CN113929781A - 抗pd-1抗体及其稳定制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种结合人PD‑1的抗体或其片段，含有所述抗人PD‑1的抗体或其片段的组合物，所述组合物优选为水针制剂。本发明的抗体利用杂交瘤技术筛选获得与人PD‑1胞外区结构域重组蛋白和细胞表面人PD‑1均具有高亲和力结合，并且能特异性阻断PD‑1/PD‑L1、PD‑1/PD‑L2配受体结合的抗体分子317，进一步通过人源化技术获得亲和力和特异性保持不变的人源化抗体h317。根据抗原‑抗体晶体复合物结构解析，构建h317轻、重链CDR区突变体，获得317系列衍生抗体。在抗人PD‑1抗体h317的基础上，经过三轮组分选择、浓度优化提供的抗体稳定制剂提高了抗体的储存稳定性和温度适应性，延长了所述抗体制剂特别是水针剂的保存期。

Description

抗PD-1抗体及其稳定制剂
本专利申请要求于2020.7.14日提交的申请号为202010676464.X的中国专利申请的优先权益，在此将其全部内容引入作为参考。
技术领域
本发明涉及抗体药物领域，具体而言，本发明涉及一种抗PD-1抗体、其稳定制剂、制药用途。
背景技术
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，也被称为CD279，是T细胞受体CD28家族的成员，表达于多种免疫细胞，如T细胞，B细胞，单核细胞等的表面，是一种在肿瘤微环境中抑制CD4+和CD8+ T细胞功能的重要的免疫检查点分子。PD-1的关键配体包括PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，它们由免疫细胞表达，并且还可以在多种组织上诱导，当T细胞上的PD-1结合PD-L1或PD-L2时，T细胞接收抑制信号，从而抑制T细胞增殖和细胞因子产生，会有效降低T细胞参与的免疫应答。而PD-L1和PD-L2在多种人类肿瘤细胞上高表达，因此使得肿瘤细胞逃避T细胞的监督(Pardoll DM.The blockade of immune checkpoints in cancerimmunotherapy.Nat.Rev.Cancer12(4),252–264(2012))。
目前在全球范围内已上市的抗人PD-1的单抗共有3种。抗人PD-1的全人源抗体纳武单抗(Nivolumab)显示抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合，临床用于治疗晚期黑色素瘤，非小细胞肺癌，肾细胞癌，霍奇金淋巴瘤，头颈部鳞癌，尿路上皮癌，结直肠癌和肝细胞癌；抗人PD-1的人源化抗体派姆单抗(Perbrolizumab)显示抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合，临床用于治疗恶性黑色素瘤，非小细胞肺癌，经典型霍奇金淋巴瘤，头颈部鳞癌，d-mmr突变或MSI-H恶性肿瘤(Alsaab et al.PD-1and PD-L1Checkpoint Signaling Inhibition forCancer Immunotherapy:Mechanism,Combinations,and ClinicalOutcome.Front.Pharmacol.8:561)。抗人PD-1的Libtayo单抗(Cemiplimab)可与PD-1结合并阻断其与PD-L1和PD-L2的相互作用，释放PD-1通路介导的免疫应答抑制，包括抗肿瘤免疫应答,临床用于治疗转移性皮肤鳞状细胞癌(CSCC)患者或局部晚期CSCC患者(Markham,A.&Duggan,S.Drugs.2018.doi:10.1007/s40265-018-1012-5)。国内处于临床阶段的抗人PD-1的单抗就有10多种，适应症覆盖复发难治恶性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，B细胞非霍奇金淋巴瘤，腺泡状软组织肉瘤，晚期或复发性恶性肿瘤，食管癌、胃癌或胃食管结合部癌，鼻咽癌、头颈部鳞癌，肺癌，转移性结直肠癌，局限性肾细胞癌，尿路上皮癌，肝细胞癌，黑色素瘤，晚期三阴性乳腺癌，胸膜间皮瘤，晚期神经内分泌肿瘤，不可切除或d-mmr突变或MSI-H实体瘤。其中恒瑞的SHR-1210、百济神州的tislelizumab、信达的IBI-308已递交上市申请，君实的JS001已于12月17日有条件批准上市，名为特瑞普利单抗注射液(商品名：拓益)。国际上，抗PD-1的抗体已经有三个上市品种，多个临床在研品种。涉及的专利包括：WO2004004771，WO2006121168，WO2008156712，WO2010029435，WO2012145493，WO2015085847，US20170044260，CN104250302，CN105330740，CN105531288等。
针对PD-1的抗体研究众多，目前已有多个抗PD-1抗体上市或正在进行临床试验，虽然抗PD-1抗体对多种肿瘤确有治疗效果，然而在具体临床应用中也经常出现疗效不佳、治疗失败的案例。导致PD-1抗体治疗失败原因涉及肿瘤疾病的复杂性、患者个体差异性等多种因素，其中抗PD-1抗体稳定性不足也是影响肿瘤治疗效果的重要原因之一。抗PD-1抗体作为一种生物大分子，结构复杂，在生产和贮存过程中，会发生聚集、变性、沉淀等物理变化及异构化、脱酰胺和氧化等化学变化。这些改变会影响产品的安全性及有效性。目前提高抗PD-1抗体稳定性的技术路线主要集中于：抗体分子结构改良和修饰，抗体制剂的优化和筛选。由于不同的抗PD-1抗体的分子结构、结合表位、治疗活性等方面均存在差异，因此针对新研发的抗PD-1抗体必需针对其具体情况研究适用的稳定制剂，以减少其在施用于受试者前因理化性状改变而导致的疗效损失。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种抗PD-L1的抗体分子，利用杂交瘤技术获得鼠抗体，通过抗体活性分析(ELISA(结合，阻断)，亲和力动力学)获得候选鼠抗体后；将鼠抗体轻重链基因可变区序列克隆至编码人抗体轻重链恒定区序列的上游，进行哺乳动物细胞表达，制备嵌合抗体，然后通过抗体活性分析，阻断PD-1与其配体结合实验，与CD28其他家族成员结合实验，与细胞表面PD-1结合实验，体外细胞学实验确定先导抗体后；根据Germline数据库选择人源化模板，进行抗体序列人源化设计，获得的人源化抗体再次通过抗体活性分析，阻断PD-1与其配体结合实验，与CD28其他家族成员结合实验，与细胞表面PD-1结合实验，体外细胞学实验验证后；再进行人源化抗体对体内外肿瘤细胞生长抑制实验进行最后的成药性评价，获得亲和力和特异性保持不变的PD-1人源化抗体序列。在抗PD-1人源化抗体晶体复合物结构解析的基础上，进行CDR区定向突变，以获得具有更高亲和力的抗体。
本发明要解决的另一技术问题是，抗PD-1的抗体分子在生产、运输、贮存过程中易受环境的影响理化性状发生改变、进而导致生物活性例如对PD-1和PD-L1相互作用阻断活性的丧失；提供一种含抗PD-1抗体的稳定制剂，特别是提供一种稳定的抗PD-1抗体水针剂。
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种抗体或其功能片段，并基于该抗体或其功能片段，提供其用途。
本发明的技术方案如下。
一方面，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中
所述重链可变区(VH)选自SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:62；
所述轻链可变区(VL)选自SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:60。
进一步，本发明所述抗体或其抗原结合片段，其为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv。
本发明提供的抗体或其片段可以为单克隆抗体、单链抗体、单域抗体、双功能抗体、纳米抗体、完全或部分人源化的抗体或者嵌合抗体等任意形式；或者，所述抗体或其片段为半抗体或半抗体的抗原结合片段，例如scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv；关于本发明提供的抗体的片段，优选地，所述片段为抗体的能够特异性结合PD-1的任何片段。本发明所述抗体或其抗原结合片段，其为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv。
或者，本发明的抗体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，更优选为IgG1。抗体的片段选自所述抗体的scFv、Fab、F(ab')2或Fv片段。
优选地，所述抗体或其片段还包含人或鼠的恒定区，优选包含人或鼠的轻链恒定区(CL)和/或重链恒定区(CH)；更优选地，所述抗体或其片段包含选自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。根据本发明的具体实施方式，所述抗体为单克隆抗体，优选为鼠源、嵌合或人源化的单克隆抗体；更优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG1或IgG4亚型。
第二方面，本发明还提供一种抗体或其抗原结合片段，其是以第一方面中所述抗体或其抗原结合片段为出发抗体，根据出发抗体与PD-1晶体复合物结构解析，通过CDR定向进化改造产生的，至少部分的保留了出发抗体对PD-1的亲和力，优选比出发抗体对PD-1的亲和力高。
进一步，本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述至少部分的保留了出发抗体对PD-1的亲和力是指保留了出发抗体对PD-1亲和力的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。
进一步，本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区与出发抗体轻链可变区相比，在选自第24、30、32、50、55、56、91、92、93、94、96位中的一个或多个位点存在氨基酸突变；和/或
所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区与出发抗体重链可变区相比，在选自第31、32、33、52、53、54、55、56、57、100、101、106位中的一个或多个位点存在氨基酸突变；
所述轻链可变区的氨基酸残基位点编号根据SEQ ID NO:60确定；所述重链可变区的氨基酸残基位点编号根据SEQ ID NO:62确定。
更进一步，本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中：
所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区与出发抗体轻链可变区相比，存在以下一个或多个氨基酸置换：K24R、E30S、V32A、V32Y、W50A、W50G、H55A、H55Q、T56S、Y91A、Y91F、S92D、S92N、R93N、R93S、Y94F、W96G和W96Y；和/或
所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区与出发抗体重链可变区相比，存在以下一个或多个氨基酸置换：S31D、Y32A、Y32N、D33S、D33Y、S52K、S52W、G53S、G53Y、G54D、G54S、G55S、S56G、Y57T、Y59A、Y59T、D100E、D100Y、S101A和Y106T。
进一步，本发明所述抗体或其抗原结合片段，其为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv。
第三方面，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与前述第一方面或第二方面中任一所述抗体或其抗原结合片段具有相同的轻链可变区CDRs和重链可变区CDRs。
进一步，本发明所述抗体或其抗原结合片段，其为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv。
第四方面，本发明提供一种阻断PD-1与其配体相互作用的组合物，包含前述第一方面至第三方面中任一所述的抗体或抗原结合片段，以及可选的药学上可接受的辅料。
进一步，本发明所述的组合物，其中，经过37℃储存稳定性试验，与试验前相比，所述组合物在37℃储存21天后，SEC>97％、CEX>70％、NR-CE>95％。
进一步，本发明所述的组合物，其中，所述药学上可接受的辅料包括一种或多种选自缓冲液、保护剂、组成的组。
进一步，本发明所述的组合物，其中，包含的抗体或抗原结合片段的浓度为15-40mg/mL。
进一步，本发明所述的组合物，其中，包含的缓冲液选自柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液；浓度为5-20mmol；pH值为4.0-8.0。
进一步，本发明所述的组合物，其中，包含的保护剂选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇；浓度为3-10％(w/v)。
进一步，本发明所述的组合物，其中，包含的表面活性剂选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、EDTA、精氨酸。
第五方面，本发明提供一种组合物，包括：
前述第一方面至第三方面中任一所述的抗体或其抗原结合片段15-40mg/mL
pH5.0-7.0的组氨酸缓冲液 5-20mM
蔗糖 3-10％(w/v)
聚山梨醇酯20 0.01-0.03％(w/v)。
进一步，本发明所述的组合物，包括：
Figure BDA0003155725550000051
Figure BDA0003155725550000061
进一步，本发明所述的组合物，包括：
Figure BDA0003155725550000062
第六方面，本发明提供一种稳定抗体的组合物，其是在第五方面中任一所述组合物的基础上省略了抗体或其抗原结合片段组分。
第七方面，本发明还提供第六方面所述的组合物在增强抗PD-1抗体稳定性和/或制备抗PD-1抗体制剂中的应用。
第八方面，本发明还提供本发明第一方面到第三方面所述抗体或其抗原结合片段，或本发明第四方面到第七方面所述组合物在制备预防或治疗肿瘤或癌症药物中的应用。
本发明前期利用人PD-1胞外区结构域重组蛋白(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa)，免疫小鼠后取脾细胞，利用杂交瘤技术筛选获得与人PD-1胞外区结构域重组蛋白和细胞表面人PD-1均具有高亲和力结合，并且能特异性阻断PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2配受体结合的抗体分子(本发明中命名为317)，进一步通过人源化技术获得亲和力和特异性保持不变的人源化抗体(本发明中命名为h317)，对其全抗体IgG4的结合、阻断、促进T细胞活化及体内抗肿瘤药效进行了全面的评估，并且构建了其Fab和PD-1-ECD的晶体复合物，通过晶体衍射和进一步的突变体验证确认了其抗原结合表位。对抗PD-1抗体分子的实验结果证明，本发明抗体能够有效阻断PD-1和PD-L1/PD-L1的结合，同时与Nivolumab和帕博利珠单抗(Keytruda)具有竞争结合关系；但是，通过抗原抗体复合物晶体结构分析发现，本发明抗体的抗原结合表位与Nivolumab和Keytruda均不同，是首个明确抗原表位与PD-1的第58位Glu的N糖基化位点相关的抗体分子(参见第201910022548.9号发明专利申请，其全部内容引入作为参考)。本发明进一步在317系列抗体(包括317、h317、CDRs定向进化衍生抗体)的基础上进行制剂研究，通过独特的三轮筛选模式最终确定了稳定的制剂配方。
具体而言，本发明相对于现有技术具有以下有益之处：
第一，针对特定的高生物活性抗PD-1抗体(317系列抗体)的具体情况进行制剂研究。本发明317系列抗体(包括317、h317、CDRs定向进化衍生抗体)具有：(1)阻断PD-1与其配体PD-L1或PD-L2的结合；(2)特异性结合灵长类动物PD-1，与非灵长类动物PD-1无交叉反应；(3)不结合除PD-1之外的其他CD28家族成员；(4)在CD4+ T细胞中诱导IL-2和/或IFN-γ产生；(5)无ADCC效应功能。
第二，采用独特的三轮制剂优化方式。传统的线性制剂优化方式是参考现有技术确定待优化的参数，根据各参数对效果的影响确定先后顺序，从对效果影响最大的参数开始，依次对各个参数进行梯度选择。这种传统制剂优化方式的缺点在于：过度依赖于对待优化参数的排序；在确定第一个参数时其它参数并未达到最优状态、并且一旦选定一个参数，后续对其它参数的优化过程中通常不会再修改该参数。本发明创造性的采用了三轮参数优化方式，每一轮参数优化既能够验证上一轮/现有技术多个参数的选择范围，又为下一轮多个参数的进一步优化提供依据，每一轮都对多个参数进行联合选择和调整。
第三，参数选择指标多样化，每一轮筛选之间既有重复验证、又有不同要求，最终获得了在37℃、25℃、2-8℃三个温度条件下稳定效果均较好的制剂配方。通过上述选择指标的控制，获得了适用于本发明317系列抗体的稳定制剂，在37℃储存21天后，SEC>97％、CEX>70％、NR-CE>95％；25℃储存3个月SEC>99.7％、CEX>71％；2-8℃储存6个月SEC>99.8％、CEX>86％。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1：ELISA测定h317抗体和Nivolumab竞争抑制PD-1与PD-L1(6A)、PD-1与PD-L2(6B)的结合情况。
图2：h317抑制PD-1转基因鼠皮下移植瘤增长的肿瘤体积统计结果。
图3：抗体制剂组分三轮优化工艺流程图。
图4：不同体系及pH中h317的Tm1。
图5：不同体系及pH中h317的Tagg。
图6：不同体系及pH中h317的SEC主峰变化趋势。
图7：不同体系及pH中h317的CEX主峰变化趋势。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1：抗人PD-1抗体杂交瘤细胞株的筛选、鉴定及抗体序列测定。
利用人PD-1胞外区结构域重组蛋白(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa)，免疫小鼠后取脾细胞，利用杂交瘤技术筛选获得与人PD-1胞外区结构域重组蛋白和细胞表面人PD-1均具有高亲和力结合，并且能特异性阻断PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2配受体结合的抗体分子(本发明中命名为317)。将317杂交瘤细胞按照TRIzol试剂盒(Cat：15596026，Invitrogen)说明书步骤提取细胞总RNA；利用M-MuLV反转录酶(Cat：M0253S，NEB)将杂交瘤细胞总RNA反转录成cDNA；使用简并引物和Phusion试剂盒(Cat：E0553L，NEB)扩增抗体轻链可变区IgVL(κ)和重链可变区VH序列；利用胶回收试剂盒(Cat：AP-GX-250，Axygen)纯化PCR扩增产物；按照T载体克隆试剂盒(Cat：ZC205，庄盟生物)说明书将扩增PCR产物连接至T载体并转化大肠杆菌感受态细胞，菌株扩增、抽提质粒后进行DNA测序获得单克隆抗体可变区序列。测序结果显示317抗体轻链可变区DNA的核苷酸序列见SEQ ID NO:53，由该DNA序列推测得到317抗体轻链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO:52；317抗体重链可变区DNA的核苷酸序列见SEQ ID NO:55，由该DNA序列推测得到317抗体重链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO:54。
实施例2：抗人PD-1单克隆抗体的人源化及稳定细胞株的构建。
首先对鼠源抗体重链序列进行综合分析，确定抗体与抗原结合的抗原互补决定簇(CDR)区域及支撑抗体保守三维构象的框架区(framework)。随后根据同源性比对结果，在人抗体germline库(http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php#VHEX)寻找最相似人源抗体模板，选择VH3(3-21)为基础模板，结合全序列blast结果，考虑重排(rearranged)抗体在特定FR区位点氨基酸出现频率(A49)，进行CDR移植，考虑FR3区(S98)靠近CDR3区，不进行更换，根据CDR3序列(Pdssgvay)情况，选择JH4(wgqgtlvtvss)为J区序列，实现了H1在框架区的高度人源化。根据同源性比对结果，在人抗体germline库(http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php#VHEX)寻找最相似人源抗体模板，选择VK II(A19)为基础模板，结合全序列blast结果，考虑重排抗体在特定FR区位点氨基酸出现频率(R45)，进行CDR移植，根据CDR3序列(Qqysrypw)情况，选择JK1(fgqgtkveik)为JK区序列，实现了轻链框架区的全人源化。
将317抗体鼠源序列进行全人源化设计并全合成该序列，并将人源化后的317抗体命名为h317，将人源化的h317-VH1通过酶切克隆入真核表达载体pKN034的人IgG4的重链恒定区编码基因的上游，将人源化的h317-VL2通过酶切克隆入真核表达载体pKN019的人轻链Cκ的编码基因的上游，构建人源化317轻、重链表达载体，将h317-H和L通过酶切的方法克隆至pKN002真核稳定高表达载体，通过Pvu I线性化后，利用Nucleofector 2b电转仪(300452，Lonza)，将h317基因整合到CHO细胞DNA中，经过MSX(Cat：M5379-500MG，Sigma)加压筛选及亚克隆得到最终高表达h317的稳定细胞株。317人源化后轻链可变区DNA的核苷酸序列见SEQ ID NO:61，氨基酸序列见SEQ ID NO:60；人源化后重链可变区DNA的核苷酸序列见SEQ ID NO:63，氨基酸序列见SEQ ID NO:62。
实施例3：ELISA检测h317对PD-1与其配体PD-L1、PD-L2结合的抑制作用。
ELISA检测h317对PD-1与PD-L1结合的抑制作用：将人PD-1-hFc(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：20180329)浓度稀释至0.5μg/mL，4℃包被过夜，用5％BSA于37℃恒温培养箱封闭60min。加入h317(Lot：DP201805002，江苏泰康生物医药有限公司)或Nivolumab(Lot：AAW4553，BMS)(起始浓度为3μg/mL，1.5倍连续稀释)，37℃恒温培养箱反应120min，加入1μg/mL的PD-L1-mFc(序列号：NP_054862.1，19aa-238aa，Lot：20180412)与抗体共孵育，37℃恒温培养箱反应60min。然后加入1:5000稀释的HRP-anti-mouse Fc(Cat：115-035-071，Jackson Immuno Research)，反应45min，加入TmB(Cat：ME142，北京泰天河生物)底物显色15min，2M HCl终止后读板。以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度值A450nm-630nm。
ELISA检测h317对PD-1与PD-L2结合的抑制作用：将PD-1-hFc(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa，Lot：20180329)浓度稀释至0.5μg/mL，4℃包被过夜，用5％BSA于37℃恒温培养箱封闭60min。加入h317(Lot：DP201805002，江苏泰康生物医药)或Nivolumab(Lot：AAW4553，BMS)(起始浓度为3μg/mL，1.5倍连续稀释)，37℃恒温培养箱反应120min，加入2μg/mL的PD-L2-hFc-Biotin(序列号：NP_079515.2，20aa-220aa，Lot：2016.12.05)，与抗体共孵育，37℃恒温培养箱反应60min。然后加入1:2000稀释的HRP-streptavidin(Cat：S2438，Sigma)反应30min，加入TmB底物显色15min，2M HCl终止后读板。以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度值A450nm-630nm。
结果显示h317可以有效阻断重组人PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的结合作用。通过ELISA测定了h317和Nivolumab对PD-1与其配体PD-L1结合的竞争抑制效应，其半数有效抑制浓度(IC50)值分别1.4nM和1.3nM(图1，1A)。通过ELISA测定了h317和Nivolumab对PD-1与其配体PD-L2结合的竞争抑制效应，其半数有效抑制浓度(IC50)值分别1.2nM和1.0nM(图1，1B)。与Nivolumab相比，h317阻断活性相近。
实施例4：h317在PD-1转基因鼠移植瘤模型中的药效体内抗肿瘤药效评价。
试验共选用65只HuGEMMPD-1小鼠(6-8周，上海南方模式生物)，在受试小鼠右侧皮下接种MC38-hPD-L1肿瘤细胞(1×106/只，1×106细胞重悬于100μL PBS)。当荷瘤鼠平均肿瘤体积到达约60-100mm3时，测定动物体重，并用游标卡尺测量肿瘤体积，开始给药，给药前使用StudyDirectorTm(版本号3.1.399.19，供应商Studylog System,Inc.，S.SanFrancisco，CA，USA)进行随机分组，共分为6组，进行给药(D0)，每组的动物数及详细的给药途径、剂量和方案见表1，给药、肿瘤测量及体重称量等全部过程都在生物安全柜或超净工作台中进行。实验中使用StudyDirectorTm(版本号3.1.399.19，供应商Studylog System,Inc.)软件收集数据，包括肿瘤的长短径的测量和动物体重的称量，原始数据由天平和游标卡尺测量后直接导入软件，当对照组小鼠瘤体积均值超过2000mm3时或最后一次给药后一星期终止实验。并收集肿瘤块，测量肿瘤重量，拍摄肿瘤照片，结束实验当天取瘤做FACS，每组4只(与采集血液动物编号对应)，Marker：CD3，CD4，CD8，CD45，Live/Dead。结实验当天取全血做FACS，每组4只(与采集肿瘤动物编号对应)，Marker：CD3，CD4，CD8，CD45。
表1.药效学实验设计
Figure BDA0003155725550000111
注：给药体积为10μL/g；hIgG对照(Lot：20180521)，h317(Lot：DP201805002，江苏泰康生物医药)，Nivolumab(Lot：AAW4553，BMS)。
HuGEMMPD-1小鼠模型是基因工程鼠，是在C57BL/6J遗传背景下，将人源PD-1蛋白编码区插入到小鼠PD-1的ATG位置，表达人源PD-1，取代小鼠PD-1的表达。MC38是C57BL/6小鼠中诱导获得的鼠源肠癌细胞系。通过基因工程的方法，敲除MC38的鼠源PD-L1，并敲入人源PD-L1，获得了表达人源PD-L1的MC38细胞系，即MC38-hPD-L1细胞系。在PD-1转基因鼠移植瘤模型上评价并比较了h317及其参比抗体Nivolumab对肿瘤生长的抑制效果。结果表明(见图2，表2)，h317在高剂量和中剂量下可显著抑制PD-1转基因鼠皮下移植瘤的生长，并且在高中剂量水平下h317与其参比抗体Nivolumab的抑瘤效果相当。
表2.各组PD-1转基因鼠皮下移植瘤的瘤重数据及统计分析
Figure BDA0003155725550000112
Figure BDA0003155725550000121
注释：a.数据以“平均值±标准误差”表示；n＝8。
b.p值运用单因素方差分析(one way ANOVA)肿瘤体积所得，F值有显著性差异(p<0.05)，应用Dunnett’s T3法进行分析。
实施例5：h317轻、重链CDR区定向突变。
1.根据PD-1-h317Fab晶体复合物结构解析，构建h317轻、重链CDR区突变体，表达载体的构建采用质粒定点突变的方法进行，具体可参照文献[王荣浩，陈瑞川，刘润忠。快速点突变的优化方法。厦门大学学报(自然科学版)，2008,Vol 47,sup 2,282-285]。突变体抗体表达和纯化方法同上。
2.突变体相对亲和力比较。
突变体与亲本抗体亲和力比较采用Fortebio公司的Octet QKe system仪器完成。具体方法同实施例4，不同之处在于所有突变体亲和力仅测定单线以评估相对亲和力。首先包被相同目标值的待测抗体，并以100nM的人PD-1重组蛋白(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa)为流动相进行相对亲和力测定。
对突变体抗体亲和力测定结果显示，多个位点突变后抗体的亲和力发生较大改变，突变位点信息如表3，部分亲和力变化如表4所示。
表3.h317突变体CDR区的氨基酸序列
Figure BDA0003155725550000122
Figure BDA0003155725550000131
表4.h317 CDR区突变体亲和力变化情况统计表(除所示突变位点外，可变区其余氨基酸与h317相同)
Figure BDA0003155725550000132
Figure BDA0003155725550000141
从表中数据看出，个别位置的氨基酸突变后，对亲和力会产生较大影响，有些位点亲和力降低10倍以上。同时，有些位点突变后抗体的亲和力有所提升，比如轻链第24位K突变为R、第56位T突变成S、第92位S突变为N后，重链第33位D突变为S、第54位G突变成S、第59位Y突变为A后，均可使抗体亲和力得到一定提高，并且这些突变位点可以进一步叠加突变，其亲和力保持不变或进一步提高。
实施例6抗体稳定制剂组分的第一轮筛选。
1.筛选指标及意义
由于蛋白的复杂性，没有单一的分析方法能够检测蛋白结构中所有可能的物理、化学和免疫学变化。因此，在组方筛选的过程中需要将多种分析手段相结合如电泳、色谱和热分析等用于表征和检测蛋白结构的变化。表5列出了本研究中所使用的检测方法，并对其稳定性指示作用做了简单介绍。
表5.h317组方研究的关键性检测指标
Figure BDA0003155725550000151
2.pH和缓冲盐对h317各关键质量属性的影响
蛋白制剂的pH对于产品的稳定性和生物学活性至关重要。制剂组方的pH选择主要受主药分子理化性质的影响。抗体作为一种由氨基酸组成的两性大分子具有如下特性：在等电点附近的pH值条件下，易发生沉淀。经检测，h317的等电点为7.2，在等电点附近选择制剂溶液的pH容易引起沉淀；在等电点之上的pH碱性较强，不适于对蛋白类物质的保存；因而只能在等电点之下选择适宜的pH条件。因此，本研究初步考察的pH范围为4.0-8.0。
缓冲体系能够防止制剂中pH的微小变化，从而保持蛋白分子的稳定，因此应该选择适合h317分子的缓冲体系。适合蛋白药物的常用缓冲体系主要有以下几种：柠檬酸、琥珀酸、组氨酸、磷酸、醋酸和Tris。将h317样品置换至配好的不同pH溶液中。将制备好的溶液置于37℃进行加速稳定性实验，并在0天、3天、7天、14天时取样进行Tm/Tagg(0天)、SEC、CEX检测。实验结果见表6-表8。
表6不同pH及缓冲盐中h317的热稳定性数据
Figure BDA0003155725550000161
Figure BDA0003155725550000171
表6、图4-5显示h317在柠檬酸4.0-5.0，琥珀酸4.0-5.0，醋酸4.0-4.5时Tm1较低，说明在这些条件下样品容易发生变性，热稳定性不佳。在组氨酸和磷酸缓冲体系中，h317的Tm1较高，同时在组氨酸5.5-7.0和磷酸7.0-8.0中，Tagg也较其他缓冲液高。因此，从热稳定性角度，h317在组氨酸和磷酸中更稳定。
表7.不同pH及缓冲盐中h317的加速稳定性SEC考察结果
Figure BDA0003155725550000172
Figure BDA0003155725550000181
表7、图6显示h317在柠檬酸4.0-4.5，磷酸7.5-8.0，琥珀酸4.0及组氨酸7.0中主峰下降较明显，均低于98％，聚体增加较明显。表明低pH的柠檬酸体系及琥珀酸体系，高pH的磷酸及组氨酸7.0不利于h317的稳定。
表8不同pH及缓冲盐中h317的加速稳定性CEX考察结果
Figure BDA0003155725550000182
Figure BDA0003155725550000191
表8、图7表明h317在柠檬酸4.0、磷酸6.5-8.0中CEX主峰下降明显，均低于60％，说明这些体系下的相应pH值不利于h317的稳定性。考察的缓冲体系中，组氨酸5.0-6.0的主峰下降速率最低，37℃，14天后CEX主峰在65％左右。
第一轮筛选经过对热稳定性和物理指标数据的综合分析，选取组氨酸5.5-6.0进行下一轮的组方筛选。
实施例7抗体稳定制剂组分的第二轮筛选。
根据第一轮的筛选结果，我们选择组氨酸缓冲体系进行进一步考察，同时考察不同蛋白浓度、缓冲盐浓度及保护剂对于h317的影响。其中蛋白浓度考察范围为15-60mg/ml，缓冲盐浓度考察范围为5-20mM，pH考察范围为5.5-6.0。同时，初步考察了生物制剂常用的保护剂蔗糖、海藻糖、甘露醇和山梨醇，表面活性剂聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20及其他添加剂如精氨酸和EDTA对h317的影响。制剂组方设计如表9，将h317样品置换至配好的不同组方溶液中。将制备好的溶液置于37℃进行加速稳定性实验，并在0天、3天、7天、21天时取样进行SEC、CEX、NR-CE检测。
表9第二轮组方筛选设计
Figure BDA0003155725550000201
1、蛋白质浓度筛选
利用处方A、B、C研究不同蛋白浓度的h317样品在37℃条件下的稳定性数据如表10和表11所示。
表10不同蛋白浓度中h317的高温稳定性考察结果
Figure BDA0003155725550000202
Figure BDA0003155725550000211
表11不同蛋白浓度中h317的理化性质变化幅度
Figure BDA0003155725550000212
表11的稳定性变化幅度数据表明浓度越高，37℃放置21天后，SEC纯度越低，变化幅度更大；40mg/ml样品的NR-CE主峰下降最多；CEX主峰下降幅度没有显著差异。因此，结合上述稳定性结果及预期临床剂量，h317的浓度可选择为25mg/ml左右。
2、保护剂种类筛选
利用组方B、J、K、L研究不同种类的保护剂中h317样品在37℃条件下的稳定性，结果数据如表12和表13所示。
表12不同保护剂中h317的高温稳定性考察结果
Figure BDA0003155725550000213
表13不同保护剂中h317的理化性质变化幅度
Figure BDA0003155725550000214
Figure BDA0003155725550000221
表13表明h317在甘露醇中SEC主峰及CEX主峰下降幅度较其他保护剂高，海藻糖和山梨醇的NR-CE主峰下降幅度高于蔗糖和甘露醇；。综合考虑，后续处方研究选择蔗糖作为h317的保护剂。
3、保护剂浓度筛选
利用组方B、M、N、O研究不同浓度蔗糖中h317样品在37℃条件下的稳定性数据如表14和表15所示。
表14不同蔗糖浓度中h317的高温稳定性考察结果
Figure BDA0003155725550000222
表15不同蔗糖浓度中h317的理化性质变化幅度
Figure BDA0003155725550000223
表15表明h317在7％蔗糖中的SEC主峰变化幅度最小，说明7％蔗糖能保护蛋白使其产生较少的聚体，10％蔗糖中样品的CEX主峰变化幅度显著高于其他组的样品，表明太高的蔗糖浓度可能影响电荷异质性，3％蔗糖中的样品NR-CE主峰变化最小，但SEC主峰下降幅度最大，5％以上蔗糖对NR-C主峰的变化没有显著差异。因此，后续的处方研究以7％蔗糖浓度为中心点进行进一步考察。
4、缓冲盐浓度筛选
利用组方E、B、F研究不同缓冲盐浓度中h317样品在37℃条件下的稳定性数据如表16和表17所示。
表16不同缓冲盐浓度中h317的高温稳定性考察结果
Figure BDA0003155725550000231
表17不同缓冲盐浓度中h317的高温稳定期预测结果
Figure BDA0003155725550000232
表17的结果表明不同组氨酸浓度对SEC主峰变化幅度的影响没有差异；但在5mM时，CEX主峰的下降幅度高于10mM和20mM样品；20mM时，NR-CE的下降幅度高于其他两组样品。综上，后续处方研究中h317样品的缓冲盐为10mM组氨酸。
5、pH筛选
利用组方B、H研究不同pH中h317样品在37℃条件下的稳定性数据如表18和表19所示。
表18不同pH中h317的高温稳定性考察结果
Figure BDA0003155725550000241
表19不同pH中h317的理化性质变化幅度
Figure BDA0003155725550000242
表19的结果表明h317在pH＝5.5时，CEX主峰下降幅度和NR-CE主峰下降幅度低于pH6.0样品，SEC变化幅度二者没有差异因此，后续处方研究中以pH＝5.5为中心点进一步考察。
6、其他添加剂的筛选
利用组方B、P、Q、R、S、T研究其他添加剂中h317样品在37℃条件下的稳定性，数据结果如表20和表21所示。
表20不同pH中h317的高温稳定性考察结果
Figure BDA0003155725550000243
表21不同添加剂中h317的理化性质变化幅度
Figure BDA0003155725550000251
表21表明h317在添加3％精氨酸后，SEC主峰下降幅度和NR-CE主峰下降幅度高于对照样品，表明精氨酸可能导致样品更容易聚集；添加聚山梨醇酯80和EDTA后，CEX主峰下降幅度明显高于对照；基于保持主药分子稳定的状态下尽可能少地使用辅料的种类和数量的原则，后续处方研究中还将进一步考察聚山梨醇酯20对h317的影响。
第二轮筛选经过对SEC、CEX、NR-CE等理化指标数据的综合分析，以25mg/ml蛋白，10mM组氨酸，7％蔗糖和0.02％聚山梨醇酯20，pH＝5.5为中心点进行下一步的处方优选，进行下一轮的处方筛选。
实施例8抗体稳定制剂组分的第三轮筛选
根据第二轮的筛选结果，我们选择25mg/ml蛋白、10mM组氨酸、7％蔗糖和0.02％聚山梨醇酯20为中心点，用JMP软件对h317处方进行确定性筛选设计，其中蛋白浓度考察范围为20-30mg/ml、蔗糖浓度为5％-9％、pH为5.3-5.7、聚山梨醇酯20浓度为0.01％-0.03％。确定性筛选设计如表22所示。
表22第三轮组方筛选设计
Figure BDA0003155725550000261
根据表22所述第三轮筛选处方设计，分别考察25℃加速1个月到3个月，2-8℃储存1个月到6个月的SEX值和CEX值。结果如表23-28所示。
表23 25℃加速一个月
Figure BDA0003155725550000271
表24 25℃加速两个月
Figure BDA0003155725550000272
Figure BDA0003155725550000281
表25 25℃加速三个月
Figure BDA0003155725550000282
表26 2-8℃储存一个月
Figure BDA0003155725550000291
表27 2-8℃储存三个月
Figure BDA0003155725550000292
Figure BDA0003155725550000301
表28 2-8℃储存六个月
Figure BDA0003155725550000302
从表23-25所示25度加速3个月的数据可以看出聚体无明显增长趋势，酸性组分增长明显。从2-8度目前的考察结果来看各组之间无明显差异，说明样品在该筛选制剂处方辅料用量范围内稳定性较好，目前选用的处方是合适的。
从表26-28所示六个月2-8度稳定性结果来各组间无明显差异，结合三轮的处方筛选结果及参考同类药物认为选择该药物处方是合适的。考虑到原液除菌过滤和制剂工序过滤可能会导致聚山梨醇酯20含量降低，选择聚山梨醇酯20含量为0.02％。
经过三轮处方优化选择，h317最终制剂处方的pH为5.5，蛋白含量为25mg/ml，辅料成分为10mM组氨酸、7％蔗糖和0.02％聚山梨醇酯20，每瓶装量4.3ml。其它质量控制标准包括：不溶性微粒≥10μm：不得过6000粒；≥25μm：不得过600粒，可见异物应符合《中国药典》2015年版三部通则0904“可见异物检查法相关规定。制剂成品的抗原结合活性和生物学活性均在工作参考品的70％-140％范围内。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
序列表
<110> 迈威（上海）生物科技股份有限公司
江苏迈威康新药研发有限公司
<120> 抗PD-1抗体及其稳定制剂
<130> NONE
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 104
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Glu Thr Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100
<210> 2
<211> 312
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtggaa actgttgtag cctggtatca acagaaacca 120
gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagattattt ctgtcagcag tatagcaggt atccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tg 312
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 3
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Asp Ser Ser Gly Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 4
<211> 351
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttaatgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatgaca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggaagtta cacctactat 180
ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtat 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aagtccagac 300
agctcgggcg ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 5
<211> 104
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Glu Thr Val
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
100
<210> 6
<211> 312
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 6
gacatcgtga tgacccagtc tcctctgtcc ctgcccgtga cacctggtga gcctgcctcc 60
atcacctgca aggcctccca ggacgtggag accgtggtgg cctggtacct gcagaagcct 120
ggccagagtc ccagactgct gatctactgg gcttccacca gacacaccgg cgtgcctgac 180
agattctccg gctctggctc cggcaccgac ttcaccctga agatctcccg ggtggaggcc 240
gaggacgtgg gcgtgtacta ctgccagcag tactccagat acccctggac cttcggccag 300
ggcaccaagc tg 312
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Asp Ser Ser Gly Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 351
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 8
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggaggc ctggtgaagc ctggcggttc cctgagactg 60
tcctgcgctg cctctggctt caccttctcc tcctacgaca tgtcctgggt gagacaggct 120
cccggaaagg gactggagtg ggtggccacc atctctggcg gaggctccta cacctactac 180
cctgactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc ctctcccgac 300
tcttccggag tggcctactg gggccaggga accctggtga ccgtgtcttc c 351
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 9
Lys Ala Ser Gln Asp Val Glu Thr Val Val Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 10
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 11
Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Trp
1 5
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 12
Ser Tyr Asp Met Ser
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 13
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 14
Pro Asp Ser Ser Gly Val Ala Tyr
1 5

Claims (20)

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中
所述重链可变区(VH)选自SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:62；
所述轻链可变区(VL)选自SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:60。
2.一种抗体或其抗原结合片段，其是以权利要求1所述抗体或其抗原结合片段为出发抗体，根据出发抗体与PD-1抗原晶体复合物的结构解析，通过CDR定向进化改造产生的，至少部分的保留了出发抗体对PD-1的亲和力，优选比出发抗体对PD-1的亲和力高。
3.如权利要求2所述抗体或其抗原结合片段，至少部分的保留了出发抗体对PD-1的亲和力是指保留了出发抗体对PD-1亲和力的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。
4.如权利要求2或3所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区与出发抗体轻链可变区相比，在选自第24、30、32、50、55、56、91、92、93、94、96位中的一个或多个位点存在氨基酸突变；和/或
所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区与出发抗体重链可变区相比，在选自第31、32、33、52、53、54、55、56、57、100、101、106位中的一个或多个位点存在氨基酸突变；
所述轻链可变区的氨基酸残基位点编号根据SEQ ID NO:60确定；所述重链可变区的氨基酸残基位点编号根据SEQ ID NO:62确定。
5.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区与出发抗体轻链可变区相比，存在以下一个或多个氨基酸置换：K24R、E30S、V32A、V32Y、W50A、W50G、H55A、H55Q、T56S、Y91A、Y91F、S92D、S92N、R93N、R93S、Y94F、W96G和W96Y；和/或
所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区与出发抗体重链可变区相比，存在以下一个或多个氨基酸置换：S31D、Y32A、Y32N、D33S、D33Y、S52K、S52W、G53S、G53Y、G54D、G54S、G55S、S56G、Y57T、Y59A、Y59T、D100E、D100Y、S101A和Y106T。
6.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与权利要求1-5任一所述抗体或其抗原结合片段具有相同的轻链可变区CDRs和重链可变区CDRs。
7.如权利要求1-6任一所述抗体或其抗原结合片段，其为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv。
8.一种阻断PD-1与其配体相互作用的组合物，包含权利要求1-7任一所述的抗体或抗原结合片段，以及可选的药学上可接受的辅料。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于经过37℃储存稳定性试验，与试验前相比，所述组合物在37℃储存21天后，SEC>97％、CEX>70％、NR-CE>95％。
10.如权利要求8或9所述的组合物，其中所述药学上可接受的辅料包括一种或多种选自缓冲液、保护剂、组成的组。
11.如权利要求8-10任一所述的组合物，其中包含的抗体或抗原结合片段的浓度为15-40mg/mL。
12.如权利要求8-10任一所述的组合物，其中包含的缓冲液选自柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液；浓度为5-20mmol；pH值为4.0-8.0。
13.如权利要求8-10任一所述的组合物，其中包含的保护剂选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇；浓度为3-10％(w/v)。
14.如权利要求8-10任一所述的组合物，其中包含的表面活性剂选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、EDTA、精氨酸。
15.一种组合物，包括：
Figure FDA0003155725540000021
16.如权利要求15所述的组合物，包括：
Figure FDA0003155725540000022
17.一种组合物，包括：
Figure FDA0003155725540000023
Figure FDA0003155725540000031
18.一种稳定抗体的组合物，其是在权利要求8-17任一所述组合物的基础上省略了抗体或其抗原结合片段组分。
19.权利要求18所述组合物在增强抗PD-1抗体稳定性和/或制备抗PD-1抗体制剂中的应用。
20.权利要求1-7任一所述抗体或其抗原结合片段或权利要求8-17中任一项所述组合物在制备预防或治疗肿瘤或癌症药物中的应用。
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