KR20200041897A - 이중특이 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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KR20200041897A
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유에 리우
웨니안 카이
지아동 시
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에이비 스튜디오 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 상이한 결합 친화도를 갖는 2개의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.

Description

이중특이적 항체 및 그의 용도
우선권 주장
본 출원은 2017년 8월 1일자로 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/539,970호 및 2018년 4월 6일자로 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/654,112호의 이점을 주장한다. 전술한 출원의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 도입된다.
기술 분야
본 개시내용은 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
이중특이적 항체는 2개의 상이한 유형의 항원 또는 2개의 상이한 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 인공 단백질이다. 이러한 이중의 특이성은, T 세포를 종양 세포로 재지시하는 것, 2개의 상이한 신호전달 경로를 동시에 차단하는 것, 상이한 질환 매개체를 이중 표적화하는 것 및 페이로드(payload)를 표적화된 부위로 전달하는 것을 포함하는 광범위한 적용분야를 열어준다. 카투막소맙(항-EpCAM 및 항-CD3) 및 블리나투모맙(항-CD19 및 항-CD3)의 승인은 이중특이적 항체의 개발에서 주요 이정표로 되어 왔다.
이중특이적 항체가 다양한 적용분야를 가짐에 따라, 이중특이적 항체에 기초한 다양한 치료제를 지속적으로 개발할 필요가 있다.
본 개시내용은 불균형 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편이 상이한 결합 친화도로 2개의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는, 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은, 제1 중쇄 가변 영역, 제2 중쇄 가변 영역, 제1 경쇄 가변 영역, 및 제2 경쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 제1 중쇄 가변 영역 및 제1 경쇄 가변 영역은 서로 회합하여, 107　M-1, 108　M-1, 109　M-1, 1010　M-1, 1011 M-1　또는 1012　M-1 초과의 결합 친화도로 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역을 형성하고, 상기 제2 중쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역은 서로 회합하여, 109　M-1, 108　M-1, 107　M-1, 106　M-1, 105　M-1 또는 104　M_1 미만의 결합 친화도로 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 형성하는, 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 영역은 107　M-1, 106　M-1, 105　M-1 또는 104　M-1 초과의 결합 친화도로 상기 제2 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 항원에 결합할 때의 상기 제1 항원 결합 영역의 결합 친화도는, 상기 제2 항원에 결합할 때의 상기 제2 항원 결합 영역의 결합 친화도보다 적어도 100, 1000 또는 10000배 더 크다.
일부 구현예에서, 상기 제1 경쇄 가변 영역 및 상기 제2 경쇄 가변 영역은 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일하다.
일부 양태에서, 본 개시내용은, 제1 중쇄 가변 영역 및 제1 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 아암(arm); 및 제2 중쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 아암을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 제1 아암은 107　M-1, 108　M-1, 109　M-1, 1010　M-1, 1011 M-1　또는 1012　M-1 초과의 결합 친화도로 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 제2 아암은 109　M-1, 108　M-1, 107　M-1, 106　M-1, 105　M-1 또는 104　M_1 미만의 결합 친화도로 제2 항원에 특이적으로 결합하는, 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 제2 아암은 107　M-1, 106　M-1, 105　M-1 또는 104　M-1 초과의 결합 친화도로 상기 제2 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 항원에 결합할 때의 상기 제1 아암의 결합 친화도는, 상기 제2 항원에 결합할 때의 제2 아암의 결합 친화도보다 적어도 100, 1000 또는 10000배 더 크다.
일부 구현예에서, 상기 제1 경쇄 가변 영역 및 상기 제2 경쇄 가변 영역은 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일하다.
일부 양태에서, 본 개시내용은, 제1 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 중쇄, 제2 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄, 제1 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 경쇄 및 제2 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 제1 중쇄 가변 영역 및 상기 제1 경쇄 가변 영역은 서로 회합하여, 107　M-1, 108　M-1, 109　M-1, 1010　M-1, 1011 M-1　또는 1012　M-1 초과의 결합 친화도로 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역을 형성하고, 상기 제2 중쇄 가변 영역 및 상기 제2 경쇄 가변 영역은 서로 회합하여, 109　M-1, 108　M-1, 107　M-1, 106　M-1, 105　M-1 또는 104　M_1 미만의 결합 친화도로 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 형성하는, 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 제2 항원 결합 영역은 107　M-1, 106　M-1, 105　M-1 또는 104　M-1 초과의 결합 친화도로 상기 제2 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 항원에 결합할 때의 상기 제1 항원 결합 영역의 결합 친화도는, 상기 제2 항원에 결합할 때의 상기 제2 항원 결합 영역의 결합 친화도보다 적어도 100, 1000 또는 10000배 더 크다.
일부 구현예에서, 상기 제1 경쇄 및 상기 제2 경쇄는 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일하다.
일부 구현예에서, 상기 제1 중쇄 및 상기 제2 쇄는 놉 인투 홀(knobs into holes) 접근법에 의해 서로 회합한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 항원은 암 특이적 항원이고, 상기 제2 항원은 CD3이다.
일부 구현예에서, 상기 제1 항원은 CD20이고, 상기 제2 항원은 CD3이다.
일부 구현예에서, 상기 제1 중쇄 가변 영역은 서열번호: 1과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하고, 상기 제2 중쇄 가변 영역은 서열번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하고, 상기 제1 및 제2 경쇄 가변 영역은 서열번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 항원은 암 특이적 항원이고, 상기 제2 항원은 암-연관된 항원이다.
일부 구현예에서, 상기 제1 항원은 PD-L1이고, 상기 제2 항원은 CD55이다.
일부 구현예에서, 상기 제1 중쇄 가변 영역은 서열번호: 4와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하고, 상기 제2 중쇄 가변 영역은 서열번호: 5와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하고, 상기 제1 및 제2 경쇄 가변 영역은 서열번호: 6 또는 서열번호: 7과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은, 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 항원-결합 단편을 동정하는 단계로서, 상기 제1 항체 또는 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함하는, 단계; VHa, VLa, VHb 및 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계; VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80%를 초과하는 것을 결정하는 단계; 공통 경쇄 가변 영역(VLc)을 설계하는 단계로서, 상기 VLc는, VHa와 회합하는 경우, 상기 제1 항원에 대한 친화도를 유지하는, 단계; 상기 VHa 및 VHb 서열을 재설계하고, 그것에 의해 VHa' 및 VHb'를 수득하여, VHa'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLc를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제1 단백질, 및 VHb'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLc를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제2 단백질 사이의 생화학적 또는 생체물리학적 특성의 차이를 증가시키는 단계; 및 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하는 단계로서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLc를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa' 및 VHb'를 각각 포함하는, 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 단계 (d)에서, 제2 항원에 대한 VLc-VHb의 결합 친화도는 저하할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은, 완충계를 개발하여 상기 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은, 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 항원-결합 단편을 동정하는 단계로서, 상기 제1 항체 또는 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함하는, 단계; VHa, VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계; VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80% 미만인 것을 결정하는 단계; 파아지 디스플레이 항체 라이브러리 중의 모든 경쇄 가변 영역을 상기 VLa로 치환하고, 상기 제2 항원에 대해 패닝(panning)하여 제3 중쇄 가변 영역(VHc)을 수득하는 단계; 상기 VHa 및 VHc 서열을 재설계하고, 그것에 의해 VHa' 및 VHc'를 수득하여, VHa'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLa를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제1 단백질, 및 VHc'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLa를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제2 단백질 사이의 생화학적 또는 생체물리학적 특성의 차이를 증가시키는 단계; 및 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하는 단계로서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLa를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa' 및 VHc'를 각각 포함하는, 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 완충계를 개발하여 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 정제하는 것을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 동정하는 단계로서, 상기 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함하는, 단계; VHa, VLa, VHb 및 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계; VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80% 미만인 것을 결정하는 단계; 파아지 디스플레이 항체 라이브러리 중의 모든 경쇄 가변 영역을 복수의 경쇄 가변 영역으로 치환하는 단계로서, 상기 경쇄 가변 영역은 VLa 또는 VLb와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한, 단계; 제2 항원에 대해 패닝하는 단계; 공통 경쇄 가변 영역(VLc) 및 제3 중쇄 가변 영역(VHc)을 선택하는 단계로서, VHa-VLc는 원하는 친화도를 갖는 제1 항원에 결합하고, VHc-VLc는 원하는 친화도를 갖는 제2 항원에 결합하는, 단계; VHa 및 VHc 서열을 재설계하고, 그것에 의해 VHa' 및 VHb'를 수득하여, VHa'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLa를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제1 단백질, 및 VHc'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLc를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제2 단백질 사이의 생화학적 또는 생체물리학적 특성의 차이를 증가시키는 단계; 및 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 단계로서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLc를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa' 및 VHc'를 각각 포함하는, 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 단계 (d)에서, 복수의 경쇄 가변 영역은 오류-유발 PCR에 의해 생성된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 완충계를 개발하여 상기 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계 중의 하나 이상을 수반한다:
(a) 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 동정하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함하는, 단계;
(b) VHa, VLa, VHb 및 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
(c) VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80% 미만인 것을 결정하는 단계;
(d) 파아지 디스플레이 항체 라이브러리 중의 모든 경쇄 가변 영역을 복수의 경쇄 가변 영역으로 치환하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 경쇄 가변 영역은 VLa 또는 VLb와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일하다;
(e) 제2 항원에 대해 패닝하는 단계;
(f) 공통 경쇄 가변 영역(VLc) 및 제3 중쇄 가변 영역(VHc)을 선택하는 단계. 일부 구현예에서, VHc-VLc는 원하는 친화도로 상기 제2 항원에 결합한다;
(g) VHa 및 VHc 서열 사이의 상동성이 80% 보다 큰 것을 결정하는 단계;
(h) 공통 경쇄 가변 영역(VLd)을 설계하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 VLd는, VHa와 회합하는 경우, 상기 제1 항원에 대한 친화도를 유지하고, VHc와 회합하는 경우, 상기 제2 항원에 대한 원하는 친화도를 갖는다;
(i) 선택적으로, VHa 및 VHc 서열을 재설계하고, 그것에 의해 VHa' 및 VHc'를 수득하여, VHa'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLd를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제1 단백질, 및 VHc'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLd를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제2 단백질 사이의 생화학적 또는 생체물리학적 특성의 차이를 증가시키는 단계; 및
(j) 선택적으로, 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLd를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa' 및 VHc'를 각각 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계 중의 하나 이상을 수반한다:
(a) 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 동정하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함한다;
(b) VHa, VLa, VHb 및 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
(c) VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80%를 초과하는 것을 결정하는 단계;
(d) 공통 경쇄 가변 영역(VLc)을 설계하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 VLc는, VHa와 회합하는 경우, 상기 제1 항원에 대한 친화도를 유지한다; 및
(e) 선택적으로, 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLc를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa 및 VHb를 각각 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계 중의 하나 이상을 수반한다:
(a) 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 동정하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함한다;
(b) VHa, VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
(c) VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80% 미만인 것을 결정하는 단계;
(d) 파아지 디스플레이 항체 라이브러리 중의 모든 경쇄 가변 영역을 상기 VLa로 치환하고, 상기 제2 항원에 대해 패닝(panning)하여 제3 중쇄 가변 영역(VHc)을 수득하는 단계; 및
(e) 선택적으로, 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLa를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa 및 VHc를 각각 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계 중의 하나 이상을 수반한다:
(a) 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 동정하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함한다;
(b) VHa, VLa, VHb 및/또는 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
(c) VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80% 미만인 것을 결정하는 단계;
(d) 파아지 디스플레이 항체 라이브러리 중의 모든 경쇄 가변 영역을 복수의 경쇄 가변 영역으로 치환하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 경쇄 가변 영역이 VLa 또는 VLb와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일하다;
(e) 상기 제1 및/또는 상기 제2 항원에 대해 패닝(panning)하는 단계;
(f) 공통 경쇄 가변 영역(VLc) 및 제3 중쇄 가변 영역(VHc)을 선택하는 단계. 일부 구현예에서, VHa-VLc는 원하는 친화도로 상기 제1 항원에 결합하고, VHc-VLc는 원하는 친화도로 상기 제2 항원에 결합한다; 및
(g) 선택적으로, 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLc를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa 및 VHc를 각각 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은, CD3에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)으로서, 상기 VH CDR1 영역은 선택된 VH CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH CDR2 영역은 선택된 VH CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH CDR3 영역은 선택된 VH CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변 영역; 및 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)으로서, 상기 VL CDR1 영역은 선택된 VL CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL CDR2 영역은 선택된 VL CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL CDR3 영역은 선택된 VL CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호: 22-24에 제시된 것이고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호: 28-30에 제시된 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 VH는 각각 서열번호: 22, 23, 24에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 3을 포함하고, 상기 VL은 각각 서열번호: 28, 29, 30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 3을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 CD3에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 이중특이적 항체이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 또한, PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)으로서, 상기 VH CDR1 영역은 선택된 VH CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH CDR2 영역은 선택된 VH CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH CDR3 영역은 선택된 VH CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변 영역; 및 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)으로서, 상기 VL CDR1 영역은 선택된 VL CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL CDR2 영역은 선택된 VL CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL CDR3 영역은 선택된 VL CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 선택된 VH CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열 및 상기 선택된 VL CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열은 하기 중의 하나인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다:
(1) 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 41-43에 각각 제시되어 있고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 53-55에 각각 제시된 것임;
(2) 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 41-43에 각각 제시되어 있고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 59-61에 각각 제시된 것임.
일부 구현예에서, 상기 VH는 각각 서열번호: 41-43에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 3을 포함하고, 상기 VL은 각각 서열번호: 59-61에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 3을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 CD3에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 이중특이적 항체이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은, CD55에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)으로서, 상기 VH CDR1 영역은 선택된 VH CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH CDR2 영역은 선택된 VH CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH CDR3 영역은 선택된 VH CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변 영역; 및 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)으로서, 상기 VL CDR1 영역은 선택된 VL CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL CDR2 영역은 선택된 VL CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL CDR3 영역은 선택된 VL CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 선택된 VH CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열 및 상기 선택된 VL CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열은 하기 중의 하나인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다:
(1) 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 47-49에 각각 제시되어 있고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 53-55에 각각 제시된 것임;
(2) 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 47-49에 각각 제시되어 있고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 59-61에 각각 제시된 것임.
일부 구현예에서, 상기 VH는 각각 서열번호: 47-49에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 3을 포함하고, 상기 VL은 각각 서열번호: 59-61에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 3을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 CD3에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 이중특이적 항체이다.
일 양태에서, 본 개시내용은, 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산으로서, 각각 서열번호: 53-55에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 VL은, 서열번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍으로 되는 경우, PD-L1에 결합하고/하거나, 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍으로 되는 경우, CD55에 결합한다.
일 양태에서, 본 개시내용은, 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산으로서, 각각 서열번호 59-61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 VL은, 서열번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍으로 되는 경우, PD-L1에 결합하고/하거나, 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍으로 되는 경우, CD55에 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 핵산은 이중특이적 항체를 코딩한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 cDNA이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 CHO 세포이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 핵산을 포함하는 세포를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은, CD20 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 서열번호: 1과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 서열번호: 2와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 제2 폴리펩타이드; 서열번호: 3과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 서열번호: 3과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제4 폴리펩타이드를 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 1을 포함하고; 상기 제2 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 2를 포함하고; 상기 제1 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 3을 포함하고; 상기 제2 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 3을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 폴리펩타이드는 서열번호: 34, 35 또는 36과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 상기 제2 폴리펩타이드는 서열번호: 37, 38 또는 39와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 상기 제3 폴리펩타이드는 서열번호: 40과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 상기 제4 폴리펩타이드는 서열번호: 40과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 폴리펩타이드는 서열번호: 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 제2 폴리펩타이드는 서열번호: 38에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은, PD-L1 및 CD55에 결합하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 서열번호: 4와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 서열번호: 5와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 제2 폴리펩타이드; 서열번호: 6 또는 7과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 서열번호: 6 또는 7과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제4 폴리펩타이드를 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 4를 포함하고; 상기 제2 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호: 5를 포함하고; 상기 제1 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 7을 포함하고; 상기 제2 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호: 7을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 폴리펩타이드는 서열번호: 65와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 상기 제2 폴리펩타이드는 서열번호: 66과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 상기 제3 폴리펩타이드는 서열번호: 67 또는 68과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 상기 제4 폴리펩타이드는 서열번호: 67 또는 68과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 폴리펩타이드는 서열번호: 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 제2 폴리펩타이드는 서열번호: 66에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 제3 폴리펩타이드는 서열번호: 68에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 제4 폴리펩타이드는 서열번호: 68에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은, 치료제와 공유 결합된 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 콘주게이트(antibody-drug conjugate)를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 치료제는 세포독성제 또는 세포증식억제제이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 본 명세서에 기재된 항체-약물 콘주게이트를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 고형 종양을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 암은 흑색종, 췌장 암종 또는 혈액학적 악성종양이다. 일부 구현예에서, 상기 암은 비-호지킨 림프종, 림프종 또는 만성 림프구성 백혈병이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 종양 성장 속도를 저하시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 대상체에서의 종양 세포를 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 본 명세서에 기재된 항체-약물 콘주게이트를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 종양 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 대상체에서의 종양 세포를 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 본 명세서에 기재된 항체-약물 콘주게이트를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은, 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은, 본 명세서에 기재된 항체 약물 콘주게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 물질은 본 발명에 사용하기 위해 본 명세서에 기재되어 있고; 당업계에서 알려진 다른 적합한 방법 및 물질도 또한 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 예는 단지 설명을 위한 것이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리, 및 다른 참조문헌은 참고로 전체적으로 편입된다. 상충하는 경우에, 정의를 비롯한 본 명세서가 우선할 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면, 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a는 실시예 1에서 재설계된 항체 A가, CD20을 발현하는 라지(Raji) 세포에 결합하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 1b는 실시예 1에서 재설계된 항체 B가, CD3을 발현하는 저켓(Jukart) 세포에 결합하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 2a는 CD20+ 라지 세포 결합 검정의 결과이다.
도 2b는 CD3+ 저켓 세포 결합 검정의 결과이다.
도 3은 T 세포 활성화 검정이다(도에서 CD20/3은 CD20/CD3 BsMab이고; A10 및 A11은 상이한 용출 분획을 나타내고; 아이소타입은 대조군으로 사용된 IgG1 항체이다).
도 4는 상이한 항체에 대한 T 세포 활성화의 적정 곡선이다.
도 5는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 존재하에 항체 매개된 CD20+ 라지 세포 사멸이다.
도 6은 T 세포를 4일 동안 IL-2 및 CD3/CD28 비드에 의해 활성화시킨 PBMC의 존재하에 항체 매개된 CD20+ 라지 세포 사멸이다.
도 7은 T 세포를 7일 동안 IL-2 및 CD3/CD28 비드에 의해 활성화시킨 PBMC의 존재하에 항체 매개된 CD20+ 라지 세포 사멸이다.
도 8은 PBMC의 존재하에 항체 매개된 CD3+ 저켓 세포 사멸이다.
도 9는 T 세포를 4일 동안 IL-2 및 CD3/CD28 비드에 의해 활성화시킨 PBMC의 존재하에 항체 매개된 CD3+ 저켓 세포 사멸이다.
도 10은 T 세포를 7일 동안 IL-2 및 CD3/CD28 비드에 의해 활성화시킨 PBMC의 존재하에 항체 매개된 CD3+ 저켓 세포 사멸이다.
도 11은 항체에 의해 유도된 PBMC에서 활성화된 T 세포의 고갈이다.
도 12는 항체에 의해 유도된 PBMC에서 불활성화된 T 세포의 고갈이다.
도 13은 FACS에 의해 결정된 보체 의존적 세포독성(CDC)에 의해 매개된 라지 세포 용해이다.
도 14는 칼세인 방출에 의해 결정된 CDC에 의해 매개된 라지 세포 용해이다.
도 15는 FACS에 의해 결정된 CDC에 의해 매개된 저켓 세포 용해이다(A11 및 B3은 상이한 용출 분획이다).
도 16은 인간 보체 풍부한 혈청의 존재하에 PBMC에서 T 세포 고갈이다.
도 17 내지 19는 3개의 상이한 공여체로부터 PBMC에 기초한 T 세포 활성화에 의해 매개된 리툭시맙-내성 세포 용해이다.
도 20은 정제된 항체를 평가하는 T 세포 활성화이다.
도 21a는 포스페이트-완충 식염수 PBS(G1), CD20/CD3 BsMab(G2; "BIS") 또는 리툭시맙(G3; "RTX")가 주입된 후에 각각의 그룹에서 마우스의 평균 중량이다.
도 21b는 포스페이트-완충 식염수 PBS(G1), CD20/CD3 BsMab(G2; "BIS") 또는 리툭시맙(G3; "RTX")가 주입된 후에 각각의 그룹에서 루시퍼라제-라벨링된 라지 세포에 대한 평균 이미징 강도이다.
도 22a는 정제된 CD20/CD3 이중특이적 항체 샘플에 대한 환원 모세관 전기영동 나트륨 도데실 설페이트(Re-CE-SDS) 결과이다.
도 22b는 정제된 CD20/CD3 이중특이적 항체 샘플에 대한 비-환원 CE(Non-Re-CE-SDS) 결과이다.
도 23a는 아벨루맙(PD-L1 wt), 및 PD-L1(서열번호: 4) 및 공통 VL(서열번호: 6)에 대한 VHa를 포함하는 설계된 PD-L1 모노-이량체 IgG 항체(PD-L1 VI)에 대한 결합 친화도이다.
도 23b는 친계 항-CD55 항체(CD55 wt), 및 CD55(서열번호: 5) 및 공통 VL(서열번호: 6)에 대한 VHb를 포함하는 설계된 CD55 모노-이량체 IgG 항체(CD55 VI)에 대한 결합 친화도이다.
도 24는 BsMab v1(서열번호: 67)에 대한 공통 경쇄 및 BsMab v2(서열번호: 68)에 대한 공통 경쇄의 정렬이다.
도 25a는 아벨루맙(PD-L1 wt), 및 PD-L1(서열번호: 4) 및 공통 VL v2(서열번호: 7)에 대한 VHa를 포함하는 재설계된 PD-L1 모노-이량체 IgG 항체(PD-L1 V2)에 대한 결합 친화도이다.
도 25b는 친계 항-CD55 항체(CD55 wt), 및 CD55(서열번호: 5) 및 공통 VL v2(서열번호: 7)에 대한 VHb를 포함하는 재설계된 CD55 모노-이량체 IgG 항체(CD55 V2)에 대한 결합 친화도이다.
도 26a 내지 26b는 MDA231 세포에서 항체 매개된 CDC이다.
도 27a는 MDA231 세포에 의한 항체 내재화 검정 결과이다.
도 27b는 SIHA 세포에 의한 항체 내재화 검정 결과이다.
도 28은 CD3 및 암 항원(예를 들어, 암 특이적 항원)에 결합하는 이중특이적 항체가 종양 세포를 어떻게 인식하고 사멸시킬 수 있는지를 나타내는 개략도이다.
도 29는 암 특이적 항원 및 암-연관된 항원에 결합하는 이중특이적 항체가 종양 세포를 어떻게 인식하고 사멸시킬 수 있는지를 나타내는 개략도이다.
이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 2개의 상이한 유형의 항원에 동시에 결합할 수 있는 인공 단백질이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 2개의 아암(arm)(아암 A 및 B)을 가질 수 있다. 각각의 아암은 1개의 중쇄 가변 영역 및 1개의 경쇄 가변 영역을 갖는다.
상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG-유사 및 비-IgG-유사일 수 있다. 상기 IgG-유사 이중특이적 항체는 2개의 Fab 아암 및 1개의 Fc 영역을 가질 수 있고, 상기 2개의 Fab 아암은 상이한 항원에 결합한다. 상기 비-IgG-유사 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들어, 화학적으로 연결된 Fab(예를 들어, 2개의 Fab 영역은 화학적으로 연결됨) 및 단일-쇄 가변성 단편(scFv)일 수 있다. 예를 들어, scFV는 2개의 중쇄 가변 영역 및 2개의 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
불균형 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편에서, 상기 2개의 아암(아암: A 및 B) 또는 상기 2개의 항원 결합 영역(항원 결합 영역: A 및 B)은 상이한 친화도로 각각의 표적 항원에 결합할 수 있다. 결합 친화도는 결합 상수(Ka)에 의해 표현될 수 있다:
Ka = [항체-항원] / [항체] [항원]
고친화도(high affinity)를 갖는 항체는 일반적으로 Ka > 107　M-1을 갖는다. 1개의 아암 또는 1개의 항원 결합 영역의 Ka는 105　M-1, 106　M-1, 107　M-1, 108　M-1, 109　M-1, 1010　M-1, 1011　M-1 또는 1012　M-1을 초과할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 Ka는 105　M-1, 106　M-1, 107　M-1, 108　M-1, 109　M-1, 1010　M-1, 1011　M-1 또는 1012　M-1 미만일 수 있다.
제1 아암 또는 제1 항원 결합 영역(A)의 결합 친화도는 제2 아암 또는 제2 항원 결합 영역(B)의 결합 친화도보다 클 수 있다. 불균형 친화도를 갖는 이중특이적 항체는 다양한 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 불균형 친화도를 갖는 이중특이적 항체를 사용하여, 암 세포 상의 암 특이적 항원 및 T 세포 상의 CD3을 표적화할 수 있다. 이 경우에, 암 특이적 항원에 대한 고친화도는 T 세포에 의한 암 세포의 보다 양호한 포획을 유도할 수 있고, CD3에 대한 저친화도는 CD3에 의한 T-세포 신호전달의 유발을 회피할 수 있다(도 28). 상기 이중특이적 항체가 표적 암 세포에 의해 다가 방식으로 T 세포에 제시되는 경우에만, 상기 T 세포는 활성화되어 표적 암 세포를 사멸시킬 수 있다. 게다가, 불균형 친화도를 갖는 이중특이적 항체는 또한 암 특이적 항원 및 암-연관된 항원을 표적화하기 위해 사용될 수 있다(도 29). 이 경우에, 상기 이중특이적 항체는 저수준(low level)의 암-연관된 항원을 발현하는 비-암 세포에 단지 약하게 결합하지만, 암 특이적 항원 및 고수준의 암-연관된 항원 둘 모두를 발현하는 암 세포에 강하게 결합한다.
불균형 친화도를 갖는 이중특이적 항체에 있어서, 제1 아암 또는 제1 항원 결합 영역(A)의 Ka는 107　M-1, 108　M-1, 109　M-1, 1010　M-1, 1011　M-1 또는 1012　M-1을 초과할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 아암 또는 제1 항원 결합 영역(A)의 Ka는 제2 아암 또는 제2 항원 결합 영역(B)의 Ka보다 10, 100, 1000, 10000 또는 100000배 더 클 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 제2 아암 또는 제2 항원 결합 영역(B)의 Ka는 105　M-1, 106　M-1, 107　M-1, 108　M-1 또는 109　M-1 미만일 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 아암 또는 제2 항원 결합 영역(B)의 Ka는 여전히 적정한 친화도, 예를 들어, 104　M-1, 105　M-1　또는 106　M-1 초과로 상기 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
상기 결합 친화도는 해리 상수(Kd)에 의해 표현될 수 있다.
Kd = [항체] [항원] / [항체-항원]
상기 Kd는 10-5　M, 10-6　M, 10-7　M, 10-8　M, 10-9　M, 10-10　M, 10-11　M 또는 10-12　M 미만일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 Kd는 10-5　M, 10-6　M, 10-7　M, 10-8　M, 10-9　M, 10-　10　M, 10-11　M 또는 10-12　M을 초과할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 아암 또는 제1 항원 결합 영역(A)의 결합 친화도는 제2 아암 또는 제2 항원 결합 영역(B)의 결합 친화도보다 크다. 예를 들어, 제2 아암 또는 제2 항원 결합 영역(B)의 Kd는 제1 아암 또는 제1 항원 결합 영역(A)의 Kd보다 10, 100, 1000, 10000 또는 100000배 더 클 수 있다(따라서 보다 작은 친화도를 가짐). 따라서, 일부 구현예에서, 제1 아암 또는 제1 항원 결합 영역(A)의 Kd는 10-7　M, 10-8　M, 10-9　M, 10-10　M, 10-11　M 또는 10-12　M 미만일 수 있고; 제2 아암 또는 제2 항원 결합 영역(B)의 Kd는 10-5　M, 10-6　M, 10-7　M, 10-8　M 또는 10-9　M을 초과할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함한다. 상기 2개의 경쇄 각각은 1개의 경쇄 가변 영역(VL) 및 1개의 경쇄 불변 영역(CL)을 갖는다. 상기 2개의 중쇄 각각은 1개의 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 일부 구현예에서, 아암 A 및 아암 B의 2개 경쇄는 동일하다. 따라서, 2개 경쇄의 VL 중의 CDR은 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편에서 2개 중쇄는 상이하다. 따라서, 2개 중쇄의 VH 중의 CDR은 상이하다.
상기 이중특이적 항체를 제조할 때에 동일한 중쇄가 서로 회합하지 않도록 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, "놉 인투 홀(knobs into holes)" 접근법은 하나의 중쇄에 큰 측쇄를 사용한 아미노산 돌연변이, 및 다른 중쇄에 작은 측쇄를 사용한 아미노산 돌연변이를 도입한다. 따라서, 동일한 중쇄는 서로 회합할 가능성이 더 적고, 2개의 상이한 중쇄는 서로 회합할 기회가 더 높다. "놉 인투 홀" 접근법은, 예를 들어, 문헌[참조: Ridgway, John BB, Leonard G. Presta, and Paul Carter. "'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization." Protein Engineering, Design and Selection 9.7 (1996)]에 기재되어 있고, 이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입된다.
T 세포 특이적 항원 및 암 항원에 결합하는 불균형 이중특이적 항체
T 세포를 동원하고 활성화시킬 수 있는 T 세포 특이적 항원(예를 들어, CD3, CD4 또는 CD8) 결합 아암을 갖는 이중특이적 항체(BsAb 또는 BsMab)는 암 요법을 위해 널리 연구되어 있다. 그러나, 다수의 이들 이중특이적 항체의 효과기(effector) 기능은 안전성 관심 때문에 제거되어 있다. 항체의 효과기 기능, 예컨대, ADCC 및 CDC는 암 세포 사멸에서 중대한 역할을 담당하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 상기 항체의 효과기 기능을 "안전하게" 유지하는 것은 치료적 항체의 작용 기전을 확장시킬 뿐만 아니라, 상기 항체의 암 사멸 기능을 개선시킬 수 있다. 상기 효과기 기능을 "안전하게" 유지하고 이들 이중특이적 항체의 적용을 확장시키기 위해, 불균형 이중특이적 항체 기술 플랫폼은 전산 항체 설계에 기초하여 개발되어 왔다.
이 설계에서, 제1 항원 결합 영역은 암 특이적 항원을 표적화하고, 제2 항원 결합 영역은 T 세포 특이적 항원(예를 들어, CD3, CD4 또는 CD8)을 표적화하여, 암 특이적 항원을 갖는 암을 공격하기 위해 T 세포를 동원한다(도 28).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "암 특이적 항원"은 암 세포 표면 상에서 구체적으로 발현되는 항원을 지칭한다. 이들 항원을 사용하여 종양 세포를 동정할 수 있다. 정상 세포는 암 특이적 항원을 희귀하게 발현한다. 일부 예시적 암 특이적 항원은, 예를 들어, CD20, PSA, PSCA, PD-L1, Her2, Her3, Herl, β-카테닌, CD19, CEACAM3, EGFR, c-Met, EPCAM, PSMA, CD40, MUC1 및 IGF1R 등을 포함한다. PSA는 전립선암 세포에서 주로 발현되고, Her2는 유방암 세포에서 주로 발현된다.
CD20 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체가 본 개시내용에서 제공된다. 이러한 이중특이적 항체는 다중 CD20 양성 암, 예컨대, CD20-양성 비-호지킨 림프종(NHL)에 적용할 수 있고, 따라서 대상체에서 비-호지킨 림프종을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 이중특이적 항체는 치료적 항체 표적 CD20 단독과 비교하여 암을 치료하기 위해 상이한 작용 기전을 적용하기 때문에, 이는 CD20 양성 암, 특히 현재의 CD20 요법에 양호하게 반응하지 않는 이들 CD20 양성 암(이들은 리툭시맙-내성 NHL을 갖는다)에 대한 상보성 요법으로서 적용될 수 있다.
CD3에 대해 고친화도를 갖는 항체는 T-세포 신호전달을 유발할 수 있고, 바람직하지 않은 면역 반응을 유발한다. 따라서, CD3에 대한 저친화도(예를 들어, Ka는 105　M-1, 106　M-1 또는 107　M-1 미만일 수 있음)는, 항체의 효과기 기능을 "안전하게" 유지하면서, CD3에 의한 T-세포 신호전달을 유발할 위험을 감소시키는데 요구된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체의 효과기 기능을 안전하게 유지하는 것"은 항체가 정상 세포(예를 들어, 비-암 세포) 상에서 ADCC 또는 CDC를 유도하지 않는 것을 의미한다. 다중 이중특이적 항체가 표적 암 세포(예를 들어, 클러스터) 상에 제시되고 암 세포와 T 세포 사이의 상호작용을 브릿징하는 경우, 이들 이중특이적 항체는 다가 방식으로 CD3을 통한 T-세포 신호전달을 유발할 수 있고, 이어서 활성화된 T 세포는 상기 표적 암 세포를 사멸시킬 것이다.
따라서, 본 개시내용은, 2개의 중쇄 가변 영역 및 2개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 제1 중쇄 가변 영역이 서열번호: 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,또는 99% 동일한 서열을 포함하고, 상기 제2 중쇄 가변 영역이 서열번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하고, 상기 제1 및 제2 경쇄 가변 영역이 서열번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
일부 구현예에서, CD20에 결합하기 위한 CDR 서열은, 카밧 넘버링에 의해 정의될 때, 중쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호: 16 내지 18 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호: 28 내지 30을 포함한다. 초티아 넘버링하에, 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 서열번호: 19 내지 21에 제시되어 있고, 경쇄 가변 도메인의 CDR은 서열번호: 31 내지 33에 제시되어 있다.
일부 구현예에서, CD3에 결합하기 위한 CDR 서열은, 카밧 넘버링에 의해 정의된 바와 같이, 중쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호: 22 내지 24 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호: 28 내지 30을 포함한다. 초티아 넘버링하에, 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 서열번호: 25 내지 27에 제시되어 있고, 경쇄 가변 도메인의 CDR은 서열번호: 31 내지 33에 제시되어 있다.
일부 구현예에서, 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 서열번호: 34, 35 또는 36과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 중쇄 아미노산 서열; 서열번호: 37, 38 또는 39와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제2 중쇄 아미노산 서열; 서열번호: 40과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 경쇄 아미노산 서열; 및 서열번호: 40과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제2 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 경쇄 아미노산 서열 및 상기 제2 경쇄 아미노산 서열은 동일하다.
암 특이적 항원 및 암-연관된 항원에 결합하는 불균형 이중특이적 항체
본 개시내용은 또한, 암 특이적 항원을 표적화하는 제1 항원 결합 영역 및 암-연관된 항원을 표적화하는 제2 항원 결합 영역을 갖는 불균형 이중특이적 항체를 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "암-연관된 항원"은 암 세포 상에서 상대적으로 높은 수준으로 발현되지만 또한 정상 세포 상에서 상대적으로 낮은 수준으로 발현될 수 있는 항원을 지칭한다. CD55, CD59, CD46 및 다수의 접착 분자, 예컨대, N-카드헤린, VE-카드헤린, NCAM, Mel-CAM, ICAM, NrCAM, VCAM1, ALCAM, MCAM 등은 암-연관된 항원이다. 암 특이적 항원 및 암-연관된 항원 둘 모두는 암 세포 표면 상에서 발현되지만, 암 특이적 항원과 암-연관된 항원 사이의 차이는 상기 암-연관된 항원이 정상 세포 상에서 또한 발현되지만, 암 세포 상의 수준과 비교하여 상대적으로 낮은 수준으로 발현된다는 것이다. 그에 반해서, 암 특이적 항원은 정상 세포 상에서 희귀하게 발현되고, 정상 세포 상에서 발현되는 경우에도, 그 양은 극도로 낮다. 암 특이적 항원을 표적화하는 항체는 일반적으로 정상 세포 상에서 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존적 세포독성(CDC)을 유도하지 않을 것이다. 그에 반해서, 고친화도를 갖는 암-연관된 항원을 표적화하는 항체는 정상 세포 중에서 세포독성 효과를 유발할 수 있다. 따라서, 이중특이적 항체는 상대적으로 저친화도로 암-연관된 항원에 결합하는 것이 중요하다(도 29).
PD-L1 및 CD55에 결합하는 이중특이적 항체가 실시예에서 제공된다. 이 항체는, PD-L1/PD1 상호작용을 차단하여 T 세포 의존적 면역 반응을 활성화시키고 CDC 상에서 CD55의 억압을 저하시킬 뿐만 아니라, ADCC 또는 CDC를 통해 PD-L1 및 CD55 양성 암을 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 게다가, 암 세포는 PD-L1 항체에 대해 내성으로 될 수 있기 때문에, 암 세포 상의 제2 아암과 CD55 사이의 결합은 추가의 치료적 효과를 제공할 수 있다.
따라서, 본 개시내용은, 2개의 중쇄 가변 영역 및 2개의 경쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 제1 중쇄 가변 영역이 서열번호: 4와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하고, 상기 제2 중쇄 가변 영역이 서열번호: 5와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하고, 상기 제1 및 상기 제2 경쇄 가변 영역이 서열번호: 6 또는 7과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
일부 구현예에서, PD-L1에 결합하는 CDR 서열은, 카밧 넘버링에 의해 정의된 바와 같이, 중쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호: 41 내지 43, 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호: 53 내지 55 또는 59 내지 61을 포함한다. 초티아 넘버링하에, 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 서열번호: 44 내지 46에 제시되어 있고, 경쇄 가변 도메인의 CDR은 서열번호: 55 내지 58 또는 62 내지 64에 제시되어 있다.
일부 구현예에서, CD55에 결합하는 CDR 서열은, 카밧 넘버링에 의해 정의된 바와 같이, 중쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호: 47 내지 49, 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, 서열번호: 53 내지 55 또는 59 내지 61을 포함한다. 초티아 넘버링하에, 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 서열번호: 50 내지 52에 제시되어 있고, 경쇄 가변 도메인의 CDR은 서열번호: 56 내지 58 또는 62 내지 64에 제시되어 있다.
일부 구현예에서, 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 서열번호: 65와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 중쇄 아미노산 서열; 서열번호: 66과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제2 중쇄 아미노산 서열; 서열번호: 67 또는 68과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 경쇄 아미노산 서열; 및 서열번호: 67 또는 68과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제2 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 경쇄 아미노산 서열 및 상기 제2 경쇄 아미노산 서열은 동일하다.
불균형 이중특이적 항체 또는 항원 또는 이의 항원-결합 단편의 제조
상기 이중특이적 항체 또는 항원 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 방법에 의해 제조할 수 있다:
1) 2개의 표적 항원을 선택하고, 제1 항원에 결합하는 항체(항체 A)의 중쇄 가변 영역 서열(VHa) 및 경쇄 가변 영역 서열(VLa)을 결정하고, 제2 항원에 결합하는 항체(항체 B)의 중쇄 가변 영역 서열(VHb) 및 경쇄 가변 영역 서열(VLb)을 결정한다.
2) VLa 및 VLb를 정렬시키고, 서열 상동성이 80%를 초과하는 경우, 컴퓨터 모델링 툴(예컨대, BioLuminate from Schordingerm, Cambridge, MA)을 사용하여 공통 VL을 설계한다. 설계 공정 동안, VLa의 친화도를 유지하도록 노력하지만, VLb의 친화도를 어느 정도까지 희생시킬 수 있다. 공통 VL은 VLa, VLb 자체, 또는 서열이 VLa 및 VLb와 높은 상동성을 공유하는 신규한 VLc일 수 있다. 상기 VLa 및 VLb의 3D 구조는, 예를 들어, 구조 모델링 또는 결정 구조로부터 결정될 수 있다. 이 공정은 VLa의 서열에 의해 개시할 수 있다. 3D 구조에 기초하는 경우, 경쇄의 아미노산은 제2 항원에 대한 결합에 중요하고(예를 들어, 이것이 VHb와 쌍으로 되는 경우), 제1 항원과의 결합에 관여하지 않는 것으로 확인되고(예를 들어, 이것이 VHa와 쌍으로 되는 경우), 이어서 VLa의 아미노산은 VLb의 상응하는 아미노산으로 변화될 수 있다. 이 공정을 수회 반복한 후, 공통 VLc를 수득할 수 있다.
3) VLa 및 VLb의 상동성이 80% 미만인 경우, 존재하는 인간 네이브 ScFv 라이브러리의 VL을 항체 A의 VL로 치환시켜 인간 ScFv 또는 Fab 파아지 라이브러리를 제조하고, 이어서 오류 유발 PCR을 사용하여 20% 미만의 뉴클레오타이드 돌연변이를 VL 내로 유도하고, 항체 B의 항원에 대해 패닝하여 이의 VL로서 VLa 또는 이의 동족체(>80% 상동성)를 갖는 신규한 항체 B를 수득한다. 상기 VL이 VLa이 아니라 VLa 동족체(예를 들어, >80% 상동성)인 경우, 단계 2)를 반복하여 공통 VL을 설계한다.
4) 컴퓨터 모델링 툴을 사용하여 각각 VHa 및 VHb 서열을 재-설계함으로써 A 및 B의 생화학적 및 생체물리학적 특성(예를 들어, 3D 등전점(PI))의 차이를 증가시킨다. 이 공정 동안, A의 친화도는 저하될 수 없고, B의 친화도는 어느 정도까지 저하될 수 있다.
5) 완충계를 개발하여 불균형 이중특이적 항체를 정제한다.
펩타이드의 등전점(PI)은 특정 분자가 통계적 평균으로 네트 전하를 갖지 않는 pH이다. 펩타이드를 구성하는 아미노산은 성질상 양성, 음성, 중성 또는 극성일 수 있고, 함께, 단백질에 이의 총 전하를 제공한다. 그러나, 단백질 중의 특정 아미노산은 상기 단백질 내에 매장되고, 그 주위의 용액과 상호작용하지 않을 것이다. 3D PI는 상기 단백질의 3D 구조를 고려하고, 단백질이 적절하게 접혀지는 경우에 통계적 평균으로 네트 전하를 갖지 않는 pH 값의 더 나은 추정치를 제공한다. (본 발명자들은 공보로부터 구배 pH 완충액을 사용했고, 따라서 상기 완충액은 본 발명이 아니다. 그러나, 본 발명자들은 여전히 정제 공정을 최적화할 필요가 있다).
일부 구현예에서, 상기 이중특이적 항체 또는 항원 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 하기 방법에 의해 제조될 수 있다:
(a) 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 동정하는 단계로서, 상기 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함하는, 단계;
(b) VHa, VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
(c) VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80% 미만인 것을 결정하는 단계;
(d) 파아지 디스플레이 항체 라이브러리 중의 모든 경쇄 가변 영역을 상기 VLa로 치환하고, 상기 제2 항원에 대해 패닝(panning)하여 제3 중쇄 가변 영역(VHc)을 수득하는 단계;
(e) 상기 VHa 및 VHc 서열을 재설계하고, 그것에 의해 VHa' 및 VHc'를 수득하여, VHa'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLa를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제1 단백질, 및 VHc'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLa를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제2 단백질 사이의 생화학적 또는 생체물리학적 특성의 차이를 증가시키는 단계; 및
(f) 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 단계로서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLa를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa' 및 VHc'를 각각 포함하는, 단계.
일부 구현예에서, 상기 이중특이적 항체 또는 항원 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 하기 방법에 의해 제조될 수 있다:
(a) 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 동정하는 단계로서, 상기 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함하는, 단계;
(b) VHa, VLa, VHb 및 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
(c) VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80% 미만인 것을 결정하는 단계;
(d) 파아지 디스플레이 항체 라이브러리 중의 모든 경쇄 가변 영역을 복수의 경쇄 가변 영역으로 치환하는 단계로서, 상기 경쇄 가변 영역은 VLa 또는 VLb와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한, 단계;
(e) 상기 제1 및/또는 상기 제2 항원(예를 들어, 상기 제2 항원)에 대해 패닝하는 단계;
(f) 공통 경쇄 가변 영역(VLc) 및 제3 중쇄 가변 영역(VHc)을 선택하는 단계로서, VHa-VLc는 원하는 친화도로 상기 제1 항원에 결합하고, VHc-VLc는 원하는 친화도로 상기 제2 항원에 결합하는, 단계;
(g) 상기 VHa 및 VHc 서열을 재설계하고, 그것에 의해 VHa' 및 VHc'를 수득하여, VHa'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLc를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제1 단백질, 및 VHc'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLc를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제2 단백질 사이의 생화학적 또는 생체물리학적 특성의 차이를 증가시키는 단계; 및
(h) 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 단계로서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLc를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa' 및 VHc'를 각각 포함하는, 단계.
일부 구현예에서, VHa-VLc가 원하는 친화도로 상기 제1 항원에 결합할 수 없는 경우, 추가의 단계가 수행될 수 있다. 예를 들어, VLc가 VLa와 적어도 80% 동일한 경우, 신규한 공통 경쇄가 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 공정은 VLa로 개시하고, 아미노산은 본 명세서에 기재된 방법에 기초하여(예를 들어, VLa 및 VLc의 3D 구조에 기초하여) VLc 중의 아미노산으로 돌연변이될 수 있다.
일부 구현예에서, 공통 경쇄 가변 영역을 설계하는 것은 VLa 및 VLb를 정렬시키고, 동일한 카밧 위치에서 VLa 및 VLb 사이의 상이한 잔기를 연구하는 것을 수반한다. VLb 상의 상이한 잔기가 B Fv 구조 상의 CDR, 계면 잔기, 정식 잔기 또는 버니어 구역 잔기와 접촉하지 않는 경우, VLb 상의 잔기는 VLa 상의 동일한 카밧 위치의 잔기로 돌연변이된다. 달리는, VLb 상의 잔기는 유지된다.
일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역을 재설계하는 것은 바이오루미네이트(BioLuminate)를 사용하여 Fv A 및 Fv B의 3D PI를 계산하고, 비-CDR, 비-정식, 비-계면 및 비-버니어 구역 잔기를 돌연변이시켜, 높은 3D PI를 보다 높게 갖는 Fv 및 낮은 3D PI를 보다 낮게 갖는 Fv를 제조하는 것을 수반한다.
바이오루미네이트를 사용하는 방법은, 예를 들어, 참조를 위한 바이오루미네이트의 사용자 가이드라인에서 발견할 수 있고, 이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입된다.
항체 및 항원 결합 단편
본 개시내용은, 본 명세서에 기재된 상보성 결정 영역(CDR), 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 항체 및 이의 항원-결합 단편은 불균형 이중특이적 항체 및 이의 항원-결합 단편이다.
일반적으로, 항체(또한 소위 면역글로불린)는 2개 부류의 폴리펩타이드 쇄, 경쇄 및 중쇄로 구성된다. 본 개시내용의 비-제한적 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 온전한, 4개 면역글로불린 쇄 항체일 수 있다. 상기 항체의 중쇄는 IgM, IgG, IgE, IgA 또는 IgD를 포함하는 임의의 아이소타입 또는 IgGl, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgEl, IgE2 등을 포함하는 하위-아이소타입의 것일 수 있다. 상기 경쇄는 카파 경쇄 또는 람다 경쇄일 수 있다. 항체는 경쇄의 2개의 동일한 카피 및/또는 중쇄의 2개의 동일한 카피를 포함할 수 있다. 1개의 가변 도메인(또는 가변 영역, VH) 및 다중 불변 도메인(또는 불변 영역)을 각각 함유하는 중쇄는 항체의 "줄기"를 형성하기 위해 이들의 불변 도메인 내에서 디설파이드 결합을 통해 서로 결합한다. 1개의 가변 도메인(또는 가변 영역, VL) 및 1개의 불변 도메인(또는 불변 영역)을 각각 함유하는 경쇄는 디설파이드 결합을 통해 1개의 중쇄에 각각 결합한다. 각 경쇄의 가변 영역은 이것이 결합되어 있는 중쇄의 가변 영역을 따라 정렬된다. 상기 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 더욱 보존된 프레임워크 영역(FR) 사이에 낀 3개의 초가변성 영역을 함유한다.
상보성 결정 영역(CDR)으로서 알려진 이들 초가변성 영역은, 항체의 원리 항원 결합 표면을 포함하는 루프(loop)를 형성한다. 상기 4개의 프레임워크 영역은 대개 베타-시트 형태를 채용하고, 상기 CDR은 상기 베타-시트 구조를 연결하고 일부 경우에 이의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄 내의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 근접하여 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께, 항원-결합 영역의 형성에 기여한다.
항체의 아미노산 서열을 분석하여 항체의 CDR 영역을 확인하는 방법은 잘 알려져 있고, 상기 CDR의 수많은 정의는 통상적으로 사용된다. 카밧 정의는 서열 가변성에 기초하고, 초티아 정의는 구조 루프 영역의 위치에 기초한다. 이들 방법 및 정의는, 예를 들어, 문헌[참조: Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. "Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains," Molecular immunology 45.14 (2008): 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203: 121-53 (1991); Morea et al, Biophys Chem. 68(l-3):9-16 (Oct. 1997); Morea et al, J Mol Biol. 275(2):269-94 (Jan .1998); Chothia et al., Nature 342(6252): 877-83 (Dec. 1989); Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007)]에 기재되어 있고; 이들 각각은 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입된다. 구체적으로 본 개시내용에서 나타내지 않는 한, 카밧 넘버링이 디폴트로서 본 개시내용에서 사용된다.
상기 CDR은 항원의 에피토프를 인식하는데 중요하다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "에피토프"는 항체의 항원 결합 도메인에 의해 구체적으로 결합될 수 있는 표적의 최소 부분이다. 에피토프의 최소 크기는 약 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 아미노산일 수 있지만, 에피토프가 항원의 이차 및 삼차 구조에 기초하여 항원의 3차원 배치형태에 의존할 수 있기 때문에, 이들 아미노산은 항원의 일차 구조의 연속 선형 서열로 존재할 필요는 없다.
일부 구현예에서, 항체는 온전한 면역글로불린 분자(예를 들어, IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA)이다. IgG 서브클래스(IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4)는 잘 보존되어 있고, 이들의 불변 영역, 특히 이들의 힌지 및 상부 CH2 도메인이 상이하다. IgG 서브클래스의 서열 및 차이는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[참조: Vidarsson, et al, "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions." Frontiers in immunology 5 (2014); Irani, et al. "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases." Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016]에 기재되어 있고; 이들 각각은 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입된다.
상기 항체는 또한 임의의 종(예를 들어, 인간, 설치류, 마우스, 랫트, 낙타과)로부터 유래되는 면역글로불린 분자일 수 있다. 본 명세서에 개시된 항체는, 비제한적으로, 다클론성, 단클론성, 단일특이적, 다중특이적 항체, 및 또 다른 폴리펩타이드와 융합된 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라 항체를 포함한다. 용어 "항원 결합 도메인" 또는 "항원 결합 단편"은 온전한 항체의 특이적 결합 활성을 보유하는 항체의 일부, 즉 온전한 항체의 표적 분자 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 임의의 부분이다. 이는, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, 이들 단편의 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, scFv, Fv, Fd, dAb, 이중특이적 항체, 이중특이적 scFv, 디아바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체, 및 항체 결합 도메인이거나 이와 상동성인 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩타이드일 수 있다. 항원 결합 도메인의 비-제한적 예는, 예를 들어, 온전한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR, 온전한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역, 온전한 항체의 전장 중쇄 또는 경쇄, 또는 온전한 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 개개 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 scFV는 2개의 중쇄 가변 도메인 및 2개의 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 scFV는 2개의 항원 결합 영역(항원 결합 영역: A 및 B)을 갖고, 상기 2개의 항원 결합 영역은 상이한 친화도로 각각의 표적 항원에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 키메라 항원 수용체는, CD3-제타 막관통- 및 엔도도메인에 융합된, 본 명세서에 기재된 단일-쇄 가변 단편(scFv)의 융합물이다. 일부 구현예에서, 상기 키메라 항원 수용체는 또한 다양한 공동자극 단백질 수용체(예를 들어, CD28, 41BB, ICOS)로부터의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키메라 항원 수용체는 다중 신호전달 도메인, 예를 들어, CD3z-CD28-41BB 또는 CD3z-CD28-OX40을 포함하여 효력을 증가시킨다. 따라서, 일 양태에서, 본 개시내용은, 본 명세서에 기재된 바와 같이 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포(예를 들어, T 세포)를 추가로 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 2개의 상이한 항원 또는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1, 표 2, 표 11 및 표 12로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 중쇄 가변 영역 CDR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 3, 표 13 및 표 14로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 경쇄 가변 영역 CDR을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 항체는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2, 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)으로서, 상기 CDR1 영역은 선택된 VH CDR1 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어지고, 상기 CDR2 영역은 선택된 VH CDR2 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어지고, 상기 CDR3 영역은 선택된 VH CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 것인 중쇄 가변 영역, 및 CDR 1, 2, 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)으로서, 상기 CDR1 영역은 선택된 VL CDR1 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어지고, 상기 CDR2 영역은 선택된 VL CDR2 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어지고, 상기 CDR3 영역은 선택된 VL CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진 것인 경쇄 가변 영역을 갖는다. 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 표 1, 표 2, 표 11 및 표 12에 제시되어 있고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 표 3, 표 13 및 표 14에 제시되어 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0, 1 또는 2개 아미노산 삽입, 결실 또는 치환과 함께 표 1, 표 2, 표 11 및 표 12로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 함유하는 중쇄 가변 도메인을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 0, 1 또는 2개의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환과 함께 표 3, 표 13 및 표 14로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 함유하는 경쇄 가변 도메인을 함유할 수 있다.
상기 삽입, 결실 및 치환은 상기 CDR 서열 내에, 또는 상기 CDR 서열의 한쪽 또는 양쪽 모두의 말단에 존재할 수 있다.
본 개시내용의 항체 및 항체 단편은 원하는 효과기 기능 또는 혈청 반감기를 제공하기 위해 Fc 영역에서 변형될 수 있다.
항체의 다량체화는 항체의 천연 응집을 통해 또는 당해 기술분야에 알려진 화학적 또는 재조합 연결 기술을 통해 달성할 수 있다. 예를 들어, 정제된 항체 제제(예를 들어, 정제된 IgG1 분자)의 일부 백분율은 항체 동종이량체 및 다른 고차 항체 다량체를 함유하는 단백질 응집물을 자발적으로 형성한다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 항원-결합 단편은 안정화 분자(예를 들어, 대상체에서 또는 용액에서 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 반감기를 증가시키는 분자)와 컨주게이트될 수 있다. 안정화 분자의 비-제한적 예는 폴리머(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜) 또는 단백질(예를 들어, 혈청 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민)을 포함한다. 안정화 분자의 컨주게이트는 시험관내(예를 들어, 조직 배양 중에서 또는 약제학적 조성물로서 저장될 때) 또는 생체내(예를 들어, 인간 내에서)에서 항체 또는 항원-결합 단편의 반감기를 증가시키거나 생물학적 활성을 연장시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 이중특이적 항체)는 치료제와 컨주게이트될 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 콘주게이트는 치료제에 공유 또는 비-공유 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 치료제는 세포독성제 또는 세포증식억제제(예를 들어, 사이코칼라신 B, 그라마이시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신, 메이탄시노이드, 예컨대, DM-1 및 DM-4, 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 에피루비신, 및 사이클로포스파마이드 및 유사체)이다.
항체 특성
본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 이중특이적 항체)는 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 T 세포(예를 들어, CD3+ 세포, CD8+ 및/또는 CD4+ 세포)의 면역 반응, 활성 또는 수를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 5배, 10배 또는 20배 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 T 세포의 활성 또는 수를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 5배, 10배 또는 20배 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 정상 세포(예를 들어, 비-종양 세포)에서 또는 종양 세포의 부재하에서 면역 반응을 유도하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 이중특이적 항체)는 PD-L1 또는 PD-L2에 결합할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 PD-1 및 PD-L1 사이의 결합 및/또는 PD-1 및 PD-L2 사이의 결합을 차단할 수 있다. 일부 구현예에서, PD-L1 또는 PD-L2에 결합함으로써, 상기 항체는 PD-1 신호전달 경로를 억제하고 면역 반응을 상향조절할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 PD-1 길항제(antagonist)이다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 PD-1 작용제(agonist)이다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 이중특이적 항체)는 CD3에 결합할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 T 세포를 표적 세포로 동원할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 항체(또는 이의 항원-결합 단편)은 0.1 s-1 미만, 0.01 s-1 미만, 0.001 s-1 미만, 0.0001 s-1 미만 또는 0.00001 s-1 미만의 해리 속도(koff)로 특이적으로 항원(예를 들어, 인간 단백질, 원숭이 단백질 및/또는 마우스 단백질)에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 해리 속도(koff)는 0.01 s-1 초과, 0.001 s-1 초과, 0.0001 s-1 초과, 0.00001 s-1 초과 또는 0.000001 s-1 초과이다. 일부 구현예에서, 동력학 결합 속도(kon)는 1 x 102/Ms 초과, 1 x 103/Ms 초과, 1 x 104/Ms 초과, 1 x 105/Ms 초과 또는 1 x 106/Ms 초과이다. 일부 구현예에서, 동력학 결합 속도(kon)는 1 x 105/Ms 미만, 1 x 106/Ms 미만 또는 1 x 107/Ms 미만이다.
친화도는 동력학 속도 상수의 몫(Kd=koff/kon)으로부터 추론할 수 있다. 일부 구현예에서, Kd는 1 x 10-4　M 미만, 1 x 10-5　M 미만, 1 x 10-6 M 미만, 1 x 10-7 M 미만, 1 x 10-8　M 미만, 1 x 10-9　M 미만 또는 1 x 10-10　M 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 Kd는 50 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM 또는 1 nM 미만이다. 일부 구현예에서, Kd는 1 x 10-4 M 초과, 1 x 10-5　M 초과, 1 x 10-6　M 초과, 1 x 10-7　M 초과, 1 x 10-8　M 초과, 1 x 10-9　M 초과, 1 x 10-10　M 초과, 1 x 10-11　M 초과 또는 1 x 10-12　M 초과이다. 추가로, Ka는 식 Ka=1/Kd에 의해 Kd로부터 추론할 수 있다.
항원에 대한 항체의 친화도를 측정하는 일반적 기술은, 예를 들어, ELISA, RIA 및 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 포함한다.
일부 구현예에서, 열 안정성이 결정된다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편은 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95℃ 초과의 Tm을 가질 수 있다.
IgG는 다중-도메인 단백질로서 기재될 수 있기 때문에, 용융 곡선은 때때로 제1 변성 온도, Tm D1 및 제2 변성 온도 Tm D2, 및 선택적으로 제3 변성 온도 Tm D3과 함께 2개 전이 또는 3개 전이를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편은 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95℃ 초과의 Tm D1을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편은 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95℃ 초과의 Tm D2를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편은 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95℃ 초과의 Tm D3을 갖는다.
일부 구현예에서, Tm, Tm Dl, Tm D2, Tm D3은 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95℃ 미만이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편은, 온도가 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95℃ 미만인 경우, 응집의 형성을 개시하지 않는다. 일부 구현예에서, Tagg266 또는 Tagg473은 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95℃ 미만이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편은 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8 또는 9.9 초과의 pI를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편은 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8 또는 9.9 미만의 pI를 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 항체는, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%를 초과하는 종양 성장 억제 백분율(TGI%)을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 항체는, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200% 미만의 종양 성장 억제 백분율을 갖는다. 상기 TGI%는, 예를 들어, 처리 개시후 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일에, 또는 처리 개시후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월에 결정될 수 있다. 본 명세서에 사용될 때 상기 종양 성장 억제 백분율(TGI%)은 하기 식을 사용하여 계산된다:
TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] x 100
Ti는 i일째에 처리 그룹의 평균 종양 부피이다. TO는 0일째에 처리 그룹의 평균 종양 부피이다. Vi는 i일째에 대조군 그룹의 평균 종양 부피이다. VO는 0일째에 대조군 그룹의 평균 종양 부피이다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 보체 의존적 세포독성(CDC)을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 5배, 10배 또는 20배 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ACDD)을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 5배, 10배 또는 20배 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 내재화율을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 5배, 10배 또는 20배 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 식균작용율을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 5배, 10배 또는 20배 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, 효과기 T 세포 증식을 증가시키고/시키거나 상기 효과기 T 세포에 의한 감마 인터페론 생산을 증가시킴으로써(예를 들어, 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 사용한 처리 전의 증식 및/또는 사이토카인 생산과 비교하여) T 세포 기능을 증강시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, CD4+ 효과기 T 세포 증식을 증가시키고/시키거나 상기 CD4+ 효과기 T 세포에 의한 감마 인터페론 생산을 증가시킴으로써(예를 들어, 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 사용한 처리 전의 증식 및/또는 사이토카인 생산과 비교하여) CD4+ 효과기 T 세포 기능을 증강시킨다. 일부 구현예에서, 상기 사이토카인은 감마 인터페론이다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 항체 또는 항원 결합 단편을 사용한 처리 전의 종양내 (침윤성) CD4+ T 세포의 수와 비교하여, 종양내 (침윤성) CD4+ 효과기 T 세포의 수(예를 들어, CD4+ 효과기 T 세포의 총수 또는, 예를 들어, CD45+ 세포 중의 CD4+ 세포의 백분율)를 증가시킨다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, 처리 전의 감마 인터페론을 발현하는 종양내 (침윤성) CD4+ T 세포의 수와 비교하여, 감마 인터페론을 발현하는 종양내 (침윤성) CD4+ 효과기 T 세포의 수(예를 들어, CD4+ 세포를 발현하는 총 감마 인터페론 또는, 예를 들어, 총 CD4+ 세포 중의 CD4+ 세포를 발현하는 감마 인터페론의 백분율)를 증가시킨다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, 처리 전의 종양내 (침윤성) CD8+ T 효과기 세포의 수와 비교하여, 종양내 (침윤성) CD8+ 효과기 T 세포의 수(예를 들어, CD8+ 효과기 T 세포의 총수 또는, 예를 들어, CD45+ 세포 중의 CD8+의 백분율)를 증가시킨다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, 항체를 사용한 처리 전에 감마 인터페론을 발현하는 종양내 (침윤성) CD8+ T 세포의 수와 비교하여, 감마 인터페론을 발현하는 종양내 (침윤성) CD8+ 효과기 T 세포의 수(예를 들어, 총 CD8+ 세포에서 감마 인터페론을 발현하는 CD8+ 세포의 백분율)를 증가시킨다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어 기억 T 세포 증식을 증가시키고/시키거나 상기 기억 세포에 의한 사이토카인(예를 들어, 감마 인터페론) 생산을 증가시킴으로써 기억 T 세포 기능을 증강시킨다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 기능성 Fc 영역을 갖는다. 일부 구현예에서, 기능성 Fc 영역의 효과기 기능은 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC)이다. 일부 구현예에서, 기능성 Fc 영역의 효과기 기능은 식균작용이다. 일부 구현예에서, 기능성 Fc 영역의 효과기 기능은 ADCC 및 식균작용이다. 일부 구현예에서, 상기 Fc 영역은 인간 IgGl, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4이다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 세포자멸사를 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 기능성 Fc 영역을 갖지 않는다. 예를 들어, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편이다.
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화 항체이다. 상기 인간화 백분율은 국제 면역유전학 정보 시스템(IMGT) 데이터베이스에서 인간 항체 서열과 비교하여 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열의 백분율 동일성을 의미한다. 일부 구현예에서, 인간화 백분율은 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 초과이다. 인간화 백분율을 결정하는 방법에 관한 상세한 설명은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[참조: Jones, Tim D., et al. "The INNs and outs of antibody nonproprietary names." MAbs. Vol. 8. No. 1. Taylor & Francis, 2016]에 기재되어 있고, 이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입된다. 높은 인간화 백분율은 종종 다양한 이점, 예를 들어, 인간에서 보다 안전하고 보다 효과적이고, 인간 대상체에 의해 보다 용인될 가능성이 있으며 보다 적은 부작용을 가질 가능성이 있다는 이점을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 항체이다.
재조합 벡터
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 단리된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)를 포함하는 재조합 벡터(예를 들어, 발현 벡터), 재조합 벡터를 도입한 숙주 세포(즉, 상기 숙주 세포가 상기 폴리뉴클레오타이드 및/또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 함유하도록), 및 재조합 기술에 의한 재조합 항체 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 생산을 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "벡터"는, 상기 벡터가 숙주 세포에 도입되는 경우, 목적하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(들)를 상기 숙주 세포에 전달할 수 있는 임의의 작제물(construct)이다. "발현 벡터"는, 상기 발현 벡터가 도입되어 있는 숙주 세포 중의 인코딩된 폴리펩타이드로서 목적하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(들)을 전달 및 발현할 수 있다. 따라서, 발현 벡터에서, 목적하는 폴리뉴클레오타이드는, 목적하는 폴리뉴클레오타이드가 발현 벡터를 도입한 숙주 세포에서 번역될 수 있도록, 목적하는 폴리뉴클레오타이드의 통합 부위에서 또는 통합 부위 근방에서 또는 통합 부위와 측접하여 벡터 내에 또는 숙주 세포의 게놈 내에서 조절 인자, 예컨대, 프로모터, 인핸서(enhancer) 및/또는 폴리-A 테일과 작동가능하게 연결됨으로써 상기 벡터에서의 발현을 위해 배치된다.
벡터는 당해 분야에서 알려진 방법, 예를 들어, 전기천공, 화학적 형질감염(예를 들어, DEAE-덱스트란), 전환, 형질감염 및 감염 및/또는 형질도입(예를 들어, 재조합 바이러스를 사용)에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 따라서, 벡터의 비-제한적 예는 바이러스 벡터(이는 재조합 바이러스를 생성하기 위해 사용될 수 있음), 네이키드 DNA 또는 RNA, 플라스미드, 코스미드, 파아지 벡터, 및 양이온성 축합제와 연관된 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함한다.
일부 실행에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드)는 바이러스 발현 시스템(예를 들어, 백시니아 또는 다른 폭스 바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스)를 사용하여 도입되고, 이는 비병원성(결함있는), 복제 가능 바이러스의 사용을 수반할 수 있거나 복제 결함있는 바이러스를 사용할 수 있다. 후자의 경우에, 바이러스 번식은 일반적으로 보체 바이러스 포장 세포에서만 발생할 것이다. 적합한 시스템은, 예를 들어, 문헌[참조: Fisher-Hoch et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321; Flexner et al., 1989, Ann. NY. Acad Sci. 569:86-103; Flexner et al, 1990, Vaccine, 8: 17-21; 미국특허 제4,603,112호, 제4,769,330호, 및 제5,017,487호; WO 제89/01973호; 미국 특허 제4,777,127호; 영국 특허 제2,200,651호; 유럽 특허 제0,345,242호; WO 제91/02805호; Berkner-Biotechmques, 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., 1991, Science, 252:431-434; Kolls et al, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 :215-219; Kass-Eisler et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 11498-11502; Guzman et al, 1993, Circulation, 88:2838-2848; and Guzman et al., 1993, Cir. Res., 73: 1202-1207]에 개시되어 있다. DNA를 이러한 발현 시스템에 도입하는 기술은 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있다. 상기 DNA는 또한, 예를 들어, 문헌[참조: Ulmer et al., 1993, Science, 259: 1745-1749, and Cohen, 1993, Science, 259: 1691-1692]에 기재된 바와 같이, "네이키드"일 수 있다. 네이키드 DNA의 흡수는 세포 내로 효율적으로 수송되는 생분해성 비드에 상기 DNA를 코팅함으로써 증가될 수 있다.
발현을 위해, 본원에 개시된 항체-인코딩 또는 폴리펩타이드-인코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 삽입물은 적절한 프로모터(예를 들어, 이종성 프로모터), 예컨대, 몇몇 예를 들면, 파아지 람다 PL 프로모터, 이. 콜리 lac, trp 및 tac 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다른 적합한 프로모터가 숙련가에게 알려져 있다. 발현 작제물은 전사 개시, 종결을 위한 부위, 및 전사된 영역에서 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 추가로 함유할 수 있다. 상기 작제물에 의해 발현된 성숙 전사체의 코딩 부분은, 번역될 폴리펩타이드의 말단에 적절하게 배치된 개시 및 종료 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)에서 개시하는 번역을 포함할 수 있다.
지시된 바와 같이, 상기 발현 벡터는 적어도 하나의 선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 그와 같은 마커는 디하이드로폴레이트 환원효소 또는 진핵 세포 배양을 위한 네오마이신 내성 및 이. 콜리 및 다른 박테리아에서 배양하기 위한 테트라사이클린 또는 암피실린 내성 유전자를 포함한다. 적절한 숙주의 대표적 예는, 비제한적으로, 박테리아 세포, 예컨대, 이. 콜리, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 타이피뮤리움 세포; 진균 세포, 예컨대, 효모 세포; 곤충 세포, 예컨대, 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9 세포; 동물 세포, 예컨대, CHO, COS, 절개(Bowes) 흑색종 및 HK 293 세포; 및 식물 세포를 포함한다. 본 명세서에 기재된 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지 및 조건은 당해 기술에 공지되어 있다.
박테리아에서 사용하기 위한 비제한적 벡터는 퀴아겐(Qiagen)으로부터 이용가능한 pQE70, pQE60 및 pQE-9; 스트라타진(Stratagene)으로부터 이용가능한 pBS 벡터, 파지스크립트(Phagescript) 벡터, 블루스크립트(Bluescript) 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; 및 파마시아(Pharmacia)로부터 이용가능한 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5를 포함한다. 비제한적 진핵 벡터는 스트라타진으로부터 이용가능한 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl 및 pSG; 및 파마시아로부터 이용가능한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL을 포함한다. 다른 적합한 벡터는 숙련가에게 용이하게 명백할 것이다.
사용에 적합한 비제한적 박테리아 프로모터는 이. 콜리 lacI 및 lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR 및 PL 프로모터 및 trp 프로모터를 포함한다. 적합한 진핵 프로모터는 CMV 즉시 초기 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 예컨대, 루 육종 바이러스(RSV)의 것들, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터를 포함한다.
효모 사카로마이세스 세레비지애에서, 구성적 또는 유도성 프로모터, 예컨대, 알파 인자, 알코올 옥시다제 및 PGH를 함유하는 수많은 벡터가 사용될 수 있다. 검토를 위해, 문헌[참조: Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, and Grant et al, Methods EnzymoL., 153: 516-544 (1997)]을 참조한다.
상기 숙주 세포 내로 상기 작제물의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 양이온성 지질-매개된 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 다른 방법에 의해 실시할 수 있다. 그와 같은 방법은 다수의 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대, 문헌[참조: Davis et al, Basic Methods In Molecular Biology (1986)]에 기재되어 있고, 이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입된다.
보다 고등 진핵생물에 의해 본 개시내용의 항체를 인코딩하는 DNA의 전사는 상기 벡터 내로 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가시킬 수 있다. 인핸서는, 소정 숙주 세포-유형에서 프로모터의 전사 활성을 증가시키도록 작용하는, 일반적으로 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-작용 요소이다. 인핸서의 예는, 염기쌍 100 내지 270에서 복제 기원의 후반 상에 위치하는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후반 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다.
번역된 단백질이 소포체의 내강, 주변세포질 공간 또는 세포외 환경으로 분비되도록, 적절한 분비 신호가 상기 발현된 폴리펩타이드에 편입될 수 있다. 상기 신호는 폴리펩타이드에 내인성일 수 있거나, 또는 이들은 이종성 신호일 수 있다.
상기 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)는 변형된 형태, 예컨대, 융합 단백질(예를 들어, GST-융합) 또는 히스티딘-tag를 갖도록 발현될 수 있고, 분비 신호 뿐만 아니라 추가의 이종성 기능성 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역은, 정제 동안 또는 후속적 취급 및 저장 동안, 상기 숙주 세포에서 안정성 및 지속성을 개선시키기 위해 상기 폴리펩타이드의 N-말단에 부가될 수 있다. 또한, 펩타이드 모이어티는 정제를 촉진하기 위해 상기 폴리펩타이드에 부가될 수 있다. 그와 같은 영역은 상기 폴리펩타이드의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 그 중에서도, 분비 또는 배출을 생기게 하고 안정성을 개선시키고 정제를 촉진하기 위해 폴리펩타이드에 펩타이드 모이어티를 부가하는 것은 당업계에서 친숙하고 일상적인 기술이다.
본 개시내용은 또한, 본 명세서에 기재된 임의의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 핵산 서열, 및 본 명세서에 기재된 임의의 아미노산 서열과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 제공한다.
본 개시내용은 또한, 본 명세서에 기재된 임의의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 갖는 핵산 서열, 및 본 명세서에 기재된 임의의 아미노산 서열과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재되어 있는 임의의 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 임의의 아미노산 서열에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 서열은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500 또는 600개 뉴클레오타이드 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 아미노산 서열은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350 또는 400개 아미노산 잔기 미만이다.
일부 구현예에서, 상기 아미노산 서열은 (i) 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 (ii) 아미노산 서열로 이루어지고, 여기서 상기 아미노산 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같은 서열 중의 어느 하나이다.
일부 구현예에서, 상기 핵산 서열은 (i) 핵산 서열을 포함하거나; 또는 (ii) 핵산 서열로 이루어지고, 여기서 상기 핵산 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같은 서열 중의 어느 하나이다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 상기 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 갭은 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 중의 하나 또는 둘 모두 또는 핵산 서열에 도입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 비교 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 80%이고, 일부 구현예에서 적어도 90%, 95% 또는 100%이다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 비교된다. 제1 서열 중의 위치가 제2 서열 중의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유되는 경우, 그 분자는 그 위치에서 동일하다(본 명세서에 사용될 때, 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"에 대해 등가이다). 2개 서열 사이의 동일성 퍼센트는, 상기 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 상기 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다. 본 발명의 목적을 위해, 2개 서열 사이의 서열의 비교 및 동일성 퍼센트의 결정은, 12의 갭 페널티, 4의 갭 연장 페널티 및 5의 틀이동 갭 페널티를 갖는 블로쑴(Blossum) 62 평점 매트릭스를 사용하여 달성될 수 있다.
서열 상동성(예를 들어, 아미노산 서열 상동성 또는 핵산 상동성)의 백분율이 또한 결정될 수 있다. 서열 상동성의 백분율을 결정하는 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 유사한 물리화학 특성(상동성 퍼센트)과 함께 보존된 아미노산 잔기, 예를 들어, 류신 및 이소류신을 사용하여 서열 유사성을 측정할 수 있다. 유사한 물리화학 특성을 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당업계에서 정의되어 있다. 이들 계열은, 예를 들어, 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 무전하 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 무극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 상동성 백분율은, 다수의 사례에서, 동일성 백분율보다 더 높다.
항체를 제조하는 방법
인간 단백질의 단리된 단편(예를 들어, CD55, CD3, 암 특이적 항원 또는 암-연관된 항원)은 다클론성 및 단클론성 항체 제제에 대한 표준 기술을 사용하여 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 다클론성 항체는 항원성 펩타이드 또는 단백질의 다중 주사(예를 들어, 피하 또는 복강내 주사)에 의해 동물에서 발생된다. 일부 구현예에서, 상기 항원성 펩타이드 또는 단백질은 적어도 하나의 아쥬반트와 함께 주입된다. 일부 구현예에서, 상기 항원성 펩타이드 또는 단백질은, 면역화될 종에서 면역원성인 제제에 컨주게이트될 수 있다. 동물은 1회보다 많이(예를 들어, 2회, 3회 또는 4회) 상기 항원성 펩타이드 또는 단백질을 주입받을 수 있다.
전장 폴리펩타이드 또는 단백질이 사용될 수 있거나, 대안적으로, 이의 항원성 펩타이드 단편이 면역원으로 사용될 수 있다. 단백질의 항원성 펩타이드는 단백질의 아미노산 서열의 적어도 8개(예를 들어, 적어도 10, 15, 20 또는 30개) 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 펩타이드에 대해 발생된 항체가 단백질과의 특이적 면역 복합체를 형성하도록 상기 단백질의 에피토프를 포함한다.
면역원은 전형적으로 적합한 대상체(예를 들어, 인간 또는 적어도 하나의 인간 면역글로불린 유전자좌를 발현하는 형질전환 동물)를 면역화함으로써 항체를 제조하기 위해 사용된다. 적절한 면역원성 제제는, 예를 들어, 재조합으로-발현된 또는 화학적으로-합성된 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 상기 제제는 아쥬반트, 예컨대, 프로인트 완전 또는 불완전 아쥬반트 또는 유사한 면역자극성 제제를 추가로 포함할 수 있다.
다클론성 항체는, 면역원으로서 폴리펩타이드 또는 이의 항원성 펩타이드(예를 들어, 단백질의 일부)를 사용하여 적합한 대상체를 면역화함으로써 상기 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 상기 면역화된 대상체에서 항체 역가는 표준 기술, 예컨대, 고정화된 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 사용한 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 경시적으로 모니터링될 수 있다. 요망하는 경우, 상기 항체 분자는 포유동물(예를 들어, 혈액)으로부터 단리될 수 있고, 공지된 기술, 예컨대, IgG 분획을 수득하기 위한 단백질 G 크로마토그래피의 단백질 A에 의해 추가로 정제될 수 있다. 면역화후 적절한 시간에서, 예를 들어, 특이적 항체 역가가 최고인 경우, 항체-생산 세포를 상기 대상체로부터 수득하고, 표준 기술, 예컨대, 문헌[참조: Kohler et al. (Nature 256:495-497, 1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술[참조: Kozbor et al., Immunol. Today 4:72, 1983], EBV-하이브리도마 기술[참조: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985], 또는 트리오마 기술에 의해 단클론성 항체를 제조하기 위해 사용할 수 있다. 하이브리도마를 생산하는 기술은 잘 알려져 있다[참조: 일반적으로, Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY]. 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 예를 들어, 표준 ELISA 검정을 사용하여, 목적하는 폴리펩타이드 또는 에피토프에 결합하는 항체에 대해 하이브리도마 배양 상청액을 스크리닝함으로써 검출된다.
본 명세서에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체는, 본 명세서에 기재된 인간, 인간화된, 또는 키메라 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 DNA 내로 적절한 뉴클레오타이드 변화를 도입함으로써, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변이체는, 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 도메인의 항원-결합 부위를 구성하는 아미노산 서열 내에서 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 이러한 변이체의 모집단에서, 일부 항체 또는 항원-결합 단편은 표적 단백질에 대해 증가된 친화도를 가질 것이다. 결실, 삽입 및/또는 조합의 임의의 조합은, 표적에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 도달하게 할 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편 내로 도입된 아미노산 변화는 또한 상기 항체 또는 항원-결합 단편 내로 신규한 번역후 변형, 예컨대, 당화 부위 수의 변화(예를 들어, 증가 또는 감소), 당화 부위 유형의 변화(예를 들어, 상이한 당이 세포에 존재하는 효소에 의해 부착되도록 아미노산 서열의 변화), 또는 신규한 당화 부위의 도입을 변경 또는 도입할 수 있다.
본 명세서에 개시된 항체는 포유동물을 포함하는 임의 종의 동물로부터 유래할 수 있다. 천연 항체의 비-제한적 예는, 인간 항체를 생산하기 위해 유전자적으로 조작된 형질전환 설치류를 포함하여, 인간, 영장류, 예를 들어, 원숭이 및 유인원, 소, 돼지, 말, 양, 낙타과(예를 들어, 낙타 및 라마), 닭, 염소 및 설치류(예를 들어, 랫트, 마우스, 햄스터 및 토끼)로부터 유래된 항체를 포함한다.
파아지 디스플레이(패닝)를 사용하여, 원하는 결합 친화도를 갖는 항체 서열을 최적화시킬 수 있다. 이러한 기술에서, 단일 쇄 Fv(VH 또는 VL을 포함)을 인코딩하는 유전자를 파아지 코팅 단백질 유전자에 삽입하여, 상기 파아지가 이의 외부에 scFv를 "디스플레이"하고 이의 내부에 단백질용의 유전자를 함유하게 함으로써, 유전자형 및 표현형 사이의 연결을 제공할 수 있다. 이어서, 이들 디스플레이 파아지를 표적 항원에 대해 선별하여, 디스플레이된 항원 결합 부위 및 표적 항원 사이의 상호작용을 검출할 수 있다. 따라서 단백질의 거대 라이브러리를 시험관내 선별로 불리우는 공정에서 선별 및 증폭시킬 수 있고, 원하는 결합 친화도를 갖는 항체 서열을 수득할 수 있다.
인간 및 인간화된 항체는, 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 (또는 이로부터 유래된 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는) 가변성 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 인간 항체는, 예를 들어, CDR에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열(예를 들어, 무작위 또는 시험관내 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
인간화된 항체는, 전형적으로 비-인간 CDR이 그라프팅된 인간 프레임워크(FR)를 갖는다. 따라서, 인간화된 항체는 비-인간인 공급원으로부터 이것 내로 도입된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "임폴트(import)" 잔기로 지칭되고, 이는 전형적으로 "임폴트" 가변 도메인으로부터 취득된다. 인간화는, 예를 들어, 설치류 CDR들 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 본질적으로 수행된다. 이들 방법은, 예를 들어, 문헌[참조: Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988); 이들 각각은 본 명세서에서 참고로 전체적으로 편입된다]에 기재되어 있다. 따라서, "인간화된" 항체는 키메라 항체이고, 여기서 실질적으로 하나보다 적은 온전한 인간 V 도메인은 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환되어 있다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로, 일부 CDR 잔기 및 일부 FR 잔기가 인간 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환되어 있는 마우스 항체이다.
항체는 상기 항원 및 다른 양호한 생물학적 특성에 대해 고 특이성 및 친화도를 유지하며 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 인간화된 항체는 친계 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용하는 친계 서열 및 다양한 개념의 인간화된 생성물의 분석 방법에 의해 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고 당해 분야의 숙련가에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능성있는 3차원 형태적 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이의 점검은 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 상기 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 이의 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로서, FR 잔기는 수령체 및 임폴트 서열로부터 선택 및 조합될 수 있고, 이에 의해 목적하는 항체 특징, 예컨대, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성된다.
최초 서열과 관련하여 동일성 또는 상동성은 일반적으로, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬시키고 갭을 도입한 후 및 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고서, 인간, 인간화된 또는 키메라 항체 또는 단편 내에 존재하는 서열과 동일한 후보 서열 내에 존재하는 아미노산 잔기의 백분율이다.
일부 구현예에서, 공유 변형은 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대해 이루어질 수 있다. 이들 공유 변형은 화학적 또는 효소적 합성에 의해, 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 이루어질 수 있다. 상기 항체 또는 항체 단편의 다른 유형의 공유 변형은 상기 항체 또는 단편의 표적화된 아미노산 잔기를, 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화 제제와 반응시킴으로써 분자 내로 도입된다.
일부 구현예에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어, WO 제2008/077546호에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정될 때, Asn 297에 부착된 모든 당구조의 합계(예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노즈 구조)에 대한, Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 상기 Fc 영역에서 약 위치 297(Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링; 또는 카밧 넘버링에서 위치 314)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭한다;그러나, Asn297은 또한 위치 297의 약 ±3 아미노산 상류(upstream) 또는 하류(downstream), 즉 항체 중의 미세한 서열 변동에 기인하여 위치 294 내지 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 글리칸 불균질성을 감소시키기 위해, 상기 항체의 Fc 영역은 위치 297에서 아스파라긴을 알라닌(N297A)으로 대체하도록 추가로 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, Fab-아암 교환을 회피함으로써 생산 효율을 촉진시키기 위해, 상기 항체의 Fc 영역은 IgG4의 위치 228(EU 넘버링)에서 세린을 프롤린(S228P)으로 대체하도록 추가로 조작한다. S228 돌연변이에 관한 상세한 설명은, 예를 들어, 문헌[참조: Silva et al. "The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation." Journal of Biological Chemistry 290.9 (2015): 5462-5469]에 기재되어 있고, 이는 본 명세서에서 참고로 전체적으로 편입된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 이중특이적 항체를 제조하도록 설계된다. 이중특이적 항체는, 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면을 조작함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 함유할 수 있다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)으로 대체된다. 큰 측쇄(들)과 동일하거나 또는 유사한 크기의 보상성 "공동"은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 산물, 예컨대, 동종이량체에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 기전을 제공한다. 이 방법은, 예를 들어, WO 제96/27011호에 기재되어 있고, 이는 참고로 전체적으로 편입된다.
일부 구현예에서, IgG의 CH3 부분 중의 하나 이상의 아미노산 잔기는 치환된다. 일부 구현예에서, 하나의 중쇄는 하기 치환 Y349C 및 T366W 중의 하나 이상을 갖는다. 다른 중쇄는 하나 이상의 하기 치환 E356C, T366S, L368A 및 Y407V을 가질 수 있다. 게다가, 치환(-ppcpScp->-ppcpPcp-)은 또한 둘 모두 치환된 IgG의 힌지 영역에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 중쇄는 T366Y(놉(knob)) 치환을 갖고, 다른 중쇄는 Y407T(홀(hole)) 치환을 갖는다.
게다가, 음이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 이중특이적 항체를 정제할 수 있다. 음이온-교환 크로마토그래피는, 양으로 하전된 그룹, 예컨대, 디에틸-아미노에틸 그룹(DEAE)을 함유하는 이온교환 수지를 사용하여 이의 전하에 기초하여 물질을 분리하는 공정이다. 용액에서, 상기 수지는 양으로 하전된 반대 이온(양이온)으로 코팅된다. 음이온 교환 수지는, 반대 이온을 치환하며 음으로 하전된 분자에 결합할 것이다. 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 그것의 등전점(pI)에 기초하여 단백질을 정제할 수 있다. 상기 등전점은 단백질이 순전하를 갖지 않는 pH로서 정의된다. pH > pI일 때에 단백질은 순 음전하를 갖고, pH < pI일 때에 단백질은 순 양전하를 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, 상이한 아미노산 치환이 2개의 중쇄에 도입될 수 있고, 이에 의해 2개의 아암 A를 포함하는 동종이량체의 pI 및 2개의 아암 B를 포함하는 동종이량체의 pI는 상이하다. 아암 A 및 아암 B를 갖는 이중특이적 항체의 pI는 대략 상기 동종이량체의 두(2) pI 사이에 있을 것이다. 따라서, 상기 2개의 동종이량체 및 상기 이중특이적 항체는 상이한 pH 조건에서 방출될 수 있다. 본 개시내용은 수 개(a few)의 아미노산 잔기 치환이 pI를 조정하기 위해 상기 중쇄에 도입될 수 있음을 나타낸다.
따라서, 일부 구현예에서, 카밧 넘버링 위치 83에서 아미노산 잔기는 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘이다. 일부 구현예에서, 위치 1, 6, 43, 81 및 105(카밧 넘버링) 중의 하나 이상에서 아미노산 잔기는 아스파르트산 또는 글루탐산이다.
일부 구현예에서, 위치 13 및 105(카밧 넘버링) 중의 하나 이상에서 아미노산 잔기는 아스파르트산 또는 글루탐산이다. 일부 구현예에서, 위치 13 및 42(카밧 넘버링) 중의 하나 이상에서 아미노산 잔기는 라이신, 아르기닌, 히스티딘 또는 글리신이다.
이중특이적 항체는 또한, 예를 들어, 가교결합된 또는 "헤테로콘주게이트" 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 헤테로콘주게이트 중의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링될 수 있고, 다른 것은 비오틴에 커플링될 수 있다. 헤테로콘주게이트 항체는 또한 임의의 편리한 가교결합 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제 및 가교결합 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입된다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 방법은 또한 당해 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 사용하여 제조할 수 있다. 문헌[참조: Brennan et al. (Science 229:81, 1985)]은, 온전한 항체가 단백질분해에 의해 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기재한다. 근접 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 결합을 방지하는 디티올 착화제 아비산나트륨의 존재하에 상기 단편이 환원된다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab' TNB 유도체 중의 하나를 머캅토에틸아민과의 반응에 의해 Fab' 티올로 재전환시키고, 등몰량의 또 다른 Fab' TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다.
치료 방법
본 명세서에 기재된 방법은 암과 연관된 장애의 치료 방법을 포함한다. 일반적으로, 본 방법은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료 유효량의 조작된 이중특이적 항체(예를 들어, 불균형 이중특이적 항체) 또는 이의 항원 결합 단편을, 이러한 치료를 필요로 하거나 또는 이러한 치료를 필요로 하는 것으로 결정된 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
이 문맥에서 사용된 바와 같이, "치료하다"는 암과 연관된 장애의 적어도 하나의 증상을 개선시키는 것을 의미한다. 종종, 암은 사망을 초래하고; 따라서, 치료는 증가된 기대 수명(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년)을 초래할 수 있다. 암과 연관된 병태의 치료를 위한 본 명세서에 기재된 제제(예를 들어, 불균형 이중특이적 항체)의 치료 유효량의 투여는 암 세포의 감소된 수 및/또는 경감된 증상을 초래할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 자율적 증식, 즉, 비정상 상태 또는 세포 성장을 빠르게 증식시키는 특징의 병태를 위한 수용력을 갖는 세포를 지칭한다. 이 용어는, 조직 병리적 유형 또는 침입 단계와 무관하게, 모든 유형의 암성 성장 또는 종양발생 프로세스, 전이성 조직 또는 악성으로 전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "종양"은 암성 세포, 예를 들어, 암성 세포 덩어리를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 치료 또는 진단될 수 있는 암은 다양한 기관계의 악성종양, 예컨대, 폐, 유방, 갑상선, 림프양, 위장 및 생식기-요로에 영향을 미치는 악성종양, 뿐만 아니라 악성종양을 포함하는 선암종, 예컨대, 결장암, 신장-세포 암종, 전립선암 및/또는 고환 종양, 폐의 비-소세포 암종, 소장암 및 식도암을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 제제는 대상체에서 암종을 치료 또는 진단하기 위해 설계된다. 용어 "암종"은 당해 분야에서 인식되고, 호흡계 암종, 위장관계 암종, 비뇨생식기계 암종, 고환 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 내분비계 암종 및 흑색종을 포함하는 상피성 또는 내분비 조직의 악성종양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 암은 신장 암종 또는 흑색종이다. 예시적 암종은 자궁경부, 폐, 전립선, 유방, 두경부, 결장 및 난소로부터 형성되는 것들을 포함한다. 이 용어는 또한 암육종을 포함하고, 이는, 예를 들어, 암종 및 육종성 조직으로 구성된 악성 종양을 포함한다. "선암종"은 선상 조직으로부터 유래되거나 종양 세포가 인식가능한 선상 구조를 형성하고 있는 암종을 지칭한다. 용어 "육종"은 당해 기술분야에 인식되고, 간엽 유도의 악성 종양을 지칭한다.
일부 구현예에서, 상기 암은 리툭시맙(리툭산®) 내성 암이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 또한 대상체에서 암을 치료하는 방법, 대상체에서 경시적으로 종양 용적의 증가 속도를 저하시키는 방법, 전이 발달 위험을 저하시키는 방법, 또는 대상체에서 추가 전이의 발달 위험을 저하시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 치료는 암의 진행을 정지, 지체, 지연 또는 억제시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 치료는 대상체의 암의 하나 이상의 증상의 개수, 중증도 및/또는 지속기간의 감소를 초래할 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은, 본원에 개시된 치료 유효량의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체 약물 콘주게이트를, 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 암, 예를 들어, 유방암(예를 들어, 삼중-음성 유방암), 암양종 암, 자궁경부암, 자궁내막암, 신경아교종, 두경부암, 간암, 폐암, 소세포 폐암, 림프종, 흑색종, 난소암, 췌장 암, 전립선암, 신장암, 결장직장암, 위암, 고환암, 갑상선암, 방광암, 요도암 또는 혈액성 악성종양을 갖거나 또는 갖는 것으로 확인되거나 진단된 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 "대상체" 및 "환자"는 본 명세서 전체에 걸쳐 상호교환적으로 사용되고, 본 발명의 방법에 따르는 치료가 제공되는 동물, 인간 또는 비-인간을 기재한다. 수의과 및 비-수의과 적용이 본 발명에 의해 고려된다. 인간 환자는 성인 인간 또는 유년 인간(예를 들어, 18세 연령 미만의 인간)일 수 있다. 인간에 추가하여, 환자는 비제한적으로 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아-피그, 토끼, 흰담비, 고양이, 개 및 영장류를 포함한다. 예를 들어, 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 침팬지, 고릴라 및 기타 동종의 것), 설치류(예를 들어, 랫트, 마우스, 게르빌루스쥐, 햄스터, 흰담비, 토끼), 토끼목, 돼지(예를 들어, 돼지, 미니어쳐 돼지), 말, 개과, 고양이, 소과, 및 다른 가정용, 농장용 및 동물원 동물을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 암은 절제불가능 흑색종 또는 전이성 흑색종, 비-소세포 폐 암종(NSCLC), 소세포 폐암(SCLC), 방광암 또는 전이성 호르몬-난치성 전립선암이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 고형 종양을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 암은 두경부의 편평상피 세포 암종(SCCHN), 신장 세포 암종(RCC), 삼중-음성 유방암(TNBC) 또는 결장직장 암종을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 호지킨 림프종을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 삼중-음성 유방암(TNBC), 위암, 요상피 암, 메르켈(Merkel)-세포 암종 또는 두경부 암을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 암은 흑색종, 췌장 암종, 중피종, 혈액학적 악성종양, 특히 비-호지킨 림프종, 림프종, 만성 림프구성 백혈병 또는 진행된 고형 종양이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 암에 걸릴 위험이 있는 환자의 치료에 사용될 수 있다. 암 환자는 당해 분야에서 알려진 다양한 방법으로 확인할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때 "유효량"이란, 질환, 예를 들어, 암의 진행을 정지, 지체, 지연 또는 억제시키는 것을 포함하여 유익한 효과 또는 원하는 결과를 초래하기에 충분한 양 또는 투약량을 의미한다. 유효량은, 예를 들어, 항체, 항원 결합 단편, 항체-약물 콘주게이트, 항체-인코딩 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및/또는 이의 조성물이 투여되는 대상체의 연령 및 체중, 증상의 중증도 및 투여 경로에 따라 달라질 것이고, 따라서 투여는 개체에 기초하여 결정될 수 있다.
유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 예로써, 항체, 항원 결합 단편 또는 항체-약물 콘주게이트의 유효량은 환자의 자가면역 질환 또는 암을 개선, 정지, 안정화, 역전, 억제, 지체 및/또는 지연시키기에 충분한 양이거나, 또는 시험관내에서 세포(예를 들어, 생체검사된 세포, 본 명세서에 기재된 임의의 암 세포 또는 세포주(예를 들어, 암 세포주))의 증식을 개선, 정지, 안정화, 역전, 지체 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, 항체, 항원 결합 단편 또는 항체-약물 콘주게이트의 유효량은, 특히, 환자 병력 뿐만 아니라 다른 인자, 예컨대, 사용된 항체의 유형(및/또는 투약량)에 따라 달라질 수 있다.
본 명세서에 개시된 항체, 항체-인코딩 폴리뉴클레오타이드, 항체-약물 콘주게이트 및/또는 조성물을 투여하기 위한 유효량 및 스케쥴은 실험적으로 결정될 수 있고, 이러한 결정은 당업계의 기술 내에 있다. 당해 분야의 숙련가는 투여되어야 하는 투약량이, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 항체, 항체-인코딩 폴리뉴클레오타이드, 항체-약물 콘주게이트 및/또는 조성물을 받을 포유동물, 투여 경로, 본 명세서에 개시된 특정한 유형의 항체, 항체-인코딩 폴리뉴클레오타이드, 항원 결합 단편, 항체-약물 콘주게이트 및/또는 조성물, 상기 포유동물에게 투여되는 다른 약물에 따라 달라질 수 있음을 이해한다. 항체 또는 항원 결합 단편의 적절한 용량을 선택하는 안내(guidance)는, 예를 들어, 문헌[참조: Handbook ofMonoc1onal Antibodies, Ferrone et a1., eds., Noges Publications, Park Ridge, N. J., 1985, ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et a1., eds., Raven Press, New York, 1977, pp.365-389]에서 발견할 수 있다.
항체 유효량의 전형적인 1일 투약량은 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 상기 투약량은 100 mg/kg, 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg 또는 0.1 mg/kg 미만일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 투약량은 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.05 mg/kg 또는 0.01 mg/kg을 초과할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 투약량은 약 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg, 0.9 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.2 mg/kg 또는 0.1 mg/kg이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법에서, 적어도 하나의 항체, 이의 항원-결합 단편, 항체-약물 콘주게이트 또는 약제학적 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 항체, 항원-결합 단편, 항체-약물 콘주게이트 또는 약제학적 조성물) 및 선택적으로 적어도 하나의 추가의 치료제는 상기 대상체에게 적어도 주 1회(예를 들어, 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회, 1일 1회, 1일 2회 또는 1일 3회) 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 상이한 항체 및/또는 항원-결합 단편은 동일한 조성물(예를 들어, 액체 조성물)에서 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항체, 항원-결합 단편, 항체-약물 콘주게이트 및 적어도 하나의 추가의 치료제는 동일한 조성물(예를 들어, 액체 조성물)에서 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항체 또는 항원-결합 단편 및 적어도 하나의 추가의 치료제는 2개의 상이한 조성물(예를 들어, 적어도 하나의 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하는 액체 조성물 및 적어도 하나의 추가의 치료제를 함유하는 고체 경구 조성물)에서 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가의 치료제는 알약, 정제 또는 캡슐로서 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가의 치료제는 지효성(sustained-release) 경구 제형으로 투여된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제는, 적어도 하나의 항체, 항원-결합 항체 단편, 항체-약물 콘주게이트 또는 약제학적 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 항체, 항원-결합 항체 단편 또는 약제학적 조성물)의 투여 전에 또는 투여 후에 상기 대상체에게 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 추가의 치료제 및 적어도 하나의 항체, 항원-결합 항체 단편, 항체-약물 콘주게이트 또는 약제학적 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 항체, 항원-결합 항체 단편 또는 약제학적 조성물)은, 상기 대상체에서 하나 이상의 추가의 치료제 및 적어도 하나의 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 항원-결합 단편)의 생물활성 기간이 중첩하도록 상기 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 장시간에 걸쳐(예를 들어, 적어도 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 1년, 2년, 3년, 4년 또는 5년의 기간에 걸쳐) 적어도 하나의 항체, 항원-결합 항체 단편, 항체-약물 콘주게이트 또는 약제학적 조성물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 항체, 항원-결합 항체 단편 또는 약제학적 조성물)을 투여받을 수 있다. 숙련된 의료 전문가는 치료의 유효성을 진단 또는 수행하기 위해 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 사용하여 치료 기간의 길이를 결정할 수 있다(예를 들어, 암의 적어도 하나의 증상의 관찰). 본 명세서에 기재된 바와 같이, 숙련된 의료 전문가는 또한 상기 대상체에게 투여된 항체 또는 항원-결합 항체 단편, 항체-약물 콘주게이트(및/또는 하나 이상의 추가의 치료제)의 속성(identity) 및 개수를 변경할 수 있고, 또한 치료 유효성의 평가(예를 들어, 본 명세서에 기재되고 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여)에 기초하여 상기 대상체에 대한 적어도 하나의 항체 또는 항원-결합 항체 단편(및/또는 하나 이상의 추가의 치료제)의 투약량 또는 투여 빈도를 조정(예를 들어, 증가 또는 감소)할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제가 상기 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 추가의 치료제는 B-Raf의 억제제, EGFR 억제제, MEK의 억제제, ERK의 억제제, K-Ras의 억제제, c-Met의 억제제, 역형성 림프종 키나제(ALK)의 억제제, 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3K)의 억제제, Akt의 억제제, mTOR의 억제제, 이중 PI3K/mTOR 억제제, 브루톤 티로신 키나제(BTK)의 억제제 및 이소시트레이트 탈수소효소 1(IDH1) 및/또는 이소시트레이트 탈수소효소 2(IDH2)의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 억제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 치료제는 인돌아민 2,3-디옥시게나제-l)(IDOl)의 억제제(예를 들어, 에파카도스타트)이다.
일부 구현예에서, 상기 추가의 치료제는 HER3의 억제제, LSD1의 억제제, MDM2의 억제제, BCL2의 억제제, CHK1의 억제제, 활성화된 헤지혹 신호전달 경로의 억제제, 및 에스트로겐 수용체를 선택적으로 분해하는 제제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 억제제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 추가의 치료제는 트라벡테딘, nab-파클리탁셀, 트레바나닙, 파조파닙, 세디라닙, 팔보시클립, 에버롤리무스, 플루오로피리미딘, IFL, 레고라페닙, 레올라이신, 알림타, 자이카디아, 수텐트, 템시롤리무스, 악시티닙, 에버롤리무스, 소라페닙, 보트리엔트, 파조파닙, IMA-901, AGS-003, 카보잔티닙, 빈플루닌, Hsp90 억제제, Ad-GM-CSF, 테마졸로미드(Temazolomide), IL-2, IFNa, 빈블라스틴, 탈로미드, 다카바진, 사이클로포스파마이드, 레날리도마이드, 아자시티딘, 레날리도마이드, 보르테조미드(bortezomid), 암루비신, 카르필조밉, 프랄라트렉세이트 및 엔자스타우린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 추가의 치료제는 아쥬반트, TLR 작용제, 종양 괴사 인자(TNF) 알파, IL-1, HMGB1, IL-10 길항제, IL-4 길항제, IL-13 길항제, IL-17 길항제, HVEM 길항제, ICOS 작용제, 치료 표적화 CX3CL1, 치료 표적화 CXCL9, 치료 표적화 CXCL10, 치료 표적화 CCL5, LFA-1 작용제, ICAMl 작용제 및 셀렉틴 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 카보플라틴, nab-파클리탁셀, 파클리탁셀, 시스플라틴, 페메트렉세드, 젬시타빈, FOLFOX 또는 FOLFIRI가 상기 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 상기 추가의 치료제는 항-OX40 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-Ll 항체, 항-PD-L2 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-BTLA 항체, 항-CTLA-4 항체 또는 항-GITR 항체이다.
약제학적 조성물 및 투여 경로
또한, 본 명세서에 기재된 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개)의 항체, 항원-결합 단편 또는 항체-약물 콘주게이트를 함유하는 약제학적 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에 기재된 2 또는 그 이상(예를 들어, 2, 3 또는 4개)의 임의의 항체, 항원-결합 단편 또는 항체-약물 콘주게이트는 임의의 조합으로 약제학적 조성물에 존재할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 당업계에서 알려진 임의의 방식으로 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 진피내, 피하 또는 복강내)와 양립가능하도록 제형화된다. 상기 조성물은 멸균 희석제(예를 들어, 멸균수 또는 염수), 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매, 항균 또는 항진균제, 예컨대, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 및 동종의 것, 산화방지제, 예컨대, 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨, 킬레이트제, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산, 완충액, 예컨대, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 등장제, 예컨대, 당류(예를 들어, 덱스트로스), 폴리알코올(예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨), 또는 염(예를 들어, 염화나트륨), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 리포좀 현탁액이 약제학적으로 허용가능한 담체로서 사용될 수 있다(참조, 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호). 상기 조성물의 제제는 앰풀, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 제형화 및 봉입될 수 있다. 요구되는 경우(예를 들어, 주입가능 제형에서와 같이), 적절한 유체성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대, 레시틴 또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 흡수는 흡수를 지연시키는 제제(예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)를 포함시킴으로써 연장될 수 있다. 대안적으로, 조절 방출은 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템에 의해 달성될 수 있고, 이는 생분해성, 생체적합성 폴리머(예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산; Alza Corporation 및 Nova Pharmaceutical, Inc.)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 임의의 항체, 항원-결합 단편, 항체-약물 콘주게이트를 함유하는 조성물은 투약량 단위 형태(즉, 투여의 용이성 및 투약량의 균일성을 위해 활성 화합물의 사전결정된 양을 함유하는 물리적으로 별개의 단위)로 비경구(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 진피내, 피하 또는 복강내) 투여를 위해 제형화될 수 있다.
조성물의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물(예를 들어, 원숭이)에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. LD50(모집단의 50% 치사 용량) 및 ED50(모집단의 50%에서 치료적 유효 용량)을 결정할 수 있고; 치료 지수는 LD50:ED50의 비이다. 높은 치료 지수를 나타내는 제제가 바람직하다. 제제가 바람직하지 않은 부작용을 나타내는 경우, 잠재적 손상을 최소화하는 것에 유의해야 한다(즉, 원치않는 부작용을 감소시킴). 독성 및 치료적 효능은 다른 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 대상체(예를 들어, 인간)에서 사용하기 위한 임의의 소정 제제의 적절한 투약량을 제형화하는데 사용될 수 있다. 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개)의 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 항체 단편)은, 대상체(예를 들어, 암을 갖는 것으로 확인된 인간 대상체) 또는 질환 발달의 위험이 있는 것으로 확인된 대상체(예를 들어, 이전에 발달된 암을 갖지만 현재 치유된 대상체)에서 질환을 치료하고(예를 들어, 암 세포를 사멸시키고) 대상체(예를 들어, 인간)에서 질환의 하나 이상의 증상의 중증도, 빈도 및/또는 지속기간을 감소시키는 양이다. 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 항원-결합 단편의 유효성 및 투약은 당해 분야에서 알려진 방법을 사용할 뿐만 아니라 대상체(예를 들어, 인간)에서 질환의 하나 이상의 증상의 관찰에 의해 건강 관리 전문의 또는 수의사에 의해 결정될 수 있다. 특정 인자는 대상체를 효과적으로 치료하는데 요구되는 투약량 및 타이밍에 영향을 미칠 수 있다(예를 들어, 질환 또는 장애의 중증도, 선행 치료, 대상체의 전반적 건강 및/또는 연령, 및 다른 질환의 존재).
예시적 용량은 상기 대상체의 킬로그램당 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항체-약물 콘주게이트의 밀리그램 또는 마이크로그램 양을 포함한다(예를 들어, 약 1 ㎍/kg 내지 약 500 mg/kg; 약 100 ㎍/kg 내지 약 500 mg/kg; 약 100 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg; 약 10 ㎍/kg 내지 약 5 mg/kg; 약 10 ㎍/kg 내지 약 0.5 mg/kg; 또는 약 1 ㎍/kg to 약 50 ㎍/kg). 이들 용량은 넓은 범위를 포괄하지만, 당해 분야의 숙련가는, 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 치료제가 그것의 효과 측면에서 다르다는 것과, 유효량은 당해 분야에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 전형적으로, 상대적으로 저용량이 먼저 투여되고, 담당 건강 관리 전문의 또는 수의사(치료적 적용의 경우에) 또는 연구자(개발 단계에서 여전히 실행하는 경우에)는 적절한 반응이 수득될 때까지 후속적으로 및 서서히 용량을 증가시킬 수 있다. 또한, 임의의 특정 대상체에 대한 특정 용량 수준은 사용된 특정 화합물의 활성, 상기 대상체의 연령, 체중, 전반적 건강, 성별 및 식습관, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 및 항체 또는 항체 단편의 생체내 반감기를 포함하는 다양한 인자에 좌우될 것이다.
상기 약제학적 조성물은 투여 지침과 함께 컨테이너(container), 팩(pack) 또는 분배기(dispenser)에 포함될 수 있다. 본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같이 다양한 용도를 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항체-약물 콘주게이트를 제조하는 방법을 제공한다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기재되며, 이는 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1: 방법 및 물질
하기 검정이 실시예에서 사용되었다.
결합 검정
a) 96 웰 플레이트의 각 웰에 50㎕의 배지에 5×105 세포를 분배한다.
b) 상이한 희석으로 100㎕의 항체를 웰들에 첨가한다.
c) 상기 플레이트를 실온(RT)에서 60분 동안 인큐베이션한다.
d) 세포를 스핀 다운하고, 0.1 소 혈청 알부민(BSA)을 갖는 포스페이트-완충 식염수(PBS)로 세포를 3회 세정한다.
e) 1:500 Cy3 컨주게이트된 염소 항-인간 IgG를 함유하는 0.1% BSA를 갖는 100㎕의 PBS에 세포 펠릿을 재현탁시킨다.
f) 30분 동안 암소에서 실온으로 인큐베이션한다.
g) 세포를 3회 세정하고, 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 완충액에 재현탁시킨다.
h) 상기 세포를 흐름 세포측정기로 분석한다.
항체-의존적 세포 세포독성(ADCC) 검정
a) 표적 세포를 칼세인(Calcein) AM 라벨링 전에 PBS로 1회 세정한다.
b) 2.5mM의 1:333 칼세인 AM 스톡을 사용하여 표적 세포를 라벨링한다.
c) 광으로부터 회피하면서, 세포를 37℃로 30분 동안 인큐베이션한다.
d) 세포를 PBS로 3회 세정한다.
e) 1×104 칼세인 AM 라벨링된 표적 세포를 각 웰에 50㎕로 분배한다.
f) 100㎕의 희석된 항체를 웰들에 첨가한다.
g) 상기 플레이트를 60분 동안 실온으로 인큐베이션한다.
h) 5×104의 PBMS(효과 세포)를 각 웰의 50㎕의 배지에 첨가한다(E/T 비는 5이다).
i) 상기 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한다.
j) 세포를 스핀 다운시키고, 180㎕의 상청액을 또 다른 반투명 바닥 및 블랙 벽의 96 웰 플레이트로 옮긴다.
k) 상기 플레이트를 485 여기 및 520 방출 파장에서 판독한다.
보체-의존적 세포독성(CDC) 검정
a) 표적 세포를 수집하고, ADCC로서 칼세인 AM으로 염색한다(칼세인 방출 검정에 대해서만).
b) 50㎕의 표적 세포(1×105 세포)를 96 웰 플레이트의 웰에 씨딩한다.
c) 100㎕ 항체를 상이한 농도로 웰들에 첨가한다.
d) 상기 플레이트를 15분 동안 실온으로 인큐베이션한다.
e) 50㎕의 10% 보체 풍부한 인간 혈청을 각 웰에 첨가한다(최종 5%).
f) 상기 플레이트를 45분 동안 실온으로 인큐베이션한다.
g) 180㎕의 상청액을 또 다른 반투명 바닥 및 블랙 벽의 96 웰 플레이트에 옮긴다(칼세인 방출 검정에 대해서만).
h) 세포를 0.1% BSA를 갖는 PBS로 3회 세정한다.
i) 실온에서 15분 동안 암소에서 2㎕의 7-아미노악티노마이신 D(7AAD)/웰로 세포를 염색한다.
j) 세포를 3회 세정하고, 세포를 흐름 세포측정기로 분석한다.
T 세포 활성화
예비-활성화된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 일부 ADCC 실험에서 사용했다.
a) 다이나비드(Dynabead)(인간 T-활성제 CD3/CD28)를 사용하여 PBMC를 활성화시킨다.
b) 완충액으로 세정한 후, 다이나비드를 30U/mL의 인터류킨-2(IL2)와 함께 1:1의 비로 PBMC에 첨가한다.
c) 세포 혼합물을 충분한 시간 동안 인큐베이션한다.
d) 인큐베이션의 말기에, 비드를 자석으로 제거한 다음, 이어서 활성화된 PBMC를 ADCC 검정에 사용한다.
MDA231 세포를 포함하는 세포-결합 검정
a) MDA231 세포를 1×106 세포/mL의 농도로 배지에서 제조한다.
b) 항체 샘플을 적절한 농도로 희석시킨다.
c) 50㎕의 세포를 96 웰 V-바닥 플레이트의 각 웰로 옮긴다.
d) 50㎕의 항체를 96 웰 V-바닥 플레이트의 웰들로 옮긴다.
e) 세포 혼합물을 60분 동안 실온으로 인큐베이션한다.
f) 세포를 스핀 다운시키고, FACS 완충액으로 2회 세정한다.
g) 각각의 웰에서 Cy3 컨주게이트된 염소 항-인간(GAH) IgG(1:500)를 함유하는 100㎕ FACS 완충액에 세포를 재-현탁시킨다.
h) 실온으로 30분 동안 인큐베이션하고, FACS 완충액으로 2회 세정한다.
i) FACS 분석한다.
MDA231 및 SIHA 세포를 포함하는 내재화 검정
a) 50㎕의 세포 현탁액(MDA231 또는 SIHA 세포)를 1×106/m으로 96 플레이트의 각 웰에 첨가한다.
b) 50㎕ Ab를 상응하는 웰에 첨가한다.
c) 30분 동안 37℃로 인큐베이션한다.
d) 100㎕의 pHrodo 레드 라벨링된 GAH IgG를 각각의 웰에 첨가하고, 24시간 동안 37℃로 인큐베이션한다.
e) 세포를 트립신화시켜 수거하고, 2회 세정하고, 이어서 FACS를 실행한다.
MDA231 세포를 포함하는 보체-의존적 세포독성(CDC) 검정
a) 표적 세포: MDA231 세포를 PBS로 2회 세정하고, 이어서 PBS에서 0.5×106/mL의 농도로 조정한다.
b) 편평 바닥의 24 웰 플레이트, 300㎕/웰로 세포를 씨딩한다.
c) 300㎕의 20㎍/mL 항체를 상응하는 웰들에 첨가하여 10㎍/mL의 최종 농도로 되게 한다.
d) 상기 플레이트를 48시간 동안 37℃로 인큐베이션한다.
e) 인큐베이션의 말기에, 세포를 트립신화시키고, 플레인 배지(plain media)로 2회 세정한다.
f) 세포 펠릿을 100㎕ 플레인 배지에 재현탁시키고, 세포를 96 웰 플레이트로 옮긴다.
g) 100㎕의 10% 보체 풍부한 혈청을 각각의 웰에 첨가한다.
h) 세포를 4시간 동안 37℃로 인큐베이션한다.
i) 세포를 FACS 완충액으로 2회 세정한다.
j) 100㎕ 트립신을 3분 동안 첨가하여 세포를 분리시킨다.
k) 세포 펠릿을 7AAD(1:50 희석)을 함유하는 FACS 완충액에 재현탁시킨다.
l) 실온으로 15분 인큐베이션 후에 세포를 2회 세정한다.
m) FACS 분석을 실행한다.
실시예 2: CD20 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 CD20 및 CD3에 결합하도록 설계한다. 이러한 이중특이적 항체는 2개의 공통 경쇄(동일한 서열을 가짐) 및 2개의 상이한 중쇄를 갖는다. 상기 2개의 중쇄 및 상기 공통 경쇄의 가변 영역의 서열을 하기에 제시한다.
CD20을 위한 VHa(리툭시맙 VH로부터 설계됨):
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLRSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA (서열번호: 1)
CD3을 위한 VHb(MAb 12F6 VH로부터 설계됨):
EVQLQESGAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGEGLEWIGYINPSSGYTKYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARWQDYDVYFDYWGEGTTLTVSS (서열번호: 2)
공통 VL(리툭시맙의 VL)
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKR (서열번호: 3)
12F6 항체는, 예를 들어, 효과적 면역조절 기능을 갖는 인간화된 항-인간 CD3 단클론 항체 12F6의 작제 및 특징규명에 기재되어 있다[참조: Immunology, 116 (4), 487-498 (2005), 이는 본 명세서에서 참고로 전체적으로 편입된다]. 친계 항체의 서열은 또한 비교 목적을 위해 하기에 제시되어 있다:
친계 CD20VH(리툭시맙 VH):
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA (서열번호: 8)
친계 CD20VL(리툭시맙):
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKR (서열번호: 9)
친계 CD3VH(MAb 12F6 VH):
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEWIGYlNPSSGYTKYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWQDYDVYFDYWGQGTTLTVSS (서열번호: 10)
친계 CD3VL(MAb 12F6 VL):
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLETKR (서열번호: 11)
재설계된 VH 및 VL에 대한 CDR 서열이 또한 하기 표에 요약되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
리툭시맙 Fv(VH+VL)의 3D(3차원) 등전점(PI)은 9.9이고, 12F6 Fv의 3D PI는 9.8이다. 상기 서열을 재설계한 후, VHa + 공통 VL의 3D PI는 10.0이고, VHb + 공통 VL의 3D PI는 9.1이다. PI 변화는 CD20에 대한 결합 친화도에 영향을 주지 않고, 제2 항원 결합 영역은 CD3에 대한 적정한 결합 친화도를 여전히 유지한다. 상기 2개 VH 쇄에서의 돌연변이는 하기 표에 제시되어 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
도 1a 및 1b에서, 재설계된 리툭시맙(항체 A) 및 재설계된 12F6(항체 B)의 항원 결합 능력을 각각 시험했다. 도 1a는 재설계된 리툭시맙(항체 A)가 CD20 양성 라지 세포에 결합하는 것을 나타낸다. 항체 A는 2개 VHa(서열번호: 1) 및 2개 공통 VL(서열번호: 3)을 갖는 동종이량체이다. 도 1b는 재설계된 12F6(항체 B)가 CD3 양성 저켓 세포에 결합하는 것을 나타낸다. 항체 B는 또한 2개 VHb(서열번호: 2) 및 2개 공통 VL(서열번호: 3)을 갖는 동종이량체이다. 이들 데이터는 재설계된 리툭시맙 중쇄, 재설계된 12F6 중쇄 및 공통 경쇄가, 예를 들어, "놉-인투-홀" 기술을 통해 기능성 이중특이적 항체에 합쳐질 수 있음을 시사한다.
따라서, CD20/CD3 "불균형 이중특이적 항체"를 설계했다. 놉 및 홀 돌연변이를 또한 중쇄의 불변 영역에 도입하여 이중특이적 항체의 형성을 촉진했다.
상기 중쇄 및 상기 경쇄의 전장 서열은 하기에 제시되어 있다.
CD20 중쇄 버전 1(야생형 IgG1 Fc)의 전장
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLRSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 34)
CD20 중쇄 버전 2(Y407T(홀) 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc)의 전장:
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLRSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 35)
CD20 중쇄 버전 3(T366Y(놉) 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc)의 전장:
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLRSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 36)
CD3 중쇄 버전 1(야생형 IgG1 Fc)의 전장:
EVQLQESGAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGEGLEWIGYINPSSGYTKYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARWQDYDVYFDYWGEGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 37)
CD3 중쇄 버전 2(T366Y(놉) 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc)의 전장:
EVQLQESGAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGEGLEWIGYINPSSGYTKYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARWQDYDVYFDYWGEGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 38)
CD3 중쇄 버전 3(Y407T(홀) 돌연변이를 갖는 IgG1)의 전장:
EVQLQESGAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGEGLEWIGYINPSSGYTKYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARWQDYDVYFDYWGEGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 39)
공통 경쇄의 전장:
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 40)
Y407T(EU 넘버링)(버전 2: 서열번호: 35)를 갖는 CD20의 IgG1 중쇄, 및 T366Y(EU 넘버링) 돌연변이(버전 2; 서열번호: 38)를 갖는 CD3의 IgG1 중쇄를 선택하여, 추가적인 실험을 위한 이중특이적 항체를 제조하였다. 이 이중특이적 항체는 또한 2개의 공통 경쇄(서열번호: 40)을 또한 갖는다.
이러한 불균형 이중특이적 항체는 또한 하기 특징을 포함한다: (1) CD3 결합 친화도는 상당히 저하되어 안정성을 증가시켰고; (2) 임상 실행을 확대하도록 ADCC/CDC 효과기 기능을 유지시켰고; (3) CD20 결합 아암 및 CD3 결합 아암의 생화학적 및 생체물리학적 특징은 다운스트림 정제 공정 동안 분화되어, 이중특이적 항체의 더 나은 단리를 가능하게 하도록 하였다.
하기 실시예에서 나타낸 바와 같이, 이러한 항체는, 인간 PBMC의 존재하에 CD20 동종이량체 및 리툭시맙의 것보다 더 나은 CD20+ 라지 세포 사멸 효능을 가졌다. 한편, 이 항체는 동일한 조건하에서 CD3+ 저켓 세포을 사멸시키거나 정상 T 세포를 고갈시키지 못했다. 따라서, 이 항체는 현재의 항-CD20 암 요법보다 유망하고 보다 넓은 임상 적용을 설명하고; 1) 리툭시맙과 비교하여, 이 항체는 T 세포 동원 기능을 갖고; 2) CAR-T/다른 T 세포 동원 요법과 비교하여, 이 항체는 기능성 효과기 기능을 유지하고; 3) 이 항체는 시험관내에서 임의의 안전성 우려를 나타내지 않는다. 종합하면, 본 개시내용에 기재된 CD20/CD3 이중특이적 항체 및 플랫폼은 표적화된 암 요법의 분야에서 미충족 요구에 대처할 수 있다.
본 명세서에 개시된 이중특이적 항체는 2단계를 통해 정제할 수 있다: 단백질 A를 사용한 친화도 정제(라운드 1) 및 모노Q5/50을 사용한 음이온 교환 정제(라운드 2). 상기 제2 라운드에서, 구배 pH 완충액(예를 들어, PBS)을 사용하여 항체를 용출시켰다. T 세포 활성화 검정을 수행하여, 용출 후에 상이한 분획을 평가했다. 도 20에서, 숫자는 상이한 분획을 나타낸다. CD20/CD3 이중특이적 항체만이 T 세포를 활성화시킬 수 있고, 따라서, 상기 T 세포 활성화 검정은 각각의 분획에서 CD20/CD3 이중특이적 항체의 순도 및 함량을 평가할 수 있다. 이 결과는 분획 4-7이 상대적으로 순수한 CD20/CD3 이중특이적 항체를 갖는 것을 나타냈고, 상기 CD20/CD3 이중특이적 항체가 본 명세서에 기재된 방법에 의해 정제될 수 있음을 실증했다.
게다가, 본 명세서에 기재된 항체의 pI를 또한 결정했다. 이 정보는 용출에 적절한 pH를 선택하는데 유용할 수 있다.
Figure pct00006
실시예 3: 이중특이적 항체의 결합 친화도
전산 설계 후, 설계된 VH 서열(서열번호: 1) 및 공통 VL 서열(서열번호: 3)을 함유하는 CD20 동종이량체 IgG는 친계 항-CD20 IgG(친계 CD20)의 것과 비교하여 CD20의 유사한 결합능을 나타냈다. 세포 결합 친화도 검정은 라지 세포(CD20 발현)로 수행했다. 결합 결과는 도 2a에 제시되었다.
설계된 VH 서열(서열번호: 2) 및 공통 VL 서열(서열번호: 3)을 함유하는 CD3 동종이량체 IgG는 친계 항-CD3 IgG(친계 CD3)의 것과 비교하여 CD3의 결합능을 감소시켰다. 세포 결합 친화도 검정은 저켓 세포(CD3 발현)로 수행했다. 결합 결과는 도 2b에 제시되었다.
실시예 4: 불균형 CD20/CD3 이중특이적 항체에 의한 T 세포의 활성화
불균형 CD20/CD3 이중특이적 단클론성 항체(BsMab)는 표적 종양 세포의 존재하에서만 T 세포를 활성화했다. 하기 실험은 CD20+ 표적 종양 세포로서 라지 세포, CD20- 대조군 세포로서 293 세포, 및 T 세포 모델로서 저켓 세포를 사용하여 수행하여, T 세포 및 표적 종양 세포 둘 모두에 결합하는 다중 BsMab에 의해 형성된 클러스터 때문에 표적 종양 세포의 존재하에 CD20/CD3 BsMab가 T 세포를 활성화할 수 있는지 여부를 테스트했다. 그에 반해서, CD20/CD3 BsMab는, T 세포 상의 CD3에 대한 1개 아암의 약한 결합에 기인하여 CD20- 대조군 세포의 존재하에 T 세포를 활성화할 수 없다.
하기 실험 절차를 이 실시예에서 사용했다:
1) U 바닥 96 웰 플레이트에서 라지 & 저켓, 저켓 & 293 1×105를 별도로 씨딩한다.
2) 테스트 항체를 첨가하고, 밤새 인큐베이션한다(19시간).
3) 상기 세포를 PBS+0.1% BSA로 1회 세정한다.
4) 항-인간 CD69 항체(PE로 라벨링됨)(1.5㎕/웰)를 첨가하고, 30분 동안 실온으로 인큐베이션한다.
5) 세포를 1회 세정한다.
6) 판독한다.
결과는 도 3에 제시되었다. 상이한 농도의 테스트 항체를 갖는 라지 세포의 존재하에 T 세포 활성화 효과는 도 4에 제시되어 있다. 아이소타입 항체(비-특이적 IgG1 항체)가 대조군으로 사용되었다. 상기 T 세포 활성화는 상기 저켓 세포 표면 상의 CD69의 발현에 의해 측정했다.
실시예 5: 불균형 CD20/CD3 BsMab는 PBMC 매개된 세포 사멸을 유도한다
불균형 CD20/CD3 BsMab는, 리툭시맙 및 CD20 동종이량체 항체 전- 및 후-T 세포 활성화보다 더 나은 PBMC 매개된 세포 사멸을 유도했다.
T 세포 활성화전: 건강한 공여체로부터 신선한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 37℃에서 밤새 휴지시키고, 4시간 동안 도면에 지시된 바와 같이 상이한 항체의 존재하에 칼세인 라벨링된 CD20+ 라지 세포로 인큐베이션했다. 세포사 비는 칼세인 방출에 의해 측정했다. 결과는 도 5에 제시되었다.
T 세포 활성화후(4일): 건강한 공여체로부터 신선한 PBMC를 4일 동안 재조합 IL-2 및 CD3/CD28 비드로 인큐베이션하여 T 세포를 활성화시키고, 이어서 2시간 동안 도면에 지시된 바와 같이 칼세인 라벨링된 CD20+ 라지 세포 및 상이한 항체로 인큐베이션했다. 세포사 비는 칼세인 방출에 의해 측정했다. 이 결과는 도 6에 제시되었다.
T 세포 활성화후(7일): 건강한 공여체로부터 신선한 PBMC를 7일 동안 재조합 IL-2 및 CD3/CD28 비드로 인큐베이션하여 T 세포를 활성화시키고, 이어서 2시간 동안 도면에 지시된 바와 같이 칼세인 라벨링된 CD20+ 라지 세포 및 상이한 항체로 인큐베이션하였다. 세포사 비는 칼세인 방출에 의해 측정했다. 결과는 도 7에 제시되었다.
PBMC 사멸 검정에서 나타낸 바와 같이 불균형 CD20/CD3 BsMab이 또한 동일한 조건하에서 CD3+ T 세포를 사멸시키는지 여부에 대한 안전성 우려에 대처하기 위해, 각각의 실험에 대해, CD3+ 저켓 세포를 대조군으로서 사용했다. 최고 항체 농도(10㎍/ml)만을 시험했다. T 세포 활성화전 결과는 도 8에 제시되었다. T 세포 활성화후(4일) 결과는 도 9에 제시되었다. T 세포 활성화후(7일) 결과는 도 10에 제시되었다. PBS로 처리한 그룹에서 저켓 세포의 수는 기준선으로서 설정했다. 따라서, 사멸 백분율은, 저켓 세포의 수가 PBS로 처리한 그룹과 등가이면 0일 것이다. 상기 사멸 백분율은 세포의 수가 PBS로 처리한 그룹보다 많으면 음성일 것이다.
이 결과는 어떠한 저켓 세포 사멸도 T 세포 활성화전 및 T 세포 활성화 4일 후에 관측되지 않은 것을 나타냈다. 그러나, 저켓 사멸은 T 세포 활성화 7일 후에 관측되었고, 이 조건하에 리툭시맙 및 CD20 동종이량체 IgG는 어떠한 라지 세포 사멸도 유도하지 않았다. 이는 7일 저켓 세포 사멸이 T 세포 수퍼-활성화에 의해 야기될 수 있음을 시사한다. 7일 활성화된 천연 T 세포 자체가 또한 불균형 CD20/CD3 BsMab의 존재하에 사멸되었는지 여부를 추가로 테스트하기 위해, 도면에 나타낸 바와 같이, 동일한 7일 활성화된 PBMC를 상이한 항체와 함께 인큐베이션하고, T 세포 고갈 상태를 체크했다. 결과는 도 11에 제시되었다. 도면 중의 LALA는 L234A 및 L235A 돌연변이(EU 넘버링)를 갖는 CD20/CD3 BsMab이다. L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 항체는 Fc 효과기 기능을 갖지 않고, 이는 음성 대조군으로 사용되었다.
실시예 6: 불균형 이중특이적 CD20/CD3 항체에 의한 T-세포 고갈
실험은, 사전-활성화된 T 세포가 불균형 CD20/CD3 BsMab에 의해 고갈될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 또한 수행했다.
도 12는 PBMC 중의 비-활성화된 T 세포가 밤새 인큐베이션 후에 불균형 CD20/CD3 BsMab에 의해 고갈되지 않았음을 나타낸다.
실시예 7: 보체 의존적 세포독성의 유도
상기 CD20/CD3 BsMab는 고친화도로 CD20에 대한 아암 결합을 갖기 때문에, 실험을 수행하여, CD20-아암-결합이 보체 의존적 세포독성을 유도하는데 충분한지 여부를 테스트했다. 상기 항체를 인간 보체 풍부한 혈청 및 CD20+ 라지 세포와 함께 인큐베이션했다. 불균형 CD20/CD3 BsMab는 리툭시맙 및 CD20 동종이량체 항체와 비교하여 CDC 효능을 감소시켰다. FACS(7AAD)에 의한 검출 결과는 도 13에 제시되어 있다. 칼세인 방출의 검출 결과는 도 14에 제시되어 있다.
실시예 8: 안전성 평가
CD3+ 저켓 세포 및 정상 T 세포가 불균형 CD20/CD3 BsMab에 의해 사멸될 수 있는지 여부를 또한 시험했다. 도 15는 고용량의 불균형 CD20/CD3 BsMab가 저켓 세포 상에서 CDC를 유도하지 않았음을 나타냈다.
도 16은 불균형 CD20/CD3 BsMab가 PBMC 및 인간 보체 풍부한 혈청을 갖는 인간 혈청과의 공-인큐베이션 후에 T 세포사를 유도하지 않았음을 나타낸다.
실시예 9: 불균형 CD20/CD3 BsMab는 리툭시맙 내성 라지 세포를 사멸시킬 수 있다.
불균형 CD20/CD3 BsMab가 리툭시맙 내성 라지 세포(RRCL)를 사멸시킬 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 3개의 상이한 공여체로부터 7일 활성화된 PBMC를 갖는 RRCL을 도면에 나타낸 바와 같이 항체의 존재하에 인큐베이션하고, 불균형 CD20/CD3 BsMab의 존재하에 유의한 RRCL 사멸이 관찰되었다(도 17-19).
실시예 10: 불균형 CD20/CD3 BsMab의 동물 연구
실험은 동물에서 CD20/CD3 BsMab의 효과를 평가하기 위해 수행했다.
라지 세포, 인간 PBMC 및 불균형 CD20/CD3 BsMab를 혼합하고, 정맥내 투여를 통해 마우스에게 주입했다. 이들 라지 세포를 루시퍼라제에 의해 라벨링했다. 처리 그룹에서 각각의 마우스(B-NDG, Biocytogen, Beijing, Cat# 201811808)에게 5×l05　라지 세포, 2.5×106　인간 PBMC 세포 및 60㎍의 항체를 투여했다. 0일, 2일, 3일, 및 3일후 3일마다 라지 세포 고갈을 추적하기 위해 마우스를 이미지화했다.
0일째에, 루시퍼라제-라벨링된 라지 세포 및 인간 PBMC 세포를 포스페이트-완충 식염수 PBS(Gl 그룹; 대조군; n=4), CD20/CD3 BsMab(G2 그룹; n=4), 또는 리툭시맙(항-CD20 항체; G3 그룹; n=4)과 혼합했다. 정맥내(i.v.) 주사후 15분에 처음으로 마우스를 이미지화하고, 이어서 2일, 3일, 및 3일후 3일마다 이미지화했다.
도 21a는 상기 CD20/CD3 BsMab 및 리툭시맙이 명백한 독성 효과를 갖지 않음을 나타낸다. 도 21b는 CD20/CD3 BsMab 및 리툭시맙 둘 모두가 종양 억제성 효과를 갖고 리툭시맙이 상기 CD20/CD3 BsMab만큼 효과적이지 않음을 나타낸다. 종양 억제성 효과의 차이는 주사후 16일부터 개시하여 관측되었다.
실시예 11: 불균형 이중특이적 항체의 특징규명
실험은 정제된 CD20/CD3 이중특이적 항체 샘플을 특징규명하기 위해 수행했다.
첫째, 모세관 전기영동 나트륨 도데실 설페이트(Re-CE-SDS)의 환원을 상기 정제된 CD20/CD3 이중특이적 항체 샘플에 대해 수행했다. 이 결과는 3개의 주요 피크가 있음을 나타냈다. 분자 크기에 기초하여, 피크 #1은 공통 경쇄(LC)였고, 피크 #2 및 #3은 2개의 상이한 중쇄(HC)였다(도 22a).
비-환원 CE(비-Re-CE-SDS)를 또한 수행했다. 결과는 CD20/CD3 이중특이적 IgG에 대해 1개의 주요 피크가 있음을 나타냈다(도 22b). 도 22a 및 22b의 결과는 상기 CD20/CD3 이중특이적 항체 샘플이 양호한 순도를 갖는 것을 시사한다.
둘째, 시차 주사 형광측정법(DSF)는 단백질 용융 온도(Tm)를 측정하기 위해 수행하고, 정적 광 산란(SLS)는 266nm(Tagg 266) 및 473nm(Tagg 473)에서 응집 온도를 측정하기 위해 수행했다. 분석을 위해 샘플은 UNcle 시스템에 제공했다. 1℃/분의 온도 램프는 DSF 및 SLS에 대해 20℃로부터 95℃까지의 모니터링으로 수행했다. UNcle는 266nm 및 473nm에서 SLS을 측정한다. Tm 및 Tagg는 UNcle 분석 소프트웨어를 사용하여 계산 및 분석했다.
일부 테스트 항체는 2개 Tm을 갖고, 일부는 3개 Tm을 갖는다. 이것은 IgG가 다중-도메인 구조이고, CH2 도메인이 일반적으로 PBS에서 ∼70℃의 Tm을 갖고, CH3이 더욱 안정하고, 그것의 Tm이 약 80℃이기 때문이다. Fab는 그것의 큰 서열 변동 때문에 광범위한 Tm, 약 50 내지 85℃를 갖는다. 따라서, 다양한 분석적 기술에 의해 측정된 Tm 값은 일반적으로 형식적 용융 온도라기보다는 "겉보기(apparent)" 전이 온도이다. 항체 전체 IgG의 경우에, DSF 측정에서 종종 2 내지 3개 Tm 값이 있다. 어느 Tm이 어느 도메인을 나타내는지를 결정하는 것은 용이하지 않다.
이러한 이중특이적 항체의 경우에, 86.7℃ Tm이 CH3 도메인 단독을 나타내는 경향이 있다. 다른 하부 1 또는 2개 Tm은 Fab, CH2 또는 Fab+CH2를 나타낸다.
Tagg와 관련하여, 이는 SLS가 응집의 검출을 개시하는 온도이다. Tagg266은 266nm에서 SLS를 측정하고, 이는 보다 작은 입자를 검출하기 위해 더욱 민감하고 적합하다. Tagg473은 473nm에서 측정하고, 더 큰 입자를 검출하기에 더 양호하다.
DSF 및 SLS 데이터 둘 모두는, 상기 CD20/CD3 이중특이적 항체가 양호한 열안정성을 갖는 것을 나타낸다.
Figure pct00007
셋째, 동적 광 산란(DLS)은 1개 크기의 분자 입자(10.15nm)를 단지 검출했다. 이 결과는 상기 샘플에서 응집이 없었음을 나타냈다.
Figure pct00008
이들 특징규명 데이터는 CD20/CD3 이중특이적 항체가 치료적 항체로서 양호한 현상성을 갖는 것을 시사한다.
실시예 12: PD-L1 및 CD55에 결합하는 이중특이적 항체
2개 버전 이중특이적 항체는, PD-L1 및 CD55(PD-L1/CD55 BsMab v1 및 PD-L1/CD55 BsMab v2)에 결합하도록 설계했다. 이들 이중특이적 항체는 2개 공통 경쇄 및 2개의 상이한 중쇄를 갖는다.
이중특이적 항체의 제1 버전(PD-L1/CD55 BsMab v1)에 대해 2개 중쇄 및 공통 경쇄의 가변 영역의 서열은 하기에 제시되어 있다.
PD-L1을 위한 VHa(아벨루맙으로부터 설계)
EVQLLESGGGLVEPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGEGTLVTVSS (서열번호: 4)
CD55를 위한 VHb(CD55 ScFV로부터 설계)
QVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYGMSWIRQTPGKRLEWVATINSGGSYTYYSDSVKGRFTISRDNVKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARRNGTLYYYLMDYWGRGTLVTVSS (서열번호: 5)
공통 VL(CD55 ScFV로부터 설계)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSASTRIFGGGTKVTVLR (서열번호: 6)
상기 CD55 ScFV는, 예들 들어, 종양 및 비종양 세포주를 사용하여 파아지 라이브러리의 감산 패닝에 의해 인간 항-CD55 단일-쇄 Fv의 확인에 기재되어 있다[참조: Cancer Res. 59 (11), 2718-2723 (1999), 이는 본 명세서에 참고로 전체적으로 편입된다]. 또한, 친계 항체의 서열은 비교를 위해 하기에 제시되어 있다:
친계 PD-L1 VH:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS (서열번호: 12)
친계 PD-L1 VL:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL (서열번호: 13)
친계 CD55 VH:
QVKLQESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGYGMSWIRQTPDKRLEWVATINSGGSYTYYSDSVKGRFTISRDNVKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARRNGTLYYYLMDYWGRGTLVTVSS (서열번호: 14)
친계 CD55 VL:
QSVLTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKFMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGVQAEDEADYYCSSYTSASTVIFGGGTKLTVL (서열번호: 15)
아벨루맙 Fv(VH+VL)의 3D PI는 9.4이고, 항-CD55 Fv의 3D PI는 9.8이다. 상기 서열을 재설계한 후, VHa+공통 VL의 3D PI는 9.9이고, VHb+공통 VL의 3D PI는 9.3이다. 2개 VH 쇄의 돌연변이는 하기 표에 제시되어 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 13: 신규 설계된 PD-L1 및 CD55 항체의 결합 친화도
이 실험은 신규 설계된 PD-L1 및 CD55 항체의 결합 친화도를 결정하기 위해 수행했다.
설계된 VH 서열(서열번호: 4) 및 공통 VL 서열(서열번호: 6)을 함유하는 항-PD-L1 동종이량체 IgG(PD-L1 v1)은 친계 항-PD-L1 항체(PD-L1 wt)보다 약한 결합 친화도를 가졌다(도 23a). 설계된 VH 서열(서열번호: 5) 및 공통 VL 서열(서열번호: 6)을 함유하는 항-CD55 동종이량체 IgG(CD55 v1)은 친계 항-CD55 항체(CD55 wt)와 비교하여 유사한 결합 친화도를 가졌다(도 23b).
상기 이중특이적 항체는 고친화도를 갖는 암 특이적 항원(PD-L1)과 결합하고 이중특이적 항체의 다른 아암은 저친화도를 갖는 암-연관된 항원(CD55)와 결합하기 때문에, 상기 항체(CD55 v1 및 PD-L1 v1)은 이 요건을 만족시키지 않았다.
따라서, 상기 이중특이적 항체의 제2 버전은 PD-L1 및 CD55(PD-L1/CD55 BsMab v2)에 결합하도록 설계했다. 상기 이중특이적 항체의 제2 버전의 VHa 및 VHb는 상기 이중특이적 항체의 제1 버전의 VHa 및 VHb와 동일하다. 그러나, 상기 공통 경쇄는 본 명세서에 기재된 방법에 기초하여 재설계했다. 상기 재설계된 공통 경쇄의 서열은 하기에 제시되어 있다:
공통 VL2(서열번호: 6으로부터 재설계):
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSG VSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSASTRIFGGGTKVTVLR (서열번호: 7)
공통 VL(서열번호: 6) 및 공통 VL2(서열번호: 7)의 정렬은 도 24에 제시되어 있다. 밑줄친 서열은 경쇄 불변 영역의 서열이다.
이들 재설계된 VH 및 VL의 CDR 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
게다가, 람다 경쇄는 인간 혈청 중의 카파 경쇄와 비교하여 덜 일반적이기 때문에, 람다 경쇄의 불변 영역은 실시예에서 카파 경쇄의 불변 영역에 의해 대체된다.
항체의 제2 버전의 결합 친화도를 결정하기 위해 실험을 수행했다. 설계된 VH 서열(서열번호: 4) 및 공통 VL2 서열(서열번호: 7)을 함유하는 항-PD-L1 동종이량체 IgG(PD-L1 v2)는 친계 항-PD-L1 항체(PD-L1 wt)와 비교하여 유사한 결합 친화도를 가졌다(도 25a). 설계된 VH 서열(서열번호: 5) 및 공통 VL2 서열(서열번호: 7)을 함유하는 항-CD55 동종이량체 IgG(CD55 v2)는 친계 항-CD55 항체(CD55 wt)와 비교하여 보다 약한 결합 친화도를 가졌다(도 25b). 따라서, 재설계된 서열을 갖는 항체의 결합 친화도는 이 요건을 만족시키고, 추가 실험을 위해 PD-L1/CD55 BsMab v2를 선택했다. PD-L1/CD55 BsMab v2는 서열번호: 7을 포함하는 2개의 공통 경쇄(카파 쇄), 서열번호: 4를 포함하는 1개의 IgG1 중쇄 및 서열번호: 5를 포함하는 1개의 IgG1 중쇄를 갖는다. 게다가, PD-L1의 중쇄는 Y407T 돌연변이(EU 넘버링)을 갖고, CD55의 IgG1 중쇄는 T366Y(EU 넘버링) 돌연변이를 갖는다.
상기 중쇄 및 상기 경쇄의 전장 서열은 하기에 제시되어 있다:
PD-Ll 중쇄의 전장:
EVQLLESGGGLVEPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGEGTLVTVSSASTKGPSPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMSTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEESGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 65)
CD55 중쇄의 전장:
QVKLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYGMSWIRQTPGKRLEWVATINSGGSYTYYSDSVKGRFTISRDNVKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARRNGTLYYYLMDYWGRGTLVTVSSASTKGPFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLIRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVWENGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 66)
CD55 공통 경쇄 버전 1의 전장:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSASTRIFGGGTKVTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 67)
CD55 공통 경쇄 버전 2의 전장:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRIFGGGTKVTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 68)
게다가, 본 명세서에 기재된 항체의 pI가 또한 결정되었다. 이 정보는 용출에 적절한 pH를 선택하는데 유용할 수 있다.
Figure pct00015
실시예 14: PD-L1/CD55 이중특이적 항체의 보체 의존적 세포독성(CDC)
PD-L1/CD55 이중특이적 항체의 보체 의존적 세포독성을 테스트하기 위해 실험을 수행했다. 이들의 친계 항체는 비교를 위해 포함되었다. 검정은 본 명세서에 기재된 프로토콜에 기초하여 MDA231 세포로 수행하고, 각 항체의 농도는 10㎍/ml였다. 결과는 도 26a-26b에 제시되었다.
도면에서 나타낸 바와 같이, 항-PD-L1(PD-L1 wt) 및 항-CD55(CD55 wt) 친계 항체 둘 모두는 CDC를 유도할 수 있다. PD-L1/CD55 이중특이적 항체 v1은 친계 항-PD-L1 항체(PD-L1 wt) 및 친계 항-CD55 항체(CD55 wt)와 비교하여 훨씬 낮은 CDC를 가졌다. 그에 반해서, PD-L1/CD55 이중특이적 항체 v2는 제1 버전, 친계 항-PD-L1 항체(PD-L1 wt) 및 친계 항-CD55 항체(CD55 wt)보다 훨씬 높은 CDC를 가졌다. PD-L1/CD55 이중특이적 항체 v2의 CDC 효과는 이중특이적 항체의 제1 버전의 CDC 효능보다 약 4.5배 더 높았다.
실시예 15: PD-L1/CD55 이중특이적 항체에 의해 유도된 내재화
PD-L1/CD55 이중특이적 항체에 의해 유도된 내재화를 평가하기 위해 실험을 수행했다.
내재화 검정은 PD-L1/CD55 이중특이적 항체 및 그것의 친계 항체의 2개 버전으로 수행했다. MDA231 세포를 제1 내재화 실험(도 27a)에 사용하고, SIHA 세포를 제2 내재화 실험(도 27b)에 사용했다. 세포를 20㎍/ml 항체와 혼합하고, 37℃로 30분 동안 인큐베이션했다. 이어서, pHrodo-라벨링된 이차 항체를 첨가하고, 37℃로 24시간 동안 세포와 함께 인큐베이션했다. 이어서, 세포를 수확하고, FACS로 분석했다.
CD55는, 내재화 능력을 갖는 수용체인 것으로 알려져 있는, 에코 바이러스 및 콕사키 B 바이러스 감염의 수용체이다. 따라서, 항-CD55 친계 단클론성 항체(CD55 wt)는 CD55의 빠른 내재화를 유발할 수 있다. 도 27a에 나타낸 바와 같이, 유사한 PD-L1 및 CD55 발현 수준을 갖는 MDA231 세포에서, 항-PD-L1 항체에 의해 유발된 내재화는 CD55의 것보다 훨씬 더 느렸다. 그러나, PD-L1/CD55 이중특이적 항체 v1 및 v2 둘 모두는 내재화를 유도할 수 있고, 내재화 비율은 항-CD55 친계 단클론성 항체의 것에 필적했다.
도 27b에서, CD55 발현은 SIHA 세포에서 PD-L1보다 더 높다. PD-L1/CD55 이중특이적 항체 v1 및 v2 둘 모두는 친계 항-PD-L1 항체 및 친계 항-CD55 항체보다 더 나은 내재화를 유도할 수 있다. 그럼에도 불구하고, v1의 것과 비교하여 CD55에 대한 PD-L1/CD55 BsMab v2의 결합이 감소하면, PD-L1/CD55 BsMab v2는 생체내에서 더 나은 효능/안전성 밸런스를 갖고, PD-L1/CD55 BsMab v1보다 더 안전하다. 따라서, PD-L1/CD55 BsMab는 3개의 상이한 수준에서 표적 암 세포사를 유도: (1) PD1/PD-L1 상호작용을 차단하고; (2) PD-L1 내재화를 유도하고; (3) 약물과 접합되는 경우, 항체 약물 콘주게이트가 암 세포를 사멸할 수 있는 것으로 예상된다.
다른 구현예
본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 기재하였지만, 전술한 설명은, 첨부의 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 설명하는 것이고 한정하는 것은 아닌 것을 이해해야 한다. 다른 양태, 이점 및 변형은 하기 특허청구의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> AB STUDIO INC. <120> BISPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 44836-0002WO1 <140> PCT/US2018/044778 <141> 2018-08-01 <150> 62/654,112 <151> 2018-04-06 <150> 62/539,970 <151> 2017-08-01 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Ile 1 5 10 <210> 65 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Glu 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 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Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 66 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 66 Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asn Gly Thr Leu Tyr Tyr Tyr Leu Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 67 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 67 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ala 85 90 95 Ser Thr Arg Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 68 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 68 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Arg Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (69)

  1. 제1 중쇄 가변 영역,
    제2 중쇄 가변 영역,
    제1 경쇄 가변 영역, 및
    제2 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    상기 제1 중쇄 가변 영역 및 상기 제1 경쇄 가변 영역은 서로 회합하여, 107　M-1, 108　M-1, 109　M-1, 1010　M-1, 1011M-1　또는 1012　M-1 초과의 결합 친화도로 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역을 형성하고,
    상기 제2 중쇄 가변 영역 및 상기 제2 경쇄 가변 영역은 서로 회합하여, 109　M-1, 108　M-1, 107　M-1, 106　M-1, 105　M-1 또는 104　M_1 미만의 결합 친화도로 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 형성하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제2 항원 결합 영역이 107　M-1, 106　M-1, 105　M-1 또는 104　M-1 초과의 결합 친화도로 제2 항원에 특이적으로 결합하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 항원에 결합할 때의 상기 제1 항원 결합 영역의 결합 친화도가, 상기 제2 항원에 결합할 때의 제2 항원 결합 영역의 결합 친화도보다 적어도 100, 1000 또는 10000배 더 큰, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 경쇄 가변 영역 및 상기 제2 경쇄 가변 영역이 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1 중쇄 가변 영역 및 제1 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 아암(arm); 및
    제2 중쇄 가변 영역 및 제2 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 아암을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    상기 제1 아암은 107　M-1, 108　M-1, 109　M-1, 1010　M-1, 1011M-1　또는 1012　M-1 초과의 결합 친화도로 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 제2 아암은 109　M-1, 108　M-1, 107　M-1, 106　M-1, 105　M-1 또는 104　M_1 미만의 결합 친화도로 제2 항원에 특이적으로 결합하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 제2 아암은 107　M-1, 106　M-1, 105　M-1 또는 104　M-1 초과의 결합 친화도로 제2 항원에 특이적으로 결합하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 청구항 5에 있어서, 제1 항원에 결합할 때의 상기 제1 아암의 결합 친화도가, 제2 항원에 결합할 때의 제2 아암의 결합 친화도보다 적어도 100, 1000 또는 10000배 더 큰, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 제1 경쇄 가변 영역 및 상기 제2 경쇄 가변 영역이 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 중쇄,
    제2 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 중쇄,
    제1 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 경쇄 및
    제2 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    상기 제1 중쇄 가변 영역 및 상기 제1 경쇄 가변 영역은 서로 회합하여, 107　M-1, 108　M-1, 109　M-1, 1010　M-1, 1011 M-1　또는 1012　M-1 초과의 결합 친화도로 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역을 형성하고,
    상기 제2 중쇄 가변 영역 및 상기 제2 경쇄 가변 영역은 서로 회합하여, 109　M-1, 108　M-1, 107　M-1, 106　M-1, 105　M-1 또는 104　M_1 미만의 결합 친화도로 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 형성하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 제2 항원 결합 영역이 107　M-1, 106　M-1, 105　M-1 또는 104　M-1 초과의 결합 친화도로 제2 항원에 특이적으로 결합하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 제1 항원에 결합할 때의 상기 제1 항원 결합 영역의 결합 친화도가, 상기 제2 항원에 결합할 때의 제2 항원 결합 영역의 결합 친화도보다 적어도 100, 1000 또는 10000배 더 큰, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 제1 경쇄 및 상기 제2 경쇄가 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 제1 중쇄 및 상기 제2 쇄가 놉 인투 홀(knobs into holes) 접근법에 의해 서로 회합하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 청구항 1 내지 13 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 항원이 암 특이적 항원이고, 상기 제2 항원이 CD3인, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 청구항 1 내지 13 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 항원이 CD20이고, 상기 제2 항원이 CD3인, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 제1 중쇄 가변 영역이 서열번호: 1과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하고, 상기 제2 중쇄 가변 영역이 서열번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하고, 상기 제1 및 제2 경쇄 가변 영역이 서열번호: 3과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 청구항 1 내지 13 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 항원이 암 특이적 항원이고, 상기 제2 항원이 암-연관된 항원인, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 청구항 1 내지 13 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 항원이 PD-L1이고, 상기 제2 항원이 CD55인, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 제1 중쇄 가변 영역이 서열번호: 4와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하고, 상기 제2 중쇄 가변 영역이 서열번호: 5와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하고, 상기 제1 및 제2 경쇄 가변 영역이 서열번호: 6 또는 서열번호: 7과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 동정하는 단계로서, 상기 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함하는, 단계;
    (b) VHa, VLa, VHb 및 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
    (c) VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80%를 초과하는 것을 결정하는 단계;
    (d) 공통 경쇄 가변 영역(VLc)을 설계하는 단계로서, 상기 VLc는, VHa와 회합하는 경우, 제1 항원에 대한 친화도를 유지하는, 단계;
    (e) VHa 및 VHb 서열을 재설계하고, 그것에 의해 VHa' 및 VHb'를 수득하여, VHa'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLc를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제1 단백질, 및 VHb'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLc를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제2 단백질 사이의 생화학적 또는 생체물리학적 특성의 차이를 증가시키는 단계; 및
    (f) 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 단계로서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLc를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa' 및 VHb'를 각각 포함하는, 단계
    를 포함하는, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 단계 (d)에서, 제2 항원에 대한 VLc-VHb의 결합 친화도가 저하할 수 있는, 방법.
  22. 청구항 20에 있어서, 상기 방법은
    (g) 완충계를 개발하여 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 정제하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  23. 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 동정하는 단계로서, 상기 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함하는, 단계;
    (b) VHa, VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
    (c) VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80% 미만인 것을 결정하는 단계;
    (d) 파아지 디스플레이 항체 라이브러리 중의 모든 경쇄 가변 영역을 상기 VLa로 치환하고, 상기 제2 항원에 대해 패닝(panning)하여 제3 중쇄 가변 영역(VHc)을 수득하는 단계;
    (e) 상기 VHa 및 VHc 서열을 재설계하고, 그것에 의해 VHa' 및 VHc'를 수득하여, VHa'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLa를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제1 단백질, 및 VHc'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLa를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제2 단백질 사이의 생화학적 또는 생체물리학적 특성의 차이를 증가시키는 단계; 및
    (f) 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 단계로서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLa를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa' 및 VHc'를 각각 포함하는, 단계
    를 포함하는, 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 방법은
    (g) 완충제를 개발하여 상기 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  25. 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 동정하는 단계로서, 상기 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함하는, 단계;
    (b) VHa, VLa, VHb 및 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
    (c) VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80% 미만인 것을 결정하는 단계;
    (d) 파아지 디스플레이 항체 라이브러리 중의 모든 경쇄 가변 영역을 복수의 경쇄 가변 영역으로 치환하는 단계로서, 상기 경쇄 가변 영역은 VLa 또는 VLb와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한, 단계;
    (e) 제2 항원에 대해 패닝하는 단계;
    (f) 공통 경쇄 가변 영역(VLc) 및 제3 중쇄 가변 영역(VHc)을 선택하는 단계로서, VHa-VLc는 원하는 친화도로 상기 제1 항원에 결합하고, VHc-VLc는 원하는 친화도로 상기 제2 항원에 결합하는, 단계;
    (g) 상기 VHa 및 VHc 서열을 재설계하고, 그것에 의해 VHa' 및 VHc'를 수득하여, VHa'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLc를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제1 단백질, 및 VHc'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLc를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제2 단백질 사이의 생화학적 또는 생체물리학적 특성의 차이를 증가시키는 단계; 및
    (h) 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 단계로서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLc를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa' 및 VHc'를 각각 포함하는, 단계
    를 포함하는, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 단계 (d)에서, 복수의 경쇄 가변 영역이 오류-유발 PCR에 의해 생성되는, 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 상기 방법은
    (i) 완충계를 개발하여 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  28. 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 동정하는 단계로서, 상기 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함하는, 단계;
    (b) VHa, VLa, VHb 및 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
    (c) VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80% 미만인 것을 결정하는 단계;
    (d) 파아지 디스플레이 항체 라이브러리 중의 모든 경쇄 가변 영역을 복수의 경쇄 가변 영역으로 치환하는 단계로서, 상기 경쇄 가변 영역은 VLa 또는 VLb와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한, 단계;
    (e) 제2 항원에 대해 패닝하는 단계;
    (f) 공통 경쇄 가변 영역(VLc) 및 제3 중쇄 가변 영역(VHc)을 선택하는 단계로서, VHc-VLc는 원하는 친화도로 상기 제2 항원에 결합하는, 단계;
    (g) VLa 및 VLc 사이의 상동성이 80% 보다 큰 것을 결정하는 단계;
    (h) 공통 경쇄 가변 영역(VLd)을 설계하는 단계로서, 상기 VLd는, VHa와 회합하는 경우, 상기 제1 항원에 대한 친화도를 유지하고, VHc와 회합하는 경우, 상기 제2 항원에 대하여 원하는 친화도를 갖는, 단계;
    (i) 선택적으로, 상기 VHa 및 VHc 서열을 재설계하고, 그것에 의해 VHa' 및 VHc'를 수득하여, VHa'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLd를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제1 단백질, 및 VHc'를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드 및 VLd를 각각 포함하는 2개 폴리펩타이드를 포함하는 제2 단백질 사이의 생화학적 또는 생체물리학적 특성의 차이를 증가시키는 단계; 및
    (j) 선택적으로, 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 단계로서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLd를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa' 및 VHc'를 각각 포함하는, 단계
    를 포함하는, 방법.
  29. 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 동정하는 단계로서, 상기 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함하는, 단계;
    (b) VHa, VLa, VHb 및 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
    (c) VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80%를 초과하는 것을 결정하는 단계;
    (d) 공통 경쇄 가변 영역(VLc)을 설계하는 단계로서, 상기 VLc는, VHa와 회합하는 경우, 제1 항원에 대한 친화도를 유지하는, 단계; 및
    (e) 선택적으로, 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 단계로서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLc를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa 및 VHb를 각각 포함하는, 단계
    를 포함하는, 방법.
  30. 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 동정하는 단계로서, 상기 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함하는, 단계;
    (b) VHa, VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
    (c) VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80% 미만인 것을 결정하는 단계;
    (d) 파아지 디스플레이 항체 라이브러리 중의 모든 경쇄 가변 영역을 상기 VLa로 치환하고, 상기 제2 항원에 대해 패닝(panning)하여 제3 중쇄 가변 영역(VHc)을 수득하는 단계; 및
    (e) 선택적으로, 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 단계로서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLa를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa 및 VHc를 각각 포함하는, 단계
    를 포함하는, 방법.
  31. 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 제1 항원 및 제2 항원을 선택하고, 상기 제1 항원에 결합하는 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 상기 제2 항원에 결합하는 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 동정하는 단계로서, 상기 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 중쇄 가변 영역(VHa) 및 제1 경쇄 가변 영역(VLa)을 포함하고, 상기 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 중쇄 가변 영역(VHb) 및 제2 경쇄 가변 영역(VLb)을 포함하는, 단계;
    (b) VHa, VLa, VHb 및/또는 VLb의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
    (c) VLa 및 VLb의 아미노산 서열을 정렬시키고, VLa 및 VLb 사이의 서열 상동성이 80% 미만인 것을 결정하는 단계;
    (d) 파아지 디스플레이 항체 라이브러리 중의 모든 경쇄 가변 영역을 복수의 경쇄 가변 영역으로 치환하는 단계로서, 상기 경쇄 가변 영역이 VLa 또는 VLb와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한, 단계;
    (e) 제1 및/또는 제2 항원에 대해 패닝(panning)하는 단계;
    (f) 공통 경쇄 가변 영역(VLc) 및 제3 중쇄 가변 영역(VHc)을 선택하는 단계로서, VHa-VLc는 원하는 친화도로 상기 제1 항원에 결합하고, VHc-VLc는 원하는 친화도로 상기 제2 항원에 결합하는, 단계; 및
    (g) 선택적으로, 2개 경쇄 가변 영역 및 2개 중쇄 가변 영역을 갖는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 단계로서, 상기 2개 경쇄 가변 영역은 각각 VLc를 포함하고, 상기 2개 중쇄 가변 영역은 VHa 및 VHc를 각각 포함하는, 단계
    를 포함하는, 방법.
  32. CD3에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)으로서, 상기 VH CDR1 영역은 선택된 VH CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH CDR2 영역은 선택된 VH CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH CDR3 영역은 선택된 VH CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변 영역; 및
    CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)으로서, 상기 VL CDR1 영역은 선택된 VL CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL CDR2 영역은 선택된 VL CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL CDR3 영역은 선택된 VL CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변 영역
    을 포함하고,
    상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호: 22-24에 제시된 것이고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 서열번호: 28-30에 제시된 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 VH가 각각 서열번호: 22, 23, 24에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 3을 포함하고, 상기 VL이 각각 서열번호: 28, 29, 30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 3을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  34. 청구항 32 내지 33 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 CD3에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  35. 청구항 32 내지 34 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 이중특이적 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  36. PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)으로서, 상기 VH CDR1 영역은 선택된 VH CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH CDR2 영역은 선택된 VH CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH CDR3 영역은 선택된 VH CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변 영역; 및 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)으로서, 상기 VL CDR1 영역은 선택된 VL CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL CDR2 영역은 선택된 VL CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL CDR3 영역은 선택된 VL CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고,
    상기 선택된 VH CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열 및 상기 선택된 VL CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열은 하기 중의 하나인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (1) 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 41-43에 각각 제시되어 있고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 53-55에 각각 제시된 것임;
    (2) 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 41-43에 각각 제시되어 있고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 59-61에 각각 제시된 것임.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 VH가 서열번호: 41-43에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 3을 각각 포함하고, 상기 VL이 서열번호: 59-61에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 3을 각각 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  38. 청구항 36 내지 37 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 CD3에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  39. 청구항 36 내지 38 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 이중특이적 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  40. CD55에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)으로서, 상기 VH CDR1 영역은 선택된 VH CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH CDR2 영역은 선택된 VH CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VH CDR3 영역은 선택된 VH CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변 영역; 및
    CDR 1, 2 및 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)으로서, 상기 VL CDR1 영역은 선택된 VL CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL CDR2 영역은 선택된 VL CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL CDR3 영역은 선택된 VL CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    상기 선택된 VH CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열 및 상기 선택된 VL CDR 1, 2 및 3 아미노산 서열은 하기 중의 하나인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (1) 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 47-49에 각각 제시되어 있고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 53-55에 각각 제시된 것임;
    (2) 상기 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 47-49에 각각 제시되어 있고, 상기 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열이 서열번호: 59-61에 각각 제시된 것임.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 VH가 서열번호: 47-49에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2, 3을 각각 포함하고, 상기 VL이 서열번호: 59-61에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3을 각각 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  42. 청구항 40 내지 41 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 CD3에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  43. 청구항 40 내지 42 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 이중특이적 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  44. 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산으로서,
    각각 서열번호: 53-55에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 포함하고,
    상기 VL은, 서열번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍으로 되는 경우, PD-L1에 결합하고/하거나, 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍으로 되는 경우, CD55에 결합하는, 핵산.
  45. 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산으로서,
    각각 서열번호 59-61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 포함하고,
    상기 VL은, 서열번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍으로 되는 경우, PD-L1에 결합하고/하거나, 서열번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH와 쌍으로 되는 경우, CD55에 결합하는, 핵산.
  46. 청구항 44 내지 45 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 핵산이 이중특이적 항체를 코딩하는, 핵산.
  47. 청구항 44 내지 45 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 핵산이 cDNA인, 핵산.
  48. 청구항 44 내지 47 중의 어느 하나의 항의 핵산을 하나 이상 포함하는 벡터.
  49. 청구항 48의 벡터를 포함하는 세포.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포인, 세포.
  51. 청구항 44 내지 47 중의 어느 하나의 항의 핵산을 하나 이상 포함하는 세포.
  52. CD20 및 CD3에 결합하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    서열번호: 1과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
    서열번호: 2와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 제2 폴리펩타이드;
    서열번호: 3과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제3 폴리펩타이드;
    서열번호: 3과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제4 폴리펩타이드를 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  53. 청구항 52에 있어서,
    상기 제1 중쇄 가변 영역(VH)이 서열번호: 1을 포함하고;
    상기 제2 중쇄 가변 영역(VH)이 서열번호: 2를 포함하고;
    상기 제1 경쇄 가변 영역(VL)이 서열번호: 3을 포함하고;
    상기 제2 경쇄 가변 영역(VL)이 서열번호: 3을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  54. 청구항 52에 있어서,
    상기 제1 폴리펩타이드가 서열번호: 34, 35 또는 36과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 제2 폴리펩타이드가 서열번호: 37, 38 또는 39와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 제3 폴리펩타이드가 서열번호: 40과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 제4 폴리펩타이드가 서열번호: 40과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  55. 청구항 52에 있어서,
    상기 제1 폴리펩타이드가 서열번호: 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 제2 폴리펩타이드가 서열번호: 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  56. PD-L1 및 CD55에 결합하는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    서열번호: 4와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
    서열번호: 5와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 제2 폴리펩타이드;
    서열번호: 6 또는 7과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제3 폴리펩타이드;
    서열번호: 6 또는 7과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 제4 폴리펩타이드를 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  57. 청구항 56에 있어서,
    상기 제1 중쇄 가변 영역(VH)이 서열번호: 4를 포함하고;
    상기 제2 중쇄 가변 영역(VH)이 서열번호: 5를 포함하고;
    상기 제1 경쇄 가변 영역(VL)이 서열번호: 7을 포함하고;
    상기 제2 경쇄 가변 영역(VL)이 서열번호: 7을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  58. 청구항 56에 있어서,
    상기 제1 폴리펩타이드가 서열번호: 65와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 제2 폴리펩타이드가 서열번호: 66과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 제3 폴리펩타이드가 서열번호: 67 또는 68과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 제4 폴리펩타이드가 서열번호: 67 또는 68과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  59. 청구항 56에 있어서,
    상기 제1 폴리펩타이드가 서열번호: 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 제2 폴리펩타이드가 서열번호: 66에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 제3 폴리펩타이드가 서열번호: 68에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 제4 폴리펩타이드가 서열번호: 68에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  60. 치료제와 공유 결합된, 청구항 1-19, 32-43 및 52-59 중의 어느 하나의 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 콘주게이트.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 치료제가 세포독성제 또는 세포증식억제제인, 항체-약물 콘주게이트.
  62. 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 청구항 1-19, 32-43 및 52-59 중의 어느 하나의 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 청구항 60 또는 61의 항체-약물 콘주게이트를 포함하는 치료학적 유효량의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  63. 청구항 62에 있어서, 상기 대상체가 고형 종양을 갖는, 방법.
  64. 청구항 62에 있어서, 상기 암이 흑색종, 췌장 암종 또는 혈액학적 악성종양인, 방법.
  65. 청구항 62에 있어서, 상기 암이 비-호지킨 림프종, 림프종 또는 만성 림프구성 백혈병인, 방법.
  66. 종양 성장 속도를 저하시키는 방법으로서, 대상체에서의 종양 세포를 청구항 1-19, 32-43 및 52-59 중의 어느 하나의 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 청구항 60 또는 61의 항체-약물 콘주게이트를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  67. 종양 세포를 사멸시키는 방법으로서, 대상체에서의 종양 세포를 청구항 1-19, 32-43 및 52-59 중의 어느 하나의 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 청구항 60 또는 61의 항체-약물 콘주게이트를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  68. 약제학적 조성물로서, 청구항 1-19, 32-43 및 52-59 중의 어느 하나의 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  69. 약제학적 조성물로서, 청구항 60 또는 61의 항체 약물 콘주게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
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