JP2023546277A - 新規の抗cd47抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本明細書に記載されるのは、ヒトで低い免疫原性を有し、かつ低レベルの赤血球枯渇もしくは赤血球凝集を引き起こすか、又はいかなるレベルの赤血球枯渇もしくは赤血球凝集も引き起こさないCD47抗体及びその免疫学的活性断片である。また提供されるのは、そのような抗体又は抗体断片を含有する医薬組成物、及びそのような抗体を、例えば、単一の薬剤として又は他の治療剤と組み合わせて使用する治療方法である。【選択図】なし
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、その内容が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2020年10月14日に出願された国際出願PCT/CN2020/120869号及び2020年10月20日に出願された国際出願PCT/CN2020/122188号の優先権利益を主張する。
本出願は、その内容が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2020年10月14日に出願された国際出願PCT/CN2020/120869号及び2020年10月20日に出願された国際出願PCT/CN2020/122188号の優先権利益を主張する。
(ASCIIテキストファイルでの配列表の提出)
ASCIIテキストファイルでの以下の提出物の内容は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる:配列表のコンピュータ可読形態(CRF)(ファイル名: 233002000241SEQLIST.TXT、記録日: 2021年10月12日、サイズ: 31,455バイト)。
ASCIIテキストファイルでの以下の提出物の内容は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる:配列表のコンピュータ可読形態(CRF)(ファイル名: 233002000241SEQLIST.TXT、記録日: 2021年10月12日、サイズ: 31,455バイト)。
(発明の分野)
本出願は、抗CD47抗体、そのような抗体を産生する方法、並びにCD47と関連する疾患及び障害の治療におけるそのような抗体の使用に関する。
本出願は、抗CD47抗体、そのような抗体を産生する方法、並びにCD47と関連する疾患及び障害の治療におけるそのような抗体の使用に関する。
(発明の背景)
CD47(分化抗原群47)は、ヒト卵巣癌上の腫瘍抗原として1980年代に最初に同定された。それ以降、CD47は、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、多発性骨髄腫(MM)、膀胱癌、及び他の固形腫瘍を含む、多数のヒト腫瘍型に発現されることが見出されている。高レベルのCD47は、より高レベルのカルレティキュリン-主要な食作用促進シグナルを有するにもかかわらず、癌細胞が食作用を回避するのを可能にする。
インテグリン関連タンパク質(IAP)、卵巣癌抗原OA3、Rh関連抗原、及びMER6としても知られているが、CD47は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する複数回膜貫通受容体である。その発現及び活性は、いくつかの疾患及び障害に関係があるとされている。それは、単一のIg様ドメイン及び5つの膜貫通領域を有する広範に発現される膜貫通糖タンパク質であり、これは、SIRPαの細胞性リガンドとして機能し、結合がシグナル調節タンパク質α(SIRPα)のNH2-末端のV様ドメインによって媒介される。SIRPαは、マクロファージ、顆粒球、骨髄性樹状細胞(DC)、肥満細胞、及びこれらの前駆細胞(造血幹細胞を含む)を含む骨髄性細胞上で主に発現される。
マクロファージは、食作用によって血流から病原体及び損傷又は老化した細胞を除去する。細胞表面CD47は、マクロファージ上のその受容体であるSIRPαと相互作用して、正常で健康な細胞の食作用を阻害する。SIRPαは、マクロファージによる宿主細胞の食作用を阻害し、この場合、宿主標的細胞上に発現されたCD47によるマクロファージ上でのSIRPαのライゲーションにより、食作用を負に調節するSHP-1によって媒介される阻害性シグナルが生じる。
CD47(分化抗原群47)は、ヒト卵巣癌上の腫瘍抗原として1980年代に最初に同定された。それ以降、CD47は、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、多発性骨髄腫(MM)、膀胱癌、及び他の固形腫瘍を含む、多数のヒト腫瘍型に発現されることが見出されている。高レベルのCD47は、より高レベルのカルレティキュリン-主要な食作用促進シグナルを有するにもかかわらず、癌細胞が食作用を回避するのを可能にする。
インテグリン関連タンパク質(IAP)、卵巣癌抗原OA3、Rh関連抗原、及びMER6としても知られているが、CD47は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する複数回膜貫通受容体である。その発現及び活性は、いくつかの疾患及び障害に関係があるとされている。それは、単一のIg様ドメイン及び5つの膜貫通領域を有する広範に発現される膜貫通糖タンパク質であり、これは、SIRPαの細胞性リガンドとして機能し、結合がシグナル調節タンパク質α(SIRPα)のNH2-末端のV様ドメインによって媒介される。SIRPαは、マクロファージ、顆粒球、骨髄性樹状細胞(DC)、肥満細胞、及びこれらの前駆細胞(造血幹細胞を含む)を含む骨髄性細胞上で主に発現される。
マクロファージは、食作用によって血流から病原体及び損傷又は老化した細胞を除去する。細胞表面CD47は、マクロファージ上のその受容体であるSIRPαと相互作用して、正常で健康な細胞の食作用を阻害する。SIRPαは、マクロファージによる宿主細胞の食作用を阻害し、この場合、宿主標的細胞上に発現されたCD47によるマクロファージ上でのSIRPαのライゲーションにより、食作用を負に調節するSHP-1によって媒介される阻害性シグナルが生じる。
正常細胞の食作用を阻害するCD47の役割と一致して、CD47が、造血幹細胞(HSC)及び前駆細胞上で、その遊走期の直前及びその間に、一過性に上方調節されるという証拠、並びにこれらの細胞上のCD47のレベルによって、細胞がインビボで飲み込まれる確率が決定されるという証拠がある。
CD47は、骨髄性白血病を含む、いくつかの癌で構成的に上方調節される。骨髄性白血病株でのCD47の過剰発現は、それが食作用を回避するのを可能にすることにより、その病原性を増大させる。CD47上方調節は、炎症媒介性動員時に正常なHSCに対する防御を提供するための重要なメカニズムであるということ、及び白血病前駆細胞は、マクロファージによる殺傷を回避するために、この能力を取り入れているということが結論付けられている。
あるCD47抗体は、食作用を回復し、アテローム性動脈硬化症を予防することが示されている。例えば、Kojimaらの文献、Nature, Vol. 36, 86-90(2016年8月4日)を参照されたい。本発明は、ヒトで低い免疫原性を有し、かつ低レベルの赤血球枯渇を引き起こすか、又はいかなるレベルの赤血球枯渇も引き起こさない新規のCD47抗体又はその免疫学的活性断片を提供する。当業者によく知られているように、そのような抗体は、「抗CD47抗体」と互換的に呼ぶことができる。
CD47は、骨髄性白血病を含む、いくつかの癌で構成的に上方調節される。骨髄性白血病株でのCD47の過剰発現は、それが食作用を回避するのを可能にすることにより、その病原性を増大させる。CD47上方調節は、炎症媒介性動員時に正常なHSCに対する防御を提供するための重要なメカニズムであるということ、及び白血病前駆細胞は、マクロファージによる殺傷を回避するために、この能力を取り入れているということが結論付けられている。
あるCD47抗体は、食作用を回復し、アテローム性動脈硬化症を予防することが示されている。例えば、Kojimaらの文献、Nature, Vol. 36, 86-90(2016年8月4日)を参照されたい。本発明は、ヒトで低い免疫原性を有し、かつ低レベルの赤血球枯渇を引き起こすか、又はいかなるレベルの赤血球枯渇も引き起こさない新規のCD47抗体又はその免疫学的活性断片を提供する。当業者によく知られているように、そのような抗体は、「抗CD47抗体」と互換的に呼ぶことができる。
(発明の概要)
本明細書に提供されるのは、ヒトCD47(hCD47)に特異的に結合する抗体又はその免疫学的活性断片であって、(a)(1)そのN-末端のグルタミン酸残基(E);(2)
を含むCDR-H1;
(3)
を含むCDR-H2;
(4)
を含むCDR-H3;及び(5)そのC-末端のセリン(S)を含む重鎖可変(VH)ドメイン;並びに(b)(1)
を含むCDR-L1;
(2)
を含むCDR-L2;及び(3)
を含むCDR-L3を含む軽鎖可変(VL)ドメイン:を含む、抗体又はその免疫学的活性断片である。
本明細書に提供されるのは、ヒトCD47(hCD47)に特異的に結合する抗体又はその免疫学的活性断片であって、(a)(1)そのN-末端のグルタミン酸残基(E);(2)
(3)
(4)
(2)
いくつかの実施態様において、VHドメインのN-末端アミノ酸は、Kabat付番システムによる位置H1に対応し、VHドメインのC-末端アミノ酸は、Kabat付番システムによる位置H113に対応する。いくつかの実施態様において、VHドメインのN-末端アミノ酸は、Chothia付番システムによる位置H1に対応し、VHドメインのC-末端アミノ酸は、Chothia付番システムによる位置H113に対応する。いくつかの実施態様において、VHドメインのN-末端アミノ酸は、IMGT付番システムによる位置H1に対応し、VHドメインのC-末端アミノ酸は、IMGT付番システムによる位置H128に対応する。いくつかの実施態様において、VHドメインのN-末端アミノ酸は、配列番号1のアミノ酸1に対応し、該VHドメインのC-末端アミノ酸は、配列番号1のアミノ酸118に対応する。いくつかの実施態様において、VHは、配列番号1と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、VLは、配列番号2と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、VHは、配列番号1を含み、VLは、配列番号2を含む。
いくつかの実施態様において、抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片は、Fcドメインを含む。いくつかの実施態様において、Fcドメインは、ヒトIgG Fcドメインである。いくつかの実施態様において、ヒトIgG Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4 Fcドメインである。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、全長抗体である。いくつかの実施態様において、全長抗CD47抗体は、配列番号3又は配列番号55を含む重鎖及び配列番号4を含む軽鎖を含む。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体の免疫学的活性断片は、Fab、Fab'、F(ab)'2、Fab'-SH、単鎖Fv(scFv)、Fv断片、又は線状抗体である。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片は、モノクローナル抗体又はその断片である。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片は、キメラ又はヒト化されているものである。
いくつかの実施態様において、抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片は、癌細胞の表面に発現されたhCD47に結合する。いくつかの実施態様において、癌細胞は、SK-OV-3細胞、Toledo細胞、K562細胞、HCC827細胞、Jurkat細胞、U937細胞、TF-1細胞、Raji細胞、SU-DHL-4細胞、MDA-MB-231細胞、A375細胞、又はSK-MES-1細胞である。いくつかの実施態様において、癌細胞は、固形腫瘍癌である。いくつかの実施態様において、固形腫瘍癌は、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌、肉腫癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、又は皮膚癌である。いくつかの実施態様において、癌細胞は、血液癌である。いくつかの実施態様において、血液癌は、非ホジキンリンパ腫である。
いくつかの実施態様において、抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片は、血液細胞の表面に発現されたhCD47に結合しない。いくつかの実施態様において、血液細胞は、赤血球である。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片とhCD47との結合は、hCD47とシグナル調節タンパク質α(SIRPα)との相互作用を妨げる。いくつかの実施態様において、SIRPαは、ヒトSIRPα(hSIRPα)である。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片と癌細胞の表面に発現されたhCD47との結合は、癌細胞のマクロファージ媒介性食作用を促進する。いくつかの実施態様において、癌細胞は、SK-OV-3細胞、Toledo細胞、K562細胞、HCC827細胞、Jurkat細胞、U937細胞、TF-1細胞、Raji細胞、SU-DHL-4細胞、MDA-MB-231細胞、A375細胞、又はSK-MES-1細胞である。いくつかの実施態様において、癌細胞は、固形腫瘍癌である。いくつかの実施態様において、固形腫瘍癌は、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌、肉腫癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、又は皮膚癌である。いくつかの実施態様において、癌細胞は、血液癌である。いくつかの実施態様において、血液癌は、非ホジキンリンパ腫である。いくつかの実施態様において、対象への抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片の投与は、対象における顕著なレベルの赤血球凝集又は対象の赤血球の枯渇を引き起こさない。
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片をコードする核酸である。また提供されるのは、そのような核酸を含むベクターである。さらに、提供されるのは、本明細書に記載される核酸及び/又はベクターを含む宿主細胞である。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、哺乳動物である。いくつかの実施態様において、哺乳動物は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。いくつかの実施態様において、CHO細胞は、CHO-K1細胞である。関連態様において、提供されるのは、抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片を産生する方法であって、a)本明細書に記載される宿主細胞を、抗CD47抗体又はその抗原結合断片の発現を引き起こすのに効果的な条件下で培養すること;及びb)該宿主細胞によって発現された抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片を回収すること:を含む、方法である。
提供されるのは、抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物である。
提供されるのは、対象の癌を治療する方法であって、有効量の抗CD47抗体を該対象に投与することを含み、ここで、該抗CD47抗体が、(a)(1)
を含むCDR-H1;
(2)
を含むCDR-H2;及び(3)
を含むCDR-H3を含む重鎖可変ドメイン(VH);
(b)(1)
を含むCDR-L1;
(2)
を含むCDR-L2;及び(3)
を含むCDR-L3を含む軽鎖可変(VL)ドメインを含む、方法である。
(2)
(b)(1)
(2)
いくつかの実施態様において、癌は、固形腫瘍である。いくつかの実施態様において、固形腫瘍は、肺腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍、肉腫腫瘍、頭頸部腫瘍、胃腫瘍、腎腫瘍、又は皮膚腫瘍である。いくつかの実施態様において、固形腫瘍は、再発性及び/又は不応性固形腫瘍である。
いくつかの実施態様において、癌は、非ホジキンリンパ腫(NHL)であり、本方法は、有効量のリツキシマブを対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施態様において、NHLは、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、又はマントル細胞リンパ腫(MCL)である。いくつかの実施態様において、NHLは、再発性/不応性NHLである。いくつかの実施態様において、対象は、少なくとも1回のNHLの事前治療を受けたことがある。いくつかの実施態様において、対象は、2~10回のNHLの事前療法を受けたことがある。いくつかの実施態様において、対象は、CD20を標的とする薬剤によるNHLの事前治療を受けたことがある。いくつかの実施態様において、対象は、CD20を標的とする薬剤による事前療法の間又はその後に進行した。
本明細書に提供される治療方法のいずれかのいくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、ヒトIgG4定常領域又はS233P突然変異を含むその変異体(ここで、付番は、EUインデックスによるものである)を含む。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、対象に10mg/kgの用量で投与される。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、対象に20mg/kgの用量で投与される。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、対象に30mg/kgの用量で投与される。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、対象に1週間毎に1回(qw)投与される。いくつかの実施態様において、ここで、抗CD47抗体は、対象に静脈内(IV)注入を介して投与される。NHLを治療する方法のいくつかの実施態様において、リツキシマブは、最初の5週間、375mg/m2の用量で週1回(qw)、及び最初の5週間の後、375mg/m2の用量で4週間毎に1回(q4w)投与される。
本明細書に記載される治療方法のいくつかの実施態様において、対象は、抗CD47抗体による治療による重大な血液毒性を経験しない。いくつかの実施態様において、対象は、抗CD47抗体による治療による血液毒性を全く経験しない。いくつかの実施態様において、血液毒性は、貧血、血球減少症、及び/又は赤血球凝集を含む。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体のVHは、配列番号1を含み、抗CD47抗体のVLは、配列番号2を含む。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体の重鎖は、配列番号3又は配列番号55を含み、抗CD47抗体の軽鎖は、配列番号4を含む。
また提供されるのは、癌を治療するためのキットであって、本明細書に記載される抗CD47抗体又は医薬組成物を含む、キットである。いくつかの実施態様において、該キットは、本明細書に提供される治療方法に従って使用するためのものである。
本明細書に記載される様々な実施態様の性質のうちの1つ、いくつか、又は全てを組み合わせて、本発明の他の実施態様を形成させることができることが理解されるべきである。本発明のこれらの及びその他の態様は、当業者には明白になるであろう。本発明のこれらの及びその他の実施態様は、以下の詳細な説明によってさらに説明される。
(図面の簡単な説明)
図1は、単量体CD47-ECD(細胞外ドメイン)に結合する抗CD47抗体B2B、5F9、及び2A1の用量依存的応答を示している。
(発明の詳細な説明)
(定義)
本実施態様を詳細に説明する前に、本開示は、当然異なり得る特定の組成物又は生物学的システムに限定されるものではないことが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施態様を説明するためだけのものであって、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
(定義)
本実施態様を詳細に説明する前に、本開示は、当然異なり得る特定の組成物又は生物学的システムに限定されるものではないことが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施態様を説明するためだけのものであって、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「a」、「an」、及び「the」は、文脈上そうでないことが明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「1つの分子(a molecule)」への言及は、2以上のそのような分子の組合せなどを任意に含む。
本明細書で使用される「約」という用語は、本技術分野の当業者に容易に分かるそれぞれの値についての通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値又はパラメータへの言及は、その値又はパラメータそれ自体を対象にする実施態様を含む(及び説明する)。
本開示の態様及び実施態様は、態様及び実施態様を「含む(comprising)」、「からなる(consisting)」、及び「から本質的になる(consisting essentially of)」を含むことが理解される。
「CD47」(これは、インテグリン関連タンパク質(IAP)、抗原性表面決定基タンパク質OA3、OA3、CD47抗原、Rh関連抗原、インテグリン関連シグナル伝達因子、モノクローナル抗体1D8によって特定される抗原、CD47糖タンパク質としても知られている)という用語は、好ましくは、ヒトCD47、特に、アミノ酸配列
又は該アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質を指す。「CD47」という用語は、任意の翻訳後修飾変異体及び立体構造変異体も指す。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、最も幅広い意味で使用されており、具体的には、それが所望の生物活性(例えば、エピトープ結合)を示す限り、無傷抗体(例えば、全長抗体)、抗体断片(限定するものではないが、Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv、ダイアボディ、scFv、scFv-Fc、単一ドメイン抗体、単一重鎖抗体、及び単一軽鎖抗体を含む)、モノクローナル抗体、並びにポリクローナル抗体を包含する。「抗体」(又は「Ab」)及び「免疫グロブリン」(又は「Ig」)は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の抗原に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで、及び骨髄腫によって高レベルで産生される。
本明細書で使用される場合、「単離された」抗体という用語は、他の細胞物質を実質的に含まない抗体を指すことができる。一実施態様において、単離された抗体は、同じ種由来の他のタンパク質を実質的に含まない。別の実施態様において、単離された抗体は、異なる種由来の細胞によって発現され、異なる種由来の他のタンパク質を実質的に含まない。いくつかの実施態様において、「単離された」抗体は、その天然環境の成分から特定され、かつ分離及び/又は回収された抗体である。その天然環境の夾雑成分は、抗体の診断的又は治療的使用を妨害する物質であり、これには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性もしくは非タンパク質性溶質が含まれ得る。抗体は、当技術分野で周知のタンパク質精製技法を用いる単離によって、天然に関連する成分(又は抗体を産生するのに使用される細胞性発現系と関連する成分)を実質的に含まないようにすることができる。いくつかの実施態様において、抗体は、(1)ローリー法によって判定したとき、抗体の75重量%超まで、最も好ましくは、80%、90%、95%、もしくは99重量%を上回るまで、又は(2)クマシーブルー、もしくは好ましくは、銀染色を用いる還元もしくは非還元条件下のSDS-PAGEによって、均一になるまで精製される。抗体の天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないので、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイチュの抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも1回の精製工程によって精製される。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原性決定基を意味する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性のある表面群からなり、通常、特定の三次元構造特徴、及び特定の電荷特徴を有する。
本明細書で使用される場合、「ネイティブな抗体及び免疫グロブリン」という用語は、通常、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖から構成される、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各々の軽鎖は、1つの共有結合的ジスルフィド結合(「VH/VL対」とも呼ばれる)によって重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で様々に異なる。各々の重鎖及び軽鎖は、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各々の重鎖は、一方の末端に、可変ドメイン(VH)と、それに続く、いくつかの定常ドメインを有する。各々の軽鎖は、一方の末端にある可変ドメイン(VL)とそのもう一方の末端にある定常ドメインを有し;軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の境界面を形成すると考えられる。例えば、Chothiaらの文献、J. Mol. Biol., 186:651(1985); Novotny及びHaberの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:4592(1985)を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分が配列に関して抗体間で大きく異なり、かつその特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合及び特異性に関して使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているわけではない。それは、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方の相補性決定領域(CDR)又は超可変領域と呼ばれる3つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク(FR)と呼ばれる。ネイティブな重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、3つのCDRによって接続された、主としてβ-シート立体配置を取る4つのFR領域を含み、この3つのCDRは、β-シート構造を接続し、場合によっては、その部分を形成する、ループを形成する。各々の鎖のCDRは、FR領域によって、至近距離で結び付けられ、他の鎖由来のCDRとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。例えば、Kabatらの文献、免疫学的に関心のあるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、第5版、National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991)を参照されたい。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。対象となる様々な領域配列には、本明細書の別所で詳細に記載されているCD47抗体のヒト化可変領域配列が含まれる。
「超可変領域(HVR)」又は「相補性決定領域(CDR)」という用語は、配列可変性の増強及び/又は定義されたループの形成を特徴とするVH及びVLドメインのサブ領域を指すことができる。これらは、VHドメイン(H1、H2、及びH3)中の3つのCDR並びにVLドメイン(L1、L2、及びL3)中の3つのCDRを含む。H3は、優れた結合特異性を付与するのに極めて重要であると考えられ、L3及びH3は、最高レベルの多様性を示す。Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo編、Human Press, Totowa, N.J., 2003)所収のJohnson及びWuの文献を参照されたい。
いくつかのCDR/HVR描写が知られている。Kabat相補性決定領域(CDR)は、配列可変性に基づくものであり、最も一般的に使用されている(Kabatらの文献、免疫学的に関心のあるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、第5版、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991))。Chothiaは、その代わりに、構造ループの位置に言及するものである(Chothia及びLeskの文献、J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。AbM HVRは、Kabat HVRとChothia構造ループの折衷案に相当し、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触」HVRは、利用可能な複合結晶構造の解析に基づくものである。これらのHVR/CDRの各々に由来する残基は、以下に記述されている。「フレームワーク」又は「FR」残基は、HVR/CDR残基以外の可変ドメイン残基である。
「伸長型」HVRも知られている: VL中の24~36又は24~34(L1)、46~56又は50~56(L2)、及び89~97又は89~96(L3)、並びにVH中の26~35(H1)、50~65又は49~65(H2)、及び93~102、94~102、又は95~102(H3)(Kabat付番)。
「Kabatによる付番」は、Kabatらの文献(上記)における抗体編集物の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用される付番システムを指すことができる。実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのFRもしくはHVRの短縮、又は可変ドメインのFRもしくはHVRへの挿入に対応するより少ないアミノ酸又は追加のアミノ酸を含有し得る。残基のKabat付番は、抗体の配列と「標準的な」Kabat付番配列との相同性領域におけるアラインメントによって、所与の抗体について決定することができる。通常、Kabat付番が可変ドメイン中の残基(およそ、軽鎖の残基1~107及び重鎖の残基1~113)を参照するときに使用されるのに対し、EU付番システム又はインデックス(例えば、Kabatと同様のEUインデックス、EU IgG1による付番)は、通常、重鎖定常領域中の残基を参照するときに使用される。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル」抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られた、例えば、実質的に同一であるが、わずかなレベルのバックグラウンド突然変異及び/又は修飾を許容する抗体を指す。「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な性質を意味し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものではない。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、そのHVR、VH、及び/もしくはVL配列並びに/又は結合特性によって選択され、例えば、クローン(例えば、組換え体、ハイブリドーマ、又はファージ由来のもの)のプールから選択される。モノクローナル抗体は、例えば、抗体の結合親和性又は他の特性に影響を及ぼし、ヒト化又はキメラ抗体を作出し、抗体の産生及び/又は均一性を向上させ、多重特異性抗体を改変する1以上の突然変異を含むように改変することができ、その得られた抗体は依然として、事実上モノクローナルであるとみなされる。モノクローナル抗体の集団は、該集団の個々のモノクローナル抗体が同じ抗原性部位を認識するので、ポリクローナル抗体と区別することができる。モノクローナル抗体の産生のための種々の技法が知られている;例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler及びMilsteinの文献、Nature, 256:495-97(1975); Hongoらの文献、Hybridoma, 14(3): 253-260(1995)、Harlowらの文献、抗体:実験室マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988); Hammerlingらの文献:モノクローナル抗体及びT細胞ハイブリドーマ(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas) 563-681(Elsevier, N.Y., 1981)所収)、組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clacksonらの文献、Nature, 352: 624-628(1991); Marksらの文献、J. Mol. Biol. 222: 581-597(1992); Sidhuらの文献、J. Mol. Biol. 338(2): 299-310(2004); Leeらの文献、J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093(2004); Fellouseの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472(2004);及びLeeらの文献、J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)を参照、並びにヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の部分又は全てを有する動物でヒト又はヒト様抗体を産生するための技術(例えば、WO 1998/24893号; WO 1996/34096号; WO 1996/33735号; WO 1991/10741号; Jakobovitsらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551(1993); Jakobovitsらの文献、Nature 362: 255-258(1993); Bruggemannらの文献、Year in Immunol. 7:33(1993);米国特許第5,545,807号;第5,545,806号;第5,569,825号;第5,625,126号;第5,633,425号;及び第5,661,016号; Marksらの文献、Bio/Technology 10: 779-783(1992); Lonbergらの文献、Nature 368: 856-859(1994); Morrisonの文献, Nature 368: 812-813(1994); Fishwildらの文献、Nature Biotechnol. 14: 845-851(1996); Neubergerの文献、Nature Biotechnol. 14: 826(1996);並びにLonberg及びHuszarの文献、Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93(1995)を参照されたい。
「キメラ」抗体は、重鎖及び/又は軽鎖のある部分が特定のアイソタイプ、クラス、又は生物に由来し、別の部分が別のアイソタイプ、クラス、又は生物に由来する抗体を指すことができる。いくつかの実施態様において、可変領域は、1つの源又は生物に由来するものであり、定常領域は、別のものに由来するものである。
「ヒト化抗体」は、大部分ヒト配列及び最小量の非ヒト(例えば、マウス又はニワトリ)配列を有する抗体を指すことができる。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、ヒトレシピエント抗体フレームワーク(FR)に移植された非ヒト(例えば、マウス又はニワトリ)生物に由来する抗体由来の1以上のHVR配列(対象となる結合特異性を有する)を有する。いくつかの実施態様において、非ヒト残基は、例えば、抗体特性を向上させるために、ヒトフレームワーク(ソース抗体にもレシピエント抗体にも存在しない)にさらに移植される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、通常、2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、この可変ドメインでは、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、かつFRの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のFRに対応する。ヒト化抗体は、通常はヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部も任意に含む。Jonesらの文献、Nature 321:522-525(1986); Riechmannらの文献、Nature 332:323-329(1988);及びPrestaの文献、Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照されたい。
「ヒト」抗体は、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に対応し、かつ/又は本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技法のいずれかを用いて作られたアミノ酸配列を有する抗体を指すことができる。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー、Hoogenboom及びWinterの文献、J. Mol. Biol., 227:381(1991); Marksらの文献、J. Mol. Biol., 222:581(1991); Coleらの文献、モノクローナル抗体及び癌療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)、Alan R. Liss, p. 77(1985); Boernerらの文献、J. Immunol., 147(1):86-95(1991)に記載されているようなヒトモノクローナル抗体の調製を含む、当技術分野で公知の様々な技法を用いて;並びにそのような抗体を抗原刺激に応答して産生するように改変されているが、その内在性遺伝子座が不能にされているトランスジェニック動物、例えば、免疫したゼノマウス(xenomice)(例えば、XENOMOUSE(商標)技術に関する米国特許第6,075,181号及び第6,150,584号を参照)又はヒト免疫グロブリン配列を有するニワトリ(例えば、WO2012162422号、WO2011019844号、及びWO2013059159号を参照)に抗原を投与することにより産生することができる。
5つの主要な免疫グロブリンのクラス: IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元形状は周知である。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語及びその全ての文法的変化形は、無傷抗体の抗原結合部位又は可変領域を含む無傷抗体の一部(これは、場合によっては、無傷抗体のFc領域の定常重鎖ドメイン(すなわち、抗体アイソタイプに応じて、CH2、CH3、及び/又はCH4)を含まない)として定義される。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、及びFv断片;ダイアボディ;限定するものではないが、(1)単鎖Fv(scFv)分子、(2)1つの軽鎖可変ドメインのみを含有する単鎖ポリペプチド、又は軽鎖可変ドメインの3つのCDRを含有し、関連する重鎖部分を有さないその断片、及び(3)1つの重鎖可変領域のみを含有する単鎖ポリペプチド、又は重鎖可変領域の3つのCDRを含有し、関連する軽鎖部分を有さないその断片;並びに抗体断片から形成される多重特異性又は多価構造を含む、連続するアミノ酸残基の1つの途切れのない配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片(本明細書では「単鎖抗体断片」又は「単鎖ポリペプチド」と呼ばれる)が挙げられる。1以上の重鎖を含む抗体断片において、重鎖は、無傷抗体の非Fc領域に見られる任意の定常ドメイン配列(例えば、IgGアイソタイプにおけるCH1)を含有することができ、かつ/又は無傷抗体に見られる任意のヒンジ領域配列を含有することができ、かつ/又は重鎖のヒンジ領域配列もしくは定常ドメイン配列に融合されているかもしくは該配列中に位置しているロイシンジッパー配列を含有することができる。
抗体のパパイン消化は、各々単一の抗原結合部位を有する「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片、及びその名前が容易に結晶化するその能力を反映する残りの「Fc」断片を生じる。ペプシン処理は、2つの抗原組合せ部位を有し、かつ依然として抗原を架橋することができるF(ab')2断片を生じる。「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体断片である。2鎖Fv種において、この領域は、緊密に非共有結合的に会合した1つの重鎖可変ドメイン及び1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖Fv種(scFv)において、1つの重鎖可変ドメイン及び1つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が2鎖Fv種におけるものと類似した「二量体」構造で会合することができるように、可撓性ペプチドリンカーによって共有結合的に連結されることができる。各々の可変ドメイン中の3つのCDRがVH-VL二量体の表面の抗原結合部位を規定するように相互作用するのは、この形状においてである。全体として、6つのCDRは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。例えば、モノクローナル抗体の薬理学(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)、第113巻、Rosenburg and Moore編、Springer-Verlag, New York, pp. 269-315(1994)所収のPluckthunの文献を参照されたい。
Fab断片も、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメイン(CH1)を含有する。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域由来の1以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されていることにより、Fab断片とは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するFab'に対する本明細書における名称である。F(ab')2抗体断片は、もともと、Fab'断片間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
本明細書で使用される場合、「医薬として許容し得る担体又は賦形剤」という用語は、概して安全であり、無毒であり、かつ生物学的にも別の点でも望ましくないことがない医薬組成物又は製剤を調製するのに有用である担体又は賦形剤を指す。利用される担体又は賦形剤は、通常、ヒト対象又は他の哺乳動物への投与に好適なものである。組成物を作製する際、活性成分は、通常、担体もしくは賦形剤と混合されるか、それによって希釈されるか、又はそれで封入される。担体又は賦形剤が希釈剤としての役割を果たす場合、それは、抗体の活性成分のためのビヒクル、担体、又は媒体として作用する固体、半固体、又は液体材料であることができる。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」(mAb)という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、微量で存在し得る天然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一の抗原性部位に対するものである。各々のmAbは、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それが他の免疫グロブリンが混入していないハイブリドーマ培養物によって合成されるという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られたものであるという抗体の性格を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されることになるモノクローナル抗体は、不死化B細胞もしくはそのハイブリドーマで作製されてもよく、又は組換えDNA法によって作製されてもよい。
本明細書におけるモノクローナル抗体は、起源種又は免疫グロブリンクラスもしくはサブクラスの指定とは無関係に、CD47抗体の可変(超可変を含む)ドメインを定常ドメインと(例えば、「ヒト化」抗体)、又は軽鎖を重鎖と、又はある種由来の鎖を別の種由来の鎖と、又は融合体を異種タンパク質と接合することにより産生されるハイブリッド及び組換え抗体、並びに抗体断片(例えば、Fab、F(ab')2、及びFv)を、それらが所望の生物活性を示す限り含む。
本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種に由来するか又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である一方で、鎖の残りの部分が別の種に由来するか又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同であるキメラ抗体(免疫グロブリン)、並びにそのような抗体の断片を、それらが所望の生物活性を示す限り、含む。
本明細書で使用される場合、「エピトープタグ化された」という用語は、「エピトープタグ」に融合されたCD47抗体を指す。エピトープタグポリペプチドは、それに対する抗体を作製することができるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、CD47抗体の活性を妨害しないように十分に短い。エピトープタグは、好ましくは、エピトープに特異的な抗体が他のエピトープと大きく交差反応しないように十分に独特である。好適なタグポリペプチドは、通常、少なくとも6アミノ酸残基、通常、約8~50アミノ酸残基(好ましくは、約9~30残基)を有する。例としては、c-mycタグ、並びにそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7、及び9E10抗体(例えば、Evanらの文献、Mol. Cell. Biol., 5(12):3610-3616(1985)を参照);並びに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体(例えば、Paborskyらの文献、Protein Engineering, 3(6):547-553(1990)を参照)が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、抗体に直接的に又は間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、それ自体、単独で検出可能であり得るか(例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識)、又は酵素標識の場合、検出可能である基質化合物もしくは組成物の化学的変化を触媒し得る。
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、臨床病理の過程で治療される個体又は細胞の自然経過を変化させるように設計された臨床的介入を指す。望ましい治療効果としては、疾患進行の速度の減少、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられる。例えば、個体は、癌と関連する1以上の症状が軽減又は消失している場合、「治療」が成功しており、これには、癌性細胞の増殖の低下(又は癌性細胞の破壊)、疾患に起因する症状の減少、疾患に罹患している者の生活の質の増大、疾患の治療に必要とされる他の医薬の用量の減少、及び/又は個体の生存の延長が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「疾患の進行を遅延させる」とは、疾患(例えば、癌)を延期させる、妨害する、緩徐化する、停滞させる、安定化する、及び/又はその発症を先に延ばすことを意味する。この遅延は、病歴及び/又は治療を受けている個体によって、様々な長さであり得る。当業者には明らかなように、十分な又は顕著な遅延は、個体が疾患を発症しないという点で、事実上、予防を包含する。例えば、末期癌、例えば、転移の発達が遅延され得る。
例示的な癌としては、卵巣癌、結腸癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、結腸直腸癌、膵癌、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠腫、膠芽腫、骨髄腫、単球性白血病、B細胞由来白血病、T細胞由来白血病、B細胞由来リンパ腫、T細胞由来リンパ腫、及び固形腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。線維性疾患は、例えば、心筋梗塞、狭心症、変形性関節症、肺線維症、喘息、嚢胞性線維症、気管支炎、又は喘息であることができる。
本明細書で使用される場合、「予防する(prevent)」、「予防する(preventing)」、及び「予防(prevention)」という用語は、疾病、障害、もしくは疾患、及び/又はその随伴症状の発症を遅延及び/又は防止するか;対象が疾病、障害、又は疾患を獲得するのを妨げるか;或いは疾病、障害、又は疾患を獲得する対象のリスクを低下させる方法を含むことが意図される。
本明細書で使用される場合、治療目的の「対象」という用語は、ヒト、飼育動物及び家畜、並びに動物園動物、競技用動物、又は愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
特許出願及び公報を含む、本明細書に引用される参考文献は全て、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。
(概観)
本明細書に提供されるのは、ヒトCD47(hCD47)がSIRPα(例えば、ヒトSIRPα又は「hSIRPα」)と相互作用するのを妨げる新規の抗CD47抗体である。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、CD47発現細胞(例えば、hCD47発現細胞、例えば、癌細胞)のマクロファージ媒介性食作用を促進する。治療用抗CD47抗体の開発における1つの課題は、標的に向かい、組織に向かわない毒性(on-target, off-tissue toxicity)である。赤血球細胞も、免疫系によるその破壊を妨げるためにCD47を発現しており、CD47療法は、用量制限的血液毒性に陥ってしまう。
本明細書に提供されるのは、ヒトCD47(hCD47)がSIRPα(例えば、ヒトSIRPα又は「hSIRPα」)と相互作用するのを妨げる新規の抗CD47抗体である。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、CD47発現細胞(例えば、hCD47発現細胞、例えば、癌細胞)のマクロファージ媒介性食作用を促進する。治療用抗CD47抗体の開発における1つの課題は、標的に向かい、組織に向かわない毒性(on-target, off-tissue toxicity)である。赤血球細胞も、免疫系によるその破壊を妨げるためにCD47を発現しており、CD47療法は、用量制限的血液毒性に陥ってしまう。
本明細書に記載される抗CD47抗体は、本明細書に記載される抗CD47抗体が、赤血球上のグリコシル化によって遮蔽されているCD47上の独特のエピトープに結合し、例えば、腫瘍細胞の表面に発現されたCD47への結合の増大をもたらすという点で、多くの他の既知の抗CD47抗体とは大きく区別される。有利なことに、本明細書に提供される抗CD47抗体は、対象(例えば、ヒト又は非ヒト霊長類)に投与した後、赤血球凝集又は赤血球枯渇を引き起こさない(例えば、重大な又は顕著なレベルの赤血球凝集又は赤血球枯渇を引き起こさない)。
さらに、出願人は、同じ条件下で培養されたが、極めて類似した抗CD47抗体をコードする核酸を発現する宿主細胞からよりも高い抗体力価が本明細書に記載される抗CD47抗体をコードする核酸を発現する宿主細胞から得られることを予想外に見出した。具体的には、本明細書に提供される抗CD47抗体は、グルタミン酸(E)をそのN-末端に及びセリン(S)をそのC-末端に含むVHドメインを含む。そのような抗体は、哺乳動物宿主細胞(例えば、CHO細胞、例えば、CHO-K1細胞)によって、同じCDRを含むが、グルタミン酸(E)以外のアミノ酸をそのN-末端に及びセリン(S)以外のアミノ酸をそのC-末端に有するVHドメインを含む抗CD47抗体よりも高い収率で産生されることができる。
(抗CD47抗体)
抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、十分な親和性及び特異性でCD47(例えば、ヒトCD47又は「hCD47」)に結合する抗体である。本明細書で使用される場合、抗体の「免疫学的活性断片」は、該抗体の抗原結合断片を指す。「免疫学的活性断片」及び「抗原結合断片」という用語は、本明細書において互換的に使用される。例えば、本明細書に提供される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、異常な(aberrant)/異常な(abnormal)CD47発現及び/又は活性と関連する疾患又は疾病を標的とし、かつ妨害する際の治療剤として使用することができる。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、キメラ(例えば、ヒト化)モノクローナル抗体である。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、下記の重鎖可変ドメイン(VH)及び/又は軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。
抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、十分な親和性及び特異性でCD47(例えば、ヒトCD47又は「hCD47」)に結合する抗体である。本明細書で使用される場合、抗体の「免疫学的活性断片」は、該抗体の抗原結合断片を指す。「免疫学的活性断片」及び「抗原結合断片」という用語は、本明細書において互換的に使用される。例えば、本明細書に提供される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、異常な(aberrant)/異常な(abnormal)CD47発現及び/又は活性と関連する疾患又は疾病を標的とし、かつ妨害する際の治療剤として使用することができる。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、キメラ(例えば、ヒト化)モノクローナル抗体である。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、下記の重鎖可変ドメイン(VH)及び/又は軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。
いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、(a)(1)そのN-末端のグルタミン酸残基(E);(2)
を含むCDR-H1;(3)
を含むCDR-H2;(4)
を含むCDR-H3;及び(5)そのC-末端のセリン(S)を含むVHドメイン、並びに(b)(1)
を含むCDR-L1;(2)
を含むCDR-L1;及び(3)
を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施態様において、CDR配列は、Kabatに従って定義される(例えば、(Kabatらの文献、免疫学的に関心のあるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、第5版、Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991)を参照)。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、(a)(1)そのN-末端のグルタミン酸残基(E);(2)
を含むCDR-H1;(3)
を含むCDR-H2;(4)
を含むCDR-H1;及び(5)そのC-末端のセリン(S)を含むVHドメイン、並びに(b)(1)
を含むCDR-L1;(2)
を含むCDR-L2;及び(3)
を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施態様において、CDR配列は、Chothia付番方式に従って定義される(例えば、Chothia及びLeskの文献(1986) EMBO J. 5(4):823-6、並びにAl-Lazikaniらの文献(1997) JMB 273: 927-948を参照)。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、(a)(1)そのN-末端のグルタミン酸残基(E);(2)
を含むCDR-H1;(3)
を含むCDR-H2;(4)
を含むCDR-H3;及び(5)そのC-末端のセリン(S)を含むVHドメイン、並びに(b)(1)
を含むCDR-L1;(2)QA(配列番号:31)を含むCDR-L2;及び(3)
を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施態様において、CDR配列は、IMGT付番方式に従って定義される(例えば、Lefranc MPの文献(2013) IMGT独自付番(IMGT Unique Numbering). 所収: Dubitzky W., Wolkenhauer O., Cho KH., Yokota H.(編) Encyclopedia of Systems Biology. Springer, New York, NY; https://doi.org/10.1007/978-1-4419-9863-7_127を参照)。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、(a)(1)そのN-末端のグルタミン酸残基(E);(2)
を含むCDR-H1;(3)
を含むCDR-H2;(4)
を含むCDR-H3;及び(5)そのC-末端のセリン(S)を含むVHドメイン、並びに(b)(1)
を含むCDR-L1;(2)
を含むCDR-L2;及び(3)
を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施態様において、CDR配列は、AbM付番方式に従って定義される(例えば、Abhinandan R.K., Martin A.C.の文献、Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains. Mol. Immunol. 2008;45:3832-3839. doi: 10.1016/j.molimm.2008.05.022を参照)。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、(a)(1)そのN-末端のグルタミン酸残基(E);(2)
を含むCDR-H1;(3)
を含むCDR-H2;(4)
を含むCDR-H3;及び(5)そのC-末端のセリン(S)を含むVHドメイン、並びに(b)(1)
を含むCDR-L1;(2)
を含むCDR-L2;及び(3)
を含むCDR-L3を含むVLドメインを含む。いくつかの実施態様において、CDR配列は、接触付番方式に従って定義される(例えば、McCallumらの文献(1996) J Mol Biol. 262(5):732-45; doi: 10.1006/jmbi.1996.0548を参照)。
いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)のVHドメインのN-末端アミノ酸は、Kabat付番システムによる位置H1に対応し、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)のVHドメインのC-末端アミノ酸は、Kabat付番による位置H113に対応する。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)のVHドメインのN-末端アミノ酸は、Chothia付番システムによる位置H1に対応し、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)のVHドメインのC-末端アミノ酸は、Chothia付番システムによる位置H113に対応する。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)のVHドメインのN-末端アミノ酸は、IMGT付番システムによる位置H1に対応し、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)のVHドメインのC-末端アミノ酸は、IMGT付番システムによる位置H128に対応する。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)のVHドメインのN-末端アミノ酸は、配列番号1のアミノ酸1に対応し、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)のVHドメインのC-末端アミノ酸は、配列番号1のアミノ酸118に対応する。
いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(VH)(ただし、該VHドメインのN-末端アミノ酸はEであり、該VHドメインのC-末端アミノ酸はSである)、及び任意に、配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。配列番号1及び2のアミノ酸配列を以下に提供する:
いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、配列番号1を含むVHドメインの3つのCDRを含み、ただし、該VHドメインのN-末端アミノ酸はEであり、該VHドメインのC-末端アミノ酸はSである。さらに又は代わりに、いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、配列番号2を含むVLドメインの3つのCDRを含む。いくつかの実施態様において、VHドメインの3つのCDRは、Kabat、Chothia、AbM、又は接触付番方式によるCDRである。さらに又は代わりに、いくつかの実施態様において、VLドメインの3つのCDRは、Kabat、Chothia、AbM、又は接触付番方式によるCDRである。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体のVHドメインは、配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含み、ただし、該VHドメインのN-末端アミノ酸はEであり、該VHドメインのC-末端アミノ酸はSである。さらに又は代わりに、いくつかの実施態様において、抗CD47抗体のVLドメインは、配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、配列番号1を含むVH及び配列番号2を含むVLを含む。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、配列番号3のアミノ酸を含む重鎖及び配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む全長抗体である。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、配列番号55のアミノ酸を含む重鎖及び配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む全長抗体である。
いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、少なくとも2つの異なる種由来のCD47に結合する(例えば、それと交差反応する)。いくつかの実施態様において、例えば、抗CD47抗体(又は抗体変異体)は、hCD47タンパク質(又はその細胞外ドメイン)及び非ヒト霊長類(例えば、カニクイザル又はアカゲザルサル)由来のCD47(又はその細胞外ドメイン)に結合する。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、ヒトCD47に完全に特異的であってもよく、かつ種又は他のタイプの非ヒト交差反応性を示さなくてもよい。
hCD47に特異的に結合する抗CD47抗体は、上で定義されている様々なタイプの抗体のいずれかであり得るが、ある実施態様において、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施態様において、抗CD47は、ヒト化抗体であるか、又はヒト抗体定常ドメイン(例えば、ヒトFcドメイン、例えば、ヒトIgG Fcドメイン、例えば、ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、もしくはヒトIgG4 Fcドメイン)を含む。いくつかの実施態様において、本開示の抗体は、キメラ抗体である。例えば、米国特許第4,816,567号及びMorrisonらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)を参照されたい。いくつかの実施態様において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、ニワトリ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えば、サルに由来する可変領域)及びヒト定常領域を含む。いくつかの実施態様において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のクラス又はサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
いくつかの実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低下させると同時に、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持するようにヒト化することができる。通常、ヒト化抗体は、HVR、例えば、CDR(又はその部分)が非ヒト抗体(例えば、ニワトリ抗体)に由来し、かつFR(又はその部分)がヒト抗体配列に由来する1以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復し又は向上させるために、非ヒト抗体(例えば、HVR又はCDR残基が由来している抗体)由来の対応する残基と置換される。ヒト化抗体及びそれを作製する方法は、例えば、Almagro及びFranssonの文献、Front. Biosci. 13:1619-1633(2008)に概説されている。
ヒト化に有用なヒトフレームワーク領域としては、「最良適合」法を用いて選択されたフレームワーク領域;軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域;ヒト体細胞突然変異型フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域;及びFRライブラリーのスクリーニングによって得られるフレームワーク領域:が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Simsらの文献 J. Immunol. 151:2296(1993) ; Carterらの文献 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285(1992); Prestaらの文献 J. Immunol., 151:2623(1993); Almagro及びFranssonの文献、Front. Biosci. 13:1619-1633(2008);並びにBacaらの文献、J. Biol. Chem. 272:10678-10684(1997)を参照されたい。
いくつかの実施態様において、本開示の抗CD47抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を用いて産生することができる。いくつかの実施態様において、ヒト抗体は、非ヒト動物、例えば、本明細書に記載される遺伝子改変ニワトリ(例えば、米国特許第8,592,644号;及び第9,380,769号を参照)並びに/又はマウスによって産生される。ヒト抗体は、Lonbergの文献、Curr. Opin. Immunol. 20:450-459(2008)に大まかに記載されている。
いくつかの実施態様において、本開示の抗CD47抗体は、限定するものではないが、Fab、F(ab')2、Fab'-SH、Fv、もしくはscFv断片、又は単一ドメイン、単一重鎖、もしくは単一軽鎖抗体を含む、抗体断片である。抗体断片は、例えば、酵素的消化によるか又は組換え技法によって作製することができる。いくつかの実施態様において、無傷抗体のタンパク質分解的消化は、例えば、Morimotoらの文献、Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)及びBrennanらの文献、Science, 229:81(1985)に記載されているような抗体断片を作製するために使用される。いくつかの実施態様において、抗体断片は、組換え宿主細胞によって産生される。例えば、Fab、Fv、及びScFv抗体断片は、大腸菌(E.coli)によって発現され、そこから分泌される。抗体断片は、代わりに、抗体ファージライブラリーから単離することができる。
Fab'-SH断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングして、F(ab')2断片を形成させることができる。Carterらの文献、Bio/Technology 10:163-167(1992)を参照されたい。F(ab')2断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離することもできる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が増大したFab及びF(ab')2断片は、米国特許第5,869,046号に記載されている。
いくつかの実施態様において、抗体は、単鎖Fv断片(scFv)である。WO 93/16185号並びに米国特許第5,571,894号及び第5,587,458号を参照されたい。scFv融合タンパク質を、scFvのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかにおけるエフェクタータンパク質の融合体を産生するように構築することができる。抗体断片はまた、例えば、米国特許第5,641,870号に記載されているような「線状抗体」であってもよい。そのような線状抗体は、単一特異性又は二重特異性であり得る。
いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、細胞の表面に発現されたhCD47を特異的に認識する(例えば、それに結合する)。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、癌細胞の表面に発現されたhCD47を特異的に認識する。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、限定されないが、例えば、SK-OV-3、Toledo、K562、HCC827、Jurkat、U937、TF-1、Raji、SU-DHL-4、MDA-MB-231、A375、及びSK-MES-1細胞株を含む、癌細胞株の細胞表面に発現されたhCD47を特異的に認識する。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、対象の癌細胞株(例えば、肺癌細胞、卵巣癌細胞、結腸直腸癌細胞、膵癌細胞、肉腫癌細胞、頭頸部癌細胞、胃癌細胞、腎臓癌細胞、皮膚癌細胞、及び非ホジキンリンパ腫細胞)の細胞表面に発現されたhCD47を特異的に認識する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)とhCD47(例えば、細胞の表面に発現されたhCD47)との結合は、hCD47とシグナル調節タンパク質α(SIRPα)、例えば、ヒトSIRPα(「hSIRPα」)との相互作用を妨げる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)と癌細胞の表面に発現されたhCD47との結合は、癌細胞のマクロファージ媒介性食作用を促進する。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片は、血液細胞の表面に発現したhCD47に結合しない。いくつかの実施態様において、対象(例えば、ヒト又は非ヒト霊長類)への本明細書に記載される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)の投与は、顕著な血液毒性(例えば、貧血、血球減少症、もしくは赤血球凝集)又は対象の赤血球の顕著な枯渇を誘導することも、引き起こすこともない。いくつかの実施態様において、対象(例えば、ヒト又は非ヒト霊長類)への本明細書に記載される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)の投与は、対象における血液毒性(例えば、貧血、血球減少症、もしくは赤血球凝集)又は対象の赤血球の枯渇を誘導することも、引き起こすこともない。
(抗CD47抗体をコードする核酸)
本明細書に記載される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)をコードする核酸分子も企図される。いくつかの実施態様において、提供されるのは、本明細書に記載される抗CD47抗体のいずれかを含む、抗CD47抗体をコードする核酸(又は核酸のセット)である。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)をコードする核酸配列(例えば、DNA配列)は、例えば、製造過程における抗CD47抗体の産生収率を増大させる目的で核酸から転写されるRNAの翻訳及び安定性を最大化するように最適化(例えば、さらに最適化)されている。例示的な最適化としては、例えば、反復配列の除去、キラーモチーフ及びスプライス部位の除去、GC含有量(グアニン-シトシン含有量)の低下、mRNA二次構造もしくは不安定モチーフを形成し得る配列の除去/交換、並びに/又は所与の宿主細胞(例えば、CHO細胞、例えば、CHO-K1細胞)におけるコドン利用の最適化が挙げられるが、これらに限定されない。コドン最適化は、宿主生物のコドンバイアス及びtRNA頻度を適応させることにより、遺伝子発現を向上させ、対象となる核酸の翻訳効率を増大させるために使用されるプロセスである。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗CD47抗体をコードする核酸は、コドン最適化されており、例えば、CHO細胞(例えば、CHO-K1細胞)における発現用にコドン最適化されている。
本明細書に記載される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)をコードする核酸分子も企図される。いくつかの実施態様において、提供されるのは、本明細書に記載される抗CD47抗体のいずれかを含む、抗CD47抗体をコードする核酸(又は核酸のセット)である。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)をコードする核酸配列(例えば、DNA配列)は、例えば、製造過程における抗CD47抗体の産生収率を増大させる目的で核酸から転写されるRNAの翻訳及び安定性を最大化するように最適化(例えば、さらに最適化)されている。例示的な最適化としては、例えば、反復配列の除去、キラーモチーフ及びスプライス部位の除去、GC含有量(グアニン-シトシン含有量)の低下、mRNA二次構造もしくは不安定モチーフを形成し得る配列の除去/交換、並びに/又は所与の宿主細胞(例えば、CHO細胞、例えば、CHO-K1細胞)におけるコドン利用の最適化が挙げられるが、これらに限定されない。コドン最適化は、宿主生物のコドンバイアス及びtRNA頻度を適応させることにより、遺伝子発現を向上させ、対象となる核酸の翻訳効率を増大させるために使用されるプロセスである。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗CD47抗体をコードする核酸は、コドン最適化されており、例えば、CHO細胞(例えば、CHO-K1細胞)における発現用にコドン最適化されている。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗CD47抗体のVHドメインをコードする核酸は、配列番号45と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み、ただし、該核酸によってコードされるVHドメインのアミノ酸配列は、N-末端アミノE及びC-末端Sを含む。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗CD47抗体のVLドメインをコードする核酸は、配列番号46と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。配列番号45及び46は、以下で提供されている:
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗CD47抗体をコードする核酸(又は核酸のセット)は、ペプチドタグ(例えば、タンパク質精製タグ、例えば、His-タグ、HAタグ)をコードする核酸配列をさらに含むことができる。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)をコードする核酸(又は核酸のセット)は、リーダー配列を含む。いくつかの実施態様において、提供されるのは、少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本明細書に記載される抗CD47抗体をコードする核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸である。
また提供されるのは、本明細書に記載される核酸が挿入されるベクターである。
簡潔にまとめると、抗CD47抗体(又はその抗原結合断片)をコードする天然又は合成核酸による抗CD47抗体(又はその抗原結合断片)の発現は、該核酸が、例えば、プロモーター(例えば、構成的で調節可能な組織特異的プロモーター)を含む5'及び3'調節エレメント並びに3'非翻訳領域(UTR)に機能的に連結されるように、該核酸を適切な発現ベクターに挿入することにより達成することができる。ベクターは、真核宿主細胞における複製及び組み込みに好適であり得る。典型的なクローニング及び発現ベクターは、所望の核酸配列の発現の調節に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びにプロモーターを含有する。
核酸は、いくつかのタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含む、ベクターにクローニングすることができる。特に対象となるベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作製ベクター、及びシークエンシングベクターが挙げられる。
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供することができる。ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrookらの文献(2001、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、並びに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも1つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1以上の選択可能マーカーを含有する(例えば、WO 01/96584号; WO 01/29058号;及び米国特許第6,326,193号を参照)。
いくつかのウイルスベースのシステムが哺乳動物への遺伝子転移用に開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための好都合なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子を、当技術分野で公知の技法を用いてベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。その後、組換えウイルスを単離し、対象の細胞にインビボ又はエクスビボのいずれかで送達することができる。いくつかのレトロウイルス系が当技術分野で公知である。いくつかの実施態様において、アデノウイルスベクターが使用される。いくつかのアデノウイルスベクターが当技術分野で公知である。いくつかの実施態様において、レンチウイルスベクターが使用される。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期にわたる安定な組み込み及び娘細胞におけるその増幅を可能にするので、長期間の遺伝子転移を達成するための好適なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞に導入することができるという点において、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターに優る追加の利点を有する。これらは、低免疫原性という追加の利点も有する。
さらなるプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。通常、これらは、開始部位の上流30~110塩基対(bp)の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが最近示された。プロモーターエレメント間の間隔は、融通が利くことが多く、そのため、エレメントが互いに対して逆転又は移動した場合、プロモーター機能は保存される。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターでは、活性が減少し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を50bpまで広げることができる。
好適なプロモーターの1つの例は、最初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに機能的に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長成長因子-1α(EF-1α)である。しかしながら、限定されないが、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)長末端反復(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、ニワトリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターを含む、他の構成的プロモーター配列を使用することもできる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が望ましいときに、それが機能的に連結されているポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、又は発現が望ましくないときに発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)をコードする核酸の発現は誘導性である。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)をコードする核酸は、当技術分野で公知の任意の誘導性プロモーターを含む誘導性プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗CD47抗体をコードする核酸は、例えば、抗体の精製又は検出を容易にするために、エピトープタグをコードするように改変されている。例示的なエピトープタグとしては、例えば、6×His(His-タグ又はヘキサヒスチジンタグとしても知られる)、FLAG、HA、Myc、V5、GFP(緑色蛍光タンパク質、例えば、増強型緑色蛍光タンパク質又はEGFP)、GST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)、β-GAL(β-ガラクトシダーゼ)、ルシフェラーゼ、MBP(マルトース結合タンパク質)、RFP(赤色蛍光タンパク質)、及びVSV-G(水疱性口内炎ウイルス 糖タンパク質)が挙げられるが、これらに限定されない。
(抗体産生の方法)
本開示の抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、当技術分野で公知の任意の手段によって産生することができる。抗体産生のための例示的な技法が以下に記載されているが;これらの例示的な技法は、説明目的でのみ提供されており、限定することを意図するものではない。さらに、本明細書に記載される抗体とともに使用することが企図される例示的な抗体特性がさらに記載されている。
本開示の抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、当技術分野で公知の任意の手段によって産生することができる。抗体産生のための例示的な技法が以下に記載されているが;これらの例示的な技法は、説明目的でのみ提供されており、限定することを意図するものではない。さらに、本明細書に記載される抗体とともに使用することが企図される例示的な抗体特性がさらに記載されている。
抗原を調製するために、抗原を天然源から精製もしくは別の方法で取得することができるか、又は抗原を組換え技法を用いて発現させることができる。いくつかの実施態様において、抗原を可溶性タンパク質として使用することができる。いくつかの実施態様において、抗原を、例えば、その免疫原性を増大させるために、別のポリペプチド又は他の部分にコンジュゲートすることができる。例えば、本明細書に記載される抗原をFc領域とカップリングさせることができる。いくつかの実施態様において、その細胞表面に抗原を発現する細胞を抗原として使用することができる。
ポリクローナル抗体は、抗原及びアジュバントの複数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射によって動物で作製することができる。例えば、ニワトリ免疫の説明が本明細書に記載されている。いくつかの実施態様において、抗原は、二機能性又は誘導体化剤を用いて、免疫原性タンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターとコンジュゲートされる。ニワトリの免疫のための例示的な方法が本明細書に提供されている。種々の他の生物、例えば、哺乳動物に好適な関連方法が当技術分野で周知である。
本明細書に記載されているように、モノクローナル抗体は、種々の方法によって産生することができる。いくつかの実施態様において、本開示のモノクローナル抗体は、Kohlerらの文献、Nature, 256:495(1975)によって最初に記載され、Hongoらの文献、Hybridoma, 14(3): 253-260(1995); Harlowらの文献、抗体:実験室マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988);及びHammerlingらの文献、所収:モノクローナル抗体及びT細胞ハイブリドーマ(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas) 563-681(Elsevier, N.Y., 1981)にさらに記載された、ハイブリドーマ法を用いて作製される。ヒトハイブリドーマ技術(Trioma技術)は、Vollmers及びBrandleinの文献、Histology and Histopathology, 20(3):927-937(2005)並びにVollmers及びBrandleinの文献、Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91(2005)に記載されている。ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、例えば、インビトロ結合アッセイ、免疫沈降、ELISA、RIAなどによって、対象となる抗体の存在についてスクリーニングすることができ;結合親和性は、例えば、スキャッチャード解析によって決定することができる。所望の結合特性を有する抗体を産生するハイブリドーマをサブクローニングし、既知の培養技法を用いて増殖させること、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させること、などができる。
いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイライブラリーなどのライブラリー法を用いて作製される。例えば、Hoogenboomらの文献、Methods in Molecular Biology 178:1-37所収(O'Brienら編、Human Press, Totowa, NJ, 2001)を参照されたい。いくつかの実施態様において、VH及びVL遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってクローニングし、ファージライブラリー中でランダムに組み換え、その後、これを、例えば、Winterらの文献、Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載されているように、抗原結合ファージについてスクリーニングする。ファージは、通常、単鎖Fv(scFv)断片としてか、又はFab断片としてかのいずれかで抗体断片を提示する。或いは、ネイティブレパートリーを(例えば、ヒトから)クローニングして、Griffithsらの文献、EMBO J, 12: 725-734(1993)によって記載されているように免疫を伴わずに、広範な非自己抗原及び同じく自己抗原に対する単一の抗体源を提供することができる。最後に、ネイティブライブラリーは、Hoogenboom及びWinterの文献、J. Mol. Biol., 227: 381-388(1992)によって記載されているように、再配列されていないV-遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングし、ランダムな配列を含有するPCRプライマーを用いて、可変性の高いCDR3領域をコードすること及びインビトロで再配列を達成することにより、合成的に作製することもできる。
抗体は、組換え法を用いて産生することができる。抗抗原抗体の組換え産生のために、抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニング(DNAの増幅)のための又は発現のための複製可能ベクターに挿入する。抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)、容易に単離及びシークエンシングすることができる。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素としては、通常、以下のもの:シグナル配列、複製起点、1以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの1つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の抗体は、成熟タンパク質又はポリペプチドのN-末端に特異的な切断部位を有する異種ポリペプチド、例えば、シグナル配列又は他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換え産生することができる。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる(例えば、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものであることができる。ネイティブな抗体シグナル配列を認識及びプロセシングしない原核宿主細胞のために、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、又は熱安定性エンテロトキシンIIリーダーから選択される原核シグナル配列によって置換される。酵母分泌のために、ネイティブなシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、a因子リーダー(サッカロミセス属及びクルイベロマイセス(Kluyveromyces) α-因子リーダーを含む)、又は酸ホスファターゼリーダー、C.アルビカンス(C. albicans)グルコアミラーゼリーダーなどによって置換され得る。哺乳動物発現では、哺乳動物シグナル配列及びウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルが利用可能である。
発現ベクターとクローニングベクターは両方とも、該ベクターが1以上の選択された宿主細胞で複製するのを可能にする、例えば、該ベクターが宿主染色体DNAとは無関係に複製するのを可能にする核酸配列を含有する。この配列は、複製起点又は自律複製配列を含むことができる。そのような配列は、種々の細菌、酵母、及びウイルスについて周知である。通常、複製起点構成要素は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない(SV40起点は、初期プロモーターを含有するので使用され得る)。
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択遺伝子又は選択可能マーカーを含有することができる。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、(b)栄養要求性欠損を補完するか、又は(c)複合培地から利用できない重要な栄養を供給するタンパク質をコードする。優性選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンという薬物を使用する。哺乳動物用の好適な選択可能マーカーの別の例は、抗体をコードする核酸を取り込む能力がある細胞の特定を可能にするもの、例えば、DHFR、グルタミンシンテターゼ(GS)、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン-I及び-II、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。例えば、DHFR遺伝子で形質転換された内在性DHFR活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株は、形質転換体をDHFRの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート(Mtx)を含有する培養培地中で培養することにより特定される。
或いは、対象となる抗体、野生型DHFR遺伝子、及び別の選択可能マーカー、例えば、アミノグリコシド 3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)をコードするDNA配列で形質転換又は共形質転換された宿主細胞(特に、内在性DHFRを含有する野生型宿主)は、選択可能マーカー、例えば、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、又はG418の選択剤を含有する培地中での細胞増殖によって選択することができる。
発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、かつ抗体をコードする核酸に機能的に連結されているプロモーターを含有する。原核宿主とともに使用するのに好適なプロモーターとしては、phoAプロモーター、β-ラクタマーゼ、及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン(trp)プロモーター系、並びにハイブリッドプロモーター、例えば、tacプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターが好適である。プロモーター配列は、真核生物について公知である。酵母プロモーターは、当技術分野で周知であり、増殖条件によって調節される誘導性プロモーター/エンハンサーを含む。ほぼ全ての真核遺伝子は、転写が開始される部位から約25~30塩基上流に位置するATリッチな領域を有する。例としては、3-ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、ウイルスのゲノムから得られたプロモーターによって制御することができる。SV40ウイルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルス複製起点も含有するSV40制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、HindIII E制限断片として好都合に得られる。或いは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
高等真核生物による本発明の抗体をコードするDNAの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増大する。哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトタンパク質、及びインスリン)由来の多くのエンハンサー配列が現在公知である。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。
真核宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)で使用される発現ベクターは、転写の終結のために及びmRNAの安定化のために必要な配列も含有する。
本明細書におけるベクター中のDNAをクローニング又は発現させるための好適な宿主細胞は、上記の原核、酵母、又は高等真核細胞である。この目的のための好適な原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、例えば、エシェリキア属(Escherichia)、例えば、大腸菌、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルウィニア属(Erwinia)、クレブシエラ属、プロテウス属(Proteus)、サルモネラ属、例えば、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、セラチア属、例えば、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescans)、及び赤痢菌などが挙げられる。原核生物の他に、糸状菌又は酵母などの真核微生物が、抗体をコードするベクターのための好適なクローニング又は発現宿主である。出芽酵母(Saccharomyce cerevisiae)、又は一般的なパン酵母は、下級真核宿主微生物の中で最も一般的に使用される。グリコシル化経路が「ヒト化」されており、結果として、部分的に又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす特定の真菌及び酵母株を使用してもよい。例えば、Liらの文献、Nat. Biotech. 24:210-215(2006)を参照されたい。
綿花、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、ウキクサ(ウキクサ科(Leninaceae))、アルファルファ(M.トルランカチュラ(M.truncatula))、及びタバコの植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。
グリコシル化抗体の発現のための好適な宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、並びにツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)(蚊)、ヒトスジシマカ(Aedes albopictus)(蚊)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)(ミバエ)、及びカイコ(Bombyx mori)などの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が特定されている。
脊椎動物細胞を宿主として使用することができ、培養(組織培養)下での脊椎動物細胞の増殖は、ルーチンの手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7、ATCC CRL 1651);ヒト胎児腎臓株(懸濁培養下での増殖のためにサブクローニングされた293又は293細胞、Grahamらの文献、J. Gen Virol. 36:59(1977));ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL 10);マウスセルトリ細胞(TM4、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251(1980));サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1587);ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2);イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL 34);バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75);ヒト肝臓細胞(Hep G2、HB 8065);マウス乳腺腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51); TRI細胞(Matherらの文献、Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982)); MRC 5細胞; FS4細胞;及びヒト肝癌株(Hep G2)である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、DHFR- CHO細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(Urlaubらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980));並びにNS0及びSp2/0などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki及びWuの文献、Methods in Molecular Biology、第248巻(B. K. C. Lo編、Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268を参照されたい。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、CHO-K1細胞である。CHO-K1細胞株は、CHO細胞株のサブクローンである(例えば、www(dot)phe-culturecollections(dot)org(dot)uk/media/128263/chok1-cell-line-profile(dot)pdf及びweb(dot)expasy(dot)org/cellosaurus/CVCL_0214を参照。
本開示の宿主細胞(例えば、CHO-K1細胞)は、種々の培地中で培養することができる。ハムF10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、及びダルベッコ改変イーグル培地((DMEM)、Sigma)などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに好適である。さらに、Hamらの文献、Meth. Enz. 58:44(1979)、Barnesらの文献、Anal. Biochem. 102:255(1980)、米国特許第4,767,704号;第4,657,866号;第4,927,762号;第4,560,655号;もしくは第5,122,469号; WO 90/03430号; WO 87/00195号;又は米国特許再発行第30,985号に記載されている培地はいずれも、宿主細胞用の培養培地として使用することができる。これらの培地はいずれも、必要に応じて、ホルモン並びに/又は他の成長因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮成長因子)、塩(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びホスフェート)、バッファー(例えば、HEPES)、ヌクレオチド(例えば、アデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCIN(商標)薬物)、微量元素(通常はマイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される)、並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補充することができる。任意の他の必要な補助物質を当業者に公知の適切な濃度で含めることもできる。培養条件、例えば、温度、pHなどは、発現のために選択された宿主細胞とともに以前に使用されたものであり、当業者には明白である。
組換え技法を使用する場合、抗体を、細胞内で産生するか、細胞周辺腔で産生するか、又は培地中に直接分泌させることができる。抗体を細胞内で産生する場合、第一段階として、宿主細胞又は溶解断片のいずれかの微粒子破片を、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去する。Carterらの文献、Bio/Technology 10:163-167(1992)には、大腸菌の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを用いて精製することができ、親和性クロマトグラフィーは、典型的に好ましい精製工程のうちの1つである。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される抗CD47抗体は、精製を容易にするためのエピトープタグ(例えば、切断可能なリンカーを介して抗体に付加されたタグ)を含む。例示的なエピトープタグとして、例えば、6×His(His-タグ又はヘキサヒスチジンタグとしても知られる)、FLAG、HA、Myc、V5、GFP(緑色蛍光タンパク質、例えば、増強型緑色蛍光タンパク質又はEGFP)、GST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)、β-GAL(β-ガラクトシダーゼ)、ルシフェラーゼ、MBP(マルトース結合タンパク質)、RFP(赤色蛍光タンパク質)、及びVSV-G(水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
したがって、いくつかの実施態様において、提供されるのは、(a)(1)そのN-末端のグルタミン酸残基(E);(2)
を含むCDR-H1;(3)
を含むCDR-H2;(4)
を含むCDR-H3;及び(5)そのC-末端のセリン(S)を含む重鎖可変(VH)ドメイン;並びに(b)(1)
を含むCDR-L1;(2)
を含むCDR-L2;及び(3)
を含むCDR-L3を含む軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)を作製する方法であって、a)抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)をコードする核酸を含む宿主細胞(例えば、CHO細胞)を該抗体(又は断片)の発現を引き起こすのに有効な条件下で培養すること;及びb)該宿主細胞によって発現された抗CD47抗体(又はその断片)を回収すること:を含む、方法である。いくつかの実施態様において、該方法は、c)抗体を精製する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体を精製することは、少なくとも1つのクロマトグラフィー工程、例えば、プロテインA又はプロテインLクロマトグラフィー工程を含む。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、哺乳動物である。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、CHO細胞、例えば、CHO-K1細胞である。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、抗CD47抗体をコードする1以上のベクターを含む。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、抗CD47抗体をコードする核酸でトランスフェクトされている(例えば、一過性にトランスフェクトされているか又は安定にトランスフェクトされている)。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体を作製する方法は、製造規模の生産プロセス(例えば、発酵プロセス)である。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体を作製する「製造規模の」生産プロセス(例えば、発酵プロセス)は、約400L~約80,000L(例えば、約400L~約25,000L、例えば、約4,000L、6,000L、8,000L、10,000L、12,000L、14,000L、又は16,000Lのいずれか1つ)の範囲の培養容積で宿主細胞を培養し及び増殖させることを包む。
(グリコシル化変異体)
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、該抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)がグリコシル化される度合いを増大又は減少させるために改変される。抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)に対するグリコシル化部位の付加又は欠失は、1以上のグリコシル化部位が生成又は除去されるように、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)又はそのポリペプチド部分のアミノ酸配列を改変することにより好都合に達成することができる。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、該抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)がグリコシル化される度合いを増大又は減少させるために改変される。抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)に対するグリコシル化部位の付加又は欠失は、1以上のグリコシル化部位が生成又は除去されるように、抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)又はそのポリペプチド部分のアミノ酸配列を改変することにより好都合に達成することができる。
抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)がFc領域を含む場合、それに付着した炭水化物を改変することができる。哺乳動物によって産生されるネイティブ抗体は、典型的には、Fc領域のCH2ドメインのAsn297へのN-結合によって通常付着している分岐状のバイアンテナ型オリゴ糖を含む。例えば、Wrightらの文献、TIBTECH 15:26-32(1997)を参照されたい。オリゴ糖としては、様々な炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、及びシアル酸、並びにバイアンテナ型オリゴ糖構造の「幹」のGlcNAcに付着したフコースを挙げることができる。いくつかの実施態様において、本明細書の抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する抗CD47抗体変異体(又はFc領域を含むその免疫学的活性断片)を生成させるために行うことができる。
FcのCH2ドメインに付着したN-グリカンは、不均一である。CHO細胞で作製される抗体又はFc融合タンパク質は、フコシルトランスフェラーゼ活性によってフコシル化される。Shoji-Hosakaらの文献、J. Biochem. 2006, 140:777-83を参照されたい。通常、わずかなパーセンテージの天然アフコシル化IgGをヒト血清中で検出することができる。FcのN-グリコシル化は、FcγRへの結合に重要であり; N-グリカンのアフコシル化は、FcγRIIIaのFcの結合能力を増大させる。FcγRIIIa結合の増大は、細胞傷害性が望ましい特定の抗体治療用途において有利であり得るADCCを増強させることができる。
いくつかの実施態様において、エフェクター機能の増強は、Fc媒介性細胞傷害性が望ましくない場合、有害であり得る。いくつかの実施態様において、Fc断片又はCH2ドメインは、グリコシル化されない。いくつかの実施態様において、CH2ドメイン中のN-グリコシル化部位は、グリコシル化を妨げるために突然変異させられる。
いくつかの実施態様において、Fc領域を含む抗CD47抗体変異体(又はその免疫学的活性断片)が提供され、ここで、該Fc領域に付着した炭水化物構造は、フコースが低下しているか又はフコースを欠如しており、このことは、ADCC機能を向上させることができる。
(免疫コンジュゲート及び共有結合的修飾)
本発明は、第二の部分にコンジュゲートされた抗体を含む免疫コンジュゲートに関する。いくつかの実施態様において、第二の部分は、細胞毒性剤、例えば、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性のある毒素、又はこれらの断片)、或いは放射性同位体(すなわち、放射性コンジュゲート)である。
本発明は、第二の部分にコンジュゲートされた抗体を含む免疫コンジュゲートに関する。いくつかの実施態様において、第二の部分は、細胞毒性剤、例えば、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性のある毒素、又はこれらの断片)、或いは放射性同位体(すなわち、放射性コンジュゲート)である。
使用することができる酵素活性のある毒素及びその断片としては、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖(緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ダイアンシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、ツルレイシ(momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、並びにトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種が放射性コンジュゲート抗体の産生に利用可能である。例としては、212Bi、131I、131In、90Y、and 186Reが挙げられる。そのような免疫コンジュゲートの作製において有用な例示的な化学療法剤は、本明細書中の別所に記載されている。
ある実施態様において、本明細書に提供されるヒト化抗CD47抗体(又はその抗原結合断片)は、メイタンシン、メイタンシノイド、又はカリケアマイシンにコンジュゲートされる。ある実施態様において、本明細書に提供されるヒト化抗CD47抗体(又はその抗原結合断片)は、メイタンシノイドDM1にコンジュゲートされる。
抗体及び細胞毒性剤のコンジュゲートは、種々の二機能性タンパク質-カップリング剤、例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二機能性誘導体(例えば、アジプイミド酸ジメチルHCl)、活性エステル(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビスジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン 2,6-ジイソシアネート)、及びビス-活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaらの文献、Science, 238: 1098(1987)に記載されているように調製することができる。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX-DTPA)は、放射性ヌクレオチドと抗体とのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。WO94/11026号を参照されたい。
別の実施態様において、抗体は、腫瘍プレターゲッティングで使用するための「受容体」(例えば、ストレプトアビジン)にコンジュゲートすることができ、この腫瘍プレターゲッティングでは、抗体-受容体コンジュゲートが患者に投与され、その後、未結合のコンジュゲートが洗浄剤を用いて循環から除去され、その後、細胞毒性剤(例えば、放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートされている「リガンド」(例えば、アビジン)が投与される。
また提供されるのは、少なくとも1つの他の抗体に共有結合された本明細書に記載されるヒト化抗CD47抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体である。ヘテロコンジュゲート抗体は、例えば、望ましくない細胞への免疫系細胞のターゲッティングのために(米国特許第4,676,980号)、及びHIV感染の治療のために提案されている。本明細書に記載されるヒト化抗CD47抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体は、架橋剤を伴う方法を含む、合成タンパク質化学における既知の方法を用いて、インビトロで調製することができる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成させることにより構築することができる。この目的のための試薬の好適な例としては、イミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチリミデート、並びに例えば、米国特許第4,676,980号に開示されているものが挙げられる。
また提供されるのは、少なくとも1つの共有結合的修飾を含むヒト化抗CD47抗体である。あるタイプの共有結合的修飾は、ヒト化抗CD47の標的とされるアミノ酸残基を抗体の選択された側鎖又はN-もしくはC-末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることを含む。一般に使用される架橋剤としては、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、4-アジドサリチル酸を有するエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジル-プロピオネート)などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタンなどの二官能性マレイミド、及びメチル-3-[(p-アジドフェニル)-ジチオ]プロピオイミデートなどの薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。
他の修飾としては、それぞれ、グルタミニル及びアスパラギニル残基の対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E.Creightonの文献、タンパク質:構造及び分子特性(Proteins: Structure and Molecular Properties)、W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)]、N-末端アミンのアセチル化、並びに任意のC-末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
別のタイプの共有結合的修飾は、本明細書に提供されるヒト化抗CD47抗体(又はその抗原結合断片)を、米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号又は第4,179,337号に示されているような方法で、種々の非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうちの1つに架橋することを含む。
(システイン改変型変異体)
いくつかの実施態様において、1以上のアミノ酸残基がシステイン残基と置換されているシステイン改変型抗CD47抗体を作出することが望ましい場合がある。いくつかの実施態様において、置換された残基は、抗CD47抗体の接近可能な部位に生じる。これらの残基をシステインと置換することにより、反応性チオール基が、それによって、抗CD47抗体の接近可能な部位に配置され、抗CD47抗体を、他の部分、例えば、薬物部分又はリンカー-薬物部分にコンジュゲートして、本明細書にさらに記載されているような抗CD47免疫コンジュゲートを作出するために使用されることができる。システイン改変型抗CD47抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されている通りに作製することができる。
いくつかの実施態様において、1以上のアミノ酸残基がシステイン残基と置換されているシステイン改変型抗CD47抗体を作出することが望ましい場合がある。いくつかの実施態様において、置換された残基は、抗CD47抗体の接近可能な部位に生じる。これらの残基をシステインと置換することにより、反応性チオール基が、それによって、抗CD47抗体の接近可能な部位に配置され、抗CD47抗体を、他の部分、例えば、薬物部分又はリンカー-薬物部分にコンジュゲートして、本明細書にさらに記載されているような抗CD47免疫コンジュゲートを作出するために使用されることができる。システイン改変型抗CD47抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されている通りに作製することができる。
(エフェクター機能改変)
例えば、癌を治療する際の抗体の有効性を増強するために、本明細書に提供される抗CD47抗体をエフェクター機能に関して修飾することが望ましい場合がある。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このようにして作製されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力並びに/又は増大した補体媒介性細胞殺傷及び抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を有することができる。Caronらの文献、J. Exp. Med., 176: 1191-1195(1992)及びShapesの文献、J. Immunol., 148: 2918-2922(1992)を参照されたい。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、Wolffらの文献、Cancer Research, 53: 2560-2565(1993)に記載されているように、ヘテロ二機能性クロスリンカーを用いて調製することもできる。或いは、抗体は、通常のFc領域を含むように改変することができ、それにより、増強された補体溶解及びADCC能力を有することができる。Stevensonらの文献、Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230(1989)を参照されたい。
例えば、癌を治療する際の抗体の有効性を増強するために、本明細書に提供される抗CD47抗体をエフェクター機能に関して修飾することが望ましい場合がある。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このようにして作製されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力並びに/又は増大した補体媒介性細胞殺傷及び抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を有することができる。Caronらの文献、J. Exp. Med., 176: 1191-1195(1992)及びShapesの文献、J. Immunol., 148: 2918-2922(1992)を参照されたい。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、Wolffらの文献、Cancer Research, 53: 2560-2565(1993)に記載されているように、ヘテロ二機能性クロスリンカーを用いて調製することもできる。或いは、抗体は、通常のFc領域を含むように改変することができ、それにより、増強された補体溶解及びADCC能力を有することができる。Stevensonらの文献、Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230(1989)を参照されたい。
Fc領域配列に突然変異又は改変を加えて、FcR結合(例えば、FcγR、FcRnへの結合)を向上させることができる。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗CD47抗体は、ネイティブなIgG又は親抗体と比較して、少なくとも1つの改変されたエフェクター機能、例えば、改変されたADCC、CDC、及び/又はFcRn結合を含む。いくつかの実施態様において、突然変異又は改変を含む抗体のエフェクター機能は、親抗体と比べて増大している。いくつかの実施態様において、突然変異又は改変を含む抗体のエフェクター機能は、親抗体と比べて減少している。いくつかの有用で具体的な突然変異の例は、例えば、Shields, RLらの文献(2001) JBC 276(6)6591-6604; Presta, L.G.の文献(2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487-490;及びWO 00/42072号に記載されている。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗CD47抗体は、Fc領域の少なくとも1つの位置にFc受容体突然変異、例えば、置換突然変異を含む。そのような置換突然変異を、限定されないが、例えば、238、239、246、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438、又は439(ここで、Fc領域中の残基の付番は、EU付番システムによるものである)を含む、Fcドメイン中のアミノ酸位置に加えることができる。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、2つのヒトIgG4 Fcドメイン単量体を含むヒトIgG4 Fc領域を含み、ここで、各々の単量体は、S228P置換(ここで、残基の付番は、EU付番システムによるものである)を含む。さらなる好適な突然変異は、当技術分野で周知である。例示的な突然変異は、例えば、米国特許第 7,332,581号に示されている。
(医薬製剤及びその投与)
本明細書に提供される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、それを必要としている対象(例えば、哺乳動物、例えば、ヒト)への投与に好適であるように、医薬として許容し得る担体又は賦形剤とともに製剤化することができる。抗体の好適な製剤は、所望の程度の純度を有する抗体(又はその免疫学的活性断片)を、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、最適な医薬として許容し得る担体、バッファー、賦形剤、又は安定化剤(レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第16版、Osol, A. Ed.(1980))と混合することにより得られる。医薬として許容し得る担体、賦形剤、又は安定化剤は、利用される投薬量及び濃度でレシピエントにとって無毒であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール;メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール; 3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物; EDTAなどのキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);並びに/又はTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤を含む。
本明細書に提供される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、それを必要としている対象(例えば、哺乳動物、例えば、ヒト)への投与に好適であるように、医薬として許容し得る担体又は賦形剤とともに製剤化することができる。抗体の好適な製剤は、所望の程度の純度を有する抗体(又はその免疫学的活性断片)を、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、最適な医薬として許容し得る担体、バッファー、賦形剤、又は安定化剤(レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第16版、Osol, A. Ed.(1980))と混合することにより得られる。医薬として許容し得る担体、賦形剤、又は安定化剤は、利用される投薬量及び濃度でレシピエントにとって無毒であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール;メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール; 3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物; EDTAなどのキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);並びに/又はTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤を含む。
本明細書に提供される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、免疫リポソームとして製剤化することもできる。該抗体を含有するリポソームは、例えば、Epsteinらの文献、PNAS USA, 82: 3688(1985); Hwangらの文献、PNAS USA, 77: 4030(1980);並びに米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されている、当技術分野で公知の方法によって調製される。循環時間が向上したリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって作製することができる。リポソームを規定の孔径のフィルターに通して押し出し、所望の直径を有するリポソームを生じさせる。本発明の抗体のFab'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martinetらの文献、J. Biol. Chem., 257: 286-288(1982)に記載されているようなリポソームにコンジュゲートすることができる。抗腫瘍剤、増殖抑制剤、又は化学療法剤(例えば、ドキソルビシン)も任意にリポソーム内に含まれる。Gabizonらの文献、J. National Cancer Inst., 81(19): 1484(1989)を参照されたい。
CD47抗体を含有する活性成分は、例えば、コアセルベーション技法によるか又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル)中又はマクロエマルジョン中のヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに封入することもできる。そのような技法は、レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第16版、Osol, A.編(1980)に開示されている。
本明細書に提供される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)を含む医薬製剤は、治療されている特定の適応症に必要な複数の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない補完的活性を有するものを含有することもできる。例えば、本明細書に提供される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)に加えて、抗腫瘍剤、増殖抑制剤、細胞毒性剤、又は化学療法剤を提供することが望ましい場合がある。そのような分子は、好適には、意図される目的のために有効である量で組合せで存在する。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患又は障害又は治療のタイプ、及び上で論じられている他の因子によって決まる。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患又は障害又は治療のタイプ、及び上で論じられている他の因子によって決まる。これらは、通常、同じ投薬量でかつ本明細書に記載される投与経路を用いて、又はこれまで利用された投薬量の約1~99%で使用される。
いくつかの実施態様において、本開示の抗体は、凍結乾燥されている。そのような凍結乾燥製剤を好適な希釈剤で高タンパク質濃度まで再構成し、再構成された製剤を哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することができる。
ある実施態様において、インビボ投与に使用されることになる医薬製剤は滅菌性である。これは、例えば、本明細書に提供される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)を含む溶液を滅菌濾過膜に通すことにより容易に達成される。
治療用量の本明細書に記載される抗CD47抗体は、少なくとも約0.01μg/kg体重、少なくとも約0.05μg/kg体重;少なくとも約0.1μg/kg体重、少なくとも約0.5μg/kg体重、少なくとも約1μg/kg体重、少なくとも約2.5μg/kg体重、少なくとも約5μg/kg体重、及び多くて約100μg/kg体重の用量として製剤化することができる。そのようなガイドラインは、例えば、抗体断片の使用において、又は抗体コンジュゲートの使用において、活性剤の分子量に応じて調整されることが当業者によって理解されるであろう。投薬量は、限局投与、例えば、鼻腔内、吸入などのために、又は全身投与、例えば、腹腔内(I.P.)、静脈内(I.V.)、皮内(I.D.)、筋肉内(I.M.)などのために変化させることもできる。
本発明のCD47抗体又は医薬組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内を含む任意の好適な手段によって投与することができる。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。さらに、抗CD47抗体は、好適には、特に、減少する用量の抗体を用いるパルス注入によって投与される。
疾患の予防又は治療のために、抗体の適切な投薬量は、上で定義されているような治療される疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的で投与されるかどうかということ、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の判断によって決まる。抗体は、好適には、一度に又は一連の治療にわたって患者に投与される。
(検出及び/又は診断の方法)
本明細書に提供される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、検出及び診断の方法において使用することができる。対象由来の試料(例えば、生物学的試料、例えば、組織試料)中のCD47(例えば、hCD47)タンパク質の存在及び/又は量は、本明細書に記載される抗体を用いて、定性的に及び/又は定量的に決定することができる。ある実施態様において、CD47タンパク質の量の存在及び/又は量を検出する方法は、生物学的試料を本明細書に記載される抗CD47抗体と、該抗体とCD47との結合が可能な条件下で接触させること、及び複合体が該抗体とCD47の間で形成されるかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボ法であり得る。一実施態様において、該方法は、抗CD47抗体を用いる療法に相応しい対象を選択するために使用される。いくつかの実施態様において、試料は、対象が抗CD47抗体で治療される前に、対象から得られる。いくつかの実施態様において、組織試料は、ホルマリン固定及びパラフィン包埋されたもの、保存されたもの、新鮮なもの、又は凍結されたものである。いくつかの実施態様において、第一の試料中のCD47の存在及び/又は量は、第二の試料中のCD47の存在及び/又は量と比較して増大又は上昇している。ある実施態様において、第一の試料中のCD47の存在及び/又は量は、第二の試料中のCD47の存在及び/又は量と比較して減少又は低下している。ある実施態様において、第二の試料は、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、又は対照組織である。試料中のCD47の存在及び/又は量は、その多くが当技術分野で公知であり、かつ当業者によって理解されるいくつかの方法によって解析することができ、該方法としては、免疫組織化学(IHC)、ウェスタンブロット解析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ELISA、ELIFA、蛍光活性化細胞選別(FACS)、MassARRAY、プロテオミクス、生化学的酵素活性アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。マルチプレックス化免疫アッセイ、例えば、Rules Based Medicine又はMeso Scale Discovery(「MSD」)から入手可能なものを使用することもできる。対象由来の試料(例えば、生物学的試料、例えば、組織試料)中のCD47(例えば、hCD47)タンパク質の存在及び/又は量の検出は、形態学的染色及び/又は蛍光インサイチュハイブリダイゼーションなどのさらなる技法と組み合わせて実施することができる。
本明細書に提供される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)は、検出及び診断の方法において使用することができる。対象由来の試料(例えば、生物学的試料、例えば、組織試料)中のCD47(例えば、hCD47)タンパク質の存在及び/又は量は、本明細書に記載される抗体を用いて、定性的に及び/又は定量的に決定することができる。ある実施態様において、CD47タンパク質の量の存在及び/又は量を検出する方法は、生物学的試料を本明細書に記載される抗CD47抗体と、該抗体とCD47との結合が可能な条件下で接触させること、及び複合体が該抗体とCD47の間で形成されるかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボ法であり得る。一実施態様において、該方法は、抗CD47抗体を用いる療法に相応しい対象を選択するために使用される。いくつかの実施態様において、試料は、対象が抗CD47抗体で治療される前に、対象から得られる。いくつかの実施態様において、組織試料は、ホルマリン固定及びパラフィン包埋されたもの、保存されたもの、新鮮なもの、又は凍結されたものである。いくつかの実施態様において、第一の試料中のCD47の存在及び/又は量は、第二の試料中のCD47の存在及び/又は量と比較して増大又は上昇している。ある実施態様において、第一の試料中のCD47の存在及び/又は量は、第二の試料中のCD47の存在及び/又は量と比較して減少又は低下している。ある実施態様において、第二の試料は、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、又は対照組織である。試料中のCD47の存在及び/又は量は、その多くが当技術分野で公知であり、かつ当業者によって理解されるいくつかの方法によって解析することができ、該方法としては、免疫組織化学(IHC)、ウェスタンブロット解析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ELISA、ELIFA、蛍光活性化細胞選別(FACS)、MassARRAY、プロテオミクス、生化学的酵素活性アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。マルチプレックス化免疫アッセイ、例えば、Rules Based Medicine又はMeso Scale Discovery(「MSD」)から入手可能なものを使用することもできる。対象由来の試料(例えば、生物学的試料、例えば、組織試料)中のCD47(例えば、hCD47)タンパク質の存在及び/又は量の検出は、形態学的染色及び/又は蛍光インサイチュハイブリダイゼーションなどのさらなる技法と組み合わせて実施することができる。
いくつかの実施態様において、CD47発現は、例えば、非癌性組織の試料と比べて、腫瘍上で又は腫瘍試料中で評価される。本明細書で使用される場合、腫瘍又は腫瘍試料は、腫瘍細胞によって占められた腫瘍領域の一部又は全てを包含し得る。いくつかの実施態様において、腫瘍又は腫瘍試料は、腫瘍関連腫瘍内細胞及び/又は腫瘍関連間質(例えば、連続的な腫瘍周辺の線維形成性間質)によって占められた腫瘍領域をさらに包含し得る。いくつかの実施態様において、CD47発現は、腫瘍細胞上で評価される。いくつかの実施態様において、試料は、臨床試料である。いくつかの実施態様において、試料は、診断アッセイで使用される。いくつかの実施態様において、試料は、原発性又は転移性腫瘍から得られる。組織生検は、代表的な腫瘍組織片を得るために使用されることが多い。或いは、腫瘍細胞は、対象となる腫瘍細胞を含有することが知られている又はそう考えられている組織又は流体の形態で間接的に得ることができる。例えば、本明細書に記載される検出方法で使用するための試料は、限定するものではないが、切除、気管支鏡検査、細針吸引、気管支擦過によって、又は喀痰、胸水、脳脊髄液、血液、血清、及び尿から得ることができる。癌性試料中の標的遺伝子又は遺伝子産物の検出のための上で論じられている同じ技法を他の体試料に適用することができる。癌細胞が癌病変から剥がれ落ち、そのような体試料に現れることがある。いくつかの実施態様において、早期癌診断は、そのような体試料をCD47タンパク質の存在及び/又は量についてスクリーニングすることにより達成することができる。いくつかの実施態様において、治療(例えば、抗CD47抗体による治療)の進行は、そのような体試料をCD47タンパク質の存在及び/又は量について検査することにより、より簡単にモニタリングすることができる。
(治療の方法)
本明細書に提供されるのは、異常なCD47発現(例えば、CD47過剰発現)と関連する疾患又は障害を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載される抗CD47抗体を、それを必要としている対象に投与することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、疾患又は障害は、癌である。
本明細書に提供されるのは、異常なCD47発現(例えば、CD47過剰発現)と関連する疾患又は障害を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載される抗CD47抗体を、それを必要としている対象に投与することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、疾患又は障害は、癌である。
(固形腫瘍の治療)
いくつかの実施態様において、提供されるのは、対象の固形腫瘍を治療する方法であって、対象への有効量の抗CD47抗体を対象に投与することを含む、方法であり、ここで、抗CD47抗体は、(a)(1)
を含むCDR-H1;(2)
を含むCDR-H2;及び(3)
を含むCDR-H3を含む重鎖可変(VH)ドメイン;(b)(1)
を含むCDR-L1;(2)
を含むCDR-L2;及び(3)
を含むCDR-L3を含む軽鎖可変(VL)ドメインを含む。いくつかの実施態様において、VHは、そのN-末端のグルタミン酸残基(E)及びそのC-末端のセリン(S)をさらに含む。いくつかの実施態様において、抗CD47は、ヒトIgG4 Fc領域をさらに含む。
いくつかの実施態様において、提供されるのは、対象の固形腫瘍を治療する方法であって、対象への有効量の抗CD47抗体を対象に投与することを含む、方法であり、ここで、抗CD47抗体は、(a)(1)
いくつかの実施態様において、固形腫瘍は、再発性固形腫瘍(例えば、固形腫瘍の事前治療の間もしくはその後に再発する)及び/又は不応性固形腫瘍(例えば、固形腫瘍の事前治療に不応性であるかもしくは応答しない)である。いくつかの実施態様において、「事前治療」は、1以上の治療剤の投与を含む治療レジメンを指す。すなわち、固形腫瘍の「事前治療」は、単一の治療剤による治療又は治療剤の組合せによる治療を含んでいた可能性がある。いくつかの実施態様において、固形腫瘍は、肺腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍、肉腫腫瘍、頭頸部腫瘍、胃腫瘍、腎腫瘍、又は皮膚腫瘍(例えば、黒色腫)である。いくつかの実施態様において、固形腫瘍は、転移性固形腫瘍である。
いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、約10mg/kg、20mg/kg、及び30mg/kgのいずれかを含む、約10mg/kg~約30mg/mgの用量で対象に投与される。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、対象に、週1回(すなわち、qw又はq1w)投与される。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、静脈内(IV)注入を介して投与される。いくつかの実施態様において、対象は、抗CD47抗体による治療が原因の何らかの治療関連有害作用(TRAE)を経験しない。いくつかの実施態様において、対象は、グレード1又はグレード2を超える何らかのTRAEを経験しない。いくつかの実施態様において、TRAEは、有害事象共通用語基準(Common Terminology Criteria for Adverse Events)(CTCAE) v 5.0に概要が示されている基準に従って等級分けされる。例えば、ctep(dot)cancer(dot)gov/protocoldevelopment/electronic_applications/docs/CTCAE_v5_Quick_Reference_5x7(dot)pdfを参照されたい。
いくつかの実施態様において、対象は、抗CD47抗体による治療が原因の重大な血液毒性を経験しない。いくつかの実施態様において、対象は、抗CD47抗体による治療が原因の何らかの血液毒性を経験しない。いくつかの実施態様において、血液毒性は、貧血、血球減少症、及び/又は赤血球凝集を含む。いくつかの実施態様において、対象は、抗CD47抗体による治療の間、血液毒性の治療を必要としない。
いくつかの実施態様において、抗CD47抗体のVHは、配列番号1を含み、抗CD47抗体のVLは、配列番号2を含む。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体の重鎖は、配列番号3を含み、抗CD47抗体の軽鎖は、配列番号4を含む。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体の重鎖は、配列番号55を含み、抗CD47抗体の軽鎖は、配列番号4を含む。
(非ホジキンリンパ腫(NHL)の治療)
いくつかの実施態様において、提供されるのは、対象の非ホジキンリンパ腫(NHL)を治療する方法であって、対象に有効量の抗CD47抗体及び任意に、有効量のリツキシマブを投与することを含む、方法であり、ここで、抗CD47抗体は、(a)(1)
を含むCDR-H1;(2)
を含むCDR-H2;及び(3)
を含むCDR-H3を含む重鎖可変(VH)ドメイン;(b)(1)
を含むCDR-L1;(2)
を含むCDR-L2;及び(3)
を含むCDR-L3を含む軽鎖可変(VL)ドメインを含む。いくつかの実施態様において、VHは、そのN-末端のグルタミン酸残基(E)及びそのC-末端のセリン(S)をさらに含む。
いくつかの実施態様において、提供されるのは、対象の非ホジキンリンパ腫(NHL)を治療する方法であって、対象に有効量の抗CD47抗体及び任意に、有効量のリツキシマブを投与することを含む、方法であり、ここで、抗CD47抗体は、(a)(1)
いくつかの実施態様において、抗CD47は、ヒトIgG4 Fc領域をさらに含む。いくつかの実施態様において、NHLは、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、又はマントル細胞リンパ腫(MCL)である。いくつかの実施態様において、NHLは、再発性NHL(例えば、NHLの事前治療の間もしくはその後に再発する)及び/又は不応性NHL(例えば、NHLの事前治療に不応性であるかもしくは応答しない)である。いくつかの実施態様において、対象は、少なくとも1回のNHLの事前治療(例えば、2~10回の事前治療)を受けたことがある。いくつかの実施態様において、「事前治療」は、1以上の治療剤の投与を含む治療レジメンを指す。すなわち、NHLの「事前治療」は、単一の治療剤による治療又は治療剤の組合せによる治療を含んでいた可能性がある。いくつかの実施態様において、対象は、抗CD20剤を含んだNHLの事前治療を受けたことがある。いくつかの実施態様において、抗CD20剤は、抗CD20抗体(例えば、限定するものではないが、リツキシマブ、オビヌツズマブ、及び/又はオファツムマブ)であった。いくつかの実施態様において、対象は、抗CD20剤(例えば、単剤としてのもの又は1以上の治療剤と組み合わせたもの)による治療の間又はその後に進行した(例えば、NHL疾患進行を示した)。
いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、対象に、週1回(すなわち、qw又はq1w)投与される。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、対象に、7日毎に1回投与される。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、静脈内(IV)注入を介して投与される。
いくつかの実施態様において、リツキシマブは、対象に、IV注入を介して、375mg/m2の用量で、週1回(qw又はq1w)、5週間、及びこの5週間の後、375mg/m2の用量で、4週間毎に1回(例えば、q4w、q28d、又は毎月)投与される。いくつかの実施態様において、リツキシマブは、処方表示(例えば、www(dot)accessdata(dot)fda(dot)gov/drugsatfda_docs/label/2018/103705s5450lbl(dot)pdfにおけるFDA処方表示及びwww(dot)ema(dot)europa(dot)eu/en/documents/overview/mabthera-epar-medicine-overview_en.pdfにおけるEMA処方表示を参照)の指示に従って投与される。
いくつかの実施態様において、対象は、抗CD47抗体による治療が原因の何らかの治療関連有害作用(TRAE)を経験しない。いくつかの実施態様において、対象は、グレード1又はグレード2を超える何らかのTRAEを経験しない。いくつかの実施態様において、TRAEは、有害事象共通用語基準(Common Terminology Criteria for Adverse Events)(CTCAE) v 5.0に概要が示されている基準に従って等級分けされる。例えば、ctep(dot)cancer(dot)gov/protocoldevelopment/electronic_applications/docs/CTCAE_v5_Quick_Reference_5x7(dot)pdfを参照されたい。
いくつかの実施態様において、対象は、抗CD47抗体による治療が原因の重大な血液毒性を経験しない。いくつかの実施態様において、対象は、抗CD47抗体による治療が原因の何らかの血液毒性を経験しない。いくつかの実施態様において、血液毒性は、貧血、血球減少症、及び/又は赤血球凝集を含む。いくつかの実施態様において、対象は、抗CD47抗体による治療の間、血液毒性の治療を必要としない。
いくつかの実施態様において、抗CD47抗体のVHは、配列番号1を含み、抗CD47抗体のVLは、配列番号2を含む。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体の重鎖は、配列番号3を含み、抗CD47抗体の軽鎖は、配列番号4を含む。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体の重鎖は、配列番号55を含み、抗CD47抗体の軽鎖は、配列番号4を含む。いくつかの実施態様において、抗CD47抗体は、レムゾパリマブである。
(製品及びキット)
提供されるのは、CD47関連疾患、例えば、CD47を発現する(例えば、CD47を過剰発現する)癌、例えば、固形腫瘍癌(例えば、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌、肉腫癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、もしくは皮膚癌など)又は血液癌、例えば、非ホジキンリンパ腫(例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)など)の治療に有用な材料を含む製品である。ある実施態様において、製品又はキットは、本明細書に記載される抗CD47抗体(もしくはその免疫学的活性断片)又は組成物のうちの1つ又は複数を含有する容器を含む。ある実施態様において、製品又はキットは、本明細書に記載される抗CD47抗体(もしくはその免疫学的活性断片)のうちの1つ(もしくは複数)をコードする核酸又は組成物を含有する容器を含む。いくつかの実施態様において、キットは、本明細書に記載される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)を産生する細胞株の細胞を含む。いくつかの実施態様において、キットは、1以上の陽性対照、例えば、CD47(もしくはその断片)又はCD47+細胞を含む。いくつかの実施態様において、キットは、陰性対照、例えば、CD47を実質的に含まない表面もしくは溶液、又はCD47を発現しない細胞を含む。
提供されるのは、CD47関連疾患、例えば、CD47を発現する(例えば、CD47を過剰発現する)癌、例えば、固形腫瘍癌(例えば、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌、肉腫癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、もしくは皮膚癌など)又は血液癌、例えば、非ホジキンリンパ腫(例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)など)の治療に有用な材料を含む製品である。ある実施態様において、製品又はキットは、本明細書に記載される抗CD47抗体(もしくはその免疫学的活性断片)又は組成物のうちの1つ又は複数を含有する容器を含む。ある実施態様において、製品又はキットは、本明細書に記載される抗CD47抗体(もしくはその免疫学的活性断片)のうちの1つ(もしくは複数)をコードする核酸又は組成物を含有する容器を含む。いくつかの実施態様において、キットは、本明細書に記載される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)を産生する細胞株の細胞を含む。いくつかの実施態様において、キットは、1以上の陽性対照、例えば、CD47(もしくはその断片)又はCD47+細胞を含む。いくつかの実施態様において、キットは、陰性対照、例えば、CD47を実質的に含まない表面もしくは溶液、又はCD47を発現しない細胞を含む。
ある実施態様において、製品又はキットは、容器及び容器上の又は容器と関連するラベル又はパッケージインサートを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV容器バッグ、試験管などが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成されてもよい。容器には、それだけであるか、或いはCD47関連疾患もしくは障害、例えば、癌、例えば、固形腫瘍癌(例えば、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌、肉腫癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、もしくは皮膚癌など)又は血液癌(例えば、非ホジキンリンパ腫(NHL)、例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)など)を治療、予防、及び/又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わされている組成物が入っている。容器は、滅菌アクセスポートを有していてもよい(例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能な栓を有する静脈用溶液バッグ又はバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも1つの薬剤は、本明細書に記載される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)である。いくつかの実施態様において、ラベル又はパッケージインサートは、組成物がCD47関連疾患又は障害(例えば、癌、例えば、固形腫瘍癌(例えば、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌、肉腫癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、もしくは皮膚癌など)又は血液癌(例えば、非ホジキンリンパ腫(NHL)、例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)など)を治療するために使用されることを示す。いくつかの実施態様において、ラベル又はパッケージインサートは、組成物が固形腫瘍、例えば、再発性及び/又は不応性固形腫瘍(例えば、肺、卵巣、結腸直腸、膵臓、肉腫、頭頸部、胃、腎臓、又は皮膚腫瘍)を治療する際に使用するためのものであることを示す。いくつかの実施態様において、ラベル又はパッケージインサートは、組成物が対象、例えば、少なくとも1回のNHLの事前治療、例えば、抗CD20剤による治療を受けたことがある対象における非ホジキンリンパ腫(NHL)、例えば、再発性及び/又は不応性NHLの治療のためのリツキシマブと組み合わせて使用するためのものであることを示す。
さらに、製品又はキットは、(a)組成物がその中に含有される第一の容器(ここで、該組成物は、本明細書に記載される抗CD47抗体(又はその免疫学的活性断片)を含む);及び(b)組成物がその中に含有される第二の容器(ここで、該組成物は、さらなる細胞毒性剤又はそれとは逆に治療剤(例えば、リツキシマブ、ここで、キットは、NHLの治療のためのものである)を含む)を含むことができる。さらに、製品は、医薬として許容し得るバッファー、例えば、静菌性注射用水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びブドウ糖溶液を含む追加の容器をさらに含むことができる。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
様々な目的のために、例えば、任意に製品と組み合わせた、例えば、対象から得られた組織試料中のCD47の単離又は検出のために有用であるキットも提供される。CD47の単離及び精製のために、キットは、ビーズ(例えば、セファロースビーズ)とカップリングされた本明細書に提供される抗CD47抗体(又はその断片)を含有することができる。インビトロにおける、例えば、ELISA又はウェスタンブロットにおけるCD47の検出及び定量のための抗体(又はその断片)を含有するキットを提供することができる。製品と同様に、キットは、容器及び容器上の又は容器と関連するラベル又はパッケージインサートを含む。例えば、容器には、本明細書に提供される少なくとも1つの抗CD47抗体を含む組成物が入っている。例えば、希釈剤及びバッファー、対照抗体を含有する追加の容器を含めてもよい。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、酵素によって必要とされる基質及び補因子(例えば、検出可能な発色団又は蛍光団を提供する基質前駆体)を含む。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を大幅に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するように幅広く変化させることができる。特に、試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができる。ラベル又はパッケージインサートは、組成物の説明、並びに意図されるインビトロもしくは診断的使用(例えば、CD47の検出、CD47関連疾患もしくは障害の診断)又はCD47関連疾患もしくは障害の診断の治療の進行のモニタリング)の指示を提供することができる。
本明細書で引用されている全ての刊行物及び特許出願は、各々の個々の刊行物又は特許出願が引用により組み込まれていることが具体的にかつ個別に示されているかのように、引用により本明細書中に組み込まれている。
(実施例)
以下の実施例は、本発明を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定することが意図されるものでも、以下の実験が実施される全ての又は唯一の実験であることを表すことが意図されるものでもない。使用される数(例えば、量、温度など)に関して精度を確保するように努力が払われているが、ある程度の実験誤差及び偏差が説明されるべきである。別途指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
以下の実施例は、本発明を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定することが意図されるものでも、以下の実験が実施される全ての又は唯一の実験であることを表すことが意図されるものでもない。使用される数(例えば、量、温度など)に関して精度を確保するように努力が払われているが、ある程度の実験誤差及び偏差が説明されるべきである。別途指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
(材料及び方法)
(ファージライブラリーの樹立)
CD47は、細胞外のN-末端IgVドメイン、5回膜貫通ドメイン、及び短いC-末端細胞内テールを有する50kDaの膜受容体である。ヒトFc又はビオチン化ヒトCD47-IgVドメイン(ACROBiosystems)とコンジュゲートされたヒトCD47-IgVドメインをファージライブラリーパニング用の抗原として使用した。
(ファージライブラリーの樹立)
CD47は、細胞外のN-末端IgVドメイン、5回膜貫通ドメイン、及び短いC-末端細胞内テールを有する50kDaの膜受容体である。ヒトFc又はビオチン化ヒトCD47-IgVドメイン(ACROBiosystems)とコンジュゲートされたヒトCD47-IgVドメインをファージライブラリーパニング用の抗原として使用した。
ファージライブラリーを、>50人の健康なヒト対象の脾臓又は骨髄から増幅させた抗体遺伝子断片からなるファージミドベクターを用いて構築した。抗体フォーマットは、単鎖可変断片(scFv、VH+リンカー+VL)である。ライブラリーサイズは1.1×1010であり、配列多様性を次のように解析した。ライブラリーから獲得され、さらにシーケンシングされた62個のクローンについて、16個の配列は、切断されたもの、フレームシフト突然変異又はアンバーコドンを有するものであり; 46個の配列は、その全てのHCDR3配列が独特である全長scFvを有していた。46個の全長scFvにおいて、13個の配列は、ラムダ軽鎖を有し、33個の配列は、カッパ軽鎖を有していた。
(ファージパニング及びクローン選択)
ヒトCD47-IgVドメインに特異的に結合するファージクローンを得るために、2つのファージパニング方法を使用した。
ヒトCD47-IgVドメインに特異的に結合するファージクローンを得るために、2つのファージパニング方法を使用した。
(1.ヒトCD47-IgVに対するファージライブラリーイムノチューブパニング)
この方法では、上記のように開発されたファージライブラリーをカゼインがコーティングされたイムノチューブ中で最初に2時間インキュベートした。ヒトCD47-IgV-Fc融合タンパク質を第一ラウンドのパニングに使用した。結合していないファージをPBSTで5~20回洗浄することにより除去した。結合したファージを、新たに調製した100mMトリエチルアミン溶液で溶出させ、第一の出力ファージプールになるように、Tris-HClバッファーの添加により中和した。この第一の出力ファージプールを増幅用の大腸菌TG-1細胞の感染によってレスキューし、ビオチン化ヒトCD47-IgVを抗原として用いて、第二ラウンドのパニングを行った。結合したファージを同じプロセスで溶出させると、第二の出力ファージプールになり、その後、これをレスキューし、その後再び、ヒトCD47-IgV-Fc融合タンパク質を抗原として用いて、第三ラウンドのパニングを行った。その後、結合したファージは第三の出力ファージプールになり、ビオチン化ヒトCD47-IgVを用いる第四ラウンドのパニングを受けた。
この方法では、上記のように開発されたファージライブラリーをカゼインがコーティングされたイムノチューブ中で最初に2時間インキュベートした。ヒトCD47-IgV-Fc融合タンパク質を第一ラウンドのパニングに使用した。結合していないファージをPBSTで5~20回洗浄することにより除去した。結合したファージを、新たに調製した100mMトリエチルアミン溶液で溶出させ、第一の出力ファージプールになるように、Tris-HClバッファーの添加により中和した。この第一の出力ファージプールを増幅用の大腸菌TG-1細胞の感染によってレスキューし、ビオチン化ヒトCD47-IgVを抗原として用いて、第二ラウンドのパニングを行った。結合したファージを同じプロセスで溶出させると、第二の出力ファージプールになり、その後、これをレスキューし、その後再び、ヒトCD47-IgV-Fc融合タンパク質を抗原として用いて、第三ラウンドのパニングを行った。その後、結合したファージは第三の出力ファージプールになり、ビオチン化ヒトCD47-IgVを用いる第四ラウンドのパニングを受けた。
(2.ヒトCD47-IgVに対するファージライブラリー溶液パニング)
この第二の方法では、ファージライブラリーをカゼインでブロッキングした100μLのストレプトアビジン-磁気ビーズ中で最初にインキュベートして、ストレプトアビジンビーズバインダーを除去した。ストレプトアビジン-磁気ビーズ及びAG0084-huIgG1/kを陰性選択に使用した。除去されたライブラリーをレスキューし、その後、ビオチン化ヒトCD47-IgVを抗原として用いて、第二ラウンドのパニングを行い、カゼインでブロッキングしたストレプトアビジン-磁気ビーズで陰性除去をさらに行った。結合していないファージをPBSTで5~20回洗浄することにより除去した。結合したファージを新たに調製した100mMトリエチルアミン溶液で溶出させ、Tris-HClバッファーの添加により中和し、その後、レスキューし、その後、ヒトCD47-IgV-Fc融合タンパク質を用いて、第三ラウンドのパニングを行い、AG0084-huIgG1/kで除去した。その後、結合したファージは、第三の出力ファージプールになり、ビオチン化ヒトCD47-IgVを用いる第四ラウンドのパニング及びカゼインでブロッキングしたストレプトアビジン-磁気ビーズによる陰性除去を受けた。
この第二の方法では、ファージライブラリーをカゼインでブロッキングした100μLのストレプトアビジン-磁気ビーズ中で最初にインキュベートして、ストレプトアビジンビーズバインダーを除去した。ストレプトアビジン-磁気ビーズ及びAG0084-huIgG1/kを陰性選択に使用した。除去されたライブラリーをレスキューし、その後、ビオチン化ヒトCD47-IgVを抗原として用いて、第二ラウンドのパニングを行い、カゼインでブロッキングしたストレプトアビジン-磁気ビーズで陰性除去をさらに行った。結合していないファージをPBSTで5~20回洗浄することにより除去した。結合したファージを新たに調製した100mMトリエチルアミン溶液で溶出させ、Tris-HClバッファーの添加により中和し、その後、レスキューし、その後、ヒトCD47-IgV-Fc融合タンパク質を用いて、第三ラウンドのパニングを行い、AG0084-huIgG1/kで除去した。その後、結合したファージは、第三の出力ファージプールになり、ビオチン化ヒトCD47-IgVを用いる第四ラウンドのパニング及びカゼインでブロッキングしたストレプトアビジン-磁気ビーズによる陰性除去を受けた。
このプロセスの後、ヒトCD47-IgVドメインに特異的に結合する複数のファージクローンを取得し、濃縮した。その後、ファージクローンを希釈し、プレーティングして、37℃で8時間増殖させ、抗カッパ抗体がコーティングされたフィルターによって一晩捕捉した。ビオチン化ヒトCD47-IgV(50nM)及びNeutrAvidin-APコンジュゲート(1:1000希釈)をフィルターに適用して、陽性結合したファージクローンを検出した。陽性ファージプラークを取り、100μLのファージ溶出バッファー中に溶出させた。約10~15μLの溶出したファージを用いて、1mLのXL1 blue細胞に感染させ、ファージシングルポイントELISA(SPE)用の高力価ファージ(HT)を作製した。フィルターリフトから取られた陽性の単一クローンをヒトCD47-IgV-Fc融合タンパク質及びビオチン化ヒトCD47-IgVドメインタンパク質の結合に供した。また、これらの陽性の単一クローンをそのVH及びVL遺伝子についてシークエンシングした。独特のVH及びVL遺伝子を有する全ての陽性ヒットを発現ベクターpFUSE2ss-CLIg-hk(軽鎖、InvivoGen、カタログ番号pfuse2ss-hclk)及びpFUSEss-CHIg-hG1(重鎖、InvivoGen、カタログ番号pfusess-hchg1)にクローニングした。抗体をHEK293細胞で発現させ、プロテインA Plusアガロースによって精製した。
(抗CD47抗体の親和性成熟)
上記のように得られたCD47抗体の結合親和性を、インビトロ親和性成熟によって、例えば、部位特異的ランダム化突然変異によって向上させることができ、これにより、同じく本発明の範囲内である突然変異した配列が得られた。
上記のように得られたCD47抗体の結合親和性を、インビトロ親和性成熟によって、例えば、部位特異的ランダム化突然変異によって向上させることができ、これにより、同じく本発明の範囲内である突然変異した配列が得られた。
例えば、BiaCore解析に基づいて、CD47抗体の重鎖及び軽鎖のCDR配列の解析は、ランダム化/突然変異させることができるHCDR1及びLCDR1領域中のいくつかの残基を同定することができる。それゆえ、ランダム突然変異生成ライブラリーを構築し、特定の残基に導入して、種々の新しい配列を生成させることができる。CDR突然変異生成ライブラリーを、平衡条件下、溶液相のビオチン化可溶性CD47 ECDを用いてパニングする。抗原濃度を低下させた複数ラウンドのパニングの後、濃縮された出力バインダーを結合ELISA試験のために選択し、その後、完全IgGに変換し、これをBiaCore解析に供して、解離速度(off-rate)が向上した配列について特異的に選択する。このスクリーニングプロセスを通して、本発明のさらなる抗体分子を、臨床用途のための全体的な最も優れた性質を求めて構築することができる。
(実施例1.組換えCD47-ECD(細胞外ドメイン)に結合するファージクローンのELISAスクリーニング)
組換えヒトCD47 IgV-Fc融合タンパク質(Acrobiosystems)を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中2μg/mLで、マイクロタイタープレート上に、室温(RT)で2時間コーティングした。抗原をコーティングした後、ウェルを、1%BSAを含むPBS/0.05%Tween(PBST)で、RTで1時間ブロッキングした。PBSTでウェルを洗浄した後、単一クローン由来の純化されたファージをウェルに添加し、RTで1時間インキュベートした。結合しているファージクローンの検出のために、M13に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート二次抗体(Jackson Immuno Research)を添加し、その後、蛍光原性基質(Roche)を添加した。全インキュベーション工程の間、プレートのウェルをPBSTで3回洗浄した。蛍光をTECAN Spectrafluorプレートリーダーで測定した。陽性のファージクローンを重鎖及び軽鎖遺伝子のシークエンシングのために選択した。
組換えヒトCD47 IgV-Fc融合タンパク質(Acrobiosystems)を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中2μg/mLで、マイクロタイタープレート上に、室温(RT)で2時間コーティングした。抗原をコーティングした後、ウェルを、1%BSAを含むPBS/0.05%Tween(PBST)で、RTで1時間ブロッキングした。PBSTでウェルを洗浄した後、単一クローン由来の純化されたファージをウェルに添加し、RTで1時間インキュベートした。結合しているファージクローンの検出のために、M13に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート二次抗体(Jackson Immuno Research)を添加し、その後、蛍光原性基質(Roche)を添加した。全インキュベーション工程の間、プレートのウェルをPBSTで3回洗浄した。蛍光をTECAN Spectrafluorプレートリーダーで測定した。陽性のファージクローンを重鎖及び軽鎖遺伝子のシークエンシングのために選択した。
上記のように得られたCD47抗体は、組換えヒトCD47 IgV-Fc融合タンパク質に対する良好な結合活性を示した。
(実施例2. CD47とSIRPαの相互作用を遮断する抗体のELISA解析)
組換えヒトCD47 IgV/マウスFc融合タンパク質又はビオチン化CD47 IgVタンパク質(Acrobiosystems)を、PBS中1μg/mLで、マイクロタイタープレート上に、RTで2時間コーティングした。抗原をコーティングした後、ウェルを、1%BSAを含むPBS/0.05%Tween(PBST)で、RTで1時間ブロッキングした。PBSTでウェルを洗浄した後、PBSに希釈した抗体をウェルに添加し(5μg/mL)、RTで1時間インキュベートした。抗体による結合の検出のために、ヒトFcに対するHRPコンジュゲート二次抗体(Jackson Immuno Research)を添加し、その後、蛍光原性基質(Roche)を添加した。全インキュベーション工程の間、プレートのウェルをPBSTで3回洗浄した。蛍光をTECAN Spectrafluorプレートリーダーで測定した。
組換えヒトCD47 IgV/マウスFc融合タンパク質又はビオチン化CD47 IgVタンパク質(Acrobiosystems)を、PBS中1μg/mLで、マイクロタイタープレート上に、RTで2時間コーティングした。抗原をコーティングした後、ウェルを、1%BSAを含むPBS/0.05%Tween(PBST)で、RTで1時間ブロッキングした。PBSTでウェルを洗浄した後、PBSに希釈した抗体をウェルに添加し(5μg/mL)、RTで1時間インキュベートした。抗体による結合の検出のために、ヒトFcに対するHRPコンジュゲート二次抗体(Jackson Immuno Research)を添加し、その後、蛍光原性基質(Roche)を添加した。全インキュベーション工程の間、プレートのウェルをPBSTで3回洗浄した。蛍光をTECAN Spectrafluorプレートリーダーで測定した。
CD47抗体A1A及びB2B)は、組換えヒトCD47-Fc融合タンパク質及びビオチン化CD47タンパク質に対する良好な結合活性を示した。
(実施例3. CD47とSIRPαの相互作用を遮断する抗体のELISA解析)
組換えhCD47 IgV-Fc 融合タンパク質(Acrobiosystems)を、PBS中1μg/mLで、マイクロタイタープレート上に、4℃で16時間コーティングした。PBST中の1%BSAでRTで1時間ブロッキングした後、1μg/mlのSIRPα-Hisタンパク質を、抗CD47抗体(10μg/mL)の存在下又は非存在下のいずれかで、RTで1時間添加した。その後、プレートを3回洗浄し、HRPコンジュゲート抗His二次抗体とともにRTで1時間インキュベートした。洗浄後、TMB溶液を各々のウェルに30分間添加し、反応を2.0M H2SO4で停止させ、ODを490nmで測定した。
組換えhCD47 IgV-Fc 融合タンパク質(Acrobiosystems)を、PBS中1μg/mLで、マイクロタイタープレート上に、4℃で16時間コーティングした。PBST中の1%BSAでRTで1時間ブロッキングした後、1μg/mlのSIRPα-Hisタンパク質を、抗CD47抗体(10μg/mL)の存在下又は非存在下のいずれかで、RTで1時間添加した。その後、プレートを3回洗浄し、HRPコンジュゲート抗His二次抗体とともにRTで1時間インキュベートした。洗浄後、TMB溶液を各々のウェルに30分間添加し、反応を2.0M H2SO4で停止させ、ODを490nmで測定した。
CD47抗体A1A及びB2Bは、CD47とSIRPαとの結合を効果的に遮断した。B2B及びA1AのVHドメイン、VLドメイン、重鎖、及び軽鎖のアミノ酸配列は、図15に示されている。
(実施例4.単量体CD47-ECDに結合する抗CD47抗体の用量依存的応答)
直接的な結合及び競合スクリーニングの後、抗CD47抗体B2Bを、2つの既知の参照抗CD47抗体、すなわち、F59及び2A1と比較して、この試験のために選択した。ビオチン化CD47タンパク質(Acrobiosystems)を、PBS中1μg/mLで、マイクロタイタープレート上に、RTで2時間コーティングした。抗原をコーティングした後、ウェルを、1%BSAを含むPBS/0.05%Tween(PBST)で、RTで1時間ブロッキングした。PBSTでウェルを洗浄した後、様々な濃度の抗CD47抗体をウェルに添加し、RTで1時間インキュベートした。抗体とCD47との結合を検出するために、ヒトFcに対するHRPコンジュゲート二次抗体(Jackson Immuno Research)を添加し、その後、蛍光原性基質(Roche)を添加した。全インキュベーション工程の間、プレートのウェルをPBSTで3回洗浄した。蛍光をTECAN Spectrafluorプレートリーダーで測定した。
直接的な結合及び競合スクリーニングの後、抗CD47抗体B2Bを、2つの既知の参照抗CD47抗体、すなわち、F59及び2A1と比較して、この試験のために選択した。ビオチン化CD47タンパク質(Acrobiosystems)を、PBS中1μg/mLで、マイクロタイタープレート上に、RTで2時間コーティングした。抗原をコーティングした後、ウェルを、1%BSAを含むPBS/0.05%Tween(PBST)で、RTで1時間ブロッキングした。PBSTでウェルを洗浄した後、様々な濃度の抗CD47抗体をウェルに添加し、RTで1時間インキュベートした。抗体とCD47との結合を検出するために、ヒトFcに対するHRPコンジュゲート二次抗体(Jackson Immuno Research)を添加し、その後、蛍光原性基質(Roche)を添加した。全インキュベーション工程の間、プレートのウェルをPBSTで3回洗浄した。蛍光をTECAN Spectrafluorプレートリーダーで測定した。
参照抗体5F9及び2A1を、Stanford University、Inhibrx LLC、及びCelgene Corp.の研究者によって開示されている通りに、Hu5F9及びCC-90002の配列に準拠して産生し(例えば、米国特許第9,017,675 B2号、米国特許第9,382,320号、米国特許第9,221,908号、米国特許出願公開第2014/0140989号、及びWO 2016/109415号を参照)、同じ試験に使用した。
図1に示されているように、抗CD47抗体B2Bは、5F9及び2A1の結合活性よりも優れた単量体CD47-ECDに対する結合活性を示した。B2Bの0.09nmというEC50は、5F9のEC50(0.11nM)及び2A1のEC50(0.25nM)よりも低かった。
(実施例5.二量体CD47-ECDに結合する抗CD47抗体の用量依存的応答)
実施例4で特定された2つの抗CD47抗体(すなわち、A1A及びB2B)をこの試験でも使用した。
実施例4で特定された2つの抗CD47抗体(すなわち、A1A及びB2B)をこの試験でも使用した。
CD47 IgV/マウスFc融合タンパク質(Acrobiosystems)を、PBS中1μg/mLで、マイクロタイタープレート上に、RTで2時間コーティングした。抗原をコーティングした後、ウェルを、1%BSAを含むPBS/0.05%Tween(PBST)で、RTで1時間ブロッキングした。PBSTでウェルを洗浄した後、様々な濃度の抗CD47抗体をウェルに添加し、RTで1時間インキュベートした。結合している抗体の検出のために、ヒトFcに対するHRPコンジュゲート二次抗体(Jackson Immuno Research)を添加し、その後、蛍光原性基質(Roche)を添加した。全インキュベーション工程の間、プレートのウェルをPBSTで3回洗浄した。蛍光をTECAN Spectrafluorプレートリーダーで測定した。
抗CD47抗体B2Bは、用量依存的な様式で二量体CD47-ECDに対する結合活性を示した。
(実施例6.CD47とSIRPαとの結合を遮断する抗CD47抗体の用量依存的応答)
組換えCD47-Fc融合タンパク質(Acrobiosystems)を、PBS中1μg/mLで、マイクロタイタープレート上に、4℃で16時間コーティングした。PBST中の1%BSAでRTで1時間ブロッキングした後、1μg/mlのSIRPα-Hisタンパク質を、様々な濃度の抗CD47抗体の非存在下又は存在下のいずれかで、RTで1時間添加した。その後、プレートを3回洗浄し、HRPコンジュゲート抗His二次抗体とともにRTで1時間インキュベートした。洗浄後、TMB溶液を各々のウェルに30分間添加し、反応を2M H2SO4で停止させ、ODを490nmで測定した。
組換えCD47-Fc融合タンパク質(Acrobiosystems)を、PBS中1μg/mLで、マイクロタイタープレート上に、4℃で16時間コーティングした。PBST中の1%BSAでRTで1時間ブロッキングした後、1μg/mlのSIRPα-Hisタンパク質を、様々な濃度の抗CD47抗体の非存在下又は存在下のいずれかで、RTで1時間添加した。その後、プレートを3回洗浄し、HRPコンジュゲート抗His二次抗体とともにRTで1時間インキュベートした。洗浄後、TMB溶液を各々のウェルに30分間添加し、反応を2M H2SO4で停止させ、ODを490nmで測定した。
図2に示されているように、抗CD47抗体B2Bは、CD47とSIRPαとの結合を遮断する際に、用量依存的な様式で活性を示し、EC50は0.18nMであった。
(実施例7A.CD47+Raji細胞に結合する抗CD47抗体の用量依存的応答)
表面にヒトCD47を内在性に発現するRaji細胞を様々な濃度の抗CD47抗体で4℃で30分間染色した。その後、細胞をPBSで3回洗浄し、その後、APC標識抗ヒトFc特異的抗体(Invitrogen)とともに4℃で30分間インキュベートした。FACSCanto(Becton-Dickinson)を用いて、結合を測定した。
表面にヒトCD47を内在性に発現するRaji細胞を様々な濃度の抗CD47抗体で4℃で30分間染色した。その後、細胞をPBSで3回洗浄し、その後、APC標識抗ヒトFc特異的抗体(Invitrogen)とともに4℃で30分間インキュベートした。FACSCanto(Becton-Dickinson)を用いて、結合を測定した。
図3に示されているように、抗CD47抗体B2Bは、CD47+ Raji細胞との結合において、同じ用量依存的なパターンに従って活性を示し、EC50は0.12nMであった。
(実施例7B:腫瘍細胞に結合する抗CD47抗体の用量依存的応答)
同様の試験を、本発明の抗体の結合強度を評価するための白血病腫瘍系統と固形腫瘍系統の両方を含む様々な腫瘍系統にわたる12の腫瘍細胞株のパネルを用いて実施した。
同様の試験を、本発明の抗体の結合強度を評価するための白血病腫瘍系統と固形腫瘍系統の両方を含む様々な腫瘍系統にわたる12の腫瘍細胞株のパネルを用いて実施した。
図4に示されているように、抗CD47抗体B2Bは、試験された12の細胞株(すなわち、SK-OV-3、Toledo、K562、HCC827、Jurkat、U937、TF-1、Raji、SU-DHL-4、MDA-MB-231、A375、及びSK-MES-1)に対して5F9と同程度の結合強度のパターンを示し、これは、下で考察されている同じ腫瘍細胞株におけるB2B及び5F9の食作用パターンで密接に補正された。
(実施例8A.ヒトマクロファージによる腫瘍細胞の食作用の試験)
末梢血単核細胞(PBMC)をヒト血液から単離し、単球をマクロファージに6日間分化させた。単球由来マクロファージ(MDM)を擦り落とし、24-ウェルディッシュに再プレーティングし、24時間接着させておいた。CD47を内在性に発現するRaji細胞を標的細胞として選び、1μMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で10分間標識し、その後、単球由来マクロファージ(MDM)に5:1の腫瘍細胞対食細胞の比で添加した。その後、抗CD47抗体を様々な用量で添加した。3時間のインキュベーションの後、貪食されていない標的細胞をPBSで洗い流し、残存する食細胞を擦り落とし、マクロファージマーカーCD14抗体で染色し、フローサイトメトリーにより解析した。CD14+細胞にゲートをかけ、その後、CFSE+細胞のパーセントを評価することにより、食作用を測定した。
末梢血単核細胞(PBMC)をヒト血液から単離し、単球をマクロファージに6日間分化させた。単球由来マクロファージ(MDM)を擦り落とし、24-ウェルディッシュに再プレーティングし、24時間接着させておいた。CD47を内在性に発現するRaji細胞を標的細胞として選び、1μMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で10分間標識し、その後、単球由来マクロファージ(MDM)に5:1の腫瘍細胞対食細胞の比で添加した。その後、抗CD47抗体を様々な用量で添加した。3時間のインキュベーションの後、貪食されていない標的細胞をPBSで洗い流し、残存する食細胞を擦り落とし、マクロファージマーカーCD14抗体で染色し、フローサイトメトリーにより解析した。CD14+細胞にゲートをかけ、その後、CFSE+細胞のパーセントを評価することにより、食作用を測定した。
図5に示されているように、抗CD47抗体B2Bは、ヒトマクロファージによる腫瘍細胞の食作用の促進において抗CD47抗体5F9及び2A1の活性と同様の活性を示した。
(実施例8B.腫瘍細胞の食作用のさらなる試験)
同様の試験を、本発明の抗体の食作用強度を評価するための白血病腫瘍系統と固形腫瘍系統の両方を含む様々な腫瘍系統にわたる12の腫瘍細胞株のパネルを用いて実施した。図6に示されているように、抗CD47抗体B2Bは、SK-OV-3、Toledo、K562、HCC827、Jurkat、U937、TF-1、Raji、SU-DHL-4、MDA-MB-231、A375、及びSK-MES-1細胞の食作用の促進において抗CD47抗体5F9の活性と同様の活性を示した。
同様の試験を、本発明の抗体の食作用強度を評価するための白血病腫瘍系統と固形腫瘍系統の両方を含む様々な腫瘍系統にわたる12の腫瘍細胞株のパネルを用いて実施した。図6に示されているように、抗CD47抗体B2Bは、SK-OV-3、Toledo、K562、HCC827、Jurkat、U937、TF-1、Raji、SU-DHL-4、MDA-MB-231、A375、及びSK-MES-1細胞の食作用の促進において抗CD47抗体5F9の活性と同様の活性を示した。
(実施例9.赤血球(RBC)凝集アッセイにおけるRBC温存特性)
ヒトRBCをPBSに10%まで希釈し、丸底96-ウェルプレートのウェル中、漸増量の抗CD47抗体とともに、37℃で2時間インキュベートした。赤血球凝集の証拠は、非赤血球凝集RBCの斑点状の赤いドットと比較してもやのように見える非沈降RBCの存在によって示される。
ヒトRBCをPBSに10%まで希釈し、丸底96-ウェルプレートのウェル中、漸増量の抗CD47抗体とともに、37℃で2時間インキュベートした。赤血球凝集の証拠は、非赤血球凝集RBCの斑点状の赤いドットと比較してもやのように見える非沈降RBCの存在によって示される。
抗CD47抗体B2Bは、最大30μg/μLまで又はさらには最大150μg/mLまでの試験濃度でRBC凝集をもたらさなかった。
(実施例10. RBC結合アッセイ)
ヒトRBCに対するCD47抗体の結合をフローサイトメトリーによって調べた。ヒトRBCをCD47抗体(10μg/mL)とともに4℃で1時間インキュベートし、その後、アロフィコシアニン(APC)コンジュゲート二次抗体を4℃で30分間添加した。
ヒトRBCに対するCD47抗体の結合をフローサイトメトリーによって調べた。ヒトRBCをCD47抗体(10μg/mL)とともに4℃で1時間インキュベートし、その後、アロフィコシアニン(APC)コンジュゲート二次抗体を4℃で30分間添加した。
図9Aに示されているように、抗CD47抗体B2Bが試験濃度で極めて低いRBC結合(通常、15%未満)しかもたらさなかったのに対し、参照抗CD47抗体5F9 は、同じ濃度ではるかに高いRBC結合(通常、70~90%)を示した。
(実施例11. RBC凝集アッセイ)
CD47抗体の添加によるRBC凝集の解析のために、RBCを6人の健康な男性及び6人の健康な女性から回収した。
CD47抗体の添加によるRBC凝集の解析のために、RBCを6人の健康な男性及び6人の健康な女性から回収した。
図9Bに示されているように、抗CD47抗体B2Bは、RBC凝集を示さなかったが、参照抗CD47抗体5F9及び2A1は、顕著な凝集を引き起こした。
(実施例12.血小板結合アッセイ)
ヒト血小板に対する本発明のCD47抗体の結合をフローサイトメトリーによって調べた。ヒト末梢全血を本明細書に記載される試験CD47抗体(10μg/mL)又はSIRPα-Ig融合体とともにインキュベートし、CD61を血小板の細胞表面マーカーとして染色した。抗CD47抗体又はSIRPα-Ig融合体の結合は、CD61陽性集団(血小板)にゲートをかけ、CD47又はSIRPα-Ig融合体結合のパーセンテージをさらに調べることにより測定した。
ヒト血小板に対する本発明のCD47抗体の結合をフローサイトメトリーによって調べた。ヒト末梢全血を本明細書に記載される試験CD47抗体(10μg/mL)又はSIRPα-Ig融合体とともにインキュベートし、CD61を血小板の細胞表面マーカーとして染色した。抗CD47抗体又はSIRPα-Ig融合体の結合は、CD61陽性集団(血小板)にゲートをかけ、CD47又はSIRPα-Ig融合体結合のパーセンテージをさらに調べることにより測定した。
抗CD47抗体B2Bが感知できるほどにはヒト血小板に結合しなかったのに対し、SIRPα-Ig 融合タンパク質はヒト血小板に結合した。
(実施例13. CD47抗体によって誘導される初代ヒト急性骨髄性白血病細胞の食作用)
ヒト急性骨髄性白血病(AML)患者由来の初代末梢血単核細胞(PBMCs)を1μMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で10分間標識し、その後、単球由来マクロファージ(MDM)に5:1の腫瘍細胞対食細胞の比で添加し、表示されたCD47抗体を様々な濃度で添加した。3時間のインキュベーションの後、貪食されていない標的細胞をPBSで洗い流し、残存する食細胞を擦り落とし、CD14抗体で染色し、フローサイトメトリーにより解析した。CD14+細胞にゲートをかけ、その後、CFSE+細胞のパーセントを評価することにより、食作用を測定した。食作用を先に記載されているように測定した。
ヒト急性骨髄性白血病(AML)患者由来の初代末梢血単核細胞(PBMCs)を1μMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で10分間標識し、その後、単球由来マクロファージ(MDM)に5:1の腫瘍細胞対食細胞の比で添加し、表示されたCD47抗体を様々な濃度で添加した。3時間のインキュベーションの後、貪食されていない標的細胞をPBSで洗い流し、残存する食細胞を擦り落とし、CD14抗体で染色し、フローサイトメトリーにより解析した。CD14+細胞にゲートをかけ、その後、CFSE+細胞のパーセントを評価することにより、食作用を測定した。食作用を先に記載されているように測定した。
それぞれ、図7及び図8に示されているように、抗CD47抗体B2Bは、参照抗CD47抗体5F9の活性と同程度の顕著なAML結合能力(95%超)及び食作用能力(少なくとも36%)を示した。
(実施例14.ルシフェラーゼ-Raji細胞株由来異種移植片(CDX)モデルにおける抗CD47抗体B2Bのインビボ効力)
NOD scidガンマ(NSG)マウスに、尾静脈注射を介して、100万細胞/マウスの濃度でRaji Luc-EGFP(増強型緑色蛍光タンパク質)を移植した。マウスをインビボでイメージングして、移植から5日後の移植のレベルを決定した。抗CD47抗体B2Bを用いる処置を同じ日から様々な用量で開始した。対照群には、ビヒクルを投与した。全てのマウスに、腹腔内注射を介して、1日おきに注射した。マウスを、抗体処置後0、4、7、11、14、18、及び21日目に、IVIS Lumina IIIイメージングシステムを介して、インビボでイメージングした。マウスにおける腫瘍成長をインビボライブイメージングシステムによる生体発光放射輝度の解析によって測定した。
NOD scidガンマ(NSG)マウスに、尾静脈注射を介して、100万細胞/マウスの濃度でRaji Luc-EGFP(増強型緑色蛍光タンパク質)を移植した。マウスをインビボでイメージングして、移植から5日後の移植のレベルを決定した。抗CD47抗体B2Bを用いる処置を同じ日から様々な用量で開始した。対照群には、ビヒクルを投与した。全てのマウスに、腹腔内注射を介して、1日おきに注射した。マウスを、抗体処置後0、4、7、11、14、18、及び21日目に、IVIS Lumina IIIイメージングシステムを介して、インビボでイメージングした。マウスにおける腫瘍成長をインビボライブイメージングシステムによる生体発光放射輝度の解析によって測定した。
Raji異種移植試験の最後に、全てのマウスを安楽死させた。B2B処置マウス及びビヒクル処置マウス由来の脾臓細胞を単離し、M1マクロファージのパーセンテージ(F4/80陽性マクロファージ中のCD80陽性の%)及びM2マクロファージのパーセンテージ(F4/80陽性マクロファージCD206陽性の%)について、フローサイトメトリー解析により解析した。
図11は、抗CD47抗体B2Bで処置されたマウスの発光強度が10mg/kgの処置の後に減少し続けるが、より低い濃度の処置の後に少しだけ増大することを示している。これは、B2Bが腫瘍担持マウスにおけるマクロファージの極性化を効果的に誘導することを示した。
(実施例15.カニクイザルにおける薬理学的安全性試験)
パイロット-単一用量:未処置のカニクイザルに、ビヒクル(n=2)、抗CD47抗体B2B(n=3、用量=15mg/kg)、又は抗CD47抗体5F9(n=3、用量=15mg/kg)を静脈内注入した。血液検査(全血算又は「CBC」)を、血液回収後24時間以内に、抗CD47抗体投与前に2回、並びに抗体投与から3、6、10、14、及び21日後に解析した。赤血球数(赤血球又は「RBC」としても知られる)、ヘモグロビン(又は「HGB」)、絶対網状赤血球数、及び血小板数を含むCBCパラメータを調べた。
パイロット-単一用量:未処置のカニクイザルに、ビヒクル(n=2)、抗CD47抗体B2B(n=3、用量=15mg/kg)、又は抗CD47抗体5F9(n=3、用量=15mg/kg)を静脈内注入した。血液検査(全血算又は「CBC」)を、血液回収後24時間以内に、抗CD47抗体投与前に2回、並びに抗体投与から3、6、10、14、及び21日後に解析した。赤血球数(赤血球又は「RBC」としても知られる)、ヘモグロビン(又は「HGB」)、絶対網状赤血球数、及び血小板数を含むCBCパラメータを調べた。
パイロット-反復用量:同様に、未処置のカニクイザル(n=2)に、抗CD47抗体B2Bを20mg/kgの用量で静脈内注射した。各々のサル由来の血液試料を、静脈穿刺により、抗凝固薬を含まないチューブ中に、様々な時点で回収した。血液検査(CBC)パラメータを抗体投与後の表示された時点で調べた。血液学的パラメータには、抗体投与後の表示された時点での赤血球数(RBC)、ヘモグロビン(HGB)、血小板数、及びリンパ球数が含まれた。
図10A及び図10Bは、抗CD47抗体B2Bが投与後のカニクイザルにおける顕著な血液学的変化を誘導しなかったことを示している。
カニクイザルにおける優良実験室規範(GLP)に準拠した4週間の反復用量静脈内(IV)毒性試験を次の通りに実施した。未処置のカニクイザルに、反復用量(週1回投与)の抗CD47抗体B2Bを、10mg/kg、30mg/kg、又は100mg/kgで静脈内注入した。赤血球数(RBC)、ヘモグロビン(HGB)、血小板数、及びリンパ球数を含む血液検査(CBC)パラメータを表示された時点で調べた。図10Aは、B2Bの単一用量処置が、5F9の処置と比較して、RBC及びヘモグロビンのレベルに最小限の影響を及ぼしたことを示している。図10Bは、様々な投薬量のB2Bによる反復処置が、ビヒクル対照と比較して、雄及び雌のカニクイザルのどちらのRBCにも顕著な影響を与えなかったことを示している。
(実施例16.再発性/不応性固形腫瘍及びリンパ腫を有する患者における臨床試験)
2パート臨床試験を、抗CD47抗体B2Bを用いて、再発性/不応性悪性腫瘍を有する患者で実施した。臨床試験のパート1は、B2B用量漸増からなり、パート2は、用量拡大試験である。用量漸増(パート1)の間、再発性/不応性固形腫瘍を有する患者に、週1回用量(1mg/kg~30mg/kg)のB2Bを静脈内投与して、固形腫瘍の応答評価基準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)(RECIST v1.1)及びiRECISTに基づく忍容性、安全性、薬物動態(PK)、薬力学(PD)、及び抗腫瘍活性を決定した(例えば、Eisenhauerらの文献(2009) European J. Cancer. 45:228-247及びSeymourらの文献(2017) Lancet Oncol. 18(3): e143-e152を参照されたい。
2パート臨床試験を、抗CD47抗体B2Bを用いて、再発性/不応性悪性腫瘍を有する患者で実施した。臨床試験のパート1は、B2B用量漸増からなり、パート2は、用量拡大試験である。用量漸増(パート1)の間、再発性/不応性固形腫瘍を有する患者に、週1回用量(1mg/kg~30mg/kg)のB2Bを静脈内投与して、固形腫瘍の応答評価基準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)(RECIST v1.1)及びiRECISTに基づく忍容性、安全性、薬物動態(PK)、薬力学(PD)、及び抗腫瘍活性を決定した(例えば、Eisenhauerらの文献(2009) European J. Cancer. 45:228-247及びSeymourらの文献(2017) Lancet Oncol. 18(3): e143-e152を参照されたい。
より具体的には、再発性/不応性固形腫瘍を有する20人の患者を5つのB2B用量漸増コホート(1、3、10、20、及び30mg/kg)のうちの1つ割り当てた。B2B毒性は、用量制限毒性(DLT)が観察されることなく、最大30mg/kgまで管理可能であった。最も一般的な治療関連有害事象(TRAE)は、貧血(30.0%、n=6)、疲労(25.0%、n=5)、注入関連反応(20.0%、n=4)、及び下痢(15.0%、n=3)であった。TRAEは全て、グレード1又は2であった。第一サイクルにおけるヘモグロビンの1.5mg/dL(範囲: 0.4~2.6mg/dL)という一過性の非用量依存的な平均低下が全てのコホートにわたって観察され、前臨床的な優良実験室基準毒性試験の結果と一致していた。溶血の実験的又は臨床的証拠は、どのコホートでも観察されなかった。予備的な結果は、B2Bの薬物動態が単一用量後に中~高用量のレベルで直線的であるように見えることを示している。CD47受容体占有は、20mg/kg及びそれを上回るピーク濃度で末梢T細胞上での完全な飽和を示した。
図12~14に示されているように、本発明の抗CD47抗体(すなわち、B2B)は、再発性/不応性固形腫瘍を有する患者において、望ましい薬物動態的(PK)及び薬力学的(PD)特徴を伴って、最大30mg/kgまで安全であるように見えた。グレード2を超えるTRAEが観察されたこともあった。
(実施例17.抗CD47抗体産生)
抗体B2Bの重鎖(配列番号3)及び軽鎖(配列番号4)をコードするcDNAを合成し、それぞれ、インハウスベクターPIM4.0にクローニングした。その後、該cDNAを含むベクターを、抗体産生のために、CHO-K1宿主細胞に安定にコトランスフェクトした。抗体C3C重鎖(配列番号7)及び軽鎖(配列番号8)をコードする核酸を含むベクターで安定にトランスフェクトされた参照細胞株を同時並行で開発した。
抗体B2Bの重鎖(配列番号3)及び軽鎖(配列番号4)をコードするcDNAを合成し、それぞれ、インハウスベクターPIM4.0にクローニングした。その後、該cDNAを含むベクターを、抗体産生のために、CHO-K1宿主細胞に安定にコトランスフェクトした。抗体C3C重鎖(配列番号7)及び軽鎖(配列番号8)をコードする核酸を含むベクターで安定にトランスフェクトされた参照細胞株を同時並行で開発した。
小型プールの選択及び一連の拡大の後、B2B又はC3Cを発現するCHO-K1細胞を、それぞれ、50mLスピンチューブ中、5×105細胞/mLの密度で、ActiPro培地中に播種した。各々20mLのワーキング容積を含む3つのバッチを各々の抗体用に調製した。Cell Boost7a(CB7a)及びCell Boost 7b(CB7b)(10:1)を供給培地として使用した。簡潔に述べると、0%~5.0%CB7a及び0%~0.5%CB7aを、3日目、6日目、8日目、10日目、及び12日目に添加した。供給パーセンテージ及び供給日を増殖及び代謝プロファイルに基づいて調整した。グルコースも培養物に添加した。フェッドバッチ培養物をKuhnerシェーカー(36.5℃、75%湿度、6%CO2、225RPM)中でインキュベートした。培養温度を、(a)生細胞密度(VCD)が約16×106細胞/mLに達したときか、又は(b)7日目かのいずれか早い方に、31℃に変化させた。
各々のバッチ由来のフェッドバッチ培養物を10日目及び14日目に回収した。回収された培養物由来の上清を力価についてプロテインA-HPLCにより測定した。各々のバッチの力価は、表1並びに図16A及び16Bに示されている通りである。
表1.フェッドバッチ培養物の産生力価
表1.フェッドバッチ培養物の産生力価
各々の抗体についての上位2つのプールのフェッドバッチ培養物の上清をワンステッププロテインA精製によってさらに精製した。その後、プロテインA精製抗体を表2に示されているサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)による品質分析及び表3に示されているキャピラリー電気泳動(CE)に供した。
表2.上位の安定なプールのSECプロファイル
表3.上位の安定なプールのCEプロファイル
表2.上位の安定なプールのSECプロファイル
上の結果は、抗体B2Bを発現するCHO-K1細胞が、抗体C3Cを発現するCHO-K1細胞と比較したとき、有意により高い平均力価の抗体を10日目と最終日(例えば、14日目)の両方に産出したことを示している。表1は、抗体C3Cと比較したときのCHO-K1細胞からの優れた抗B2B抗体産生を示している。表2及び3は、CHO-K1細胞によって発現された抗体B2Bの製品品質がCHO-K1細胞によって発現された抗体C2Cの製品品質と同等であることを示している。
(実施例18:再発性/不応性悪性腫瘍を有する対象における差別化された抗CD47抗体であるレムゾパリマブのファースト・イン・ペイシェント試験からの初期単剤療法の結果)
(背景)
CD47は、ほとんどの癌で発現される。CD47とSIRPαの相互作用の遮断は、「私を食べないで(do not eat me)」シグナルの阻害をもたらし、CD47を発現する腫瘍細胞の食作用を引き起こす。薬物クラスとしての抗CD47抗体は、癌に対する有望な治療法として浮上しており、これは、リンパ腫(例えば、実施例22を参照)及び白血病を有する患者における初期の臨床データによって裏付けられている。しかしながら、CD47は、赤血球(RBC)でも天然に発現される。初期臨床試験及び前臨床試験は、様々な治療用抗CD47抗体が、血液毒性、すなわち、重度の貧血又は血小板減少症を引き起こし得ることを示している。
(背景)
CD47は、ほとんどの癌で発現される。CD47とSIRPαの相互作用の遮断は、「私を食べないで(do not eat me)」シグナルの阻害をもたらし、CD47を発現する腫瘍細胞の食作用を引き起こす。薬物クラスとしての抗CD47抗体は、癌に対する有望な治療法として浮上しており、これは、リンパ腫(例えば、実施例22を参照)及び白血病を有する患者における初期の臨床データによって裏付けられている。しかしながら、CD47は、赤血球(RBC)でも天然に発現される。初期臨床試験及び前臨床試験は、様々な治療用抗CD47抗体が、血液毒性、すなわち、重度の貧血又は血小板減少症を引き起こし得ることを示している。
レムゾパリマブ(TJ011133、TJC4、又はB2Bとしても知られる)は、IgG4アイソタイプの新規の完全ヒトCD47抗体である。これは、RBCとの最小の相互作用のために、計画的に、独自に選択され、同じクラスの他のCD47抗体とは高度に差別化されている。レムゾパリマブは、カニクイザルにおけるRBCレベルの最小かつ一過性の低下のみを誘導する(例えば、図9Bを参照)。レムゾパリマブのRBC温存特性は、RBC上のグリコシル化によって遮蔽されるCD47の独特の糖エピトープのその認識に機械的に起因する。レムゾパリマブは、(a)様々な腫瘍細胞タイプへの結合、(b)インビトロでの腫瘍食作用、及び(c)マウス異種移植モデルにおける腫瘍根絶のための強い活性を保持する。
(方法/試験設計)
本実施例は、進行性の再発性又は不応性固形腫瘍及びリンパ腫を有する対象におけるレムゾパリマブの安全性、忍容性、最大忍容可能用量(MTD)又は最大投与用量(MAD)、薬物動態(PK)、及び薬力学(PD)、並びに推奨される第2相用量(RP2D)を評価するために設計された第1相試験からの予備的な結果を提供する。標準的な3+3設計における本試験のパート1の単剤用量漸増を使用した。図17を参照されたい。レムゾパリマブを、プライミング用量(例えば、治療用抗CD47抗体を投与するときに一般に使用される低い(~1mg/kg)週1回用量)なしの連続用量コホート(1、3、10、20、及び30mg/kg)で、進行性の再発性又は不応性固形腫瘍を有する患者に週1回のIV注入として投与した。
本実施例は、進行性の再発性又は不応性固形腫瘍及びリンパ腫を有する対象におけるレムゾパリマブの安全性、忍容性、最大忍容可能用量(MTD)又は最大投与用量(MAD)、薬物動態(PK)、及び薬力学(PD)、並びに推奨される第2相用量(RP2D)を評価するために設計された第1相試験からの予備的な結果を提供する。標準的な3+3設計における本試験のパート1の単剤用量漸増を使用した。図17を参照されたい。レムゾパリマブを、プライミング用量(例えば、治療用抗CD47抗体を投与するときに一般に使用される低い(~1mg/kg)週1回用量)なしの連続用量コホート(1、3、10、20、及び30mg/kg)で、進行性の再発性又は不応性固形腫瘍を有する患者に週1回のIV注入として投与した。
(結果)
(ベースライン特徴)
進行性の再発性又は不応性固形腫瘍(すなわち、肺、卵巣、直腸結腸、膵臓、肉腫、頭頸部、胃、腎臓、及び皮膚)を有する20人の患者を単剤療法用量漸増試験に登録した。qwで1、3、10、20、又は30mg/kgのレムゾパリマブが投与された患者のベースライン特徴及び患者の数は、表4に示されている:
表4:ベースライン特徴
(ベースライン特徴)
進行性の再発性又は不応性固形腫瘍(すなわち、肺、卵巣、直腸結腸、膵臓、肉腫、頭頸部、胃、腎臓、及び皮膚)を有する20人の患者を単剤療法用量漸増試験に登録した。qwで1、3、10、20、又は30mg/kgのレムゾパリマブが投与された患者のベースライン特徴及び患者の数は、表4に示されている:
表4:ベースライン特徴
(安全性)
試験の全体を通じて、用量制限毒性(DLT)又は薬物関連の重大有害作用(SAE)がないことが報告された。グレード3のリパーゼ増加1例を除き、治療関連有害作用(TAAE)は全て、グレード1又はグレード2のどちらかであった。表5(GR=グレード)を参照されたい。毒性は全て、有害事象共通用語基準(Common Terminology Criteria for Adverse Events)(CTCAE) v 5.0を用いて等級分けした。例えば、ctep(dot)癌(dot)gov/protocoldevelopment/electronic_applications/docs/CTCAE_v5_Quick_Reference_5x7(dot)pdfを参照されたい。
表5:コホート別の治療関連有害事象(TRAE)
試験の全体を通じて、用量制限毒性(DLT)又は薬物関連の重大有害作用(SAE)がないことが報告された。グレード3のリパーゼ増加1例を除き、治療関連有害作用(TAAE)は全て、グレード1又はグレード2のどちらかであった。表5(GR=グレード)を参照されたい。毒性は全て、有害事象共通用語基準(Common Terminology Criteria for Adverse Events)(CTCAE) v 5.0を用いて等級分けした。例えば、ctep(dot)癌(dot)gov/protocoldevelopment/electronic_applications/docs/CTCAE_v5_Quick_Reference_5x7(dot)pdfを参照されたい。
表5:コホート別の治療関連有害事象(TRAE)
(ヘモグロビン及び網状赤血球レベルに対する効果)
第一サイクル(すなわち、21日)におけるヘモグロビンレベルの一過性の低下が全てのコホートにわたって観察された。図18Aは、20人の患者全員のヘモグロビン及び網状赤血球レベルの時間経過を示しており、図18Bは、最大用量(30mg/kg)のレムゾパリマブを受容した患者におけるヘモグロビン及び網状赤血球レベルの時間経過を示している。平均の下落は、~10%であり、用量依存的ではなかった。この発見は、前臨床的な優良実験室基準(GLP)毒性試験の結果と一致している。報告された薬物関連貧血はいずれも、重症又は溶血性の性質であるとみなされなかった。
第一サイクル(すなわち、21日)におけるヘモグロビンレベルの一過性の低下が全てのコホートにわたって観察された。図18Aは、20人の患者全員のヘモグロビン及び網状赤血球レベルの時間経過を示しており、図18Bは、最大用量(30mg/kg)のレムゾパリマブを受容した患者におけるヘモグロビン及び網状赤血球レベルの時間経過を示している。平均の下落は、~10%であり、用量依存的ではなかった。この発見は、前臨床的な優良実験室基準(GLP)毒性試験の結果と一致している。報告された薬物関連貧血はいずれも、重症又は溶血性の性質であるとみなされなかった。
(薬物動態(PK))
レムゾパリマブのPKプロファイルは、単回投与後、10mg/kgよりも高い用量で直線的であるように見えたが、その曝露は1~10mg/kgの用量範囲にわたって用量比例的であるものよりも大きく、より高い用量では、レムゾパリマブがCD47のシンク効果を克服することができることを示唆している。図19Aは、単回投与後の患者におけるレムゾパリマブの血清PKを示しており、図19Bは、複数回投与後の患者におけるレムゾパリマブqwの血清PKを示している。5人の対象は、1回目の治療の後: 3人は1mg/kgから、1人は3mg/kgから、1人は10mg/kgから、抗薬物抗体(ADA)について陽性であることが確認された。安全性又はPKに対して、ADAの影響は見られなかった。
レムゾパリマブのPKプロファイルは、単回投与後、10mg/kgよりも高い用量で直線的であるように見えたが、その曝露は1~10mg/kgの用量範囲にわたって用量比例的であるものよりも大きく、より高い用量では、レムゾパリマブがCD47のシンク効果を克服することができることを示唆している。図19Aは、単回投与後の患者におけるレムゾパリマブの血清PKを示しており、図19Bは、複数回投与後の患者におけるレムゾパリマブqwの血清PKを示している。5人の対象は、1回目の治療の後: 3人は1mg/kgから、1人は3mg/kgから、1人は10mg/kgから、抗薬物抗体(ADA)について陽性であることが確認された。安全性又はPKに対して、ADAの影響は見られなかった。
(薬理学(PD))
末梢T細胞上のCD47の最大飽和(受容体占有RO)は、レムゾパリマブの週1回投与後、20及び30mg/kgで達成された。図20を参照されたい。
末梢T細胞上のCD47の最大飽和(受容体占有RO)は、レムゾパリマブの週1回投与後、20及び30mg/kgで達成された。図20を参照されたい。
(予備的有効性)
1例の確認された部分応答(PR)が30mg/kg単剤療法コホートで観察された(1/3)。5サイクルで行われている30mg/kg qwの単剤療法が終了した。患者は、転移性黒色腫を有しており、ニボルマブ(抗PD1抗体)及びイピリムマブ(抗CTLA抗体)による事前の全身治療を受けていた。黒色腫患者における肝転移の応答を示している図21を参照されたい。
1例の確認された部分応答(PR)が30mg/kg単剤療法コホートで観察された(1/3)。5サイクルで行われている30mg/kg qwの単剤療法が終了した。患者は、転移性黒色腫を有しており、ニボルマブ(抗PD1抗体)及びイピリムマブ(抗CTLA抗体)による事前の全身治療を受けていた。黒色腫患者における肝転移の応答を示している図21を参照されたい。
(結論)
レムゾパリマブは、プライミング投与戦略なしで、週ベースで最大30mg/kgまで安全でかつ忍容性が良好であるように見える。用量制限毒性は観察されず、最大耐用量に達しなかった。最も頻繁に起こる有害事象には、疲労及び一過性の貧血が含まれた。治療関連の重大有害事象は認められなかった。レムゾパリマブPKは、単回投与後、顕著なシンク効果を伴わずに、中~高用量レベルで直線的であるように見える。単剤臨床活性(部分応答)は、チェックポイント阻害剤による事前治療に失敗していた1人の患者(30mg/kg)で観察された。
(参考文献)
Willingham et al. (2012) PNAS USA. 109(17): 6662-6667
Liu et al. (2015) PLOS One. 10(9): e0137345
Sikic et al. (2019) J Clin Oncol. 37:946-953.
レムゾパリマブは、プライミング投与戦略なしで、週ベースで最大30mg/kgまで安全でかつ忍容性が良好であるように見える。用量制限毒性は観察されず、最大耐用量に達しなかった。最も頻繁に起こる有害事象には、疲労及び一過性の貧血が含まれた。治療関連の重大有害事象は認められなかった。レムゾパリマブPKは、単回投与後、顕著なシンク効果を伴わずに、中~高用量レベルで直線的であるように見える。単剤臨床活性(部分応答)は、チェックポイント阻害剤による事前治療に失敗していた1人の患者(30mg/kg)で観察された。
(参考文献)
Willingham et al. (2012) PNAS USA. 109(17): 6662-6667
Liu et al. (2015) PLOS One. 10(9): e0137345
Sikic et al. (2019) J Clin Oncol. 37:946-953.
(実施例22:再発性及び不応性非ホジキンリンパ腫における差別化された抗CD47抗体であるレムゾパリマブとリツキシマブとの組合せの初期臨床結果)
(序論)
レムゾパリマブ(TJ011133、TJC4、及びB2Bとしても知られる)は、独特の赤血球温存特性を付与する独自のCD47エピトープを標的とする一方で、固形腫瘍を有する患者で示されているような強い抗腫瘍活性を保持する差別化されたCD47 IgG4抗体である(実施例21を参照)。レムゾパリマブは、顕著な血液毒性を誘導せず、他のCD47抗体に必要とされるプライミング用量(例えば、~1mg/kgの低い週1回用量)を必要とせずに投与することができる。レムゾパリマブは、リンパ腫動物モデルにおいてリツキシマブと組み合わせたとき、治療効果の増強を示す。
(序論)
レムゾパリマブ(TJ011133、TJC4、及びB2Bとしても知られる)は、独特の赤血球温存特性を付与する独自のCD47エピトープを標的とする一方で、固形腫瘍を有する患者で示されているような強い抗腫瘍活性を保持する差別化されたCD47 IgG4抗体である(実施例21を参照)。レムゾパリマブは、顕著な血液毒性を誘導せず、他のCD47抗体に必要とされるプライミング用量(例えば、~1mg/kgの低い週1回用量)を必要とせずに投与することができる。レムゾパリマブは、リンパ腫動物モデルにおいてリツキシマブと組み合わせたとき、治療効果の増強を示す。
(方法)
これは、少なくとも2回の前治療歴を有するCD20陽性非ホジキンリンパ腫(NHL)を有する再発性かつ不応性(R/R)の患者を登録した第1b相試験である。患者には、3+3用量漸増設計でレムゾパリマブを投与し、その後、用量を拡大した。レムゾパリマブを、週1回20mg/kg又は週1回30mg/kgの用量で、リツキシマブ(週1回375mg/m2を5回投与、その後、月1回(q4w又は28日毎)を3回投与と組み合わせて、静脈内投与した。Lugano基準(Chesonらの文献(2014) Journal of Clinical Oncology. 32:27, 3059-3067及びVan Heertumらの文献(2017) Drug Des Devel Ther. 11: 1719-1728を参照)に基づく安全性、忍容性、薬物動態(PK)、薬力学(PD)、及び抗腫瘍活性を評価した。
これは、少なくとも2回の前治療歴を有するCD20陽性非ホジキンリンパ腫(NHL)を有する再発性かつ不応性(R/R)の患者を登録した第1b相試験である。患者には、3+3用量漸増設計でレムゾパリマブを投与し、その後、用量を拡大した。レムゾパリマブを、週1回20mg/kg又は週1回30mg/kgの用量で、リツキシマブ(週1回375mg/m2を5回投与、その後、月1回(q4w又は28日毎)を3回投与と組み合わせて、静脈内投与した。Lugano基準(Chesonらの文献(2014) Journal of Clinical Oncology. 32:27, 3059-3067及びVan Heertumらの文献(2017) Drug Des Devel Ther. 11: 1719-1728を参照)に基づく安全性、忍容性、薬物動態(PK)、薬力学(PD)、及び抗腫瘍活性を評価した。
(結果)
事前のCD20標的療法を受けて進行していた再発性/不応性非ホジキンリンパ腫(R/R NHL)を有する厳しい前治療を受けた8人の患者を、リツキシマブと組み合わせた20mg/kg(n=6)及び30mg/kg(n=2)のレムゾパリマブの用量コホートに登録した。診断には、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)[n=2]、マントル細胞リンパ腫(MCL)[n=1]、及び濾胞性リンパ腫(FL)[n=5]が含まれた。患者は、63歳の年齢中央値(範囲: 43~83)及び4回の事前療法の中央値(範囲: 2~10)を有していた。安全性及び忍容性:最も一般的な治療関連有害事象(TRAE)は、注入関連反応(n=4)、掻痒症(n=3)、疲労(n=3)、発疹(n=2)、便秘(n=2)、及び呼吸困難(n=2)であった。20mg/kg用量レベルで、胸膜滲出、頻脈、咳、掻痒症、疲労、発疹、及び呼吸困難を含むグレード3のTRAEを報告した1人の例外を除き、TRAEは全て、グレード1又は2であった。軽度の血液有害事象(AE)が、それぞれ、1回の単発的な貧血及び血小板減少症の発作として観察され、治療は必要なかった。PK及びPD:リツキシマブの共投与は、レムゾパリマブのPK又は免疫原性に影響を及ぼさなかった。平均して、80%及び90%のCD47受容体占有が、それぞれ、20及び30mg/kgで投与された患者由来の生検リンパ節で検出され、顕著な腫瘍標的エンゲージメントを示した。抗腫瘍活性:有効性評価可能な7人の患者のうち、FLの3例の完全応答(CR)[1例の形質転換したFL-DLBCL+2例のFL]及び1例の部分応答(PR)が3例の安定疾患(SD持続期間3~6カ月)とともに観察された(ORR=57%)。全体的な疾患制御率(DCR)は100%であった。腫瘍の縮小は、評価可能な全ての患者で観察された。1人の患者は、第一サイクルで試験から脱落した後の臨床的疾患進行が原因で、治療有効性について評価することができなかった。治療に対する初期応答までの時間中央値は2カ月であり、全てのレスポンダーがデータカットオフの時点で臨床応答を持続していた。継続的な治療の間、2人の患者は、改善された応答を生じた。形質転換したFL-DLBCLを有する1人の患者は、2カ月目のPRから8カ月目のCRに改善し、FLを有する別の患者は、2カ月目のSDから4カ月目のPRに改善した。
事前のCD20標的療法を受けて進行していた再発性/不応性非ホジキンリンパ腫(R/R NHL)を有する厳しい前治療を受けた8人の患者を、リツキシマブと組み合わせた20mg/kg(n=6)及び30mg/kg(n=2)のレムゾパリマブの用量コホートに登録した。診断には、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)[n=2]、マントル細胞リンパ腫(MCL)[n=1]、及び濾胞性リンパ腫(FL)[n=5]が含まれた。患者は、63歳の年齢中央値(範囲: 43~83)及び4回の事前療法の中央値(範囲: 2~10)を有していた。安全性及び忍容性:最も一般的な治療関連有害事象(TRAE)は、注入関連反応(n=4)、掻痒症(n=3)、疲労(n=3)、発疹(n=2)、便秘(n=2)、及び呼吸困難(n=2)であった。20mg/kg用量レベルで、胸膜滲出、頻脈、咳、掻痒症、疲労、発疹、及び呼吸困難を含むグレード3のTRAEを報告した1人の例外を除き、TRAEは全て、グレード1又は2であった。軽度の血液有害事象(AE)が、それぞれ、1回の単発的な貧血及び血小板減少症の発作として観察され、治療は必要なかった。PK及びPD:リツキシマブの共投与は、レムゾパリマブのPK又は免疫原性に影響を及ぼさなかった。平均して、80%及び90%のCD47受容体占有が、それぞれ、20及び30mg/kgで投与された患者由来の生検リンパ節で検出され、顕著な腫瘍標的エンゲージメントを示した。抗腫瘍活性:有効性評価可能な7人の患者のうち、FLの3例の完全応答(CR)[1例の形質転換したFL-DLBCL+2例のFL]及び1例の部分応答(PR)が3例の安定疾患(SD持続期間3~6カ月)とともに観察された(ORR=57%)。全体的な疾患制御率(DCR)は100%であった。腫瘍の縮小は、評価可能な全ての患者で観察された。1人の患者は、第一サイクルで試験から脱落した後の臨床的疾患進行が原因で、治療有効性について評価することができなかった。治療に対する初期応答までの時間中央値は2カ月であり、全てのレスポンダーがデータカットオフの時点で臨床応答を持続していた。継続的な治療の間、2人の患者は、改善された応答を生じた。形質転換したFL-DLBCLを有する1人の患者は、2カ月目のPRから8カ月目のCRに改善し、FLを有する別の患者は、2カ月目のSDから4カ月目のPRに改善した。
(結論)
単剤療法の結果(実施例21を参照)と一致して、リツキシマブと組み合わせて20~30mg/kgで投与されたレムゾパリマブは、他の治療用抗CD47抗体で一般に必要とされるプライミング用量を必要とせずに、R/R NHLを有する患者において安全でかつ忍容性が良好である。両方の用量レベルで、高レベルの腫瘍内標的エンゲージメントに達した。組合せ療法は、事前のCD20標的療法を受けて進行していた、厳しい前治療を受けたR/R NHL患者における臨床活性の証拠を示した。
単剤療法の結果(実施例21を参照)と一致して、リツキシマブと組み合わせて20~30mg/kgで投与されたレムゾパリマブは、他の治療用抗CD47抗体で一般に必要とされるプライミング用量を必要とせずに、R/R NHLを有する患者において安全でかつ忍容性が良好である。両方の用量レベルで、高レベルの腫瘍内標的エンゲージメントに達した。組合せ療法は、事前のCD20標的療法を受けて進行していた、厳しい前治療を受けたR/R NHL患者における臨床活性の証拠を示した。
本発明は、本発明の実施のための好ましい様式を含むことが本発明者らによって見出され又は提案された特定の実施態様に関して記載されている。本開示を考慮して、多くの修正及び変更を、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施態様において行うことができることが当業者によって理解されるであろう。例えば、コドン縮重のために、変更を、タンパク質配列に影響を及ぼすことなく、基礎となるDNA配列において行うことができる。さらに、生物学的な機能的等価性を考慮することにより、変更を、種類又は量において生物学的作用に影響を及ぼすことなく、タンパク質構造において行うことができる。そのような修正は全て、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
アミノ酸及び核酸配列
アミノ酸及び核酸配列
Claims (64)
- 前記VHドメインのN-末端アミノ酸がKabat付番システムによる位置H1に対応し、該VHドメインのC-末端アミノ酸がKabat付番システムによる位置H113に対応する、請求項1記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記VHドメインのN-末端アミノ酸がChothia付番システムによる位置H1に対応し、該VHドメインのC-末端アミノ酸がChothia付番システムによる位置H113に対応する、請求項1記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記VHドメインのN-末端アミノ酸がIMGT付番システムによる位置H1に対応し、該VHドメインのC-末端アミノ酸がIMGT付番システムによる位置H128に対応する、請求項1記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記VHドメインのN-末端アミノ酸が配列番号1のアミノ酸1に対応し、該VHドメインのC-末端アミノ酸が配列番号1のアミノ酸118に対応する、請求項1~4のいずれか一項記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記VHが配列番号1と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記VLが配列番号2と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~5のいずれか一項記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記VHが配列番号1を含み、前記VLが配列番号2を含む、請求項1~6のいずれか一項記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- Fcドメインを含む、請求項1~7のいずれか一項記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- ヒトIgG Fcドメインを含む、請求項8記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記ヒトIgG Fcドメインが、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4 Fcドメインである、請求項9記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記抗体が全長抗体である、請求項1~10のいずれか一項記載の抗CD47抗体。
- 配列番号3又は配列番号55を含む重鎖及び配列番号4を含む軽鎖を含む、請求項1~11のいずれか一項記載の抗CD47抗体。
- 前記断片が、Fab、Fab'、F(ab)'2、Fab'-SH、単鎖Fv(scFv)、Fv断片、又は線状抗体である、請求項1~10のいずれか一項記載の抗CD47抗体の免疫学的活性断片。
- 前記抗体又はその断片がモノクローナル抗体又はその断片である、請求項1~13のいずれか一項記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記抗体又はその断片がキメラ又はヒト化されたものである、請求項1~14のいずれか一項記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記抗体又は断片が癌細胞の表面に発現されたhCD47に結合する、請求項1~15のいずれか一項記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記癌細胞が、SK-OV-3細胞、Toledo細胞、K562細胞、HCC827細胞、Jurkat細胞、U937細胞、TF-1細胞、Raji細胞、SU-DHL-4細胞、MDA-MB-231細胞、A375細胞、又はSK-MES-1細胞である、請求項16記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記癌細胞が固形腫瘍癌である、請求項16記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記固形腫瘍癌が、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌、肉腫癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、又は皮膚癌である、請求項18記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記癌細胞が血液癌である、請求項16記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記血液癌が非ホジキンリンパ腫である、請求項20記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記抗体又は断片が血液細胞の表面に発現されたhCD47に結合しない、請求項1~21のいずれか一項記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記血液細胞が赤血球である、請求項22記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記抗体又はその断片とhCD47との結合がhCD47とシグナル調節タンパク質α(SIRPα)との相互作用を妨げる、請求項1~23のいずれか一項記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記SIRPαがヒトSIRPα(hSIRPα)である、請求項24記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記抗体又はその断片と癌細胞の表面に発現されたhCD47との結合が該癌細胞のマクロファージ媒介性食作用を促進する、請求項1~25のいずれか一項記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記癌細胞が、SK-OV-3細胞、Toledo細胞、K562細胞、HCC827細胞、Jurkat細胞、U937細胞、TF-1細胞、Raji細胞、SU-DHL-4細胞、MDA-MB-231細胞、A375細胞、又はSK-MES-1細胞である、請求項26記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記癌細胞が固形腫瘍癌である、請求項26記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記固形腫瘍癌が、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌、肉腫癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、又は皮膚癌である、請求項28記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記癌細胞が血液癌である、請求項26記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記血液癌が非ホジキンリンパ腫である、請求項30記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 前記抗体又はその断片の対象への投与が該対象における顕著なレベルの赤血球凝集又は該対象の赤血球の枯渇を引き起こさない、請求項1~31のいずれか一項記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片。
- 請求項1~32のいずれか一項記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片をコードする核酸。
- 請求項33記載の核酸を含むベクター。
- 請求項33記載の核酸又は請求項34記載のベクターを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項35記載の宿主細胞。
- 前記哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項36記載の宿主細胞。
- 前記CHO細胞がCHO-K1細胞である、請求項37記載の宿主細胞。
- 抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片を産生する方法であって、
a)請求項35~38のいずれか一項記載の宿主細胞を、該抗CD47抗体又はその抗原結合断片の発現を引き起こすのに効果的な条件下で培養すること;及び
b)該宿主細胞によって発現された該抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片を回収すること
:を含む、前記方法。 - 請求項1~32のいずれか一項記載の抗CD47抗体又はその免疫学的活性断片及び医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物。
- 前記癌が固形腫瘍である、請求項41記載の方法。
- 前記固形腫瘍が、肺腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍、肉腫腫瘍、頭頸部腫瘍、胃腫瘍、腎腫瘍、又は皮膚腫瘍である、請求項42又は43記載の方法。
- 前記固形腫瘍が再発性及び/又は不応性固形腫瘍である、請求項42又は43記載の方法。
- 前記癌が非ホジキンリンパ腫(NHL)であり、前記方法が有効量のリツキシマブを前記対象に投与することをさらに含む、請求項41記載の方法。
- 前記NHLが、濾胞性リンパ腫(FL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、又はマントル細胞リンパ腫(MCL)である、請求項45記載の方法。
- 前記NHLが再発性/不応性NHLである、請求項45又は46記載の方法。
- 前記対象が少なくとも1回のNHLの事前治療を受けたことがある、請求項45~47のいずれか一項記載の方法。
- 前記対象が2~10回のNHLの事前療法を受けたことがある、請求項48記載の方法。
- 前記対象がCD20を標的とする薬剤によるNHLの事前治療を受けたことがある、請求項48又は49記載の方法。
- 前記対象がCD20を標的とする薬剤による事前療法の間又はその後に進行した、請求項50記載の方法。
- 前記抗CD47抗体がヒトIgG4定常領域又はS233P突然変異を含むその変異体(ここで、付番はEUインデックスによるものである)を含む、請求項41~51のいずれか一項記載の方法。
- 前記抗CD47抗体が前記対象に10mg/kgの用量で投与される、請求項41~52のいずれか一項記載の方法。
- 前記抗CD47抗体が前記対象に20mg/kgの用量で投与される、請求項41~52のいずれか一項記載の方法。
- 前記抗CD47抗体が前記対象に30mg/kgの用量で投与される、請求項41~52のいずれか一項記載の方法。
- 前記抗CD47抗体が前記対象に毎週1回(qw)投与される、請求項41~55のいずれか一項記載の方法。
- 前記抗CD47抗体が前記対象に静脈内(IV)注入を介して投与される、請求項41~56のいずれか一項記載の方法。
- 前記リツキシマブが、最初の5週間、375mg/m2の用量で週1回(qw)、及び該最初の5週間の後、375mg/m2の用量で4週間毎に1回(q4w)投与される、請求項45~57のいずれか一項記載の方法。
- 前記対象が前記抗CD47抗体による治療による重大な血液毒性を経験しない、請求項41~58のいずれか一項記載の方法。
- 前記対象が前記抗CD47抗体による治療による血液毒性を全く経験しない、請求項59記載の方法。
- 前記血液毒性が、貧血、血球減少症、及び/又は赤血球凝集を含む、請求項59又は60記載の方法。
- 前記抗CD47抗体のVHが配列番号1を含み、かつ該抗CD47抗体のVLが配列番号2を含む、請求項41~61のいずれか一項記載の方法。
- 前記抗CD47抗体の重鎖が配列番号3又は配列番号55を含み、かつ該抗CD47抗体の軽鎖が配列番号4を含む、請求項41~62のいずれか一項記載の方法。
- 癌を治療するためのキットであって、請求項1~32のいずれか一項記載の抗体又は請求項40記載の組成物を含む、前記キット。
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