位置183处的赖氨酸；并且
iv)该第二轻链多肽包含在位置176处的谷氨酸；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，该第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽衍生自IgG1-、IgG2-、IgG3-或IgG4-免疫球蛋白CH3结构域多肽或者是IgG1-、IgG2-、IgG3-或IgG4-免疫球蛋白CH3结构域多肽的突变形式。
在某些实施例中，该第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽衍生自IgG1-或IgG2-免疫球蛋白CH3结构域多肽或者是IgG1-或IgG2-免疫球蛋白CH3结构域多肽的突变形式。
在一个方面，本发明涉及生成多特异性抗原结合蛋白的方法，该抗原结合蛋白包含与不同表位结合的至少两个结合结构域，该方法包括在哺乳动物宿主细胞中表达：
(i)包含以下氨基酸取代的第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽：D399K和K439D/E；以及
(ii)包含以下氨基酸取代的第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽：K409D/E、K392D/E和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引，
其中第一结合结构域与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N或C末端融合，并且第二结合结构域与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N或C末端融合，并且
其中这些结合结构域选自由以下组成的组：VH、scFab和scFv。
在某些实施例中，该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第一表位的抗体轻链。
在某些实施例中，该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第二表位的抗体轻链。
在某些实施例中，该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第一表位的抗体轻链；并且
该第二结合结构域与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该第二结合结构域选自由以下组成的组：scFab和scFv。
在某些实施例中，该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第二表位的抗体轻链；并且
该第一结合结构域与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该第一结合结构域选自由以下组成的组：scFab和scFv。
在某些实施例中，该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的scFab，并且该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的scFab。
在某些实施例中，这些结合结构域与它们各自的CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与这些CH1-铰链-CH2-CH3多肽中的一个或两个的C末端融合的第三结合结构域，其中该第三结合结构域是受体配体VH、scFab或scFv。
在一个方面，本发明涉及生成多特异性抗原结合蛋白的方法，该抗原结合蛋白包含与不同表位结合的至少两个结合结构域，该方法包括在哺乳动物宿主细胞中表达：
(i)包含以下氨基酸取代的第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽：D399K和K439D/E；以及
(ii)包含以下氨基酸取代的第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽：K409D/E、K392D/E和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引，
其中第一结合结构域与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N或C末端融合，并且第二结合结构域与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N或C末端融合，并且
其中这些结合结构域选自由以下组成的组：VH、scFab和scFv。
在某些实施例中，该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第一表位的抗体轻链。
在某些实施例中，其中该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第二表位的抗体轻链。
在某些实施例中，其中该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第一表位的第一抗体轻链；并且
该第二结合结构域与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该第二结合结构域选自由以下组成的组：scFab和scFv。
在某些实施例中，其中该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第二表位的第二抗体轻链；并且
该第一结合结构域与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该第一结合结构域选自由以下组成的组：scFab和scFv。
在某些实施例中，该第一抗体轻链和第二抗体轻链是相同的。
在某些实施例中，其中该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的scFab，并且该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的scFab。
在某些实施例中，其中这些结合结构域与它们各自的CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与这些CH1-铰链-CH2-CH3多肽中的一个或两个的C末端融合的第三结合结构域，其中该第三结合结构域是受体配体VH、scFab或scFv。
在某些实施例中，该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽和该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的表达在第一哺乳动物宿主细胞中进行，并且该表达相比于在与该第一哺乳动物宿主细胞同一类型的第二哺乳动物宿主细胞中以下多肽的表达：
(i)包含以下氨基酸取代的第三CH1-铰链-CH2-CH3多肽：D399K和E356K；以及
(ii)包含以下氨基酸取代的第四CH1-铰链-CH2-CH3多肽：K409D/E、K392D/E和K439D/E，导致如通过SEC测量的更低的1/2抗体物质杂质百分比。
在某些实施例中，(i)该第一免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和K439D；并且
(ii)该第二免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D、K392D/E和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，(i)该第一免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和K439D；并且
(ii)该第二免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D、K392D和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，(i)该第三免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和E356K；并且
(ii)该第四免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D、K392D和K439D；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽和该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的表达在第一哺乳动物宿主细胞中进行，并且该表达相比于在与该第一哺乳动物宿主细胞同一类型的第二哺乳动物宿主细胞中以下多肽的表达：
(i)包含以下氨基酸取代的第三CH1-铰链-CH2-CH3多肽：D399K和E356K；以及
(ii)包含以下氨基酸取代的第四CH1-铰链-CH2-CH3多肽：K409D/E、K392D/E和K439D/E，导致蛋白A纯化后如以mg/ml测量的更高的多特异性抗原结合蛋白产量。
在某些实施例中，(i)该第一免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和K439D；并且
(ii)该第二免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D、K392D/E和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，(i)该第一免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和K439D；并且
(ii)该第二免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D、K392D和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，(i)该第三免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和E356K；并且
(ii)该第四免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D、K392D和K439D；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
附图说明
图1描绘了异IgG分子中CPMv103的合理部署。
具体实施方式
如本文所用，术语“抗原结合蛋白”是指特异性地结合至一个或多个靶抗原的蛋白质。抗原结合蛋白可包括抗体及其功能片段。“功能性抗体片段”是抗体中不含全长重链和/或轻链中存在的氨基酸的至少一部分，但仍能够特异性地结合至抗原的部分。功能性抗体片段包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、Fd片段和互补决定区(CDR)片段，且可以衍生自任何哺乳动物来源，例如人、小鼠、大鼠、兔或骆驼。功能性抗体片段可以与完整抗体竞争结合靶抗原并且这些片段可以通过修饰完整抗体(例如酶或化学裂解)或使用重组DNA技术或肽合成从头合成产生。
抗原结合蛋白还可包括包含并入单一多肽链中或并入多个多肽链中的一个或多个功能性抗体片段的蛋白质。例如，抗原结合蛋白可以包括但不限于单链Fv(scFv)、双抗体(diabody)(参见，例如，EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],第90卷:6444-6448,1993)；内抗体；结构域抗体(单VL或VH结构域或者通过肽接头连接的两个或更多个VH结构域；参见Ward等人,Nature[自然],第341卷:544-546,1989)；大分子抗体(2个scFv与Fc区的融合物，参见Fredericks等人,Protein Engineering,Design&Selection[蛋白质工程化、设计和选择],第17卷：95-106,2004；和Powers等人,Journal of Immunological Methods[免疫法杂志],第251卷:123-135,2001)；三功能抗体；四功能抗体；微抗体(minibody)(scFv与CH3结构域的融合物；参见Olafsen等人,Protein Eng Des Sel.[蛋白质工程设计与选择],第17卷:315-23,2004)；肽抗体(一个或多个肽附接至Fc区，参见WO 00/24782)；线性抗体(一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区，参见Zapata等人,Protein Eng.[蛋白质工程改造],第8卷:1057-1062,1995)；小模块免疫药物(smallmodular immunopharmaceutical)(参见美国专利公开号20030133939)；和免疫球蛋白融合蛋白(例如IgG-scFv、IgG-Fab、2scFv-IgG、4scFv-IgG、VH-IgG、IgG-VH和Fab-scFv-Fc)。
“多特异性”是指抗原结合蛋白能够特异性结合两种或更多种不同的抗原。“双特异性”是指抗原结合蛋白能够特异性结合两种不同的抗原。如本文所用，当抗原结合蛋白在类似结合测定条件下对靶抗原的结合亲和力明显高于其对其他不相关蛋白质的亲和力且因此能够相区分时，该抗原结合蛋白“特异性结合至”该抗原。特异性结合抗原的抗原结合蛋白的平衡解离常数(KD)≤1x 10-6M。当KD≤1x 10-8M时，抗原结合蛋白以“高亲和力”特异性结合抗原。
使用多种技术确定亲和力，其中一个实例是亲和力ELISA测定。在各种实施例中，通过表面等离子共振测定(例如，基于的测定)确定亲和力。使用此方法，可以测量缔合速率常数(以M-1s-1表示的ka)和解离速率常数(以s-1表示的kd)。平衡解离常数(以M表示的KD)然后可以由动力学速率常数的比率(kd/ka)计算。在一些实施例中，通过动力学方法，例如Rathanaswami等人，Analytical Biochemistry[分析生物化学]，第373卷:52-60,2008中所描述的动力学排除测定(KinExA)确定亲和力。使用KinExA测定，可以测量平衡解离常数(以M表示的KD)和缔合速率常数(以M-1s-1表示的ka)。解离速率常数(以s-1表示的kd)可以由这些值计算(KD x ka)。在其他实施例中，通过平衡/溶液方法确定亲和力。在某些实施例中，通过FACS结合测定确定亲和力。
在一些实施例中，本文所述的双特异性抗原结合蛋白表现出期望的特性，例如通过kd(解离速率常数)测量的约10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10s-1或更低的结合亲合力(更低的值表示更高的结合亲合力)、和/或通过KD(平衡解离常数)测量的约10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15、10-16M或更低的结合亲和力(更低的值表示更高的结合亲和力)。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”可与“结合结构域”互换使用，是指抗原结合蛋白的区域，所述区域含有与抗原相互作用并赋予抗原结合蛋白对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基。
如本文所用，术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区(也称为“最小识别单元”或“高变区”)。有三个重链可变区CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变区CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。如本文所用，术语“CDR区”是指出现在单个可变区中的三个CDR的组(即三个轻链CDR或三个重链CDR)。两条链的每个中的CDR典型地通过框架区对齐以形成与靶蛋白上的特定表位或结构域特异性结合的结构。自N末端至C末端，天然存在的轻链和重链可变区典型地遵循这些元件的以下次序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。编号系统已经被设计为将编号指派给在这些结构域中的每一个中占据位置的氨基酸。此编号系统定义于以下文献中：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质序列](1987和1991,美国国家卫生研究院(NIH),马里兰州贝塞斯达)；或Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917；Chothia等人,1989,Nature[自然]342:878-883。给定抗体的互补决定区(CDR)和框架区(FR)可以使用此系统标识。
在本发明的双特异性抗原结合蛋白的一些实施例中，结合结构域包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链可变片段(scFv)或纳米抗体。在一个实施例中，两个结合结构域都是Fab片段。在另一个实施例中，一个结合结构域是Fab片段，而另一个结合结构域是scFv。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段有单抗原结合位点和含有免疫球蛋白恒定区的残余“Fc”片段。Fab片段包含所有可变结构域，以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，“Fab片段”由一条免疫球蛋白轻链(轻链可变区(VL)和恒定区(CL))以及一条免疫球蛋白重链的CH1区和可变区(VH)构成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。Fc片段展示碳水化合物，并负责许多抗体效应子功能(如结合补体和细胞受体)，该抗体效应子功能区分一类抗体和另一类抗体。“Fd片段”包含来自免疫球蛋白重链的VH和CH1结构域。Fd片段代表Fab片段的重链组分。
“Fab'片段”是在CH1结构域的C末端处具有一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸残基的Fab片段。
“F(ab')2片段”是包括两个Fab'片段的二价片段，该两个Fab'片段通过在铰链区的重链之间的二硫桥连接。
“Fv”片段是含有来自抗体的完整抗原识别和结合位点的最小片段。此片段由一个免疫球蛋白重链可变区(VH)和一个免疫球蛋白轻链可变区(VL)以紧密非共价缔合的二聚体组成。正是在这种构型中，每个可变区的三个CDR相互作用，以将抗原结合位点限定在VH-VL二聚体的表面上。单个轻链或重链可变区(或仅包含三个对抗原具有特异性的CDR的Fv片段的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于包含VH和VL二者的整个结合位点。
“单链可变抗体片段”或“scFv片段”包含抗体的VH和VL区，其中这些区存在于单个多肽链中，并且任选地包含VH和VL区之间的肽接头，该肽接头能够使Fv形成用于抗原结合的所需的结构(参见例如，Bird等人,Science[科学],第242卷:423-426,1988；和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],第85卷:5879-5883,1988)。
“纳米抗体”是重链抗体的重链可变区。这样的可变结构域是这样的重链抗体的最小的全功能抗原结合片段，分子量仅为15kDa。参见Cortez-Retamozo等人,CancerResearch[癌症研究]64:2853-57,2004。不含轻链的功能性重链抗体天然存在于某些动物物种(诸如护士鲨、沃贝贡鲨(wobbegong shark)和骆驼科诸如骆驼、单峰骆驼、羊驼和美洲驼)中。在这些动物中，抗原结合位点被减少为单个结构域，即VHH结构域。这些抗体仅使用重链可变区形成抗原结合区，即这些功能性抗体是仅具有结构H2L2的重链同二聚体(称为“重链抗体”或“HCAb”)。据报道，驼源化VHH与IgG2和IgG3恒定区重组，这些恒定区含有铰链、CH2和CH3结构域并且缺乏CH1结构域。已发现骆驼化VHH结构域以高亲和力与抗原结合(Desmyter等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],卷276:26285-90,2001)并在溶液中具有高稳定性(Ewert等人,Biochemistry[生物化学],第41卷:3628-36,2002)。用于产生具有驼源化重链的抗体的方法描述于例如美国专利公开号2005/0136049和2005/0037421中。可替代的支架可以由更紧密地匹配鲨鱼V-NAR支架的人可变样结构域制成，并且可以提供用于长穿透环结构的框架。
特别是本发明的双特异性抗原结合蛋白的实施例，结合结构域包含特异性结合所需抗原的抗体或抗体片段的免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)。
本文中可与“可变结构域”互换使用的“可变区”(轻链(VL)的可变区，重链(VH)的可变区)是指轻和重免疫球蛋白链中的每一个中直接参与抗体与抗原结合的区。如上所述，可变轻链和可变重链的区具有相同的一般结构，并且每个区包含四个框架(FR)区，这些框架区的序列是广泛保守的，由三个CDR连接。框架区呈β-折叠构形且CDR可以形成连接该β-折叠结构的环。各链中的CDR通过框架区保持其三维结构，且与来自另一链的CDR一起形成抗原结合位点。
与靶抗原特异性结合的结合结构域可以衍生自a)这些抗原的已知抗体，或者b)通过使用抗原蛋白或其片段的从头免疫方法，通过噬菌体展示或其他常规方法获得的新抗体或抗体片段。衍生出双特异性抗原结合蛋白的结合结构域的抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体或人源化抗体。在某些实施例中，衍生出结合结构域的抗体是单克隆抗体。在这些和其他实施例中，抗体是人抗体或人源化抗体，并且可以是IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。
如本文所用，术语“单克隆抗体”(或“mAb”)是指从基本上同源的抗体群获得的一种抗体，即，构成该群体的个别抗体除以微量存在的可能天然存在的突变外是相同的。相对于典型地包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体针对个别抗原位点或表位具有高度特异性。可使用本领域中已知的任何技术，例如通过在完成免疫程序之后使自转基因动物收集的脾细胞永生化来产生单克隆抗体。可以使用本领域中已知的任何技术，例如通过使脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤来使脾细胞永生化。用于产生杂交瘤的融合程序的骨髓瘤细胞优选地是非抗体产生的，具有高融合效率和酶缺陷使得它们不能在某些选择性培养基中生长，该培养基仅支持所需融合细胞(杂交瘤)的生长。适用于小鼠融合的细胞系的实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XXO Bul；用于大鼠融合的细胞系的实例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210。可用于细胞融合的其他细胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
在一些情况下，通过用靶抗原免疫动物(例如，具有人免疫球蛋白序列的转基因动物)来产生杂交瘤细胞系；自经免疫动物收集脾细胞；使收集的脾细胞与骨髓瘤细胞系融合，由此产生杂交瘤细胞；从杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞系，并鉴定产生结合靶抗原的抗体的杂交瘤细胞系。
由杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体可以使用本领域中已知的任何技术，例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石层析法、凝胶电泳、透析或亲和层析法纯化。可以进一步筛选杂交瘤或mAb以鉴定具有特定特性的mAb，这些特定特性是例如结合表达靶抗原的细胞的能力、阻断或干扰靶抗原配体与它们各自受体结合的能力、或功能性地阻断任一受体的能力，例如cAMP测定。
在一些实施例中，本发明的双特异性抗原结合蛋白的结合结构域可衍生自人源化抗体。“人源化抗体”是指其中区(例如框架区)已被修饰以包含来自人免疫球蛋白的对应区的抗体。通常，人源化抗体可以从最初在非人动物中产生的单克隆抗体产生。该单克隆抗体中的某些氨基酸残基，典型地来自抗体的非抗原识别部分的氨基酸残基经修饰成与相应同种型的人抗体中的相应残基同源。例如，可使用各种方法，通过将啮齿动物可变区的至少一部分取代为人抗体的相应区域来进行人源化(参见例如美国专利号5,585,089和5,693,762；Jones等人,Nature[自然],第321卷:522-525,1986；Riechmann等人,Nature[自然],第332卷:323-27,1988；Verhoeyen等人,Science[科学],第239卷:1534-1536,1988)。在另一物种中产生的抗体的轻链可变区和重链可变区的CDR可以嫁接到共有人FR上。为了产生共有人FR，可以比对来自几种人重链或轻链氨基酸序列的FR以鉴定共有氨基酸序列。
针对靶抗原产生的新抗体(从其衍生出本发明的双特异性抗原结合蛋白的结合结构域)可以是完全人抗体。“完全人抗体”是包含衍生自或指示人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。提供的用于产生完全人抗体的一种特定方式是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入内源性Ig基因失活的小鼠中是在小鼠中产生完全人单克隆抗体(mAb)的一种方式，小鼠是可以免疫接种任何所需抗原的动物。使用完全人抗体可以使免疫原性和过敏性应答减到最少，这些应答有时是由向人施用小鼠或小鼠源性mAb作为治疗剂而引起。
可以通过对在不产生内源性免疫球蛋白情况下，免疫接种能够产生人抗体谱系的转基因动物(通常为小鼠)来产生完全人抗体。用于此目的的抗原典型地具有六个或更多个连续氨基酸，且任选地与运载体，例如半抗原结合。参见例如，Jakobovits等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:2551-2555；Jakobovits等人,1993,Nature[自然]362:255-258；和Bruggermann等人,1993,Year in Immunol.[免疫学年评]7:33。在这样的方法的一个实例中，通过使编码小鼠重链和轻链免疫球蛋白链的内源小鼠免疫球蛋白基因座失去能力，并将含有编码人重链和轻链蛋白质的含人基因组DNA的基因座的较大片段插入小鼠基因组中来产生转基因动物。然后对具有少于人免疫球蛋白基因座完全补体的部分修饰的动物进行杂交繁育，以获得具有全部所需免疫系统修饰的动物。当施用免疫原时，这些转基因动物产生对该免疫原具有免疫特异性，同时具有人而非鼠类氨基酸序列，包括可变区的抗体。关于这样的方法的进一步详情，参见例如WO 96/33735及WO94/02602。有关用于制备人抗体的转基因小鼠的其他方法描述于美国专利号5,545,807、6,713,610、6,673,986、6,162,963、5,939,598、5,545,807、6,300,129、6,255,458、5,877,397、5,874,299和5,545,806；以及PCT公开WO 91/10741、WO 90/04036、WO 94/02602、WO96/30498、WO 98/24893；以及EP 546073B1和EP 546073A1中。
以上所述的转基因小鼠在本文中称为“HuMab”小鼠，含有编码未重排人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列以及使内源μ和κ链基因座失活的靶突变的人免疫球蛋白基因微型基因座(Lonberg等人，1994,Nature[自然]368:856-859)。因此，这些小鼠展现了小鼠IgM或κ表达以及对免疫的应答降低，且使引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg等人,同上；Lonberg和Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.[国际免疫学评论]13:65-93；Harding和Lonberg,1995,Ann.N.YAcad.Sci.[纽约科学院年报]764:536-546)。HuMab小鼠的制备详细描述于以下中：Taylor等人，1992,Nucleic Acids Research[核酸研究]20:6287-6295；Chen等人,1993,International Immunology[国际免疫学]5:647-656；Tuaillon等人,1994,J.Immunol.[免疫学杂志]152:2912-2920；Lonberg等人,1994,Nature[自然]368:856-859；Lonberg,1994,Handbook of Exp.Pharmacology[实验药理学手册]113:49-101；Taylor等人,1994,International Immunology[国际免疫学]6:579-591；Lonberg和Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.[国际免疫学评论]13:65-93；Harding和Lonberg,1995,Ann.N.YAcad.Sci.[纽约科学院年报]764:536-546；Fishwild等人，1996,Nature Biotechnology[自然生物技术]14:845-851；上述参考文献出于所有目的而通过援引以其全文特此并入。另参见美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299、和5,770,429；以及美国专利号5,545,807；国际公开号WO 93/1227、WO 92/22646；和WO 92/03918，所有参考文献的披露内容均出于所有目的而通过援引以其全文特此并入。用于在这些转基因小鼠中产生人抗体的技术还披露于WO 98/24893和Mendez等人，1997,Nature Genetics[自然遗传学]15:146-156中，其通过援引特此并入。
人源性抗体还可使用噬菌体展示技术产生。噬菌体展示描述于例如Dower等人，WO91/17271；McCafferty等人，WO 92/01047；以及Caton和Koprowski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],87:6450-6454(1990)中，其各自通过援引以其全文并入本文。通过噬菌体技术产生的抗体通常在细菌中是以抗原结合片段，例如Fv或Fab片段形式产生，且因此缺乏效应子功能。效应子功能可以通过以下两种策略之一引入：必要时，可以将这些片段工程化为完整抗体以在哺乳动物细胞中表达，或工程化为具有能够触发效应子功能的第二结合位点的双特异性抗体片段。典型地，利用PCR分开克隆抗体的Fd片段(VH-CH1)和轻链(VL-CL)并在组合噬菌体展示文库中随机重组，然后可以针对与特定抗原的结合进行选择。在噬菌体表面上表达这些抗体片段，并利用抗原结合，经几轮抗原结合和再扩增来选择Fv或Fab(且因此选择含有编码该抗体片段的DNA的噬菌体)，此程序称为淘选(panning)。富集且最终分离对于抗原具有特异性的抗体片段。噬菌体展示技术还可用于使啮齿动物单克隆抗体人源化的方法中，称为“导向选择”(参见Jespers,L.S.,等人，Bio/Technology[生物/技术]12,899-903(1994))。为此，可以将小鼠单克隆抗体的Fd片段与人轻链文库组合展示，且然后可以用抗原选出由此获得的杂交Fab文库。小鼠Fd片段由此提供导向选择的模板。随后，将所选人轻链与人Fd片段文库组合。所得文库的选择获得完全人Fab。
在某些实施例中，本发明的双特异性抗原结合蛋白是抗体。如本文所用，术语“抗体”是指包含两个轻链多肽(各自约25kDa)和两个重链多肽(各自约50-70kDa)的四聚免疫球蛋白。术语“轻链”或“免疫球蛋白轻链”是指自氨基末端至羧基末端包含单一免疫球蛋白轻链可变区(VL)和单一免疫球蛋白轻链恒定结构域(CL)的多肽。免疫球蛋白轻链恒定结构域(CL)可以是kappa(κ)或lambda(λ)。术语“重链”或“免疫球蛋白重链”是指从氨基末端至羧基末端包含单个免疫球蛋白重链可变区(VH)、免疫球蛋白重链恒定结构域1(CH1)、免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白重链恒定结构域2(CH2)、免疫球蛋白重链恒定结构域3(CH3)和任选地免疫球蛋白重链恒定结构域4(CH4)的多肽。重链分类为mu(μ)、delta(Δ)、gamma(γ)、alpha(α)和epsilon(ε)链，并且其分别将抗体同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG类别和IgA类别的抗体进一步细分为数个亚类，即分别为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2。IgG、IgA和IgD抗体中的重链具有三个结构域(CH1、CH2和CH3)，而IgM和IgE抗体中的重链具有四个结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。免疫球蛋白重链恒定结构域可以来自任何免疫球蛋白同种型，包括亚型。抗体链是经由在CL结构域与CH1结构域之间(即，在轻链与重链之间)和在抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。
在特定实施例中，本发明的双特异性抗原结合蛋白是异二聚抗体(在本文可与“异免疫球蛋白”或“异Ig”互换使用)，其指的是包含两条不同的轻链和两条不同的重链的抗体。然而，在某些实施例中，可以使用“共同的轻链”。“共同的轻链”是指在双特异性或多特异性分子内与多于一条重链或其片段配对以形成至少第一抗原结合位点和第二抗原结合位点(例如Fab，每个结合位点对不同的抗原具有特异性)的轻链。在这样的实施例中，两条轻链相同，而重链则不同。即使两条轻链相同，异Ig的两个fab部分也与不同的表位结合。
异二聚抗体可包含任何免疫球蛋白恒定区。如本文所用，术语“恒定区”是指抗体中除可变区外的所有结构域。恒定区不直接参与抗原的结合，但展现各种效应子功能。如以上所述，抗体取决于其重链恒定区的氨基酸序列而分为特定同种型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)和亚型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。轻链恒定区可以为例如见于全部五个抗体同种型中的κ型或λ型轻链恒定区，例如人κ型或λ型轻链恒定区。
异二聚抗体的重链恒定区可以为例如α、Δ、ε、γ或μ型重链恒定区，例如人α、Δ、ε、γ或μ型重链恒定区。在一些实施例中，异二聚抗体包含来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的重链恒定区。在一个实施例中，异二聚抗体包含来自人IgG1免疫球蛋白的重链恒定区。在另一个实施例中，异二聚抗体包含来自人IgG2免疫球蛋白的重链恒定区。
为了促进特定重链与其同源轻链的缔合，重链和轻链都可以包含互补性氨基酸取代。如本文所用，“互补性氨基酸取代”是指一条链中带正电的氨基酸的取代与另一条链中带负电的氨基酸的取代配对。例如，在一些实施例中，重链包含至少一个氨基酸取代以引入带电氨基酸，并且相应的轻链包含至少一个氨基酸取代以引入带电氨基酸，其中引入重链的带电氨基酸具有与引入轻链的氨基酸相反的电荷。在某些实施例中，可以将一个或多个带正电的残基(例如赖氨酸、组氨酸或精氨酸)引入第一轻链(LC1)并且可以将一个或多个带负电的残基(例如天冬氨酸或谷氨酸)引入LC1/HC1结合界面处的相伴重链(HC1)，而可以将一个或多个带负电的残基(例如，天冬氨酸或谷氨酸)引入第二轻链(LC2)中，并且可以将一个或多个带正电的残基(例如，赖氨酸、组氨酸或精氨酸)引入LC2/HC2结合界面处的相伴重链(HC2)中。当界面处相反的带电残基(极性)吸引时，静电相互作用将引导LC1与HC1成对，LC2与HC2成对。在界面处具有相同带电残基(极性)的重/轻链对(例如LC1/HC2和LC2/HC1)将排斥，导致抑制不需要的HC/LC配对。
在这些和其他实施例中，重链的CH1结构域或轻链的CL结构域包含与野生型IgG氨基酸序列不同的氨基酸序列，使得野生型IgG氨基酸序列中的一个或多个带正电的氨基酸被一个或多个带负电的氨基酸替换。可替代地，重链的CH1结构域或轻链的CL结构域包含与野生型IgG氨基酸序列不同的氨基酸序列，使得野生型IgG氨基酸序列中的一个或多个带负电的氨基酸被一个或多个带正电的氨基酸替换。在一些实施例中，异二聚抗体中的第一和/或第二重链的CH1结构域中在选自F126、P127、L128、A141、L145、K147、D148、H168、F170、P171、V173、Q175、S176、S183、V185和K213的EU位置处的一个或多个氨基酸被带电氨基酸替换。在某些实施例中，用带负电或正电的氨基酸取代的优选残基是S183(EU编号系统)。在一些实施例中，S183被带正电的氨基酸取代。在可替代的实施例中，S183被带负电的氨基酸取代。例如，在一个实施例中，S183在第一重链中被带负电的氨基酸取代(例如S183E)，并且S183在第二重链中被带正电的氨基酸取代(例如S183K)。
在轻链为κ轻链的实施例中，异二聚抗体中的第一和/或第二轻链的CL结构域中在选自F116、F118、S121、D122、E123、Q124、S131、V133、L135、N137、N138、Q160、S162、T164、S174和S176的位置(在κ轻链中以EU和Kabat编号)处的一个或多个氨基酸被带电氨基酸替换。在轻链为λ轻链的实施例中，异二聚抗体中的第一和/或第二轻链的CL结构域中在选自T116、F118、S121、E123、E124、K129、T131、V133、L135、S137、E160、T162、S165、Q167、A174、S176和Y178的位置(在λ链中以Kabat编号)处的一个或多个氨基酸被带电氨基酸替换。在一些实施例中，用带负电或正电的氨基酸取代的优选残基是κ或λ轻链的CL结构域的S176(EU和Kabat编号系统)。在某些实施例中，CL结构域的S176被带正电的氨基酸替换。在可替代的实施例中，CL结构域的S176被带负电的氨基酸替换。在一个实施例中，S176在第一轻链中被带正电的氨基酸取代(例如S176K)，并且S176在第二轻链中被带负电的氨基酸取代(例如S176E)。
除了CH1和CL结构域中的互补性氨基酸取代或作为其替代，异二聚抗体中轻链和重链的可变区可包含一个或多个互补性氨基酸取代以引入带电氨基酸。例如，在一些实施例中，异二聚抗体的重链的VH区或轻链的VL区包含与野生型IgG氨基酸序列不同的氨基酸序列，使得野生型IgG氨基酸序列中的一个或多个带正电的氨基酸被一个或多个带负电的氨基酸替换。可替代地，重链的VH区或轻链的VL区包含与野生型IgG氨基酸序列不同的氨基酸序列，使得野生型IgG氨基酸序列中的一个或多个带负电的氨基酸被一个或多个带正电的氨基酸替换。
VH区内的V区界面残基(即，介导VH和VL区组装的氨基酸残基)包括Kabat位置1、3、35、37、39、43、44、45、46、47、50、59、89、91和93。VH区中的这些界面残基中的一个或多个可以被带电(带正电或负电)氨基酸取代。在某些实施例中，第一和/或第二重链的VH区中Kabat位置39处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如赖氨酸)取代。在可替代的实施例中，第一和/或第二重链的VH区中Kabat位置39处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如谷氨酸)取代。在一些实施例中，第一重链的VH区中的Kabat位置39处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如G39E)取代，并且第二重链的VH区中的Kabat位置39处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如G39K)取代。在一些实施例中，第一和/或第二重链的VH区中Kabat位置44处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如赖氨酸)取代。在可替代的实施例中，第一和/或第二重链的VH区中Kabat位置44处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如谷氨酸)取代。在某些实施例中，第一重链的VH区中的Kabat位置44处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如G44E)取代，并且第二重链的VH区中的Kabat位置44处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如G44K)取代。
VL区内的V区界面残基(即，介导VH和VL区组装的氨基酸残基)包括Kabat位置32、34、35、36、38、41、42、43、44、45、46、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、85、87、89、90、91和100。VL区中的一个或多个界面残基可以用带电氨基酸(优选与引入同源重链的VH区中的那些具有相反电荷的氨基酸)取代。在一些实施例中，第一和/或第二轻链的VL区中Kabat位置100处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如赖氨酸)取代。在可替代的实施例中，第一和/或第二轻链的VL区中Kabat位置100处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如谷氨酸)取代。在某些实施例中，第一轻链的VL区中的Kabat位置100处的氨基酸被带正电的氨基酸(例如G100K)取代，并且第二轻链的VL区中的Kabat位置100处的氨基酸被带负电的氨基酸(例如G100E)取代。
在某些实施例中，本发明的异二聚抗体包含第一重链和第二重链以及第一轻链和第二轻链，其中该第一重链在位置44(Kabat)、183(EU)、392(EU)、409(EU)和356(EU)处包含氨基酸取代，其中该第二重链在位置44(Kabat)、183(EU)、439(EU)和399(EU)处包含氨基酸取代，其中该第一轻链和第二轻链在位置100(Kabat)和176(EU)处包含氨基酸取代，并且其中该氨基酸取代在所述位置处引入带电氨基酸。在相关的实施例中，第一重链的位置44(Kabat)处的甘氨酸被谷氨酸替换，第二重链的位置44(Kabat)处的甘氨酸被赖氨酸替换，第一轻链的位置100(Kabat)处的甘氨酸被赖氨酸替换，第二轻链的位置100(Kabat)处的甘氨酸被谷氨酸替换，第一轻链的位置176(EU)处的丝氨酸被赖氨酸替换，第二轻链的位置176(EU)处的丝氨酸被谷氨酸替换，第一重链的位置183(EU)处的丝氨酸被谷氨酸替换，第一重链的位置392(EU)处的赖氨酸被天冬氨酸替换，第一重链的位置409(EU)处的赖氨酸被天冬氨酸替换，第一重链的位置356(EU)处的谷氨酸被赖氨酸替换，第二重链的位置183(EU)处的丝氨酸被赖氨酸替换，第二重链的位置439(EU)处的赖氨酸被天冬氨酸替换，并且第二重链的位置399(EU)处的天冬氨酸被赖氨酸替换。
在某些实施例中，本发明的异二聚抗体包含第一重链和第二重链以及第一轻链和第二轻链，其中该第一重链在位置183(EU)、392(EU)、409(EU)和356(EU)处包含氨基酸取代，其中该第二重链在位置183(EU)、439(EU)和399(EU)处包含氨基酸取代，其中该第一轻链和第二轻链在位置176(EU)处包含氨基酸取代，并且其中该氨基酸取代在所述位置处引入带电氨基酸。在相关的实施例中，第一轻链的位置176(EU)处的丝氨酸被赖氨酸替换，第二轻链的位置176(EU)处的丝氨酸被谷氨酸替换，第一重链的位置183(EU)处的丝氨酸被谷氨酸替换，第一重链的位置392(EU)处的赖氨酸被天冬氨酸替换，第一重链的位置409(EU)处的赖氨酸被天冬氨酸替换，第一重链的位置356(EU)处的谷氨酸被赖氨酸替换，第二重链的位置183(EU)处的丝氨酸被赖氨酸替换，第二重链的位置439(EU)处的赖氨酸被天冬氨酸替换，以及第二重链的位置399(EU)处的天冬氨酸被赖氨酸替换。
在相关的实施例中，第一轻链的位置176(EU)处的丝氨酸被谷氨酸替换，第二轻链的位置176(EU)处的丝氨酸被赖氨酸替换，第一重链的位置183(EU)处的丝氨酸被赖氨酸替换，第一重链的位置392(EU)处的赖氨酸被天冬氨酸替换，第一重链的位置409(EU)处的赖氨酸被天冬氨酸替换，第一重链的位置356(EU)处的谷氨酸被赖氨酸替换，第二重链的位置183(EU)处的丝氨酸被谷氨酸替换，第二重链的位置439(EU)处的赖氨酸被天冬氨酸替换，以及第二重链的位置399(EU)处的天冬氨酸被赖氨酸替换。
在一个方面，本发明涉及分离的异多聚体，其包含异二聚免疫球蛋白CH3结构域，该异二聚免疫球蛋白CH3结构域包含第一免疫球蛋白CH3结构域多肽和第二免疫球蛋白CH3结构域多肽，其中：
(i)该第一免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和K439D/E；并且
(ii)该第二免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D/E、K392D/E和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，该异多聚体包含异二聚Fc区，该异二聚Fc区包含第一免疫球蛋白Fc多肽和第二免疫球蛋白Fc多肽，其中该第一免疫球蛋白Fc多肽包含该第一CH3结构域多肽，并且该第二Fc多肽包含该第二CH3结构域多肽。
在某些实施例中，该异多聚体包含含有第一铰链结构域多肽和该第一Fc多肽的第一多肽；以及含有第二铰链结构域多肽和该第二Fc多肽的第二多肽。
在某些实施例中，该异多聚体是双特异性抗体构建体，该双特异性抗体构建体包含第一重链多肽和第一轻链多肽；以及第二重链多肽和第二轻链多肽，
其中该第一重链多肽包含第一VH结构域、第一CH1结构域多肽、第一铰链结构域多肽、和该第一Fc多肽；并且该第二重链多肽包含第二VH结构域、第二CH1结构域多肽、第二铰链结构域多肽、和该第二Fc多肽。
在某些实施例中，i)该第一重链多肽包含在位置183处的赖氨酸；
ii)该第一轻链多肽包含在位置176处的谷氨酸；
iii)该第二重链多肽包含在位置183处的谷氨酸；并且
iv)该第二轻链多肽包含在位置176处的赖氨酸；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，i)该第一重链多肽包含在位置183处的谷氨酸；
ii)该第一轻链多肽包含在位置176处的赖氨酸；
iii)该第二重链多肽包含在位置183处的赖氨酸；并且
iv)该第二轻链多肽包含在位置176处的谷氨酸；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，该第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽衍生自IgG1-、IgG2-、IgG3-或IgG4-免疫球蛋白CH3结构域多肽或者是IgG1-、IgG2-、IgG3-或IgG4-免疫球蛋白CH3结构域多肽的突变形式。
在某些实施例中，该第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽衍生自IgG1-或IgG2-免疫球蛋白CH3结构域多肽或者是IgG1-或IgG2-免疫球蛋白CH3结构域多肽的突变形式。
在一个方面，本发明涉及生成多特异性抗原结合蛋白的方法，该抗原结合蛋白包含与不同表位结合的至少两个结合结构域，该方法包括在哺乳动物宿主细胞中表达：
(i)包含以下氨基酸取代的第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽：D399K和K439D/E；以及
(ii)包含以下氨基酸取代的第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽：K409D/E、K392D/E和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引，
其中第一结合结构域与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N或C末端融合，并且第二结合结构域与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N或C末端融合，并且
其中这些结合结构域选自由以下组成的组：VH、scFab和scFv。
在某些实施例中，该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第一表位的抗体轻链。
在某些实施例中，该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第二表位的抗体轻链。
在某些实施例中，该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第一表位的抗体轻链；并且
该第二结合结构域与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该第二结合结构域选自由以下组成的组：scFab和scFv。
在某些实施例中，该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第二表位的抗体轻链；并且
该第一结合结构域与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该第一结合结构域选自由以下组成的组：scFab和scFv。
在某些实施例中，该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的scFab，并且该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的scFab。
在某些实施例中，这些结合结构域与它们各自的CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与这些CH1-铰链-CH2-CH3多肽中的一个或两个的C末端融合的第三结合结构域，其中该第三结合结构域是受体配体VH、scFab或scFv。
在一个方面，本发明涉及生成多特异性抗原结合蛋白的方法，该抗原结合蛋白包含与不同表位结合的至少两个结合结构域，该方法包括在哺乳动物宿主细胞中表达：
(i)包含以下氨基酸取代的第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽：D399K和K439D/E；以及
(ii)包含以下氨基酸取代的第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽：K409D/E、K392D/E和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引，
其中第一结合结构域与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N或C末端融合，并且第二结合结构域与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N或C末端融合，并且
其中这些结合结构域选自由以下组成的组：VH、scFab和scFv。
在某些实施例中，该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第一表位的抗体轻链。
在某些实施例中，其中该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第二表位的抗体轻链。
在某些实施例中，其中该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第一表位的抗体轻链；并且
该第二结合结构域与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该第二结合结构域选自由以下组成的组：scFab和scFv。
在某些实施例中，其中该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第二表位的抗体轻链；并且
该第一结合结构域与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该第一结合结构域选自由以下组成的组：scFab和scFv。
在某些实施例中，其中该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的scFab，并且该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的scFab。
在某些实施例中，其中这些结合结构域与它们各自的CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与这些CH1-铰链-CH2-CH3多肽中的一个或两个的C末端融合的第三结合结构域，其中该第三结合结构域是受体配体VH、scFab或scFv。
如本文所用，术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C末端区域，其可通过木瓜蛋白酶消化完整抗体产生。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，即CH2结构域和CH3结构域，且任选地包含CH4结构域。在某些实施例中，Fc区是来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的Fc区。在一些实施例中，Fc区包含来自人IgG1或人IgG2免疫球蛋白的CH2和CH3结构域。Fc区可以保持效应子功能，例如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和吞噬作用。在其他实施例中，Fc区可以修饰成降低或消除效应子功能，如本文更详细地描述。
在本发明的抗原结合蛋白的一些实施例中，位于Fc区的羧基末端的结合结构域(即羧基末端结合结构域)是scFv。在某些实施例中，scFv包含通过肽接头连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。可变区可以在scFv内以VH-VL或VL-VH取向定向。例如，在一个实施例中，scFv从N末端到C末端包含VH区、肽接头和VL区。在另一个实施例中，scFv从N末端到C末端包含VL区、肽接头和VH区。scFv的VH和VL区可以包含一个或多个半胱氨酸取代，以允许在VH和VL区之间形成二硫键。这样的半胱氨酸夹钳稳定了抗原结合构型中的两个可变结构域。在一个实施例中，VH区中的位置44(Kabat编号)和VL区中的位置100(Kabat编号)各被半胱氨酸残基取代。
在某些实施例中，scFv在其氨基末端通过肽接头融合或以其他方式连接到Fc区的羧基末端(例如CH3结构域的羧基末端)。因此，在一个实施例中，scFv与Fc区融合，使得所得融合蛋白从N末端到C末端包含CH2结构域、CH3结构域、第一肽接头、VH区、第二肽接头和VL区。在另一个实施例中，scFv与Fc区融合，使得所得融合蛋白从N末端到C末端包含CH2结构域、CH3结构域、第一肽接头、VL区、第二肽接头和VH区。“融合蛋白”是包括衍生自一种以上亲本蛋白或多肽的多肽组分的蛋白。典型地，融合蛋白从融合基因表达，其中编码来自一种蛋白的多肽序列的核苷酸序列与编码多肽序列的核苷酸序列附在可读框内，并且任选地通过接头与编码来自不同蛋白的多肽序列的核苷酸序列分开。然后可以通过重组宿主细胞表达融合基因以产生单融合蛋白。
“肽接头”是指将一个多肽共价连接到另一个多肽的约2至约50个氨基酸的寡肽。肽接头可用于连接scFv内的VH和VL结构域。肽接头还可用于将scFv、Fab片段或其他功能性抗体片段连接到Fc区的氨基末端或羧基末端，以产生本文所述的双特异性抗原结合蛋白。优选地，肽接头的长度为至少5个氨基酸。在某些实施例中，肽接头的长度为约5个氨基酸至长度为约40个氨基酸。在其他实施例中，肽接头的长度为约8个氨基酸至长度为约30个氨基酸。在仍其他实施例中，肽接头的长度为约10个氨基酸至长度为约20个氨基酸。
优选地，但不是必须地，肽接头包含来自二十个标准氨基酸中的氨基酸，特别是半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和/或丝氨酸。在某些实施例中，肽接头由空间上无阻碍的大多数氨基酸(例如甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸)构成。因此，在一些实施例中优选的接头包括聚甘氨酸、聚丝氨酸和聚丙氨酸，或这些中任何的组合。一些示例性肽接头包括但不限于：聚(Gly)2-8(SEQ ID NO:22-28)，特别是(Gly)3(SEQ ID NO:23)、(Gly)4(SEQ ID NO:24)、(Gly)5(SEQ ID NO:25)和(Gly)7(SEQ ID NO:27)，以及聚(Gly)4Ser(SEQID NO:29)、聚(Gly-Ala)2-4(SEQ ID NO:30-32)和聚(Ala)2-8(SEQ ID NO:33-39)。在某些实施例中，肽接头是(GlyxSer)n，其中x＝3或4且n＝2、3、4、5或6(SEQ ID NO:41-50)。这样的肽接头包括“L5”(GGGGS；或“G4S”；SEQ ID NO:40)、“L9”(GGGSGGGGS；或“G3SG4S”；SEQ ID NO:51)、“L10”(GGGGSGGGGS；或“(G4S)2”；SEQ ID NO:46)、“L15”(GGGGSGGGGSGGGGS；或“(G4S)3”；SEQ ID NO:47)、和“L25”(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；或“(G4S)5”；SEQ ID NO:49)。在一些实施例中，连接scFv内的VH和VL区的肽接头是L15或(G4S)3接头(SEQ ID NO:47)。在这些和其他实施例中，将羧基末端结合结构域(例如scFv或Fab)连接到Fc区的C末端的肽接头是L9或G3SG4S接头(SEQ ID NO:51)或L10(G4S)2接头(SEQ ID NO:46)。
可以在本发明的双特异性抗原结合蛋白中使用的肽接头的其他特定实例包括(Gly)5Lys(SEQ ID NO:1)；(Gly)5LysArg(SEQ ID NO:2)；(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO:3)；(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO:4)；(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO:5)；GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO:6)；GGEGGG(SEQ ID NO:7)；GGEEEGGG(SEQ ID NO:8)；GEEEG(SEQ ID NO:9)；GEEE(SEQ ID NO:10)；GGDGGG(SEQ ID NO:11)；GGDDDGG(SEQ ID NO:12)；GDDDG(SEQ ID NO:13)；GDDD(SEQ ID NO:14)；GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS(SEQ ID NO:15)；WEWEW(SEQ ID NO:16)；FEFEF(SEQ ID NO:17)；EEEWWW(SEQ ID NO:18)；EEEFFF(SEQ IDNO:19)；WWEEEWW(SEQ ID NO:20)；和FFEEEFF(SEQ ID NO:21)。
本文所述的双特异性抗原结合蛋白的重链恒定区或Fc区可包含影响抗原结合蛋白的糖基化和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。免疫球蛋白Fc区的功能之一是当免疫球蛋白结合其靶标时与免疫系统通信。这通常称为“效应子功能”。通信导致抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。ADCC和ADCP是经由Fc区结合至免疫系统细胞表面上的Fc受体介导。CDC是经由Fc与补体系统，例如C1q的蛋白质结合所介导。在一些实施例中，本发明的双特异性抗原结合蛋白在恒定区中包含增强该抗原结合蛋白的效应子功能(包括ADCC活性、CDC活性、ADCP活性和/或清除率或半衰期)的一个或多个氨基酸取代。可以增强效应子功能的示例性氨基酸取代(EU编号)包括但不限于，E233L、L234I、L234Y、L235S、G236A、S239D、F243L、F243V、P247I、D280H、K290S、K290E、K290N、K290Y、R292P、E294L、Y296W、S298A、S298D、S298V、S298G、S298T、T299A、Y300L、V305I、Q311M、K326A、K326E、K326W、A330S、A330L、A330M、A330F、I332E、D333A、E333S、E333A、K334A、K334V、A339D、A339Q、P396L或前述中任何的组合。
在其他实施例中，本发明的双特异性抗原结合蛋白在恒定区中包含降低效应子功能的一个或多个氨基酸取代。可以降低效应子功能的示例性氨基酸取代(EU编号)包括但不限于，C220S、C226S、C229S、E233P、L234A、L234V、V234A、L234F、L235A、L235E、G237A、P238S、S267E、H268Q、N297A、N297G、V309L、E318A、L328F、A330S、A331S、P331S或前述中任何的组合。
糖基化可以促进抗体，特别是IgG1抗体的效应子功能。因此，在一些实施例中，本发明的双特异性抗原结合蛋白可包含影响结合蛋白糖基化的水平或类型的一个或多个氨基酸取代。多肽的糖基化典型地是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸)是将碳水化合物部分酶促附接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中这些三肽序列中的任一个的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种附接至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
在某些实施例中，通过向例如本文所述的双特异性抗原结合蛋白的Fc区中添加一个或多个糖基化位点来增加该结合蛋白的糖基化。在抗原结合蛋白中添加糖基化位点通常可以通过改变氨基酸序列，以使其含有上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)中的一个或多个来实现。还可以通过向起始序列(对于O-连接的糖基化位点)添加或取代为一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来作出改变。为便利起见，可以通过在DNA层面上的变化，特别是通过使编码靶多肽的DNA在预先选择的碱基处突变，由此产生会翻译成所需氨基酸的密码子，来改变抗原结合蛋白的氨基酸序列。
本发明还涵盖产生具有改变的碳水化合物结构而引起效应子活性改变的双特异性抗原结合蛋白分子，包括岩藻糖基化不存在或减少的展现改善的ADCC活性的抗原结合蛋白。本领域中已知各种减少或消除岩藻糖基化的方法。例如，通过使抗体分子与FcγRIII受体结合来介导ADCC效应子活性，经显示此取决于在CH2结构域N297残基处N-连接的糖基化的碳水化合物结构。相较于天然、岩藻糖基化抗体，非岩藻糖基化抗体以增加的亲和力结合此受体且更有效地触发FcγRIII介导的效应子功能。例如，在α-1,6-岩藻糖基转移酶已敲除的CHO细胞中重组产生非岩藻糖基化抗体使抗体具有100倍增加的ADCC活性(参见Yamane-Ohnuki等人,Biotechnol Bioeng.[生物技术及生物工程]87(5):614-22,2004)。通过降低α-1,6-岩藻糖基转移酶或岩藻糖基化路径中的其他酶的活性，例如通过siRNA或反义RNA处理，将细胞系工程化以敲除一种或多种酶，或与选择性糖基化抑制剂一起培养可以实现类似作用(参见Rothman等人，Mol Immunol.[分子免疫学]26(12):1113-23,1989)。一些宿主细胞系，例如Lec13或大鼠杂交瘤YB2/0细胞系天然地产生岩藻糖基化程度较低的抗体(参见Shields等人,J Biol Chem.[生物化学杂志]277(30):26733-40,2002以及Shinkawa等人,J Biol Chem.[生物化学杂志]278(5):3466-73,2003)。还已确定例如经由在过度表达GnTIII酶的细胞中重组产生抗体以增加等分碳水化合物的含量，可增加ADCC活性(参见Umana等人,Nat Biotechnol.[自然生物技术]17(2):176-80,1999)。
在其他实施例中，通过例如自本文所述的双特异性抗原结合蛋白的Fc区移除一个或多个糖基化位点来减少或消除该结合蛋白的糖基化。消除或改变N-连接的糖基化位点的氨基酸取代可以减少或消除抗原结合蛋白的N-连接的糖基化。在某些实施例中，本文所述的双特异性抗原结合蛋白包含在位置N297(EU编号)处的突变，例如N297Q、N297A或N297G。在一个特定实施例中，本发明的双特异性抗原结合蛋白包含来自人IgG1抗体的具有N297G突变的Fc区。为了改善含N297突变的分子的稳定性，可以对分子的Fc区进行进一步工程化。例如，在一些实施例中，Fc区中的一个或多个氨基酸经半胱氨酸取代以促进二聚体状态下二硫键的形成。对应于IgG1 Fc区的V259、A287、R292、V302、L306、V323或I332(EU编号)的残基因此可以经半胱氨酸取代。优选地，特定残基对经半胱氨酸取代以使其优先彼此形成二硫键，由此限制或防止二硫键混乱。优选的对包括但不限于，A287C与L306C、V259C与L306C、R292C与V302C，以及V323C与I332C。在特定实施例中，本文所述的双特异性抗原结合蛋白包含来自人IgG1抗体的具有R292C和V302C突变的Fc区。在这样的实施例中，Fc区还可包含N297G突变。
还可能希望对本发明的双特异性抗原结合蛋白进行修饰以增加血清半衰期，例如通过并入或添加补救受体结合表位(例如通过使适当区域突变或通过将该表位并入肽标签中，接着使其与抗原结合蛋白在任一端或在中间融合，例如通过DNA或肽合成；参见例如WO96/32478)或添加例如PEG或其他水溶性聚合物的分子，包括多糖聚合物。补救受体结合表位优选构成这样一种区域，其中来自Fc区中一个或两个环的任一个或多个氨基酸残基转移至抗原结合蛋白中的类似位置。甚至更优选地，来自Fc区中一个或两个环的三个或更多个氨基酸残基经转移。又更优选地，自Fc区(例如IgG Fc区)的CH2结构域取得表位并将其转移至抗原结合蛋白的CH1、CH3或VH区，或超过一个这样的区域。可替代地，自Fc区的CH2结构域取得表位并将其转移至抗原结合蛋白的CL区或VL区，或这两个区域。有关Fc变体及其与补救受体相互作用的说明，参见国际公开WO 97/34631和WO 96/32478。
本发明包括编码本文所述的双特异性抗原结合蛋白及其组分的一种或多种分离的核酸。本发明的核酸分子包括呈单链和双链形式的DNA和RNA，以及相应互补序列。DNA包括例如cDNA、基因组DNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA及其组合。本发明的核酸分子包括全长基因或cDNA分子，以及其片段组合。本发明的核酸优先衍生自人源，但本发明也包括衍生自非人物种的核酸。
来自免疫球蛋白或其区域(例如可变区、Fc区等)的相关氨基酸序列或感兴趣的多肽可以通过直接蛋白质测序确定，且适合编码核苷酸序列可以根据通用密码子表设计。可替代地，可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)从产生单克隆抗体的细胞中分离编码这样的抗体(可从其衍生出本发明的双特异性抗原结合蛋白的结合结构域)的基因组或cDNA并对其进行测序。
“分离的核酸”在本文中与“分离的多核苷酸”可互换使用，在自天然存在的来源分离核酸的情况下，是指已与分离出核酸的生物体基因组中存在的相邻基因序列分离的核酸。在由模板酶法合成或化学合成核酸，例如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸的情况下，应理解，由这样的方法获得的核酸是分离的核酸。分离的核酸分子是指呈独立片段形式或作为较大核酸构建体的一种组分的核酸分子。在一个优选实施例中，核酸基本上不含污染性内源物质。核酸分子优选衍生自呈基本上纯的形式和以能够通过标准生物化学方法(例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约州(1989)中概述的方法)鉴别、操作和回收其组分核苷酸序列的量或浓度分离至少一次的DNA或RNA。这样的序列优选是以不含典型地存在于真核基因中的内部非翻译序列或内含子的可读框形式提供和/或构建。非翻译DNA序列可以存在于可读框的5'或3'处，其中这些序列不干扰编码区的操作或表达。除非另外说明，否则本文所述的任何单链多核苷酸序列的左手端是5’端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5’方向。新生RNA转录物的5'至3'产生方向称为转录方向；在具有与RNA转录物的序列相同序列的DNA链上作为RNA转录物5'端至5'端的序列区称为“上游序列”；在具有与RNA转录物的序列相同序列的DNA链上作为RNA转录物3'端至3'端的序列区称为“下游序列”。
本发明还包括在中等严格度条件下，且更优选在高严格度条件下与编码如本文所描述的多肽的核酸杂交的核酸。影响杂交条件的选择的基本参数及关于设计适合的条件的指导阐述于以下中：Sambrook,Fritsch和Maniatis(1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约州,第9和11章；及Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学现代方法],1995,Ausubel等人编辑,John Wiley&Sons,Inc.[约翰·威利父子公司],第2.10节及第6.3-6.4节)，且可由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度和/或碱基组成而容易地确定。实现中等严格度条件的一种方式涉及使用一种含5xSSC、0.5％ SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的预洗涤溶液、含约50％甲酰胺、6x SSC的杂交缓冲液和约55℃杂交温度(或其他类似的杂交溶液，例如含有约50％甲酰胺的杂交溶液，和约42℃杂交温度)，以及约60℃和0.5x SSC、0.1％ SDS的洗涤条件。通常，高严格度条件定义为如上所述的杂交条件，但利用在约68℃下0.2x SSC、0.1％SDS的洗涤条件。SSPE(l x SSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)可以取代杂交和洗涤缓冲液中的SSC(lxSSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；洗涤是在杂交完成之后进行，持续15分钟。应理解，必要时，可以通过应用本领域技术人员已知和以下进一步描述的管理杂交反应和双链体稳定性的基本原理调整洗涤温度和洗涤液盐浓度以达到所需的严格度(参见例如Sambrook等人，1989)。当核酸与未知序列的靶核酸杂交时，假定杂交体长度是杂交核酸的长度。当序列已知的核酸杂交时，杂交体长度可以通过比对核酸序列并鉴别序列互补性最佳的一个或多个区域来确定。预期长度小于50个碱基对的杂交体的杂交温度应比杂交体的熔融温度(Tm)低5℃至10℃，其中Tm是根据以下等式确定。对于长度小于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+T碱基的数量)+4(G+C碱基的数量)。对于长度超过18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交体中碱基的数量，且[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于l x SSC，[Na+]＝0.165M)。优选地，每个这样的杂交核酸的长度为至少15个核苷酸(或更优选地，至少18个核苷酸，或至少20个核苷酸，或至少25个核苷酸，或至少30个核苷酸，或至少40个核苷酸，或最优选地至少50个核苷酸)，或为其所杂交的本发明的核酸长度的至少25％(更优选至少50％，或至少60％，或至少70％且最优选地至少80％)，且与其所杂交的本发明的核酸具有至少60％(更优选至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％且最优选地至少99.5％)序列一致性，其中序列一致性通过比较杂交核酸的序列来确定，如上文更详细地描述的，在比对时，使重叠和一致性最大化同时使序列空位最小化。
如本文所述，可以通过使用盒式或PCR诱变，或本领域中熟知的其他技术对编码多肽的DNA中的核苷酸进行位点特异性诱变，以产生编码变体的DNA，且随后在细胞培养中表达重组DNA来制备本文所述的抗原结合蛋白的变体。不过，还可使用确定的技术，通过体外合成制备包含具有多达约100-150个残基的变体CDR的抗原结合蛋白。这些变体典型地展现与天然存在的类似物相同的定性生物活性，例如结合至抗原。这样的变体包括例如在抗原结合蛋白的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任何组合以达到最终构建体，条件是最终的构建体具有所需特征。氨基酸变化还可能改变抗原结合蛋白的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置。在某些实施例中，抗原结合蛋白变体的制备意图修饰直接参与表位结合的那些氨基酸残基。在其他实施例中，出于本文所论述的目的，需要对不直接参与表位结合的残基或不以任何方式参与表位结合的残基进行修饰。预期在任何CDR区和/或框架区内的诱变。本领域技术人员可以采用协方差分析设计抗原结合蛋白的氨基酸序列中的有用修饰。参见例如，Choulier等人,Proteins[蛋白质]41:475-484,2000；Demarest等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]335:41-48,2004；Hugo等人,Protein Engineering[蛋白质工程]16(5):381-86,2003；Aurora等人,美国专利公开号2008/0318207A1；Glaser等人,美国专利公开号2009/0048122A1；Urech等人,WO 2008/110348 A1；Borras等人,WO 2009/000099 A2。由协方差分析确定的这样的修饰可以改善抗原结合蛋白的效力、药物代谢动力学、药效学和/或可制造性特征。
本发明还包括载体，其包含编码本发明的双特异性抗原结合蛋白的一种或多种组分(例如可变区、轻链、重链、修饰的重链、和Fd片段)的一个或多个核酸。术语“载体”是指用于将蛋白质编码信息转移至宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、非游离型哺乳动物载体和表达载体(例如，重组表达载体)。如本文所用，术语“表达载体”或“表达构建体”是指含有所需编码序列和用于在特定宿主细胞中表达可操作地连接的编码序列所必需的适当的核酸控制序列的重组DNA分子。表达载体可以包括但不限于这样的序列，这些序列影响或控制转录、翻译以及(如果存在内含子的话)影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接。用于在原核生物中表达所必需的核酸序列包括启动子，任选地操纵序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子、和终止子以及多腺苷酸化信号。分泌信号肽序列还可以任选地由表达载体编码，与目的编码序列可操作地连接，使得表达的多肽可以由重组宿主细胞分泌，如果需要，以便更容易地从细胞中分离目的多肽。例如，在一些实施例中，信号肽序列可以与要求保护的多肽序列中的任一个的氨基末端附接/融合。在某些实施例中，具有MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列的信号肽与多肽序列中的任一个的氨基末端融合。在其他实施例中，具有MAWALLLLTLLTQGTGSWA(SEQ ID NO:53)的氨基酸序列的信号肽与多肽序列中的任一个的氨基末端融合。在仍其他实施例中，具有MTCSPLLLTLLIHCTGSWA(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列的信号肽与多肽序列中的任一个的氨基末端融合。可以与本文所述的多肽序列的氨基末端融合的其他适合信号肽序列包括：MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO:55)、MEWT WRVLFLVAAATGAHS(SEQ ID NO:56)、METPAQLLFLLLLW LPDTTG(SEQ ID NO:57)、METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO:58)、MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO:59)、和MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO:60)。其他信号肽是本领域技术人员已知的，并且可以与多肽序列中的任一个融合，例如以促进或优化在特定宿主细胞中的表达。
典型地，用于宿主细胞中以产生本发明的双特异性抗原蛋白的表达载体将含有用于质粒维持以及用于克隆和表达编码双特异性抗原结合蛋白各组分的外源核苷酸序列的序列。在某些实施例中，这样的序列(统称为“侧接序列”)典型地将包括以下核苷酸序列中的一个或多个：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的核酸的多接头区和可选择标记物元件。这些序列分别于下文论述。
任选地，载体可以含有“标签”编码序列，即，位于多肽编码序列的5'或3'端的寡核苷酸分子；该寡核苷酸标签序列编码聚组氨酸(例如六组氨酸)、FLAG、HA(血凝素流感病毒)、myc或现有可商购抗体所针对的另一“标签”分子。在表达多肽时，此标签典型地与多肽融合，并且可以用作从宿主细胞亲和纯化或检测多肽的方式。亲和纯化可以例如通过使用针对标签的抗体作为亲和基质的柱层析法来完成。任选地，随后可以通过各种方式，例如使用某些肽酶裂解，自纯化的多肽移除标签。
侧接序列可以为同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或品系)、异源的(即，来自与宿主细胞物种或品系不同的物种)、混合的(即，来自超过一种来源的侧接序列的组合)、合成的或天然的。因此，侧接序列的来源可以为任何原核或真核生物体、任何脊椎动物或非脊椎动物生物体，或任何植物，只要该侧接序列在宿主细胞机器中起作用且可以经宿主细胞机器激活。
可用于本发明载体中的侧接序列可以通过本领域中熟知的几种方法中的任一种获得。典型地，可用于本文中的侧接序列将预先通过定位和/或通过限制性核酸内切酶消化鉴定且因此可以使用适当限制性核酸内切酶自适当组织来源分离。在一些情况下，侧接序列的全核苷酸序列可以是已知的。此处，侧接序列可以使用常规核酸合成或克隆方法合成。
无论已知侧接序列的全部抑或仅一部分，其均可使用聚合酶链反应(PCR)和/或通过用适合探针，例如来自相同或另一物种的寡核苷酸和/或侧接序列片段筛选基因组文库来获得。若侧接序列未知，则可以自可能含有例如编码序列或甚至另外一个或多个基因的较大DNA片段分离含有侧接序列的DNA片段。可以通过限制性核酸内切酶消化产生适当DNA片段，随后使用琼脂糖凝胶纯化、柱层析法(加利福尼亚州查茨沃斯(Chatsworth,CA))或技术人员已知的其他方法分离来实现分离。本领域普通技术人员将易于了解实现此目的的适合酶的选择。
复制起点通常是商业购买的那些原核表达载体的一部分，并且该起点有助于载体在宿主细胞中的扩增。如果选择的载体不含有复制起点的位点，则可以根据已知序列化学合成一个，然后连接到载体中。例如，来自质粒pBR322(马萨诸塞州贝弗利的新英格兰生物实验室(New England Biolabs,Beverly,MA))的复制起点适合大多数革兰氏阴性细菌，且各种病毒起点(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水疱性口炎病毒(VSV)，或乳头瘤病毒，例如HPV或BPV)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(例如，通常仅使用SV40起点，因为其还含有病毒早期启动子)。
转录终止序列典型地位于多肽编码区3'端且用于终止转录。通常，原核细胞中的转录终止序列为富G-C片段，继之以聚T序列。尽管该序列易于自文库克隆或甚至作为载体的一部分商购获得，但其还可使用核酸合成方法容易地合成。
可选择标记物基因编码选择性培养基中生长的宿主细胞存活和生长所需的蛋白质。典型的选择标记物基因编码如下蛋白质：(a)赋予针对抗生素或其他毒素(例如，对于原核宿主细胞，胺苄青霉素、四环素或卡那霉素)的抗性；(b)补充细胞的营养缺陷；或(c)提供不可得自复杂培养基或限定培养基的重要营养素。特定可选择标记物为卡那霉素抗性基因、胺苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有利地，新霉素抗性基因还可用于在原核和真核宿主细胞中进行选择。
其他可选择基因可用于扩增将表达的基因。扩增为如下的过程：其中使产生对生长或细胞存活非常重要的蛋白质所需的基因在重组细胞连续世代的染色体内串联重复。适用于哺乳动物细胞的可选择标记物的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子胸苷激酶基因。使哺乳动物细胞转化株处于选择压力下，其中由于载体中存在可选择基因，故仅转化株唯一适于存活。选择压力是通过在连续地增加培养基中选择剂的浓度的条件下培养经转化细胞，由此使可选择基因和编码另一基因，例如本文所述的双特异性抗原结合蛋白的一种或多种组分的DNA扩增来施加。因此，由扩增的DNA合成增加的量的多肽。
核糖体结合位点对于mRNA翻译起始而言通常为必需的且以Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)为特征。该元件典型地位于启动子的3'端且在待表达的多肽编码序列的5'端。在某些实施例中，一个或多个编码区可以可操作地连接到内部核糖体结合位点(IRES)，由此允许自单一RNA转录物翻译两个可读框。
在一些情况下，例如在真核宿主细胞表达系统中需要糖基化的情况下，可以操作各种前序列或原序列以改善糖基化或产量。举例而言，可改变特定信号肽的肽酶裂解位点，或添加还可影响糖基化的前序列。最终蛋白质产物可以在位置-1(相对于成熟蛋白质的第一个氨基酸)具有一个或多个易于表达的另外的氨基酸，这些氨基酸可能未完全移除。举例而言，最终蛋白质产物可具有一或两个与氨基末端附接的在肽酶裂解位点发现的氨基酸残基。可替代地，当酶在成熟多肽内的这样的区域切割时，使用一些酶裂解位点可能产生所需多肽的略微截短的形式。
本发明的表达和克隆载体典型地将含有由宿主生物体识别且可操作地连接至编码多肽的分子的启动子。如本文所用，术语“可操作地连接”是指两个或更多个核酸序列以使得产生能够引导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子的方式连接。例如，载体中与蛋白质编码序列“可操作地连接”的控制序列这样与其连接，使得在与这些控制序列的转录活性相容的条件下表达蛋白质编码序列。更特别地，如果启动子和/或增强子序列(包括顺式作用转录控制元件的任何组合)在适当的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子和/或增强子序列与该编码序列可操作地连接。
启动子为位于控制结构基因转录的结构基因起始密码子(通常在约100至1000bp内)上游(即，5’)的非转录序列。启动子通常分组为两种类别：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子起始处于其控制下的DNA响应于培养条件的某种变化(诸如营养素的存在或不存在，或者温度变化)以提高的水平转录。另一方面，组成型启动子一致地转录其可操作地连接的基因，即，对基因表达具有极小控制或无控制。许多由多种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。通过限制性酶消化移除源DNA启动子，并将所需启动子序列插入载体中，将适合启动子可操作地连接至编码例如本发明的双特异性抗原结合蛋白的重链、轻链、修饰的重链或其他组分的DNA。
用于酵母宿主的适合启动子在本领域中也是众所周知的。酵母增强子有利地与酵母启动子一起使用。用于哺乳动物宿主细胞的适合启动子是众所周知的，且包括但不限于获自病毒基因组的那些启动子，这些病毒为诸如多形瘤病毒、传染性上皮瘤病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、B型肝炎病毒，以及最优选地猿猴病毒40(SV40)。其他适合哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。
可能有意义的其他启动子包括但不限于：SV40早期启动子(Benoist和Chambon,1981,Nature[自然]290:304-310)；CMV启动子(Thornsen等人,1984,Proc.Natl.Acad.U.S.A.[美国国家科学院院刊]81:659-663)；劳斯肉瘤病毒(Roussarcoma virus)的3'长末端重复序列中所含的启动子(Yamamoto等人,1980,Cell[细胞]22:787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]78:1444-1445)；来自金属硫蛋白基因的启动子和调控序列(Prinster等人,1982,Nature[自然]296:39-42)；和原核启动子，例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]80:21-25)。有意义的还有以下动物转录控制区，它们表现出组织特异性并已用于转基因动物中：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人,1984,Cell[细胞]38:639-646；Ornitz等人,1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.[冷泉港定量生物学研讨会]50:399-409；MacDonald,1987,Hepatology[肝脏病学]7:425-515)；在胰脏β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan,1985,Nature[自然]315:115-122)；在淋巴细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，1984,Cell[细胞]38:647-658；Adames等人，1985,Nature[自然]318:533-538；Alexander等人，1987,Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]7:1436-1444)；在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中具有活性的小鼠乳房肿瘤病毒控制区(Leder等人,1986,Cell[细胞]45:485-495)；在肝中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等人,1987,Genes and Devel.[基因与发育]1:268-276)；在肝中具有活性的α-胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人,1985,Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]5:1639-1648；Hammer等人，1987,Science[科学]253:53-58)；在肝中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人,1987,Genes and Devel.[基因与发育]1:161-171)；在骨髓细胞中具有活性的β-球蛋白基因控制区(Mogram等人,1985,Nature[自然]315:338-340；Kollias等人,1986,Cell[细胞]46:89-94)；在脑中的寡树突细胞中具有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等人,1987,Cell[细胞]48:703-712)；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani,1985,Nature[自然]314:283-286)；和在下丘脑中具有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等人,1986,Science[科学]234:1372-1378)。
可以将增强子序列插入载体中以增加高等真核细胞中编码双特异性抗原结合蛋白的组分(例如，轻链、重链、修饰的重链、Fd片段)的DNA的转录。增强子为DNA的顺式作用元件，长度通常为约10-300bp，作用于启动子以增加转录。增强子在取向和位置方面为相对独立的，已见于转录单元的5'和3'位置。已知可得自哺乳动物基因的几种增强子序列(例如，球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。然而，典型地使用来自于病毒的增强子。本领域中已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子是用于激活真核启动子的例示性强化元件。尽管增强子可以定位于载体中编码序列的5'或3'，但其典型地位于启动子5'的位点处。可将编码适当天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列并入表达载体中，以促进抗体的细胞外分泌。信号肽或前导序列的选择取决于待产生抗体的宿主细胞的类型，且异源信号序列可替换天然信号序列。信号肽的实例在上文有描述。在哺乳动物宿主细胞中起作用的其他信号肽包括美国专利号4,965,195中所述的白介素-7(IL-7)的信号序列；Cosman等人,1984,Nature[自然]312:768中所述的白介素-2受体的信号序列；欧洲专利号0367 566中所描述的白介素-4受体信号肽；美国专利号4,968,607中所述的I型白介素-1受体信号肽；欧洲专利号0 460 846中所描述的II型白介素-1受体信号肽。
可由起始载体(例如可商购载体)构建所提供的表达载体。这些载体可含有或可不含所有所需侧接序列。在载体中不存在一个或多个本文所述的侧接序列的情况下，其可以独立地获得且连接到载体中。用于获得各侧接序列的方法是本领域技术人员熟知的。可以将表达载体引入宿主细胞中，由此产生由如本文所述的核酸所编码的蛋白质，包括融合蛋白。
在某些实施例中，可以将编码本发明的双特异性抗原结合蛋白的不同组分的核酸插入相同表达载体中。在这样的实施例中，该两个核酸可以由内部核糖体进入位点(IRES)隔开且处于单一启动子控制下，由此使轻链和重链由相同mRNA转录物表达。可替代地，该两个核酸可以处于两个独立启动子控制下，由此使轻链和重链由两个独立的mRNA转录物表达。
类似地，对于IgG-scFv双特异性抗原结合蛋白，可以将编码轻链的核酸克隆到与编码修饰的重链的核酸相同的表达载体中(包含重链和scFv的融合蛋白)，其中这两个核酸受单个启动子控制并被IRES分开，或者其中这两个核酸受两个单独的启动子控制。对于IgG-Fab双特异性抗原结合蛋白，编码三个组分中每一个的核酸可被克隆到相同的表达载体中。在一些实施例中，编码IgG-Fab分子的轻链的核酸和编码第二多肽(包含C末端Fab结构域的另一半)的核酸被克隆到一个表达载体中，而编码修饰的重链(包含重链和Fab结构域的一半的融合蛋白)的核酸被克隆到第二表达载体中。在某些实施例中，本文所述的双特异性抗原结合蛋白的所有组分都从相同的宿主细胞群表达。例如，即使将一种或多种组分克隆到单独的表达载体中，宿主细胞也用两种表达载体共转染，使得一个细胞产生双特异性抗原结合蛋白的所有组分。
在构建出载体并将编码本文所述的双特异性抗原结合蛋白各组分的一个或多个核酸分子插入一个或多个载体的一个或多个适当位点中之后，可以将一个或多个完整载体插入适合宿主细胞中以进行扩增和/或多肽表达。因此，本发明包括分离的宿主细胞，其包含编码双特异性抗原结合蛋白的组分的一个或多个表达载体。如本文所用，术语“宿主细胞”是指已经用核酸转化或能够用核酸转化并且由此表达目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论后代与原始亲本细胞在形态或遗传构成方面是否相同，只要存在目的基因即可。包含本发明的分离核酸优选可操作地连接到至少一个表达控制序列(例如启动子或增强子)的宿主细胞是“重组宿主细胞”。
可以通过熟知方法，包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其他已知技术将抗原结合蛋白的表达载体转化至所选宿主细胞中。所选择的方法将部分随待使用的宿主细胞类型而变化。这些方法和其他适合的方法对于技术人员是熟知的，并且阐述于例如Sambrook等人,2001,同上中。
宿主细胞当在适当条件下培养时合成抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白随后可以自培养基收集(若宿主细胞将其分泌至培养基中)或直接由产生该抗原结合蛋白的宿主细胞收集(若其并非分泌的)。适当的宿主细胞的选择将取决于多种因素，诸如所需表达水平、活性所需或必需的多肽修饰(诸如糖基化或磷酸化)和折叠成生物活性分子的容易性。
示例性宿主细胞包括原核生物细胞、酵母或高等真核细胞。原核宿主细胞包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏杆菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏杆菌(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacillus)，例如枯草杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)、和链霉菌属(Streptomyces)。真核微生物(如丝状真菌或酵母)是用于重组多肽的适合克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。不过，多种其他属、物种和菌株是常用的且可用于本文中，例如毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，耶氏酵母属(Yarrowia)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，例如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如像脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、木霉菌属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达糖基化抗原结合蛋白的宿主细胞可以衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体以及来自以下宿主的相应的许可性昆虫宿主细胞，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)，埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。用于转染这样的细胞的多种病毒株是公开可获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株。
脊椎动物宿主细胞也是适合宿主，且由这样的细胞重组产生抗原结合蛋白已成为常规程序。可用作表达的宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，并且包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括CHOK1细胞(ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4216,1980)；由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胎肾细胞系(293或亚克隆用于以悬浮培养方式生长的293细胞)(Graham等人，J.Gen Virol.[普通病毒学杂志]36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞托利细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.[生殖生物学]23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1、ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝癌细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y Acad.Sci.[纽约科学院年报]383:44-68,1982)；MRC 5细胞或FS4细胞；哺乳动物骨髓瘤细胞，以及许多其他的细胞系。在另一实施例中，可以自B细胞谱系选择不产生自身抗体但能够制备并分泌异源抗体的细胞系。在一些实施例中，CHO细胞是用于表达本发明的双特异性抗原结合蛋白的优选宿主细胞。
宿主细胞用上述核酸或载体转化或转染以产生双特异性抗原结合蛋白且在经适当改良的常规营养培养基中培养以诱导启动子、选择转化株或扩增编码所需序列的基因。此外，具有由选择性标记物隔开的多个转录单元拷贝的新颖载体和经转染细胞系特别适用于表达抗原结合蛋白。因此，本发明还提供了用于制备本文所述的双特异性抗原结合蛋白的方法，该方法包括在允许由本文所述的一种或多种表达载体编码的双特异性抗原结合蛋白表达的条件下，在培养基中培养包含该一种或多种表达载体的宿主细胞；并且从该培养基中回收该双特异性抗原结合蛋白。
用于产生本发明的抗原结合蛋白的宿主细胞可以在多种培养基中培养。诸如Ham's F10(西格玛公司(Sigma))、最小必需培养基((MEM)，(西格玛公司))、RPMI-1640(西格玛公司)和杜尔贝科改良型伊戈尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM)，西格玛公司))等可商购培养基适用于培养宿主细胞。另外，在Ham等人,Meth.Enz.[酶学方法]58:44,1979；Barnes等人,Anal.Biochem.[分析生物化学]102:255,1980；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90103430；WO 87/00195；或美国专利注册号30,985中描述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。必要时，这些培养基中的任一种可以补充有激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如健他霉素(GentamycinTM)药物)、微量元素(定义为通常以在微摩尔浓度范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量来源。还可以按本领域技术人员已知的适当浓度包含任何其他必需的补充剂。培养条件，例如温度、pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，并且对于普通技术人员来说是显而易见的。
在培养宿主细胞后，双特异性抗原结合蛋白可以在细胞内、在周质空间中产生，也可以直接分泌到培养基中。若在细胞内产生抗原结合蛋白，则作为第一个步骤，例如通过离心或超滤来除去宿主细胞或溶解片段的颗粒状碎片。双特异性抗原结合蛋白可以使用例如羟基磷灰石层析法、阳离子或阴离子交换层析法、或优选亲和层析法、使用一种或多种目的抗原或蛋白A或蛋白G作为亲和配体来纯化。蛋白A可用于纯化包括基于人γ1、γ2或γ4重链的多肽的蛋白质(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.[免疫学方法杂志]62:1-13,1983)。对于所有小鼠同种型和对于人γ3推荐蛋白G(Guss等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]5:15671575,1986)。亲和配体所连接的基质最常为琼脂糖，但其他基质也是可用的。相较于用琼脂糖，机械稳定的基质，例如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可以提高流动速率并缩短加工时间。在蛋白质包含CH3结构域的情况下，将Bakerbond ABXTM树脂(吉提贝可公司(J.T.Baker)，新泽西州菲利普斯堡(Phillipsburg,N.J.))用于纯化。根据要回收的特定双特异性抗原结合蛋白，其他用于蛋白质纯化的技术例如乙醇沉淀、反相HPLC、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可能的。
在某些实施例中，该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽和该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的表达在第一哺乳动物宿主细胞中进行，并且该表达相比于在与该第一哺乳动物宿主细胞同一类型的第二哺乳动物宿主细胞中以下多肽的表达：
(i)包含以下氨基酸取代的第三CH1-铰链-CH2-CH3多肽：D399K和E356K；以及
(ii)包含以下氨基酸取代的第四CH1-铰链-CH2-CH3多肽：K409D/E、K392D/E和K439D/E，导致如通过SEC测量的更低的1/2抗体物质杂质百分比。
在某些实施例中，(i)该第一免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和K439D；并且
(ii)该第二免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D、K392D/E和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，(i)该第一免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和K439D；并且
(ii)该第二免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D、K392D和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，(i)该第三免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和E356K；并且
(ii)该第四免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D、K392D和K439D；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽和该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的表达在第一哺乳动物宿主细胞中进行，并且该表达相比于在与该第一哺乳动物宿主细胞同一类型的第二哺乳动物宿主细胞中以下多肽的表达：
(i)包含以下氨基酸取代的第三CH1-铰链-CH2-CH3多肽：D399K和E356K；以及
(ii)包含以下氨基酸取代的第四CH1-铰链-CH2-CH3多肽：K409D/E、K392D/E和K439D/E，导致蛋白A纯化后如以mg/ml测量的更高的多特异性抗原结合蛋白产量。
在某些实施例中，(i)该第一免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和K439D；并且
(ii)该第二免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D、K392D/E和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，(i)该第一免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和K439D；并且
(ii)该第二免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D、K392D和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，(i)该第三免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和E356K；并且
(ii)该第四免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D、K392D和K439D；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
在某些实施例中，该第一抗体轻链和第二抗体轻链是相同的。
实例
实验程序
分子生物学
预期分子(抗体HC，抗体LC，scFv-Fc，Fc)的可变结构域的可读框由外部提供者合成，然后使用Golden Gate技术和BsmBI限制性位点单独克隆到含有恒定结构域的瞬时表达载体中。在aglyco人IgG1支架中构建HC，其中在CH2中添加了稳定的二硫键(Jacobsen等人,2017)。设计用于优先形成异IgG的HC具有突变到Fc-CH3结构域中的电荷对突变(CPM)。序列确认后，使用行业标准制备试剂盒制备转染级DNA。对于单价scFv-Fc分子，质粒以1:1(scFv-Fc:Fc)的质量基比率混合，对于单克隆抗体，质粒以1:1:1:1(LC1:HC1:LC2:HC2)的质量基比率混合。
哺乳动物表达
所有单价异IgG分子均使用加拿大国家研究委员会(National Research Councilof Canada)开发的瞬时HEK 293-6E表达系统表达。还将丙戊酸钠掺入到表达系统中。在这种情况下，使细胞生长至2e6个活细胞/mL用于转染。通过以下进行转染：将0.5μg DNA/mL与1.5μl PEImax/mL(聚合科学公司(Polysciences))在100μl FreeStyle F-17培养基中混合10min，然后将复合物添加900μL的细胞培养物中。转染后二十四小时，添加新鲜培养基以使培养物的体积加倍，并添加胰蛋白胨-N1(有机技术公司(Organotechnie))和葡萄糖(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))分别达到2.5g/L和4.5g/L的最终浓度。转染后四天，添加丙戊酸钠(MP生物医学公司(MP Biomedicals))达到3.75mM的最终浓度。转染后六天，通过离心然后用0.22um过滤器真空过滤来收获条件培养基。在Fc构建体的情况下，使用内部稳定的CHO-K1方法结合转座酶技术进行表达。对于转染，将细胞离心并在Opti-MEM培养基(赛默飞世尔公司)中以2E6个活细胞/mL重悬。通过以下进行转染：将2μg质粒DNA与2μgtransposagen DNA和10μL Lipofectamine LTX(赛默飞世尔公司)在1mL的Opti-MEM中混合，孵育15-20分钟，以及将复合物添加到1mL的重悬细胞中。将培养物在设定为120RPM的振荡平台上在37℃和5％ CO2下孵育。转染后五小时，添加2mL我们内部开发的生长培养基。转染后七十二小时，将细胞重悬在添加有10μg/mL的嘌呤霉素和600μg/mL的潮霉素的生长培养基中，并且通过稀释传代，直至生长和活力达到转染前水平。在内部开发的生产培养基中通过培养基交换，以1.5E6个细胞/mL接种培养物进行生产。接种后七天收获条件培养基。
纯化
将异IgG CPM分子通过蛋白A亲和树脂来纯化，随后进行SP HP CEX，如DEVD异IgG方案中所述；但是不使用SEC柱。将每个样品加载到1mL HiTrap SP HP CEX柱上，并且用30CV的每种pH缓冲液中的0-400mM NaCl梯度洗脱。通过MCE、UPLC和LC-MS分析最终样品的峰级分。将池加载到在50mM乙酸钠(pH 5.6)中平衡的10mL SP HP柱上，并且用30CV的0-400mM NaCl梯度洗脱。将峰级分合并并在10mM乙酸钠、9％蔗糖(pH5.2)中透析。
对于所有分子，使用卡尺仪器(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))通过微毛细管电泳(mCE)，以及通过UPLC(沃特斯公司(Waters))用BEH C-200，4.6x 150mm柱在100mM磷酸钠、50mM NaCl、7.5％EtOH(pH 6.9)中分析最终蛋白质样品的纯度。还进行了LCMS-QC以确定每个分子的正确质量。
对于SEC分析，将约70μg的每个样品进样到配备有BEH200，4.6×300mm柱的Acquity UPLC(沃特斯公司)中。流动相为100mM磷酸钠和500mM NaCl，pH 6.8，流速为0.3mL/min。使用Chromeleon软件(赛默飞世尔公司)分析数据。
平衡电荷构建体
在4个异IgG分子中评估了CPM设计v103(图1和表1)。每个异IgG含有两个不同的Fv区，以确定序列多样性的影响。尽管在替代分子中可以清楚地证明有效的配对，但引入另外的序列可能会扭转这种关系(例如一条多肽链的过表达/低表达)。此外，为了了解CH3/CH3'界面上的CPM分布对蛋白质表达以及目的物质相比于错误配对物质的百分比的影响，评估了2种不同的情景：i)二元正/负分布的交换和ii)CH3/CH3'界面中CPMv103的电荷分布是混合的(HC_1上的D399K和K439D/E(为蓝色)；HC_2上的K409D/E、K392D/E和E356K(为绿色))，产生平衡电荷分布(BCD)，然后进行后续交换。令人惊讶的是，表达数据(通过蛋白A柱捕获)显示，在场景i)的情况下，一个取向(HC_1上带负电的突变K409D/E K392D/EK439D/E(为蓝色)和HC_2上带正电的突变D399K E356K(为绿色))将3/4分子的表达增加高达约2倍(图1A)。v103的这种随机部署似乎也会影响蛋白质折叠和杂质。实际上，如通过分析SEC确定的，异IgG A×B从展示超过13.3％的1/2-Ab(约75kDa)变为CPM交换后接近0％的1/2-Ab(图1B)。这种约75kDa杂质的产生可能是出于以下原因：一个HC相对于另一个HC过度表达；因此，由于这些CPM产生的排斥电荷而无法形成同二聚体。相比之下，C×D、E×F和G×H分子都示出了这种杂质的增加(图1B)。这似乎表明了互补决定区(CDR)中的蛋白质序列与CH3/CH3’二聚体中部署的5个带电突变之间的关系。与此形成鲜明对比的是，情景ii中的交换，CPMv103BCD的交换不会影响该4个分子组的表达，其中位值几乎相同(图1A)。关于1/2-Ab物质，并且除了CPMv103BCD交换中的A×B分子外，BCD设计似乎大大降低了这种约75kDa杂质，这将转化为所需物质的更高的最终回收率(图1B)。
表1.具有CPMv103和CPMv103BCD的4个异IgG分子的产生和分析结果。
<110> 美国安进公司
<120> 多特异性和单价IgG分子组装中链配对的静电转向中的平衡电荷分布
<130> A-2745-WO01-SEC
<150> 63/177,325
<151> 2021-04-20
<160> 60
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Gly Lys
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Gly Lys Arg
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 3
Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 4
Gly Gly Gly Asn Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 5
Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 6
Gly Pro Asn Gly Gly
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 7
Gly Gly Glu Gly Gly Gly
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 8
Gly Gly Glu Glu Glu Gly Gly Gly
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 9
Gly Glu Glu Glu Gly
1 5
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 10
Gly Glu Glu Glu
1
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 11
Gly Gly Asp Gly Gly Gly
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 12
Gly Gly Asp Asp Asp Gly Gly
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 13
Gly Asp Asp Asp Gly
1 5
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 14
Gly Asp Asp Asp
1
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Asp Ser Asp Glu Gly Ser Asp Gly Glu Asp
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 16
Trp Glu Trp Glu Trp
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 17
Phe Glu Phe Glu Phe
1 5
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 18
Glu Glu Glu Trp Trp Trp
1 5
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 19
Glu Glu Glu Phe Phe Phe
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 20
Trp Trp Glu Glu Glu Trp Trp
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 21
Phe Phe Glu Glu Glu Phe Phe
1 5
<210> 22
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 22
Gly Gly
1
<210> 23
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 23
Gly Gly Gly
1
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 24
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 30
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 30
Gly Ala Gly Ala
1
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 31
Gly Ala Gly Ala Gly Ala
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 32
Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala
1 5
<210> 33
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 33
Ala Ala
1
<210> 34
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 34
Ala Ala Ala
1
<210> 35
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 35
Ala Ala Ala Ala
1
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 36
Ala Ala Ala Ala Ala
1 5
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 37
Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 38
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 39
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 41
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 42
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 43
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 43
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 44
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 44
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 45
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 46
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 47
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 48
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 48
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 49
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 49
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 50
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 50
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 51
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 52
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 52
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys
20
<210> 53
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 53
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala
<210> 54
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 54
Met Thr Cys Ser Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ile His Cys Thr Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala
<210> 55
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 55
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly
20
<210> 56
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 56
Met Glu Trp Thr Trp Arg Val Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 57
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 57
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly
20
<210> 58
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 58
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly
20
<210> 59
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 59
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 60
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 60
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser

Claims (19)

1.一种分离的异多聚体，其包含异二聚免疫球蛋白CH3结构域，该异二聚免疫球蛋白CH3结构域包含第一免疫球蛋白CH3结构域多肽和第二免疫球蛋白CH3结构域多肽，其中：
(i)该第一免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：D399K和K439D/E；并且
(ii)该第二免疫球蛋白CH3结构域多肽包含以下氨基酸取代：K409D/E、K392D/E和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
2.根据权利要求1所述的分离的异多聚体，其中该异多聚体包含异二聚Fc区，该异二聚Fc区包含第一免疫球蛋白Fc多肽和第二免疫球蛋白Fc多肽，其中该第一免疫球蛋白Fc多肽包含该第一CH3结构域多肽，并且该第二Fc多肽包含该第二CH3结构域多肽。
3.根据权利要求2所述的分离的异多聚体，其中该异多聚体包含含有第一铰链结构域多肽和该第一Fc多肽的第一多肽；以及含有第二铰链结构域多肽和该第二Fc多肽的第二多肽。
4.根据权利要求2所述的分离的异多聚体，其中该异多聚体是双特异性抗体构建体，该双特异性抗体构建体包含第一重链多肽和第一轻链多肽；以及第二重链多肽和第二轻链多肽，
其中该第一重链多肽包含第一VH结构域、第一CH1结构域多肽、第一铰链结构域多肽、和该第一Fc多肽；并且该第二重链多肽包含第二VH结构域、第二CH1结构域多肽、第二铰链结构域多肽、和该第二Fc多肽。
5.根据权利要求4所述的双特异性抗体构建体，其中
i)该第一重链多肽包含在位置183处的赖氨酸；
ii)该第一轻链多肽包含在位置176处的谷氨酸；
iii)该第二重链多肽包含在位置183处的谷氨酸；并且
iv)该第二轻链多肽包含在位置176处的赖氨酸；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
6.根据权利要求4所述的双特异性抗体构建体，其中
i)该第一重链多肽包含在位置183处的谷氨酸；
ii)该第一轻链多肽包含在位置176处的赖氨酸；
iii)该第二重链多肽包含在位置183处的赖氨酸；并且
iv)该第二轻链多肽包含在位置176处的谷氨酸；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引。
7.根据任一前述权利要求所述的分离的异多聚体，其中该第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽衍生自IgG1-、IgG2-、IgG3-或IgG4-免疫球蛋白CH3结构域多肽或者是IgG1-、IgG2-、IgG3-或IgG4-免疫球蛋白CH3结构域多肽的突变形式。
8.根据权利要求7所述的分离的异多聚体，其中该第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽衍生自IgG1-或IgG2-免疫球蛋白CH3结构域多肽或者是IgG1-或IgG2-免疫球蛋白CH3结构域多肽的突变形式。
9.一种生成多特异性抗原结合蛋白的方法，该抗原结合蛋白包含与不同表位结合的至少两个结合结构域，该方法包括在哺乳动物宿主细胞中表达：
(i)包含以下氨基酸取代的第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽：D399K和K439D/E；以及
(ii)包含以下氨基酸取代的第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽：K409D/E、K392D/E和E356K；
其中氨基酸残基的编号是根据Kabat中列出的EU索引，
其中第一结合结构域与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N或C末端融合，并且第二结合结构域与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N或C末端融合，并且
其中这些结合结构域选自由以下组成的组：VH、scFab和scFv。
10.根据权利要求9所述的方法，其中该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第一表位的第一抗体轻链。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第二表位的第二抗体轻链。
12.根据权利要求10所述的方法，其中该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第一表位的抗体轻链；并且
该第二结合结构域与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该第二结合结构域选自由以下组成的组：scFab和scFv。
13.根据权利要求11所述的方法，其中该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的VH，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与该VH缔合以结合第二表位的抗体轻链；并且
该第一结合结构域与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该第一结合结构域选自由以下组成的组：scFab和scFv。
14.根据权利要求9所述的方法，其中该第一结合结构域是与该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的scFab，并且该第二结合结构域是与该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合的scFab。
15.根据权利要求9-15中任一项所述的方法，其中这些结合结构域与它们各自的CH1-铰链-CH2-CH3多肽的N末端融合，并且该多特异性抗原结合蛋白进一步包含与这些CH1-铰链-CH2-CH3多肽中的一个或两个的C末端融合的第三结合结构域，其中该第三结合结构域是受体配体VH、scFab或scFv。
16.根据权利要求9-15中任一项所述的方法，其中该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽和该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的表达在第一哺乳动物宿主细胞中进行，并且该表达相比于在与该第一哺乳动物宿主细胞同一类型的第二哺乳动物宿主细胞中以下多肽的表达：
(i)包含以下氨基酸取代的第三CH1-铰链-CH2-CH3多肽：D399K和E356K；以及
(ii)包含以下氨基酸取代的第四CH1-铰链-CH2-CH3多肽：K409D/E、K392D/E和K439D/E，导致如通过SEC测量的更低的1/2抗体物质杂质百分比。
17.根据权利要求9-15中任一项所述的方法，其中该第一CH1-铰链-CH2-CH3多肽和该第二CH1-铰链-CH2-CH3多肽的表达在第一哺乳动物宿主细胞中进行，并且该表达相比于在与该第一哺乳动物宿主细胞同一类型的第二哺乳动物宿主细胞中以下多肽的表达：
(i)包含以下氨基酸取代的第三CH1-铰链-CH2-CH3多肽：D399K和E356K；以及
(ii)包含以下氨基酸取代的第四CH1-铰链-CH2-CH3多肽：K409D/E、K392D/E和K439D/E，导致蛋白A纯化后如以mg/ml测量的更高的多特异性抗原结合蛋白产量。
18.根据权利要求4所述的异多聚体，其中该第一抗体轻链和第二抗体轻链是相同的。
19.根据权利要求11所述的方法，其中该第一抗体轻链和第二抗体轻链是相同的。
CN202280043338.8A 2021-04-20 2022-04-19 多特异性和单价IgG分子组装中链配对的静电转向中的平衡电荷分布 Pending CN117651714A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163177325P 2021-04-20 2021-04-20
US63/177325 2021-04-20
PCT/US2022/025340 WO2022225921A1 (en) 2021-04-20 2022-04-19 Balanced charge distribution in electrostatic steering of chain pairing in multi-specific and monovalent igg molecule assembly

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117651714A true CN117651714A (zh) 2024-03-05

Family

ID=81580206

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280043338.8A Pending CN117651714A (zh) 2021-04-20 2022-04-19 多特异性和单价IgG分子组装中链配对的静电转向中的平衡电荷分布

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240182600A1 (zh)
EP (1) EP4326761A1 (zh)
JP (1) JP2024515301A (zh)
CN (1) CN117651714A (zh)
AU (1) AU2022263406A1 (zh)
CA (1) CA3216559A1 (zh)
MX (1) MX2023012324A (zh)
WO (1) WO2022225921A1 (zh)

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US30985A (en) 1860-12-18 Thomas l
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US4965195A (en) 1987-10-26 1990-10-23 Immunex Corp. Interleukin-7
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
DE68925971T2 (de) 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1990005183A1 (en) 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
AU651596B2 (en) 1990-06-05 1994-07-28 Immunex Corporation Type II interleukin-1 receptors
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
AU2249592A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Dnx Corporation Production of human hemoglobin in transgenic pigs
DE69224906T2 (de) 1991-07-08 1998-10-29 Univ Massachusetts Thermotropes flüssig-kristallines segment-blockcopolymer
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
KR100654645B1 (ko) 1995-04-27 2007-04-04 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
KR20080059467A (ko) 1996-12-03 2008-06-27 아브게닉스, 인크. 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
EP1433793A4 (en) 2001-09-13 2006-01-25 Inst Antibodies Co Ltd METHOD FOR CREATING A CAMEL ANTIBODY LIBRARY
JP5374359B2 (ja) 2006-03-17 2013-12-25 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 安定化されたポリペプチド化合物
CA2680564C (en) 2007-03-12 2018-05-01 Esbatech Ag Sequence based engineering and optimization of single chain antibodies
US8793074B2 (en) 2007-06-21 2014-07-29 Saint Louis University Sequence covariance networks, methods and uses therefor
CN102838673B (zh) 2007-06-25 2016-05-11 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 修饰抗体的方法和具有改善的功能性质的修饰抗体
LT2794905T (lt) * 2011-12-20 2020-07-10 Medimmune, Llc Modifikuoti polipeptidai, skirti bispecifinių antikūnų karkasams
AR108377A1 (es) * 2016-05-06 2018-08-15 Medimmune Llc Proteínas de unión biespecíficas y sus usos
CA3025162A1 (en) * 2016-05-26 2017-11-30 Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation Mixtures of antibodies
MX2021015791A (es) * 2019-06-28 2022-04-01 Amgen Inc Proteínas de unión al antígeno biespecificas anti-receptor de cgrp/anti-receptor pac1.

Also Published As

Publication number Publication date
MX2023012324A (es) 2023-10-30
CA3216559A1 (en) 2022-10-27
WO2022225921A1 (en) 2022-10-27
JP2024515301A (ja) 2024-04-08
AU2022263406A1 (en) 2023-10-19
US20240182600A1 (en) 2024-06-06
EP4326761A1 (en) 2024-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230322955A1 (en) Antigen binding proteins with non-canonical disulfide in fab region
JP7500619B2 (ja) 抗体の二量体化を促進するためのヒンジ領域の操作
US20230047631A1 (en) Novel multispecific antibody format
CA3043528A1 (en) Bispecific or biparatopic antigen binding proteins and uses thereof
CN117651714A (zh) 多特异性和单价IgG分子组装中链配对的静电转向中的平衡电荷分布
US20220389119A1 (en) ENGINEERING CHARGE PAIR MUTATIONS FOR PAIRING OF HETERO-IgG MOLECULES
US20240002545A1 (en) Novel linkers of multispecific antigen binding domains
US20230374162A1 (en) Rational selection of building blocks for the assembly of multispecific antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination