KR20230114745A - 신규 항-cd47 항체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에 제공된 것은 인간에서 낮은 면역원성을 갖고 적혈구 고갈 또는 혈구응집 수준이 낮거나 없는 CD47 항체 및 이의 면역학적 활성 단편이다. 또한 이러한 항체 또는 항체 단편을 함유하는 약제학적 조성물뿐 아니라 이러한 항체를 예를 들어 단일 제제로서 또는 다른 치료제(들)과 조합하여 사용하는 치료 방법도 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 10월 14일 출원된 국제 출원 번호 PCT/CN2020/120869 및 2020년 10월 20일 출원된 국제 출원 번호 PCT/CN2020/122188의 우선권을 주장하고, 이의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일에 서열 목록 제출
ASCII 텍스트 파일의 다음 제출 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 형태(CRF)(파일 명: 233002000241SEQLIST. TXT, 기록일: 2021년 10월 12일, 크기: 31,455 바이트)
기술분야
본 출원은 항-CD47 항체, 이러한 항체를 제조하는 방법 및 CD47과 관련한 질병 및 장애의 치료에서 이러한 항체의 용도에 관한 것이다.
CD47(분화 클러스터 47)은 1980년대에 인간 난소암에서의 종양 항원으로 처음 확인되었다. 그 후로부터, CD47은 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 비호지킨 림프종(NHL), 다발성 골수종(MM), 방광암 및 기타 고형 종양을 포함하는 여러 인간 종양 유형에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 높은 수준의 CD47은 암 세포가 더 높은 수준의 칼레티쿨린(지배적인 전-식균 신호)을 가짐에도 불구하고 식균작용을 피할 수 있도록 한다.
인테그린 관련 단백질(IAP), 난소암 항원 OA3, RH 관련 항원 및 MER6로도 알려진 CD47은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 다중 스패닝 막관통 수용체이다. 이의 발현 및 활성도는 다수의 질병과 장애와 관련이 있다. 이는 단일 Ig-유사 도메인과 5 개의 막 스패닝 영역을 갖는, 광범위하게 발현되는 막관통 당단백질이며, 신호 조절 단백질α(signal-regulatory-protein α, SIRPα)의 NH2-말단 V-유사 도메인을 통해 매개되는 결합을 갖는 SIRPα에 대한 세포 리간드로서 기능한다. SIRPα는 대식세포, 과립구, 골수 수지상 세포(DC), 비만 세포를 포함하는 골수 세포 및 조혈모세포를 포함한 이들의 전구세포에서 주로 발현된다.
대식세포는 식균작용을 통해 혈류에서 병원균과 손상되거나 노화된 세포를 제거한다. 세포 표면 CD47은 대식세포에 있는 이의 수용체, SIRPα와 상호작용하여 정상적이고 건강한 세포에 대한 식균작용을 억제한다. SIRPα는 대식세포에 의한 숙주 세포에 대한 식균작용을 억제하며, 숙주 표적 세포에 발현된 CD47에 의한 대식세포 상의 SIRPα의 라이게이션(ligation)은 식균작용을 음성적으로 조절하는 SHP-1에 의해 매개되는 억제 신호를 생성한다.
정상 세포에 대한 식균작용을 억제하는 CD47의 역할에 따라, CD47이 조혈모세포(HSC)와 전구세포 상에서 이들의 이동 단계 직전 및 도중에 일시적으로 과발현되고, 이들 세포의 CD47 수준이 생체 내에서 삼켜질 확률을 결정한다는 증거가 있다.
CD47은 또한 골수성 백혈병을 포함한 여러 암에서 구성적으로 과발현된다. 골수성 백혈병 세포주에서의 CD47의 과발현은 식균작용을 회피하도록 함으로써 병원성을 증가시킨다. CD47 과발현은 염증 매개 동원(mobilization) 도중 정상 HSC에 대한 보호를 제공하기 위한 중요한 메커니즘이고, 백혈병 전구세포는 대식세포 사멸을 피하기 위해 이 능력을 선택한다는 것이 결론내려졌다.
특정 CD47 항체는 식균작용을 회복시키고 죽상동맥경화증을 예방하는 것으로 나타났다. 예를 들어, Kojima et al., Nature, Vol. 36, 86-90 (2016. 8. 4.) 참조. 본 발명은, 인간에서 낮은 면역원성을 갖고 적혈구 고갈 수준이 낮거나 없는 신규 CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 제공한다. 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 이러한 항체는 상호교환적으로 "항-CD47 항체"로 지칭될 수 있다.
발명의 요약
본 명세서에 제공된 것은 인간 CD47(hCD47)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편이고, 다음을 포함한다: (a) (1) N-말단에 글루탐산 잔기(E); (2) RAWMN(서열번호: 5)을 포함하는 CDR-H1; (3) RIKRKTDGETTDYAAPVKG(서열번호: 6)를 포함하는 CDR-H2; (4) SNRAFDI(서열번호: 7)를 포함하는 CDR-H3; 및 (5) C-말단에 세린(S)을 포함하는 중쇄 가변(VH) 도메인; 및 (b) (1) KSSQSVLYAGNNRNYLA(서열번호: 8)을 포함하는 CDR-L1; (2) QASTRAS(서열번호: 9)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) QQYYTPPLA(서열번호: 10)를 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인.
일부 실시양태에서, VH 도메인의 N-말단 아미노산은 Kabat 넘버링 시스템에 따른 위치 H1에 해당하고, VH 도메인의 C-말단 아미노산은 Kabat 넘버링 시스템에 따른 위치 H113에 해당한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인의 N-말단 아미노산은 Chothia 넘버링 시스템에 따른 위치 H1에 해당하고, VH 도메인의 C-말단 아미노산은 Chothia 넘버링 시스템에 따른 위치 H113에 해당한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인의 N-말단 아미노산은 IMGT 넘버링 시스템에 따른 위치 H1에 해당하고, VH 도메인의 C-말단 아미노산은 IMGT 넘버링 시스템에 따른 위치 H128에 해당한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인의 N-말단 아미노산은 서열번호: 1의 아미노산 1에 해당하고, VH 도메인의 C-말단 아미노산은 서열번호: 1의 아미노산 118에 해당한다. 일부 실시양태에서, VH는 서열번호: 1과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열번호: 2와 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 서열번호: 1을 포함하고, VL은 서열번호: 2를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편은 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 IgG Fc 도메인이다. 일부 실시양태에서, 인간 IgG Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 도메인이다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 전장 항체(full length antibody)이다. 일부 실시양태에서, 전장 항-CD47 항체는 서열번호: 3 또는 서열번호: 55를 포함하는 중쇄 및 서열번호: 4를 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체의 면역학적 활성 단편은 Fab, Fab', F(ab)'2, Fab'-SH, 단일쇄 Fv(scFv), Fv 단편 또는 선형 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편은 단일클론항체 또는 이의 단편이다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편은 키메라 또는 인간화된 것이다.
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편은 암 세포의 표면 상에 발현된 hCD47에 결합한다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 SK-OV-3 세포, Toledo 세포, K562 세포, HCC827 세포, Jurkat 세포, U937 세포, TF-1 세포, Raji 세포, SU-DHL-4 세포, MDA-MB-231 세포, A375 세포 또는 SK-MES-1 세포이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 고형 종양 암이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 암은 폐암, 난소암, 대장암, 췌장암, 육종암, 두경부암, 위암, 신장암 또는 피부암이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 혈액암이다. 일부 실시양태에서, 혈액암은 비호지킨 림프종이다.
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편은 혈액 세포의 표면 상에 발현된 hCD47에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 혈액 세포는 적혈구이다. 일부 실시양태에서, hCD47에 대한 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편의 결합은 hCD47과 신호 조절 단백질 α(SIRPα)의 상호작용을 예방한다. 일부 실시양태에서, SIRPα는 인간 SIRPα(hSIRPα)이다. 일부 실시양태에서, 암 세포의 표면 상에 발현된 hCD47에 대한 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편의 결합은 암 세포에 대한 대식세포 매개 식균작용을 촉진시킨다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 SK-OV-3 세포, Toledo 세포, K562 세포, HCC827 세포, Jurkat 세포, U937 세포, TF-1 세포, Raji 세포, SU-DHL-4 세포, MDA-MB-231 세포, A375 세포 또는 SK-MES-1 세포이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 고형 종양 암이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 암은 폐암, 난소암, 대장암, 췌장암, 육종암, 두경부암, 위암, 신장암 또는 피부암이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 혈액암이다. 일부 실시양태에서, 혈액암은 비호지킨 림프종이다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 투여해도 대상체에서의 현저한 수준의 혈구응집 또는 대상체의 적혈구 고갈을 유발하지 않는다.
본 명세서에 기재된 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 암호화하는 핵산이 본 명세서에 제공된다. 이러한 핵산을 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 또한, 본 명세서에 기재된 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 포유류 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 일부 실시양태에서, CHO 세포는 CHO-K1 세포이다. 관련된 양태에서, a) 항-CD47 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현을 유발하기에 효과적인 조건 하에서 본 명세서에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 b) 숙주 세포에 의해 발현된 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 제조하는 방법이 제공된다.
항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
(a) (1) RAWMN(서열번호: 5)을 포함하는 CDR-H1; (2) RIKRKTDGETTDYAAPVKG(서열번호: 6)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) SNRAFDI(서열번호: 7)를 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); (b) (1) KSSQSVLYAGNNRNYLA(서열번호: 8)를 포함하는 CDR-L1; (2) QASTRAS(서열번호: 9)를 포함하는 CDR-L2; 및 QQYYTPPLA(서열번호: 10)를 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하는 항-CD47 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 폐 종양, 난소 종양, 대장 종양, 췌장 종양, 육종 종양, 두경부 종양, 위 종양, 신장 종양 또는 피부 종양이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 재발성 및/또는 난치성 고형 종양이다.
일부 실시양태에서, 암은 비호지킨 림프종(NHL)이고, 방법은 리툭시맙(rituximab)의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, NHL은 여포성 림프종(FL), 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL) 또는 맨틀 세포 림프종(MCL)이다. 일부 실시양태에서, NHL은 재발성/난치성 NHL이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 NHL에 대한 선행 치료를 적어도 1 회 받았다. 일부 실시양태에서, 대상체는 NHL에 대한 선행 치료를 2 내지 10회 사이로 받았다. 일부 실시양태에서, 대상체는 CD20을 표적으로 하는 제제를 사용하는, NHL에 대한 선행 치료를 받았다. 일부 실시양태에서, 대상체는 CD20을 표적으로 하는 제제를 사용하는 선행 치료의 진행 도중 또는 이후에 있었다.
본 명세서에 제공된 임의의 치료방법의 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 S233P 돌연변이(여기서 넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 10 mg/kg의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 20 mg/kg의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 30 mg/kg의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 매주 1 회(qw) 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 정맥내(IV) 주입을 통해 대상체에게 투여된다. NHL 치료방법의 일부 실시양태에서, 리툭시맙은 처음 5 주 동안 375 mg/m2의 용량으로 매주 1회(qw) 투여되고, 처음 5 주 이후 375 mg/m2의 용량으로 4주 마다 1회(q4w) 투여된다.
본 명세서에 기재된 치료방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 항-CD47 항체를 사용한 치료로 인해 현저한 혈액학적 독성을 경험하지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 항-CD47 항체를 사용한 치료로 인해 어떠한 혈액학적 독성도 경험하지 않는다. 일부 실시양태에서, 혈액학적 독성은 빈혈, 혈구감소증 및/또는 혈구응집을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체의 VH는 서열번호: 1을 포함하고, 항-CD47 항체의 VL은 서열번호: 2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체의 중쇄는 서열번호: 3 또는 서열번호: 55를 포함하고, 항-CD47 항체의 경쇄는 서열번호: 4를 포함한다.
또한 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체 또는 약제학적 조성물을 포함하는, 암을 치료하기 위한 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 본 명세서에 제공된 치료방법에 따라 사용하기 위한 것이다.
본 명세서에 기재된 다양한 실시양태의 특성 중 하나, 일부 또는 전부가 조합되어 본 발명의 다른 실시양태를 형성할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 이러한 양태 및 다른 양태는 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명의 이러한 실시양태 및 다른 실시양태는 다음의 상세한 설명에 의해 추가로 설명된다.
도 1은 단량체 CD47-ECD(세포외 도메인)에 결합하는 항-CD47 항체 B2B, 5F9 및 2A1의 용량 의존적 반응을 나타낸다.
도 2는 SIRPα에 대한 CD47의 결합을 차단하는 항-CD47 항체 B2B, 5F9 및 2A1의 용량 의존적 반응을 나타낸다.
도 3은 CD47+ Raji 세포에 결합하는 항-CD47 항체 B2B, 5F9 및 2A1의 용량 의존적 반응을 나타낸다.
도 4는 표면 플라즈몬 공명(BiaCore) 분석에 의해 측정된 CD47 항체의 종양 세포 결합을 나타낸다.
도 5는 Raji 세포 상에 발현된 CD47에 대한 항-CD47 항체 B2B의 결합이 인간 대식세포에 의한 Raji 세포에 대한 식균작용을 촉진시킨다는 것을 나타낸다.
도 6은 다양한 인간 종양 세포주 상에 발현된 CD47에 대한 항-CD47 항체 B2B의 결합이 인간 대식세포에 의한 종양 세포에 대한 식균작용을 촉진시킨다는 것을 나타낸다.
도 7은 CD47 항체에 의한 급성 골수성 백혈병(AML) 세포의 결합을 나타낸다.
도 8은 CD47 항체에 의한 급성 골수성 백혈병(AML) 세포에 대한 식균작용을 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 항-CD47 항체 B2B가 적혈구(RBC)에 대한 결합을 최소화하고 RBC 응집을 일으키지 않음을 나타낸다. 구체적으로, 도 9a는 항-CD47 항체 B2B에 의한 최소화된 RBC 결합을 나타내고, 도 9b는 항-CD47 항체 B2B에 의한 RBC 응집이 없음을 나타낸다.
도 10a-10b는 항-CD47 항체 B2B가 투여 후 사이노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey)에서 현저한 혈액학적 변화를 유도하지 않았음을 나타낸다. 도 10a는 B2B의 단일 투여 처리가 5F9의 처리와 비교하여 RBC 및 헤모글로빈 수준에 대해 최소의 영향을 나타냈음을 도시한다. 도 10b는 상이한 용량으로 B2B를 반복 처리하는 것이 비히클(vehicle) 대조군과 비교하여 수컷 및 암컷 사이노몰거스 원숭이 모두에서 RBC에 현저한 영향을 미치지 않았음을 도시한다.
도 11은 쥐의 루시퍼레이즈-Raji 이종이식 모델(luciferase-Raji xenograft model)에서 CD47 항체 B2B를 사용한 치료의 생체내 효능을 나타낸다.
도 12a는 항-CD47 항체 B2B 투여 후 헤모글로빈 수치의 시간 경과를 각각 나타낸다. 도 12b는 항-CD47 항체 B2B 투여 후 망상적혈구(reticulocyte) 수치의 시간 경과를 각각 나타낸다.
도 13a 및 13b는 단일 투여 및 다중 투여 후의 항-CD47 항체 B2B Q1W의 혈청 약동학(pharmacokinetics, PK)을 나타낸다. 구체적으로, 도 13a는 단일 투여 후의 항-CD47 항체 B2B Q1W의 혈청 PK를 나타내고, 도 13b는 다중 투여 후의 항-CD47 항체 B2B Q1W의 혈청 PK를 나타낸다.
도 14는 CD47 항체 B2B를 다양한 농도로 매주 투여한 후 말초 T세포 상의 수용체 점유율(receptor occupancy, RO)을 나타낸다.
도 15는 항-CD47 항체 B2B 및 C3C의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 16a는 Acti-pro 배지에 의해 제조된 B2B 항체 및 C3C항체의 10일차 역가를 나타낸다. 도 16b는 Acti-pro 배지에 의해 제조된 B2B 항체 및 C3C항체의 최종 역가를 나타낸다.
도 17은 실시예 21 에 기재된 I상 연구를 위한 연구 설계를 제공한다.
도 18a는 실시예 21 에 기재된 I상 연구에 참여한 모든 20 명의 환자의 헤모글로빈 및 망상적혈구 수준의 시간 경과를 나타낸다. 도 18b는 실시예 21 에 기재된 I상 연구에서 항-CD47 항체의 최고 용량(30 mg/kg)을 투여받은 환자의 헤모글로빈 및 망상적혈구 수준의 시간 경과를 나타낸다.
도 19a는 단일 투여 후 환자에서의 항-CD47 항체 렘조팔리맙(lemzoparlimab)의 혈청 약동학을 나타낸다. 도 19b는 다중 투여 후 환자에서의 항-CD47 항체 렘조팔리맙 qw의 혈청 약동학을 나타낸다.
도 20은 매주 20 또는 30 mg/kg의 항체를 투여받은 환자에서의 말초 T세포 상의 항-CD47 항체 렘조팔리맙에 의한 CD47의 %수용체 점유율을 나타낸다.
도 21은 항-CD47 항체로 치료받은 실시예 21의 흑색종 환자에서 반응하는 간 전이를 나타낸다.
도 2는 SIRPα에 대한 CD47의 결합을 차단하는 항-CD47 항체 B2B, 5F9 및 2A1의 용량 의존적 반응을 나타낸다.
도 3은 CD47+ Raji 세포에 결합하는 항-CD47 항체 B2B, 5F9 및 2A1의 용량 의존적 반응을 나타낸다.
도 4는 표면 플라즈몬 공명(BiaCore) 분석에 의해 측정된 CD47 항체의 종양 세포 결합을 나타낸다.
도 5는 Raji 세포 상에 발현된 CD47에 대한 항-CD47 항체 B2B의 결합이 인간 대식세포에 의한 Raji 세포에 대한 식균작용을 촉진시킨다는 것을 나타낸다.
도 6은 다양한 인간 종양 세포주 상에 발현된 CD47에 대한 항-CD47 항체 B2B의 결합이 인간 대식세포에 의한 종양 세포에 대한 식균작용을 촉진시킨다는 것을 나타낸다.
도 7은 CD47 항체에 의한 급성 골수성 백혈병(AML) 세포의 결합을 나타낸다.
도 8은 CD47 항체에 의한 급성 골수성 백혈병(AML) 세포에 대한 식균작용을 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 항-CD47 항체 B2B가 적혈구(RBC)에 대한 결합을 최소화하고 RBC 응집을 일으키지 않음을 나타낸다. 구체적으로, 도 9a는 항-CD47 항체 B2B에 의한 최소화된 RBC 결합을 나타내고, 도 9b는 항-CD47 항체 B2B에 의한 RBC 응집이 없음을 나타낸다.
도 10a-10b는 항-CD47 항체 B2B가 투여 후 사이노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey)에서 현저한 혈액학적 변화를 유도하지 않았음을 나타낸다. 도 10a는 B2B의 단일 투여 처리가 5F9의 처리와 비교하여 RBC 및 헤모글로빈 수준에 대해 최소의 영향을 나타냈음을 도시한다. 도 10b는 상이한 용량으로 B2B를 반복 처리하는 것이 비히클(vehicle) 대조군과 비교하여 수컷 및 암컷 사이노몰거스 원숭이 모두에서 RBC에 현저한 영향을 미치지 않았음을 도시한다.
도 11은 쥐의 루시퍼레이즈-Raji 이종이식 모델(luciferase-Raji xenograft model)에서 CD47 항체 B2B를 사용한 치료의 생체내 효능을 나타낸다.
도 12a는 항-CD47 항체 B2B 투여 후 헤모글로빈 수치의 시간 경과를 각각 나타낸다. 도 12b는 항-CD47 항체 B2B 투여 후 망상적혈구(reticulocyte) 수치의 시간 경과를 각각 나타낸다.
도 13a 및 13b는 단일 투여 및 다중 투여 후의 항-CD47 항체 B2B Q1W의 혈청 약동학(pharmacokinetics, PK)을 나타낸다. 구체적으로, 도 13a는 단일 투여 후의 항-CD47 항체 B2B Q1W의 혈청 PK를 나타내고, 도 13b는 다중 투여 후의 항-CD47 항체 B2B Q1W의 혈청 PK를 나타낸다.
도 14는 CD47 항체 B2B를 다양한 농도로 매주 투여한 후 말초 T세포 상의 수용체 점유율(receptor occupancy, RO)을 나타낸다.
도 15는 항-CD47 항체 B2B 및 C3C의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 16a는 Acti-pro 배지에 의해 제조된 B2B 항체 및 C3C항체의 10일차 역가를 나타낸다. 도 16b는 Acti-pro 배지에 의해 제조된 B2B 항체 및 C3C항체의 최종 역가를 나타낸다.
도 17은 실시예 21 에 기재된 I상 연구를 위한 연구 설계를 제공한다.
도 18a는 실시예 21 에 기재된 I상 연구에 참여한 모든 20 명의 환자의 헤모글로빈 및 망상적혈구 수준의 시간 경과를 나타낸다. 도 18b는 실시예 21 에 기재된 I상 연구에서 항-CD47 항체의 최고 용량(30 mg/kg)을 투여받은 환자의 헤모글로빈 및 망상적혈구 수준의 시간 경과를 나타낸다.
도 19a는 단일 투여 후 환자에서의 항-CD47 항체 렘조팔리맙(lemzoparlimab)의 혈청 약동학을 나타낸다. 도 19b는 다중 투여 후 환자에서의 항-CD47 항체 렘조팔리맙 qw의 혈청 약동학을 나타낸다.
도 20은 매주 20 또는 30 mg/kg의 항체를 투여받은 환자에서의 말초 T세포 상의 항-CD47 항체 렘조팔리맙에 의한 CD47의 %수용체 점유율을 나타낸다.
도 21은 항-CD47 항체로 치료받은 실시예 21의 흑색종 환자에서 반응하는 간 전이를 나타낸다.
정의
실시양태를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은, 당연하게도 다양할 수 있는 특정 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 또한 본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시양태를 설명하기 위한 목적일 뿐, 제한하려는 의도가 아니라는 것을 이해해야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "an" 및 "the"는 내용이 달리 명시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "분자"에 대한 언급은 선택적으로 그러한 분자 2 개 이상의 조합 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "약"은 본 기술분야의 기술자에게 쉽게 알려진 각 값에 대한 일반적인 오차 범위를 의미한다. 본 명세서에 "약" 얼마의 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 실시양태를 포함 (및 설명)한다.
본 발명의 양태 및 실시양태는 "포함하는," "구성되는," 및 "본질적으로 구성되는" 양태 및 실시양태를 포함하는 것으로 이해한다.
용어 "CD47"(인테그린 관련 단백질(IAP), 항원 표면 결정 단백질 OA3, OA3, CD47 항원, RH-관련 항원, 인테그린 관련 신호 전달기, 단일클론항체 1D8에 의해 식별되는 항원, CD47 당단백질로도 알려져 있음)은 바람직하게는 인간 CD47 및, 특히, 아미노산 서열
MWPLVAALLL GSACCGSAQL LFNKTKSVEF TFCNDTVVIP CFVTNMEAQN TTEVYVKWKF
KGRDIYTFDG ALNKSTVPTD FSSAKIEVSQ LLKGDASLKM DKSDAVSHTG NYTCEVTELT
REGETIIELK YRVVSWFSPN ENILIVIFPI FAILLFWGQF GIKTLKYRSG GMDEKTIALL
VAGLVITVIV IVGAILFVPG EYSLKNATGL GLIVTSTGIL ILLHYYVFST AIGLTSFVIA
ILVIQVIAYI LAVVGLSLCI AACIPMHGPL LISGLSILAL AQLLGLVYMK FVASNQKTIQ
PPRKAVEEPL NAFKESKGMM NDE (서열번호: 14)
를 포함하는 단백질 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 의미한다. 용어 "CD47"은 또한 임의의 번역 후 변형된 변이체 및 형태 변이체를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고 원하는 생물학적 활성(예를 들어, 에피토프(epitope) 결합)을 나타내는 한, 온전한 항체(예를 들어, 전장 항체), 항체 단편(Fab, F(ab')2, Fab'-SH, Fv, 다이아바디(diabody), scFv, scFv-Fc, 단일 도메인 항체, 단일 중쇄 항체 및 단일 경쇄 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않음), 단일클론항체 및 다중클론항체를 포함한다. "항체"(또는 "Ab") 및 " 면역글로불린"(또는 "Ig")은 동일한 구조적 특성을 갖는 당단백질이다. 항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 반면, 면역글로불린은 항원 특이성이 결여된 항체 및 기타 항체 유사 분자를 모두 포함한다. 후자 유형의 폴리펩타이드는 예를 들어 림프계에 의해 낮은 수준으로 생성되고 골수종에 의해 증가된 수준으로 생성된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "분리된" 항체는 다른 세포 물질이 실질적으로 없는 항체를 의미할 수 있다. 일 실시양태에서, 분리된 항체는 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 실질적으로 없다. 다른 실시양태에서, 분리된 항체는 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되고 상이한 종으로부터의 다른 단백질이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, "분리된" 항체는 이의 자연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 것이다. 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 항체는 당업계에 잘 알려진 단백질 정제 기술을 사용하여, 분리에 의해 자연 유래 성분(또는 항체를 제조하기 위해 사용되는 세포 발현 시스템 유래 성분)이 실질적으로 없도록 만들 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리법(Lowry method)에 의해 결정되는, 항체의 75 중량% 및 가장 바람직하게는 80 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량% 초과로 정제되거나, (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균질하게 정제된다. 분리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 구성요소가 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 원위치(in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 일반적으로 분리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계를 거쳐 제조된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 항체의 파라토프(paratope)가 결합하는 항원 상의 임의의 항원 결정자를 의미한다. 에피토프 결정자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹화로 구성되고, 일반적으로 특이적 전하 특성뿐 아니라 특이적 3차원 구조적 특성도 가지고 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "천연(native) 항체 및 면역글로불린"은 일반적으로 2 개의 동일한 경쇄(L) 및 2 개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 한편("VH/VL 쌍"이라고도 함), 디설파이드 결합의 수는 상이한 면역글로불린 이소형(isotype)의 중쇄 사이에서 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 사슬내(intrachain) 디설파이드 가교를 갖는다. 각 중쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VH)을 갖고 그 뒤에 다수의 불변 도메인이 있다. 각 경쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인을 갖고 다른쪽 끝에 불변 도메인을 갖는다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 경계면을 형성하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, Chothia et al., J. Mol. Biol., 186: 651 (1985); Novotny 및 Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 4592 (1985) 참조.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 사이에서 광범위하게 서열이 다르고 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 고르게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, CDR) 또는 초가변 영역이라고 하는 세 부분에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분을 프레임워크(framework, FR)라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4 개의 FR 영역을 포함하며 이는 주로 β-시트 구조를 채택하고, β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성하는 3 개의 CDR에 의해 연결된다. 각 사슬의 CDR은 FR 영역에 접하게 근접하여 함께 유지되고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 자리 형성에 기여한다. 예를 들어, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991) 참조. 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 데 직접적으로 관여하지 않으나, 항체 의존성 세포 독성에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터(effector) 기능을 나타낸다. 관심 가변 영역 서열은 본 명세서의 다른 곳에 상세하게 설명된 CD47 항체에 대한 인간화 가변 영역 서열을 포함한다.
용어 "초가변 영역(hypervariable region, HVR)" 또는 "상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)"은 향상된 서열 가변성 및/또는 정의된 루프의 형성을 특징으로 하는 VH 및 VL 도메인의 하위 영역을 의미할 수 있다. 이들은 VH 도메인에 있는 3 개의 CDR(H1, H2 및 H3)과 VL 도메인에 있는 3 개의 CDR(L1, L2 및 L3)을 포함한다. H3는 정교한 결합 특이성을 부여하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지고, L3 및 H3는 최고 수준의 다양성을 보여준다. Johnson 및 Wu, in Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003) 참조.
CDR/HVR에 대한 다수의 설명이 공지되어 있다. Kabat 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성을 기반으로 하고 가장 일반적으로 사용된다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 대신, Chothia는 구조적 루프의 위치를 나타낸다(Chothia 및 Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). AbM HVR은 Kabat HVR 및 Chothia 구조 루프 간의 절충안을 나타내고, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용된다. "접촉(contact)" HVR은 이용 가능한 복합 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 이들 HVR/CDR 각각으로부터의 잔기는 아래에 기재되어 있다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 HVR/CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
또한, "연장된" HVR은 VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3) 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3)로 알려져 있다(Kabat 넘버링).
"Kabat에 따른 넘버링"은 상기 Kabat 등에서의 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용되는 넘버링 시스템을 의미할 수 있다. 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이에의 삽입에 해당하는 더 적거나 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. "표준" Kabat 넘버링 서열을 갖는 항체 서열의 상동성 영역에서의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 잔기의 Kabat 넘버링이 결정될 수 있다. 일반적으로, Kabat 넘버링은 가변 도메인에 있는 잔기(대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 언급할 때 사용되는 반면, EU 넘버링 시스템 또는 인덱스(예를 들어, EU 인덱스는 Kabat로, EU에 따른 넘버링은 IgG1으로 함)는 일반적으로 중쇄 불변 영역에 있는 잔기를 언급할 때 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "단일클론"항체는 실질적으로 동종인 항체, 예를 들어 실질적으로 동일하나 미미한 수준의 배경 돌연변이(background mutation) 및/또는 변형을 허용하는 항체 집단으로부터 얻은 항체를 의미한다. "단일클론"은 항체의 실질적으로 동종인 특성을 나타내고, 어떠한 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단일클론항체는 이의 HVR, VH 및/또는 VL 서열 및/또는 결합 특성에 의해, 예를 들어 클론의 풀(pool)(예를 들어, 재조합, 하이브리도마 또는 파지(phage)-유래)로부터 선택된다. 단일클론 항체는, 예를 들어 항체의 결합 친화성 또는 다른 특성에 영향을 미치고, 인간화 또는 키메라 항체를 생성하고, 항체 제조 및/또는 동종성을 개선하고, 다중특이적 항체를 조작하기 위해, 하나 이상의 돌연변이를 포함하도록 조작될 수 있고, 그 결과 항체는 여전히 본질적으로 단일클론으로 간주된다. 단일클론항체 집단은 집단의 개별 단일클론항체가 동일한 항원 자리를 인식하기 때문에 다중클론항체와 구별될 수 있다. 단일클론항체를 제조하는 다양한 기술이 공지되어 있다; 예를 들어, 하이브리도마 방법 (예를 들어, Kohler 및 Milstein, Nature, 256: 495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995) , Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 등록번호 4,816,567 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004) 참조) 및 인간 면역글로불린 유전자자리 또는 인간 면역글로불린 서열을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간 유사 항체를 제조하는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. Pat. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 및 Lonberg 및 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995) 참조).
"키메라"항체는 특정 이소형, 클래스 또는 유기체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄의 한 부분 및 또 다른 이소형, 클래스 또는 유기체로부터의 또 다른 부분을 갖는 항체를 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가변 영역은 하나의 소스(source) 또는 유기체로부터 유래할 것이고, 불변 영역은 또 다른 것으로부터 유래할 것이다.
"인간화 항체"는 주로 인간 서열 및 최소량의 비-인간(예를 들어, 쥐 또는 닭) 서열을 갖는 항체를 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 인간 수용자 항체 프레임워크(FR) 상에 이식된 비-인간(예를 들어, 쥐 또는 닭) 유기체로부터 유래된 항체로부터 하나 이상의 HVR 서열(관심 결합 특이성을 포함함)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 비-인간 잔기는 예를 들어 항체 특성을 개선하기 위해 인간 프레임워크(소스 또는 수용자 항체 어느 쪽에도 존재하지 않음)상에 추가로 이식된다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 일반적으로 2 개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린, 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc)의 적어도 한 부분을 선택적으로 포함할 것이다. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) 참조.
"인간" 항체는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체 및/또는 본 명세서에 개시된, 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 항체를 의미할 수 있다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함하여 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)에 기재된 바와 같은 인간 단일클론항체의 제조; 및 항원 공격에 대응하여 이러한 항체를 생성하도록 변형되었으나 그의 내인성 유전자자리(endogenous loci)가 비활성화된 유전자 변형(transgenic) 동물, 예를 들어 면역화된 제노쥐(xenomouse)(예를 들어, XENOMOUSETM 기술에 관한 미국 특허 등록번호 6,075,181 및 6,150,584 참조) 또는 인간 면역글로불린 서열(들)을 갖는 닭(예를 들어, WO2012162422, WO2011019844, 및 WO2013059159 참조)에 항원을 투여함으로써.
면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5 개의 주요 클래스가 있고, 이들 중 일부는 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2와 같은 서브클래스(이소형)로 나눌 수 있다. 서로 다른 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ라고 한다. 상이한 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 구성은 잘 알려져 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편" 및 이의 모든 문법적 변형은 특정 예에서 온전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인(즉, 항체 이소형에 따라 CH2, CH3 및/또는 CH4)이 없는 온전한 항체의 항원 결합 자리 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부로 정의된다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 및 Fv 단편; 다이아바디; (1) 단쇄 Fv(scFv) 분자, (2) 단 하나의 경쇄 가변 도메인을 함유하는 단쇄 폴리펩타이드 또는 연결된 중쇄 모이어티 없이 경쇄 가변 도메인의 3 개의 CDR을 함유하는 이의 단편 및 (3) 단 하나의 중쇄 가변 영역을 함유하는 단쇄 폴리펩타이드 또는 연결?? 경쇄 모이어티 없이 중쇄 가변 영역의 3 개의 CDR을 함유하는 이의 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는, 인접한 아미노산 잔기의 연속적인 하나의 서열로 구성된 1차 구조를 갖는 폴리펩타이드인 임의의 항체 단편; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 또는 다가 구조를 포함한다. 하나 이상의 중쇄를 포함하는 항체 단편에서, 중쇄(들)은, 온전한 항체의 비-Fc 영역에서 발견되는 임의의 불변 도메인 서열(예를 들어, IgG 이소형에서의 CH1)을 함유할 수 있고/있거나 온전한 항체에서 발견되는 임의의 힌지(hinge) 영역 서열을 함유할 수 있고/있거나 중쇄(들)의 힌지 영역 서열 또는 불변 도메인 서열에 융합되거나 위치하는 류신 지퍼 서열을 함유할 수 있다.
항체의 파파인(papain) 분해는 각각 단일 항원 결합 자리를 갖는, "Fab" 단편으로 불리는, 2 개의 동일한 항원 결합 단편 및 잔여 "Fc" 단편을 생성하며, 이의 이름은 용이하게 결정화하는 능력을 반영한다. 펩신 처리는 2 개의 항원 결합 자리를 갖고 여전히 항원을 교차 결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다. "Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 자리를 함유하는 최소 항체 단편이다. 2쇄 Fv 종에서, 이 영역은 단단한 비공유결합으로 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단쇄 Fv 종(scFv)에서, 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 유연한 펩타이드 링커(linker)에 의해 공유결합될 수 있어 경쇄 및 중쇄가 2쇄 Fv 종에서와 유사한 "이량체의" 구조로 연상될 수 있도록 한다. 이러한 구성에서 각 가변 도메인의 3 개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 자리를 규정짓는다. 종합적으로, 6 개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3 개의 CDR만 포함하는 Fv의 절반)조차도, 전체 결합 자리보다 친화력이 낮지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖고 있다. 예를 들어, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) 참조.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH-1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역에서 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 몇 개의 잔기가 추가된다는 점에서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 본 명세서에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올 그룹을 포함하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제(excipient)"는 일반적으로 안전하고, 무독성이며, 생물학적으로나 달리 바람직한 약제학적 조성물 또는 제제를 제조하는 데 유용한 담체 또는 부형제를 의미한다. 사용되는 담체 또는 부형제는 일반적으로 인간 대상체 또는 다른 포유류에 투여하기에 적합한 것이다. 조성물을 제조하는 데 있어서, 활성 성분은 일반적으로 담체 또는 부형제와 혼합되거나, 희석되거나, 동봉된다. 담체 또는 부형제가 희석제로 쓰이는 경우, 이는 항체의 활성 성분에 대한 비히클, 담체 또는 배지로 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"(mAb)는 실질적으로 동종인 항체 집단, 즉 집단을 구성하는 개별 항체가 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 것인 집단으로부터 얻은 항체를 의미한다. 단일클론항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 자리에 대해 지시된다. 각 mAb는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 특이성 외에도 단일클론항체는 다른 면역글로불린에 오염되지 않은 하이브리도마 배양으로 합성할 수 있다는 장점이 있다. 수식어 "단일클론"은 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 얻어지는 항체의 특성을 나타내고, 어떠한 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론항체는 불멸화 B세포(immortalized B cell) 또는 이의 하이브리도마에서 제조될 수 있거나 재조합 DNA 방법으로 제조될 수 있다.
본 명세서의 단일클론항체는 CD47 항체의 가변(초가변 포함) 도메인을 불변 도메인으로 스플라이싱하여 제조되거나(예를 들어 "인간화" 항체), 경쇄를 중쇄로 스플라이싱하여 제조되거나, 하나의 종의 사슬을 다른 종의 사슬로 스플라이싱하여 제조되거나, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2 및 Fv)뿐 아니라 기원 종 또는 면역글로불린 클래스 또는 서브클래스 명칭에 관계없이 이종 단백질과 융합하여 제조되는 하이브리드 및 재조합 항체를 포함한다.
본 명세서의 단일클론항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가, 특정 종으로부터 유도되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 키메라 항체(면역글로불린)를 포함하는 반면, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 사슬(들)의 나머지 부분은 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 및 이러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프 태그된"은 "에피토프 태그"에 융합된 CD47 항체를 의미한다. 에피토프 태그 폴리펩타이드는 항체가 만들어질 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 가지고 있으나, CD47 항체의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 에피토프 태그는 바람직하게는 에피토프에 특이적인 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 교차 반응하지 않도록 충분히 유니크하다. 적합한 태그 폴리펩타이드는 일반적으로 적어도 6 개의 아미노산 잔기, 일반적으로 약 8-50 개의 아미노산 잔기(바람직하게는 약 9-30 개 사이의 잔기)를 갖는다. 예는 c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체(예를 들어, Evan et al., Mol. Cell. Biol., 5(12):3610-3616 (1985) 참조); 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그 및 이의 항체(예를 들어, Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990) 참조)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "표지(label)"는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된(conjugated) 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지 자체가 자체적으로 검출될 수 있거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우, 표지는 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 임상 병리 과정 동안 치료되는 개인 또는 세포의 자연 과정을 변경하도록 고안된 임상적 개입을 의미한다. 치료의 바람직한 효과는 질병 진행 속도 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화 및 경감되거나 개선된 예후를 포함한다. 예를 들어, 암과 관련된 하나 이상의 증상이 완화되거나 제거되면 개인이 성공적으로 "치료"된 것이고, 이는 암 세포의 증식 감소(또는 파괴), 질병으로 인한 증상 감소, 질병으로 고통받는 이들의 삶의 질 향상, 질병 치료에 필요한 다른 약물의 복용량 감소 및/또는 개인의 생존 연장을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "질병의 진행을 지연시키는 것"은 (암과 같은) 질병의 발달을 지연, 방해, 둔화, 지체, 안정화 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 이 지연은 과거 병력 및/또는 치료 중인 개인에 따라 다양한 길이의 시간이 될 수 있다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 충분하거나 현저한 지연은 개인이 질병을 발달시키지 않는다는 점에서 사실상 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전이의 발달과 같은 말기 암은 지연될 수 있다.
예시적인 암은 난소암, 결장암, 유방암, 폐암, 두경부암, 방광암, 대장암, 췌장암, 비호지킨 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 흑색종, 평활근종, 평활근육종, 신경아교종, 교모세포종, 골수종, 단구성 백혈병, B세포 유래 백혈병, T세포 유래 백혈병, B세포 유래 림프종, T세포 유래 림프종 및 고형 종양을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 섬유증 질환은 예를 들어 심근경색증, 협심증, 골관절염, 폐 섬유증, 천식, 낭포성 섬유증, 기관지염 또는 천식일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "예방하다," "예방하는" 및 "예방"은 상태, 장애 또는 질병 및/또는 이에 수반되는 증상의 시작을 지연 및/또는 예방하는; 대상체가 상태, 장애 또는 질병에 걸리지 않도록 하는; 또는 대상체가 상태, 장애 또는 질병에 걸릴 위험을 감소시키는 방법을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 치료 목적을 위한 용어 "대상체"는 포유류로 분류되는 임의의 동물을 의미하고, 인간, 개, 말, 고양이, 소 등과 같은 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물을 포함한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
특허 출원 및 공보를 포함하여 본 명세서에 인용된 모든 참조문헌은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
개요
본 명세서에 제공된 것은 인간 CD47(hCD47)이 SIRPα(예를 들어, 인간 SIRPα 또는 "hSIRPα")와 상호작용하는 것을 예방하는 신규 항-CD47 항체이다. 일부 실시양태에서 항-CD47 항체는 CD47 발현 세포(예를 들어, 암 세포와 같은 hCD47 발현 세포)의 대식세포 매개 식균작용을 촉진시킨다. 치료용 항-CD47 항체의 개발의 과제 중 하나는 표적, 조직 외 독성이었다. 적혈구 또한 면역계에 의한 파괴를 예방하기 위해 CD47을 발현하며, CD47 요법은 용량 제한 혈액학적 독성에 직면해 있다.
본 명세서에 기재된 항-CD47 항체는 적혈구 상의 글리코실화에 의해 보호되는 CD47 상의 유니크한 에피토프에 결합하여 예를 들어 종양 세포의 표면 상에 발현된 CD47에 대한 결합을 증가시킨다는 점에서 다수의 기타 공지된 항-CD47 항체와 크게 차별화된다. 유리하게는, 본 명세서에 제공된 항-CD47 항체는 대상체(예를 들어, 인간 또는 비-인간 영장류)에게 투여된 후 적혈구의 혈구응집 또는 고갈을 유발하지 않는다(예를 들어, 유의미하거나 눈에 띄는 수준으로 유발하지 않는다).
또한, 출원인은 동일한 조건에서 배양되었으나 매우 유사한 항-CD47 항체를 암호화하는 핵산을 발현하는 숙주 세포에서보다 본 명세서에 기재된 CD47 항체를 암호화하는 핵산을 발현하는 숙주 세포에서 더 높은 항체 역가를 얻었다는 것을 예기치 않게 발견하였다. 구체적으로, 본 명세서에 제공된 항-CD47 항체는 N-말단에 글루탐산(E) 및 C-말단에 세린(S)을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 이러한 항체는, 동일한 CDR을 포함하나 N-말단에 글루탐산(E) 이외의 아미노산 및 C-말단에 세린(S) 이외의 아미노산을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항-CD47 항체에 비해, 포유류 숙주 세포(예를 들어, CHO-K1 세포와 같은 CHO 세포)에 의해 높은 수율로 제조될 수 있다.
항-CD47 항체
항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 충분한 친화성과 특이성으로 CD47(예를 들어, 인간 CD47 또는 "hCD47")에 결합하는 항체이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체의 "면역학적 활성 단편"은 상기 항체의 항원 결합 단편을 의미한다. 용어 "면역학적 활성 단편" 및 "항원 결합 단편"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 정도에서 벗어난/비정상적인 CD47 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 상태를 표적으로 하고 방해하는 치료제로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 키메라(예컨대 인간화) 단일클론항체이다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 아래의 중쇄 가변 도메인(VH) 및/또는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 (a) (1) N-말단에 글루탐산 잔기(E); (2) RAWMN(서열번호: 5)을 포함하는 CDR-H1; (3) RIKRKTDGETTDYAAPVKG(서열번호: 6)를 포함하는 CDR-H2; (4) SNRAFDI(서열번호: 7)를 포함하는 CDR-H3; 및 (5) C-말단에 세린(S)을 포함하는 VH 도메인 및 (b) (1) KSSQSVLYAGNNRNYLA(서열번호: 8)를 포함하는 CDR-L1; (2) QASTRAS(서열번호: 9)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) QQYYTPPLA(서열번호: 10)를 포함하는 CDR-L3를 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR 서열은 Kabat에 따라 정의된다(예를 들어, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) 참조). 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 (a) (1) N-말단에 글루탐산 잔기(E); (2) GLTFERA(서열번호: 21)를 포함하는 CDR-H1; (3) KRKTDGET(서열번호: 22)를 포함하는 CDR-H2; (4) SNRAFDI(서열번호: 7)를 포함하는 CDR-H3; 및 (5) C-말단에 세린(S)을 포함하는 VH 도메인 및 (b) (1) KSSQSVLYAGNNRNYLA(서열번호: 24)를 포함하는 CDR-L1; (2) QASTRAS(서열번호: 25)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) QQYYTPPLA(서열번호: 26)를 포함하는 CDR-L3를 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR 서열은 Chothia 넘버링 체계에 따라 정의된다(예를 들어, Chothia 및 Lesk (1986) EMBO J. 5(4):823-6 및 Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273: 927-948 참조). 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 (a) (1) N-말단에 글루탐산 잔기(E); (2) GLTFERAW(서열번호: 27)를 포함하는 CDR-H1; (3) IKRKTDGETT(서열번호: 28)를 포함하는 CDR-H2; (4) AGSNRAFDI(서열번호: 29)를 포함하는 CDR-H3; 및 (5) C-말단에 세린(S)을 포함하는 VH 도메인 및 (b) (1) QSVLYAGNNRNY(서열번호: 30)를 포함하는 CDR-L1; (2) QA(서열번호: 31)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) QQYYTPPLA(서열번호: 32)를 포함하는 CDR-L3를 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR 서열은 IMGT 넘버링 체계에 따라 정의된다(예를 들어, Lefranc MP. (2013) IMGT Unique Numbering. In: Dubitzky W., Wolkenhauer O., Cho KH., Yokota H. (eds) Encyclopedia of Systems Biology. Springer, New York, NY; https://doi.org/10.1007/978-1-4419-9863-7_127 참조). 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 (a) (1) N-말단에 글루탐산 잔기(E); (2) GLTFERAWMN(서열번호: 33)을 포함하는 CDR-H1; (3) RIKRKTDGETTD(서열번호: 34)를 포함하는 CDR-H2; (4) SNRAFDI(서열번호: 35)를 포함하는 CDR-H3; 및 (5) C-말단에 세린(S)을 포함하는 VH 도메인 및 (b) (1) KSSQSVLYAGNNRNYLA(서열번호: 36)를 포함하는 CDR-L1; (2) QASTRAS(서열번호: 37)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) QQYYTPPLA(서열번호: 38)를 포함하는 CDR-L3를 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR 서열은 AbM 넘버링 체계에 따라 정의된다(예를 들어, Abhinandan R.K., Martin A.C. Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains. Mol. Immunol. 2008;45:3832-3839. doi: 10.1016/j.molimm.2008.05.022 참조).
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 (a) (1) N-말단에 글루탐산 잔기(E); (2) ERAWMN(서열번호: 39)을 포함하는 CDR-H1; (3) WVGRIKRKTDGETTD(서열번호: 40)를 포함하는 CDR-H2; (4) AGSNRAFD(서열번호: 41)를 포함하는 CDR-H3; 및 (5) C-말단에 세린(S)을 포함하는 VH 도메인 및 (b) (1) LYAGNNRNYLAWY(서열번호: 42)를 포함하는 CDR-L1; (2) LLINQASTRA(서열번호: 43)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) QQYYTPPL(서열번호: 44)을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 CDR-L3를 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDR 서열은 Contact 넘버링 체계에 따라 정의된다(예를 들어, McCallum et al. (1996) J Mol Biol. 262(5):732-45; doi: 10.1006/jmbi.1996.0548 참조).
참조의 편의를 위해, 서열번호: 5-10의 아미노산 서열이 아래 표 a 에 제공된다.
표 a
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)의 VH 도메인의 N-말단 아미노산은 Kabat 넘버링 시스템에 따른 위치 H1에 해당하고, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)의 VH 도메인의 C-말단 아미노산은 Kabat 넘버링 시스템에 따른 위치 H113에 해당한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)의 VH 도메인의 N-말단 아미노산은 Chothia 넘버링 시스템에 따른 위치 H1에 해당하고, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)의 VH 도메인의 C-말단 아미노산은 Chothia 넘버링 시스템에 따른 위치 H113에 해당한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)의 VH 도메인의 N-말단 아미노산은 IMGT 넘버링 시스템에 따른 위치 H1에 해당하고, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)의 VH 도메인의 C-말단 아미노산은 IMGT 넘버링 시스템에 따른 위치 H128에 해당한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)의 VH 도메인의 N-말단 아미노산이 서열번호: 1의 아미노산 1에 해당하고, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)의 VH 도메인의 C-말단 아미노산이 서열번호: 1의 아미노산 118에 해당한다.
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 서열번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하되, 단 VH 도메인의 N-말단 아미노산은 E이고 VH 도메인의 C-말단 아미노산은 S이며, 선택적으로 서열번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 서열번호: 1 및 서열번호: 2의 아미노산 서열은 아래에 제공된다:
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGLTFE RAWMNWVRQA PGKGLEWVGR IKRKTDGETT
DYAAPVKGRF SISRDDSKNT LYLQMNSLKT EDTAVYYCAG SNRAFDIWGQ GTMVTVSS
(서열번호: 1)
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL YAGNNRNYLA WYQQKPGQPP KLLINQASTR
ASGVPDRFSG SGSGTEFTLI ISSLQAEDVA IYYCQQYYTP PLAFGGGTKL EIK
(서열번호: 2)
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 서열번호: 1을 포함하는 VH 도메인의 3 개의 CDR을 포함하되, 단 VH 도메인의 N-말단 아미노산은 E이고 VH 도메인의 C-말단 아미노산은 S이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 서열번호: 2를 포함하는 VL 도메인의 3 개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인의 3 개의 CDR은 Kabat, Chothia, AbM 또는 Contact 넘버링 체계에 따른 CDR이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, VL 도메인의 3 개의 CDR은 Kabat, Chothia, AbM 또는 Contact 넘버링 체계에 따른 CDR이다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체의 VH 도메인은 서열번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하되, 단 VH 도메인의 N-말단 아미노산은 E이고 VH 도메인의 C-말단 아미노산은 S이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체의 VL 도메인은 서열번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 서열번호: 1을 포함하는 VH 및 서열번호: 2를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 아미노산 서열번호: 3을 포함하는 중쇄 및 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 전장 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 아미노산 서열번호: 55를 포함하는 중쇄 및 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 전장 항체이다.
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGLTFE RAWMNWVRQA PGKGLEWVGR IKRKTDGETT
DYAAPVKGRF SISRDDSKNT LYLQMNSLKT EDTAVYYCAG SNRAFDIWGQ GTMVTVSSAS
TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPPCPAP EFLGGPSVFL
FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV
VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ
VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV
FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK (서열번호: 3)
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGLTFE RAWMNWVRQA PGKGLEWVGR IKRKTDGETT
DYAAPVKGRF SISRDDSKNT LYLQMNSLKT EDTAVYYCAG SNRAFDIWGQ GTMVTVSSAS
TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPPCPAP EFLGGPSVFL
FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV
VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ
VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV
FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLG (서열번호: 55)
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL YAGNNRNYLA WYQQKPGQPP KLLINQASTR
ASGVPDRFSG SGSGTEFTLI ISSLQAEDVA IYYCQQYYTP PLAFGGGTKL EIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA KVQWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS
LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC (서열번호: 4)
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 적어도 2 가지의 상이한 종의 CD47에 결합(예를 들어, 교차 반응)한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 항-CD47 항체(또는 항체 변이체)는 hCD47 단백질(또는 이의 세포외 도메인) 및 비-인간 영장류(예컨대 사이노몰거스 또는 히말라야 원숭이(rhesus monkey))의 CD47에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 인간 CD47에 대해 완전히 특이적일 수 있고 종 또는 다른 유형의 비-인간 교차 반응성을 나타내지 않을 수 있다.
hCD47에 특이적으로 결합하는 항-CD47 항체는 상기 정의된 바와 같은 임의의 다양한 유형의 항체일 수 있으나, 특정 실시양태에서는, 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 인간화 항체이거나 인간 항체 불변 도메인(예를 들어, 인간 IgG Fc 도메인과 같은 인간 Fc 도메인, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4 Fc 도메인)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 키메라 항체이다. 예를 들어, 미국 특허 등록번호 4,816,567 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) 참조. 일부 실시양태에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어, 닭, 쥐(mouse), 쥐(rat), 햄스터, 토끼 또는 원숭이와 같은 비-인간 영장류에서 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모항체의 클래스 또는 서브클래스에서 변경된 것인 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화될 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR(또는 이의 일부)이 비-인간 항체(예를 들어, 닭 항체)에서 유래된 것이고 FR(또는 이의 일부)이 인간 항체 서열에서 유래된 것인 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 선택적으로 적어도 일부의 인간 불변 영역을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체에 있는 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성을 회복하거나 개선하기 위해, 비-인간 항체(예를 들어, HVR 또는 CDR 잔기가 유래된 항체)의 상응하는 잔기로 치환된다. 인간화 항체 및 이의 제조 방법은 예를 들어 Almagro 및 Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에 기재되어 있다.
인간화에 유용한 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: "최적화(best-fit)" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위 그룹의 인간 항체의 공통 서열에서 유래된 프레임워크 영역; 인간 체세포 돌연변이 프레임워크 영역 또는 인간 생식세포 프레임워크 영역; 및 스크리닝 FR 라이브러리에서 유래된 프레임워크 영역. 예를 들어, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993); Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993); Almagro 및 Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008); 및 Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 참조.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-CD47 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 항체는 본 명세서에 기재된 유전자 조작된 닭(예를 들어, 미국 특허 등록번호 8,592,644; 및 9,380,769 참조) 및/또는 쥐와 같은 비-인간 동물에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-CD47 항체는 Fab, F(ab')2, Fab'-SH, Fv, 또는 scFv 단편, 또는 단일 도메인, 단일 중쇄, 또는 단일 경쇄 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 항체 단편이다. 항체 단편은 예를 들어 효소 분해 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)에 기재되어 있는 바와 같이, 온전한 항체의 단백질 분해적 소화는 항체 단편을 생성하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 제조된다. 예를 들어, Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 대장균(E.coli)에 의해 발현되고 분비된다. 항체 단편은 대안적으로 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
Fab'-SH 단편은 대장균으로부터 직접 회수될 수 있고 F(ab')2 단편을 형성하기 위해 화학적으로 커플링될 수 있다. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) 참조. F(ab')2 단편은 또한 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국 특허 등록번호 5,869,046에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 단일쇄 Fv 단편(scFv)이다. WO 93/16185 및 미국 특허 등록번호 5,571,894 및 5,587,458 참조. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합을 생성하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 또한, 예를 들어 미국 특허 등록번호 5,641,870에 기재된 바와 같이, "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 세포의 포면 상에 발현되는 hCD47을 특이적으로 (결합과 같이) 인식한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 암 세포의 표면 상에 발현된 hCD47을 특이적으로 인식한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는, 예를 들어 SK-OV-3, Toledo, K562, HCC827, Jurkat, U937, TF-1, Raji, SU-DHL-4, MDA-MB-231, A375, 및 SK-MES-1 세포주를 포함하나 이에 제한되지 않는 암 세포주의 세포 표면 상에 발현된 hCD47을 특이적으로 인식한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 대상체에 있는 암 세포(예를 들어, 폐암 세포, 난소암 세포, 대장암세포, 췌장암 세포, 육종암 세포, 두경부암 세포, 위암 세포, 신장암 세포, 피부암 세포 및 비호지킨 림프종 세포)의 세포 표면 상에 발현된 hCD47을 특이적으로 인식한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)의 hCD47(예를 들어, 세포의 표면 상에 발현된 hCD47)에 대한 결합은 인간 SIRPα("hSIRPα")와 같은 신호 조절 단백질 알파(SIRPα)와 hCD47 의 상호작용을 예방한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)의 암 세포의 표면 상에 발현된 hCD47에 대한 결합은 암 세포의 대식세포 매개 식균작용을 촉진시킨다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편은 혈액 세포의 표면 상에 발현된 hCD47에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)를 대상체(예를 들어, 인간 또는 비-인간 영장류)에게 투여하는 것은 대상체에서 현저한 혈액학적 독성(예를 들어, 빈혈, 혈구감소증 또는 혈구응집)을 유도하거나 유발하지 않거나 현저한 대상체의 적혈구 고갈을 유도하거나 유발하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)를 대상체(예를 들어, 인간 또는 비-인간 영장류)에게 투여하는 것은 대상체에서 혈액학적 독성(예를 들어, 빈혈, 혈구감소증 또는 혈구응집)을 유도하거나 유발하지 않거나 대상체의 적혈구 고갈을 유도하거나 유발하지 않는다.
항-CD47 항체를 암호화하는 핵산
본 명세서에 기재된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)를 암호화하는 핵산이 또한 고려된다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 항-CD47 항체를 포함하는 항-CD47 항체를 암호화하는 핵산(또는 핵산의 집합)이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)를 암호화하는 (DNA 서열(들)과 같은) 핵산 서열은, 예를 들어 제조 공정 동안 항-CD47 항체의 제조 수율을 증가시킬 목적으로, 핵산(들)로부터 전사된 RNA의 번역 및 안정성을 최대화하기 위해 (추가로 최적화와 같이) 최적화되었다. 예시적인 최적화는, 예를 들어 반복된 서열 제거, 킬러 모티프 및 스플라이스 자리 제거, GC 함량(구아닌-사이토신 함량) 감소, mRNA 2차 구조 또는 불안정한 모티프를 형성할 수 있는 서열 제거/대체, 및/또는 주어진 숙주 세포(예를 들어, CHO-K1 세포와 같은 CHO 세포)에서의 코돈 사용의 최적화를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 코돈 최적화는 숙주 유기체의 코돈 편향 및 tRNA 빈도를 조정함으로써 유전자 발현을 개선하고 관심 핵산의 번역 효율을 증가시키는 데 사용되는 공정이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체를 암호화하는 핵산(들)은 코돈 최적화, 예를 들어 CHO 세포(예컨대 CHO-K1 세포)에서의 발현을 위해 코돈 최적화 되었다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항-CD47 항체의 VH 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호: 45에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하되, 단 핵산에 의해 암호화된 VH 도메인의 아미노산 서열은 N-말단 아미노 E 및 C-말단 S를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항-CD47 항체의 VL 도메인을 암호화하는 핵산은 서열번호: 46에 대해 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 서열번호: 45 및 서열번호: 46은 아래에 제공된다:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGCGGACTCGTGAAGCCTGGAGGAAGCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGCTTCCGGCCTCACCTTCGAGCGGGCTTGGATGAACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGGCCGGATCAAGAGGAAAACAGATGGCGAGACCACCGATTACGCCGCTCCCGTGAAGGGCCGGTTTAGCATCTCCAGGGACGACTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCGCTGGCAGCAACAGGGCCTTTGATATCTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACAGTGTCCTCC (서열번호: 45)
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCTGATTCCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCTACCATCAACTGCAAGTCCTCCCAGAGCGTGCTGTACGCCGGCAACAACCGGAACTATCTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCCAAGCTGCTGATCAACCAGGCTAGCACCAGGGCTTCCGGCGTGCCTGATAGGTTCAGCGGCTCCGGCTCCGGCACCGAGTTTACCCTGATCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCATCTACTACTGCCAGCAGTACTACACCCCTCCTCTGGCCTTTGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (서열번호: 46)
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체를 암호화하는 핵산(또는 핵산의 집합)은 펩타이드 태그(예컨대 단백질 정제 태그, 예를 들어 His-tag, HA tag)를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)을 암호화하는 핵산(또는 핵산의 집합)은 리더 서열(leader sequence)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 어느 정도 엄격한 혼성화(hybridization) 조건 하에, 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체를 암호화하는 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 제공된다.
또한, 본 명세서에 기재된 핵산이 삽입된 벡터가 제공된다.
간단히 요약하자면, 항-CD47 항체(또는 이의 항원 결합 단편)을 암호화하는 천연 또는 합성 핵산에 의한 항-CD47 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 발현은 핵산을, 예를 들어 프로모터(promoter)(예를 들어, 구성적, 조절가능한, 조직 특이적 프로모터) 및 3' 비번역 영역(UTR)을 포함하는 5' 및 3' 조절 요소에 작동가능하게 연결되도록 핵산을 적합한 발현 벡터에 삽입함으로써 달성될 수 있다. 벡터는 진핵 숙주 세포에서 복제 및 통합(integration)에 적합할 수 있다. 일반적인 클로닝 및 발현 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현을 조절하는 데 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다.
핵산은 여러 유형의 벡터에 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드(phagemid), 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드(cosmid)를 포함하나 이에 제한되지 않는 벡터에 클로닝될 수 있다. 특정 관심 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 기타 바이러스학 및 분자생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스(lentivirus)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 원점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레이스(restriction endonuclease) 자리 및 하나 이상의 선별가능한 마커(selectable marker)를 함유한다 (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 등록번호 6,326,193 참조).
포유류 세포로의 유전자 전달을 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 벡터 내에 삽입될 수 있고 레트로바이러스 입자에 포장될 수 있다. 그 다음 재조합 바이러스는 분리되어 생체내 또는 생체외로 대상체의 세포에 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 백터가 사용된다. 렌티바이러스와 같이 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는, 이식유전자(transgene)의 장기적이고 안정적인 통합과 딸 세포에서의 증식을 가능하게 하기 때문에, 장기 유전자 전달(long-term gene transfer)을 달성하기에 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 간세포와 같은 비증식 세포에 형질도입(transduce) 할 수 있다는 점에서, 쥣과 백혈병 바이러스(murine leukemia viruse)와 같은 종양-레트로바이러스(onco-retroviruse)에서 유래된 벡터에 비해 추가적인 이점이 있다. 이는 또한 낮은 면역원성이라는 추가적인 이점이 있다.
추가적인 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서(enhancer)는 전사 개시 빈도를 조절한다. 일반적으로, 이는 시작 자리(start site)에서 상류로 30-110 염기쌍(bp)인 영역에 위치하나, 최근 다수의 프로모터가 시작 자리의 하류에도 기능적 요소를 포함하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소 사이의 간격은 종종 유연하므로 요소가 반전되거나 서로 상대적으로 이동하는 경우 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 카이네이즈(thymidine kinase, tk) 프로모터에서, 활성도가 감소하기 시작하기 전에 프로모터 요소 사이의 간격을 50 bp로 늘릴 수 있다.
적합한 프로모터의 한 예는 전초기(immediate early) 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 또 다른 예는 신장 성장 인자-1α(Elongation Growth Factor-1α, EF-1α)이다. 그러나, 다른 구성적 프로모터 서열 또한 사용될 수 있고, 여기에는 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 카이네이즈 프로모터와 같으나 이에 제한되지 않는 인간 유전자 프로모터뿐 아니라, 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 쥐 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복(long terminal repeat, LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus) 전초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 프로모터도 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용에 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터(Inducible promoter) 또한 본 발명의 일부로 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 켤 수 있는 분자 스위치를 제공하고, 이는 이러한 발현을 원할 때 작동가능하게 연결되거나, 발현을 원하지 않을 때 발현을 끈다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)를 암호화하는 핵산(들)의 발현을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)를 암호화하는 핵산(들)은 당업계에 공지된 임의의 유도성 프로모터를 포함하는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체를 암호화하는 핵산(들)은, 예를 들어 항체의 정제 또는 검출을 용이하게 하기 위해, 에피토프 태그를 암호화하도록 조작되어 왔다. 예시적인 에피토프 태그는 예를 들어 6x His(His-태그 또는 헥사히스티딘 태그로도 알려짐), FLAG, HA, Myc, V5, GFP(녹색 형광 단백질(green fluorescent protein), 예를 들어 강화된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP)), GST(글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase)), β-GAL(β-갈락토시데이즈(β-galactosidase)), 루시퍼레이즈(Luciferase), MBP(말토스 결합 단백질(Maltose Binding Protein)), RFP(적색 형광 단백질(Red Fluorescence Protein)) 및 VSV-G(수포성 구내염 바이러스 당단백질(Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein))를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
항체 제조 방법
본 발명의 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 항체를 제조하는 예시적인 기술은 아래에 기재된다; 그러나 이러한 예시적인 기술은 예시적인 목적으로만 제공되고 제한하려는 의도가 아니다. 또한, 본 명세서에 기재된 항체를 사용하기 위해 고려되는 예시적인 항체 특성이 추가로 기재된다.
항원을 제조하기 위해, 항원은 정제되거나 천연 소스로부터 얻어질 수 있거나, 재조합 기술을 사용하여 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 수용성 단백질(soluble protein)로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 예를 들어 그의 면역원성을 증가시키기 위해 또 다른 폴리펩타이드 또는 다른 모이어티에 접합할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항원은 Fc 영역과 커플링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 자신의 세포 표면 상에 항원을 발현하는 세포가 항원으로 사용될 수 있다.
다중클론항체는 항원 및 보조제(adjuvant)의 다중 피하(multiple subcutaneous, sc) 또는 복강내(intraperitoneal, ip) 주사에 의해 동물에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 닭 면역화에 대한 설명이 본 명세서에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 이기능성(bifunctional) 또는 유도체화제(derivatizing agent)를 사용하여 면역원성 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린(bovine thyroglobulin) 또는 콩 트립신 저해제(soybean trypsin inhibitor)와 접합된다. 닭을 면역화하는 예시적인 방법은 본 명세서에 제공된다. 포유류와 같은 다양한 다른 유기체에 적합한 관련 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
상기와 같이, 단일클론항체는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단일클론항체는, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)에 의해 처음 설명되고 이후 Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); 및 Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)에 설명되는 하이브리도마 방법을 사용해 제조된다. 인간 하이브리도마 기술(트리오마(Trioma) 기술)은 Vollmers 및 Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers 및 Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 설명된다. 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는, 예를 들어 시험관내 결합 분석, 면역침전(immunoprecipitation), ELISA, RIA 등에 의해 관심 항체의 존재에 대해 스크리닝될 수 있고; 예를 들어 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 결합 친화성이 결정될 수 있다. 원하는 결합 특성을 갖는 항체를 제조하는 하이브리도마는 공지된 배양 기술을 사용하여 서브클로닝 및 성장시킬 수 있고, 동물 등에서 복수 종양(ascites tumor)으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 단일클론항체는 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 라이브러리 방법을 사용하여 제조된다. 예를 들어, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) 참조. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 예를 들어 Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에 설명된 바와 같이, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합된 다음 항원 결합 파지에 대해 스크리닝된다. 파지는 일반적으로 단쇄 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 디스플레이한다. 대안적으로, Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 설명된 바와 같이, 나이브(naive) 레퍼토리는 어떠한 면역화 없이 비자기 및 자가 항원의 넓은 범위에 대해 항체의 단일 소스를 제공하기 위해 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝될 수 있다. 마지막으로, Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에 의해 설명된 바와 같이, 나이브 라이브러리는, 줄기 세포에서 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 매우 가변적인 CDR3 영역을 암호화하고 시험관 내에서 재배열을 수행하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 인공적으로 제조될 수도 있다.
항체는 재조합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 항-항원 항체의 재조합 제조의 경우, 항체를 암호화하는 핵산은 분리되어 추가 클로닝(DNA 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내에 삽입된다. 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여) 용이하게 분리되고 시퀀싱될 수 있다. 다수의 백터가 사용가능하다. 벡터 구성은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
본 발명의 항체는 이종 폴리펩타이드, 예를 들어 신호 서열, 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특이적인 절단 자리를 갖는 다른 폴리펩타이드를 갖는 융합 폴리펩타이드로서 재조합적으로 제조될 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는(예를 들어, 신호 펩티데이즈에 의해 절단되는) 것일 수 있다. 천연 항체 신호 서열을 인식하고 처리하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은, 예를 들어 알칼리성 포스파테이즈(alkaline phosphatase), 페니실리네이즈(penicillinase), lpp 또는 열에 안정한 장독소 II 리더(heat-stable enterotoxin II leader)로부터 선택된 원핵 신호 서열로 치환된다. 효모 분비의 경우, 천연 신호 서열은, 예를 들어 효모 인버테이즈 리더(yeast invertase leader), (사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더를 포함하는) 인자 리더(factor leader) 또는 산성 포스파테이즈 리더(acid phosphatase leader), 칸디다 알비칸스 글루코 아밀레이즈 리더(C. albicans glucoamylase leader) 등에 의해 치환될 수 있다. 포유류 세포 발현에서, 바이러스 분비 리더(viral secretory leader), 예를 들어 헤르페스 단순 gD 신호뿐 아니라 포유류 신호 서열도 사용가능하다.
발현 벡터 및 클로닝 벡터 모두, 예를 들어 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있도록 하기 위해, 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 이 서열은 복제 원점 또는 자율 복제 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 일반적으로, 포유류 발현 벡터에는 복제 원점 구성이 필요하지 않다 (SV40 원점은 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다).
발현 벡터 및 클로닝 벡터는 선별 유전자(selection gene) 또는 선별가능한 마커를 함유할 수 있다. 일반적인 선별 유전자는, (a) 항체 또는 다른 독소에 저항성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍(auxotrophic deficiency)을 보완하거나, (c) 복합 배지에서 얻을 수 없는 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 암호화한다. 우성 선별(dominant selection)의 예는 네오마이신(neomycin), 마이코페놀산(mycophenolic acid) 및 하이그로마이신(hygromycin)이라는 약물을 사용한다. 포유류 세포에 적합한 선별가능한 마커의 또 다른 예는 DHFR, 글루타민 합성 효소(GS), 티미딘 카이네이즈, 메탈로티오네인-I 및 -II(metallothionein-I 및 -II), 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 탈아미노화효소(adenosine deaminase), 오르니틴 탈카복실화효소(ornithine decarboxylase) 등과 같이, 항체 암호화 핵산을 흡수할 능력이 있는 세포를 식별할 수 있는 것들이다. 예를 들어, DHFR 유전자로 형질전환된(transformed), 내인성 DHFR 활성이 결핍된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주는 형질전환체(transformant)를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트(methotrexate, Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양하여 동정한다.
대안적으로, 관심 항체, 야생형 DHFR 유전자 및 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼레이즈(APH)와 같은 다른 선별가능한 마커를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환 또는 공 형질전환된(co-transformed) 숙주 세포(특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 아미노글리코사이드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은, 선별가능한 마커에 대한 선별제(selection agent)를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다.
발현 벡터 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주와 사용하는 데 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타메이즈 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파테이즈 프로모터, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지 박테리아 프로모터가 적합하다. 프로모터 서열은 진핵생물에 대해 공지되어 있다. 효모 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있고 성장 조건에 의해 조절되는 유도성 프로모터/인핸서를 포함할 수 있다. 사실상 모든 진핵생물 유전자는 전사가 시작되는 자리로부터 상류로 약 25 내지 30 염기에 위치한 AT-풍부 영역을 갖고 있다. 예는 3-포스포글리세레이트 카이네이즈 또는 다른 해당과정 효소(glycolytic enzyme), 예컨대 에놀레이즈, 글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소, 헥소카이네이즈, 피루베이트 탈카복실화효소, 포스포프룩토카이네이즈, 글루코스-6-인산 이소머레이즈, 3-포스포글리세레이트 뮤테이즈, 피루베이트 카이네이즈, 트리오스포스페이트 이소머레이즈, 포스포글루코스 이소머레이즈 및 글루코카이네이즈에 대한 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 포유류 숙주 세포에 있는 벡터로부터의 항체 전사는, 예를 들어 바이러스의 게놈(genome)에서 얻은 프로모터에 의해 제어될 수 있다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 원점도 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻을 수 있다. 인간 사이토메갈로바이러스의 전초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻을 수 있다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복을 프로모터로 사용할 수 있다.
고등 진핵생물에 의한, 본 발명의 항체를 암호화하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가된다. 현재 다수의 인핸서 서열이 포유류 유전자(글로빈(globin), 엘라스테이즈(elastase), 알부민, α-태아단백질(α-fetoprotein) 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로 하나는 진핵 세포 바이러스의 인핸서를 사용할 것이다.
진핵 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 기타 다세포 유기체의 유핵세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다.
본 명세서의 벡터에 있는 DNA를 클로닝 또는 발현하는 데 적합한 숙주 세포는 상기의 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체와 같은 진정세균(eubacteria), 예를 들어 Escherichia, 예컨대 대장균(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예컨대 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예컨대 세레티아 마르세센스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella) 등과 같은 장내세균군(Enterobacteriaceae)을 포함한다. 원핵생물 외에도, 사상균(filamentous fungi) 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 항체 암호화 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반적인 제빵 효모는 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산하는 특정 진균 및 효모 균주가 선택될 수 있다. 예를 들어, Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) 참조.
목화, 옥수수, 감자, 콩, 피튜니아(petunia), 토마토, 개구리밥(duckweed(Leninaceae)), 알팔파(alfalfa(M. truncatula)) 및 담배의 식물 세포 배양물이 또한 숙주로 이용될 수 있다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 애데스 애집티(Aedes aegypti)(모기), 애대스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노게스터(Drosophila melanogaster)(과일파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) 와 같은 숙주로부터의 수많은 바큘로바이러스(baculovirus) 균주 및 변이체 및 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다.
척추동물 세포는 숙주로 사용될 수 있고, 배양물(조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식은 일반적인 절차가 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양에서 성장하기 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 쥐 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개(caninie) 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 쥐 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주(Hep G2) 이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는, DHFR-CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 NS0 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다. 항체 제조에 적합한 포유류 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 Yazaki 및 Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268을 참조하라. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO-K1 세포이다. CHO-K1 세포주는 CHO 세포주의 서브클론이다(예를 들어, www(dot)phe-culturecollections(dot)org(dot)uk/media/128263/chok1-cell-line-profile(dot)pdf 및 web(dot)expasy(dot)org/cellosaurus/CVCL_0214 참조).
본 발명의 숙주 세포(예를 들어, CHO-K1 세포)는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10(Sigma), 최소 필수 배지((Minimal Essential Medium, MEM), (Sigma)), RPMI-1640(Sigma) 및 둘베코 변형 이글 배지((Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM), Sigma) 와 같은 상업적으로 이용가능한 배지가 숙주 세포 배양에 적합하다. 또한 Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), 미국 특허 등록번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 U.S. Pat. Re. 30,985에 기재된 배지 무엇이든 숙주 세포 배양 배지로 사용될 수 있다. 이러한 배지 무엇이든 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염(예컨대 소듐 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 뉴클레오타이드(예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대 GENTAMYCINTM 약물), 미량 원소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨) 및 글루코스 또는 동등한 에너지 소스로 보충될 수 있다. 또한, 다른 필요한 보충물 무엇이든 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이고, 당업자에게 명백할 것이다.
재조합 기술 사용 시, 항체는, 세포 내에서 생산될 수 있거나, 주변 세포질 공간(periplasmic space)에서 생산될 수 있거나, 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되는 경우, 첫 번째 단계로 미립자 잔해(숙주 세포 또는 용해된 단편)이 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)은 대장균의 주변 세포질 공간으로 분비되는 항체를 분리하는 절차를 설명한다.
세포로부터 제조되는 항체 조성물은, 예를 들어 하이드록실아파타이트(hydroxylapatite) 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고, 친화성 크로마토그래피가 일반적으로 선호되는 정제 단계 중 하나이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체는 정제를 용이하게 하기 위해 에피토프 태그(예를 들어, 절단 가능한 링커를 통해 항체에 부착된 태그)를 포함한다. 예시적인 에피토프 태그는, 예를 들어, 예를 들어 6x His(His-태그 또는 헥사히스티딘 태그로도 알려짐), FLAG, HA, Myc, V5, GFP(녹색 형광 단백질, 예를 들어 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)), GST(글루타치온-S-전이효소), -GAL(β-갈락토시데이즈), 루시퍼레이즈, MBP(말토스 결합 단백질), RFP(적색 형광 단백질) 및 VSV-G(수포성 구내염 바이러스 당단백질)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
따라서, 일부 실시양태에서, (a) (1) N-말단에 글루탐산 잔기(E); (2) RAWMN(서열번호: 5)을 포함하는 CDR-H1; (3) RIKRKTDGETTDYAAPVKG(서열번호: 6)를 포함하는 CDR-H2; (4) SNRAFDI(서열번호: 7)를 포함하는 CDR-H3; 및 (5) C-말단에 세린(S)을 포함하는 중쇄 가변(VH) 도메인; 및 (b) (1) KSSQSVLYAGNNRNYLA(서열번호: 8)을 포함하는 CDR-L1; (2) QASTRAS(서열번호: 9)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) QQYYTPPLA(서열번호: 10)를 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하는 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)를 제조하는 방법이 제공되는데, 방법은 다음을 포함한다: a) 항체(또는 단편)의 발현을 유발하기에 효과적인 조건 하에서, 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포(예컨대 CHO 세포)를 배양하는 단계; 및 b) 숙주 세포에 의해 발현된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)을 회수하는 단계. 일부 실시양태에서, 방법은 c) 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체를 정제하는 단계는 단백질 A 또는 단백질 L 크로마토그래피 단계와 같은, 적어도 하나의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서 숙주 세포는 포유류 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포, 예를 들어 CHO-K1 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 항-CD47 항체를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 항-CD47 항체를 암호화하는 핵산(들)로 형질감염(예를 들어, 일시적으로 형질감염(transiently transfected) 또는 안정적으로 형질감염(stably transfected))되었다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체를 제조하는 방법은 제조-규모(manufacturing-scale) 제조 공정(예컨대 발효 공정)이다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체를 제조하는 "제조-규모" 제조 공정(예컨대 발효 공정)은 약 400 L 내지 약 80,000 L 사이(예컨대 약 400 L 내지 약 25,000 L, 예를 들어 약 4,000 L, 약 6,000 L, 약 8,000 L, 약 10,000 L, 약 12,000 L, 약 14,000 L, 또는 약 16,000 L 중 어느 하나 사이)의 범위의 배양 부피에서 숙주 세포를 배양하고 성장시키는 단계를 수반한다.
글리코실화 변이체
일부 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)에 글리코실화 자리를 추가하거나 삭제하는 것은 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편) 또는 이의 폴리펩타이드 부분의 아미노산 서열을 변경하여 하나 이상의 글리코실화 자리가 생성되거나 제거되도록 함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 카보하이드레이트가 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 제조된 천연 항체는 일반적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 부착된 분지형, 바이안테나형(biantennary) 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997) 참조. 올리고사카라이드는 다양한 카보하이드레이트, 예를 들어 바이안테나형 올리고사카라이드 구조의 "줄기"에 있는 GlcNAc에 부착된 푸코스뿐 아니라, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 개선된 특성을 갖는 항-CD47 항체 변이체(또는 Fc 영역을 포함하는, 이의 면역학적 활성 단편)를 생성하기 위해 본 명세서의 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)에 있는 올리고사카라이드의 변형이 이루어질 수 있다.
Fc의 CH2 도메인에 부착된 N-글리칸은 이종(heterogeneous)이다. CHO 세포에서 생성된 항체 또는 Fc 융합 단백질은 푸코실전이효소(fucosyltransferase) 활성에 의해 푸코실화된다. Shoji-Hosaka et al., J. Biochem. 2006, 140:777-83 참조. 일반적으로, 낮은 백분율의 자연 발생 어푸코실화된(afucosylated) IgG가 인간 혈청에서 검출될 수 있다. Fc의 N-글루코실화는 FcγR에 결합하는 데 중요하고; N-글리칸의 어푸코실화는 FcγRIIIa에 대한 Fc의 결합 능력을 증가시킨다. 증가된 FcγRIIIa 결합은 ADCC를 향상시킬 수 있고, 이는 세포 독성이 바람직한 특정 항체 치료를 적용하는 데 유리할 수 있다.
일부 실시양태에서, 향상된 이펙터 기능은 Fc 매개 세포독성이 바람직하지 않을 때 해로울 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 단편 또는 CH2 도메인은 글리코실화되지 않는다. 일부 실시양태에서, CH2 도메인에 있는 N-글리코실화 자리는 글리코실화를 예방하기 위해 돌연변이된다.
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체 변이체(또는 이의 면역학적 활성 단편)가 제공되며, 이는, Fc 영역에 부착된 카보하이드레이트 구조에서 푸코스가 감소되거나 푸코스가 결여되어 있어 ADCC 기능을 개선할 수 있는 것인 Fc 영역을 포함한다.
면역접합체(Immunoconjugate) 및 공유결합 변형
본 발명은 또한 제2 모이어티에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 제2 모이어티는 화학요법제, 독소(예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 이들의 단편) 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 접합체(radioconjugate))와 같은 세포독성제(cytotoxic agent)이다.
사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 사슬(diphtheria A chain), 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 사슬(ricin A chain), 아브린 A 사슬(abrin A chain), 모데신 A 사슬(modeccin A chain), 알파-사르신(alpha-sarcin), 알류라이트 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴(dianthin) 단백질, 파이토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 커신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 리스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(neomycin) 및 트리코테신(tricothecene)을 포함한다. 다양한 방사성 동위원소를 방사성 접합 항체(adioconjugated antibody) 제조에 사용할 수 있다. 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 포함한다. 이러한 면역접합체의 생성에 유용한 예시적인 화학요법제는 본 명세서의 다른 곳에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 인간화 항-CD47 항체(또는 이의 항원 결합 단편)는 메이탄신(maytansine), 메이탄시노이드(maytansinoid) 또는 칼리키아마이신(calicheamicin)에 접합된다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 인간화 항-CD47 항체(또는 이의 항원 결합 단편)는 메이탄시노이드 DM1에 접합된다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol) propionate, SPDP), 이미노티올레인(iminothiolane, IT), 이미도에스터(예컨대 디메틸 아디피미데이트(adipimidate) HCl)의 이기능성 유도체, 활성 에스터(예컨대 디숙신이미딜 서버레이트(disuccinimidyl suberate)), 알데하이드(예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스디아조늄 유도체(예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물(예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)과 같은 다양한 이기능성 단백질 커플링제를 사용하여 제조된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)에 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)는 항체에 라디오뉴클레오타이드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO94/11026 참조.
다른 실시양태에서, 항체-수용체 접합체가 환자에게 투여된 후 제거제를 사용하여 순환계로부터 결합되지 않은 접합체를 제거한 다음 세포독성제(예를 들어, 라디오뉴클레오타이드)에 접합된 "리간드"(예를 들어, 아비딘(avidin))를 투여하는 종양 사전 표적화(pre-targeting)에 사용하기 위해, 항체는 "수용체"(예컨대 스트렙트아비딘(streptavidin))에 접합될 수 있다.
또한, 적어도 하나의 다른 항체에 공유결합한, 본 명세서에 기재된 인간화 항-CD47 항체를 포함하는 이종접합체 항체가 제공된다. 이종접합체 항체는, 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화하고(미국 특허 등록번호 4,676,980) HIV 감염을 치료하기 위해 제안되었다. 본 명세서에 기재된 인간화 항-CD47 항체를 포함하는 이종접합체 항체는, 가교결합제(crosslinking agent)와 관련된 것을 포함하여 합성 단백질 화학 분야에 공지된 방법을 사용하여 시험관에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 디설파이드 교환 반응을 사용하거나 티오에터 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토뷰티르이미데이트 및 예를 들어 미국 특허 등록번호 4,676,980에 개시된 것들을 포함한다.
또한, 적어도 하나의 공유결합 변형을 포함하는 인간화 항-CD47 항체가 제공된다. 공유결합 변형의 한 유형은 표적화된 인간화 항-CD47의 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 항체의 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. 일반적으로 사용되는 가교결합제는, 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데하이드, N-하이드록시숙신이미드 에스터, 예를 들어 4-아지도살리실산을 갖는 에스터, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜-프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스터를 포함하는 동종이기능성 이미도에스터, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이기능성 말레 이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)-디티오]프로피오이미데이트와 같은 제제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다른 변형은, 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로의 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 탈아미드화, 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카복시기의 아미드화를 포함한다.
공유결합 변형의 다른 유형은 본 명세서에 제공된 인간화 항-CD47 항체(또는 이의 항원 결합 단편)를 미국 특허 번호 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 제시된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 연결하는 것을 포함한다.
시스테인 조작 변이체
일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작 항-CD47 항체를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환된 잔기는 항-CD47 항체의 접근가능한 자리에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 항-CD47 면역접합체를 생성하기 위해, 반응성 티올기는 항-CD47 항체의 접근가능한 자리에 위치되고 항-CD47 항체를 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티와 같은 다른 모이어티에 접합시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 등록번호 7,521,541에 설명된 바와 같이, 시스테인 조작된 항-CD47 항체가 생성될 수 있다.
이펙터 기능 조작
예를 들어 암 치료에서 항체의 효능을 향상시키기 위해, 이펙터 기능과 관련하여 본 명세서에 제공된 항-CD47 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 Fc 영역에 도입될 수 있으며, 이로써 이 영역에서 사슬간 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 한다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체 매개 세포 사멸 및 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 가질 수 있다. Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) 및 Shapes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992) 참조. 향상된 항종양 활성을 갖는 동종이량체 항체는 또한 Wolff et al., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)에 설명된 바와 같이 이종이기능성 가교결합제(cross-linker)를 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체는 일반적인 Fc 영역을 포함하도록 조작될 수 있고 이로써 향상된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design3: 219-230 (1989) 참조.
FcR 결합(예를 들어, FcγR, FcRn에 대한 결합)을 개선하기 위해 Fc 영역 서열에서의 돌연변이 또는 변경이 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항-CD47 항체는 적어도 하나의 변경된 이펙터 기능, 예를 들어 천연 IgG 또는 모항체와 비교하여 변경된 ADCC, CDC 및/또는 FcRn 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 또는 변경을 포함하는 항체의 이펙터 기능은 모항체에 비해 증가된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 또는 변경을 포함하는 항체의 이펙터 기능은 모항체에 비해 감소된다. 몇 가지 유용한 특정 돌연변이의 예는 예를 들어 Shields, RL et al. (2001) JBC 276(6)6591-6604; Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487-490; 및 WO 00/42072에 설명된다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항-CD47 항체는 Fc 수용체 돌연변이, 예를 들어 Fc 영역의 적어도 하나의 위치에서의 치환 돌연변이를 포함한다. 이러한 치환 돌연변이(들)는, 예를 들어 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439를 포함하나 이에 제한되지 않는 Fc 도메인 내의 아미노산 위치에 만들어질 수 있고, 여기서 Fc 영역에 있는 잔기의 넘버링은 EU 넘버링 시스템을 따른다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 2 개의 인간 IgG4 Fc 영역 단량체를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역을 포함하되, 각 단량체는 S228P 치환(잔기의 넘버링은 EU 넘버링 시스템에 따름)을 포함한다. 추가적인 적합한 돌연변이는 당업계에 잘 알려져 있다. 예시적인 돌연변이는 예를 들어 미국 특허 등록번호 7,332,581에 제시되어 있다.
약제학적 제제 및 이의 투여
본 명세서에 제공된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어 인간과 같은 포유류)에게 투여하기에 적합하도록 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 제제화 될 수 있다. 항체의 적합한 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)를 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 버퍼(buffer), 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) 동결 건조 제제 또는 수용액의 형태로 얻어진다. 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 버퍼; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 뷰틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨과 같은 당류; 소듐과 같은 염 형성 반대 이온(salt-forming counter-ion); 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
본 명세서에 제공된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 또한 면역리포좀으로 제제화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 Epstein et al., PNAS USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., PNAS USA, 77: 4030 (1980); 및 미국 특허 등록번호 4,485,045 및 4,544,545에 설명된 바와 같은 당업계에 공지된 방법으로 제조된다. 향상된 순환 시간(circulation time)을 갖는 리포좀은 미국 특허 등록번호 5,013,556에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발법(reverse-phase evaporation method)에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 원하는 직경의 리포좀을 생성하기 위해 정의된 포어(pore) 크기의 필터를 통해 압출된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 Martinet al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)에 설명된 바와 같이 디설파이드 교환 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 항종양제, 성장 억제제 또는 화학요법제(예컨대 독소루비신(doxorubicin)) 또한 선택적으로 리포좀 내에 함유된다. Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989) 참조.
CD47 항체를 함유하는 활성 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼(macroemulsion)에서 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.
본 명세서에 제공된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)를 포함하는 약제학적 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는 활성 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)에 추가적으로 항종양제, 성장 억제제, 세포독성제 또는 화학요법제를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 적합하게 조합되어 존재한다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제제에 존재하는 항체의 양, 질병 또는 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 기타 요인에 따라 다르다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제제에 존재하는 항체의 양, 질병 또는 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 기타 요인에 따라 다르다. 이들은 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 동일한 용량 및 투여 경로로 사용되거나 지금까지 사용된 용량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 동결 건조된다. 이러한 동결 건조 제제는 적합한 희석제로 높은 단백질 농도로 재구성될 수 있고, 재구성된 제제는 포유류(예컨대 인간)에게 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 생체내 투여에 사용되는 약제학적 제제는 멸균된다. 이는, 예를 들어 멸균 여과막을 통해 본 명세서에 제공된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)를 포함하는 용액을 여과함으로써 쉽게 달성된다.
본 명세서에 기재된 항-CD47 항체의 치료 용량은 적어도 약 0.01 μg/kg 체중, 적어도 약 0.05 μg/kg 체중; 적어도 약 0.1 μg/kg 체중, 적어도 약 0.5 μg/kg 체중, 적어도 약 1 μg/kg 체중, 적어도 약 2.5 μg/kg 체중, 적어도 약 5 μg/kg 체중, 및 약 100 μg/kg 체중 이하의 용량으로 제제화될 수 있다. 당업자는 이러한 가이드라인이, 예를 들어 항체 단편의 사용 또는 항체 접합체의 사용에서 활성 제제의 분자량에 대해 조정될 것이라는 것을 이해할 것이다. 용량은 또한 국소 투여, 예를 들어 비강내, 흡입 등, 또는 전신 투여, 예를 들어 복강내(I.P.), 정맥내(I.V.), 진피내(I.D.), 근육내(I.M.) 등을 위해 다양할 수 있다.
본 발명의 CD47 항체 또는 약제학적 조성물은 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항-CD47 항체는 특히 항체의 용량을 감소시키면서 펄스 주입에 의해 적합하게 투여된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 항체의 적절한 용량은 상기 정의된 바와 같이 치료할 질병의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 여부, 선행 치료법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응 및 주치의의 의견에 따라 다르다. 항체는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.
검출 및/또는 진단 방법
본 명세서에 제공된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)는 검출 및 진단 방법에 사용될 수 있다. 대상체의 샘플(예를 들어, 조직 샘플과 같은 생물학적 샘플) 내 CD47(예를 들어, hCD47) 단백질의 존재 및/또는 양은 본 명세서에 기재된 항체를 사용하여 정성적 및/또는 정량적으로 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, CD47 단백질의 존재 및/또는 양을 검출하는 방법은 CD47에 대한 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체와 접촉시키는 단계 및 항체와 CD47 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 이 방법은 항-CD47 항체를 사용한 치료에 적격인 대상체를 선택하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 대상체가 항-CD47 항체로 치료받기 전에 대상체로부터 얻어진다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 포르말린 고정 및 파라핀 포매(paraffin embedded)되어 신선 또는 냉동 상태로 보관된다. 일부 실시양태에서, 첫 번재 샘플 내 CD47의 존재 및/또는 양은 두 번째 샘플 내 CD47의 존재 및/또는 양과 비교하여 증가되거나 높아진다. 특정 실시양태에서, 첫 번재 샘플 내 CD47의 존재 및/또는 양은 두 번째 샘플 내 CD47의 존재 및/또는 양과 비교하여 감소되거나 줄어든다. 특정 실시양태에서, 두 번째 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조군 샘플, 대조군 세포 또는 대조군 조직이다. 샘플 내 CD47의 존재 및/또는 양은 여러 방법론에 의해 분석할 수 있고, 이들 중 다수는 당업계에 공지되어 있고 당업자에 의해 이해되며, 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC), 웨스턴 블롯 분석, 면역침전, 분자 결합 분석, ELISA, ELIFA, 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS), MassARRAY, 프로테오믹스(proteomics), 생화학적 효소 활성 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는다. Rules Based Medicine 또는 Meso Scale Discovery("MSD")에서 제공하는 것과 같은 다중 면역분석법도 사용할 수 있다. 대상체의 샘플(예를 들어, 조직 샘플과 같은 생물학적 샘플) 내 CD47(예를 들어, hCD47) 단백질의 존재 및/또는 양을 검출하는 것은 형태학적 염색 및/또는 형광 제자리 혼성화와 같은 추가 기술과 조합하여 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, CD47 발현은 예를 들어 비-암성 조직의 샘플에 비해, 종양 또는 종양 샘플에서 평가된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 종양 또는 종양 샘플은 종양 세포가 차지하는 종양 영역의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 종양 샘플은 종양 관련 종양내 세포 및/또는 암 관련 스트로마(stroma)(예를 들어, 인접 종양주위 섬유조직형성 스트로마)가 차지하는 종양 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD47 발현은 종양 세포에서 평가된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 임상 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 진단 분석에 사용된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 얻어진다. 종양 조직의 대표적인 조각을 얻기 위해 조직 생검이 종종 사용된다. 대안적으로, 종양 세포는 관심 종양 세포를 함유하는 것으로 알려지거나 생각되는 조직 또는 체액의 형태로 간접적으로 얻어질 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 검출 방법에 사용되는 샘플은 제한 없이 절제, 기관지내시경, 세침 흡인, 기관지 브러싱(bronchial brushing) 또는 담(sputum), 흉수(pleural fluid), 뇌척수액, 혈액, 혈청 및 소변으로부터 얻을 수 있다. 암 샘플 내 표적 유전자 또는 유전자 산물을 검출하기 위해 위에서 논의한 동일한 기술을 다른 신체 샘플에 적용할 수 있다. 암 세포는 암 병변에서 벗겨져 이러한 신체 샘플에 나타날 수 있다. 일부 실시양태에서, CD47 단백질의 존재 및/또는 양에 대해 이러한 신체 샘플을 스크리닝함으로써 조기 암 진단이 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료법(예를 들어, 항-CD47 항체를 사용한 치료법)의 진행은 CD47 단백질의 존재 및/또는 양에 대해 이러한 신체 샘플을 테스트함으로써 쉽게 모니터링될 수 있다.
치료 방법
이상 CD47 발현(예를 들어, CD47 과발현)과 관련된 질병 또는 장애를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공되고, 이 방법은 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 질병 도는 장애는 암이다.
고형 종양의 치료
일부 실시양태에서, (a) (1) RAWMN(서열번호: 5)을 포함하는 CDR-H1; (2) RIKRKTDGETTDYAAPVKG(서열번호: 6)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) SNRAFDI(서열번호: 7)를 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); (b) (1) KSSQSVLYAGNNRNYLA(서열번호: 8)를 포함하는 CDR-L1; (2) QASTRAS(서열번호: 9)를 포함하는 CDR-L2; 및 QQYYTPPLA(서열번호: 10)를 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하는 항-CD47 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 고형 종양을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, VH는 N-말단에 글루탐산 잔기(E) 및 C-말단에 세린(S) 잔기를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47은 인간 IgG4 Fc 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 고형 종양은 재발성 고형 종양(예를 들어, 고형 종양에 대한 선행 치료 동안 또는 이후에 재발됨) 및/또는 난치성 고형 종양(예를 들어, 고형 종양에 대한 선행 치료에 대해 난치성이거나 반응하지 않음)이다. 일부 실시양태에서, "선행 치료"는 하나 이상의 치료제의 투여를 포함하는 치료법을 의미한다. 즉, 고형 종양에 대한 "선행 치료"는 단일 치료제를 사용한 치료 또는 치료제 조합을 사용한 치료를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 폐 종양, 난소 종양, 대장 종양, 췌장 종양, 육종 종양, 두경부 종양, 위 종양, 신장 종양 또는 피부 종양(예를 들어, 흑색종)이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 전이성 고형 종양이다.
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 약 10 mg/kg, 20 mg/kg 및 30 mg/kg 중 임의의 것을 포함하는 약 10 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 매주 1회(즉, qw 또는 q1w) 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 정맥내(IV) 주입을 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 항-CD47 항체를 사용한 치료로 인해 어떠한 치료 관련 부작용(TRAE)도 경험하지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 1등급 또는 2등급보다 큰 어떠한 TRAE도 경험하지 않는다. 일부 실시양태에서, TRAE는 부작용에 대한 공통 용어 기준(Common Terminology Criteria for Adverse Events, CTCAE) v 5.0에 약술된 기준에 따라 등급이 매겨진다. 예를 들어, ctep(dot)cancer(dot)gov/protocoldevelopment/electronic_applications/docs/CTCAE_v5_Quick_Reference_5x7(dot)pdf 참조.
일부 실시양태에서, 대상체는 항-CD47 항체를 사용한 치료로 인해 현저한 혈액학적 독성을 경험하지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 항-CD47 항체를 사용한 치료로 인해 어떠한 혈액학적 독성도 경험하지 않는다. 일부 실시양태에서, 혈액학적 독성은 빈혈, 혈구감소증 및/또는 혈구응집을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 항-CD47 항체로 치료하는 동안 혈액학적 독성에 대한 치료를 필요로 하지 않는다.
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체의 VH는 서열번호: 1을 포함하고, 항-CD47 항체의 VL은 서열번호: 2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체의 중쇄는 서열번호: 3을 포함하고, 항-CD47 항체의 경쇄는 서열번호: 4를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체의 중쇄는 서열번호: 55을 포함하고, 항-CD47 항체의 경쇄는 서열번호: 4를 포함한다.
비호지킨 림프종(NHL)의 치료
일부 실시양태에서, (a) (1) RAWMN(서열번호: 5)을 포함하는 CDR-H1; (2) RIKRKTDGETTDYAAPVKG(서열번호: 6)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) SNRAFDI(서열번호: 7)를 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); (b) (1) KSSQSVLYAGNNRNYLA(서열번호: 8)를 포함하는 CDR-L1; (2) QASTRAS(서열번호: 9)를 포함하는 CDR-L2; 및 QQYYTPPLA(서열번호: 10)를 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하는 항-CD47 항체의 유효량 및 선택적으로 리툭시맙의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 비호지킨 림프종(NHL)을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, VH는 N-말단에 글루탐산 잔기(E) 및 C-말단에 세린(S) 잔기를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-CD47은 인간 IgG4 Fc 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, NHL은 여포성 림프종(FL), 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL) 또는 맨틀 세포 림프종(MCL)이다. 일부 실시양태에서, NHL은 재발성 NHL(예를 들어, NHL대한 선행 치료 동안 또는 이후에 재발됨) 및/또는 난치성 NHL(예를 들어, NHL에 대한 선행 치료에 대해 난치성이거나 반응하지 않음)이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 NHL에 대해 적어도 1 회의 선행 치료(예를 들어, 2 내지 10 회 사이의 선행 치료)를 받았다. 일부 실시양태에서, "선행 치료"는 하나 이상의 치료제의 투여를 포함하는 치료법을 의미한다. 즉, NHL에 대한 "선행 치료"는 단일 치료제를 사용한 치료 또는 치료제 조합을 사용한 치료를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD20 제제는 항-CD20 항체(예를 들어, 제한 없이, 리툭시맙, 오비누투주맙(obinutuzumab) 및/또는 오파투무맙(ofatumumab))이다. 일부 실시양태에서, 항-CD20 제제(예를 들어, 단일 제제로서 또는 하나 이상의 치료제와 조합하여)로 치료하는 동안 또는 이후에 진행(예를 들어, NHL 질병 진행을 입증함)하였다.
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 매주 1 회(즉, qw 또는 q1w) 대상체에게 투여된. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 매 7 일마다 1 회 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 정맥내(IV) 주입을 통해 투여된다.
일부 실시양태에서, 리툭시맙은 IV 주입을 통해 5 주 동안 주 1 회(qw 또는 q1w) 375 mg/m2의 양으로 대상체에게 주입되고, 5 주 이후 4 주마다 1 회(예를 들어, q4w, q28d 또는 매 달) 375 mg/m2의 양으로 대상체에게 주입된다. 일부 실시양태에서, 리툭시맙은 처방 라벨의 지시에 따라 투여된다(예를 들어, www(dot)accessdata(dot)fda(dot)gov/drugsatfda_docs/label/2018/103705s5450lbl(dot)pdf에서 FDA 처방 라벨 및 www(dot)ema(dot)europa(dot)eu/en/documents/overview/mabthera-epar-medicine-overview_en.pdf에서 EMA 처방 라벨 참조).
일부 실시양태에서, 대상체는 항-CD47 항체를 사용한 치료로 인해 어떠한 치료 관련 부작용(TRAE)도 경험하지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 1등급 또는 2등급보다 큰 어떠한 TRAE도 경험하지 않는다. 일부 실시양태에서, TRAE는 부작용에 대한 공통 용어 기준(CTCAE) v 5.0에 약술된 기준에 따라 등급이 매겨진다. 예를 들어, ctep(dot)cancer(dot)gov/protocoldevelopment/electronic_applications/docs/CTCAE_v5_Quick_Reference_5x7(dot)pdf 참조.
일부 실시양태에서, 대상체는 항-CD47 항체를 사용한 치료로 인해 현저한 혈액학적 독성을 경험하지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 항-CD47 항체를 사용한 치료로 인해 어떠한 혈액학적 독성도 경험하지 않는다. 일부 실시양태에서, 혈액학적 독성은 빈혈, 혈구감소증 및/또는 혈구응집을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 항-CD47 항체로 치료하는 동안 혈액학적 독성에 대한 치료를 필요로 하지 않는다.
일부 실시양태에서, 항-CD47 항체의 VH는 서열번호: 1을 포함하고, 항-CD47 항체의 VL은 서열번호: 2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체의 중쇄는 서열번호: 3을 포함하고, 항-CD47 항체의 경쇄는 서열번호: 4를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체의 중쇄는 서열번호: 55을 포함하고, 항-CD47 항체의 경쇄는 서열번호: 4를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD47 항체는 렘조팔리맙이다.
제조물 및 키트
CD47 관련 질병, 예를 들어 CD47 발현(예컨대 CD47 과발현) 암, 예를 들어 고형 암(예컨대, 폐암, 난소암, 대장암, 췌장암, 육종암, 두경부암, 위암, 신장암 또는 피부암 등) 또는 혈액암, 예를 들어 비호지킨 림프종(예컨대 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종(FL), 맨틀 세포 림프종(MCL) 등)의 치료에 유용한 물질을 포함하는 제조물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 제조물 또는 키트는 하나 이상의 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편) 또는 본 명세서에 기재된 조성물을 함유하는 용기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제조물 또는 키트는 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편) 또는 본 명세서에 기재된 조성물 중 하나(또는 하나 이상)를 암호화하는 핵산(들)을 함유하는 용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)를 제조하는 세포주의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 양성 대조군, 예를 들어 CD47(또는 이의 단편) 또는 CD47+ 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 음성 대조군, 예를 들어 CD47이 실질적으로 없는 표면 또는 용액, 또는 CD47을 발현하지 않는 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제조물 또는 키트는 용기 및 용기 상에 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알(vial), 주사기, IV 용액 백, 시험관 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기는 그 자체로, 또는 다른 조성물과 조합하여 CD47 관련 질병 또는 장애, 예를 들어 고형 종양암(예를 들어, 폐암, 난소암, 대장암, 췌장암, 육종암, 두경부암, 위암, 신장암 또는 피부암 등)과 같은 암 또는 혈액암(예를 들어, 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종(FL), 맨틀 세포 림프종(MCL) 등과 같은 비호지킨 림프종(NHL))을 치료, 예방 및/또는 진단하는 데 효과적인 조성물을 담는다. 용기는 멸균 액세스 포트(sterile access port)를 가질 수 있다(예를 들어 용기는 정맥 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 적어도 하나의 제제는 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)이다. 일부 실시양태에서, 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 CD47 관련 질병 또는 장애, 예를 들어 고형 종양암(예를 들어, 폐암, 난소암, 대장암, 췌장암, 육종암, 두경부암, 위암, 신장암 또는 피부암 등)과 같은 암 또는 혈액암(예를 들어, 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종(FL), 맨틀 세포 림프종(MCL) 등과 같은 비호지킨 림프종(NHL))을 치료하기 위해 사용된다는 것을 표시한다. 일부 실시양태에서, 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 재발 및/또는 난치성 고형 종양(예를 들어, 폐, 난소, 대장, 췌장, 육종, 두경부, 위, 신장 또는 피부 종양)과 같은 고형 종양을 치료하는 데 사용하기 위한 것이라는 것을 표시한다. 일부 실시양태에서, 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 리툭시맙과 조합하여 사용되어 대상체, 예를 들어 항-CD20 제제를 사용한 치료와 같은 적어도 하나의 선행 치료를 받은 대상체에서 재발성 및/또는 난치성 NHL과 같은 비호지킨 림프종(NHL)을 치료하기 위한 것이라는 것을 나타낸다.
또한, 제조물 또는 키트는 (a) 본 명세서에 기재된 항-CD47 항체(또는 이의 면역학적 활성 단편)를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가적인 세포독성 또는 다른 치료제(예를 들어, NHL 치료용인 키트에서, 리툭시맙)를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 또한, 제조물은 주사용 정균수(bacteriostatic water for injection, BWFI), 포스페이트-버퍼된 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 버퍼를 포함하는 추가적인 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
선택적으로 제조물과 조합하여, 다양한 목적, 예를 들어 대상체에서 얻은 조직 샘플에서, 예를 들어 CD47의 분리 또는 검출을 위해 유용한 키트가 또한 제공된다. CD47의 분리 및 정제를 위해, 키트는 비드(예를 들어, 세파로스 비드(sepharose bead))에 커플링된, 본 명세서에 제공된 항-CD47 항체(또는 이의 단편)를 함유할 수 있다. 시험관내, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 CD47의 검출 및 정량화를 위한 항체(또는 이의 단편)를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 제조물과 마찬가지로, 키트는 용기 및 용기 상에 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 예를 들어, 용기는 본 명세서에 제공된 적어도 하나의 항-CD47 항체를 포함하는 조성물을 보유한다. 예를 들어, 희석제 및 버퍼, 대조군 항체를 함유하는 추가 용기가 포함될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우, 키트는 효소에 필요한 기질 및 보조인자(예를 들어, 검출 가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구세포)를 포함할 것이다. 다양한 시약의 상대적인 양은 분석의 감도를 실질적으로 최적화하는 시약 용액의 농도를 제공하기 위해 광범위하게 변할 수 있다. 특히, 시약은 용해시 적절한 농도의 시약 용액을 제공할 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결 건조된 건조 분말로 제공될 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 의도된 시험관내 또는 진단적 사용(예를 들어, CD47 검출, CD47 관련 질병 또는 장애 진단) 또는 CD47 관련 질병 또는 장애의 치료 경과 모니터링을 위한 지침뿐 아니라 조성에 대한 설명 또한 제공할 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허 출원은 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것처럼 본 명세서에 참조로 포함된다.
실시예
다음 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되고, 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것이 아니며, 아래의 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내려는 의도도 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했으나 일부 실험적 오류 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 대기압에 가깝다.
재료 및 방법
파지 라이브러리 확립
CD47은 세포외 N-말단 IgV 도메인, 5 개의 막통과 도메인 및 짧은 C-말단 세포내 꼬리를 갖는, 50 kDa의 막 수용체이다. 인간 Fc 또는 비오틴화된 인간 CD47-IgV 도메인(ACROBiosystems)과 접합된 인간 CD47-IgV 도메인은 파지 라이브러리 패닝(panning)을 위한 항원으로 사용되었다.
파지 라이브러리는 >50 명의 건강한 인간 대상체의 비장 또는 골수로부터 증폭된 항체 유전자 단편으로 구성된 파지미드 벡터를 사용하여 구축되었다. 항체 형식은 단쇄 가변 단편(scFv, VH + linker + VL)이다. 라이브러리 크기는 1.1 x 1010이고 서열 다양성은 다음과 같이 분석하였다. 라이브러리에서 선택하고 추가로 시퀀싱한 62 개의 클론의 경우, 16 개의 시퀀스가 잘렸거나 프레임 이동 돌연변이 또는 앰버(amber) 코돈이 있었다; 46 개의 시퀀스는, 모든 HCDR3 서열이 고유한 전장 scFv를 갖고 있었다. 46 개의 전장 scFv에서, 13 개의 서열은 람다(lambda) 경쇄를, 33 개의 서열은 카파(kappa) 경쇄를 갖고 있었다.
파지 패닝 및 클론 선택
인간 CD47-IgV 도메인에 특이적으로 결합하는 파지 클론을 얻기 위해, 파지 패닝을 위한 두 가지 방법이 사용되었다.
1. 인간 CD47-IgV에 대한 파지 라이브러리 면역튜브(immunotube) 패닝
이 방법에서, 상기와 같이 전개된 파지 라이브러리를 먼저 카제인 코팅된(casein-coated) 면역튜브에서 2 시간 동안 배양하였다. 인간 CD47-IgV-Fc 융합 단백질을 1차 패닝에 사용하였다. 결합되지 않은 파지는 PBST로 5-20 회 세척하여 제거하였다. 결합된 파지를 새로 준비한 100 mM 트리에틸아민 용액으로 용출하고, Tris-HCL 버퍼를 첨가하여 중화시켜, 제1 산출 파지 풀(first output phage pool)이 되도록 하였다. 증폭을 위한 대장균 TG-1 세포의 감염을 통해 제1 산출 파지 풀을 구제하였고, 이어서 비오틴화된 인간 CD47-IgV를 항원으로 사용하여 2차 패닝을 수행하였다. 결합된 파지를 동일한 과정으로 용출하고 제2 산출 파지 풀이 되도록 한 후, 이를 구제 하고 이어서 다시 인간 CD47-IgV-Fc 융합 단백질을 항원으로 사용하여 3차 패닝을 수행하였다. 결합된 파지는 이후 제3 산출 파지 풀이 되었고 비오틴화된 인간 CD47-IgV를 사용하여 4차 패닝을 거쳤다.
2. 인간 CD47-IgV에 대한 파지 라이브러리 용액 패닝
이 두 번째 방법에서, 스트렙트아비딘 비드 바인더를 고갈시키기 위해 먼저 파지 라이브러리를 카제인 차단된(casein-blocked) 100 μL의 스트렙트아비딘-자기(streptavdin-magnetic) 비드에서 배양하였다. 스트렙트아비딘-자기 비드 및 AG0084-huIgG1/k를 음성 고갈(negative depletion)에 사용하였다. 고갈된 라이브러리를 구제한 후 비오틴화된 인간 CD47-IgV를 항원으로 사용하여 2차 패닝을 수행하였고 카제인 차단된 스트렙트아비딘-자기 비드를 사용하여 추가로 음성 고갈을 거쳤다. 결합되지 않은 파지는 PBST로 5-20 회 세척하여 제거하였다. 결합된 파지를 새로 준비한 100 mM 트리에틸아민 용액으로 용출하고, Tris-HCL 버퍼를 첨가하여 중화시킨 다음 구조하고, 이어서 CD47-IgV-Fc 융합 단백질을 사용하여 3차 패닝을 수행하고 AG0084-huIgG1/k로 고갈시켰다. 이후, 결합된 파지는 제3 산출 파지 풀이 되고 비오틴화된 인간 CD47-IgV를 사용하여 4차 패닝을 수행하였고 카제인 차단된 스트렙트아비딘-자기 비드를 사용하여 음성 고갈을 거쳤다.
이 과정 이후, 인간 CD47-IgV 도메인에 특이적으로 결합하는 다중 파지 클론을 획득하고 농축하였다. 그런 다음 파지 클론을 희석하고 배양하여 37℃에서 8 시간 동안 성장시키고 항-카파 항체 코팅된 필터로 밤새 포획하였다. 양성으로 결합된 파지 클론을 검출하기 위해, 비오틴화된 인간 CD47-IgV(50 nM) 및 뉴트리아비딘-AP 접합체(NeutrAvidin-AP conjugate)(1:1000 희석)를 필터에 도포하였다. 양성 파지 플라크(positive phage plaque)를 선택하여 100 μL의 파지 용출 버퍼로 용출시켰다. 약 10-15 μL의 용출된 파지를 사용하여 1 mL의 XL1 청색 세포를 감염시켜 파지 단일점 ELISA(SPE)를 위한 고역가 파지(HT)를 만들었다. 필러 리프트로부터 선택된 양성 단일클론을 인간 CD47-IgV-Fc 융합 단백질 및 비오틴화된 인간 CD47-IgV 도메인 단백질의 결합에 적용하였다. 이들 양성 단일 클론은 이들의 VH 및 VL 유전자에 대해서도 시퀀싱되었다. 고유한 VH 및 VL 유전자가 있는 모든 양성 히트(hit)가 발현 벡터 pFUSE2ss-CLIg-hk(경쇄, InvivoGen, Cat No. pfuse2ss-hclk) 및 pFUSEss-CHIg-hG1(중쇄, InvivoGen, Cat No. pfusess-hchg1)에 의해 클로닝되었다. 항체는 HEK293 세포에서 발현되었고 단백질 A 플러스 아가로스(Protein A Plus Agarose)로 정제되었다.
항-CD47 항체의 친화성 성숙(Affinity maturation)
상기에 의해 얻은 CD47 항체의 결합 친화성은 시험관내 친화성 성숙, 예를 들어 자리-특이적 무작위 돌연변이에 의해 개선될 수 있고, 이는 또한 본 발명의 범위 내에 있는 돌연변이 서열을 초래한다.
예를 들어, 비아코어(BiaCore) 분석에 기초하여, CD47 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR 서열 분석은 무작위화/돌연변이될 수 있는 HCDR1 및 LCDR1 영역 내의 여러 잔기를 확인할 수 있다. 따라서 무작위 돌연변이 유발 라이브러리를 구축하고 특정 잔기에 도입하여 다양한 새로운 서열을 생성할 수 있다. CDR 돌연변이유발 라이브러리는 평형 조건 하에 용액상(solution phase)에서 비오틴화된 가용성 CD47 ECD를 사용하여 패닝됩니다. 감소된 항원 농도로 여러 차수의 패닝 후, 결합 ELISA 테스트를 위해 풍부한 산출 바인더가 선택되고 후속적으로 전장 IgG로 변환되고, 이는 오프율(off-rate) 개선된 서열에 대해 특이적으로 선택하기 위해 비아코어 분석에 적용된다. 이러한 스크리닝 과정을 통해, 본 발명의 추가적인 항체 분자는 임상 적용을 위한 전반적으로 최상의 특성을 위해 구축될 수 있다.
실시예1. 재조합 CD47-ECD(세포외 도메인)에 결합하는 파지 클론의 ELISA 스크리닝
재조합 인간 CD47 IgV-Fc 융합 단백질(Acrobiosystems)을 실온(RT)에서 2 시간 동안 마이크로타이터 플레이트 상에 포스페이트 버퍼 식염수(PBS)로 2 μg/mL로 코팅하였다. 항원 코팅 후, 웰(well)을 RT에서 1 시간 동안 1% BSA와 PBS/0.05% Tween(PBST)으로 차단하였다. 웰을 PBST로 세척한 후, 단일클론으로부터의 정제된 파지를 웰에 첨가하고 RT에서 1 시간 동안 배양하였다. 결합 파지 클론의 검출을 위해, M13에 대한 홀스래디쉬 퍼옥시데이즈(horseradish peroxidase, HRP) 접합된 2차 항체를 첨가한 후, 형광 기질(Roche)을 첨가하였다. 모든 배양 단계 사이에 플레이트의 웰을 PBST로 세 번 세척하였다. 형광은 테칸 스펙트라플루오르 플레이트 리더(TECAN Spectrafluor plate reader)에서 측정하였다. 중쇄 및 경쇄 유전자의 시퀀싱을 위해 양성 파지 클론을 선택하였다.
상기와 같이 얻어진 CD47 항체는 재조합 인간 CD47 IgV-Fc 융합 단백질에 대해 우수한 결합 활성을 보였다.
실시예2. CD47과 SIRPα의 상호작용을 차단하는 항체의 ELISA 분석
재조합 인간 CD47 IgV/쥐 Fc 융합 단백질 또는 비오틴화된 CD47 IgV 단백질(Acrobiosystems)을 RT에서 2 시간 동안 마이크로타이터 플레이트 상에 PBS로 1 μg/mL로 코팅하였다. 항원으로 코팅한 후, 웰(well)을 RT에서 1 시간 동안 1% BSA와 PBS/0.05% Tween(PBST)으로 차단하였다. PBST로 웰을 세척한 후, PBS에 희석된 항체를 웰에 첨가하고(5 μg/mL) RT에서 1 시간 동안 배양하였다. 항체에 의한 결합의 검출을 위해, 인간 Fc에 대한 HRP 접합된 2차 항체(Jackson Immuno Research)를 첨가한 후, 형광 기질(Roche)을 첨가하였다. 모든 배양 단계 사이에 플레이트의 웰을 PBST로 세 번 세척하였다. 형광은 테칸 스펙트라플루오르 플레이트 리더에서 측정하였다.
CD47 항체 A1A 및 B2B는 재조합 인간 CD47-Fc 융합 단백질 및 비오틴화된 CD47 단백질에 대해 우수한 결합 활성을 나타냈다.
실시예3. CD47과 SIRPα의 상호작용을 차단하는 항체의 ELISA 분석
재조합 hCD47 IgV-Fc 융합 단백질(Acrobiosystems)을 4℃에서 16 시간 동안 마이크로타이터 플레이트 상에 PBS로 1 μg/mL로 코팅하였다. RT에서, PBST에서 1% BSA로 1 시간 동안 차단한 후, 항-CD47 항체(10 μg/mL)의 부재 또는 존재 하에 RT에서 1 시간 동안 SIRPα-His 단백질 1 μg /mL를 첨가하였다. 이어서 플레이트를 3 회 세척하고 HRP 접합된 항-His 2차 항체와 함께 RT에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 후, 각 웰에 TMB 용액을 30 분 동안 첨가하고 2.0 M H2SO4로 반응을 정지시킨 후 490 nm에서 OD를 측정하였다.
CD47 항체 A1A 및 B2B는 SIRPα에 대한 CD47의 결합을 효과적으로 차단하였다. B2B 및 A1A의 VH 도메인, VL 도메인, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 도 15에 나타냈다.
실시예4. 단량체 CD47-ECD에 결합하는 항-CD47 항체의 용량 의존적 반응
직접 결합 및 경쟁 스크리닝 후, 항-CD47 항체 B2B를 2개의 공지된 참조 항-CD47 항체, 즉 F59 및 2A1과 비교하여 이 시험을 위해 선택하였다. 비오틴화된 CD47 단백질(Acrobiosystems)을 RT에서 2 시간 동안 마이크로타이터 플레이트에 PBS로 1 μg/mL로 코팅하였다. 항원 코팅 후, 웰을 RT에서 1 시간 동안 1% BSA와 PBS/0.05% Tween(PBST)으로 차단하였다. PBST로 웰을 세척한 후, 다양한 농도의 항-CD47 항체를 웰에 첨가하고 RT에서 1 시간 동안 배양하였다. CD47에 대한 항체의 결합을 검출하기 위해, 인간 Fc에 대한 HRP 접합된 2차 항체(Jackson Immuno Research)를 첨가한 후 형광 기질(Roche)을 첨가하였다. 모든 배양 단계 사이에 플레이트의 웰을 PBST로 3 회 세척하였다. 형광은 테칸 스펙트라플루오르 플레이트 리더에서 측정하였다.
참조 항체 5F9 및 2A1은 Stanford University, Inhibrx LLC 및 Celgene Corp.의 연구원이 공개한 Hu5F9 및 CC-90002의 서열에 따라 제조되었으며(예를 들어, 미국 특허 등록번호 9,017,675 B2, 9,382,320, 9,221,908, 미국 특허출원 공개번호 2014/0140989 및 WO 2016/109415 참조) 동일한 연구에 사용되었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 항-CD47 항체 B2B는 5F9 및 2A1보다 우수한 단량체 CD47-ECD에 대한 결합 활성을 나타냈다. 0.09 nm의 B2B의 EC50은 5F9(0.11 nM) 및 2A1(0.25 nM)의 EC50보다 낮았다.
실시예 5. 이량체 CD47-ECD에 결합하는 항-CD47 항체의 용량 의존적 반응
실시예 4 에서 확인된 2 개의 항-CD47 항체(즉, A1A 및 B2B)도 본 연구에서 사용되었다.
CD47 IgV/쥐 Fc 융합 단백질(Acrobiosystems)을 RT에서 2 시간 동안 마이크로타이터 플레이트 상에 PBS로 1 μg/mL로 코팅하였다. 항원 코팅 후, 웰을 RT에서 1 시간 동안 1% BSA와 PBS/0.05% Tween(PBST)으로 차단하였다. PBST로 웰을 세척한 후, 다양한 농도의 항-CD47 항체를 웰에 첨가하고 RT에서 1 시간 동안 배양하였다. 결합 항체의 검출을 위해, 인간 Fc에 대한 HRP 접합된 2차 항체(Jackson Immuno Research)를 첨가한 후 형광 기질(Roche)을 첨가하였다. 모든 배양 단계 사이에 플레이트의 웰을 PBST로 3 회 세척하였다. 형광은 테칸 스펙트라플루오르 플레이트 리더에서 측정하였다.
항-CD47 항체 B2B는 용량 의존적으로 이량체 CD47-ECD에 대한 결합 활성을 나타냈다.
실시예 6. SIRPα에 대한 CD47의 결합을 차단하는 항-CD47 항체의 용량 의존적 반응
재조합 CD47-Fc 융합 단백질(Acrobiosystems)을 4
에서 16 시간 동안 마이크로타이터 플레이트 상에 PBS로 1 μg/mL로 코팅하였다. RT에서, PBST에서 1% BSA로 1 시간 동안 차단한 후, 다양한 농도의 항-CD47 항체의 부재 또는 존재 하에 RT에서 1 시간 동안 SIRPα-His 단백질 1 μg/mL를 첨가하였다. 이어서 플레이트를 3 회 세척하고 HRP 접합된 항-His 2차 항체와 함께 RT에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 후, 각 웰에 TMB 용액을 30 분 동안 첨가하고 2 M H2SO4로 반응을 정지시킨 후 490 nm에서 OD를 측정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 항-CD47 항체 B2B는 용량 의존적으로 SIRPα에 대한 CD47의 결합을 차단하는 활성을 나타냈고, EC50은 0.18 nM이었다.
실시예 7a. CD47
+
Raji 세포에 결합하는 항-CD47 항체의 용량 의존적 반응
표면 상에 인간 CD47을 내재적으로 발현하는 Raji 세포를 4℃에서 30 분 동안 다양한 농도의 항-CD47 항체로 염색하였다. 그런 다음, 세포를 PBS로 3 회 세척한 후, APC-표지된 항-인간 Fc 특이적 항체(Invitrogen)와 함께 4℃에서 30 분 동안 배양하였다. FACSCanto(Becton-Dickinson)를 사용하여 결합을 측정하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 항-CD47 항체 B2B는 동일한 용량 의존적 패턴에 따라 CD47+ Raji 세포에 결합하는 활성을 나타냈고, EC50은 0.12 nM이었다.
실시예 7b: 종양 세포에 결합하는 항-CD47 항체의 용량 의존적 반응
본 발명의 항체의 결합 강도를 평가하기 위해 백혈병 및 고형 종양 계통 모두를 포함하는 상이한 종양 계통에 걸쳐 12개 종양 세포주의 패널(panel)로 유사한 연구를 수행하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 항-CD47 항체 B2B는 테스트된 12개 세포주(즉, SK-OV-3, Toledo, K562, HCC827, Jurkat, U937, TF-1, Raji, SU-DHL-4, MDA-MB-231, A375, 및 SK-MES-1)에서 5F9와 유사한 패턴의 결합 강도를 나타냈고, 이는 아래에서 논의된 바와 같이 동일한 종양 세포주에서 B2B 및 5F9에 대한 식균작용 패턴으로 밀접하게 보정되었다.
실시예 8a. 인간 대식세포에 의한 종양 세포에 대한 식균작용에 관한 연구
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 인간 혈액으로부터 분리하고, 단핵구를 6일 동안 대식세포로 분화시켰다. 단핵구 유래 대식세포(MDM)를 긁어내어 24웰 접시에 다시 놓고 24 시간 동안 부착되도록 하였다. CD47을 내재적으로 발현하는 Raji 세포를 표적 세포로 선택하고 1 μM 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스터(CFSE)로 10분 동안 표지한 다음, 5:1의 식세포당 종양 세포 비율로 단핵구 유래 대식세포(MDM)에 첨가하였다. 이후 항-CD47 항체를 다양한 용량으로 첨가하였다. 3 시간 동안 배양한 후, 포식되지 않은 표적 세포를 PBS로 세척하고 남은 식세포를 긁어내어 대식세포 마커 CD14 항체로 염색하고 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 분석하였다. 식균작용은 CD14+ 세포를 게이팅(gating)한 다음 CFSE+ 세포의 백분율을 평가하여 측정하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 항-CD47 항체 B2B는 항-CD47 항체 5F9 및 2A1과 마찬가지로 인간 대식세포에 의한 종양 세포에 대한 식균작용을 촉진시키는 데 있어서 유사한 활성을 나타냈다.
실시예 8b. 종양 세포에 대한 식균작용에 관한 추가 연구
본 발명의 항체의 식균작용 강도를 평가하기 위해 백혈병 및 고형 종양 계통 모두를 포함하는 상이한 종양 계통에 걸쳐 12개 종양 세포주의 패널로 유사한 연구를 수행하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 항-CD47 항체 B2B는 항-CD47 항체 5F9와 마찬가지로 SK-OV-3, Toledo, K562, HCC827, Jurkat, U937, TF-1, Raji, SU-DHL-4, MDA-MB-231, A375 및 SK-MES-1 세포에 대한 식균작용을 촉진시키는 데 있어서 유사한 활성을 나타냈다.
실시예 9. 적혈구(RBC) 응집 분석에서의 RBC-보존(sparing) 특성
인간 RBC를 PBS에서 10%로 희석하고 둥근 바닥 96-웰 플레이트의 웰에서 항-CD47 항체의 적정과 함께 37
에서 2 시간 동안 배양하였다. 혈구응집의 증거는 혈구응집되지 않은 RBC의 빨간 점과 비교하여 안개와 같이 보이는 비침전 RBC의 존재에 의해 입증된다.
항-CD47 항체 B2B는 30 μg/μL 또는 심지어 150 μg/μL까지의 테스트 농도에서 RBC 응집을 일으키지 않았다.
실시예10. RBC 결합 분석
인간 RBC에 대한 CD47 항체의 결합을 유세포 분석에 의해 검사하였다. 인간 RBC를 CD47 항체(10 μg/mL)와 함께 4℃에서 1 시간 동안 배양한 다음, 알로피코시아닌(Allophycocyanin, APC) 접합된 2차 항체를 4℃에서 30 분동안 첨가하였다.
도 9a에 나타난 바와 같이, 항-CD47 항체 B2B는 테스트 농도에서 매우 낮은 RBC 결합(보통 15% 미만)만을 초래하였고, 반면 참조 항-CD47 항체 5F9는 동일한 농도에서 훨씬 더 높은 RBC 결합(보통 70-90% 사이)을 나타냈다.
실시예 11. RBC 응집 분석
CD47 항체의 첨가에 의한 RBC 응집을 분석하기 위해 6명의 남성 및 6명의 여성 건강한 개인으로부터 RBC를 수집하였다.
도 9b에 나타난 바와 같이, 항-CD47 항체 B2B는 RBC 응집을 나타내지 않았으나, 참조 항-CD47 항체 5F9 및 2A1은 현저한 응집을 일으켰다.
실시예 12. 혈소판 결합 분석
인간 혈소판에 대한 본 발명의 CD47 항체의 결합을 유세포 분석에 의해 검사하였다. 인간 말초 전혈(human peripheral whole blood)을 본 명세서에 기재된 테스트 CD47 항체(10 μg/mL) 또는 SIRPα-Ig 융합체와 함께 배양하고, CD61을 혈소판에 대한 세포 표면 마커로서 염색하였다. 항-CD47 항체 또는 SIRPα-Ig 융합체의 결합은 CD61 양성 모집단(혈소판)을 게이팅하고 CD47 또는 SIRPα-Ig 융합체 결합의 백분율을 추가로 조사하여 측정하였다.
항-CD47 항체 B2B는 인간 혈소판에 눈에 띄게 결합하지 않은 반면 SIRPα-Ig 융합 단백질은 인간 혈소판에 눈에 띄게 결합하였다.
실시예 13. CD47 항체에 의해 유도된 원발성 인간 급성 골수성 백혈병 세포에 대한 식균작용
원발성 인간 급성 골수성 백혈병(AML) 환자의 원발성 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 1 μM 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스터(CFSE)로 10분 동안 표지한 다음, 5:1의 식세포당 종양 세포 비율로 단핵구 유래 대식세포(MDM)에 첨가하고 표시된 CD47 항체를 다양한 농도로 첨가하였다. 3 시간 동안 배양한 후, 포식되지 않은 표적 세포를 PBS로 세척하고 남은 식세포를 긁어내어 CD14 항체로 염색하고 유세포 분석에 의해 분석하였다. 식균작용은 CD14+ 세포를 게이팅한 다음 CFSE+ 세포의 백분율을 평가하여 측정하였다. 식균작용은 이전에 설명한 대로 측정하였다.
도 7 및 도 8에 각각 나타난 바와 같이, 항-CD47 항체 B2B는 참조 항-CD47 항체 5F9의 활성과 유사한, 현저한 AML 결합 능력(95% 초과) 및 식균작용 능력(최소 36%)을 나타냈다.
실시예 14. 루시퍼레이즈-Raji 세포주 유래 이종이식(CDX) 모델에서의 항-CD47 항체 B2B의 생체네 효능
NOD scid 감마(NSG) 쥐에 Raji Luc-EGFP(강화된 녹색 형광 단백질)를 꼬리 정맥 주사를 통해 1백만 세포/쥐의 농도로 이식하였다. 쥐는 생착(engraftment) 5일 후에 생착 수준을 결정하기 위해 생체 내에서 이미지화되었다. 항-CD47 항체 B2B를 사용한 치료는 같은 날부터 다른 용량으로 시작하였다. 대조군은 주어진 비히클이었다. 모든 쥐를 복강내 주사를 통해 격일로 주사하였다. 쥐는 항체 처리 후 0일, 4일, 7일, 11일, 14일, 18일 및 21일에 IVIS Lumina III 이미징 시스템을 통해 생체 내에서 이미지화되었다. 쥐의 종양 성장은 생체내 라이브 이미징 시스템을 통한 생물발광 발광(bioluminescent radiance) 분석을 통해 측정하였다.
Raji-이종이식 연구 종료 시, 모든 쥐를 안락사시켰다. B2B 처리된 쥐 및 비히클 처리된 쥐의 비장 세포를 분리하고, 유세포 분석에 의해 M1 대식세포(F4/80 양성 대식세포에 있는 CD80 양성의 %) 및 M2 대식세포(F4/80 양성 대식세포에 있는 CD206 양성의 %)의 백분율에 대해 분석하였다.
도 11은 항-CD47 항체 B2B로 처리된 쥐의 발광 강도가 10 mg/kg의 처리 후에 계속 감소하나, 더 낮은 농도의 처리 후에는 약간만 증가한다는 것을 나타낸다. 이는 B2B가 종양 보유 쥐에서 대식세포의 분극화를 효과적으로 유도했다는 것을 입증하였다.
실시예 15. 사이노몰거스 원숭이의 약리학적 안전성 연구
파일럿 - 단일 투여: 자연(Na
ve) 사이노몰거스 원숭이에 비히클(n=2), 항-CD47 항체 B2B(n=3, 용량=15 mg/kg) 또는 항-CD47 항체 5F9(n=3, 용량=15 mg/kg)를 정맥내 주입하였다. 혈액학(일반혈액검사 또는 "CBC(complete blood count)")를 채혈 후 24 시간 이내, 항-CD47 항체 투여 전 2 회 및 항체 투여 후 3, 6, 10, 14 및 21일차에 분석하였다. 적혈구 수(적혈구 또는 "RBC"라고도 함), 헤모글로빈(또는 "HGB"), 절대(absolute) 망상적혈구 수 및 혈소판 수를 포함하여 CBC 파라미터를 검사하였다.
파일럿 - 반복 투여: 유사하게, 자연 사이노몰거스 원숭이(n=2)에 항-CD47 항체 B2B를 20 mg/kg의 용량으로 정맥 주사하였다. 각 원숭이의 혈액 샘플을 서로 다른 시점에 항응고제가 없는 튜브에 정맥천자(venipuncture)하여 수집하였다. 항체 투여 후 지시된 시점에 혈액학(CBC) 파라미터를 검사하였다. 혈액학적 파라미터는 적혈구 수(RBC), 헤모글로빈(HGB), 혈소판 수 및 림프구 수를 포함한다. 항체 투여 후 표시된 시점에.
도 10a 및 도 10b는 항-CD47 항체 B2B는 투여 후 사이노몰거스 원숭이에서 현저한 혈액학적 변화를 유도하지 않았다는 것을 나타낸다.
사이노몰거스 원숭이에서 비임상시험관리기준(Good Laboratory Practice, GLP) 준수 4주 반복 용량 정맥내(IV) 독성 연구를 다음과 같이 수행하였다. 자연 사이노몰거스 원숭이에 항-CD47 항체 B2B 10 mg/kg, 30 mg/kg 또는 100 mg/kg을 반복 투여(매주 투여)로 정맥 주사하였다. 표시된 시점에 적혈구 수(RBC), 헤모글로빈(HGB), 혈소판 수 및 림프구 수를 포함하는 혈액학(CBC) 매개변수를 검사하였다. 도 10a는 B2B의 단일 투여 처리가 5F9의 처리와 비교하여 RBC 및 헤모글로빈의 수준에 최소한의 영향을 미쳤음을 나타낸다. 도 10b는 비히클 대조군과 비교하여, B2B를 상이한 용량으로 반복 처리하는 것이 수컷 및 암컷 사이노몰거스 원숭이 모두에서 RBC에 현저한 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다.
실시예 16. 재발성/난치성 고형 종양 및 림프종 환자에 대한 임상 연구
재발성/난치성 악성 종양 환자에서 항-CD47 항체 B2B를 사용하여 두 부분으로 구성된 임상 연구를 수행하였다. 임상 연구의 파트 1은 B2B 용량 증량으로 구성되어 있고, 파트 2는 용량 확장 연구이다. 용량 증량(파트 1) 동안, 고형 종양의 반응 평가 기준(RECIST v1.1) 및 iRECIST에 기반한 내약성, 안전성, 약동학(PK), 약력학(pharmacodynamics, PD) 및 항종양 활성을 결정하기 위해 재발성/난치성 고형 종양 환자에게 B2B를 매주 정맥 투여(1 mg/kg 내지 30 mg/kg)하였다. 예를 들어, Eisenhauer et al. (2009) European J. Cancer. 45:228-247 및 Seymour et al. (2017) Lancet Oncol. 18(3): e143-e152 참조.
더 구체적으로, 재발성/난치성 고형 종양 환자 20명을 5개의 B2B 용량 증량 코호트(1, 3, 10, 20 및 30 mg/kg) 중 하나에 할당하였다. B2B 독성은 관찰되는 용량 제한 독성(DLT) 없이 최대 30 mg/kg까지 관리할 수 있었다. 가장 흔한 치료 관련 부작용(TRAE)은 빈혈(30.0%, n=6), 피로(25.0%, n=5), 주입 관련 반응(20.0%, n=4) 및 설사(15.0%, n=3)였다. 모든 TRAE는 1등급 또는 2등급이었다. 첫 번째 주기 동안 헤모글로빈의 일시적이고 용량 의존적이지 않은 평균 1.5 mg/dL(범위: 0.4-2.6 mg/dL)의 감소가 모든 코호트에서 관찰되었으며, 이는 전임상(pre-clinical) GLP 독성 연구 결과와 일치한다. 용혈에 대한 실험실 또는 임상 증거는 어떤 코호트에서도 관찰되지 않았다. 예비 결과는 B2B의 약동학이 단일 투여 후 중용량 내지 고용량 수준에서 선형인 것으로 나타났다는 것을 보여준다. CD47 수용체 점유율은 20 mg/kg 이상의 피크 농도에서 말초 T세포에서 완전한 포화를 보였다.
도 12-14에 나타난 바와 같이, 본 발명의 항-CD47 항체(즉, B2B)는 재발성/난치성 고형 종양 환자에서 유리한 약동학(PK) 및 약력학(PD) 특성과 함께 30 mg/kg까지 안전한 것으로 나타났다. 2등급 초과의 TRAE가 관찰되었다.
실시예 17. 항-CD47 항체 제조
항체 B2B의 중쇄(서열번호: 3) 및 경쇄(서열번호: 4)를 암호화하는 cDNA를 합성하고 각각 인하우스(in house) 벡터 PIM4.0에 클로닝하였다. 그 다음 상기 cDNA를 포함하는 벡터를 항체 제조를 위해 CHO-K1 숙주 세포에 안정적으로 공 형질감염(co-transfect)시켰다. 항체 C3C 중쇄(서열번호: 7) 및 경쇄(서열번호: 8)를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 안정적으로 형질감염된 참조 세포주를 병행하여 개발하였다.
미니(mini) 풀 선택 및 일련의 확장 후, B2B 또는 C3C를 발현하는 CHO-K1 세포를 50 mL 스핀 튜브에서 5Х105 세포/mL의 밀도로 ActiPro 배지에 각각 접종하였다. 작업 부피가 각각 20 mL인 3 개의 배치(batch)를 각 항체에 대해 준비하였다. Cell Boost7a(CB7a) 및 Cell Boost 7b(CB7b)(10:1)를 피드 배지로 사용하였다. 간략히 설명하면, 3일차, 6일차, 8일차, 10일차 및 12일차에 0% - 5.0% CB7a 및 0% - 0.5% CB7a를 첨가하였다. 피딩 백분율과 피드 일(feed day)은 성장 및 대사 프로필에 따라 조정하였다. 글루코스 또한 배양물에 추가하였다. 유가 배양물(fed-batch cultures)을 Kuhner 진탕기(36.5℃, 75% 습도, 6% CO2, 225 RPM)에서 배양하였다. 배양 온도를 (a) 생존 세포 밀도(VCD)가 약 16Х106 세포/mL에 도달했을 때 또는 (b) 7일 중 먼저 도래하는 시점에 31℃로 변경하였다.
각 배치의 유가 배양물을 10일차와 14일차에 수확하였다. 수확된 배양물의 상층액을 단백질 A-HPLC에 의해 역가에 대해 측정하였다. 각 배치의 역가는 표 1 및 도 16a 및 16b에 나타난 바와 같다.
표 1. 유가 배양물의 제조 역가
각 항체에 대한 상위 2 개 풀의 유가 배양물의 상층액을 1단계 단백질 A 정제에 의해 추가로 정제하였다. 이어서, 단백질 A 정제된 항체를 표 2 에 나타낸 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 표 3 에 나타낸 모세관 전기영동(CE)에 의해 품질 분석하였다.
표 2. 상위 안정적인 풀의 SEC 프로파일
표 3. 상위 안정적인 풀의 CE 프로파일
위의 결과는 항체 B2B를 발현하는 CHO-K1 세포가 항체 C3C를 발현하는 CHO-K1 세포와 비교하여 10일차 및 마지막 날(예를 들어, 14일차) 모두에서 현저히 더 높은 항체의 평균 역가를 산출하였다는 것을 입증한다. 표 1 은 표 1은 항체 C3C와 비교하여 CHO-K1 세포로부터 항 B2B 항체의 우수한 제조를 나타낸다. 표 2 및 3 은 CHO-K1 세포에 의해 발현된 항체 B2B의 생성물 품질이 CHO-K1 세포에 의해 발현된 항체 C2C의 생성물 품질과 유사함을 나타낸다.
실시예 18: 재발성/난치성 악성 종양을 갖는 대상체에서, 차별화된 항-CD47 항체인 렘조팔리맙의 최초 환자 연구의 초기 단독요법(monotherapy) 결과
배경
CD47은 대부분의 암에서 발현된다. CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 차단하면 "날 먹지마" 신호가 억제되고 CD47을 발현하는 종양 세포에 대한 식균작용이 유발된다. 약물 클래스로서의 항-CD47 항체는 암에 대한 유망한 치료법으로 등장했으며, 이는 림프종(예를 들어, 실시예 22 참조) 및 백혈병 환자의 초기 임상 데이터에 의해 뒷받침된다. 그러나 CD47은 적혈구(RBC)에서도 자연적으로 발현된다. 초기 임상 및 전임상 연구는 다양한 치료용 항-CD47 항체가 혈액학적 독성, 즉 중증 빈혈 또는 혈소판 감소증을 유발할 수 있다는 것을 나타냈다.
렘조팔리맙(TJ011133, TJC4 또는 B2B로도 알려짐)은 IgG4 이소형의 신규한 완전 인간 CD47 항체이다. 이는 RBC와의 최소한의 상호작용을 위해 설계상 고유하게 선택되고 동일한 클래스의 다른 CD47 항체와 매우 차별화된다. 렘조팔리맙은 사이노몰거스 원숭이에서 RBC 수준의 최소한의 및 일시적인 감소만을 유도한다(예를 들어, 도 9b 참조). 렘조팔리맙의 RBC 보존 특성은 RBC의 글리코실화에 의해 보호되는 CD47의 고유한 글리코 에피토프를 인식하는 데에서 메커니즘적으로 기인한다. 렘조팔리맙은 쥐 이종이식 모델에서 (a) 다양한 종양 세포 유형에 대한 결합, (b) 시험관 내 종양 식균 작용 및 (c) 종양 박멸에 대한 강력한 활성을 유지한다.
방법 / 연구 설계
이 실시예는 진행성 재발성 또는 난치성 고형 종양 및 림프종이 있는 대상체에서 안전성, 내약성, 최대 허용 용량(MTD) 또는 최대 투여 용량(MAD), 약동학(PK) 및 약력학(PD), 및 권장되는 2상 용량(RP2D)을 평가하도록 설계된 1상 연구의 예비 결과를 제공한다. 연구의 파트 1에서는 표준 3+3 디자인의 단일 제제 용량 증량을 사용하였다. 도 17 참조. 렘조팔리맙은 치료용 항-CD47 항체를 투여할 때 일반적으로 사용되는 프라이밍 투여(priming dose)(예를 들어 낮은(-1 mg/kg) 매주 투여) 없이 연속 투여 코호트(1, 3, 10, 20 및 30 mg/kg)에서 진행성 재발성 또는 난치성 고형 종양이 있는 환자에게 매주 IV 주입으로 투여되었다.
결과
기본 특성
진행성 재발성 또는 난치성 고형 종양(즉, 폐, 난소, 대장, 췌장, 육종, 두경부, 위, 신장 및 피부)이 있는 20명의 환자가 단독요법 용량 증량 연구에 등록되었다. 환자의 기본 특성과 1, 3, 10, 20 또는 30 mg/kg 렘조팔리맙을 qw 투여한 환자의 수는 표 4 에 나타난다:
표 4: 기본 특성
안전성
연구 내내 용량 제한 독성(DLT) 또는 약물 관련 심각한 부작용(SAE)이 보고되지 않았다. 모든 치료 관련 부작용(TAAE)은 3등급 라이페이즈 증가 1건을 제외하고 1등급 또는 2등급이었습니다. 표 5 (GR = 등급) 참조. 모든 독성은 부작용에 대한 공통 용어 기준(CTCAE) v 5.0을 사용하여 등급이 매겨졌다. 예를 들어 ctep(dot)cancer(dot)gov/protocoldevelopment/electronic_applications/docs/CTCAE_v5_Quick_Reference_5x7(dot)pdf 참조.
표 5: 코호트별 치료 관련 부작용(TRAE)
헤모글로빈 및 망상적혈구 수준에 미치는 영향
첫 번째 주기(즉, 21일) 동안 헤모글로빈 수준의 일시적인 감소가 모든 코호트에서 관찰되었다. 도 18a는 모든 20명의 환자의 헤모글로빈 및 망상적혈구 수준의 시간 경과를 나타내고, 도 18b는 최고 용량(30 mg/kg)의 렘조팔리맙을 투여받은 환자의 헤모글로빈 및 망상적혈구 수준의 시간 경과를 나타낸다. 평균 하락은 -10%였으며 용량 의존적이지 않았다. 이 발견은 전임상 비임상시험관리기준(GLP) 독성 연구 결과와 일치한다. 보고된 약물 관련 빈혈 중 어느 것도 본질적으로 심각하거나 용혈성인 것으로 간주되지 않았다.
약동학(PK)
렘조팔리맙의 PK 프로파일은 단일 투여 후 10 mg/kg보다 높은 용량에서 선형으로 나타난 반면, 이의 노출은 1 내지 10 mg/kg의 용량 범위에 걸쳐 용량 비례보다 컸으며, 이는 더 높은 용량에서 렘조팔리맙이 CD47 싱크(sink) 효과를 극복할 수 있다는 것을 시사한다. 도 19a는 단일 투여 후 환자에서의 렘조팔리맙의 혈청 PK를 나타내고, 도 19b는 다중 투여 후 환자에서의 렘조팔리맙 qw의 혈청 PK를 나타낸다. 첫 번째 치료 후 5명의 대상체가 항약물 항체(ADA)에 대해 양성으로 확인되었다: 1 mg/kg에서 3명, 3 mg/kg에서 1명 및 O mg/kg에서 1명. 안전성 또는 PK에 대한 ADA의 영향은 관찰되지 않았다.
약력학(PD)
말초 T세포 상의 CD47(수용체 점유율 RO)의 최대 포화는 렘조팔리맙의 매주 투여 후, 20 및 30 mg/kg에서 달성되었다. 도 20 참조.
예비 효능
30 mg/kg 단독요법 코호트에서 하나의 확인된 부분 반응(PR)이 관찰되었다(1/3). 5 주기로 진행중인 30 mg/kg qw 단일 요법이 완료되었다. 환자는 전이성 흑색종을 가지고 있었고 이전에 니볼루맙(nivolumab)(항-PD1 항체) 및 이필리무맙(ipilimumab)(항-CTLA 항체)으로 전신 치료를 받았다. 흑색종 환자에서 반응하는 간 전이를 나타내는 도 21 참조.
결론
렘조팔리맙은 프라이밍 투여 전략 없이 매주 30 mg/kg까지 안전하고 내약성이 우수한 것으로 나타난다. 용량 제한 독성이 관찰되지 않았으며 최대 허용 용량에 도달하지 않았다. 가장 흔한 부작용은 피로와 일시적인 빈혈을 포함하였다. 치료 관련 심각한 부작용은 보고되지 않았다. 렘조팔리맙 PK는 현저한 싱크 효과 없이 단일 투여 후 중용량 내지 고용량 수준에서 선형인 것으로 나타난다. 체크포인트 억제제를 사용한 선행 치료에 실패한 한 명의 환자(30 mg/kg)에서 단일 요법 임상 활동(부분 반응)이 관찰되었다.
참조
Willingham et al. (2012) PNAS USA. 109(17): 6662-6667
Liu et al. (2015) PLOS One. 10(9): e0137345
Sikic et al. (2019) J Clin Oncol. 37:946-953.
실시예 22: 재발성 및 난치성 비호지킨 림프종에서의, 리툭시맙과 조합한 차별화된 항-CD47 항체 렘조팔리맙의 초기 임상 결과
서론
렘조팔리맙(TJ011133, TJC4 및 B2B로도 알려짐)은 고유한 적혈구 보존 특성을 부여하는 별개의 CD47 에피토프를 표적으로 하는 차별화된 CD47 IgG4 항체이며, 고형 종양이 있는 환자에서 입증된 바와 같이 강력한 항종양 활성을 유지한다. ( 실시예 21 참조) 렘조팔리맙은 상당한 혈액학적 독성을 유도하지 않고 다른 CD47 항체에 필요한 프라이밍 투여(예를 들어 - 1 mg/kg의 낮은 매주 투여) 없이 투여할 수 있다. 렘조팔리맙은 림프종 동물 모델에서 리툭시맙과 조합 시 향상된 치료 효과를 나타낸다.
방법
이것은 적어도 2 개의 선행 치료를 받은, CD20 양성 비호지킨 림프종(NHL)을 갖는 재발성 및 난치성(R/R) 환자를 등록한 1b상 연구이다. 환자들에게 3+3 용량 증량 설계로 렘조팔리맙을 투여한 후 용량을 늘렸다. 렘조팔리맙은 리툭시맙(매주 375 mg/m2)과 조합하여 매주 20 mg/kg 또는 매주 30 mg/kg의 용량으로 5회 투여한 후 월 1회(q4w 또는 28일마다)로 3 회 정맥 투여하였다. Lugano 기준(Cheson et al. (2014) Journal of Clinical Oncology. 32:27, 3059-3067 및 Van Heertum et al. (2017) Drug Des Devel Ther. 11: 1719-1728)에 기초하여 안전성, 내약성, 약동학(PK), 약력학(PD) 및 항종양 활성을 평가하였다.
결과
이전에 CD20 표적 요법을 진행한, 심하게 선행 치료를 받은 8 명의 재발성/난치성 비호지킨 림프종(R/R NHL) 환자를 20 mg/kg(n=6) 및 30 mg/kg(n=2)의, 리툭시맙과 조합한 렘조팔리맙 투여 코호트에 등록하였다. 진단에는 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL)[n=2], 맨틀 세포 림프종(MCL)[n=1] 및 여포성 림프종(FL)[n=5]이 포함되었다. 환자의 중간 나이는 63 세(범위: 43-48 세)였고 중간 선행 치료 횟수는 4 회(범위: 2-10)였다. 안전성 및 내약성: 가장 흔한 치료 관련 부작용(TRAE)은 주입 관련 반응(n=4), 가려움증(n=3), 피로(n=3), 발진(n=2), 변비(n=2) 및 호흡곤란(n=2)이었다. 20 mg/kg 용량 수준에서 흉막 삼출, 빈맥, 기침, 소양증, 피로, 발진 및 호흡곤란을 포함하는 3등급 TRAE를 보고한 한 사람을 제외하고 모든 TRAE는 1등급 또는 2등급이었다. 경미한 혈액학적 이상반응(AE)이 각각 빈혈과 혈소판 감소증의 단독 에피소드로 관찰되었으며 치료가 필요하지 않았다. PK 및 PD: 리툭시맙의 조합 투여는 렘조팔리맙의 PK 또는 면역원성에 영향을 미치지 않았다. 평균적으로, 20 및 30 mg/kg을 투여한 환자의 생검 림프절에서 각각 80% 및 90%의 CD47 수용체 점유율이 발견되었으며, 이는 현저한 종양 표적 결합을 나타낸다. 항종양 활성: 효능을 평가할 수 있는 7 명의 환자 중에서, 3 개의 완전 반응(CR)[1 개의 변형된 FL-DLBCL + 2 개의 FL]과 1 개의 FL의 부분 반응(PR), 총 3 개의 안정 질병(SD 기간 3-6 개월 사이)이 관찰되었다(ORR=57%). 전체 질병 통제율(DCR)은 100%였다. 모든 평가 가능한 환자에서 종양 수축이 관찰되었다. 1 명의 환자는 첫 번째 주기에서 연구 중단 후 임상적 질병 진행으로 인해 치료 효능에 대해 평가할 수 없었다. 치료에 대한 초기 반응까지의 평균 시간은 2 개월이었고 모든 반응자는 데이터 컷오프(cutoff) 시점에 임상 반응을 유지하였다. 지속적인 치료 도중, 2 명의 환자가 개선된 반응을 보였다. 1 명의 변형된 FL-DLBCL 환자는 2 개월차 PR에서 8 개월차 CR로 호전되었고 다른 FL 환자는 2 개월차 SD에서 4 개월차 PR로 호전되었다.
결론
단독요법 결과와 일관되게( 실시예 21 참조), 리툭시맙과 조합하여 20 - 30 mg/kg으로 주어진 렘조팔리맙은 R/R NHL 환자에게 안전하고 내약성이 양호하며, 다른 치료용 항-CD47 항체에 대해 일반적으로 사용되는 프라이밍 투여가 필요하지 않다. 두 용량 수준 모두에서 높은 수준의 종양 내 표적 결합에 도달하였다. 조합 요법은 이전에 CD20 표적 요법을 진행한, 심하게 선행 치료를 받은 R/R NHL 환자에서 임상 활동의 증거를 나타냈다.
본 발명은 본 발명의 실시를 위한 바람직한 양태를 포함하기 위해 본 발명자에 의해 발견되거나 제안된 특정 실시양태의 관점에서 설명되었다. 당업자는 본 발명의 의도된 범위를 벗어나지 않고, 예시된 특정 실시양태에서 본 개시 내용에 비추어 수많은 수정 및 변경이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 코돈 중복성으로 인해 단백질 서열에 영향을 주지 않고 기본 DNA 서열을 변경할 수 있다. 또한, 생물학적 기능적 동등성을 고려하여 생물학적 작용의 종류나 양에 영향을 주지 않고 단백질 구조를 변경할 수 있다. 이러한 모든 수정은 첨부된 청구범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
아미노산 및 핵산 서열
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I-MAB BIOPHARMA US LIMITED
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Gln Gln Tyr Tyr Thr Pro Pro Leu Ala
1 5
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 39
Glu Arg Ala Trp Met Asn
1 5
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 40
Trp Val Gly Arg Ile Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr Thr Asp
1 5 10 15
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 41
Ala Gly Ser Asn Arg Ala Phe Asp
1 5
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 42
Leu Tyr Ala Gly Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr
1 5 10
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 43
Leu Leu Ile Asn Gln Ala Ser Thr Arg Ala
1 5 10
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 44
Gln Gln Tyr Tyr Thr Pro Pro Leu
1 5
<210> 45
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 45
gaggtgcagc tggtggagag cggaggcgga ctcgtgaagc ctggaggaag cctgaggctg 60
tcctgtgccg cttccggcct caccttcgag cgggcttgga tgaactgggt gaggcaggcc 120
cctggaaagg gcctggaatg ggtgggccgg atcaagagga aaacagatgg cgagaccacc 180
gattacgccg ctcccgtgaa gggccggttt agcatctcca gggacgactc caagaacacc 240
ctgtatctgc agatgaacag cctgaagacc gaggacaccg ctgtgtacta ctgcgctggc 300
agcaacaggg cctttgatat ctggggccag ggcaccatgg tgacagtgtc ctcc 354
<210> 46
<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 46
gacatcgtga tgacccagtc ccctgattcc ctggccgtga gcctgggcga aagggctacc 60
atcaactgca agtcctccca gagcgtgctg tacgccggca acaaccggaa ctatctggct 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagcctccc aagctgctga tcaaccaggc tagcaccagg 180
gcttccggcg tgcctgatag gttcagcggc tccggctccg gcaccgagtt taccctgatc 240
atctcctccc tgcaggccga ggatgtggcc atctactact gccagcagta ctacacccct 300
cctctggcct ttggcggcgg caccaagctg gagatcaag 339
<210> 47
<211> 1338
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 47
gaggtgcagc tggtggagag cggaggcgga ctcgtgaagc ctggaggaag cctgaggctg 60
tcctgtgccg cttccggcct caccttcgag cgggcttgga tgaactgggt gaggcaggcc 120
cctggaaagg gcctggaatg ggtgggccgg atcaagagga aaacagatgg cgagaccacc 180
gattacgccg ctcccgtgaa gggccggttt agcatctcca gggacgactc caagaacacc 240
ctgtatctgc agatgaacag cctgaagacc gaggacaccg ctgtgtacta ctgcgctggc 300
agcaacaggg cctttgatat ctggggccag ggcaccatgg tgacagtgtc ctccgcctcc 360
acaaagggac cttccgtgtt ccctctggcc ccttgttccc ggtccacctc cgaaagcacc 420
gctgctctgg gctgcctcgt caaggactac ttccctgagc ccgtgaccgt gagctggaac 480
tccggcgctc tgacaagcgg cgtgcatacc ttccctgccg tgctgcaaag cagcggcctg 540
tatagcctga gcagcgtggt gaccgtgcct agctcctccc tgggcaccaa aacctacacc 600
tgcaatgtgg accacaagcc ttccaacacc aaggtggaca agcgggtcga gtccaagtac 660
ggccctcctt gccctccctg ccccgctccc gagtttctgg gaggacccag cgtgttcctc 720
ttccccccta agcccaagga caccctgatg atcagccgga cacctgaggt cacctgcgtg 780
gtggtggatg tgagccaaga ggatcctgag gtccagttca actggtacgt ggacggagtg 840
gaggtgcata acgccaagac caagcctcgg gaggagcagt tcaactccac ctatagggtg 900
gtgagcgtgc tcacagtgct ccaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caaatgcaag 960
gtgtccaaca agggactccc cagcagcatc gaaaagacca tcagcaaggc caaaggccag 1020
cccagggaac cccaggtgta cacactgccc ccctcccaag aggaaatgac caagaatcag 1080
gtgtccctga cctgcctggt gaaaggcttt taccccagcg acatcgctgt cgagtgggag 1140
agcaacggcc agcctgagaa taactataag accacccccc ccgtgctgga tagcgacgga 1200
tccttcttcc tctactcccg gctgaccgtg gataagtccc ggtggcagga gggcaacgtg 1260
ttcagctgct ccgtcatgca cgaggccctg cataaccact acacccagaa gtccctgagc 1320
ctgtccctgg gcaagtga 1338
<210> 48
<211> 663
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 48
gacatcgtga tgacccagtc ccctgattcc ctggccgtga gcctgggcga aagggctacc 60
atcaactgca agtcctccca gagcgtgctg tacgccggca acaaccggaa ctatctggct 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagcctccc aagctgctga tcaaccaggc tagcaccagg 180
gcttccggcg tgcctgatag gttcagcggc tccggctccg gcaccgagtt taccctgatc 240
atctcctccc tgcaggccga ggatgtggcc atctactact gccagcagta ctacacccct 300
cctctggcct ttggcggcgg caccaagctg gagatcaaga ggacagtggc cgccccctcc 360
gtgttcattt tccctccctc cgacgagcag ctgaagtccg gcaccgcctc cgtggtgtgc 420
ctgctgaaca acttctaccc cagggaggcc aaggtgcagt ggaaggtgga caatgccctg 480
cagagcggca acagccagga gagcgtcacc gagcaggact ccaaagacag cacatacagc 540
ctgtccagca ccctgaccct gtccaaggct gactatgaga agcacaaggt gtacgcctgc 600
gaggtgaccc accagggact gagctcccct gtgaccaagt ccttcaaccg gggagagtgc 660
tga 663
<210> 49
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 49
cgggcttgga tgaac 15
<210> 50
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 50
cggatcaaga ggaaaacaga tggcgagacc accgattacg ccgctcccgt gaagggc 57
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 51
agcaacaggg cctttgatat c 21
<210> 52
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 52
aagtcctccc agagcgtgct gtacgccggc aacaaccgga actatctggc t 51
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 53
caggctagca ccagggcttc c 21
<210> 54
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 54
cagcagtact acacccctcc tctggcc 27
<210> 55
<211> 444
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Glu Arg Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gly Ser Asn Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
Claims (64)
- (a) (1) N-말단에 글루탐산 잔기(E); (2) RAWMN(서열번호: 5)을 포함하는 CDR-H1; (3) RIKRKTDGETTDYAAPVKG(서열번호: 6)를 포함하는 CDR-H2; (4) SNRAFDI(서열번호: 7)를 포함하는 CDR-H3; 및 (5) C-말단에 세린(S)을 포함하는 중쇄 가변(VH) 도메인; 및
(b) (1) KSSQSVLYAGNNRNYLA(서열번호: 8)을 포함하는 CDR-L1; (2) QASTRAS(서열번호: 9)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) QQYYTPPLA(서열번호: 10)를 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인
을 포함하는, 인간 CD47(hCD47)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항에 있어서,
VH 도메인의 N-말단 아미노산이 Kabat 넘버링 시스템에 따른 위치 H1에 해당하고, VH 도메인의 C-말단 아미노산이 Kabat 넘버링 시스템에 따른 위치 H113에 해당하는 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항에 있어서,
VH 도메인의 N-말단 아미노산이 Chothia 넘버링 시스템에 따른 위치 H1에 해당하고, VH 도메인의 C-말단 아미노산이 Chothia 넘버링 시스템에 따른 위치 H113에 해당하는 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항에 있어서,
VH 도메인의 N-말단 아미노산이 IMGT 넘버링 시스템에 따른 위치 H1에 해당하고, VH 도메인의 C-말단 아미노산이 IMGT 넘버링 시스템에 따른 위치 H128에 해당하는 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
VH 도메인의 N-말단 아미노산이 서열번호: 1의 아미노산 1에 해당하고, VH 도메인의 C-말단 아미노산이 서열번호: 1의 아미노산 118에 해당하는 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
VH가 서열번호: 1과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호: 2와 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
VH가 서열번호: 1을 포함하고, VL이 서열번호: 2를 포함하는 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
Fc 도메인을 포함하는, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제8항에 있어서,
인간 IgG Fc 도메인을 포함하는, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제9항에 있어서,
인간 IgG Fc 도메인이 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 도메인인 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
항체가 전장 항체(full length antibody)인, 항-CD47 항체. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호: 3 또는 서열번호: 55를 포함하는 중쇄 및 서열번호: 4를 포함하는 경쇄를 포함하는, 항-CD47 항체. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
단편이 Fab, Fab', F(ab)'2, Fab'-SH, 단일쇄 Fv(scFv), Fv 단편 또는 선형 항체인, 항-CD47 항체의 면역학적 활성 단편. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
항체 또는 이의 단편이 단일클론항체 또는 이의 단편인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
항체 또는 이의 단편이 키메라 또는 인간화된 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
항체 또는 단편이 암 세포의 표면 상에 발현된 hCD47에 결합하는, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제16항에 있어서,
암 세포가 SK-OV-3 세포, Toledo 세포, K562 세포, HCC827 세포, Jurkat 세포, U937 세포, TF-1 세포, Raji 세포, SU-DHL-4 세포, MDA-MB-231 세포, A375 세포 또는 SK-MES-1 세포인 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제16항에 있어서,
암 세포가 고형 종양 암인 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제18항에 있어서,
고형 종양 암이 폐암, 난소암, 대장암, 췌장암, 육종암, 두경부암, 위암, 신장암 또는 피부암인 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제16항에 있어서,
암 세포가 혈액암인 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제20항에 있어서,
혈액암이 비호지킨 림프종인 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
항체 또는 단편이 혈액 세포의 표면 상에 발현된 hCD47에 결합하지 않는, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제22항에 있어서,
혈액 세포가 적혈구인 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
hCD47에 대한 항체 또는 이의 단편의 결합이 hCD47과 신호 조절 단백질 α(signal-regulatory-protein α, SIRPα)의 상호작용을 예방하는 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제24항에 있어서,
SIRPα가 인간 SIRPα(hSIRPα)인 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항 내지 제25항에 있어서,
암 세포의 표면 상에 발현된 hCD47에 대한 항체 또는 이의 단편의 결합이 암 세포에 대한 대식세포-매개 식균작용을 촉진시키는 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제26항에 있어서,
암 세포가 SK-OV-3 세포, Toledo 세포, K562 세포, HCC827 세포, Jurkat 세포, U937 세포, TF-1 세포, Raji 세포, SU-DHL-4 세포, MDA-MB-231 세포, A375 세포 또는 SK-MES-1 세포인 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제26항에 있어서,
암 세포가 고형 종양 암인 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제28항에 있어서,
고형 종양 암이 폐암, 난소암, 대장암, 췌장암, 육종암, 두경부암, 위암, 신장암 또는 피부암인 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제26항에 있어서,
암 세포가 혈액암인 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제30항에 있어서,
혈액암이 비호지킨 림프종인 것인, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체에게 항체 또는 이의 단편을 투여해도 대상체에서의 현저한 수준의 혈구응집 또는 대상체의 적혈구 고갈을 유발하지 않는, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편. - 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 암호화하는, 핵산.
- 제33항의 핵산을 포함하는, 벡터.
- 제33항의 핵산 또는 제34항의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
- 제35항에 있어서,
포유류 세포인, 숙주 세포. - 제36항에 있어서,
포유류 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 것인, 숙주 세포. - 제37항에 있어서,
CHO 세포가 CHO-K1 세포인 것인, 숙주 세포. - a) 항-CD47 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 유발하기에 효과적인 조건 하에서 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
b) 숙주 세포에 의해 발현된 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 회수하는 단계
를 포함하는, 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 제조하는 방법. - 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 항-CD47 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
- (a) (1) RAWMN(서열번호: 5)을 포함하는 CDR-H1; (2) RIKRKTDGETTDYAAPVKG(서열번호: 6)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) SNRAFDI(서열번호: 7)를 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH);
(b) (1) KSSQSVLYAGNNRNYLA(서열번호: 8)를 포함하는 CDR-L1; (2) QASTRAS(서열번호: 9)를 포함하는 CDR-L2; 및 QQYYTPPLA(서열번호: 10)를 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인
을 포함하는 항-CD47 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법. - 제41항에 있어서,
암이 고형 종양인 것인, 방법. - 제42항 또는 제43항에 있어서,
고형 종양이 폐 종양, 난소 종양, 대장 종양, 췌장 종양, 육종 종양, 두경부 종양, 위 종양, 신장 종양 또는 피부 종양인 것인, 방법. - 제42항 또는 제43항에 있어서,
고형 종양이 재발성 및/또는 난치성 고형 종양인 것인, 방법. - 제41항에 있어서,
암이 비호지킨 림프종(NHL)인 것이고, 리툭시맙의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제45항에 있어서,
NHL이 여포성 림프종(FL), 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL) 또는 맨틀 세포 림프종(MCL)인 것인, 방법. - 제45항 또는 제46항에 있어서,
NHL이 재발성/난치성 NHL인 것인, 방법. - 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체가 NHL에 대한 선행 치료를 적어도 1 회 받은 것인, 방법. - 제48항에 있어서,
대상체가 NHL에 대한 선행 치료를 2 내지 10 회 사이로 받은 것인, 방법. - 제48항 또는 제49항에 있어서,
대상체가 CD20을 표적으로 하는 제제를 사용하는 NHL에 대한 선행 치료를 받은 것인, 방법. - 제50항에 있어서,
대상체가 CD20을 표적으로 하는 제제를 사용하는 선행 치료의 진행 도중 또는 이후에 있는 것인, 방법. - 제41항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
항-CD47 항체가 S233P 돌연변이(넘버링은 EU 인덱스에 따름)를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 것인, 방법. - 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
항-CD47 항체가 10 mg/kg의 용량으로 대상체에게 투여되는 것인, 방법. - 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
항-CD47 항체가 20 mg/kg의 용량으로 대상체에게 투여되는 것인, 방법. - 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
항-CD47 항체가 30 mg/kg의 용량으로 대상체에게 투여되는 것인, 방법. - 제41항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
항-CD47 항체가 매주 1 회(qw) 대상체에게 투여되는 것인, 방법. - 제41항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
항-CD47 항체가 정맥내(IV) 주입을 통해 대상체에게 투여되는 것인, 방법. - 제45항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
리툭시맙이 처음 5 주 동안 375 mg/m2의 용량으로 매주 1회(qw) 투여되고, 처음 5 주 이후 375 mg/m2의 용량으로 4주 마다 1회(q4w) 투여되는 것인, 방법. - 제41항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체가 항-CD47 항체를 사용한 치료로 인해 현저한 혈액학적 독성을 경험하지 않는 것인, 방법. - 제59항에 있어서,
대상체가 항-CD47 항체를 사용한 치료로 인해 어떠한 혈액학적 독성도 경험하지 않는 것인, 방법. - 제59항 또는 제60항에 있어서,
혈액학적 독성이 빈혈, 혈구감소증 및/또는 혈구응집을 포함하는 것인, 방법. - 제41항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
항-CD47 항체의 VH가 서열번호: 1을 포함하고, 항-CD47 항체의 VL이 서열번호: 2를 포함하는 것인, 방법. - 제41항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
항-CD47 항체의 중쇄가 서열번호: 3 또는 서열번호: 55를 포함하고, 항-CD47 항체의 경쇄가 서열번호: 4를 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 항체 또는 제40항의 조성물을 포함하는, 암을 치료하기 위한 키트.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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