CN110655582B - 具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双特异性抗体或抗体混合物，具体涉及具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物，以及所述双特异性抗体或抗体混合物的制备方法。本发明还涉及编码所述双特异性抗体或抗体混合物的核酸分子、含有该核酸分子的重组载体和重组细胞，以及所述双特异性抗体或抗体混合物的检测和定量方法。本发明通过共同轻链技术制备双特异性抗体或抗体混合物，其制备方法简单、可控，可以避免双特异性抗体中轻链的错配，对于抗体混合物，其可以在同一宿主细胞中表达，降低了混合细胞群培养的难度，更有利于放大生产。

Description

具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物
本申请是申请日为2015年1月8日、申请号为201510008045.8、发明名称为“具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及双特异性抗体或抗体混合物，以及所述双特异性抗体或抗体混合物的制备方法。本发明还涉及编码所述双特异性抗体或抗体混合物的核酸分子、含有该核酸分子的重组载体和重组细胞，以及所述双特异性抗体或抗体混合物的检测和定量方法。
背景技术
单克隆抗体药物在近十五年内增长迅速，成为制药行业的成长点。自1996年起，一共有30个左右单抗药物被批准上市。其中有九个单抗药物年销售超过十亿美元。2010年单抗药物总销售超过300亿美元，并且年增长率超过10％。由于单克隆抗体的靶标特异性强，只能抑制单一靶点。而在多种疾病中，包括肿瘤，自体免疫，需要抑制多重信号通路来避免代偿效应。对于病毒感染疾病，由于病毒的高突变率，往往需要抑制多抗原位点来防止逃逸。因此，有以下几种备选方案可以解决此类问题。一种备选方案是使用多克隆抗体，或通过改造抗体Fc段获得异二聚体如双特异性抗体，至少可以对两个不同抗原或者同一个抗原的不同结合位点具有活性。还有一种方案是使用抗体混合物来治疗，抗体混合物可包含两种或更多种针对同一靶物上不同表位的抗体，或针对不同靶物的抗体的混合物。
双特异性抗体(Bispecific antibody,BsAbs)是含有两个不同配体结合位点的免疫球蛋白分子。它取代了经典的抗体Fab两臂相同的序列，而是用两个不同的Fab序列，因此Y型两臂可以结合不同的抗原表位。双特异性抗体在癌症治疗中的应用已经被多篇文献所综述(Carter 2001；Chames and Baty 2009；Chames and Baty 2009)。BsAbs的一臂可以连接肿瘤细胞表面的相关抗原而另外一臂则可以触发免疫效应细胞进一步杀伤细胞，通过免疫体系来杀死癌症肿瘤细胞。
对于双特异性抗体的制备，早在90年代，Carter等人用“把手-孔洞”(knob intohole)模型改造抗体重链的部分氨基酸，比较成功的实现了双特异性抗体(Ridgway,Prestaet al.1996；Carter 2001)。然而在他们的研究结果中，“孔洞-孔洞”模型对阻碍同二聚体的形成的能力仍然不够，依旧遗留了大概有5％的同二聚体。之后该研究组通过随机突变-噬菌体展示等方法进一步提高异二聚体的含量，但也没有解决根本问题。
本发明的发明人通过电荷氨基酸相互作用网络修改Fc的CH3相关氨基酸来减弱区域自身相互作用(有利于形成同二聚体)并增强区域之间的相互作用(有利于形成异二聚体)，成功的解决了“把手-孔洞”模型中5％同二聚体的残留，相关方法已经发表专利(公开号：CN 102558355A)。
相对异二聚体平台技术，混合抗体生产平台的发展相对比较早期。其中最受关注的是丹麦的Symphogen A/S公司的抗体混合物技术。该技术首先通过抗体筛选平台的筛选获得多个针对同一靶标的抗体，随后针对每个抗体分别进行细胞株构建。之后将不同细胞摇瓶培养的种子液进行混合，最后进行混合物逐步扩大培养放大，并进行纯化工艺优化获得最终的产品。尽管使用这一方法通过培养多个细胞的混合群可以直接从一个重组生产过程中获得多个抗体，但在由于对混合细胞群培养的控制的难度，以及因此带来的放大生产的复杂性，使得该方案依然有一些潜在的问题。
本发明申请人通过对Fc部分进行突变，改变Fc直接相互作用，发明了一种用于在单一重组细胞中生成包含两种或多种同二聚体蛋白或抗体混合物的方法。该方案避免了混合细胞培养带来的工艺控制及放大的潜在困难，提供了一种更为经济有效的抗体混合物制备与生产方式。此方案也已发表专利(公开号：CN 103388013A)。
但不论上述哪种方法，在利用全抗体框架制备双特异性抗体或抗体混合物时，都可能出现轻链和重链之间错配的现象，进而影响抗体的活性，目前本领域比较成熟的方法是Roche(Genentech)开发的Crossmab，即通过对其中一组Fab进行轻链-重链序列的互相替换来防止该轻链序列与另一组轻链-重链之间的错配(专利号US20090162359,US20120164726)。此方法虽然能解决大部分的重链-轻链错配问题，但是又会因为对重轻链序列进行人为改造而带来新的问题，如轻链的解离，聚体含量增加，以及对有些Fab序列，会对抗原表位的识别造成一些影响。
赫赛汀(Herceptin，也叫曲妥珠单抗，Trastuzumab)作为第一个在乳腺癌中显示有切实疗效的治疗性单抗，为人类的抗人类表皮生长因子受体2(HER2)单克隆抗体，它作用于乳腺癌细胞的HER2-Neu表面蛋白，干扰癌细胞的生物学进程，最终致其死亡。赫赛汀(Herceptin)的主要适宜人群是HER2过度表达(免疫组化3+或者荧光原位杂交FISH阳性)的乳腺癌患者，而该人群约占所有乳腺癌患者的20～30％。
帕妥珠单抗(pertuzumab)是一种重组的单克隆抗体，与HER-2受体胞外结构域Ⅱ区结合，抑制二聚体的形成，抑制受体介导的信号转导通路(Agus DB，Gordon MS，TaylorC，et al.2005)。这可能部分解释帕妥珠单抗抑制HER-2低表达肿瘤生长的原因，而曲妥珠单抗与HER-2受体的细胞外Ⅳ区结合，二聚体的形成不涉及Ⅳ区，因此曲妥珠单抗只对HER-2过表达的乳腺癌患者有效。目前正在进行帕妥珠单抗治疗HER-2低表达晚期乳腺癌的Ⅱ期临床研究。Baselga(Baselga J，et al.2007)等的研究显示帕妥珠单抗联合赫赛汀(曲妥珠单抗)对经治HER-2阳性乳腺癌患者具有确凿的抗肿瘤活性。该研究显示1/5的患者对帕妥珠单抗治疗有效(肿瘤缩小或消失)，另外1/5的患者病情保持稳定达6个月以上。帕妥珠单抗治疗乳腺癌的III期临床试验结果显示，该药能极长延长ERBB2阳性转移性乳腺癌患者的无进展生存期。
日前，罗氏公司公布了一项最新实验的结果，该试验是一项评估采用帕妥珠单抗和赫赛汀(曲妥珠单抗)联合化疗(多西他赛)，来治疗早期原癌基因人类表皮生长因子受体2(HER2)阳性乳腺癌女性患者的疗效的II期新辅助治疗研究。美国癌症研究协会(CTRC-AACR)在圣安东尼奥乳腺癌研讨会(SABCS)上发布的数据显示，在术前新辅助治疗中给予者两种抗体联合多西他赛治疗的乳腺肿瘤完全消失率(45.8％的病例完全缓解率)较赫赛汀联合多西他赛(29.0的病例完全缓解率)显著提高50％以上。和赫赛汀及化疗相比，帕妥珠单抗和帕妥珠单抗联合多西他赛不会导致副作用或心脏风险显著增加。
本发明即以帕妥珠单抗和曲妥珠单抗为例，制备得到了同时具备帕妥珠单抗和曲妥珠单抗功能的双特异性抗体和抗体混合物，并在此基础上找到了一种制备轻链和重链能够正确组合的双特异性抗体或抗体混合物的新方法。
发明内容
本发明的发明人通过反复实验，令人惊奇地发现，可以将两个原始抗体或抗体混合物中的轻链替换为共同轻链，以得到具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物，该具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物能够实现轻链和重链的正确组合，并且与两个原始抗体相比，具有良好的结合特性、生物学活性和稳定性，甚至在生物学活性上优于原始抗体。
本发明第一方面涉及双特异性抗体或其抗原结合部分，其特征在于所述双特异性抗体或其抗原结合部分的两条轻链具有相同的序列。
根据本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其重链能够分别与所述轻链在生理条件或体外的蛋白表达状态下正确结合。
根据本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，所述双特异性抗体或其抗原结合部分的轻链从两株原始单克隆抗体改造获得，所述轻链至少与两株原始单克隆抗体中一株的轻链序列不同。
根据本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，所述双特异性抗体或其抗原结合部分的重链Fc段经过改造以更有利于形成异二聚体蛋白。
在本发明的实施方案中，两株原始单克隆抗体为帕妥珠抗体和赫赛汀抗体。
根据本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述的轻链能够分别与帕妥珠单抗和曲妥株单抗的重链结合。
根据本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述的轻链选自帕妥珠单抗或曲妥株单抗的轻链或者它们的突变体。
根据本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，所述双特异性抗体或其抗原结合部分的重链(包括可变区和恒定区)可以与两株原始单克隆抗体相同，或者经过改造；所述改造例如为对重链Fc段进行改造以更有利于形成异二聚体蛋白。
根据本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链可变区的序列包含选自如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6中第1～107位氨基酸所示的序列。
根据本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链恒定区的序列包含SEQ ID NO：1中第108～214位氨基酸所示的序列。
根据本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其重链可变区分别为帕妥珠单抗和曲妥株单抗的重链可变区。
根据本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其两条重链可变区的序列分别包含如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的序列。
根据本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其两条重链Fc段的序列分别包含如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的序列。
根据本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其两条重链的序列分别包含如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的序列。
本发明第二方面涉及能够在一个细胞中正确产生的抗体或其抗原结合部分的混合物，所述混合物包括至少两种抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分具有共同的轻链。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其中所述抗体或其抗原结合部分的重链能够分别与所述轻链在生理条件或体外的蛋白表达状态下正确结合。
根据本发明第二方面任一项的混合物，所述双特异性抗体或其抗原结合部分来源于两株原始单克隆抗体，所述双特异性抗体或其抗原结合部分的重链可变区序列和/或CH1结构域序列与原始单克隆抗体相同。
根据本发明第二方面任一项的混合物，所述双特异性抗体或其抗原结合部分的的重链(包括可变区和恒定区)可以与两株原始单克隆抗体相同，或者经过改造；所述改造例如为对重链Fc段进行改造以更有利于形成同二聚体蛋白。
在本发明的实施方案中，两株原始单克隆抗体为帕妥珠抗体和赫赛汀抗体。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其中所述的轻链能够分别与帕妥珠单抗和曲妥株单抗的重链结合。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其中所述的轻链选自帕妥珠单抗或曲妥株单抗的轻链或者它们的突变体。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其中所述轻链可变区的序列包含选自如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6中第1～107位氨基酸所示的序列。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其中所述轻链恒定区的序列包含SEQ IDNO：1中第108～214位氨基酸所示的序列。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其中所述抗体或其抗原结合部分的重链可变区分别为帕妥珠单抗和曲妥株单抗的重链可变区。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其两条重链可变区的序列分别包含如SEQID NO：23和SEQ ID NO：24所示的序列。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其两条重链Fc段的序列分别包含如SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：28所示的序列。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其中所述抗体或其抗原结合部分的重链序列分别包含如SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示的序列。
本发明第三方面涉及HER2蛋白胞外区域的变体蛋白，其与野生型HER2蛋白胞外区域的序列相比，具有选自如下一组的突变：
1)第558位谷氨酸的突变和第573位苯丙氨酸的突变；
2)第288位丝氨酸的突变和第296位组氨酸的突变。
在本发明的一个实施方案中，将第558位谷氨酸突变为丙氨酸。
在本发明的一个实施方案中，将第573位苯丙氨酸突变为丙氨酸。
在本发明的一个实施方案中，将第288位丝氨酸突变为丙氨酸。
在本发明的一个实施方案中，将第296位组氨酸突变为丙氨酸。
在本发明的一个实施方案中，所述HER2变体蛋白包含选自如SEQ ID NO：13、SEQID NO：14或SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。
在本发明的实施方案中，野生型HER2蛋白胞外区域的序列如SEQ ID NO：18所示。
本发明第四方面涉及核酸分子，其编码本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分或者第二方面任一项的混合物中所述的抗体或其抗原结合部分、或者所述抗体或其抗原结合部分的部分序列，或者编码第三方面任一项的HER2变体蛋白。
本发明第五方面涉及重组载体，其含有本发明第四方面任一项的核酸分子。
本发明第六方面涉及重组细胞，其含有本发明第五方面任一项的重组载体或第四方面任一项的核酸分子。
本发明第七方面涉及一种根据两株针对不同表位的单克隆抗体或其抗原结合部分制备双特异性抗体或其抗原结合部分的方法，其包括以下步骤：
1)根据两株单克隆抗体的轻链序列得到能够分别与两株单抗重链结合的共同轻链序列，该共同轻链为其中一株单抗的轻链或者为其中一株单抗轻链的突变体；
2)分别将两株单抗的重链序列和共同轻链序列构建于表达载体中，得到两个重组表达载体；优选地，对重链序列特别是Fc段进行突变，以更有利于具有不同重链的Fc段的结合；
3)将两个重组表达载体转入同一宿主细胞，诱导表达，得到双特异性抗体或其抗原结合部分。
根据本发明第七方面任一项的方法，其中所述共同轻链的获取方法为，首先确定两株单抗与抗原或抗原表位之间接触的界面氨基酸，然后确定以任意其中一株单抗的轻链为候选共同轻链时，该共同轻链与抗原或抗原表位之间接触的界面氨基酸与另一株单抗轻链相应位置的氨基酸相比较时的差异氨基酸，选取差异氨基酸数量较少的轻链为共同轻链；优选地，对该共同轻链进一步突变以获得结合力更好的共同轻链。
本发明第八方面涉及一种制备包括至少两种单克隆抗体或其抗原结合部分的混合物的方法，所述方法包括以下步骤：
1)根据两株单克隆抗体的轻链序列得到能够分别与两株单抗重链结合的共同轻链序列，该共同轻链为其中一株单抗的轻链或者为其中一株单抗轻链的突变体；
2)分别将两株单抗的重链序列和共同轻链序列构建于表达载体中，得到两个重组表达载体；优选地，对重链序列特别是Fc段进行突变，以更有利于具有相同重链的Fc段的结合；
3)将两个重组表达载体转入同一宿主细胞，诱导表达，得到抗体或其抗原结合部分的混合物。
根据本发明第八方面任一项的方法，其中所述共同轻链的获取方法为，首先确定两株单抗与抗原或抗原表位之间接触的界面氨基酸，然后确定以任意其中一株单抗的轻链为候选共同轻链时，该共同轻链与抗原或抗原表位之间接触的界面氨基酸与另一株单抗轻链相应位置的氨基酸相比较时的差异氨基酸，选取差异氨基酸数量较少的轻链为共同轻链；优选地，对该共同轻链进一步突变以获得结合力更好的共同轻链。
本发明还涉及一种检测抗体或其抗原结合部分是否为双特异性抗体或其抗原结合部分和/或对其定量的方法，所述方法包括以下步骤(参见图25的示意图)：
1)分别制备能够和双特异性抗体或其抗原结合部分的抗原结合部分1结合而不和抗原结合部分2结合的特异性抗原1，以及能够和抗原结合部分2结合而不和抗原结合部分1结合的特异性抗原2；
2)取特异性抗原1(或者特异性抗原2)包被酶标板，加入待检抗体，反应一段时间，再加入标记的特异性抗原2(或者特异性抗原1)，反应一段时间，最后加入能够与前述标记分子结合的检测分子，反应一段时间，所述检测分子带有可检测的标记，根据检测原理读数，判断为反应阳性或阴性；
3)当反应为阳性、并且该反应具有浓度依赖性时，则判断该抗体或其抗原结合部分为双特异性抗体或其抗原结合部分；任选地，根据所得阳性数值进一步对双特异性抗体或其抗原结合部分进行定量。
在本发明中，所述抗原结合部分1和2分别是指双特异性抗体或其抗原结合部分中的两个分别与不同抗原或抗原表位结合的部分；在本发明的实施方案中，所述抗原结合部分1和2分别在两株原始抗体的基础上改造获得，并且抗原结合部分1和2分别和两株原始抗体结合的抗原或抗原表位相同。
在本发明的实施方案中，所述特异性抗原1和特异性抗原2是HERm1和HERm2。
在本发明的实施方案中，所述标记的特异性抗原是用生物素标记的特异性抗原。
在本发明的实施方案中，所述检测分子是指可用于检测的底物分子，例如为HRP标记的链霉亲和素。
本发明还涉及一种检测抗体或其抗原结合部分的混合物是否为同二聚体蛋白的方法，所述混合物包括两种抗体(抗体1和抗体2)或其抗原结合部分，所述方法包括以下步骤(参见图26的示意图)：
1)分别制备能够和抗体1结合而不和抗体2结合的特异性抗原1，以及能够和抗体2结合而不和抗体1结合的特异性抗原2；
2)取特异性抗原1(或者特异性抗原2)包被酶标板，加入待检混合物，反应一段时间，再加入标记的特异性抗原1(或者特异性抗原2)，反应一段时间，最后加入能够与前述标记分子结合的检测分子，反应一段时间，所述检测分子带有可检测的标记，根据检测原理读数，判断为反应阳性或阴性；
3)另取特异性抗原1(或者特异性抗原2)包被酶标板，加入待检混合物，反应一段时间，再加入标记的特异性抗原2(或者特异性抗原1)，反应一段时间，最后加入能够与前述标记分子结合的检测分子，反应一段时间，所述检测分子带有可检测的标记，根据检测原理读数，判断为反应阳性或阴性；
4)当步骤2)反应阳性、并且该反应具有浓度依赖性，同时步骤3)反应阴性时，则判断混合物中为同二聚体蛋白并且不含异二聚体蛋白；当步骤2)反应阳性同时步骤3)反应阳性时，则判断混合物中既含有同二聚体蛋白也含有异二聚体蛋白。
在本发明的实施方案中，所述特异性抗原1和特异性抗原2是HERm1和Herm2。
在本发明的实施方案中，所述标记的特异性抗原是用生物素标记的抗原。
在本发明的实施方案中，所述检测分子是指可用于检测的底物分子，例如为HRP标记的链霉亲和素。
本发明还涉及组合物(例如药物组合物)，其含有本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还涉及组合物(例如药物组合物)，其含有本发明第二方面任一项的混合物，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还涉及试剂盒，其含有本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，以及任选的缓冲液或说明书。
在本发明的实施方案中，所述试剂盒用于诊断HER2阳性肿瘤(例如乳腺癌、胃癌)。
本发明还涉及试剂盒，其含有本发明第二方面任一项的混合物，以及任选的缓冲液或说明书。
在本发明的实施方案中，所述试剂盒用于诊断HER2阳性肿瘤(例如乳腺癌、胃癌)。
本发明还涉及本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备预防和/或治疗HER2阳性肿瘤(例如乳腺癌、胃癌)的药物中的用途。
本发明还涉及本发明第二方面任一项的混合物在制备预防和/或治疗HER2阳性肿瘤(例如乳腺癌、胃癌)的药物中的用途。
本发明还涉及本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备诊断HER2阳性肿瘤(例如乳腺癌、胃癌)的试剂或试剂盒中的用途。
本发明还涉及本发明第二方面任一项的混合物在制备诊断HER2阳性肿瘤(例如乳腺癌、胃癌)的试剂或试剂盒中的用途。
本发明还涉及本发明第三方面任一项的HER2蛋白胞外区域的变体蛋白用于检测第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分或者用于检测第二方面任一项的混合物的用途。
本发明还涉及预防和/或治疗HER2阳性肿瘤(例如乳腺癌、胃癌)的方法，所述方法包括给有需要的受试者预防或治疗有效量的本发明第一方面任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分的步骤。
本发明还涉及预防和/或治疗HER2阳性肿瘤(例如乳腺癌、胃癌)的方法，所述方法包括给有需要的受试者预防或治疗有效量的本发明第二方面任一项的混合物的步骤。
以下对本发明做进一步描述。
在本发明中，术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
在本发明中，术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，HER2)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如单克隆抗体2E12)获得抗体的抗原结合部分(例如，上述抗体片段)，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。
在本发明中，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
在本发明中，术语“抗体Fc段””是熟练的技术人员公知的术语并基于抗体的木瓜蛋白酶裂解而定义，指的是人免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分。例如，免疫球蛋白Fc区可包括重链CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-l，IgG-2，IgG-3，IgG-4，IgA-l和IgA-2。从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc区在本领域技术人员所掌握的范围之内。
在本发明的实施方案中，本发明所用的抗体Fc段包括至少一个免疫球蛋白绞链区，一个CH2结构域和一个CH3结构域，具体为人IgG1 Fc。
在本发明中，术语“双特异性抗体”能够分别和两种抗原或抗原表位结合，其包括特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链，以及特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链。
在本发明中，术语“表位”或“抗原表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
在本发明中，20种常规氨基酸和其缩写遵从常规用法。参见Immunology-ASynthesis(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其通过引用合并入本文。
在本发明中，对两株针对不同抗原或抗原表位的单克隆抗体(即原始抗体)的轻链序列进行分析和验证，获得能够和两株单抗的重链结合的共同轻链。该共同轻链和重链结合后，仍能特异性结合原单抗的抗原或抗原表位。
在本发明中，该共同轻链可以用于表达双特异性抗体中，也可以用于表达含有两种抗体的混合物中；在双特异性抗体中，该抗体含有能够和第一种抗原结合的轻链和重链，以及能够和第二种抗原结合的轻链和重链，其中的两条轻链序列完全相同，即为该共同轻链；在抗体混合物中，每种抗体各含有两条轻链和重链，其中的轻链序列完全相同，即为该共同轻链。
在本发明中，两株原始抗体的轻链类型(κ或λ)可以相同或不同，当类型相同时，可以仅对轻链的可变区进行突变，以获得共同轻链；当类型不同时，需要同时对轻链的可变区和恒定区进行突变，以获得共同轻链。
在本发明中，两株原始抗体的重链类型可以相同或不同，优选为类型相同。在本发明的实施方案中，在制备双特异性抗体和抗体混合物时，与原始抗体相比，其重链序列的可变区和CH1结构域的序列不变。
在本发明中，所述双特异性抗体中的两个臂或含有两种抗体混合物中的抗体都来源于两株原始单克隆抗体。在构建双特异性抗体或抗体混合物时，仅需要改变轻链可变区的序列以获得共同轻链，而不需要改变重链可变区的序列。也就是说，在构建的双特异性抗体和抗体混合物中，抗体的重链可变区序列与原始抗体可以是相同的，但轻链可变区序列与原始抗体不同。那种需要改变重链可变区序列的方法，其轻链可变区序列与原始抗体相同，即使其获得的双特异性抗体或抗体混合物中的轻链是相同的，也与本发明不同。
在本发明中，可以根据不同的需要或目的选择两种原始单克隆抗体，例如可以选择针对同一抗原不同抗原表位的两株单抗，也可以其中一种抗体连接肿瘤细胞表面的相关抗原，而另一种抗体可以触发免疫效应细胞以进一步杀伤细胞。
在本发明的实施方案中，在制备双特异抗体时，可以利用现有技术对重链例如Fc段进行改造，以在抗体表达时，更有利于异二聚体蛋白的形成。
在本发明的实施方案中，在制备抗体混合物时，可以利用现有技术对重链例如Fc段进行改造，以在抗体表达时，更有利于同二聚体蛋白的形成。
在本发明中，通过改造抗体重链的Fc段以更有利于同二聚体或异二聚体蛋白的技术为本领域所公知，例如可参考Ridgway,Presta et al.1996；Carter 2001，专利CN102558355A，专利CN 103388013A。
在本发明的实施方案中，用到融合具有不同抗原识别表位的多肽的技术包括但不仅限于如具体实施例中的异二聚体Fc融合技术，也可以是“Fab”技术,见图1。
在本发明的实施方案中，本发明所用到的异二聚体Fc融合技术，可以为“把手”-“孔洞”模型，也可以是“电荷排斥”模型，但不仅仅限制于这两种模型。
在本发明的实施方案中，本发明所用到的能够在单一重组细胞生产制备的抗体混合物平台可以是“电荷排斥”模型，但不仅仅限制于这一模型。
在本发明的一些实施方案中，当用于制备双特异抗体或抗体混合物时，所述核酸分子编码针对第一抗原的抗体的轻链和/或重链，或者编码针对第二抗原的抗体的轻链和/或重链。在本发明的实施方案中，所述轻链为共同轻链；在本发明的实施方案中，所述重链的Fc段进行了改造。
在本发明的一些实施方案中，所述载体可以为克隆载体或表达载体。所述克隆载体用于克隆抗体的相关片段；所述表达载体用于表达双特异抗体或抗体混合物。可以根据本领域的公知常识选择适合抗体表达的载体。在本发明的具体实施方案中，所述表达载体为pcDNA4m，其是在载体pcDNA4/myc-HisA的基础上进行改造后得到的载体。
在本发明的一些实施方案中，所述表达载体中含有编码针对第一抗原的抗体的轻链和/或重链的核酸分子，或者含有编码针对第二抗原的抗体的轻链和/或重链的核酸分子。
在本发明的一些实施方案中，所述宿主细胞为适合抗体表达的宿主细胞，例如为原核细胞(例如E.Coli)或真核细胞；所述真核细胞例如为酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞例如为CHO细胞、HEK293细胞或骨髓瘤细胞等。
在本发明的一些实施方案中，所述宿主细胞中同时含有表达针对第一抗原的抗体的轻链和/或重链的表达载体以及表达针对第二抗原的抗体的轻链和/或重链的表达载体；在本发明的具体实施方案中，所述轻链为共同轻链；在本发明的实施方案中，所述重链的Fc段进行了改造。当用于表达双特异抗体时，通过Fc段的改造，使针对不同抗原的抗体的轻链和重链更容易结合，以形成双特异抗体；当用于表达抗体混合物时，通过Fc段的改造，使针对同一抗原的抗体的轻链和重链更容易结合，以形成抗体混合物。
双特异性抗体或抗体混合物可以用标准的实验手段从宿主细胞中纯化。纯化方法包括但不限于色谱技术如体积排阻、离子交换、亲和色谱法及超滤法。在本发明的实施方案中，通过ProteinA亲和层析法对双特异性抗体和抗体混合物进行纯化。
在本发明中，本发明的双特异性抗体或其抗原结合部分或其混合物还可与化疗药物和/或其它抗体联用，因此本发明的组合物中还可含有化疗药物和/或其它抗体。
在本发明中，所述化疗药物包括但不限于：阿霉素(Adriamycin)、环磷酰胺和紫杉烷类[紫杉醇(Taxol)和多西他赛(Taxotere)]、卡培他滨(Xeloda)、吉西他滨(Gemzar)、长春瑞滨(Navelbine)、他莫昔芬、芳香酶抑制剂(瑞宁得、弗隆、阿诺新)、5-FU加亚叶酸、伊立替康(camptosar)、奥沙利铂、顺铂、卡铂、雌莫司汀、米托蒽醌(Novantrone)、泼尼松、长春新碱(Oncovin)等，或它们的组合。
在本发明中，通过对HER2蛋白突变，制备得到了仅能够和帕妥珠单抗和赫赛汀单抗中的一种特异性结合的HER2蛋白突变体。在本发明的实施方案中，利用这几种突变体对双特异抗体和抗体混合物进行鉴定。
在本发明中，通过双抗原夹心ELISA(也叫桥式ELISA)方法结合突变的HER2蛋白鉴定抗体是否为双特异性抗体或者抗体混合物中是否含有同二聚体蛋白，并进一步对双特异性抗体或抗体混合物中的同二聚体蛋白进行定量。
在本发明中，所述双抗原夹心法ELISA为本领域所公知，其工作原理为利用连接于固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子上两个抗原结合位点结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原免疫复合物。该方法的检测步骤例如包括：⑴将特异性抗原包被固相载体。孵育一定时间，使形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原和杂质。⑵加待检标本，孵育，使标本中的抗体与固相载体上的抗原充分反应，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。⑶加酶标抗原，孵育，使形成固相抗原-待测抗体-酶标抗原夹心复合物。洗涤除去未结合酶标抗原。⑷加底物显色。固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗体的量。
在本发明中，所述HER2阳性肿瘤既包括HER2蛋白过表达的肿瘤(例如乳腺癌、胃癌)，也包括HER2蛋白低表达的肿瘤(例如乳腺癌、胃癌)。
本发明通过分析两株不同单抗的轻链序列，获得能够分别与两株单抗重链结合的共同轻链，并在此基础上制备了具有共同轻链的双特异性抗体和抗体混合物，实验证明利用该方法制备得到的双特异性抗体和抗体混合物具有良好的结合特性、生物学活性和稳定性，并且在生物学活性方面可能优于原始抗体。
该共同轻链技术简单、可控，在不影响抗体稳定性、活性及纯度的情况下，有效解决了双特异性抗体中重轻链错配的难题；对于抗体混合物，更是使其可以在同一宿主细胞中表达，能避免混合细胞群培养的难度，更有利于放大生产。
附图说明
图1.异二聚体蛋白融合示意图。a图表示异二聚体FC融合技术,b图表示“fab”技术。
图2帕妥珠单抗和曲妥珠单抗轻链高变区的识别，其中A为帕妥珠单抗轻链高变区识别结果，B为曲妥珠单抗轻链高变区识别结果，C为帕妥珠单抗和曲妥珠单抗轻链序列比对及抗原界面氨基酸综合分析结果。
图3.曲妥珠单抗Fab片段和Her2胞外区域(ECD)结构图。
图4.Her2m1和Her2m2变体蛋白SDS-PAGE电泳分析结果(18％SDS-PAGE非还原条件)。
1：HER2m1；2：HER2m2；M：蛋白质量标准。
图5.ELISA法检测HER2变体蛋白对Trastuzumab或Pertuzumab的特异性结合
图6：一步亲和层析纯化得到的共同轻链单抗蛋白样品利用非还原的SDS-PAGE进行初步的检测(12％SDS-PAGE还原条件)
1～6：TmabCLC1～6；7～12：PmabCLC1～6；M：蛋白质量标准。
图7：带有共同轻链的Trastuzumab对其特异性抗原HER2m1的亲和力
图8：带有共同轻链的Pertuzumab对其特异性抗原HER2m2的亲和力
图9一步亲和层析纯化得到的KN026抗体蛋白样品利用SDS-PAGE进行初步的检测(12％SDS-PAGE还原条件)
1：KN026瞬时表达细胞培养上清；2：KN026亲和层析流穿；3：KN026一步亲和层析后纯化蛋白样品(还原)；4：KN026一步亲和层析后纯化蛋白样品(非还原)M：蛋白质量标准。
图10KN026抗体蛋白纯度的SE-HPLC检测结果
图11双特异性抗体KN026识别两种抗原的亲和曲线
图12一步亲和层析纯化得到的KN010抗体蛋白样品利用SDS-PAGE进行初步的检测(12％SDS-PAGE还原条件)
图13混合抗体蛋白KN026纯度的SE-HPLC检测结果
图14混合抗体蛋白KN026识别两种抗原的亲和曲线
图15Ptmab双特异性抗体(KN026)以及Pertuzumab、Trastuzumab与BT474细胞结合的浓度依存性曲线
图16Ptmab双特异性抗体(KN026)以及Pertuzumab、Trastuzumab与N-87细胞结合的浓度依存性曲线
图17Pmab、Tmab抗体混合物(KN010)以及Pertuzumab、Trastuzumab与BT474细胞结合的浓度依存性曲线
图18KN026、Trastuzumab及Trastuzumab+Pertuzumab联合用药对人乳腺癌BT474细胞增殖的抑制作用
图19KN026、Trastuzumab及Trastuzumab+Pertuzumab联合用药对人胃癌N-87细胞增殖的抑制作用
图20Ptmab双特异性抗体KN026(浅色曲线)以及Trastuzumab参比样品(深色曲线)的热稳定性(Tm值)检测
图21KN026和Trastuzumab的药代曲线
图22Ptmab双特异性抗体对人卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤的肿瘤体积的影响
图23Ptmab双特异性抗体对人胃癌N-87裸鼠移植瘤的肿瘤体积的影响
图24PTmab双特异性抗体对人胃癌N-87裸鼠移植瘤的肿瘤体积的影响
图25检测抗体是否为双特异性抗体的方法以及定量方法的示意图。
图26检测抗体混合物是否为同二聚体蛋白的方法的示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本申请提供了以下实施方式：
1.双特异性抗体或其抗原结合部分，其特征在于所述双特异性抗体或其抗原结合部分的两条轻链具有相同的序列。
2.实施方式1的双特异性抗体或其抗原结合部分，其重链能够分别与所述轻链在生理条件或体外的蛋白表达状态下正确结合。
3.实施方式1或2的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述的轻链能够分别与帕妥珠单抗和曲妥株单抗的重链结合。
4.实施方式3的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述的轻链选自帕妥珠单抗或曲妥株单抗的轻链或者它们的突变体。
5.实施方式4的双特异性抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链可变区的序列包含选自如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6中第1～107位氨基酸所示的序列。
6.实施方式3的双特异性抗体或其抗原结合部分，其重链可变区分别为帕妥珠单抗和曲妥株单抗的重链可变区。
7.实施方式3任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其重链Fc段的序列分别包含如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的序列。
8.实施方式3任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分，其两条重链的序列分别包含如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的序列。
9.能够在一个细胞中正确产生的抗体或其抗原结合部分的混合物，所述混合物包括至少两种抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分具有共同的轻链。
10.实施方式9的混合物，其中所述抗体或其抗原结合部分的重链能够分别与所述轻链在生理条件或体外的蛋白表达状态下正确结合。
11.实施方式9或10的混合物，其中所述的轻链能够分别与帕妥珠单抗和曲妥株单抗的重链结合。
12.实施方式11的混合物，其中所述的轻链选自帕妥珠单抗或曲妥株单抗的轻链或者它们的突变体。
13.实施方式11的混合物，其中所述轻链可变区的序列包含选自如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6中第1～107位氨基酸所示的序列。
14.实施方式11的混合物，其中所述抗体或其抗原结合部分的重链可变区分别为帕妥珠单抗和曲妥株单抗的重链可变区。
15.实施方式11的混合物，其中所述抗体或其抗原结合部分的重链Fc段的序列分别包含如SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的序列。
16.实施方式11的混合物，其中所述抗体或其抗原结合部分的重链序列分别包含如SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示的序列。
17.HER2蛋白胞外区域的变体蛋白，其与野生型HER2蛋白胞外区域的序列相比，具有选自如下一组的突变：
1)第558位谷氨酸的突变和第573位苯丙氨酸的突变；
2)第288位丝氨酸的突变和第296位组氨酸的突变。
18.实施方式17的HER2蛋白胞外区域的变体蛋白，其特征在于以下(1)～(4)项中的一项或多项：
(1)将第558位谷氨酸突变为丙氨酸；
(2)将第573位苯丙氨酸突变为丙氨酸；
(3)将第288位丝氨酸突变为丙氨酸；
(4)将第296位组氨酸突变为丙氨酸。
19.实施方式18的HER2蛋白胞外区域的变体蛋白，所述HER2蛋白胞外区域的变体蛋白包含选自如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。
20.核酸分子，其编码实施方式1-8中任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分或者实施方式9-16中任一项的混合物中所述的抗体或其抗原结合部分、或者所述抗体或其抗原结合部分的部分序列，或者编码实施方式17-19任一项的HER2变体蛋白。
21.重组载体，其含有实施方式20的核酸分子。
22.重组细胞，其含有实施方式21的重组载体或实施方式20的核酸分子。
23.一种根据两株针对不同表位的单克隆抗体或其抗原结合部分制备双特异性抗体或其抗原结合部分的方法，其包括以下步骤：
1)根据两株单克隆抗体的轻链序列得到能够分别与两株单抗重链结合的共同轻链序列，该共同轻链为其中一株单抗的轻链或者为其中一株单抗轻链的突变体；
2)分别将两株单抗的重链序列和共同轻链序列构建于表达载体中，得到两个重组表达载体；优选地，对重链序列特别是Fc段进行突变，以更有利于具有不同重链的Fc段的结合；
3)将两个重组表达载体转入同一宿主细胞，诱导表达，得到双特异性抗体或其抗原结合部分。
24.实施方式23的方法，其中所述共同轻链的获取方法为，首先确定两株单抗与抗原或抗原表位之间接触的界面氨基酸，然后确定以任意其中一株单抗的轻链为候选共同轻链时，该共同轻链与抗原或抗原表位之间接触的界面氨基酸与另一株单抗轻链相应位置的氨基酸相比较时的差异氨基酸，选取差异氨基酸数量较少的轻链为共同轻链；优选地，对该共同轻链进一步突变以获得结合力更好的共同轻链。
25.一种制备包括至少两种单克隆抗体或其抗原结合部分的混合物的方法，所述方法包括以下步骤：
1)根据两株单克隆抗体的轻链序列得到能够分别与两株单抗重链结合的共同轻链序列，该共同轻链为其中一株单抗的轻链或者为其中一株单抗轻链的突变体；
2)分别将两株单抗的重链序列和共同轻链序列构建于表达载体中，得到两个重组表达载体；优选地，对重链序列特别是Fc段进行突变，以更有利于具有相同重链的Fc段的结合；
3)将两个重组表达载体转入同一宿主细胞，诱导表达，得到抗体或其抗原结合部分的混合物。
26.实施方式25的方法，其中所述共同轻链的获取方法为，首先确定两株单抗与抗原或抗原表位之间接触的界面氨基酸，然后确定以任意其中一株单抗的轻链为候选共同轻链时，该共同轻链与抗原或抗原表位之间接触的界面氨基酸与另一株单抗轻链相应位置的氨基酸相比较时的差异氨基酸，选取差异氨基酸数量较少的轻链为共同轻链；优选地，对该共同轻链进一步突变以获得结合力更好的共同轻链。
27.一种检测抗体或其抗原结合部分是否为双特异性抗体或其抗原结合部分和/或对其定量的方法，所述方法包括以下步骤：
1)分别制备能够和双特异性抗体或其抗原结合部分的抗原结合部分1结合而不和抗原结合部分2结合的特异性抗原1，以及能够和抗原结合部分2结合而不和抗原结合部分1结合的特异性抗原2；
2)取特异性抗原1(或者特异性抗原2)包被酶标板，加入待检抗体，反应一段时间，再加入标记的特异性抗原2(或者特异性抗原1)，反应一段时间，最后加入能够与前述标记分子结合的检测分子，反应一段时间，所述检测分子带有可检测的标记，根据检测原理读数，判断为反应阳性或阴性；
3)当反应为阳性，并且该反应具有浓度依赖性时，则判断该抗体或其抗原结合部分为双特异性抗体或其抗原结合部分；任选地，根据所得阳性数值进一步对双特异性抗体或其抗原结合部分进行定量。
28.一种检测抗体或其抗原结合部分的混合物中是否为同二聚体蛋白的方法，所述混合物包括两种抗体(抗体1和抗体2)或其抗原结合部分，所述方法包括以下步骤：
1)分别制备能够和抗体1结合而不和抗体2结合的特异性抗原1，以及能够和抗体2结合而不和抗体1结合的特异性抗原2；
2)取特异性抗原1(或者特异性抗原2)包被酶标板，加入待检混合物，反应一段时间，再加入标记的特异性抗原1(或者特异性抗原2)，反应一段时间，最后加入能够与前述标记分子结合的检测分子，反应一段时间，所述检测分子带有可检测的标记，根据检测原理读数，判断为反应阳性或阴性；
3)另取特异性抗原1(或者特异性抗原2)包被酶标板，加入待检混合物，反应一段时间，再加入标记的特异性抗原2(或者特异性抗原1)，反应一段时间，最后加入能够与前述标记分子结合的检测分子，反应一段时间，所述检测分子带有可检测的标记，根据检测原理读数，判断为反应阳性或阴性；
4)当步骤2)反应阳性，并且该反应具有浓度依赖性，同时步骤3)反应阴性时，则判断混合物中为同二聚体蛋白并且不含异二聚体蛋白；当步骤2)反应阳性同时步骤3)反应阳性时，则判断混合物中既含有同二聚体蛋白也含有异二聚体蛋白。
29.组合物(例如药物组合物)，其含有实施方式1-8任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分、或者实施方式9-16任一项的混合物，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
30.实施方式29的组合物，其还含有化疗药物和/或其它抗体。
31.试剂盒，其含有实施方式1-8任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分、或者实施方式9-16任一项的混合物，以及任选的缓冲液或说明书。
32.实施方式3-8任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备预防和/或治疗HER2阳性肿瘤(例如乳腺癌、胃癌)的药物中的用途。
33.实施方式11-16任一项的混合物在制备预防和/或治疗HER2阳性肿瘤(例如乳腺癌、胃癌)的药物中的用途。
34.实施方式3-8任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备诊断HER2阳性肿瘤(例如乳腺癌、胃癌)的试剂或试剂盒中的用途。
35.实施方式11-16任一项的混合物在制备诊断HER2阳性肿瘤(例如乳腺癌、胃癌)的试剂或试剂盒中的用途。
36.实施方式17-19任一项的HER2蛋白胞外区域的变体蛋白用于检测实施方式3-8任一项的双特异性抗体或其抗原结合部分或者用于检测实施方式11-16任一项的混合物的用途。
实施例1共同轻链的获取
1.序列及结构获得
从蛋白质数据库(PDB,www.pdb.org)中获得曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的复合体晶体结构，曲妥珠单抗PDB编号为1N8Z,帕妥珠单抗PDB编号为1S78。两个筛选策略可用来识别CH3-CH3之间的氨基酸接触：(i)氨基酸作用的距离(ii)溶剂可及区域分析。这里根据氨基酸作用距离进行筛选。
2.单抗轻链及抗原HER2界面氨基酸获取
根据氨基酸接触规则，界面氨基酸指侧链重原子与另外一条链的任何一个氨基酸的重原子之间的距离小于一个阈值的那些氨基酸。在这里阈值选择为
Figure GDA0002257238040000191
在某些文献中也可以选择
Figure GDA0002257238040000192
(Bahar和Jernigan 1997)。表1为曲妥珠单抗轻链及抗原HER2相互作用的氨基酸列表。表1所列的为通过氨基酸接触筛选规则所筛选出的曲妥珠单抗的12个界面氨基酸。
表1曲妥珠单抗轻链-抗原HER2界面氨基酸列表
Figure GDA0002257238040000193
表2为帕妥珠单抗轻链及抗原HER2相互作用的氨基酸列表。表2所列的为通过氨基酸接触筛选规则所筛选出的帕妥珠单抗的8个界面氨基酸。
表2帕妥珠单抗轻链-抗原HER2界面氨基酸列表
Figure GDA0002257238040000201
3.帕妥珠单抗和曲妥珠单抗轻链高变区(CDRL1,CDRL2,CDRL3)的识别
将帕妥珠单抗和曲妥珠单抗轻链通过高变区识别系统–kabat编号进行识别，识别软件为http://www.bioinf.org.uk/abs/abnum/。帕妥珠单抗轻链高变区识别结果见图2-A，曲妥珠单抗高变区轻链识别结果见图2-B。
4.帕妥珠单抗和曲妥珠单抗轻链序列比对及轻链与抗原界面氨基酸综合分析
帕妥珠单抗和曲妥珠单抗轻链序列比对及抗原界面氨基酸综合分析结果见图2-C，帕妥珠单抗(P-mab)和曲妥珠单抗(T-mab)轻链与抗原接触氨基酸用背景颜色黑色显示。如以曲妥珠单抗轻链为共同轻链，则该共同轻链上与抗原接触的界面氨基酸与帕妥珠单抗(P-mab)轻链上相应位置的氨基酸相比较得到的差异氨基酸见表3。
表3帕妥珠单抗(P-mab)和曲妥珠单抗(T-mab)轻链与抗原接触的差异氨基酸
Figure GDA0002257238040000202
如以帕妥珠单抗轻链为共同轻链，则该共同轻链上与抗原接触的界面氨基酸与曲妥珠单抗(T-mab)轻链上相应位置的氨基酸相比较得到的差异氨基酸见表4。
表4帕妥珠单抗(P-mab)和曲妥珠单抗(T-mab)轻链与抗原接触的差异氨基酸
Figure GDA0002257238040000211
从帕妥珠单抗(P-mab)和曲妥珠单抗(T-mab)轻链与抗原接触的差异氨基酸分析，分别选择曲妥珠单抗(T-mab)的轻链为框架，引入T31I或/及T94Y突变，得到帕妥珠、曲妥珠双特异性抗体的共同轻链序列CLC1～CLC4；选择帕妥珠单抗(P-mab)的轻链为框架，引入T31I或/及Y94T突变，得到帕妥珠、曲妥珠双特异性抗体的共同轻链序列CLC5～CLC6。各共同轻链的氨基酸序列如下：
CLC1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：1)
CLC2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：2)
CLC3
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTYPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：3)
CLC4
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTYPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：4)
CLC5
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：5)
CLC6
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYITPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：6)
实施例2抗原蛋白HER2变体蛋白的制备及功能验证
1.只结合帕妥珠单抗HER2变体蛋白的设计
Robert F.Kelley’and Mark P.O’Connell在1993年公布了曲妥珠单抗及相应的突变和HER2胞外区域(ECD)结合的动力学参数。其中H91A，R50A,W95A，Y100aA对曲妥珠单抗与HER2胞外域的结合造成了重大影响。Hyun-Soo Cho团队在2003年对曲妥珠单抗Fab片段和HER2胞外区域(ECD)的复合物进行了结晶(PDB编号：1N8Z)，该项结果发表于Nature上。通过分析曲妥珠单抗Fab片段和HER2胞外区域(ECD)(其序列为SEQ ID NO：18所示)的复合物的结构，我们获得了曲妥珠单抗Fab片段和HER2胞外区域(ECD)的界面接触氨基酸，如表5。
着重对H91L，R50H,W95H，Y100aH接触的氨基酸进行分析。发现有两个组合可能对这几个氨基酸结合具有重要作用。组合1：ASP570，PRO571和PRO572，组合2：GLU558和PHE573。
表5曲妥珠单抗Fab片段和HER2胞外区域(ECD)的界面接触氨基酸
Figure GDA0002257238040000221
Figure GDA0002257238040000231
从以上结果可以看出
组合1：P571,P572本身与Fab几个关键氨基酸都有作用力的形成。考虑这两个氨基酸处于loop转角处，如突变将影响本身结构稳定性。
组合2：GLU558与曲妥珠Fab重链ARG50形成离子键，同Fab重链多个氨基酸形成范德华力，破坏可以阻断曲妥珠Fab与HER2的作用，因此选择将GLU558→ALA558；PHE573与Fab重链多个氨基酸形成范德华力，包括关键氨基酸ARG508,TRP99,TYR105，破坏可以阻断Fab与HER2的作用，因此选择将PHE573→ALA573。
以上分析结果可以见图3。
2.只结合曲妥珠单抗的HER2变体蛋白的设计
Matthew C.Franklin在Cancer cell上发表了帕托珠单抗Fab与HER2胞外结构的复合物结构。该团队同时用丙氨酸扫描的方法研究了HER2哪些关键氨基酸会影响与帕托珠单抗Fab的结合。其研究表明，HER2蛋白表面H296,S288,L295等氨基酸具有明显的作用，本发明选择了S288A/H296A双突变用于获得只结合曲妥珠单抗的HER2抗原。
其中只被Trastuzumab识别的HER2变体蛋白命名为HER2m1，只被Pertuzumab识别的HER2变体蛋白命名为HER2m2和HER2m3。HER2变体蛋白的氨基酸序列分别为：
HER2m1：
TQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGACTLVCPLANQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLT(SEQ ID NO：13)
HER2m2：
TQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPAADQCVACAHYKDPAFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLT(SEQ ID NO：14)
HER2m3：
TQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDAAFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLT(SEQ ID NO：15)
3.商业化哺乳动物细胞表达载体pcDNA4/myc-HisA的改造
商业化载体pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen，V863-20)含有两个PvuII酶切位点，分别在大约1411bp和3160bp的位置。对质粒定点突变，将3106bp位置的碱基C突变为G，去除在该位置的PvuII酶切位点，只保留在大约1411bp处的一个酶切位点，新的载体命名为pcDNA4m。
根据NCBI上人免疫球蛋白gamma1(IgG1)的可结晶片段(Fc)的DNA序列(AY623427)设计引物，如下
F:AAGCTTCCCTTACCCGGATCCGAAATCCTCTGACAAAACTCAC(SEQ ID NO：29)
R：CCCGAATTCTATTTACCCGGAGACAGGGAG(SEQ ID NO：30)
其中上游引物中添加了HindIII以及BamHI的酶切位点，用于后续克隆，下游引物中添加了EcoRI的酶切位点。
以PBMC的全cDNA为模板，扩增得到Fc片段的基因，之后经Takara公司的HindIII与EcoRI双酶切克隆到改造的载体pcDNA4m中，测序验证构建质粒的准确性，获得重组质粒pcDNA4m-Fc。
4.HER2变体蛋白真核表达载体的构建
根据NCBI上HER2蛋白的DNA序列信息(NM_004448.2)设计引物，将野生型HER2蛋白的胞外结构域(第1至第652位氨基酸残基)克隆出来，所用引物如下：
F：GCCAAGCTTGCCACCATGGAGCTGGCGGCCT(SEQ ID NO：31)
R：CGCGGATCCATCGTCAGAGGGCTGGCTCTC(SEQ ID NO：32)
引物中包含了上游的HindIII识别位点以及下游的BamHI识别位点。利用BT474细胞(购自中科院上海细胞库)的cDNA作为模板，扩增得到编码HER2wt的胞外结构域的1.9kb长的DNA片段并克隆进商业化的T载体中(pMD19-T Simple Vector；购自Takara公司)，得到T-Her2ECD质粒，测序确认序列的正确性。
根据前述得到的只被Trastuzumab识别的HER2变体蛋白HER2m1以及只被Pertuzumab识别的HER2变体蛋白HER2m2以及HER2m3的氨基酸序列，根据突变位点设计相应的突变引物：
M1-F：GCACCCTCGTCTGCCCCCTGGCTAACCAAGAGG(SEQ ID NO：33)
M1-R：GGGGGCAGACGAGGGTGCAAGCTCCCACGT(SEQ ID NO：34)
M2-1-F：GGACCGGCGGCTGACCA(SEQ ID NO：35)
M2-1-R：TGGTCAGCCGCCGGTCC(SEQ ID NO：36)
M2-2-F：TATAAGGACCCTGCCTTCTGCG(SEQ ID NO：37)
M2-2-R：CGCAGAAGGCAGGGTCCTTAT(SEQ ID NO：38)
M3-F：CTATAAGGACGCTGCCTTCTGCG(SEQ ID NO：39)
M3-R：CGCAGAAGGCAGCGTCCTTATAG(SEQ ID NO：40)
以T-Her2ECD质粒为模板，利用上述引物进行定点突变，得到三个HER2胞外结构域的变体蛋白(HER2m1，HER2m2，HER2m3)的基因。之后，经Takara公司的HindIII与BamHI双酶切克隆到载体pcDNA4m-Fc上，将HER2m1，HER2m2，HER2m3三个基因分别融合于Fc基因的5’端，得到三个新载体，命名为：pcDNA4m-Her2m1-Fc，pcDNA4m-Her2m2-Fc，pcDNA4m-Her2m3-Fc。这三个载体可用于在哺乳动物细胞中表达融合蛋白HER2m1-Fc，HER2m2-Fc，HER2m3-Fc。
5.HER2变体蛋白的瞬时表达及纯化
转染前两天，准备200mL×3经悬浮驯化的HEK293(ATCC，CRL-1573TM)细胞用于瞬时转染，接种密度为0.8×106cells/mL。两天后对待转染细胞悬液进行计数细胞密度为3.5～4×106cells/mL，取细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清液。用40mL×3的新鲜的Freestyle293培养基重新悬浮细胞，再次1000rpm离心5min，弃上清液。用200mL×3Freestyle293培养基重新悬浮293细胞。将实施例2-4中所得的3个HER2变体蛋白的表达载体各取200μg，分别用2mL Freestyle293培养基稀释。随后用5mL Freestyle293培养基稀释1.5mL Polyethylenimine，配置转化所需PEI溶液。分别在稀释好的2mL的表达用质粒中加入2mL的PEI溶液并混匀，室温静置5分钟。将3份质粒/PEI混合物分别加入3份200mL细胞悬液中，放置在37℃，10％CO2，90rpm中培养；同时补加50μg/L IGF-1。四小时后于每份转化样品中再分别补加200mL EX293培养基，2mM Glutamine和50ug/L IGF-1，135rpm培养。二十四小时后加3.8mM VPA。
培养5～6天后，分别收集3份400mL的HER2变体蛋白细胞瞬时表达培养上清液，通过ProteinA亲和层析法，初步纯化得到HER2变体蛋白样品。其中HER2m3表达水平非常低，其细胞培养上清中模板蛋白的滴度小于0.5mg/L，推测主要是由于蛋白变体不稳定造成的，因此对该蛋白没有进一步纯化。得到的HER2m1和HER2m2变体蛋白通过纯化计算的表达水平约20mg/L。得到的蛋白样品利用SDS-PAGE进行初步的检测，可以清晰的看到目的条带(见图4)。
6.用ELISA法检测HER2变体蛋白对Trastuzumab或Pertuzumab的特异性结合
用Trastuzumab单抗蛋白或Pertuzumab单抗包被酶标板，4℃过夜。之后加入3％BSA溶液，室温封闭2小时。待检样品(HER2m1或是HER2m2蛋白)预先用生物素标记，之后生物素化的蛋白HER2m1-Biotin以及HER2m2-Biotin自16μg/mL起，1:4梯度稀释，直至0.224ng/μL，共9个梯度。酶标板中加入梯度稀释的生物素化的HER2变体蛋白样品，室温反应2小时。之后加入HRP标记的链霉亲和素，室温作用1.5小时，最后催化底物显色读数。得到的数据通过四参数法拟合，得到亲和曲线。
如图5所示，HER2m1蛋白对Pertuzumab的表观亲和力与其对Trastuzumab的表观亲和力相比，降低了20倍，可以认为该变体蛋白为Trastuzumab特异性抗原蛋白。而HER2m2蛋白对Trastuzumab的表观亲和力比起对Trastuzumab的表观亲和力降低了>2个数量级，表现为Pertuzumab特异性抗原。
实施例4用共同轻链替换Tmab及Pmab原始轻链，并验证共同轻链的效果
1.携带共同轻链的Tmab及Pmab单抗真核表达载体的构建
根据专利US2009/0285837A1搜索到的Trastuzumab和Pertuzumab全抗体的氨基酸序列(专利中图2及图16)，利用DNAworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列，并通过人工合成方法获得Trastuzumab的重链基因(SEQ ID NO:16)、Pertuzumab的重链基因(SEQ ID NO:17)。根据实施例1中得到的一组共同轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:1～6)，利用DNAworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码DNA序列，并通过人工合成方法获得Pmab-Tmab双特异性抗体的共同轻链基因CLC1(SEQ ID NO：7)以及CLC5(SEQ NO：11)。
之后根据CLC2～CLC6的序列设计突变引物，序列如下：
T31I-F：GACGTGAACATTGCCGTTGC(SEQ ID NO：41)
T31I-R：GCAACGGCAATGTTCACGTC(SEQ ID NO：42)
T94Y-F：AGCACTATACTTATCCTCCAACATTC(SEQ ID NO：43)
T94Y-R：ATGTTGGAGGATAAGTATAGTGCTG(SEQ ID NO：44)
Y94T-F:TCGCCACCACTTATTGTCAG(SEQ ID NO：45)
Y94T-R:CTGACAATAAGTGGTGGCGA(SEQ ID NO：46)
以CLC1基因为模板，利用T31I及T94Y两对引物定点突变得到CLC2～CLC4的基因序列(SEQ ID NO：8～SEQ ID NO：10)；以CLC5为模板，利用Y94T引物对定点突变得到CLC6基因序列(SEQ ID NO：12)。
合成好的Trastuzumab的重链基因、Pertuzumab的重链基因、以及共同轻链基因(CLC1～CLC6)分别经Takara公司的HindIII与EcoRI双酶切亚克隆到改造的载体pcDNA4m中，测序验证构建质粒的准确性，获得重组质粒DNA即：pcDNA4m-TmabHC，pcDNA4m-PmabHC以及共同轻链相关载体pcDNA4m-CLC1～pcDNA4m-CLC6。
取上述构建成功的共同轻链基因表达载体pcDNA4m-CLC1～6用Takara公司的BglII，Pvu II双酶切。酶切产物通过0.8％的琼脂糖电泳分离纯化，并分别回收约2kb大小含有共同基因的DNA片段；pcDNA4m-TmabHC经BglII，NruI双酶切回收约6kb大小含有TmabHC基因的DNA片段；pcDNA4m-PmabHC经BglII，NruI双酶切回收约6kb大小含有PmabHC基因的DNA片段。随后将酶切处理过的DNA片段进行连接，将TmabHC或PmabHC的表达原件与不同序列的共同轻链表达原件整合在一起，获得重组质粒pcDNA4m-Tmab-CLC1、pcDNA4m-Tmab-CLC2、pcDNA4m-Tmab-CLC3、pcDNA4m-Tmab-CLC4、pcDNA4m-Tmab-CLC5、pcDNA4m-Tmab-CLC6、pcDNA4m-Pmab-CLC1、pcDNA4m-Pmab-CLC2、pcDNA4m-Pmab-CLC3、pcDNA4m-Pmab-CLC4、pcDNA4m-Pmab-CLC5、pcDNA4m-Pmab-CLC6。
2.携带共同轻链的Tmab及Pmab单抗的瞬时表达及纯化
转染前两天，准备50mL×12经悬浮驯化的HEK293(ATCC，CRL-1573TM)细胞用于瞬时转染，接种密度为0.8×106cells/mL。两天后对待转染细胞悬液进行计数细胞密度为3.5～4×106cells/mL，取细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清液。用10mL×12的新鲜的Freestyle293培养基重新悬浮细胞，再次1000rpm离心5min，弃上清液。用50mL×12Freestyle293培养基重新悬浮293细胞。将实施例4-1中所得的12个共同轻链单抗相关的表达载体各取50μg，分别用0.5mL Freestyle293培养基稀释。随后用5mL Freestyle293培养基稀释1.5mL Polyethylenimine，配置转化所需PEI溶液。分别在稀释好的0.5mL的表达用质粒中加入0.5mL的PEI溶液并混匀，室温静置5分钟。将12份质粒/PEI混合物分别加入12份50mL细胞悬液中，放置在37℃，10％CO2，90rpm中培养；同时补加50μg/L IGF-1。四小时后于每份转化样品中再分别补加50mL EX293培养基，2mM Glutamine和50μg/L IGF-1，135rpm培养。二十四小时后加3.8mM VPA。
培养5～6天后，分别收集12份100mL的共同轻链单抗细胞瞬时表达培养上清液，通过ProteinA亲和层析法，初步纯化得到12个共同轻链单抗蛋白样品：Tmab-CLC1～6以及Pmab-CLC1～6；每个单抗通过纯化计算的表达水平见表6。
一步亲和层析纯化得到的蛋白样品利用非还原的SDS-PAGE进行初步的检测。可以看到，如图6所示，所有的共同轻链单抗蛋白在还原胶上都能看到清晰的两条带，分别为位于25kDa与35kDa之间的轻链条带及位于85kDa和50kDa之间的重链条带。蛋白样品的纯度通过SE-HPLC进行检测，结果见表6。
表6共同轻链单抗细胞瞬时表达水平及一步纯化后后样品纯度
Figure GDA0002257238040000291
3.用ELISA法对携带共同轻链的Tmab及Pmab单抗进行亲和力分析
检测带有共同轻链的Tratuzumab及Pertuzumab对其各自的特异性抗原的亲和力变化，所用的间接ELISA的方法与实施例2-6中所述相似。其中，检测带有共同轻链的Tratuzumab的亲和力变化时，使用其特异性抗原蛋白HER2m1进行检测；检测带有共同轻链的Pertuzumab的亲和力变化时，使用其特异性抗原蛋白HER2m2进行检测。得到亲和力曲线见图7～8，根据EC50判断，当使用由原始Trastuzumab的轻链改造而来的共同轻链(CLC1～CLC4)时，Trastuzumab对其特异性抗原HER2m1的亲和力没有明显改变；而Pertuzumab对其特异性抗原HER2m2的亲和力略有降低，但是这种变化在可接受范围内。而当使用由原始Pertuzumab的轻链改造得到的共同轻链(CLC5和CLC6)时，Pertuzumab对其特异性抗原HER2m2的亲和力没有明显改变，但是Trastuzumab对其特异性抗原HER2m1的亲和力降低了近一倍。
实施例5Ptmab双特异性抗体的制备和鉴定
1.Ptmab双特异性抗体的瞬时表达及纯化
对pcDNA4m-Tmab-CLC1中的TmabHC的Fc片段进行点突变，使TmabHC成为TmabHC-knob(重链序列为SEQ ID NO：19所示；突变的残基为：S354C,T366W,)，并进一步构建pcDNA4m-Tmabknob-CLC1；同时利用定点突变，将pcDNA4m-Pmab-CLC1中的PmabHC中的氨基酸残基参照专利CN102558355A，突变为PmabHC-hole(重链序列为SEQ ID NO：20所示，突变的残基为：Y349C,T366S,L368A,Y407V)，并进一步构建pcDNA4m-Pmabhole-CLC1。具体突变方案参照CN102558355A。这两个新构建的质粒将在“把手-孔洞”模型上，利用共同轻链模型构建Pmab-Tmab双特异性抗体。
2.Ptmab双特异性抗体的瞬时表达及纯化
转染前两天，准备600mL经悬浮驯化的HEK293(ATCC，CRL-1573TM)细胞用于瞬时转染，接种密度为0.8×106cells/mL。两天后对待转染细胞悬液进行计数细胞密度为3.5～4×106cells/mL，取细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清液。用100mL的新鲜的Freestyle293培养基重新悬浮细胞，再次1000rpm离心5min，弃上清液。用600mL Freestyle293培养基重新悬浮293细胞。取pcDNA4m-Tmabknob-CLC1及pcDNA4m-Pmabhole-CLC1各300μg混匀后用3mL Freestyle293培养基稀释。随后用5mL Freestyle293培养基稀释1.5mLPolyethylenimine，配制转化所需PEI溶液，并在稀释好的3mL混合质粒中加入3mL的PEI溶液并混匀，室温静置5分钟。将质粒/PEI混合物加入600mL的细胞悬液中，放置在37℃，10％CO2，90rpm中培养；同时补加50μg/L IGF-1。四小时后于转化样品中再分别补加600mLEX293培养基，2mM Glutamine和50ug/L IGF-1，135rpm培养。二十四小时后加3.8mM VPA。
培养6～7天后，收集1200mL的Ptmab双特异性抗体细胞瞬时表达培养上清液，通过ProteinA亲和层析法以及离子交换层析法和分子筛层析法初步纯化得到Ptmab双特异性蛋白样品，命名为KN026。根据OD280计算得到KN026瞬时表达水平可达到80mg/L。
纯化得到的蛋白样品利用SDS-PAGE进行初步的检测。可以看到，如图9所示，KN026双特异性抗体蛋白在还原胶上能看到清晰的两条带，分别为位于25kDa与35kDa之间的轻链条带及位于85kDa和50kDa之间的重链条带。同时，非还原条件下，KN026为一条带。蛋白样品的纯度通过SE-HPLC进行检测，结果见图10，纯度约95％。
3.用Bridging ELISA法验证KN026抗体蛋白能同时识别Trastuzumab和Pertuzumab各自的特异性抗原
用Trastuzumab特异性抗原蛋白HER2m1包被酶标板，4℃过夜。之后加入3％BSA溶液，室温封闭2小时。待检样品自5μg/mL起，1:3梯度稀释，直至1.06ng/uL，共八个梯度。酶标板中加入梯度稀释的待检样品，室温反应2小时。之后生物素化的Pertuzumab特异性抗原蛋白HER2m2-Biotin加入酶标板，和待检样品室温反应2小时。随后加入HRP标记的链霉亲和素，与HER2m2-Biotin室温作用1.5小时，最后催化底物显色读数。得到的数据通过四参数法拟合，得到亲和曲线。
如图11所示，只有同时能识别两种抗原的双特异性抗体KN026才能够得到亲和曲线，而对于只能特异性识别一种抗原的Trastuzumab或Pertuzumab，则即使在最高浓度，也不能看到明显的显色读值。
实施例6Ptmab抗体混合物的制备和鉴定
1.Ptmab抗体混合物的瞬时表达及纯化
对pcDNA4m-Tmab-CLC1中的TmabHC的Fc片段进行点突变，使TmabHC成为TmabHC-mix1(其中重链序列如SEQ ID NO：21所示)，并进一步构建pcDNA4m-Tmabmix1-CLC1，具体突变方案参照专利CN 103388013A实施例1。这两个新构建的质粒将在“电荷排斥”混合物模型上，利用共同轻链模型构建可在单一重组细胞株中表达的Pmab、Tmab抗体混合物。
2.Pmab、Tmab抗体混合物的瞬时表达及纯化
转染前两天，准备600mL经悬浮驯化的HEK293(ATCC，CRL-1573TM)细胞用于瞬时转染，接种密度为0.8×106cells/mL。两天后对待转染细胞悬液进行计数细胞密度为3.5～4×106cells/mL，取细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清液。用100mL的新鲜的Freestyle293培养基重新悬浮细胞，再次1000rpm离心5min，弃上清液。用600mL Freestyle293培养基重新悬浮293细胞。取pcDNA4m-Tmabmix1-CLC1及pcDNA4m-Pmab-CLC1(其中重链序列如SEQ IDNO：22所示)各300μg混匀后用3mL Freestyle293培养基稀释。随后用5mL Freestyle293培养基稀释1.5mL Polyethylenimine，配制转化所需PEI溶液，并在稀释好的3mL混合质粒中加入3mL的PEI溶液并混匀，室温静置5分钟。将质粒/PEI混合物加入600mL的细胞悬液中，放置在37℃，10％CO2，90rpm中培养；同时补加50μg/L IGF-1。四小时后于转化样品中再分别补加600mL EX293培养基，2mM Glutamine和50μg/L IGF-1，135rpm培养。二十四小时后加3.8mM VPA。
培养6～7天后，收集1200mL的Pmab、Tmab抗体混合物细胞瞬时表达培养上清液，通过ProteinA亲和层析法，初步纯化得到Pmab、Tmab抗体混合物蛋白样品，命名为KN010。根据OD280计算得到KN010瞬时表达水平可达到100mg/L。
一步亲和层析纯化得到的蛋白样品利用SDS-PAGE进行初步的检测。可以看到，如图12所示，共同轻链混合单抗蛋白产物在还原胶上能看到清晰的两条带，分别为位于25kDa与35kDa之间的轻链条带及位于85kDa和50kDa之间的重链条带。同时，非还原条件下，KN010为一条带。蛋白样品的纯度通过SE-HPLC进行检测，结果见图13，纯度约95％。
3.用同抗原Bridging ELISA法验证KN010抗体蛋白能分别识别Trastuzumab和Pertuzumab各自的特异性抗原；用异抗原Bridging ELISA法验证KN010不能同时识别这一对抗原。
用Trastuzumab特异性抗原蛋白HER2m1包被酶标板，4℃过夜。之后加入3％BSA溶液，室温封闭2小时。待检样品自2.5μg/mL起，1:4梯度稀释，直至0.61ng/μL，共七个梯度。酶标板中加入梯度稀释的待检样品，室温反应2小时。之后用生物素化的Pertuzumab特异性抗原蛋白HER2m2-Biotin，或者生物素化的HER2m1-Biotin加入酶标板，和待检样品室温反应2小时。随后加入HRP标记的链霉亲和素，与HER2m2-Biotin或者HER2m1-Biotin室温作用1.5小时，最后催化底物显色读数。得到的数据通过四参数法拟合，得到亲和曲线。
用Perstuzumab特异性抗原蛋白HER2m2包被酶标板，4℃过夜。之后加入3％BSA溶液，室温封闭2小时。待检样品自2.5μg/mL起，1:4梯度稀释，直至0.61ng/μL，共七个梯度。酶标板中加入梯度稀释的待检样品，室温反应2小时。之后用生物素化的Pertuzumab特异性抗原蛋白HER2m2-Biotin加入酶标板，和待检样品室温反应2小时。随后加入HRP标记的链霉亲和素，与HER2m2-Biotin室温作用1.5小时，最后催化底物显色读数。得到的数据通过四参数法拟合，得到亲和曲线。
如图14所示，KN010蛋白的两臂通过同抗原桥式ELISA证明能同时识别Trastuzumab的抗原，或者同时识别Pertuzumab的抗原。这说明KN010蛋白中至少包括了两种能识别不同抗原靶标的抗体。但是异抗原桥式ELISA没有得到显色，证明KN010的双臂不能同时识别两种抗原，即KN010中不含有Ptmab异二聚体的成分。
实施例7Ptmab双特异性抗体的对细胞表面HER2蛋白的结合作用
1.Ptmab双特异性抗体对人乳腺癌BT474细胞表面HER2蛋白的结合作用
利用流式细胞仪观察HER2高表达乳腺癌细胞BT474与Ptmab双特异性抗体、Pertuzumab、Trastuzumab等HER2抗体的结合情况，并考察其作用的浓度依存性。
取BT474细胞，消化后用5％BSA/PBS重悬，并于每个1.5mL离心管中加入3×105个/管细胞；待测样品自100μg/mL起3倍稀释，至0.001694μg/mL，共11个浓度。将样品与细胞反应，然后加入FITC-兔抗人IgG检测与细胞结合待测抗体，并利用流式细胞仪读取平均荧光值(MFI)。用MFI对抗体浓度的对数值做曲线，并通过四参数法拟合，得到待检抗体与BT474细胞结合的浓度依存性曲线。由图15可知，Ptmab双特异性抗体(KN026)以及Pertuzumab、Trastuzumab都与BT474有明显结合，且此种作用存在浓度依存性。从结合曲线的EC50可以看出，KN026对BT474细胞表面HER2蛋白的亲和力接近Trastuzumab。
2.Ptmab双特异性抗体对人胃癌N-87细胞表面HER2蛋白的结合作用
利用流式细胞仪观察HER2高表达胃癌细胞N-87与Ptmab双特异性抗体KN026、Pertuzumab、Trastuzumab等HER2抗体的结合情况，并考察其作用的浓度依存性。
取N-87细胞，消化后用5％BSA/PBS重悬，并于每个1.5mL离心管中加入3×105个/管细胞；待测样品自40μg/mL起，2倍稀释至0.009766ug/mL，共13个浓度。将样品与细胞反应，然后加入FITC-兔抗人IgG检测与细胞结合待测抗体，并利用流式细胞仪读取平均荧光值(MFI)。用MFI对抗体浓度的对数值做曲线，并通过四参数法拟合，得到待检抗体与N-87细胞结合的浓度依存性曲线。由图16可知，Ptmab双特异性抗体(KN026)以及Pertuzumab、Trastuzumab都与N-87有明显结合，且此种作用存在浓度依存性。从结合曲线的EC50可以看出，KN026对N-87细胞表面HER2蛋白的亲和力略低于Trastuzumab和Pertuzumab。
实施例8Pmab、Tmab抗体混合物对细胞表面Her2蛋白的结合作用
Pmab、Tmab抗体混合物对人乳腺癌BT474细胞表面HER2蛋白的结合作用
利用流式细胞仪观察HER2高表达乳腺癌细胞BT474与Pmab、Tmab抗体混合物、Pertuzumab、Trastuzumab等HER2抗体的结合情况，并考察其作用的浓度依存性。
取BT474细胞，消化后用5％BSA/PBS重悬，并于每个1.5mL离心管中加入15×106个/管细胞；待测样品自1000μg/mL起3倍稀释，至0.01694μg/mL，共11个浓度。将样品与细胞反应，然后加入FITC-兔抗人IgG检测与细胞结合待测抗体，并利用流式细胞仪读取平均荧光值(MFI)。用MFI对抗体浓度的对数值做曲线，并通过四参数法拟合，得到待检抗体与BT474细胞结合的浓度依存性曲线。由图17可知，Pmab、Tmab抗体混合物(KN010)以及Pertuzumab、Trastuzumab都与BT474有明显结合，且此种作用存在浓度依存性。从结合曲线的EC50可以看出，KN010对BT474细胞表面HER2蛋白的亲和力介于Trastuzumab和Pertuzumab之间。
实施例9Ptmab双特异性抗体的癌细胞增殖的抑制作用
1.Ptmab双特异性抗体对人乳腺癌BT474细胞增殖的抑制作用
利用CKK-8法观察HER2高表达乳腺癌细胞BT474在Ptmab双特异性抗体、Pertuzumab、Trastuzumab等HER2抗体存在的情况下其增殖情况的变化，从而比较并评价Ptmab双特异性抗体对BT474癌细胞增殖作用的抑制效果。
BT474细胞用于96孔板，密度为10000cells/well，37℃贴壁培养16h。用assaymedium(DMEM培养基，补充1％的胎牛血清)分别配制不同浓度的样品：最高10μg/ml～0.0015μg/ml，3倍稀释，共9个浓度。每个细胞孔中加入150μl样品，72h后CKK-8试剂盒(DOJINDO)测定细胞活力。将得到的细胞活力值对样品浓度对数作图，并通过四参数法拟合，得到待测样品(Ptmab双特异性抗体KN026)以及参比品(Trastuzumab以及Trastuzumab+Pertuzumab联合给药)的细胞杀伤曲线。
由图18所示，KN026与Trastuzumab及Trastuzumab+Pertuzumab联合用药都对BT474有明显杀伤效果，且此效果具有浓度依存性。而双特异性抗体KN026在高浓度的情况下，其对BT474的抑制效果要明显优于Trastuzumab单独使用或联合Pertuzumab使用。
2.Ptmab双特异性抗体对人胃癌N-87细胞增殖的抑制作用
利用MTT法观察HER2高表达胃癌细胞N-87在Ptmab双特异性抗体、Pertuzumab、Trastuzumab等HER2抗体存在的情况下其增殖情况的变化，从而比较并评价Ptmab双特异性抗体对N-87癌细胞增殖作用的抑制效果。
N-87细胞用于96孔板，密度为10000cells/well，37℃贴壁培养16h。用assaymedium(RPMI-1640培养基，补充1％的胎牛血清)分别配制不同浓度的样品：最高10μg/ml～0.0015μg/ml，3倍稀释，共9个浓度。每个细胞孔中加入150μl样品，72h后CKK-8试剂盒(DOJINDO)测定细胞活力。将得到的细胞活力值对样品浓度对数作图，并通过四参数法拟合，得到待测样品(Ptmab双特异性抗体)以及参比品(Trastuzumabd以及Trastuzumab+Pertuzumab联合给药)的细胞杀伤曲线。
由图19所示，KN026与Trastuzumab及Trastuzumab+Pertuzumab联合用药都对有明显杀伤效果，且此效果具有浓度依存性。而双特异性抗体在高浓度的情况下，其对N-87的抑制效果要明显优于Trastuzumab单独使用或联合Pertuzumab使用。
实施例10Ptmab双特异性抗体的热稳定性的评价
1.Ptmab双特异性抗体的Tm值的测定
采用DSC(差式扫描热量仪)的方法测定Ptmab双特异性抗体KN026以及参考抗体(此处用Trastuzumab作为参比品)的Tm值，并据此初步判断Ptmab双特异性抗体的热稳定性。
样品蛋白于1×PBS缓冲液(pH7.4)中，制备成2mg/mL浓度的溶液。自10℃开始，以60℃/hr的速率对样品或空白缓冲液的比热容(Cp)进行扫描。将样品扫描的结果分别扣除相应缓冲液的结果，利用得到的Cp值对温度作图，其中，Cp值明显升高的峰值所对应的温度即为样品的Tm值。
由图20可知，与传统抗体相似，Ptmab双特异性抗体KN026以及Trastuzumab参比样品均显示两个明显的Tm值，包括60℃左右的CH2溶解温度以及位于80℃左右的CH3的溶解温度。同时可以看出60℃左右的Tm值，双特异性抗体和Trastuzumab参比品无显著差异；80℃左右的Tm值，双特异性抗体略低，但是仍高于80℃，与参比品相比差别并不明显，并不认为会对抗体的热稳定性造成影响。
实施例11Ptmab双特异性抗体的小鼠药代实验
1.Ptmab双特异性抗体的在小鼠中的代谢情况考察
选取6～7周ICR小鼠随机分为两组，实验组单次腹腔注射Ptmab双特性抗体KN02610mg/kg，参比组单次腹腔注射Trastuzumab标准品10mg/kg进行实验。各组动物分为三个梯队，每个梯队4只动物按时间点取血。各动物非终点取血(5min–96h)时眼眶静脉丛取血约0.2ml；终点取血时(192h–576h)，异氟烷吸入麻醉后下腔静脉取血安乐死。血样采集后，分离血清，-80℃冰箱暂存。
血清样品利用Tmab以及Ptmab特异性ELISA检测血药浓度，检测出的血清中抗体含量对采血时间做曲线，得到双特异性抗体(KN026)以及参比抗体(赫赛汀)的药代曲线(见图21)，并进一步计算相应药代参数(表7)。可以看到Ptmab双特异性抗体(KN026)在小鼠体内的半衰期比Trastuzumab略低一些，但是仍然大于10天，与大部分单抗药物在小鼠内的半衰期相似，可以认为Ptmab在小鼠体内稳定性与常规单抗药物类似。
表7 KN026和Trastuzumab的药代参数
Figure GDA0002257238040000351
实施例12Ptmab双特异性抗体对人卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤模型的药效作用
Balb/c裸鼠皮下接种人卵巢癌SKOV3细胞，剂量为5×106cells+50％基质胶(matrigel)/只，将成瘤小鼠随机分组，每组6只(雌雄各半)。肿瘤大小长到约直径100-150mm3时，开始注射抑瘤药物进行实验。腹腔给药,每周给药两次；连续给药2周。一周两次测量肿瘤的大小。实验组每次给药Ptmab双特性抗体KN026 20mg/kg，参比组每次给药Trastuzumab标准品，或Pertuzumab标准品20mg/kg，空白对照组每次给药相同体积PBS缓冲液。
如图22所示，实验组与参比组相对空白对照组，对SKOV3的裸鼠移植瘤模型均表现出一定的肿瘤抑制效果。其中PTmab双特异性抗体表现出比母本参比品Trastuzumab标准品，或Pertuzumab标准品单独使用时更强的抑瘤效果。
实施例13Ptmab双特异性抗体对人胃癌N-87裸鼠移植瘤模型的药效作用
Balb/c裸鼠皮下接种人胃癌N-87细胞，剂量为4×106cells/只，将成瘤小鼠随机分组，每组6只(雌雄各半)。肿瘤大小长到约直径100-130mm3时，开始注射抑瘤药物进行实验。IP给药，每周给药两次；连续给药4-5周。一周两次测量肿瘤的大小。
实验组每次给药Ptmab双特性抗体KN026 5mg/kg，参比组每次给药Trastuzumab标准品，或Pertuzumab标准品5mg/kg，空白对照组每次给药相同体积PBS缓冲液。
如图23所示，实验组与参比组相对空白对照组，对N-87的裸鼠移植瘤模型均表现出一定的肿瘤抑制效果。其中Ptmab双特异性抗体表现出明显优于参比品Trastuzumab标准品，或Pertuzumab标准品单独使用时的抑瘤效果。
实施例14Ptmab双特异性抗体对人胃癌N-87裸鼠移植瘤模型的药效作用
Balb/c裸鼠皮下接种人胃癌N-87细胞，剂量为4×106cells/只，将成瘤小鼠随机分组，每组6只(雌雄各半)。肿瘤大小长到约直径100-120mm3时，开始注射抑瘤药物进行实验。IP给药，每周给药两次，连续给药3周。一周两次测量肿瘤的大小。
实验组给药PTmab双特性抗体KN026 2.5mg/kg，参比组每次给药Trastuzumab标准品与Pertuzumab标准品联合用药，2.5mg/kg，空白对照组每次给药相同体积PBS缓冲液。
如图24所示，实验组与参比组相对空白对照组，对N-87的裸鼠移植瘤模型均表现出一定的肿瘤抑制效果。其中PTmab双特异性抗体表现出比同等摩尔数给药参比品Trastuzumab标准品加Pertuzumab标准品联合使用时更强的抑瘤效果。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
　　 序列表
　　<110> 江苏康宁杰瑞生物制药有限公司
　　<120> 具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物
　　<130> 0096-PA-004.DIV1
　　<160> 28
　　<170> PatentIn version 3.5
　　<210> 1
　　<211> 214
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 1
　　Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
　　1 5 10 15
　　Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
　　 20 25 30
　　Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
　　 35 40 45
　　Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
　　 50 55 60
　　Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
　　65 70 75 80
　　Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
　　 85 90 95
　　Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
　　 100 105 110
　　Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
　　 115 120 125
　　Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
　　 130 135 140
　　Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
　　145 150 155 160
　　Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
　　 165 170 175
　　Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
　　 180 185 190
　　Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
　　 195 200 205
　　Phe Asn Arg Gly Glu Cys
　　 210
　　<210> 2
　　<211> 214
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 2
　　Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
　　1 5 10 15
　　Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Ile Ala
　　 20 25 30
　　Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
　　 35 40 45
　　Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
　　 50 55 60
　　Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
　　65 70 75 80
　　Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
　　 85 90 95
　　Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
　　 100 105 110
　　Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
　　 115 120 125
　　Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
　　 130 135 140
　　Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
　　145 150 155 160
　　Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
　　 165 170 175
　　Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
　　 180 185 190
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　　 195 200 205
　　Phe Asn Arg Gly Glu Cys
　　 210
　　<210> 3
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　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 3
　　Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
　　1 5 10 15
　　Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
　　 20 25 30
　　Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
　　 35 40 45
　　Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
　　 50 55 60
　　Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
　　65 70 75 80
　　Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Tyr Pro Pro
　　 85 90 95
　　Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
　　 100 105 110
　　Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
　　 115 120 125
　　Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
　　 130 135 140
　　Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
　　145 150 155 160
　　Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
　　 165 170 175
　　Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
　　 180 185 190
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　　 195 200 205
　　Phe Asn Arg Gly Glu Cys
　　 210
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　　<211> 214
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
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　　 35 40 45
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　　 50 55 60
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　　65 70 75 80
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　　 100 105 110
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　　 115 120 125
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　　 165 170 175
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　　 50 55 60
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　　65 70 75 80
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　　 100 105 110
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　　 115 120 125
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　　 130 135 140
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　　 165 170 175
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　　 195 200 205
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　　<213> 人工序列
　　<400> 6
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　　1 5 10 15
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　　 20 25 30
　　Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
　　 35 40 45
　　Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
　　 50 55 60
　　Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
　　65 70 75 80
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　　 85 90 95
　　Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
　　 100 105 110
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　　 115 120 125
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　　 130 135 140
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　　 165 170 175
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　　 180 185 190
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　　 195 200 205
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　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<400> 7
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgcc gcgccagcca ggacgtgaac actgccgttg catggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagcttcc tgtacagcgg cgtgcccagc 180
cgcttcagcg gcagccgcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactatacta ctcctccaac attcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgcaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctcaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cgcggcgagt gc 642
　　<210> 8
　　<211> 642
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<400> 8
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgcc gcgccagcca ggacgtgaac attgccgttg catggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagcttcc tgtacagcgg cgtgcccagc 180
cgcttcagcg gcagccgcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactatacta ctcctccaac attcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgcaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctcaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cgcggcgagt gc 642
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　　<211> 642
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<400> 9
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgcc gcgccagcca ggacgtgaac actgccgttg catggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagcttcc tgtacagcgg cgtgcccagc 180
cgcttcagcg gcagccgcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactatactt atcctccaac attcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgcaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctcaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cgcggcgagt gc 642
　　<210> 10
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　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<400> 10
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgcc gcgccagcca ggacgtgaac attgccgttg catggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagcttcc tgtacagcgg cgtgcccagc 180
cgcttcagcg gcagccgcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactatactt atcctccaac attcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgcaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctcaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cgcggcgagt gc 642
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gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgca aggccagcca ggacgtgagc atcggcgtgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc gctacaccgg cgtgcccagc 180
cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tactacatct acccctacac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgcaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctcaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cgcggcgagt gc 642
　　<210> 12
　　<211> 642
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<400> 12
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgca aggccagcca ggacgtgagc atcggcgtgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc gctacaccgg cgtgcccagc 180
cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tactacatca ccccctacac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgcaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctcaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cgcggcgagt gc 642
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　　<211> 630
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 13
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　　1 5 10 15
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　　Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile
　　 50 55 60
　　Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val
　　65 70 75 80
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　　 85 90 95
　　Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro
　　 100 105 110
　　Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
　　 115 120 125
　　Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr
　　 130 135 140
　　Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr
　　145 150 155 160
　　Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
　　 165 170 175
　　Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser
　　 180 185 190
　　Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro
　　 195 200 205
　　Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly
　　 210 215 220
　　Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
　　225 230 235 240
　　Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr
　　 245 250 255
　　Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser
　　 260 265 270
　　Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ala
　　 275 280 285
　　Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu Ala Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp
　　 290 295 300
　　Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys
　　305 310 315 320
　　Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser
　　 325 330 335
　　Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu
　　 340 345 350
　　Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
　　 355 360 365
　　Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
　　 370 375 380
　　Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu
　　385 390 395 400
　　Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn
　　 405 410 415
　　Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly
　　 420 425 430
　　Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His
　　 435 440 445
　　Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe
　　 450 455 460
　　Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp
　　465 470 475 480
　　Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly
　　 485 490 495
　　His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe
　　 500 505 510
　　Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu
　　 515 520 525
　　Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu
　　 530 535 540
　　Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp
　　545 550 555 560
　　Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala
　　 565 570 575
　　Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp
　　 580 585 590
　　Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys
　　 595 600 605
　　Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln
　　 610 615 620
　　Arg Ala Ser Pro Leu Thr
　　625 630
　　<210> 14
　　<211> 630
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 14
　　Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser
　　1 5 10 15
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　　 20 25 30
　　Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser
　　 35 40 45
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　　 50 55 60
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　　65 70 75 80
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　　 85 90 95
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　　 100 105 110
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　　 115 120 125
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　　 130 135 140
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　　145 150 155 160
　　Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
　　 165 170 175
　　Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser
　　 180 185 190
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　　 195 200 205
　　Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly
　　 210 215 220
　　Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
　　225 230 235 240
　　Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr
　　 245 250 255
　　Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser
　　 260 265 270
　　Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser
　　 275 280 285
　　Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp
　　 290 295 300
　　Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys
　　305 310 315 320
　　Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser
　　 325 330 335
　　Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu
　　 340 345 350
　　Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
　　 355 360 365
　　Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
　　 370 375 380
　　Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu
　　385 390 395 400
　　Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn
　　 405 410 415
　　Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly
　　 420 425 430
　　Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His
　　 435 440 445
　　Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe
　　 450 455 460
　　Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp
　　465 470 475 480
　　Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly
　　 485 490 495
　　His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe
　　 500 505 510
　　Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu
　　 515 520 525
　　Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu
　　 530 535 540
　　Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Ala Ala Asp
　　545 550 555 560
　　Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Ala Phe Cys Val Ala
　　 565 570 575
　　Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp
　　 580 585 590
　　Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys
　　 595 600 605
　　Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln
　　 610 615 620
　　Arg Ala Ser Pro Leu Thr
　　625 630
　　<210> 15
　　<211> 630
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 15
　　Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser
　　1 5 10 15
　　Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln
　　 20 25 30
　　Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser
　　 35 40 45
　　Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile
　　 50 55 60
　　Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val
　　65 70 75 80
　　Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp
　　 85 90 95
　　Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro
　　 100 105 110
　　Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
　　 115 120 125
　　Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr
　　 130 135 140
　　Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr
　　145 150 155 160
　　Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
　　 165 170 175
　　Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser
　　 180 185 190
　　Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro
　　 195 200 205
　　Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly
　　 210 215 220
　　Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
　　225 230 235 240
　　Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr
　　 245 250 255
　　Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser
　　 260 265 270
　　Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser
　　 275 280 285
　　Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp
　　 290 295 300
　　Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys
　　305 310 315 320
　　Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser
　　 325 330 335
　　Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu
　　 340 345 350
　　Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
　　 355 360 365
　　Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
　　 370 375 380
　　Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu
　　385 390 395 400
　　Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn
　　 405 410 415
　　Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly
　　 420 425 430
　　Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His
　　 435 440 445
　　Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe
　　 450 455 460
　　Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp
　　465 470 475 480
　　Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly
　　 485 490 495
　　His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe
　　 500 505 510
　　Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu
　　 515 520 525
　　Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu
　　 530 535 540
　　Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp
　　545 550 555 560
　　Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Ala Ala Phe Cys Val Ala
　　 565 570 575
　　Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp
　　 580 585 590
　　Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys
　　 595 600 605
　　Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln
　　 610 615 620
　　Arg Ala Ser Pro Leu Thr
　　625 630
　　<210> 16
　　<211> 1350
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<400> 16
gaggtgcagc tcgtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcgccaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtggcccgc atctacccca ccaacggcta cacccgctac 180
gccgacagcg tgaagggccg cttcaccatc agcgccgaca ccagcaagaa caccgcctac 240
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcag ccgctggggc 300
ggcgacggct tctacgccat ggactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360
gccagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgagc 480
tggaacagcg gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 720
cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccgcaccccc 780
gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgcgagga gcagtacaac 900
agcacctacc gcgtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagccccag gtgtacaccc tgccccccag ccgcgaggag 1080
atgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 1200
ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagccgctgg 1260
cagcagggca acgtgttctc gtgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320
cagaagagcc tgagcctgag ccccggcaag 1350
　　<210> 17
　　<211> 1347
　　<212> DNA
　　<213> 人工序列
　　<400> 17
gaggtgcagc tcgtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcacc gactacacca tggactgggt gcgccaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtggccgac gtgaacccca acagcggcgg cagcatctac 180
aaccagcgct tcaagggccg cttcaccctg agcgtggacc gcagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcaacctg 300
ggccccagct tctacttcga ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagcgcc 360
agcaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 420
accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgagctgg 480
aacagcggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 540
ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660
agctgcgaca agacccacac ctgccccccc tgccccgccc ccgagctgct gggcggcccc 720
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg cacccccgag 780
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gcgaggagca gtacaacagc 900
acctaccgcg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960
tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg cccgccccca tcgagaagac catcagcaag 1020
gccaagggcc agccccgcga gccccaggtg tacaccctgc cccccagccg cgaggagatg 1080
accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccgtgctg 1200
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag ccgctggcag 1260
cagggcaacg tgttctcgtg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320
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　　<210> 18
　　<211> 630
　　<212> PRT
　　<213> HER2-ECD
　　<400> 18
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　　1 5 10 15
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　　 20 25 30
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　　 35 40 45
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　　 50 55 60
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　　65 70 75 80
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　　 85 90 95
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　　 100 105 110
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　　 130 135 140
　　Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr
　　145 150 155 160
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　　 165 170 175
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　　 180 185 190
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　　 195 200 205
　　Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly
　　 210 215 220
　　Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
　　225 230 235 240
　　Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr
　　 245 250 255
　　Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser
　　 260 265 270
　　Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser
　　 275 280 285
　　Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp
　　 290 295 300
　　Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys
　　305 310 315 320
　　Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser
　　 325 330 335
　　Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu
　　 340 345 350
　　Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
　　 355 360 365
　　Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
　　 370 375 380
　　Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu
　　385 390 395 400
　　Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn
　　 405 410 415
　　Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly
　　 420 425 430
　　Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His
　　 435 440 445
　　Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe
　　 450 455 460
　　Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp
　　465 470 475 480
　　Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly
　　 485 490 495
　　His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe
　　 500 505 510
　　Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu
　　 515 520 525
　　Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu
　　 530 535 540
　　Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp
　　545 550 555 560
　　Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala
　　 565 570 575
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　　 580 585 590
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　　 595 600 605
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　　 610 615 620
　　Arg Ala Ser Pro Leu Thr
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　　<211> 450
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 19
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　　 20 25 30
　　Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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　　Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
　　 50 55 60
　　Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
　　65 70 75 80
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　　 100 105 110
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　　 115 120 125
　　Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
　　 130 135 140
　　Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
　　145 150 155 160
　　Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
　　 165 170 175
　　Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
　　 180 185 190
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　　 210 215 220
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　　 275 280 285
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　　 290 295 300
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　　 325 330 335
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　　 340 345 350
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　　 355 360 365
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　　 370 375 380
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　　385 390 395 400
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　　 405 410 415
　　Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
　　 420 425 430
　　Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
　　 435 440 445
　　Gly Lys
　　 450
　　<210> 20
　　<211> 449
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 20
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　　1 5 10 15
　　Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
　　 20 25 30
　　Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
　　 35 40 45
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　　 50 55 60
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　　65 70 75 80
　　Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
　　 85 90 95
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　　 100 105 110
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　　 115 120 125
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　　 130 135 140
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　　 165 170 175
　　Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
　　 180 185 190
　　Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
　　 195 200 205
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　　 210 215 220
　　Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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　　Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
　　 245 250 255
　　Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
　　 260 265 270
　　Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
　　 275 280 285
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　　 290 295 300
　　Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
　　305 310 315 320
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　　 325 330 335
　　Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
　　 340 345 350
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　　 355 360 365
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　　 370 375 380
　　Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
　　385 390 395 400
　　Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
　　 405 410 415
　　Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
　　 420 425 430
　　Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
　　 435 440 445
　　Lys
　　<210> 21
　　<211> 450
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 21
　　Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
　　1 5 10 15
　　Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
　　 20 25 30
　　Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
　　 35 40 45
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　　 50 55 60
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　　 100 105 110
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　　 115 120 125
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　　 130 135 140
　　Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
　　145 150 155 160
　　Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
　　 165 170 175
　　Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
　　 180 185 190
　　Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
　　 195 200 205
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　　225 230 235 240
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　　 245 250 255
　　Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
　　 260 265 270
　　Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
　　 275 280 285
　　Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
　　 290 295 300
　　Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
　　305 310 315 320
　　Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
　　 325 330 335
　　Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
　　 340 345 350
　　Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
　　 355 360 365
　　Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
　　 370 375 380
　　Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
　　385 390 395 400
　　Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
　　 405 410 415
　　Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
　　 420 425 430
　　Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
　　 435 440 445
　　Gly Lys
　　 450
　　<210> 22
　　<211> 449
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 22
　　Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
　　1 5 10 15
　　Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
　　 20 25 30
　　Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
　　 35 40 45
　　Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
　　 50 55 60
　　Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
　　65 70 75 80
　　Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
　　 85 90 95
　　Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
　　 100 105 110
　　Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
　　 115 120 125
　　Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
　　 130 135 140
　　Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
　　145 150 155 160
　　Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
　　 165 170 175
　　Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
　　 180 185 190
　　Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
　　 195 200 205
　　Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
　　 210 215 220
　　Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
　　225 230 235 240
　　Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
　　 245 250 255
　　Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
　　 260 265 270
　　Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
　　 275 280 285
　　Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
　　 290 295 300
　　Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
　　305 310 315 320
　　Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
　　 325 330 335
　　Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
　　 340 345 350
　　Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
　　 355 360 365
　　Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
　　 370 375 380
　　Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu
　　385 390 395 400
　　Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys
　　 405 410 415
　　Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
　　 420 425 430
　　Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
　　 435 440 445
　　Lys
　　<210> 23
　　<211> 120
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 23
　　Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
　　1 5 10 15
　　Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
　　 20 25 30
　　Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
　　 35 40 45
　　Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
　　 50 55 60
　　Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
　　65 70 75 80
　　Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
　　 85 90 95
　　Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
　　 100 105 110
　　Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
　　 115 120
　　<210> 24
　　<211> 119
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 24
　　Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
　　1 5 10 15
　　Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
　　 20 25 30
　　Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
　　 35 40 45
　　Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
　　 50 55 60
　　Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
　　65 70 75 80
　　Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
　　 85 90 95
　　Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
　　 100 105 110
　　Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
　　 115
　　<210> 25
　　<211> 227
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 25
　　Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
　　1 5 10 15
　　Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
　　 20 25 30
　　Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
　　 35 40 45
　　Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
　　 50 55 60
　　His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
　　65 70 75 80
　　Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
　　 85 90 95
　　Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
　　 100 105 110
　　Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
　　 115 120 125
　　Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
　　 130 135 140
　　Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
　　145 150 155 160
　　Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
　　 165 170 175
　　Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
　　 180 185 190
　　Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
　　 195 200 205
　　His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
　　 210 215 220
　　Pro Gly Lys
　　225
　　<210> 26
　　<211> 227
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 26
　　Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
　　1 5 10 15
　　Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
　　 20 25 30
　　Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
　　 35 40 45
　　Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
　　 50 55 60
　　His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
　　65 70 75 80
　　Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
　　 85 90 95
　　Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
　　 100 105 110
　　Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
　　 115 120 125
　　Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
　　 130 135 140
　　Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
　　145 150 155 160
　　Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
　　 165 170 175
　　Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
　　 180 185 190
　　Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
　　 195 200 205
　　His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
　　 210 215 220
　　Pro Gly Lys
　　225
　　<210> 27
　　<211> 227
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 27
　　Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
　　1 5 10 15
　　Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
　　 20 25 30
　　Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
　　 35 40 45
　　Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
　　 50 55 60
　　His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
　　65 70 75 80
　　Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
　　 85 90 95
　　Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
　　 100 105 110
　　Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
　　 115 120 125
　　Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
　　 130 135 140
　　Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
　　145 150 155 160
　　Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
　　 165 170 175
　　Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
　　 180 185 190
　　Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
　　 195 200 205
　　His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
　　 210 215 220
　　Pro Gly Lys
　　225
　　<210> 28
　　<211> 227
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<400> 28
　　Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
　　1 5 10 15
　　Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
　　 20 25 30
　　Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
　　 35 40 45
　　Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
　　 50 55 60
　　His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
　　65 70 75 80
　　Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
　　 85 90 95
　　Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
　　 100 105 110
　　Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
　　 115 120 125
　　Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
　　 130 135 140
　　Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
　　145 150 155 160
　　Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro
　　 165 170 175
　　Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val
　　 180 185 190
　　Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
　　 195 200 205
　　His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
　　 210 215 220
　　Pro Gly Lys
　　225

Claims (23)

1.双特异性抗体或其抗原结合部分，所述双特异性抗体或其抗原结合部分的两条轻链具有相同的序列；
其中所述轻链的轻链可变区的序列选自如SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：6中第1～107位氨基酸所示的序列;
其中所述双特异性抗体或其抗原结合部分的重链可变区的序列分别如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示，其中所述的轻链能够分别与帕妥珠单抗和曲妥株单抗的重链结合。
2.权利要求1所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，所述双特异性抗体或其抗原结合部分的重链可变区分别为帕妥珠单抗和曲妥株单抗的重链可变区。
3.权利要求1-2中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，所述双特异性抗体或其抗原结合部分的重链Fc段的序列分别包含如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的序列。
4.权利要求1-2中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分，其两条重链的序列分别包含如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的序列。
5.混合物，其包含具有共同轻链的两种抗体或其抗原结合部分，其中所述共同轻链的可变区包含选自如SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：6中第1～107位氨基酸所示的序列；且
所述两种抗体或其抗原结合部分的重链可变区的序列分别如SEQ ID NO：23和SEQ IDNO：24所示，其中所述共同轻链能够分别与帕妥珠单抗和曲妥株单抗的重链结合。
6.权利要求5所述的混合物，其中所述两种抗体或其抗原结合部分的重链可变区分别为帕妥珠单抗和曲妥株单抗的重链可变区。
7.权利要求5-6中任一项所述的混合物，其中所述两种抗体或其抗原结合部分的重链Fc段分别包含如SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的序列。
8.权利要求5-6中任一项所述的混合物，其中所述两种抗体或其抗原结合部分的重链分别包含如SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示的序列。
9.核酸分子，其编码权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分或者权利要求5-8中任一项所述的混合物中所述的抗体或其抗原结合部分。
10.重组载体，其含有权利要求9所述的核酸分子。
11.重组细胞，其含有权利要求10所述的重组载体或权利要求9所述的核酸分子。
12.组合物，其含有权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分、或者权利要求5-8中任一项所述的混合物，以及任选地药学上可接受的载体或赋形剂。
13.权利要求12所述的组合物，其还含有化疗药物和/或其它抗体。
14.权利要求12-13中任一项所述的组合物，其为药物组合物。
15.试剂盒，其含有权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分、或者权利要求5-8中任一项所述的混合物，以及任选地缓冲液或说明书。
16.权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备预防和/或治疗HER2阳性肿瘤的药物中的用途。
17.权利要求16所述的用途，其中所述HER2阳性肿瘤包含卵巢癌、乳腺癌和/或胃癌。
18.权利要求5-8中任一项所述的混合物在制备预防和/或治疗HER2阳性肿瘤的药物中的用途。
19.权利要求18所述的用途，其中所述HER2阳性肿瘤包含卵巢癌、乳腺癌和/或胃癌。
20.权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分在制备诊断HER2阳性肿瘤的试剂或试剂盒中的用途。
21.权利要求20所述的用途，其中所述HER2阳性肿瘤包含卵巢癌、乳腺癌和/或胃癌。
22.权利要求5-8中任一项所述的混合物在制备诊断HER2阳性肿瘤的试剂或试剂盒中的用途。
23.权利要求22所述的用途，其中所述HER2阳性肿瘤包含卵巢癌、乳腺癌和/或胃癌。
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