JP2018504113A - 共通軽鎖を有する二重特異性抗体又は抗体混合物 - Google Patents

Abstract

本発明は、共通軽鎖を有する二重特異性抗体又は抗体混合物、及びその調製方法を提供する。本発明は更に、上記抗体又は混合物をコードする核酸分子、当該核酸分子を含む組換えベクター及び組換え細胞、並びに上記抗体又は混合物の検出及び定量方法を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、二重特異性抗体又は抗体混合物、及び上記二重特異性抗体又は抗体混合物の調製方法に関する。本発明は更に、上記二重特異性抗体又は抗体混合物をコードする核酸分子、当該核酸分子を含む組換えベクター及び組換え細胞、並びに上記二重特異性抗体又は抗体混合物の検出及び定量方法に関する。

モノクローナル抗体薬は、この１５年間で大きな進歩を遂げ、製薬業界の推進力となっている。１９９６年以降、合計３０個前後のモノクローナル抗体薬が認可され、市販されている。このうち９つのモノクローナル薬の年間売上高は１０億ＵＳドルを超えている。２０１０年のモノクローナル薬の販売総額は３００億ＵＳドルを超えており、年間成長率が１０％を超えている。モノクローナル抗体は標的特異性が高いので、単一の標的のみ抑制することができる。しかしながら、腫瘍及び自己免疫疾患等を含む複数の疾患では、多重シグナル経路を抑制して補償作用を回避する必要がある。ウイルス感染疾患については、ウイルスの変異率が高いので、一般に、複数の抗原部位を抑制して漏れがないようにする必要がある。したがって、このような問題を解決することができる解決策がいくつかある。１つは、ポリクローナル抗体を用いるか、又は抗体のＦｃフラグメントの改変によって、二重特異性抗体等のヘテロダイマーを得るものであり、少なくとも２つの異なる抗原又は同一抗原の異なる結合部位に対して活性を有するようにすることができる。もう１つは、抗体混合物の使用による治療であり、抗体混合物は同一標的における異なるエピトープに対する２種類以上の抗体の混合物、又は異なる標的に対する２種類以上の抗体の混合物を含むことができる。

二重特異性抗体（ＢｓＡｂ：Bispecific antibody）は２つの異なるリガンド結合部位を含む免疫グロブリン分子である。これは代表的な抗体のＦａｂの両腕が同じ配列であるのに対し、２つの異なるＦａｂ配列を用いているので、Ｙ字型の両腕が異なる抗原エピトープに結合することができるものである。癌治療における二重特異性抗体の適用は既に複数の文献で概要が述べられている（非特許文献１、非特許文献２）。ｂｓＡｂの一方の腕は腫瘍細胞表面の関連抗原に結合し、他方の腕は細胞を更に殺傷するように免疫エフェクター細胞をトリガーし、免疫システムを通じて癌腫瘍細胞を殺すことができる。

二重特異性抗体の調製については、既に９０年代にＣａｒｔｅｒ他が「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」モデルによって抗体重鎖の一部のアミノ酸を改変しており、二重特異性抗体の調製実現に成功している（非特許文献３、非特許文献１）。しかしながら、彼らの研究結果では、「ｈｏｌｅｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」モデルにおけるホモダイマーの形成阻害能力は依然として不十分であり、ホモダイマーが約５％残存している。その後、この研究グループはランダム変異−ファージディスプレイ等の方法によってヘテロダイマーの含有率を向上させたが、問題を根本的に解決してはいない。

本発明の発明者は、電荷アミノ酸の相互作用ネットワークを通じてＦｃのＣＨ３の関連アミノ酸を修飾することで領域自体の相互作用（ホモダイマーの形成に有利）を弱めると共に、領域間の相互作用（ヘテロダイマーの形成に有利）を強めて、「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」モデルにおけるホモダイマーの５％の残存を成功裏に解決しており、その方法は特許文献１に開示されている。

ヘテロダイマーのプラットフォーム技術については、混合抗体生産プラットフォームは比較的早くから発展している。このうち最も注目されているのはデンマークのSymphogen社の抗体混合物技術である。この技術は、まず、抗体スクリーニングプラットフォームのスクリーニングを通じて同一標的に対する複数の抗体を得て、各抗体に対してそれぞれ細胞株を構築する。その後、それぞれの細胞のフラスコ培養の種子液を混合し、最後に、混合物の培養増幅を次第に拡大させ、精製工程で最適化して最終産物を得る。この方法により複数の細胞の混合集団を培養することによって１つの組換え生産過程から複数の抗体を直接的に得ることができても、混合細胞集団の培養に対する制御の難しさにより、及びこれによる増幅生産の複雑さにより、この手法には依然として潜在的な問題がいくつかある。

本発明の出願人は、Ｆｃ部分を変異させてＦｃの直接的な相互作用を改変することによって、２種類以上のホモダイマータンパク質又は抗体を含む混合物の単一組換え細胞における生成方法を発明した。この手法は、混合細胞の培養によるプロセス制御及び増幅の潜在的な難しさを回避しており、より経済的で効果的な抗体混合物の調製及び生産方式を提供している。この手法は特許文献２に記載されている。

上述したいずれの方法であっても、全ての抗体フレームワークを利用して二重特異性抗体又は抗体混合物を調製する場合には、軽鎖と重鎖との間のミスマッチが起こるおそれがあり、さらには、抗体の活性に影響するおそれがあり、従来、この分野で比較的確立されている方法は、Roche（Genentech）の開発したＣｒｏｓｓｍａｂである。すなわち、１組のＦａｂに対する軽鎖−重鎖配列の相互置換によってその軽鎖配列と別の軽鎖−重鎖との間のミスマッチを防止する（特許文献３、特許文献４）。この方法は重鎖−軽鎖のミスマッチ問題を大部分解決することができるが、軽鎖の解離、凝集体含有率の増加、及びいくつかのＦａｂ配列に対しては抗原エピトープの認識に何らかの影響があること等の重軽鎖配列の人為的な改変による新たな問題もある。

ハーセプチン（Herceptin、トラスツズマブ（Trastuzumab）ともいう）は、乳癌において確実な治療効果を示す最初の治療的モノクローナル抗体であり、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）のモノクローナル抗体である。これは乳癌細胞のＨＥＲ２−Ｎｅｕ表面タンパク質に作用し、癌細胞のバイオプロセスに干渉して、最終的には死に至らせる。ハーセプチンの主な適用者はＨＥＲ２が過度に発現した（免疫組織化学３＋又は蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションＦＩＳＨ陽性）乳癌患者であり、この患者群は乳癌患者の２０％〜３０％を占めている。

ペルツズマブ（pertuzumab）は組み換えられたモノクローナル抗体であり、ＨＥＲ−２受容体の細胞外ドメインＩＩ領域に結合して、ダイマーの形成を抑制し、受容体が媒介するシグナル伝達経路（非特許文献４）を抑制する。これはペルツズマブがＨＥＲ−２の低発現腫瘍の成長を抑制する原因として一部解釈することができる。トラスツズマブはＨＥＲ−２受容体の細胞外ＩＶ領域に結合して、ダイマーの形成はＩＶ領域に関わらないので、トラスツズマブはＨＥＲ−２が過剰に発現した乳癌患者にのみ有効である。目下、ＨＥＲ−２低発現末期乳癌のペルツズマブ治療のＩＩ期臨床研究が行われている。Ｂａｓｅｌｇａ（非特許文献５）他の研究によると、ペルツズマブは、ハーセプチン（トラスツズマブ）と併用すると、治療の難しいＨＥＲ−２陽性乳癌患者に対して確実に抗腫瘍活性を有する。この研究によると、ペルツズマブ治療に対して１／５の患者に効果があり（腫瘍の縮小又は消失）、また、１／５の患者の病状が６カ月以上継続的に安定する。乳癌のペルツズマブ治療のＩＩＩ期臨床試験の結果によると、この薬はＥＲＢＢ２陽性の転移性乳癌患者の無増悪生存期間を極めて長く延長させることができる。

先日、ロシュ社が或る最新の実験結果を発表した。この試験は、ペルツズマブ及びハーセプチン（トラスツズマブ）に化学療法（ドセタキセル）を併用することで早期の癌原遺伝子であるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）が陽性の乳癌女性患者を治療した治療効果を評価するＩＩ期術前補助療法研究である。米国癌学会（ＣＴＲＣ−ＡＡＣＲ）がサンアントニオ乳癌シンポジウム（ＳＡＢＣＳ）で発表したデータによると、術前補助療法において２種類の抗体にドセタキセル治療を併用した乳腺腫瘍の完全消失率（症例の完全寛解率４５．８％）は、ハーセプチンにドセタキセルを併用した場合（症例の完全寛解率２９．０％）よりも著しく５０％以上向上している。ペルツズマブ及びペルツズマブとドセタキセルとの併用は、ハーセプチン及び化学療法に比べて、副作用を招いたり、心臓リスクが増加したりすることがない。

本発明は、ペルツズマブ及びトラスツズマブを例として、ペルツズマブ及びトラスツズマブの機能を同時に有する二重特異性抗体及び抗体混合物を調製しており、その上で、軽鎖及び重鎖の正確な組合せが可能な二重特異性抗体又は抗体混合物を調製する新しい方法を見出した。

中国特許出願公開第１０２５５８３５５号明細書 中国特許出願公開第１０３３８８０１３号明細書 米国特許第２００９０１６２３５９号明細書 米国特許第２０１２０１６４７２６号明細書

Carter 2001 Chames and Baty 2009 Ridgway, Presta et al.1996 Agus DB, Gordon MS, Taylor C, et al.2005 Baselga J, et al.2007

本発明の発明者は実験を繰り返すことによって、２つのオリジナル抗体又は抗体混合物中の軽鎖を共通軽鎖に置き換えて、共通軽鎖を有する二重特異性抗体又は抗体混合物を得ることができ、当該共通軽鎖を有する二重特異性抗体又は抗体混合物は軽鎖及び重鎖の正確な組合せを実行することができると共に、２つのオリジナル抗体に比べて、良好な結合特性と、生物活性と、安定性とを有しており、さらには、生物活性的にオリジナル抗体よりも優れているという驚くべき発見をした。

本発明の第１の態様は、共通軽鎖を有し、上記共通軽鎖は、２本の軽鎖が同じ配列を有することを指すことを特徴とする、二重特異性抗体又はその抗原結合部分に関する。

本発明の一実施の形態において、重鎖が、それぞれ上記軽鎖に対して生理的条件又はｉｎ ｖｉｔｒｏのタンパク質発現状態で正確に結合することができる。

本発明の一実施の形態において、上記二重特異性抗体又はその抗原結合部分の共通軽鎖が、２株のオリジナルモノクローナル抗体（既知のモノクローナル抗体）から改変して取得したものであり、上記共通軽鎖が、少なくとも２株のオリジナルモノクローナル抗体のうちの一方の軽鎖とは配列が異なっている。本発明の一実施の形態において、上記共通軽鎖が、２株のオリジナルモノクローナル抗体のうちの一方の軽鎖と同じか、又はそれをベースとして改変（例えばアミノ酸配列の改変）によって取得したものであり、それぞれの抗原又は抗原エピトープとの親和力を可能な限り維持することが改変の目的である。本発明の一実施の形態において、上記アミノ酸配列の改変には、アミノ酸の変異、欠失又は付加が含まれ、例えば、変異、欠失又は付加のアミノ酸は、３つを超えず、好ましくは２つを超えず、より好ましくは１つを超えない。

本発明の一実施の形態において、上記二重特異性抗体又はその抗原結合部分の重鎖のＦｃフラグメントが、改変によって、ヘテロダイマータンパク質の形成にとってより有利になっている。

本発明の一実施の形態において、２株のオリジナルモノクローナル抗体が、ペルツズマブ及びトラスツズマブである。

本発明の一実施の形態において、上記共通軽鎖が、それぞれペルツズマブ及びトラスツズマブの重鎖に結合することができる。

本発明の一実施の形態において、上記共通軽鎖が、ペルツズマブ若しくはトラスツズマブの軽鎖又はそれらの変異体から選択される。本発明の一実施の形態において、上記二重特異性抗体又はその抗原結合部分の重鎖（可変領域及び定常領域を含む）が、２株のオリジナルモノクローナル抗体と同じであるか、又はヘテロダイマータンパク質の形成にとってより有利になるように改変されていてもよい。上記改変は、例えば、ヘテロダイマータンパク質の形成にとってより有利になるように、重鎖のＦｃフラグメントを改変することである。

本発明の一実施の形態において、上記共通軽鎖の可変領域の配列には、配列番号１〜配列番号６における第１位〜第１０７位のアミノ酸に示される配列が含まれる。

本発明の一実施の形態において、上記軽鎖の定常領域の配列には、配列番号１における第１０８位〜第２１４位のアミノ酸に示される配列が含まれる。

本発明の一実施の形態において、重鎖可変領域が、それぞれペルツズマブ及びトラスツズマブの重鎖可変領域である。

本発明の一実施の形態において、２本の重鎖の可変領域の配列には、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列が含まれる。

本発明の一実施の形態において、２本の重鎖のＦｃフラグメントの配列には、それぞれ配列番号２５及び配列番号２６に示される配列が含まれる。

本発明の一実施の形態において、２本の重鎖の配列には、それぞれ配列番号１９及び配列番号２０に示される配列が含まれる。

本発明第２の態様は、１つの細胞中で正確に生産可能な抗体又はその抗原結合部分の混合物であって、該混合物が、少なくとも２種類の抗体又はその抗原結合部分を含み、上記抗体又はその抗原結合部分が、共通軽鎖を有し、上記共通軽鎖は、２本の軽鎖の可変領域が同じ配列を有することを指す、混合物に関する。

本発明の一実施の形態において、上記抗体又はその抗原結合部分の重鎖が、それぞれ上記軽鎖に対して生理的条件又はｉｎ ｖｉｔｒｏのタンパク質発現状態で正確に結合することができる。

本発明の一実施の形態において、上記二重特異性抗体又はその抗原結合部分の共通軽鎖が、２株のオリジナルモノクローナル抗体（既知のモノクローナル抗体）から改変して取得したものであり、上記共通軽鎖が、少なくとも２株のオリジナルモノクローナル抗体のうちの一方の軽鎖とは配列が異なっている。本発明の一実施の形態において、上記共通軽鎖が、２株のオリジナルモノクローナル抗体のうちの一方の軽鎖と同じか、又はそれをベースとして改変（例えばアミノ酸配列の改変）によって取得したものであり、それぞれの抗原又は抗原エピトープとの親和力を可能な限り維持することが改変の目的である。本発明の一実施の形態において、上記アミノ酸配列の改変には、アミノ酸の変異、欠失又は付加が含まれ、例えば、変異、欠失又は付加のアミノ酸は、３つを超えず、好ましくは２つを超えず、より好ましくは１つを超えない。

本発明の一実施の形態において、上記二重特異性抗体又はその抗原結合部分の重鎖が、２株のオリジナルモノクローナル抗体に由来しており、上記二重特異性抗体又はその抗原結合部分の重鎖の可変領域配列及び／又はＣＨ１ドメイン配列が、オリジナルモノクローナル抗体と同じである。

本発明の一実施の形態において、上記二重特異性抗体又はその抗原結合部分の重鎖（可変領域及び定常領域を含む）が、２株のオリジナルモノクローナル抗体と同じであるか、又はホモダイマータンパク質の形成にとってより有利になるように改変されていてもよい。上記改変は、例えば、ホモダイマータンパク質の形成にとってより有利になるように、重鎖のＦｃフラグメントを改変することである。

本発明の一実施の形態において、２株のオリジナルモノクローナル抗体が、ペルツズマブ及びハーセプチンである。

本発明の一実施の形態において、上記共通軽鎖が、それぞれペルツズマブ及びトラスツズマブの重鎖に結合することができる。

本発明の一実施の形態において、上記共通軽鎖が、ペルツズマブ若しくはトラスツズマブの軽鎖又はそれらの変異体から選択される。

本発明の一実施の形態において、上記共通軽鎖の可変領域の配列には、配列番号１〜配列番号６における第１位〜第１０７位のアミノ酸に示される配列が含まれる。

本発明の一実施の形態において、上記軽鎖の定常領域の配列には、配列番号１における第１０８位〜第２１４位のアミノ酸に示される配列が含まれる。

本発明の一実施の形態において、上記抗体又はその抗原結合部分の重鎖可変領域が、それぞれペルツズマブ及びトラスツズマブの重鎖可変領域である。

本発明の一実施の形態において、２本の重鎖の可変領域の配列には、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列が含まれる。

本発明の一実施の形態において、２本の重鎖のＦｃフラグメントの配列には、それぞれ配列番号２７及び配列番号２８に示される配列が含まれる。

本発明の一実施の形態において、上記抗体又はその抗原結合部分の重鎖配列には、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列が含まれる。

本発明の第３の態様は、野生型ＨＥＲ２タンパク質の細胞外領域の配列に比べて、
１）第５５８位のグルタミン酸の変異及び第５７３位のフェニルアラニンの変異と、
２）第２８８位のセリンの変異及び第２９６位のヒスチジンの変異と、
から選択される変異を含む、ＨＥＲ２タンパク質の細胞外領域の変異体タンパク質に関する。

本発明の一実施の形態において、第５５８位のグルタミン酸をアラニンに変異させる。

本発明の一実施の形態において、第５７３位のフェニルアラニンをアラニンに変異にさせる。

本発明の一実施の形態において、第２８８位のセリンをアラニンに変異させる。

本発明の一実施の形態において、第２９６位のヒスチジンをアラニンに変異させる。

本発明の一実施の形態において、上記ＨＥＲ２変異体タンパク質には、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列が含まれる。

本発明の一実施の形態において、野生型ＨＥＲ２タンパク質の細胞外領域の配列が、配列番号１８に示される。

本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様のいずれか一項の二重特異性抗体若しくはその抗原結合部分、若しくは第２の態様のいずれか一項の混合物中の上記抗体若しくはその抗原結合部分、若しくは上記抗体若しくはその抗原結合部分の一部の配列（例えば軽鎖及び／又は重鎖）をコードするか、又は第３の態様のいずれか一項のＨＥＲ２変異体タンパク質をコードする、核酸分子に関する。

本発明の第５の態様は、本発明の第４の態様のいずれか一項の核酸分子を含む、組換えベクターに関する。

本発明の第６の態様は、本発明の第５の態様のいずれか一項の組換えベクター又は第４の態様のいずれか一項の核酸分子を含む、組換え細胞に関する。

本発明の第７の態様は、異なる抗原エピトープに対する２株のモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に基づく二重特異性抗体又はその抗原結合部分の調製方法であって、２株のモノクローナル抗体の軽鎖配列に基づいて、２株のモノクローナル抗体の重鎖にそれぞれ結合可能な共通軽鎖の配列を取得する工程を含み、上記共通軽鎖は、２本の軽鎖が同じ配列を有することを指し、好ましくは、当該共通軽鎖が、一方のモノクローナル抗体の軽鎖又は一方のモノクローナル抗体の軽鎖の変異体である、方法に関する。

本発明の一実施の形態において、
それぞれ２株のモノクローナル抗体の重鎖配列と共通軽鎖配列とを発現ベクターに構築して、２つの組換え発現ベクターを取得する工程と、
なお、好ましくは、異なる重鎖を有する２株のモノクローナル抗体のＦｃフラグメントの結合にとってより有利になるように、重鎖配列の特にＦｃフラグメントを変異させ、
２つの組換え発現ベクターを同一宿主細胞に移入し、発現を誘導して、二重特異性抗体又はその抗原結合部分を取得する工程と、
を更に含む。

本発明の一実施の形態において、上記共通軽鎖の可変領域の取得方法が、まず、２株のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域とそれぞれの抗原又は抗原エピトープとの間で接触する界面アミノ酸を確定し、その後、任意の一方のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域を候補共通軽鎖の可変領域とすると、当該共通軽鎖とこのモノクローナル抗体の抗原又は抗原エピトープとの間で接触する界面アミノ酸と他方のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸とを比較した場合の相違アミノ酸を確定して、相違アミノ酸の数量が少ない軽鎖可変領域を共通軽鎖の可変領域として選択することである。好ましくは、抗原又は抗原エピトープとの親和力がより良好な共通軽鎖の可変領域を取得するように、当該共通軽鎖の可変領域を更に変異させることである。本発明の一実施の形態において、上記共通軽鎖の定常領域の取得方法が、共通軽鎖の可変領域の提供が確定された方のモノクローナル抗体の軽鎖定常領域を共通軽鎖の定常領域とするか、又は当該軽鎖定常領域を更に変異させて共通軽鎖の定常領域を取得することである。

本発明の一実施の形態において、上記変異は、界面アミノ酸に対する変異を指す。

本発明の一実施の形態において、上記抗原又は抗原エピトープとの親和力がより良好とは、当該共通軽鎖と、当該二重特異性抗体又はその抗原結合部分が対応する２つの抗原又は抗原エピトープとの親和力で均衡が取れており、当該二重特異性抗原又はその抗原結合部分がより良好な生物活性と物理的化学的特性（例えば安定性）とを備えていること指す。

本発明の第８の態様は、少なくとも２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を含む混合物の調製方法であって、２株のモノクローナル抗体の軽鎖配列に基づいて、２株のモノクローナル抗体の重鎖にそれぞれ結合可能な共通軽鎖の配列を取得する工程を含み、上記共通軽鎖は、２本の軽鎖が同じ配列を有することを指し、好ましくは、当該共通軽鎖が、一方のモノクローナル抗体の軽鎖又は一方のモノクローナル抗体の軽鎖の変異体である、方法に関する。

本発明の一実施の形態において、
それぞれ２株のモノクローナル抗体の重鎖配列と共通軽鎖配列とを発現ベクターに構築して、２つの組換え発現ベクターを取得する工程と、
なお、好ましくは、同じ重鎖を有するモノクローナル抗体のＦｃフラグメントの結合にとってより有利になるように、重鎖配列の特にＦｃフラグメントを変異させ、
２つの組換え発現ベクターを同一宿主細胞に移入し、発現を誘導して、抗体又はその抗原結合部分の混合物を取得する工程と、
を更に含む。

本発明の一実施の形態において、上記共通軽鎖の可変領域の取得方法が、まず、２株のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域とそれぞれの抗原又は抗原エピトープとの間で接触する界面アミノ酸を確定し、その後、任意の一方のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域を候補共通軽鎖の可変領域とすると、当該共通軽鎖とこのモノクローナル抗体の抗原又は抗原エピトープとの間で接触する界面アミノ酸と他方のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸とを比較した場合の相違アミノ酸を確定して、相違アミノ酸の数量が少ない軽鎖可変領域を共通軽鎖の可変領域として選択することである。好ましくは、抗原又は抗原エピトープとの親和力がより良好な共通軽鎖の可変領域を取得するように、当該共通軽鎖の可変領域を更に変異させることである。本発明の一実施の形態において、上記共通軽鎖の定常領域の取得方法が、共通軽鎖の可変領域の提供が確定された方のモノクローナル抗体の軽鎖定常領域を共通軽鎖の定常領域とするか、又は当該軽鎖定常領域を更に変異させて共通軽鎖の定常領域を取得することである。

本発明の一実施の形態において、上記変異は、界面アミノ酸に対する変異を指す。

本発明の一実施の形態において、上記抗原又は抗原エピトープとの親和力がより良好とは、当該共通軽鎖と、当該混合物中の２株のモノクローナル抗体が対応する２つの抗原又は抗原エピトープとの親和力で均衡が取れており、当該混合物がより良好な生物活性と物理的化学的特性（例えば安定性）とを備えていることを指す。

本発明は更に、抗体又はその抗原結合部分が二重特異性抗体又はその抗原結合部分であるか否かの検出方法及び／又はその定量方法であって、
１）二重特異性抗体又はその抗原結合部分中の抗原結合部分１に結合可能であって抗原結合部分２に結合しない特異的抗原１と、抗原結合部分２に結合可能であって抗原結合部分１に結合しない特異的抗原２とをそれぞれ調製する工程と、
２）特異的抗原１（又は特異的抗原２）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、被験抗体を加え、暫くの間反応させ、標識された特異的抗原２（又は特異的抗原１）を更に加え、暫くの間反応させ、最後に、上記標識分子に結合可能な検出可能標識付き検出分子を加え、暫くの間反応させ、検出原理に基づき読み取って、反応が陽性であるか、又は陰性であるかを判断する工程と、
３）反応が陽性であり、且つ当該反応に濃度依存性がある場合には、当該抗体又はその抗原結合部分が二重特異性抗体又はその抗原結合部分であると判断し、任意選択により、得られた陽性数値に基づいて、二重特異性抗体又はその抗原結合部分を更に定量する工程と、
を含む、方法に関する（図２５の概略図参照）。

本発明では、上記抗原結合部分１と抗原結合部分２とは、それぞれ、二重特異性抗体又はその抗原結合部分中の、異なる抗原又は抗原エピトープにそれぞれ結合する２つの部分を指す。本発明の実施の形態では、上記抗原結合部分１と抗原結合部分２とは、それぞれ、２株のオリジナル抗体をベースとして改変したものであり、２株のオリジナル抗体が結合する抗原又は抗原エピトープと同じである。

本発明の一実施の形態において、上記特異的抗原１と特異的抗原２とが、ＨＥＲｍ１とＨＥＲｍ２とである。

本発明の一実施の形態において、上記標識された特異的抗原が、ビオチンによって標識された特異的抗原である。

本発明の一実施の形態において、上記検出分子は、検出に使用可能な基質分子を指し、例えば、ＨＲＰ標識されたストレプトアビジンである。

本発明は更に、抗体又はその抗原結合部分の混合物がホモダイマータンパク質であるか否かの検出方法であって、当該混合物には、２種類の抗体（抗体１及び抗体２）又はそれらの抗原結合部分が含まれ、当該方法は、
１）抗体１に結合可能であって抗体２に結合しない特異的抗原１と、抗体２に結合可能であって抗体１に結合しない特異的抗原２とをそれぞれ調製する工程と、
２）特異的抗原１（又は特異的抗原２）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、被験混合物を加え、暫くの間反応させ、標識された特異的抗原１（又は特異的抗原２）を更に加え、暫くの間反応させ、最後に、上記標識分子に結合可能な検出可能標識付き検出分子を加え、暫くの間反応させ、検出原理に基づき読み取って、反応が陽性であるか、又は陰性であるかを判断する工程と、
３）別途、特異的抗原１（又は特異的抗原２）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、被験混合物を加え、暫くの間反応させ、標識された特異的抗原２（又は特異的抗原１）を更に加え、暫くの間反応させ、最後に、上記標識分子に結合可能な検出可能標識付き検出分子を加え、暫くの間反応させ、検出原理に基づき読み取って、反応が陽性であるか、又は陰性であるかを判断する工程と、
４）工程２）の反応が陽性であり、当該反応に濃度依存性があり、且つ工程３）の反応が陰性である場合には、混合物がホモダイマータンパク質であってヘテロダイマータンパク質を含んでいないと判断し、工程２）の反応が陽性であり、且つ工程３）の反応も陽性である場合には、混合物がホモダイマータンパク質もヘテロダイマータンパク質も含んでいると判断する工程と、
を含む、方法に関する（図２６の概略図参照）。

本発明の一実施の形態において、上記特異的抗原１と特異的抗原２とが、ＨＥＲｍ１とＨｅｒｍ２とである。

本発明の一実施の形態において、上記標識された特異的抗原が、ビオチンによって標識された抗原である。

本発明の一実施の形態において、上記検出分子は、検出に使用可能な基質分子を指し、例えば、ＨＲＰ標識されたストレプトアビジンである。

本発明は更に、本発明の第１の態様のいずれか一項の二重特異性抗体又はその抗原結合部分と、任意選択の薬学的に許容可能なベクター又は賦形剤とを含む、組成物（例えば医薬組成物）に関する。

本発明は更に、本発明の第２の態様のいずれか一項の混合物と、任意選択の薬学的に許容可能なベクター又は賦形剤とを含む、組成物（例えば医薬組成物）に関する。

本発明は更に、本発明の第１の態様のいずれか一項の二重特異性抗体又はその抗原結合部分と、任意選択の緩衝液及び／又は説明書とを含む、キットに関する。

本発明の一実施の形態において、上記キットが、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）の診断に用いられる。

本発明は更に、本発明の第２の態様のいずれか一項の混合物と、任意選択の緩衝液又は説明書とを含む、キットに関する。

本発明の一実施の形態において、上記キットが、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）の診断に用いられる。

本発明は更に、本発明の第１の態様のいずれか一項の二重特異性抗体又はその抗原結合部分の、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）を予防及び／又は治療する医薬品の調製における用途に関する。

本発明は更に、本発明の第２の態様のいずれか一項の混合物の、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）を予防及び／又は治療する医薬品の調製における用途に関する。

本発明は更に、本発明の第１の態様のいずれか一項の二重特異性抗体又はその抗原結合部分の、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）を診断する試薬又はキットの調製における用途に関する。

本発明は更に、本発明の第２の態様のいずれか一項の混合物の、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）を診断する試薬又はキットの調製における用途に関する。

本発明は更に、本発明の第３の態様のいずれか一項のＨＥＲ２タンパク質の細胞外領域の変異体タンパク質を、第１の態様のいずれか一項の二重特異性抗体若しくはその抗原結合部分の検出又は第２の態様のいずれか一項の混合物の検出に用いる用途に関する。

本発明は更に、予防又は治療有効量の本発明の第１の態様のいずれか一項の二重特異性抗体又はその抗原結合部分を必要な被験者に投与する工程を含む、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）の予防及び／又は治療方法に関する。

本発明は更に、予防又は治療有効量の本発明の第２の態様のいずれか一項の混合物を必要な被験者に投与する工程を含む、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）の予防及び／又は治療方法に関する。

本発明は更に、本発明の第１の態様のいずれか一項の二重特異性抗体又はその抗原結合部分を使用する工程を含む、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）の診断方法に関する。

本発明は更に、本発明の第２の態様のいずれか一項の混合物を使用する工程を含む、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）の診断方法に関する。

本発明は更に、本発明の第３の態様のいずれか一項のＨＥＲ２タンパク質の細胞外領域の変異体タンパク質を使用する工程を含む、本発明の第１の態様のいずれか一項の二重特異性抗体若しくはその抗原結合部分又は本発明の第２の態様のいずれか一項の混合物の検出方法に関する。

本発明は更に、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）の予防及び／又は治療に用いる、本発明の第１の態様のいずれか一項の二重特異性抗体又はその抗原結合部分に関する。

本発明は更に、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）の予防及び／又は治療に用いる、本発明の第２の態様のいずれか一項の混合物に関する。

以下、本発明を更に説明する。

本発明において、「抗体」という用語は、一般に２対の同じポリペプチド鎖（各対が１本の「軽」（Ｌ）鎖と１本の「重」（Ｈ）鎖とを有する）からなる免疫グロブリン分子を指す。抗体の軽鎖はκ軽鎖とλ軽鎖とに分けることができる。重鎖はμ、δ、γ、α又はεに分けることができ、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義する。軽鎖及び重鎖では、可変領域と定常領域とが約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖には約３つ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域が更に含まれている。各重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）とからなる。重鎖定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とからなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。抗体の定常領域は免疫グロブリンと宿主組織又は宿主因子とを媒介することができ、これには免疫系の各種細胞（例えば、エフェクター細胞）と代表的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）との結合が含まれる。ＶＨ領域及びＶＬ領域は更に、変化しやすい領域（相補性決定領域（ＣＤＲ））に細分することができ、その間には保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）という領域が分散している。各ＶＨ及びＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でＮ末端からＣ末端まで配列された３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなる。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）はそれぞれ、抗体結合部位を形成している。アミノ酸から各領域又はドメインまでの割り当ては、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７ａｎｄ１９９１））、又はＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ他（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８−８８３の定義に従うものとする。「抗体」という用語は、いずれかの特定の抗体生産方法に制限されるものではない。抗体には特に、例えば、組換え抗体と、モノクローナル抗体と、ポリクローナル抗体とが含まれる。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のサブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体とすることができる。

本発明において、抗体の「抗原結合部分」という用語は、全長抗体の１つ又は複数の部分を指し、上記部分は抗体により結合される同一抗原（例えばＨＥＲ２）を結合する能力を保持しており、抗原に対する特異的結合が完全抗体と競合する。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．、ｅｄ．第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）は、全ての目的で引用することにより本明細書の一部をなす。組換えＤＮＡ技術又は完全抗体の酵素触媒作用若しくは化学的切断によって抗原結合部分を産生することができる。いくつかの場合では、抗原結合部分には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ及び相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重特異性抗体（diabody）、並びにこのようなポリペプチドが含まれており、ポリペプチドに特異的抗原結合能力を与えるのに十分な抗体の少なくとも一部分が含まれる。当業者に既知の通常の技術（例えば、組換えＤＮＡ技術、酵素触媒作用又は化学的切断法）によって、所定の抗体（例えばモノクローナル抗体２Ｅ１２）から抗体の抗原結合部分（例えば、上記抗体フラグメント）を得ると共に、完全抗体に対する方式と同じ方式で抗体の抗原結合部分を特異的にスクリーニングすることができる。

本発明において、「Ｆｄフラグメント」という用語はＶ_Ｈドメイン及びＣ_Ｈ１ドメインからなる抗体フラグメントを意味し、「Ｆｖフラグメント」という用語は抗体の片腕のＶ_Ｌドメイン及びＶ_Ｈドメインからなる抗体フラグメントを意味し、「ｄＡｂフラグメント」という用語はＶ_Ｈドメインからなる抗体フラグメントを意味する（Ｗａｒｄ他、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６（１９８９））。「Ｆａｂフラグメント」という用語はＶ_Ｌドメイン、Ｖ_Ｈドメイン、Ｃ_Ｌドメイン及びＣ_Ｈ１ドメインからなる抗体フラグメントを意味し、「Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント」という用語はヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む抗体フラグメントを意味する。

本発明において、「抗体Ｆｃフラグメント」という用語は、習熟した技術者に既知の用語であり、抗体のパパイン消化に基づいて定義されるものであり、ヒト免疫グロブリン鎖の定常領域、特に免疫グロブリン重鎖定常領域のＣ末端又はその一部を指す。例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域には、重鎖ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４の２つ以上のドメインと免疫グロブリンのヒンジ領域との組合せを含むことができる。重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは異なるタイプに分けることができる。主に５つのタイプの免疫グロブリンが存在する。すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭであり、免疫グロブリンのいくつかは、更にサブタイプ（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−４、ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２に分けることができる。特定の免疫グロブリンのタイプ及びサブタイプからの特定の免疫グロブリンのＦｃ領域の選択は、当業者の能力の範囲内である。

本発明の一実施の形態において、本発明に用いられる抗体Ｆｃフラグメントには、少なくとも１つの免疫グロブリンのヒンジ領域と、１つのＣＨ２ドメインと、１つのＣＨ３ドメインとが含まれており、例えばヒトＩｇＧ１ Ｆｃである。

本発明において、「二重特異性抗体」という用語は、それぞれ２種類の抗原又は抗原エピトープに結合することができるものであり、これには、第１の抗原又は抗原エピトープに特異的に結合可能な抗体の軽鎖及び重鎖と、第２の抗原又は抗原エピトープに特異的に結合可能な抗体の軽鎖及び重鎖とが含まれる。本発明の一実施の形態において、上記二重特異性抗体のうち第１の抗原又は抗原エピトープに特異的に結合可能な抗体の軽鎖と、第２の抗原又は抗原エピトープに特異的に結合可能な抗体の軽鎖とは、同じ配列を有する。本発明の一実施の形態において、上記二重特異性抗体のうち第１の抗原又は抗原エピトープに特異的に結合可能な抗体の重鎖と、第２の抗原又は抗原エピトープに特異的に結合可能な抗体の重鎖とは、異なる配列を有する。

本発明において、「エピトープ」又は「抗原エピトープ」という用語は、抗原において免疫グロブリン又は抗体により特異的に結合される部位を指す。当該分野では「エピトープ」は「抗原決定基」とも呼ばれる。エピトープすなわち抗原決定基は、一般に、分子の化学的界面活性基、例えばアミノ酸、炭水化物又は糖の側鎖からなり、一般に、特定の三次元構造特性と、特定の電荷特性とを有している。例えば、エピトープには、一般に、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個の連続又は非連続のアミノ酸が独特の空間配置で含まれており、「線状」であっても、「立体構造」であってもよい。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ、Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい。線状エピトープでは、タンパク質と相互作用分子（例えば抗体）との間の全ての相互作用点は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に存在している。立体構造エピトープでは、相互作用点は互いに離間したタンパク質アミノ酸残基にわたって存在している。

本発明において、２０種類の通常のアミノ酸及びその略称は通常の用法に従っている。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ及びＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ、Ｅｄｓ．、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．（１９９１））は、引用することにより本発明の一部をなす。

本発明において、異なる抗原又は抗原エピトープに対する２株のモノクローナル抗体（すなわち、オリジナル抗体）の軽鎖配列（特に、可変領域の配列）に関して解析及び検証を行っており、２株のモノクローナル抗体の重鎖に結合可能な共通軽鎖を取得している。当該共通軽鎖は重鎖に結合した場合にも、オリジナルモノクローナル抗体の抗原又は抗原エピトープに特異的に結合することができる。

本発明において、当該共通軽鎖は二重特異性抗体の発現に用いることも、２種類の抗体を含む混合物の発現に用いることもできる。二重特異性抗体の発現の場合、当該抗体には、第１の種類の抗原に結合可能な軽鎖及び重鎖と、第２の種類の抗原に結合可能な軽鎖及び重鎖とが含まれ、このうちの２本の軽鎖の配列は完全に同一であり、すなわち、当該共通軽鎖である。抗体混合物の発現の場合には、各種の抗体にはそれぞれ２本の軽鎖及び重鎖が含まれ、このうち軽鎖の配列は完全に同一であり、すなわち、当該共通軽鎖である。

本発明において、上記２株のオリジナル抗体の軽鎖定常領域はκ型又はλ型とすることができる。上記κ型軽鎖定常領域には各種のアロタイプ、例えば、Ｋｍ１、Ｋｍ１，２、Ｋｍ３が含まれ、上記λ型軽鎖定常領域には各種のアロタイプ、例えば、ＣＬ１、ＣＬ２、ＣＬ３、ＣＬ６及びＣＬ７が含まれる。

当該分野で既知の通り、抗原及び抗体に対する可変領域の特異的結合が極めて重要であり、したがって、抗体の改変又は取得の場合には、可変領域の配列に対する選択及び改変が特に肝要である。したがって、本発明において、本発明の共通軽鎖を有する二重特異性抗体又は抗体混合物を取得する場合には、まず、当該共通軽鎖の可変領域を取得する必要がある。本発明の上述した方法に基づいて１株のオリジナルモノクローナル抗体の軽鎖可変領域又はその変異配列を当該共通軽鎖の可変領域として選択した後に、当該共通軽鎖の定常領域を確定する。通常の場合には、当該共通軽鎖の可変領域が確定された方のモノクローナル抗体の軽鎖定常領域を当該共通軽鎖の定常領域として選択する。当然ながら、いくつかの場合には、他方のモノクローナル抗体の軽鎖定常領域を共通軽鎖の定常領域として選択してもよい。必要な場合には、当該分野の既知の技術に基づいて、より適切な共通軽鎖の定常領域を取得するように、オリジナルの軽鎖定常領域に対して改変（例えば、アミノ酸の付加、欠失又は変異等）を行うことができ、例えば、より良好なＡＤＣＣ、ＣＤＣ、エンドサイトーシス、安定性、免疫原性又は半減期等を改変によって有するようにすることができる。

本発明において、２株のオリジナル抗体の重鎖のタイプは、同一であっても、異なっていてもよく、タイプが同一であることが好ましい。本発明の一実施の形態において、二重特異性抗体及び抗体混合物を調製する場合には、オリジナル抗体と比較して、重鎖配列の可変領域及びＣＨ１ドメインの配列は変わらない。

本発明において、上記二重特異性抗体における２つの腕又は２種類の抗体を含む混合物における抗体はいずれも、２株のオリジナルモノクローナル抗体に由来するものである。二重特異性抗体又は抗体混合物を構築する場合には、共通軽鎖を取得するように、軽鎖可変領域の配列のみ改変する必要があり、重鎖可変領域の配列を改変する必要はない。つまり、構築される二重特異性抗体及び抗体混合物において、抗体の重鎖可変領域の配列はオリジナル抗体と同じものとすることができるが、少なくとも１つの軽鎖可変領域の配列はオリジナル抗体とは異なっている。

本発明において、それぞれの必要又は目的に応じて、２種類のオリジナルモノクローナル抗体を選択することができ、例えば、同一抗原の異なる抗原エピトープに対する２株のモノクローナル抗体を選択することができ、このうちの一方の抗体は腫瘍細胞表面の関連抗原に結合してもよく、他方の抗体は細胞を更に殺傷するように免疫エフェクター細胞をトリガーしてもよい。

本発明の実施の形態において、二重特異性抗体を調製する場合には、抗体の発現の際にヘテロダイマータンパク質の形成にとってより有利になるように、従来技術を用いて重鎖、例えばＦｃフラグメントを改変することができる。

本発明の実施の形態において、抗体混合物を調製する場合には、抗体の発現の際にホモダイマータンパク質の形成にとってより有利になるように、従来技術を用いて重鎖、例えばＦｃフラグメントを改変することができる。

本発明において、ホモダイマータンパク質又はヘテロダイマータンパク質にとってより有利になるように抗体の重鎖のＦｃフラグメントを改変する技術は、当該分野で既知であり、例えば、非特許文献３、非特許文献１、特許文献１、特許文献２を参照することができる。

本発明の実施の形態において、図１に示すように、異なる抗原認識エピトープを有するポリペプチドの融合に用いる技術は、具体的な実施例におけるヘテロダイマーＦｃ融合技術を含むが、これに限定されるものではなく、「Ｆａｂ」技術であってもよい。

本発明の実施の形態において、本発明で用いられるヘテロダイマーＦｃ融合技術は、「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」モデルであってもよく、「電荷反発」モデルであってもよいが、この２種類のモデルに限定されるものではない。

本発明の実施の形態において、本発明で用いられる単一の組換え細胞において生産調製可能な抗体混合物のプラットフォームは、「電荷反発」モデルとすることができるが、このモデルに限定されるものではない。

本発明のいくつかの実施の形態において、二重特異性抗体又は抗体混合物の調製に用いる場合には、上記核酸分子が、第１の抗原に対する抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードするか、又は第２の抗原に対する抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードする。本発明の実施の形態において、上記軽鎖が共通軽鎖である。本発明の実施の形態において、上記重鎖のＦｃフラグメントが改変されている。

本発明のいくつかの実施の形態において、上記ベクターはクローニングベクター又は発現ベクターとすることができる。上記クローニングベクターは抗体の関連フラグメントのクローニングに用いられる、上記発現ベクターは二重特異性抗体又は抗体混合物の発現に用いられる。当該分野の既知の常識により、抗体の発現に適したベクターを選択することができる。本発明の具体的な実施形態において、上記発現ベクターはｐｃＤＮＡ４ｍであり、ベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡをベースとして改変して得られたベクターである。

本発明のいくつかの実施の形態において、上記発現ベクターには、第１の抗原に対する抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードする核酸分子、又は第２の抗原に対する抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードする核酸分子が含まれる。

本発明のいくつかの実施の形態において、上記宿主細胞が、抗体の発現に適した宿主細胞であり、例えば、原核細胞（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ）又は真核細胞である。上記真核細胞が、例えば、酵母細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞であり、上記哺乳動物細胞が、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又は骨髄腫細胞等である。

本発明のいくつかの実施の形態において、上記宿主細胞には、第１の抗原に対する抗体の軽鎖及び／又は重鎖を発現する発現ベクターと、第２の抗原に対する抗体の軽鎖及び／又は重鎖を発現する発現ベクターとが同時に含まれる。本発明の具体的な実施の形態において、上記軽鎖が共通軽鎖である。本発明の実施の形態において、上記重鎖のＦｃフラグメントは改変されている。二重特異性抗体の発現に用いる場合には、異なる抗原に対する抗体の軽鎖及び重鎖が更に容易に結合するようにＦｃフラグメントを改変して、二重特異性抗体を形成する。抗体混合物の発現に用いる場合には、同一抗原に対する抗体の軽鎖及び重鎖が更に容易に結合するようにＦｃフラグメントを改変して、抗体混合物を形成する。

二重特異性抗体又は抗体混合物は、標準的実験手段によって宿主細胞から精製することができる。精製方法は、クロマトグラフィー法、例えばサイズ排除、イオン交換、アフィニティークロマトグラフィー及び限外濾過を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の実施の形態において、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーによって二重特異性抗体及び抗体混合物を精製する。

本発明において、本発明の二重特異性抗体若しくはその抗原結合部分又はその混合物は、更に化学療法薬及び／又は他の抗体と併用することができ、したがって、本発明の組成物は、化学療法薬及び／又は他の抗体を更に含むことができる。

本発明において、上記化学療法薬は、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シクロホスファミド、タキサン類（パクリタキセル（タキソール）及びドセタキセル（タキソテール））、カペシタビン（ゼロータ）、ゲムシタビン（ジェムザール）、ビノレルビン（ナベルビン）、タモキシフェン、アロマターゼ阻害薬（アリミデックス、フェマーラ、アロマシン）、５−ＦＵ＋フォリン酸、イリノテカン（カンプトサール）、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エストラムスチン、ミトキサントロン（ノバントロン）、プレドニゾン、ビンクリスチン（オンコビン）等、又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明において、ＨＥＲ２タンパク質の変異によって、ペルツズマブ及びハーセプチンのうちの１つのみと特異的に結合可能なＨＥＲ２タンパク質変異体を調製して得た。本発明の実施の形態において、これらの変異体を用いて、二重特異性抗体及び抗体混合物を同定している。

本発明において、二重抗原サンドイッチＥＬＩＳＡ（別名ブリッジングＥＬＩＳＡ）法によって、変異したＨＥＲ２タンパク質を結合して、抗体が二重特異性抗体であるか否か、又は抗体混合物にホモダイマータンパク質が含まれているか否かを同定すると共に、更に二重特異性抗体又は抗体混合物中のホモダイマータンパク質を定量する。

本発明において、上記二重抗原サンドイッチＥＬＩＳＡ法は当該分野で既知である。その動作原理としては、固相担体に連結された抗原と酵素標識抗原とをサンプル中の被検出抗体分子の２つの抗原結合部位にそれぞれ結合させて、固相抗原−抗体−酵素標識抗原免疫複合体を形成する。この方法には例えば以下の検出工程が含まれる。（１）固相担体に特異的抗原をコーティングする。一定の時間インキュベートし、固相抗原を形成させて、結合していない抗原及び夾雑物を洗浄し、除去する。（２）被験サンプルを加え、インキュベートし、被験サンプル中の抗体と固相担体上の抗原とを十分に反応させて、固相抗原抗体複合体を形成する。結合していない他の物質を洗浄し、除去する。（３）酵素標識抗原を加え、インキュベートし、固相抗原−被験抗体−酵素標識抗原サンドイッチ複合体を形成させる。結合していない酵素標識抗原を洗浄し、除去する。（４）基質を加えて発色させる。固相上の酵素触媒基質に有色産物が産生し、比色によって被験サンプル中の抗体の量を測定する。

本発明において、上記ＨＥＲ２陽性腫瘍には、ＨＥＲ２タンパク質が過剰発現した腫瘍（例えば、乳癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌及び頭頸部癌）も含まれ、ＨＥＲ２タンパク質が低発現した腫瘍（例えば、ＨＥＲ２が低発現した乳癌、胃癌、肺癌等）も含まれる。

本発明は、２株の異なるモノクローナル抗体の軽鎖配列の解析を通じて、２株のモノクローナル抗体の重鎖にそれぞれ結合可能な共通軽鎖を取得しており、その上で、共通軽鎖を有する二重特異性抗体及び抗体混合物を調製しており、当該方法により調製された二重特異性抗体及び抗体混合物が良好な結合特性と、生物活性と、安定性とを有すると共に生物活性的にはオリジナル抗体よりも優れている可能性があることを実験により証明している。

当該共通軽鎖の技術はシンプルであり、制御可能であり、抗体の安定性、活性及び純度に影響を与えない場合には、二重特異性抗体における重軽鎖のミスマッチという難題が効果的に解決される。さらに、抗体混合物について、同一宿主細胞において発現させることができ、混合細胞集団の培養の難しさを回避することができ、増幅生産にとってより効果的である。

ヘテロダイマータンパク質の融合の概略図である。図１のａはヘテロダイマーＦｃ融合技術を示し、図１のｂは「Ｆａｂ」技術を示す。 ペルツズマブ及びトラスツズマブの軽鎖の高度可変領域の認識を示す図である。図２のＡはペルツズマブの軽鎖の高度可変領域の認識結果であり、図２のＢはトラスツズマブの軽鎖の高度可変領域の認識結果であり、図２のＣはペルツズマブ及びトラスツズマブの軽鎖配列の比較並びに抗原界面アミノ酸の総合解析結果である。 トラスツズマブＦａｂフラグメント及びＨｅｒ２細胞外領域（ＥＣＤ）の構造図である。 Ｈｅｒ２ｍ１及びＨｅｒ２ｍ２変異体タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動解析結果を示す図である（１８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元条件）。１はＨＥＲ２ｍ１であり、２はＨＥＲ２ｍ２であり、Ｍはタンパク質質量基準である。 トラスツズマブ又はペルツズマブに対するＨＥＲ２変異体タンパク質の特異的結合のＥＬＩＳＡ法による検出を示す図である。 シングルステップアフィニティークロマトグラフィー精製により得られた共通軽鎖モノクローナル抗体タンパク質サンプルの非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる一次検出を示す図である（１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元条件）。１〜６はＴｍａｂＣＬＣ１〜ＴｍａｂＣＬＣ６であり、７〜１２はＰｍａｂＣＬＣ１〜ＰｍａｂＣＬＣ６であり、Ｍはタンパク質質量基準である。 特異的抗原ＨＥＲ２ｍ１に対する共通軽鎖付きトラスツズマブの親和力を示す図である。 特異的抗原ＨＥＲ２ｍ２に対する共通軽鎖付きペルツズマブの親和力を示す図である。 シングルステップアフィニティークロマトグラフィー精製により得られたＫＮ０２６抗体タンパク質サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる一次検出を示す図である（１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元条件）。１はＫＮ０２６の一過性発現細胞の培養上清であり、２はＫＮ０２６のアフィニティークロマトグラフィーのフロースルーであり、３はＫＮ０２６のシングルステップアフィニティークロマトグラフィー後に精製したタンパク質サンプル（還元）であり、４はＫＮ０２６のシングルステップアフィニティークロマトグラフィー後に精製したタンパク質サンプル（非還元）であり、Ｍはタンパク質質量基準である。 ＫＮ０２６の抗体タンパク質の純度のＳＥ−ＨＰＬＣ検出結果を示す図である。 二重特異性抗体ＫＮ０２６が２種類の抗原を認識する親和曲線である。 シングルステップアフィニティークロマトグラフィー精製により得られたＫＮ０１０抗体タンパク質サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる一次検出を示す図である（１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元条件）。 混合抗体タンパク質ＫＮ０２６の純度のＳＥ−ＨＰＬＣ検出結果を示す図である。 混合抗体タンパク質ＫＮ０２６が２種類の抗原を認識する親和曲線ある。 Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体（ＫＮ０２６）、ペルツズマブ及びトラスツズマブとＢＴ４７４細胞との結合の濃度依存性曲線である。 Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体（ＫＮ０２６）、ペルツズマブ及びトラスツズマブとＮ−８７細胞との結合の濃度依存性曲線である。 Ｐｍａｂ／Ｔｍａｂ抗体混合物（ＫＮ０１０）、ペルツズマブ及びトラスツズマブとＢＴ４７４細胞との結合の濃度依存性曲線である。 ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞の増殖に対するＫＮ０２６、トラスツズマブ及びトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用薬の抑制作用を示す図である。 ヒト胃癌Ｎ−８７細胞の増殖に対するＫＮ０２６、トラスツズマブ及びトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用薬の抑制作用を示す図である。 Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体ＫＮ０２６（薄い色の曲線）及びトラスツズマブ標準試料（濃い色の曲線）の熱安定性（Ｔｍ値）の検出を示す図である。 ＫＮ０２６及びトラスツズマブの薬物動態曲線である。 ヒト卵巣癌ＳＫＯＶ３のヌードマウス移植腫瘍の腫瘍体積に対するＰｔｍａｂ二重特異性抗体の影響を示す図である。 ヒト胃癌Ｎ−８７のヌードマウス移植腫瘍の腫瘍体積に対するＰｔｍａｂ二重特異性抗体の影響を示す図である。 ヒト胃癌Ｎ−８７のヌードマウス移植腫瘍の腫瘍体積に対するＰＴｍａｂ二重特異性抗体の影響を示す図である。 抗体が二重特異性抗体であるか否かの検出方法及び定量方法の概略図である。 抗体混合物がホモダイマータンパク質であるか否かの検出方法の概略図である。 ＨＥＲ２低発現腫瘍株のヒト非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ５２２のマウス移植腫瘍モデルに対するＰＴｍａｂ二重特異性抗体の用量依存性を示す図である。 ＨＥＲ２低発現腫瘍株のヒト非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ５２２のマウス移植腫瘍モデルに対するＰＴｍａｂ二重特異性抗体の薬効作用が等モル数のトラスツズマブ標品＋等モル数のペルツズマブ標品の併用時に相当することを示す図である。

以下、実施例を参照して本発明の実施形態を詳細に説明するが、以下の実施例は単に本発明を例示するのみであり、本発明を限定するものとみなすべきでないことが当業者には理解されよう。具体的な条件が与えられていない実施例は、従来の条件又は製造者により提示された条件に従って実施される。製造業者が与えられていない試薬又は機器は、全て従来の市販製品である。

実施例１ 共通軽鎖の取得
１．配列及び構造の取得
タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ、www.pdb.org）から、トラスツズマブ及びペルツズマブの複合体の結晶構造を取得する。トラスツズマブのＰＤＢコードは１Ｎ８Ｚであり、ペルツズマブのＰＤＢコードは１Ｓ７８である。ＣＨ３−ＣＨ３間のアミノ酸接触を認識することができる２つのスクリーニング戦略がある。すなわち、（ｉ）アミノ酸が作用する距離と（ｉｉ）溶媒露出領域の解析とである。ここでは、アミノ酸が作用する距離に基づいてスクリーニングを実施する。

２．モノクローナル抗体の軽鎖及び抗原ＨＥＲ２の界面アミノ酸の取得
アミノ酸接触ルールに基づいて、界面アミノ酸とは、側鎖の重原子と、別の１本鎖のいずれか１つのアミノ酸の重原子との間の距離が或る閾値よりも低いアミノ酸を指す。ここでは閾値として４．５オングストロームを選択した。一部の文献では５．５オングストロームを選択することもできる（Ｂａｈａｒ及びＪｅｒｎｉｇａｎ １９９７）。表１はトラスツズマブ軽鎖と抗原ＨＥＲ２とが相互作用するアミノ酸リストである。表１の記載はアミノ酸接触スクリーニングルールによってスクリーニングされたトラスツズマブの１２個の界面アミノ酸である。

表２はペルツズマブ軽鎖と抗原ＨＥＲ２とが相互作用するアミノ酸リストである。表２の記載はアミノ酸接触スクリーニングルールによってスクリーニングされたペルツズマブの８個の界面アミノ酸である。

３．ペルツズマブ及びトラスツズマブの軽鎖の高度可変領域（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）の認識
ペルツズマブ及びトラスツズマブの軽鎖を高度可変領域認識システム、すなわちｋａｂａｔ番号によって認識した。認識ソフトはhttp://www.bioinf.org.uk/abs/abnum/とした。ペルツズマブの軽鎖の高度可変領域の認識結果は図２のＡに示され、トラスツズマブの軽鎖の高度可変領域の認識結果は図２のＢに示されている。

４．ペルツズマブ及びトラスツズマブの軽鎖配列の比較並びに軽鎖と抗原との界面アミノ酸の総合解析
ペルツズマブ及びトラスツズマブの軽鎖配列の比較並びに抗原界面アミノ酸の総合解析結果が図２のＣに示されている。ペルツズマブ（Ｐ−ｍａｂ）及びトラスツズマブ（Ｔ−ｍａｂ）の軽鎖と抗原との接触アミノ酸には背景の色を黒で示している。トラスツズマブの軽鎖を共通軽鎖とすると、当該共通軽鎖における抗原に接触する界面アミノ酸と、ペルツズマブ（Ｐ−ｍａｂ）軽鎖における界面アミノ酸とを比較して得られた相違アミノ酸は、表３に示されている。

ペルツズマブの軽鎖を共通軽鎖とすると、当該共通軽鎖における抗原に接触する界面アミノ酸と、トラスツズマブ（Ｔ−ｍａｂ）軽鎖における界面アミノ酸とを比較して得られた相違アミノ酸は、表４に示されている。

ペルツズマブ（Ｐ−ｍａｂ）及びトラスツズマブ（Ｔ−ｍａｂ）の軽鎖と抗原とが接触する相違アミノ酸の解析から、それぞれ、フレームワークとしてトラスツズマブ（Ｔ−ｍａｂ）の軽鎖を選択し、Ｔ３１Ｉ及び／又はＴ９４Ｙの変異を導入して、Ｐ−ｍａｂ／Ｔ−ｍａｂ二重特異性抗体の共通軽鎖配列ＣＬＣ１〜ＣＬＣ４を取得し、フレームワークとしてペルツズマブ（Ｐ−ｍａｂ）の軽鎖を選択し、Ｔ３１Ｉ及び／又はＹ９４Ｔの変異を導入して、Ｐ−ｍａｂ／Ｔ−ｍａｂ二重特異性抗体の共通軽鎖配列ＣＬＣ５〜ＣＬＣ６を取得する。各共通軽鎖のアミノ酸配列は以下の通りである。

ＣＬＣ１
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１）

ＣＬＣ２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２）

ＣＬＣ３
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＹＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号３）

ＣＬＣ４
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＹＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４）

ＣＬＣ５
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＩＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号５）

ＣＬＣ６
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＩＴＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号６）

実施例２ 抗原タンパク質ＨＥＲ２変異体タンパク質の調製及び機能の検証
１．ペルツズマブのみに結合するＨＥＲ２変異体タンパク質の設計
１９９３年にＲｏｂｅｒｔ Ｆ．Ｋｅｌｌｅｙ’ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｐ．Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌがトラスツズマブ及び対応する変異とＨＥＲ２細胞外領域（ＥＣＤ）との結合の動態パラメータを開示した。このうち、Ｈ９１Ａ、Ｒ５０Ａ、Ｗ９５Ａ、Ｙ１００ａＡはトラスツズマブとＨＥＲ２細胞外領域との結合に対して重大な影響を及ぼしている。２００３年にＨｙｕｎ−Ｓｏｏ ＣｈｏグループがトラスツズマブＦａｂフラグメントとＨＥＲ２細胞外領域（ＥＣＤ）との複合体を結晶化した（ＰＤＢコード：１Ｎ８Ｚ）。その結果がＮａｔｕｒｅに発表されている。トラスツズマブＦａｂフラグメントとＨＥＲ２細胞外領域（ＥＣＤ）（その配列は配列番号１８により示される）との複合体の構造を解析することによって、表５に示すように、トラスツズマブＦａｂフラグメントとＨＥＲ２細胞外領域（ＥＣＤ）との界面接触アミノ酸を取得した。

主にＨ９１Ｌ、Ｒ５０Ｈ、Ｗ９５Ｈ、Ｙ１００ａＨが接触するアミノ酸を解析して、これらのアミノ酸結合に対して重要な作用がある可能性がある２つの組合せを発見した。組合せ１はＡＳＰ５７０、ＰＲＯ５７１及びＰＲＯ５７２であり、組合せ２はＧＬＵ５５８及びＰＨＥ５７３である。

以上の結果から、以下のことが分かる。

組合せ１については、Ｐ５７１、Ｐ５７２自身がＦａｂのいくつかのキーアミノ酸と共に作用力の形成を有している。この２つのアミノ酸が、自身の構造の安定性に変異が影響するようなループ（ターン）に位置していると考えられる。

組合せ２については、ＧＬＵ５５８がＴ−ｍａｂのＦａｂ重鎖ＡＲＧ５０とイオン結合を形成しており、Ｆａｂ重鎖の複数のアミノ酸とファンデルワールス力を形成しており、Ｔ−ｍａｂのＦａｂとＨＥＲ２とを遮断可能な作用が破壊され、したがって、ＧＬＵ５５８→ＡＬＡ５５８を選択する。ＰＨＥ５７３がＦａｂ重鎖の複数のアミノ酸とファンデルワールス力を形成しており、これにはキーアミノ酸ＡＲＧ５０８、ＴＲＰ９９、ＴＹＲ１０５が含まれており、ＦａｂとＨＥＲ２とを遮断可能な作用が破壊され、したがって、ＰＨＥ５７３→ＡＬＡ５７３を選択する。

以上の解析結果は図３を参照することができる。

２．トラスツズマブのみに結合するＨＥＲ２変異体タンパク質の設計
Ｍａｔｔｈｅｗ Ｃ．ＦｒａｎｋｌｉｎがＣａｎｃｅｒ ｃｅｌｌにおいて、ペルツズマブＦａｂとＨＥＲ２細胞外ドメインとの複合体の構造を開示している。また、このグループはアラニンスキャニングの手法によって、ＨＥＲ２のいずれのキーアミノ酸がペルツズマブＦａｂとの結合に影響するかを研究している。この研究によると、ＨＥＲ２タンパク質表面のＨ２９６、Ｓ２８８、Ｌ２９５等のアミノ酸に明らかな作用があり、本発明では、Ｓ２８８Ａ／Ｈ２９６Ａの二重変異を選択して、トラスツズマブのみに結合するＨＥＲ２抗原の取得に用いた。

なお、トラスツズマブのみに認識されるＨＥＲ２変異体タンパク質をＨＥＲ２ｍ１とし、ペルツズマブのみに認識されるＨＥＲ２変異体タンパク質をＨＥＲ２ｍ２及びＨＥＲ２ｍ３とする。ＨＥＲ２変異体タンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ以下の通りである。

ＨＥＲ２ｍ１
ＴＱＶＣＴＧＴＤＭＫＬＲＬＰＡＳＰＥＴＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱＧＮＬＥＬＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＤＩＦＨＫＮＮＱＬＡＬＴＬＩＤＴＮＲＳＲＡＣＨＰＣＳＰＭＣＫＧＳＲＣＷＧＥＳＳＥＤＣＱＳＬＴＲＴＶＣＡＧＧＣＡＲＣＫＧＰＬＰＴＤＣＣＨＥＱＣＡＡＧＣＴＧＰＫＨＳＤＣＬＡＣＬＨＦＮＨＳＧＩＣＥＬＨＣＰＡＬＶＴＹＮＴＤＴＦＥＳＭＰＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣＶＴＡＣＰＹＮＹＬＳＴＤＶＧＡＣＴＬＶＣＰＬＡＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬＧＭＥＨＬＲＥＶＲＡＶＴＳＡＮＩＱＥＦＡＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＡＳＮＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＨＮＴＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡＣＨＱＬＣＡＲＧＨＣＷＧＰＧＰＴＱＣＶＮＣＳＱＦＬＲＧＱＥＣＶＥＥＣＲＶＬＱＧＬＰＲＥＹＶＮＡＲＨＣＬＰＣＨＰＥＣＱＰＱＮＧＳＶＴＣＦＧＰＥＡＤＱＣＶＡＣＡＨＹＫＤＰＰＦＣＶＡＲＣＰＳＧＶＫＰＤＬＳＹＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＣＰＩＮＣＴＨＳＣＶＤＬＤＤＫＧＣＰＡＥＱＲＡＳＰＬＴ（配列番号１３）

ＨＥＲ２ｍ２
ＴＱＶＣＴＧＴＤＭＫＬＲＬＰＡＳＰＥＴＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱＧＮＬＥＬＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＤＩＦＨＫＮＮＱＬＡＬＴＬＩＤＴＮＲＳＲＡＣＨＰＣＳＰＭＣＫＧＳＲＣＷＧＥＳＳＥＤＣＱＳＬＴＲＴＶＣＡＧＧＣＡＲＣＫＧＰＬＰＴＤＣＣＨＥＱＣＡＡＧＣＴＧＰＫＨＳＤＣＬＡＣＬＨＦＮＨＳＧＩＣＥＬＨＣＰＡＬＶＴＹＮＴＤＴＦＥＳＭＰＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣＶＴＡＣＰＹＮＹＬＳＴＤＶＧＳＣＴＬＶＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬＧＭＥＨＬＲＥＶＲＡＶＴＳＡＮＩＱＥＦＡＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＡＳＮＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＨＮＴＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡＣＨＱＬＣＡＲＧＨＣＷＧＰＧＰＴＱＣＶＮＣＳＱＦＬＲＧＱＥＣＶＥＥＣＲＶＬＱＧＬＰＲＥＹＶＮＡＲＨＣＬＰＣＨＰＥＣＱＰＱＮＧＳＶＴＣＦＧＰＡＡＤＱＣＶＡＣＡＨＹＫＤＰＡＦＣＶＡＲＣＰＳＧＶＫＰＤＬＳＹＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＣＰＩＮＣＴＨＳＣＶＤＬＤＤＫＧＣＰＡＥＱＲＡＳＰＬＴ（配列番号１４）

ＨＥＲ２ｍ３
ＴＱＶＣＴＧＴＤＭＫＬＲＬＰＡＳＰＥＴＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱＧＮＬＥＬＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＤＩＦＨＫＮＮＱＬＡＬＴＬＩＤＴＮＲＳＲＡＣＨＰＣＳＰＭＣＫＧＳＲＣＷＧＥＳＳＥＤＣＱＳＬＴＲＴＶＣＡＧＧＣＡＲＣＫＧＰＬＰＴＤＣＣＨＥＱＣＡＡＧＣＴＧＰＫＨＳＤＣＬＡＣＬＨＦＮＨＳＧＩＣＥＬＨＣＰＡＬＶＴＹＮＴＤＴＦＥＳＭＰＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣＶＴＡＣＰＹＮＹＬＳＴＤＶＧＳＣＴＬＶＣＰＬＨＮＱＥＶＴＡＥＤＧＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬＧＭＥＨＬＲＥＶＲＡＶＴＳＡＮＩＱＥＦＡＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＡＳＮＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＨＮＴＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡＣＨＱＬＣＡＲＧＨＣＷＧＰＧＰＴＱＣＶＮＣＳＱＦＬＲＧＱＥＣＶＥＥＣＲＶＬＱＧＬＰＲＥＹＶＮＡＲＨＣＬＰＣＨＰＥＣＱＰＱＮＧＳＶＴＣＦＧＰＥＡＤＱＣＶＡＣＡＨＹＫＤＡＡＦＣＶＡＲＣＰＳＧＶＫＰＤＬＳＹＭＰＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡＣＱＰＣＰＩＮＣＴＨＳＣＶＤＬＤＤＫＧＣＰＡＥＱＲＡＳＰＬＴ（配列番号１５）

３．市販の哺乳動物細胞の発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡの改変
市販のベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（Invitrogen、Ｖ８６３−２０）には２つのＰｖｕＩＩ酵素消化部位があり、それぞれ略１４１１ｂｐ及び３１６０ｂｐの位置にある。プラスミドの部位特異的変異について、３１６０ｂｐの位置の塩基ＣをＧに変異させて、この位置のＰｖｕＩＩ酵素消化部位を除去し、略１４１１ｂｐの１つの酵素消化部位のみを残存させた。新しいベクターをｐｃＤＮＡ４ｍとする。

ＮＣＢＩにおけるヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ１（ＩｇＧ１）の結晶性フラグメント（Ｆｃ）のＤＮＡ配列（ＡＹ６２３４２７）に基づいて以下のようにプライマーを設計する。

Ｆ：ＡＡＧＣＴＴＣＣＣＴＴＡＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＡＴＣＣＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣ（配列番号２９）
Ｒ：ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧ（配列番号３０）

なお、フォワードプライマーにはその後のクローニングに用いるＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩの酵素消化部位を加え、リバースプライマーにはＥｃｏＲＩ酵素消化部位を加えた。

ＰＢＭＣの全ｃＤＮＡをテンプレートとし、Ｆｃフラグメントの遺伝子を増殖させた後、Takara社のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩのダブルダイジェストによって改変ベクターｐｃＤＮＡ４ｍにクローニングし、プラスミド構築の正確性をシークエンシング検証して、組換えプラスミドｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｆｃを取得した。

４．ＨＥＲ２変異体タンパク質の真核発現ベクターの構築
ＮＣＢＩにおけるＨＥＲ２タンパク質のＤＮＡ配列情報（ＮＭ＿００４４４８．２）に基づいてプライマーを設計し、野生型ＨＥＲ２タンパク質の細胞外ドメイン（第１位〜第６５２位のアミノ酸残基）をクローニングした。使用したプライマーは以下の通りである。

Ｆ：ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＴ（配列番号３１）
Ｒ：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＴＣＡＧＡＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣ（配列番号３２）

プライマーにはフォワードのＨｉｎｄＩＩＩ認識部位と、リバースのＢａｍＨＩ認識部位が含まれている。ＢＴ４７４細胞（中国科学院上海細胞データバンクから購入）のｃＤＮＡをテンプレートとし、ＨＥＲ２ｗｔの細胞外ドメインをコードする１．９ｋｂ長のＤＮＡ断片を増殖させ、市販のＴベクター（ｐＭＤ１９−Ｔ Ｓｉｍｐｌｅ Ｖｅｃｔｏｒ、Takara社から購入）にクローニングし、Ｔ−Ｈｅｒ２ＥＣＤプラスミドを取得して、配列の正確性をシークエンシングして確認した。

このようにして得たトラスツズマブのみに認識されるＨＥＲ２変異体タンパク質ＨＥＲ２ｍ１と、ペルツズマブのみに認識されるＨＥＲ２変異体タンパク質ＨＥＲ２ｍ２及びＨＥＲ２ｍ３とのアミノ酸配列に基づき、変異部位に応じて、対応する変異プライマーを設計した。

Ｍ１−Ｆ：ＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧ（配列番号３３）
Ｍ１−Ｒ：ＧＧＧＧＧＣＡＧＡＣＧＡＧＧＧＴＧＣＡＡＧＣＴＣＣＣＡＣＧＴ（配列番号３４）
Ｍ２−１−Ｆ：ＧＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＡＣＣＡ（配列番号３５）
Ｍ２−１−Ｒ：ＴＧＧＴＣＡＧＣＣＧＣＣＧＧＴＣＣ（配列番号３６）
Ｍ２−２−Ｆ：ＴＡＴＡＡＧＧＡＣＣＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＧ（配列番号３７）
Ｍ２−２−Ｒ：ＣＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＧＧＧＴＣＣＴＴＡＴ（配列番号３８）
Ｍ３−Ｆ：ＣＴＡＴＡＡＧＧＡＣＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＧ（配列番号３９）
Ｍ３−Ｒ：ＣＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＧＣＧＴＣＣＴＴＡＴＡＧ（配列番号４０）

Ｔ−Ｈｅｒ２ＥＣＤプラスミドをテンプレートとし、上述のプライマーを用いて部位特異的変異を行い、ＨＥＲ２細胞外ドメインの３つの変異体タンパク質（ＨＥＲ２ｍ１、ＨＥＲ２ｍ２、ＨＥＲ２ｍ３）の遺伝子を取得した。その後、Takara社のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩのダブルダイジェストによってベクターｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｆｃにクローニングし、ＨＥＲ２ｍ１、ＨＥＲ２ｍ２、ＨＥＲ２ｍ３の３つの遺伝子をそれぞれＦｃ遺伝子の５’端に融合させて、３つの新しいベクターを取得した。すなわち、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｈｅｒ２ｍ１−Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｈｅｒ２ｍ２−Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｈｅｒ２ｍ３−Ｆｃとする。この３つのベクターは哺乳動物細胞における融合タンパク質ＨＥＲ２ｍ１−Ｆｃ、ＨＥＲ２ｍ２−Ｆｃ、ＨＥＲ２ｍ３−Ｆｃの発現に用いることができる。

５．ＨＥＲ２変異体タンパク質の一過性発現及び精製
トランスフェクションの２日前に、懸濁され順化された２００ｍＬ×３のＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞を一過性トランスフェクション用に用意し、播種密度を０．８×１０^６細胞／ｍＬとした。２日後、トランスフェクションされる細胞懸濁液を計数して細胞密度を３．５×１０^６細胞／ｍＬ〜４×１０^６細胞／ｍＬとし、細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで５分遠心分離して、上清を捨てた。４０ｍＬ×３の新鮮なＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて再び細胞を懸濁し、再度１０００ｒｐｍで５分遠心分離して、上清を捨てた。２００ｍＬ×３のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて再び２９３細胞を懸濁した。実施例２の４で得られた３つのＨＥＲ２変異体タンパク質の発現ベクターを２００μｇずつ取り、２ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いてそれぞれ希釈した。続いて、５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて１．５ｍＬのポリエチレンイミンを希釈し、形質転換に必要なＰＥＩ溶液をセットした。希釈済の２ｍＬの発現用プラスミドに２ｍＬのＰＥＩ溶液をそれぞれ加えて均一に混合し、室温で５分間静置した。３つのプラスミド／ＰＥＩ混合物を３つの２００ｍＬ細胞懸濁液にそれぞれ加えて３７℃、１０％ＣＯ２、９０ｒｐｍで培養した。また、５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１を追加した。４時間後、２００ｍＬのＥＸ２９３培地と、２ｍＭのグルタミンと、５０ｕｇ／ＬのＩＧＦ−１とを各形質転換サンプルにそれぞれ追加して１３５ｒｐｍで培養した。２４時間後、３．８ｍＭのＶＰＡを加えた。

５日〜６日培養した後、３つの４００ｍＬのＨＥＲ２変異体タンパク質細胞の一過性発現培養上清をそれぞれ集め、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー法によって、ＨＥＲ２変異体タンパク質サンプルを予備精製した。なお、ＨＥＲ２ｍ３の発現レベルは非常に低く、その細胞培養上清においてテンプレートのタンパク質の力価は０．５ｍｇ／Ｌ未満であり、これは主にタンパク質の変異体が不安定であることによるものと推測されるので、当該タンパク質については更なる精製を行わなかった。得られたＨＥＲ２ｍ１及びＨＥＲ２ｍ２変異体タンパク質の精製によって算出された発現レベルは約２０ｍｇ／Ｌである。得られたタンパク質サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって一次検出を行い、目的のバンドをはっきりと見ることができた（図４参照）。

６．トラスツズマブ又はペルツズマブに対するＨＥＲ２変異体タンパク質の特異的結合のＥＬＩＳＡ法による検出
トラスツズマブモノクローナル抗体タンパク質又はペルツズマブモノクローナル抗体によりＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、４℃で一晩置く。その後、３％ＢＳＡ溶液を加えて室温で２時間密閉した。被験サンプル（ＨＥＲ２ｍ１又はＨＥＲ２ｍ２タンパク質）は予めビオチンで標識しておき、その後、ビオチン化されたタンパク質ＨＥＲ２ｍ１−Ｂｉｏｔｉｎ及びＨＥＲ２ｍ２−Ｂｉｏｔｉｎを１６μｇ／ｍＬから０．２２４ｎｇ／μＬになるまで１：４の合計９段階で段階希釈した。段階希釈したビオチン化ＨＥＲ２変異体タンパク質サンプルをＥＬＩＳＡプレートに加えて室温で２時間反応させた。その後、ＨＲＰ標識されたストレプトアビジンを加えて室温で１．５時間作用させ、最後に触媒基質を発色させて読み取った。得られたデータは４パラメーターロジスティックによって親和曲線を得た。

図５に示すように、ＨＥＲ２ｍ１タンパク質のペルツズマブに対する見かけの親和性は、そのトラスツズマブに対する見かけの親和性に比べて２０倍低下し、当該変異体タンパク質がトラスツズマブ特異的抗原タンパク質であると考えることができる。一方、ＨＥＲ２ｍ２タンパク質のトラスツズマブに対する見かけの親和性は、トラスツズマブに対する見かけの親和性に比べて２桁超低下し、ペルツズマブ特異的抗原であることを示している。

実施例４ Ｔｍａｂ及びＰｍａｂのオリジナル軽鎖の共通軽鎖による置換並びに共通軽鎖の効果の検証
１．共通軽鎖を伴うＴｍａｂ及びＰｍａｂモノクローナル抗体の真核発現ベクターの構築
米国特許出願公開第２００９／０２８５８３７号明細書により検索されたトラスツズマブ及びペルツズマブの全抗体のアミノ酸配列（特許における図２及び図１６）に基づき、オンラインツールＤＮＡ ｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を利用して、対応するコーディングＤＮＡ配列を設計すると共に、人工合成の手法によってトラスツズマブの重鎖遺伝子（配列番号１６）と、ペルツズマブの重鎖遺伝子（配列番号１７）とを取得した。実施例１で得られた１組の共通軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１〜配列番号６）に基づき、オンラインツールＤＮＡ ｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を利用して、対応するコーディングＤＮＡ配列を設計すると共に、人工合成の手法によってＰｍａｂ−Ｔｍａｂ二重特異性抗体の共通軽鎖遺伝子ＣＬＣ１（配列番号７）及びＣＬＣ５（配列番号１１）を取得した。

その後、ＣＬＣ２〜ＣＬＣ６の配列に基づいて変異プライマーを設計した。配列は以下の通りである。

Ｔ３１Ｉ−Ｆ：ＧＡＣＧＴＧＡＡＣＡＴＴＧＣＣＧＴＴＧＣ（配列番号４１）
Ｔ３１Ｉ−Ｒ：ＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＴＧＴＴＣＡＣＧＴＣ（配列番号４２）
Ｔ９４Ｙ−Ｆ：ＡＧＣＡＣＴＡＴＡＣＴＴＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＴＣ（配列番号４３）
Ｔ９４Ｙ−Ｒ：ＡＴＧＴＴＧＧＡＧＧＡＴＡＡＧＴＡＴＡＧＴＧＣＴＧ（配列番号４４）
Ｙ９４Ｔ−Ｆ：ＴＣＧＣＣＡＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＴＣＡＧ（配列番号４５）
Ｙ９４Ｔ−Ｒ：ＣＴＧＡＣＡＡＴＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡ（配列番号４６）

ＣＬＣ１遺伝子をテンプレートとし、Ｔ３１Ｉ及びＴ９４Ｙの２対のプライマーを用いて部位特異的変異させてＣＬＣ２〜ＣＬＣ４の遺伝子配列（配列番号８〜配列番号１０）を取得した。ＣＬＣ５をテンプレートとし、Ｙ９４Ｔのプライマー対を用いて部位特異的変異させてＣＬＣ６遺伝子配列（配列番号１２）を取得した。

合成されたトラスツズマブの重鎖遺伝子と、ペルツズマブの重鎖遺伝子と、共通軽鎖遺伝子（ＣＬＣ１〜ＣＬＣ６）とは、それぞれTakara社のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩのダブルダイジェストによって改変ベクターｐｃＤＮＡ４ｍにサブクローニングされ、プラスミド構築の正確性をシークエンシング検証して、組換えプラスミドＤＮＡであるｐｃＤＮＡ４ｍ−ＴｍａｂＨＣと、ｐｃＤＮＡ４ｍ−ＰｍａｂＨＣと、共通軽鎖の関連ベクターであるｐｃＤＮＡ４ｍ−ＣＬＣ１〜ｐｃＤＮＡ４ｍ−ＣＬＣ６とを取得した。

このように構築された共通軽鎖の遺伝子発現ベクターｐｃＤＮＡ４ｍ−ＣＬＣ１〜ｐｃＤＮＡ４ｍ−ＣＬＣ６をTakara社のＢｇｌＩＩ、ＰｖｕＩＩでダブルダイジェストした。酵素消化産物は０．８％のアガロースの電気泳動によって分離精製すると共に、それぞれ共通遺伝子を含む約２ｋｂサイズのＤＮＡ断片を回収した。ｐｃＤＮＡ４ｍ−ＴｍａｂＨＣは、ＢｇｌＩＩ、ＮｒｕＩのダブルダイジェストによって、ＴｍａｂＨＣ遺伝子を含む約６ｋｂサイズのＤＮＡ断片を回収した。ｐｃＤＮＡ４ｍ−ＰｍａｂＨＣは、ＢｇｌＩＩ、ＮｒｕＩのダブルダイジェストによって、ＰｍａｂＨＣ遺伝子を含む約６ｋｂサイズのＤＮＡ断片を回収した。続いて、酵素消化処理されたＤＮＡ断片を連結させて、ＴｍａｂＨＣ又はＰｍａｂＨＣの発現原物と、異なる配列の共通軽鎖の発現原物とを１つにまとめて、組換えプラスミドｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｔｍａｂ−ＣＬＣ１、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｔｍａｂ−ＣＬＣ２、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｔｍａｂ−ＣＬＣ３、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｔｍａｂ−ＣＬＣ４、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｔｍａｂ−ＣＬＣ５、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｔｍａｂ−ＣＬＣ６、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｐｍａｂ−ＣＬＣ１、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｐｍａｂ−ＣＬＣ２、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｐｍａｂ−ＣＬＣ３、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｐｍａｂ−ＣＬＣ４、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｐｍａｂ−ＣＬＣ５、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｐｍａｂ−ＣＬＣ６を取得した。

２．共通軽鎖を伴うＴｍａｂ及びＰｍａｂのモノクローナル抗体の一過性発現及び精製
トランスフェクションの２日前に、懸濁され順化された５０ｍＬ×１２のＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞を一過性トランスフェクション用に用意し、播種密度を０．８×１０^６細胞／ｍＬとした。２日後、トランスフェクションされる細胞懸濁液を計数して細胞密度を３．５×１０^６細胞／ｍＬ〜４×１０^６細胞／ｍＬとし、細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで５分遠心分離して、上清を捨てた。１０ｍＬ×１２の新鮮なＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて再び細胞を懸濁し、再度１０００ｒｐｍで５分遠心分離して、上清を捨てた。５０ｍＬ×１２のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて再び２９３細胞を懸濁した。実施例４の１で得られた１２個の共通軽鎖モノクローナル抗体の関連発現ベクターを５０μｇずつ取り、それぞれ０．５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて希釈した。続いて、５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて１．５ｍＬのポリエチレンイミンを希釈し、形質転換に必要なＰＥＩ溶液をセットした。それぞれ、希釈済の０．５ｍＬの発現用プラスミドに０．５ｍＬのＰＥＩ溶液を加えて均一に混合し、室温で５分間静置した。１２個のプラスミド／ＰＥＩ混合物を１２個の５０ｍＬ細胞懸濁液にそれぞれ加えて３７℃、１０％ＣＯ２、９０ｒｐｍで培養した。また、５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１を追加した。４時間後、５０ｍＬのＥＸ２９３培地と、２ｍＭのグルタミンと、５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１とを各形質転換サンプルにそれぞれ追加して１３５ｒｐｍで培養した。２４時間後、３．８ｍＭのＶＰＡを加えた。

５日〜６日培養した後、１２個の１００ｍＬの共通軽鎖モノクローナル抗体細胞の一過性発現培養上清をそれぞれ集め、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー法によって、１２個の共通軽鎖モノクローナル抗体タンパク質サンプル、すなわちＴｍａｂ−ＣＬＣ１〜Ｔｍａｂ−ＣＬＣ６及びＰｍａｂ−ＣＬＣ１〜Ｐｍａｂ−ＣＬＣ６を予備精製した。各モノクローナル抗体の精製によって算出された発現レベルは表６に示されている。

シングルステップアフィニティークロマトグラフィーにより精製して得られたタンパク質サンプルを非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって一次検出した。図６に示すように、全ての共通軽鎖モノクローナル抗体タンパク質について、２５ｋＤａと３５ｋＤａとの間に位置する軽鎖のバンドと、８５ｋＤａと５０ｋＤａとの間に位置する重鎖のバンドとの２つのバンドをそれぞれ還元ゲル上にはっきりと見ることができることが分かる。タンパク質サンプルの純度はＳＥ−ＨＰＬＣによって検出しており、結果は表６に示されている。

３．共通軽鎖を伴うＴｍａｂ及びＰｍａｂのモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ法による親和力解析
共通軽鎖付きトラスツズマブ及びペルツズマブのそれぞれの特異的抗原に対する親和力の変化を検出した。使用した間接ＥＬＩＳＡ法は実施例２の６の記載と類似している。なお、共通軽鎖付きトラスツズマブの親和力の変化を検出する場合には、その特異的抗原タンパク質ＨＥＲ２ｍ１を用いて検出し、共通軽鎖付きペルツズマブの親和力の変化を検出する場合には、その特異的抗原タンパク質ＨＥＲ２ｍ２を用いて検出した。得られた親和力曲線は図７〜図８に示されており、ＥＣ５０に基づいて、オリジナルトラスツズマブの軽鎖が改変された共通軽鎖（ＣＬＣ１〜ＣＬＣ４）を用いた場合には、トラスツズマブのその特異的抗原ＨＥＲ２ｍ１に対する親和力には明らかな変化がなく、ペルツズマブのその特異的抗原ＨＥＲ２ｍ２に対する親和力はやや低下したが、このような変化は許容可能な範囲であると判断した。一方、オリジナルペルツズマブの軽鎖が改変された共通軽鎖（ＣＬＣ５及びＣＬＣ６）を用いた場合には、ペルツズマブのその特異的抗原ＨＥＲ２ｍ２に対する親和力には明らかな変化がなかったが、トラスツズマブのその特異的抗原ＨＥＲ２ｍ１に対する親和力は１倍近く低下した。

実施例５ Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体の調製及び同定
１．Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体の一過性発現及び精製
ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｔｍａｂ−ＣＬＣ１におけるＴｍａｂＨＣのＦｃフラグメントを点突然変異させて、ＴｍａｂＨＣをＴｍａｂＨＣ−ｋｎｏｂ（重鎖配列は配列番号１９により示され、変異した残基はＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗである）とし、更にｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｔｍａｂｋｎｏｂ−ＣＬＣ１を構築した。また、部位特異的変異によって、ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｐｍａｂ−ＣＬＣ１におけるＰｍａｂＨＣ中のアミノ酸残基を、特許文献１を参照してＰｍａｂＨＣ−ｈｏｌｅに（重鎖配列は配列番号２０により示され、変異した残基はＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖである）変異させ、更にｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｐｍａｂｈｏｌｅ−ＣＬＣ１を構築した。具体的な変異の手段は特許文献１を参照されたい。「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」モデルでは、新たに構築されたこの２つのプラスミドが共通軽鎖モデルによってＰｍａｂ−Ｔｍａｂ二重特異性抗体を構築する。

２．Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体の一過性発現及び精製
トランスフェクションの２日前に、懸濁され順化された６００ｍＬのＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞を一過性トランスフェクション用に用意し、播種密度を０．８×１０^６細胞／ｍＬとした。２日後、トランスフェクションされる細胞懸濁液を計数して細胞密度を３．５×１０^６細胞／ｍＬ〜４×１０^６細胞／ｍＬとし、細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで５分遠心分離して、上清を捨てた。１００ｍＬの新鮮なＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて再び細胞を懸濁し、再度１０００ｒｐｍで５分遠心分離して、上清を捨てた。６００ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて再び２９３細胞を懸濁した。ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｔｍａｂｋｎｏｂ−ＣＬＣ１及びｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｐｍａｂｈｏｌｅ−ＣＬＣ１を３００μｇずつ取り、均一に混合した後に、３ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて希釈した。続いて、５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて１．５ｍＬのポリエチレンイミンを希釈し、形質転換に必要なＰＥＩ溶液を調合し、希釈済の３ｍＬの混合プラスミドに３ｍＬのＰＥＩ溶液を加えて均一に混合し、室温で５分間静置した。プラスミド／ＰＥＩ混合物を６００ｍＬの細胞懸濁液に加えて３７℃、１０％ＣＯ２、９０ｒｐｍで培養した。また、５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１を追加した。４時間後、６００ｍＬのＥＸ２９３培地と、２ｍＭのグルタミンと、５０ｕｇ／ＬのＩＧＦ−１とを形質転換サンプルにそれぞれ追加して１３５ｒｐｍで培養した。２４時間後、３．８ｍＭのＶＰＡを加えた。

６日〜７日培養した後、１２００ｍＬのＰｔｍａｂ二重特異性抗体細胞の一過性発現培養上清を集め、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法及び分子ふるいクロマトグラフィー法によって、Ｐｔｍａｂ双特異性タンパク質サンプルを予備精製して、ＫＮ０２６とした。ＯＤ２８０に基づき、ＫＮ０２６の一過性発現レベルが８０ｍｇ／Ｌに達し得ることを算出した。

精製して得られたタンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって一次検出した。図９に示すように、ＫＮ０２６二重特異性抗体タンパク質について、２５ｋＤａと３５ｋＤａとの間に位置する軽鎖のバンドと、８５ｋＤａと５０ｋＤａとの間に位置する重鎖のバンドとの２つのバンドをそれぞれ還元ゲル上にはっきりと見ることができることがわかる。また、非還元条件下では、ＫＮ０２６は１つのバンドであった。タンパク質サンプルの純度はＳＥ−ＨＰＬＣによって検出し、結果は図１０に示されており、純度は約９５％であった。

３．ＫＮ０２６抗体タンパク質がトラスツズマブ及びペルツズマブそれぞれの特異的抗原を同時認識可能であることのブリッジングＥＬＩＳＡ法による検証
トラスツズマブ特異的抗原タンパク質ＨＥＲ２ｍ１によりＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、４℃で一晩置く。その後、３％ＢＳＡ溶液を加えて室温で２時間密閉した。被験サンプルは５μｇ／ｍＬから１．０６ｎｇ／ｕＬになるまで１：３の合計８段階で段階希釈した。段階希釈した被験サンプルをＥＬＩＳＡプレートに加えて室温で２時間反応させた。その後、ビオチン化されたペルツズマブ特異的抗原タンパク質ＨＥＲ２ｍ２−ＢｉｏｔｉｎをＥＬＩＳＡプレートに加えて、室温で被験サンプルと２時間反応させた。続いて、ＨＲＰ標識されたストレプトアビジンを加えて、室温でＨＥＲ２ｍ２−Ｂｉｏｔｉｎと１．５時間作用させ、最後に触媒基質を発色させて読み取った。得られたデータは４パラメーターロジスティックによって親和曲線を得た。

図１１に示すように、２種類の抗原を同時に認識可能な二重特異性抗体ＫＮ０２６である場合に限って親和曲線を得ることができ、１種類の抗原しか特異的に認識することができないトラスツズマブ又はペルツズマブについては最大濃度であっても明らかな発色が見られなかった。

実施例６ Ｐｔｍａｂ抗体混合物の調製及び同定
１．Ｐｔｍａｂ抗体混合物の一過性発現及び精製
ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｔｍａｂ−ＣＬＣ１におけるＴｍａｂＨＣのＦｃフラグメントを点突然変異させて、ＴｍａｂＨＣをＴｍａｂＨＣ−ｍｉｘ１（重鎖配列は配列番号２１により示される）とし、更にｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｔｍａｂｍｉｘ１−ＣＬＣ１を構築した。具体的な変異の手段は特許文献２の実施例１を参照されたい。「電荷反発」混合物モデルでは、新たに構築されたこの２つのプラスミドが、共通軽鎖モデルによって、単一組換え細胞株で発現可能なＰｍａｂ／Ｔｍａｂ抗体混合物を構築する。

２．Ｐｍａｂ／Ｔｍａｂ抗体混合物の一過性発現及び精製
トランスフェクションの２日前に、懸濁され順化された６００ｍＬのＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞を一過性トランスフェクション用に用意し、播種密度を０．８×１０^６細胞／ｍＬとした。２日後、トランスフェクションされる細胞懸濁液を計数して細胞密度を３．５×１０^６細胞／ｍＬ〜４×１０^６細胞／ｍＬとし、細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで５分遠心分離して、上清を捨てた。１００ｍＬの新鮮なＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて再び細胞を懸濁し、再度１０００ｒｐｍで５分遠心分離して、上清を捨てた。６００ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて再び２９３細胞を懸濁した。ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｔｍａｂｍｉｘ１−ＣＬＣ１及びｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｐｍａｂ−ＣＬＣ１（重鎖配列は配列番号２２により所示される）を３００μｇずつ取り、均一に混合した後に、３ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて希釈した。続いて、５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて１．５ｍＬのポリエチレンイミンを希釈し、形質転換に必要なＰＥＩ溶液を調合し、希釈済の３ｍＬの混合プラスミドに３ｍＬのＰＥＩ溶液を加えて均一に混合し、室温で５分間静置した。プラスミド／ＰＥＩ混合物を６００ｍＬの細胞懸濁液に加えて、３７℃、１０％ＣＯ２、９０ｒｐｍで培養した。また、５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１を追加した。４時間後、６００ｍＬのＥＸ２９３培地と、２ｍＭのグルタミンと、５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１とを形質転換サンプにそれぞれ追加して１３５ｒｐｍで培養した。２４時間後、３．８ｍＭのＶＰＡを加えた。

６日〜７日培養した後、１２００ｍＬのＰｍａｂ／Ｔｍａｂ抗体混合物細胞の一過性発現培養上清を集め、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー法によって、Ｐｍａｂ／Ｔｍａｂ抗体混合物タンパク質サンプルを予備精製して、ＫＮ０１０とした。ＯＤ２８０に基づき、ＫＮ０１０の一過性発現レベルが１００ｍｇ／Ｌに達し得ることを算出した。

シングルステップアフィニティークロマトグラフィーにより精製して得られたタンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって一次検出した。図１２に示すように、共通軽鎖混合モノクローナル抗体タンパク質産物について、２５ｋＤａと３５ｋＤａとの間に位置する軽鎖のバンドと、８５ｋＤａと５０ｋＤａとの間に位置する重鎖のバンドとの２つのバンドをそれぞれ還元ゲル上にはっきりと見ることができることがわかる。また、非還元条件下では、ＫＮ０１０は１本のバンドであった。タンパク質サンプルの純度はＳＥ−ＨＰＬＣによって検出し、結果は図１３に示されており、純度は約９５％であった。

３．ＫＮ０１０抗体タンパク質がトラスツズマブ及びペルツズマブそれぞれの特異的抗原をそれぞれ認識可能であることの同一抗原のブリッジングＥＬＩＳＡ法による検証、並びにＫＮ０１０がこの１対の抗原を同時認識不可能なことの異なる抗原のブリッジングＥＬＩＳＡ法による検証
トラスツズマブ特異的抗原タンパク質ＨＥＲ２ｍ１によりＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、４℃で一晩置く。その後、３％ＢＳＡ溶液を加えて、室温で２時間密閉した。被験サンプルは２．５μｇ／ｍＬから０．６１ｎｇ／μＬになるまで１：４の合計７段階で段階希釈した。段階希釈した被験サンプルをＥＬＩＳＡプレートに加えて室温で２時間反応させた。その後、ビオチン化されたペルツズマブ特異的抗原タンパク質ＨＥＲ２ｍ２−Ｂｉｏｔｉｎ、又はビオチン化されたＨＥＲ２ｍ１−ＢｉｏｔｉｎをＥＬＩＳＡプレートに加えて、室温で被験サンプルと２時間反応させた。続いて、ＨＲＰ標識されたストレプトアビジンを加え、室温でＨＥＲ２ｍ２−Ｂｉｏｔｉｎ又はＨＥＲ２ｍ１−Ｂｉｏｔｉｎと１．５時間作用させ、最後に、触媒基質を発色させて読み取った。得られたデータは４パラメーターロジスティックによって親和曲線を得た。

ペルツズマブ特異的抗原タンパク質ＨＥＲ２ｍ２によりＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、４℃で一晩置く。その後、３％ＢＳＡ溶液を加えて、室温で２時間密閉した。被験サンプルは２．５μｇ／ｍＬから０．６１ｎｇ／μＬになるまで１：４の合計７段階で段階希釈した。段階希釈した被験サンプルをＥＬＩＳＡプレートに加えて室温で２時間反応させた。その後、ビオチン化されたペルツズマブ特異的抗原タンパク質ＨＥＲ２ｍ２−ＢｉｏｔｉｎをＥＬＩＳＡプレートに加えて、室温で被験サンプルと２時間反応させた。続いて、ＨＲＰ標識されたストレプトアビジンを加え、室温でＨＥＲ２ｍ２−Ｂｉｏｔｉｎと１．５時間作用させ、最後に、触媒基質を発色させて読み取った。得られたデータは４パラメーターロジスティックによって親和曲線を得た。

図１４に示すように、同一抗原のブリッジングＥＬＩＳＡによって、ＫＮ０１０タンパク質の両腕はトラスツズマブの抗原を同時認識可能であるか、又はペルツズマブの抗原を同時認識可能であることが示された。これはＫＮ０１０タンパク質には少なくとも異なる抗原標的を認識可能な２種類の抗体が含まれていることを意味している。しかし、異なる抗原のブリッジングＥＬＩＳＡでは発色せず、これは、ＫＮ０１０の両腕が２種類の抗原を同時に認識することができないこと、すなわち、ＫＮ０１０にはＰｔｍａｂヘテロダイマーの成分が含まれていないことを示している。

実施例７ 細胞表面ＨＥＲ２タンパク質に対するＰｔｍａｂ二重特異性抗体の結合作用
１．ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞表面ＨＥＲ２タンパク質に対するＰｔｍａｂ二重特異性抗体の結合作用
ＨＥＲ２高発現乳癌細胞ＢＴ４７４と、Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体、ペルツズマブ、トラスツズマブ等のＨＥＲ２抗体との結合状況をフローサイトメーターによって観察すると共に、その作用の濃度依存性を考察した。

ＢＴ４７４細胞を消化後に５％ＢＳＡ／ＰＢＳで再度懸濁して、３×１０^５個／管の細胞を１．５ｍＬの遠沈管それぞれに加えた。被験サンプルは１００μｇ／ｍＬから０．００１６９４μｇ／ｍＬになるまで合計１１個の濃度で３倍希釈した。サンプルを細胞と反応させ、その後、ＦＩＴＣ−ウサギ抗ヒトＩｇＧを加え、細胞に結合した被験抗体を検出して、フローサイトメーターによって平均蛍光値（ＭＦＩ）を読み取った。ＭＦＩで抗体濃度の対数を曲線にし、被験抗体とＢＴ４７４細胞との結合の濃度依存性曲線を４パラメーターロジスティックによって得た。図１５から分かるように、Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体（ＫＮ０２６）、ペルツズマブ及びトラスツズマブはいずれもＢＴ４７４と明らかに結合しており、このような作用には濃度依存性がある。結合曲線のＥＣ５０から分かるように、ＢＴ４７４細胞表面ＨＥＲ２タンパク質に対するＫＮ０２６の親和力はトラスツズマブに近い。

２．ヒト胃癌Ｎ−８７細胞表面ＨＥＲ２タンパク質に対するＰｔｍａｂ二重特異性抗体の結合作用
ＨＥＲ２高発現胃癌細胞Ｎ−８７と、Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体ＫＮ０２６、ペルツズマブ、トラスツズマブ等のＨＥＲ２抗体との結合状況をフローサイトメーターによって観察すると共に、その作用の濃度依存性を考察した。

Ｎ−８７細胞を消化後に５％ＢＳＡ／ＰＢＳで再度懸濁して、３×１０^５個／管の細胞を１．５ｍＬの遠沈管にそれぞれ加えた。被験サンプルは４０μｇ／ｍＬから０．００９７６６ｕｇ／ｍＬになるまで合計１３個の濃度で２倍希釈した。サンプルを細胞と反応させ、その後、ＦＩＴＣ−ウサギ抗ヒトＩｇＧを加え、細胞に結合した被験抗体を検出して、フローサイトメーターによって平均蛍光値（ＭＦＩ）を読み取った。ＭＦＩで抗体濃度の対数を曲線にし、被験抗体とＮ−８７細胞との結合の濃度依存性曲線を４パラメーターロジスティックによって得た。図１６から分かるように、Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体（ＫＮ０２６）、ペルツズマブ及びトラスツズマブはいずれもＮ−８７と明らかに結合しており、このような作用には濃度依存性がある。結合曲線のＥＣ５０から分かるように、Ｎ−８７細胞表面ＨＥＲ２タンパク質に対するＫＮ０２６の親和力は、トラスツズマブ及びペルツズマブよりもやや低い。

実施例８ 細胞表面Ｈｅｒ２タンパク質に対するＰｍａｂ／Ｔｍａｂ抗体混合物の結合作用
ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞表面ＨＥＲ２タンパク質に対するＰｍａｂ／Ｔｍａｂ抗体混合物の結合作用
ＨＥＲ２高発現乳癌細胞ＢＴ４７４と、Ｐｍａｂ／Ｔｍａｂ抗体混合物、ペルツズマブ、トラスツズマブ等のＨＥＲ２抗体との結合状況をフローサイトメーターによって観察すると共に、その作用の濃度依存性を考察した。

ＢＴ４７４細胞を消化後に５％ＢＳＡ／ＰＢＳで再度懸濁して、１５×１０^６個／管の細胞を１．５ｍＬの遠沈管にそれぞれ加えた。被験サンプルは１０００μｇ／ｍＬから０．０１６９４μｇ／ｍＬになるまで合計１１個の濃度で３倍希釈した。サンプルを細胞と反応させ、その後、ＦＩＴＣ−ウサギ抗ヒトＩｇＧを加え、細胞に結合した被験抗体を検出して、フローサイトメーターによって平均蛍光値（ＭＦＩ）を読み取った。ＭＦＩで抗体濃度の対数を曲線にし、被験抗体とＢＴ４７４細胞との結合の濃度依存性曲線を４パラメーターロジスティックによって得た。図１７から分かるように、Ｐｍａｂ／Ｔｍａｂ抗体混合物（ＫＮ０１０）、ペルツズマブ及びトラスツズマブはいずれもＢＴ４７４と明らかに結合しており、このような作用には濃度依存性がある。結合曲線のＥＣ５０から分かるように、ＢＴ４７４細胞表面ＨＥＲ２タンパク質に対するＫＮ０１０の親和力はトラスツズマブとペルツズマブとの間である。

実施例９ Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体の癌細胞増殖の抑制作用
１．ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞の増殖に対するＰｔｍａｂ二重特異性抗体の抑制作用
Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体、ペルツズマブ、トラスツズマブ等のＨＥＲ２抗体存在下におけるＨＥＲ２高発現乳癌細胞ＢＴ４７４の増殖情况の変化をＣＫＫ−８法によって観察して、ＢＴ４７４癌細胞の増殖作用に対するＰｔｍａｂ二重特異性抗体の抑制効果を比較し評価した。

密度を１００００細胞／ウェルとしてＢＴ４７４細胞を９６ウェルプレートに用い、３７℃で１６時間単層培養した。アッセイ培地（ＤＭＥＭ培地、１％のウシ胎児血清を補充）を用いてそれぞれ濃度の異なるサンプルを調合した。最高１０μｇ／ｍｌから０．００１５μｇ／ｍｌになるまで合計９つの濃度で３倍希釈した。１５０μｌのサンプルを各細胞ウェルに加え、７２時間後にＣＫＫ−８キット（DOJINDO）で細胞生存率を測定した。得られた細胞生存率の値についてサンプル濃度の対数をプロットして、被験サンプル（Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体ＫＮ０２６）及び標準製剤（トラスツズマブ及びトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用薬）の細胞殺傷曲線を４パラメーターロジスティックによって得た。

図１８に示すように、ＫＮ０２６、トラスツズマブ、及びトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用薬はいずれもＢＴ４７４に対して明らかに殺傷効果があり、この効果には濃度依存性がある。また、二重特異性抗体ＫＮ０２６は、高濃度の場合には、トラスツズマブの単独使用又はペルツズマブとの併用よりもＢＴ４７４に対する抑制効果が明らかに優れている。

２．ヒト胃癌Ｎ−８７細胞の増殖に対するＰｔｍａｂ二重特異性抗体の抑制作用
Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体、ペルツズマブ、トラスツズマブ等のＨＥＲ２抗体存在下におけるＨＥＲ２高発現胃癌細胞Ｎ−８７の増殖情况の変化をＭＴＴ法によって観察して、Ｎ−８７癌細胞の増殖作用に対するＰｔｍａｂ二重特異性抗体の抑制効果を比較し評価した。

密度を１００００細胞／ウェルとしてＮ−８７細胞を９６ウェルプレートに用い、３７℃で１６時間単層培養した。アッセイ培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地、１％のウシ胎児血清を補充）を用いてそれぞれ濃度の異なるサンプルを調合した。最高１０μｇ／ｍｌから０．００１５μｇ／ｍｌになるまで合計９つの濃度で３倍希釈した。１５０μｌのサンプルを各細胞ウェル中に加え、７２時間後にＣＫＫ−８キット（DOJINDO）で細胞生存率を測定した。得られた細胞生存率の値についてサンプル濃度の対数をプロットして、被験サンプル（Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体）及び標準製剤（トラスツズマブ及びトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用薬）の細胞殺傷曲線を４パラメーターロジスティックによって得た。

図１９に示すように、ＫＮ０２６、トラスツズマブ、及びトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用薬は対していずれも明らかに殺傷効果があり、この効果には濃度依存性がある。また、二重特異性抗体は、高濃度の場合には、トラスツズマブの単独使用又はペルツズマブとの併用よりもＮ−８７に対する抑制効果が明らかに優れている。

実施例１０ Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体の熱安定性の評価
１．Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体のＴｍ値の測定
ＤＳＣ（示差走査熱量計）の方法により、Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体ＫＮ０２６及び対照抗体（ここでは標準製剤としてトラスツズマブを用いる）のＴｍ値を測定すると共に、これにより、Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体の熱安定性を予備的に判断した。

サンプルタンパク質は１×ＰＢＳの緩衝液（ｐＨ７．４）において２ｍｇ／ｍＬ濃度の溶液に調製する。サンプル又はブランクバッファーの比熱容量（Ｃｐ）を１０℃から６０℃／時の速度で走査した。サンプルの走査結果をそれぞれ対応する緩衝液の結果で差し引き、得られたＣｐ値で温度をプロットした。なお、Ｃｐ値が明らかに高いピーク値に対応する温度がサンプルのＴｍ値となる。

図２０から分かるように、従来の抗体と近似しており、Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体ＫＮ０２６とトラスツズマブ標準試料とはいずれも、６０℃前後のＣＨ２溶解温度と、８０℃前後に位置するＣＨ３の溶解温度との２つのＴｍ値を明らかに示している。また、６０℃前後のＴｍ値は二重特異性抗体とトラスツズマブ標準製剤とで顕著な違いがなく、８０℃前後のＴｍ値は二重特異性抗体の方がやや低いものの、８０℃よりも高く、標準製剤と比べて顕著に違うわけではなく、抗体の熱安定性に影響を及し得るとは思われないことが分かる。

実施例１１ Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体のマウスの薬物動態実験
１．Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体のマウスにおける代謝状況の考察
６週〜７週のＩＣＲマウスを選び、ランダムに２つの群に分け、実験群にはＰｔｍａｂ二重特異性抗体ＫＮ０２６ １０ｍｇ／ｋｇを腹腔内単回注射し、対照群にはトラスツズマブ標品１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内単回注射して実験を行った。各郡の動物を３つの段階に分け、各段階で４匹の動物から時点毎に採血した。各動物は、中間採血時（５分〜９６時間）には眼窩静脈叢から約０．２ｍｌを採血し、最終採血時（１９２時間〜５７６時間）には、イソフルランの吸入麻酔後に下大静脈から採血して安楽死させた。血液サンプルは採集後に血清分離して、−８０℃の冷蔵庫で一時保管した。

血清サンプルはＴｍａｂ及びＰｔｍａｂ特異的ＥＬＩＳＡによって血漿濃度を検出し、検出された血清中の抗体含有率を採血時間に対して曲線にし、二重特異性抗体（ＫＮ０２６）及び対照抗体（ハーセプチン）の薬物動態曲線を得て（図２１参照）、さらには、対応する薬物動態パラメータを算出した（表７）。マウス体内におけるＰｔｍａｂ二重特異性抗体（ＫＮ０２６）の半減期はトラスツズマブよりもやや低いが、依然として１０日を超えており、大部分のモノクローナル薬のマウスにおける半減期と近似していることが分かり、マウス体内におけるＰｔｍａｂの安定性が通常のモノクローナル薬と類似していると考えられる。

実施例１２ ヒト卵巣癌ＳＫＯＶ３のヌードマウス移植腫瘍モデルに対するＰｔｍａｂ二重特異性抗体の薬効作用
用量を５×１０^６細胞＋５０％マトリゲル／匹として、ヒト卵巣癌ＳＫＯＶ３細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスに皮下播種し、腫瘍形成マウスをランダムに各郡６匹（雌雄半分ずつ）の郡に分けた。腫瘍サイズが直径約１００ｍｍ^３〜１５０ｍｍ^３になった時に抗腫瘍薬の注射を開始して実験を行った。毎週２回の腹腔内投与で２週間続けた。１週間に２回腫瘍サイズを測定した。実験群にはＰｔｍａｂ二重特異性抗体ＫＮ０２６ ２０ｍｇ／ｋｇを毎回投与し、対照群にはトラスツズマブ標品又はペルツズマブ標品２０ｍｇ／ｋｇを毎回投与し、ブランク対照群には同じ体積のＰＢＳ緩衝液を毎回投与した。

図２２に示すように、ブランク対照群に対して、実験群及び対照群はＳＫＯＶ３のヌードマウス移植腫瘍モデルに対していずれも或る程度の腫瘍抑制効果を示した。このうち、ＰＴｍａｂ二重特異性抗体は、母本の標準製剤のトラスツズマブ標品又はペルツズマブ標品の単独使用時よりも強い抗腫瘍効果を示した。

実施例１３ ヒト胃癌Ｎ−８７のヌードマウス移植腫瘍モデルに対するＰｔｍａｂ二重特異性抗体の薬効作用
用量を４×１０^６細胞／匹として、ヒト胃癌Ｎ−８７細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスに皮下播種し、腫瘍形成マウスをランダムに各郡６匹（雌雄半分ずつ）の郡に分けた。腫瘍サイズが直径１００ｍｍ^３〜１３０ｍｍ^３になった時に抗腫瘍薬の注射を開始して実験を行った。毎週２回のＩＰ投与で４週間〜５週間続けた。１週間に２回腫瘍サイズを測定した。

実験群にはＰｔｍａｂ二重特異性抗体ＫＮ０２６ ５ｍｇ／ｋｇを毎回投与し、対照群にはトラスツズマブ標品又はペルツズマブ標品５ｍｇ／ｋｇを毎回投与し、ブランク対照群には同じ体積のＰＢＳ緩衝液を毎回投与した。

図２３に示すように、ブランク対照群に対して、実験群及び対照群はＮ−８７のヌードマウス移植腫瘍モデルに対していずれも或る程度の腫瘍抑制効果を示した。このうち、Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体は、標準製剤のトラスツズマブ標品又はペルツズマブ標品の単独使用時よりも明らかに優れた抗腫瘍効果を示した。

実施例１４ ヒト胃癌Ｎ−８７のヌードマウス移植腫瘍モデルに対するＰｔｍａｂ二重特異性抗体の薬効作用
用量を４×１０^６細胞／匹として、ヒト胃癌Ｎ−８７細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスに皮下播種し、腫瘍形成マウスをランダムに各郡６匹（雌雄半分ずつ）の郡に分けた。腫瘍サイズが直径約１００ｍｍ^３〜１２０ｍｍ^３になった時に抗腫瘍薬の注射を開始して実験を行った。毎週２回のＩＰ投与で３週間続けた。１週間に２回腫瘍サイズを測定した。

実験群にはＰＴｍａｂ二重特異性抗体ＫＮ０２６ ２．５ｍｇ／ｋｇを投与し、対照群にはトラスツズマブ標品とペルツズマブ標品との併用薬２．５ｍｇ／ｋｇを毎回投与し、ブランク対照群には同じ体積のＰＢＳ緩衝液を毎回投与した。

図２４に示すように、ブランク対照群に対して、実験群及び対照群はＮ−８７のヌードマウス移植腫瘍モデルに対していずれも或る程度の腫瘍抑制効果を示した。このうち、ＰＴｍａｂ二重特異性抗体は、等モル数の標準製剤のトラスツズマブ標品＋ペルツズマブ標品の併用投与時よりも強い抗腫瘍効果を示した。

実施例１５ ＨＥＲ２低発現腫瘍株ヒト非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ５２２のマウス移植腫瘍モデルに対するＰＴｍａｂ二重特異性抗体の用量依存性
１匹当たりの播種用量を５×１０^６細胞／匹として、非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ５２２細胞とマトリゲルとの混合物（細胞：マトリゲルの比は１：１とする）をＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスに皮下播種してモデルを構築し、腫瘍形成マウスをランダムに各郡６匹（雌雄半分ずつ）の郡に分けた。腫瘍サイズが体積約１００ｍｍ^３になった時に抗腫瘍薬の注射を開始して実験を行った。初回ＩＰ（腹腔内）投与の当日を０日目とした。その後、投与濃度を初回用量の半分として、毎週１回ＩＰ投与し、７週間続けた。１週間に２回腫瘍サイズを測定した。

実験群は３つに分け、ＰＴｍａｂ二重特異性抗体ＫＮ０２６をそれぞれ次の用量で投与した。初回で３０ｍｇ／ｋｇを投与し、その後、毎週毎回１５ｍｇ／ｋｇを投与する。初回で１０ｍｇ／ｋｇを投与し、その後、毎週毎回５ｍｇ／ｋｇを投与する。初回で３ｍｇ／ｋｇを投与し、その後、毎週毎回１．５ｍｇ／ｋｇを投与する。ブランク対照群には同じ体積のＰＢＳ緩衝液を毎回投与した。

図２７に示すように、ブランク対照群に対して、３つの実験群はＮＣＩ−Ｈ５２２のマウス移植腫瘍モデルに対していずれも著しい腫瘍抑制効果を示しており、この効果には用量依存性が見られる。

実施例１６ ＨＥＲ２低発現腫瘍株ヒト非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ５２２のマウス移植腫瘍モデルに対するＰＴｍａｂ二重特異性抗体の薬効作用
１匹当たりの播種用量を５×１０^６細胞／匹として、非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ５２２細胞とマトリゲルとの混合物（細胞：マトリゲルの比は１：１とする）をＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスに皮下播種してモデルを構築し、腫瘍形成マウスをランダムに各郡６匹（雌雄半分ずつ）の郡に分けた。腫瘍サイズが体積約１００ｍｍ^３になった時に抗腫瘍薬の注射を開始して実験を行った。投与用量を５ｍｇ／ｋｇとして、初回ＩＰ（腹腔内）投与の当日を０日目とした。その後、投与濃度を初回用量の半分、すなわち２．５ｍｇ／ｋｇとして、毎週１回ＩＰ投与し、７週間続けた。１週間に２回腫瘍サイズを測定した。

実験群にはＰＴｍａｂ二重特異性抗体ＫＮ０２６を投与した。対照群にはトラスツズマブ標品とペルツズマブ標品との併用薬を毎回投与した。各種の薬は上述の用量で与え、すなわち、初回で５ｍｇＰ＋５ｍｇＴ／ｋｇを投与し、その後、毎週毎回２．５ｍｇＰ＋２．５ｍｇＴ／ｋｇを投与した。ブランク対照群には同じ体積のＰＢＳ緩衝液を毎回投与した。

図２８に示すように、ブランク対照群に対して、実験群及び対照群はＮＣＩ−Ｈ５２２のマウス移植腫瘍モデルに対していずれも比較的著しい腫瘍抑制効果を示した。また、ＰＴｍａｂ二重特異性抗体の単独投与は、等モル数の標準製剤のトラスツズマブ標品＋ペルツズマブ標品の併用投与時に匹敵する抗腫瘍効果を有している。

本発明の具体的な実施形態を詳細に説明したが、既に開示されたあらゆる教示に基づいてこれらの詳細に対して種々の変更及び置換をすることができ、これらの変更はいずれも本発明の請求の範囲内であることが当業者には理解されよう。本発明の全ての範囲は、添付の請求項及びそれらのあらゆる均等物により定められる。

本発明は更に、本発明の第１の態様のいずれか一項の二重特異性抗体又はその抗原結合部分と、任意選択の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む、組成物（例えば医薬組成物）に関する。

本発明は更に、本発明の第２の態様のいずれか一項の混合物と、任意選択の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む、組成物（例えば医薬組成物）に関する。

二重特異性抗体の調製については、既に９０年代にＣａｒｔｅｒ他が「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」モデルによって抗体重鎖の一部のアミノ酸を改変しており、二重特異性抗体の調製実現に成功している（非特許文献３、非特許文献１）。しかしながら、彼らの研究結果では、「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」モデルにおけるホモダイマーの形成阻害能力は依然として不十分であり、ホモダイマーが約５％残存している。その後、この研究グループはランダム変異−ファージディスプレイ等の方法によってヘテロダイマーの含有率を向上させたが、問題を根本的に解決してはいない。

ペルツズマブ（pertuzumab）は組み換えられたモノクローナル抗体であり、ＨＥＲ−２受容体の細胞外ドメインＩＩ領域に結合して、ダイマーの形成を抑制し、受容体が媒介するシグナル伝達経路（非特許文献４）を抑制する。これはペルツズマブがＨＥＲ−２の低発現腫瘍の成長を抑制する原因として一部解釈することができる。トラスツズマブはＨＥＲ−２受容体の細胞外ドメインＩＶ領域に結合して、ダイマーの形成はＩＶ領域に関わらないので、トラスツズマブはＨＥＲ−２が過剰に発現した乳癌患者にのみ有効である。目下、ＨＥＲ−２低発現末期乳癌のペルツズマブ治療のＩＩ期臨床研究が行われている。Ｂａｓｅｌｇａ（非特許文献５）他の研究によると、ペルツズマブは、ハーセプチン（トラスツズマブ）と併用すると、治療の難しいＨＥＲ−２陽性乳癌患者に対して確実に抗腫瘍活性を有する。この研究によると、ペルツズマブ治療に対して１／５の患者に効果があり（腫瘍の縮小又は消失）、また、１／５の患者の病状が６カ月以上継続的に安定する。乳癌のペルツズマブ治療のＩＩＩ期臨床試験の結果によると、この薬はＥＲＢＢ２陽性の転移性乳癌患者の無増悪生存期間を極めて長く延長させることができる。

本発明の一実施の形態において、上記抗原又は抗原エピトープとの親和力がより良好とは、当該共通軽鎖と、当該二重特異性抗体又はその抗原結合部分が対応する２つの抗原又は抗原エピトープとの親和力で均衡が取れており、当該二重特異性抗体又はその抗原結合部分がより良好な生物活性と物理的化学的特性（例えば安定性）とを備えていること指す。

実施例２ 抗原タンパク質ＨＥＲ２変異体タンパク質の調製及び機能の検証
１．トラスツズマブのみに結合するＨＥＲ２変異体タンパク質の設計
１９９３年にＲｏｂｅｒｔ Ｆ．Ｋｅｌｌｅｙ’ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｐ．Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌがトラスツズマブ及び対応する変異とＨＥＲ２細胞外領域（ＥＣＤ）との結合の動態パラメータを開示した。このうち、Ｈ９１Ａ、Ｒ５０Ａ、Ｗ９５Ａ、Ｙ１００ａＡはトラスツズマブとＨＥＲ２細胞外領域との結合に対して重大な影響を及ぼしている。２００３年にＨｙｕｎ−Ｓｏｏ ＣｈｏグループがトラスツズマブＦａｂフラグメントとＨＥＲ２細胞外領域（ＥＣＤ）との複合体を結晶化した（ＰＤＢコード：１Ｎ８Ｚ）。その結果がＮａｔｕｒｅに発表されている。トラスツズマブＦａｂフラグメントとＨＥＲ２細胞外領域（ＥＣＤ）（その配列は配列番号１８により示される）との複合体の構造を解析することによって、表５に示すように、トラスツズマブＦａｂフラグメントとＨＥＲ２細胞外領域（ＥＣＤ）との界面接触アミノ酸を取得した。

組合せ１については、ＰＲＯ５７１、ＰＲＯ５７２自身がＦａｂのいくつかのキーアミノ酸と共に作用力の形成を有している。この２つのアミノ酸が、自身の構造の安定性に変異が影響するようなループ（ターン）に位置していると考えられる。

２．ペルツズマブのみに結合するＨＥＲ２変異体タンパク質の設計
Ｍａｔｔｈｅｗ Ｃ．ＦｒａｎｋｌｉｎがＣａｎｃｅｒ ｃｅｌｌにおいて、ペルツズマブＦａｂとＨＥＲ２細胞外ドメインとの複合体の構造を開示している。また、このグループはアラニンスキャニングの手法によって、ＨＥＲ２のいずれのキーアミノ酸がペルツズマブＦａｂとの結合に影響するかを研究している。この研究によると、ＨＥＲ２タンパク質表面のＨ２９６、Ｓ２８８、Ｌ２９５等のアミノ酸に明らかな作用があり、本発明では、Ｓ２８８Ａ／Ｈ２９６Ａの二重変異を選択して、ペルツズマブのみに結合するＨＥＲ２抗原の取得に用いた。

５．ＨＥＲ２変異体タンパク質の一過性発現及び精製
トランスフェクションの２日前に、懸濁され順化された２００ｍＬ×３のＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞を一過性トランスフェクション用に用意し、播種密度を０．８×１０^６細胞／ｍＬとした。２日後、トランスフェクションされる細胞懸濁液を計数して細胞密度を３．５×１０^６細胞／ｍＬ〜４×１０^６細胞／ｍＬとし、細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで５分遠心分離して、上清を捨てた。４０ｍＬ×３の新鮮なＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて再び細胞を懸濁し、再度１０００ｒｐｍで５分遠心分離して、上清を捨てた。２００ｍＬ×３のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて再び２９３細胞を懸濁した。実施例２の４で得られた３つのＨＥＲ２変異体タンパク質の発現ベクターを２００μｇずつ取り、２ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いてそれぞれ希釈した。続いて、５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて１．５ｍＬのポリエチレンイミンを希釈し、形質転換に必要なＰＥＩ溶液を準備した。希釈済の２ｍＬの発現用プラスミドに２ｍＬのＰＥＩ溶液をそれぞれ加えて均一に混合し、室温で５分間静置した。３つのプラスミド／ＰＥＩ混合物を３つの２００ｍＬ細胞懸濁液にそれぞれ加えて３７℃、１０％ＣＯ２、９０ｒｐｍで培養した。また、５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１を追加した。４時間後、２００ｍＬのＥＸ２９３培地と、２ｍＭのグルタミンと、５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１とを各形質転換サンプルにそれぞれ追加して１３５ｒｐｍで培養した。２４時間後、３．８ｍＭのＶＰＡを加えた。

図５に示すように、ＨＥＲ２ｍ１タンパク質のペルツズマブに対する見かけの親和性は、そのトラスツズマブに対する見かけの親和性に比べて２０倍低下し、当該変異体タンパク質がトラスツズマブ特異的抗原タンパク質であると考えることができる。一方、ＨＥＲ２ｍ２タンパク質のペルツズマブに対する見かけの親和性は、トラスツズマブに対する見かけの親和性に比べて２桁超低下し、ペルツズマブ特異的抗原であることを示している。

実施例３ Ｔｍａｂ及びＰｍａｂのオリジナル軽鎖の共通軽鎖による置換並びに共通軽鎖の効果の検証
１．共通軽鎖を伴うＴｍａｂ及びＰｍａｂモノクローナル抗体の真核発現ベクターの構築 米国特許出願公開第２００９／０２８５８３７号明細書により検索されたトラスツズマブ及びペルツズマブの全抗体のアミノ酸配列（特許における図２及び図１６）に基づき、オンラインツールＤＮＡ ｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を利用して、対応するコーディングＤＮＡ配列を設計すると共に、人工合成の手法によってトラスツズマブの重鎖遺伝子（配列番号１６）と、ペルツズマブの重鎖遺伝子（配列番号１７）とを取得した。実施例１で得られた１組の共通軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１〜配列番号６）に基づき、オンラインツールＤＮＡ ｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を利用して、対応するコーディングＤＮＡ配列を設計すると共に、人工合成の手法によってＰｍａｂ−Ｔｍａｂ二重特異性抗体の共通軽鎖遺伝子ＣＬＣ１（配列番号７）及びＣＬＣ５（配列番号１１）を取得した。

２．Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体の一過性発現及び精製
トランスフェクションの２日前に、懸濁され順化された６００ｍＬのＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞を一過性トランスフェクション用に用意し、播種密度を０．８×１０^６細胞／ｍＬとした。２日後、トランスフェクションされる細胞懸濁液を計数して細胞密度を３．５×１０^６細胞／ｍＬ〜４×１０^６細胞／ｍＬとし、細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで５分遠心分離して、上清を捨てた。１００ｍＬの新鮮なＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて再び細胞を懸濁し、再度１０００ｒｐｍで５分遠心分離して、上清を捨てた。６００ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて再び２９３細胞を懸濁した。ｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｔｍａｂｋｎｏｂ−ＣＬＣ１及びｐｃＤＮＡ４ｍ−Ｐｍａｂｈｏｌｅ−ＣＬＣ１を３００μｇずつ取り、均一に混合した後に、３ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて希釈した。続いて、５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を用いて１．５ｍＬのポリエチレンイミンを希釈し、形質転換に必要なＰＥＩ溶液を調合し、希釈済の３ｍＬの混合プラスミドに３ｍＬのＰＥＩ溶液を加えて均一に混合し、室温で５分間静置した。プラスミド／ＰＥＩ混合物を６００ｍＬの細胞懸濁液に加えて３７℃、１０％ＣＯ２、９０ｒｐｍで培養した。また、５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１を追加した。４時間後、６００ｍＬのＥＸ２９３培地と、２ｍＭのグルタミンと、５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１とを形質転換サンプルにそれぞれ追加して１３５ｒｐｍで培養した。２４時間後、３．８ｍＭのＶＰＡを加えた。

３．ＫＮ０２６抗体タンパク質がトラスツズマブ及びペルツズマブそれぞれの特異的抗原を同時認識可能であることのブリッジングＥＬＩＳＡ法による検証
トラスツズマブ特異的抗原タンパク質ＨＥＲ２ｍ１によりＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、４℃で一晩置く。その後、３％ＢＳＡ溶液を加えて室温で２時間密閉した。被験サンプルは５μｇ／ｍＬから１．０６ｎｇ／μＬになるまで１：３の合計８段階で段階希釈した。段階希釈した被験サンプルをＥＬＩＳＡプレートに加えて室温で２時間反応させた。その後、ビオチン化されたペルツズマブ特異的抗原タンパク質ＨＥＲ２ｍ２−ＢｉｏｔｉｎをＥＬＩＳＡプレートに加えて、室温で被験サンプルと２時間反応させた。続いて、ＨＲＰ標識されたストレプトアビジンを加えて、室温でＨＥＲ２ｍ２−Ｂｉｏｔｉｎと１．５時間作用させ、最後に触媒基質を発色させて読み取った。得られたデータは４パラメーターロジスティックによって親和曲線を得た。

Ｎ−８７細胞を消化後に５％ＢＳＡ／ＰＢＳで再度懸濁して、３×１０^５個／管の細胞を１．５ｍＬの遠沈管にそれぞれ加えた。被験サンプルは４０μｇ／ｍＬから０．００９７６６μｇ／ｍＬになるまで合計１３個の濃度で２倍希釈した。サンプルを細胞と反応させ、その後、ＦＩＴＣ−ウサギ抗ヒトＩｇＧを加え、細胞に結合した被験抗体を検出して、フローサイトメーターによって平均蛍光値（ＭＦＩ）を読み取った。ＭＦＩで抗体濃度の対数を曲線にし、被験抗体とＮ−８７細胞との結合の濃度依存性曲線を４パラメーターロジスティックによって得た。図１６から分かるように、Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体（ＫＮ０２６）、ペルツズマブ及びトラスツズマブはいずれもＮ−８７と明らかに結合しており、このような作用には濃度依存性がある。結合曲線のＥＣ５０から分かるように、Ｎ−８７細胞表面ＨＥＲ２タンパク質に対するＫＮ０２６の親和力は、トラスツズマブ及びペルツズマブよりもやや低い。

実施例９ Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体の癌細胞増殖の抑制作用
１．ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞の増殖に対するＰｔｍａｂ二重特異性抗体の抑制作用
Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体、ペルツズマブ、トラスツズマブ等のＨＥＲ２抗体存在下におけるＨＥＲ２高発現乳癌細胞ＢＴ４７４の増殖情况の変化をＣＣＫ−８法によって観察して、ＢＴ４７４癌細胞の増殖作用に対するＰｔｍａｂ二重特異性抗体の抑制効果を比較し評価した。

密度を１００００細胞／ウェルとしてＢＴ４７４細胞を９６ウェルプレートに用い、３７℃で１６時間単層培養した。アッセイ培地（ＤＭＥＭ培地、１％のウシ胎児血清を補充）を用いてそれぞれ濃度の異なるサンプルを調合した。最高１０μｇ／ｍｌから０．００１５μｇ／ｍｌになるまで合計９つの濃度で３倍希釈した。１５０μｌのサンプルを各細胞ウェルに加え、７２時間後にＣＣＫ−８キット（DOJINDO）で細胞生存率を測定した。得られた細胞生存率の値についてサンプル濃度の対数をプロットして、被験サンプル（Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体ＫＮ０２６）及び標準製剤（トラスツズマブ及びトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用薬）の細胞殺傷曲線を４パラメーターロジスティックによって得た。

密度を１００００細胞／ウェルとしてＮ−８７細胞を９６ウェルプレートに用い、３７℃で１６時間単層培養した。アッセイ培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地、１％のウシ胎児血清を補充）を用いてそれぞれ濃度の異なるサンプルを調合した。最高１０μｇ／ｍｌから０．００１５μｇ／ｍｌになるまで合計９つの濃度で３倍希釈した。１５０μｌのサンプルを各細胞ウェル中に加え、７２時間後にＣＣＫ−８キット（DOJINDO）で細胞生存率を測定した。得られた細胞生存率の値についてサンプル濃度の対数をプロットして、被験サンプル（Ｐｔｍａｂ二重特異性抗体）及び標準製剤（トラスツズマブ及びトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用薬）の細胞殺傷曲線を４パラメーターロジスティックによって得た。

図１９に示すように、ＫＮ０２６、トラスツズマブ、及びトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用薬はＮ−８７に対していずれも明らかに殺傷効果があり、この効果には濃度依存性がある。また、二重特異性抗体は、高濃度の場合には、トラスツズマブの単独使用又はペルツズマブとの併用よりもＮ−８７に対する抑制効果が明らかに優れている。

Claims (45)

1. 共通軽鎖を有し、
   前記共通軽鎖は、２本の軽鎖が同じ配列を有することを指すことを特徴とする、二重特異性抗体又はその抗原結合部分。
2. 重鎖が、それぞれ前記軽鎖に対して生理的条件又はｉｎ ｖｉｔｒｏのタンパク質発現状態で正確に結合することができる、請求項１に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分。
3. 前記共通軽鎖が、それぞれペルツズマブ及びトラスツズマブの重鎖に結合することができる、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分。
4. 前記共通軽鎖が、ペルツズマブ若しくはトラスツズマブの軽鎖又はそれらの変異体から選択される、請求項３に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分。
5. 前記共通軽鎖の可変領域の配列には、配列番号１〜配列番号６における第１位〜第１０７位のアミノ酸に示される配列が含まれる、請求項４に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分。
6. 重鎖可変領域が、それぞれペルツズマブ及びトラスツズマブの重鎖可変領域であり、例えば、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列が含まれる、請求項３に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分。
7. 重鎖のＦｃフラグメントの配列には、それぞれ配列番号２５及び配列番号２６に示される配列が含まれる、請求項３に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分。
8. ２本の重鎖の配列には、それぞれ配列番号１９及び配列番号２０に示される配列が含まれる、請求項３に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分。
9. １つの細胞中で正確に生産可能な抗体又はその抗原結合部分の混合物であって、
   該混合物が、少なくとも２種類の抗体又はその抗原結合部分を含み、
   前記抗体又はその抗原結合部分が、共通軽鎖を有し、
   前記共通軽鎖は、２本の軽鎖が同じ配列を有することを指す、混合物。
10. 前記抗体又はその抗原結合部分の重鎖が、それぞれ前記軽鎖に対して生理的条件又はｉｎ ｖｉｔｒｏのタンパク質発現状態で正確に結合することができる、請求項９に記載の混合物。
11. 前記共通軽鎖が、それぞれペルツズマブ及びトラスツズマブの重鎖に結合することができる、請求項９又は１０に記載の混合物。
12. 前記共通軽鎖が、ペルツズマブ若しくはトラスツズマブの軽鎖又はそれらの変異体から選択される、請求項１１に記載の混合物。
13. 前記共通軽鎖の可変領域の配列には、配列番号１〜配列番号６における第１位〜第１０７位のアミノ酸に示される配列が含まれる、請求項１１に記載の混合物。
14. 前記抗体又はその抗原結合部分の重鎖可変領域が、それぞれペルツズマブ及びトラスツズマブの重鎖可変領域であり、例えば、それぞれ配列番号２３及び配列番号２４に示される配列が含まれる、請求項１１に記載の混合物。
15. 前記抗体又はその抗原結合部分の重鎖のＦｃフラグメントの配列には、それぞれ配列番号２７及び配列番号２８に示される配列が含まれる、請求項１１に記載の混合物。
16. 前記抗体又はその抗原結合部分の重鎖配列には、それぞれ配列番号２１及び配列番号２２に示される配列が含まれる、請求項１１に記載の混合物。
17. 野生型ＨＥＲ２タンパク質の細胞外領域の配列に比べて、
    １）第５５８位のグルタミン酸の変異及び第５７３位のフェニルアラニンの変異と、
    ２）第２８８位のセリンの変異及び第２９６位のヒスチジンの変異と、
    から選択される変異を含む、ＨＥＲ２タンパク質の細胞外領域の変異体タンパク質。
18. （１）第５５８位のグルタミン酸をアラニンに変異させることと、
    （２）第５７３位のフェニルアラニンをアラニンに変異させることと、
    （３）第２８８位のセリンをアラニンに変異させることと、
    （４）第２９６位のヒスチジンをアラニンに変異させることと、
    のうちの１つ又は複数を特徴とする、請求項１７に記載のＨＥＲ２タンパク質の細胞外領域の変異体タンパク質。
19. 配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列が含まれる、請求項１８に記載のＨＥＲ２タンパク質の細胞外領域の変異体タンパク質。
20. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体若しくはその抗原結合部分、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の混合物中の前記抗体若しくはその抗原結合部分、若しくは前記抗体若しくはその抗原結合部分の一部の配列（例えば軽鎖及び／又は重鎖）をコードするか、又は請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のＨＥＲ２変異体タンパク質をコードする、核酸分子。
21. 請求項２０に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
22. 請求項２１に記載の組換えベクター又は請求項２０に記載の核酸分子を含む、組換え細胞。
23. 異なる抗原エピトープに対する２株のモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に基づく二重特異性抗体又はその抗原結合部分の調製方法であって、
    ２株のモノクローナル抗体の軽鎖配列に基づいて、２株のモノクローナル抗体の重鎖にそれぞれ結合可能な共通軽鎖の配列を取得する工程を含み、
    前記共通軽鎖は、２本の軽鎖が同じ配列を有することを指し、好ましくは、該共通軽鎖が、一方のモノクローナル抗体の軽鎖又は一方のモノクローナル抗体の軽鎖の変異体である、方法。
24. それぞれ２株のモノクローナル抗体の重鎖配列と共通軽鎖配列とを発現ベクターに構築して、２つの組換え発現ベクターを取得する工程と、
    なお、好ましくは、異なる重鎖を有する２株のモノクローナル抗体のＦｃフラグメントの結合によってより有利になるように、重鎖配列の特にＦｃフラグメントを変異させ、
    ２つの組換え発現ベクターを同一宿主細胞に移入し、発現を誘導して、二重特異性抗体又はその抗原結合部分を取得する工程と、
    を更に含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記共通軽鎖の可変領域の取得方法が、まず、２株のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域とそれぞれの抗原又は抗原エピトープとの間で接触する界面アミノ酸を確定し、その後、任意の一方のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域を候補共通軽鎖の可変領域とすると、該共通軽鎖とこのモノクローナル抗体の抗原又は抗原エピトープとの間で接触する界面アミノ酸と他方のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の界面アミノ酸とを比較した場合の相違アミノ酸を確定して、相違アミノ酸の数量が少ない軽鎖可変領域を共通軽鎖の可変領域として選択することであり、好ましくは、抗原又は抗原エピトープとの親和力がより良好な共通軽鎖の可変領域を取得するように、該共通軽鎖の可変領域を更に変異させることである、請求項２３に記載の方法。
26. 少なくとも２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を含む混合物の調製方法であって、
    ２株のモノクローナル抗体の軽鎖配列に基づいて、２株のモノクローナル抗体の重鎖にそれぞれ結合可能な共通軽鎖の配列を取得する工程を含み、
    前記共通軽鎖は、２本の軽鎖が同じ配列を有することを指し、好ましくは、該共通軽鎖が、一方のモノクローナル抗体の軽鎖又は一方のモノクローナル抗体の軽鎖の変異体である、方法。
27. それぞれ２株のモノクローナル抗体の重鎖配列と共通軽鎖配列とを発現ベクターに構築して、２つの組換え発現ベクターを取得する工程と、
    なお、好ましくは、同じ重鎖を有するモノクローナル抗体のＦｃフラグメントの結合にとってより有利になるように、重鎖配列の特にＦｃフラグメントを変異させ、
    ２つの組換え発現ベクターを同一宿主細胞に移入し、発現を誘導して、抗体又はその抗原結合部分の混合物を取得する工程と、
    を更に含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記共通軽鎖の可変領域の取得方法が、まず、２株のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域とそれぞれの抗原又は抗原エピトープとの間で接触する界面アミノ酸を確定し、その後、任意の一方のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域を候補共通軽鎖の可変領域とすると、該共通軽鎖とこのモノクローナル抗体の抗原又は抗原エピトープとの間で接触する界面アミノ酸と他方のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の界面アミノ酸とを比較した場合の相違アミノ酸を確定して、相違アミノ酸の数量が少ない軽鎖可変領域を共通軽鎖の可変領域として選択することであり、好ましくは、抗原又は抗原エピトープとの親和力がより良好な共通軽鎖の可変領域を取得するように、該共通軽鎖の可変領域を更に変異させることである、請求項２６に記載の方法。
29. 抗体又はその抗原結合部分が二重特異性抗体又はその抗原結合部分であるか否かの検出方法及び／又はその定量方法であって、
    １）二重特異性抗体又はその抗原結合部分中の抗原結合部分１に結合可能であって抗原結合部分２に結合しない特異的抗原１と、抗原結合部分２に結合可能であって抗原結合部分１に結合しない特異的抗原２とをそれぞれ調製する工程と、
    ２）特異的抗原１（又は特異的抗原２）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、被験抗体を加え、暫くの間反応させ、標識された特異的抗原２（又は特異的抗原１）を更に加え、暫くの間反応させ、最後に、前記標識分子に結合可能な検出可能標識付き検出分子を加え、暫くの間反応させ、検出原理に基づき読み取って、反応が陽性であるか、又は陰性であるかを判断する工程と、
    ３）反応が陽性であり、且つ該反応に濃度依存性がある場合には、抗体又はその抗原結合部分が二重特異性抗体又はその抗原結合部分であると判断し、任意選択により、得られた陽性数値に基づいて、二重特異性抗体又はその抗原結合部分を更に定量する工程と、
    を含む、方法。
30. 抗体又はその抗原結合部分の混合物がホモダイマータンパク質であるか否かの検出方法であって、該混合物には、２種類の抗体（抗体１及び抗体２）又はそれらの抗原結合部分が含まれ、該方法は、
    １）抗体１に結合可能であって抗体２に結合しない特異的抗原１と、抗体２に結合可能であって抗体１に結合しない特異的抗原２とをそれぞれ調製する工程と、
    ２）特異的抗原１（又は特異的抗原２）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、被験混合物を加え、暫くの間反応させ、標識された特異的抗原１（又は特異的抗原２）を更に加え、暫くの間反応させ、最後に、前記標識分子に結合可能な検出可能標識付き検出分子を加え、暫くの間反応させ、検出原理に基づき読み取って、反応が陽性であるか、又は陰性であるかを判断する工程と、
    ３）別途、特異的抗原１（又は特異的抗原２）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、被験混合物を加え、暫くの間反応させ、標識された特異的抗原２（又は特異的抗原１）を更に加え、暫くの間反応させ、最後に、前記標識分子に結合可能な検出可能標識付き検出分子を加え、暫くの間反応させ、検出原理に基づき読み取って、反応が陽性であるか、又は陰性であるかを判断する工程と、
    ４）工程２）の反応が陽性であり、該反応に濃度依存性があり、且つ工程３）の反応が陰性である場合には、混合物がホモダイマータンパク質であってヘテロダイマータンパク質を含んでいないと判断し、工程２）の反応が陽性であり、且つ工程３）の反応も陽性である場合には、混合物がホモダイマータンパク質もヘテロダイマータンパク質も含んでいると判断する工程と、
    を含む、方法。
31. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体若しくはその抗原結合部分、又は請求項９〜１６のいずれか一項に記載の混合物と、任意選択の薬学的に許容可能なベクター又は賦形剤とを含む、組成物（例えば医薬組成物）。
32. 他の化学療法薬及び／又は他の抗体を更に含む、請求項３１に記載の組成物。
33. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分、又は請求項９〜１６のいずれか一項に記載の混合物と、任意選択の緩衝液及び／又は説明書とを含む、キット。
34. 請求項３〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分の、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）を予防及び／又は治療する医薬品の調製における用途。
35. 請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の混合物の、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）を予防及び／又は治療する医薬品の調製における用途。
36. 請求項３〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分の、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）を診断する試薬又はキットの調製における用途。
37. 請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の混合物の、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）を診断する試薬又はキットの調製における用途。
38. 請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のＨＥＲ２タンパク質の細胞外領域の変異体タンパク質を、請求項３〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体若しくはその抗原結合部分の検出又は請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の混合物の検出に用いる用途。
39. 予防又は治療有効量の請求項３〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分を必要な被験者に投与する工程を含む、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）の予防及び／又は治療方法。
40. 予防又は治療有効量の請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の混合物を必要な被験者に投与する工程を含む、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）の予防及び／又は治療方法。
41. 請求項３〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分を使用する工程を含む、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）の診断方法。
42. 請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の混合物を使用する工程を含む、ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）の診断方法。
43. 請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のＨＥＲ２タンパク質の細胞外領域の変異体タンパク質を使用する工程を含む、請求項３〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体若しくはその抗原結合部分又は請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の混合物の検出方法。
44. ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）の予防及び／又は治療に用いる、請求項３〜８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分。
45. ＨＥＲ２陽性腫瘍（例えば乳癌、胃癌）の予防及び／又は治療に用いる、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の混合物。