JP2018519832A - 多重特異的結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般的に、多重特異的結合タンパク質に関する。本発明はまた、このようなタンパク質の作製法、及びこのようなタンパク質の使用法に関する。このようなタンパク質を含む医薬組成物及びキットも開示されている。
単独療法としてのモノクローナル抗体は、癌及び免疫学的疾患をはじめとする様々な疾患の処置において使用されかなりの成功を収めてきた。それらの標的に対するそれらの特異的結合能により医学の発展がもたらされた。しかしながら、いくつかの療法においては、1つを超える標的の調節が有益である場合があり、そして1つを超えるタンパク質に又は標的タンパク質上の様々なエピトープに結合する生物学的分子が、モノクローナル抗体と比較してさらなる利点を与える場合がある。
本発明は上記の需要に取り組み、そして2つの異なるエピトープに対して特異的である少なくとも2つの結合単位を含むタンパク質を提供する。1つの態様では、本発明は、第一のエピトープに対して特異的な第一の結合単位を形成している第一の重鎖と第一の軽鎖、及び第二のエピトープに対して特異的な第二の結合単位を形成している第二の重鎖と第二の軽鎖を含む。1つの態様では、第一の重鎖及び前記の第二の重鎖は各々、一方の重鎖のホモ二量体の形成を減少させる1つ以上のアミノ酸変化を含む。1つの態様では、このようなアミノ酸変化は、第一の重鎖の366位のチロシン(Y)[T366Y、EU番号付け(Edelman et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85)]及び第二の重鎖の407位のトレオニン(T)[Y407T、EU番号付け]である。1つの態様では、このようなアミノ酸変化は、第一の重鎖の366位のトリプトファン(W)[T366W]、及び第二の重鎖の366位のセリン(S)[T366S]、368位のアラニン(A)[L368A]及び407位のバリン(V)[Y407V]である。1つの態様では、重鎖は、IgG1又はIgG4の重鎖に由来する重鎖である。1つの態様では、第一の重鎖は、366位のトリプトファン(W)[T366W]に加えて354位のシステイン(C)[S354C]を含み、そして第二の重鎖は、366位のセリン(S)[T366S]、368位のアラニン(A)[L368A]及び407位のバリン(V)[Y407V]に加えて349位のシステイン(C)[Y349C]を含む。1つの態様では、重鎖は、IgG4の重鎖に由来する重鎖である。2本の重鎖へのこれらのアミノ酸変化の包含は、2本の重鎖のヘテロ二量体化を促進し、そしてホモ二量体の形成を最小限とする。これらのアミノ酸変化はまた、インシリコでの評価に基づいた低い免疫原性を有する(De Groot et al. Trends Immunol. 2007 Nov;28(11):482)。
a)第一のエピトープに対して特異的な第一の結合単位を形成している第一の重鎖と第一の軽鎖、及び
b)第二のエピトープに対して特異的な第二の結合単位を形成している第二の重鎖と第二の軽鎖
を含み、
第一の重鎖は366位にチロシン(Y)[T366Y]を含み、第二の重鎖は407位にトレオニン(T)[Y407T]を含み、そして第一又は第二の重鎖はさらに435位にアルギニン[H435R]及び436位にフェニルアラニン[Y436F]を含むタンパク質を提供する。
a)第一のエピトープに対して特異的な第一の結合単位を形成している第一の重鎖と第一の軽鎖、及び
b)第二のエピトープに対して特異的な第二の結合単位を形成している第二の重鎖と第二の軽鎖
を含み、
前記の第一の重鎖は366位にトリプトファン(W)[T366W]を含み、前記の第二の重鎖は366位にセリン(S)[T366S]、368位にアラニン(A)[L368A]、及び407位にバリン(V)[Y407V]を含み、そして前記の第一又は前記の第二の重鎖はさらに435位にアルギニン[H435R]及び436位にフェニルアラニン[Y436F]を含むタンパク質を提供する。
本発明は、多重特異的結合タンパク質を提供する。本発明の多重特異的結合タンパク質は、標的タンパク質に対する結合単位が取り込まれた構造を提供する。例示的な本発明の多重特異的結合タンパク質の一般的構造を図1に示すが(この場合、例示的な二重特異的結合タンパク質)、多重特異的結合タンパク質もまた本発明に包含される。本発明の多重特異的結合タンパク質はまた本明細書において「ZweiMab」、「ZweiMab抗体」又は「抗体」と称される。ZweiMabのいくつかの実施態様は二重特異的であり、そして本明細書においていくつかの場合には「ZweiMab二重特異的抗体」又は「二重特異的抗体」と称される。ZweiMabのいくつかの実施態様は多重特異的であり、そして本明細書においていくつかの場合には「ZweiMab多重特異的抗体」又は「多重特異的抗体」と称される。
抗体は改変を含み得る。例えば、癌の処置における抗体の効力を増強させるために、エフェクター機能に関して抗体を改変することが望ましい場合がある。1つのこのような改変は、Fc領域へのシステイン残基(群)の導入であり、これによりこの領域内での鎖間ジスルフィド結合形成が可能となる。このようにして作製されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能及び/又は増加した補体媒介性細胞殺滅及び/又は抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)を有し得る。例えば、Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; and Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922を参照されたい。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体はまた、Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565に記載のようなヘテロ二官能性架橋リンカーを使用して調製されてもよい。あるいは、抗体は、二重Fc領域を含有して、補体による溶解及び抗体のADCC能を増強させるように工学操作されてもよい。Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230を参照されたい。
抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗体DNAに導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような変異体としては、例えば、本明細書における実施例の抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び/又はへの挿入、及び/又はの置換を含む。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性親水性:cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖の配向に影響を及ぼす残基:gly、pro;及び
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
他の実施態様は、抗体をコードしている配列を含む単離されたポリヌクレオチド、ベクター、及び該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、並びに、抗体の産生のための組換え技術を包含する。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、完全長のモノクローナル抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFv断片、ディアボディ、鎖状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異的抗体をはじめとする、任意の所望の形態の抗体をコードすることができる。
本明細書に記載の抗体は、アフィニティ精製剤として有用である。このプロセスでは、抗体を固相上に、例えばプロテインA樹脂上に、当技術分野において周知である方法を使用して固定する。固定された抗体を、精製しようとする含有している試料と接触させ、その後、支持体を適切な溶媒で洗浄し、これにより固定された抗体に結合している標的タンパク質以外の試料中の全ての材料は実質的に除去されるであろう。最後に、支持体を、抗体から標的タンパク質を遊離するであろう別の適切な溶媒で洗浄する。
抗体は、診断キット、すなわち診断アッセイを実施するための説明書と予め決定された量の試薬との梱包された組合せにおいて使用され得る。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、検出可能な発色団又はフルオロフォアを与える基質前駆体などの酵素によって必要とされる基質及び補因子を含み得る。さらに、他の添加剤、例えば安定化剤、緩衝液(例えば遮断緩衝液又は溶解緩衝液)などが含まれ得る。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する溶液中の試薬濃度を提供するために、幅広く変更され得る。試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を与えるであろう、賦形剤を含む、乾燥粉末、通常は凍結乾燥粉末として提供され得る。
別の実施態様では、本明細書において開示された抗体は、1つ以上の標的タンパク質の発現に関連した様々な障害の処置に有用である。障害を処置するための方法は、治療有効量の抗体をそれを必要とする被験者に投与する工程を含む。
抗体を含む組成物を、炎症疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝障害、中枢神経系(CNS)疾患、例えば炎症に関連した中枢神経系(CNS)疾患、又は癌を有する又は有するリスクがある被験者に投与することができる。本発明はさらに、炎症疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝障害、中枢神経系(CNS)疾患、例えば炎症に関連した中枢神経系(CNS)疾患、又は癌の予防若しくは治療用の医薬品の製造における抗体の使用を提供する。本明細書において使用する「被験者」という用語は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト及び非ヒト哺乳動物、例えば霊長類、げっ歯類、並びにイヌを意味する。本明細書に記載の方法を使用した処置に特に意図される被験者としては、ヒトが挙げられる。抗体又は薬剤を、単独で又は他の組成物と組み合わせてのいずれかで、炎症疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝障害、中枢神経系(CNS)疾患、例えば炎症に関連した中枢神経系(CNS)疾患、又は癌の予防若しくは治療において投与することができる。抗体又は薬剤と組み合わせて投与され得るこのような組成物は、メトトレキサート(MTX)及び免疫調節剤、例えば抗体又は小分子を含む。
別の態様では、上記の障害の処置に有用な材料を含有している製品が含まれる。製品は、容器及びラベルを含む。適切な容器は、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、容態を処置するのに効果的な組成物を保持し、そして無菌アクセスポートを有し得る。例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静注バッグ又はバイアルであり得る。組成物中の活性薬剤は、抗体である。容器上の又は容器に付随したラベルは、該組成物が選択された容態の処置に使用されることを示す。製品はさらに、薬学的に許容される緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水、リンガー液、及びデキストロース溶液などを含む第二の容器を含み得る。それはさらに、商業的見地及び使用者の見地から望ましい他の材料、例えば他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を含む添付文書を含み得る。
実施例1:タンパク質の発現及び精製
可変領域をコードしている核酸配列を、標準的なPCR制限酵素に基づいたクローニング技術を使用して、IgG1発現カセットの定常領域を含有している特別注文の哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。多重特異的抗体を、チャイニーズハムスター卵巣細胞株における一過性トランスフェクションによって発現させた。抗体を最初に、MabSelectSuReプロテインAカラム(GEヘルスケア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)によって精製した(Brown, Bottomley et al. 1998)。カラムを、リン酸緩衝食塩水(PBS)(pH7.2)を用いて平衡化し、そして2mL/分の流速で発酵上清をローディングした。ローディング後、カラムをPBS(4カラム体積)を用いて洗浄し、その後、30mM酢酸ナトリウム(pH3.5)で溶出した。Akta Explorer(GEヘルスケア社)で280nmの吸光度によってモニタリングされたタンパク質ピークを含有している画分を共にプールし、そして1%の3M 酢酸ナトリウム(pH9.0)の添加によってpH5.0まで中和した。プロテインAにより精製された抗体の平均回収率は90%超であった。研磨工程として、抗体を分取サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)でスーパーデックス200カラム(GEヘルスケア社)を使用して精製した。
SEC−HPLCを、50mMリン酸塩、200mMアルギニン、0.05%アジ化ナトリウム、pH6.5緩衝液中のTSKゲルG3000SWXLカラム(直径7.8mm、長さ30cm、5μm)を使用して実施した。流速を1mL/分に維持し、そしてローディングされた試料容量は50μLであった。溶出ピークを、単量体の比率を計算するために製造され提供されたソフトウェアを使用して積分した(曲線下面積)。これらの実験からの結果を図4及び図8に示す。
全ての実験は、ベックマンXL1分析超遠心機(ベックマンコールター社、フラートン、CA州)で実施された。全ての沈降速度実験は、40,000rpm及び20℃で実施された。実験は、20mMクエン酸塩及び115mM NaClを含有しているpH6.0の緩衝液中で実施された。データを280nmで回収し、そしてSedFitバージョン12.1cの連続c(S)モデルを使用して分析した。これらの実験からの結果を図2に示す。
多重特異的抗体の熱的安定性は、キャピラリーVP−DSCマイクロカロリメーター(マイクロキャル社、ノーサンプトン、MA州)によって特徴付けられた。タンパク質の濃度は、0.450mLのセル容量で1℃/分の走査速度で測定したところ約1.4mg/mLであった。温度走査は25〜120℃で実施された。緩衝液基準走査を、タンパク質走査から差し引き、そしてタンパク質の濃度を熱力学的分析の前に正規化した。データはOrigin7.0(オリジンラボ社、ノーサンプトン、MA州)でプロットされ、そしてその後の熱力学的分析は、遷移前及び遷移後の基線の修正されたデータで実施された。DSC曲線を、2状態ではないモデルを使用してフィットさせることにより、熱量測定エンタルピー、ファントホッフエンタルピー、及び見かけの遷移温度(Tm)を得た。
ProteOn XPR36(バイオラッド社、ハーキュリーズ、CA州)を使用して、二重特異的抗体に結合している標的タンパク質の動態及び親和性を測定した。ヤギ抗ヒトIgGγFc特異的(GAHA)(インビトロジェン社、グランドアイランド、NY州)を、製造業者の説明書に従って、8000RUから10000RUまでの表面密度で、アミンカップリングキット(バイオラッド社、ハーキュリーズ、CA州)を使用して6つの水平なチャンネルに沿って、GLMチップのデキストランマトリックス(バイオラッド社、ハーキュリーズ、CA州)に固定した。二重特異的抗体を、約200RUの表面密度で5つの垂直チャネルに沿ってGAHA表面に捕捉した。最後の垂直チャンネルを、かさの変動を除去するためのカラム基準として使用した。各抗体と標的タンパク質の結合動態は、5つの希釈率(10、5.0、2.5、1.25、0.625、及び0nM)の標的タンパク質の2回の注射のグローバルフィッティングによって決定された。2回の5つの濃度の標的タンパク質の回収された結合センサーグラムは、不活性なチャンネル/スポット間基準及び抽出緩衝液基準を使用して二重基準とした。基準にしたセンサーグラムを1:1のラングミュア結合モデルにフィットさせ、結合速度(ka)、解離速度(kd)、及び解離定数(KD)を決定した。これらの実験からの結果を図5に示す。
1×動態緩衝液及びヒト血清(シグマ社、セントルイス、MO州)中の各抗体とそれらの(ビオチニル化)標的タンパク質の相互作用はそれぞれ、ストレプトアビジン(SA)バイオセンサーチップ(フォルテバイオ社)の具備されたOctetQK(フォルテバイオ社)機器で実施された。ビオチニル化標的タンパク質を用いて捕捉されたセンサーをヒト血清中に浸漬し、抗体と標的タンパク質との望ましい相互作用をモニタリングする前に、血清中の結合についての基線を確立した。様々な結合時点(60秒間、120秒間、及び240秒間)における1×動態緩衝液及びヒト血清中の結合センサーグラムの応答を比較して、抗体がヒト血清中のオフターゲット分子に結合したかどうかを決定した。
ELISAに基づいた方法を使用して、多重特異的抗体の変異体がプロテインAに結合する能力を評価した。ビオチニル化プロテインAをストレプトアビジンELISAプレート上に捕捉し、そしてそれをPBST緩衝液中1%ミルクと共にインキュベートして、非特異的結合を最小限とした。続いて、2つのホモ二量体変異体(AA及びBB)をヘテロ二量体多重特異的抗体(AB)及び対照IgGと共に、室温で1時間インキュベートした。プレートをELISA緩衝液を用いて3回洗浄し、そして結合を、HRPにコンジュゲートさせた抗κ抗体を使用して検出した。これらの実験からの結果を図7bを示す。
多重特異的抗体の皮下薬物動態を、カニクイザルにおいて評価した。試験はIACUCによって許可され、そして米国農務省の動物福祉法(9CFRパート1、2及び3)を遵守した。抗体を皮下注射によって中央肩甲骨間領域に投与した。多重特異的抗体の血清中濃度を、検証された抗原捕捉ELISAアッセイを使用して決定した。簡潔に言えば、ビオチニル化標的タンパク質をストレプトアビジンでコーティングされたヌンクマキシソープ(アフィメトリクス社、イーバイオサイエンス社、サンディエゴ、CA州)に固定した。次いで、96ウェルプレートを洗浄し、次いでPBS及び2%BSA(w/v)を用いて遮断した。次いで、マトリックス基準標準物質試料(品質管理)及び試験試料を、5%サル血清の最終濃度に希釈し、そして遮断されたプレートに移した。プレートを、0.05μg/mlの濃度のヤギ抗ヒトIgG−HRP(サザンバイオテック社)の添加前に洗浄した。プレートを再度洗浄し、BioFx(サーモディクス社、エデンプレーリー、MN州)TMBW基質を加えた。プレートを、TMB基質のためのBioFx液体停止溶液(0.2M H2SO4)の添加前に室温で約5分間展開させ、次いで、SpectraMax(モレキュラーデバイス社、サニーベール、CA州)M5プレートリーダーを使用して450nMの吸光度で解読した。濃度は、Softmax Proソフトウェア(モレキュラーデバイス社、サニーベール、CA州)を使用して両対数曲線フィットに450 ODシグナル強度に対して標準的な曲線濃度をプロットすることによって得られた。ノンコンパートメント薬物動態分析はWinNonlin(v.5.3、ファーサイト社、マウンテンビュー、CA州、米国)を用いて実施された。最後の定量可能な時点までの血清中濃度−時間曲線下の面積(AUC0−t)を、線形トラペゾイダル法を使用して計算し、そして終末相半減期(t1/2)を推定するために個々の曲線の終末相部分の対数線形回帰を使用して時間∞(AUC∞)に外挿した。消失速度定数(Kel)は、1日目から7日目までの検査によって同定された、終末相を使用して対数変換された濃度データの最小二乗回帰によって決定され、そして終末相半減期はln2/kelと等しかった。これらの実験からの結果を図6に示す。
二重特異的抗体配列を、EpiVax Epimatrixのインシリコでの免疫原性予測プログラムからの制御性T細胞(Treg)調整スコアを使用して可能性ある免疫原性について分析した。
a)DNA構築法及び細胞培養
DNA構築物を、伝統的なクローニング法を使用して構築した。DNAセグメントは、外部の供給業者(IDTDNA)で合成されるか、又は事前に社内で構築された構築物のPCRから合成されるかのいずれかであった。セグメントをSOE(スプライスオーバーラップ伸長)PCRを使用して構築し、そして制限酵素で消化されたベクターに内部融合(クロンテック社、製造番号639638)するか又はライゲートした。使用される標準的なベクターは、CHO−E(チャイニーズハムスター卵巣)細胞におけるエピソーム複製のためのCMVプロモーター、AMP遺伝子選択マーカー、及びOriP遺伝子を有するpTT5(カナダ国立研究機関)であった。ベクターを、IgG1KOベクターについてはHindIII/NheI(ニューイングランドバイオラボ社)を用いて又はIgG4ProベクターについてはEcoRI/ApaI(ニューイングランドバイオラボ社)を用いてのいずれかで制限酵素により消化した。DNA挿入断片を有するベクターをStellar細胞(クロンテック社)に形質転換し、そして振盪しながら37℃で一晩培養した。プラスミド精製ミニプレップ(キアゲン社、製造番号27173)を完了させ、そして陽性試料は、外部供給業者(ユーロフィンジェノミクス社)でのサンガーシークエンスによって決定された。次いで、配列の確認された挿入断片を有する培養液を、ギガプレッププラスミド精製(キアゲン社、製造番号12991)又は自動マキシプレップ(ベンチプロ2100プラスミド精製システム、サーモフィッシャー社)を介してスケールアップした。次いで、DNAをCHO−E細胞のトランスフェクションに使用した。
CHO−E培養上清 30mlを、プロテインA樹脂(PhyNexus、カタログ番号PTR91−40−07)40μlを含有している「ProPlusPhyTip」アフィニティカラムにローディングした。流速は0.25ml/分であった。PhyTipsを、緩衝液A(DPBS)1.3ml、緩衝液B(DPBSと1M NaCl、pH6.5)1.3ml、及び緩衝液A 1.3mlを用いて0.5ml/分で順次洗浄した。次いで、結合したタンパク質を、緩衝液C(30mM NaOAc、pH3.5)0.3mlを3回用いて溶出した。pHは、各溶出液について1%の緩衝液D(3.0M NaOAc、pH約9)を用いてpH約5の60mM NaOAcの最終緩衝液となるように調整された。
Claims (38)
- a)第一のエピトープに対して特異的な第一の結合単位を形成している第一の重鎖と第一の軽鎖、及び
b)第二のエピトープに対して特異的な第二の結合単位を形成している第二の重鎖と第二の軽鎖
を含むタンパク質であって、
前記の第一の重鎖は366位にチロシン(Y)[T366Y]を含み、前記の第二の重鎖は407位にトレオニン(T)[Y407T]を含み、そして前記の第一又は前記の第二の重鎖はさらに435位にアルギニン[H435R]及び436位にフェニルアラニン[Y436F]を含むか、又は前記の第一の重鎖は366位にトリプトファン(W)[T366W]を含み、前記の第二の重鎖は366位にセリン(S)[T366S]、368位にアラニン(A)[L368A]、及び407位にバリン(V)[Y407V]を含み、そして前記の第一又は第二の重鎖はさらに435位にアルギニン[H435R]及び436位にフェニルアラニン[Y436F]を含む、該タンパク質。 - 前記の第二の重鎖がさらに435位にアルギニン[H435R]及び436位にフェニルアラニン[Y436F]を含む、請求項1記載のタンパク質。
- 前記の第一及び第二の重鎖がさらにYTE突然変異(M252Y/S254T/T256E)を含む、請求項1又は2記載のタンパク質。
- 前記の第一の重鎖が366位にトリプトファン(W)[T366W]を含み、前記の第二の重鎖が366位にセリン(S)[T366S]、368位にアラニン(A)[L368A]、及び407位にバリン(V)[Y407V]を含み、前記の第二の重鎖がさらに435位にアルギニン[H435R]及び436位にフェニルアラニン[Y436F]を含み、前記の重鎖がIgG1又はIgG4の重鎖に由来する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一の重鎖が、配列番号1、4、36又は37のアミノ酸配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第二の重鎖が、配列番号3、5、38又は39のアミノ酸配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一の重鎖が配列番号1又は4のアミノ酸配列を含み、そして前記の第二の重鎖が配列番号3又は5のアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一の重鎖が配列番号36のアミノ酸配列を含み、及び/又は前記の第二の重鎖が配列番号38のアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一の重鎖が配列番号37のアミノ酸配列を含み、及び/又は前記の第二の重鎖が配列番号39のアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一又は第二の軽鎖が配列番号2又は35のアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一の重鎖及び前記の第一の軽鎖が第一のリンカーを通して共有結合している、請求項1〜10のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第二の重鎖及び前記の第二の軽鎖が第二のリンカーを通して共有結合している、請求項1〜10のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一の重鎖及び前記の第一の軽鎖が第一のリンカーを通して共有結合し、そして前記の第二の重鎖及び前記の第二の軽鎖が第二のリンカーを通して共有結合している、請求項1〜10のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一及び/又は前記の第二のリンカーが26〜42アミノ酸を含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一及び/又は前記の第二のリンカーが30〜40アミノ酸を含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一及び/又は前記の第二のリンカーが34〜40アミノ酸を含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一及び/又は前記の第二のリンカーが36〜39アミノ酸を含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一及び/又は前記の第二のリンカーが38アミノ酸を含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一及び/又は前記の第二のリンカーがグリシン及びセリンアミノ酸を含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一及び/又は前記の第二のリンカーが配列番号6から配列番号14又は配列番号40のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一及び前記の第二のリンカーが同じ長さを有する、請求項13〜20のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一及び前記の第二のリンカーが同一である、請求項13〜20のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一のリンカーが前記の第一の重鎖のN末端に及び前記の第一の軽鎖のC末端に共有結合し、そして前記の第二のリンカーが前記の第二の重鎖のN末端に及び前記の第二の軽鎖のC末端に共有結合している、請求項13〜22のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第一及び前記の第二のエピトープが同じ標的タンパク質上にある、請求項1記載のタンパク質。
- 前記の第一及び前記の第二のエピトープが異なる標的タンパク質上にある、請求項1記載のタンパク質。
- 第三のエピトープに対して特異的な第三の結合単位をさらに含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第三の結合単位が、前記の第一又は第二の重鎖のC末端に共有結合している、請求項26記載のタンパク質。
- 前記の第三の結合単位が、前記の第一又は前記の第二の軽鎖のN末端に共有結合している、請求項26記載のタンパク質。
- 第四のエピトープに対して特異的な第四の結合単位をさらに含む、請求項26〜28のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記の第四の結合単位が、前記の第一又は前記の第二の重鎖のC末端に共有結合している、請求項29記載のタンパク質。
- 前記の第四の結合単位が、前記の第一又は前記の第二の軽鎖のN末端に共有結合している、請求項29記載のタンパク質。
- 前記の第三及び/又は前記の第四の結合単位がscFvである、請求項26〜31のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 請求項1〜32のいずれか一項に記載のタンパク質と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 請求項1〜32のいずれか一項に記載の軽鎖又は重鎖をコードしている配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項34記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項34記載の1つ以上のポリヌクレオチド又は請求項35記載の1つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞。
- a)請求項36記載の宿主細胞を得る工程;及び
b)宿主細胞を培養する工程
を含むタンパク質の産生法。 - 前記タンパク質を回収及び精製する工程をさらに含む、請求項37記載の方法。
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A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
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C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
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C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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C13 | Notice of reasons for refusal |
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C23 | Notice of termination of proceedings |
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C03 | Trial/appeal decision taken |
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C30A | Notification sent |
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