JP2015502409A - 二重特異的抗体足場用改変ポリペプチド - Google Patents

Abstract

本技術は、一部には、遺伝子操作された抗体に関する。特に、多重特異的な遺伝子操作された抗体。このような抗体は、一部の態様において、診断および治療用途に利用することができる。【選択図】図２

Description

本技術は、一部には、遺伝子操作された抗体に関する。このような抗体は、一部の態様において診断および治療用途に利用することができる。

抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）とも称され、脊椎動物の血液中または他の体液中で天然に生じるタンパク質である。抗体は、外来物質、例えば細菌およびウイルスに結合し、それを中和する免疫系作用物質である。

天然に生じる抗体は、一般に、２つの大きい重鎖および２つの小さい軽鎖を含む。天然完全長抗体の場合、これらの鎖は一緒に結合して「Ｙ形状」タンパク質を形成する。重鎖および軽鎖は、ジスルフィド結合を介して互いに結合し得るシステインアミノ酸を含む。このようなジスルフィド結合は、一般に、フリーのシステインアミノ酸のチオール側鎖部分間に形成される。重鎖は、各鎖のシステインアミノ酸間のジスルフィド結合により互いに結合される。各軽鎖は、同様に鎖中のシステインアミノ酸間のジスルフィド結合により重鎖に結合している。各重鎖および軽鎖の特定のシステインアミノ酸は、一般に抗体鎖間のジスルフィド結合に関与するため、「鎖間システイン」と称される。

各重鎖（ＨＣ）は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いて複数の定常ドメイン（ＣＨ）を有する。各軽鎖（ＬＣ）は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、かつその他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定の完全長抗体では、可変ドメインは「Ｙ字型」タンパク質の各アームの端部に位置する。天然抗体内の可変ドメインは、典型的には各可変重鎖成分について同じポリペプチド配列を有し、かつ可変軽鎖成分について同じポリペプチド配列を有して、完全に構築されたとき、各アームがそれぞれ同じ抗原種に結合することができる。ある場合には、抗体が異なるポリペプチド配列ならびに異なる抗原および／またはエピトープ特異性を備える可変ドメインを有するように、抗体を遺伝子操作することができる。このような分子は多くの場合に「二重特異的」抗体と称され、診断または治療用途に有用であり得る。

本明細書には、改変重鎖であって、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換、および（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む改変重鎖と；改変軽鎖であって、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換、および（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む改変軽鎖とを含む抗体が提供される。ある態様において、重鎖の置換システインと軽鎖の置換システインとがジスルフィド結合を形成し得る。ある態様において、抗体は第２の重鎖と第２の軽鎖とをさらに含み、ここで第２の重鎖および軽鎖は天然システインから非システインアミノ酸への置換を含まない。さらに他の態様において、第１および／または第２の重鎖はＦｃ領域に改変を含む。一部の態様において、第１および第２の重鎖の両方のＦｃ領域が、第１の重鎖と第２の重鎖との鎖間ペアリングに有利に働く異なる改変を含む。

本明細書には、（ｉ）突出および／または空洞をもたらす少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む第１の改変重鎖、および代償性の空洞および／または突出をもたらす少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む第１の改変軽鎖と；（ｉｉ）空洞および／または突出をもたらす少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む第２の改変重鎖、および代償性の突出および／または空洞をもたらす少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む第２の改変軽鎖とを含む抗体が提供され、これらの改変は、第１の重鎖と第１の軽鎖との、および第２の重鎖と第２の軽鎖との鎖間ペアリングに有利に働く。ある態様において、第１の重鎖におけるアミノ酸置換は第２の重鎖におけるアミノ酸置換と異なり、第１の軽鎖におけるアミノ酸置換は第２の軽鎖におけるアミノ酸置換と異なる。ある態様において、第１の重鎖および軽鎖および／または第２の重鎖および軽鎖は、天然システインから非システインアミノ酸への置換をさらに含む。さらに他の態様において、第１および／または第２の重鎖はＦｃ領域に改変を含む。一部の態様において、第１および第２の重鎖の両方のＦｃ領域が、第１の重鎖と第２の重鎖との鎖間ペアリングに有利に働く異なる改変を含む。

また、上記の抗体のいずれかを含む組成物およびその使用方法も提供される。

また、改変重鎖ポリペプチドをコードする核酸であって、改変重鎖が（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換、および（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、核酸と；改変軽鎖ポリペプチドをコードする核酸であって、改変軽鎖が（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換、および（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、核酸とが提供される。ある態様において、重鎖の置換システインと軽鎖の置換システインとはジスルフィド結合を形成し得る。ある態様において、核酸はさらに第２の重鎖および第２の軽鎖をコードし、ここで第２の重鎖および軽鎖は天然システインから非システインアミノ酸への置換を含まない。

さらに他の態様において、第１および／または第２の重鎖はＦｃ領域に改変を含む。一部の態様において、第１および第２の重鎖の両方のＦｃ領域が、第１の重鎖と第２の重鎖との鎖間ペアリングに有利に働く異なる改変を含む。

また、突出および／または空洞をもたらす少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む第１の改変重鎖をコードする核酸、代償性の空洞および／または突出をもたらす少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む第１の改変軽鎖をコードする核酸と；空洞および／または突出をもたらす少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む第２の改変重鎖をコードする核酸、および代償性の突出および／または空洞をもたらす少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む第２の改変軽鎖をコードする核酸とが提供され、これらの改変は、第１の重鎖と第１の軽鎖との、および第２の重鎖と第２の軽鎖との鎖間ペアリングに有利に働く。ある態様において、第１の重鎖におけるアミノ酸置換は第２の重鎖におけるアミノ酸置換と異なり、第１の軽鎖におけるアミノ酸置換は第２の軽鎖におけるアミノ酸置換と異なる。ある態様において、第１の重鎖および軽鎖および／または第２の重鎖および軽鎖は、天然システインから非システインアミノ酸への置換をさらに含む。さらに他の態様において、第１および／または第２の重鎖はＦｃ領域に改変を含む。一部の態様において、第１および第２の重鎖の両方のＦｃ領域が、第１の重鎖と第２の重鎖との鎖間ペアリングに有利に働く異なる改変を含む。

また、上記の核酸のいずれかを含むベクターおよび細胞ならびに上記の核酸のいずれかの発現方法も提供される。

以下の説明、例、実施形態、特許請求の範囲および図面に特定の態様をさらに記載する。

図面は本技術の態様を示すもので、限定するものではない。明確にするため、および例示しやすくするため、図面の縮尺は一定にはせず、ある場合には、特定の態様の理解を促進するため種々の態様が強調または拡大されて示され得る。

抗体の図を示す。パネルＡに親の二価単一特異的親抗体が示される。パネルＢに代表的な一価二重特異的抗体（ＭＢａｂ）が示される。「ホール」を含む重鎖の星印は、「ホール」鎖のプロテインＡ結合を除去する遺伝子操作を表す。さらなるＭＢａｂ構築物が企図され、以下に記載する。左側のＭＢａｂは一方のアームに野生型ＨＣ−ＬＣ界面を含み、かつ他方のアームに、鎖間ジスルフィド結合を再配置するシステイン遺伝子操作ＨＣ−ＬＣ界面を含む。このジスルフィド結合は、図示されるとおりＣＨ１−ＣＬ界面内で再配置されてもよく、または本明細書に記載されるとおりＶＬ−ＶＨ界面に再配置されてもよい。右側のＭＢａｂは各アームに遺伝子操作されたＨＣ−ＬＣ界面を含み、ここで界面領域は、特異的なＨＣ−ＬＣ界面相互作用を促進するように遺伝子操作されており、これには、ＣＬとＣＨ１との領域間のジスルフィド結合（破線によって指示される）の形成に関与する天然システイン残基の置換が含まれ得る。両方のＭＢａｂとも、Ｆｃ領域（例えばＣＨ３）において、重鎖のヘテロダイマー化を促進するように遺伝子操作されている。Ｆａｂ領域の結合特異性は任意の所望の標的に向けられ得る。示される結合特異性は、本明細書の例で利用した抗体のものである。親抗体は、４つの抗原：ＩＬ−６、ＲＡＧＥ、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２のうちの１つに結合することができる。一価二重特異的抗体（ＭＢａｂ）は、ＩＬ−６およびＲＡＧＥの両方またはＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の両方に結合することができる。 図１Ａと同じ。 ＩＬ−６に結合する１つのアームとＲＡＧＥに結合する第２のアームとを有する一価二重特異的抗体（ＭＢａｂ）の三次元表現示す。矢印は、ヘテロダイマー化を促進する重鎖定常領域における重鎖突然変異の場所を示す。括弧で括ったＦａｂ領域を右側に拡大して示す。矢印は、変異体１０における改変（Ｖ１０；ＨＣ：Ａ１４１Ｃ−ＬＣ：Ｆ１１６Ｃ）；変異体１１における改変（Ｖ１１；ＨＣ：Ｈ１６８Ｃ−ＬＣ：Ｔ１６４Ｃ）；および変異体１２における改変（Ｖ１２；ＨＣ：Ｆ１２６Ｃ−ＬＣ：Ｓ１２１Ｃ）の場所を示す。天然システインを除去するさらなる改変（−Ｃｙｓ；例えば、ＨＣ：Ｃ２２０Ｖ−ＬＣ：Ｃ２１４Ｖ）は図示しないが、変異体１０〜１２（Ｖ１０〜Ｖ１２）に存在する。 単一の哺乳動物選択マーカーを利用する代表的なＭＢａｂ発現ベクターを示す。図３Ａおよび図３Ｂは２つのカッパまたはラムダ軽鎖の発現用ベクターを示し、図３Ｃは２つの重鎖の発現用ベクターを示す。１つのラムダ鎖および１つのカッパ鎖を発現する別の軽鎖ベクターも容易に作成し得る。このようなベクターを使用して、例えば；カッパ ＷＴ／カッパ Ｖ１２、ラムダ ＷＴ／ラムダ Ｖ１２、カッパ ＷＴ／ラムダ Ｖ１２およびラムダ ＷＴ／カッパ Ｖ１２を含め、多数の組み合わせを作成することができる。各ベクターは、２つの異なる軽鎖または２つの異なる重鎖のいずれを発現することもできる。各鎖は、それ自体のプロモーターを使用して個別に発現させる。各ベクターは、種々の可変領域の迅速クローニングを促進する複数の制限部位を含む。各ベクターはまた、細菌性複製起点、およびＥＢＮＡ配列との組み合わせで哺乳動物系におけるプラスミドの維持および発現の増進に有用であり得るｏｒｉＰ配列に加えて、細菌および哺乳動物の双方の選択マーカーも含む。第１のベクターから２つの軽鎖を発現し、および第２のベクターから２つの重鎖を発現させると、ホモダイマー化重鎖および単一のベクターによる細胞の形質転換によって生じ得る他の望ましくない産物の生成が最小限に抑えられる。例えば、重鎖は典型的には、軽鎖なしには効率的に分泌されず、軽鎖は典型的には、重鎖なしにはプロテインＡクロマトグラフィーで精製することができない。したがってプロテインＡ結合抗体を分泌する任意の細胞が、２つの軽鎖および２つの重鎖を発現する第１および第２のプラスミドの両方を有し得る。 図３Ａと同じ。 図３Ａと同じ。 ＩＬ６／ＲＡＧＥ二重特異的一価抗体（ＭＢａｂ）変異体１０、１１および１２（Ｖ１０、Ｖ１１およびＶ１２）の非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、変異体は各々、分子の抗ＲＡＧＥ部分に代替的な（すなわち再配置された）鎖間ジスルフィド結合を有する。左側のパネルは、実施例１および実施例５に記載されるとおり、抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ ＷＴ（レーン１）；抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ（−Ｃｙｓ）（レーン２）；重鎖抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ Ｖ１０（レーン３）；抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ Ｖ１１（レーン４）；および抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ Ｖ１２（レーン５）の発現用ｐＭＢａｂベクターを形質移入したＨＥＫ２９３Ｆ細胞からの培養上清を示す。各重鎖は、ＨＣヘテロダイマー化を促進するＣＨ３改変を含み、およびＶ１０、Ｖ１１およびＶ１２改変はまた−Ｃｙｓ改変も含んだ。右側のパネルにおいて、矢印は各々、２Ｈ２Ｌ（約１５０ｋＤａ）−２つの各重鎖および２つの軽鎖を有するＩｇＧ；２Ｈ１Ｌ（約１２５ｋＤａ）−軽鎖を欠くＩｇＧ；および１Ｌ（約２５ｋＤａ）−フリーの軽鎖を示す。−Ｃｙｓ変異体は対をなさない軽鎖の産生をもたらし、これは、本明細書に記載されるジスルフィド結合変異体を導入することにより修復され、Ｖ１２が最も効率的なＬＣ／ＨＣペアリングであった。 ＡｌｐｈａＬＩＳＡスクリーンを使用したＩＬ６／ＲＡＧＥ抗体の二重特異性の決定を示す。−Ｃｙｓ変異体は抗ＲＡＧＥ Ｆａｂに鎖間ジスルフィド結合を有しなかった。Ｖ１０、Ｖ１１およびＶ１２変異体は抗ＲＡＧＥ Ｆａｂに代替的な鎖間ジスルフィド結合を有した。Ｖ１２変異体はほぼ１００％の二重特異的ＩｇＧを生じた一方、ＷＴ Ｆａｂでは３０％未満であった。−Ｃｙｓ、Ｖ１０およびＶ１１変異体は、各々中程度の改善を示した（それぞれ約４２％、約４０％、および約３３％）。 図５Ａと同じ。 抗ＩＬ６ ＷＴ／抗ＲＡＧＥ変異体１２（Ｖ１２）一価二重特異的抗体（ＭＢａｂ）および親抗体のＳＥＣおよび光散乱分析を示す。図６Ａは、ＳＥＣ精製した親抗体（左上および右上）およびＳＥＣ精製した抗ＩＬ６ ＷＴ／抗ＲＡＧＥ Ｖ１２ ＭＢａｂ（中央下）のＳＥＣ ＵＶトレースを示す。各トレースから、精製した材料の大部分がモノマーであったことが示された。抗ＲＡＧＥおよび抗ＩＬ６親抗体は、それぞれ２４．６１分および２６．２７分の保持時間を有した一方、抗ＩＬ６ ＷＴ／抗ＲＡＧＥ Ｖ１２ ＭＢａｂは２５．８５の中間の保持時間を有し、これにより、ＭＢａｂがモノマープロファイルを呈し、かつ２つの親の特性を見せたことが示された。図６Ｂは、プロテインＡ精製した抗ＩＬ６ ＷＴ／抗ＲＡＧＥ Ｖ１２ ＭＢａｂのＳＥＣ ＵＶトレース（左側のパネル）および対応する光散乱トレース（右側のパネル）を示し、これから、プロテインＡ精製した材料が、２Ｈ２Ｌを有するインタクトなＩｇＧが約８５％と、１Ｈ１Ｌを有するＩｇＧ（半ＩｇＧ）が約１０％と、凝集物約５％とから構成されたことが示された。 図６Ａと同じ。 抗原Ａ結合用のラムダ軽鎖（抗原Ａ重鎖は、「ＲＦ」置換に加えて「ホール」を含む）と、抗原Ｂ結合用のカッパ軽鎖（抗原重鎖は「ノブ」を含む）とを含むＭＢａｂ−ＲＦ構築物の分析を示す。図７Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（左）分析、レーン１：プロテインＡ精製ＭＢａｂ−ＲＦ非還元、レーン２：プロテインＡ精製ＭＢａｂ−ＲＦ還元、およびプロテインＡ精製ＭＢａｂ−ＲＦのＳＥＣ ＵＶトレース（右）を示す。図７Ｂは、非還元条件下におけるプロテインＡ精製した親抗体およびＭＢａｂ−ＲＦ抗体の移動プロファイルを示す。図７Ｃは、還元条件下のプロテインＡ精製ＭＢａｂ−ＲＦ、抗原Ａ軽鎖（ＬＣ−Ａ）、抗原Ｂ軽鎖（ＬＣ−Ｂ）、抗原Ａ重鎖（ＨＣ−Ａ）、抗原Ｂ重鎖（ＨＣ−Ｂ）の移動プロファイルを示し、移動時間が示される。 図７Ａと同じ。 図７Ａと同じ。 抗原Ａ結合用のラムダ軽鎖（抗原Ａ重鎖は、「ＲＦ」置換に加えて「ホール」を含む）と、抗原Ｂ結合用のカッパ軽鎖（抗原重鎖は「ノブ」を含む）とを含むＬａｍｂｄａＳｅｌｅｃｔ精製したＭＢａｂ−ＲＦ構築物の分析を示す。図８Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（左）分析、レーン１、５：プロテインＡ精製ＭＢａｂ−ＲＦ、レーン２、６：プロテインＡ＋ＬａｍｂｄａＳｅｌｅｃｔ精製ＭＢａｂ−ＲＦ、レーン３、７：ＬａｍｂｄａＳｅｌｅｃｔフロースルー、レーン４、８：プロテインＡ精製親Ｂ；およびプロテインＡ＋ＬａｍｂｄａＳｅｌｅｃｔ精製ＭＢａｂ−ＲＦのＳＥＣ ＵＶトレース（右）を示す。図８Ｂは、還元条件下におけるＬａｍｂｄａＳｅｌｅｃｔフロースルーの移動プロファイルを示す。図８Ｃは、還元条件下のプロテインＡ＋ＬａｍｂｄａＳｅｌｅｃｔ精製ＭＢａｂ−ＲＦ、抗原Ａ軽鎖（ＬＣ−Ａ）、抗原Ｂ軽鎖（ＬＣ−Ｂ）、抗原Ａ重鎖（ＨＣ−Ａ）、抗原Ｂ重鎖（ＨＣ−Ｂ）の移動プロファイルを示し、移動時間が示される。 図８Ａと同じ。 図８Ａと同じ。 Ｏｃｔｅｔ分析により決定されるときの、抗ＩＬ６ ＷＴ／抗ＲＡＧＥ変異体１２一価二重特異的抗体（ＩＬ６／ＲＡＧＥ Ｖ１２ ＭＢａｂ）の二重特異性を示す。図９Ａは、抗体捕捉（１０マイクログラム／ｍｌ）部分、ベースライン、ならびにＲＡＧＥ結合およびＩＬ６結合部分を含む全トレースを示す。図９Ｂは、トレースのベースライン、ＲＡＧＥおよびＩＬ６結合部分の拡大を示す。２つの親抗体が、それらの特異的抗原の結合に応答した単一のシグナル増加を示した一方、抗ＩＬ６ ＷＴ／抗ＲＡＧＥ Ｖ１２ ＭＢａｂはＲＡＧＥおよびＩＬ６の両方に応答したシグナル増加を示し、これにより二重特異性および同時的な抗原結合が実証された。抗ＩＬ６ ＷＴ／抗ＲＡＧＥ Ｖ１２ ＭＢａｂは、２つの親抗体の同時発現と、続くＩＬ−６およびＲＡＧＥアフィニティーカラムでの連続アフィニティー精製により生じる２回精製二重特異的抗体と同一の同時結合プロファイルを有した。 図９Ａと同じ。 抗ＩＬ６／抗ＲＡＧＥ Ｖ１２ ＭＢａｂおよび親抗体の結合キネティクスを示す。ＩＬ６（図１０Ａ）およびＲＡＧＥ（図１０Ｂ）に対する抗ＩＬ６ ＷＴ／抗ＲＡＧＥ Ｖ１２ ＭＢａｂの結合親和性を親抗体（抗ＩＬ６および抗ＲＡＧＥ）に匹敵した。 図１０Ａと同じ。 抗ＥＧＦＲ ＷＴ／抗ＨＥＲ２変異体１２一価二重特異的抗体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂ）の発現および分析を示す。図１１Ａは、右側にＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂの非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、左側にＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂの概略図を示す。矢印は、２Ｈ２Ｌ（約１５０ｋＤａ）−２つの重鎖と２つの軽鎖とを有するＩｇＧ、および１Ｈ１Ｌ（約７５ｋＤａ）−１つの重鎖と１つの軽鎖とを有する半ＩｇＧを指し示す。図１１Ｂは、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂのＳＥＣ分析を示す。ＳＥＣ前、プロテインＡ精製した材料は、約９０％のモノマー、約１０％の半ＩｇＧおよび３％未満の凝集物というＳＥＣプロファイルを有した（上側パネル）。分取ＳＥＣ後、モノマーＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂが試料の９９％超となった（下側パネル）。図９Ｃは、ＳＥＣ精製した親抗体（左上および右上）およびＳＥＣ精製した抗ＥＧＦＲ ＷＴ／抗ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂ（中央下）のＳＥＣ ＵＶトレースを示す。いずれも大部分がモノマーであった。抗ＥＧＦＲおよび抗ＨＥＲ２親抗体はそれぞれ８．７４５分および８．８９９分の保持時間を有した一方、抗ＥＧＦＲ ＷＴ／抗ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂは８．８５７の中間の保持時間を有し、これにより、ＭＢａｂが２つの親の中間の特性を見せたことが示された。図９Ｄは、抗ＥＧＦＲ ＷＴ／抗ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂおよび親抗体の光散乱トレースのオーバーレイを示し、これにより、抗ＥＧＦＲ ＷＴ／抗ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂがモノマー抗体についての約１５０ｋＤａの予想分子質量を有したことが示された。 図１１Ａと同じ。 図１１Ａと同じ。 図１１Ａと同じ。 Ｏｃｔｅｔ分析（捕捉フォーマットＩ）により決定されるときの、抗ＥＧＦＲ ＷＴ／抗ＨＥＲ２ Ｖ１２一価二重特異的抗体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂ）の二重特異性を示す。図１２Ａは、抗体捕捉（２０マイクログラム／ｍｌ）部分、ベースライン、ならびにＨＥＲ２結合およびＥＧＦＲ結合部分を含む全トレースを示す。図１２Ｂは、トレースのベースライン、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲ結合部分の拡大を示す。２つの親抗体は、それらの特異的抗原の結合に応答した単一のシグナル増加を示した一方、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂはＨＥＲ２およびＥＧＦＲの両方に応答したシグナル増加を示し、これにより二重特異性および同時的な抗原結合が実証された。ＨＥＲ２またはＥＧＦＲのいずれにも結合しないＮＭＧＣを陰性対照抗体として使用した。 図１２Ａと同じ。 Ｏｃｔｅｔ分析（捕捉フォーマットＩＩ）により決定されるときの、抗ＥＧＦＲ ＷＴ／抗ＨＥＲ２ Ｖ１２一価二重特異的抗体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂ）の二重特異性を示す。図１３Ａは、ＥＧＦＲ抗原上の抗体捕捉、ベースライン、およびＨＥＲ２抗原結合部分を含む全トレースを示す。図１３Ｂは、ＨＥＲ２抗原上の抗体捕捉、ベースライン、およびＥＧＦＲ抗原結合部分を含む全トレースを示す。２つの親抗体は、それらの特異的抗原の結合に応答した単一のシグナル増加を示した一方、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂはＨＥＲ２およびＥＧＦＲの両方に応答したシグナルの増加を示し、これにより二重特異性および同時的な抗原結合が実証された。 図１３Ａと同じ。 示差走査熱量測定分析を用いた熱安定性試験を示す。図１４Ａは、抗ＨＥＲ２（抗ＨＥＲ２；左上）および抗ＥＧＦＲ（抗ＥＧＦＲ；右下）のサーモグラムを示す。抗ＨＥＲ２サーモグラムは２つの転移を示した；Ｆａｂは極めて安定しており、そのＴＭは約８１℃のＣＨ３のＴＭと重なり、ＣＨ２は約６９℃のＴＭを有した。抗ＥＧＦＲサーモグラムは４つの転移を示した。図１１Ｂは、抗ＥＧＦＲ ＷＴ／抗ＨＥＲ２変異体１２一価二重特異的抗体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂ）のサーモグラムを示す。ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂサーモグラムのデコンボリューション（左上）から４つの転移が明らかとなった；約６０℃での転移はセツキシマブ抗ＥＧＦＲ可変ドメインに対応し、約７３℃での転移はセツキシマブ抗ＥＧＦＲ ＣＨ１およびＣｋドメインに対応し、約７０℃での転移はＣＨ２およびＣＨ３（ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ））ドメインに対応し、約８１℃での転移は、代替的なジスルフィド結合を有するＭＢａｂ中の遺伝子操作された抗ＨＥＲ２ Ｆａｂに対応した。この対応はサーモグラムのオーバーレイによっても示される（右下）。 図１４Ａと同じ。 フローサイトメトリー分析により決定されるときの、抗ＥＧＦＲ ＷＴ／抗ＨＥＲ２変異体１２一価二重特異的抗体（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂ）の細胞結合特性を示す。抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂは、標的が特定の細胞型に顕著であった親抗体と同様、種々のレベルのＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を発現する細胞に結合した。図１５Ａは、Ａ４３１表皮細胞（左）およびＢｘＰＣ−３膵臓細胞（右）との結合を示す。これらの細胞はより高レベルのＥＧＦＲを発現し、かつより低レベルのＨＥＲ２を発現する。図１５Ｂは、ＳＫＢＲ−３乳房細胞（左）およびＳＫ−ＯＶ−３卵巣細胞（右）との結合を示す。これらの細胞はより高レベルのＨＥＲ２を発現し、かつより低レベルのＥＧＦＲを発現する。抗Ｈｕ ＩｇＧ Ｆｃ ＦＩＴＣを検出用の二次抗体として用いた。ＨＥＲ２またはＥＧＦＲと結合しないＮＭＧＣを陰性対照抗体として用いた。標的発現レベルを表に示す。 図１５Ａと同じ。 成長阻害アッセイにより決定されるときの、抗ＥＧＦＲ ＷＴ／抗ＨＥＲ２変異体１２一価二重特異的抗体（抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂ）の細胞傷害特性を示す。抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂは、親抗体の組み合わせが複数の細胞型において細胞成長を阻害したのと同じ程度に細胞成長を阻害した。Ａ４３１およびＢｘＰＣ−３細胞で認められるとおり、ＥＧＦＲレベルがＨＥＲ２レベルと同程度かまたはそれより高い場合に、相加的殺傷効果が実現した。図１６Ａは、Ａ４３１表皮細胞（上）およびＢｘＰＣ−３膵臓細胞（下）の成長阻害を示す。これらの細胞はより高レベルのＥＧＦＲを発現し、かつより低レベルのＨＥＲ２を発現する。図１６Ｂは、ＳＫ−ＯＶ−３卵巣細胞（下）およびＳＫＢＲ−３乳房細胞（上）の成長阻害を示す。これらの細胞はより高レベルのＨＥＲ２を発現し、かつ低レベルのＥＧＦＲを発現する。抗Ｈｕ ＩｇＧ Ｆｃ ＦＩＴＣを検出用の二次抗体として用いた。ＨＥＲ２またはＥＧＦＲと結合しないＮＭＧＣを陰性対照抗体として用いた。標的発現レベルを表に示す。図１６Ｃは、折れ線グラフとしてプロットし直したＡ４３１細胞の阻害データを示す。 図１６Ａと同じ。 図１６Ａと同じ。 ＦｃγＲＩＩＩａおよびＣ１ｑ結合ならびにＡＤＣＣ活性を示す。図１７Ａは、直接ＥＬＩＳＡを用いた、精製抗ＥＧＦＲ ＷＴ／抗ＨＥＲ２変異体１２一価二重特異的抗体（抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ Ｖ１２ ＭＢａｂ）および親抗体とＦｃγＲＩＩＩａ（左上）およびＣ１ｑ（右下）との結合を示す。図１７Ｂは、Ａ４３１細胞を使用した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）試験を示す。ＭＢａｂは、親抗体による併用処置と同程度に特異的ＡＤＣＣ活性を誘発した。対照抗体ＮＭＧＣおよび親の抗ＨＥＲ２はＡＤＣＣ活性を示さなかったが、親の抗ＥＧＦＲは強力なＡＤＣＣ活性を示した。−ＫＣアッセイは、キラー細胞を除く全てのアッセイ成分を含んだ。 図１７Ａと同じ。 ＭＢａｂ活性を調節する親和性／アビディティの役割を表す図を示す。上のパネルは、高いＭＢａｂ濃度ではアビディティ効果が機能するようにならず、したがって受容体との結合は高親和性結合ドメインによって媒介され、ひいては受容体架橋／活性化がないことを示す。下のパネルは、低いＭＢａｂ濃度ではアビディティ効果が機能するようになり、したがって受容体との結合が両方の結合ドメインによって媒介され、受容体架橋／活性化がもたらされることを示す。 ホモダイマー化または受容体架橋が望ましくない場合および／または両方の抗原が選択的に標的細胞／組織に限定されている場合のＭＢａｂの応用を表す図を示す。左側のパネルは、ホモダイマー化を誘発するには不十分な非標的細胞に対するＭＢａｂの低アビディティ一価結合を示す。右側のパネルは、標的細胞上の両方の抗原に対する同時的なＭＢａｂのより高いアビディティの二価結合を示す。二価結合は、２つの標的に同時に結合することにより標的細胞との選択的結合を増強することができ、受容体ダイマー化を増強し得る。 ＭＢａｂの選択的結合および選択性（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）の改善を示す。図２０Ａは、細胞表面抗原ＣおよびＤを発現する細胞に対するＣ／Ｄ特異的ＭＢａｂの同時結合を実証するために用いられる生物学的検出アッセイの図を示す。図２０Ｂ、左側のパネルは、Ｃ抗原（Ｃ細胞、三角）、Ｄ抗原（Ｄ細胞、四角）またはＣ抗原およびＤ抗原の両方（Ｃ／Ｄ細胞、丸）を発現する細胞に対する親の抗Ｃ抗体（白抜き記号）および抗Ｄ抗体（陰影付き記号）の結合曲線を示す。図２０Ｂ、右側のパネルは、Ｃ抗原（Ｃ細胞、三角）、Ｄ抗原（Ｄ細胞、四角）またはＣ抗原およびＤ抗原の両方（Ｃ／Ｄ細胞、丸）を発現する細胞に対するＣ／Ｄ−ＭＢａｂの結合曲線を示す。図２０Ｃは、Ｃ抗原（Ｃ細胞、三角）、Ｄ抗原（Ｄ細胞、四角）またはＣ抗原およびＤ抗原の両方（Ｃ／Ｄ細胞、丸）を発現する細胞に対するＣ／Ｄ−ＭＢａｂ結合と、続く標識組換えＤタンパク質（ｒＤ、左側のパネル）または標識組換えＣタンパク質（ｒＣ、右側のパネル）の結合の結合曲線を示す。 図２０Ａと同じ。 図２０Ａと同じ。 Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））において説明されるＫａｂａｔインデックスによる当分野において公知のいくつかの代表的な軽鎖可変領域（抗ＣＤ５２；抗ＨＥＲ２；抗ＶＥＧＦ；および抗ＥＧＦＲ）のアミノ酸配列およびナンバリングを示す。ＣＤＲ領域に陰影を付し、および以下に記載するとおり、ナンバリングスキーム中における可能な挿入位置を、短剣符（†）および二重短剣符（‡）によって示す。対応する重鎖可変領域については図２３Ａおよび図２３Ｂを参照のこと。 図２１Ａと同じ。 Ｋａｂａｔ（前掲）において説明されるＥＵインデックスによるＩｇＧ軽鎖定常領域（カッパおよびラムダ）のアミノ酸配列およびナンバリングを示す。カッパと異なるラムダ鎖残基に陰影を付し、既知の対立遺伝子変異部位をアスタリスク（＊）によって示す。 Ｋａｂａｔ（前掲）において説明されるＫａｂａｔインデックスによる当分野において公知のいくつかの代表的な重鎖可変領域（抗ＣＤ５２；抗ＨＥＲ２；抗ＶＥＧＦ；および抗ＥＧＦＲ）のアミノ酸配列およびナンバリングを示す。ＣＤＲ領域に陰影を付し、および以下に記載するとおり、ナンバリングスキーム中におけるさらなる可能な挿入位置を二重短剣符（‡）によって示す。対応する軽鎖可変領域については図２１Ａおよび図２１Ｂを参照のこと。 図２３Ａと同じ。 Ｋａｂａｔ（前掲）において説明されるＥＵインデックスによるＩｇＧ重鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）のアミノ酸配列およびナンバリングを示す。図２４Ａ〜図２４Ｂは、ＣＨ１領域およびヒンジ領域のアミノ酸配列およびナンバリングを示す。図２４Ｃは、ＣＨ２領域のアミノ酸配列およびナンバリングを示す。図２４Ｄは、ＣＨ３領域のアミノ酸配列およびナンバリングを示す。ＩｇＧと異なる残基に陰影を付し、既知の対立遺伝子変異部位をアスタリスク（＊）によって示す。 図２４Ａと同じ。 図２４Ａと同じ。 図２４Ａと同じ。

本明細書には、以下にさらに十分に考察するとおり、遺伝子操作された抗体であって、１つ以上の鎖間システインが再配置されており、一部の態様では、それによりＨＣ−ＬＣ界面における鎖間ジスルフィド結合の再配置がもたらされる抗体が提供される。一部の態様において、これは、抗体中の１つの重鎖および対応する軽鎖の改変を伴い、これにより天然システインが非システインアミノ酸により置換され、かつ天然非システインアミノ酸がシステインアミノ酸により置換される。一部の態様において、本明細書に提供される抗体は二重特異性であり、これはすなわち、それらの抗体が異なる抗原および／またはエピトープ特異性を有する可変ドメインを含むことを意味する。ある態様において、所与の抗体の改変された重鎖および軽鎖の二重鎖が、ある抗原特異性を有する可変ドメインを含み、かつ同じ抗体中の改変されていない重鎖および軽鎖の二重鎖が、異なる抗原特異性を有する可変ドメインを含む。二重特異的抗体の生成方法は公知である。しかしながら、かかる方法は、多くの場合に多数の可能な抗体の形成によって制限され、そうした抗体には重鎖と軽鎖との正しくないペアリングの組み合わせがいくつか含まれ得る。かかるミスペアリングは生成効率を低下させ得る。他の方法は共通の軽鎖を使用する必要があるため、一方または両方の可変ドメインの親和性に影響がおよび得るか、またはｓｃＦｖの使用に頼るため、同様に親和性に影響がおよび得るとともに、さらに安定性が低く、潜在的に免疫原性の構造である。他の方法は、ジスルフィド結合を全て取り除き、重鎖および軽鎖の両方に多数の突然変異を導入して鎖の静電相互作用を変化させる必要があり、これは安定性を低下させ、得られる分子の免疫原性を増加させ得る。本明細書に提供される改変重鎖および改変軽鎖は、互いに選択的にハイブリダイズして好ましい二重特異的一価抗体構築物を生成することにより、これらの制限を解消する。本明細書に提供されるＢＭａｂは関与する突然変異の数が限られているため、容易に生成され、安定しており、かつ非免疫原性であるかまたは免疫原性が低い可能性が高い。

用語
本明細書に提供される方法は、多くの場合に特定の組成物またはプロセス工程に限定されず、従って変更し得る。また、本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に文脈上明確に示されない限り複数の指示対象を含む。用語「ａ」（または「ａｎ」）、ならびに用語「１つ以上」、および「少なくとも１つ」は、本明細書では同義的に使用することができる。

本明細書において使用される用語「約」は、基礎となるパラメータの１０％（すなわちプラスまたはマイナス１０％）の範囲内の値を指し、一連の値の先頭における用語「約」の使用は、値のそれぞれを修飾する（すなわち、「約１、２および３」は、約１、約２および約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の重量には、重量９０グラム〜１１０グラムが含まれ得る。さらに、値のリストが本明細書に記載されるとき（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）、そのリストには、それらの全ての中間値および小数値（例えば、５４％、８５．４％）が含まれる。

さらに、「および／または」は、本明細書において使用される場合、２つの具体的な特徴または構成要素の各々の、他方を伴うまたは伴わない具体的な開示として意図される。したがって、本明細書における「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句において使用される用語「および／または」は、以下の態様の各々を包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、この技術が関連する分野において通常理解されている意味と同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；および ｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓが、本明細書で用いられる用語の多くの一般的辞書を提供する。

単位、接頭語、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められた形式で表される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。特に指示されない限り、アミノ酸配列はアミノからカルボキシに向かって左から右に書かれる。本明細書に提供される見出しは本明細書における技術の種々の態様または実施形態を限定するものではなく、本明細書を全体として参照することにより理解することができる。したがって、このすぐ後に定義する用語は、本明細書を全体として参照することにより、さらに完全に定義される。

態様または実施形態が本明細書において用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いて記載される場合は常に、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の用語で記載される他の点では類似の態様または実施形態もまた提供されることが理解される。

多くの場合にアミノ酸は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）が推奨する一般に知られる三文字記号または一文字記号によって参照される。多くの場合にヌクレオチドも同様に、一般に認められた一文字コードによって参照される。

用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内にある少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、他のハプテン、または前述のものの組み合わせを認識し、それに特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書において使用される用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、免疫グロブリンとしても知られ、その抗体が所望の生物活性を呈する限りにおいて、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合ドメインを含む多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科動物抗体、キメラ抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む任意の他の改変免疫グロブリン分子を包含する。特に、抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち少なくとも１つの抗原結合部位を含む分子が含まれる。免疫グロブリン分子は任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、サブアイソタイプ／サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはアロタイプ（例えば、Ｇｍ、例えば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａまたはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、またはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、およびＫｍ（１、２または３））であってよい。抗体は、限定されるものではないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなどを含む任意の哺乳動物、または他の動物、例えばトリ（例えばニワトリ）に由来し得る。抗体はネイキッドであっても、または他の分子、例えば毒素、放射性同位元素等とコンジュゲートされていてもよい。

抗体の「可変領域」は、単独での、あるいは組み合わせでの、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域は、各々、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＷ）からなる。各鎖のＣＤＲはこれらのＦＷ領域によって近接して一体に保持され、他方の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。抗体の可変ドメイン、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）中のアミノ酸のナンバリングは、特に指定のない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）において説明される、本明細書では「Ｋａｂａｔインデックス」または「Ｋａｂａｔナンバリング」とも呼ばれるＫａｂａｔ定義に従う。このナンバリング体系を使用すると、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮またはそれへの挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２後のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）および重鎖ＦＲ残基８２後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。

残基のＫａｂａｔナンバリングは、「標準的」Ｋａｂａｔナンバリング配列との抗体の配列の相同性の領域におけるアラインメントにより所与の抗体について決定することができる。フレームワーク残基の最大アラインメントは、Ｆｖ領域に使用するためにナンバリング体系中の「スペーサー」残基の挿入を要求することが多い。さらに、任意の所与のＫａｂａｔ部位番号におけるある個々の残基の同一性は、種間またはアレル多様性に起因して抗体鎖間で変動し得る。本明細書全体を通じて用いられるとおりの、記載されるＶＬおよびＶＨ ＣＤＲ配列は、表１に提供するとおりの古典的Ｋａｂａｔナンバリング位置に対応し、それに従い介在するフレームワーク領域がナンバリングされる。図１５Ａ、図１５Ｂ、図１７Ａおよび図１７Ｂは、いくつかの代表的な抗体の可変領域（フレームワークおよびＣＤＲ）のＫａｂａｔナンバリングを提供する。

本明細書において使用されるとき、Ｆｃ領域（本明細書では単純に「Ｆｃ」とも称される）は、１番目の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。したがってＦｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、およびＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、またこれらのドメインに対する柔軟なヒンジＮ末端も含み得る。ＩｇＡおよびＩｇＭでは、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧでは、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジの少なくとも一部分を含む。Ｆｃは、この領域を独立して指し得るか、または抗体、抗体断片、もしくはＦｃ融合タンパク質との関連においてこの領域を指し得る。Ｆｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むものと定義され、ここでナンバリングはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））において説明されるＥＵインデックスによる。カッパおよびラムダ軽鎖定常領域のナンバリングについては図２２を参照、およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の重鎖定常領域のナンバリングについては図２４Ａ〜図２４Ｄを参照されたく、定常領域のナンバリングは全て、Ｋａｂａｔにおいて説明されるＥＵインデックスによる。限定されるものではないが、ＥＵインデックスによりナンバリングされる位置２７０、２７２、３１２、３１５、３５６、および３５８を含めた複数の異なるＦｃ部分に多型が認められており、したがって示される配列と先行技術の配列との間には僅かな違いがあり得る。

抗体
抗体は、特異的抗原に結合する免疫学的タンパク質である。ほとんどの哺乳動物、例としてヒトおよびマウスにおいて、抗体が重および軽ポリペプチド鎖のペアから構築される。それぞれの鎖は、可変（Ｆｖ）および定常（Ｆｃ）領域と称される２つの区別される領域から構成される。軽鎖および重鎖Ｆｖ領域は、分子の抗原結合決定基を含有し、標的抗原の結合を担う。Ｆｃ領域は、抗体のクラス（またはアイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ）を定義し、重要な生化学的イベントを誘発するための多数の天然タンパク質の結合を担う。

それぞれの軽鎖は、１つの共有結合性のジスルフィド結合により重鎖に結合している。２つの軽鎖−重鎖ダイマーが重鎖間のジスルフィド架橋を介して結合して、Ｙ字型の分子を形成する。重鎖間のジスルフィド結合の数は、種々の免疫グロブリンアイソタイプの間で異なり得る。Ｙ字のアームがステムに合流する領域はヒンジ領域と呼ばれ、いくらかのフレキシビリティを示す。

それぞれの鎖は、抗体クラスを代表する定常領域およびそれぞれの抗体に特異的な可変領域を含む。定常領域は、抗原を破壊するために使用される機構を決定する。抗体は、それらの定常領域構造および免疫機能に基づき５つの主要なクラス、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥに分類される。軽鎖および重鎖の両方の可変および定常領域は、ドメインと呼ばれる機能ユニットに構造的に折りたたまれている。それぞれの軽鎖は、一端部における１つの可変ドメイン（ＶＬ）およびその他端部における１つの定常ドメイン（ＣＬ）からなる。それぞれの重鎖は、一端部において可変ドメイン（ＶＨ）に続く３または４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）を有する。

Ｙのアームは、抗原に結合し、Ｆａｂ（断片、抗原結合）領域と呼ばれる部位を含有する。これは、抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖からの１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインから構成される。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと協調しており、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと協調している。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づきラムダ鎖またはカッパ鎖として分類される。カッパ軽鎖の可変ドメインは、本明細書においてＶＫと示すこともできる。

抗体のＦｃ領域は、多数のリガンド、例としてＦｃ受容体および他のリガンドと相互作用し、エフェクター機能と称される一連の重要な機能的能力を付与する。ＩｇＧクラスのＦｃ受容体の重要なファミリーは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は、抗体および免疫系の細胞アームの間のコミュニケーションを媒介する。ヒトにおいて、このタンパク質ファミリーには、ＦｃγＲＩ（ＣＩＤ６４）、例として、アイソフォームＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、およびＦｃγＲＩＣ；ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、例として、アイソフォームＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣ；ならびにＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、例として、アイソフォームＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢが含まれる。これらの受容体は、典型的には、Ｆｃへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内の一部のシグナリングイベントを媒介し得る細胞内ドメインを有する。これらの異なるＦｃγＲサブタイプは、異なる細胞型上で発現される。例えば、ヒトにおいては、ＦｃγＲＩＩＩＢは、好中球上にのみ見出される一方、ＦｃγＲＩＩＩＡはマクロファージ、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＴ細胞のサブ集団上に見出される。

Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、エフェクター細胞を結合した抗原の部位にリクルートし、典型的には、細胞内のシグナリングイベントならびにその後の重要な免疫応答、例えば、炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞傷害性攻撃をもたらす。細胞傷害性および食作用性エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的化された細胞を破壊する潜在的な機構である。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と称される。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩＡのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。

別の重要なＦｃリガンドは、補体タンパク質Ｃ１ｑである。Ｃ１ｑへのＦｃ結合は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）と呼ばれるプロセスを媒介する。Ｃ１ｑは６つの抗体に結合し得るが、補体カスケードを活性化するためには２つのＩｇＧへの結合で十分である。Ｃ１ｑは、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓセリンプロテアーゼと複合体を形成して補体経路のＣ１複合体を形成する。

抗体のいくつかの重要な特徴、例として、限定されるものではないが、標的についての特異性、免疫エフェクター機構を媒介する能力、および血清中の長い半減期により、抗体および関連する免疫グロブリン分子は強力な治療剤になる。抗体が腫瘍細胞を破壊する多数の可能性のある機構、例として、必要とされる成長経路の遮断を介する抗増殖、アポトーシスをもたらす細胞内シグナリング、下方調節および／もしくは受容体のターンオーバーの向上、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ならびに適応的免疫応答の促進が存在する。

本明細書に提供される抗体には、完全長またはインタクト抗体、抗体断片、天然配列抗体またはアミノ酸変異体、ヒト、ヒト化、翻訳後修飾、キメラまたは融合抗体、免疫コンジュゲート、およびそれらの機能性断片が含まれる。一部の態様において、抗体は、Ｆｃ領域において改変されていてよく、ある改変は、所望のエフェクター機能または血清半減期を提供し得る。以下のセクションにより詳細に考察されるとおり、適切なＦｃ領域を用いると、細胞表面上に結合している裸抗体は、例えば、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）において補体をリクルートすることにより、もしくは標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）もしくは一部の他の機構における標的細胞の食作用を引き起こす１つ以上のエフェクターリガンドを発現する非特異的細胞傷害性細胞をリクルートすることにより細胞傷害を誘導し得る。エフェクター機能を排除しまたは低減させて副作用または治療合併症を最小化することが望まれる場合、ある他のＦｃ領域を使用することができる。抗体のＦｃ領域を修飾してＦｃＲｎについての結合親和性を増加させ、したがって血清半減期を増加させることができる。あるいは、Ｆｃ領域をＰＥＧまたはアルブミンにコンジュゲートさせて血清半減期を増加させ、または所望の効果をもたらす一部の他のコンジュゲーション。

ある態様において、本明細書における抗体は、単離および／または精製された、および／または発熱物質不含の抗体である。本明細書において使用される用語「精製された」は、天然環境の構成成分から同定、分離および／または回収された目的の分子を指す。したがって、一部の態様において、本明細書で提供される抗体は、その天然環境の１つ以上の構成成分から分離された精製された抗体である。本明細書において使用される用語「単離された抗体」は、異なる構造または抗原特異性を有する他の抗体分子を実質的に含まない抗体を指す。二重または多重特異的抗体分子は、他の抗体分子を実質的に含まない単離された抗体である。したがって、一部の態様において、提供される抗体は、異なる特異性を有する抗体から分離された単離された抗体である。単離された抗体は、モノクローナル抗体であり得る。しかしながら、標的のエピトープ、アイソフォームまたは変異体に特異的に結合する単離された抗体は、例えば、他の種からの他の関連抗原（例えば、種相同体）に対する交差反応性を有し得る。提供される単離された抗体は、１つ以上の他の細胞材料を実質的に含まないものであり得る。一部の態様において、「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせが提供され、その組み合わせは異なる特異性を有する抗体に関し、規定された組成物中で組み合わせられる。抗体の生成および精製／単離方法は、本明細書に別に記載する。

提供される単離された抗体は、任意の好適なポリヌクレオチドによりコードされ得る本明細書に開示される抗体アミノ酸配列を含む。単離された抗体は、製剤化形態で提供されることもある。一部の態様において、抗体は１つ以上のタンパク質に結合し、それにより少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性、例えば細胞増殖活性を部分的または実質的に変化させる。

ヒト化抗体
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合することが可能であって、かつ実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するフレームワーク領域と、実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む抗体またはその変異体またはそれらの断片である。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、多くの場合に抗体の中で最も可変的な領域であり、特定の抗原に対する抗体の親和性および特異性を決定する。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のものに対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、典型的には、ヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含み得る。抗体は、軽鎖および重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有し得る。抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域も含み得る。

ヒト化抗体は、免疫グロブリンの任意のクラス、例としてＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥ、ならびに任意のアイソタイプ、例としてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択することができる。通常、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞傷害活性を示し、そのクラスが典型的にはＩｇＧ１であることが望ましい補体固定定常ドメインである。このような細胞傷害活性が望まれない場合、定常ドメインはＩｇＧ２またはＩｇＧ４クラスのものであり得る。ヒト化抗体は、２つ以上のクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含むことができ、特定の定常ドメインを選択して所望のエフェクター機能を最適化する方法は、当分野において公知である。

ヒト化抗体のフレームワークおよびＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応する必要はなく、例えばドナーＣＤＲまたはコンセンサスフレームワークは、その部位におけるＣＤＲまたはフレームワーク残基がコンセンサス抗体にもインポート抗体にも対応しないように少なくとも１つの残基の置換、挿入または欠失により突然変異させることができる。しかしながら、このような突然変異は、広範囲でなくてよい。ヒト化抗体残基の少なくとも７５％が、親フレームワーク領域（ＦＲ）およびＣＤＲ配列のものに対応し得、対応性は、例えば、９０％以上または９５％以上であることもある。

ヒト化は、当分野において公知の方法に従って、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列について置換することにより本質的に実施することができる。具体的には、ヒト化抗体は、当分野において公知の方法、例としてＣＤＲグラフティングアプローチ、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）、鎖シャフリング戦略、分子モデリング戦略などにより調製することができる。これらの一般的アプローチは、標準的な突然変異導入および組換え合成技術と組み合わせて所望の特性を有する本明細書における抗体を生成することができる。

ＣＤＲグラフティングは、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の１つ以上のＣＤＲを、ドナー抗体（例えば、非ヒト抗体）の１つ以上のＣＤＲにより置き換えることにより実施する。アクセプター抗体は、候補アクセプター抗体およびドナー抗体の間のフレームワーク残基の類似性に基づき選択することができ、さらに修飾して類似残基を導入することができる。ＣＤＲグラフティング後、追加の変更をドナーおよび／またはアクセプター配列において行って抗体結合および機能性を最適化することができる。

短縮ＣＤＲ領域のグラフティングは、関連アプローチである。短縮ＣＤＲ領域は、特異性決定残基および隣接アミノ酸、例として軽鎖の位置２７ｄ〜３４、５０〜５５および８９〜９６におけるもの、ならびに重鎖の位置３１〜３５ｂ、５０〜５８、および９５〜１０１におけるものを含む。特異性決定残基（ＳＤＲ）のグラフティングは、抗体結合部位の結合特異性および親和性がＣＤＲ領域のそれぞれの範囲内の最も高度な可変残基により決定されるという理解を前提とする。利用可能なアミノ酸配列データの分析と組み合わせた抗体−抗原複合体の三次元構造の分析を使用してＣＤＲ内のそれぞれの位置において生じるアミノ酸残基の構造相違性に基づき配列可変性をモデリングした。ＳＤＲと称される接触残基からなる最少免疫原性ポリペプチド配列を同定し、ヒトフレームワーク領域上にグラフティングする。

フレームワーク領域中のフレームワーク残基をＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基により置換して、抗原結合を変化させ、潜在的に改善することができる。これらのフレームワーク置換は当分野において公知の方法により同定され、例えば、ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定し、および配列比較して特定位値における通常でないフレームワーク残基を同定する。

ベニアリングまたはリサーフェシングは、ヒトアミノ酸配列による抗体の溶媒接近可能な外部のリサーフェシングにより齧歯類または他の非ヒト抗体における潜在的に免疫原性のアミノ酸配列を低減させる概念に基づく。したがって、ベニアリングされた抗体は、ヒト細胞とはそれほど異質でないと考えられる。非ヒト抗体は、（１）ヒト抗体のフレームワーク領域中の同一位置のものと異なる非ヒト抗体中の曝露された外部フレームワーク領域残基を同定し、（２）同定された残基を典型的には非ヒト抗体中のそれらの同一位置を占有するアミノ酸により置き換えることによりベニアリングする。

定義により、ヒト化抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同性である一方、鎖の別の一部は、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同性である抗体、およびそのような抗体の断片（それらが所望の生物学的活性を示す限り）である。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、例えばヒヒ、アカゲザルまたはカニクイザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化された」抗体が含まれる。

ヒト抗体
一部の使用、例としてヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイのため、ヒトまたはキメラ抗体を使用することが適切であり得る。完全ヒト抗体は、ヒト対象の治療的処置に望ましいことがある。ヒト抗体は、当分野において公知の種々の方法、例としてヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する下記のファージディスプレイ法により作製することができる。

ヒト抗体は、機能性内因性免疫グロブリンを発現し得ないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを使用して生成することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、マウス胚性幹細胞中にランダムにまたは相同組換えにより導入することができる。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域は、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えてマウス胚性幹細胞中に導入することができる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別個にまたは同時に非機能的とすることができる。特に、ＪＨ領域のホモ接合体欠失は、内因性抗体生成を妨げる。改変された胚性幹細胞を拡張させ、胚盤胞中に微量注入してキメラマウスを生成する。次いで、キメラマウスを交配させてヒト抗体を発現するホモ接合体子孫を生成する。トランスジェニックマウスを選択された抗原、例えば、本明細書における抗体のポリペプチドの全てまたは一部により通常の様式で免疫化する。

抗原に対して指向されたモノクローナル抗体は、慣用のハイブリドーマ技術を使用して免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスにより保有されるヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再構成し、続いてクラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。したがって、このような技術を使用すると、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を生成することが可能である。さらに、Ｍｅｄａｒｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）などの会社は、選択された抗原に対して指向されたヒト抗体を提供する。

「小遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチも当分野において公知である。小遺伝子座アプローチにおいて、外因性Ｉｇ遺伝子座を、Ｉｇ遺伝子座からの小片（個々の遺伝子）の包含を介して模倣する。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ｍｕ定常領域、および通常、第２定常領域（ガンマ定常領域の場合もある）を、動物中への挿入のための構築物中に形成させる。

マイクロセル融合を介して染色体の大片または染色体全体が導入されたマウスからのヒト抗体の生成も、当分野において公知である。例えば、Ｋｉｒｉｎ製ＴｃマウスとＭｅｄａｒｅｘ製小遺伝子座（Ｈｕｍａｂ）マウスとの交雑は、ＫｉｒｉｎマウスのヒトＩｇＨトランス染色体およびＧｅｎｐｈａｒｍマウスのカッパ鎖トランス遺伝子を有するマウスを生成した。

ヒト抗体は、インビトロ法により誘導することもできる。好適な例には、限定されるものではないが、ファージディスプレイ（（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（旧ＣＡＴ）、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（旧Ｐｒｏｌｉｆｅｒｏｎ），Ａｆｆｉｍｅｄ）、リボソームディスプレイ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（旧ＣＡＴ））、酵母ディスプレイなどが含まれる。ファージディスプレイ技術は、ヒト抗体および抗体断片をインビトロで、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから生成するために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を糸状バクテリオファージ、例えばＭ１３またはｆｄのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子中にインフレームでクローニングし、機能性抗体断片としてファージ粒子の表面上でディスプレイする。糸状粒子はファージゲノムの１本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能的特性に基づく選択は、それらの特性を示す抗体コードする遺伝子の選択ももたらす。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、当分野において公知の種々のフォーマットで実施することができる。多様な数々の抗オキサゾロン抗体は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムコンビナトリアルライブラリーから単離されている。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、多様な数々の抗原（例として、自己抗原）に対する抗体を、当分野において公知の技術に従って本質的に単離することができる。ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞により生成することもできる。

多価抗体
典型的には、抗体は二価として特徴付けられ、つまり抗体は、２つの抗原結合部位（すなわちＦ（ａｂ’）２断片の各アームに１つずつ）を含むことを意味する。二価より高い価数の抗体もまた企図される（例えばＦ（ａｂ’）２断片の一方または両方のアームに２つ以上の抗原結合部位）。例えば、三重特異的抗体を調製することができる。したがって、提供される本明細書における抗体は、３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラスのもの以外である）（例えば、四価抗体）であり得、それは抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は、ダイマー化ドメインおよび３つ以上の抗原結合部位を含み得る。一態様において、ダイマー化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはそれらからなる）。この方針において、抗体は、Ｆｃ領域およびＦｃ領域に対する３つ以上の抗原結合部位アミノ末端および／またはカルボキシル末端を含み得る。ある態様において、本明細書における多価抗体は、３から約８つの抗原結合部位を含む（またはそれからなる）。多価抗体は、ポリペプチド鎖が２つ以上の可変ドメインを含む少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含み得、ＶＤ１が第１の可変ドメインであり、ＶＤ２が第２の可変ドメインであり、ＦｃがＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２がアミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎが０または１である。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ−ＣＨ１−フレキシブルリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含み得る。本明細書における多価抗体は、少なくとも２つの軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含み得る。本明細書における多価抗体は、例えば、約２から約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。本明細書において企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、場合によりＣＬドメインをさらに含む。

二重特異的抗体
一部の態様において、本明細書に提供される抗体は二重特異的である。本明細書において使用されるとき、二重特異的抗体は、少なくとも２つの独立した抗原（または標的）または同じ抗原内の異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異的抗体は、標的の２つの異なるエピトープに結合し得るか、または２つの異なる標的に結合し得る。他のこのような抗体は、第１の標的結合部位を別の標的に対する第２の結合部位と組み合わせ得る。ある標的結合アームを、白血球上のトリガー分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えばＣＤ３）、またはＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと組み合わせて、細胞防御機構を標的タンパク質発現細胞にフォーカスおよび局在化させることもある。二重特異的抗体は、抗原を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化させるために使用することもできる。このような抗体は、標的結合アームと、細胞傷害剤（例えばサポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームとを有し得る。

ある場合には、二重特異的抗体は、ただ一つの人造分子の投与で、２つの抗原が同時に標的化されることによって得られる相加的および／または相乗的治療効果を提供する。例えば、抗ＨＥＲ２ ｍＡｂ療法では治療できなかった、中程度のＨＥＲ２発現を伴う乳癌を有する癌患者は、その腫瘍がＥＧＦＲも発現するならば、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲの両方の二重特異的標的化による相乗的治療の利益を受け得る。しかしながら、２つの二価ｍＡｂまたはこれらの２つのｍＡｂの二価二重特異的誘導体による治療は、重度の治療リスクおよび／または毒性リスクをもたらし得る。２つのｍＡｂまたは二価二重特異的抗体が悪性形質転換に関連する２つの受容体と反応することを所与すれば、治療の腫瘍特異性は増加するはずである。しかしながら、併用ｍＡｂ治療または二価二重特異的抗体は抗原の中程度の発現を伴う腫瘍細胞に対して活性であるため、抗原発現が低い何らかの正常組織の存在に起因して、何らかの新しい副作用が生じ得る。これらの組織は単一のｍＡｂには感受性を有しないこともあるが、併用ｍＡｂ治療または二価二重特異的誘導体に対しては感受的となり得る。この潜在的リスクは、アビディティ効果により抗原細胞結合の増強を呈する二価または多価分子ではさらに深刻となり得る。

一部の態様において、本明細書に提供される抗体は一価二重特異的抗体（ＭＢａｂ）である。本明細書に記載される一価二重特異的抗体足場は、その一価の性質によって上述の潜在的な治療リスクを低減する一方で、二重特異的抗体に関連するあらゆる利益を実現する二重特異的抗体生成用の優れたプラットフォームを提供する。さらに、本明細書に提供されるＭＢａｂは容易に発現し、安定しており、かつ免疫原性が低い可能性が高い。本明細書において使用されるとき、用語「一価二重特異的」（「ＭＢａｂ」と略され得る）は、各アームが異なる標的抗原に特異的に結合することができ、かつ異なる標的抗原（ＡおよびＢ）の所与のペアに対し、ＭＢａｂが各１つずつと結合することができる二重特異的抗体を指す。ある態様において、一価二重特異的抗体は、２つの独立した抗原（または標的）または同じ抗原上の２つの独立したエピトープに特異的に結合することができる。典型的には、一価二重特異的抗体は２つの異なる可変領域を含む。一部の態様において、２つの独立した抗原に対する結合親和性はほぼ同じである。一部の態様において、２つの独立した抗原に対する結合親和性は異なる。一部の態様において、同じ抗原上の２つの独立したエピトープに対する結合親和性はほぼ同じである。一部の態様において、同じ抗原上の２つの独立したエピトープに対する結合親和性は異なる。さらに他の態様において、各アームは同じ特異性を有する（例えば、同じ、または重複するエピトープに結合する）が、異なる親和性で結合する。一部の態様において、親和性は３倍以上異なり得る。異なるインビボ力価を有する抗体の可変領域を組み合わせる場合、アームの一方が過剰量または過少量となることを防止するため、より高い親和性の１つのアームと、より低い親和性の１つのアームとを有することが特に望ましいこともある。

ある態様において、ＭＢａｂは、同じ抗原（例えば受容体）上の同じエピトープまたは重複するエピトープに異なる親和性で結合する。特に、同じエピトープまたは重複するエピトープは、抗原がダイマー化されると近接している。このような抗体は、相対濃度に応じた二重特性を有し得る。例えば、高濃度において、ＭＢａｂ濃度が抗原濃度を飽和する場合、高親和性結合ドメインが低親和性結合ドメインと競合してほとんどないし全くアビディティ効果が起こらない。すなわち抗体は主に一価の結合実体として機能し、抗原架橋／シグナル伝達はほとんどないし全く起こらない（図１８を参照のこと）。しかしながら、低濃度ではアビディティ効果が働くようになり、ＭＢａｂは、好ましくは２つの抗原分子上の、両方の結合部位に同時に結合することができるため、抗原架橋／シグナル伝達が生じる（図１８を参照のこと）。このように、抗原シグナル伝達をＭＢａｂ濃度により調節することができる。

ある態様において、ＭＢａｂは２つの異なる抗原（例えば異なる受容体）であって、それらの抗原のホモダイマー化が望ましくない抗原、および／または両方の抗原が非標的細胞／組織上では別々に存在し、かつ標的細胞／組織上では一緒に存在する抗原に結合する。このような抗体は非標的細胞上では１つのアームのみで結合し、非標的細胞／組織に対するＭＢａｂの１つのアームのみのこの低アビディティ一価結合は、ホモダイマー化を誘発するには不十分である（図１９左を参照のこと）。対照的に、ＭＢａｂは標的細胞／組織上では両方の抗原と結合することができ、標的細胞上の両方の抗原と同時に結合するため、より高いアビディティの二価結合がもたらされ、これにより標的細胞に対する選択的結合が増進され、受容体ダイマー化が増進され得る（図１９右を参照のこと）。

一部の態様において、一価二重特異的抗体は追加の結合部位をさらに含む。追加の結合部位は、モノクローナル二重特異的抗体（ＭＢａｂ）の一方または両方の標的抗原（ＡおよびＢ）に特異的であってもよく、および／または追加の標的抗原に特異的であってもよい。一部の態様において、一方または両方の重鎖および／または一方または両方の軽鎖のＮ末端またはＣ末端に１つ以上の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が付加され、ここでこの１つ以上のｓｃＦｖは１つ以上の追加の標的抗原に特異的に結合する。例えば、一価二重特異的抗体（抗原ＡおよびＢに特異的）の一方の鎖（例えば、重鎖または軽鎖）にｓｃＦｖ（抗原Ｃに特異的）を付加することにより、一価三重特異的抗体を作成することができる。この場合、抗体は、抗原Ａ、Ｂ、およびＣに対して一価となり得る。ｓｃＦｖ（抗原Ｃに特異的）が２つの鎖（例えば両方の重鎖、両方の軽鎖、一方の重鎖と一方の軽鎖）に付加される場合、この三重特異的抗体は抗原ＡおよびＢに対して一価、および抗原Ｃに対して二価となり得る。本明細書における一価二重特異的抗体には、追加の結合部位の任意の可能な組み合わせが企図される（例えば、Ｄｉｍａｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００９）３９３：６７２−６９２を参照のこと）。追加の結合部位の結合親和性はＭＢａｂの一方もしくは両方のアームとほぼ同じであってもよく、またはＭＢａｂの一方もしくは両方のアームと異なってもよいことが企図される。上記のとおり、相対的な親和性は、抗原および分子の目的の用途に応じて選択または調整することができる。

二重特異的抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異的抗体）として調製することができる。完全長二重特異的抗体の慣習的生成は、２つの鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの同時発現に基づく。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムなアソートメントのため、それらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１つのみが正確な二重特異的構造を有する１０個の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成する。通常、親和性クロマトグラフィー工程により行う正確な分子の精製は、かなり煩雑であり、生成物収率が低い場合がある。

二重特異的抗体には、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方をアビジンと、他方をビオチンとカップリングすることができる。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を用いて作製することができる。しかしながらこの方法は、典型的には、高い免疫原性の可能性を有し得る非ヒトタンパク質を使用する必要がある。さらに、抗体断片はエフェクター機能をほとんどまたは全く有さず、半減期が短いこともある。

二重特異的抗体は、化学的結合を用いて調製することができる。一手順において、インタクトな抗体をタンパク質分解で開裂させてＦ（ａｂ’）２断片を生成する。これらの断片をジチオール錯形成剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元してビシナルなジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を妨げる。次いで、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方を、メルカプトエチルアミンによる還元によりＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異的抗体を形成する。しかしながらこの方法は、多くの場合に収率が低く、制御が困難で、かつ生成物は高い免疫原性の可能性を有し得る。さらに、抗体断片はエフェクター機能をほとんどまたは全く有さず、半減期が短いこともある。

Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収することができ、それを化学的にカップリングさせて二重特異的抗体を形成することができる。完全ヒト化二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子は、それぞれのＦａｂ’断片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から別個に分泌させ、インビトロで指向化学カップリングに供して二重特異的抗体を形成することにより作出できる。しかしながらこの方法は、多くの場合に収率が低く、かつ制御が困難である。さらに、抗体断片はエフェクター機能をほとんどまたは全く有さず、半減期が短いこともある。

二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して生成することもできる。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域において還元してモノマーを形成し、次いで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法は、抗体ホモダイマーの生成に利用することもできる。記載の「ダイアボディ」技術は、二重特異的抗体断片を作製する追加の機構を提供している。断片は、短すぎて同一鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能とできないリンカーによりＶＬに連結しているＶＨを含む。したがって、１つの断片のＶＨおよびＶＬドメインを別の断片の相補的ＶＬおよびＶＨドメインとペアリングさせ、それにより２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦＶ）ダイマーの使用により二重特異的抗体断片を作製する別の戦略も当分野において公知である。しかしながらこの方法は、多くの場合に収率が低く、制御が困難で、かつ生成物は高い免疫原性の可能性を有し得る。さらに、抗体断片はエフェクター機能をほとんどまたは全く有さず、半減期が短いこともある。

二重特異的抗体はまた、重鎖ヘテロダイマー化方法を用いて生成してもよい。かかる方法には、「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ ｉｎ ｈｏｌｅ）」法および鎖交換遺伝子操作ドメイン（ＳＥＥＤ）法、およびＦｃダイマー界面にわたる電荷極性を変化させる方法が含まれる。このような方法は、本明細書ならびに例えば、米国特許第７，１８３，０７６号明細書；Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １６：６７７−６８１；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９：６１７−６２１；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２３：１９５−２０２；国際公開第２００７／１１０２０５号パンフレット；国際公開第２００７／１４７９０１号パンフレット；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＪＢＣ ２８５：１９６３７−４６にさらに詳細に記載される。これらの方法では、一対の抗体分子間の界面を遺伝子操作することにより、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの割合を最大化し得る。「ノブ・イン・ホール」法では、第１の抗体分子の界面の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）に置き換えることにより、「突出」が生成される。第２の抗体分子の界面に、その大型側鎖と同一または類似サイズの代償性の「空洞」が、大きい側鎖を有するアミノ酸をより小さい側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニンまたはトレオニン）に置き換えることにより作出される。これは、他の望ましくない最終生成物、例えばホモダイマーと比べてヘテロダイマーの収率を増加させる機構を提供する。ＳＥＥＤ法では、ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ ＣＨ３ドメインのベータ鎖セグメントが互いに絡み合うことにより、Ｆｃホモダイマーがヘテロダイマーに変換される。ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ ＣＨ３ドメインのこれらの誘導体は、ヒトＩｇＡおよびＩｇＧ ＣＨ３配列のセグメントが交互になって構成される相補ヒトＳＥＥＤ ＣＨ３ヘテロダイマーを作出する。得られる一対のＳＥＥＤ ＣＨ３ドメインは、哺乳動物細胞で発現されるとき、選択的に会合してヘテロダイマーを形成する。他の方法には、静電的に適合したＦｃ領域の同時発現がヘテロダイマー化をもたらすようにＦｃダイマー界面にわたる電荷極性を変化させる改変を導入することが含まれる。これらの方法は重鎖ヘテロダイマー化を改善するが、二重特異的抗体形成中に形成される軽鎖−重鎖ミスペアリングには対処しない。ある場合には、国際公開第９８／５０４３１号パンフレットに記載されるとおり共通の軽鎖を使用することで、可能性のあるミスペアリングの数を減らすことができるが、結合特異性および／または親和性の損失または低下が起こることが多い。

デュアル特異的（ｄｕｅｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、生成することのできる別のタイプの二重特異的抗体である（例えば、Ｂｏｓｔｒｕｍ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３：１６１０−１６１４を参照）。このような抗体は、その天然の標的抗原に対する結合特異性を維持しながらも新しい抗原標的に結合することができるように、軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）に突然変異を有する変異体を作成することにより生成できる。しかしながら、多くの場合に抗原結合部位が重複し、抗体が両方の抗原に同時に結合することを妨げる。さらに、これらの抗体は作成が困難であり、２つの抗原のそれぞれに対する所望の親和性を有しないことがある。

本明細書に提供される改変ポリペプチドは、二重特異的抗体の作成に有用であり、上述の制限および技術的困難を解消し得る。一部の態様において、抗体中の１つの重鎖および１つの軽鎖が改変され、それにより天然システインが非システインアミノ酸により置換され、かつ天然非システインアミノ酸がシステインアミノ酸により置換される。本明細書に提供されるこのような改変はＨＣおよびＬＣドメインに作成され、ＨＣ−ＬＣ鎖間ジスルフィド架橋の再配置をもたらす。４つの別個のポリペプチドから二重特異的抗体を作成するとき、例えば、改変されたアームがある標的に対する結合特異性を有し、かつ非改変アームが異なる標的に対する結合特異性を有する場合、４つのポリペプチドは、改変重鎖が改変軽鎖と正しくハイブリダイズし、かつ非改変重鎖が非改変軽鎖と正しくハイブリダイズするように集合し得る。本明細書において使用される用語「非改変」は、本明細書に記載されるとおりの、システインおよび／またはジスルフィド架橋の再配置用に導入されたＨＣ−ＬＣ改変を含まない重鎖および軽鎖を指す。このような「非改変」重鎖および軽鎖は、他の改変、例えば、本明細書に記載されるおよび／または当分野において公知のＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるヘテロダイマー化改変を含み得る。本明細書に提供されるＨＣ−ＬＣ改変は、特にＣＨ２および／またはＣＨ３領域において、重鎖のさらなる改変と組み合わせて適切な重鎖ヘテロダイマー化を確実にし、および／または重鎖ヘテロダイマーの精製を増進させることができ、以下にさらに詳細に記載する。

二重特異性のアッセイ
二重特異性を決定するための当分野において公知の任意のアッセイを用いて、本明細書に提供される抗体を特徴付けることができる。二重特異性のアッセイの非限定的な例としては、イムノアッセイ、直接結合アッセイ、および架橋アッセイが挙げられる。例えば、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）はイムノアッセイであり、抗体の二重特異性の決定に用いることができる。ＡＰＬＨＬＩＳＡアッセイは、ドナーおよびアクセプタービーズを近接させて記録可能なシグナルを得ることに基づく。二重特異的抗体については、抗体が２つの抗原に同時結合することによりドナーおよびアクセプタービーズが近接し、シグナルが生成される。第１の抗原は、タグ、例えばＦＬＡＧタグを含むように遺伝子操作されていてもよく、これは、抗タグ抗体（例えば抗ＦＬＡＧ）とコンジュゲートしたアクセプタービーズに結合する。第２の抗原はビオチン化されていてもよく、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）被覆ドナービーズに結合することができる。第１および第２の抗原に対して二重特異性である抗体は、ドナーおよびアクセプタービーズを近接させてシグナルを生成し得る。本明細書の例に、二重特異性を決定するさらなるアッセイが例示される。

抗体機能
抗体は、いくつかの機能、例えば抗原結合および免疫応答の誘導などをもたらし得る。

抗原結合
本明細書において使用される用語「抗原」は、生物中に導入された場合に免疫応答を引き起こし、特異的抗体と結合し得る分子を指す。抗体−抗原結合は、抗原および抗体の間の多くの弱い相互作用、例として、例えば水素結合、ファン・デル・ワールス力、ならびにイオンおよび／または疎水性相互作用の合計により媒介される。

抗原は、抗体上の相補性領域に結合する。抗原の対応する領域は、「抗原決定基」または「エピトープ」と称される。ほとんどの抗原は、複数の決定基を有し；２つ以上が同一である場合、抗原は多価である。

抗体の親和性は、抗原決定基および抗体結合部位の間の適合を反映し、結合部位の数とは無関係である。結合のアビディティは、抗体−抗原複合体の全体の安定性を反映する。アビディティは、全ての結合部位の全結合強度として定義される。したがって、抗体のその抗原についての親和性ならびに抗体および抗原両方の価数が両方ともアビディティに影響を与え得る。１つのみではなく両方の多価結合部位の関与は、典型的なＩｇＧ分子中で１００００倍だけ多く結合を強化し得る。

多くの抗体および抗原の多価性質は、二次反応、例えば沈降、細胞クランピング、および生物における補体固定を生じさせ得る。このような反応は、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降などの技術において有用であり得る。しかしながら、これらの反応は、治療および／または診断適用を目的とする分子では望ましくないこともある。したがって本明細書に提供される二重特異的抗体の一価の性質は、治療および／または診断目的に利点を提供する。

標的の例
一部の態様では、本明細書に提供されるとおりの抗体により、特定の分子ペアが標的化される。本開示の抗体は、例えば、ＩＬ−１アルファおよびＩＬ−１ベータ；ＩＬ−１２およびＩＬ−１８；ＴＮＦアルファおよびＩＬ−２３；ＴＮＦアルファおよびＩＬ−１３；ＴＮＦおよびＩＬ−１８；ＴＮＦおよびＩＬ−１２；ＴＮＦおよびＩＬ−１ベータ；ＴＮＦおよびＭＩＦ；ＴＮＦおよびＩＬ−１７；ＴＮＦおよびＩＬ−１５；ＴＮＦおよびＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ；ＩＬ−１３およびＩＬ−９；ＩＬ−１３およびＩＬ−４；ＩＬ−１３およびＩＬ−５；ＩＬ−１３およびＩＬ−２５；ＩＬ−１３およびＴＡＲＣ；ＩＬ−１３およびＭＤＣ；ＩＬ−１３およびＭＩＦ；ＩＬ−１３およびＴＧＦ−ベータ；ＩＬ−１３およびＬＨＲアゴニスト；ＩＬ−１３およびＣＬ２５；ＩＬ−１３およびＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ−１３およびＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ−１３およびＡＤＡＭ８；ＴＮＦアルファおよびＰＧＥ４；ＩＬ−１３およびＰＥＤ２；ＴＮＦおよびＰＥＧ２；ＨＥＲ２およびＨＥＲ３；ＨＥＲ１およびＨＥＲ２；ＨＥＲ１およびＨＥＲ３から選択されるサイトカインのペアに結合し得る。

ある態様において、本明細書に提供されるとおりの抗体は、例えば、ＣＤ１３８およびＣＤ２０；ＣＤ１３８およびＣＤ４０；ＣＤ１９およびＣＤ２０；ＣＤ２０およびＣＤ３；ＣＤ３８およびＣＤ１３８；ＣＤ３８およびＣＤ２０；ＣＤ３８およびＣＤ４０；ＣＤ４０およびＣＤ２０；ＣＤ−８およびＩＬ−６；ＣＳＰＧおよびＲＧＭ Ａ；ＣＴＬＡ４およびＢＴＮＯ２；ＩＧＦ１およびＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２およびＥｒｂＢ２；ＩＧＦＲおよびＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ２およびＣＤ６４；ＩＬ−１２およびＴＷＥＡＫ；ＩＬ−１３およびＩＬ−１ベータ；ＭＡＧおよびＲＧＭ Ａ；ＮｇＲおよびＲＧＭ Ａ；ＮｏｇｏＡおよびＲＧＭ Ａ；ＯＭＧｐおよびＲＧＭ Ａ；ＰＤＬ−１およびＣＴＬＡ４；ＲＧＭ ＡおよびＲＧＭ Ｂ；Ｔｅ３８およびＴＮＦアルファ；ＴＮＦアルファおよびＢｌｙｓ；ＴＮＦアルファおよびＣＤ−２２；ＴＮＦアルファおよびＣＴＬＡ−４；ＴＮＦアルファおよびＧＰ１３０；ＴＮＦアルファおよびＩＬ−１２ｐ４０；およびＴＮＦアルファおよびＲＡＮＫリガンドから選択される標的ペアに結合し得る。

一部の態様において、本明細書に提供されるとおりの抗体は、例えば、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＣＳＦ１（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲＬ１、ＦＧＦＲ６、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷ１、ＦＩＬ１、ＦＩＬ１（イプシロン）、ＦＩＬ１（ゼータ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＤ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ２８ＲＡ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＡＣＶＲＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＴＡ（ＴＮＦ−ベータ）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−アルファ）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（エイプリル）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（Ｔｒａｉｌ受容体）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（Ｔｒａｉｌ受容体２）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（Ｔｒａｉｌ受容体３）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（Ｔｒａｉｌ受容体４）、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＮＲＰ１、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、ＡＬＫおよびＴＨＰＯの中から選択される１つ、２つ以上の成長因子、サイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、および受容体に結合し得る。

さらなる態様において、本明細書に提供されるとおりの抗体は、例えば、ＣＣＬ１（Ｉ−３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１ａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１ｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−１ｄ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス−２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）、ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ １０）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤ１）、ＳＣＹＥ１、ＸＣＬ１（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−１ｂ）、ＢＬＲ１（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲ１（ＣＫＲ１／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−１ＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩ１）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ−Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／ボンゾ（Ｂｏｎｚｏ））、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒａ）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒｂ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＩＦ１Ａ、ＩＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、およびＶＨＬの中から選択される１つ以上のケモカイン、ケモカイン受容体、およびケモカイン関連タンパク質に結合し得る。

本明細書に提供されるとおりの他の抗体は、例えば、内在性膜タンパク質、例えばイオンチャネル、イオンポンプ、Ｇタンパク質共役受容体、構造タンパク質、インテグリンなどの接着タンパク質、トランスポーター、膜結合酵素、エネルギーの蓄積および形質導入に関与するタンパク質および脂質アンカータンパク質、例えばＧタンパク質およびいくつかの膜固定キナーゼの中から選択される細胞表面タンパク質に結合し得る。本明細書に提供されるとおりの抗体はまた、酵素、例えばキナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、脂肪酸シンテターゼ、消化酵素、例えばペプシン、トリプシン、およびキモトリプシン、リゾチーム、およびポリメラーゼにも結合し得る。本明細書に提供されるとおりの抗体はまた、受容体、例えばホルモン受容体、リンホカイン受容体、モノカイン受容体、成長因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体等にも結合し得る。

一部の態様において、本明細書に提供されるとおりの抗体の多量体的性質は、標識または治療剤を特定の細胞型または分子標的に標的化させる能力を付与する。例えば、本明細書に提供されるとおりの抗体のある抗原結合ドメインが細胞の表面にある標的に結合する一方、同じ抗体の別の抗原結合ドメインがハプテンまたは検出に有用な標識剤に結合し得る。同様に、ある機能ドメインが細胞標的に結合する一方、第２の機能ドメインが毒素に結合し得る。両方の結合反応とも単一の分子によって媒介されるため、毒素が細胞標的に近接して置かれ、そこで毒素は細胞傷害機能を生じ得る。

免疫機能
抗体は病原体に結合し、それを不活性化させ、病原体をコートすることによりマクロファージおよび他の細胞による病原体の除去を刺激し、他の免疫応答、例えば補体経路を刺激することにより病原体の破壊をトリガーし得る。抗体は、例えば、細菌または癌細胞上の表面抗原に結合することにより補体経路を活性化させる。次いで、抗体のＦｃ領域が補体カスケードと相互作用する。抗体および補体カスケード分子の結合は、食細胞を誘引し、消化のために微生物または細胞を標識する。補体系構成成分は、膜攻撃複合体を形成して抗体の細菌または細胞の殺傷を直接支援し得る。

抗体結合は、病原体の凝集を引き起こし得る。抗体によりコートされた病原体は、抗体Ｆｃ領域を認識する細胞中のエフェクター機能を刺激する。エフェクター機能は、最終的に、侵入微生物または病原細胞の破壊をもたらし、例えば、食細胞が食作用し、マスト細胞および好中球が脱顆粒し、かつナチュラルキラー細胞がサイトカインおよび細胞傷害分子を放出する。

形質転換された腫瘍細胞は、いくつかの源、例として癌遺伝子ウイルス、異常に高レベルの生物自体のタンパク質、および癌誘導癌遺伝子から異常な抗原を発現する。腫瘍抗原は、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ分子上に、ウイルス抗原と同様の様式で提示される。抗原はキラーＴ細胞を活性化させ、補体系をトリガーする抗体も生成する。

本明細書における抗体は、腫瘍または他の病原細胞抗原に結合し、抗体機能を介する細胞破壊をトリガーし得る。ある態様において、本明細書における抗体は、治療分子、例として診断分子または毒素にコンジュゲートしていてよく、抗体−抗原親和性により選択された部位にコンジュゲートされた分子を担持し得る。

エピトープ
本明細書において使用される用語「エピトープ」は、抗体に結合し得る分子決定基を指す。エピトープは、一般に、分子の化学的活性表面基群（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）、例えばアミノ酸および／または糖側鎖を含み、一般に、特異的な三次元構造的特徴、ならびに特異的化学的特徴（例えば、電荷、極性、塩基性、酸性、疎水性など）を有する。立体構造および非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は損失するが、後者への結合は損失しない点で区別される。

ある態様において、エピトープは、標的タンパク質の少なくとも１つの細胞外可溶性親水性外部または細胞内部分からなる。規定のエピトープは、標的タンパク質の連続アミノ酸の規定部分全体に対する少なくとも３つのアミノ酸残基からの少なくとも１つのアミノ酸配列の任意の組み合わせを含み得る。一部の態様において、エピトープは、標的タンパク質の連続アミノ酸の規定部分全体に対する少なくとも４つのアミノ酸残基、少なくとも５つのアミノ酸残基、少なくとも６つのアミノ酸残基、少なくとも７つのアミノ酸残基、少なくとも８つのアミノ酸残基または少なくとも９つのアミノ酸残基である。

抗体断片
ある態様において、本発明の抗体は、抗体断片またはそれらの断片を含む抗体である。抗体断片は、一般に、完全長抗体の抗原結合または可変領域である完全長抗体の一部を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびＦｖ断片が含まれる。ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子；および多重特異的抗体は、これらの抗体断片から形成された抗体である。

慣習的に、これらの断片は、当分野において公知の技術を使用するインタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された。しかしながら、これらの断片は、目下、組換え宿主細胞により直接生成することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖ抗体断片は、全て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させ、それから分泌させることができ、したがってこれらの断片の大量の容易な生成が可能となる。一態様において、抗体断片は、本明細書の他に考察した抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｆａｂ’−ＳＨ断片を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収し、化学的にカップリングしてＦ（ａｂ’）２断片を形成することもできる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離することもできる。抗体断片を生成する他の技術は、当分野において公知である。ある態様において、本明細書に提供される抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）または他の抗原結合ドメインを含む。

ある態様において、本明細書における抗体は、ドメイン抗体、例えば、ヒト抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）または軽鎖の可変領域（ＶＬ）に対応する、抗体の小さい機能性結合ユニットを含有する抗体を含む。ドメイン抗体の例には、限定されるものではないが、治療標的に特異的なＤｏｍａｎｔｉｓから入手可能なものが含まれる。ドメイン抗体の市販のライブラリーを使用して抗原ドメイン抗体を同定することができる。ある態様において、本明細書における抗体は、機能性結合ユニットおよびＦｃガンマ受容体機能性結合ユニットを含む。

ある態様において、本明細書における抗体はワクチボディを含む。ワクチボディはダイマーポリペプチドである。ワクチボディのそれぞれのモノマーは、ＡＰＣ上の表面分子に対して特異性を有するｓｃＦｖがヒンジ領域およびＣγ３ドメインを介して第２のｓｃＦｖに連結したものからなる。一部の態様において、ｓｃＦｖの１つとして鎖間システインを欠く抗体の断片を含有するワクチボディを使用して、破壊するそれらの細胞およびＡＤＣＣを媒介するエフェクター細胞を並置することができる。

ある態様において、本明細書における抗体は直鎖抗体である。直鎖抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直鎖抗体は、ある態様では二重特異的であり得る。

ＨＣおよびＬＣ改変
本明細書には、一部の態様において、１つ以上の鎖間システインが再配置された、一部の態様では、それにより鎖間ジスルフィド結合の再配置がもたらされる遺伝子操作された抗体が提供される。一部の態様において、これには抗体中の１つの重鎖および１つの軽鎖の改変が関与し、ここでは重鎖の天然システインおよび軽鎖の天然システインが、それぞれ非システインアミノ酸により置換され、かつ重鎖の天然非システインアミノ酸および軽鎖の天然非システインアミノ酸が、それぞれシステインアミノ酸により置換されている。一部の態様において、再配置されたジスルフィド架橋は、抗体の２つのＣＨ１−ＣＬ界面のうちの一方の上（すなわち、抗体の１つのアーム上）にある。多くの場合に、ＨＣおよびＬＣ領域は、それぞれが天然システインから非システインアミノ酸への置換と、天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含むように改変され、したがって改変されたＨＣおよびＬＣ領域間に形成される得られるジスルフィド架橋は、界面に沿った位置が、非改変ＨＣおよびＬＣ領域間に形成されるジスルフィド架橋とは異なる。ある態様において、それぞれの重鎖が、重鎖ヘテロダイマー化に有利に働く改変をさらに含む。他の態様において、１つの重鎖が、ヘテロダイマーの精製を促進する改変をさらに含み、この改変は、重鎖ヘテロダイマー化に有利に働く改変に追加的なものまたはそれを代替するものであってよい。

また、本明細書には、一部の態様において、第１の重鎖と第１の軽鎖との、および第２の重鎖と第２の軽鎖との鎖間ペアリングに有利に働くように重鎖および対応する軽鎖が遺伝子操作された抗体も提供される。一部の態様において、これには第１の重鎖および第１の軽鎖の改変が関与し、ここでは第１の重鎖が突出および／または空洞を含み、かつ第１の軽鎖が、第１の重鎖と第１の軽鎖との鎖間ペアリングに有利に働く代償性の空洞および／または突出を含む。一部の態様において、これにはさらに、第２の重鎖および第２の軽鎖の改変が関与し、ここでは第２の重鎖が突出および／または空洞を含み、かつ第２の軽鎖が、第２の重鎖と第２の軽鎖との鎖間ペアリングに有利に働く代償性の空洞および／または突出を含む。一部の態様において、第１の重鎖および軽鎖および／または第２の重鎖および軽鎖は、天然システインから非システインアミノ酸への置換をさらに含む。ある態様において、それぞれの重鎖が、重鎖ヘテロダイマー化に有利に働く改変をさらに含む。他の態様において、１つの重鎖が、ヘテロダイマーの精製を促進する改変をさらに含み、この改変は、重鎖ヘテロダイマー化に有利に働く改変に追加的なものまたはそれを代替するものであってよい。

Ｋａｂａｔにおいて説明されるＥＵインデックスによりナンバリングした、ＩｇＧ重鎖または軽鎖の定常領域内の置換を含む位置の例、ならびに表８および本明細書における配列表に説明される配列内の対応する位置を、以下の表２に提示する。図２２および図２４は、Ｋａｂａｔにおいて説明されるＥＵインデックスによる、軽鎖および重鎖定常領域のナンバリングをそれぞれ示す。

Ｋａｂａｔ定義によりナンバリングした、ＩｇＧ重鎖または軽鎖の可変領域内の置換を含む位置の例を、以下の表３に提示する。

非システインアミノ酸により置換されている天然システイン
一部の態様において、天然システインが非システインアミノ酸により置き換えられている。一部の態様において、ＨＣ−ＬＣ界面内の鎖間システインが非システインアミノ酸により置き換えられている。一部の態様において、１つ以上の鎖間システインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中で非システインアミノ酸により置き換えられている。一部の態様において、ＩｇＧ１重鎖は位置２２０に天然システインから非システインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ２重鎖は位置１３１および／または２１９および／または２２０に天然システインから非システインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は位置１３１に天然システインから非システインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、鎖間システインはＩｇＧ軽鎖中で非システインアミノ酸により置き換えられている。一部の態様において、軽鎖はカッパ軽鎖であり、および一部の態様において軽鎖はラムダ軽鎖である。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖は位置２１４に天然システインから非システインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。このような非システインアミノ酸は、一部の態様において、天然に生じるアミノ酸および／または非古典的アミノ酸を含む。

天然に生じる非システインアミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、メチオニン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが含まれる。非古典的アミノ酸は、細胞発現系（例えば、原核生物および／または真核生物発現系）を介して導入できることもある。非古典的アミノ酸の例には、オルニチン、ジアミノ酪酸、ノルロイシン、ピリルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンが含まれる。非古典的アミノ酸の他の例は、アルファアミノ酸およびアルファ二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸^＊、天然アミノ酸のハロゲン化物誘導体、例えばトリフルオロチロシン^＊、ｐ−Ｘ−フェニルアラニン（式中、Ｘはハロゲン化物、例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである）^＊、アリルグリシン^＊、７−アミノヘプタン酸^＊、メチオニンスルホン^＊、ノルロイシン^＊、ノルバリン^＊、ｐ−ニトロフェニルアラニン^＊、ヒドロキシプロリン＃、チオプロリン^＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば４−メチル−Ｐｈｅ^＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ^＊、Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｔｙｒ（メチル）^＊、Ｐｈｅ（４−イソプロピル）^＊、Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）^＊、ジアミノプロピオン酸、Ｐｈｅ（４−ベンジル）^＊、４−アミノ酪酸（ガンマ−Ａｂｕ）^＊、２−アミノ酪酸（アルファ−Ａｂｕ）^＊、６−アミノヘキサン酸（イプシロン−Ａｈｘ）^＊、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）^＊、３−アミノプロピオン酸^＊、ノルバリン^＊、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン^＊、ｔ−ブチルアラニン^＊、フェニルグリシン^＊、シクロヘキシルアラニン^＊、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばベータ−メチルアミノ酸などである。注釈^＊は、疎水性特徴を有する誘導体を示し、＃は、親水性特徴を有する誘導体を示す。

ある態様において、ＨＣ−ＬＣ鎖間システインはバリンまたはアラニンにより置き換えられている。一部の態様において、ＩｇＧ１重鎖中の位置２２０のアミノ酸が、バリンまたはアラニンにより置き換えられている。一部の態様において、ＩｇＧ２重鎖中の位置１３１および／または２１９および／または２２０のアミノ酸が、バリンまたはアラニンにより置き換えられている。一部の態様において、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中の位置１３１のアミノ酸が、バリンまたはアラニンにより置き換えられている。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖中の位置２１４のアミノ酸が、バリンにより置き換えられている。

システインにより置換されている天然非システインアミノ酸
一部の態様において、天然非システインアミノ酸がシステインアミノ酸により置き換えられている。一部の態様において、天然非システインアミノ酸は、ＨＣおよびＬＣ領域中でシステインアミノ酸により置き換えられている。天然非システインアミノ酸は、天然非システインアミノ酸を含むＣＨ１領域およびＣＬ領域内の任意の位置でシステインアミノ酸により置き換えられてよい。このような位置は、一部の態様において、天然アミノ酸がシステインアミノ酸により置換されたときの鎖間ジスルフィド結合形成に許容的である。一部の態様において、天然非システインアミノ酸は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中でシステインアミノ酸により置き換えられている。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、位置１４１に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、位置１６８に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、位置１２６に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、位置１２８に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。

一部の態様において、天然非システインアミノ酸は、ＩｇＧ軽鎖中でシステインアミノ酸により置き換えられている。一部の態様において、軽鎖はカッパ軽鎖であり、および一部の態様において軽鎖はラムダ軽鎖である。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖は、位置１１６に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖は、位置１６４に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖は、位置１２１に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖は、位置１１８に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。

一部の態様において、位置１４１のアラニンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中でシステインにより置換されている。一部の態様において、位置１６８のヒスチジンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中でシステインにより置換されている。一部の態様において、位置１２６のフェニルアラニンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中でシステインにより置換されている。一部の態様において、位置１２８のロイシンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中でシステインにより置換されている。一部の態様において、位置１１６のフェニルアラニンまたはトレオニンが、ＩｇＧ軽鎖中でシステインにより置換されている。一部の態様において、位置１６４のトレオニンまたはリジンが、ＩｇＧ軽鎖中でシステインにより置換されている。一部の態様において、位置１２１のセリンが、ＩｇＧ軽鎖中でシステインにより置換されている。一部の態様において、位置１１８のフェニルアラニンが、ＩｇＧ軽鎖中でシステインにより置換されている。

一部の態様において、天然非システインアミノ酸が、ＶＨおよびＶＬ領域内でシステインアミノ酸により置き換えられている。天然非システインアミノ酸は、天然非システインアミノ酸を含むＶＨ領域およびＶＬ領域内の任意の位置でシステインアミノ酸により置き換えられてよい。このような位置は、一部の態様において、天然アミノ酸がシステインアミノ酸により置換されたときの鎖間ジスルフィド結合形成に許容的である。一部の態様において、天然非システインアミノ酸は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖可変領域中でシステインアミノ酸により置き換えられている。一部の態様において、天然非システインアミノ酸は、ＶＨおよびＶＬの可変領域内で当分野において公知の位置においてシステインアミノ酸により置き換えられており、例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ，９０：７５３８−４２；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．６：７８１−８；Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：５４５１−９；Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ １４：１２３９−４５；Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：８２５−３１；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．３７７：１３５−９；Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：１３６２−７を参照のこと。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、可変領域の位置３７に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、可変領域の位置４４に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、可変領域の位置４５に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、可変領域の位置５５に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、可変領域の位置９８に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、可変領域の位置１００に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、可変領域の位置１０１に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、可変領域の位置１０５に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、可変領域の位置１０６に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。

一部の態様において、天然非システインアミノ酸が、ＩｇＧ軽鎖可変領域中でシステインアミノ酸により置き換えられている。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖は、可変領域の位置４３に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖は、可変領域の位置４６に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖は、可変領域の位置５０に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖は、可変領域の位置５７に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖は、可変領域の位置８７に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖は、可変領域の位置９５に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖は、可変領域の位置１００に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖は、可変領域の位置１０１に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖は、可変領域の位置１０５に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を有し、ここでナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる。

突出および空洞
一部の態様において、少なくとも１つのアミノ酸の置換が突出および／または空洞を生成する。突出および／または空洞を生成するアミノ酸置換は、ＣＨ１領域および／またはＣＬ領域内の任意の位置であってよい。一部の態様において、少なくとも１つのアミノ酸の置換はＣＨ１領域内に突出および／または空洞を生成し、かつＣＬ領域内に代償性の空洞および／または突出を生成する。このような置換は、ある態様において、空洞および／または突出を含むＣＨ１と代償性の空洞および／または突出を含むＣＬとの鎖間ペアリングに有利に働く。ある態様において、突出および／または空洞を生成する置換に加えて、ＣＨ１およびＣＬは、上記のとおりのＨＣ−ＬＣ界面内の鎖間システインを非システインアミノ酸で置き換える置換をさらに含む。

一部の態様において、少なくとも１つのアミノ酸の置換は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中に突出および／または空洞を生成する。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖の位置１４５は、大型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖の位置１８３は、大型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖の位置１８５は、大型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖の位置１４７は、小型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖の位置１７０は、小型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中で位置１４７が小型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、かつ位置１８５が大型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中で位置１４５が大型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、位置１７０が小型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、位置１８３が大型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、かつ位置１８５が大型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。ある態様において、突出および／または空洞を生成する置換に加えて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、上記のとおりの非システインアミノ酸による鎖間システインの置換をさらに含む。

一部の態様において、少なくとも１つのアミノ酸の置換は、ＩｇＧ軽鎖中に突出および／または空洞を生成する。一部の態様において、軽鎖はカッパ軽鎖であり、および一部の態様において軽鎖はラムダ軽鎖である。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖の位置１３１は、大型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖の位置１７６は、大型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖の位置１３５は、小型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖の位置１７８は、小型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖中で位置１３１が大型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、かつ位置１３５が小型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ＩｇＧ軽鎖中で位置１７６が大型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、かつ位置１７８が小型側鎖を有するアミノ酸により置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。ある態様において、突出および／または空洞を生成する置換に加えて、ＩｇＧ軽鎖は、上記のとおりの非システインアミノ酸による鎖間システインの置換をさらに含む。

一態様において、位置１４５のロイシンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中でフェニルアラニンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一態様において、位置１４７のリジンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中でアラニンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一態様において、位置１７０のフェニルアラニンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中でバリンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一態様において、位置１８３のセリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中でフェニルアラニンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一態様において、位置１８５のバリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中でトリプトファンまたはフェニルアラニンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中で位置１８５のバリンがトリプトファンにより置換されており、かつ位置１４７のリジンがアラニンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一態様において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖中で位置１４５のロイシンがフェニルアラニンにより置換されており、位置１７０のフェニルアラニンがバリンにより置換されており、位置１８３のセリンがフェニルアラニンにより置換されており、かつ位置１８５のバリンがフェニルアラニンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。ある態様において、突出および／または空洞を生成する置換に加えて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖は、上記のとおりの非システインアミノ酸による鎖間システインの置換をさらに含む。

一態様において、カッパ軽鎖の位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１３１のセリンまたはラムダ軽鎖の位置１３１のトレオニンがトリプトファンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一態様において、カッパまたはラムダ軽鎖の位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１７６のセリンがフェニルアラニンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一態様において、カッパまたはラムダ軽鎖の位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１３５のロイシンがグリシンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一態様において、カッパ軽鎖の位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１７８のトレオニンまたはラムダ軽鎖の位置１７８のチロシンがアラニンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、カッパ軽鎖中の位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１３１のセリンがトリプトファンにより置換されており、かつ位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１３５のロイシンがアラニンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、カッパ軽鎖中の位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１７６のセリンがフェニルアラニンにより置換されており、かつ位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１７８のトレオニンがアラニンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。

一部の態様において、ラムダ軽鎖中で位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１３１のトレオニンがトリプトファンにより置換されており、かつ位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１３５のロイシンがアラニンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。一部の態様において、ラムダ軽鎖中の位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１７６のセリンがフェニルアラニンにより置換されており、かつ位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１７８のチロシンがアラニンにより置換されており、ここでナンバリングはＥＵインデックスによる。ある態様において、突出および／または空洞を生成する置換に加えて、ＩｇＧ軽鎖は、上記のとおりの非システインアミノ酸による鎖間システインの置換をさらに含む。

ＨＣ−ＬＣアミノ酸置換の組み合わせ
ある態様において、ＩｇＧ重鎖および対応する軽鎖に置換の組み合わせが作製される。多くの場合、このような置換の組み合わせは、典型的にはＨＣおよびＬＣ領域内で重鎖と軽鎖との間にジスルフィド架橋を形成する天然システインの除去、およびＨＣ−ＬＣ界面内の異なる位置にジスルフィド架橋を形成し得る新しい一対のシステインの生成をもたらす。この新しい一対のシステインは、重鎖および軽鎖の可変領域および／またはＣＨ１−ＬＣ内に局在し得る。このような置換の組み合わせを以下の表４に要約する。位置ナンバリングは、定常領域についてＥＵインデックスにより、および可変領域についてＫａｂａｔインデックスによる。表４に具体的には示さないが、軽鎖はカッパ（κ）軽鎖またはラムダ（λ）軽鎖であってよい。

ある態様において、本発明の二重特異的抗体は、同じＩｇタイプの２つの異なる重鎖（例えば、２つのＩｇＧ１重鎖、一方がシステイン残基の改変を有し、一方がそのような改変を有しない）および２つの異なる軽鎖（例えば、一方がシステイン残基の改変を有し、一方がそのような改変を有しない）を含み、軽鎖はカッパおよび／またはラムダの任意の組み合わせであってよい（すなわち２つのカッパ軽鎖、２つのラムダ軽鎖、または１つのラムダ軽鎖と１つのカッパ軽鎖）。詳細な態様において、本発明の二重特異的抗体は、同じＩｇタイプの２つの異なる重鎖と１つのラムダ軽鎖と１つのカッパ軽鎖とを含み得る。

本明細書に記載される種々の改変を使用すると二価抗体の形成が大幅に増強されるが、重鎖と軽鎖とのミスペアリングに起因してまたは重鎖のホモダイマー化に起因して何らかのミスペアリングされた抗体が生じ得る。２つの異なる軽鎖定常領域の存在により、カッパまたはラムダタイプの軽鎖に特異的なアフィニティークロマトグラフィー媒体（例えば、樹脂）を使用して、同じ軽鎖を有する任意のミスペアリング抗体を除去する好都合な手段が提供される。カッパまたはラムダ軽鎖定常ドメインと特異的に相互作用するアフィニティークロマトグラフィー媒体は、当分野において公知である（例えば、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＫａｐｐａおよびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｌａｍｂｄａアフィニティーマトリックス（ＢＡＣ ＢＶ、オランダ））。ある態様において、１つの軽鎖のみが過剰であるため、あるタイプのＬＣミスペアリング副産物のみが形成される。したがって、過剰の軽鎖がカッパである場合、ラムダ軽鎖に特異的なアフィニティークロマトグラフィー媒体を使用してＬＣ副産物が除去され、および過剰の軽鎖がラムダである場合、カッパ軽鎖に特異的なアフィニティークロマトグラフィー媒体を使用して副産物が除去され得る。

あるいは、または場合により、軽鎖特異的アフィニティー媒体を多段階プロセスで使用して、１つのカッパ軽鎖と１つのラムダ軽鎖とを有する抗体を精製することもできる。代表的な三段階プロセスを例として提供する：（１）必要に応じてプロテインＡおよび／またはＧ樹脂を使用してＩｇＧを捕捉する（ミスペアリング産物を含めた全てのＩｇＧがプロテインＡおよび／またはＧに結合し得る）；（２）プロテインＡおよび／またはＧ媒体からの抗体をカッパ特異的媒体に通過させて、カッパ軽鎖を含有するＩｇＧを捕捉する（１つまたは２つのカッパ軽鎖を含むＩｇＧが全てカッパ特異的媒体に結合する一方、２つのラムダ鎖を含む抗体は通過する）、（３）カッパ特異的媒体からの抗体をラムダ特異的媒体に通過させて、ラムダ軽鎖を含有するＩｇＧを捕捉する（２つのカッパ鎖を含む抗体は通過する）。これらの工程の順序は変えてもよく、さらに、ある工程を省くおよび／または夾雑物（例えば、宿主細胞タンパク質）からの抗体の精製において有用な他のクロマトグラフィー方法と置き換えてもよいことに留意しなければならない。本明細書に提供される実施例では、代表的な二段階プロセスを例示する。また、国際公開第２０１２／０２３０５３号パンフレットおよび本明細書に提供される実施例も参照のこと。

本明細書に記載されるとおりの（例えば、天然アミノ酸残基、システインおよび／または非システインアミノ酸残基の）アミノ酸置換は、当分野において公知の任意の方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、限定されるものではないが、ＰＣＲ伸長オーバーラップ突然変異導入、部位特異的突然変異導入またはカセット突然変異導入が挙げられる（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ，１９８９；Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９３を参照）。部位特異的突然変異導入キットは、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）など、市販されている。カセット突然変異導入は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｇｅｎｅ，３４：３１５−３２３に基づき実施することができる。あるいは、突然変異体は、重複オリゴヌクレオチドのアニーリング、ライゲーションおよびＰＣＲ増幅およびクローニングによる全遺伝子合成によって作製することができる。

Ｆｃ領域改変
本明細書には、可変領域および／またはＣＨ１領域および／またはＣＬ領域にＨＣおよびＬＣ改変を有する抗体が提供される。また、一部の態様において、以下に記載するＦｃ領域における１つ以上の改変をさらに含む改変抗体も提供される。１つ以上の改変を含むＦｃ領域は、本明細書では「変異体Ｆｃ領域」と称される。

一対の抗体分子間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの割合を最大化するように遺伝子操作することができる。適切な界面は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）に置き換えることにより、「突出」（ここでは「ノブ」とも称される）が作成される。その大型側鎖と同一または同様のサイズの代償性の「空洞」（本明細書では「ホール」とも称される）が、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例えばアラニンまたはトレオニン）に置き換えることにより、第２の抗体分子の界面に作出される。あるいは、または加えて、ＣＨ３領域が、ジスルフィド結合を形成し得るシステイン残基を導入する突然変異を含むように改変されてもよい。これらの改変は、ヘテロダイマーの収率を、ホモダイマーなどの他の望ましくない最終生成物と比べて増加させる機構を提供する。ヘテロダイマー化を増強するＣＨ３改変には、例えば、一方の重鎖上のＹ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａおよび他方の重鎖上のＴ３６６Ｗ；一方の重鎖上のＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗおよび他方の重鎖上のＹ３４９Ｃ／Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａが含まれる。一方の鎖に突出および他方に空洞をもたらすさらなる改変が表５に提供され、米国特許第７，１８３，０７６号明細書；およびＭｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １６：６７７−６８１に記載されている。ヘテロダイマーの作成に用いられ得る他の改変には、限定されるものではないが、静電的に適合したＦｃ領域の同時発現がヘテロダイマー化をもたらすようにＦｃダイマー界面にわたる電荷極性を変化させる改変が含まれる。電荷極性を変化させる改変には、限定されるものではないが、表６に提示される改変が含まれる（また、国際公開第２００７／１４７９０１号パンフレット；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＪＢＣ ２８５：１９６３７−４６も参照のこと）。さらに、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２３：１９５−２０２）が、ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ ＣＨ３ドメインの誘導体である鎖交換遺伝子操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣＨ３領域を使用したヘテロダイマーＦｃプラットフォームについて記載している（また、国際公開第２００７／１１０２０５号パンフレットも参照のこと）。

本明細書に記載されるヘテロダイマー化を増進する任意のＣＨ３改変はいずれも、一方の鎖がある一組の改変を有し、かつ他方の鎖が代償性の改変を有する限り、本明細書に提供される抗体のいずれの鎖上にあってもよい。例えば、Ｔ３６６Ｗ改変が非改変ＣＨ１領域を伴う重鎖にある場合、上記に記載されるＹ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ改変は、本明細書に記載されるＣＨ１改変を含む同じ重鎖にあってよい。逆に、Ｔ３６６Ｗ改変が本明細書に記載されるＣＨ１改変を含む重鎖にある場合、Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ改変は非改変ＣＨ１領域を伴う重鎖にあってよい。ある態様において、ヘテロダイマー形成を増加／安定化させるのに有用な追加の突然変異がＣＨ２および／またはＣＨ３領域に導入される。一部の態様において、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域における１つ以上の残基が、２つの重鎖間の鎖間ジスルフィド結合を形成し得るシステイン残基に突然変異している。

当業者は、異なる可変領域を有する抗体は異なるレベルで発現し得ることを理解するであろう。したがって、本明細書に提供されるＭＢａｂを構成する異なる可変領域を有する重鎖および／または軽鎖は、異なるレベルで発現し得る。このような不均等な発現が、緩くペアリングされたホモダイマー重鎖を有する抗体の生成をもたらすことがあり、これは半抗体として分泌され得るか、または分泌され、続いて半抗体を形成し得る。本明細書には、半抗体の生成を最小限に抑える方法が提供される。具体的には、ある態様において、第２の重鎖より高いレベルで発現する第１の重鎖が、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域に、ホモダイマーペアリングを強力に不安定化させる突然変異を含むように遺伝子操作される。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、ホモダイマーペアを強力に不安定化させる突然変異の存在は、分泌よりむしろ、そのようなペアの分解をもたらし、したがって半抗体の生成を最小限に抑える。例えば、ある態様において、より高いレベルで発現する方の重鎖のＣＨ３領域にＴ３６６Ｗ突然変異が導入され、他方の重鎖に代償性のＹ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ改変が導入される。本明細書に記載されるとおり、ヘテロダイマー形成を増加／安定化させ、および／またはエフェクター機能を変化させ、および／または半減期を変化させるため、Ｆｃ領域に追加の突然変異がさらに導入されてもよい。強力な／弱いプロモーターの使用など、当分野において公知の他の方法を用いて２つの重鎖の発現レベルを均衡させてもよい。

ＥＵインデックスによりナンバリングした、ＩｇＧのＦｃ領域における残基４３５は、ブドウ球菌プロテインＡとの相互作用部位に局在し（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，１９８１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：２３６１−２３７０）、Ｈ４３５およびＹ４３６を含むＩｇＧはプロテインＡと結合する一方、Ｒ４３５およびＦ４３６を含むＩｇＧはプロテインＡと結合しない（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１：２５−３４）。さらに、一方の重鎖上にＨ４３５／Ｙ４３６および他方の重鎖上にＲ４３５／Ｆ４３６を含む抗体は、プロテインＡ媒体上でＨ４３５／Ｙ４３６を含む２つの重鎖を含む抗体と分離することができる（例えば、国際公開第２０１０／１５１７９２号パンフレットおよび本明細書に提供される実施例を参照のこと）。したがって、一方の重鎖ＣＨ３領域に適切な突然変異を組み込むと、プロテインＡクロマトグラフィーを用いたホモダイマーを除去を促進する機構が提供される。したがって、一部の態様において、本明細書に提供される抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、プロテインＡ結合を低減または消失させる突然変異を有する１つの重鎖ＣＨ３領域と、プロテインＡとの結合を維持する１つの重鎖とを含む。他の態様において、本明細書に提供される抗体はＩｇＧ３であり、プロテインＡ結合を回復する突然変異を有する１つの重鎖ＣＨ３領域と、プロテインＡに結合しない１つの重鎖とを含む。ある態様において、本明細書に提供される抗体は、Ｈ４３５を有する１つの重鎖ＣＨ３領域と、Ｒ４３５を有する１つの重鎖ＣＨ３とを含む。他の態様において、本明細書に提供される抗体は、Ｈ４３５／Ｙ４３６を有する１つの重鎖ＣＨ３領域と、Ｒ４３５／Ｆ４３６を有する１つの重鎖ＣＨ３とを含む。

ＶＨ３ファミリー可変ドメインはプロテインＡと結合することが知られている。したがって、ある態様では、プロテインＡ結合を除去する突然変異を有するもののＶＨ３ファミリー可変ドメインで構成されるホール重鎖の結合を妨げるため、ＶＨ３可変ドメインに結合しない形態のプロテインＡが用いられる（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。

本明細書に記載されるプロテインＡ結合を変化させる改変は、一方の重鎖のみが残基４３５単独でまたは４３６との組み合わせで改変され、他方の鎖の４３５が野生型である限り、本明細書に提供される抗体のいずれの鎖にあってもよい。図２４Ｄに示すとおり、野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、それぞれＨ４３５／Ｙ４３６を含む一方、野生型ヒトＩｇＧ３はＲ４３５／Ｆ４３６を含む。したがって、突然変異の性質はＩｇＧのタイプに依存し得る。具体的には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４については、１つの重鎖ＣＨ３にＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ突然変異が導入されるが、ＩｇＧ３については、１つの重鎖ＣＨ３に４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙ突然変異が導入される。ある態様において、プロテインＡ結合を低減または消失させる代替的な突然変異が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の１つの重鎖のみに導入される。ある他の態様において、プロテインＡ結合を回復する代替的な突然変異が、ＩｇＧ３の１つの重鎖のみに導入される。プロテインＡ結合を低減または除去する位置４３５および／または４３６における代替的な置換は、他の１８個の標準アミノ酸残基のいずれかを従来のＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４抗体の重鎖ＣＨ３領域に導入して、プロテインＡ結合の損失についてスクリーニングすることにより、同定することができる。プロテインＡ結合を回復する位置４３５および／または４３６における代替的な置換は、他の１８個の標準アミノ酸残基を従来のＩｇＧ３抗体の重鎖ＣＨ３領域に導入して、プロテインＡ結合についてスクリーニングすることにより、同定することができる。

本明細書に提供される特定のＦｃ突然変異は二価抗体の形成を増進するが（例えば、表５に提供されるもの）、重鎖のホモダイマー化に起因して、何らかのミスペアリング抗体がなお生じ得る。特に、空洞（本明細書では「ホール」とも称される）の形成をもたらす突然変異を有する重鎖は、特に過剰のとき、ホモダイマーを形成することが公知である（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７−６８１）。したがって、一部の態様において、ヘテロダイマー形成を増加させるのに有用なＦｃ突然変異を、アフィニティー媒体との結合を変化させるのに有用なＦｃ突然変異と組み合わせて、重鎖ヘテロダイマーの精製を増進してもよい。ある態様において、本明細書に提供される抗体は、「空洞」の形成をもたらすＦｃ突然変異およびＣＨ３残基Ｒ４３５／Ｆ４３６を有する１つの重鎖と；「突出」の形成をもたらすＦｃ突然変異およびＣＨ３残基Ｈ４３５／Ｙ４３６を有する１つの重鎖とを含む。本開示から、ＩｇＧのタイプに応じて、どちらかの鎖が位置４３５および４３６に突然変異を含み得ることが理解されるであろう。特定の態様では、ＭｂａｂはＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、Ｆｃ突然変異Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｈ４３５Ｒおよび場合によりＹ４３６Ｆを有する１つの重鎖と、Ｆｃ突然変異Ｔ３６６Ｗを有する１つの重鎖とを含む。別の特定の態様では、ＭｂａｂはＩｇＧ３であり、Ｆｃ突然変異Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを有する１つの重鎖と、Ｆｃ突然変異Ｔ３６６Ｗ／Ｒ４３５Ｈおよび場合によりＦ４３６Ｙを有する１つの重鎖とを含む。別の特定の態様では、ＭｂａｂはＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、Ｆｃ突然変異Ｙ３４９Ｃ／Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｈ４３５Ｒおよび場合によりＹ４３６Ｆを有する１つの重鎖と、Ｆｃ突然変異Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを有する１つの重鎖とを含む。別の特定の態様では、ＭｂａｂはＩｇＧ３であり、Ｆｃ突然変異Ｙ３４９Ｃ／Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを有する１つの重鎖と、Ｆｃ突然変異Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ／Ｒ４３５Ｈおよび場合によりＦ４３６Ｙを有する１つの重鎖とを含む。

ある態様において、ヘテロダイマー形成を増加させるのに有用なＦｃ改変を、Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：６３７−４０；Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：５６３−５６４；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：２６５７−２６６２；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：５３−５９；Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５７：１５３７−１５４３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９２：１１９８０−１１９８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．４４：１１１−１１７；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｆａｓｅｂ Ｊ ９：１１５−１１９；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ５４：１０１−１０４；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：４９６３−４９６９；Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：２６１３−２６２４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：４１７８−４１８４；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：１９２５−１９３３；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００：１６−２６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：２５７１−２５７５；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１−６６０４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７−６５；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３０：４８７−４９０）；米国特許第５，６２４，８２１号明細書；同第５，８８５，５７３号明細書；同第５，６７７，４２５号明細書；同第６，１６５，７４５号明細書；同第６，２７７，３７５号明細書；同第５，８６９，０４６号明細書；同第６，１２１，０２２号明細書；同第５，６２４，８２１号明細書；同第５，６４８，２６０号明細書；同第６，５２８，６２４号明細書；同第６，１９４，５５１号明細書；同第６，７３７，０５６号明細書；同第７，１２２，６３７号明細書；同第７，１８３，３８７号明細書；同第７，３３２，５８１号明細書；同第７，３３５，７４２号明細書；同第７，３７１，８２６号明細書；同第６，８２１，５０５号明細書；同第６，１８０，３７７号明細書；同第７，３１７，０９１号明細書；同第７，３５５，００８号明細書；米国特許出願公開第２００４／０００２５８７号明細書；および国際公開第９９／５８５７２号パンフレットに開示されるものなどの、エフェクター機能を変化させるのに有用な他の公知のＦｃ改変と組み合わせてもよい。当業者には、Ｆｃの他の改変（例えば、置換および／または付加および／または欠失）が容易に明らかであろう。

ある場合には、Ｆｃ領域に対するある改変（例えば、アミノ酸置換および／または付加および／または欠失）により、エフェクター機能が増進または減弱し得る。ある態様において、抗体の変異体Ｆｃ領域は、天然Ｆｃと比較したとき同程度のエフェクター機能誘導レベルを呈する。種々の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比較したとき、より高いエフェクター機能誘導を呈する。変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比較したとき、より低いエフェクター機能誘導を呈することもある。一部の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比較したとき、より高い抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）誘導を呈する。ある態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比較したとき、より低いＡＤＣＣ誘導を呈する。一部の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比較したとき、より高い補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）誘導を呈する。一部の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比較したとき、より低いＣＤＣ誘導を呈する。

変異体Ｆｃ領域を有する任意の特定の抗体がＡＤＣＣにより標的細胞の溶解を媒介する能力をアッセイすることができる。ＡＤＣＣ活性を評価するため、目的の変異体Ｆｃ領域を有する抗体が免疫エフェクター細胞と組み合わせて標的細胞に添加され、免疫エフェクター細胞が抗原抗体複合体により活性化されると、標的細胞の細胞溶解がもたらされ得る。細胞溶解は、一般に、溶解した細胞からの標識（例えば放射性基質、蛍光色素または天然細胞内タンパク質）の放出により検出される。このようなアッセイ用のエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれ得る。インビトロＡＤＣＣアッセイの具体例は当分野において公知である。

ある態様において、ＩｇＧ抗体によって誘発されるエフェクター機能は、タンパク質のＦｃ領域に結合した炭水化物部分に強く依存する（Ｃｌａｕｄｉａ Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９３：８５１−８６１）。したがって、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域のグリコシル化を改変してエフェクター機能を増加または減少させることができる（例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６−３４７３；米国特許第６，６０２，６８４号明細書；同第６，９４６，２９２号明細書；同第７，０６４，１９１号明細書；同第７，２１４，７７５号明細書；同第７，３９３，６８３号明細書；同第７，４２５，４４６号明細書；同第７，５０４，２５６号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書；同第２００３／０００３０９７号明細書；同第２００９／００１０９２１号明細書；Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（登録商標）グリコシル化遺伝子操作技術（ＧＬＹＣＡＲＴ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，スイス）を参照）。したがって、一態様において、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域は、アミノ酸残基のグリコシル化の変化を含む。別の態様において、アミノ酸残基のグリコシル化の変化は、エフェクター機能の低下をもたらす。別の態様において、アミノ酸残基のグリコシル化の変化は、エフェクター機能の増加をもたらす。特定の態様において、Ｆｃ領域はフコシル化が低下している。別の態様において、Ｆｃ領域は非フコシル化型である（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２６８６７号明細書を参照）。一態様において、親細胞によって産生される抗体と比較して１００倍超高いＡＤＣＣを有する高度に脱フコシル化した抗体を産生するように遺伝子操作された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、コウキクサ（Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ））で生成されるとおりの、エフェクター機能、特にＡＤＣＣが増加したこれらの抗体（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１−９０８；Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４：１５９１−７）。

ＩｇＧ分子上のオリゴ糖へのシアル酸の付加は、それらの抗炎症活性を向上させ、それらの細胞傷害性を変化させ得る（例えば、Ｋｅｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１３：６７０−６７３；Ｓｃａｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ．２００７ Ｍａｒ；４４（７）：１５２４−３４）。したがって、抗体治療薬の効力は、意図される用途に最良に適した糖型の選択により最適化することができる。抗体の２つのＣＨ２ドメイン間に介入される２つのオリゴ糖鎖は、Ｆｃ領域のその受容体への結合に関与する。シアル化が増加したＩｇＧ分子は抗炎症特性を示す一方、シアル化が低減したＩｇＧ分子は免疫賦活特性の増加を示す。したがって、抗体治療薬は、特定の用途に適切なシアル化プロファイルを用いて「テーラーメード」することができる。抗体のシアル化状態をモジュレートする方法は、当分野において公知である（例えば、米国特許出願公開第２００９／０００４１７９号明細書および国際公開第２００７／００５７８６号パンフレット）。

一部の態様において、ヘテロダイマー形成を増加させるのに有用なＦｃ改変を、比較分子（例えば、野性型Ｆｃ領域を有することを除き同一のアミノ酸配列を有するタンパク質）と比べてＦｃリガンド（例えば、Ｆｃ受容体、ＣＩｑ）に対する結合特性を変化させるのに有用な他の改変と組み合わせてもよい。結合特性の例には、限定されるものではないが、結合特異性、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）、解離および会合速度（それぞれｋ_ｏｆｆおよびｋ_ｏｎ）、結合親和性および／またはアビディティが含まれる。一般的には、低いＫ_ｏｎを有する結合分子、例えば抗体の方が、高いｋ_ｏｆｆを有する結合分子より好ましいものであり得ると理解される。しかしながら、ある場合には、ｋ_ｏｎまたはｋ_ｏｆｆの値がＫ_Ｄの値よりも関連性が高いこともある。当業者は、どの速度論的パラメータが所与の抗体用途に最も重要であるかを決定することができる。

Ｆｃ領域のそのリガンドに対する親和性および結合特性は、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用、すなわちＦｃＲに対するＦｃ領域の特異的結合を決定するための当分野において公知の種々のインビトロアッセイ法（生化学または免疫学ベースのアッセイ）、例として、限定されるものではないが、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、またはキネティクス（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析）、および他の方法、例えば間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）により決定することができる。これらのおよび他の方法は、試験されている構成成分の１つ以上に対して標識を利用し、および／または種々の検出法、例として、限定されるものではないが、比色分析、分光分析、分光光度分析、蛍光、発光、または同位体標識を用い得る。

一部の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べて１つ以上のＦｃリガンドへの結合の向上を有する。種々の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、Ｆｃ受容体への結合の向上を有する。一部の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の向上を有する。ある態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲ ＩＩＢへの結合の向上を有する。変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べてＣＩｑへの結合の向上を有することもある。種々の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、Ｆｃ受容体ＦｃＲｎへの結合の向上を有する。

一部の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べてＡＤＣＣ活性の向上を有する。ある態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べてＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の向上を有し、かつＡＤＣＣ活性の向上を有する。一部の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べてＡＤＣＣ活性の向上および血清中半減期の向上の両方を有する。

ある態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べてＡＤＣＣ活性の低下を有する。種々の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べてＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低下を有し、かつＡＤＣＣ活性の低下を有する。変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べてＡＤＣＣ活性の低下および血清中半減期の向上の両方を有することもある。

一部の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べてＣＤＣ活性の向上を有する。ある態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べてＣＤＣ活性の向上および血清中半減期の向上の両方を有する。一部の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べて１つ以上のＦｃリガンドへの結合の低下を有する。

一部の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べてＦｃ受容体への結合の低下を有する。ある態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べてＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低下を有する。変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べてＦｃ受容体ＦｃＲｎへの結合の低下を有することもある。一部の態様において、変異体Ｆｃ領域を有する抗体は、天然Ｆｃを有する同じ抗体と比べてＣＩｑへの結合の低下を有する。

Ｆｃ領域を改変してタンパク質の半減期を増加させることもできる。半減期の増加は、患者に投与される薬物量の低減ならびに投与頻度の低減を可能とし得る。したがって、半減期が増加した本明細書における抗体は、ＦｃとＦｃＲｎとの受容体間の相互作用に関与すると同定されたアミノ酸残基を改変（例えば、置換、欠失、または付加）することにより作成することができる（米国特許第７，０８３，７８４号明細書）。ある態様において、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体の位置２５２のメチオニン、および／または位置２５４のセリンおよび／または位置２５６のトレオニンを、得られる抗体がチロシン−２５２、トレオニン−２５４およびグルタミン酸−２５６を含むようにチロシン、トレオニンおよびグルタミン酸にそれぞれ変えることができる（すなわち、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）。ＩｇＧ抗体のこのようなＦｃ領域はＹＴＥ改変を含み、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体の相当位置を同様に改変することができる。さらに、本明細書における抗体の半減期を、当分野において公知の技術によるＰＥＧまたはアルブミンとのコンジュゲーションにより増加させることができる。ある態様において、ヘテロダイマー形成を増加させるのに有用なＦｃ改変を、限定されるものではないが、Ｍ２５２Ｙおよび／またはＳ２５４Ｔおよび／またはＴ２５６Ｅを含めた、抗体の半減期を変化させるのに有用な他の改変と組み合わせ、および／または本明細書に記載されるものを含めた、エフェクター機能を変化させるおよび／または１つ以上のＦｃリガンドとの結合を変化させるのに有用な他の公知のＦｃ改変と組み合わせてもよい。

抗体合成
再配置された鎖間システインを含む抗体は、抗体の合成のための当分野において公知の任意の方法により、特に、化学合成により、または組換え発現技術により生成することができる。

任意の抗原を使用して抗体を合成することができる。抗原、または「標的」の例は、本明細書に記載される。所望の抗原を細胞表面または細胞から調整された膜において発現する細胞を使用して抗体を生成することもできる。抗原は、組換えにより生成して、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して細菌または真核細胞中で単離することができる。抗原をタグ付加物（例えば、エピトープタグ）または他の融合タンパク質として発現させて種々のアッセイにおける単離ならびに同定を促進することができる。

モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原部位または多重特異的遺伝子操作抗体の場合には複数抗原部位に対して指向される。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の同一の決定基に対して指向される。モノクローナル抗体は、それらの特異性に加え、それらを他の抗体により汚染されることなく合成することができる点で有利である。

モノクローナル抗体は、当分野において公知の広範な技術、例として、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術の使用、またはそれらの組み合わせを使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、例として当分野において公知のものを使用して生成することができる。本明細書における用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を介して生成される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、単一クローン、例として任意の真核、原核、またはファージクローンから誘導される抗体を指し、それが生成される方法は指さない。一部の態様において、本明細書における抗体は９０％以上のモノクローナルである。限定されるものではなく、例えば、モノクローナル哺乳動物、キメラ、ヒト化、ヒト、ドメイン、ダイアボディ、ワクチボディ、直鎖および多重特異的抗体を生成するために使用することができるモノクローナル抗体を生成する代表的な方法を以下に記載する。

ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を生成およびスクリーニングする方法は、当分野において公知である。簡単に述べると、マウスを標的抗原（完全長タンパク質またはそのドメイン、例えば、細胞外ドメインもしくはリガンド結合ドメインのいずれか）により免疫化することができ、免疫応答を１回検出し、例えば、標的抗原に特異的な抗体をマウス血清中で検出し、マウス脾臓を摘出し、脾細胞を単離する。次いで、脾細胞を公知の技術により任意の好適な骨髄腫細胞、例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞系ＳＰ２０からの細胞に融合させる。ハイブリドーマを選択し、限定希釈によりクローニングする。次いで、ハイブリドーマクローンを当分野において公知の方法により、本明細書における抗体のポリペプチドに結合し得る抗体を分泌する細胞についてアッセイする。一般に、高レベルの抗体を含有する腹水液を、マウスを陽性ハイブリドーマクローンにより免疫化により生成することができる。

したがって、モノクローナル抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することにより生成することができる。ハイブリドーマは、標的抗原により免疫化したマウスから単離した脾細胞を骨髄腫細胞と融合し、次いで特異的標的抗原に結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることにより生成する。

さらに、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。免疫化後、リンパ球を単離し、次いで好適な融合剤または融合パートナー、例えばポリエチレングリコールを使用して骨髄腫細胞系と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する。ある態様において、選択される骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による抗体の安定な高レベル生成を支持し、未融合親細胞に対して選択する選択培地に感受性のものである。一態様において、骨髄腫細胞系は、マウス骨髄腫系、例えばＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＳＰ−２および誘導体、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手可能なＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞から誘導されたものである。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系も、当分野において公知である。

所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を生成するハイブリドーマ細胞を同定したら、クローンを、限定希釈手順によりサブクローニングし、標準的方法により成長させることができる。この目的に好適な培養培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞を、例えばマウス中への細胞の腹腔内注射によりインビボで動物中で腹水腫瘍として成長させることができる。

サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、慣用の抗体精製手順、例えば、親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ−セファロースまたはカッパを使用）またはイオン交換クロマトグラフィー、親和性タグ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などにより培養培地、腹水液、または血清から好適に分離する。例示的精製法は、以下により詳細に記載する。

特異的標的抗原エピトープを認識する抗体断片は、当分野に公知の任意の技術により生成することができる。例えば、本明細書におけるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、酵素、例えばパパイン（Ｆａｂ断片を生成するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成するため）を使用する免疫グロブリン分子のタンパク質分解開裂により生成することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。さらに、本明細書における抗体は、当分野において公知であり、以下により詳細に考察する種々のファージディスプレイ法を使用して、例として、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用して生成することもできる。

ファージディスプレイ技術
ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上に提示される。詳細には、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、リンパ組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリー）から増幅させる。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡを、ｓｃＦｖリンカーと一緒にＰＣＲにより組換え、ファージミドベクター（例えば、ｐ ＣＡＮＴＡＢ ６またはｐＣｏｍｂ ３ ＨＳＳ）中にクローニングする。ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でエレクトロポレートし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をヘルパーファージにより感染させる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、繊維状ファージ、例としてｆｄおよびＭ１３であり、ＶＨおよびＶＬドメインは、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換えにより融合させる。目的のエピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原により、例えば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して、選択または同定することができる。ファージディスプレイ法は、当分野において公知である。

ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離および使用して、全抗体、例としてヒト抗体、または任意の他の所望の抗原結合断片を生成することができ、任意の所望の宿主、例として、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌において、例えば下記のとおり発現させることができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を組換え生成するための技術もまた、当分野において公知の方法を使用して用いることができる。

全抗体を生成するため、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するためのフランキング配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、ｓｃＦｖクローン中のＶＨまたはＶＬ配列を増幅することができる。当分野において公知のクローニング技術を利用して、ＰＣＲ増幅したＶＨドメインをＶＨ定常領域、例えばヒトガンマ４定常領域を発現するベクター中にクローニングすることができ、およびＰＣＲ増幅したＶＬドメインをＶＬ定常領域、例えばヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクター中にクローニングすることができる。ＶＨまたはＶＬドメインを発現させるためのベクターは、プロモーター（例えば、ＥＦ−１αプロモーター）、分泌シグナル（例えばｐｅｌＢシグナル）、可変ドメイン用のクローニング部位、定常ドメイン、および選択マーカー、例えばネオマイシンを含むこともある。ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、必要な定常領域を発現する１つのベクター中にクローニングすることもできる。以下の実施例に詳述するとおり、単一のベクターから２つの軽鎖が発現し得るように、必要なＣＬ領域を発現する１つのベクターに２つのＶＬドメインをクローニングしてもよく（例えば、図３Ａおよび図３Ｂを参照）、および単一のベクターから２つの重鎖が発現し得るように、必要な定常領域を発現する１つのベクターに２つのＶＨドメインをクローニングしてもよい（例えば、図３Ｃを参照）。次いで、重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターを、当業者に公知の技術を使用して細胞系中に同時形質移入し、完全長抗体、例えばＩｇＧを発現する安定または一過性細胞系を生成する。一価二重特異的抗体鎖のクローニングおよび発現の非限定的な例を、実施例１に記載する。

核酸
ポリヌクレオチドを得て、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することは、当分野において公知の任意の方法によることができる。抗体のアミノ酸配列は既知であるため、それらの抗体をコードするヌクレオチド配列は、当分野において公知の方法を使用して決定することができ、例えば特定のアミノ酸をコードすることが分かっているヌクレオチドコドンを、本明細書における抗体またはその断片をコードする核酸を生成するようにアセンブルする。このような抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学合成オリゴヌクレオチドからアセンブルすることができ、簡潔には、抗体をコードする配列の一部を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、次いでライゲートされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅が関わる。

一部の態様において、抗体をコードするポリヌクレオチドは、好適な供給源由来の核酸から生成することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンを入手できず、しかし抗体の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸を化学合成してもよく、または好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、またはその抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から作成されたｃＤＮＡライブラリー、もしくはそれから単離された核酸（ポリＡ＋ＲＮＡであることもある）から、配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅によるか、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングにより、例えば抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを同定して得てもよい。次いで、ＰＣＲにより生成された増幅核酸を、当分野において公知の任意の方法を使用して複製クローニングベクター中にクローニングすることができる。

抗体のヌクレオチド配列を決定したら、抗体のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の操作のための当分野において公知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異導入、ＰＣＲなどを使用して操作して、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成し、例えば、本明細書に提供されるアミノ酸置換を含めた、アミノ酸置換、欠失、および／または挿入を作出し得る。

ある態様において、ＣＤＲの１つ以上を、組換えＤＮＡ技術を使用してフレームワーク領域内に挿入する。フレームワーク領域は、天然に生じるフレームワーク領域またはコンセンサスフレームワーク領域であってよく、ヒトフレームワーク領域であることもある。フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせにより生成されたポリヌクレオチドは、１つまたは複数の選択された抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体をコードし得る。一部の態様において、１つ以上のアミノ酸置換をフレームワーク領域内に作製することができ、アミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善し得る。ポリヌクレオチドの他の変化が本開示により包含され、および／または当分野において公知である。

発現系
本明細書における抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、誘導体、類似体またはその断片の組換え発現は、抗体またはその一部をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を要する。本明細書における抗体または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその一部をコードするポリヌクレオチドが得られると、当分野において公知の方法を使用する組換えＤＮＡ技術により、抗体の生成のためのベクターを生成することができる。したがって、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法が、本明細書に記載される。当業者に公知である方法を使用して、抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。

したがって、本明細書において、プロモーターに機能的に連結された、本明細書における抗体、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメインもしくはその一部、または重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターが提供される。このようなベクターは、抗体の定常ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得、抗体の可変ドメインは、全重鎖、全軽鎖、または全重鎖もしくは全軽鎖の両方の発現のために、このようなベクター中にクローニングすることができる。特に、カッパおよび／またはラムダの任意の組み合わせ（すなわち２つのカッパ軽鎖、２つのラムダ軽鎖、または１つのラムダおよび１つのカッパ軽鎖）であってよい２つの異なる軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターが提供される。また、両方ともＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であってよい２つの異なる重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターも提供される。特に、２つの異なる重鎖と２つの異なる軽鎖とを含む本明細書に提供されるとおりの抗体を発現させるため、これらのベクターが組み合わせて用いられることが企図される。

発現ベクターを、慣用の技術により宿主細胞に移し、次いで形質移入した細胞を慣用の技術により培養して本明細書における抗体を生成する。したがって、本明細書において、異種プロモーターに機能的に連結された、本明細書における抗体もしくはその断片、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはそれらの一部、または本明細書における単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞が提供される。２本鎖抗体の発現のためのある態様において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述するとおり、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中で同時発現させることができる。

本明細書における抗体を発現させるために、種々の宿主発現ベクター系を利用することができる。このような宿主発現系は、目的のコード配列を生成し、続いて精製することができる運搬体を表すが、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換または形質移入された場合、本明細書における抗体をインサイチューで発現し得る細胞も表す。これらには、限定されるものではないが、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された微生物、例えば細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ））；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保持する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、および３Ｔ３細胞）が含まれる。

細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、および真核細胞を、組換え抗体の発現に使用することができる。非限定的な例について、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、ベクター、例えばヒトサイトメガロウイルスからの主要前初期遺伝子プロモーターエレメントと併せて、抗体のための有効な発現系であり得る。

細菌系において、多数の発現ベクターを、発現される抗体のために意図される使用に応じて、有利に選択することができる。例えば、抗体の医薬組成物の生成のために大量のこのようなタンパク質を生成する場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を指向するベクターが望ましいことがある。このようなベクターには、限定されるものではないが、融合タンパク質が生成されるように、抗体コード配列をｌａｃＺコード領域とインフレームでベクターに個々にライゲートすることができる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＵＲ２７８；ｐＩＮベクターなどが含まれる。ＰＧＥＸベクターを使用してグルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来ポリペプチドを発現させることもできる。一般に、このような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合に続くフリーグルタチオンの存在下での溶出により、溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化標的遺伝子生成物がＧＳＴ部分から放出され得るように、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計される。

昆虫系において、キンウワバ科（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病 昆虫系において、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、キンウワバ科（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が使用される。ウイルスは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で成長する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域中に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーターの制御下で配置することができる。

哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的の抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三成分リーダー配列にライゲートすることができる。次いで、このキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノム中に挿入することできる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域ＥＩまたはＥ３）中への挿入は、感染宿主内で生存可能で、抗体を発現し得る組換えウイルスをもたらし得る。また、挿入される抗体コード配列の効率的な翻訳のために、特異的開始シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、挿入物全体の翻訳を保証するため、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームと一致しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方で、種々の起源からのものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの包含により増強することができる。

一部の態様において、挿入された配列の発現をモジュレートする、または遺伝子生成物を所望の規定の様式で修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質生成物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、開裂）は、タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子生成物の翻訳後プロセシングならびに修飾のための、特徴的および特異的機構を有する。適切な細胞系または宿主系を選択して、発現させた外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確保することができる。この目的のため、遺伝子生成物の適切な一次転写物のプロセシング、グリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用することができる。このような哺乳動物宿主細胞には、限定されるものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ、ＮＳ１およびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（いかなる免疫グロブリン鎖も内因的に生成しないマウス骨髄腫細胞系）、ＣＲＬ７Ｏ３ＯならびにＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が含まれる。

組換えタンパク質の長期的な高収率の生成のために、安定的発現が適切である。例えば、抗体を安定的に発現する細胞系を、遺伝子操作することができる。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用する代わりに、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡ、および選択可能なマーカーにより宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入に続いて、遺伝子操作された細胞を強化培地中で１〜２日間増殖させ、次いで、選択培地に切り替えることができる。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをそれらの染色体中に安定的に統合し、成長してフォーカスを形成することを可能とし、次いでそのフォーカスをクローニングし、細胞系に拡張させることができる。この方法は、抗体を発現する細胞系を遺伝子操作するために使用することができる。このような遺伝子操作された細胞系は、抗体と直接的または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価において有用であり得る。

ある態様において、本明細書に提供される抗体は、抗体の一過的発現を有する細胞系中で発現させる。一過的発現は、細胞中に導入された核酸がその細胞のゲノム中にも染色体ＤＮＡ中にも統合しないが、細胞中で染色体外エレメント、例えばエピソームとして維持されるプロセスである。エピソームの核酸転写プロセスは影響を受けず、エピソームの核酸によりコードされるタンパク質が生成される。

安定的または一過的に形質移入された細胞系は、抗体タンパク質の発現および生成をもたらす当分野において公知の細胞培養培地および条件下で維持する。ある態様において、哺乳動物細胞培養培地は、市販の培地配合物、例として、例えばＤＭＥＭまたはＨａｍ’ｓ Ｆ１２をベースとする。一部の態様において、細胞培養培地は、細胞成長および生物タンパク質発現の両方の増加を支持するように改変される。本明細書において使用される用語「細胞培養培地」、「培養培地」および「培地配合物」は、多細胞生物または組織外部の人工インビトロ環境中での細胞の維持、成長、増殖、または拡張のための栄養溶液を指す。細胞培養培地は、規定の細胞培養使用、例として、例えば、細胞成長を促進するために配合された細胞培養成長培地、または組換えタンパク質生成を促進するために配合された細胞培養生成培地について最適化することができる。栄養、成分、および構成成分という用語は、細胞培養培地を構成する構成要素を指すために本明細書において互換的に使用することができる。

種々の態様において、細胞系はフェドバッチ法を使用して維持する。本明細書における「フェドバッチ法」は、フェドバッチ細胞培養物を、最初に基礎培地とインキュベートした後にそれに追加の栄養素を供給する方法を指す。例えば、フェドバッチ法は、決定されたフィードスケジュールに従って所与の期間内で補給培地を添加することを含み得る。したがって、「フェドバッチ細胞培養」は、細胞、典型的には哺乳動物細胞、および細胞培地を、培養ベッセルに最初に供給し、追加の培養栄養素を、培養の間に培養物に継続的にまたは不連続的に増分してフィードし、培養終了前の定期的な細胞および／または生成物回収を伴うまたは伴わない細胞培養を指す。

使用される細胞培養培地およびそれに含有される栄養素は、当分野に公知である。一部の態様において、細胞培養培地は、基礎培地および改変基礎培地をもたらす少なくとも１つの加水分解物、例えば、ダイズベースの加水分解物、酵母ベースの加水分解物、またはこの２タイプの加水分解物の組み合わせを含む。追加の栄養素は、基礎培地、例えば濃縮基礎培地のみを含み得ることもあり、または加水分解物、もしくは濃縮加水分解物のみを含み得る。好適な基礎培地には、限定されるものではないが、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥ／Ｆ１２、最少必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、α−最少必須培地（α−ＭＥＭ）、グラスゴー最少必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、ＰＦ ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯタンパク質不含培地（Ｓｉｇｍａ）またはＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３２５ ＰＦ ＣＨＯ Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ＣＨＯ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）参照、およびイスコフ改変ダルベッコ培地が含まれる。本明細書における技術において使用することができる基礎培地の他の例には、ＢＭＥ基礎培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、粉末）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃３１６００））が含まれる。

ある態様において、基礎培地は血清不含であり得、それは培地が血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウマ血清、ヤギ血清、または当業者に公知の任意の他の動物由来血清）を含有しないことを意味し、または動物タンパク質不含培地もしくは既知組成培地であり得る。

基礎培地は、標準的基礎培地中に見出されるある非栄養構成成分、例えば種々の無機および有機緩衝液、界面活性剤、および塩化ナトリウムを除去するように改変することができる。このような構成成分を基礎細胞培地から除去することにより、残留栄養構成成分の濃度の増加を可能とし、全細胞成長およびタンパク質発現を改善することができる。さらに、排除した構成成分を、細胞培養条件の要求に従って改変基礎細胞培地を含有する細胞培養培地中に戻すことができる。ある態様において、細胞培養培地は、改変基礎細胞培地、および以下の栄養素の少なくとも１つ、鉄源、組換え成長因子；緩衝液；界面活性剤；オスモル濃度調節剤；エネルギー源；および非動物加水分解物を含有する。さらに、改変基礎培地は、場合により、アミノ酸、ビタミン、またはアミノ酸およびビタミンの両方の組み合わせを含有し得る。一部の態様において、改変基礎細胞培地は、グルタミン、例えばＬ−グルタミン、および／またはメトトレキセートをさらに含有する。

一部の態様において、大量の抗体生成は、当分野において公知のフェドバッチ、バッチ、パーフュージョンまたは連続フィードバイオリアクター法を使用するバイオリアクタープロセスにより実施する。ラージスケールバイオリアクターは、少なくとも１０００リットルの容量を有し、約１０００から１０００００リットルの容量を有することもある。これらのバイオリアクターは、撹拌インペラを使用して酸素および栄養素を分布し得る。スモールスケールバイオリアクターは、一般に、容積が約１００リットル以下の細胞培養を指し、約１リットルから約１００リットルの範囲であり得る。あるいは、シングルユースバイオリアクター（ＳＵＢ）は、ラージスケールまたはスモールスケール培養のいずれにも使用することができる。

温度、ｐＨ、撹拌、通気および接種密度は、使用される宿主細胞および発現させる組換えタンパク質に応じて変動し得る。例えば、組換えタンパク質細胞培養物は、３０から４５摂氏度の温度において維持することができる。培養培地のｐＨは、ｐＨが最適レベルにおいて留まるように培養プロセスの間モニタリングすることができ、そのレベルは、ある宿主細胞については６．０から８．０のｐＨ範囲内であり得る。インペラにより駆動される混合は、このような培養法に撹拌のために使用することができる。インペラの回転速度は、約５０から２００ｃｍ／秒の先端速度であり得るが、培養される宿主細胞のタイプに応じて当分野において公知の他のエアリフトまたは他の混合／通気系を使用することができる。さらに、培養される選択宿主細胞に応じて、培養物中の約２０％から８０％空気飽和の溶解酸素濃度を維持するために十分な通気を提供する。あるいは、バイオリアクターは、空気または酸素を培養培地中に直接スパージし得る。他の酸素供給の方法、例として、中空糸膜エアレーターを用いるバブルフリー通気系が存在する。

多数の選択系、例として、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、グルタミンシンテターゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を使用することができ、それらの遺伝子はそれぞれ、ｔｋ−、ｇｓ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞において用いることができる。また、以下の遺伝子についての選択の基礎として、抗代謝産物の耐性を使用することができる：メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ、およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ。

組換えＤＮＡ技術の分野において公知の方法を適用して所望の組換えクローンを選択することができ、その方法には、例として、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、グルタミンシンテターゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それらの遺伝子はそれぞれ、ｔｋ−、ｇｓ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞において用いることができる。

また、以下の遺伝子についての選択の基礎として、抗代謝産物の耐性を使用することができる：メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ。組換えＤＮＡ技術の分野において公知の方法を適用して所望の組換えクローンを選択することができる。

抗体タンパク質の発現レベルは、ベクター増幅により増加させることができる。抗体タンパク質を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤レベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させ得る。増幅領域は、抗体遺伝子と会合しているため、抗体タンパク質の生成も増加し得る。

本明細書に提供される一価二重特異的抗体を生成するため、宿主細胞を本明細書における抗体の２つの発現ベクターにより同時形質移入してもよい；ここでは、各ベクターが重鎖および軽鎖をコードし、したがって２つのベクター間で４つ全ての鎖（すなわち２つの重鎖および２つの軽鎖）がコードされる。各ベクターが重鎖および軽鎖をコードする場合、各ベクターが異なる哺乳動物選択マーカーを含むことが好ましい。２つの異なる選択マーカーを使用することにより、宿主細胞に両方のベクターが存在することが確実になる。あるいは、第１のベクターが２つの重鎖ポリペプチドをコードし（例えば、図３Ｃを参照のこと）、第２のベクターが２つの軽鎖ポリペプチドをコードする（例えば、図３Ａおよび図３Ｂを参照のこと）。各ベクターが重鎖または軽鎖のみを発現する場合、両方のプラスミドを含む宿主細胞のみがＩｇＧを発現することになり、それは主にＭＢａｂである可能性が極めて高いため、２つのベクターは同一の選択可能マーカーを含有し得る。あるいは、全ての重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードし、それらを発現し得る単一のベクターを使用することができる。このような状況において、過剰の毒性フリー重鎖を回避するために、軽鎖は重鎖の前に置かれ得る。本明細書に記載されるとおり、重鎖および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を実現するため複数の方法を利用し得る。重鎖および軽鎖についてのコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。

一部の態様において、宿主細胞は２つの発現ベクターにより同時形質移入される；本明細書に記載される任意の改変を含む第１の重鎖ポリペプチドと、改変を有しないまたは代償性のＦｃ改変を有する第２の重鎖ポリペプチドとをコードする第１のベクター（例えば、図３Ｃを参照のこと）；および第１の重鎖に対応する第１の改変軽鎖ポリペプチドおよび第２の非改変軽鎖ポリペプチドをコードする第２のベクター（例えば、図３Ａおよび図３Ｂを参照のこと）。一部の態様において、各鎖は、それ自体のプロモーターを使用して個別に発現される。単一のベクターからの２つの軽鎖および単一のベクターからの２つの重鎖の発現が、異なる重鎖および軽鎖を有する抗体の生成に特に有用であり得る。さらに、本明細書に記載されるとおり、どの突然変異を各重鎖のＦｃ領域に導入すべきかの選択を用いて、半抗体の生成を最小限に抑えることができる。

１つの改変されたＨＣ−ＬＣ界面と１つの改変されていないＨＣ−ＬＣ界面とを有する抗体を組換え発現によって生成した後、それを当分野において公知の任意の免疫グロブリン分子精製方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特異的抗原に対する親和性によって、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度差、または任意の他の標準的なタンパク質精製技術により精製することができる。さらに、本明細書における抗体またはその断片は、本明細書に記載される、またはそうでなければ当分野において公知の異種ポリペプチド配列に融合させて精製を促進することができる。

抗体精製および単離
本明細書における抗体タンパク質を組換え発現により生成した後、それを当分野において公知の任意の免疫グロブリン分子精製方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に特異的抗原プロテインＡまたはプロテインＧに対する親和性により、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、または任意の他の標準的なタンパク質精製技術により精製することができる。さらに、本技術の抗体またはその断片は、上記のまたはそうでなければ当分野において公知の異種ポリペプチド配列（本明細書において「タグ」と称される）に融合させて精製を促進することができる。一部の態様において、本明細書に提供される抗体は、２つ以上のアフィニティー媒体を含む多段階プロセスにより精製される。本明細書に提供される抗体の精製に有用な媒体には、Ｆｃ部分に特異的な媒体、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ；軽鎖定常領域に特異的な樹脂、例えば、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＫａｐｐａおよびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｌａｍｂｄａ；抗原結合ドメインに特異的な樹脂、例えば、抗原の全てもしくは一部分を組み込むか、または抗ｉｄ抗体結合ドメインを含む樹脂が含まれる。

組換え技術を使用する場合、抗体タンパク質は、細胞内で、ペリプラズム空間中で生成することができ、または培地中に直接分泌させることができる。抗体を細胞内で生成する場合、第１の工程として、粒子状デブリス、宿主細胞または溶解断片を、例えば遠心分離または限外濾過により除去する。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズム空間中に分泌される抗体を単離する手順は当分野において公知である。抗体タンパク質を培地中に分泌させる場合、このような発現系からの上清を一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して最初に濃縮する。プロテアーゼ阻害剤、例えばＰＭＳＦを上記工程のいずれかに含めてタンパク質分解を阻害することができ、抗生物質を含めて外来汚染物質の成長を防止することができる。

細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および／または親和性クロマトグラフィーを単独でまたは他の精製工程と組み合わせて使用して精製することができる。親和性リガンドとしてのプロテインＡの好適性は、種および抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃ領域のアイソタイプに依存し、当業者により理解される。親和性リガンドを付着させるマトリックスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定性のマトリックス、例えば制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースにより達成することができるものよりも早い流速および短い処理時間を可能とする。抗体タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えばイオン交換カラム上でのフラクショネーション、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリン上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥクロマトグラフィー（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿も、回収すべき抗体タンパク質に応じて利用可能である。

任意の事前精製工程に続いて、目的の抗体および汚染物質を含む混合物を、約２．５〜４．５のｐＨにおける溶出緩衝液を使用し、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍ塩）において実施する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することができる。

したがって、ある態様において、本明細書に提供される抗体は、実質的に精製／単離されている。一態様において、これらの精製／単離された組換え発現抗体を患者に投与して予防または治療効果を媒介することができる。一部の態様において、これらの単離／精製された抗体を使用して疾患を診断することができる。

有用な診断方法
ある態様において、本明細書における改変されたＨＣ−ＬＣ界面を有する抗体および組成物は、抗体分子に関連する疾患の診断にインビボおよび／またはインビトロで使用することができる。これは、例えば、場合により対照試料とともに試験用試料を抗体と、抗体と目的の分子との複合体の形成を可能とする条件下で接触させることにより達成することができる。次いで、複合体形成を検出する（例えば、ＥＬＩＳＡを使用）。対照試料を試験試料とともに使用する場合、複合体を両方の試料中で検出し、試料間における複合体形成の任意の統計的に有意な差異が、試験試料中の目的の分子の存在を示す。

一部の態様において、本明細書における技術は、目的の分子を含有する疑いのある試料中のそのような分子の存在を決定する方法であって、本明細書に提供される抗体に試料を曝露し、試料中の目的の分子への抗体の結合を決定することを含む方法を提供し、ここでは試料中の目的の分子への抗体の結合が、試料中の目的の分子の存在を示す。一部の態様において、試料は生物試料である。ある態様において、生物試料は、目的の分子に関連する疾患または障害を罹患しているまたは罹患している疑いがある哺乳動物からのものである。

ある態様において、本明細書に提供される抗体を使用して、インビボ診断アッセイを使用して目的の分子の過剰発現または増幅を検出することができる。一部の態様において、本明細書に提供される抗体が試料に添加され、そこで抗体は検出する目的の分子に結合し、および検出可能な標識（例えば、放射性同位体または蛍光標識）によりタグづけされ、標識の局在について患者を外部からスキャンする。

ＦＩＳＨアッセイ、例えばＩＮＦＯＲＭ（商標）（Ｖｅｎｔａｎａ，Ａｒｉｚ．により販売）またはＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（商標）（Ｖｙｓｉｓ，ＩＩＩ．）をホルマリン固定されたパラフィン包埋組織上で実施して、腫瘍中の目的の分子の過剰発現の程度（存在する場合）を決定することができる。

ある態様において、本明細書に提供される抗体は、目的の分子を発現する細胞の増加に関連する細胞増殖障害を診断する方法において使用することができる。一部の態様において、本方法は、生物試料中の試験細胞を、本明細書に提供される抗体と接触させること；本明細書に提供される抗体の結合を検出することにより試料中の試験細胞中の目的の分子のレベルを決定すること；および対照試料中の細胞に結合した抗体のレベルを比較することを含み、結合した抗体のレベルは、試験試料および対照試料中の目的の分子を発現する細胞の数に正規化され、対照試料と比較して試験試料中の結合した抗体レベルが高ければ、目的の分子を発現する細胞に関連する細胞増殖障害の存在が示される。

ある態様において、本明細書に提供される抗体は、血中または血清中の目的の可溶性分子を検出する方法において使用することができる。一部の態様において、本方法は、目的の分子に関連する障害を罹患している疑いがある哺乳動物からの血液または血清の試験試料を、本明細書に提供される抗体と接触させること、および正常哺乳動物からの血液または血清の対照試料に対する試験試料中の目的の可溶性分子の増加を検出することを含む。一部の態様において、検出する方法は、哺乳動物の血中または血清中の目的の可溶性分子の増加に関連する障害を診断する方法として有用である。

有用な治療方法
種々の態様において、本明細書に提供される抗体は細胞、例えば癌細胞に投与される。本明細書に提供される抗体の生物学的効果、例として、限定されるものではないが、細胞死、細胞増殖阻害、効果の欠如、細胞形態の変化、および細胞成長パターンの変化を観察することができる。一部の態様において、本明細書に提供される抗体は検出可能な標識を含み、および／または腫瘍抗原に対する薬物または毒素を有する。ある態様において、標識は、細胞内の腫瘍抗原の局在を示す。

病態または過剰増殖性障害の例には、良性または悪性の腫瘍、白血病およびリンパ性悪性腫瘍が含まれる。他には、ニューロン、グリア、星状膠、視床下部、腺性、マクロファージ、上皮、内皮、および間質悪性腫瘍が含まれる。他の癌または過剰増殖性障害には、頭部、頸部、眼、口腔、咽頭、食道、胸部、皮膚、骨、肺、結腸、直腸、結腸直腸、胃、脾臓、腎臓、骨格筋、皮下組織、転移性メラノーマ、子宮内膜、前立腺、乳房、卵巣、精巣、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、脳、または中枢神経系の癌が含まれる。本明細書における方法により予防、管理、治療または改善することができる癌の例には、限定されるものではないが、頭部、頸部、眼、口腔、咽頭、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、腎臓、肝臓、膵臓、および脳の癌が含まれる。追加の癌には、限定されるものではないが、以下のもの：白血病、例えば、限定されるものではないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、例えば骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病性白血病および骨髄形成異常症候群、慢性白血病、例えば、限定されるものではないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、へアリー細胞白血病；真性多血症；リンパ腫、例えば、限定されるものではないが、ホジキン病、非ホジキン病；多発性骨髄腫、例えば、限定されるものではないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、単発性形質細胞腫、および髄外性形質細胞腫；ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症；意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン異常症；良性単クローン性ガンマグロブリン血症；重鎖病；骨癌および結合組織肉腫、例えば、限定されるものではないが、骨肉腫、骨髄腫骨疾患、多発性骨髄腫、真珠腫誘発性骨肉腫、骨パジェット病、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部肉腫、血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経線維鞘腫、横紋筋肉腫、および骨膜肉腫；脳腫瘍、例えば、限定されるものではないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起神経膠腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、および原発性脳リンパ腫；乳癌、例として、限定されるものではないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、管内癌、髄様乳癌、ムチン産生乳癌、細管乳癌、乳頭状乳癌、パジェット病（若年性パジェット病を含む）および炎症性乳癌；副腎癌、例えば、限定されるものではないが、褐色細胞腫および副腎皮質癌；甲状腺癌、例えば、限定されるものではないが、乳頭状または小胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌および退形成甲状腺癌；膵臓癌、例えば、限定されるものではないが、インスリノーマ、ガストリン産生腫瘍、グルカゴン産生腫瘍、ＶＩＰ産生腫瘍、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドもしくは島細胞腫；下垂体癌、例えば、限定されるものではないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端肥大症、および尿崩症；眼癌、例えば、限定されるものではないが、眼メラノーマ、例えば虹彩メラノーマ、脈絡膜メラノーマおよび毛様体メラノーマ、ならびに網膜芽細胞腫；膣癌、例えば扁平上皮癌、腺癌、およびメラノーマ；外陰癌、例えば扁平上皮癌、メラノーマ、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病；子宮頸癌、例えば、限定されるものではないが、扁平上皮癌および腺癌；子宮癌、例えば、限定されるものではないが、子宮内膜癌および子宮肉腫；卵巣癌、例えば、限定されるものではないが、卵巣上皮癌、境界性腫瘍、胚細胞腫瘍、および間質腫瘍；食道癌、例えば、限定されるものではないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢包癌、粘表皮癌、腺様扁平上皮癌、肉腫、メラノーマ、形質細胞腫、疣状癌、および燕麦細胞（小細胞）癌；胃癌、例えば、限定されるものではないが、腺癌、菌状発育性病変（ポリープ状）、潰瘍性、表在性、びまん性、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫；結腸癌；直腸癌；肝癌、例えば、限定されるものではないが、肝細胞癌および肝芽腫、胆嚢癌、例えば腺癌；胆管癌、例えば、限定されるものではないが、乳頭状、結節性、およびびまん性；肺癌、例えば非小細胞肺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌；精巣癌、例えば、限定されるものではないが、胚芽性腫瘍、セミノーマ、無形成性、古典的（典型的）、精母細胞、非セミノーマ、胎児性癌、テラトーマ癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）、前立腺癌、例えば、限定されるものではないが、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫；ペナル（ｐｅｎａｌ）癌；口腔癌、例えば、限定されるものではないが、扁平上皮癌；基底癌；唾液腺癌、例えば、限定されるものではないが、腺癌、粘表皮癌および腺様嚢胞癌；咽頭癌、例えば、限定されるものではないが、鱗状細胞癌および疣状；皮膚癌、例えば、限定されるものではないが基底細胞癌、扁平上皮癌およびメラノーマ、表在性メラノーマ、結節性メラノーマ、悪性黒子、末端性黒子性メラノーマ；腎臓癌、例えば、限定されるものではないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌（腎盤および／または尿管）；ウィルムス腫瘍；膀胱癌、例えば、限定されるものではないが、移行上皮癌、鱗状細胞癌、腺癌、癌肉腫が含まれる。さらに、癌には、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌および乳頭状腺癌が含まれる。

アポトーシスの異常により引き起こされる癌を、本明細書における方法および組成物により治療することもできることも企図される。このような癌には、限定されるものではないが、濾胞性リンパ腫、ｐ５３突然変異を有する癌、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに前癌性病変、例えば家族性腺腫様ポリープ症、および骨髄形成異常症候群が含まれ得る。

本明細書における抗体タンパク質および組成物は、多くの目的に、例えば、広範な慢性および急性の疾患および障害、例として、限定されるものではないが、自己免疫および／もしくは炎症障害、例えばシェーグレン症候群、関節リウマチ、狼瘡 乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生性緑内障、血管腫、甲状腺過形成（グレーヴス病を含む）、角膜および他の組織移植、および慢性炎症、敗血症、関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再灌流障害、敗血症、内毒素ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、関節炎（例えば、乾癬性関節炎）、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流障害、脊髄損傷、ならびに同種移植片拒絶に対する治療薬として有用である。

自己免疫および／または炎症障害の例には、限定されるものではないが、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、シェーグレン症候群、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生性緑内障、血管腫、甲状腺過形成（グレーヴス病を含む）、角膜および他の組織移植、および慢性炎症、敗血症、関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再灌流障害、敗血症、内毒素ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、関節炎（例えば、乾癬性関節炎）、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流障害、脊髄損傷および同種移植片拒絶。自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄多発性神経障害、チャーグーストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、円板状狼瘡、必須混合クリオグロブリン血症、線維筋肉痛−線維筋炎、糸球体腎炎、ギランバレー、橋本病甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパチー、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、１型または免疫媒介型糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、例えば疱疹状皮膚炎脈管炎、尋常性白斑およびウェゲナー肉芽腫症が含まれる。

炎症障害の例には、限定されるものではないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節障害、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルスまたは細菌感染から生じる慢性炎症が含まれる。

本明細書における組成物および方法は、上記疾患を予防、管理または治療するために使用される１つ以上の慣用の治療とともに使用することができる。一部の態様において、種々の感染性因子、例えばウイルス、真菌、真核微生物、および細菌を不活性化するための抗体の使用方法も提供される。一部の態様において、本明細書における抗体は、ＲＳＶ、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ、またはインフルエンザウイルスを不活性化するために使用することができる。一部の態様において、本明細書における抗体は、真菌病原体、例えば、限定されるものではないが、ネグレリア属（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラストマイセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）または白癬属（Ｔｉｎｅａ）のメンバーを不活性化するために使用することができる。一部の態様において、本明細書における抗体は、真核微生物、例えば、限定されるものではないが、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、およびエントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）のメンバーを不活性化するために使用することができる。一部の態様において、本明細書における抗体は、細菌病原体、例えば、限定されるものではないが、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｏ）、およびネイセリア属（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ）のメンバーを不活性化するために使用することができる。

本明細書における抗体および組成物は、多くの目的に、例えば、広範な慢性および急性の疾患および障害、例として、限定されるものではないが、感染性疾患、例として、ウイルス性、細菌性、および真菌性疾患に対する治療剤として有用である。ウイルス病原体の例には、限定されるものではないが、アデノウイルス科（例えば、マストアデノウイルス属およびアビアデノウイルス属）、ヘルペスウイルス科（例えば、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、単純ヘルペスウイルス５、および単純ヘルペスウイルス６）、レヴィウイルス科（例えば、レヴィウイルス属、腸内細菌ファージＭＳ２、アロレヴィウイルス属）、ポックスウイルス科（例えば、チョルドポックスウイルス亜科、パラポックスウイルス属、アビポックスウイルス属、カプリポックスウイルス属、レポリポックスウイルス属、スイポックスウイルス属、モルスサイポックスウイルス属、およびエントモポックスウイルス亜科）、パポーバウイルス科（例えば、ポリオーマウイルス属およびパピローマウイルス属）、パラミクソウイルス科（例えば、パラミクソウイルス属、パラインフルエンザウイルス１、モルビリウイルス属（例えば、麻疹ウイルス）、ルブラウイルス属（例えば、ムンプスウイルス）、ニューモノウイルス亜科（例えば、ニューモウイルス属、ヒト呼吸器合包体ウイルス）およびメタニューモウイルス（例えば、トリニューモウイルスおよびヒトメタニューモウイルス））、ピコルナウイルス科（例えば、エンテロウイルス属、ライノウイルス属、ヘパトウイルス属（例えば、ヒトＡ型肝炎ウイルス）、カルヂオウイルス属、およびアフトウイルス属）、レオウイルス科（例えば、オルソレオウイルス属、オルビウイルス属、ロタウイルス属、シポウイルス属、フィジーウイルス属、フィトレオウイルス属、およびオリザウイルス属）、レトロウイルス科（例えば、哺乳類Ｂ型レトロウイルス属、哺乳動物Ｃ型レトロウイルス属、トリＣ型レトロウイルス属、Ｄ型レトロウイルス群、ＢＬＶＨＴＬＶレトロウイルス、レンチウイルス属（例えば、ヒト免疫不全ウイルス１およびヒト免疫不全ウイルス２）、スプマウイルス属）、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、トガウイルス科（例えば、アルファウイルス属（例えば、シンドビスウイルス）およびルビウイルス属（例えば、風疹ウイルス））、ラブドウイルス科（例えば、ベシクロウイルス属、リッサウイルス属、エフェメロウイルス属、シトラブドウイルス属、およびヌクレオラブドウイルス属）、アレナウイルス科（例えば、アレナウイルス属、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イッピーウイルス、およびラッサウイルス）、ならびにコロナウイルス科（例えば、コロナウイルス属およびトロウイルス属）が含まれる。

細菌病原体の例には、限定されるものではないが、アクワスピリルム（Ａｑｕａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）科、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）科、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）科、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）科、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）種、ブデロビブリオ（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）科、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種（例えば、クラミジア肺炎菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、クロストリジウム、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科（例えば、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、エドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター・エアロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）種、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）種、クレブジエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）種、変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、セラティア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、およびシゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ））、ガルジネラ（Ｇａｒｄｉｎｅｌｌａ）科、インフルエンザエ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）科、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎａｌｌａｃｅａｅ）科、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科、マイコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（例えば結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）科、オセアノスピリルム（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）科、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）科、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）科、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）科、スピロソマセア（Ｓｐｉｒｏｓｏｍａｃｅａｅ）科、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓ）（例えば、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、およびスタフィロコッカス・パイロゲネス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ））、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、腸炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・フェーシエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｓｃｉａｅ）、および肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、バンピロビブルヘリコバクター（Ｖａｍｐｉｒｏｖｉｂｒ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）科、ならびにバンピロビブリオ（Ｖａｍｐｉｒｏｖｉｂｒｉｏ）科が含まれる。

真菌病原体の例には、限定されるものではないが、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）種（例えば、アブシディア・コリムビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）およびアブシディア・ラモサ（Ａｂｓｉｄｉａ ｒａｍｏｓａ））、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種（例えば、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、およびアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ））、バシジオボルス・ラナルム（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｒａｎａｒｕｍ）、ブラストマイセス・デルマティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、カンジダ種（例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ガラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・ケル（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｒｒ）、カンジダ・クルーゼイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・シュードトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・クイレルモンディイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｑｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・ルゴーザ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、カンジダ・ステラトイデア（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）、およびカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、コニジオボルス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）種、クリプトコッカス・ネオフォルムス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍｓ）、カニンガメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）種、皮膚糸状菌、ヒストプラズマ・カプスラタム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、マイクロスポルム・ジプセウム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｅｕｍ）、ムコル・プシルス（Ｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、パラコッキディオイデス・ブラシリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、シューダルエシェリア・ボイディイイ（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ）、リノスポリジウム・シーベリ（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｅｂｅｒｉ）、ニューモシスティス・カリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種（例えば、リゾップス・アルヒザス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ）、リゾップス・オライザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、およびリゾップス・マイクロスポルス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ））、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、スポロトリクス・シェネキイイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、ならびに例えば接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、不完全菌（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）、および卵菌（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）等の綱が含まれる。

一部の態様において、細胞集団を枯渇させるための抗体の使用方法も提供される。一態様において、本明細書における方法は、以下の細胞タイプ：好酸球、好塩基球、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、単球、内皮細胞、および腫瘍細胞を枯渇させるのに有用である。

ある態様において、本明細書における抗体、疾患またはその症状の診断および検出においても有用であり得る。一部の態様において、本明細書における組成物は、疾患進行のモニタリングにおいて有用であり得る。種々の態様において、本明細書における組成物は、治療レジメンのモニタリングにおいて有用であり得る。ある態様において、本明細書における組成物は、エクスビボ用途、例えば、診断キットにおける診断に有用であり得る。

本明細書における組成物は、標的抗原の可視化において有用であり得る。一部の態様において、標的抗原は、内在化する細胞表面受容体である。ある態様において、標的抗原は、細胞内抗原である。一部の態様において、標的は、核内抗原である。一部の態様において、本明細書における抗体のあるものは、細胞に結合すると細胞内に内在化する。

コンジュゲート
本明細書に提供される抗体は非コンジュゲート型で使用されてもよく、または標的検出を促進するため、またはイメージングもしくは療法用に、種々の異種部分の少なくとも１つとコンジュゲートしてもよい。精製を実施する場合、精製前または精製後にＴｎ３足場を標識またはコンジュゲートすることができる。

多くの異種部分は、本明細書における抗体を結合することのできる好適な官能基を欠いている。したがって、一部の態様において、エフェクター分子がリンカーを介して足場に結合され、ここでリンカーは、コンジュゲーション用の反応基を含む。一部の態様において、本明細書における抗体にコンジュゲートした異種部分が、リンカーとして機能することができる。他の態様において、部分は、開裂可能または開裂不可能であってよいリンカーを介して本明細書における抗体にコンジュゲートすることができる。一態様において、開裂可能結合分子はレドックス開裂可能結合分子であり、したがって結合分子は、より低い酸化還元電位の環境、例えば細胞質および遊離スルフヒドリル基を有する分子の濃度がより高い他の領域で開裂可能である。酸化還元電位の変化により開裂し得る結合分子の例には、ジスルフィドを含有するものが含まれる。

一部の態様において、本明細書における抗体は、コンジュゲーション用の反応基を提供するように遺伝子操作される。そのような抗体では、Ｎ末端および／またはＣ末端もまた、コンジュゲーション用の反応基を提供する働きをし得る。他の態様において、Ｎ末端がある部分（例えば、限定されるものではないがＰＥＧ）にコンジュゲートされ、一方でＣ末端が別の部分（例えば、限定されるものではないがビオチン）にコンジュゲートされてもよく、逆もまた同様である。

用語「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、カップリング剤、カップリング部分または活性化部分（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アジリジン、オキシラン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはマレイミド部分を含む）を伴うまたは伴わないポリエチレングリコール化合物またはその誘導体を意味する。用語「ＰＥＧ」は、例えば末端ＯＨ基がメトキシ基により置き換えられた類似体（ｍＰＥＧと称される）を含めて、分子量５００〜１５０，０００Ｄａのポリエチレングリコールを示すことが意図される。

本明細書における抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により誘導体化され得る。ＰＥＧは、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンオキシド繰り返し単位の線状の水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、典型的には約５００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの範囲であるその分子量によって分類される。特定の態様において、用いられるＰＥＧは、５，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。本明細書における足場とカップリングされるＰＥＧは、分枝鎖または非分枝鎖のいずれであってもよい。例えば、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ６：６２−６９を参照。ＰＥＧは、Ｎｅｋｔａｒ Ｉｎｃ．、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．および他の会社から市販されている。そのようなＰＥＧとしては、限定されるものではないが、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルスクシネート（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、およびモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）が含まれる。

簡潔に言えば、用いられる親水性ポリマー、例えばＰＥＧは、一端でメトキシ基またはエトキシ基などの非反応性基によりキャッピングされる。その後、好適な活性化剤、例えばハロゲン化シアヌル（例えば、塩化、臭化またはフッ化シアヌル）、カルボニルジイミダゾール、無水物試薬（例えば、無水ジブロモコハク酸などの無水ジハロコハク酸）、アシルアジド、ｐ−ジアゾニウムベンジルエーテル、３−（ｐ−ジアゾニウムフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピルエーテル）などとの反応により、他端でポリマーが活性化される。次いで、活性化されたポリマーを、本明細書に記載されるとおりのポリペプチドと反応させて、ポリマーにより誘導体化されたポリペプチドを生成する。あるいは、ポリマーとの反応のため本明細書における抗体中の官能基を活性化してもよく、または協奏的カップリング反応において公知のカップリング方法を用いて２つの基をつなぎ合わせてもよい。当分野において公知の無数の他の反応スキームを用いて本明細書におけるポリペプチドをＰＥＧにより誘導体化し得ることは、容易に理解されるであろう。ＰＥＧは本明細書における足場と、抗体のいずれかの末端にあるまたは抗体内部にある１つ以上の官能基でカップリングすることができる。ある態様において、ＰＥＧはＮ末端またはＣ末端のいずれかでカップリングされる。

他の態様において、本明細書における抗体、その類似体または誘導体は、診断剤または検出可能な薬剤にコンジュゲートされてもよい。このような抗体は、臨床試験手順の一部としての疾患の発生または進行のモニタリングまたは予後診断、例えば特定療法の効力の決定に有用であり得る。

本明細書における技術は、治療部分にコンジュゲートした本明細書における抗体の使用をさらに包含する。本明細書における抗体は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤または細胞破壊剤、治療剤または放射性金属イオン、例えばアルファ放射体などの治療部分にコンジュゲートされてもよい。細胞毒素または細胞傷害剤には、細胞に有害な任意の薬剤が含まれる。

組成物
ある態様において、本開示は組成物を提供する。そのような組成物は、本明細書に提供される抗体をコードする核酸分子を含む組成物であり得る。そのような医薬組成物はまた、本明細書に提供される抗体を含む組成物、または本明細書における抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤との組み合わせであってもよい。ある態様において、本開示の組成物は薬物として用いられる。

ある態様において、本明細書における抗体または本明細書における抗体の組み合わせ（または１つ以上の本明細書における抗体をコードする核酸分子）は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または安定剤と共に医薬組成物として製剤化されてもよい。ある態様において、そのような医薬組成物は、当分野において公知の方法を用いた任意の１つ以上の投与経路を介したヒトまたは非ヒト動物への投与に好適である。当業者により理解されるであろうとおり、投与の経路および／または様式は、所望の結果により変動し得る。用語「薬学的に許容可能な担体」は、活性成分の生物活性の有効性を妨げない１つ以上の非毒性材料を意味する。そのような調製物は、ルーチン的に、塩、緩衝剤、保存剤、適合担体、および場合により他の治療剤を含有し得る。そのような薬学的に許容可能な調製物はまた、ヒトへの投与に好適な適合する固形または液状充填剤、希釈剤または封入物質も含有し得る。本明細書に記載される製剤において利用され得る他の企図される担体、賦形剤、および／または添加剤には、例えば、香味剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、脂質、タンパク質賦形剤、例えば血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン、塩形成対イオン、例えばナトリウムなどが含まれる。本明細書に記載される製剤における使用に好適なこれらのおよび他の公知の医薬担体、賦形剤および／または添加剤は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２１^ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００５）、および“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，６０^ｔｈ ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．（２００５）に掲載されるとおり、当分野において公知である。投与様式、所望のまたは要求される溶解度および／または安定性に好適な薬学的に許容可能な担体は、ルーチン的に選択することができる。

一態様において、本開示の製剤は、内毒素および／または関連発熱物質を実質的に含まない発熱物質不含製剤である。内毒素には、微生物の内部に封じ込められていて、微生物が破壊または死滅した場合にのみ放出される毒素が含まれる。発熱物質には、細菌および他の微生物の外膜からの発熱誘発性熱安定性物質（糖タンパク質）も含まれる。これらの物質は両方とも、ヒトに投与された場合に、発熱、低血圧、およびショックを引き起こし得る。この潜在的な有害効果のため、内毒素は、たとえ少量であっても、静脈内投与される医薬品溶液から除去されなければならない。Ｆｏｏｄ ＆ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬物適用の１回の１時間の期間中、５内毒素単位（ＥＵ）／用量／キログラム体重の上限を定めている（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｆｏｒｕｍ ２６（１）：２２３（２０００））。ある特定の態様では、組成物中の内毒素および発熱物質レベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、または５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。

生体内投与に使用する場合、本開示の製剤は無菌でなければならない。本開示の製剤は、滅菌濾過、放射線等を含む種々の滅菌方法により滅菌することができる。一態様において、製剤は予め滅菌された０．２２ミクロンフィルタで濾過滅菌される。注射用の無菌組成物は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２１^ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００５）に記載されるとおりの従来の薬務に従い製剤化することができる。

本開示の治療組成物は、特定の投与経路、例えば、経口、経鼻、肺内、局所（頬側および舌下を含む）、直腸、腟および／または非経口投与用に製剤化することができる。本明細書において使用される語句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、腸内および局所投与以外の投与様式を指し、通常は、注射によるものであり、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が含まれる。局所または経皮投与に好適な本開示の製剤には、粉末、噴霧剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入薬が含まれる。ｉＭｅｒは無菌条件下で薬学的に許容可能な担体と、および必要とされ得る任意の保存剤、緩衝液、または噴射剤と混合され得る（米国特許第７，３７８，１１０号明細書；同第７，２５８，８７３号明細書；同第７，１３５，１８０号明細書；米国特許出願公開第２００４−００４２９７２号明細書；および同第２００４−００４２９７１号明細書）。

製剤は、好都合には単位剤で存在してもよく、薬学分野において公知の任意の方法により調製されてもよい。本開示の医薬組成物における活性成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性となることなく、特定の患者、組成物、および投与様式に所望される治療応答を達成するのに有効な活性成分量（例えば「治療有効量」）が得られるように変えることができる。選択される投与量レベルは、種々の薬物動態学的要因、例として、用いられる特定の組成物の活性、投与経路、投与時点、用いられる特定の化合物の排泄速度、治療の持続期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、病態、全体的健康状態、および病歴、ならびに医学分野において周知されている同様の要因に依存し得る。好適な投与量は、約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重以上、例えば約０．１、１、１０、または５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であってよく、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重が好適である。

本開示は、診断および研究用途に好適な製剤が作製されてもまたよいことを同様に企図することに留意されたい。そのような製剤における活性薬剤の濃度、ならびに賦形剤および／または発熱物質の存在または非存在は、特定の適用および目的の用途に基づき選択することができる。

実施形態
以下、本技術の特定の実施形態の非限定的な例を提供する。

Ａ１．改変重鎖を含む抗体であって、改変重鎖が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、抗体。

Ａ２．ＣＨ１領域が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、実施形態Ａ１の抗体。

Ａ３．ＣＨ１領域が天然システインから非システインアミノ酸への置換を含み、かつＶＨ領域が天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、実施形態Ａ１の抗体。

Ａ４．重鎖天然システインが鎖間ジスルフィド結合を形成し得る、実施形態Ａ１〜Ａ３のいずれか一つの抗体。

Ａ５．改変軽鎖をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ４のいずれか一つの抗体であって、改変軽鎖が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、抗体。

Ａ６．ＣＬ領域が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、実施形態Ａ５の抗体。

Ａ７．ＣＬ領域が天然システインから非システインアミノ酸への置換を含み、かつＶＬ領域が天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、実施形態Ａ５の抗体。

Ａ８．軽鎖天然システインが鎖間ジスルフィド結合を形成し得る、Ａ５〜Ａ７のいずれか一つの抗体。

Ａ９．天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換から得られる、改変重鎖の置換システインと、天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換から得られる、改変軽鎖の置換システインとが、ジスルフィド結合を形成することができる、実施形態Ａ５〜Ａ８のいずれか一つの抗体。

Ａ１０．２つの重鎖および２つの軽鎖を含む、実施形態Ａ１〜Ａ９のいずれか一つの抗体。

Ａ１１．２つの重鎖および２つの軽鎖が４つの別個のポリペプチドである、実施形態Ａ１０の抗体。

Ａ１２．２つの重鎖および２つの軽鎖が単一のポリペプチドである、実施形態Ａ１０の抗体。

Ａ１３．完全長抗体である、実施形態Ａ１〜Ａ１２のいずれか一つの抗体。

Ａ１４．２つの重鎖がそれぞれＶＨドメイン、ＣＨ１ドメインおよびＦｃ領域を含み、ＶＨドメインが同一であるかまたは異なるアミノ酸配列を有し、ＣＨ１ドメインが異なるアミノ酸配列を有し、かつＦｃ領域が異なるアミノ酸配列を有する、実施形態Ａ１０〜Ａ１３のいずれか一つの抗体。

Ａ１５．２つの重鎖がヘテロダイマーを形成する、実施形態Ａ１４の抗体。

Ａ１６．２つの軽鎖がそれぞれＶＬドメインおよびＣＬドメインを含み、ＶＬドメインが同一であるかまたは異なるアミノ酸配列を有し、かつＣＬドメインが異なるアミノ酸配列を有する、実施形態Ａ１０〜Ａ１５のいずれか一つの抗体。

Ａ１７．２つの独立した抗原または同じ抗原上の２つの独立したエピトープに特異的に結合する、実施形態Ａ１〜Ａ１６のいずれか一つの抗体。

Ａ１８．２つの独立した抗原に対する結合親和性が同一であるかまたは異なる、実施形態Ａ１７の抗体。

Ａ１９．同じ抗原上の２つの独立したエピトープに対する結合親和性が同一であるかまたは異なる、実施形態Ａ１７の抗体。

Ａ２０．２つの異なる結合親和性で同じエピトープに特異的に結合する、実施形態Ａ１７の抗体。

Ａ２１．軽鎖がカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖である、実施形態Ａ５〜Ａ２０のいずれか一つの抗体。

Ａ２２．１つの軽鎖がカッパ軽鎖であり、かつ１つの軽鎖がラムダ軽鎖である、実施形態Ａ１０〜Ａ２０のいずれか一つの抗体。

Ａ２３．（ｉ）ＣＨ１領域に改変を含む１つの改変重鎖、およびＣＬ領域に改変を含む対応する１つの改変軽鎖と、（ｉｉ）ＣＨ１領域およびＣＬ領域が改変されていない、第２の重鎖および対応する軽鎖とを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２２のいずれか一つの抗体。

Ａ２４．免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である、実施形態Ａ１〜Ａ２３のいずれか一つの抗体。

Ａ２５．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置２２０に天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか一つの抗体。

Ａ２６．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１および／または２１９および／または２２０に天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか一つの抗体。

Ａ２７．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１および２１９および２２０のそれぞれに天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか一つの抗体。

Ａ２８．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれに天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか一つの抗体。

Ａ２９．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１に天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれか一つの抗体。

Ａ３０．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置２１４に天然システインから非システインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ２９の抗体。

Ａ３１．非システインアミノ酸がバリンまたはアラニンである、実施形態Ａ２４〜Ａ３０のいずれか一つの抗体。

Ａ３２．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ２４〜Ａ３１のいずれか一つの抗体。

Ａ３３．改変重鎖が、ＣＨ領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ３２の抗体。

Ａ３４．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ３２の抗体。

Ａ３５．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ３２の抗体。

Ａ３６．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ３２〜Ａ３４のいずれか一つの抗体。

Ａ３７．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ３２、Ａ３４、Ａ３５またはＡ３６のいずれか一つの抗体。

Ａ３８．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１６における天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換と、ＣＬ領域の位置２１４における天然システインから非システインアミノ酸への置換とを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ３２〜Ａ３７のいずれか一つの抗体。

Ａ３９．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１６におけるフェニルアラニンまたはトレオニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ３２〜Ａ３８のいずれか一つの抗体。

Ａ４０．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ３２〜Ａ３９のいずれか一つの抗体。

Ａ４１．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１６におけるトレオニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ３２〜Ａ３９のいずれか一つの抗体。

Ａ４２．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ２４〜Ａ３１のいずれか一つの抗体。

Ａ４３．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ４２の抗体。

Ａ４４．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ４２の抗体。

Ａ４５．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ４２の抗体。

Ａ４６．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ４２〜Ａ４４のいずれか一つの抗体。

Ａ４７．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ４２、Ａ４４またはＡ４５のいずれか一つの抗体。

Ａ４８．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１６４における天然非システインアミノ酸からシステインへの置換と、ＣＬ領域の位置２１４における天然システインから非システインアミノ酸への置換とを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ４２〜Ａ４７のいずれか一つの抗体。

Ａ４９．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１６４におけるトレオニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインが非システインアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ４２〜Ａ４８のいずれか一つの抗体。

Ａ５０．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１６４におけるトレオニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ４２〜Ａ４９のいずれか一つの抗体。

Ａ５１．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ２４〜Ａ３１のいずれか一つの抗体。

Ａ５２．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ５１の抗体。

Ａ５３．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ５１の抗体。

Ａ５４．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ５１の抗体。

Ａ５５．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ５１〜Ａ５３のいずれか一つの抗体。

Ａ５６．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ５１またはＡ５３〜Ａ５５のいずれか一つの抗体。

Ａ５７．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１２１における天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換と、ＣＬ領域の位置２１４における天然システインから非システインアミノ酸への置換とを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ５１〜Ａ５６のいずれか一つの抗体。

Ａ５８．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１２１のセリンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ５１〜Ａ５７のいずれか一つの抗体。

Ａ５９．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１２１におけるセリンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ５１〜Ａ４８のいずれか一つの抗体。

Ａ６０．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８における天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ２４〜Ａ３１のいずれか一つの抗体。

Ａ６１．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ６０の抗体。

Ａ６２．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ６０の抗体。

Ａ６３．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ６０の抗体。

Ａ６４．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ６０〜Ａ６２のいずれか一つの抗体。

Ａ６５．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ６０またはＡ６２〜Ａ６４のいずれか一つの抗体。

Ａ６６．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１８における天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換と、ＣＬ領域の位置２１４における天然システインから非システインアミノ酸への置換とを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ６０〜Ａ６５のいずれか一つの抗体。

Ａ６７．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１８におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ６０〜Ａ６６のいずれか一つの抗体。

Ａ６８．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１８におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ６０〜Ａ６７のいずれか一つの抗体。

Ａ６９．改変重鎖が、可変領域の位置４４に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる、実施形態Ａ２４〜Ａ３１のいずれか一つの抗体。

Ａ７０．改変重鎖が、可変領域の位置４４に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＫａｂａｔインデックスにより、かつＣＨ領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されており、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ６９の抗体。

Ａ７１．改変重鎖が、可変領域の位置４４に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＫａｂａｔインデックスにより、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されており、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ６９の抗体。

Ａ７２．改変重鎖が、可変領域の位置４４に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＫａｂａｔインデックスにより、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されており、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ６９の抗体。

Ａ７３．対応する改変軽鎖が、可変領域の位置１００における天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換（ナンバリングはＫａｂａｔによる）と、ＣＬ領域の位置２１４における天然システインから非システインアミノ酸への置換（ナンバリングはＥＵインデックスによる）とを含む、実施形態Ａ６９〜Ａ７２のいずれか一つの抗体。

Ａ７４．一方または両方の重鎖のＦｃ領域が１つ以上の改変を含む、実施形態Ａ１４〜Ａ７３のいずれか一つの抗体。

Ａ７５．Ｆｃ領域における改変が、重鎖のヘテロダイマー化を促進する、実施形態Ａ７４の抗体。

Ａ７６．Ｆｃ領域における改変がプロテインＡ結合を変化させ、かつ一方の重鎖にのみ存在する、実施形態Ａ７４の抗体。

Ａ７７．プロテインＡ結合を変化させ、かつ一方の重鎖にのみ存在するＦｃ領域における改変をさらに含む、実施形態Ａ７５の抗体。

Ａ７８．抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつプロテインＡ結合を変化させるＦｃ領域改変がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆであり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ７６またはＡ７７の抗体。

Ａ７９．抗体がＩｇＧ３であり、かつプロテインＡ結合を変化させるＦｃ領域改変がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙであり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ７６またはＡ７７の抗体。

Ａ８０．改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ１４〜Ａ７５のいずれか一つの抗体。

Ａ８１．抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ８０の抗体。

Ａ８２．抗体がＩｇＧ３であり、かつ改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ８０の抗体。

Ａ８３．改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含み、かつ第２の重鎖が、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含むＦｃ（ｂ）領域を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ１４〜Ａ７５のいずれか一つの抗体。

Ａ８４．抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつ改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ８３の抗体。

Ａ８５．抗体がＩｇＧ３であり、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ８３の抗体。

Ａ８６．改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ８０〜Ａ８５のいずれか一つの抗体。

Ａ８７．改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含み、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ａ８０〜Ａ８５のいずれか一つの抗体。

Ａ８８．Ｆｃ領域における改変が抗体の半減期を変化させ、半減期がＦｃＲｎ結合親和性に依存する、実施形態Ａ７４の抗体。

Ａ８９．抗体の半減期を変化させるＦｃ領域における改変をさらに含む、実施形態Ａ５７ｂ〜Ａ５９ｄのいずれか一つの抗体であって、半減期がＦｃＲｎ結合親和性に依存する、抗体。

Ａ９０．エフェクター機能を変化させるＦｃ領域における改変、Ｆｃガンマ受容体またはＣ１ｑ補体タンパク質に対する結合親和性が増加または減少する、実施形態Ａ７４のいずれか一つの抗体。

Ａ９１．エフェクター機能を変化させるＦｃ領域における改変をさらに含む、実施形態Ａ７７〜Ａ８９のいずれか一つの抗体であって、Ｆｃガンマ受容体またはＣ１ｑ補体タンパク質に対する結合親和性が増加または減少する、抗体。

Ａ９２．ヒト抗体である、実施形態Ａ１〜Ａ９１のいずれか一つの抗体。

Ａ９３．ヒト化抗体である、実施形態Ａ１〜Ａ９１のいずれか一つの抗体。

Ａ９４．キメラ抗体である、実施形態Ａ１〜Ａ９１のいずれか一つの抗体。

Ｂ１．改変重鎖を含む抗体であって、改変重鎖が、突出および／または空洞をもたらすＣＨ１領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む、抗体。

Ｂ２．改変重鎖が、天然システインから非システインアミノ酸への置換をさらに含む、実施形態Ｂ１の抗体。

Ｂ３．重鎖天然システインが鎖間ジスルフィド結合を形成し得る、実施形態Ｂ２の抗体。

Ｂ４．改変軽鎖をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ３のいずれか一つの抗体であって、改変軽鎖が、代償性の空洞および／または突出をもたらすＣＬ領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む、抗体。

Ｂ５．改変が、改変重鎖と改変軽鎖との鎖間ペアリングに有利に働く、実施形態Ｂ４の抗体。

Ｂ６．改変軽鎖が、天然システインから非システインアミノ酸への置換をさらに含む、実施形態Ｂ４またはＢ５の抗体。

Ｂ７．軽鎖天然システインが鎖間ジスルフィド結合を形成し得る、実施形態Ｂ６の抗体。

Ｂ８．第２の重鎖および第２の軽鎖をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ７のいずれか一つの抗体。

Ｂ９．２つの重鎖および軽鎖が４つの別個のポリペプチドである、実施形態Ｂ８の抗体。

Ｂ１０．２つの重鎖および２つの軽鎖が単一のポリペプチドである、実施形態Ｂ８の抗体。

Ｂ１１．完全長抗体である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１０のいずれか一つの抗体。

Ｂ１２．第１および第２の重鎖がそれぞれＶＨドメイン、ＣＨ１ドメインおよびＦｃ領域を含み、ＶＨドメインが同一であるかまたは異なるアミノ酸配列を有し、ＣＨ１ドメインが異なるアミノ酸配列を有し、かつＦｃ領域が異なるアミノ酸配列を有する、実施形態Ｂ８〜Ｂ１１のいずれか一つの抗体。

Ｂ１３．第１および第２の重鎖がヘテロダイマーを形成する、実施形態Ｂ１２の抗体。

Ｂ１４．第１および第２の軽鎖がそれぞれＶＬドメインおよびＣＬドメインを含み、ＶＬドメインが同一であるかまたは異なるアミノ酸配列を有し、かつＣＬドメインが異なるアミノ酸配列を有する、実施形態Ｂ８〜Ｂ１３のいずれか一つの抗体。

Ｂ１５．２つの独立した抗原または同じ抗原上の２つの独立したエピトープに特異的に結合する、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか一つの抗体。

Ｂ１６．２つの独立した抗原に対する結合親和性が同一であるかまたは異なる、実施形態Ｂ１５の抗体。

Ｂ１７．同じ抗原上の２つの独立したエピトープに対する結合親和性が同一であるかまたは異なる、実施形態Ｂ１５の抗体。

Ｂ１８．２つの異なる結合親和性で同じエピトープに特異的に結合する、実施形態Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか一つの抗体。

Ｂ１９．第１および第２の軽鎖がカッパ軽鎖であるか、またはラムダ軽鎖である、実施形態Ｂ８〜Ｂ１８のいずれか一つの抗体。

Ｂ２０．１つの軽鎖がカッパ軽鎖であり、かつ１つの軽鎖がラムダ軽鎖である、実施形態Ｂ８〜Ｂ１８のいずれか一つの抗体。

Ｂ２１．（ｉ）ＣＨ１領域に改変を含む１つの改変重鎖、およびＣＬ領域に改変を含む対応する１つの改変軽鎖と、（ｉｉ）ＣＨ１領域およびＣＬ領域が改変されていない、第２の重鎖および対応する軽鎖とを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２０のいずれか一つの抗体。

Ｂ２２．第２の重鎖が、突出および／または空洞をもたらすＣＨ１領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む改変重鎖である、実施形態Ｂ８〜Ｂ２０のいずれか一つの抗体。

Ｂ２３．第２の改変重鎖が、天然システインから非システインアミノ酸への置換をさらに含んだ、実施形態Ｂ２２の抗体。

Ｂ２４．重鎖天然システインが鎖間ジスルフィド結合を形成し得る、実施形態Ｂ２３の抗体。

Ｂ２５．第２の軽鎖が、代償性の空洞および／または突出をもたらすＣＬ領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む改変軽鎖である、実施形態Ｂ２２〜Ｂ２４のいずれか一つの抗体。

Ｂ２６．改変が、第２の改変重鎖と第２の改変軽鎖との鎖間ペアリングに有利に働く、実施形態Ｂ２０の抗体。

Ｂ２７．第２の改変軽鎖が、天然システインから非システインアミノ酸への置換をさらに含む、実施形態Ｂ２５またはＢ２６の抗体。

Ｂ２８．軽鎖天然システインが鎖間ジスルフィド結合を形成し得る、実施形態Ｂ２７の抗体。

Ｂ２９．第１および／または第２の改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置２２０に天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ２〜Ｂ２８のいずれか一つの抗体。

Ｂ３０．第１および／または第２の改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１および２１９および２２０のそれぞれに天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ２〜Ｂ２８のいずれか一つの抗体。

Ｂ３１．第１および／または第２の改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれに天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ２〜Ｂ２８のいずれか一つの抗体。

Ｂ３２．第１および／または第２の改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１に天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ２〜Ｂ２８のいずれか一つの抗体。

Ｂ３３．第１および／または第２の改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置２１４に天然システインから非システインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ６〜Ｂ３２のいずれか一つの抗体。

Ｂ３４．非システインアミノ酸がバリンまたはアラニンである、実施形態Ｂ２〜Ｂ３３のいずれか一つの抗体。

Ｂ３５．突出および／または空洞をもたらすＣＨ１領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換が、位置１４５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換、位置１７０におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換、位置１８３におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換、および位置１８５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ１〜Ｂ３４のいずれか一つの抗体。

Ｂ３６．位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１４５におけるロイシンがフェニルアラニンにより置換されており、位置１７０におけるフェニルアラニンがバリンにより置換されており、位置１８３におけるセリンがフェニルアラニンにより置換されており、かつ位置１８５におけるバリンがフェニルアラニンにより置換されており、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ３５の抗体。

Ｂ３７．代償性の空洞および／または突出をもたらすＣＬ領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換が、位置１７６におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換、および位置１７８におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ３５またはＢ３６の抗体。

Ｂ３８．位置１７６におけるセリンがフェニルアラニンにより置換されており、かつ位置１７８におけるトレオニンまたはチロシンがアラニンにより置換されており、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ３７の抗体。

Ｂ３９．突出および／または空洞をもたらすＣＨ１領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換が、位置１４７におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換、および位置１８５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ１〜Ｂ２８のいずれか一つの抗体。

Ｂ４０．位置１４７におけるリジンがアラニンにより置換されており、かつ位置１８５におけるバリンがトリプトファンにより置換されており、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ３９の抗体。

Ｂ４１．代償性の空洞および／または突出をもたらすＣＬ領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換が、位置１３１におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換、および位置１３５におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ３９またはＢ４０の抗体。

Ｂ４２．位置１３１におけるセリンまたはトレオニンがトリプトファンにより置換されており、かつ位置１３５におけるロイシンがグリシンにより置換されており、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ４１の抗体。

Ｂ４３．実施形態Ｂ２４〜Ｂ３４のいずれか一つの抗体であって、
（ａ）改変重鎖が、位置１４５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１７０におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１８３におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１８５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み；および
（ｂ）改変軽鎖が、位置１７６におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１７８におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み、
ナンバリングはＥＵインデックスによる、抗体。

Ｂ４４．実施形態Ｂ２４〜Ｂ３４のいずれか一つの抗体であって、
（ａ）改変重鎖が、位置１４７におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１８５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み；および
（ｂ）改変軽鎖が、位置１３１におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１３５におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み、
ナンバリングはＥＵインデックスによる、抗体。

Ｂ４５．実施形態Ｂ２５〜Ｂ３４のいずれか一つの抗体であって、
（ａ）第１の改変重鎖が、位置１４５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１７０におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１８３におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１８５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み；
（ｂ）第１の改変軽鎖が、位置１７６におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１７８におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み；
（ｃ）第２の改変重鎖が、位置１４７におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１８５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み；および
（ｄ）第２の改変軽鎖が、位置１３１におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１３５におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み、
ナンバリングはＥＵインデックスによる、抗体。

Ｂ４６．実施形態Ｂ４３の抗体であって、
（ａ）改変重鎖が、位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１４５におけるロイシンがフェニルアラニンにより置換されており、位置１７０におけるフェニルアラニンがバリンにより置換されており、位置１８３におけるセリンがフェニルアラニンにより置換されており、かつ位置１８５におけるバリンがフェニルアラニンにより置換されているアミノ酸置換を含み；
（ｂ）改変軽鎖が、位置１７６におけるセリンがフェニルアラニンにより置換されており、かつ位置１７８におけるトレオニンまたはチロシンがアラニンにより置換されているアミノ酸置換を含み、
ナンバリングはＥＵインデックスによる、抗体。

Ｂ４７．実施形態Ｂ４４の抗体であって、
（ａ）改変重鎖が、位置１４７におけるリジンがアラニンにより置換されており、かつ位置１８５におけるバリンがトリプトファンにより置換されているアミノ酸置換を含み；および
（ｂ）改変軽鎖が、位置１３１におけるセリンまたはトレオニンがトリプトファンにより置換されており、かつ位置１３５におけるロイシンがグリシンにより置換されているアミノ酸置換を含み、
ナンバリングはＥＵインデックスによる、抗体。

Ｂ４８．実施形態Ｂ４５の抗体であって、
（ａ）第１の改変重鎖が、位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）１４５におけるロイシンがフェニルアラニンにより置換されており、位置１７０におけるフェニルアラニンがバリンにより置換されており、位置１８３におけるセリンがフェニルアラニンにより置換されており、かつ位置１８５におけるバリンがフェニルアラニンにより置換されているアミノ酸置換を含み；
（ｂ）第１の改変軽鎖が、位置１７６におけるセリンがフェニルアラニンにより置換されており、かつ位置１７８におけるトレオニンまたはチロシンがアラニンにより置換されているアミノ酸置換を含み：
（ｃ）第２の改変重鎖が、位置１４７におけるリジンがアラニンにより置換されており、かつ位置１８５におけるバリンがトリプトファンにより置換されているアミノ酸置換を含み；および
（ｄ）第２の改変軽鎖が、位置１３１におけるセリンまたはトレオニンがトリプトファンにより置換されており、かつ位置１３５におけるロイシンがグリシンにより置換されているアミノ酸置換を含み、
ナンバリングはＥＵインデックスによる、抗体。

Ｂ４９．実施形態Ｂ２５〜Ｂ３４のいずれか一つの抗体であって、
（ａ）第１の改変重鎖が、位置１４７におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１８５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み；および
（ｂ）第１の改変軽鎖が、位置１３１におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１３５におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み、
（ｃ）第２の改変重鎖が、位置１４５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１７０におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１８３におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１８５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み；
（ｄ）第２の改変軽鎖が、位置１７６におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１７８におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み、
ナンバリングはＥＵインデックスによる、抗体。

Ｂ５０．実施形態Ｂ４９の抗体であって、
（ａ）第１の改変重鎖が、位置１４７におけるリジンがアラニンにより置換されており、かつ位置１８５におけるバリンがトリプトファンにより置換されているアミノ酸置換を含み；および
（ｂ）第１の改変軽鎖が、位置１３１におけるセリンまたはトレオニンがトリプトファンにより置換されており、かつ位置１３５におけるロイシンがグリシンにより置換されているアミノ酸置換を含み：
（ｃ）第２の改変重鎖が、位置（ｐｏｔｉｏｎ）１４５におけるロイシンがフェニルアラニンにより置換されており、位置１７０におけるフェニルアラニンがバリンにより置換されており、位置１８３におけるセリンがフェニルアラニンにより置換されており、かつ位置１８５におけるバリンがフェニルアラニンにより置換されているアミノ酸置換を含み；
（ｄ）第２の改変軽鎖が、位置１７６におけるセリンがフェニルアラニンにより置換されており、かつ位置１７８におけるトレオニンまたはチロシンがアラニンにより置換されているアミノ酸置換を含み、
ナンバリングはＥＵインデックスによる、抗体。

Ｂ５１．Ｆｃ領域が１つ以上の改変を含む、実施形態Ｂ１１〜Ｂ５０のいずれか一つの抗体。

Ｂ５２．Ｆｃ領域における改変が、重鎖のヘテロダイマー化を促進する、実施形態Ｂ５１の抗体。

Ｂ５３．Ｆｃ領域における改変がプロテインＡ結合を変化させ、かつ一方の重鎖にのみ存在する、実施形態Ｂ５１の抗体。

Ｂ５４．プロテインＡ結合を変化させ、かつ一方の重鎖にのみ存在するＦｃ領域における改変をさらに含む、実施形態Ｂ５２の抗体。

Ｂ５５．抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつプロテインＡ結合を変化させるＦｃ領域改変がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆであり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ５３またはＢ５４の抗体。

Ｂ５６．抗体がＩｇＧ３であり、かつプロテインＡ結合を変化させるＦｃ領域改変がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙであり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ５３またはＢ５４の抗体。

Ｂ５７．改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、かつ第２の重鎖アミノ酸置換Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ１１〜Ｂ５２のいずれか一つの抗体。

Ｂ５８．抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ５７の抗体。

Ｂ５９．抗体がＩｇＧ３であり、かつ改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ５７の抗体。

Ｂ６０．改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含み、かつ第２の重鎖がアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ１１〜Ｂ５２のいずれか一つの抗体。

Ｂ６１．抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつ改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ６０の抗体。

Ｂ６２．抗体がＩｇＧ３であり、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ６０の抗体。

Ｂ６３．改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ５７〜Ｂ６２のいずれか一つの抗体。

Ｂ６４．第１の改変重鎖Ｆｃ領域がＹ３４９Ｃのアミノ酸置換をさらに含み、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｂ５７〜Ｂ６２のいずれか一つの抗体。

Ｂ６５．抗体の半減期を変化させるＦｃ領域における改変、半減期がＦｃＲｎ結合親和性に依存する、Ｂ５１の抗体。

Ｂ６６．抗体の半減期を変化させるＦｃ領域における改変をさらに含む、実施形態Ｂ５２〜Ｂ６４のいずれか一つの抗体であって、半減期がＦｃＲｎ結合親和性に依存する、抗体。

Ｂ６７．１つ以上の改変がエフェクター機能を変化させ、Ｆｃガンマ受容体またはＣ１ｑ補体タンパク質に対する結合親和性が増加または減少する、実施形態Ｂ５１〜Ｂ６５のいずれか一つの抗体。

Ｂ６８．エフェクター機能を変化させるＦｃ領域における改変をさらに含む、実施形態Ｂ５２〜Ｂ６６のいずれか一つの抗体であって、Ｆｃガンマ受容体またはＣ１ｑ補体タンパク質に対する結合親和性が増加または減少する、抗体。

Ｂ６９．ヒト抗体である、実施形態Ｂ１〜Ｂ６８のいずれか一つの抗体。

Ｂ７０．ヒト化抗体である、実施形態Ｂ１〜Ｂ４６８のいずれか一つの抗体。

Ｂ７１．キメラ抗体である、実施形態Ｂ１〜Ｂ６８のいずれか一つの抗体。

Ｃ１．改変重鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、改変重鎖が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、核酸。

Ｃ２．改変重鎖ポリペプチドのＣＨ１領域が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、実施形態Ｃ１の核酸。

Ｃ３．改変重鎖ポリペプチドのＣＨ１領域が、天然システインから非システインアミノ酸への置換を含み、かつ改変重鎖のＶＨ領域が、天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、実施形態Ｃ１の核酸。

Ｃ４．改変重鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、改変重鎖が、突出および／または空洞をもたらすＣＨ１領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む、核酸。

Ｃ５．改変重鎖が、天然システインから非システインアミノ酸への置換をさらに含む、実施形態Ｃ２の核酸。

Ｃ６．重鎖天然システインが鎖間ジスルフィド結合を形成し得る、実施形態Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、またはＣ５のいずれか一つの核酸。

Ｃ７．改変免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖をコードする、実施形態Ｃ１〜Ｃ６のいずれか一つの核酸。

Ｃ８．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置２２０に天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７の核酸。

Ｃ９．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１および／または２１９および／または２２０に天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７の核酸。

Ｃ１０．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１および２１９および２２０のそれぞれに天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７の核酸。

Ｃ１１．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれに天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７の核酸。

Ｃ１２．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１に天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７の核酸。

Ｃ１３．非システインアミノ酸がバリンまたはアラニンである、実施形態Ｃ７〜Ｃ１２のいずれか一つの核酸。

Ｃ１４．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７〜Ｃ１３のいずれか一つの核酸。

Ｃ１５．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ１４の核酸。

Ｃ１６．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ１４の核酸。

Ｃ１７．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ１４の核酸。

Ｃ１８．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ１４〜Ｃ１６のいずれか一つの核酸。

Ｃ１９．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ１４、またはＣ１６〜Ｃ１８のいずれか一つの核酸。

Ｃ２０．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７〜Ｃ１３のいずれか一つの核酸。

Ｃ２１．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ２０の核酸。

Ｃ２２．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ２０の核酸。

Ｃ２３．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ２０の核酸。

Ｃ２４．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ２０〜Ｃ２２のいずれか一つの核酸。

Ｃ２５．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ２０、またはＣ２２〜Ｃ２４のいずれか一つの核酸。

Ｃ２６．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７〜Ｃ１３のいずれか一つの核酸。

Ｃ２７．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ２６の核酸。

Ｃ２８．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ２６の核酸。

Ｃ２９．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ２６の核酸。

Ｃ３０．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ２６〜Ｃ２８のいずれか一つの核酸。

Ｃ３１．改変重鎖が、位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつ位置１３１におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ２６またはＣ２８〜Ｃ３０のいずれか一つの核酸。

Ｃ３２．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８における天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７〜Ｃ１３のいずれか一つの核酸。

Ｃ３３．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ３２の核酸。

Ｃ３４．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ３２の核酸。

Ｃ３５．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ３２の核酸。

Ｃ３６．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ３２〜Ｃ３４のいずれか一つの核酸。

Ｃ３７．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ３２またはＣ３４〜Ｃ３６のいずれか一つの核酸。

Ｃ３８．改変重鎖が、可変領域の位置４４に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる、実施形態Ｃ７〜Ｃ１３のいずれか一つの核酸。

Ｃ３９．改変重鎖が、可変領域の位置４４に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＫａｂａｔインデックスにより、かつＣＨ領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されており、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ３８の核酸。

Ｃ４０．改変重鎖が、可変領域の位置４４に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＫａｂａｔインデックスにより、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されており、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ３８の核酸。

Ｃ４１．改変重鎖が、可変領域の位置４４に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＫａｂａｔインデックスにより、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されており、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ３８の核酸。

Ｃ４２．改変重鎖が、位置１４５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１７０におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１８３におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１８５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ２、Ｃ３、またはＣ７〜Ｃ１２のいずれか一つの核酸。

Ｃ４３．改変重鎖が、位置１４５におけるロイシンがフェニルアラニンにより置換されており、位置１７０におけるフェニルアラニンがバリンにより置換されており、位置１８３におけるセリンがフェニルアラニンにより置換されており、かつ位置１８５におけるバリンがフェニルアラニンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ４２の核酸。

Ｃ４４．改変重鎖が、位置１４７におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１８５におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ２、Ｃ３、またはＣ７〜Ｃ１２のいずれか一つの核酸。

Ｃ４５．改変重鎖が、位置１４７におけるリジンがアラニンにより置換されており、かつ位置１８５におけるバリンがトリプトファンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ４４の核酸。

Ｃ４６．改変重鎖がＦｃ領域を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ４５のいずれか一つの核酸。

Ｃ４７．改変重鎖Ｆｃ領域が１つ以上の改変を含む、実施形態Ｃ４６の核酸。

Ｃ４８．改変重鎖Ｆｃ領域における改変が、２つの重鎖のヘテロダイマー化を促進する、実施形態Ｃ４７の核酸。

Ｃ４９．改変重鎖Ｆｃ領域における改変が、プロテインＡ結合を変化させる、実施形態Ｃ４７の核酸。

Ｃ５０．改変重鎖Ｆｃ領域が、プロテインＡ結合を変化させる改変をさらに含む、実施形態Ｃ４８の核酸。

Ｃ５１．改変重鎖がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつプロテインＡ結合を変化させる改変がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆであり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ４９またはＣ５０の核酸。

Ｃ５２．改変重鎖がＩｇＧ３であり、かつプロテインＡ結合を変化させる改変がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙであり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ４９またはＣ５０の核酸。

Ｃ５３．改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ４７またはＣ４８の核酸。

Ｃ５４．改変重鎖がＩｇＧ３重鎖であり、かつアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ５３の核酸。

Ｃ５５．改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ４７またはＣ４８の核酸。

Ｃ５６．改変重鎖がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４重鎖であり、かつアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ５５の核酸。

Ｃ５７．改変重鎖Ｆｃ領域がＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃのアミノ酸置換をさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ５３〜Ｃ５６のいずれか一つの核酸。

Ｃ５８．改変重鎖Ｆｃ領域における改変が抗体の半減期を変化させ、半減期がＦｃＲｎ結合親和性に依存する、実施形態Ｃ４７の核酸。

Ｃ５９．抗体の半減期を変化させる改変重鎖Ｆｃ領域における改変をさらに含む、実施形態Ｃ４８〜Ｃ５７のいずれか一つの核酸であって、半減期がＦｃＲｎ結合親和性に依存する、核酸。

Ｃ６０．改変重鎖Ｆｃ領域における改変がエフェクター機能を変化させ、Ｆｃガンマ受容体またはＣ１ｑ補体タンパク質に対する結合親和性が増加または減少する、実施形態Ｃ４７の核酸。

Ｃ６１．エフェクター機能を変化させる改変重鎖Ｆｃ領域における改変をさらに含む、実施形態Ｃ４８〜Ｃ５９のいずれか一つの核酸であって、Ｆｃガンマ受容体またはＣ１ｑ補体タンパク質に対する結合親和性が増加または減少する、核酸。

Ｃ６２．発現ベクターである、実施形態Ｃ１〜Ｃ６１のいずれか一つの核酸。

Ｃ６３．発現ベクターが、第２の重鎖をコードする第２の核酸をさらに含み、第２の重鎖が非改変のＣＨ１領域を含む、実施形態Ｃ６２の核酸。

Ｃ６４．発現ベクターが、第１および第２の軽鎖をそれぞれコードする第３および第４の核酸をさらに含み、
（ａ）第１の軽鎖が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む改変軽鎖であり；および
（ｂ）第２の軽鎖が改変されていない、実施形態Ｃ６３の核酸。

Ｃ６５．発現ベクターが、第２の重鎖をコードする第２の核酸をさらに含み、第２の重鎖が、改変されているＣＨ１領域を含む、実施形態Ｃ６２の核酸。

Ｃ６６．第２の改変重鎖が、突出および／または空洞をもたらすＣＨ１領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む、実施形態Ｃ６５の核酸。

Ｃ６７．発現ベクターが、第１および第２の軽鎖をそれぞれコードする第３および第４の核酸をさらに含み、
（ａ）第１の軽鎖が、代償性の空洞および／または突出をもたらすＣＬ領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む改変軽鎖であり；および
（ｂ）第２の軽鎖が、代償性の空洞および／または突出をもたらすＣＬ領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む改変軽鎖であり、
改変が、第１の重鎖と第１の軽鎖との、および第２の重鎖と第２の軽鎖との鎖間ペアリングに有利に働く、実施形態Ｃ６５またはＣ６６の核酸。

Ｃ６８．第２の重鎖がＦｃ領域を含む、実施形態Ｃ６３〜Ｃ６７のいずれか一つの核酸。

Ｃ６９．第２の重鎖のＦｃ領域が１つ以上の改変を含む、実施形態Ｃ６８の核酸。

Ｃ７０．第２の重鎖Ｆｃ領域における改変が、２つの重鎖のヘテロダイマー化を促進する、実施形態Ｃ６９の核酸。

Ｃ７１．第２の重鎖Ｆｃ領域における改変がプロテインＡ結合を変化させる、実施形態Ｃ６９の核酸。

Ｃ７２．第２の重鎖Ｆｃ領域が、プロテインＡ結合を変化させる改変をさらに含む、実施形態Ｃ７０の核酸。

Ｃ７３．第２の重鎖がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつプロテインＡ結合を変化させる改変が、アミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆであり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ５０ａまたはＣ５０ｂの核酸。

Ｃ７４．第２の重鎖がＩｇＧ３であり、かつプロテインＡ結合を変化させる改変が、アミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙであり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７１またはＣ７２の核酸。

Ｃ７５．改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含み、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ６９またはＣ７０の核酸。

Ｃ７６．重鎖がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつ改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７５の核酸。

Ｃ７７．重鎖がＩｇＧ３であり、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７５の核酸。

Ｃ７８．改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ６９またはＣ７０の核酸。

Ｃ７９．重鎖がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７８の核酸。

Ｃ８０．重鎖がＩｇＧ３であり、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７８の核酸。

Ｃ８１．第２の重鎖Ｆｃ領域がＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃのアミノ酸置換をさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｃ７５〜Ｃ８０のいずれか一つの核酸。

Ｃ８２．第２の重鎖Ｆｃ領域における改変が抗体の半減期を変化させ、半減期がＦｃＲｎ結合親和性に依存する、実施形態Ｃ６９の核酸。

Ｃ８３．抗体の半減期を変化させる第２の重鎖Ｆｃ領域における改変をさらに含む、実施形態Ｃ６９〜Ｃ８０のいずれか一つの核酸であって、半減期がＦｃＲｎ結合親和性に依存する、核酸。

Ｃ８４．第２の重鎖Ｆｃ領域における改変がエフェクター機能を変化させ、Ｆｃガンマ受容体またはＣ１ｑ補体タンパク質に対する結合親和性が増加または減少する、実施形態Ｃ４９の核酸。

Ｃ８５．エフェクター機能を変化させる第２の重鎖Ｆｃ領域における改変をさらに含む、実施形態Ｃ６９〜Ｃ８３のいずれか一つの核酸であって、Ｆｃガンマ受容体またはＣ１ｑ補体タンパク質に対する結合親和性が増加または減少する、核酸。

Ｄ１．改変軽鎖を含む抗体であって、改変軽鎖が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、抗体。

Ｄ２．ＣＬ領域が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、実施形態Ｄ１の抗体。

Ｄ３．ＣＬ領域が天然システインから非システインアミノ酸への置換を含み、かつＶＬ領域が天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、実施形態Ｄ１の抗体。

Ｄ４．軽鎖天然システインが鎖間ジスルフィド結合を形成し得る、実施形態Ｄ１〜Ｄ３のいずれか一つの抗体。

Ｄ５．改変重鎖をさらに含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ４のいずれか一つの抗体であって、改変重鎖が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、抗体。

Ｄ６．ＣＨ１領域が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、実施形態Ｄ５の抗体。

Ｄ７．ＣＨ１領域が天然システインから非システインアミノ酸への置換を含み、かつＶＨ領域が天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、実施形態Ｄ５の抗体。

Ｄ８．重鎖天然システインが鎖間ジスルフィド結合を形成し得る、実施形態Ｄ５〜Ｄ７のいずれか一つの抗体。

Ｄ９．天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換から得られる、改変重鎖の置換システインと、天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換から得られる、改変軽鎖の置換システインとが、ジスルフィド結合を形成することができる、実施形態Ｄ５〜Ｄ８のいずれか一つの抗体。

Ｄ１０．２つの重鎖および２つの軽鎖を含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ９のいずれか一つの抗体。

Ｄ１１．２つの重鎖および２つの軽鎖が４つの別個のポリペプチドである、実施形態Ｄ１０の抗体。

Ｄ１２．２つの重鎖および２つの軽鎖が単一のポリペプチドである、実施形態Ｄ１０の抗体。

Ｄ１３．完全長抗体である、実施形態Ｄ１〜Ｄ１２のいずれか一つの抗体。

Ｄ１４．２つの重鎖がそれぞれＶＨドメイン、ＣＨ１ドメインおよびＦｃ領域を含み、ＶＨドメインが同一であるかまたは異なるアミノ酸配列を有し、ＣＨ１ドメインが異なるアミノ酸配列を有し、かつＦｃ領域が異なるアミノ酸配列を有する、実施形態Ｄ１０〜Ｄ１３のいずれか一つの抗体。

Ｄ１５．２つの重鎖がヘテロダイマーを形成する、実施形態Ｄ１４の抗体。

Ｄ１６．２つの軽鎖がそれぞれＶＬドメインおよびＣＬドメインを含み、ＶＬドメインが同一であるかまたは異なるアミノ酸配列を有し、かつＣＬドメインが異なるアミノ酸配列を有する、実施形態Ｄ１０〜Ｄ１５のいずれか一つの抗体。

Ｄ１７．２つの独立した抗原または同じ抗原上の２つの独立したエピトープに特異的に結合する、実施形態Ｄ１〜Ｄ１６のいずれか一つの抗体。

Ｄ１８．２つの独立した抗原に対する結合親和性が同一であるかまたは異なる、実施形態Ｄ１７の抗体。

Ｄ１９．同じ抗原上の２つの独立したエピトープに対する結合親和性が同一であるかまたは異なる、実施形態Ｄ１７の抗体。

Ｄ２０．２つの異なる結合親和性で同じエピトープに特異的に結合する、実施形態Ｄ１〜Ｄ１６のいずれか一つの抗体。

Ｄ２１．軽鎖がカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖である、実施形態Ｄ１〜Ｄ２０のいずれか一つの抗体。

Ｄ２２．１つの軽鎖がカッパ軽鎖であり、かつ１つの軽鎖がラムダ軽鎖である、実施形態Ｄ６〜Ｄ２０のいずれか一つの抗体。

Ｄ２３．（ｉ）ＣＨ１領域に改変を含む１つの改変重鎖、およびＣＬ領域に改変を含む対応する１つの改変軽鎖と、（ｉｉ）ＣＨ１領域およびＣＬ領域が改変されていない、第２の重鎖および対応する軽鎖とを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ２２のいずれか一つの抗体。

Ｄ２４．免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である、実施形態Ｄ１〜Ｄ２３のいずれか一つの抗体。

Ｄ２５．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置２２０に天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ５〜Ｄ２４のいずれか一つの抗体。

Ｄ２６．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１および／または２１９および／または２２０に天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ５〜Ｄ２４のいずれか一つの抗体。

Ｄ２７．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１および２１９および２２０のそれぞれに天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ５〜Ｄ２４のいずれか一つの抗体。

Ｄ２８．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれに天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ５〜Ｄ２４のいずれか一つの抗体。

Ｄ２９．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１３１に天然システインから非システインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ５〜Ｄ２４のいずれか一つの抗体。

Ｄ３０．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置２１４に天然システインから非システインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ２９の抗体。

Ｄ３１．非システインアミノ酸がバリンまたはアラニンである、実施形態Ｄ２５〜Ｄ３０のいずれか一つの抗体。

Ｄ３２．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ２５〜Ｄ３１のいずれか一つの抗体。

Ｄ３３．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ３２の抗体。

Ｄ３４．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ３２の抗体。

Ｄ３５．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ３２の抗体。

Ｄ３６．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ３２〜Ｄ３４のいずれか一つの抗体。

Ｄ３７．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１４１におけるアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ３２〜Ｄ３５のいずれか一つの抗体。

Ｄ３８．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１６における天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換と、ＣＬ領域の位置２１４における天然システインから非システインアミノ酸への置換とを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ３２〜Ｄ３７のいずれか一つの抗体。

Ｄ３９．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１６におけるフェニルアラニンまたはトレオニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ３２〜Ｄ３８のいずれか一つの抗体。

Ｄ４０．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ３２〜Ｄ３９のいずれか一つの抗体。

Ｄ４１．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１６におけるトレオニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ３２〜Ｄ３９のいずれか一つの抗体。

Ｄ４２．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ２５〜Ｄ３３のいずれか一つの抗体。

Ｄ４３．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ４２の抗体。

Ｄ４４．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ４２の抗体。

Ｄ４５．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ４２の抗体。

Ｄ４６．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ４２〜Ｄ４４のいずれか一つの抗体。

Ｄ４７．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１６８におけるヒスチジンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ４２、Ｄ４４またはＤ４５のいずれか一つの抗体。

Ｄ４８．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１６４における天然非システインアミノ酸からシステインへの置換と、ＣＬ領域の位置２１４における天然システインから非システインアミノ酸への置換とを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ４２〜Ｄ４７のいずれか一つの抗体。

Ｄ４９．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１６４におけるトレオニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインが非システインアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ４２〜Ｄ４８のいずれか一つの抗体。

Ｄ５０．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１６４におけるトレオニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ４２〜Ｄ４９のいずれか一つの抗体。

Ｄ５１．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ２５〜Ｄ３１のいずれか一つの抗体。

Ｄ５２．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ５１の抗体。

Ｄ５３．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ５１の抗体。

Ｄ５４．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ５１の抗体。

Ｄ５５．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ５１〜Ｄ５３のいずれか一つの抗体。

Ｄ５６．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ５１またはＤ５３〜Ｄ５５のいずれか一つの抗体。

Ｄ５７．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１２１における天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換と、ＣＬ領域の位置２１４における天然システインから非システインアミノ酸への置換とを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ５１〜Ｄ５６のいずれか一つの抗体。

Ｄ５８．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１２１におけるセリンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ５１〜Ｄ５７のいずれか一つの抗体。

Ｄ５９．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１２１におけるセリンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ５１〜Ｄ５８のいずれか一つの抗体。

Ｄ６０．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８における天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ２５〜Ｄ３１のいずれか一つの抗体。

Ｄ６１．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ６０の抗体。

Ｄ６２．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ６０の抗体。

Ｄ６３．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ６０の抗体。

Ｄ６４．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置２２０におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ６０〜Ｄ６２のいずれか一つの抗体。

Ｄ６５．改変重鎖が、ＣＨ１領域の位置１２８におけるロイシンがシステインにより置換されており、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ６０またはＤ６２〜Ｄ６４のいずれか一つの抗体。

Ｄ６６．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１８における天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換と、ＣＬ領域の位置２１４における天然システインから非システインアミノ酸への置換とを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ６０〜Ｄ６５のいずれか一つの抗体。

Ｄ６７．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１８におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ６０〜Ｄ６６のいずれか一つの抗体。

Ｄ６８．対応する改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１８におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ６０〜Ｄ６７のいずれか一つの抗体。

Ｄ６９．改変重鎖が、可変領域の位置４４に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＫａｂａｔインデックスによる、実施形態Ｄ２３〜Ｄ３１のいずれか一つの抗体。

Ｄ７０．改変重鎖が、可変領域の位置４４に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ１重鎖であり、ナンバリングはＫａｂａｔインデックスにより、かつＣＨ領域の位置２２０におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されており、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ６９の抗体。

Ｄ７１．改変重鎖が、可変領域の位置４４に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ２重鎖であり、ナンバリングはＫａｂａｔインデックスにより、かつＣＨ１領域の位置１３１および２２０のそれぞれにおけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されており、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ６９の抗体。

Ｄ７２．改変重鎖が、可変領域の位置４４に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含むＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖であり、ナンバリングはＫａｂａｔインデックスにより、かつＣＨ１領域の位置１３１におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されており、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ６９の抗体。

Ｄ７３．対応する改変軽鎖が、可変領域の位置１００における天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換（ナンバリングはＫａｂａｔによる）と、ＣＬ領域の位置２１４における天然システインから非システインアミノ酸への置換（ナンバリングはＥＵインデックスによる）とを含む、実施形態Ｄ６９〜Ｄ７２のいずれか一つの抗体。

Ｄ７４．Ｆｃ領域が１つ以上の改変を含む、実施形態Ｄ１４の抗体。

Ｄ７５．Ｆｃ領域における改変が、重鎖のヘテロダイマー化を促進する、実施形態Ｄ７４の抗体。

Ｄ７６．Ｆｃ領域における改変がプロテインＡ結合を変化させ、かつ一方の重鎖にのみ存在する、実施形態Ｄ７４の抗体。

Ｄ７７．プロテインＡ結合を変化させ、かつ一方の重鎖にのみ存在するＦｃ領域における改変をさらに含む、実施形態Ｄ７５の抗体。

Ｄ７８．抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつプロテインＡ結合を変化させるＦｃ領域改変がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆであり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ７６またはＤ７７の抗体。

Ｄ７９．抗体がＩｇＧ３であり、かつプロテインＡ結合を変化させるＦｃ領域改変がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙであり、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ７６またはＤ７７の抗体。

Ｄ８０．改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ２３〜Ｄ７５のいずれか一つの抗体。

Ｄ８１．抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ８０の抗体。

Ｄ８２．抗体がＩｇＧ３であり、かつ第１の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ８０の抗体。

Ｄ８３．改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含み、かつ第２の重鎖が、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含むＣＨ３領域を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ２３〜Ｄ７５のいずれか一つの抗体。

Ｄ８４．抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつ改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ８３の抗体。

Ｄ８５．抗体がＩｇＧ３であり、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ８３の抗体。

Ｄ８６．改変重鎖Ｆｃ領域さらにＳ３５４Ｃのアミノ酸置換、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ８０〜Ｄ８５のいずれか一つの抗体。

Ｄ８７．改変重鎖Ｆｃ領域がＹ３４９Ｃのアミノ酸置換をさらに含み、かつ第２の重鎖Ｆｃ領域鎖がアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｄ８０〜Ｄ８５のいずれか一つの抗体。

Ｄ８８．Ｆｃ領域における改変が抗体の半減期を変化させ、半減期がＦｃＲｎ結合親和性に依存する、実施形態Ｄ７４の抗体。

Ｄ８９．抗体の半減期を変化させるＦｃ領域における改変をさらに含む、実施形態Ｄ７４〜Ｄ８８のいずれか一つの抗体であって、半減期がＦｃＲｎ結合親和性に依存する、抗体。

Ｄ９０．Ｆｃ領域における改変がエフェクター機能を変化させ、Ｆｃガンマ受容体またはＣ１ｑ補体タンパク質に対する結合親和性が増加または減少する、実施形態Ｄ７４の抗体。

Ｄ９１．エフェクター機能を変化させるＦｃ領域における改変をさらに含む、実施形態Ｄ７４〜Ｄ８９のいずれか一つの抗体であって、Ｆｃガンマ受容体またはＣ１ｑ補体タンパク質に対する結合親和性が増加または減少する、抗体。

Ｄ９２．ヒト抗体である、実施形態Ｄ１〜Ｄ９１のいずれか一つの抗体。

Ｄ９３．ヒト化抗体である、実施形態Ｄ１〜Ｄ９１のいずれか一つの抗体。

Ｄ９４．キメラ抗体である．、実施形態Ｄ１〜Ｄ９１のいずれか一つの抗体。

Ｅ１．実施形態Ａ１〜Ａ９４のいずれか一つの抗体を含む組成物。

Ｅ２．実施形態Ｂ１〜Ｂ７１のいずれか一つの抗体を含む組成物。

Ｅ３．実施形態Ｄ１〜Ｄ９４のいずれか一つの抗体を含む組成物。

Ｆ１．改変軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、改変軽鎖が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、核酸。

Ｆ２．改変軽鎖ポリペプチドのＣＬ領域が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、実施形態Ｆ１の核酸。

Ｆ３．改変軽鎖ポリペプチドのＣＬ領域が、天然システインから非システインアミノ酸への置換を含み、かつ改変軽鎖ポリペプチドのＶＬ領域が、天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、実施形態Ｆ１の核酸。

Ｆ４．改変軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、改変軽鎖が、空洞および／または突出をもたらすＣＬ領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む、核酸。

Ｆ５．改変軽鎖が、天然システインから非システインアミノ酸への置換をさらに含む、実施形態Ｆ４の核酸。

Ｆ６．軽鎖天然システインが鎖間ジスルフィド結合を形成し得る、実施形態Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、またはＦ５のいずれか一つの核酸。

Ｆ７．改変軽鎖がカッパ軽鎖である、実施形態Ｆ１〜Ｆ６のいずれか一つの核酸。

Ｆ８．改変軽鎖がラムダ軽鎖である、実施形態Ｆ１〜Ｆ６のいずれか一つの核酸。

Ｆ９．改変免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）軽鎖をコードする、実施形態Ｆ１〜Ｆ８のいずれか一つの核酸。

Ｆ１０．改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置２１４における天然システインから非システインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｆ９の核酸。

Ｆ１１．改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１６における天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換と、ＣＬ領域の位置２１４における天然システインから非システインアミノ酸への置換とを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｆ９の核酸。

Ｆ１２．改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１６におけるフェニルアラニンまたはトレオニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインが、システインでないアミノ酸により置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｆ１１の核酸。

Ｆ１３．改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１６におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｆ１２の核酸。

Ｆ１４．改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１６におけるトレオニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｆ１２のいずれか一つの核酸。

Ｆ１５．改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１６４におけるトレオニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｆ５の核酸。

Ｆ１６．改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１２１におけるセリンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｆ９の核酸。

Ｆ１７．改変軽鎖が、ＣＬ領域の位置１１８におけるフェニルアラニンがシステインにより置換されており、かつＣＬ領域の位置２１４におけるシステインがバリンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｆ９の核酸。

Ｆ１８．改変軽鎖が、可変領域の位置１００に天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含み、ナンバリングはＫａｂａｔによる、実施形態Ｆ９の核酸。

Ｆ１９．改変軽鎖が、位置１３１におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１３５におけるアミノ酸の、小型側鎖を有するアミノ酸による置換とを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｆ９またはＦ１０の核酸。

Ｆ２０．改変軽鎖が、位置１３１におけるセリンまたはトレオニンがトリプトファンにより置換されており、かつＣＬ領域の位置１３５におけるロイシンがグリシンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｆ１９の核酸。

Ｆ２１．改変軽鎖が、位置１７６におけるアミノ酸の、大型側鎖を有するアミノ酸による置換と、位置１７８におけるアミノ酸の、小型側鎖の鎖を有するアミノ酸による置換とを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｆ９またはＦ１０の核酸。

Ｆ２２．改変軽鎖が、位置１７６におけるセリンがフェニルアラニンにより置換されており、かつ位置１７８におけるトレオニンまたはチロシンがアラニンにより置換されているアミノ酸置換を含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、実施形態Ｆ２の核酸。

Ｆ２３．発現ベクターである、実施形態Ｆ１〜Ｆ２２のいずれか一つの核酸。

Ｆ２４．発現ベクターが、改変されていない第２の軽鎖をコードする第２の核酸をさらに含む、実施形態Ｆ２３の核酸。

Ｆ２５．発現ベクターが、第１および第２の重鎖をそれぞれコードする第３および第４の核酸をさらに含み、
（ａ）第１の重鎖が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む改変重鎖であり；および
（ｂ）第２の重鎖が改変されていない、実施形態Ｆ２３の核酸。

Ｆ２６．発現ベクターが、改変されている第２の軽鎖をコードする第２の核酸をさらに含む、実施形態Ｆ２３の核酸。

Ｆ１．第２の改変軽鎖が、空洞および／または突出をもたらすＣＬ領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む、実施形態Ｆ２６の核酸。

Ｆ２７．発現ベクターが、第１および第２の重鎖をそれぞれコードする第３および第４の核酸をさらに含み、
（ａ）第１の重鎖が、代償性の突出および／または空洞をもたらすＣＨ１領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む改変重鎖であり；および
（ｂ）第２の重鎖が、代償性の突出および／または空洞をもたらすＣＨ１領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む改変重鎖であり、
改変が、第１の軽鎖と第１の重鎖との、および第２の軽鎖と第２の重鎖との鎖間ペアリングに有利に働く、実施形態Ｆ２６またはＦ２７の核酸。

Ｇ１．実施形態Ｃ６２〜Ｃ８５のいずれか一つの核酸を含む細胞。

Ｇ２．実施形態Ｆ２３〜Ｆ２８のいずれか一つの核酸を含む細胞。

Ｇ３．実施形態Ｃ６２、Ｃ６３、Ｃ６５、Ｃ６６またはＣ６８〜Ｃ８５のいずれか一つの核酸と、実施形態Ｆ２３、Ｆ２４、Ｆ２６またはＦ２７のいずれか一つの核酸とを含む細胞。

Ｈ１．改変重鎖ポリペプチドおよび対応する改変軽鎖ポリペプチドを生成する方法であって、実施形態Ｃ６２、Ｃ６３、Ｃ６５、Ｃ６６またはＣ６８〜Ｃ８５のいずれか一つの核酸と、実施形態Ｆ２３、Ｆ２４、Ｆ２６またはＦ２７のいずれか一つの核酸とを含む複数の細胞を、ポリペプチドが発現する条件に接触させることを含む、方法。

Ｈ２．細胞が、改変されていない第２の重鎖ポリペプチドをコードする核酸と、改変されていない対応する第２の軽鎖ポリペプチドをコードする核酸とをさらに含む、実施形態Ｈ１の方法。

Ｈ３．細胞が、改変されている第２の重鎖ポリペプチドをコードする核酸と、改変されている対応する第２の軽鎖ポリペプチドをコードする核酸とをさらに含む、実施形態Ｈ１の方法。

Ｈ４．（ａ）改変重鎖ポリペプチド、（ｂ）対応する改変軽鎖ポリペプチド、（ｃ）改変されていない第２の重鎖ポリペプチドおよび（ｄ）改変されていない対応する軽鎖ポリペプチドを生成する方法であって、実施形態Ｃ６３またはＣ６８〜Ｃ８５のいずれか一つの核酸と、実施形態Ｆ２４の核酸とを含む複数の細胞を、ポリペプチドが発現する条件に接触させることを含む、方法。

Ｈ５．（ａ）改変重鎖ポリペプチド、（ｂ）対応する改変されている第１の軽鎖ポリペプチド、（ｃ）第２の改変重鎖ポリペプチド、および（ｄ）対応する第２の改変軽鎖ポリペプチドを生成する方法であって、実施形態Ｃ６５、Ｃ６６、またはＣ６８〜Ｃ８５のいずれか一つの核酸と、実施形態Ｆ２６の核酸とを含む複数の細胞を、ポリペプチドが生成する条件に接触させることを含む、方法。

Ｈ５．（ａ）改変重鎖ポリペプチド、（ｂ）対応する改変軽鎖ポリペプチド、（ｃ）改変されていないＣＨ１領域を含む第２の重鎖ポリペプチド、および（ｄ）改変されていない対応する軽鎖ポリペプチドを生成する方法であって、実施形態Ｃ６４またはＣ６８〜Ｃ８５のいずれか一つの核酸または実施形態Ｆ２５の核酸を含む複数の細胞を、ポリペプチドが発現する条件に接触させることを含む、方法。

Ｈ６．（ａ）第１の改変重鎖ポリペプチド、（ｂ）対応する改変軽鎖ポリペプチド、（ｃ）改変されている第２の重鎖ポリペプチド、および（ｄ）改変されている対応する軽鎖ポリペプチドを生成する方法であって、実施形態Ｃ６７またはＣ６８〜Ｃ８５のいずれか一つの核酸または実施形態Ｆ２８の核酸を含む複数の細胞を、ポリペプチドが発現する条件に接触させることを含む、方法。

以下に説明する例は特定の態様を例示し、本技術を限定するものではない。

実施例１：材料および方法
この実施例に説明する材料および方法を使用して後続の例に記載する実験を実施した。全ての試薬は、特に明記しない限り、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡによった。

ｐＭＢａｂ−ＨｅａｖｙおよびｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔ哺乳動物発現ベクターの構築ならびにＭＢａｂ ＩｇＧ１として発現する免疫グロブリン遺伝子のクローニング
哺乳動物細胞培養で一価二重特異的ヒトＩｇＧ１抗体（ＭＢａｂ）を生成するため、プラスミドｐＭＢａｂ−ＨｅａｖｙおよびｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔ（カッパおよびラムダ）を設計した。ｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙベクターは２つのヒトガンマ１重鎖（ＨＣ）カセットを含有してＨＣヘテロダイマー化を支援した。前者の重鎖がＣＨ３ドメインに「ホール」セットの突然変異を有する一方、後者がＣＨ３に相補体「ノブ」突然変異を有し、ただしこれらのカセットの順序は容易に逆にし得る。重鎖および軽鎖のミスペアリングを回避するため、軽鎖と界面ジスルフィドを形成する「ノブ」重鎖のＣＨ１ドメインにおける天然システインを除去し、代替的な界面システインをＣＨ１ドメインにおける他の場所またはＶＨ領域における他の場所に挿入して、コグネイト（本明細書では「対応する」とも称される）軽鎖および重鎖のホモダイマー化を支援する。あるいは、軽鎖と界面ジスルフィドを形成する「ホール」重鎖のＣＨ１ドメインにおける天然システインを除去してもよく、代替的な界面システインをＣＨ１ドメインにおける他の場所またはＶＨドメインにおける他の場所に挿入して、コグネイト軽鎖および重鎖のダイマー化を支援した。場合により、代替的な界面システインの代わりに、コグネイト軽鎖および重鎖のダイマー化を支援するため空洞および／または突出を生成する１つ以上の置換がそれぞれのＣＨ１に導入され、ｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙベクターにおける「ホール」および「ノブ」ＨＣカセットに、それぞれＢｓｓＨＩＩ／ＮｈｅＩおよびＢｓｒＧＩ／ＳａｌＩ制限酵素断片としてＶＨドメインが導入される。ｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔカッパベクターは２つのヒトカッパ軽鎖（ＬＣ）カセットを含有する。ｐＭＢａｂ−ＬｉｇｈｔカッパベクターにおけるＬＣカセットに、それぞれＢｓｓＨＩＩ／ＢｓｉＷＩおよびＢｓｒＧＩ／ＮｏｔＩ制限酵素断片としてＶｋドメインが導入される。ｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔラムダベクターも同様の方法を用いて調製される。ｐＭＢａｂ−ＬｉｇｈｔラムダベクターにおけるＬＣカセットに、それぞれＢｓｓＨＩＩ／ＫａｓＩおよびＢｓｒＧＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素断片としてＶλドメインが導入される。同様に、カッパドメインを含む１つのカセットとラムダドメインを含む１つのカセットとを有するｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔベクターが構築され得る。重鎖および軽鎖のミスペアリングを回避するため、重鎖と界面ジスルフィドを形成するＣＬ（ＣｋまたはＣλ）ドメインの１つにおける天然システインを除去し、代わりに、ＣＬ（ＣｋまたはＣλ）ドメインにおける他の場所またはＶＬにおける他の場所に、ＣＨ１ドメインまたはＶＨドメインにおける代替的なシステインを相補する代替的な界面システインを挿入して、コグネイト軽鎖および重鎖のダイマー化を支援する。場合により、ＣＬドメインにおける代替的な界面システインの代わりに、それぞれのＣＬに、ＣＨ１ドメインにおける空洞および／または突出を相補する代償性の突出および／または空洞を生成する１つ以上の置換が導入され、コグネイト軽鎖および重鎖のダイマー化がを支援される。これらのベクターを使用して、２つの重鎖および（ｉ）２つのカッパ鎖；（ｉｉ）２つのラムダ鎖；または（ｉｉｉ）１つのラムダ鎖および１つのカッパ鎖を有するＭＢａｂを生成することができ、ここで重鎖の少なくとも１つおよび軽鎖の１つには置換が導入されており、それによりミスペアリングが回避され、かつコグネイト軽鎖および重鎖のダイマー化が支援される。

哺乳動物ヒトＩｇＧ１抗体の生成に用いられるインハウス哺乳動物発現ベクターの骨格に、プラスミドｐＭＢａｂ−ＨｅａｖｙおよびｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔ（カッパおよびラムダ）を構築した。ｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙベクターを構築するため、オーバーラップ伸長ＰＣＲ技法を用いた部位特異的突然変異導入によってヒンジ領域配列にＰｍｌＩ部位を導入し、遺伝子操作された定常ドメインの好都合なクローニングを促進した。「ノブ」突然変異Ｔ３６６Ｗ、および安定化突然変異Ｓ３５４Ｃを、オーバーラップ伸長ＰＣＲ技法を用いた部位特異的突然変異導入によってＣＨ３ドメインに導入した。得られた「ノブ」ＣＨ２−ＣＨ３ ＰＣＲ産物を、ベクターにＰｍｌＩ／ＥｃｏＲＩ制限酵素断片としてクローニングし戻すと、ベクターにおいて内部ＮｏｔＩ部位が除去された。Ｖ１２変異体の構築には、２つの突然変異Ｃ２２０ＶおよびＦ１２６Ｃを、オーバーラップ伸長ＰＣＲ技法を用いた部位特異的突然変異導入によって「ノブ」重鎖のＣＨ１ドメインに導入し、ここでは前者が、軽鎖と界面ジスルフィドを形成するＣＨ１における天然システインを突然変異させ、および後者がＣＨ１に代替的な界面システインを導入して、コグネイト軽鎖および重鎖のホモダイマー化を支援した。Ｖ１０、Ｖ１１、またはＶＮ変異体の構築には、Ｃ２２０Ｖ突然変異をＡ１４１Ｃ突然変異、またはＨ１６８Ｃ突然変異、またはＬ１２８Ｃ突然変異と組み合わせる。Ｖ１変異体の構築には、Ｖ１８５ＷおよびＫ１４７Ａ突然変異を場合によりＣ２２０Ｖ突然変異と組み合わせる。Ｖ３変異体の構築には、Ｌ１４５Ｆ、Ｆ１７０Ｖ、Ｓ１８３ＦおよびＶ１８５Ｆ突然変異を場合によりＣ２２０Ｖと組み合わせる。以下に詳述する例では、Ｖ１またはＶ３変異体は合成遺伝子断片の生成によってＣ２２０Ｖ突然変異と組み合わせ、種々のベクターにおける「ノブ」重鎖カセットに挿入し、続いて「ホール」重鎖カセットにおける代替的な変異体とペアリングした（下記参照）（すなわち、ノブカセットにおけるＶ１をホールカセットにおけるＶ３とペアリングした）。望ましくない「ホール−ホール」ホモダイマーの除去を促進するため、ＩｇＧ３ Ｆｃ領域の「ノブ」ＣＨ３ドメインに追加の突然変異を導入してプロテインＡ結合を導入する。例えば、Ｒ４３５Ｈ、Ｆ４３６Ｙ突然変異がＩｇＧ３抗体にプロテインＡ結合を導入することが知られており、以下に詳述するのと同様の方法を用いて導入し得る。

「ホール」セットの突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、および安定化突然変異Ｙ３４９Ｃを、オーバーラップ伸長ＰＣＲ技法を用いた部位特異的突然変異導入によって第２のベクターのＣＨ３ドメインに導入した。得られた「ホール」ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３ ＰＣＲ産物をＢｓｓＨＩＩ／ＸｂａＩで消化し、ＢｓｓＨＩＩ／ＮｈｅＩでベクターを線状化した後の「ノブ」重鎖を有するベクターに挿入し戻した。結果的に「ホール」重鎖断片がベクターにおける軽鎖セグメントを置き換え、さらに内部ＮｈｅＩ部位がノックアウトされたサイレント突然変異が導入され、かつ新しいＨｉｎｄＩＩＩ部位が挿入された。「ホール」重鎖セグメントにＶＨドメインを好都合にクローニングするため、ＣＨ１ドメインの５’における内部ＳａｌＩ部位を、オーバーラップ伸長ＰＣＲ技法を用いた部位特異的突然変異導入によってＮｈｅＩに突然変異させた。配列検証後、得られたプラスミドをｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙと命名した。Ｖ１変異体の構築には、Ｖ１８５ＷおよびＫ１４７Ａ突然変異を場合によりＣ２２０Ｖ突然変異と組み合わせる。Ｖ３変異体の構築には、Ｌ１４５Ｆ、Ｆ１７０Ｖ、Ｓ１８３ＦおよびＶ１８５Ｆ突然変異を場合によりＣ２２０Ｖと組み合わせる。以下に詳述する例では、Ｖ１およびＶ３変異体はＣ２２０Ｖ突然変異なしに合成遺伝子断片として生成し、それぞれ「ノブ」カセットに代替的な変異体を含むｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙベクターの「ホール」重鎖カセットに挿入した。望ましくない「ホール−ホール」ホモダイマーの除去を促進するため、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域の「ホール」ＣＨ３ドメインに追加の突然変異を導入して、プロテインＡ結合を低下させまたは除去する。例えば、以下に記載するとおり、プロテインＡ結合を除去することが知られるＨ４３５Ｒ、Ｙ４３６Ｆ突然変異を導入した。

Ｖ１２変異体を含むｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔベクターの構築用に、オーバーラップ伸長ＰＣＲ技法を用いた部位特異的突然変異導入によってベクターにおける軽鎖カセットに２つの突然変異Ｃ２１４ＶおよびＳ１２１Ｃを導入した。前者が、重鎖と界面ジスルフィドを形成するＣｋドメインにおける天然システインを突然変異させ、および後者が、Ｃｋにおける代替的な界面システインを導入してＣＨ１ドメインにおける代替的なシステインを相補して、コグネイト軽鎖および重鎖のホモダイマー化を支援した。得られたＶ−Ｃｋ ＰＣＲ産物をＢｓｒＧＩ／ＥｃｏＲＩ制限酵素断片としてベクターに導入し戻すと、既存の重鎖カセットが置き換えられた。これはさらに、ベクターにおける内部ＮｏｔＩ部位の除去をもたらした。システイン突然変異軽鎖にＶｋドメインを好都合にクローニングするため、Ｃｋドメインの５’における内部ＳａｌＩ部位を、オーバーラップ伸長ＰＣＲ技法を用いた部位特異的突然変異導入によってＮｈｅＩに突然変異させた。配列検証後、得られたベクターをｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔカッパ鎖と命名した。Ｖλ領域を使用して作製した同様のベクターは、第２の軽鎖カセットにおけるＮｏｔＩ部位を置き換える遺伝子操作されたＨｉｎｄＩＩＩ部位および第１の軽鎖カセットにおけるＢｓｉＷＩを置き換えるＫａｓＩ部位を含む。得られたベクターは、ｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔラムダ鎖と命名した。Ｖ１０、Ｖ１１、またはＶＮ変異体の構築には、Ｃ２１４Ｖ突然変異をＦ１１６Ｃ突然変異（κ）／Ｔ１１６Ｃ突然変異（λ）、またはＴ１６４Ｃ突然変異（κまたはλ）、またはＦ１１８Ｃ突然変異（κまたはλ）と組み合わせる。

Ｖ１変異体の構築には、Ｓ１３１Ｗ（κ）／Ｔ１３１Ｗ（κ）突然変異およびＬ１３５Ｇ（κまたはλ）突然変異を場合によりＣ２２０Ｖ突然変異と組み合わせる。Ｖ３変異体の構築には、Ｓ１７６Ｆ（κまたはλ）突然変異およびＴ１７８Ａ（κ）／Ｙ１７８Ａ（λ）突然変異を場合によりＣ２２０Ｖと組み合わせる。以下に詳述する例では、Ｖ１またはＶ３変異体のいずれも、合成遺伝子断片の生成によってＣ２１４Ｖ突然変異と組み合わせ、ｐＭａｂ−Ｌｉｇｈｔベクターに挿入した。Ｃ２１４Ｖ突然変異は、Ｃ２２０Ｖ突然変異を有する対応するＣＨ１とペアリングしたＶＬのみに含まれた。

発現、アフィニティー精製およびタンパク質定量化
以下に示す構築物は全て、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質移入試薬として使用して懸濁液中でＨＥＫ２９３Ｆ細胞において一過的に発現させて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地で成長させた。これらの試験で使用した抗体の発現には、以下のベクターの組み合わせを用いた：
１．ｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙ抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ ＷＴ＋ｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔ抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ ＷＴ；
２．ｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙ抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ（−Ｃｙｓ）＋ｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔ抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ（−Ｃｙｓ）；３．ｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙ抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ Ｖ１０＋ｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔ抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ Ｖ１０；
４．ｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙ抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ Ｖ１１＋ｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔ抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ Ｖ１１；５．ｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙ抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ Ｖ１２＋ｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔ抗ＩＬ６ ＷＴ＋抗ＲＡＧＥ Ｖ１２；
５．ｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙ抗ＥＧＦＲ ＷＴ＋抗ＨＥＲ２ Ｖ１２＋ｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔ抗ＥＧＦＲ ＷＴ＋抗ＨＥＲ２ Ｖ１２；
６．ｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙ抗ＩＬ６ Ｖ１＋抗ＲＡＧＥ Ｖ３（−Ｃｙｓ）＋ｐＭａｂ−Ｌｉｇｈｔ抗ＩＬ６ Ｖ１＋抗ＲＡＧＥ Ｖ３（−Ｃｙｓ）；
７．ｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙ抗ＩＬ６ Ｖ３＋抗ＲＡＧＥ Ｖ１（−Ｃｙｓ）＋ｐＭａｂ−Ｌｉｇｈｔ抗ＩＬ６ Ｖ３＋抗ＲＡＧＥ Ｖ１（−Ｃｙｓ）；
８．ｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙ抗ＩＬ６ Ｖ１＋抗ＲＡＧＥ Ｖ３＋ｐＭａｂ−Ｌｉｇｈｔ抗ＩＬ６ Ｖ１＋抗ＲＡＧＥ Ｖ３；および
９．ｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙ抗ＩＬ６ Ｖ３＋抗ＲＡＧＥ Ｖ１＋ｐＭａｂ−Ｌｉｇｈｔ抗ＩＬ６ Ｖ３＋抗ＲＡＧＥ Ｖ１。

培養培地は形質移入の１０日後に回収し、全ての抗体フォーマットは、製造者のプロトコルに従い標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製し（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、続いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて還元および非還元条件下で、および分析的サイズ排除クロマトグラフィーを使用して（以下の方法を参照）、構築物の純度を分析した。理論的に決定された吸光係数を使用して、２８０ｎｍの吸光度を読み取ることにより精製抗体の濃度を決定した。

「ホール」重鎖に「ＲＦ」突然変異を有するｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙ構築物の遺伝子操作、生成および分析
「ホール」重鎖のプロテインＡ結合を除去するため、ＣＨ３ドメインにおけるｈＩｇＧ１残基Ｈ４３５およびＹ４３６を、ヒトＩｇＧ３に見られるとおり、それぞれ対応するＲ４３５およびＦ４３６へと、オーバーラップ伸長ＰＣＲ技法を用いた部位特異的突然変異導入によって突然変異した（Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ）。「ＲＦ」突然変異と称される突然変異Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆを有する得られたヒトＩｇＧ１「ホール」重鎖は、プロテインＡとの結合能力を欠いている。ＲＦ突然変異を有するｐＭＢａｂ構築物を、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質移入試薬として使用して懸濁液中でＨＥＫ２９３Ｆ細胞において一過的に発現させて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地で成長させた。標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、製造者のプロトコル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に従い培養上清を精製し、続いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、および還元および非還元条件下で逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により、タンパク質試料を分析および特徴付けした。軽鎖がミスペアリングした副産物（すなわち、ミスペアリングした軽鎖を含む重鎖ヘテロダイマー）を、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＬＣ−ＫａｐｐａまたはＬＣ−Ｌａｍｂｄａアフィニティークロマトグラフィーにより、製造者のプロトコル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に従い除去し、続いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。決定されている吸光係数を使用して、２８０ｎｍの吸光度を読み取ることにより精製抗体の濃度を決定した。

ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよび光散乱検出分析
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、分取ＳＥＣ−ＨＰＬＣを１ｍｌ／分の流速で実施した。光散乱検出器とインラインで連結した分析用ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、親抗体および一価二重特異的抗体（ＭＢａｂ）の絶対分子質量を決定した。

ＥＬＩＳＡ結合
ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で２０時間、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈した抗原でコーティングし、ＰＢＳ中の２％（ｖ／ｖ）脱脂乳＋０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ ２０により室温で２時間ブロックした。後続の工程は全て室温で行った。抗体を種々の濃度でプレートに加え、１時間インキュベートした。ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトを二次抗体として使用した。発色ＨＲＰ基質ＴＭＢを使用してＥＬＩＳＡプレートを発色させ、発色を１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止させ、得られたシグナルをＡ４５０ｎｍで読み取った。

ＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合
全てのＡｌｐｈａＬＩＳＡ試薬はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒによった。弱い照明の条件下、室温でＡｌｐｈａＬＩＳＡビーズとのインキュベーション工程を実施した。アッセイは、白色９６ウェルハーフエリアＯＰＴＩＰＬＡＴＥＳにおいて実施した。種々の濃度の抗体を、１Ｘ ＡｌｐｈａＬＩＳＡイムノアッセイ緩衝液中、室温で１時間、４０マイクログラム／ｍｌのＡｌｐｈａＬＩＳＡ抗ＦＬＡＧアクセプタービーズおよび１０ｎＭのビオチン化ＩＬ６およびＲＡＧＥ−ＦＬＡＧ抗原と共にインキュベートした。４００マイクログラム／ｍｌのＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＳＡ）ドナービーズを３０分間加え、続いてアッセイプレートをＥＮＶＩＳＩＯＮプレートリーダーで読み取った。

キネティクスおよび同時結合
結合キネティクスを、２つの異なる捕捉フォーマットを用いて、Ｏｃｔｅｔ３８４機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）でバイオレイヤー干渉法により計測した。

フォーマットＩ：抗ｈＩｇＧ−Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーに、ＰＢＳ ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（キネティック緩衝液）中の抗体をローディングした。ローディングしたバイオセンサーを同じ緩衝液で洗浄した後、指示時間に対して種々の抗原による結合および解離測定を実施した。ＯＣＴＥＴソフトウェア ｖ．６．１を使用して、データの非線形フィットから速度論的パラメータ（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）および親和性（ＫＤ）を計算した。

フォーマットＩＩ：ストレプトアビジン高結合キャパシティ（キネティクスグレード）バイオセンサーに、ＰＢＳ ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（キネティック緩衝液）中のビオチン化抗原をローディングした。ローディングしたバイオセンサーを同じ緩衝液で洗浄した後、指示時間に対して抗体および抗原による結合および解離測定を実施した。Ｏｃｔｅｔソフトウェア ｖ．６．１を使用してデータ解析を行った。

示差走査熱量測定分析
ＭＩＣＲＯＣＡＬ ＶＰ−ＤＳＣ走査マイクロカロリメーター（Ｍｉｃｒｏｃａｌ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、ＤＳＣ実験を実施した。ＤＳＣに用いた全ての溶液および試料は０．２２マイクロメートルフィルタを使用して濾過し、脱気してからカロリメーターにローディングした。ＤＳＣ試験に用いた抗体は、分析的ゲル濾過クロマトグラフィーにより判断するとき、９５％超モノマーであった。ＤＳＣ分析の前に、全ての試料を２５ｍＭヒスチジン−ＨＣｌ（ｐＨ６）で徹底的に透析した（少なくとも３つの緩衝液交換）。次いで、この透析からの緩衝液を後続のＤＳＣ実験の参照緩衝液として使用した。試料測定の前、試料計測値から差し引くベースライン計測値（緩衝液対緩衝液）を得た。透析試料（１ｍｇ／ｍｌの濃度）をサンプルウェルに加え、ＤＳＣ測定を１℃／分の走査速度で実施した。Ｍｉｃｒｏｃａｌにより提供されるＯｒｉｇｉｎ（商標）ＤＳＣソフトウェアを使用して、データ解析およびデコンボリューションを実施した。非二状態モデルを使用してデコンボリューション分析を実施し、１００反復サイクルを用いてベストフィットを得た。ＤＳＣデコンボリューション結果の解釈は、オリゴ特異的抗体フォーマットにおける異なるドメインが協同的転移で独立してアンフォールドされることに基づいた。

ペプチドマッピング
初めに、１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミドを使用して試料中の遊離チオール基をキャッピングした。次いで、５ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび６Ｍグアニジン、ｐＨ７．０の溶液中、３７℃で３０分間、試料を変性させた。次いで、変性した溶液を、ｐＨ７．０の０．０６ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液で２．５倍希釈した。エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃを１：１０の酵素：タンパク質比で添加し、反応混合物を３７℃で１６時間インキュベートした。追加のＬｙｓＣを１：１０の酵素：タンパク質比で添加し、さらに３７℃で４時間インキュベートした。Ｌｙｓ−Ｃ消化後、ＤＴＴを終濃度３０ｍＭとなるように添加して３７℃で１５分間インキュベートすることにより、各反応混合物の半分を還元した。反応混合物の残りの半分は、還元せずに調製した。消化したペプチドをＵＰＬＣ逆相クロマトグラフィー分析（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ ＲＰ Ｃ１８カラム；１．７マイクロメートル １００×２．１ｍｍ）により分離し、ＵＶ検出器およびオンラインＬＴＱ ＯＲＢＩＴＲＡＰ質量分析器（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）により分析した。ＲＰ−ＵＰＬＣ移動相Ａは水中０．０２％ＴＦＡであったとともに、移動相Ｂはアセトニトリル中０．０２％ＴＦＡである；緩衝液Ｂが増加する勾配を用いて試料を溶出した。非還元（ジスルフィド結合したペプチドを含有する）と還元（還元型のペプチドを含有する）とのペプチドマップの結果を比較してペプチドを同定し、分析した。既知のタンパク質配列に基づき、ＭＳ（質量）データを使用して各ペプチドの配列を同定し、ＭＳ／ＭＳ（ペプチド質量シークエンシング）データを使用して確認した。ＭＳデータにより、また非還元試料中にのみ存在したペプチドとして、ジスルフィド結合したペプチドが確認された。

パパイン消化Ｑ−ＴＯＦ ＬＣ−ＭＳ分析
パパイン消化のため、１ｍｇ／ｍｌの抗体を０．４マイクログラムのパパインワーキング溶液で処理し、３７±１℃の水浴中で４時間インキュベートした。Ｑ−ＴＯＦ（四重極直交加速飛行時間）型質量分析器の一つをＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（商標）システムと連動させて、Ｑ−ＴＯＦ ＭＳを実施した。逆相クロマトグラフィー分離を、ＢＥＨ Ｃ４ １．７マイクロメートル ２．１×５０ｍｍカラムで、水中０．１％ＦＡ、０．０１％ＴＦＡの移動相Ａおよびアセトニトリル中０．１％ＦＡ、０．０１％ＴＦＡの移動相Ｂを使用して実施した。移動相Ｂが増加する２５分線形勾配を用いて試料を溶出した。既知のタンパク質配列に基づき、ＭＳ（質量）データを使用してＦａｂおよびＦｃ ｍＡｂ断片を同定した。

細胞結合
一価二重特異的ＩｇＧ１抗体（ＭＢａｂ）および親ｍＡｂによる細胞結合をフローサイトメトリーによって試験した。用いた細胞系はヒト類表皮癌Ａ４３１細胞系、ヒト乳癌細胞系ＳＫＢＲ３、ヒト膵癌細胞系ＢｘＰＣ−３およびヒト卵巣癌細胞系ＳＫ−ＯＶ−３であった。各実験につき約５×１０^５細胞を使用した。トリプシン処理後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ中１％ＢＳＡ（Ｃａ^＋＋、ｍｇ^＋＋不含））で２回洗浄した。１０マイクログラム／ｍｌの抗体を４℃で１時間、細胞チューブに添加した。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトを４℃で４５分間、添加した。ＳＬＲ ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＡ）のフローサイトメトリーを用いて結合した抗体の検出を実施し、結果をＦＬＯＷＪＯプログラムで分析した。

細胞生存率アッセイ
細胞殺傷活性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ルミネセンス細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。用いた細胞系は、ヒト類表皮癌Ａ４３１細胞系、ヒト乳癌細胞系ＳＫＢＲ３、ヒト膵癌細胞系ＢｘＰＣ−３およびヒト卵巣癌細胞系ＳＫ−ＯＶ−３であった。細胞を９６ウェルプレートに、１０％ＦＣＳを補足したＤＭＥＭ中５×１０^３細胞／ウェルの密度で播種した。種々の濃度の抗体を４通りの試料に添加し、細胞を５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で９６時間インキュベートした。処理後、細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬に２０分間曝露し、ＥＮＶＩＳＩＯＮプレートリーダーを使用してルミネセンスを測定した。

Ｆｃ受容体に対する結合キネティクス
種々のヒトＦｃ受容体に対するＭＢａｂ抗体およびヒトＩｇＧ１アイソタイプの結合親和性は、ＰｒｏｔｅＯｎで定常状態平衡結合アッセイを用いた。ｐＨ５．０のＰｒｏｔｅＯｎ酢酸緩衝液中、５０ｕｇ／ｍｌの抗体をＧＬＣチップ表面に固定化した。同じ緩衝液を使用した１：３段階希釈液中の５つの濃度の分析物を、固定化した表面上に通過させた。結合試験は室温で実施し、各分析物の平衡結合速度を決定し、それを用いて平衡解離定数（ＫＤ）を計算した。

ＡＤＣＣ試験
ＡＤＣＣをＣＹＴＯＴＯＸ ９６非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。このアッセイではヒト類表皮癌Ａ４３１細胞系を使用した。細胞を９６ウェルプレートに、３％ＦＣＳを補足したフェノールレッド不含ＲＰＭＩ １６４０中４×１０^４細胞／ウェルの密度で播種した。ヒトＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）およびＦｃεＲＩγの悪性非ホジキンリンパ腫トランスジェニック由来のヒトＮＫ細胞系を標的細胞と１：１の比で混合した。種々の濃度の抗体を４通りの試料に添加し、細胞を５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で５時間インキュベートした。処理後、細胞をＣＹＴＯＴＯＸ ９６試薬に１５分間曝露し、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ ３４０ＰＣプレートリーダーを使用して４０９ｎｍのＯＤを測定した。

選択的結合試験
選択的結合試験では、抗細胞表面抗原Ｃ（抗Ｃ）および抗細胞表面抗原Ｄ（抗Ｄ）を含むＭＢａｂを生成した（Ｃ／Ｄ−ＭＢａｂ）。両方の標的抗原（ＣおよびＤ）を発現する細胞に対するＭＢａｂの選択的結合を、抗原Ｃのみを発現する細胞（Ｃ細胞）、抗原Ｄを発現する細胞（Ｄ細胞）ならびにＣおよびＤの両方を発現する細胞（Ｃ／Ｄ細胞）を抗体染色用の単一のウェルに混合した複合集団培養系を使用して測定した。簡潔に言えば、Ｃ細胞およびＣ／Ｄ細胞が、それらを培養下で組み合わせる前に、それぞれ固有の同定トレーサー色素で染色され：Ｃ細胞がｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４０−９０）で染色され、Ｃ／Ｄ細胞がＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ３４５５７）で染色された一方、Ｄ細胞は染色されないままであった。このように、抗体染色後のフローサイトメトリー分析においてそれぞれの集団を区別することができた。細胞を１：１：１の比で組み合わせ、Ｃ／Ｄ−ＭＢａｂおよび２つの二価親ＩｇＧ（抗Ｃおよび抗Ｄ）の段階希釈液と共にインキュベートした。一次抗体インキュベーションを４℃で１時間実施し、過剰な抗体を除去し、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧを使用して細胞結合抗体を検出した。ＢＤ ＬＳＲ ＩＩで分析を実施し、ここでダブレットは物理的特性（高さ、幅および密度）に基づき除外した。

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ３０００９）で標識した組換え標的タンパク質およびフローサイトメトリー分析を用いて、同じ細胞上の標的抗原に対する各Ｃ／Ｄ−ＭＢａｂアームの同時結合を決定した。Ｃ／Ｄ細胞（両方の標的抗原を発現する）をＣ／Ｄ−ＭＢａｂの段階希釈液（５〜０．０１ｎＭ）と共に１時間インキュベートし、その後、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ウシ胎仔血清）で２回洗浄して未結合のＣ／Ｄ−ＭＢａｂを除去した。ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧを使用して、細胞に結合したＣ／Ｄ−ＭＢａｂを検出し、未結合のＣ／Ｄ−ＭＢａｂアームは、蛍光Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７マイクロスケールタンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ３０００９）色素で標識した組換え標的タンパク質（ＣまたはＤ）を使用して検出することができた。単一の細胞に対する同時結合が測定されたことを確かめるため、ダブレット（フローサイトメーターを一緒に通過する２つ以上の細胞）を、分析に含まれた各細胞の高さ、幅および密度の物理的特性に基づき厳密に除外した。

実施例２：一価二重特異的抗体（ＭＢａｂ）設計
一価二重特異的ＩｇＧフォーマット（ＭＢａｂ）の概略図を図１Ｂに提示する。ＭＢａｂは、ＩｇＧフォーマットにおいて各抗原に対して一価の結合部位を有する二重特異的抗体である。２つの異なる重鎖のヘテロダイマー化のため、プラットフォームは、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（７）：６１７−２１に記載されるとおりＣＨ３ドメインに古典的「ノブ・イントゥー・ホール」概念を利用し、また、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ．ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ １６：６７７−６８１に記載されるとおり、２つの重鎖の安定性およびヘテロダイマー化をさらに向上させるＣＨ３ドメインにおける鎖間ジスルフィドの組み込みも利用した。それに加えてまたは代えて、ＣＨ３ドメインが、一方の重鎖上にアミノ酸残基Ｈ４３５およびＹ４３６を含み、かつ他方の重鎖上にアミノ酸残基Ｒ４３５およびＦ４３６を含むように遺伝子操作され、１つの鎖のプロテインＡ結合が除去される。上記のとおり、「ノブ・イントゥー・ホール」プラットフォームが用いられる場合、「ホール」を含む重鎖は酸残基Ｒ４３５およびＦ４３６を含み得る（図１Ｂで星印により示される）。ＣＨ３ドメインのこの場所は、図２の左側のパネルに提示する構造において矢印により示される。一価二重特異的抗体におけるコグネイト重鎖および軽鎖の正しいペアリングのため、ＭＢａｂ構築物における２つの抗体の一方の重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を形成する天然の鎖間システインを除去し、代わりに、ＣＬ−ＣＨ１界面における他の場所に代替的な鎖間ジスルフィドを挿入して、コグネイト重鎖および軽鎖のホモダイマー化を支援した。

実施例３：ＬＣ−ＨＣ界面に代替的システインを有する変異体の設計
コグネイト重鎖および軽鎖に限る正しいペアリングを強制する代替的なＬＣ−ＨＣ界面を生成するため、ＭＢａｂ構築物における２つの抗体の一方の鎖間ジスルフィドの再構築を含め、いくつかの方法を実施し得る。初めに、重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を形成する天然の鎖間システインを、非システインアミノ酸残基、例えばバリンにより置き換えた。次に、３つの基準を用いて、システインへの置換に好適なＬＣ−ＨＣ界面におけるアミノ酸ペアを同定した。第一に、対応するアルファ炭素間の距離が、天然に生じるジスルフィド結合に見られる距離（６．０〜７．０Å）と同程度でなければならない。第二に、ベータ炭素が（４．０〜５．０Å）の距離で互いの方を向いていなければならない。第三に、残基ペアが異なる鎖に属しなければならない。これらの基準を満たすＬＣ−ＨＣ界面の７つの残基ペアを表７に提供する。

それぞれ変異体１０、１１および１２（Ｖ１０、Ｖ１１およびＶ１２）に対応する３つの変異体、ＨＣ：Ａ１４１／ＬＣ：Ｆ１１６、ＨＣ：Ｈ１６８／ＬＣ：Ｔ１６４およびＨＣ：Ｆ１２６／ＬＣ：Ｓ１２１を試験した。図２の右側のパネルに提示する構造では、これらの位置の場所を矢印により示す。

別のアプローチでは、代替的な鎖間ジスルフィドを抗体の可変領域においてＶＨおよびＶＬ領域間で遺伝子操作し得る。特に、ＶＬおよびＶＨ領域が代替的なジスルフィドを介して結合されるように、そのようなジスルフィドをフレームワーク領域に導入してもよい。このアプローチでは、重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を形成する天然の鎖間システインが非システインアミノ酸残基（例えば、バリン、アラニン、グリシン等）により置き換えられ、ＶＨおよびＶＬ領域の、一般にはフレームワーク領域におけるある非システインアミノ酸が、システインにより置き換えられる。位置は、システイン残基がジスルフィド結合を形成することができるように選択される。これらの基準を満たすＶＨおよびＶＬ領域における残基の位置を表８に提供する。

さらに別のアプローチでは、ＣＨ１領域が、突出および／または空洞を生成するように遺伝子操作される一方、コグネイト軽鎖が、代償性の空洞および／または突出を生成するように遺伝子操作され得る。コグネイト重鎖および軽鎖に限る正しいペアリングをさらに強制するため、ＣＨ１およびＣＬ領域を、重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を形成する天然の鎖間システインが除去されるようにさらに改変してもよい。

一方のアームだけＬＣ−ＨＣ界面が上記のとおり改変されるか、あるいは、両方のアームとも改変され得る二重特異的抗体が生成され得る。本明細書における教示に基づけば、正しくないペアリングを最小限に抑える一方でコグネイト重鎖および軽鎖の正しいペアリングを強制するため、各アームのＬＣ−ＨＣ界面は異なる形で改変されるであろうことが理解される。例えば、限定するものではないが、一方のアームが天然のジスルフィド結合をＬＣおよびＣＨ１領域内の異なる位置に再配置するように改変され、かつ他方のアームが天然のジスルフィド結合をＶＬ−ＶＨ領域に再配置するように遺伝子操作されてもよく、または両方のアームが天然のジスルフィド結合をＬＣおよびＣＨ１界面内の異なる位置に再配置するように改変されてもよく、または両方のアームがＬＣおよびＣＨ１界面内の異なる位置に空洞および／または突出を組み込むように改変されてもよい。

実施例４：哺乳動物細胞における一価二重特異的抗体生成用のｐＭＢａｂベクター系の開発
哺乳動物細胞培養で一価二重特異的ヒトＩｇＧ１抗体を生成するため、プラスミドｐＭＢａｂ−ＨｅａｖｙおよびｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔを設計した。ｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙベクター（図３Ｃ）は２つのヒトガンマ１重鎖カセットを含有してＨＣヘテロダイマー化を支援し、前者の重鎖はＣＨ３ドメインに「ホール」セットの突然変異を有した一方、後者はＣＨ３ドメインに相補「ノブ」突然変異を有し、およびＣＨ１ドメインに代替的システインを有した。ＶＨドメインをｐＭＢａｂ−Ｈｅａｖｙベクターの「ホール」および「ノブ」ＨＣカセットに、それぞれＢｓｓＨＩＩ／ＮｈｅＩおよびＢｓｒＧＩ／ＳａｌＩ制限酵素断片として導入した。ｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔカッパベクター（図３Ａ）は２つのヒトカッパ軽鎖（ＬＣ）カセットを有し、後者は、ＣＨ１ドメインの代替的システインを相補するＣｋドメインにおける代替的な界面システインを有した。ＶｋドメインをｐＭＢａｂ−ＬｉｇｈｔベクターのＬＣカセットに、それぞれＢｓｓＨＩＩ／ＢｓｉＷＩおよびＢｓｒＧＩ／ＮｏｔＩ制限酵素断片として導入した。強力なヒトサイトメガロウイルス初期プロモーターは、両方のｐＭＢａｂベクターで軽鎖および重鎖遺伝子を駆動することができる。２つの重鎖および２つの軽鎖を別個のベクターに置くことで、モノトランスフェクションに起因して親抗体のいずれかが生成されるリスクを取り除いた。さらに、より高い発現レベルを有する抗体の重鎖可変領域を、「ノブ」を含む定常領域カセットにクローニングすると、半抗体の生成を最小限に抑え得る。さらに、１つの鎖のみがプロテインＡに結合するように、本明細書に記載されるとおり重鎖のＣＨ３ドメインを遺伝子操作してもよい。

実施例５：変異体の発現、精製および分析
変異体をＨＥＫ２９３Ｆ細胞で一過的に発現させて、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー前後の培養上清を還元および非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図４に示すとおり、分子の抗ＲＡＧＥ部分の重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を形成する天然の鎖間システインを除去すると、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで軽鎖の分離が生じ、２Ｈ１Ｌおよび別個の軽鎖に対応する１２５ｋＤａおよび２５ｋＤａの泳動プロファイルが得られた。一方のアームが天然の鎖間システインを欠いているＶ１およびＶ３変異体を含む抗体についても同様の泳動プロファイルが見られた（データは示さず）。プロテインＡ精製画分におけるフリーの軽鎖の存在は、抗体が溶液中で適切に構築され、２つの軽鎖および２つの重鎖を有するインタクトな抗体として精製できることを示している。天然の鎖間システインを欠くものの、代替的な鎖間ジスルフィド結合を有する変異体を、代替的な鎖間ジスルフィド結合の形成および重鎖および軽鎖の２つのペアの正しい構築を示す１５０ｋＤａ泳動プロファイルを再構成するその能力について試験した。変異体１０および１１（Ｖ１０およびＶ１１）が１５０ｋＤａ泳動プロファイルの何らかの再構成およびフリーの軽鎖の量の減少を示した一方、変異体１２（Ｖ１２）は、Ｆａｂにおける天然の鎖間ジスルフィドおよびＣＨ３におけるノブ・イントゥー・ホールを有するＷＴ ＩｇＧ分子（ノブ・イントゥー・ホールＩｇＧ）と全体的に同一の泳動プロファイルを有する１５０ｋＤａ分子マーカーの完全な再構成を示した（図４）。分析的サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ））で変異体１２（Ｖ１２）のプロテインＡ精製画分のオリゴマー状態を解析したところ、モノマーＭＢａｂが約８５％であり、約１０％が対をなさない半ＩｇＧ、かつ約５％が凝集物であることが示された（図６Ｂ）。分取ＳＥＣ後、変異体１２（Ｖ１２）を、９９％超モノマーの準均一に達し、かつ親抗ＲＡＧＥおよび抗ＩＬ６ ｍＡｂと全体的に同様のＳＥＣプロファイルになるまで精製した。

Ｆａｂを有するＶ１２の結晶構造を解析した。電子密度により、新規に導入されたシステイン残基の位置で重鎖と軽鎖との間に新しいジスルフィド結合が形成されたことが確認された（データは示さず）。

ＭＢａｂ分子を含む４つの鎖の不均等な発現は、軽鎖の１つが過剰であることに起因した３種類の副産物の形成をもたらし得る；ホール−ホールホモダイマー、ホール−半ＩｇＧおよびＬＣミスペアリング副産物。「ホール−ホール」ホモダイマー副産物の形成については、既に報告されている（Ｒｉｄｇｗａｙ，ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９：６１７−２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６：６７７−６８１）。ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインにおけるＨｉｓ４３５をＩｇＧ３由来の対応するＡｒｇ４３５により置換すると、プロテインＡ結合能力が除去されることが実証された（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１：２５−３４）。Ｔｙｒ４３６Ｐｈｅのさらなる置換を作製することにより、全てのヒト抗体配列を維持することで免疫原性が低下した（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．前掲）。「ホール」関連副産物を効率的に除去するため、「ホール」重鎖のＣＨ３ドメインにおける残基Ｈ４３５およびＹ４３６を、ＩｇＧ３のように、それぞれ対応するＲ４３５およびＦ４３６に突然変異した。突然変異Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆを有する得られたｈＩｇＧ１「ホール」重鎖を「ホール−ＲＦ」と命名した。「ホール」重鎖にＲＦ突然変異を有する抗抗原Ａ（ホール重鎖；ラムダ軽鎖）と抗抗原Ｂ（ノブ重鎖；カッパ軽鎖）とを含むＭＢａｂ構築物（「ＭＢａｂ−ＲＦ」と命名）を、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞で一過的に発現させた。この発現により、２つの親抗体の発現プロファイル（２００〜３４８ｍｇ／ｌ）と相関するＭＢａｂ−ＲＦ（１９０ｍｇ／ｌ）が生じた。非還元および還元条件下でのプロテインＡ精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、過剰な「ホール」重鎖がなく、「ホール」および「ノブ」重鎖が均等に分布していることを示す（図７Ａ、左側のパネル、それぞれレーン１および２）。プロテインＡ精製したＭＢａｂ−ＲＦのＳＥＣプロファイルから、約９７．５％がモノマーで、約２．５％が凝集物であり、対をなさない半ＩｇＧ副産物がないことが示された（図７Ａ、右側のパネル）。ＲＰ−ＨＰＬＣによる非還元条件下でのプロテインＡ精製親ＩｇＧおよびＭＢａｂ−ＲＦの移動プロファイルから、溶出中心が約１６．２分のＭＢａｂ−ＲＦが親Ｂ（１４．７分）と親Ａ（１７．４分）との間で移動したことが示された（図７Ｂ）。このデータもやはり、ＭＢａｂ−ＲＦが等量の「ホール」および「ノブ」重鎖を含み、過剰な「ホール」重鎖がないことの確認となる。還元条件下におけるＲＰ−ＨＰＬＣによってＭＢａｂ−ＲＦのプロテインＡ精製画分のオリゴマー状態を分析することにより、抗原Ｂ軽鎖が抗原Ａ軽鎖に対して１．０〜０．６の比で過剰であると、約２５％抗原Ｂカッパ軽鎖ミスペアリング副産物が生じたことが示された（図７Ｃ）。

ミスペアリング軽鎖副産物を効率的に除去するため、選択的軽鎖アフィニティークロマトグラフィーが実施され、ここでは本明細書に記載されるとおりラムダに対して選択的なアフィニティー媒体を使用して所望のＭＢａｂを捕捉し、２つのカッパ鎖を含むミスペアリング抗体を除去させる。図８に示すとおり、続いてＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティーカラムでＭＢａｂ−ＲＦのプロテインＡ精製画分の分離が生じて抗原Ｂ軽鎖ミスペアリング副産物が除去され、純粋な、正しく構築されたＭＢａｂ−ＲＦ産物が得られた。還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ精製試料について２つの軽鎖が等量である一方、フロースルーにおけるタンパク質はｃＭＥＴ軽鎖のみを有することを示す（図８Ａ左側、レーン６および７を比較）。ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ精製ＭＢａｂ−ＲＦのＳＥＣプロファイルから、１００％がモノマーで、凝集物がないことが示された（図８Ａ右側）。還元条件下におけるＲＰ−ＨＰＬＣによってＭＢａｂ−ＲＦのＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ精製画分のオリゴマー状態を分析することにより、フロースルーにおけるタンパク質が抗原Ａ軽鎖ミスペアリング副産物に対応した（図８Ｂ）一方、溶出画分におけるタンパク質が等量の２つの軽鎖を含む純粋なＭＢａｂに対応した（図８Ｃ）ことが示された。

実施例６：ＡｌｐｈａＬＩＳＡによる変異体二重特異性の決定
２つの結合部位の二重特異性および同時結合を決定するため、実施例１に示すとおりＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを開発した。簡潔に言えば、２つの結合部位がＲＡＧＥ抗原およびＩＬ６抗原に同時結合したことでドナーおよびアクセプタービーズが近接し、それにより記録可能なシグナルが生じた。変異体の二重特異性レベルを定量化するため、単細胞において親の抗ＩＬ６および抗ＲＡＧＥ抗体のＤＮＡプラスミドを同時発現させることにより、参照一価二重特異的ＩｇＧを生成した。軽鎖と重鎖との自発的なペアリングが起こるはずであり、理論上、総タンパク量の１２．５％が一価二重特異的ＩｇＧとして生成される。初めにＩＬ６カラムでの、次いでＲＡＧＥカラムでの連続アフィニティークロマトグラフィーにより、遺伝子操作が関わることなく純粋な一価二重特異的ＩｇＧが得られた。２段階精製した一価二重特異性により得られたＡｌｐｈａＬＩＳＡシグナルを使用して、１００％二重特異性の参照を設定した（図５）。変異体１および３の組み合わせは、ノブ・イントゥー・ホールＩｇＧと比べてＡｌｐｈａＬＩＳＡ二重特異性アッセイにおいて小さい増加を示し、これは、単一の（−Ｃｙｓ）を加えることによりさらに増進された。ＩＬ６ Ｖ１およびＲＡＧＥ Ｖ３（−Ｃｙｓ）の組み合わせが、ノブ・イントゥー・ホールＩｇＧと比べてＡｌｐｈａＬＩＳＡ二重特異性アッセイにおける最大の増加を示した（図５Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と一致して、変異体１０および１１（Ｖ１０およびＶ１１）がノブ・イントゥー・ホールＩｇＧと比べてＡｌｐｈａＬＩＳＡ二重特異性アッセイにおける中程度の改善を示した一方、変異体１２（Ｖ１２）はほぼ１００％の二重特異性を示した（図５ｂ）。

実施例７：Ｏｃｔｅｔ分析によるキネティクスおよび同時結合
ＲＡＧＥ抗原およびＩＬ６抗原に対する変異体１２（Ｖ１２）ＭＢａｂの二重特異性および同時結合を、上記に記載した捕捉フォーマットＩを使用したＯｃｔｅｔ３８４でのバイオレイヤー干渉法によってさらに特徴付けた。以下の抗体：変異体１２ ＭＢａｂ、抗ＲＡＧＥ、抗ＩＬ６および二段階精製一価二重特異的誘導体を、抗Ｆｃセンサで捕捉し、次いで特異的抗原結合について試験した。親の抗ＩＬ６および抗ＲＡＧＥは、そのそれぞれの抗原のみに対して特異的結合を示したが、変異体１２ ＭＢａｂおよび二段階精製一価二重特異体は、ＲＡＧＥ抗原およびＩＬ６抗原に対して同じ同時結合プロファイルを呈した（図９）。ＲＡＧＥ抗原およびＩＬ６抗原に対するその結合キネティクスについて試験すると、変異体１２は、図１０に示すとおり、それぞれの抗原に対して親抗体と同じキネティック親和性（ＫＤ）を全体的に同様のｋｏｎおよびｋｏｆｆ速度で示した。

実施例８：ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ ＭＢａｂの生成および分析
ＭＢａｂ分子の治療的意義を評価し、さらにプラットフォームを検証するため、２つの臨床的に承認された抗体、すなわちＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）と同様の結合特性を有する一価二重特異的抗体（ＭＢａｂ）を生成した（図１１Ａ、左側のパネル）。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびセツキシマブによる同時治療では、各ｍＡｂ単独の効果と比較してヒト異種移植片においてはるかに大きい腫瘍退縮が生じ得る（Ｌａｒｂｏｕｒｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：３３５６−３３６２）。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にｐＭＢａｂ−ＨｅａｖｙおよびｐＭＢａｂ−Ｌｉｇｈｔベクターを一過性に同時形質移入した後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで培養上清を精製した。非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、抗体の大部分が２つの重鎖と２つの軽鎖とを伴い正しく生成されたことが示された（図１１Ａ、右側のパネル）。ＭＢａｂの発現収率（１５０ｍｇ／ｌ）は、２つの親抗体の発現プロファイル；抗ＨＥＲ２（２００ｍｇ／ｌ）および抗ＥＧＦＲ（９０ｍｇ／ｌ）と相関した。プロテインＡ精製ＭＢａｂのＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイルから、約９０％がモノマーであり、約１０％が対をなさない半ＩｇＧであり、および３％未満が凝集物であることが示された。分取ＳＥＣ後、９９％超モノマーの準均一に達し（図１１Ｂ）、かつ親ｍＡｂと全体的に同様のＳＥＣプロファイルになるまで（図１１Ｃ）、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ ＭＢａｂを精製した。ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析から、ＭＢａｂについてＭＷ値１５４．８ＫＤならびに抗ＥＧＦＲおよび抗ＨＥＲ２についてそれぞれ１５８．５ＫＤおよび１５４．０ＫＤが示された。３つの抗体の移動プロファイルから、約９．２８分の溶出中心のＭＢａｂが抗ＥＧＦＲ（９．２０分）と抗ＨＥＲ２（９．３３分）との間で移動したことが示された（図１１Ｄ）。

実施例９：Ｏｃｔｅｔ分析による同時結合分析
ＨＥＲ２抗原およびＥＧＦＲ抗原に対するＨＥＲ２／ＥＧＦＲ ＭＢａｂの二重特異性および同時結合を、上記に記載したフォーマットＩを用いたＯｃｔｅｔ分析により決定した。抗Ｆｃセンサでの捕捉後、ＭＢａｂは、ＨＥＲ２抗原およびＥＧＦＲ抗原に対する同時結合プロファイルを示した一方、親抗体は、そのそれぞれの抗原のみに対する特異的結合を示した（図１２）。

さらに、ＨＥＲ２抗原およびＥＧＦＲ抗原に対するＨｅｒ２／ＥＧＦＲ ＭＢａｂの二重特異性および同時結合を、代替的な捕捉フォーマット（上記に記載したフォーマットＩＩ）を用いたＯｃｔｅｔ分析により決定した。ストレプトアビジン高結合キャパシティセンサでのビオチン化ＥＧＦＲまたはビオチン化ＨＥＲ２の捕捉後、ＭＢａｂは対応する非標識抗原に対する同時結合プロファイルを示した一方、親の抗ＨＥＲ２および抗ＥＧＲＦ抗体は、そのそれぞれの抗原のみに対する特異的結合を示した（図１３）。

実施例１０：示差走査熱量測定による熱安定性分析
抗ＨＥＲ２、抗ＥＧＦＲ、およびＨＥＲ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂの熱安定性を、ＤＳＣを用いて評価した（図１４）。抗ＨＥＲ２のＤＳＣサーモグラムは、６８．９℃および８１．３℃の変性温度（Ｔｍ）の２つの異なるアンフォールディング転移を示した（図１４Ａ、左上）。これらの転移は、それぞれＣＨ２およびＦａｂ＋ＣＨ３ドメインの変性に対応した。抗ＥＧＦＲのＤＳＣサーモグラムは、４つの転移を明らかにした（図１４Ａ、右下）。抗ＥＧＦＲのキメラＦａｂドメインは、ＣＨ１、ＣｋならびにＶＨ、およびＶｋドメインについてそれぞれ７３．５℃および６３．１℃の別個のＴｍ値を呈した。抗ＥＧＦＲのＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、それぞれ６８．４℃および８２．１℃のＴｍ値を示した。ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂ ＤＳＣサーモグラムのデコンボリューションから、４つの転移が明らかになった（図１４Ｂ、左上）。アンフォールディング転移温度をＨＥＲ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂと親抗体とで比較することにより、６０．４℃のＴｍのピークは抗ＥＧＦＲ可変ドメインの変性転移に対応したと推定された。同時に、７３．５℃のＴｍのピークが抗ＥＧＦＲ ＣＨ１およびＣｋドメインの変性転移に対応した。ある場合には、ＣＨ３ドメインにノブ・イントゥー・ホール突然変異を組み込むことにより、ＣＨ３ドメインのＴｍが約８０．０℃から約６９．０℃に低下し得る。したがって、６９．７℃のＴｍのピークはＣＨ２およびＣＨ３ドメインの変性転移に対応した。結果的に、８０．６℃のＴｍのピークは抗ＨＥＲ２ Ｆａｂドメインの変性転移に対応した。３つのＤＳＣサーモグラムを重ね合わせると（図１４Ｂ、右下）、抗ＨＥＲ２ Ｆａｂドメインの変性転移は約８０．０℃のＴｍにおけるＨＥＲ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂピークと重複したことが示された。これにより、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂの抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ部分に遺伝子操作された代替的な鎖間ジスルフィドがＦａｂ足場の全体的なフォールディングを不安定化させなかったことが示された。まとめると、熱安定性試験により、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂが従来のＩｇＧ抗体と同様のアンフォールディング転移を呈したことが確認された。

実施例１１：パパイン消化ＱＴＯＦ ＬＣ−ＭＳマッピング
パパイン消化Ｑ−ＴＯＦ ＬＣ−ＭＳの結果により、ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂタンパク質の予想されたＦａｂ領域を確認した。１０．７分で溶出するＨＥＲ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂのＦａｂ（Ｂ）領域は、ＬＣ＋抗ＨＥＲ２（１−２２４）およびＬＣ＋抗ＨＥＲ２（１−２２７）と同定された。保持時間および切断部位は、親の抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ、抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ ＷＴおよび抗ＨＥＲ２ Ｖ１２ Ｆａｂ試料と一致した。１１．９分で溶出するＨＥＲ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂのＦａｂ（Ａ）領域は、ＬＣ＋抗ＥＧＦＲ（１−２２６）と同定された。この切断部位および保持時間は、親の抗ＥＧＦＲ ＩｇＧのＦａｂ領域と一致した。

実施例１２：フローサイトメトリーによる細胞結合
種々のレベルのＨＥＲ２およびＥＧＦＲを発現する４つの腫瘍細胞系に対するＨｅｒ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂの細胞結合特性をフローサイトメトリーにより試験して、２つの親抗体の細胞結合活性と比較した。図１５に提示する結果は、親の抗ＨＥＲ２および抗ＥＧＦＲ抗体の染色強度が種々の腫瘍細胞上のＨＥＲ２抗原およびＥＧＦＲ抗原のレベルに対応したことを示す。しかしながら、ＭＢａｂは一貫して、種々のレベルのＨＥＲ２およびＥＧＦＲの細胞において最大のＦＡＣＳシグナルを記録した親抗体の染色強度に達した。

実施例１３：細胞生存率アッセイ
Ｈｅｒ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂの治療用途を評価するため、インビトロ細胞殺傷実験で分子の効力を試験した。ある場合には、抗ＥＧＦＲと抗ＨＥＲ２との併用処置によって得られる相加的または相乗的治療活性が、ＨＥＲ２と比べて同様のまたはより高いレベルのＥＧＦＲを有する腫瘍において起こり得る（例えば、Ｌａｒｂｏｕｒｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：３３５６−３３６２を参照）。これを実証するため、種々のレベルのＨＥＲ２およびＥＧＦＲを有する４つの腫瘍細胞系を選択した。ＭＢａｂの細胞殺傷活性を、親抗体単独および２つの親抗体による併用処置の細胞殺傷活性と比較した。図１６に提示する結果は、ＨＥＲ２と比べて約２５倍多くＥＧＦＲを発現するＡ４３１細胞では、Ｈｅｒ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂが２つの親ｍＡｂの組み合わせと同程度の相加的細胞殺傷活性および各ｍＡｂ単独と比べてはるかに強力な活性を示したことを示す。同じ相加的殺傷プロファイルが、約２０倍多くＥＧＦＲを発現するＢｘＰｃ３細胞でも認められ、また２つの抗原を比較的同程度発現するＳＫ−ＯＶ−３細胞でも認められた。しかしながら、ＥＧＦＲと比べて４０倍多くＨＥＲ２を発現するＳＫＢＲ３細胞については、ＭＢａｂまたは２つの親抗体による併用処置で相加的殺傷効果は得られなかった。ＭＢａｂの細胞殺傷力価測定曲線から、高い抗体濃度では、Ｈｅｒ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂは併用処置と同程度の、および各ｍＡｂ単独と比べて高い相加的細胞殺傷活性を付与したが、しかしながらより低い抗体濃度では、Ｈｅｒ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂは併用処置と比較して活性の低下を示したことが明らかになった（図１６Ｃ）。この挙動は、Ｈｅｒ２／ＥＧＦＲ Ｖ１２ ＭＢａｂが一価であることに伴うアビディティ効果の欠如に起因する可能性が最も高かった。ＭＢａｂのこの固有の特性により、付与される標的関連毒性は低くなり得る。

実施例１４：Ｆｃ受容体に対する結合キネティクス
種々のヒトＦｃ受容体との結合に対するノブ・イントゥー・ホール突然変異ならびにＣＬ−ＣＨ１界面におけるＶ１２突然変異の影響を評価するため、種々のＭＢａｂ構築物を生成し、ヒトＦｃ受容体に対するそれらの結合キネティクスを測定し、対応する親ＩｇＧ１と比較した。ＰｒｏｔｅＯｎでの定常状態平衡結合アッセイにより解離定数（ＫＤ）を決定した。この試験に使用した親ＩｇＧは以下であった；親抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２および対照ｈＩｇＧ１（ＮＭＧＣ）。この試験用に生成したＭＢａｂ構築物には、以下の組み合わせが含まれた：ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ／ＮＭＧＣおよびＮＭＧＣ／ＨＥＲ２。表９に要約したＫＤ値から、ＭＢａｂ構築物とそれらの対応する親ＩｇＧならびにヒトＩｇＧ１アイソタイプについて報告されている値との間に、試験したＦｃ受容体のいずれに対しても結合キネティクスの差はないことが明らかになった。

実施例１５：抗体依存細胞傷害性ならびにＦｃγＲＩＩＩａおよびＣ１ｑに対する結合
ＦｃγＲＩＩＩａおよびＣ１ｑに対する結合を維持する能力は、抗体がＡＤＣＣおよびＣＤＣを誘発する能力の重要な指標であり得る。この例では、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＣ１ｑに対する直接結合についてＥＬＩＳＡによりＭＢａｂを試験し、また、Ａ４３１細胞においてＡＤＣＣを誘発するその能力についても試験した。図１７Ａに提示する結果から、ＭＢａｂがＦｃγＲＩＩＩａおよびＣ１ｑに対して結合を呈したことが分かる。さらに、ＡＤＣＣ試験では、ＭＢａｂは２つの親抗体による組み合わせと同様のＡＤＣＣ活性を誘発した。親抗ＨＥＲ２単独はＡＤＣＣ活性を示さなかったが、セツキシマブ抗ＥＧＦＲはより強力なＡＤＣＣ活性を呈した（図１７Ｂ）。

実施例１６：単一細胞上の２つの抗原に対する選択的結合および同時結合による選択性の向上
単一細胞上の２つの細胞表面抗原（ここでは抗原ＣおよびＤと称される）に対する選択的結合および同時結合による選択性の向上を実証するため、抗Ｃおよび抗Ｄを含むＭＢａｂを生成した（Ｃ／Ｄ−ＭＢａｂと命名した）。両方の標的抗原（ＣおよびＤ）を発現する細胞に対するＣ／Ｄ−ＭＢａｂの選択的結合を、Ｃのみを発現する細胞（Ｃ細胞）、Ｄのみを発現する細胞（Ｄ細胞）ならびにＣおよびＤの両方を発現する細胞（Ｃ／Ｄ細胞）の予め染色した集団を１：１：１比で単一のウェルに混合し、続いて親ＩｇＧまたはＣ／Ｄ−ＭＢａｂと共にインキュベートすることにより、フローサイトメトリーによって分析した。（図２０Ｂのそれぞれ左側および右側のパネル）に示されるとおり、Ｃ／Ｄ−ＭＢａｂは、細胞表面抗原ＣおよびＤの両方の抗原を発現するＣ／Ｄ細胞に対する選択的結合を示した。Ｃ／Ｄ細胞に対する選択的結合が細胞表面抗原ＣおよびＤの両方との同時的な二価結合によるものであったことを確認するため、蛍光Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識した可溶性組換えＣおよびＤタンパク質を使用してＣ／Ｄ−ＭＢａｂ分子の未結合アームをトレースした。本質的に、Ｃ／Ｄ−ＭＢａｂが細胞表面に一価で結合する場合、一方のアームが可溶性蛍光型のＣまたはＤタンパク質と結合していない状態のままであり、これはフローサイトメトリー分析により検出することができる（図２０Ａに概略的に図示する）。この試験の鍵となる制御は、標的抗原の１つのみを発現することが分かっている細胞集団を使用することである。この事象では、表面に結合するいかなるＣ／Ｄ−ＭＢａｂも、一価的にのみそのように結合することができるため、未結合のアームがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識組換えタンパク質で検出できる状態となる。Ｄ細胞を発現しないＣ細胞と共にＣ／Ｄ−ＭＢａｂをインキュベートすると、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識組換えＤタンパク質と共にインキュベートした後に濃度依存的な蛍光シグナルが生じたことから、Ｃ／Ｄ−ＭＢａｂのあらゆる分子が細胞表面上の抗原Ｃに結合した一方、抗ＤアームはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識組換えＤタンパク質に結合していなかったことが示された（図２０Ｃ、左側のパネル）。同じように、抗原Ｄのみを発現して抗原Ｃは発現しないＤ細胞と共にＣ／Ｄ−ＭＢａｂをインキュベートすると、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識組換えＣタンパク質を添加した後に濃度依存的な蛍光シグナルが得られたことから、細胞表面上の抗原Ｄに結合したＣ／Ｄ−ＭＢａｂのあらゆる分子について、抗ＣアームはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識組換えＣタンパク質と結合していなかったことが示された（図２０Ｃ、右側のパネル）。しかしながら、Ｃ／Ｄ−ＭＢａｂをＣ／Ｄ細胞と共にインキュベートしたときには、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識組換えＤタンパク質またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識組換えＣタンパク質を添加した後、蛍光シグナルの増加は認められなかったことから、Ｃ／Ｄ−ＭＢａｂの両方のアームが同時に結合し、いずれの組換えタンパク質も細胞−抗体複合体に結合できないため、ひいては、ＰＥシグナルのみが認められることが示された（図２０Ｃ、両方のパネル）。細胞表面上のＣ／Ｄ−ＭＢａｂの量と、結合可能な可溶性組換えタンパク質の量との間の関係が、最終的に、細胞表面に対するＣ／Ｄ−ＭＢａｂの同時の二価または一価結合のエビデンスを提供する。Ｃ／Ｄ−ＭＢａｂが細胞表面に結合することが明らかでありながら、フリーアームが検出されない場合、両方のアームがそれらの標的抗原と同時に結合すると結論付けることができる。

本明細書において参照されるそれぞれの特許、特許出願、刊行物および文献の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。上記特許、特許出願、刊行物および文献の引用は、上記のいずれかが関連のある先行技術であることの承認でもなく、それらの刊行物または文献の内容またはデータに関するいかなる承認を構成するものでもない。さらに、２０１１年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／５７７，９５６号明細書が、あらゆる目的から全体として参照により組み込まれる。

本技術の基本態様から逸脱することなく、上記のものに改変を行うことができる。本技術を１つ以上の具体的な実施形態を参照してかなり詳細に記載したが、当業者は、本出願に具体的に開示された実施形態に変化を行うことができることを認識し、それらの改変および改善は、本技術の範囲および趣旨の範囲内である。

本明細書に例示的に記載した本技術は、好適には、本明細書に具体的に開示されない任意の要素が存在しなくても実施することができる。したがって、例えば、本明細書のそれぞれの例において用語「含む」、「から本質的になる」および「からなる」のいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。用いられているこれらの用語および表現は、説明に関して使用し、限定に関するものではなく、そのような用語および表現の使用は、図示および記載される特徴またはその一部のいかなる均等物も排除せず、特許請求される技術の範囲内で種々の改変が可能である。したがって、本技術を代表的な態様、実施形態および任意選択の特徴により具体的に開示したが、本明細書に開示される概念の改変および変更を当業者が採用することができ、そのような改変および変更は本技術の範囲内にあると見なされることを理解すべきである。

Claims (75)

1. （ａ）改変重鎖であって、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む改変重鎖；および
   （ｂ）対応する改変軽鎖であって、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む改変軽鎖
   を含む抗体において、
   前記天然非システインアミノ酸から前記システインアミノ酸への前記置換から得られる、前記改変重鎖の前記置換システインと、前記天然非システインアミノ酸から前記システインアミノ酸への前記置換から得られる、前記対応する改変軽鎖の前記置換システインとが、ジスルフィド結合を形成することができる、抗体。
2. （ａ）改変重鎖であって、前記改変重鎖のＣＨ１領域が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、改変重鎖；および
   （ｂ）対応する改変軽鎖であって、前記改変軽鎖のＣＬ領域が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、改変軽鎖
   を含む抗体において、
   前記天然非システインアミノ酸から前記システインアミノ酸への前記置換から得られる、前記改変重鎖の前記置換システインと、前記天然非システインアミノ酸から前記システインアミノ酸への前記置換から得られる、前記対応する改変軽鎖の前記置換システインとが、ジスルフィド結合を形成することができる、抗体。
3. 前記改変重鎖および対応する改変軽鎖における前記置換が、表４に提供されるとおりの変異体Ｖ１０、Ｖ１０−２ａ、Ｖ１０−２ｂ、Ｖ１０−３、Ｖ１０−４、Ｖ１１、Ｖ１１−２ａ、Ｖ１１−２ｂ、Ｖ１１−３、Ｖ１１−４、Ｖ１２、Ｖ１２−２ａ、Ｖ１２−２ｂ、Ｖ１２−３およびＶ１２−４からなる群から選択される、請求項２に記載の抗体。
4. （ａ）改変重鎖であって、（ｉ）前記改変重鎖のＣＨ１領域が、天然システインから非システインアミノ酸への置換を含み、かつ（ｉｉ）可変領域が、天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、改変重鎖；および
   （ｂ）対応する改変軽鎖であって、（ｉ）前記改変軽鎖のＣＬ領域が、天然システインから非システインアミノ酸への置換を含み、かつ（ｉｉ）可変領域が、天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含む、改変軽鎖
   を含む抗体において、
   前記天然非システインアミノ酸から前記システインアミノ酸への前記置換から得られる、前記改変重鎖の前記置換システインと、前記天然非システインアミノ酸から前記システインアミノ酸への前記置換から得られる、前記対応する改変軽鎖の前記置換システインが、ジスルフィド結合を形成することができる、抗体。
5. 前記改変重鎖および対応する改変軽鎖における前記置換が、表４に提供されるとおりの変異体ＶＶａ−１、ＶＶａ−２ａ、ＶＶａ−２ｂ、ＶＶａ−３、ＶＶａ−４、ＶＶｂ−１、ＶＶｂ−２ａ、ＶＶｂ−２ｂ、ＶＶｂ−３、ＶＶｂ−４、ＶＶｃ−１、ＶＶｃ−２ａ、ＶＶｃ−２ｂ、ＶＶｃ−３、ＶＶｃ−４、ＶＶｄ−１、ＶＶｄ−２ａ、ＶＶｄ−２ｂ、ＶＶｄ−３、ＶＶｄ−４、ＶＶｅ−１、ＶＶｅ−２ａ、ＶＶｅ−２ｂ、ＶＶｅ−３、ＶＶｅ−４、ＶＶｆ−１、ＶＶｆ−２ａ、ＶＶｆ−２ｂ、ＶＶｆ−３、ＶＶｆ−４、ＶＶｇ−１、ＶＶｇ−２ａ、ＶＶｇ−２ｂ、ＶＶｇ−３、ＶＶｇ−４、ＶＶｈ−１、ＶＶｈ−２ａ、ＶＶｈ−２ｂ、ＶＶｈ−３、ＶＶｈ−４、ＶＶｉ−１、ＶＶｉ−２ａ、ＶＶｉ−２ｂ、ＶＶｉ−３、ＶＶｉ−４、ＶＶｊ−１、ＶＶｊ−２ａ、ＶＶｊ−２ｂ、ＶＶｊ−３およびＶＶｊ−４からなる群から選択される、請求項４に記載の抗体。
6. （ａ）改変重鎖であって、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）突出および／または空洞をもたらす少なくとも１つのアミノ酸の置換とを含む改変重鎖；および
   （ｂ）対応する改変軽鎖であって、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）代償性の空洞および／または突出をもたらす少なくとも１つのアミノ酸の置換とを含む改変軽鎖
   を含む抗体において、
   前記改変が、前記改変重鎖と前記対応する改変軽鎖との鎖間ペアリングに有利に働く、抗体。
7. 前記改変重鎖および対応する改変軽鎖における前記置換が、表４に提供されるとおりの変異体Ｖ１、Ｖ１−２ａ、Ｖ１−２ｂ、Ｖ１−３、Ｖ１−４、Ｖ３、Ｖ３−２ａ、３−２ｂ、Ｖ３−３、Ｖ３−４からなる群から選択される、請求項６に記載の抗体。
8. 前記天然システインが鎖間ジスルフィド結合を形成し得る、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
9. 第２の重鎖および第２の対応する軽鎖を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体において、前記第２の重鎖および第２の対応する軽鎖が、天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換を含まない、抗体。
10. 第２の重鎖および第２の対応する軽鎖を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体において、前記第２の重鎖および第２の対応する軽鎖が、天然システインアミノ酸から非システインアミノ酸への置換を含む、抗体。
11. 前記第２の重鎖および第２の対応する軽鎖が、天然システインから非システインアミノ酸への置換を含まない、請求項９に記載の抗体。
12. 前記第２の重鎖および第２の対応する軽鎖が、突出および／または空洞をもたらす少なくとも１つのアミノ酸の置換を含まない、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
13. 前記２つの軽鎖が、各々、ＶＬドメインとＣＬドメインとを含み、前記ＶＬドメインが異なるアミノ酸配列を有し、かつ前記ＣＬドメインが異なるアミノ酸配列を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
14. １つの軽鎖がカッパ軽鎖であり、かつ１つの軽鎖がラムダ軽鎖である、請求項１３に記載の抗体。
15. 前記２つの重鎖が、各々、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメインおよびＦｃ領域を含み、前記ＶＨドメインが異なるアミノ酸配列を有し、前記ＣＨ１ドメインが異なるアミノ酸配列を有し、かつ前記Ｆｃ領域が異なるアミノ酸配列を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体。
16. 前記２つの重鎖がヘテロダイマーを形成する、請求項１５に記載の抗体。
17. 前記抗体が２つの独立した抗原または同じ抗原上の２つの独立したエピトープに特異的に結合する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
18. 前記２つの独立した抗原または２つの独立したエピトープに対する結合親和性が同一であるかまたは異なる、請求項１７に記載の抗体。
19. 一方または両方の重鎖の前記Ｆｃ領域が１つ以上の改変を含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の抗体。
20. 前記Ｆｃ領域における前記改変が、前記重鎖のヘテロダイマー化を促進する、請求項１９に記載の抗体。
21. 前記Ｆｃ領域における前記改変が、表５および表６に提供されるものから選択される、請求項２０に記載の抗体。
22. 前記Ｆｃ領域における前記改変が、プロテインＡ結合を変化させ、かつ一方の重鎖にのみ存在する、請求項１９に記載の抗体。
23. プロテインＡ結合を変化させ、かつ一方の重鎖にのみ存在する前記Ｆｃ領域における改変をさらに含む、請求項２０または２１に記載の抗体。
24. （ａ）前記抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつプロテインＡ結合を変化させる前記Ｆｃ領域における前記改変が、アミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆであるか；または
    （ｂ）前記抗体がＩｇＧ３であり、かつプロテインＡ結合を変化させる前記Ｆｃ領域における前記改変が、アミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙであり、および
    ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項２２または２３に記載の抗体。
25. 前記改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、かつ前記第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
26. （ａ）前記抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつ前記第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆをさらに含むか；または
    （ｂ）前記抗体がＩｇＧ３であり、かつ前記改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙをさらに含み、
    ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項２５に記載の抗体。
27. 前記改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含み、かつ前記第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
28. （ａ）前記抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつ前記改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆをさらに含むか；または
    （ｂ）前記抗体がＩｇＧ３であり、かつ前記第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙをさらに含み、
    ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項２７に記載の抗体。
29. （ａ）前記改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、かつ前記第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含むか；または
    （ｂ）前記改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含み、かつ前記第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、
    ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の抗体。
30. 前記抗体の半減期を変化させる前記Ｆｃ領域における改変をさらに含み、前記半減期がＦｃＲｎ結合親和性に依存する、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の抗体。
31. 前記エフェクター機能を変化させる前記Ｆｃ領域における改変をさらに含み、前記Ｆｃガンマ受容体またはＣ１ｑ補体タンパク質に対する結合親和性が増加または減少する、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の抗体。
32. ヒト抗体またはヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体。
33. 請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗体と賦形剤とを含む組成物。
34. 改変軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸において、前記改変軽鎖が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、核酸。
35. 前記置換が、表４に提供されるとおりの変異体ＶＶａ−１、ＶＶａ−２ａ、ＶＶａ−２ｂ、ＶＶａ−３、ＶＶａ−４、ＶＶｂ−１、ＶＶｂ−２ａ、ＶＶｂ−２ｂ、ＶＶｂ−３、ＶＶｂ−４、ＶＶｃ−１、ＶＶｃ−２ａ、ＶＶｃ−２ｂ、ＶＶｃ−３、ＶＶｃ−４、ＶＶｄ−１、ＶＶｄ−２ａ、ＶＶｄ−２ｂ、ＶＶｄ−３、ＶＶｄ−４、ＶＶｅ−１、ＶＶｅ−２ａ、ＶＶｅ−２ｂ、ＶＶｅ−３、ＶＶｅ−４、ＶＶｆ−１、ＶＶｆ−２ａ、ＶＶｆ−２ｂ、ＶＶｆ−３、ＶＶｆ−４、ＶＶｇ−１、ＶＶｇ−２ａ、ＶＶｇ−２ｂ、ＶＶｇ−３、ＶＶｇ−４、ＶＶｈ−１、ＶＶｈ−２ａ、ＶＶｈ−２ｂ、ＶＶｈ−３、ＶＶｈ−４、ＶＶｉ−１、ＶＶｉ−２ａ、ＶＶｉ−２ｂ、ＶＶｉ−３、ＶＶｉ−４、ＶＶｊ−１、ＶＶｊ−２ａ、ＶＶｊ−２ｂ、ＶＶｊ−３、ＶＶｊ−４、Ｖ１０、Ｖ１０−２ａ、Ｖ１０−２ｂ、Ｖ１０−３、Ｖ１０−４、Ｖ１１、Ｖ１１−２ａ、Ｖ１１−２ｂ、Ｖ１１−３、Ｖ１１−４、Ｖ１２、Ｖ１２−２ａ、Ｖ１２−２ｂ、Ｖ１２−３およびＶ１２−４からなる群から選択される、請求項３４に記載の核酸。
36. 改変軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸において、前記改変軽鎖が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）空洞および／または突出をもたらすＣＬ領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換とを含む、核酸。
37. 前記置換が、表４に提供されるとおりの変異体Ｖ１、Ｖ１−２ａ、Ｖ１−２ｂ、Ｖ１−３、Ｖ１−４、Ｖ３、Ｖ３−２ａ、３−２ｂ、Ｖ３−３、Ｖ３−４からなる群から選択される、請求項３６に記載の核酸。
38. 前記天然システインが鎖間ジスルフィド結合を形成し得る、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の核酸。
39. 発現ベクターである、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の核酸。
40. 改変されていない第２の軽鎖をコードする第２の核酸をさらに含む、請求項３９に記載の核酸。
41. 前記２つの軽鎖が、各々、ＶＬドメインとＣＬドメインとを含み、前記ＶＬドメインが異なるアミノ酸配列を有し、かつ前記ＣＬドメインが異なるアミノ酸配列を有する、請求項４０に記載の核酸。
42. １つの軽鎖がカッパ軽鎖であり、かつ１つの軽鎖がラムダ軽鎖である、請求項４０または４１に記載の核酸。
43. 改変重鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸において、前記改変重鎖が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）天然非システインアミノ酸からシステインアミノ酸への置換とを含む、核酸。
44. 前記置換が、表４に提供されるとおりの変異体ＶＶａ−１、ＶＶａ−２ａ、ＶＶａ−２ｂ、ＶＶａ−３、ＶＶａ−４、ＶＶｂ−１、ＶＶｂ−２ａ、ＶＶｂ−２ｂ、ＶＶｂ−３、ＶＶｂ−４、ＶＶｃ−１、ＶＶｃ−２ａ、ＶＶｃ−２ｂ、ＶＶｃ−３、ＶＶｃ−４、ＶＶｄ−１、ＶＶｄ−２ａ、ＶＶｄ−２ｂ、ＶＶｄ−３、ＶＶｄ−４、ＶＶｅ−１、ＶＶｅ−２ａ、ＶＶｅ−２ｂ、ＶＶｅ−３、ＶＶｅ−４、ＶＶｆ−１、ＶＶｆ−２ａ、ＶＶｆ−２ｂ、ＶＶｆ−３、ＶＶｆ−４、ＶＶｇ−１、ＶＶｇ−２ａ、ＶＶｇ−２ｂ、ＶＶｇ−３、ＶＶｇ−４、ＶＶｈ−１、ＶＶｈ−２ａ、ＶＶｈ−２ｂ、ＶＶｈ−３、ＶＶｈ−４、ＶＶｉ−１、ＶＶｉ−２ａ、ＶＶｉ−２ｂ、ＶＶｉ−３、ＶＶｉ−４、ＶＶｊ−１、ＶＶｊ−２ａ、ＶＶｊ−２ｂ、ＶＶｊ−３、ＶＶｊ−４、Ｖ１０、Ｖ１０−２ａ、Ｖ１０−２ｂ、Ｖ１０−３、Ｖ１０−４、Ｖ１１、Ｖ１１−２ａ、Ｖ１１−２ｂ、Ｖ１１−３、Ｖ１１−４、Ｖ１２、Ｖ１２−２ａ、Ｖ１２−２ｂ、Ｖ１２−３およびＶ１２−４からなる群から選択される、請求項４３に記載の核酸。
45. 改変重鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸において、前記改変重鎖が、（ｉ）天然システインから非システインアミノ酸への置換と、（ｉｉ）空洞および／または突出をもたらすＣＬ領域における少なくとも１つのアミノ酸の置換とを含む、核酸。
46. 前記置換が、表４に提供されるとおりの変異体Ｖ１、Ｖ１−２ａ、Ｖ１−２ｂ、Ｖ１−３、Ｖ１−４、Ｖ３、Ｖ３−２ａ、３−２ｂ、Ｖ３−３、Ｖ３−４からなる群から選択される、請求項４５に記載の核酸。
47. 前記天然システインが鎖間ジスルフィド結合を形成し得る、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の核酸。
48. 前記改変重鎖がＦｃ領域を含む、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の核酸。
49. 前記改変重鎖Ｆｃ領域が１つ以上の改変を含む、請求項４８に記載の核酸。
50. 前記改変重鎖Ｆｃ領域における前記改変が、２つの重鎖のヘテロダイマー化を促進する、請求項４９に記載の核酸。
51. 前記改変重鎖Ｆｃ領域における前記改変が、表５および表６に提供されるものから選択される、請求項５０に記載の核酸。
52. 前記改変重鎖Ｆｃ領域における前記改変がプロテインＡ結合を変化させる、請求項４９に記載の核酸。
53. 前記改変重鎖Ｆｃ領域が、プロテインＡ結合を変化させる改変をさらに含む、請求項５０または５１に記載の核酸。
54. 前記改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項４９〜５１または５３のいずれか一項に記載の核酸。
55. 前記改変重鎖がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項５４に記載の核酸。
56. 前記改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項４９〜５１または５３のいずれか一項に記載の核酸。
57. 前記改変重鎖がＩｇＧ３であり、かつアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項５６に記載の核酸。
58. 発現ベクターである、請求項４３〜５７のいずれか一項に記載の核酸。
59. 第２の重鎖をコードする第２の核酸をさらに含む、請求項５８に記載の核酸において、前記第２の重鎖が、改変されていないＣＨ１領域を含む、核酸。
60. 前記第２の重鎖がＦｃ領域を含む、請求項５９に記載の核酸。
61. 前記第２の重鎖Ｆｃ領域が１つ以上の改変を含む、請求項６０に記載の核酸。
62. 前記第２の重鎖Ｆｃ領域における前記改変が、２つの重鎖のヘテロダイマー化を促進する、請求項６１に記載の核酸。
63. 前記第２の重鎖Ｆｃ領域における前記改変が、表５および表６に提供されるものから選択される、請求項６２に記載の核酸。
64. 前記第２の重鎖Ｆｃ領域における前記改変がプロテインＡ結合を変化させる、請求項６１に記載の核酸。
65. 前記第２の重鎖Ｆｃ領域が、プロテインＡ結合を変化させる改変をさらに含む、請求項６２または６３に記載の核酸。
66. 前記改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、かつ前記第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項６１〜６３または６５のいずれか一項に記載の核酸。
67. 前記重鎖がＩｇＧ３であり、かつ前記改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項６６に記載の核酸。
68. 前記重鎖がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつ前記第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項６６に記載の核酸。
69. 前記改変重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａを含み、かつ前記第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項６１〜６３または６５のいずれか一項に記載の核酸。
70. 前記重鎖がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４であり、かつ前記改変重鎖Ｆｃ領域が、アミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項６９に記載の核酸。
71. 前記重鎖がＩｇＧ３であり、かつ前記第２の重鎖Ｆｃ領域がアミノ酸置換Ｒ４３５Ｈ／Ｆ４３６Ｙをさらに含み、ナンバリングはＥＵインデックスによる、請求項６９に記載の核酸。
72. 請求項のいずれか一項に記載の核酸を含む細胞 請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の核酸を含む細胞。
73. 請求項５８〜７１のいずれか一項に記載の核酸を含む細胞。
74. 請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の核酸と、請求項５８〜７１のいずれか一項に記載の核酸とを含む細胞。
75. 抗体を発現させる方法であって、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の核酸と、請求項５８〜７１のいずれか一項に記載の核酸とを含む複数の細胞を、前記ポリペプチドが発現する条件に接触させることを含む、方法。

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