TW201734045A - 抗－ｉｌ１ｒａｐ抗體、結合ｉｌ１ｒａｐ及ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文中提供特異性結合至IL1RAP之抗體。亦描述能夠編碼所提供之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段的相關多核苷酸、表現所提供之抗體或抗原結合片段的細胞、以及相關聯之載體及經可偵測標示之抗體或抗原結合片段。此外，描述使用所提供之抗體之方法。舉例而言，所提供之抗體可用來診斷、治療、或監測IL1RAP表現性癌症之進展、消退、或穩定；用來判定病患是否應該進行癌症治療；或用來判定對象是否罹患IL1RAP表現性癌症，並因而可適於以IL1RAP特異性抗癌症治療劑(諸如本文中所述之針對IL1RAP及CD3的多特異性抗體)來進行治療。

Description

抗-IL1RAP抗體、結合IL1RAP及CD3之雙特異性抗原結合分子及其用途
本申請案主張2015年11月2日申請之美國專利臨時申請案第62/249,466號之權利，該案全文以引用方式併入本文中。
本申請案含有序列表，其已經以ASCII格式藉由電子方式提交且其全文以引用方式併入本文中。該ASCII副本(建立於2016年10月27日)被命名為PRD3394USNP_SL.TXT且檔案大小為121,828位元組。
本文中所提供之揭示係關於特異性結合介白素-1受體輔助蛋白(IL1RAP)的單株抗體、特異性結合IL1RAP與決定簇3(cluster determinant 3,CD3)的多特異性抗體、及生產和使用所述抗體的方法。
急性骨髓性白血病(AML)係以白血病細胞之殖株擴增為特徵的遺傳異質性疾病。儘管對AML之潛在疾病生物學之理解增加，但是在過去幾十年中，用細胞毒性化學療法的標準治療在很大程度上保持不變，並且總體五年存活率仍然很差，小於30%(Cancer Genome Atlas Research Network(2013)N Engl J Med 368(22)：2059-2074；Burnett A,Wetzler M,Löwenberg B(2011)J Clin Oncol 29(5)：487-494)。因此，迫切需要具有增加之功效及減少之毒性的新療法，其理想地靶向AML幹細胞，因為這些細胞被認為在AML之致 病機制中係緊要的，並認為其由於標準療法之不充分根除而促成高復發率(Hope KJ,Jin L,Dick JE(2004)Nat Immunol 5(7)：738-743；Ishikawa F等人(2007)Nat Biotechnol 25(11)：1315-1321)。儘管針對細胞表面分子之治療性抗體已經證明對於治療惡性疾病諸如淋巴瘤及急性淋巴母細胞性白血病以及實體腫瘤係有效的(Hoelzer D(2013)Curr Opin Oncol 25(6)：701-706,Jackson SE,Chester JD(2015)Int J Cancer 137(2)：262-266)，但目前沒有基於抗體之療法被批准用於AML。
介白素1受體輔助蛋白(IL1RAP)，亦稱為IL1R3，係1型介白素1受體(IL1R1)、介白素-33受體(IL-33R，亦稱為ST2)、及介白素-36受體(IL-36R，亦稱為IL-1RL2)之共受體(coreceptor)，並對於IL-1、IL-33、及IL-36傳訊係不可缺少的(Subramaniam S,Stansberg C,Cunningham C(2004)Dev Comp Immunol 28(5)：415-428)。已經報導IL1RAP作為推定的慢性骨髓性白血病幹細胞之生物標記(Järås M等人(2010)Proc Natl Acad Sci USA 107(37)：16280-16285)。最近研究顯示，在約80%的AML病患中IL1RAP在細胞表面上表現，且可藉由抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)在體外選擇性殺滅候選CD34+CD38- AML幹細胞(Askmyr M等人(2013)Blood 121(18)：3709-3713)。此外，IL1RAP在具有染色體7異常之高危AML的未成熟細胞中上調，且增加之IL1RAP表現與不良預後相關(Barreyro L等人(2012)Blood 120(6)：1290-1298)。這些發現表明IL1RAP係AML中基於抗體之療法的合適目標。
在WO2009120903及WO2011021014中提及了抗IL1RAP抗體用於治療AML之用途。針對IL1RAP之抗體係描述於例如WO2014100772中。所描述之IL1RAP抗體利用ADCC作為其作用模式。不幸的是，由治療性抗體觸發ADCC面臨數個限制。首先，Fc與其受體之間的親和力扮演至關重要的角色，且80%的群體表現受體之低親和力變異體之事實係主要問題(Chames P,Van Regenmortel M,Weiss E,Baty D.(2009)British Journal of Pharmacology.157(2)：220-233)。其次，IgG1分子在Fc區之CH2域(Asn 297)中經醣 基化。已證明該修飾減少ADCC效率(Shinkawa T,Nakamura K,Yamane N,Shoji-Hosaka E,Kanda Y,Sakurada M等人J Biol Chem.2003；278：3466-3473.)。第三個限制在於治療性抗體必須與高濃度的病患IgG競爭結合至FcγRIIIa之事實(Preithner S,Elm S,Lippold S,Locher M,Wolf A,da Silva AJ等人Mol Immunol.2006；43：1183-1193)。最後，使用治療性抗體之第四個限制可為它們對由B細胞、巨噬細胞、樹突細胞、及嗜中性球所表現之抑制性Fc受體(諸如FcγRIIb)的親和力(Nimmerjahn F,Ravetch JV.Antibodies,Fc receptors and cancer.Curr Opin Immunol.2007；19：239-245)。
因此，仍然需要有用於治療IL1RAP表現性癌症的進一步選擇。
本文中提供特異性結合至IL1RAP之抗體及其抗原結合片段。亦描述能夠編碼所提供之IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段的相關多核苷酸、表現所提供之抗體及抗原結合片段的細胞、以及相關聯之載體和經可偵測標示之抗體及抗原結合片段。此外，描述使用所提供之抗體及抗原結合片段的方法。舉例而言，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段可用來診斷或監測IL1RAP表現性癌症(IL1RAP-expressing cancer)之進展、消退、或穩定；用來判定病患是否應該進行癌症治療；或用來判定對象是否罹患IL1RAP表現性癌症，並因而可適於以IL1RAP特異性抗癌症治療劑(諸如本文中所述之針對IL1RAP及CD3的多特異性抗體)來進行治療。
本文中進一步提供特異性結合至IL1RAP及CD3之多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段。亦描述能夠編碼所提供之IL1RAP×CD3多特異性抗體的相關多核苷酸、表現所提供之抗體的細胞、以及相關聯之載體和經可偵測標示之多特異性抗體。此外，描述使用所提供之多特異性抗體的方法。舉例而言，該等IL1RAP×CD3多特異性抗體可用來診斷或監測IL1RAP表現性癌症之進展、消退、或穩定；用來判定病患是否應該進行癌症治療；或用來判定對象 是否罹患IL1RAP表現性癌症，並因而可適於以IL1RAP特異性抗癌症治療劑(諸如本文中所述之IL1RAP×CD3多特異性抗體)來進行治療。
IL1RAP特異性抗體
本文中描述對於IL1RAP具有特異性之重組抗體及抗原結合片段。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段結合人類IL1RAP。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段結合人類IL1RAP及食蟹獼猴(cynomolgus monkey)IL1RAP。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段結合至一表位，該表位包括一或多個來自IL1RAP胞外域(ECD)的殘基。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。
表1提供本文中所述之一些IL1RAP特異性抗體實例的摘要：
在一些實施例中提供包含重鏈之IL1RAP特異性抗體、或其抗原結合片段，該重鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中提供包含重鏈及輕鏈之IL1RAP特異性抗體、或其抗原結合片段，該重鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3。在本文所提供之一些實施例中，該IL1RAP特異性抗體或其抗原結合片段與包含重鏈及輕鏈之抗體或抗原結合片段競爭對於IL1RAP之結合，該重鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3。
IgG類別在人類中係分成四種同型(isotype)：IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。它們在Fc區之胺基酸序列具有超過95%的同源性，但在鉸鏈區之胺基酸組成及結構顯示主要差異。Fc區媒介效應功能，諸如抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗體之Fc區結合至免疫效應細胞(諸如自然殺手細胞或巨噬細胞)表面上之Fc受體(FcgR)，促使吞噬或溶解標靶細胞。在CDC中，抗體藉由在細胞表面引發補體級聯反應(complement cascade)來殺滅標靶細胞。本文中所述之抗體包括具有所述可變域特性與任何IgG同型組合的抗體，包括其中Fc序列已經修飾以致使不同效應功能之經修飾版本。
在許多治療性抗體之應用中，Fc媒介之效應功能並非作用機制之一部分。這些Fc媒介之效應功能可能有害且由於造成偏離機制毒性(off-mechanism toxicity)而可能構成安全風險。修飾效應功能可藉由工程改造Fc區以降低其對FcgR或補體因子之結合來達成。IgG對於活化性(FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIIa、及FcgRIIIb)和抑制性(FcgRIIb)FcgR或補體之第一成分(C1q)的結合取決於位在鉸鏈區和CH2域中之殘基。已將突變引入IgG1、IgG2、及IgG4中以降低或靜默Fc功能性。本文中所述之抗體可包括這些修飾。
在一個實施例中，抗體包含具有一或多個下列特性之Fc區：(a)在與親系Fc比較時效應功能有所降低；(b)對於Fcg RI、Fcg RIIa、Fcg RIIb、Fcg RIIIb及/或Fcg RIIIa之親和力降低、(c)對於FcgRI之親和力降低、(d)對於FcgRIIa之親和力降低、(e)對於FcgRIIb之親和力降低、(f)對於Fcg RIIIb之親和力降低、或(g)對於FcgRIIIa之親和力降低。
在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段係IgG、或其衍生物，例如，IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4同型。在抗體具有IgG1同型之一些實施例中，該抗體在其Fc區中含有L234A、L235A、及/或K409R取代。在抗體具有IgG4同型之一些實施例中，該抗體在其Fc區中含有S228P、L234A、及L235A取代。本文中所述之抗體可包括這些修飾。
在一些實施例中，所述抗體能夠以50nM或更小之解離常數結合至IL1RAP，如由表面電漿共振(surface plasmon resonance,SPR)所測得者。在一些實施例中，該等抗體包含上表1中所示之抗體的CDR。用於測量親和力之測定包括使用BIAcore 3000機器所執行之測定，其中測定係在室溫(例如在25℃或接近25℃)下執行，其中能夠結合至IL1RAP之抗體係藉由抗Fc抗體(例如山羊抗人類IgG Fc特異性抗體，Jackson ImmunoResearch laboratories Prod # 109-005-098)捕獲至BIAcore感測晶片上達75RU左右之水準，接著在40μL/min之流率下收集締合及解離數據。
除了所述之IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段外，亦 提供能夠編碼所述抗體及抗原結合片段之多核苷酸序列。亦提供包含所述多核苷酸之載體，如表現本文中所提供之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段的細胞。亦描述能夠表現所揭示之載體的細胞。這些細胞可為哺乳動物細胞(諸如HEK-293F細胞、CHO-K1細胞)、昆蟲細胞(諸如Sf7細胞)、酵母菌細胞、植物細胞、或細菌細胞(諸如E.coli)。所述之抗體亦可藉由融合瘤細胞來生產。
使用IL1RAP特異性抗體之方法
亦揭示使用所述之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段之方法。此節中討論之方法所使用的特定抗體包括彼等具有如表1所述之抗體的CDR組。舉例而言，這些抗體或抗原結合片段可用於治療癌症，藉由1)干擾IL1RAP-受體交互作用，2)其中抗體與毒素共軛，從而將毒素靶向IL1RAP表現性癌症，或3)將身體之免疫細胞重新導向至IL1RAP表現性癌症之部位(ADCC，T細胞重新導向)。此外，這些抗體或抗原結合片段可用於偵測生物樣本(諸如血液或血清)中之IL1RAP的存在；用於定量生物樣本(諸如血液或血清)中之IL1RAP的量；用於診斷IL1RAP表現性癌症；判定治療罹患癌症之對象的方法；或者監測對象中之IL1RAP表現性癌症的進展。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症可為血液性癌症，諸如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS，低、中、或高危)、急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm,DPDCN)。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症包括實體腫瘤，諸如下列者：前列腺、乳腺、肺、結腸直腸、黑色素瘤、膀胱、腦/CNS、子宮頸、食道、胃、頭/頸、腎、肝、卵巢、胰腺、及肉瘤。所述方法可在該對象接受IL1RAP表現性癌症之治療前進行，諸如用針對IL1RAP及CD3之多特異性抗體治療。此外，所述方法可在該對象接受IL1RAP表現性癌症之治療後進行，諸如用本文中所述之針對IL1RAP及CD3之多特異性抗體治療。
所述之偵測生物樣本中之IL1RAP的方法包括使該生物樣本暴露於本文中所述之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段之一或多者。
所述之診斷對象中之IL1RAP表現性癌症的方法亦涉及使該生物樣本暴露於本文中所述之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段之一或多者；然而，該等方法亦包括定量存在於該樣本中之IL1RAP的量；將存在於該樣本中之IL1RAP的量與已知標準品或參考樣本比較；以及判定該對象之IL1RAP水準是否落入與癌症相關聯之IL1RAP水準。
本文中亦描述監測對象中之IL1RAP表現性癌症的方法。所述方法包括使該生物樣本暴露於本文中所述之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段之一或多者；定量存在於該樣本中由該抗體、或其抗原結合片段所結合之IL1RAP的量；將存在於該樣本中之IL1RAP的量與已知標準品或參考樣本比較，或者與先前得自該對象之類似樣本中之IL1RAP的量比較；以及基於所比較之樣本中之IL1RAP的量之差異來判定對象之IL1RAP水準是否指示癌症進展、消退或穩定疾病。
得自或衍生自對象之樣本係生物樣本，諸如尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞(cells that are not tissue associated)、組織、手術切除之腫瘤組織、活體組織切片、細針穿刺樣本、或組織標本(histological preparation)。
所述IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可經標示以用於所述方法或所屬領域中具有通常知識者所習知之其他方法中。舉例而言，本文中所述之抗體、或其抗原結合片段可用放射性標記、螢光標記、表位標籤、生物素、發色基(chromophore)標記、ECL標記、酶、釕、111In-DOTA、111In-二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶及β-半乳糖苷酶、或多-組胺酸或所屬領域中所習知之類似此等標記來加以標示。
IL1RAP特異性抗體套組
本文中所述者為包括所揭示之IL1RAP特異性抗體或其抗原結合片段之套組。所述套組可用來進行該等使用本文中所提供之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段之方法，或者所屬領域中具有通常知識者所習知之其他方法。在一些實施例中，所述套組可包括本文中所述之抗體或抗原結合片段及用於偵測生物樣本中之IL1RAP之存在的試劑。因此，所述套組可包括本文中所述之抗體(或其抗原結合片段)之一或多者及用於容納未使用時之該抗體或片段之容器、該抗體或片段之使用說明、固定至固相撐體(solid support)之抗體或片段、及/或該抗體或片段之可偵測標示形式，如本文中所述。
IL1RAP×CD3多特異性抗體
經由TCR/CD3複合體將T淋巴球重新導向至IL1RAP表現性癌細胞代表一種有吸引力的替代方法。T淋巴球的TCR/CD3複合體係由TCR阿法(α)/貝他(β)或TCR伽馬(γ)/德他(δ)異二聚體、以及共表現於細胞表面之不變CD3次單元(標示為伽馬(γ)、德他(δ)、艾普西龍(ε)、澤塔(ζ)、及艾塔(η))所組成。人類CD3ε係描述於UniProt P07766(CD3E_HUMAN)。在現有技術中所描述之一種抗CD3ε抗體係SP34(Yang SJ,The Journal of Immunology(1986)137；1097-1100)。SP34與靈長動物CD3及人類CD3反應。SP34可購自Pharmingen。在現有技術中所描述之進一步抗CD3抗體係UCHT-1(見WO2000041474)。在現有技術中所描述之進一步抗CD3抗體係BC-3(Fred Hutchinson Cancer Research Institute；用於GvHD的I/II期試驗，Anasetti等人，Transplantation 54：844(1992))。SP34與UCHT-1及BC-3的不同點在於SP-34辨識只存在於CD3的ε鏈上的表位(見Salmeron等人，(1991)J.Immunol.147：3047)，然而UCHT-1及BC-3則辨識由ε鏈及γ鏈兩者形成之表位。與抗體SP34具有相同序列之抗體的序列係在WO2008119565、WO2008119566、WO2008119567、WO2010037836、WO2010037837、及WO2010037838中提及。與抗體SP34的VH具有96%同一性的序列 係在US8236308(WO2007042261)中提及。
本文中所述者為結合IL1RAP及CD3之重組多特異性抗體(「IL1RAP×CD3多特異性抗體(IL1RAP×CD3 multispecific antibody)」)及其多特異性抗原結合片段。在一些實施例中，提供特異性結合至IL1RAP的重組抗體、或其抗原結合片段。
在一些實施例中，該多特異性抗體之IL1RAP特異性臂(IL1RAP-specific arm)結合人類IL1RAP及/或食蟹獼猴IL1RAP。在一些實施例中，該等IL1RAP×CD3多特異性抗體或抗原結合片段之IL1RAP特異性臂結合人類IL1RAP之胞外域。在較佳實施例中，該IL1RAP×CD3多特異性抗體或抗原結合片段係雙特異性抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，提供重組IL1RAP×CD3雙特異性抗體(包含：a)第一重鏈(HC1)；b)第二重鏈(HC2)；c)第一輕鏈(LC1)；及d)第二輕鏈(LC2)，其中該HC1及該LC1配對形成特異性結合IL1RAP之第一抗原結合部位，且該HC2及該LC2配對形成特異性結合CD3之第二抗原結合部位)或其IL1RAP×CD3雙特異性結合片段。在另一實施例中，提供表現該抗體或雙特異性結合片段之重組細胞。在一些實施例中，該IL1RAP×CD3多特異性抗體之IL1RAP結合臂(或「IL1RAP特異性臂(IL1RAP-specific arm)」)係衍生自本文中所述之IL1RAP抗體(例如，自具有表1中所列示之CDR序列之抗體)。
在一些實施例中，該等IL1RAP×CD3多特異性抗體或抗原結合片段之IL1RAP特異性臂係IgG、或其衍生物。在一些實施例中，所述IL1RAP×CD3多特異性抗體能夠以30nM或更小之解離常數結合至IL1RAP，如由表面電漿共振所測得者。在一些實施例中，所述IL1RAP×CD3多特異性抗體不是促效劑。在一些實施例中，所述IL1RAP×CD3多特異性抗體在高於6.7nM的濃度下抑制IL-1β媒介之AP-1活化及NF-κB活化。
在一些實施例中，該IL1RAP×CD3多特異性抗體之CD3結合臂(或「CD3特異性臂(CD3-specific arm)」)係衍生自小鼠單株抗體SP34，其係小鼠IgG3/λ同型。(K.R.Abhinandan and A.C. Martin,2008.Mol.Immunol.45,3832-3839)。在一些實施例中，該IL1RAP×CD3多特異性抗體之CD3結合臂包含選自表2之一個VH域及一個VL域。
IgG類別在人類中係分成四種同型：IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。它們在Fc區之胺基酸序列具有超過95%的同源性，但在鉸鏈區之胺基酸組成及結構顯示主要差異。Fc區媒介效應功能，諸如抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗體之Fc區結合至免疫效應細胞(諸如自然殺手細胞或巨噬細胞)表面上之Fc受體(FcgR)，促使吞噬或溶解標靶細胞。在CDC中，抗體藉由在細胞表面引發補體級聯反應來殺滅標靶細胞。
在許多治療性抗體之應用中，Fc媒介之效應功能並非作用機制之一部分。這些Fc媒介之效應功能可能有害且由於造成偏離機制毒性而可能構成安全風險。修飾效應功能可藉由工程改造Fc區以降低其對FcgR或補體因子之結合來達成。IgG對於活化性(FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIIa、及FcgRIIIb)和抑制性(FcgRIIb)FcgR或補體之第一成分(C1q)的結合取決於位在鉸鏈區和CH2域中之殘基。已將突變引入IgG1、IgG2、及IgG4中以降低或靜默Fc功能性。
在一個實施例中，抗體包含具有一或多個下列特性之Fc區：(a)在與親系Fc比較時效應功能有所降低；(b)對於Fcg RI、Fcg RIIa、Fcg RIIb、Fcg RIIIb及/或Fcg RIIIa之親和力降低、(c)對於FcgRI之親和力降低、(d)對於FcgRIIa之親和力降低、(e)對於FcgRIIb之親和力降低、(f)對於Fcg RIIIb之親和力降低、或(g)對於FcgRIIIa之親和力降低。
在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其衍生之該CD3特異性抗體或抗原結合片段係IgG、或其衍生物。在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其衍生之該CD3特異性抗體或抗原結合片段係IgG1、或其衍生物。在一些實施例中，舉例而言，該CD3結合臂係自其衍生之該CD3特異性IgG1抗體的Fc區在其Fc區中包含L234A、L235A、及F405L取代。在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其衍生之該CD3特異性抗體或抗原結合片段係IgG4、或其衍生物。在一些實施例中，舉例 而言，該CD3結合臂係自其衍生之該CD3特異性IgG4抗體的Fc區在其Fc區中包含S228P、L234A、L235A、F405L、及R409K取代。在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其衍生之該CD3特異性抗體或抗原結合片段結合初級人類T細胞及/或初級食蟹獼猴T細胞上之CD3ε。在一些實施例中，該多特異性抗體之CD3特異性臂係自其衍生之該CD3特異性抗體或抗原結合片段活化初級人類CD4+ T細胞及/或初級食蟹獼猴CD4+ T細胞。
除了所述IL1RAP×CD3多特異性抗體外，亦提供能夠編碼所述IL1RAP×CD3多特異性抗體之多核苷酸序列。在一些實施例中，提供編碼該IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段之該HC1、該HC2、該LC1、或該LC2的單離合成性多核苷酸。亦提供包含所述多核苷酸之載體，如表現本文中所提供之IL1RAP×CD3多特異性抗體的細胞。亦描述能夠表現所揭示之載體的細胞。這些細胞可為哺乳動物細胞(諸如HEK-293F細胞、CHO-K1細胞)、昆蟲細胞(諸如Sf7細胞)、酵母菌細胞、植物細胞、或細菌細胞(諸如E.coli)。所述之抗體亦可藉由融合瘤細胞來生產。在一些實施例中，提供用於藉由培養細胞來產生該IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段的方法。
本文中進一步提供包含該等IL1RAP×CD3多特異性抗體或抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑之醫藥組成物。
使用IL1RAP×CD3多特異性抗體之方法
亦揭示使用所述IL1RAP×CD3多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段之方法。舉例而言，該等IL1RAP×CD3多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段可用於治療有彼之需要的對象中的IL1RAP表現性癌症。在一些實施例中，該IL1RAP表現性癌症為血液性癌症，諸如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS，低、中、或高危)、急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(DPDCN)。在一些實施例 中，IL1RAP表現性癌症包括實體腫瘤，諸如下列者：前列腺、乳腺、肺、結腸直腸、黑色素瘤、膀胱、腦/CNS、子宮頸、食道、胃、頭/頸、腎、肝、卵巢、胰腺、及肉瘤。
所述之治療有彼之需要的對象中之IL1RAP表現性癌症的方法包括向該對象投予治療有效量之所述IL1RAP×CD3多特異性抗體或其多特異性抗原結合片段。在一些實施例中，該對象為哺乳動物，較佳為人類。在較佳實施例中，提供用於治療具有癌症之對象之方法，其係藉由向有彼之需要的病患投予治療有效量的該IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性抗原結合片段達一段足以治療該癌症的時間。
本文中進一步提供用於抑制癌細胞生長或增生之方法，其係藉由投予治療有效量的該IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段來抑制(inhibit)癌細胞之生長或增生。
本文中亦提供將T細胞重新導向IL1RAP表現性癌細胞之方法，其係藉由投予治療有效量的該IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段以將T細胞重新導向至癌症。
IL1RAP×CD3特異性抗體套組
本文中描述包括所揭示之IL1RAP×CD3多特異性抗體之套組。所述套組可用來進行該等使用本文中所提供之IL1RAP×CD3多特異性抗體之方法，或者所屬領域中具有通常知識者所習知之其他方法。在一些實施例中，所述套組可包括本文中所述之抗體及用於治療IL1RAP表現性癌症之試劑。因此，所述套組可包括本文中所述之多特異性抗體(或其多特異性抗原結合片段)之一或多者及用於容納未使用時之該抗體或片段之容器、及/或該抗體或片段之使用說明、固定至固相撐體(solid support)之抗體或片段、及/或該抗體或片段之可偵測標示形式，如本文中所述。
圖1。用於選殖IL1RAP胞外域之pDisplay載體。
圖2。在HEK-BlueTM IL-1報導細胞中，對來自IL1RAP噬菌體呈現(phage display)及OMT-1融合瘤之上清液篩選促效劑或拮抗劑活性(加入外源重組人類IL-1β)。值表示為每個樣本之三次讀數之平均值的原始光學密度(650nm處之OD)單位。
圖3A至3D。IAPB57表位位置及IL1RAP與IAPB57之間的交互作用。(圖3A)表位位置概觀。IAPB57結合至IL1RAP之D2及D3域(黑色區域)。(圖3B)IL1RAP與IAPB57之間的2D交互作用圖譜。除了CDR-L1及-L2以外的所有CDR殘基均接觸IL1RAP。凡得瓦(Van der Waals)交互作用顯示為虛線，H鍵係帶有箭頭的實線，指示主鏈H鍵並指向主鏈原子。IL1RAP、LC、及HC殘基分別在灰色框、白色框、及橢圓形中。使用4Å的距離截值(distance cut-off)來識別接觸殘基。(C、D)IL1RAP與Fab輕鏈(圖3C)及重鏈(圖4D)之主要交互作用的近視圖。H-鍵以虛線顯示。
圖4。IAPB57的表位及互補位(paratope)殘基。在IL1RAP同型中，表位殘基加下劃線，其序列中之差異以陰影區域顯示。僅顯示同型1及4之胞外區。互補位殘基是有陰影的，CDR區加下劃線(Kabat定義)。
圖5。表位群組之競爭概況：任何一個表位群組之成員具有相同競爭概況。在文氏圖(Venn diagram)中，若表位群組重疊，則它們競爭。否則，它們不競爭人類IL1RAP。
圖6A及圖6B。使用MV4-11 AML細胞之IL1RAP×CD3雙特異性抗體媒介之T細胞殺傷測定的代表性數據集：(6A)前9種IL1RAP×CD3雙特異性抗體，以及剩餘的6種雙特異性IL1RAP×CD3雙特異性抗體。IL1RAP陰性/低細胞系係(SU-DHL-10)，亦獲得對照數據(未顯示)。用增加濃度之抗體以5：1的E：T比用全人類T細胞(供體D103)運行測定。
圖7A及圖7B。NF-κB傳訊評估：(7A)在HEK-BlueTM IL-1報導細胞中，在存在外源重組人類IL-1β的情況下分析IC3B18、 IC3B19、及各自空臂雙特異性對照抗體(IAPB100、IAPB101、及CNTO 7008)之拮抗劑活性。(7B)在HEK-BlueTM IL-1報導細胞中，在不存在外源重組人類IL-1β(0.1ng/mL)的情況下分析IC3B18、IC3B19、及各自空臂雙特異性對照抗體(IAPB100、IAPB101、及CNTO 7008)之促效性活性。所有數據表示為來自每個樣本之3次讀數之平均值的對照百分比。
圖8A至圖8E。IL1RAP×CD3 T細胞媒介之細胞毒性測定。使用抗CD3臂CD3B219之IL1RAP×CD3雙特異性抗體與人類全T細胞及獲自細胞庫服務之IL1RAP+AML細胞系(8A至8D)或IL1RAP陰性/低B細胞淋巴瘤細胞系(8E)培養。在37℃、5% CO2下48小時後，藉由流式細胞術測量總腫瘤細胞之細胞毒性。
圖9。所檢查之四種細胞系之EC50值的摘要。
圖10。單離的自體正常健康人類CD14+單核球及CD3+T細胞之IC3B18及IC3B19媒介之細胞毒性的離體(ex vivo)評估。該圖顯示IC3B18、IC3B19、CNTO 7008(空×CD3)、IAPB100(IAPB63×B23B49)、及IAPB101(IAPB57×B23B49)雙特異性抗體之CD14+單核球之細胞毒性的百分比。
圖11A及圖11B。IC3B18及IC3B19對外源性添加至正常健康人類全血(供體27067)之SKNO-1細胞之細胞毒性的離體評估：在24小時(11A)和48小時(11B)時點，使用IC3B18及IC3B19(IL1RAP×CD3)及CNTO 7008(空×CD3)雙特異性抗體的SKNO-1細胞之細胞毒性的百分比。
圖12A至12E。IC3B18及IC3B19對新鮮AML供體全血中之母細胞之細胞毒性及T細胞活化的離體評估：(12A)顯示使用IC3B18及IC3B19、CNTO 7008(空×CD3)、及IAPB100或IAPB101(IL1RAP×空)雙特異性抗體之AML細胞的總細胞之細胞毒性的百分比；(12B)顯示由IC3B18及IC3B19、CNTO 7008、及IAPB100及IAPB101雙特異性抗體誘導的T細胞活化。不加入Fc阻斷劑。(12C)IC3B19誘發初級AML IL1RAP+母細胞之IL1RAP+特異性細胞之細胞毒性。對照抗體IAPB101(12D)及 CNTO 7008(12E)不誘導細胞毒性。
圖13A及圖13B。在正常健康人類全血中，IC3B19媒介之OCI-AML5細胞之細胞毒性。
圖14A至14E。測試了IL1RAP×CD3雙特異性抗體IC3B18及IC3B19結合至(13A)HEK-293F親系、(13B)HEK-293F人類HE2、(13C)HEK-293F食蟹獼猴CB8、(13D)HEK-293F小鼠殖株5、及(13E)HEK-293F大鼠殖株1之IL1RAP FL ECD細胞系的代表性數據。數值表示為來自每個測試樣本之重複讀數之平均值的MSD光單位。
圖15。在PBMC人化NSG小鼠中用IC3B19處理之OCI-AML5人類AML異種移植物的腫瘤發生預防。NSG小鼠係經靜脈內植入人類PBMC，7天後皮下接種OCI-AML5細胞，並在第0、3、5、7、及10天(由箭頭指示)，以0.0005mg/kg、0.005mg/kg、0.05mg/kg、及0.5mg/kg之IC3B19靜脈內給藥。每週兩次測量SC腫瘤，結果表示為各組之平均腫瘤體積，以mm3±平均值標準誤差(SEM)來表示。
圖16。在PBMC人化NSG小鼠中用IC3B19處理之MOLM-13人類AML異種移植物的腫瘤發生預防。NSG小鼠係經靜脈內植入人類PBMC，7天後皮下接種MOLM-13細胞，然後在第0、2、5、7、及9天(由箭頭指示)，以0.0005mg/kg、0.005mg/kg、0.05mg/kg、及0.5mg/kg之IC3B19靜脈內給藥。每週兩次測量SC腫瘤，結果表示為各組之平均腫瘤體積，以mm3±平均值標準誤差(SEM)來表示。
圖17。在PBMC人化NSG小鼠中用IC3B18及IC3B19處理之MOLM-13人類AML異種移植物的腫瘤發生預防。NSG小鼠係經靜脈內植入人類PBMC，7天後皮下接種MOLM-13細胞，然後在第0、2、4、7、及9天(由箭頭指示)，以0.005mg/kg、0.05mg/kg、及0.5mg/kg之IC3B18或IC3B19靜脈內給藥。每週兩次測量SC腫瘤，結果表示為各組之平均腫瘤體積，以mm3±平均值標準誤差(SEM)來表示。
圖18。IC3B19在PBMC人化NSG小鼠中之OCI-AML5人類AML異種移植物中的抗腫瘤功效。NSG小鼠係經OCI-AML5細胞皮下接種，然後當腫瘤建立(平均腫瘤體積=93.7mm3)時，經靜脈內植人類PBMC入。然後在第28、31、33、35、及38天(由黑色箭頭指示)以0.0005mg/kg、0.005mg/kg、0.05m/kg、及0.5mg/kg之IC3B19或在第31、33、35、38、40、47、及54天(由灰色箭頭指示)以0.05m/kg及0.5mg/kg之IC3B19靜脈內給藥予小鼠。每週兩次測量SC腫瘤，結果表示為各組之平均腫瘤體積，以mm3±平均值標準誤差(SEM)來表示。
圖19。將第31天與第35天開始之治療比較，IC3B18及IC3B19在PBMC人化NSG小鼠中之OCI-AML5人類AML異種移植物中的抗腫瘤功效。NSG小鼠係經OCI-AML5細胞皮下接種，然後當腫瘤建立(平均腫瘤體積=111.5mm3)時，經靜脈內植入人類PBMC。在第31天，七個組在第31、33、35、38、及40天(由黑色箭頭指示)以0.05mg/kg、0.5mg/kg、及1mg/kg之PBS、IC3B18、或IC3B19靜脈內給藥。此外，在第35天，四個組在第35、38、41、42、及46天(由灰色箭頭指示)以0.5mg/kg及1mg/kg之IC3B18或IC3B19靜脈內給藥。每週兩次測量SC腫瘤，結果表示為各組之平均腫瘤體積，以mm3±平均值標準誤差(SEM)來表示。
圖20A至圖20E。相對於野生型hIgG1、hIgG4 PAA同型、及一批相關IgG4 PAA親系(二價)及空臂(單價)對照抗體，對IC3B18及IC3B19所測量之與人類Fc配體FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、及FcRn之結合競爭，如藉由實例23中所述之AlphaScreenTM測定來判定。圖20A)FcγRI競爭。圖20B)FcγRIIa競爭。圖20C)FcγRIIb競爭。圖20D)FcγRIIIa競爭。圖20E)FcRn競爭。
圖21。IC3B19在T細胞人化NSG小鼠中之SKNO-1人類AML異種移植物中的抗腫瘤功效。NSG小鼠在第0天係經皮下(sc)接種SKNO-1 AML腫瘤片段，然後在第34天經腹膜內(ip)植入人類T 細胞。在第35、37、39、41、43、46、48、50、53、55天(箭頭)，以0.5或1mg/kg之IC3B19靜脈內(iv)給藥予小鼠。每週兩次測量Sc腫瘤，結果表示為各組之平均腫瘤體積，以mm3±(SEM)來表示。由於達到最大腫瘤大小限制導致隨後每組損失多隻動物，僅圖示植入後第60天之數據。說明：AML=急性骨髓性白血病；NSG=NOD scid伽馬(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wj1/SzJ)；PBS磷酸鹽緩衝鹽水；iv=靜脈內，sc=皮下；ip=腹膜內；SEM=平均值標準誤差。
圖22。IC3B19在T細胞人化NSG小鼠中之散播性MOLM-13螢光素酶人類AML模型中的功效。注意：NSG小鼠在第0天係經靜脈內(iv)接種MOLM-13螢光素酶AML細胞，然後在第3天經腹膜內(ip)植入人類T細胞。在第4、8、11、14、17、21、24、28、31、35、及38天，向小鼠以0.05、0.5、或1mg/kg之IC3B19 q3d-q4d腹膜內給藥，總共11個劑量。由於後肢麻痹而將動物安樂死，將發病率或過度可觸知腫瘤負荷及存活比例作圖。由於隨後GvHD相關發病導致動物損失，僅圖示植入後第46天之數據。說明：AML=急性骨髓性白血病；NSG=NOD scid伽馬(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wj1/SzJ)；iv=靜脈內；ip=腹膜內；GvHD=移植物抗宿主疾病。
圖23。盒狀圖概述了IL1RAP之RNA表現的轉化分佈。各個組織學之頂部盒狀圖代表實體組織正常，且底部盒狀圖代表腫瘤中之表現值。
圖24。IC3B19刺激T細胞導向之細胞凋亡反應，其特徵在於在此顯示之實體腫瘤細胞系中之凋亡蛋白酶活性增加(A、B、D至G)，但在(C)中未增加。表示以下實體腫瘤類型：(A)NSCLC-腺癌，(B)NSCLC-鱗狀細胞癌、(C)NSCLC-鱗狀細胞癌(D)小細胞肺癌、(E)結腸癌、(F)胰腺癌、(G)前列腺癌。在Graphpad Prism 6.02中計算的曲線下面積之各個點(n=8)±SEM，其係基於在72小時的總綠色物體面積(μm2/孔)度量之原始值，其中T細胞在IncuCyteTM成像器處理定義內按照大小來排除。在圖24A、C、 E、F、及G中，各條曲線代表供體#M6807、LS-11-53847A，而供體#M7267，批號LS-11-53072B係顯示於圖24B、D中。
圖26A至26C。(A)IL1RAP雙特異性Ab IC3B19誘發CML細胞系之IL1RAP+特異性細胞之細胞毒性。對照抗體IAPB101(B)及CNTO 7008(C)不誘導細胞毒性。
圖27A至27C。(A)IL1RAP雙特異性Ab IC3B19誘發T細胞白血病及淋巴瘤細胞系之IL1RAP+特異性細胞之細胞毒性。對照抗體IAPB101(B)及CNTO 7008(C)不誘導細胞毒性。
圖28A至28C。(A)IL1RAP雙特異性Ab IC3B19誘發DLBCL細胞系U-2940之IL1RAP+特異性細胞之細胞毒性。對照抗體IAPB101(B)及CNTO 7008(C)不誘導細胞毒性。
圖29。IC3B19在T細胞人化NSG小鼠中之H1975人類非小細胞肺癌異種移植物中的抗腫瘤功效。NSG小鼠在第0天係經皮下(sc)接種1e6 H1975人類非小細胞肺癌細胞，然後在第13天經腹膜內(ip)植入人類T細胞。在第14、17、20、23、27、30、35、及38天，以0.5mg/kg、1mg/kg、或2.5mg/kg之IC3B19腹膜內給藥予小鼠，總共8個劑量(箭頭)。每週兩次測量Sc腫瘤，結果表示為各組之平均腫瘤體積，以mm3±(SEM)來表示。由於達到最大腫瘤大小限制導致隨後每組損失多隻動物，僅圖示植入後第30天之數據。說明：AML=急性骨髓性白血病；NSG=NOD scid伽馬(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wj1/SzJ)；PBS磷酸鹽緩衝鹽水；iv=靜脈內，sc=皮下；ip=腹膜內；SEM=平均值標準誤差。
圖30。IL1RAP×CD3媒介之mMDSC之消耗的離體測定：新鮮全血非小細胞肺癌(NSCLC)/前列腺癌(PC)。
圖31A至31E。內部MDSC圈選(gating)策略及量化MDSC群體新鮮全血。評價初級新鮮全血非小細胞肺癌(NSCLC)/前列腺癌(PC)中之MDSC群體。顯示MDSC群體之圈選策略的代表性繪圖：(A)存活的總有核細胞(B)HLA-DR低/譜系標記陰性(C)CD33+/CD11b+/CD15+/CD14+MDSC群體(D)CD33+/CD11b+/CD14+IL1RAP+M-MDSC(E) CD33+/CD11b+/CD15+IL1RAP+G-MDSC。所有圈選之MDSC表現IL1RAP，如代表性繪圖所示。
圖32A及圖32B。在不同腫瘤中，供體血液樣本中之MDSC水準可變。(A)評價初級新鮮全血非小細胞肺癌(NSCLC)/前列腺癌(PC)中之MDSC群體盛行及(B)與健康正常相比，定量MDSC+IL1RAP+受體密度。
圖33。響應於促血管生成及抗血管生成治療，隨著時間而變化的每單位面積之管狀網路之數目。螢光標示之HUVEC細胞在VEGF存在下在玻璃上培養以刺激管狀伸長及分枝。加入蘇拉明(suramin)以克服VEGF之效應並防止網路擴增。數據代表來自一個實驗之三次技術重製的平均值±SEM。由於技術原因，丟失來自前24小時之影像。
圖34A及圖34B。響應於與健康供體T細胞(M2550)、癌細胞、H1975(A)及OCI-AML5(B)或T細胞與癌細胞之組合共培養，隨著時間而變化之每單位面積之管狀網路之數目。螢光標示之HUVEC細胞在VEGF存在下在玻璃上培養以刺激管狀伸長及分枝。數據代表來自一個實驗之三次技術重製的平均值±SEM。由於技術原因，丟失來自前24小時之影像。
圖35A至35C。對自健康志願者(A)、及H1975(B)及OCI-AML5(C)細胞系單離之T細胞從IL1RAP(灰色線)或對應同型(黑線)染色並藉由流式細胞術分析。在繪圖上指示IL1RAP陽性細胞百分比。
圖36。在NHDF存在下在玻璃上培養之HUVEC，及指示之處理條件顯示IL1RAP之一些表現。
圖37A及圖37B。響應於在10nM IL1RAP×CD3(紅色圓圈)、10nM空×CD3(綠色三角形)、或媒劑PBS(藍色方形)存在下與健康供體T細胞(M2550)、癌細胞(H1975(A)及OCI-AML5(B))共培養，隨著時間而變化之每單位面積之管狀網路之數目。螢光標示之HUVEC細胞在VEGF存在下在玻璃上培養以刺激管狀伸長及分枝。隨後，對所培養之細胞進行藥理學處理(由虛線指 示)，並在接下來的4天內測量網路密度。僅顯示10nM劑量處理。數據代表來自一個實驗之三次技術重製的平均值±SEM。由於技術原因，丟失來自前24小時之影像。
圖38A至38F。在抗體處理後72小時，在H1975腫瘤細胞及T細胞存在下IL1RAP×CD3對管狀網路之效應。顯示了媒劑對照(A)、空×CD3(B)及IL1RAP×CD3(C)處理條件。對應網路掩模(D、E及F)係由IncuCyteTM ZOOM軟體產生。顯示來自一個孔的三次技術重製之影像。比例尺係500μm。
圖39A至39D。在癌細胞及HUVEC培養物存在下，IL1RAP×CD3對T細胞活化之效應。T細胞與HUVEC及H1975腫瘤細胞(A及B)或OCI-AML5細胞(C及D)培養4天，並藉由流動分析CD25表現(A及C)或IL1RAP表現(B及D)。IL1RAP×CD3雙特異性抗體及空×CD3對照用於比較分析。顯示選擇條件以傳達T細胞上活化及IL1RAP表現之一般模式。
圖40A至40D。在癌細胞及HUVEC培養物存在下，IL1RAP×CD3對T細胞表面標記表現之效應。T細胞與HUVEC及H1975腫瘤細胞(A及B)或OCI-AML5細胞(C及D)培養4天，並藉由流動分析CD25表現及IL1RAP表現。IL1RAP×CD3雙特異性抗體(A及C)及空×CD3對照(B及D)用於比較分析。顯示選擇條件以傳達T細胞上活化及IL1RAP表現之一般模式。
圖41。藉由流式細胞術在處理之第0天評價IL1RAP在AML及MDS母細胞上之細胞表面表現。將細胞以白血病母細胞進行圈選，並將IL1RAP(淺灰色)之表現與同型對照(深灰色)進行比較。
圖42A至42D。在與人類基質細胞系HS-5之共培養系統中，初級AML樣本(MT0034)中IL1RAP×CD3媒介之T細胞活化及母細胞消耗的離體評估。藉由流式細胞術測量T細胞活化及母細胞消耗。(A)圖顯示具有及不具有IL1RAP×CD3處理的CD45+細胞群體內CD8+ T細胞之百分比。(B)CD45+細胞群體內CD4+ T細胞之百 分比。(C)繪圖顯示用IL1RAP×CD3抗體處理之樣本中CD8+及CD4+ T細胞之活化。活化係藉由在兩個T細胞群體上表現CD25標記來證明。(D)圖藉由比較CD45+細胞群體內母細胞之百分比來證明由IL1RAP×CD3處理誘導的AML母細胞之消耗。
圖43A至43H。在與人基質細胞系HS-5之共培養系統中，IL1RAP×CD3媒介的初級MDS樣本(MDS_4332及MDS_4954)中之T細胞活化及母細胞消耗的離體評估。藉由流式細胞術測量T細胞活化及母細胞消耗。(A)及(E)圖分別顯示在MDS樣本4332及4954中具有及不具有IL1RAP×CD3處理的CD45+細胞群體內CD8+ T細胞之百分比。(B)及(F)MDS樣本4332及4954中CD45+細胞群體內CD4+ T細胞之百分比。(C)及(G)繪圖顯示用IL1RAP×CD3 Ab處理之樣本中CD8+及CD4+ T細胞之活化。活化係藉由在兩個T細胞群體上表現CD25標記來證明。(D)及(H)圖藉由比較CD45+細胞群體內母細胞之百分比來證明由IL1RAP×CD3處理誘導的MDS母細胞之消耗。
圖44A至44D。在與人類基質細胞系HS-5之共培養系統中，初級AML樣本(AML_5503)中IL1RAP×CD3媒介之T細胞活化及母細胞消耗的離體評估。藉由流式細胞術測量T細胞活化及母細胞消耗。(A)圖顯示在所有治療組中培養期間CD45+細胞群體內CD8+T細胞之百分比的減少。(B)CD45+細胞群體內CD4+ T細胞之百分比。(C)繪圖顯示用IL1RAP×CD3 Ab處理之樣本中CD8+及CD4+ T細胞之活化；然而，CD8+細胞之數量非常低，且在培養物中不存在CD4+細胞。活化係藉由在兩個T細胞群體上表現CD25來證明。(D)圖藉由比較CD45+細胞群體內母細胞之百分比來證明缺乏由IL1RAP×CD3處理誘導的AML母細胞之消耗。
圖45A及圖45B。評價初級AML及MDS樣本中之MDSC群體。(A)顯示MDSC群體之圈選策略的代表性繪圖：HLA-DR低/譜系標記陰性/CD33+/CD11b+/CD15+/CD14-。所有圈選之MDSC表現IL1RAP，如右側的代表性繪圖所示。(B)在對於處理作出響應之樣本中，與用對照Ab處理或未處理細胞的樣本相比，經 IL1RAP×CD3處理之樣本具有顯著地較低水準之MDSC。AML 5503係具有相對低水準之MDSC的無響應樣本，並在所有治療組中相同。
定義
各種關於實施方式之態樣的用語係用於說明書與申請專利範圍的各個部分中。這些用語係以其在該項技術領域中之原始意義來使用，除非另有指示。其他經特別定義之用語的解讀係與本說明書中所提供之定義一致。
於本說明書及隨附的申請專利範圍中，除非內文另有明確說明，否則單數形式的「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱。因此，例如對於「一細胞(a cell)」之指稱包括兩或更多個細胞之組合與類似者。
本文中所使用之用語「約(about)」在指稱一可測量的值(諸如數量、持續時間及類似者)時，意欲涵蓋在指定值之高達±10%內的變異，若此類變異為適合執行所揭示之方法者。除非另有指示，所有用於說明書及申請專利範圍中以表達成分量、特性(諸如分子量、反應條件等)之數目應理解為在所有情況中皆經用語「約(about)」所修飾。因此，除非另有相反指示，以下說明書及隨附申請專利範圍中所提出之數值參數為近似值，其可視本發明所尋求獲得之所欲特性而有所變化。無論如何，且並非意圖限制申請專利範圍的範疇之等效原則的應用，每一個數值參數應至少鑑於所報導的有效位數之數目並藉由應用一般捨入計數來加以詮釋。
儘管闡明本發明內容之廣域範圍的數值範圍及參數為近似值，仍盡可能精確地報導特定實例中所提出的數值。然而，任何數值固有地包含由在它們的個別測試測量值中發現之標準偏差所必然產生的某些誤差。
「單離(Isolated)」意指生物組分(諸如核酸、肽或蛋白質)已經與該組分所天然出現於內之生物體中的其他生物組分(即其 他染色體及染色體外DNA及RNA、和蛋白質)實質上分開、與該等其他生物組分分開生產、或經純化而遠離該等其他生物組分。已「單離(isolated)」之核酸、肽及蛋白質因而包括藉由標準純化方法所純化之核酸及蛋白質。「單離(isolated)」核酸、肽及蛋白質可為組成物之一部分且仍為單離，只要該組成物並非該核酸、肽及蛋白質之原生環境的一部分。該用語亦包含藉由在宿主細胞中重組表現所製備之核酸、肽及蛋白質以及化學合成之核酸。本文中所使用之「單離(isolated)」抗體或抗原結合片段意指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體或抗原結合片段的抗體或抗原結合片段(例如，特異性結合至IL1RAP之單離抗體係實質上不含特異性結合IL1RAP以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合至IL1RAP之表位、異構體、或變異體的單離抗體可對於其他相關抗原例如來自其他物種之相關抗原(諸如IL1RAP物種同源物)具有交叉反應性。
用語「重組抗體(recombinant antibody)」係用於描述由涉及使用重組DNA技術之任何過程所生產的抗體，包括天然免疫球蛋白或其片段的任何類似物。
「多核苷酸(polynucleotide)」同義地稱為「核酸分子(nucleic acid molecule)」、「核苷酸(nucleotide)」、或「核酸(nucleic acid)」，係指任何多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸，其可為未經修飾之RNA或DNA或經修飾之RNA或DNA。「多核苷酸(Polynucleotide)」包括但不限於單股及雙股DNA、為單股及雙股區之混合物的DNA、單股及雙股RNA、及為單股及雙股區之混合物的RNA、包含可為單股或(更典型地)雙股或單股及雙股區之混合物的DNA及RNA之混雜分子。此外，「多核苷酸(polynucleotide)」係指包含RNA或DNA或RNA及DNA兩者的三股區。用語多核苷酸亦包括含有一或多個經修飾鹼基之DNA或RNA及具有為了穩定性或其他理由經修飾之主鏈的DNA或RNA。「經修飾(Modified)」鹼基包括例如三苯甲基化(tritylated)鹼基及不常見鹼基諸如肌苷(inosine)。可對於DNA及RNA進行各種修飾；因此，「多核苷酸(polynucleotide)」包含典型在自然界所發現之經化學、酶、或代謝修飾之多核苷酸形式，以 及病毒和細胞所特有之DNA及RNA的化學形式。「多核苷酸(Polynucleotide)」亦包含相對短之核酸鏈，其通常稱為寡核苷酸。
「實質上相同(substantially the same)」之意義可隨著使用該用語處之上下文而有所不同。由於在重鏈及輕鏈及編碼彼等之基因中可能存在有天然序列變異，可預期在胺基酸序列或編碼本文所述之抗體或抗原結合片段之基因中發現某種程度的變異，此變異對於彼等之獨特結合特性(例如，特異性及親和力)幾乎沒有影響。此預期一部分是由於基因密碼的簡併性(degeneracy of the genetic code)，以及由於保守性胺基酸序列變異(不會可察覺地改變所編碼之蛋白質的本質)之演化成功所致。因此，在提及核酸序列時，「實質上相同(substantially the same)」意指在兩或更多個序列之間有至少65%同一性(identity)。較佳的是，該用語係指在兩或更多個序列間有至少70%同一性，更佳為至少80%同一性，更佳為至少85%同一性，更佳為至少90%同一性，更佳為至少91%同一性，更佳為至少92%同一性，更佳為至少93%同一性，更佳為至少94%同一性，更佳為至少95%同一性，更佳為至少96%同一性，更佳為至少97%同一性，更佳為至少98%同一性，而更佳為至少99%或更高之同一性。兩個序列間之同一性百分比為該等序列所共有之同一性位置數目的函數(即同源性%=同一性位置#/總位置#×100)，並且將需要被導入以最佳排比這兩個序列之缺口(gap)數目及各缺口長度納入考慮。兩個核苷酸或胺基酸序列間的同一性百分比可使用例如E.Meyers and W.Miller,Comput.Appl.Biosci 4,11-17(1988)之演算法來判定，該演算法已納入ALIGN程式(版本2.0)中，其採用PAM120加權殘基表、缺口長度罰分為12及缺口罰分為4。此外，兩個胺基酸序列間的同一性百分比可使用Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48,444-453(1970)演算法來判定。
在蛋白質之胺基酸序列內發生不會實質影響蛋白質功能之變異的程度遠低於核酸序列，因為相同的簡併性理論不適用於胺基酸序列。因此，在提及抗體或抗原結合片段時，「實質上相同(substantially the same)」意指抗體或抗原結合片段與所述抗體或抗原 結合片段具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。其他實施例所包括的IL1RAP特異性抗體、或抗原結合片段具有不與本文中所述之抗體及抗原結合片段共有顯著同一性之架構、支架、或其他非結合區，但的確包含一或多個CDR或其他賦予結合所需且與本文中所述之此等序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的序列。「載體(vector)」是一種複製子(replicon)，諸如質體、噬菌體、黏質體(cosmid)、或病毒，可將另一個核酸區段可操作地插入其中，從而使該區段複製或表現。
「殖株(clone)」係自單一細胞或共同源始細胞(ancestor)藉由有絲分裂所衍生之細胞群。「細胞系(cell line)」係能夠在體外穩定生長許多代之初級細胞殖株。在本文中所提供之一些實例中，細胞係藉由DNA轉染細胞加以轉形。
用語「表現(express)」及「生產(produce)」在本文中係同義地使用，並且係指基因產物之生物合成。這些用語涵蓋將基因轉錄成RNA。這些用語亦涵蓋將RNA轉譯成一或多種多肽，並且進一步涵蓋所有天然發生之轉錄後及轉譯後修飾。抗體或其抗原結合片段之表現或生產可在細胞之細胞質內，或者進到細胞外環境中，諸如細胞培養之生長介質。
用語「治療(treating或treatment)」係指任何成功地或有成功跡象地減輕或改善傷害、病理變化或病況，包括任何客觀或主觀參數，諸如症狀之減少、緩解或消退或者使病況對於病患而言更可忍受、減慢退化或衰退速率、使退化終點較不耗弱、改善對象之身體或心理健康、或延長存活時間。治療可藉由客觀或主觀參數來加以評估；包括身體檢查、神經檢查或精神狀況評價的結果。
「有效量(effective amount)」或「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指達到所欲治療結果所需之有效劑量量及時間量。IL1RAP×CD3抗體之治療有效量可依不同因素而異，諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重、及抗體在個體中誘 發所欲反應之能力。治療有效量亦為抗體或抗體部分之治療有益效果超過其任何毒性或有害效果之量。
「抗體(Antibody)」係指免疫球蛋白之所有同型(IgG、IgA、IgE、IgM、IgD、及IgY)，包括各種單體、聚合及嵌合形式，除非另有指定。用語「抗體(antibody)」所具體涵蓋者為多株抗體、單株抗體(mAb)、及類抗體多肽，諸如嵌合抗體及人化抗體。
「抗原結合片段(Antigen-binding fragment)」為可對特定抗原展現結合親和力之任何蛋白質結構。抗原結合片段包括藉由任何習知技術所提供者，諸如酶切割、肽合成、及重組技術。一些抗原結合片段係由保有親系抗體分子之抗原結合特異性的完整抗體之部分組成。舉例而言，抗原結合片段可包含已知結合特定抗原之抗體的至少一個可變區(重鏈或輕鏈可變區)或一或多個CDR。合適抗原結合片段之實例包括但不限於雙價抗體(diabody)及單鏈分子以及Fab、F(ab’)2、Fc、Fabc、及Fv分子、單鏈(Sc)抗體、個別抗體輕鏈、個別抗體重鏈、抗體鏈或CDR及其他蛋白質、蛋白質支架間之嵌合融合物、重鏈單體或二聚體、輕鏈單體或二聚體、由一個重鏈及一個輕鏈所組成之二聚體、由VL、VH、CL及CH1域所組成之單價片段、或如WO2007059782中所述之單價抗體、包含兩個由鉸鏈區之雙硫橋所連接之Fab片段之雙價片段、包括VH及CH1域之Fd片段；主要由抗體單臂之VL及VH域所組成的Fv片段、dAb片段(Ward等人，Nature 341,544-546(1989))(其主要由VH域組成且亦稱為域抗體(domain antibody)(Holt等人；Trends Biotechnol.2003 Nov.；21(11)：484-90)；駱駝或奈米抗體(Revets等人；Expert Opin Biol Ther.2005 Jan.；5(1)：111-24)；單離互補決定區(CDR)、及類似者。所有抗體同型皆可用來生產抗原結合片段。此外，抗原結合片段可包括非抗體蛋白質架構諸如蛋白質支架，以成功地將多肽區段納入可賦予對所關注之指定抗原的親和力之位向。抗原結合片段可經重組生產，或藉由酶或化學切割完整抗體來生產。用語「抗體或其抗原結合片段(an antibody or antigen-binding fragment thereof)」可用來意謂指定抗原結合片段納入該用語中所指涉之抗體的一或多個胺基酸區段。當在 兩個或更多個抗體或抗原結合片段之上下文中使用時，用語「與...競爭(competes with)」或「與...交叉競爭(cross-competes with)」指示該兩個或更多個抗體或抗原結合片段競爭結合至IL1RAP，例如在實例11中所述之測定中競爭IL1RAP結合。對於一些抗體對或抗原結合片段對而言，在實例中之測定中的競爭或阻斷僅見於一種抗體係塗覆在盤上而另一種係用來競爭時，反之則不可見。除非另有定義或上下文中加以否定，當用語「與...競爭(competes with)」或「與...交叉競爭(cross-competes with)」用於本文中時亦意欲涵括此等抗體對或抗原結合片段對。
用語「表位(epitope)」意指能夠特異性結合至抗體之蛋白質決定位(determinant)。表位通常由分子(諸如胺基酸或糖側鏈)之表面分群所組成，且通常具有特定三維結構特性以及特定電荷特性。構形及非構形表位的差別在於與前者的結合在變性溶劑存在下即失去，但後者並不會。表位可包含直接涉及結合之胺基酸殘基及其他非直接涉及結合之胺基酸殘基，諸如被特異性抗原結合肽有效阻斷或覆蓋之胺基酸殘基(換言之，該胺基酸殘基位在該該特異性抗原結合肽之足跡內)。
當「特異性結合(Specific binding)」或「免疫特異性結合(immunospecific binding)」或其衍生用語在提及抗體、或抗體片段時使用，代表經由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段所編碼之域結合至所關注蛋白質之一或多個表位，並且在含有混合分子群體之樣本中不會優先結合其他分子。典型而言，抗體以小於約1×10-8M之Kd結合至同源(cognate)抗原，如由表面電漿共振測定或細胞結合測定所測得者。諸如「[抗原]特異性([antigen]-specific)」抗體之用語(例如IL1RAP特異性抗體)係意欲傳達該引述之抗體特異性結合該引述之抗原。
本文中所用之用語「kd」(sec-1)係指特定抗體-抗原交互作用之解離速率常數。該值亦稱為koff值。
本文中所使用之用語「ka」(M-1 sec-1)係指特定抗體-抗原交互作用之締合速率常數。
本文中所用之用語「KD」(M)係指特定抗體-抗原交互作用之解離平衡常數。
本文中所用之用語「KA」(M-1)係指特定抗體-抗原交互作用之締合平衡常數並且係藉由將ka除以kd獲得。
用語「對象(subject)」係指人類及非人類動物，包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長動物、小鼠、兔、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、及爬蟲動物。在所述方法之許多實施例中，該對象為人類。
如本文所用之用語「重新導向(redirect或redirecting)」係指IL1RAP×CD3抗體將T細胞活性自其固有同源特異性有效地傳遞到針對IL1RAP表現性細胞的反應性的能力。
本文中所用之「樣本(sample)」係指單離自對象之類似流體、細胞、或組織(例如，手術切下之腫瘤組織、活體組織切片，包括細針穿刺)、以及存在於對象內之流體、細胞、或組織的總稱。在一些實施例中，樣本係生物流體。生物流體在生理溫度下典型為液體並且可包括存在於、抽取自、表現自或以其他方式擷取自對象或生物來源之天然出現流體。某些生物流體衍生自特定組織、器官或局部區域而某些其他生物流體可能更全域性或全身性位於對象或生物來源中。生物流體之實例包括血液、血清及漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、唾液、囊液、淚液、糞便、痰、分泌組織及器官之黏膜分泌物、陰道分泌物、腹水(諸如與非實質腫瘤有關之腹水)、胸膜液、心包膜液、腹膜液、腹腔液及其他體腔液、支氣管灌洗收集液及類似者。生物流體亦可包括與對象或生物來源接觸之液體溶液，例如細胞及器官培養基(包括細胞或器官條件培養基)、灌洗液及類似者。本文中所用之用語「樣本(sample)」涵括自對象取出之材料或存在於對象中之材料。
「已知標準品(known standard)」可為具有已知量或濃度之IL1RAP之溶液，其中該溶液可為天然出現溶液，諸如來自已知具有早期、中期、晚期、進行性、或穩定性癌症之病患的樣本，或者該溶液可為合成溶液，諸如具有已知量之IL1RAP稀釋於其中之緩衝 水。本文中所述之已知標準品可包括單離自對象之IL1RAP、重組或純化之IL1RAP蛋白質、或與病況相關聯之IL1RAP濃度值。
用語「CD3」係指人類CD3蛋白質之多重次單元複合體(multi-subunit complex)。CD3蛋白質多重次單元複合體由6個不同之多肽鏈組成。這些多肽鏈包括CD3γ鏈(SwissProt P09693)、CD3δ鏈(SwissProt P04234)、兩個CD3ε鏈(SwissProt P07766)、及一個與T細胞受體α及β鏈相關聯之CD3 ζ鏈同二聚體(homodimer)(SwissProt 20963)。用語「CD3」包括任何CD3變異體、異構體及物種同源物，其係由細胞(包括T細胞)所天然表現，或者可表現在經編碼這些多肽之基因或cDNA轉染的細胞上，除非另有註明。
如本文所用，用語「介白素-1受體輔助蛋白(interleukin-1 receptor accessory protein)」、「IL1RAP」、及「IL1-RAP」尤其包括人類IL1RAP蛋白，例如描述於GenBank登錄號AAB84059、NCBI參考序列：NP_002173.1、及UniProtKB/Swiss-Prot登錄號Q9NPH3-1(亦參見Huang等人，1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94(24),12829-12832)。IL1RAP在科學文獻中亦稱為IL1R3、C3orf13、FLJ37788、IL-1 RAcP、及EG3556。
「IL1RAP×CD3抗體(IL1RAP×CD3 antibody)」為多特異性抗體，可選地為雙特異性抗體，其包含兩個不同之抗原結合區，其中一個特異性結合至抗原IL1RAP而另一個特異性結合至CD3。多特異性抗體可為雙特異性抗體、雙價抗體、或類似分子(例如請參見PNAS USA 90(14),6444-8(1993)以獲得雙價抗體之說明)。本文中所提供之雙特異性抗體、雙價抗體、及類似者除了結合IL1RAP之一部分外，可結合任何合適目標。用語「雙特異性抗體(bispecific antibody)」係理解為具有兩個由不同抗體序列所定義之不同抗原結合區的抗體。此可理解為不同之目標結合但亦包括對於一個目標中之不同表位的結合。
「參考樣本(reference sample)」係可與另一個樣本(諸如測試樣本)比較之樣本，以允許用於表徵所比較之樣本。參考樣本將具有一些經表徵之性質，該等性質可作為與測試樣本比較之基礎。 舉例而言，參考樣本可用來作為IL1RAP水準的指標，以用於指示對象具有癌症。參考樣本不必然需要與測試樣本一起分析，因此在一些情況中，參考樣本可為已預先判定以表徵給定病況之一數值或數值範圍，諸如指示對象中之癌症的IL1RAP水準。該用語亦包括用於比較目的之樣本，該樣本已知與生理狀態或疾病狀況(諸如IL1RAP表現性癌症)相關聯，但具有未知量的IL1RAP。
如在提及IL1RAP表現性癌症之進展時所使用之用語「進展(progression)」，包括癌症從較不嚴重狀態到較嚴重狀態之改變。此可包括腫瘤數目或嚴重性增加、轉移程度增加、癌症生長或擴散之速度增加、及類似者。舉例而言，「結腸癌進展(the progression of colon cancer)」包括該癌症從較不嚴重狀態進展到較嚴重狀態，諸如從第I期進展到第II期、從第II期進展到第III期等。
如在提及IL1RAP表現性癌症之消退時所使用之用語「消退(regression)」，包括癌症從較嚴重狀態到較不嚴重狀態之改變。此可包括腫瘤數目或嚴重性減少、轉移程度減少、癌症生長或擴散速度減少、及類似者。舉例而言，「結腸癌消退(the regression of colon cancer)」包括該癌症從較嚴重狀態消退到較不嚴重狀態，諸如從第III期消退到第II期、從第II期消退到第I期等。
如在提及穩定性IL1RAP表現性癌症時所用之用語「穩定性(stable)」，係意欲描述疾病狀況在臨床相關之時期內並未(或尚未)顯著地變化到足以被認為癌症正在進展或癌症正在消退。
本文中所述之實施例不限於特定方法、試劑、化合物、組成物或生物系統，其當然可能有所變化。
IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段
本文中描述特異性結合IL1RAP之重組單株抗體或抗原結合片段。抗體分子之一般結構包含抗原結合域，其包括重鏈及輕鏈；及Fc域，其具有各式功能，包括補體固定(complement fixation)及結合抗體受體。
所述IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段包括所有同型 (IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM)、及四鏈免疫球蛋白結構之合成性多聚體。所述抗體或抗原結合片段亦包括通常在母雞或火雞血清及母雞或火雞蛋黃中所發現之IgY同型。
IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段可藉由重組手段而衍生自任何物種。舉例而言，該等抗體或抗原結合片段可為小鼠、大鼠、山羊、馬、豬、牛、雞、兔、駱駝、驢、人、或其等之嵌合版本。針對投予至人類之用途，非人類衍生性抗體或抗原結合片段可經基因或結構改造以在投予至人類病患時較不具抗原性。
在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段係嵌合者。本文中所用之用語「嵌合(chimeric)」係指抗體、或其抗原結合片段具有衍生自非人類哺乳動物、囓齒動物、或爬蟲動物之抗體胺基酸序列的至少一個可變域之至少一些部分，並且該抗體、或其抗原結合片段之剩餘部分係衍生自人類。
在一些實施例中，該等抗體為人化(humanized)抗體。人化抗體可為含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體之其他抗原結合子序列)。大體上，人化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體(recipient antibody))，其中來自該接受者之互補決定區(CDR)的殘基係經來自具有所欲特異性、親和力、及能力之非人類物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或兔之CDR的殘基置換。一般而言，該人化抗體將包含實質上所有至少一個及典型地兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應非人類免疫球蛋白之CDR區，並且所有或實質上所有架構區係人類免疫球蛋白序列之架構區。人化抗體可包括免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型為人類免疫球蛋白之恆定區。
本文中所述之抗體或抗原結合片段可以各種形式出現，但將包括表1中所示之抗體CDR的一或多者。
本文中描述特異性結合至IL1RAP之重組抗體及抗原結合片段。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段係人類IgG、或其衍生物。雖然本文中所例示之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段係人類抗體或抗原結合片段，所例示之抗體或抗原結 合片段可經嵌合化。
在一些實施例中提供包含重鏈之IL1RAP特異性抗體、或其抗原結合片段，該重鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中提供包含重鏈及輕鏈之IL1RAP特異性抗體、或其抗原結合片段，該重鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3，該輕鏈包含表1中所述抗體之任一者的CDR1、CDR2、及CDR3。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：10之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：11之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：12之重鏈CDR3。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：10之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：11之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：12之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：40之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：41之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：42之輕鏈CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：68實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：68實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：69實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：13之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：14之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：15之重鏈CDR3。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：13之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：14之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：15之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：43之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：44之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：45之輕鏈 CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：70實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：70實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：71實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：16之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：17之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：18之重鏈CDR3。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：16之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：17之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：18之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：46之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：47之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：103之輕鏈CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：72實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：72實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：73實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：19之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：20之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：21之重鏈CDR3。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：19之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：20之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：21之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：49之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：50之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：51之輕鏈CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：74實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：74實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：75實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：22之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：23之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：24之重鏈CDR3。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：22之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：23之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：24之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：52之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：47之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：53之輕鏈CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：76實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：76實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：77實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：25之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：26之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：27之重鏈CDR3。在一些實施例 中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：25之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：26之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：27之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：54之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：55之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：56之輕鏈CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：78實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：78實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：79實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：25之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：28之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：29之重鏈CDR3。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：25之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：28之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：29之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：54之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：55之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：56之輕鏈CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：80實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：80實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：79實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：30之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：31之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：32之重鏈CDR3。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：30之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：31之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：32之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：57之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：58之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：59之輕鏈CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：81實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：81實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：82實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：33之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：34之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：35之重鏈CDR3。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：33之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：34之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：35之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：60之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：47之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：48之輕鏈CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：83實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：83實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：84實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重 鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：13之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：34之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：36之重鏈CDR3。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：13之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：34之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：36之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：60之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：47之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：48之輕鏈CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：85實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：85實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：84實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：25之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：37之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：38之重鏈CDR3。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：25之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：37之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：38之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：60之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：47之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：48之輕鏈CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：86實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含 與SEQ ID NO：86實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：84實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：19之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：20之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：21之重鏈CDR3。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：19之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：20之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：21之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：49之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：50之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：61之輕鏈CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：74實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：74實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：87實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：22之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：23之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：24之重鏈CDR3。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：22之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：23之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：24之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：62之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：63之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：64之輕鏈CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原 結合片段包含與SEQ ID NO：76實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：76實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：88實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：22之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：23之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：24之重鏈CDR3。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：22之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：23之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：24之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：62之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：63之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：65之輕鏈CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：76實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：76實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：89實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：25之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：26之重鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：39之重鏈CDR3。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：25之重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：26之重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：39之重鏈CDR3、含有SEQ ID NO：66之輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：50之輕鏈CDR2、及含有SEQ ID NO：67之輕鏈CDR3。此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可包含人類架構序列。 此IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可以50nM或更小之親和力結合至IL1RAP。在一些實施例中，該等CDIL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：90實質上相同或與其同一之重鏈可變域。在一些實施例中，該等IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段包含與SEQ ID NO：90實質上相同或與其同一之重鏈可變域及與SEQ ID NO：91實質上相同或與其同一之輕鏈可變域。此段中所討論之抗體重鏈可變域及輕鏈可變域係適合納入雙特異性建構體中，該建構體中有一個臂係抗IL1RAP臂。
在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段係IgG、或其衍生物，例如，IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4同型。在抗體具有IgG1同型之一些實施例中，該抗體在其Fc區中含有L234A、L235A、及K409R取代。在抗體具有IgG4同型之一些實施例中，該抗體在其Fc區中含有S228P、L234A、及L235A取代。以上段落中所討論之由CDR及/或可變域序列所定義的特定抗體可包括這些修飾。
亦揭示編碼該等特異性結合至IL1RAP之抗體或抗原結合片段的重組多核苷酸。該等能夠編碼本文中所提供之可變域區段的重組多核苷酸可被包括於相同(或不同)之載體上以生產抗體或抗原結合片段。
編碼重組抗原結合蛋白質之多核苷酸亦在本揭示之範疇內。在一些實施例中，所述多核苷酸(及彼等所編碼之肽)包括前導序列(leader sequence)。可採用所屬技術領域中所習知的任何前導序列。前導序列可包括但不限於限制部位(restriction site)或轉譯起始部位(translation start site)。
本文中所述之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段包括具有單一或多個胺基酸取代、刪除、或添加之變異體，並且該等變異體保留了所述IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段之生物特性(例如，結合親和力或免疫效應活性)。在本發明之上下文中，除非另有指示，下列符號係用來描述突變；i)取代指定位置中之胺基酸係寫成例如S228P，其代表用脯胺酸取代位置228中之絲胺酸；且ii)在特定變 異體中，使用特定三個或一個字母之代碼(包括代碼Xaa及X)來指示任何胺基酸殘基。因此，用絲胺酸取代位置228中之脯胺酸係標為：S228P，或者用任何胺基酸殘基取代位置228中之絲胺酸係標為S228X。刪除位置228中之絲胺酸的情況係以S228*指示。具有通常知識者可生產具有單一或多個胺基酸取代、刪除、或添加之變異體。
這些變異體可包括：(a)其中一或多個胺基酸殘基係經保留性或非保留性胺基酸取代之變異體、(b)其中一或多個胺基酸係經添加至該多肽或自該多肽刪除之變異體、(c)其中一或多個胺基酸包括取代基之變異體、及(d)其中該多肽係與另一肽或多肽融合之變異體(諸如融合夥伴、蛋白質標籤或其他化學部分，其可將有用特性賦予該多肽，諸如，例如，針對抗體之表位、多組胺酸序列、生物素部分及類似者)。本文中所述之抗體或抗原結合片段可包括其中來自一個物種之保留性或非保留性位置之胺基酸殘基係經另一物種之對應殘基所取代的變異體。在其他實施例中，非保守性位置之胺基酸殘基係經保留性或非保留性殘基取代。獲得這些變異體之技術(包括基因(刪除、突變等)、化學、及酶技術)皆為所屬技術領域中具有通常知識者所習知。
本文中所述之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可體現數種抗體同型，諸如IgM、IgD、IgG、IgA、及IgE。在一些實施例中，該抗體同型係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型，較佳為IgG1或IgG4同型。抗體或其抗原結合片段之特異性大部分是由CDR之胺基酸序列及排列來決定。因此，一種同型之CDR可轉移到另一種同型而不會改變抗原特異性。或者，已經建立使融合瘤從生產一種抗體同型轉換到生產另一種(同型轉換)而不會改變抗原特異性之技術。因此，此等抗體同型係在所述抗體或抗原結合片段之範疇內。
本文所述之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段具有對IL1RAP之結合親和力，其包括小於約50nM之解離常數(KD)。所述之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段之親和力可藉由所屬技術領域中已知之多種方法來判定，諸如表面電漿共振或基於ELISA之方法。用於測量親和力之測定包括使用BIAcore 3000機器所執行之測定，其 中測定係在室溫(例如在25℃或接近25℃)下執行，其中能夠結合至IL1RAP之抗體係藉由抗Fc抗體(例如山羊抗人類IgG Fc特異性抗體，Jackson ImmunoResearch laboratories Prod # 109-005-098)捕獲至BIAcore感測晶片上達75RU左右之水準，接著在40μl/min之流率下收集締合及解離數據。
亦提供包含本文中所述之多核苷酸的載體。該等載體可為表現載體(expression vector)。含有編碼所關注之多肽的序列之重組表現載體因而被考慮為在本揭示之範疇內。該表現載體可含有一或多個額外序列，諸如但不限於調節序列(例如，啟動子、增強子)、選擇標記、及多腺核苷酸化訊號。用於轉形廣泛各種宿主細胞之載體係廣為周知，並且包括但不限於質體、噬菌體質體(phagemid)、黏質體(cosmid)、桿狀病毒、桿粒(bacmid)、人造細菌染色體(BAC)、人造酵母菌染色體(YAC)、以及其他細菌、酵母、及病毒載體。
本實施方式之範疇內的重組表現載體包括編碼至少一種與合適調節元件可操作地連接之重組蛋白質的合成性、基因體性、或cDNA衍生性核酸片段。此等調節元件可包括轉錄啟動子、編碼合適mRNA核糖體結合部位之序列、及控制轉錄和轉譯之終止的序列。表現載體(尤其是哺乳動物表現載體)亦可包括一或多種非轉錄元件，諸如複製起源、連接至所欲表現基因之合適啟動子及增強子、其他5'或3'側翼(flanking)非轉錄序列、5'或3'非轉譯序列(諸如必要的核糖體結合部位)、多腺核苷酸化部位、剪接供體及受體部位、或轉錄終止序列。亦可納入賦予在宿主中複製之能力的複製起源。
在用來轉形脊椎動物細胞之表現載體中的轉錄及轉譯控制序列可由病毒來源提供。例示性載體可如以下文獻所述建構：Okayama and Berg,3Mol.Cell.Biol.280(1983)。
在一些實施例中，抗體編碼序列或抗原結合片段編碼序列係置於強大組成性啟動子的控制之下，諸如下列基因的啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅素、人類肌肉肌酸、及其他。此外，許多病毒啟動子在真核細胞中組成性地發揮作用，並且適合搭配所述實 施例使用。此等病毒啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、SV40之早期及晚期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、莫洛尼白血病病毒(Maloney leukemia virus)之長末端重複(LTR)、人類免疫不全病毒(HIV)、艾巴二氏病毒(EBV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、及其他反轉錄病毒、和單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus)之胸苷激酶啟動子。在一個實施例中，IL1RAP特異性抗體或其抗原結合片段編碼序列係置於誘導性啟動子的控制之下，諸如金屬硫蛋白啟動子、四環素誘導性啟動子、多西環素(doxycycline)誘導性啟動子、含有一或多種干擾素刺激反應元件(interferon-stimulated response element,ISRE)之啟動子，諸如蛋白質激酶R 2',5'-寡腺苷酸合成酶、Mx基因、ADAR1、及類似者。
本文中所述之載體可含有一或多個內部核糖體進入部位(IRES)。將IRES序列納入融合載體中可有利於增強一些蛋白質之表現。在一些實施例中，載體系統將包括一或多個多腺核苷酸化部位(例如SV40)，其可在任一前述核酸序列之上游或下游。載體組分可相鄰地連接，或者以提供用於表現基因產物之最佳間隔的方式來排列(即藉由在ORF之間引入「間隔子(spacer)」核苷酸)，或者以其他方式放置。調節元件(諸如IRES模體)亦可經排列以提供用於表現之最佳間隔。
該等載體可包含選擇標記，其為所屬技術領域中所廣為周知。選擇標記包括正向及負向選擇標記，例如抗生素抗藥性基因(例如新黴素抗藥性基因、溼球菌素(hygromycin)抗藥性基因、康黴素(kanamycin)抗藥性基因、四環素抗藥性基因、青黴素抗藥性基因)、麩胺酸鹽合成酶基因、HSV-TK、用於更昔洛威(ganciclovir)選擇之HSV-TK衍生物、或用於6-甲基嘌呤選擇之細菌性嘌呤核苷磷酸化酶基因(Gadi等人，7 Gene Ther.1738-1743(2000))。編碼選擇標記或選殖部位之核酸序列可在編碼所關注多肽或選殖部位之核酸序列的上游或下游。
本文中所述之載體可用來以編碼所述抗體或抗原結合片段之基因轉形各種細胞。舉例而言，該等載體可用來產出生產 IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段的細胞。因此，另一個態樣的特點在於經載體轉形的宿主細胞，該載體包含編碼特異性結合IL1RAP之抗體或其抗原結合片段(諸如本文中所描述及例示之抗體或抗原結合片段)的核酸序列。
許多用於將外來基因引入細胞之技術皆為所屬技術領域所習知，並且可用來建構重組細胞以依據本文中所描述及例示之各式實施例來實施所述之方法。所使用之技術應提供異源基因序列之穩定轉移至宿主細胞，以使該異源基因序列可由細胞後代所繼承及表現，並且使接受者細胞之必要發育及生理功能不受干擾。可使用之技術包括但不限於染色體轉移(例如，細胞融合、染色體媒介之基因轉移、微細胞媒介之基因轉移)、物理方法(例如，轉染、球形質體(spheroplast)融合、微注射、電穿孔、脂質體載劑)、病毒載體轉移(例如，重組DNA病毒、重組RNA病毒)及類似者(描述於Cline,29 Pharmac.Ther.69-92(1985))。磷酸鈣沉澱及聚乙二醇(PEG)誘導之細菌原生質體與哺乳動物細胞融合亦可用來轉形細胞。
適用於表現本文中所述之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段的細胞，較佳為真核細胞，更佳為源自植物、囓齒動物、或人類之細胞，例如但不限於NSO、CHO、CHO-K1、perC.6、Tk-ts13、BHK、HEK-293細胞、COS-7、T98G、CV-1/EBNA、L細胞、C127、3T3、HeLa、NS1、Sp2/0骨髓瘤細胞、及BHK細胞系、和其他者。此外，抗體之表現可使用融合瘤細胞來達成。用於生產融合瘤之方法在所屬技術領域中已充分建立。
經本文中所述之表現載體轉形的細胞可針對本文中所述之抗體或抗原結合片段的重組表現來選擇或篩選。重組陽性細胞係經擴增並針對展現所欲表型之次殖株(subclone)進行篩選，所欲表型諸如高表現水準、增強之生長特性、或產出例如由於蛋白質修飾或經修改之轉譯後修飾而具有所欲生化特徵之蛋白質的能力。這些表型可能是因給定次殖株之固有特性或因突變而來。突變可透過使用化學品、UV波長光、放射線、病毒、插入型致突變原、抑制DNA不匹配修復、或此等方法之組合來實現。
使用IL1RAP特異性抗體之治療方法
本文中提供用於療法之IL1RAP特異性抗體或其抗原結合片段。特定而言，這些抗體或抗原結合片段可用來治療癌症，諸如IL1RAP表現性癌症。因此，本發明提供一種治療癌症之方法，該方法包含投予如本文中所述之抗體，諸如IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段。舉例而言，用途可為1)干擾IL1RAP-受體交互作用，2)其中抗體與毒素共軛，從而將毒素靶向IL1RAP表現性癌症，或3)使用抗體將身體之免疫細胞重新導向至IL1RAP表現性癌症細胞(例如ADCC，T細胞重新導向)。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症包括血液性癌症，諸如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS，低或高危)、急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm,DPDCN)。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症包括實體腫瘤，諸如下列者：前列腺、乳腺、肺、結腸直腸、黑色素瘤、膀胱、腦/CNS、子宮頸、食道、胃、頭/頸、腎、肝、卵巢、胰腺、及肉瘤。用於這些方法中之抗體包括那些上文所述的抗體，例如具有表1所闡述之特徵(例如CDR或可變域序列)及在這些抗體的進一步討論中之特徵的IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段。
在本文中所述之一些實施例中，IL1RAP特異性抗體之免疫效應(effector)性質可透過以所屬領域中具有通常知識者習知之技術所進行之Fc修飾來強化或靜默。舉例而言，Fc效應功能(諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞媒介細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞媒介吞噬作用(ADCP)、向下調控細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)等)可藉由修飾Fc中負責這些活性之殘基來提供及/或控制。
「抗體依賴性細胞媒介細胞毒性(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)」或「ADCC」係指一種細胞媒介反應，其中表現Fc受體(FcR)之非特異性細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細 胞、嗜中性球、及巨噬細胞)辨識目標細胞上的已結合抗體，然後造成目標細胞溶解。
單株抗體誘導ADCC之能力可藉由工程改造其寡醣組分來增強。人類IgG1或IgG3係在Asn297處經N-醣基化並且大部分聚醣係呈廣為周知之雙觸角(biantennary)G0、G0F、G1、G1F、G2、或G2F形式。由未經工程改造之CHO細胞所生產之抗體典型具有約至少85%之聚醣海藻糖(glycan fucose)含量。自附接至Fc區之雙觸角複合型寡醣移除核心海藻糖經由改善Fc.gamma.RIIIa結合且不改變抗原結合或CDC活性來增強抗體之ADCC。此等mAb可使用已報導會促使成功表現相對高量去海藻糖基化(defucosylated)抗體(帶有雙觸角複合型之Fc寡醣)的不同方法來達成，諸如控制培養滲透壓(Konno等人，Cytotechnology 64：249-65,2012)、應用變異體CHO系Lec13作為宿主細胞系(Shields等人，J Biol Chem 277：26733-26740,2002)、應用變異體CHO系EB66作為宿主細胞系(Olivier等人，MAbs；2(4),2010；紙本發行前之電子發行版本；PMID：20562582)、應用大鼠融合瘤細胞系YB2/0作為宿主細胞系(Shinkawa等人，J Biol Chem 278：3466-3473,2003)、引入特異性針對α1,6-海藻糖基轉移酶(FUT8)基因之小型干擾RNA(Mori等人，Biotechnol Bioeng 88：901-908,2004)、或共表現β-1,4-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶III及高基氏體α-甘露糖苷酶II或強效α-甘露糖苷酶I抑制劑kifunensine(Ferrara等人，J Biol Chem 281：5032-5036,2006,Ferrara等人，Biotechnol Bioeng 93：851-861,2006；Xhou等人，Biotechnol Bioeng 99：652-65,2008)。
在本文中所述之一些實施例中，由IL1RAP抗體所誘發之ADCC亦可藉由抗體Fc中之某些取代而增強。例示性取代例如為在胺基酸位置256、290、298、312、356、330、333、334、360、378、或430處之取代(殘基編號根據EU索引)，如美國專利第6,737,056號中所述。
偵測IL1RAP之方法
本文中提供用於偵測生物樣本中之IL1RAP的方法，其藉由使該樣本接觸本文中所述之抗體、或其抗原結合片段。如本文中所述，該樣本可衍生自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞(即游離細胞)、組織(例如手術切除之腫瘤組織、活體組織切片包括細針穿刺)、組織標本、及類似者。在一些實施例中，所述方法包括藉由使生物樣本接觸任何本文中所述之IL1RAP特異性抗體、或其抗原結合片段來偵測該樣本中之IL1RAP。
在一些實施例中，該樣本可與超過一種表1中所述之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段接觸。舉例而言，樣本可與第一IL1RAP特異性抗體、或其抗原結合片段接觸，然後與第二IL1RAP特異性抗體、或其抗原結合片段接觸，其中該第一抗體或抗原結合片段與該第二抗體或抗原結合片段並非相同抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，在接觸樣本之前，該第一抗體、或其抗原結合片段可固定至表面(諸如多孔盤、晶片、或類似基材)。在其他實施例中，在接觸樣本之前，該第一抗體、或其抗原結合片段可完全未經固定(或附接)至任何東西。在一個替代性實施例中，樣本可與IL1RAP特異性抗體接觸，然後可藉由經標示之抗體或其他抗體標靶結合劑來偵測經樣本結合之IL1RAP特異性抗體。
在此節提供之方法的一些示例性實施例中，適合的IL1RAP特異性抗體包括具有以下抗體中任一者之相同重鏈CDR1、CDR2、及CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3之組合的抗體，如表1所揭示：IAPB47、IAPB38、IAPB57、IAPB61、IAPB62、IAPB3、IAPB17、IAPB23、IAPB25、IAPB29、IAPB9、IAPB55、IAPB63、IAPB64、或IAPB65。
所述IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段可經可偵測地標示。在一些實施例中，經標示之抗體及抗原結合片段有助於經由本文中所述之方法偵測IL1RAP。許多此等標記係所屬領域中具有通常知識者所熟知者。舉例而言，適合的標記包括(但不應將之視為限制於)放射性標記、螢光標記、表位標籤、生物素、發色團 (chromophore)標記、ECL標記、或酶。更具體而言，所述標記包括釕、111In-DOTA、111In-二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶及β-半乳糖苷酶、多組胺酸(HIS標籤)、吖啶染料、花青(cyanine)染料、螢光酮(fluorone)染料、(oxazin)染料、啡啶染料、玫瑰紅染料、Alexafluor®染料、及類似者。
所述IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段可用於各式測定中以偵測生物樣本中之IL1RAP。一些適合的測定包括(但不應將之視為限制於)西方墨點分析、放射免疫測定、表面電漿共振、免疫螢光法、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫測定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)或ELISA測定。
在本文所述之一些實施例中，偵測對象中之IL1RAP表現性癌細胞可用來判定該對象可用針對IL1RAP之治療劑來治療。
IL1RAP係以可偵測水準存在於血液及血清樣本中。因此，本文中提供用於偵測衍生自血液之樣本(諸如血清樣本)中之IL1RAP之方法，其藉由使該樣本與特異性結合IL1RAP之抗體或其抗原結合片段接觸。該血液樣本或其衍生物可經稀釋、份化、或以其他方式處理以產出可對其執行所述方法的樣本。在一些實施例中，IL1RAP可藉由所屬技術領域中所習知之許多測定來在血液樣本或其衍生物中偵測，諸如但不限於西方墨點分析、放射免疫測定、表面電漿共振、免疫螢光法、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫測定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)、或ELISA測定。
用於診斷癌症之方法
本文中提供用於診斷對象中之IL1RAP表現性癌症的方法。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症包括血液性癌症，諸如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS，低或高危)、急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞 腫瘤(DPDCN)。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症包括實體腫瘤，諸如下列者：前列腺、乳腺、肺、結腸直腸、黑色素瘤、膀胱、腦/CNS、子宮頸、食道、胃、頭/頸、腎、肝、卵巢、胰腺、及肉瘤。在一些實施例中，如上所述，偵測生物樣本(諸如血液樣本或血清樣本)中之IL1RAP提供診斷對象(該樣本自其獲得)中之癌症的能力。或者，在一些實施例中，其他樣本(諸如組織樣本、細針穿刺樣本、切除腫瘤組織、循環細胞、循環腫瘤細胞、及類似者)亦可用來評估該對象(該樣本自其獲得)是否患有癌症。在一些實施例中，可能已經知道該對象(該樣本自其獲得)患有癌症，但該對象所罹患之癌症類型可能尚未診斷出來或者初步診斷結果可能尚未明朗，因此偵測獲自該對象之生物樣本中之IL1RAP可讓該癌症之診斷得以作出或明朗化。舉例而言，可能已經知道對象患有癌症，但可能不知道或不清楚該對象之癌症是否為IL1RAP表現性。
在一些實施例中，所述方法涉及評估對象是否罹患IL1RAP表現性癌症，其藉由判定衍生自該對象之生物樣本中所存在之IL1RAP的量；以及比較所觀察到之IL1RAP的量與對照(或參考)樣本中之IL1RAP的量，其中衍生自該對象之樣本中之IL1RAP的量與對照(或參考)樣本中之IL1RAP的量之間的差異為該對象罹患IL1RAP表現性癌症之指示。在另一個實施例中，獲自對象之生物樣本中所觀察到之IL1RAP的量可與已知和癌症的某些形式或期別相關聯之IL1RAP水準比較，以判定該對象之癌症的形式或期別。在一些實施例中，衍生自該對象之樣本中之IL1RAP的量係藉由使該樣本與特異性結合IL1RAP之抗體、或其抗原結合片段(諸如本文中所述之IL1RAP特異性抗體)接觸來評估。用於評估IL1RAP之存在的樣本可衍生自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞(即游離細胞)、組織(例如手術切除之腫瘤組織、活體組織切片包括細針穿刺)、組織標本、及類似者。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症包括血液性癌症，諸如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS，低或高危)、急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤 (DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(DPDCN)。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症包括實體腫瘤，諸如下列者：前列腺、乳腺、肺、結腸直腸、黑色素瘤、膀胱、腦/CNS、子宮頸、食道、胃、頭/頸、腎、肝、卵巢、胰腺、及肉瘤。在一些實施例中，該對象為人類。
在一些實施例中，診斷IL1RAP表現性癌症之方法將涉及：使對象之生物樣本與IL1RAP特異性抗體、或其抗原結合片段(諸如可衍生自表1所提供之抗體及片段者)接觸；定量存在於該樣本中由該抗體或其抗原結合片段所結合之IL1RAP的量；比較存在於該樣本中之IL1RAP的量與已知標準品或參考樣本；以及判定該對象之IL1RAP水準是否落入與癌症相關聯之IL1RAP水準。在額外實施例中，在該診斷方法之後可接著進行投予或處方癌症特異性治療之額外步驟。在另一實施例中，在該診斷方法之後可接著進行傳送判定結果以利於癌症治療之額外步驟。在一些實施例中，該癌症特異性治療可針對IL1RAP表現性癌症，諸如本文中所述之IL1RAP×CD3多特異性抗體。
在一些實施例中，所述方法涉及評估對象是否罹患IL1RAP表現性癌症，其藉由判定獲自該對象之血液或血清樣本中所存在之IL1RAP的量；以及比較所觀察到之IL1RAP的量與對照(或參考)樣本中之IL1RAP的量，其中衍生自該對象之樣本中之IL1RAP的量與對照(或參考)樣本中之IL1RAP的量之間的差異為該對象罹患IL1RAP表現性癌症之指示。
在一些實施例中，該對照(或參考)樣本可衍生自未罹患IL1RAP表現性癌症之對象。在一些實施例中，該對照(或參考)樣本可衍生自罹患IL1RAP表現性癌症之對象。在該對照(或參考)樣本係衍生自未罹患IL1RAP表現性癌症之對象的一些實施例中，觀察到存在於測試樣本中之IL1RAP的量相對於該對照或參考樣本中所觀察到的量增加，係該評估對象罹患IL1RAP表現性癌症之指示。在該對照樣本係衍生自未罹患IL1RAP表現性癌症之對象的一些實施例中，觀察到存在於測試樣本中之IL1RAP的量相對於該對照或參考樣 本中所觀察到的量減少或類似，係該評估對象未罹患IL1RAP表現性癌症之指示。在該對照或參考樣本係衍生自罹患IL1RAP表現性癌症之對象的一些實施例中，觀察到存在於測試樣本中之IL1RAP的量相對於該對照或參考樣本中所觀察到的量類似，係該評估對象罹患IL1RAP表現性癌症之指示。在該對照或參考樣本係衍生自罹患IL1RAP表現性癌症之對象的一些實施例中，觀察到存在於測試樣本中之IL1RAP的量相對於該對照或參考樣本中所觀察到的量減少，係該評估對象未罹患IL1RAP表現性癌症之指示。
在一些實施例中，衍生自該對象之樣本中之IL1RAP的量係藉由使該樣本與特異性結合IL1RAP之抗體、或其抗原結合片段(諸如本文中所述之抗體)接觸來評估。用於評估IL1RAP之存在的樣本可衍生自血液樣本、血清樣本、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞(即游離細胞)、組織(例如手術切除之腫瘤組織、活體組織切片包括細針穿刺)、組織標本、及類似者。
在各種態樣中，IL1RAP的量係藉由使樣本與特異性結合IL1RAP之抗體、或其抗原結合片段接觸來判定。在一些實施例中，樣本可由超過一種類型之特異性結合IL1RAP的抗體、或其抗原結合片段接觸。在一些實施例中，樣本可由特異性結合IL1RAP之第一抗體、或其抗原結合片段接觸，然後由特異性結合IL1RAP之第二抗體、或其抗原結合片段接觸。諸如本文中所述之IL1RAP特異性抗體或抗原結合片段可用於此方法。
IL1RAP特異性抗體及抗原結合片段之各式組合可用來提供「第一」及「第二」抗體或抗原結合片段以實施所述之診斷方法。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症包括血液性癌症，諸如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS，低或高危)、急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(DPDCN)。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症包括實體腫瘤，諸如下列者：前列腺、乳腺、肺、結腸直腸、黑色素瘤、膀胱、腦/CNS、子宮頸、食道、胃、頭/頸、腎、肝、卵巢、胰腺、及肉瘤。
在某些實施例中，IL1RAP的量係藉由下列方法判定：西方墨點分析、放射免疫測定、免疫螢光法、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫測定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)、或ELISA測定。
在所述診斷方法之各式實施例中，使用對照或參考樣本。此樣本可作為陽性或陰性測定對照組以確保所使用之測定的正確運作；舉例而言，具有此性質之測定對照組可能常用於免疫組織化學測定。或者，該樣本可為來自健康對象之用於生物樣本中之IL1RAP量的標準參考品。在一些實施例中，所觀察到之受測對象的IL1RAP水準可與來自已知患有IL1RAP表現性癌症之對象的樣本中所觀察到之IL1RAP水準比較。在一些實施例中，該對照對象可能罹患所關注之特定癌症。在一些實施例中，已知該對照對象患有早期癌症，該癌症可為或非為IL1RAP表現性癌症。在一些實施例中，已知該對照對象患有中期癌症，該癌症可為或非為IL1RAP表現性癌症。在一些實施例中，已知該對照對象患有晚期癌症，該癌症可為或非為IL1RAP表現性癌症。
用於監測癌症之方法
本文中提供用於監測對象中之IL1RAP表現性癌症的方法。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症包括血液性癌症，諸如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS，低或高危)、急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(DPDCN)。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症包括實體腫瘤，諸如下列者：前列腺、乳腺、肺、結腸直腸、黑色素瘤、膀胱、腦/CNS、子宮頸、食道、胃、頭/頸、腎、肝、卵巢、胰腺、及肉瘤。在一些實施例中，所述方法涉及評估IL1RAP表現性癌症是否正在進展、消退、或保持穩定，其藉由判定衍生自該對象之測試樣本中所存在之IL1RAP的量；以及比較所觀察到之IL1RAP的量與在較早時間點以類似方式獲自該對象之生物樣本中之IL1RAP的量，其中測試樣 本與較早樣本中之IL1RAP的量之間的差異提供該癌症是否正在進展、消退、或保持穩定之指示。在此方面，測試樣本之IL1RAP的量相對於較早樣本所觀察到的量增加，可能指示IL1RAP表現性癌症之進展。反之，測試樣本之IL1RAP的量相對於較早樣本所觀察到的量減少，可能指示IL1RAP表現性癌症之消退。
因此，測試樣本之IL1RAP的量相對於較早樣本所觀察到的量之差異不顯著，可能指示IL1RAP表現性癌症的穩定疾病狀態。在一些實施例中，衍生自該對象之生物樣本中之IL1RAP的量係藉由使該樣本與特異性結合IL1RAP之抗體、或其抗體片段(諸如本文中所述之抗體)接觸來評估。用於評估IL1RAP之存在的樣本可衍生自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞(即游離細胞)、組織(例如手術切除之腫瘤組織、活體組織切片包括細針穿刺)、組織標本、及類似者。在一些實施例中，該對象為人類。
在一些實施例中，監測IL1RAP表現性癌症之方法將涉及：使對象之生物樣本與IL1RAP特異性抗體、或其抗原結合片段(諸如可衍生自表1所提供之抗體及片段者)接觸；定量存在於該樣本中之IL1RAP的量；比較存在於該樣本中之IL1RAP的量與在較早時間點以類似方式得自相同對象之生物樣本中所判定之IL1RAP的量；以及判定該對象之IL1RAP水準是否隨時間改變。測試樣本之IL1RAP的量相對於較早樣本所觀察到的量增加，可能指示癌症之進展。反之，測試樣本之IL1RAP的量相對於較早樣本所觀察到的量減少，可能指示IL1RAP表現性癌症之消退。因此，測試樣本之IL1RAP的量相對於較早樣本所觀察到的量之差異不顯著，可能指示IL1RAP表現性癌症的穩定疾病狀態。在一些實施例中，樣本之IL1RAP水準可與已知標準品或參考樣本單獨比較，或另外與在較早時間點評估之樣本所觀察到的IL1RAP水準比較。在額外實施例中，在該診斷方法之後可接著進行投予癌症特異性治療之額外步驟。在一些實施例中，該癌症特異性治療可針對IL1RAP表現性癌症，諸如本文中所述之IL1RAP×CD3多特異性抗體。
在各種態樣中，ILIRAP的量係藉由使樣本與特異性結合IL1RAP之抗體、或其抗原結合片段接觸來判定。在一些實施例中，樣本可由超過一種類型之特異性結合IL1RAP的抗體、或其抗原結合片段接觸。在一些實施例中，樣本可由特異性結合IL1RAP之第一抗體、或其抗原結合片段接觸，然後由特異性結合IL1RAP之第二抗體、或其抗原結合片段接觸。諸如本文中所述之抗體可用於此方法。
表1所述之抗體及抗原結合片段之各式組合可用來提供「第一」及「第二」抗體或抗原結合片段以實施所述之監測方法。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症包括血液性癌症，諸如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS，低或高危)、急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(DPDCN)。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症包括實體腫瘤，諸如下列者：前列腺、乳腺、肺、結腸直腸、黑色素瘤、膀胱、腦/CNS、子宮頸、食道、胃、頭/頸、腎、肝、卵巢、胰腺、及肉瘤。
在某些實施例中，IL1RAP的量係藉由下列方法判定：西方墨點分析、放射免疫測定、免疫螢光法、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫測定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)、或ELISA測定。
用於偵測IL1RAP之套組
本文中提供用於偵測生物樣本中之IL1RAP的套組。這些套組包括本文中所述之一或多種IL1RAP特異性抗體、或其抗原結合片段，以及套組之使用說明。
所提供之IL1RAP特異性抗體、或抗原結合片段可為在溶液中；經凍乾；經固定至基材、載劑、或盤；或經可偵測地標示。
所述套組亦可包括可用於執行本文中所述之方法的額外組分。舉例來說，該等套組可包含用於自對象獲得樣本之手段、對照或參考樣本(例如來自患有緩慢進展癌症之對象及/或未患有癌症之對 象的樣本)、一或多個樣本隔間、及/或描述本發明方法之執行及組織特定對照組或標準品的說明資料。
用於判定IL1RAP水準之手段可進一步包括例如緩衝液或其他用於判定IL1RAP水準之測定中的試劑。該等說明可為例如用於執行該測定之印刷說明及/或用於評價IL1RAP表現水準之說明。
所述套組亦可包括用於自對象單離樣本之手段。這些手段可包含可用來自對象獲得流體或組織之一或多個設備項目或試劑。用於自對象獲得樣本之手段亦可包含用於自血液樣本單離血液組分(諸如血清)之手段。較佳的是，該套組係針對人類對象使用而設計。
多特異性抗體
本文中所述之抗IL1RAP抗體的結合域辨識在表面上表現IL1RAP之細胞。如上所述，IL1RAP表現可為癌性細胞之指示。更特異性靶向細胞之特定子集可藉由製造雙特異性或特異性分子(諸如結合至IL1RAP及另一目標的抗體或抗體片段)來達成。該等抗原結合區可採取任何能夠特異性辨識目標之形式，例如該結合區可為或可包括重鏈可變域、Fv(重鏈可變域與輕鏈可變域之組合)、基於纖連蛋白素III型域(fibronectin type III domain)的結合域(諸如來自纖連蛋白素、或基於來自纖連蛋白素的III型域的一致序列、或來自固生蛋白(tenascin)、或基於來自固生蛋白的III型域的一致序列，諸如來自Janssen Biotech,Inc.的Centyrin分子，見例如WO2010/051274及WO2010/093627)。因此，提供包含兩個或更多個分別結合IL1RAP及另一抗原之不同抗原結合區的雙特異性或多特異性分子。
一些本文中所述之多特異性抗體包含兩個分別結合IL1RAP及CD3之不同抗原結合區。在較佳實施例中，提供結合IL1RAP及CD3之多特異性抗體(IL1RAP×CD3多特異性抗體)及其多特異性抗原結合片段。在一些實施例中，該IL1RAP×CD3多特異性抗體包含第一重鏈(HC1)及第一輕鏈(LC1)(配對形成特異性結合IL1RAP之第一抗原結合部位)和第二重鏈(HC2)及第二輕鏈(LC2) (配對形成特異性結合CD3之第二抗原結合部位)。在較佳實施例中，該IL1RAP×CD3多特異性抗體係包含IL1RAP特異性臂及CD3特異性臂之雙特異性抗體，該IL1RAP特異性臂包含第一重鏈(HC1)及第一輕鏈(LC1)(配對形成特異性結合IL1RAP之第一抗原結合部位)，該CD3特異性臂包含第二重鏈(HC2)及第二輕鏈(LC2)(配對形成特異性結合CD3之第二抗原結合部位)。在一些實施例中，本發明之雙特異性抗體包括具有全長抗體結構之抗體。本文中所用之「全長抗體(Full length antibody)」係指具有兩個全長抗體重鏈及兩個全長抗體輕鏈之抗體。全長抗體重鏈(HC)包括重鏈可變域及恆定域VH、CHI、CH2、及CH3。全長抗體輕鏈(LC)包括輕鏈可變域及恆定域VL及CL。全長抗體可在任一或兩個重鏈中缺乏C端離胺酸(K)。用語「Fab臂(Fab-arm)」或「半分子(half molecule)」係指特異性結合抗原之一個重鏈-輕鏈對。在一些實施例中，該等抗原結合域中之一者係非基於抗體的結合域，例如基於纖連蛋白素III型域(fibronectin type 3 domain)的結合域，例如Centyrin。
本文中所提供之多特異性抗體的IL1RAP結合臂可衍生自上述IL1RAP特異性抗體之任一者。在此等IL1RAP結合臂之一些例示性實施例中，結合IL1RAP之第一抗原結合區包含衍生自如表1所述之抗體殖株的重鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在此等IL1RAP結合臂之一些例示性實施例中，結合IL1RAP之第一抗原結合區包含衍生自如表1所述之抗體殖株的重鏈CDR1、CDR2、及CDR3和輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。在此等IL1RAP結合臂之一些示例性實施例中，結合IL1RAP之第一抗原結合區包含以下IL1RAP特異性抗體中任一者的重鏈CDR1、CDR2、及CDR3：IAPB47、IAPB38、IAPB57、IAPB61、IAPB62、IAPB3、IAPB17、IAPB23、IAPB25、IAPB29、IAPB9、IAPB55、IAPB63、IAPB64、或IAPB65。在此等IL1RAP結合臂之一些示例性實施例中，結合IL1RAP之第一抗原結合區包含以下IL1RAP特異性抗體中任一者的重鏈CDR1、CDR2、及CDR3和輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3：IAPB47、IAPB38、IAPB57、IAPB61、IAPB62、IAPB3、IAPB17、IAPB23、IAPB25、 IAPB29、IAPB9、IAPB55、IAPB63、IAPB64、或IAPB65。在此等IL1RAP結合臂之一些示例性實施例中，結合IL1RAP之第一抗原結合區包含衍生自如表1所述之抗體的重鏈可變域。在此等IL1RAP結合臂之一些示例性實施例中，結合IL1RAP之第一抗原結合區包含衍生自如表1中所述之抗體的重鏈可變域及輕鏈可變域。在此等IL1RAP結合臂之一些示例性實施例中，結合IL1RAP之第一抗原結合區包含以下IL1RAP特異性抗體中任一者的重鏈可變域：IAPB47、IAPB38、IAPB57、IAPB61、IAPB62、IAPB3、IAPB17、IAPB23、IAPB25、IAPB29、IAPB9、IAPB55、IAPB63、IAPB64、或IAPB65。在此等IL1RAP結合臂之一些示例性實施例中，結合IL1RAP之第一抗原結合區包含以下IL1RAP特異性抗體中任一者的重鏈可變域及輕鏈可變域：IAPB47、IAPB38、IAPB57、IAPB61、IAPB62、IAPB3、IAPB17、IAPB23、IAPB25、IAPB29、IAPB9、IAPB55、IAPB63、IAPB64、或IAPB65。
在該等雙特異性抗體之一些實施例中，該IL1RAP結合臂亦結合食蟹獼猴IL1RAP，較佳地結合其胞外域。
在一些實施例中，該多特異性抗體之IL1RAP結合臂係IgG、或其衍生物，例如IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4同型。在IL1RAP結合臂具有IgG1同型之一些實施例中，該IL1RAP結合臂在其Fc區中含有L234A、L235A、及K409R取代。在IL1RAP結合臂具有IgG4同型之一些實施例中，該IL1RAP結合臂在其Fc區中含有S228P、L234A、及L235A取代。
在該等雙特異性抗體之一些實施例中，該第二抗原結合臂結合人類CD3。在一些較佳實施例中，該IL1RAP×CD3雙特異性抗體之CD3特異性臂係衍生自結合及活化人類初級T細胞及/或食蟹獼猴初級T細胞之CD3特異性抗體。在一些實施例中，該CD3結合臂結合在CD3ε之N端的表位。在一些實施例中，該CD3結合臂接觸包括CD3ε之六個N端胺基酸的表位。在一些實施例中，該雙特異性抗體之CD3特異性結合臂係衍生自小鼠單株抗體SP34，其係小鼠IgG3/λ同型。在一些實施例中，該CD3結合臂包含抗體SP34之 CDR。此等CD3結合臂可以5×10-7M或更小(諸如1×10-7M或更小、5×10-8M或更小、1×10-8M或更小、5×10-9M或更小、或者1×10-9M或更小)之親和力結合至CD3。該CD3特異性結合臂可為小鼠單株抗體SP34之臂的人化版本。人類架構適應(HFA)可用來人化CD3特異性臂係自其衍生之抗CD3抗體。在該等雙特異性抗體之一些實施例中，該CD3結合臂包含選自表2之重鏈及輕鏈對。
在一些實施例中，該CD3結合臂係IgG，或其衍生物。在一些實施例中，該CD3結合臂係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。在CD3結合臂具有IgG1同型之一些實施例中，該CD3結合臂在其Fc區中含有L234A、L235A、及F405L取代。在CD3結合臂具有IgG4同型之一些實施例中，該CD3結合臂在其Fc區中含有S228P、L234A、L235A、F405L、及R409K取代。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段結合初級人類T細胞上之CD3ε。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段結合初級食蟹獼猴T細胞上之CD3ε。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段結合初級人類及食蟹獼猴T細胞上之CD3ε。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段活化初級人類CD4+ T細胞。在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段活化初級食蟹獼猴CD4+ T細胞。
在一些實施例中，提供具有IL1RAP結合臂之IL1RAP×CD3雙特異性抗體，該IL1RAP結合臂包含抗體IAPB47、IAPB38、IAPB57、IAPB61、IAPB62、IAPB3、IAPB17、IAPB23、IAPB25、IAPB29、IAPB9、IAPB55、IAPB63、IAPB64、或IAPB65中任一者之重鏈。在一些實施例中，提供具有IL1RAP結合臂之IL1RAP×CD3雙特異性抗體，該IL1RAP結合臂包含抗體IAPB47、IAPB38、IAPB57、IAPB61、IAPB62、IAPB3、IAPB17、IAPB23、IAPB25、IAPB29、IAPB9、IAPB55、IAPB63、IAPB64、或IAPB65中任一者之重鏈及輕鏈。在一些實施例中提供具有CD3結合臂之IL1RAP×CD3雙特異性抗體，該CD3結合臂包含抗體CD3B220或CD3B219之重鏈。在一些實施例中提供具有CD3結合臂之IL1RAP×CD3雙特異性抗體，該CD3結合臂包含抗體CD3B220 或CD3B219之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，提供具有IL1RAP結合臂及CD3結合臂之IL1RAP×CD3雙特異性抗體，該IL1RAP結合臂包含IAPB47、IAPB38、IAPB57、IAPB61、IAPB62、IAPB3、IAPB17、IAPB23、IAPB25、IAPB29、IAPB9、IAPB55、IAPB63、IAPB64、或IAPB65中任一者之抗體之重鏈，該CD3結合臂包含抗體CD3B220或CD3B219之重鏈。在一些實施例中，提供具有IL1RAP結合臂及CD3結合臂之IIL1RAP×CD3雙特異性抗體，該IL1RAP結合臂包含抗體IAPB47、IAPB38、IAPB57、IAPB61、IAPB62、IAPB3、IAPB17、IAPB23、IAPB25、IAPB29、IAPB9、IAPB55、IAPB63、IAPB64、或IAPB65中任一者之重鏈及輕鏈，該CD3結合臂包含抗體CD3B220或CD3B219之重鏈及輕鏈。
較佳IL1RAP×CD3雙特異性抗體係提供於表10及15中。
已經描述雙特異性抗體之不同格式且近來已由下列文獻所回顧：Kontermann(2012)MAbs(2012)4：182-197及Chames and Baty(2009)Curr Opin Drug Disc Dev 12：276。
在一些實施例中，本發明之雙特異性抗體係雙價抗體、交叉抗體(cross-body)、或經由如本發明中所述之受控Fab臂交換所獲得之雙特異性抗體。
在一些實施例中，雙特異性抗體包括具有互補CH3域以迫使異二聚化的類IgG分子；重組類IgG雙靶向分子，其中該分子之兩側各包含至少兩種不同抗體之Fab片段或該Fab片段的一部分；IgG融合分子，其中全長IgG抗體係融合至額外Fab片段或Fab片段之部分；Fc融合分子，其中單鏈Fv分子或穩定化雙價抗體係融合至重鏈恆定域、Fc區或其部分；Fab融合分子，其中不同之Fab片段係融合在一起；基於ScFv之抗體及基於雙價抗體之抗體及重鏈抗體(例如，域抗體、奈米抗體)，其中不同單鏈Fv分子或不同雙價抗體或不同重鏈抗體(例如，域抗體、奈米抗體)係融合至彼此或融合至另一個蛋白質或載劑分子。
在一些實施例中，具有互補CH3域分子之類IgG分子包括Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、Knobs-into-Holes(Genentech)、CrossMAbs(Roche)及靜電匹配者(electrostatically-matched)(Amgen)、LUZ-Y(Genentech)、股交換工程改造域抗體(Strand Exchange Engineered Domain body,SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)、及DuoBody(Genmab A/S)。
在一些實施例中，重組類IgG雙靶向分子包括Dual Targeting(DT)-Ig(GSK/Domantis)、二合一抗體(Two-in-one Antibody)(Genentech)、交聯單株抗體(Cross-linked Mabs)(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star)、及CovX-body(CovX/Pfizer)。
在一些實施例中，IgG融合分子包括雙可變域(Dual Variable Domain,DVD)-Ig(Abbott)、類IgG雙特異性抗體(IgG-like Bispecific)(InnClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)及BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)及TvAb(Roche)。
在一些實施例中，Fc融合分子包括ScFv/Fc Fusions(Academic Institution)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)、Dual Affinity Retargeting Technology(Fc-DART)(MacroGenics)、及Dual(ScFv)2-Fab(National Research Center for Antibody Medicine--China)。
在一些實施例中，Fab融合雙特異性抗體包括F(ab)2(Medarex/AMGEN)、Dual-Action或Bis-Fab(Genentech)、Dock-and-Lock(DNL)(ImmunoMedics)、Bivalent Bispecific(Biotecnol)、及Fab-Fv(UCB-Celltech)。基於ScFv之抗體、基於雙價抗體之抗體及域抗體包括但不限於Bispecific T Cell Engager(BITE)(Micromet)、Tandem Diabody(Tandab)(Affimed)、Dual Affinity Retargeting Technology(DART)(MacroGenics)、Single-chain Diabody(Academic)、TCR-like Antibodies(AIT,ReceptorLogics)、Human Serum Albumin ScFv Fusion(Merrimack)及COMBODY(Epigen Biotech)、雙靶向奈米抗體(Ablynx)、僅雙靶向重鏈域抗體 (dual targeting heavy chain only domain antibody)。
本發明之全長雙特異性抗體可使用例如兩個單特異性雙價抗體之間的Fab臂交換(或半分子交換)來產製，其於各半分子中之重鏈CH3介面引入取代以利於兩個具有不同特異性之抗體半分子的異二聚體在無細胞環境中在體外或者使用共表現形成。該Fab臂交換反應係雙硫鍵異構化反應及CH3域之解離-締合的結果。親系單特異性抗體之鉸鏈區中的重鏈雙硫鍵係經還原。其中一個親系單特異性抗體所生成的游離半胱胺酸與第二親系單特異性抗體分子之半胱胺酸殘基形成重鏈間雙硫鍵，同時該等親系抗體之CH3域藉由解離-締合而釋出及重新形成。該等Fab臂之CH3域可經工程改造以利於異二聚化而非同二聚化。所生成之產物係具有兩個Fab臂或半分子之雙特異性抗體，這兩個Fab臂或半分子各自結合不同表位，即IL1RAP上的表位及CD3上的表位。
本文中所用之「同二聚化(Homodimerization)」係指具有相同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。本文中所用之「同二聚體(Homodimer)」係指具有兩個有相同CH3胺基酸序列之重鏈的抗體。
本文中所用之「異二聚化(Heterodimerization)」係指具有不同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。本文中所用之「異二聚體(Heterodimer)」係指具有兩個有不同CH3胺基酸序列之重鏈的抗體。
「孔中鈕(knob-in-hole)」策略(請參見例如PCT Inti.Publ.No.WO 2006/028936)可用來產製全長雙特異性抗體。簡言之，在人類IgG中形成CH3域介面之選定胺基酸可在影響CH3域交互作用的位置處突變以促進異二聚體形成。將具有小側鏈之胺基酸(孔)引入特異性結合第一抗原之抗體的重鏈中，並將具有大側鏈之胺基酸(鈕)引入特異性結合第二抗原之抗體的重鏈中。在共表現這兩個抗體之後，具有「孔(hole)」之重鏈與具有「鈕(knob)」之重鏈優先交互作用而導致異二聚體形成。形成鈕和孔之例示性CH3取代對係(表現為第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/第二重鏈之第二 CH3域中的經修飾位置)：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S、及T366W/T366S_L368A_Y407V。
可使用其他策略，諸如使用靜電交互作用促進重鏈異二聚化，其取代一個CH3表面之帶正電荷殘基及第二CH3表面之帶負電荷殘基，如在美國專利公開號US2010/0015133；美國專利公開號US2009/0182127；US Pat.Publ.No.US2010/028637或US Pat.Publ.No.US2011/0123532中所述。在其他策略中，異二聚化可藉由下列取代來促進(表現為第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中的經修飾位置)：L351Y_F405AY407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如在U.S.Pat.Publ.No.US2012/0149876或U.S.Pat.Publ.No.US2013/0195849中所述。
除了上述方法外，本發明之雙特異性抗體可在無細胞環境中在體外產生，此藉由在兩個單特異性同二聚體抗體之CH3區中引入非對稱突變，且在還原條件中(以讓雙硫鍵異構化)以兩個親體單特異性同二聚體抗體形成該雙特異性異二聚體抗體，其係根據描述於Inti.專利公開號W02011/131746之方法。在該等方法中，第一單特異性雙價抗體(例如，抗IL1RAP抗體)及第二單特異性雙價抗體(例如，抗CD3抗體)係經工程改造以在CH3域具有某些促進異二聚體穩定性之取代；該等抗體係在足以讓絞鏈區中之半胱胺酸進行雙硫鍵異構化的還原條件下一起培養；從而藉由Fab臂交換來產生該雙特異性抗體。培養條件可最佳地被回復為非還原性條件。可使用之例示性還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、二硫赤蘚醇(dithioerythritol,DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸、及β-巰基乙醇，還原劑較佳係選自由下列所組成之群組：2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇及參(2-羧乙基)膦。舉例而言，可 使用在至少20℃之溫度且有至少25mM之2-MEA存在下或於至少0.5mM之二硫蘇糖醇存在且在5至8之pH下(例如在7.0之pH下或在7.4之pH下)培養至少90分鐘。
除了所述IL1RAP×CD3多特異性抗體外，亦提供能夠編碼所述IL1RAP×CD3多特異性抗體之多核苷酸序列。亦提供包含所述多核苷酸之載體，如表現本文中所提供之IL1RAP×CD3多特異性抗體的細胞。亦描述能夠表現所揭示之載體的細胞。這些細胞可為哺乳動物細胞(諸如293F細胞、CHO細胞)、昆蟲細胞(諸如Sf7細胞)、酵母菌細胞、植物細胞、或細菌細胞(諸如E.coli)。所述抗體亦可藉由融合瘤細胞來生產。
使用多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段之治療組成物及治療方法
以上討論之IL1RAP雙特異性抗體(例如以上討論之IL1RAP×CD3雙特異性抗體)可用於療法中。特定而言，IL1RAP雙特異性抗體可用於治療癌症。本文中亦提供用於治療哺乳動物中之過度增生性病症的治療組成物，其包含治療有效量之本文中所述之多特異性抗體或多特異性抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之IL1RAP×CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體、或其IL1RAP×CD3雙特異性抗原結合片段。在一個實施例中，該醫藥組成物係用於治療IL1RAP表現性癌症，包括(但不限於)下列者：IL1RAP表現性血液性癌症，諸如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS，低、中、或高危)、急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(DPDCN)；及其他表現有IL1RAP但尚未被判定之血液性癌症。在另一個實施例中，該醫藥組成物用於治療IL1RAP表現性實體腫瘤，包括(但不限於)下列者：前列腺、乳腺、肺、結腸直腸、黑色素瘤、膀胱、腦/CNS、子宮頸、食道、頭/頸、腎、肝、卵 巢、胰腺、及肉瘤；及其他表現有IL1RAP但尚未被判定之腫瘤。可用於治療癌症(諸如血液性癌症或實體腫瘤，包括上述特定癌症)的特定雙特異性抗體包括抗體IC3B1、IC3B2、IC3B3、IC3B4、IC3B5、IC3B6、IC3B6、IC3B7、IC3B8、IC3B9、IC3B10、IC3B11、IC3B12、IC3B13、IC3B14、IC3B15、IC3B16、IC3B17、IC3B18、IC3B19。用於治療癌症(諸如血液性癌症或實體腫瘤，包括這些特定癌症)之有用雙特異性抗體的一個實例係抗體IC3B18。用於治療癌症(諸如血液性癌症或實體腫瘤，包括這些特定癌症)之有用雙特異性抗體的另一個實例係抗體IC3B19。在一個實施例中，抗體IC3B19可用於治療一種或多種IL1RAP表現性血液性癌症。在所述治療方法之一個實施例中，抗體IC3B19可用於治療急性骨髓性白血病(AML)。在所述治療方法之一個實施例中，抗體IC3B19可用於治療骨髓發育不良症候群(MDS，低或高危)。在所述治療方法之一個實施例中，抗體IC3B19可用於治療急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)。在所述治療方法之一個實施例中，抗體IC3B19可用於治療彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。在所述治療方法的一個實施例中，抗體IC3B19可用於治療慢性骨髓性白血病(CML)。在所述治療方法之一個實施例中，抗體IC3B19可用於治療母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(DPDCN)。
本文所述之IL1RAP雙特異性抗體可用於抑制血管生成。本文中亦提供用於抑制哺乳動物中之血管生成的治療組成物，其包含治療有效量之本文中所述之多特異性抗體或多特異性抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。在一些實施例中，可用於抑制血管生成之多特異性抗體係本文所述之IL1RAP×CD3多特異性抗體或其多特異性抗原結合片段。在一個實施例中，所述之IL1RAP雙特異性抗體可用於藉由向需要血管生成抑制之對象投予所述IL1RAP雙特異性抗體之一者來抑制與癌症相關之血管生成，而不論癌症是否表現IL1RAP。在一個實施例中，可將抗體IC3B19投予至對象以抑制血管生成。在一個實施例中，可將抗體IC3B19投予至對象以抑制血管生成。在一些實施例中，投予抗體IC3B18或IC3B19將抑制患有癌症之 對象的血管生成。雖然可藉由投予本文所述之雙特異性抗體抑制血管生成來治療多種癌症，但是此類治療最常見於展現出實體腫瘤之癌症類型，包括(但不限於)下列者：前列腺、乳腺、肺、結腸直腸、黑色素瘤、膀胱、腦/CNS、子宮頸、食道、胃、頭/頸、腎、肝、卵巢、胰腺、及肉瘤。可用於藉由抑制血管生成來治療癌症的特定雙特異性抗體包括抗體IC3B1、IC3B2、IC3B3、IC3B4、IC3B5、IC3B6、IC3B6、IC3B7、IC3B8、IC3B9、IC3B10、IC3B11、IC3B12、IC3B13、IC3B14、IC3B15、IC3B16、IC3B17、IC3B18、IC3B19。用於抑制血管生成以治療癌症之有用雙特異性抗體的一個實例係抗體IC3B18。用於抑制血管生成以治療癌症之有用雙特異性抗體的另一個實例係抗體IC3B19。
本文所述IL1RAP之雙特異性抗體可用於消耗骨髓衍生抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)群體。使用所述雙特異性抗體來消耗對象之MDSC可藉由移除有效去除MDSC之抑制(suppressor)功能來增強對象對給定刺激之免疫響應。在一些實施例中，所述雙特異性抗體可用於消耗患有癌症之對象的MDSC，從而讓同一對象之免疫系統被導向來攻擊對象之癌症。在一些實施例中，可用於消耗MDSC之多特異性抗體係本文所述IL1RAP×CD3多特異性抗體或其多特異性抗原結合片段。在一個實施例中，所述IL1RAP雙特異性抗體可用於藉由對需要免疫系統增強之對象投予所述IL1RAP雙特異性抗體之一者來消耗患有癌症之對象的MDSC，而不論癌症是否表現IL1RAP。在一個實施例中，可將抗體IC3B19投予對象以消耗對象之MDSC群體。在一個實施例中，可將抗體IC3B19投予對象以消耗對象之MDSC群體。在一些實施例中，投予抗體IC3B18或IC3B19將消耗患有癌症之對象的MDSC。雖然可藉由投予本文所述之雙特異性抗體消耗MDSC來治療多種癌症，但是此類治療最常見於展現出實體腫瘤之癌症類型，包括(但不限於)下列者：前列腺、乳腺、肺、結腸直腸、黑色素瘤、膀胱、腦/CNS、子宮頸、食道、胃、頭/頸、腎、肝、卵巢、胰腺、及肉瘤。可用於藉由消耗MDSC來治療癌症的特定雙特異性抗體包括抗體IC3B1、IC3B2、IC3B3、 IC3B4、IC3B5、IC3B6、IC3B6、IC3B7、IC3B8、IC3B9、IC3B10、IC3B11、IC3B12、IC3B13、IC3B14、IC3B15、IC3B16、IC3B17、IC3B18、IC3B19。用於消耗MDSC以治療癌症之有用雙特異性抗體的一個實例係抗體IC3B18。用於消耗MDSC以治療癌症之有用雙特異性抗體的另一個實例係抗體IC3B19。在一個實施例中，抗體IC3B18可用於在患有肺癌之對象中消耗MDSC。在一個實施例中，抗體IC3B18可用於在患有前列腺癌之對象中消耗MDSC。在一個實施例中，抗體IC3B19可用於在患有肺癌之對象中消耗MDSC。在一個實施例中，抗體IC3B19可用於在患有前列腺癌之對象中消耗MDSC。
在一些實施例中，向患有癌症之對象投予所述雙特異性抗體可同時將對象之T細胞導向以靶向IL1RAP陽性癌細胞，同時亦消耗對象之MDSC以促進針對癌細胞之更強免疫響應。雖然可藉由投予本文所述之雙特異性抗體來以此方式治療多種IL1RAP表現性癌症，但是此類治療最常見於展現出實體腫瘤之癌症類型，包括(但不限於)下列者：前列腺、乳腺、肺、結腸直腸、黑色素瘤、膀胱、腦/CNS、子宮頸、食道、胃、頭/頸、腎、肝、卵巢、胰腺、及肉瘤。可用於導向對象之T細胞以靶向IL1RAP陽性癌細胞並消耗MDSC的特定雙特異性抗體包括抗體IC3B1、IC3B2、IC3B3、IC3B4、IC3B5、IC3B6、IC3B6、IC3B7、IC3B8、IC3B9、IC3B10、IC3B11、IC3B12、IC3B13、IC3B14、IC3B15、IC3B16、IC3B17、IC3B18、IC3B19。用於導向對象之T細胞以靶向IL1RAP陽性癌細胞同時亦消耗MDSC以治療癌症之有用雙特異性抗體的一個實例係抗體IC3B18。用於導向對象之T細胞以靶向IL1RAP陽性癌細胞同時亦消耗MDSC以治療癌症之有用雙特異性抗體的另一個實例係抗體IC3B19。在一個實施例中，抗體IC3B18可用於導向對象之T細胞以靶向IL1RAP陽性癌細胞，同時亦消耗患有肺癌之對象的MDSC。在一個實施例中，抗體IC3B18可用於導向對象之T細胞以靶向IL1RAP陽性癌細胞，同時亦消耗患有前列腺癌之對象的MDSC。在一個實施例中，抗體IC3B19可用於導向對象之T細胞以靶向IL1RAP陽性癌 細胞，同時亦消耗患有肺癌之對象的MDSC。在一個實施例中，抗體IC3B19可用於導向對象之T細胞以靶向IL1RAP陽性癌細胞，同時亦消耗患有前列腺癌之對象的MDSC。
本文中所提供之醫藥組成物包含：a)有效量之本發明之多特異性抗體或抗體片段、及b)醫藥上可接受之載劑，其可為惰性或生理活性。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之IL1RAP×CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體、或其IL1RAP×CD3雙特異性抗原結合片段。本文中所用之用語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」包括生理相容之任何及所有溶劑、分散介質、塗層、抗菌和抗真菌劑、及類似者。合適載劑、稀釋劑及/或賦形劑之實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、及類似物之一或多者，以及上述者之任何組合。在許多情況中，較佳的是將等張劑(諸如糖、多元醇、或氯化鈉)納入該組成物中。特定而言，合適載劑之相關實例包括：(1)達爾伯克氏(Dulbecco)磷酸鹽緩衝鹽水，pH約7.4，含有或未含有約1mg/mL至25mg/mL人類血清白蛋白、(2)0.9%鹽水(0.9% w/v氯化鈉(NaCl))、及(3)5%(w/v)葡萄糖；並且亦可含有抗氧化劑諸如色胺(tryptamine)及穩定劑諸如Tween 20 ®。
本文中之組成物亦可包含視需要用於治療特定病症之額外治療劑。較佳的是，多特異性抗體或抗體片段與補充性活性化合物將具有不會互相不利影響之互補活性。在較佳實施例中，該額外治療劑係阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環黴素(anthracycline)、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。在較佳實施例中，該額外治療劑係化學治療劑。
本發明之組成物可呈各種形式。這些包括例如液體、半固體、及固體劑量形式，但較佳形式取決於預期投予模式及治療應用。典型較佳組成物係呈可注射或可輸注溶液之形式。較佳投予模式係非經腸(例如，靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮下)。在較佳實施例中，本發明之組成物係以推注(bolus)靜脈內投予或藉由在一段時間內連續輸注投予。在另一較佳實施例中，彼等係藉由肌肉內、皮下、關 節內、滑膜內、腫瘤內、腫瘤周圍、病灶內、或病灶周圍路徑來注射，以產生局部以及全身性治療效果。
用於非經腸投予之無菌組成物可藉由將本發明之抗體、抗體片段或抗體共軛物(conjugate)以所需量納入適當溶劑中，接著藉由微過濾進行滅菌來製備。在溶劑或媒劑方面，可使用水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、及類似者，以及上述者之任何組合。在許多情況中，較佳的是將等張劑(諸如糖、多元醇、或氯化鈉)納入該組成物中。這些組成物亦可含有佐劑，尤其是潤濕、等張、乳化、分散及穩定劑。用於非經腸投予之無菌組成物亦可製備為無菌固體組成物之形式，其可在使用時溶於無菌水或任何其他注射用無菌介質中。
多特異性抗體或抗體片段亦可經口投予。在經口投予之固體組成物方面，可使用錠劑、丸劑、粉劑(明膠膠囊、囊劑(sachet))、或粒劑。在這些組成物中，依據本發明之活性成分係於氬氣流下與一或多種惰性稀釋劑(諸如澱粉、纖維素、蔗糖、乳糖、或二氧化矽)混合。這些組成物亦可包含非為稀釋劑之物質，例如一或多種潤滑劑(諸如硬脂酸鎂或滑石)、著色劑、塗層(糖衣錠)或糖釉(glaze)。
在經口投予之液體組成物方面，可使用含有惰性稀釋劑(諸如水、乙醇、甘油、植物油或石蠟油)之醫藥上可接受之溶液、懸浮液、乳液、糖漿及酏劑。這些組成物可包含非為稀釋劑之物質，例如潤濕、增甜、增稠、調味或穩定用產品。
劑量取決於所欲之效果、治療持續期間及所使用之投予路徑；成人口服劑量通常介於每天5mg到1000mg，並且單位劑量含有範圍在1mg到250mg的活性物質。一般而言，醫師將會視待治療對象之年齡、體重及任何其他特定因素來判定適當劑量。
本文亦提供藉由向有彼之需要的病患投予多特異性抗體來誘導IL1RAP+細胞之細胞毒性的方法，所述多特異性抗體結合該IL1RAP並能夠募集T細胞以誘導該IL1RAP+細胞之細胞毒性(即T細胞重新導向(T cell redirection))。任何本發明之多特異性抗體或抗 體片段皆可使用在治療上。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之IL1RAP×CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體、或其IL1RAP×CD3雙特異性抗原結合片段。
在較佳實施例中，本發明之多特異性抗體或抗體片段係用於治療哺乳動物中之過度增生性病症。在更佳實施例中，以上所揭示並含有本發明之多特異性抗體或抗體片段的醫藥組成物之一者係用於治療哺乳動物中之過度增生性病症。在一實施例中，該病症係癌症。特定而言，癌症係IL1RAP表現性癌症，包括(但不限於)下列者：IL1RAP表現性血液性癌症，諸如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS，低、中、或高危)，急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)，彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)，慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(DPDCN)；及其他表現有IL1RAP但尚未被判定之癌症。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之IL1RAP×CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體、或其IL1RAP×CD3雙特異性抗原結合片段。
因此，本發明之醫藥組成物可用於治療或預防各種癌症，包括(但不限於)下列者：IL1RAP表現性癌症，包括(但不限於)下列者：IL1RAP表現性血液性癌症，諸如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS，低、中、或高危)、急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(DPDCN)；及其他表現有IL1RAP但尚未被判定之癌症。本發明之醫藥組成物亦可用於治療及預防IL1RAP表現性實體腫瘤，包括(但不限於)下列者：前列腺、乳腺、肺、結腸直腸、黑色素瘤、膀胱、腦/CNS、子宮頸、食道、胃、頭/頸、腎、肝、卵巢、胰腺、及肉瘤；及其他表現有IL1RAP但尚未被判定之實體腫瘤。
類似地，本文中進一步提供一種用於抑制所選細胞群體生長之方法，其包含在周邊血液單核細胞(PBMC)存在下，使IL1RAP 表現性目標細胞、或含有此等目標細胞之組織與有效量之本發明之多特異性抗體或抗體片段(單獨或組合其他細胞毒性劑或治療劑)接觸。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之IL1RAP×CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體、或其IL1RAP×CD3雙特異性抗原結合片段。在較佳實施例中，該額外治療劑係阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環黴素(anthracycline)、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。在較佳實施例中，該額外治療劑係化學治療劑。用於抑制所選細胞群體生長之方法可在體外、在體內、或離體(ex vivo)實施。
在體外用途之實例包括在將自體骨髓移植到同一病患之前先對其處理以殺滅染病或惡性細胞；在移植骨髓之前先對其處理，以殺滅勝任T細胞並預防移植物抗宿主疾病(graft-versus-host-disease,GVHD)；處理細胞培養，以殺滅除了未表現目標抗原之所欲變異體以外的所有細胞；或殺滅表現非所欲抗原之變異體。非臨床在體外用途之條件可由所屬技術領域中具有通常知識者所輕易判定。
臨床離體使用之實例係於自體骨髓移植治療癌症之前從骨髓移除腫瘤細胞。治療可實施如下。自病患或其他個體獲取骨髓，接著將骨髓在加入本發明之細胞毒性劑的含血清培養基中進行培養。濃度範圍係約1uM至10uM，在約37℃下進行約30分鐘至約48小時。精確濃度及培養時間條件(即劑量)可由所屬技術領域中具有通常知識者所輕易判定。在培養之後，將骨髓細胞用含血清之培養基洗滌，然後依據習知方法藉由靜脈輸液送回病患體內。在病患於收獲骨髓到重新輸回經處理細胞之間的時間內接受其他治療諸如清除性化學療法(ablative chemotherapy)或全身放射線照射的情況下，該等經處理之骨髓細胞係使用標準醫療設備冷凍儲存於液態氮中。
在臨床體內用途中，向有彼之需要的對象投予治療有效量的多特異性抗體或抗原結合片段。舉例而言，該等IL1RAP×CD3多特異性抗體及其多特異性抗原結合片段可用於治療有彼之需要的對象中的IL1RAP表現性癌症。在一些實施例中，該IL1RAP表現性癌症為血液性癌症，諸如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候 群(MDS，低、中、或高危)、急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(DPDCN)。在一些實施例中，IL1RAP表現性癌症為實體腫瘤，包括(但不限於)下列者：前列腺、乳腺、肺、結腸直腸、黑色素瘤、膀胱、腦/CNS、子宮頸、食道、胃、頭/頸、腎、肝、卵巢、胰腺、及肉瘤；及其他表現有IL1RAP但尚未被判定之腫瘤。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之IL1RAP×CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體、或其IL1RAP×CD3雙特異性抗原結合片段。在一些實施例中，該對象為哺乳動物，較佳為人類。在一些實施例中，該多特異性抗體或抗原結合片段將以已測試過無菌性之溶液形式投予。
以上治療方法及用途中之劑量方案係經調整以提供最佳之所欲反應(例如，治療反應)。舉例而言，可投予單次推注、可在一段時間內投予數次分開之劑量、或者可依治療情況之急迫性所示來按比例降低或增加劑量。非經腸組成物可配製為劑量單元形式以增進投予便利性及劑量一致性。
多特異性抗體及片段之有效劑量及劑量方案取決於待治療之疾病及病況並且可由所屬領域中具有通常知識者判定。本發明化合物之治療有效量的例示性、非限定範圍係約0.001至10mg/kg，諸如約0.001至5mg/kg，例如約0.001至2mg/kg，諸如約0.001至1mg/kg，例如約0.001、約0.01、約0.1、約1或約10mg/kg。
所屬技術領域中具有通常知識之醫師或獸醫師可輕易判定並處方所需之醫藥組成物的有效量。舉例而言，醫師或獸醫師可從低於欲達所欲治療效果所需的該醫藥組成物中所採用之多特異性抗體或片段的劑量水準開始，然後逐漸增加劑量直到達到所欲效果。一般而言，本發明之雙特異性抗體之合適每日劑量將為該化合物有效產生治療效果之最低劑量的量。投予可為例如非經腸，諸如靜脈內、肌肉內或皮下。在一個實施例中，多特異性抗體或片段可依mg/m2計算之每周劑量來輸液投予。此等劑量可基於例如以上提供之mg/kg劑量， 並且依據下式：劑量(mg/kg)×70：1.8提供。此投予可重複例如1至8次，諸如3至5次。該投予可藉由在2至24小時(諸如2至12小時)期間內連續輸注來執行。在一個實施例中，多特異性抗體或片段可藉由在長期間(諸如超過24小時)內緩慢連續輸注來投予，以降低毒性副作用。
在一個實施例中，多特異性抗體或片段可以每周劑量投予，該每周劑量經計算為至多給予八次之固定劑量，諸如當每周給予一次時給予四至六次。此方案可視需要例如在六個月或十二個月之後重複一或多次。此等固定劑量可基於例如以上所提供之mg/kg劑量，並且體重估計為70kg。劑量可藉由測量本發明之雙特異性抗體經投予後在血液中的量來判定或調整，其係藉由例如採集生物樣本並使用靶向本發明之多特異性抗體之IL1RAP抗原結合區的抗遺傳型抗體(anti-idiotypic antibody)來測量。
在一個實施例中，多特異性抗體或片段可藉由維持療法來投予，諸如，例如，一周一次進行六個月或更長的期間。
多特異性抗體或片段亦可預防性投予以降低發展癌症之風險、延緩癌症進展事件之開始發生、及/或當癌症處於緩解時降低復發之風險。
如本文中所述之多特異性抗體及其片段亦可以組合療法來投予，即與所欲治療之疾病或病況的其他相關治療劑組合。因此，在一個實施例中，含抗體之藥劑係與一或多種額外治療劑(諸如化學治療劑)組合。在一些實施例中，該其他治療劑係阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環黴素(anthracycline)、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。此組合式投予可為同時、分開、或依序(以任何順序)進行。針對同時投予，該等劑可作為一個組成物或作為分開之組成物(視情況而定)投予。
在一個實施例中，提供一種用於治療涉及對象中之表現IL1RAP細胞的病症之方法，該方法包含向有彼之需要的對象投予治療有效量的多特異性抗體或片段(諸如本文中所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體)及進行放射性療法。在一個實施例中，提供一種用於 治療或預防癌症之方法，該方法包含向有彼之需要的對象投予治療有效量的多特異性抗體或片段(諸如本文中所述之IL1RAP×CD3抗體)，以及進行放射性療法。放射性療法可包含放射線照射或者提供給病患相關聯之放射性藥品投予。放射線源可位於受治療病患外部或內部(放射線治療例如可為體外放射治療(external beam radiation therapy,EBRT)或近程放射治療(brachytherapy,BT)之形式)。可用於實施此等方法之放射性元素包括例如鐳、銫-137、銥-192、鋂-241、金-198、鈷-57、銅-67、鎝-99、碘-123、碘-131、及銦-111。
套組
本文中亦提供者係套組，其例如包含所述多特異性抗體或其抗原結合片段及該抗體或片段對於特定細胞類型之細胞毒性的使用說明。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之IL1RAP×CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳係如本文中所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體、或其IL1RAP×CD3雙特異性抗原結合片段。該等說明可包括對於在體外、在體內、或離體使用該多特異性抗體或其抗原結合片段之用法說明。
典型而言，套組將具有內含多特異性抗體或其抗原結合片段之隔間。該多特異性抗體或其抗原結合片段可呈凍乾形式、液體形式、或其他可經修改以被包括在套組中之形式。套組亦可含有實施該套組中之說明上描述之方法所需的額外元件，諸如用於重組凍乾粉劑之滅菌溶液、在向病患投予前用於與該多特異性抗體或其抗原結合片段組合之額外劑、及協助向病患投予該多特異性抗體或其抗原結合片段之工具。
診斷用途
本文中所述之多特異性抗體及片段亦可用於診斷目的。因此，亦提供包含如本文中所定義之多特異性抗體或片段的診斷組成物、及其用途。在較佳實施例中，該多特異性抗體係如本文中所述之IL1RAP×CD3多特異性抗體、或其多特異性抗原結合片段，且更佳 係如本文中所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體、或其IL1RAP×CD3雙特異性抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種用於診斷癌症之套組，其包含含有雙特異性IL1RAP×CD3抗體之容器、及一或多種用於偵測該抗體對於IL1RAP之結合的試劑。試劑可包括例如螢光標籤、酶標籤、或其他可偵測標籤。該等試劑亦可包括用於酶反應之二級或三級抗體或試劑，其中該等酶反應產生可視覺化之產物。舉例而言，本文中所述之多特異性抗體、或其抗原結合片段可用放射性標記、螢光標記、表位標籤、生物素、發色基(chromophore)標記、ECL標記、酶、釕、111In-DOTA、111In-二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶及β-半乳糖苷酶、或多-組胺酸或所屬領域中所習知之類似此等標記來加以標示。
所述申請標的之例示性實施例
為了更佳且更完全地描述本文中之申請標的，此節提供所示之申請標的之列舉例示性實施例。
列舉實施例：
1.一種特異性結合至IL1RAP的重組抗體或其抗原結合片段，其包含：a.具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列的重鏈CDR3；b.具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈CDR3；c.具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈CDR3；d.具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：21之胺 基酸序列的重鏈CDR3；e.具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：24之胺基酸序列的重鏈CDR3；f.具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈CDR3；g.具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的重鏈CDR3；h.具有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：32之胺基酸序列的重鏈CDR3；i.具有SEQ ID NO：33之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：34之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：35之胺基酸序列的重鏈CDR3；j.具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：34之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：36之胺基酸序列的重鏈CDR3；k.具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：37之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：38之胺基酸序列的重鏈CDR3；或l.具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列的重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列的重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：39之胺基酸序列的重鏈CDR3。
2.如實施例1之抗體或其抗原結合片段，其中a.包含具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：40之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：41之胺基酸序 列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的輕鏈CDR3；b.包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：14之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：43之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：44之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：45之胺基酸序列的輕鏈CDR3；c.包含具有SEQ ID NO：16之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：103之胺基酸序列的輕鏈CDR3；d.包含具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：49之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：50之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR3；e.包含具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：24之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：52之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈CDR3；f.包含具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：55之胺基酸序 列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：56之胺基酸序列的輕鏈CDR3；g.包含具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：28之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：55之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：56之胺基酸序列的輕鏈CDR3；h.包含具有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：32之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：57之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR3；i.包含具有SEQ ID NO：33之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：34之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：35之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列的輕鏈CDR3；j.包含具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：34之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：36之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：47之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列的輕鏈CDR3；k.包含具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：37之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：38之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：47之胺基酸序 列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：48之胺基酸序列的輕鏈CDR3；l.包含具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：49之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：50之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：61之胺基酸序列的輕鏈CDR3；m.包含具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：24之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：62之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：63之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：64之胺基酸序列的輕鏈CDR3；n.包含具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：24之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：62之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：63之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：65之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或o.包含具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列的該重鏈CDR1、具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列的該重鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：39之胺基酸序列的該重鏈CDR3之該抗體進一步包含具有SEQ ID NO：66之胺基酸序列的輕鏈CDR1、具有SEQ ID NO：50之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及具有SEQ ID NO：67之胺基酸序列的輕鏈CDR3。
3.如實施例1之抗體或抗原結合片段，其中(a)之抗體包含SEQ ID NO：68中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：69中所示之輕鏈序列；(b)之抗體包含SEQ ID NO：70中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：71中所示之輕鏈序列；(c)之抗體包含SEQ ID NO：72中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：73中所示之輕鏈序列；(d)之抗體包含SEQ ID NO：74中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：75中所示之輕鏈序列；(e)之抗體包含SEQ ID NO：76中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：77中所示之輕鏈序列；(f)之抗體包含SEQ ID NO：78中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：79中所示之輕鏈序列；(g)之抗體包含SEQ ID NO：80中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：79中所示之輕鏈序列；(h)之抗體包含SEQ ID NO：81中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：82中所示之輕鏈序列；(i)之抗體包含SEQ ID NO：83中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：84中所示之輕鏈序列；(j)之抗體包含SEQ ID NO：85中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：84中所示之輕鏈序列；(k)之抗體包含SEQ ID NO：86中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：84中所示之輕鏈序列；(l)之抗體包含SEQ ID NO：74中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：87中所示之輕鏈序列；(m)之抗體包含SEQ ID NO：76中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：88中所示之輕鏈序列；(n)之抗體包含SEQ ID NO：76中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：89中所示之輕鏈序列；或(o)之抗體包含SEQ ID NO：90中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：91中所示之輕鏈序列。
4.如實施例1至3中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至人類IL1RAP之胞外域。
5.如實施例1至4中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體 或抗原結合片段係人類抗體或抗原結合片段。
6.如實施例1至5中任一者之抗原結合片段，其中該抗原結合片段係Fab片段、Fab2片段、或單鏈抗體。
7.如實施例1至6中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以小於約50nM之KD特異性結合IL1RAP，如由表面電漿共振所測得者。
8.如實施例1至7中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。
9.如實施例1至8中任一者之抗體或抗原結合片段，其係IgG1或IgG4同型。
10.如實施例9之抗體，其中該IgG1在其Fc區中具有K409R取代。
11.如實施例9之抗體，其中該IgG1在其Fc區中具有F405L取代。
12.如實施例9之抗體，其中該IgG4在其Fc區中具有F405L取代及R409K取代。
13.如實施例10至12中任一者之抗體，其進一步在其Fc區中包含S228P取代、L234A取代、及L235A取代。
14.如實施例1至13中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合人類IL1RAP並與食蟹獼猴(cynomolgus monkey)IL1RAP交叉反應。
15.一種重組細胞，其表現如實施例1至14中任一者之抗體或抗原結合片段。
16.如實施例15之細胞，其中該細胞係融合瘤或轉染瘤(transfectoma)。
17.如實施例15之細胞，其中該抗體係經重組生產。
18.一種重組IL1RAP×CD3雙特異性抗體，其包含：a)第一重鏈(HC1)；b)第二重鏈(HC2)；c)第一輕鏈(LC1)；及 d)第二輕鏈(LC2)，其中該HC1及該LC1配對形成特異性結合CD3之第一抗原結合部位，且該HC2及該LC2配對形成特異性結合IL1RAP之第二抗原結合部位，或其IL1RAP×CD3雙特異性結合片段。
19.如實施例18之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。
20.如實施例19及20中任一者之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段係IgG1或IgG4同型。
21.如實施例18至20中任一者之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC1包含SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：94，且LC1包含SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：95。
22.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：68，且LC2包含SEQ ID NO：69。
23.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：70，且LC2包含SEQ ID NO：71。
24.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：72，且LC2包含SEQ ID NO：73。
25.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：74，且LC2包含SEQ ID NO：75。
26.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：76，且LC2包含SEQ ID NO：77。
27.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：78，且LC2包含SEQ ID NO：79。
28.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：80，且LC2包含SEQ ID NO：79。
29.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：81，且LC2包含SEQ ID NO：82。
30.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片 段，其中HC2包含SEQ ID NO：83，且LC2包含SEQ ID NO：84。
31.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：84，且LC2包含SEQ ID NO：84。
32.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：86，且LC2包含SEQ ID NO：84。
33.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：74，且LC2包含SEQ ID NO：87。
34.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：76，且LC2包含SEQ ID NO：88。
35.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：76，且LC2包含SEQ ID NO：89。
36.如實施例21之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC2包含SEQ ID NO：90，且LC2包含SEQ ID NO：91。
37.如實施例18至36之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段以小於約30nM之KD特異性結合IL1RAP，如由表面電漿共振所測得者。
38.如實施例18至37之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或其雙特異性結合片段結合選自由以下所組成之群組之細胞表面上的IL1RAP：人類急性骨髓性白血病細胞、人類肺癌細胞、人類結腸癌細胞、人類胰腺癌細胞、人類骨髓發育不良症候群癌細胞、人類慢性骨髓性白血病、人類彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞、人類急性淋巴母細胞性白血病細胞、及人類T細胞白血病/淋巴瘤細胞。
39.如實施例18至38之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段在高於6.7nM之濃度下抑制IL-1β媒介之透過AP-1及NF-κB反應元件的傳訊。
40.如實施例18至39之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段在體外以小於約1.3nM的EC50誘導IL1RAP表現性細胞的T細胞依賴性細胞毒性。
41.一種重組IL1RAP×CD3雙特異性抗體或其IL1RAP×CD3雙 特異性結合片段，其包含：a)第一重鏈(HC1)；b)第二重鏈(HC2)；c)第一輕鏈(LC1)；及d)第二輕鏈(LC2)，其中該HC1及該LC1配對形成特異性結合CD3之第一抗原結合部位，且包含如SEQ ID NO：96中所描寫之重鏈CDR1(HCDR1)、如SEQ ID NO：102中所描寫之HCDR2、如SEQ ID NO：98中所描寫之HCDR3、如SEQ ID NO：99中所描寫之輕鏈CDR1(LCDR1)、如SEQ ID NO：100中所描寫之LCDR2、及如SEQ ID NO：101中所描寫之LCDR3；且該HC2及該LC2配對形成特異性結合IL1RAP之第二抗原結合部位，且包含如SEQ ID NO：16或22中所描寫之重鏈CDR1(HCDR1)、如SEQ ID NO：17或23中所描寫之HCDR2、如SEQ ID NO：18或24中所描寫之HCDR3、如SEQ ID NO：46或62中所描寫之輕鏈CDR1(LCDR1)、如SEQ ID NO：47或63中所描寫之LCDR2、及如SEQ ID NO：103或64中所描寫之LCDR3。
42.一種重組細胞，其表現如實施例18至41中任一者之抗體或雙特異性結合片段。
43.如實施例42之細胞，其中該細胞係融合瘤。
44.如實施例42之細胞，其中該抗體或雙特異性結合片段係經重組生產。
45.一種用於治療患有癌症之對象之方法，該方法包含：向有彼之需要的病患投予治療有效量的如實施例18至41中任一者之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段達一段足以治療該癌症的時間。
46.一種用於抑制癌細胞生長或增生之方法，該方法包含：投予治療有效量的如實施例16至39中任一者之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段以抑制癌細胞之生長或增生。
47.一種將T細胞重新導向至IL1RAP表現性癌細胞之方法，該方法包含：投予治療有效量的如實施例18至41中任一者之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段以將T細胞重新導向至癌症。
48.如實施方式47之方法，其中該癌症係IL1RAP表現性癌症。
49.如實施例48之方法，其中該IL1RAP表現性癌症係急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS，低或高危)、急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(DPDCN)、T細胞白血病/淋巴瘤、前列腺癌、肺癌、結腸直腸癌、或胰腺癌。
50.如實施例45之方法，其進一步包含投予第二治療劑。
51.如實施例50之方法，其中該第二治療劑係化學治療劑或標靶抗癌療法。
52.如實施例51之方法，其中該化學治療劑係阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環黴素(anthracycline)、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。
53.如實施例52之方法，其中該第二治療劑係與該雙特異性抗體同時、依序、或分開投予至該對象。
54.一種醫藥組成物，其包含如實施例18至41中任一者之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段及醫藥上可接受之載劑。
55.一種用於藉由培養如實施例42至45中任一者之細胞來產生如實施例18至41中任一者之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段的方法。
56.一種單離合成性多核苷酸，其編碼如實施例18至41中任一者之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段的該HC1、該HC2、該LC1、或該LC2。
57.一種套組，其包含如實施例18至41中任一者之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段及其使用說明。
58.一種抑制對象之血管生成之方法，該方法包含：向有彼之需要的對象投予如實施例18至41中任一者之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段。
59.如實施例58之方法，其中該對象患有癌症。
60.如實施例59之方法，其中該癌症具有一種或多種實體腫瘤。
59.如實施例59或60之方法，其中該癌症係IL1RAP表現性癌症。
60.如實施例59或60之方法，其中該癌症並非IL1RAP表現性癌症。
61.一種消耗對象之MDSC之方法，該方法包含：向有彼之需要的對象投予如實施例18至41中任一者之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段。
62.如實施例58之方法，其中該對象患有癌症。
63.如實施例59之方法，其中該癌症具有一種或多種實體腫瘤。
64.如實施例59或60之方法，其中該癌症係IL1RAP表現性癌症。
65.如實施例59或60之方法，其中該癌症並非IL1RAP表現性癌症。
實例
下列實例係提供用來增補前述揭示及提供對於本文中所述之申請標的之更佳理解。不應將這些實例視為限制所述之申請標的。應瞭解本文中所述之實例及實施例僅用於說明性之目的，並且根據該等實例及實施例之各式修飾或變化將為所屬領域中具有通常知識者所顯而易知且應被納入本發明之真實範疇內，而且在不偏離本發明之真實範疇下可作出這些修飾或變化。
實例1：材料 產生可溶性IL1RAP ECD蛋白質
將人類(h)IL1RAP同型1(SEQ ID NO：1)、hIL1RAP同型2(SEQ ID NO：2及3)、及食蟹獼猴(cyno)IL1RAP(SEQ ID NO：4)之胞外域(ECD)表現並純化用於結合及親和力測量。使用基因合成技術(美國專利第6,670,127號；美國專利第6,521,427號)製備編碼各個蛋白質之cDNA，並使用標準分子生物學技術製備用於表現之質體。此外，各個ECD蛋白在N-或C-端具有6x-His標籤以便於純化。若需要，具有N-末端6x-His標籤之建構體亦包括用於移除標籤之HRV3C切割部位。所有IL1RAP ECD蛋白係用於結合及親和力測量及表位(epitope mapping)。
此外，亦自Sino Biologicals，Inc.獲得重組hIL1RAP ECD-His標籤蛋白(Lot # MB06NOO704)(SEQ ID NO：5)，用於噬菌體淘選及篩選。在使用前針對內毒素來測試蛋白質。亦將此材料用於結合及親和力測量。
該可溶性IL1RAP ECD蛋白質係使用SureLink Biotinylation Kit(KPL #86-00-01)依製造商說明來生物素化。使蛋白質在SDS/PAGE上運行以確認單體狀態。
產生IL1RAP細胞系
展示人類IL1RAP ECD(SEQ ID NO：6)、食蟹獼猴IL1RAP ECD(SEQ ID NO：7)、小鼠IL1RAP ECD(SEQ ID NO：8)、及大鼠IL1RAP ECD(SEQ ID NO：9)之pDisplayTM載體集合用作篩選工具以評估抗IL1RAP前導(anti-IL1RAP lead)。使用允許蛋白質呈現在細胞表面上之哺乳動物表現載體pDisplay(Invitrogen)(圖1)。表現自pDisplayTM之蛋白質的N端係融合至鼠Ig κ-鏈前導序列，該前導序列引導該蛋白質至分泌途徑，且C端融合至血小板衍生生長因子受體(PDGFR)跨膜域，該跨膜域將該蛋白質錨定至細胞膜，使其呈現在胞外側。表現自pDisplayTM之重組蛋白質含有血球凝集素A及myc表位以供流式細胞術、西方墨點、及/或免疫螢光法偵測。CMV啟動子驅動序列之表現。
使用標準方法將載體轉染至HEK-293F細胞中。將轉染 之HEK-293F貼附細胞(adherent cell)在穩定質體整合之選擇培養基中培養，然後分選或單離單一細胞，並藉由FACS使用BangsLabsQuantumTM Simply Cellular®抗小鼠IgG(目錄#815,Bangs Laboratories,Inc)或BD BioSciences PE藻紅蛋白螢光定量套組(cat# 340495)來定量IL1RAP表面受體表現。針對各細胞系選出10個單一細胞殖株之一集合以用於篩選，並針對IL1RAP ECD表現加以定量。用於後續命中篩選(hit screening)之細胞系具有每細胞約500,000個IL1RAP ECD拷貝(copy)的表面表現。
實例2：使用噬菌體呈現技術產生IL1RAP抗體
重新(de novo)人類Fab-pIX庫[Shi,L.等人J Mol Biol,2010.397(2)：p.385-396.WO 2009/085462](由VH1-69、3-23、及5-51重鏈庫配對Vk1-39、3-11、3-20、及4-1輕鏈庫所組成)之溶液淘選係如所述使用生物素化抗原-鏈親和素(streptavidin)磁珠捕獲法在後續四輪中執行(Rothe等人，J.Mol.Biol.376：1182-1200,2008；Steidl等人，Mol.Immunol.46：135-144,2008)。
在第四輪淘選後隨即將該pIX基因自噬菌體質體DNA切下以產生可溶性經his標記之Fab編碼區。Fab在大腸桿菌(E.coli)中表現並在ELISA中針對與IL1RAP之結合來進行篩選。簡言之，96孔Nunc Maxisorp盤(Nunc #437111)係在4℃下經PBS中之1μg/mL綿羊抗人類Fd(結合部位#PC075)塗覆過夜。使含有該Fab表現載體之細菌殖株在深孔培養盤中於450μL的2xYT(卡本西林(Carbenecillin))中生長直到呈混濁(OD6000.6)。藉由加入IPTG達1mM的濃度來誘導Fab表現。使培養物在30℃下生長過夜，然後藉由離心使其澄清。將經抗Fd塗覆之Maxisorp盤用TBS,0.5% Tween-20(Sigma #79039-10PAK)洗滌一次，並在室溫下用每孔200μL PBS-Tween(0.5%)+脫脂乾燥奶(3%)阻斷一小時。在此步驟及所有後續步驟中，孔盤用TBS,0.5% Tween-20(Sigma #79039-10PAK)洗滌三次。各孔接受50μL的Fab上清液，接著在室溫下進行一小時培養。在洗滌之後，將50uL的生物素化IL1RAP加入，然後在室溫下培養 一小時。在洗滌之後，將50μL的Streptavidin：HRP(Pierce #21130)以1：5000稀釋加入，然後在室溫下培養孔盤一小時。洗滌孔盤，然後將50uL化學發光基質PoD(Roche # 121-5829500001)依據製造商說明加入。接著在EnVision(Perkin Elmer)孔盤分析儀上讀取孔盤以獲得發光值。呈現超過背景值>5倍之訊號的孔認為是命中(hit)。
對表露與IL1RAP結合之抗體在重(HC)及輕鏈(LC)可變域進行定序。經由噬菌體淘選識別出總共52個獨特Fab序列，並且最終45個藉由融合選殖(in-fusion cloning)轉換為IgG1同型。融合選殖係藉由使用PCR SuperMix High Fidelity套組(Life Technologies # 10790-020)來PCR擴增HC及LC可變區，並使用In-Fusion® HD Cloning Plus套組(Clontech # 638909)將HC選殖至vDR149之Esp3I部位且將LC選殖至vDR157之Esp3I部位。
實例3：單離人類IL1RAP單株抗體表現性融合瘤
使用人類免疫球蛋白基因轉殖大鼠品系(OmniRat ®；OMT,Inc.)以發展人類IL1RAP單株抗體表現性融合瘤細胞。OmniRat®含有一嵌合人類/大鼠IgH基因座(包含22個人類VH、所有呈天然構型的人類D及JH區段，該等區段係連接至大鼠CH基因座)再加上完整的人類IgL基因座(12個Vκ連接到Jκ-Cκ及16個Vλ連接到Jλ-Cλ)。(見例如Osborn等人(2013)J Immunol 190(4)：1481-1490)。因此，該等大鼠展現降低表現之大鼠IgM或κ，且所引入的人類重鏈及輕鏈轉殖基因響應於免疫會經歷類別轉換(class switching)及體細胞突變，以產生高親和力人類IgG單株抗體。OmniRat®的製備及使用，以及這些大鼠所攜帶的基因體修飾係由Bruggemann等人敘述於PCT公開號WO 14/093908中。
當用重組人類BIL1RAP(rhIL1RAP)免疫時，這些基因轉殖大鼠生產對人類IL1RAP有特異性之人類IgG抗體。
如下進行兩種免疫方案：對於第一種方案，用rhuIL1RAP來免疫四隻大鼠。在35天免疫方案之後，收穫來自大鼠10344之脾臟及淋巴結，並用於生產融合瘤。經由結合ELISA篩選76 個96孔盤的融合瘤上清液，其中選擇76個融合瘤上清液。類似地，對於第二種方案，用rhuIL1RAP來免疫四隻大鼠。在77天免疫方案之後，收穫來自大鼠10428、10424、及10600之淋巴結，並用於生產融合瘤。藉由ELISA篩選24個96孔盤的融合瘤上清液以識別展現出與rhuIL1RAP結合之mAb。在進一步驗證篩選後，對來自兩個篩選之展現出與rhuIL1RAP及食蟹獼猴IL1RAP(rcynoIL1RAP)特異性結合的融合瘤上清液進行定序、選殖並以小規模表現。
實例4：MSD細胞與IL1RAP之結合
使用MSD(Mesoscale Discovery)細胞結合測定來評估IL1RAP抗體與工程改造pDisplay細胞(IL1RAP表現性HEK-293F細胞)之結合。該篩選測定之目的在於識別出結合至表現hIL1RAP之細胞的抗體，以及與表現食蟹獼猴IL1RAP之細胞有交叉反應性的抗體。
細胞係經固定化，且IL1RAP抗體樣本係經三重複測定。簡言之，將經純化IL1RAP抗體表現上清液正規化至10μg/mL。將每孔5000個細胞接種至384孔盤(MA6000,cat.L21XB,MSD)中，並讓其貼附2小時。然後將細胞用20% FBS於PBS中(Gibco)阻斷15分鐘。然後將抗體上清液加入，留置在室溫下1小時。將細胞用PBS洗滌三次，然後將2μg/mL之經釕標示之二級抗體(Mesoscale Discovery)加入，並在室溫下培養1小時。然後再次洗滌，然後將每孔35μL的2X MSD讀取緩衝液T(無界面活性劑)加入，並培養5至30分鐘以供偵測。然後使用Sector Imager 2400(MSD)讀取孔盤。將數據相對於對照組正規化，並使用GraphPad Prism Version 5繪圖。具有比親系細胞系背景大3倍之訊號的陽性結合體判定為命中。重複該測定以確認數據一致性，並且選出前幾名結合體以進行進一步發展。
實例5：以SPR測量親和力。 ProteOn親和力測量
52種抗IL1RAP候選者[來自噬菌體淘選之38種mAb、來自融合瘤集合1之11種mAb、及經生產以消除序列不利條件之三種突變體(IAPB63、IAPB64、及IAPB65係)]對於重組人類IL1RAP ECD之親和力係使用ProteOn XPR36蛋白質交互作用陣列系統(BioRad)藉由表面電漿共振(SPR)測量。
測量各變異體的IL1RAP ECD締合及解離速率。生物感測器表面係使用製造商針對胺偶合化學之說明藉由將山羊抗人類IgG(Fc)共價偶合至GLC晶片(BioRad)之表面來製備。將約8800RU(反應單元(response unit))的山羊抗人類IgG(Fc)抗體(Jackson ImmunoResearch laboratories Prod # 109-005-098)固定化。所固定化之RU亦包括山羊抗小鼠Fc抗體，其加入係用來捕獲未包括於此處所報導抗體之其他抗體。因為混合物為1：1，約50%的這些所固定化RU預期會是山羊抗人類Fc。動力學實驗係在25℃下於運行緩衝液(PBS pH 7.4,0.005% P20,3mM EDTA)中執行。在運行緩衝液中製備人類IL1RAP ECD的4倍(1：3)連續稀釋液(以400nM起始)。感測器晶片的各通道上捕獲平均300RU的mAb(174至600)。將不含所捕獲之候選者的參考點(經山羊抗人類IgG(Fc)修飾表面)用作為參考表面。在捕獲mAb之後以40μL/min進行3分鐘的抗原注射(締合相)，接著進行10分鐘的緩衝液流(解離相)。晶片表面係藉由注射0.85%磷酸(在100μL/min下)來再生。數據係在儀器軟體上處理。數據的雙參考減法係藉由從分析物注射之已扣除參考之曲線減去由緩衝液注射所產生的曲線來進行。數據的動力學分析係使用1：1 Langmuir結合模型搭配群適配(group fit)來執行。各mAb之結果係以Ka(kon或結合速率)、Kd(koff或解離速率)、KD(平衡解離常數)之格式來報導(表3)。
噬菌體命中之結果示於表4中。所有38種mAb與人類IL1RAP ECD結合，且具有親和力範圍自1.19至30.4nM(表3)。觀察到10個mAb(以星號標識)與1：1結合模型之擬合(fitting)較差，且它們的Chi2值大於20% Rmax。結果表明良好重現性(基於陽性對照抗體MAB676，n=4)。對於高達400nM(所測試之最高濃 度)之陰性對照(MAB002、CNTO9412、及模擬轉染)，未觀察到結合。此表明與人類IL1RAP ECD結合之抗體係特異性的。
融合瘤命中之結果示於表4中。結果指示11種抗體中的5種以0.16至49.9nM範圍內之親和力與人類IL1RAP ECD結合(表4)。陽性對照(MAB676)運行兩次，且顯示出良好重現性。如所預期的，陰性對照(MAB002及CNTO7967)直到400nM(所測試之最高濃度)不顯示結合。
表5顯示經生產以消除序列不利條件之三種突變抗體的數據。評估突變體並將與其與親系抗體進行比較。結果表明僅變異體IAPB63(具有LC突變C91A之IAPB54)保留了與親系小於2倍不同的結合親和力。值得注意的是，純化及未純化親系IAPB4(噬菌體命中B4)之親和力彼此在2倍以內(表5：4.73nM之於表3：5.66nM)。相比之下，親系抗體IAPB54(具有人類IgG4-PAA之17B04，表5)顯示比17B04(具有大鼠IgG1之融合瘤命中，表4)更緊密的結合。差異可能是由於物種及同型。
實施例6：中和測定
使用來自Invivogen(cat# hkb-ilb)之HEK-BlueTM IL-1β細胞以評估IL1RAP抗體之促效劑或拮抗劑活性。根據製造商：「HEK-BlueTM IL-1β細胞允許藉由監測NF-κB及AP-1途徑之活化來偵測生物活性IL-1β。」「它們係衍生自HEK-BlueTM TNF-α/IL-1β細胞，其中TNF-α反應已被阻斷。因此，HEK-BlueTM IL-1β細胞特異性地對於IL-1β作出響應。它們表現NF-κB/AP-1-誘導型SEAP報導基因。IL-1β與其在HEK-BlueTM IL-1β細胞表面上之受體IL-1R的結 合觸發促使NF-κB活化及隨後SEAP之生產的傳訊級聯。」所有抗體上清液以10μg/mL之最終濃度單獨或在1ng/mL重組人類IL-1β之存在下篩選。
噬菌體命中之評估結果顯示於圖2中。在HEK-BlueTM NFκB報導細胞系中分析噬菌體上清液之促效劑(無IL-1β)或拮抗劑活性(在IL-1β之存在下)。在分析的上清液中，沒有一個呈現促效劑活性。然而，IAPB54及IAPB57(融合瘤上清液)在重組人類IL-1β之存在下呈現拮抗劑活性。
實例7：命中評價及選擇
發現與食蟹獼猴交叉反應並經由Proteon評估具有可測量親和力的所有噬菌體及融合瘤命中被收集在一起。從該列表中，基於它們的特徵及它們僅與靈長動物而不是與小鼠或大鼠之交叉反應性選擇六個候選者(在表6中以灰色突出顯示)。亦包括顯示拮抗性活性的兩種融合瘤命中(在表6中以灰色突出顯示)。由於序列不利條件，未選擇IAPB4及IAPB54；然而，製造這些親系之突變體用於進一步分析。突變體IAPB63及IAPB64係IAPB54之突變體，而IAPB65係IAPB4之突變體。此外，有用於調查額外生物學問題之替代分子的潛在需求。因此，亦選擇額外四種靈長動物/鼠類交叉反應性抗體用於測試(在表6中以灰色突出顯示)。
因此，出於製造小規模IL1RAP×CD3雙特異性小組之目的，將總共一小組15種IL1RAP親系(來自融合瘤篩選之5種命中及來自噬菌體淘選之8種命中)以及三種突變體(IAPB63、IAPB64、IAPB65)-全部描寫於表7中-表現並純化。
15種IL1RAP mAb之VH及VL係顯示於下表8中。
實例8：抗IL1RAP Fab之晶體結構
一種抗IL1RAP抗體(IAPB57)之晶體結構係以游離Fab形式以及當結合至人類IL1RAP ECD時判定，以表徵抗體/抗原交互作用的原子細節、增加我們對抗體作用機制的認識、及支持任何所需的抗體工程努力。
材料
經His標誌之IAPB57 Fab在HEK293細胞中表現，並使用親和力及粒徑排阻層析法純化。將Fab接收於50mM NaCl、20mM Tris(pH 7.4)中。
帶有C端His標籤的人類IL1RAP胞外區(成熟同型1、2、及4之殘基1-348；以下簡稱為IL1RAP)係使用桿狀病毒系統表現並藉由親和力及粒徑排阻層析法純化。將蛋白接收於50mM NaCl、20mM Tris(pH 8)中。
結晶 IL1RAP/IAPB57 Fab複合物
該Fab/抗原複合體係藉由將IL1RAP與IAPB57 Fab以1.2：1的莫耳比(過量的IL1RAP)在4℃混合23小時來製備，同時將緩衝液置換為20mM Mes(pH 6)。然後將該複合體自monoS 5/50管柱以16至19mM NaCl(於20mM Mes pH 6中)的梯度沖提，並濃縮至25mg/mL。適用於X射線繞射之晶體係在20℃下使用坐滴蒸汽擴散法自3.5M甲酸鈉、0.1M Tris(pH 8.5)獲得。
IAPB57 Fab
將IAPB57 Fab濃縮至14mg/mL並不再進一步純化。適用於X射線繞射之晶體係在20℃下使用坐滴蒸汽擴散法自25% PEG 3kDa、0.2M(NH4)2SO4、0.1M Mes(pH 6.5)獲得。
X射線數據收集及結構判定
關於X射線數據收集，將晶體在含有對應母液並用20%甘油增補的冷凍保護液中浸泡幾秒鐘，然後在液態氮中急速冷凍。在Argonne National Laboratory之Advanced Photon Source(APS)的束線22-ID下使用Rayonix 300HS CCD偵測器來收集X射線繞射數據。繞射數據係用程式HKL(Otwinowski,Z.& Minor,W.(1997).Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.Methods in Enzymology 276：307-326)處理。
藉由用Phaser進行分子置換(MR)來解析結構(Read,R.J.(2001).Pushing the boundaries of molecular replacement with maximum likelihood.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 57：1373-82)。就游離Fab結構而言，MR的搜尋模型(search model)係IMC-11F8 Fab(PDB碼：3B2U)。就IL1RAP/Fab複合物而言，MR的搜尋模型係IL1RAP之晶體結構(PDB碼：4DEP)及IAPB57游離Fab結構。用PHENIX精修結構(Adams,P.D.,Gopal,K.,Grosse-Kunstleve,R.W.,Hung,L.W.,Ioerger,T.R.,McCoy,A.J.,Moriarty,N.W.,Pai,R.K.,Read,R.J.,Romo,T.D.,Sacchettini,J.C.,Sauter,N.K.,Storoni,L.C.& Terwilliger,T.C.(2004).Recent developments in the PHENIX software for automated crystallographic structure determination.J Synchrotron Radiat 11：53-5)，並使用COOT進行模型調整(Emsley P.& Cowtan,K.(2004).Coot：Model building tools for molecular graphics.Acta Crystallogr.D60：2126-2132)。所有其他結晶學計算皆用CCP4程式套組(Collaborative Computational Project Number 4,1994)來執行。所有分子圖形都是用PyMol(DeLano,W.(2002).The PyMOL molecular graphics system.Palo Alto,CA,USA；Delano Scientific)產生的。
IAPB57游離Fab結構及複合體兩者的統計數據係顯示於表9中。
表位、互補位、及交互作用
IAPB57識別由IL1RAP的D2(殘基I131、E132、及L183-S185)及D3(殘基N219、V224、H226、Y249、S283-R286、及D289-T291)免疫球蛋白樣域中之殘基所組成的構形表位，如圖3及4所示。IAPB57表位包含在IL1RAP上之約780Å2的區域。大多數抗體接觸係與IL1RAP之D3域；然而，許多氫鍵交互作用涉及D2(圖3)，此強化IAPB57對於IL1RAP的親和力。精胺酸286係關鍵表位殘基，且其插入由IAPB57輕鏈及重鏈殘基(V91L、N92L、Y94L、L96L、E100H、及Y107H)所內襯之袋部(pocket)中。其他普 遍表位殘基係Y249及H284，其在IL1RAP β薄層之相對端，並與重鏈CDR具有廣泛凡得瓦及氫鍵交互作用。
IAPB57互補位係由除了CDR-L1及-L2以外的所有CDR殘基構成(圖3及4)。重鏈具有比輕鏈多5倍的IL1RAP接觸。重鏈CDR裝填在IL1RAP之凸表面上，其中CDR-H2 β-鏈(S58-D60殘基)與D2殘基交互作用，而CDR-H2環區(Y54-T56殘基)結合D3。CDR-H3僅結合D3域(S283R286殘基範圍)，而CDR-H1及-L3結合D2及D3兩者。
IL1RAP基因之選擇性剪接導致編碼膜結合同型(membrane-bound isoform)1及4及可溶性同型2及3的轉錄變異體。膜結合同型1及4之胞外區在序列上不同於分泌的同型2及3(圖3)。胞外差異係位於D3域及連接至跨膜域之連結區(linker region)。六個IAPB57表位殘基(H284、S285、R286、D289、E290、及T291)係位於同型3獨特區內。因此，預期IAPB57以類似親和力結合至同型1、2、4且由於抗體與同型3之間的氫鍵交互作用之喪失，以較低親和力結合至同型3。具體而言，在IAPB57/同型3複合體中，R286-Y94L、R286-V91L、D289-Y54H、及T291-T33H氫鍵可能被破壞。
實例9：製備具有IgG4 S228P、L234A、L235A之雙特異性格式之IL1RAP及CD3抗體
15種單特異性IL1RAP抗體(參見表6)係經表現為IgG4，具有Fc取代S228P、L234A、及L235A或S228P、L234A、L235A、F405L、及R409K(CD3臂)(根據EU索引編號)。亦產生包含VH及VL區之單特異性抗CD3抗體CD3B220，其具有SEQ ID NO：92之VH及SEQ ID NO：93之VL，和具有S228P、L234A、L235A、F405L、及R409K取代之IgG4恆定區。
該等單特異性抗體係使用標準方法利用Protein A管柱(HiTrap MabSelect SuRe管柱)純化。在沖提之後，將儲集物透析至D-PBS,pH 7.2。
雙特異性IL1RAP×CD3抗體係藉由在體外Fab臂交換中組合單特異性CD3 mAb及單特異性IL1RAP mAb而產生(如WO2011/131746中所述)。簡言之，將1至20mg/mL之1.08：1莫耳比的抗IL1RAP/抗CD3抗體在PBS、pH 7至7.4、及75mM 2-巰乙醇胺(2-MEA)中混合在一起，並在25至37℃下培養2至6小時，接著使用標準方法經由透析、滲濾(diafiltration)、切向流過濾及/或旋轉細胞過濾來移除2-MEA。
IL1RAP×CD3雙特異性Ab之重鏈及輕鏈係顯示於下表10。
實例10.對IL1RAP×CD3雙特異性抗體之抗IL1RAP親和力判定
使用表面電漿共振(SPR)來測量15種IL1RAP×CD3雙特異性Ab對人類及食蟹獼猴IL1RAP的親和力值。所遵循之規程與實例5所述者類似。結果指示這些IL1RAP×CD3雙特異性Ab對人類IL1RAP ECD具有34pM至29.7nM之結合親和力(表11)，對食蟹獼猴IL1RAP ECD具有86pM至27.8nM的結合親和力(表12)。然而，一種分子，IC3B3，顯示對於人類及食蟹獼猴IL1RAP ECD之 弱結合。將所有良好結合體之人類與食蟹獼猴之親和力比較顯示它們在彼此5倍範圍內結合(表13)。
實例11：競爭分級測定：
該測定允許評估15種所生產之IL1RAP×CD3雙特異性Ab的小組，該等抗體個別地充當小組中其餘抗體之捕獲及偵測試劑。彼此形成有效捕獲/偵測試劑的抗體理論上識別單體蛋白上之空間分離表位，從而允許兩種抗體同時結合至目標蛋白。假設在整個小組中展現出類似活性模式之抗體群組結合至類似表位。因此，選擇來自不同群組之殖株應提供識別不同表位之抗體。
雙特異性Ab係直接固定在GLC感測器(BioRad)。將競爭樣本(300nM)與30nM的hIL1RAP-ECD預培養4小時，之後注射在晶片表面上歷時5分鐘以允許締合。然後監測解離5分鐘。分組至級別1及2中之大多數分子及群組成員彼此不競爭(參見表14)。此指示它們的結合表位沒有重疊。級別3具有兩個成員，而級別4至7各自具有一個成員。文氏圖(Venn diagram)顯示表位群組之競爭概況的摘要(圖5)。若表位群組相交，則抗體競爭。否則，它們不競爭人 類IL1RAP。應當注意，在此得出之結論大多來自與感測器上之集合1(B1、B3、B6、B9、B12、B13)的競爭，其由於強結合親和力而給出清楚的結果。由於弱結合親和力，來自感測器上之集合2(B2、B4、B8、B10、B11、B15)的競爭係弱得多，級別7來自該集合。
實例12：在功能性細胞殺滅測定中評價雙特異性抗體
T細胞媒介之細胞毒性測定係一種功能性測定，使用來自健康捐贈者之T細胞來評價IL1RAP×CD3雙特異性抗體的細胞溶解作用。
遵循Laszlo等人之規程(Laszlo,G.等人2014 BLOOD 123：4,554-561)。簡言之，效應細胞係經收獲、計數、洗滌、並在RPMI(10% FBS)細胞培養基中再懸浮至1×106細胞/ml。將目標細胞(MV4-11、SKNO-1、及OCI-AML5)用CFSE(Invitrogen #C34554)標示，並在具有10% FBS(Invitrogen #10082-147)之RPMI(Invitrogen #61870-036)中再懸浮至2×105細胞/mL。將效應細胞及經CFSE標示之目標細胞以效應細胞對目標細胞(E：T)比=5：1混合於無菌96孔圓底盤中。將5μL等分之各雙特異性抗體加至各孔(含有各種不同濃度)。將培養物在37℃、5% CO2下培養48小時。在48小時之後，將LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain緩衝液(life technologies Cat# L10119)加至樣本中，並將培養物在暗處在室溫(RT)下培養20分鐘、洗滌，及再懸浮於170μL FACS緩衝液中。藥物誘導之細胞毒性係使用CANTO II流動式細胞測量儀(BD Biosciences)來 判定，並用FlowJo軟體或Dive軟體(BD Biosciences)來分析。所關注之群為雙陽性CFSE+/活/死+細胞(double positive CFSE+/live/dead+cell)。
顯示在37℃、5% CO2下培養48小時後，一種AML細胞系(MV4-11；圖6)之T細胞媒介細胞溶解的結果。
除了IAPB61及IAPB25之外，當與抗CD3抗體組合成雙特異性形式時，所有IL1RAP抗體在三種不同T細胞供體中在48小時誘發IL1RAP+MV4-11細胞之T細胞重新導向細胞毒性。表14總結用IL1RAP×CD3多特異性抗體所產生之EC50值。
實例13：IL1RAP×CD3雙特異性Ab之生化特徵的摘要
收集來自細胞之細胞毒性及生化測定之結果(表15)。總共四種雙特異性抗體：IC3B1、IC3B13、IC3B3、及IC3B12具有理想特徵，包括僅人類/食蟹獼猴結合體。選擇跨越三個不同的表位級別，除IC3B1外，全部具有在子nM範圍內之IL1RAP親和力。此外，四種雙特異性Ab中的兩種以抗體形式顯示中和功能。
a假定與IPAB54親系具有相同功能活性。 b值係兩次測量之平均值。
因此，具有Fc取代S228P、L234A、及L235A(根據EU索引編號)、表現為IgG4的這些IAPB47、IAPB55、IAPB63、及IAP57與抗CD3抗體CD3B219配對，該抗CD3抗體包含VH及VL區(具有SEQ ID NO：94之VH及SEQ ID NO：95之VL)以及具有S228P、L234A、L235A、F405L、及R409K取代的IgG4恆定區。
與實例9類似，雙特異性IL1RAP×CD3抗體係藉由在體外Fab臂交換中組合CD3B219 mAb及單特異性IL1RAP mAb而產生(如WO2011/131746中所述)。
IL1RAP×CD3雙特異性Ab之重鏈及輕鏈係顯示於下表16。
實施例14：藉由IC3B18及IC3B19之IL1傳訊
評估IL1RAP×CD3雙特異性抗體的任何促效劑或拮抗劑活性。在不存在或存在0.1ng/mL重組人類(rh)IL-1β的情況下，來自InvivoGen的HEK-BlueTMIL-1β細胞與100μg/mL之濃度(10倍稀釋)下的抗體培養。「HEK-BlueTM IL-1β細胞允許藉由監測NF-κB及AP-1途徑之活化來偵測生物活性IL-1β。它們係衍生自HEK-BlueTM TNF-α/IL-1β細胞，其中TNF-α反應已被阻斷。因此，HEK-BlueTM IL-1β細胞特異性地對於IL-1β作出響應。它們表現NF-κB/AP-1-誘導型分泌型胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)報導基因。IL-1β與其在HEK-BlueTM IL-1β細胞表面上之受體IL-1R的結合觸發促使NF-κB活化及隨後SEAP之生產的傳訊級聯。」
在1ng/mL rhIL-1β的存在下，IC3B18及IC3B19以及它們各自的IL1RAP空臂對照IAPB100(IAPB63×B23B49)及IAPB101(IAPB57×B23B49)在24小時抑制NF-κB報導活性。CD3 空臂對照CNTO 7008(B23B39×CD3B219)在任何測試濃度下都沒有拮抗性活性(圖7A)。當在不存在rhIL-1β的情況下測試時，IC3B18、IC3B19、各自的IL1RAP空臂對照IAPB100及IAPB101、及CD3空臂對照CNTO 7008幾乎沒有促效劑活性(圖7B)。此外，IC3B16及空臂對照IAPB99在任何測試濃度下都沒有拮抗性活性。
實例15：在功能細胞的細胞毒性測定中評價IC3B18及IC3B19
使用IL1RAP陽性表現AML細胞系(MOLM-13、MV4-11、SKNO-1、及OCI-AML-5)及IL1RAP陰性/低表現彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞系(SU-DHL-10)評價IC3B18及IC3B19的T細胞媒介之細胞毒性。遵循先前在實例12中描述之規程。
以全T細胞供體M7287作為代表(圖8及圖9)，其為所評估的五個全T細胞供體之一。IC3B18及IC3B19均誘導IL1RAP+AML細胞系Molm-13、MV4-11、SKNO-1、OCI-AML5之T細胞媒介細胞毒性，但在IL1RAP陰性/低表現B細胞淋巴瘤系SU-DHL-10中不誘導T細胞媒介細胞毒性。對照抗體(CNTO 7008、IAPB100、及IAPB101)沒有總體T細胞媒介之腫瘤細胞的細胞毒性。
實施例16：IC3B18及IC3B19之離體細胞毒性
離體自體單核球細胞毒性測定
先前，正常人類單核球(CD14+)顯示在細胞表面上具有IL1RAP之表現(Jarasa,M等人(2010)PNAS.107：16280-16285)。為了評估IC3B18及IC3B19之細胞毒性潛力，使用5：1效應(T細胞)：目標(單核球)比之單離自體(相同供體)CD3+T細胞及CD14+單核球+Fc阻斷劑，以降低分子之潛在非特異性Fc結合。圖10中之數據顯示IC3B18及IC3B19在48小時後特異性殺滅IL1RAP+單核球(描寫為CD14+細胞毒性%)，但空臂對照幾乎沒有細胞毒性；數據代表用四個個別正常人類血液供體進行的兩個實驗。
離體全血SKNO-1細胞毒性測定
為了進一步評估在存在生理水準之可溶性IL1RAP的情況下IC3B18及IC3B19之細胞毒性潛力，利用使用具有外源添加IL1RAP+ AML細胞系SKNO-1之正常健康人類全血的離體細胞毒性測定。圖11中之數據指示IC3B18及IC3B19在24及48小時皆特異性誘導SKNO-1細胞之細胞毒性。此外，自24至48小時，細胞毒性以及EC50(nM)值增加。空臂對照CNTO 7008(空×CD3)用作陰性雙特異性抗體對照。空臂對照幾乎沒有顯示出SKNO-1細胞之細胞毒性活性。對這些分子運行總共使用七個不同正常健康人供體的兩次獨立研究。圖11中之數據顯示在48小時後，IC3B18及IC3B19在體外特異性殺滅IL1RAP+細胞系(描寫為細胞毒性的%；數據代表用不同T細胞供體進行的五次實驗)。各個細胞系及供體之EC50值係顯示在表17中。
在AML初級樣本中，離體IC3B18及IC3B19媒介之母細胞降低及T細胞活化
為了評估IC3B18及IC3B19之細胞毒性潛力，使用AML供體全血進行離體細胞毒性測定(圖12)。在該測定中，將各種雙特異性抗體加至來自AML供體之稀釋全血中歷時24小時不提供額 外T細胞，因為該測定仰賴於供體血液中自體T細胞之存在。藉由在雙特異性抗體存在下定量級分中之IL1RAP+細胞來判定細胞毒性之程度，並將其表現為細胞毒性%。藉由CD69之表現(顯示)來評價T細胞活化。
如圖12所顯示，IC3B18及IC3B19促進在24小時後與T細胞活化相關的總細胞毒性之劑量依賴性降低。空臂對照抗體未能顯示腫瘤細胞之細胞毒性或T細胞活化。該結果亦顯示IC3B18及IC3B19抗體皆在自體環境中起作用。該實驗亦用另一AML供體樣本進行。僅分析IC3B19及空臂對照抗體之24及48小時IL1RAP+細胞毒性，並顯示~40%最大細胞毒性，且在24及48小時確實導致CD25及CD69上調(數據未顯示)。
離體全血OCI-AML5細胞毒性
亦在相同離體全血分析中測試OCI-AML5細胞系。圖13顯示在48小時後，IC3B19在體外特異性殺滅IL1RAP+ OCI-AML5細胞(描寫為細胞毒性的%；數據代表用不同T細胞供體進行的五次實驗)。細胞毒性之平均EC50值(圖13A)為3.132nM，且活化(圖13B)為5.993nM。空臂對照CNTO 7008(空×CD3)及IAPB101(IL1RAP×空)作為陰性對照抗體來使用，且幾乎不顯示細胞毒性活性。對這些分子運行總共十五種不同正常健康人類供體(ELN ref：IL1RAP×CD3雙特異性-00425)。這些數據顯示當將IC3B19加至含有外源OCI-AML5細胞之全血中時，IC3B19能夠活化並重新導向T細胞以誘導細胞毒性。
實例17：IL1RAP之實驗交叉反應性評價
實例4中所描述之MSD細胞結合測定係用於評估IL1RAP結合。篩選測定之目的係在於表徵與HEK-293F親系對照相比，IC3B18及IC3B19是否特異性結合至表現HEK-293F人類(殖株HE2)及食蟹獼猴(殖株CB8)細胞系的IL1RAP全長(FL)胞外域 (ECD)之細胞系。HEK-293F小鼠(殖株5)及大鼠(殖株1)細胞系之使用亦用於識別物種交叉反應性。
自結合研究之結果顯示在圖13中。IC3B18及IC3B19、以及IL1RAP空臂對照IAPB100(IAPB63×B23B49)及IAPB101(IAPB57×B23B49)特異性結合至HEK-293F人類殖株HE2及食蟹獼猴殖株CB8 IL1RAP FL-ECD細胞系。抗MYC陽性對照抗體偵測各個細胞系上建構體之表現。CD3空臂CNTO 7008(B23B39×CD3B219)及I3CB15(人類IgG4-PAA空臂同型對照)具有低結合表現。僅在所測定之最高濃度下觀察到IC3B18及IC3B19與HEK-293F親系、小鼠殖株5、及大鼠殖株1之背景結合。
實例18：IC3B19在PBMC人化NSG小鼠中之OCI-AML5人類AML異種移植物之腫瘤發生預防中的抗腫瘤功效
該研究評價IC3B19在預防PBMC人化NSG小鼠中之OCI-AML5人類AML異種移植物之腫瘤發生中的功效。各別向小鼠靜脈內注射200μL體積之PBS中的1×107人類PBMC。在第7天，在背側脇部向小鼠皮下植入OCI-AML5人類AML細胞(在200μL PBS中之10×106個細胞)，接著大約每隔一天靜脈內投予PBS或IC3B19，共五個劑量。在人類效應細胞的存在下，有0.5mg/kg之IC3B19活性，如在第18天及第21天與PBS處理相比的統計學顯著腫瘤生長抑制所示(p<0.0001)(圖14)。
實例19：IC3B19在PBMC人化NSG小鼠中之MOLM-13人類AML異種移植物之腫瘤發生預防中的抗腫瘤功效
該研究評價IC3B19在預防PBMC人化NSG小鼠中之MOLM-13人類AML異種移植物之腫瘤發生中的功效。各別向小鼠靜脈內注射200μL PBS中的1×107人類PBMC。在第7天，在背側脇部向小鼠皮下植入MOLM-13人類AML細胞(在200μL PBS中之1×106個細胞)，接著大約每隔一天靜脈內投予PBS或IC3B19，共五個劑量。在人類效應細胞的存在下，有0.05mg/kg及0.5mg/kg之 IC3B19活性，如在第8天(分別為p<0.0001、p<0.0001、及p<0.0001)及第12天(分別為p<0.0001、p<0.0001、及p<0.0001)與PBS處理相比的統計學顯著腫瘤生長抑制所示(圖15)。
實例20：IC3B18及IC3B19在PBMC人化NSG小鼠中之MOLM-13人類AML異種移植物之腫瘤發生預防中的抗腫瘤功效
該研究評價IC3B18及IC3B19在預防PBMC人化NSG小鼠中之MOLM-13人類AML異種移植物之腫瘤發生中的功效。各別向小鼠靜脈內注射200μL PBS中的1×107人類PBMC。在第7天，在背側脇部向小鼠皮下植入MOLM-13人類AML細胞(在200μL PBS中之1×106個細胞)，接著大約每隔一天靜脈內投予PBS、IC3B18、或IC3B19，共五個劑量。在人類效應細胞的存在下，有0.05mg/kg及0.5mg/kg之IC3B19活性，如在第18天(分別為p<0.0001、p<0.0001)及第21天(分別為p<0.0001、p<0.0001)與PBS處理相比的統計學顯著腫瘤生長抑制所示。此外，在人類效應細胞存在下，有0.5mg/kg及0.05mg/kg之IC3B18活性，如在第14天(分別為p<0.05、p<0.05)、第18天(分別為p<0.0001、p<0.0001)、及第21天(分別為p<0.0001、p<0.0001)與PBS處理相比的統計學顯著腫瘤生長抑制所示(圖16)。
實例21：將第28天與第31天開始之治療比較，IC3B19在PBMC人化NSG中之OCI-AML5人類AML異種移植物中的抗腫瘤功效
該研究評價IC3B19在建立雌性NSG小鼠中之OCI-AML5人類AML異種移植物中的功效。在背側協部各別向小鼠皮下植入OCI-AML5人類AML細胞(在200μL PBS中之10×106細胞)。動物在第28天以93.7mm3之平均體積按照腫瘤體積來隨機化，並靜脈內接受PBMC注射。在第28天，大約每隔一天以PBS或IC3B19向五個群組靜脈內給藥，共五個劑量。此外，在第35天，大約每隔一天以IC3B19向兩個群組靜脈內給藥，共五個劑量。在PBMC注射(第28天)的同一天經0.5mg/kg IC3B19給藥之動物與 在第45天PBS處理相比具有顯著腫瘤生長抑制(p<0.0001)。此外，在PBMC注射後三天(第31天)經0.5mg/kg IC3B19給藥之動物與在第41天(p<0.0001)及第45天(p<0.0001)PBS處理相比具有顯著腫瘤生長抑制(圖17)。
實例22：將第31天與第35天開始之治療比較，IC3B18及IC3B19在PBMC人化NSG小鼠中之OCI-AML19人類AML異種移植物中的抗腫瘤功效
該研究評價IC3B19在建立雌性NSG小鼠中之OCI-AML5人類AML異種移植物中的功效。在背側脇部各別向小鼠皮下植入OCI-AML5人類AML細胞(在200μL PBS中之10×106細胞)。動物在第28天以111.5mm3之平均體積按照腫瘤體積來隨機化，並靜脈內接受PBMC注射。在第31天，大約每隔一天以PBS、IC3B18、或IC3B19向七個群組靜脈內給藥，共五個劑量。此外，在第35天，大約每隔一天以IC3B18或IC3B19向四個群組靜脈內給藥，共五個劑量。與PBS處理相比，在人類效應細胞的存在下IC3B18沒有活性，與在第31天或第35天開始的給藥無關。在人類效應細胞的存在下，在第35天開始給藥，有0.5mg/kg之IC3B19活性，如在第46天與PBS相比的統計學顯著腫瘤生長抑制所示(p<0.0001)。另外，在人類效應細胞的存在下，在第35天開始給藥，有1mg/kg之IC3B19活性，如在第42天(p<0.05)及第46天(p<0.0001)與PBS處理相比的統計學顯著腫瘤生長抑制所示。此外，在人類效應細胞的存在下，在第31天開始給藥，有1mg/kg之IC3B19活性，如在第46天與PBS處理相比的統計學顯著腫瘤生長抑制所示(p<0.01)(圖18)。
實例23：IC3B19在PBMC人化NSG小鼠中之SKNO-1人類AML異種移植物中的抗腫瘤功效
該研究評價IC3B19在建立雌性NSG小鼠中之SKO-1人類AML異種移植物中的功效。在第0天，在背側脇部兩邊經套管 針植入各別向小鼠皮下植入SKNO-1腫瘤片段。動物在第50天以135.0mm3之平均體積按照腫瘤體積來隨機化，並靜脈內接受PBMC注射。在第57天，PBMC注射後7天，大約每隔一天以IC3B19向動物靜脈內給藥，共五個劑量。在第67天(p<0.05)及第71天(p<0.001)時，與在人類效應細胞存在下的PBS處理相比，0.5mg/kg之IC3B19導致統計學顯著腫瘤生長抑制(圖19)。
實例23：Fc配體結合測定
相對於野生型hIgG1、hIgG4 PAA同型、及一批相關IgG4 PAA親系(二價)及空臂(單價)對照抗體，針對IC3B18及IC3B19測量與人類Fc配體FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、及FcRn之結合競爭。使用AlphaScreenTM測定(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay(ALPHA),PerkinElmer,Wellesley,Mass.)，基於珠之發光親近測定(luminescent proximity assay)進行測量。供體珠之雷射激發激發氧，若該氧足夠接近受體珠，則產生化學發光事件之級聯，最終促使在520至620nm下的螢光發射。藉由用於附著於鏈親和素供體珠之標準方法將對照抗體生物素化，並將GST標記之FcγR及FcRn與麩胱甘肽螯合受體珠結合。在不存在競爭的情況下，該IL1RAP×CD3雙特異性抗體、對照或野生型抗體、及該人類Fc配體在520至620nm下交互作用並產出訊號。
對於FcγRI、IC3B18、及IC3B19不比hIgG4 PAA同型對照更具競爭性(圖20A)。對於FcγRIIa、IC3B18、及IC3B19不比hIgG4 PAA同型對照更具競爭性(圖20B)。對於FcγRIIb、IC3B18、及IC3B19不比hIgG4 PAA同型對照更具競爭性(圖20C)。對於FcγRIIIa、IC3B18、及IC3B19不比hIgG4 PAA同型對照更具競爭性(圖20D)。IC3B18及IC3B19與hIgG1 WT及hIgG4 PAA同型一樣有效地結合FcRn(圖20E)。總而言之，IC3B18及IC3B19在與匹配IgG4 PAA同型基本相同的程度上結合所測試的所有Fc受體。應當注意，對於FcγRIIa及FcγRIIb，IC3B18及IC3B19之競爭性顯著地小於CD3B219親系及CD3B219×B21M(空臂)Ab (圖20B及20C)。對於FcγRIIa及FcγRIIb，IL1RAP×CD3雙特異性抗體之競爭性亦顯著地小於兩種IL1RAP×B21M(空臂)抗體(圖20B及20C)。
實例24：IC3B19在T細胞人化NSG小鼠中之SKNO-1人類AML異種移植物中的功效
在用20×106個在體外擴增並活化之人類T細胞腹膜內人化的雌性NSG小鼠中，在建立的SKNO-1人類AML異種移植物中評價IC3B19之功效。在第35、37、39、41、43、46、48、50、53、及55天，以0.5或1mg/kg之IC3B19或PBS對照給藥q2d-q3d，總共10個劑量。在腫瘤植入後第60天，即所有治療組中八隻動物中的至少六隻餘留的最後日期，計算腫瘤生長抑制(%TGI)。在兩個治療組中，在0.5或1mg/kg之IC3B19觀察到統計學上顯著的腫瘤生長抑制(100% TGI)，與PBS處理的對照相比，在第63天除了一隻動物以外，全部觀察到完全或部分消退(p<0.001，圖21)。到第81天，在0.5mg/kg治療組中6/8個腫瘤完全消退，且在1mg/kg治療組中7/8個腫瘤完全消退。
實例25：IC3B19在T細胞人化NSG小鼠中之散播性MOLM-13螢光素酶人類AML模型中的功效
在雌性NSG小鼠中之螢光素酶轉染散播性MOLM-13人類AML模型中評價IC3B19的功效，該等小鼠用20×106個在體外活化並擴增之人類T細胞來腹膜內人化並藉由活動物生物發光成像來隨機化。在第4、8、11、14、17、21、24、28、31、35、及38天，以0.05、0.5、或1mg/kg之IC3B19或1mg/kg之CD3×空對照CNTO 7008進行之治療係腹膜內給予q3d-q4d，總共11個劑量。在腫瘤植入後第46天，即由於GvHD相關發病率而使動物安樂死之前的最後日期，計算增加的壽命(%ILS)。與CD3×空對照抗體相比，0.05、0.5、及1mg/kg之IC3B19分別具有199%、138%、及>138%的統計學顯著壽命增加(分別為p<0.0001、p=0.0003、p<0.0001，圖 22)。用CNTO 7008對照處理之小鼠中的MOLM-13螢光素酶細胞侵蝕到後肢及脊柱，在第16天最終後肢癱瘓或發病。此外，IC3B19 0.5mg/kg治療組中的兩隻動物由於後肢癱瘓或發病而在第16天安樂死或發現死亡。用IC3B19處理之小鼠藉由生物發光在第12天及第14天在脊柱及後肢中顯示降低的腫瘤負荷。在第46天，各個IC3B19治療組(0.05、0.5、1mg/kg)中之三隻動物藉由生物發光評估為無腫瘤。
實例26：實體腫瘤中IL1RAP之RNA表現
在此研究中，在廣泛範圍之腫瘤類型(n=14)中評價IL1RAP之RNA表現的分佈，並將各個腫瘤之RNA表現與來自Cancer Genome Anatomy(TCGA,http：//cancergenome.nih.gov/)中可取得之數據的匹配正常樣本進行比較。進行此研究以評估哪些實體腫瘤類型具有升高之IL1RAP表現，以幫助識別哪些病患可受益於IL1RAP抑制。
TCGA RNA-Seq
使用由omicsoft(www.omicsoft.com)所提供之內部知識庫(Oncoland,TCGA_B37)查詢TCGA項目中之RNASeq研究的數據。衍生數據係使用OSA比對器1藉由Omicsoft預先編譯，並使用基因組參考庫Human.B37.3及基因模型「OmicsoftGene20130723」透過RPKM正規化判定RNA定量。藉由比較衍生自TCGA中相同病患子集之腫瘤與相鄰正常組織來評價RNA-Seq輸出。
分析程序
評估具有可用於實體腫瘤中腫瘤及正常組織之數據的十四種適應症(indication)。
ID 類型
ESCA 食道癌
BLCA 膀胱癌
KIRP 乳頭狀腎癌
UCEC 子宮癌
STAD 胃癌
COAD 結腸癌
HNSC 頭及頸癌
LUSC 肺鱗狀細胞癌
PRAD 前列腺癌
THCA 未分化型甲狀腺癌
LUAD 肺腺癌
KIRC 腎透明細胞癌
BRCA 乳癌
PAAD 胰腺癌
在Oncoland中查詢IL1RAP，並將相對於鄰近正常之具有更高表現的腫瘤數目製表並計算頻率估計。當表現值大於匹配正常樣本中之最高表現值時，計數具有升高表現之樣本。亦針對各種腫瘤類型產生用於視覺評價正規化(FPKM)RNA分佈的盒狀圖。
有五種腫瘤類型經識別具有明顯升高表現，其亦具有足夠數量的可用於比較目的之匹配正常樣本(>10)(表18及圖23)。相對於正常具有升高表現之腫瘤類型包括食道癌(28%)、膀胱癌(26%)、結腸癌(72%)、肺鱗狀細胞癌(29%)、及未分化型甲狀腺癌(70%)。
實例26：實體腫瘤細胞系表面上IL1RAP受體的定量
來自實例26之RNA Seq數據顯示在實體腫瘤中IL1RAP RNA之存在。為了探究IL1RAP×CD3作為實體腫瘤療法之可能性，將多種癌症腫瘤細胞類型針對IL1RAP表面表現及其在基於凋亡細胞之測定中被殺滅的能力來加以定量。
根據ATCC條件培養肺、前列腺、胰腺、及結腸細胞系，並生長至70至85%長滿(confluence)。在適當的情況下用非酶促解離緩衝液(Invitrogen,Cat# 13151-004)解離癌細胞系，並在DPBS-/-(Invitrogen,Cat#141902-250)中洗滌。將細胞計數並再懸浮於DPBS-/-中達3*10^6個細胞/mL之濃度，並將100μL接種到各個孔中。在室溫下將LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain緩衝液(Invitrogen,Cat#10082-147)加至樣本中25分鐘。樣本在200uL流式細胞術染色緩衝液(BD Pharmigen,Cat##554657)中洗滌，在室溫下用FC塊(Accurate Chemical,NB309)阻斷15分鐘，並在4℃下在流式細胞術染色緩衝液中用5μg/mL同型對照(R&D Systems,Cat# IC002P)或IL1RAP(R&D Systems,Cat#FAB676P)染色45分鐘。在BD FACS CANTO IITM上評價染色細胞。在Flow Jo V_10中使用單株/活細胞/細胞群體計算幾何平均值(Geomean)比。使用QuantumTM Simply Cellular®系統(Bang’s Laboratories,Cat#815)及BD相對線性標度校準曲線巨集(BD Relative Linear Scale Calibration Plot macro)來計算受體密度。各個細胞系之IL1RAP受體密度係總結在表19中，其顯示實體腫瘤中之廣泛範圍的表面表現。
表19：各個細胞系之IL1RAP受體密度
實例27：細胞凋亡測定中IL1RAP×CD3雙特異性抗體的評價
根據ATCC條件培養肺、前列腺、胰腺、及結腸細胞系，並生長至70至85%長滿。在適當的情況下用非酶促解離緩衝液(Life Technologies,Cat#13151-014)解離目標細胞，並在PBS中洗滌。將細胞計數並再懸浮於特定的完全無酚紅培養基中達0.4*10^6細胞/mL。將目標細胞分配至無菌96孔盤(50μL/孔)中，並允許在37℃及5% CO2下培養過夜。隔天，計數來自健康供體(Biological Specialties，供體#M7412、LS-11-53108、#M6807、LS-11-53847A、或M7267，批號LS-11-53072B)之全T細胞，並以1.0*10^6細胞/mL接種在完全無酚紅培養基(100uL/孔)中，其含有500X之Essen Bioscience’s IncuCyteTM凋亡蛋白酶-3/7試劑 (Cat#4440)。將不同濃度之IC3B19(IAPB57×CD3219)及對照抗體[CNTO 7008(B23B39×CD3B219)及IAPB101(IAPB57×B23B49])加至適當的孔中。使盤在室溫下平衡20分鐘，並置於維持在37℃及5% CO2的IncuCyteTM成像器中高達120小時。在72小時，使用總綠色物體面積(μm2/孔)度量對細胞凋亡進行定量，其中T細胞在IncuCyteTM成像器處理定義內按照大小來排除。在Graphpad Prism 6.02中以72小時之各濃度下的原始值來計算曲線下面積。繪製濃度響應曲線，並使用具有可變斜率函數之非線性迴歸計算來計算IC3B19之EC50值。若95%信賴區間<對數1.5，則EC50值係有效的。IC3B19刺激T細胞導向之細胞凋亡反應，其特徵在於在所測試之大多數實體腫瘤細胞系中凋亡蛋白酶活性增加。對照抗體(CNTO7008及IAPB101)不產出可測量的細胞凋亡反應。隨著IC3B19的添加，H520不產出可測量的細胞凋亡反應，標識為「無擬合(No Fit)」(NF)。細胞凋亡測定之結果總結在表20中。代表圖顯示在圖24中。
使用三種健康T細胞供體；供體#M7412、LS-11-53108、及#M6807、LS-11-53847A、及M7267，批號LS-11-53072B當Prism不返回值(例如「不明確(ambiguous)」)或者擬合被判定為差(對數EC 50之95%CI範圍>對數1.5)時，使用NF=無擬合ND=未判定
總而言之，IL1RAP在多種實體腫瘤細胞系之表面上表現，包括肺、結腸、胰腺、及前列腺細胞系。IC3B19刺激T細胞導向之細胞凋亡反應，其特徵在於這些IL1RAP陽性實體腫瘤細胞系中凋亡蛋白酶活性增加，但在作為IL1RAP陰性細胞系之H520中未增加。
實例28.血液性惡性細胞系上之IL1RAP受體密度水準：
為了理解IL1RAP細胞表面表現，分析226種血液性細胞系之IL1RAP細胞表面受體密度水準。利用市售可得之藻紅蛋白(PE)標示抗IL1RAP單株抗體(R&D Systems,cat# FAB676P)，利用兩種不同方法判定受體密度水準。使用PE標示珠(BD Biosciences,QuantiBRITE,cat# 340768)或抗小鼠捕獲珠(Bang’s Laboratories,Simply Cellular,cat# 815)用來捕獲市售可得之PE標示抗IL1RAP抗體以產生標準曲線。計算測試的所有細胞系之IL1RAP幾何平均值(geomean)表現，並減去同型(R&D Systems,cat# IC002P)值。自兩種方法之標準曲線產生受體密度水準。不能外推或在偵測限以下的值係標為未判定(ND)。這些數據顯示大多數血液性細胞系以不同水準在細胞表面上表現IL1RAP(表21)。在所列示之疾病適應症中，急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)B細胞、及T細胞急性淋巴母細胞性白血病及T細胞白血病在疾病適應症中係具有相對升高的IL1RAP受體密度水準。
表21：藉由PE標示珠(QuantiBRITE)或抗小鼠捕獲珠(Bangs Labs)定量之各個細胞系的IL1RAP受體密度
實例29. IC3B19在使用CML、DLBCL、T-ALL、及T細胞白血病細胞系之功能細胞的細胞毒性測定中之評價
在額外血液性適應症中測試IC3B19及對照抗體(CNTO 7008及IAPB101)。慢性骨髓性白血病(CML)目標細胞(LAMA-84、MEG-01、及KYO-1)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)目標細胞(SU-DHL-16、U-2940、SU-DHL-6)、及T急性淋巴母細胞性白血病(ALL)及T細胞白血病/淋巴瘤目標細胞(ALL-SIL、CEM/C1、HPB-ALL、Jurkat、及SUP-T1)用三個健康對照全CD3+T細胞供體進行測試。遵循先前在實例12中描述之規程。
示出3個健康對照全CD3+T細胞之平均值(圖26至28)。IC3B19誘導CML、T-ALL/T細胞白血病/淋巴瘤、及DLBCL細胞系中的細胞毒性以及T細胞媒介之活化(CD25)。所觀察到之最大細胞毒性及對應的EC50(nM)係顯示在表22中。這些數據顯示IL1RAP×CD3在CML、T-ALL/T細胞白血病/淋巴瘤、及DLBCL適應症中具有活性，但對照抗體(CNTO 7008及IAPB101)沒有總體T細胞媒介之腫瘤細胞的細胞毒性。
實例30. IC3B19在T細胞人化NSG小鼠中之H1975人類非小細胞肺癌異種移植物中的功效
在用20×106個在體外擴增並活化之人類T細胞腹膜內人化的雌性NSG小鼠中，在建立的H1975人類非小細胞肺癌異種移植物中評價IC3B19之功效。在腫瘤植入後第13天，將小鼠隨機以腫瘤體積分組，各組十隻動物，平均腫瘤體積為74mm3。在第14、17、20、23、27、30、35、及38天，每週兩次以0.5、1、或2.5mg/kg之IC3B19或1mg/kg之CNTO 7008(CD3×空對照)腹膜內給藥，總共8個劑量。在腫瘤植入後第30天，即所有治療組中十隻動物中的至少九隻餘留的最後日期，計算腫瘤生長抑制(%TGI)。與CNTO 7008處理對照相比，在1mg/kg及2.5mg/kg之IC3B19下，觀察到分別具有80%及90%TGI之統計學顯著腫瘤生長抑制(p<0.0001，圖29)。經2.5mg/kg之IC3B19治療在第30天導致4/10小鼠的腫瘤停滯或消退。
實例31.以IC3B19靶向IL1RAP + 骨髓衍生抑制細胞(MDSC)
Treg及MDSC在肺及前列腺腫瘤微環境中之擴增係癌細胞逃避宿主免疫監視並可將反應限於檢查點抑制劑(checkpoint inhibitor)的機制之一部分(Peterson 2006；Dasanu 2012；Srivastava 2012,Idorn等人2014)。IL1RAP係允許涉及促發炎及先天免疫響應之細胞介素傳訊的IL-1細胞介素家族(IL-1/IL-1R、IL-33/ST2、及IL-36/IL-1RL2)成員之輔助蛋白。雖然IL1RAP在正常組織及正常細胞中表現較差，但已在來自肺及前列腺癌供體全血之骨髓衍生抑制細胞上偵測到高水準之IL1RAP表面表現。雖然生物學尚未完全瞭解， 但IL1RAP、IL-1、及IL-33可藉由抑制(suppress)免疫攻擊及促進血管生成來增強腫瘤存活/生長。因為在液體及實體腫瘤類型之病患中缺乏持久之結果，故開發IC3B19，其重新導向免疫系統以殺滅IL1RAP陽性腫瘤細胞及腫瘤衍生MDSC。因此，假設IC3B19對此免疫抑制群體之消耗可促使實體腫瘤中臨床反應的改善。
為了測試此假設，遵循MDSC供體血液消耗離體測定。簡言之，將血液樣本用RPMI(10%FBS+1%青黴素/鏈黴素)以1：1稀釋。此用作在MDSC上之目標表現(受體密度/細胞)的基線百分比。該MDSC小組係由以下所組成：L/D、LIN-(CD3/CD56/CD19/)、HLA-DR-低、CD11b+、CD33+、CD14、CD15：在MDSC上之目標表現：PE IL1-RAP上。將樣本用上述小組染色，並在4℃下培養30分鐘。使用RBC裂解緩衝液(ebioscience cat#00-4300-54)來裂解RBC，在室溫下覆蓋5分鐘，並以1500rpm離心4分鐘以移除緩衝液。用緩衝液進行裂解至少4次。用DPBS(Invitrogen,Cat#141902-250)洗滌樣本，用Near IR L/D染料(Invitrogen,Cat#10082-147)染色，並在室溫下覆蓋10至15分鐘。用PBS/FACS進行最終洗滌，並將樣本再懸浮於FACS緩衝液中以用於在Fortessa上分析。使用單株/活細胞/細胞群體，在Flow Jo V_10中計算幾何平均比，接著以MDSC小組標記，並測量MDSC群體之消耗(%)(圖30)。
與來自健康對象之外周血相比，來自NSCLC及前列腺癌供體之商業來源的外周血樣本之臨床前分析表露在所有經測試供體中IL1RAP+ MDSC顯著增加。詳細分析表露在單核細胞MDSC群體上之IL1RAP的表現升高(圖31)，及在離體測定中，在前列腺及肺癌供體血液中這些MDSC對藉由IL1RAP×CD3進行之消耗的敏感性。使用quant-brite珠定量方法，在實體腫瘤供體之全血中，IL1RAP受體密度係在~2500個受體/細胞(針對NSCLC)至~600至800個受體/細胞(針對前列腺癌)的範圍內(圖32)。這些血液樣本中IL1RAP+免疫抑制細胞之消耗促使T細胞活化及增生的增加。
總而言之，在不同腫瘤中，供體血液樣本中之MDSC 水準可變，在前列腺中為~25%，在NSCLC中為~10%。IL1RAP在來自病患供體樣本之MDSC上可看到以多種受體密度來表現：針對前列腺，為~600至800個受體/細胞，且針對NSCLC，為~2500個受體/細胞。IL1RAP×CD3具有消耗來自供體血液樣本中之IL1RAP+ MDSC的能力。
實例32.評估IL1RAP×CD3雙特異性抗體在破壞新生腫瘤脈管系統中之角色
為了調查IL1RAP×CD3依賴性T細胞重新導向是否可破壞並消除腫瘤微環境中新建立的脈管系統，開發出血管生成測定，其測量管狀網路在2D玻璃表面上的相對擴增。為此，獲得螢光標示之正常人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，並在VEGF刺激(4ng/mL)的存在下將其與正常人類皮膚纖維母細胞(NHDF)共培養。補充蘇拉明(100μM)(一種常用酪胺酸激酶抑制劑)以阻斷VEGF傳訊。然後每3小時使用IncuCyteTM Zoom對含有培養細胞之盤成像。如圖33所顯示，VEGF刺激在處理後不久誘導管狀網路之快速擴增，而蘇拉明之添加完全抵消了該效應。建立之網路可在培養器中持續至少5天。這些結果證明測定之動態範圍。
作為判定IL1RAP×CD3依賴性T細胞重新導向之效應的下一步驟，評估在單離健康供體全T細胞及腫瘤細胞存在下的網路生長。使用H1975肺癌細胞系以模擬實體腫瘤(NSCLC)，並使用OCI-AML5細胞以模擬液體腫瘤(AML)。圖34顯示在測定期間將HUVEC與T細胞或H1975細胞共培養不干擾管狀網路形成。引起關注地，將OCI-AML5細胞加至HUVEC培養物中稍微減慢網路生長，但並不抑制最大網路密度，因為在測定之第6天(144小時)，所有網路都生長相當好。
然後評估T細胞及癌細胞上IL1RAP表現之水準。與先前多次觀察一致，T細胞對於IL1RAP係完全陰性的，而H1975及OCI-AML5在表面上表現高水準之分子(圖35)。這證實在血管生成測定中使用這些細胞作為IL1RAP陽性腫瘤及其微環境之模型的意 圖。已評估T細胞及癌細胞上之IL1RAP表現水準，出現HUVEC細胞是否表現IL1RAP的問題。解凍後立即進行之流式細胞術分析揭露IL1RAP不存在於細胞表面上(數據未顯示)。然而，在玻璃上培養7天後，HUVEC顯示IL1RAP之一些表現，大約60%的細胞具有高於同型之蛋白質染色(圖36)。誘導的表現不依賴於培養條件，但似乎在蘇拉明存在下增強，可能作為應付應力(stress)之機制。
最後，在IL1RAP×CD3雙特異性抗體存在下HUVEC與T細胞及癌細胞共培養。圖37顯示在處理後24小時內，10nM IL1RAP×CD3足以完全破壞管狀網路。然而，用對照化合物(空×CD3)或媒劑(PBS)處理並不改變已建立的網路動力學。此觀察結果係重複於H1975(圖37A)及OCI-AML5(圖37B)細胞，指示IL1RAP×CD3依賴性T細胞重新導向在腫瘤血管生成中之角色在固體及液體腫瘤中係相關的。亦測試100nM及1nM之IL1RAP×CD3雙特異性抗體的劑量並產出類似結果。響應於藥理學干預的代表性網路架構之實例係顯示於圖38中，其中圖A、B、及C顯示來自HUVEC管狀網路之綠色螢光，且D、E、及F顯示用於分析的計算機產生之網路掩模。
在成像測定完成後，將技術重製彙集並針對T細胞活化標記(CD25)及T細胞上之IL1RAP表現藉由流式細胞術進行分析。與HUVEC上之IL1RAP之表現及其在用IL1RAP×CD3雙特異性抗體處理後被破壞一致，以抗體依賴性方式看到T細胞上之CD25的明顯增加。暴露於空×CD3 DuoBody® Ab(CNTO 9253)的T細胞不上調CD25。此情況在H1975細胞(圖39A)與OCI-AML5細胞(圖39C)之間係類似的。引起關注地，儘管在H1975存在下被活化之T細胞上未誘導IL1RAP(圖39B)，但看到用OCI-AML5活化之T細胞上IL1RAP實質增加(圖39D)，表明藉由AML細胞系生產的可溶性因子在活化時觸發T細胞上之IL1RAP的表現。
最後，為了調查在T細胞上之CD25與IL1RAP表現之間的關係，產生輪廓圖並基於同型對照染色設置象限門。所得之圖顯示在H1975細胞存在下，10nM IL1RAP×CD3誘導CD25但不誘導IL1RAP(圖40A)。活化係特異性的，因為空×CD3不產出CD25的 類似增加(圖40B)。然而，與OCI-AML5細胞共培養並用IL1RAP×CD3處理的T細胞增加CD25及IL1RAP(圖40C)。重要的是，僅活化T細胞之一部分表現IL1RAP。此外，空×CD3並不誘導T細胞上的CD25或IL1RAP表現(圖40D)。
實例33. IL1RAP×CD3雙特異性抗體對於初級AML及MDS白血病母細胞及骨髓衍生抑制細胞之作用的離體評價。
此研究之目的係調查IL1RAP×CD3雙特異性抗體是否可活化急性骨髓性白血病(AML)及骨髓發育不良症候群(MDS)供體之T細胞來對抗白血病母細胞。為此，建立模擬腫瘤微環境(TME)之培養條件以支持初級供體白血病細胞之生長。使用具有IL1RAP結合臂(IAPB57)及CD3結合臂(B220)之工具化合物進行該研究。簡言之，將自兩個AML供體樣本之外周血(PBMC)單離的新鮮單核細胞及來自兩個MDS供體樣本之冷凍保存之骨髓單核(BMMC)細胞(分別為表23及表24)接種在人類基質細胞系HS-5之層中並擴增十至十四天。接下來，將細胞培養物分為三組：未處理、用IL1RAP×CD3 Ab處理、及用空×CD3 Ab處理(兩種Ab均為1μg/mL)。在處理的第0天及第14天，藉由流式細胞術分析細胞以評價IL1RAP+母細胞及骨髓衍生抑制細胞(MDSC)以及T細胞之擴增/活化。
初級AML PBMC及MDS BMMC細胞與基質細胞系之共培養支持白血病母細胞及T細胞的存活高達28天。在所有測試樣本中，白血病母細胞係IL1RAP陽性的(圖41)。與對照或空×CD3 Ab處理之細胞相比，用IL1RAP×CD3 Ab處理導致在所測試MDS pts樣本及兩個AML測試樣本之一者中IL1RAP+白血病母細胞顯著(40至60%)減少。IL1RAP+細胞之減少與CD8+及CD4+ T細胞群體及其活化之增加密切相關。在未處理之細胞或用空×CD3 Ab處理之細胞中，未觀察到T細胞之擴增(圖42及43)。類似地，在無響應AML樣本中，存在最少CD8+細胞，且在第14天未偵測到CD4+ T細胞(圖44)。
此外，在所有測試樣本中，由於在培養最初幾天內與基質細胞接觸而在T細胞活化時產生MDSC。在AML及MDS樣本中，MDSC係IL1RAP+(圖45A)。在響應樣本中，與未處理之對照或用空×CD3 Ab處理之細胞相比，用IL1RAP×CD3處理後MDSC之百分比顯著地減低，表明針對MDSC之目標特異性殺滅。在無響應 AML樣本中，在所有三個治療組中MDSC之百分比係相同的，此與缺乏T細胞相關(圖45B)。在響應樣本中，與未處理之對照或用空×CD3 Ab處理之細胞相比，用IL1RAP×CD3處理後MDSC之百分比顯著地減低，表明針對MDSC之目標特異性殺滅。在無響應AML樣本中，在所有三個治療組中MDSC之百分比係相同的，此與缺乏T細胞相關(圖45B)。
序列表簡單說明
<110> 健生藥品公司(JANSSEN PHARMACEUTICA NV)
<120> 抗-IL1RAP抗體、結合IL1RAP及CD3之雙特異性抗原結合分子及其用途
<130> PRD3394USNP
<140>
<141>
<150> 62/249,466
<151> 2015-11-02
<160> 103
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 359
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IL1RAP同型1-ECD-C-末端His
<400> 1
<210> 2
<211> 353
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IL1RAP同型2-ECD-N-末端His
<400> 2
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<211> 348
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IL1RAP同型2-ECD-C-末端His
<400> 3
<210> 4
<211> 359
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<220>
<223> IL1RAP-ECD-C末端His
<400> 4
<210> 5
<211> 350
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IL1RAP同型1-ECD-C-末端His-無連結
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IL1RAP同型1-ECD
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<211> 347
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<220>
<223> IL1RAP-ECD
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<212> PRT
<213> 鼠屬
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<211> 347
<212> PRT
<213> 大鼠屬
<220>
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<212> PRT
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<223> IAPB62、IAPB63、及IAPB64-HCDR2
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<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<400> 43
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB38-LCDR2
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB38-LCDR3
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
<223> IAPB61-LCDR3
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB62-LCDR3
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB38-VL
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<212> PRT
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<211> 214
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB57-VL
<400> 73
<210> 74
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB61及IAPB55-VH
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<210> 75
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB61-VL
<400> 75
<210> 76
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB62、IAPB63、及IAPB64-VH
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<220>
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB3及IAPB17-VL
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<211> 449
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB17-VH
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<211> 446
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<223> IAPB23-VL
<400> 82
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<211> 448
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB25-VH
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<220>
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB63-VL
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<211> 216
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 446
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB65-VH
<400> 90
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<211> 214
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB65-VL
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<210> 92
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<220>
<223> CD3B220-VH
<400> 92
<210> 93
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<220>
<223> CD3B220-VL
<400> 93
<210> 94
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<220>
<223> CD3B219-VH
<400> 94
<210> 95
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<220>
<223> CD3B219-VL
<400> 95
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠屬
<220>
<223> CD3B219及CD3B220-HCDR1
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<212> PRT
<213> 鼠屬
<220>
<223> CD3B220-HCDR2
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<211> 14
<212> PRT
<213> 鼠屬
<220>
<223> CD3B219及CD3B220-HCDR3
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<211> 14
<212> PRT
<213> 鼠屬
<220>
<223> CD3B219及CD3B220-LCDR1
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<213> 鼠屬
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<223> CD3B219及CD3B220-LCDR2
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<213> 鼠屬
<220>
<223> CD3B219及CD3B220-LCDR3
<400> 101
<210> 102
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
peptide
<220>
<223> CD3B219-HCDR2
<400> 102
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> IAPB57-LCDR3
<400> 103

Claims (30)

  1. 一種特異性結合至IL1RAP的單離抗體或其抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO：68中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：69中所示之輕鏈序列的抗體；包含SEQ ID NO：70中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：71中所示之輕鏈序列的抗體；包含SEQ ID NO：72中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：73中所示之輕鏈序列的抗體；包含SEQ ID NO：74中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：75中所示之輕鏈序列的抗體；包含SEQ ID NO：76中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：77中所示之輕鏈序列的抗體；包含SEQ ID NO：78中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：79中所示之輕鏈序列的抗體；包含SEQ ID NO：80中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：79中所示之輕鏈序列的抗體；包含SEQ ID NO：81中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：82中所示之輕鏈序列的抗體；包含SEQ ID NO：83中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：84中所示之輕鏈序列的抗體；包含SEQ ID NO：85中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：84中所示之輕鏈序列的抗體；包含SEQ ID NO：86中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：84中所示之輕鏈序列的抗體；包含SEQ ID NO：74中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：87中所示之輕鏈序列的抗體；包含SEQ ID NO：76中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：88中所示之輕鏈序列的抗體；包含SEQ ID NO：76中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：89中所示之 輕鏈序列的抗體；或包含SEQ ID NO：90中所示之重鏈序列及SEQ ID NO：91中所示之輕鏈序列的抗體。
  2. 如請求項1所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合至人類IL1RAP之胞外域。
  3. 如請求項1所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係人類抗體或抗原結合片段。
  4. 如請求項1所述之抗體或抗原結合片段，其具有IgG1或IgG4同型。
  5. 如請求項1所述之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段特異性結合人類IL1RAP並與食蟹獼猴(cynomolgus monkey)IL1RAP交叉反應。
  6. 一種單離細胞，其表現如請求項1所述之抗體或抗原結合片段。
  7. 如請求項6所述之細胞，其中該抗體係經重組生產。
  8. 一種單離IL1RAP×CD3雙特異性抗體，其包含：a)第一重鏈(HC1)；b)第二重鏈(HC2)；c)第一輕鏈(LC1)；及d)第二輕鏈(LC2)，其中該HC1及該LC1配對形成特異性結合CD3之第一抗原結合部位，且該HC2及該LC2配對形成特異性結合IL1RAP之第二抗原結合部位，或其IL1RAP×CD3雙特異性結合片段。
  9. 如請求項8所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中HC1包含SEQ ID NO：94，LC1包含SEQ ID NO：95，HC2包含SEQ ID NO：72，且LC2包含SEQ ID NO：73。
  10. 如請求項8所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段以小於約30nM之KD特異性結合IL1RAP，如由表面電漿共振所測得者。
  11. 如請求項8所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或其雙特異性結合片段結合選自由以下所組成之群 組之細胞表面上的IL1RAP：人類急性骨髓性白血病細胞、人類肺癌細胞、人類結腸癌細胞、人類胰腺癌細胞、人類骨髓發育不良症候群癌細胞、人類慢性骨髓性白血病、人類彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞、人類急性淋巴母細胞性白血病細胞、及人類T細胞白血病/淋巴瘤細胞。
  12. 如請求項8所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段在高於6.7nM之濃度下抑制IL-1β媒介之透過AP-1及NF-κB反應元件的傳訊。
  13. 如請求項8所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段，其中該抗體或雙特異性結合片段在體外以小於約1.3nM的EC50誘導IL1RAP表現性細胞的T細胞依賴性細胞毒性。
  14. 一種單離IL1RAP×CD3雙特異性抗體或其IL1RAP×CD3雙特異性結合片段，其包含：a)第一重鏈(HC1)；b)第二重鏈(HC2)；c)第一輕鏈(LC1)；及d)第二輕鏈(LC2)，其中該HC1及該LC1配對形成特異性結合CD3之第一抗原結合部位，且包含如SEQ ID NO：96中所描寫之重鏈CDR1(HCDR1)、如SEQ ID NO：102中所描寫之HCDR2、如SEQ ID NO：98中所描寫之HCDR3、如SEQ ID NO：99中所描寫之輕鏈CDR1(LCDR1)、如SEQ ID NO：100中所描寫之LCDR2、及如SEQ ID NO：101中所描寫之LCDR3；且該HC2及該LC2配對形成特異性結合IL1RAP之第二抗原結合部位，且包含如SEQ ID NO：16或22中所描寫之重鏈CDR1(HCDR1)、如SEQ ID NO：17或23中所描寫之HCDR2、如SEQ ID NO：18或24中所描寫之HCDR3、如SEQ ID NO：46或62中所描寫之輕鏈CDR1(LCDR1)、如SEQ ID NO：47或63中所描寫之LCDR2、及如SEQ ID NO：103或64中所描寫之LCDR3。
  15. 一種單離細胞，其表現如請求項14所述之抗體或雙特異性結合片段。
  16. 如請求項15所述之細胞，其中該抗體或雙特異性結合片段係經重組生產。
  17. 一種治療有效量的如請求項14所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段之用途，其用於製造治療患有癌症之對象之醫藥品。
  18. 一種治療有效量的如請求項14所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段之用途，其用於製造抑制癌細胞之生長或增生之醫藥品。
  19. 一種治療有效量的如請求項14所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段之用途，其用於製造將T細胞重新導向至IL1RAP表現性癌細胞之醫藥品。
  20. 如請求項19所述之用途，其中該癌症係IL1RAP表現性癌症。
  21. 如請求項20所述之用途，其中該IL1RAP表現性癌症係急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS，低或高危)、急性淋巴球性白血病(ALL，包括所有亞型)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm,DPDCN)、T細胞白血病/淋巴瘤、前列腺癌、肺癌、結腸直腸癌、或胰腺癌。
  22. 如請求項19所述之用途，其進一步包含投予第二治療劑。
  23. 如請求項22所述之用途，其中該第二治療劑係化學治療劑或標靶抗癌療法。
  24. 如請求項23所述之用途，其中該化學治療劑係阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環黴素(anthracycline)、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。
  25. 如請求項22所述之用途，其中該第二治療劑係與該雙特異性抗體同時、依序、或分開投予至該對象。
  26. 一種醫藥組成物，其包含如請求項14所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段及醫藥上可接受之載劑。
  27. 一種單離合成性多核苷酸，其編碼如請求項14所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段的該HC1、該HC2、該LC1、或該LC2。
  28. 一種套組，其包含如請求項14所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段及其使用說明。
  29. 一種如請求項14所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段之用途，其用於製造抑制對象之血管生成之醫藥品，其中該對象患有癌症。
  30. 一種如請求項14所述之IL1RAP×CD3雙特異性抗體或雙特異性結合片段之用途，其用於製造消耗對象中MDSC之醫藥品，其中該對象患有癌症。
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