KR20180069065A - 항-변이체 fc-부위 항체 및 사용 방법 - Google Patents

항-변이체 fc-부위 항체 및 사용 방법 Download PDF

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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 Fc-부위에서 돌연변이 P329G 또는 돌연변이 P329G/L234A/L235A 또는 돌연변이 I253A/H310A/H435A 를 갖는 항체에 특이적으로 결합하는 항-변이체 Fc-부위 항체, 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

항-변이체 FC-부위 항체 및 사용 방법
본 발명은 변이체 Fc-부위에 특이적으로 결합하면서 상응하는 야생형 Fc-부위에는 결합하지 않는, 변이체 Fc-부위에 대한 항체 (항-변이체 Fc-부위 항체) 에 관한 것이다. 본원에서는 또한, 그의 제조 방법 및 용도가 보고된다.
1974 년에 Koehler 와 Milstein 에 의해 첫 번째 단일클론 항체가 개발된 이후로, 인간에서의 치료요법에 적절한 항체를 개발하는데 많은 노력이 이루어져왔다. 이용가능하게 된 첫 번째 단일클론 항체는 마우스 및 랫트에서 개발되었다. 이들 항체는 인간 치료요법에서 사용시 항-설치류 항체로 인해 원치않는 부작용을 초래하였다. 이러한 원치않는 부작용을 감소시키거나 제거하는데 많은 노력이 이루어지고 있다.
지난 해 점점 늘어나는 수의 인간 단일클론 항체 또는 인간화 단일클론 항체가 시판에 이르렀다. 널리 공지된 예는 예를 들어 Hoffmann-La Roche, Basel 사로부터의 Herceptin® 및 MabThera® 를 포함한다.
꽤 상당한 수의 인간 또는 인간화 단일클론 항체가 조사 중에 있고 실험 동물에서 연구될 필요가 있어, 인간에게 진입 전에 제 1 시험 목적으로 고려될 수 있다.
그중 두 가지만 언급하자면 생체 이용률 및 항체 소거 (clearance) 와 같은 중요한 기준이 실험 동물의 도움으로 연구되어야 한다. 이들 연구 중 많은 것들이 숙주의 고유 항체의 배경에 있어서 치료적 항체의 정량화를 필요로 한다. 대부분의 경우 포유동물이 실험 동물로서 사용된다. 독성학은 마우스 또는 랫트와 같은 설치류에서 종종 처음으로 평가된다. 보다 진보된 약물 개발 단계에서, 특히 인간에 대한 약물 진입 전에, 이러한 전임상 연구에 원숭이가 포함되어야 한다.
포유동물은 통상 순환에 있어서 1 ㎖ 당 약 10 내지 약 30 ㎎ 의 면역글로불린을 갖는다.
치료적 단일클론 항체는 통상 1 ㎖ 당 약 1 ng 내지 1 ㎖ 당 약 100 ㎍ 범위의 혈청 수준으로 시험되어야 한다. 따라서 치료적 항체는 약 100 배 내지 1000 만 배 과량으로 존재하는 숙주 항체의 배경에 대해 검출되어야 한다. 숙주 면역글로불린의 배경에서의 인간 또는 인간화 치료적 항체의 검출은 약리학자에게 상당히 중요한 임무를 나타낸다. 추가로, 상이한 치료적 항체가 상이한 시약 및 검정 포맷을 필요로 할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 치료적 항체가 야생형 인간 항체와 더 밀접하게 관계될수록, 인간 또는 인간화 항체의 검출은 점점 더 어려워진다.
현재, 효소 연결 면역흡착제 샌드위치 검정 (enzyme linked immunosorbent sandwich assay (ELISA)) 가교 (bridging) 검정 (도 1a) 은 그의 고처리량 및 민감성 및 상이한 프로젝트에 대한 그의 용이한 적용가능성으로 인해, 면역원성 시험을 위한 최신식 검정 포맷을 나타낸다 (Mikulskis, A., et al., J. Immunol. Meth. 365 (2011) 38-49). 그러나, 이러한 검정의 신뢰도는 위양성 결과를 초래하는 올리고머성 표적으로 인한 간섭 (Bautista, A.C., et al., Bioanal. 2 (2010) 721-731; Mire-Sluis, A.R., et al., J. Immunol. Meth. 289 (2004) 1-16 (2004); Weeraratne, D.K., et al., J. Immunol. Meth. 396 (2013) 44-55; Zhong, Z.D., et al., J. Immunol. Meth. 355 (2010) 21-28) 및 표지된 약물 분자와 경쟁하여 생성 신호로부터 ADA 를 방지하고, 그로써 위음성 결과를 초래하는, 임상 샘플 중 높은 약물 농도의 존재 (Mire-Sluis, A.R., et al., J. Immunol. Meth. 289 (2004) 1-16 (2004); Geng, D., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 39 (2005) 364-375) 둘 모두에 의해 도전을 받고 있다. 특히, 약물 면역-복합체에서 결합한 ADA 의 검출은 전통적인 가교 검정에서는 상당히 제한된다 (Mire-Sluis, A.R., et al., J. Immunol. Meth. 289 (2004) 1-16 (2004); Geng, D., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 39 (2005) 364-375).
발명의 개요
항-약물 항체 (ADA) 의 검출을 위한 가교 검정이 종종 올리고머성 표적 및 높은 약물 농도에 의해 방해되므로, 개선된 접근방식이 필요하다. 예를 들어 Fc-부위 내에 Pro329Gly (PG) 치환을 도입함에 의한 Fc 효과기 기능이 없는 치료적 항체에 대해, Fc-부위 내 치환에 대해 특이적인 포획 항체, 예를 들어 항-PG 항체, 및 검출을 위한 인간 가용성 Fcγ 수용체를 이용하는 약물- 및 표적-내성 면역 복합체 검정이 본원에 보고되어 있다. 본원에 보고된 바와 같은 검정은 종래의 가교 검정에 비해 증가한 약물 올리고머성 표적 내성을 갖는다 (Wessels, U., et al., Bioanalysis 8 (2016) 2135-2145). 인간 가용성 Fc 감마 수용체, 예를 들어 인간 가용성 FcγRI 가 야생형 (wt) IgG 에 특이적으로 결합하나 Fc-부위 변형 IgG 에는 특이적으로 결합하지 않기 때문에, 높은 약물 농도의 존재 하에서도 이 방법은 항-약물 항체 측정이 가능하게 한다.
가교 검정과 조합으로, 임상 샘플의 상세한 ADA 특징화가 이제 가능한데, 두 검정 모두가 별도로 ADA Ig-아형을 인지하기 때문이다. 본원에서 보고하는 바와 같은 검정으로, 종래의 가교 검정은 Fc-부위-변형 치료적 항체에 대한 개별적 ADA-반응의 면밀한 특징화에 대해 보완된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는, 하기 단계를 포함하는, (혈청 함유) 샘플 중 항-약물 항체의 존재 및/또는 양의 측정을 위한 검정이다:
- 샘플을 (Fc-부위 내 하나 이상의 치환(들) 의 도입에 의한) Fc 효과기 기능이 없는 항체에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 인큐베이션하여, 샘플로부터 Fc 효과기 기능이 없는 항체를 포획하는 단계 (자유 및 ADA 복합화 항체 포함),
- 포획된 항체를 인간 가용성 FcγRI 와 함께 인큐베이션하여, 포획된 항체를 검출하고,
샘플 중 항-약물 항체의 존재 및/또는 양을 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 다중특이적 결합제의 제 1 결합 특이성 (first binding specificity) 에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너의 존재 및/또는 양의 시험관내 측정을 위한 방법이며, 여기서 다중특이적 결합제에 결합한 결합 파트너는, 샘플을 다중특이적 결합제의 제 2 결합 특이성 (second binding specificity) 에 특이적으로 결합하는 단일특이적 결합제와 함께 인큐베이션함으로써 결합 파트너 검출 전에 감손된다:
- 결합 파트너 및 다중특이적 결합제를 포함하는 샘플을, 제 1 결합 특이성과 상이한 다중특이적 결합제의 제 2 결합 특이성에 특이적으로 결합하는 단일특이적 결합제와 함께 인큐베이션하는 단계,
- 자유 결합 파트너의 존재 또는 양 측정 전에 샘플로부터 단일특이적 결합제-다중특이적 결합제-복합체를 감손시키는 단계, 및
- 이전의 양태에서 보고한 바와 같은 방법으로 다중특이적 결합제-감손 샘플에서의 결합 파트너의 양을 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 (a) SEQ ID NO: 09 또는 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 12, 13 또는 14 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO: 16, 17 또는 18 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 23 또는 24 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 26 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 28, 29 또는 30 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는, 위치 253, 310 및 435 에서 각각 아미노산 잔기 알라닌을 포함하는 Fc-부위에 특이적으로 결합하는 단리된 항체이다 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름).
이러한 항체를 하기에서 항-AAA 항체로서 나타낸다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 (a) SEQ ID NO: 20 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 32 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 34 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 35 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는, 위치 329 에서 아미노산 잔기 글리신 (및 임의로는 위치 234 및 235 에서 각각 아미노산 잔기 알라닌) 을 포함하는 Fc-부위에 특이적으로 결합하는 단리된 항체이다 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름).
이러한 항체를 하기에서 항-PG 항체로서 나타낸다.
한 구현예에서 항체는 단일클론 항체이다.
한 구현예에서 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다.
한 구현예에서 항체는 각각의 돌연변이화된 Fc-부위에 특이적으로 결합하는 항체 단편이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 본원에서 보고하는 바와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포이다.
한 구현예에서 숙주 세포는 진핵세포이다. 한 구현예에서 진핵세포는 포유류 세포이다. 한 바람직한 구현예에서 포유류 세포는 CHO 세포 또는 HEK 세포이다.
한 양태는 본원에서 보고하는 바와 같은 숙주 세포를 배양하여 항체를 생성하는 것을 포함하는, 항체 생성 방법이다.
한 구현예에서는, 본원에서 보고하는 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 본원에서 보고하는 바와 같은 세포를 배양하고, 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 검출가능한 표지에 접합된 본원에서 보고하는 바와 같은 항체를 포함하는 접합체이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는, (샘플 중) Fc-부위에서 돌연변이 P329G 또는 돌연변이 P329G/L234A/L235A 또는 돌연변이 I253A/H310A/H435A (번호화는 Kabat EU 지표에 따름) 를 포함하는 IgG1 또는 IgG4 하위부류의 치료적 항체의 측정을 위한 포획 (capture) 항체 또는 트레이서 (tracer) 항체로서의 면역검정에서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항체의 용도이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는, 포획 항체 및 트레이서 항체가 그들의 HVR 서열에 있어서 상이한, 샘플 중 돌연변이 I253A/H310A/H435A 를 포함하는 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름) IgG1 또는 IgG4 하위부류의 치료적 항체의 측정을 위한 포획 항체 및 트레이서 항체로서의 면역검정에서의 본원에서 보고하는 바와 같은 2 개 상이한 항체의 용도이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는, (샘플 중) 치료적 항체의 Fc-부위가 돌연변이 P329G 또는 돌연변이 P329G/L234A/L235A 또는 돌연변이 I253A/H310A/H435A 를 포함하는 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름) IgG1 또는 IgG4 하위부류의 치료적 항체에 대한 항-약물 항체의 측정을 위한 포획 항체 및 트레이서 항체로서의 면역검정에서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항체의 용도이다.
도 1: 포획 시약으로서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체를 사용하는 면역검정의 모식도.
도 2: 트레이서 시약으로서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체를 사용하는 면역검정의 모식도.
도 3: 포획 및 트레이서 시약으로서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체를 사용하는 면역검정의 모식도.
도 4: 표준물으로서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체를 사용하는 면역검정의 모식도.
도 5: 포획 항체로서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체, 및 트레이서 분자로서 가용성 Fc 감마 수용체를 사용하는 면역검정의 모식도.
도 6: 포획 항체로서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체, 및 트레이서 항체로서 항-표적 항체를 사용하는 면역검정의 모식도.
도 7: 임상 시험의 4 명 환자에서의 ADA 발생의 예시적 시간 경과: 환자는 격주 투여 (A,C) 로 또는 매주 투여 (B) 로 치료적 항체를 받았고 (각 10 mg 용량), 혈액 샘플을 각 용량 전 및 후에 매일 수집하였다 (C2, C3: 제 2 및 제 3 의 처리 사이클). 모든 샘플을 종래의 가교 검정 (연회색 막대) 및 hsFcγRI-PG 검정 (흑색 막대) 모두에 의해, 항-약물 항체 (ADA) 에 대해 시험하였다. 혈액 약물 농도 (ng/㎖) 를 제공하고 (하부 곡선), ADA 음성 (-) 또는 양성 (+) 으로서 평가된 샘플을 상응하는 막대 위에 나타낸다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
본원에서 사용하는 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 모든 불변 부위 및 도메인의 아미노산 위치는 [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 에 기재된 Kabat 번호화 시스템에 따라 번호화되며, 본원에 서 "Kabat 에 따른 번호화" 로서 지칭된다. 특히, [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 의 Kabat 번호화 시스템 (647-660 페이지 참조) 은 카파 및 람다 동형의 경쇄 불변 도메인 CL 에 대해 사용되며, Kabat EU 지표 번호화 시스템 (661-723 페이지 참조) 은 불변 중쇄 도메인 (CH1, 힌지, CH2 및 CH3) 에 대해 사용된다.
본원에서의 목적을 위한 "수용기 인간 골격" 은 하기에서 정의한 바와 같이, 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 (consensus) 골격에서 유래하는 경쇄 가변 도메인 (VL) 골격 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 골격의 아미노산 서열을 포함하는 골격이다. 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격에서 "유래한" 수용기 인간 골격은 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 변화의 수는 10 개 이하, 9 개 이하, 8 개 이하, 7 개 이하, 6 개 이하, 5 개 이하, 4 개 이하, 3 개 이하, 또는 2 개 이하이다. 일부 구현예에서, VL 수용기 인간 골격은 VL 인간 면역글로불린 골격 서열 또는 인간 컨센서스 골격 서열과 서열에 있어서 동일하다.
"친화성" 은 분자 (예를 들어, 항체) 의 단일 결합 위치와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 나타낸다. 다르게 나타내지 않는 한, 본원에서 사용하는 바와 같이, "결합 친화성" 은 결합 쌍의 일원 간 (예를 들어, 항체 및 항원) 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화성을 나타낸다. 분자 X 의, 그의 파트너 Y 에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수 (kd) 로 나타낼 수 있다. 친화성은 본원에서 기재된 것들을 포함하여, 당업계에 공지된 흔한 방법에 의해 측정될 수 있다.
"친화성 성숙" 항체는, 변경을 갖지 않는 모체 항체와 비교하여 하나 이상의 과가변 부위 (HVR) 에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 나타내며, 이러한 변경은 항원에 대한 항체의 친화성 개선을 초래한다.
용어 "변경" 은 변이체 항체 또는 융합 폴리펩티드가 수득되도록 하는, 모체 아미노산 서열에서의 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 Fc-부위의 적어도 하나의 FcRn 결합 부위를 포함하는 항체 또는 융합 폴리펩티드의 돌연변이, 삽입 또는 결실을 나타낸다.
용어 "아미노산 돌연변이" 는 모체 아미노산 서열의 아미노산 서열에 있어서의 변형을 나타낸다. 예시적 변형은 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 한 구현예에서 아미노산 돌연변이는 치환이다. 용어 "위치에서의 아미노산 돌연변이" 는 명시된 잔기의 치환 또는 결실, 또는 명시된 잔기에 인접한 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입을 나타낸다. 용어 "명시된 잔기에 인접한 삽입" 은 그의 1 내지 2 개의 잔기 내 삽입을 나타낸다. 삽입은 명시된 잔기에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다.
용어 "아미노산 치환" 은 상이한 "대체" 아미노산 잔기로의 선결된 모체 아미노산 서열에서의 적어도 하나의 아미노산 잔기의 대체를 나타낸다. 대체 잔기 또는 잔기들은 "자연 발생 아미노산 잔기" (즉, 유전자 코드에 의해 인코딩됨) 일 수 있으며, 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile): 류신 (Leu); 리신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val) 으로 이루어지는 군에서 선택된다. 한 구현예에서 대체 잔기는 시스테인이 아니다. 하나 이상의 비-자연 발생 아미노산 잔기으로의 치환은 또한 본원에서의 아미노산 치환의 정의에 의해 포함된다. "비-자연 발생 아미노산 잔기" 는 상기 열거된 이들 자연 발생 아미노산 잔기 외에, 폴리펩티드 사슬에서 인접한 아미노산 잔기(들) 에 공유 결합할 수 있는 잔기를 나타낸다. 비-자연 발생 아미노산 잔기의 예는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린, aib 및 [Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336] 에 기재된 것들과 같은 기타 아미노산 잔기를 포함한다. 이러한 비-자연 발생 아미노산 잔기를 생성시키기 위해, Noren, et al. (Science 244 (1989) 182) 및/또는 Ellman, et al. (상기와 같음) 의 절차를 사용할 수 있다. 간략하게는, 이들 절차는 억제자 tRNA 를 비-자연 발생 아미노산 잔기로 화학적으로 활성화시킨 후 RNA 를 시험관내 전사 및 번역하는 것을 포함한다. 비-자연 발생 아미노산은 또한 화학적 펩티드 합성 및 이후 이들 펩티드와 재조합적으로 생성된 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 항체 단편의 융합을 통해 펩티드에 혼입될 수 있다.
용어 "아미노산 삽입" 은 선결된 모체 아미노산 서열 내로의 적어도 하나의 추가적인 아미노산 잔기 혼입을 나타낸다. 삽입이 통상 1 또는 2 개의 아미노산 잔기의 삽입으로 이루어질 것이지만, 본 출원은 더 큰 "펩티드 삽입", 예를 들어 약 3 내지 약 5 개 또는 심지어 최대 약 10 개의 아미노산 잔기 삽입을 고려한다. 삽입된 잔기(들) 는 상기 정의한 바와 같이 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다.
용어 "아미노산 결실" 은 아미노산 서열에서 선결된 위치에서의 적어도 하나의 아미노산 잔기 제거를 나타낸다.
본 출원 내에서 아미노산 변경이 언급될 때마다, 이는 고의적 아미노산 변경이며 무작위 아미노산 변형이 아니다.
용어 "항-변이체 (인간) Fc-부위 항체" 및 "변이체 (인간) Fc-부위에 특이적으로 결합하는 항체" 는 충분한 친화성으로 변이체 (인간) Fc-부위에 결합할 수 있어, 변이체 (인간) Fc-부위를 표적화하는데 있어서 진단제로서 유용한 항체를 나타낸다. 한 구현예에서, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체의 상응하는 야생형 (인간) Fc-부위에 대한 결합 정도는 항체의 변이체 (인간) Fc-부위에 대한 결합의 약 10% 미만이다. 이는 예를 들어 표면 플라스몬 공명을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 변이체 (인간) Fc-부위에 특이적으로 결합하는 항체는 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M 의 해리 상수 (KD) 를 갖는다.
본원에서 용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되며, 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 비제한적으로 포함하는 다양한 항체 구조를 포함한다.
"항체 단편" 은 미손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 미손상 항체의 일부를 포함하는 미손상 항체 외의 분자를 나타낸다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 비제한적으로 포함한다.
용어 "~에 결합하는" 은 제 1 개체의 제 2 개체에 대한 결합, 예를 들어 항체의 그의 항원에 대한 결합을 나타낸다. 이러한 결합은 예를 들어 BIAcore® 검정 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 을 사용하여 측정될 수 있다.
예를 들어, BIAcore® 검정의 한 가능한 구현예에서 항원은 표면에 결합하며 항체의 결합은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의해 측정된다. 결합 친화성은 용어 ka (결합 상수: 복합체를 형성하는 결합에 대한 반응속도 상수), kd (해리 상수; 복합체의 해리에 대한 반응속도 상수) 및 KD (kd/ka) 에 의해 정의된다. 대안적으로, SPR 센서그램의 결합 신호는, 공명 신호 높이 및 해리 거동에 대하여 참조물의 반응 신호와 직접 비교될 수 있다.
용어 "CH2 도메인" 은 대략 EU 위치 231 로부터 EU 위치 340 까지 (Kabat 에 따른 EU 번호화 시스템) 확장되는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 나타낸다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에 있어서 고유하다. 오히려, 2 개의 N-연결된 분지형 탄수화물 사슬은 미손상 선천적 Fc-부위의 2 개 CH2 도메인 사이에 개입된다. 탄수화물이 도메인-도메인 쌍이룸 (pairing) 에 대한 대체물을 제공할 수 있으며 CH2 도메인을 안정화시키는 것을 돕는다는 것이 추측되고 있다. Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206.
용어 "CH3 도메인" 은 대략 EU 위치 341 로부터 EU 위치 446 까지 확장되는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 나타낸다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 한편, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 공급원 또는 종에서 유래하는 항체를 나타낸다.
항체의 "부류" 는 그의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 부위의 유형을 나타낸다. 5 개의 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 이 존재하며, 이들 중 몇몇은 하위부류 (동형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 로 더 분류될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 지칭된다.
용어 "보체-의존적 세포독성 (CDC)" 은 보체의 존재 하 본원에서 보고하는 바와 같은 항체에 의해 유도된 세포의 용해를 나타낸다. 항체가 30 ㎍/㎖ 의 농도에서 표적 세포의 20% 이상의 용해를 유도하는 경우, CDC 가 발견된다. 보체 인자 C1q 에 대한 결합은 ELISA 에서 측정될 수 있다. 이러한 검정에서 원칙적으로 ELISA 플레이트는 항체의 농도 범위로 코팅되는데, 이에 정제된 인간 C1q 또는 인간 혈청이 첨가된다. C1q 결합은 C1q 에 대해 유도되는 항체, 이후 퍼옥시다아제-표지된 접합체에 의해 검출된다. 결합 (최대 결합 Bmax) 의 검출은 퍼옥시다아제 기질 ABTS® (2,2'-아지노-디-[3-에틸벤즈티아졸린-6-술포네이트 (6)]) 에 대해 405 nm 에서의 광학 밀도 (OD405) 로서 측정된다.
"효과기 기능" 은 항체 부류에 따라 가변적인 항체의 Fc-부위에 기인하는 이들 생물학적 활성을 나타낸다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체) 의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.
Fc 수용체 결합 의존적 효과기 기능은 항체의 Fc-부위와 Fc 수용체 (FcR) (조혈 세포 상 특화된 세포 표면 수용체임) 의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. Fc 수용체는 면역글로불린 상과 (superfamily) 에 속하며, 면역 복합체의 식균작용에 의한 항체-코팅된 병원체의 제거, 및 항체 의존적 세포 매개 세포독성 (ADCC) 을 통한 적혈구 및 상응하는 항체로 코팅된 다양한 기타 세포 표적 (예를 들어 종양 세포) 의 용해 둘 모두를 매개하는 것으로 나타난다 (예를 들어, Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524 참조). FcR 은 면역글로불린 동형에 대한 그의 특이성에 의해 정의되고: IgG 항체에 대한 Fc 수용체는 FcγR 로서 지칭된다. Fc 수용체 결합은 예를 들어 [Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; Gessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248] 에 기재되어있다.
IgG 항체의 Fc-부위에 대한 수용체 (FcγR) 의 교차결합은, 면역 복합체 소거 및 항체 생성의 조절 뿐 아니라 식균작용, 항체-의존적 세포 세포독성, 및 염증 매개제의 배출을 포함하는 광범위한 효과기 기능을 촉발시킨다. 인간에서, 하기와 같은 3 개 부류의 FcγR 이 특징화되어있다:
- FcγRI (CD64) 은 고친화성으로 단량체성 IgG 에 결합하며 대식세포, 단핵구, 호중구 및 호산구 상에서 발현된다. Fc-부위 IgG 에서 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327 및 P329 (Kabat 의 EU 지표에 따른 번호화) 중 적어도 하나의 변형은 FcγRI 에 대한 결합을 감소시킨다. IgG1 및 IgG4 로 치환된, 위치 233-236 에서의 IgG2 잔기는 FcγRI 에 대한 결합을 103-배로 감소시켰으며, 항체-민감화 적혈구 세포에 대한 인간 단핵구 반응을 제거하였다 (Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624).
- FcγRII (CD32) 는 중간 내지 저친화성으로 복합화된 IgG 에 결합하며 광범위하게 발현된다. 이러한 수용체는 2 개의 하위유형, FcγRIIA 및 FcγRIIB 로 분화될 수 있다. FcγRIIA 는 사멸에 관련되는 많은 세포 (예를 들어 대식세포, 단핵구, 호중구) 상에서 발견되며 사멸 과정을 활성화시킬 수 있는 것으로 보인다. FcγRIIB 는 저해 과정에 있어서 역할을 하는 것으로 보이며 B-세포, 대식세포 및 비만 세포 및 호산구에서 발견된다. B-세포 상에서 이는 추가 면역글로불린 생성 및 예를 들어 IgE 부류로의 동형 전환을 억제하는 기능을 하는 것으로 보인다. 대식세포 상에서, FcγRIIB 는 FcγRIIA 를 통해 매개되는 바와 같이 식균작용을 저해하는 작용을 한다. 호산구 및 비만 세포 상에서 B-형태는 그의 별개 수용체에 대한 IgE 결합을 통해 이들 세포의 활성화를 억제하는 것을 도울 수 있다. FcγRIIA 에 대한 감소된 결합은 예를 들어 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 및 K414 (Kabat 의 EU 지표에 따름) 중 적어도 하나에서 돌연변이를 갖는 IgG Fc-부위를 포함하는 항체에 대해 발견된다.
- FcγRIII (CD16) 은 중간 내지 저친화성으로 IgG 에 결합하며 2 개 유형으로서 존재한다. FcγRIIIA 는 NK 세포, 대식세포, 호산구 및 일부 단핵구 및 T 세포 상에서 발견되며 ADCC 를 매개한다. FcγRIIIB 는 호중구 상에서 고도로 발현된다. FcγRIIIA 에 대한 감소한 결합이 예를 들어 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 및 D376 (Kabat 의 EU 지표에 따름) 중 적어도 하나에서 돌연변이를 갖는 IgG Fc-부위를 포함하는 항체에 대해 발견된다.
Fc 수용체에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위의 맵핑, 상술한 돌연변이 위치, 및 FcγRI 및 FcγRIIA 에 대한 결합 측정 방법이 [Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604] 에 기재되어있다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "Fc 수용체" 는 수용체와 연관된 세포질 (cytoplasmatic) ITAM 서열의 존재에 의해 특징지어지는 활성화 수용체를 나타낸다 (예를 들어, Ravetch, J.V. and Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290 참조). 이러한 수용체는 FcγRI, FcγRIIA 및 FcγRIIIA 이다. 용어 "FcγR 에 대해 결합하지 않음" 은 10 ㎍/㎖ 의 항체 농도에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체의 NK 세포에 대한 결합이 WO 2006/029879 에서 보고된 바와 같이 항-OX40L 항체 LC.001 에 대해 발견된 결합의 10% 이하라는 것을 나타낸다.
IgG4 가 감소한 FcR 결합을 나타내지만, 다른 IgG 하위부류의 항체는 강력한 결합을 나타낸다. 그러나 Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 탄수화물 손실), Pro329 및 234, 235, 236 및 237 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435 는, 변경되는 경우 또한 FcR 결합을 감소시키는 잔기이다 (Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434). 한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체는 IgG1 또는 IgG2 하위부류의 것이며 돌연변이 PVA236, GLPSS331 및/또는 L234A/L235A 를 포함한다. 한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체는 IgG4 하위부류의 것이며 돌연변이 L235E 를 포함한다. 한 구현예에서 항체는 돌연변이 S228P 를 추가로 포함한다.
본원에서 용어 "Fc-부위" 는 불변 부위의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 부위를 정의하는데 사용된다. 용어는 선천적 (native) 서열 Fc-부위 및 변이체 Fc-부위를 포함한다. 한 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-부위는 Cys226, 또는 Pro230 으로부터, 중쇄의 카르복실-말단까지 확장된다. 그러나, Fc-부위의 C-말단 리신 (Lys447) 은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 다르게 명시하지 않는 한, Fc-부위 또는 불변 부위에서의 아미노산 잔기의 번호화는, [Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242] 에서 기재한 바와 같이, EU 지표로도 지칭하는 EU 번호화 시스템에 따른다.
본원에서 보고되는 바와 같은 항체는 Fc-부위로서, 한 구현예에서는 인간 기원에서 유래한 Fc-부위를 포함한다. 한 구현예에서 Fc-부위는 인간 불변 부위의 모든 부분을 포함한다. 항체의 Fc-부위는 보체 활성화, C1q 결합, C3 활성화 및 Fc 수용체 결합에 직접적으로 관련된다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향이 특정 조건에 따라 의존적이지만, C1q 에 대한 결합은 Fc-부위에서 정의된 결합 위치에 의해 초래된다. 이러한 결합 위치는 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어 Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434 에 의해 기재되어있다. 이러한 결합 위치는 예를 들어 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329 이다 (Kabat 의 EU 지표에 따름; 본원에서 다르게 명시하지 않는 한, Fc-부위 또는 불변 부위에서의 아미노산 잔기의 번호화는 Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242 에서 기재된 바와 같이, EU 지표로도 지칭되는 EU 번호화 시스템에 따름). 하위부류 IgG1, IgG2 및 IgG3 의 항체는 통상 보체 활성화, C1q 결합 및 C3 활성화를 나타내는 한편, IgG4 는 보체 시스템을 활성화시키지 않고, C1q 에 결합하지 않으며 C3 을 활성화시키지 않는다. "항체의 Fc-부위" 는 당업자에게 널리 공지된 용어이며 항체의 파파인 절단을 기반으로 하여 정의된다. 한 구현예에서 Fc-부위는 인간 Fc-부위이다. 한 구현예에서 Fc-부위는 돌연변이 S228P 및/또는 L235E (Kabat 의 EU 지표에 따름) 를 포함하는 인간 IgG4 하위부류의 것이다. 한 구현예에서 Fc-부위는 돌연변이 L234A 및 L235A (Kabat 의 EU 지표에 따름) 를 포함하는 인간 IgG1 하위부류의 것이다.
"골격" 또는 "FR" 은 과가변 부위 (HVR) 잔기 외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR 은 일반적으로 4 개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4 로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL) 에서 하기 서열에서 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전체 길이 항체", "미손상 항체" 및 "전체 항체" 는 본원에서 선천적 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 가지거나 본원에서 정의한 바와 같은 Fc-부위를 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타내는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물" 은 상호교환가능하게 사용되며, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함) 를 나타낸다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포" 를 포함하며 이는 1 차 형질전환 세포 및 계대 수에 관계없이 그로부터 유래한 자손을 포함한다. 자손은 모체 세포와 핵산 함량에 있어서 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 특정 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환 세포에서 스크리닝되거나 선택되는 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
"인간 컨센서스 골격" 은 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격 서열의 선택에 있어서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 골격이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터의 것이다. 일반적으로, 서열의 하위군은 [Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3] 에서와 같은 하위군이다. 한 구현예에서, VL 에 대해, 하위군은 Kabat et al. (상기 참조) 에서와 같은 하위군 카파 I 이다. 한 구현예에서, VH 에 대해, 하위군은 Kabat et al. (상기 참조) 에서와 같은 하위군 III 이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 나타낸다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 및 통상 2 개 모두의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR) 은 비-인간 항체의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 임의로는 인간 항체에서 유래한 항체 불변 부위의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태" 는, 인간화를 거친 항체를 나타낸다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "과가변 부위" 또는 "HVR" 은, 서열에서 과가변인 아미노산 잔기 스트레치를 포함 ("상보성 결정 부위" 또는 "CDR") 하고/하거나 구조적으로 규정된 루프를 형성 ("과가변 루프") 하고/하거나 항원-접촉 잔기를 함유 ("항원 접촉부") 하는 항체 가변 도메인의 부위 각각을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6 개의 HVR 을 포함하는데; 3 개는 VH (H1, H2, H3) 에 있고, 3 개는 VL (L1, L2, L3) 에 있다.
HVR 은:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) 에서 발생하는 과가변 루프 (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) 에서 발생하는 CDR (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) 및 93-101 (H3) 에서 발생하는 항원 접촉부 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) 및 94-102 (H3) 을 포함하는, (a), (b) 및/또는 (c) 의 조합
을 포함한다.
다르게 나타내지 않는 한, 가변 도메인에서의 HVR 잔기 및 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기) 는 본원에서 Kabat et al. (상기 참조) 에 따라 번호화된다.
용어 "힌지 부위" 는 야생형 항체 중쇄에서 CH1 도메인과 CH2 도메인을 연결시키는, 예를 들어 약 위치 216 에서 약 위치 230 의 (Kabat 의 EU 번호화 시스템에 따름), 또는 약 위치 226 에서 약 위치 230 의 (Kabat 의 EU 번호화 시스템에 따름) 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 나타낸다. 다른 IgG 하위부류의 힌지 부위는 IgG1 하위부류 서열의 힌지-부위 시스테인 잔기에 맞추어 조정함으로써 결정될 수 있다.
힌지 부위는 보통, 동일한 아미노산 서열을 갖는 2 개의 폴리펩티드로 이루어지는 이량체성 분자이다. 힌지 부위는 일반적으로 약 25 개의 아미노산 잔기를 포함하며 항원 결합 부위가 독립적으로 움직이도록 유연성이 있다. 힌지 부위는 3 개 도메인: 상부, 중부 및 하부 힌지 도메인으로 세분화될 수 있다 (예를 들어 Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083 참조).
한 구현예에서 힌지 부위는 아미노산 서열 DKTHTCPX4CP 를 가지며, 여기서 X4 는 S 또는 P 이다. 한 구현예에서 힌지 부위는 아미노산 서열 HTCPX4CP 를 가지며, 여기서 X4 는 S 또는 P 이다. 한 구현예에서 힌지 부위는 아미노산 서열 CPX4CP 를 가지며, 여기서 X4 는 S 또는 P 이다.
용어 Fc-부위의 "하부 힌지 부위" 는 힌지 부위의 바로 C-말단의 아미노산 잔기의 스트레치, 즉 Kabat 의 EU 번호화에 따른 Fc-부위의 잔기 233 ~ 239 를 나타낸다.
"개인" 또는 "대상" 은 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로, 가축 (예를 들어 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트) 를 포함한다. 특정 구현예에서, 개인 또는 대상은 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 자연적 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 에 의해 측정되는 바와 같이 95% 또는 99% 초과 순도로 정제된다. 항체 순도 평가를 위한 방법의 검토를 위해서는, 예를 들어 [Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87] 를 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연적 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 나타낸다. 단리된 핵산은 정상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하나, 핵산 분자는 염색체외 또는 그의 자연적 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-변이체 (인간) Fc-부위 항체를 인코딩하는 단리된 핵산" 은, 단일 벡터 또는 별개 벡터에 이러한 핵산 분자(들) 를 포함하며 이러한 핵산 분자(들) 는 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는, 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편) 를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 나타낸다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "단일클론 항체" 는 실질적으로 동질 항체 집단, 즉 동일한 집단 및/또는 동일한 에피토프에 결합하는 집단을 포함하는 개별 항체 (예를 들어, 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 단일클론 항체 제조물의 생성 동안 발생하는 (이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재함), 가능한 변이체 항체는 제외) 에서 수득한 항체를 나타낸다. 통상 상이한 결정자 (에피토프) 에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제조물과 반대로, 단일클론 항체 제조물의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "단일클론" 은 항체의 실질적 동질 집단에서 수득되는 바와 같은 항체의 특질을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것으로서 이해되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단일클론 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 모두 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 비제한적으로 포함하는 다양한 기법에 의해 만들어질 수 있으며, 이러한 방법 및 단일클론 항체 생성을 위한 기타 예시적 방법이 본원에 기재된다.
"선천적 항체" 는 가변적 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 나타낸다. 예를 들어, 선천적 IgG 항체는 2 개의 동일한 경쇄 및 2 개의 동일한 중쇄 (디술피드-결합됨) 로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 부위 (VH), 이후 3 개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3) 을 가져, 그로써 첫 번째와 두 번째 불변 도메인 사이에 힌지 부위가 위치한다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 부위 (VL), 이후 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 지칭되는 2 개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)" 는, 필요시, 최대 서열 동일성 % 가 달성되도록 하는 서열 정렬 및 갭 (gap) 도입 후, 참조 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되며, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환은 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 % 를 측정하기 위한 정렬은, 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교하는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해서, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2 를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc. 에 의해 만들어졌으며, 원시 코드 (source code) 는 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559 에서 사용자 문서로 채워지며, 이는 U.S. Copyright Registration No. TXU510087 하에 등록된다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, California 로부터 공개적으로 이용가능하거나, 원시 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D 를 포함하는 UNIX 운영 체제에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 가변적이지 않다.
ALIGN-2 가 아미노산 서열 비교를 위해 이용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B 에 대한, 주어진 아미노산 서열 B 와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B 에 비한 주어진 아미노산 서열 A 의 아미노산 서열 동일성 % (이는 대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B 에 대한, 주어진 아미노산 서열 B 와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B 에 비한 특정 아미노산 서열 동일성 % 를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A 로서 표현될 수 있음) 는 하기와 같이 계산되며:
100 x 분수 X/Y
여기서 X 는, A 및 B 의 프로그램 정렬에 있어서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 에 의해 동일한 매치로서 점수 매겨진 아미노산 잔기의 수이고, Y 는 B 에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A 의 길이는 아미노산 서열 B 의 길이와 동일하지 않다는 것이 인지될 것이며, A 대 B 의 아미노산 서열 동일성 % 는 B 대 A 의 아미노산 서열 동일성 % 와 동일하지 않을 것이다. 다르게 명시적으로 언급하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 직전의 단락에서 기재되는 바와 같이 수득된다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "선천적 Fc-부위" 및 "야생형 Fc-부위" 는 다르게 나타내지 않는 한, 영장류 (예를 들어 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트) 와 같은 포유동물을 포함하는 임의의 척추동물 근원으로부터의 임의의 선천적 또는 야생형 Fc-부위를 나타낸다.
용어 "변이체 (인간) Fc-부위" 는 적어도 하나의 "아미노산 변경/돌연변이" 에 의해 "선천적" 또는 "야생형" (인간) Fc-부위 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 나타낸다. 한 구현예에서 변이체 Fc-부위는 선천적 Fc-부위와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 돌연변이, 예를 들어 선천적 Fc-부위에서 약 1 내지 약 10 개의 아미노산 돌연변이, 한 구현예에서 약 1 내지 약 5 개의 아미노산 돌연변이를 갖는다. 한 구현예에서 (변이체) Fc-부위는 야생형 Fc-부위와 적어도 약 80% 상동성을 갖고, 한 구현예에서 변이체 Fc-부위는 적어도 약 90% 상동성을 갖고, 한 구현예에서 변이체 Fc-부위는 적어도 약 95% 상동성을 갖는다.
본원에서 보고하는 바와 같은 변이체 Fc-부위는 함유되는 아미노산 변경에 의해 정의된다. 따라서, 예를 들어 용어 P329G 는 모체 (야생형) Fc-부위에 관하여 아미노산 위치 329 에서 프롤린의 글리신으로의 돌연변이를 갖는 변이체 Fc-부위를 나타낸다. 야생형 아미노산의 동일성은 명시되지 않을 수 있는데, 이러한 경우 상술한 변이체를 329G 로서 나타낸다. 변경은 첨가, 결실 또는 돌연변이일 수 있다. 용어 "돌연변이" 는 자연 발생 아미노산에 대한 변화 뿐 아니라 비-자연 발생 아미노산에 대한 변화를 나타낸다 (예를 들어 US 6,586,207, WO 98/48032, WO 03/073238, US 2004/0214988, WO 2005/35727, WO 2005/74524, Chin, J.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026-9027; Chin, J.W. and Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024; Wang, L. and Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10 참조).
용어 "야생형 Fc-부위" 는 자연에서 발견된 Fc-부위의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 나타낸다. 야생형 인간 Fc-부위는 선천적 인간 IgG1 Fc-부위 (비-A 및 A 동종이인자형), 선천적 인간 IgG2 Fc-부위, 선천적 인간 IgG3 Fc-부위 및 선천적 인간 IgG4 Fc-부위 뿐 아니라 이의 자연 발생 변이체를 포함한다.
용어 "치료적 항체" 는 인간에서 사용하기 위해 의도되는 임의의 항체 제조물에 관한 것이다. 바람직하게는 이러한 치료적 항체는 단일클론 항체일 것이다. 추가로 바람직한 이러한 단일클론 항체는 유인원으로부터 수득되거나 인간 단일클론 항체일 것이다. 바람직하게는, 이는 인간 단일클론 항체일 것이다. 또한 바람직한 이러한 치료적 단일클론 항체는 인간화 단일클론 항체일 것이다.
용어 "가변 부위" 또는 "가변 도메인" 은 항체를 항원에 결합시키는 것에 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 나타낸다. 선천적 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 보존된 골격 부위 (FR) 및 3 개의 과가변 부위 (HVR) 를 포함한다 (예를 들어, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 91 페이지 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다 (예를 들어, Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628 참조).
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "벡터" 는, 연결되는 또 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐 아니라 도입되는 숙주 세포 게놈에 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결되는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서 "발현 벡터" 로서 나타낸다.
II. 조성물 및 방법
한 양태에서, 본 발명은 부분적으로, 상응하는 야생형 (인간) Fc-부위에 실질적으로 결합하지 않는, 변이체 (인간) Fc-부위에 특이적으로 결합하는 항체가 제공될 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 특정 구현예에서, 돌연변이 P329G 또는 L234A, L235A, P329G 또는 I253A, H310A, H435A 를 갖는 인간 Fc-부위에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다 (Kabat 의 EU 지표에 따름). 본 발명의 항체는, 예를 들어 샘플 중 각각의 치료적 항체의 측정, 또는 치료적 항체에 대한 항-약물 항체 (ADA) 의 측정에 유용하다.
A. 예시적 항-Fc-부위 항체
시노몰구스 (cynomolgus) 또는 마우스에서의 전임상 연구에 대해 전에 기재된 바와 같이 (Stubenrauch, K., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 52 (2010) 249-254; Moore, G.L., et al., MAbs 2 (2010) 181-189; Stubenrauch, K., et al., Anal. Biochem. 430 (2012) 193-199; Carrasco-Triguero, M., et al., J. Immunol. Res. 2016 2618575 (2016)), 약물 내성 (drug tolerance) 은 약물 및 ADA (항-약물 항체) 의 복합체를 검출하는 포괄적 (generic) 또는 보편적 (universal) 검정 포맷에 의해 개선될 수 있다. 마찬가지로, 본원에서 보고하는 바와 같은 검정, 예를 들어 hsFcγRI-PG 검정에 의한 약물-ADA 복합체의 검출 (약물 = 사전에 투여한 치료적 항체) 은 포획 또는 검출 시약으로서 표지된 약물 항체를 필요로 하지 않는다. 이러한 검정 구성이 개선된 약물 내성을 초래한다는 것이 발견되었다. 이는 스파이킹 (spiking) 실험에서 확인되었다.
약물 내성 인자는, 양성적으로 검출가능한 양성 대조군의 양과 샘플 중 존재하는 약물의 양 사이의 비이다. 가교 검정에 대해서는 약물 내성 인자 6 (500 ng/㎖ 양성 대조군이 최대 3 ㎍/㎖ 약물의 존재 하에 검출될 수 있었음), 한편 hsFcγRI-PG 검정에 대해서는 약물 내성 인자 833 (30 ng/㎖ 대조군 ADA 가 최대 25 ㎍/㎖ 약물의 존재 하에 양성으로 발견되었음) 이 측정되었다.
본원에서 보고하는 바와 같은 검정 및 표준 가교 검정으로, ADA 발생의 시간 경과를 4 명의 환자로부터의 임상 샘플로부터 측정하였다 (도 7). 이들 데이터세트는, 약물 내성, 민감성 및 Ig 동형 특이성에 관해 두 검정 모두의 차이를 예시적 방식으로 보여준다.
환자 A (하기 표; 도 7a) 에서, 두 검정 모두는 가교 검정에 대해 120h 에서 및 hsFcγRI-PG 검정에 대해 168h 에서 초기 ADA 양성도를 보여준다. 두 검정 모두에 대해 168h 에서의 ADA 신호는 비슷하며 대략 0.5 OD 로 유의하다. 샘플 중 상응하는 약물 수준은 매우 낮다 (약 2 ng/㎖). 다음 측정 시점에서, 두 번째 투여 24h 후 (C2 24h), 약물 수준은 훨씬 더 높다 (약 2430 ng/㎖). 이는 가교 검정에 영향을 주어, 주요 신호가 상응하는 커트 포인트 (cut point) 미만으로 감소되게 한다. 반대로 hsFcγRI-PG 검정은 약물에 의해 영향받지 않으며, ADA 신호는 심지어 168h 에서 C2 24h 으로 상승한다.
가교 검정에 대한 약물 수준 상승으로 인한 유사한 신호 감소가 다른 환자 샘플에서 관찰되었다 (하기 표 참조). hsFcγRI-PG 검정의 신호는 어느 환자에서도 영향받지 않았으며, 이러한 검정의 개선된 약물 내성이 확인되었다.
표: 종래의 가교 검정 및 본원에서 보고하는 바와 같은 hsFcγRI-PG 검정에 의한 8 명의 환자에서의 ADA 형성의 평가.
Figure pct00001
Figure pct00002
도 7b 는 환자 B 의 시간 경과를 보여준다 (상기 표). 96h 에서의 초기 양성도 후, 가교 검정은 다음 6 개 지점에 걸쳐 매우 낮은 신호를 나타내며, 4 개 신호는 심지어 커트 포인트 미만이어서, 이들 샘플의 음성 분류를 초래한다. 이는 시점 C2 24h 및 C3 24h 에 대한 약물 수준 증가로 인한 것일 수 있으나, 정량 한계 미만의 약물 수준으로는 (C3 pre), 샘플은 가교 검정에서 커트 포인트 미만의 ADA 신호를 나타낸다.
hsFcγRI-PG 검정은 또한 C2 24h 에서 초기 양성도를 나타낸다. 그러나, 이러한 환자는 전체 시간 경과 동안 유의한 신호로 양성으로 남아 있다. 이는 가교 검정과 비교하여 hsFcγRI-PG 검정에 대한 더 양호한 민감성을 나타낸다. 환자 A (상기 표; 도 7a) 는 또한 가교 검정과 비교하여 hsFcγRI-PG 검정에서 매우 늦은 시점 동안 훨씬 더 높은 신호를 나타낸다. 1 명의 환자는 전체 시간 경과에 걸쳐 가교 검정에서 음성이었으며, 마지막 2 시점 동안 hsFcγRI-PG 검정에서 양성으로 검출되었다.
hsFcγRI-PG 검정에서 1 내지 50 희석 샘플 및 가교 검정에서 1 내지 10 희석 샘플을 사용한 두 검정 모두에 대한 상이한 희석 인자를 또한 고려하면, hsFcγRI-PG 검정은 특히 후기 ADA 반응에 대해 보다 민감성이어서, 일부 연구 샘플에서 ADA 양성도에 있어서 질적 차이를 초래한다.
반대로, 가교 검정은 hsFcγRI-PG 검정보다 훨씬 더 낮은 커트 포인트를 가지며, 초기 ADA 반응에 대해 가교 검정은 hsFcγRI-PG 검정보다 더 높은 신호를 나타낸다. 일부 환자에 대해, 표준 가교 검정은 hsFcγRI-PG 검정에서보다 초기 ADA 반응에 대해 더 높은 신호 세기 및/또는 더 조기의 ADA 양성도를 나타내었다. 이는 예를 들어 환자 C 에 대해 관찰될 수 있다 (상기 표; 도 7c). 가교 검정은 96h 부터 계속 모든 샘플에 대해 양성도를 나타내며, hsFcγRI-PG 검정은 단지 마지막 2 시점 동안 양성 ADA 양성도를 나타낸다. hsFcγRI-PG 검정이 독점적으로 IgG 를 검출하나 IgM 는 검출하지 않으므로 (Fridman, W.H., FASEB J. 5 (1991) 2684-2690), 가교 검정에 의해 관찰된 ADA 양성도의 제 1 피크가 IgM 반응을 반영할 가능성이 높은데, 이는 IgM 이 통상 초기 항원 노출에 대한 반응으로 나타나는 제 1 항체 부류이기 때문이다 (Stewart, J.J., et al., Autoimmunity 44 (2011) 294-303). 초기 샘플에서 가교 검정에서의 이러한 더 높은 ADA 반응의 패턴은, IgM 반응이 3/8 환자에서 관찰될 수 있다는 것을 나타낸다. 일시적 진행으로 가교 검정에 대해 초기 ADA 반응을 나타내었으므로, 환자 D (상기 표) 는 특히 중요하였다. hsFcγRI-PG 검정은 유사한 일시적 진행으로 단지 약한 ADA 양성도를 나타내었는데, 이는 IgM 의 우세한 비율을 갖는 혼합 IgM, IgG 반응을 나타낸다. 특히 높은 수준의 류마티스 인자를 갖는 환자에 대해, IgM 는 가교 ADA 검정에 대한 문제점이 될 수 있어, 위양성 결과를 초래한다 (Stubenrauch, K., et al., Clin. Ther. 32 (2010) 1597-1609).
두 검정 포맷 모두의 조합은 ADA 반응에 관한 해석이 가능하게 하는데, 이는 단 하나의 검정으로는 가능하지 않다.
본원에서 보고하는 바와 같은 검정 및 표준 가교 검정은 ADA 포획 및 검출의 원리에 있어서 상이하다. 가교 검정에서, ADA 는 구별하여 표지된 약물 분자에 의해 포획되고 검출된다. 그 결과, 올리고머성 표적은 위양성 결과를 생성할 수 있으며, 약물 내성은 통상 낮다 (Bautista, A.C., et al., Bioanal. 2 (2010) 721-731; Mire-Sluis, A.R., et al., J. Immunol. Meth. 289 (2004) 1-16 (2004); Weeraratne, D.K., et al., J. Immunol. Meth. 396 (2013) 44-55; Zhong, Z.D., et al., J. Immunol. Meth. 355 (2010) 21-28). 그러나, 가교 검정은 IgM 을 포함하는 각종 Ig-아형의 ADA 를 검출할 수 있으며 모든 종류의 치료적 항체에 적용가능하다 (Mire-Sluis, A.R., et al., J. Immunol. Meth. 289 (2004) 1-16 (2004); Geng, D., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 39 (2005) 364-375). hsFcγRI-PG 검정에서, 치료적 항체의 결합 부위와 관계없이 ADA 및 치료적 mAb 의 복합체가 검출된다. 이러한 검정은 올리고머성 표적에 의해 영향받지 않으며, 약물 내성이 표준 가교 포맷에서보다 훨씬 더 양호하다. 검정은 FcyRI-기반 항체 검출로 인해, IgG 외의 Ig-아형을 인지하지 않는다. 또한, FcyRI-기반 검정은 Fc-부위 내에 PG 변형을 가지는 치료적 항체에 특히 적합하다. 이러한 치료적 항체 군에 대해, hsFcγRI-PG 검정은 포괄적 접근방식을 나타내며 용이하게 적용될 수 있다. 또한, hsFcγRI-PG 검정에 대해, 표지된 형태로 치료적 항체 (약물) 를 사용할 필요가 없다. 특히 치료적 항체 (예를 들어 다가 항체 또는 항체-약물 접합체) 의 복잡성 증가에 관하여, 표지화가 어려울 수 있다.
요약하여, 본원에서 보고하는 바와 같은 검정은 Fc-부위 변형된 치료적 항체에 대한 ADA 의 강건하고 민감한 검출을 위한 가능성을 제공한다. 표준 가교 검정과 조합으로, 이는 예를 들어 IgG 기반의 것으로서 검정 신호를 분류함으로써 보다 상세히 면역 반응을 특징화하는데 사용될 수 있다.
본원에서 보고하는 바와 같은 검정은 포괄적 접근방식이며 모든 치료적 항체, 예를 들어 Pro329Gly 치환을 갖고 FcγR 결합이 방지된 것들에 대해 적용가능하다. hsFcγRI-PG 검정은 약물-ADA 복합체를 검출하며 2 개의 특이적 검정 시약, (i) Fc-부위 변형에 대해 이중-표지된 항체 (예를 들어 P329G 변형된 치료적 항체) 및 (ii) 인간 IgG1 을 특이적으로 검출하나 Fc-부위 변형된 Ig 는 검출하지 않는 dig-표지된 hsFcγRI 을 기반으로 한다. 종래의 가교 검정과 비교하여, 후기 면역 반응에 대한 민감성 및 약물 내성은 hsFcγRI-PG 검정에서 현저하게 개선된다. hsFcγRI-기반 검정에 의해서 비-IgG 관련 신호가 검출되지 않으나 종래의 가교 검정에 의해서는 검출되므로, 두 검정의 조합은 IgG 와 IgM 반응 사이의 초기 분화를 포함하여 면역원성의 보다 상세하고 강건한 평가를 가능하게 한다.
본원에서 보고하는 바와 같은 검정은 임상 시험 및 전임상 시험 둘 모두에 대해 적용가능하다. 인간 및 시노몰구스 원숭이 IgG 둘 모두의 Fc 부위는 높은 서열-상동성을 가지며 (Jacobsen, F.W., et al., J. Immunol. 186 (2011) 341-349), hsFcγRI-기반 검출 시약은 시노몰구스 원숭이에서 치료적 mAb 에 대한 ADA 를 인지하는 것으로 입증되어있다 (Wessels, U., et al., Bioanalysis 8 (2016) 2135-2145). 이러한 점은, 동물 및 인간 샘플의 분석에 있어서 상이한 검정의 필요조건을 제거한다. 더욱이, PG-치환 외의 여러 다른 Fc 변형이, Fc 수용체 및 보체 둘 모두에 대한 치료적 항체의 친화성에 영향을 주고, 그 결과로 그의 기능적 프로필을 변경시킨다는 것이 확인되어있다 (Moore, G.L., et al., MAbs 2 (2010) 181-189; Richards, J.O., et al., Mol. Cancer. Ther. 7 (2008) 2517-2527; Lazar, G.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2010) 4005-4010; Schlothauer, T., et al., Prot. Eng. Des. Sel. 29 (2016) 457-466).
본원에서 보고하는 바와 같은 검정의 원리는 특이적 항체의 생성을 가능하게 하는 광범위한 Fc-부위 돌연변이로 인계될 수 있다.
여기서 나타낸 예에서, 샘플을 치료적 항체를 함유하는 검정 완충제 중 예비인큐베이션하였으나, 기존 약물-AD 복합체는 약물의 사전 스파이킹 없이 동일한 프로토콜에 의해 동일하게 검출될 수 있다. ADA 형성에 관련된 많은 역효과가 ADA 면역 복합체의 형성으로 인해 생기므로, 약물 면역 복합체에서 결합된 ADA 의 검출이 특히 중요한 것으로 나타난다 (Krishna, M. and Nadler, S.G., Front. Immunol. 7 (2016) 21).
요약하여, 종래의 가교 검정과 본원에 보고하는 바와 같은 방법의 조합은 억제되거나 변경된 Fc 효과기 기능을 갖는 치료적 mAb 의 면역원성 프로필을 특징화하는 것을 돕는다. 높은 수준의 가용성 올리고머성 표적이 발생하고, 높은 약물 농도가 전임상 및 임상 샘플에 존재하는 경우, 이러한 접근방식이 가장 중요한 것일 수 있다.
따라서, 본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는, (약물 항체를 투여한 환자의) 샘플 중 항-약물 항체의 존재 및/또는 양의 측정을 위한 방법이다:
- 샘플을 (Fc-부위 내 하나 이상의 치환(들) 의 도입에 의한) Fc 효과기 기능이 없는 항체에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 인큐베이션하여, 샘플로부터 Fc 효과기 기능이 없는 항체를 포획하는 단계 (자유 및 ADA 복합화 항체 포함),
- 포획된 항체를 인간 가용성 FcγRI 와 함께 인큐베이션하여, 포획된 항체를 검출하고,
샘플 중 항-약물 항체의 존재 및/또는 양을 측정하는 단계.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 샘플을 본원에서 보고하는 바와 같은 항-PG 항체 (Fc-부위에서 P329G 치환을 가지며 인간 IgG1 하위부류의 것인 약물 항체에 특이적으로 결합함) 와 함께 인큐베이션하여, 샘플로부터 약물 항체를 포획하는 단계 (자유 및 ADA 복합화 약물 항체 포함),
- 포획된 약물 항체를 인간 가용성 FcγRI 와 함께 인큐베이션하여, 포획된 약물 항체를 검출하고,
결합한 인간 가용성 FcγRI 의 존재 및/또는 양을 측정하여, 샘플 중 항-약물 항체의 존재 및/또는 양을 측정하는 단계.
한 구현예에서 항-PG 항체는 고체상에 고정된다.
한 구현예에서 항-PG 항체는 (a) SEQ ID NO: 20 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 32 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 34 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 35 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함한다.
본원에서 보고하는 바와 같은 항체는 하기 서열을 갖는다:
Figure pct00003
한 양태에서, 본 발명은 변이체 (인간) Fc-부위에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 본원에서 보고하는 바와 같은 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체 (항-AAA 항체) 는:
● 아미노산 잔기 (A)253, (A)310 및 (A)435 를 포함하는 변이체 (인간) Fc-부위 상의 에피토프에 특이적으로 결합하고 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름),
● 위치 253, 310 및 435 에서 알라닌 아미노산 잔기를 갖는 변이체 (인간) Fc-부위에 특이적으로 결합하고 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름),
● 위치 253 에서 이소류신 아미노산 잔기 및 위치 310 에서 히스티딘 아미노산 잔기 및 위치 435 에서 히스티딘 아미노산 잔기를 갖는 야생형 (인간) Fc-부위에 (특이적으로) 결합하지 않고 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름),
● 위치 253 에서 이소류신 아미노산 잔기 및 위치 310 에서 히스티딘 아미노산 잔기 및 위치 435 에서 히스티딘 아미노산 잔기 및 위치 329 에서 글리신 아미노산 잔기 및 위치 234 에서 알라닌 아미노산 잔기 및 위치 235 에서 알라닌 아미노산 잔기를 갖는 (인간) Fc-부위에 (특이적으로) 결합하지 않고 (번호화는 Kabat 에 따름),
● 위치 253 에서 이소류신 아미노산 잔기 및 위치 310 에서 히스티딘 아미노산 잔기 및 위치 435 에서 히스티딘 아미노산 잔기 및 위치 329 에서 프롤린 아미노산 잔기 및 위치 234 에서 류신 아미노산 잔기 및 위치 235 에서 류신 아미노산 잔기를 갖는 변이체 (인간) Fc-부위에 (특이적으로) 결합하지 않는다 (번호화는 Kabat 에 따름).
용어 "(특이적으로) 결합하지 않는" 은, 결합이 측정되는 검정에서, 수득한 결과가 의문의 항체를 포함하지 않는 샘플, 즉 블랭크 샘플 또는 완충제 샘플로 수득한 결과와 크게 상이하지 않은 것을 나타낸다.
한 특정 구현예에서 변이체 (인간) Fc-부위는 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A 를 갖는 인간 IgG1 또는 IgG4 하위부류의 Fc-부위이다 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름).
한 양태에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 09 또는 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 12, 13 또는 14 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO: 16, 17 또는 18 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 23 또는 24 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 26 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 28, 29 또는 30 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 HVR 을 포함하는, 위치 253, 310 및 435 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름) 에서 각각 아미노산 잔기 알라닌을 포함하는 Fc-부위에 특이적으로 결합하는 항-Fc-부위 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) SEQ ID NO: 09 또는 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) SEQ ID NO: 12 또는 13 또는 14 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 16, 17 또는 18 에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) SEQ ID NO: 23 또는 24 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) SEQ ID NO: 26 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) SEQ ID NO: 28, 29 또는 30 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 09 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 23 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 26 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 28 에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 13 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO: 17 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 24 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 26 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 29 에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO: 18 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 24 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 26 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 30 에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 상기 제공되는 바와 같은 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체의 임의의 하나 이상의 아미노산은 하기의 HVR 위치에서 치환된다:
- HVR-H1 (SEQ ID NO: 11) 에서: 위치 5;
- HVR-H2 (SEQ ID NO: 15) 에서: 위치 3, 7, 8, 11, 12;
- HVR-H3 (SEQ ID NO: 19) 에서: 위치 2, 10;
- HVR-L1 (SEQ ID NO: 25) 에서: 위치 3, 14;
- HVR-L2 (SEQ ID NO: 27) 에서: 위치 4; 및
- HVR-L3 (SEQ ID NO: 31) 에서: 위치 1, 6.
특정 구현예에서, 치환은 본원에 제공되는 바와 같이 보존적 치환이다. 특정 구현예에서, 하기 아미노산 잔기 중 임의의 하나 이상 (단독 또는 서로 독립적으로 조합으로의 임의의 것) 은 임의의 조합으로 하기와 같이 존재할 수 있다:
- HVR-H1 (SEQ ID NO: 11) 에서: 위치 5 에서, S, T, N 및 Q 로 이루어지는 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 중성 친수성 아미노산 잔기;
- HVR-H2 (SEQ ID NO: 15) 에서: 위치 3 에서, S, T, N, Q, D 및 E 로 이루어지는 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 중성 친수성 또는 산성 아미노산 잔기, 위치 7 에서, S, T, N, Q, H, K 및 R 로 이루어지는 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 중성 친수성 또는 염기성 아미노산 잔기, 위치 8 에서, S, T, N, Q, G 및 P 로 이루어지는 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 중성 친수성 아미노산 잔기 또는 사슬 배향에 영향을 주는 잔기, 위치 11 에서, S, T, N, Q, G, P, W, Y 및 F 로 이루어지는 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 중성 친수성 또는 방향족 아미노산 잔기 또는 사슬 배향에 영향을 주는 잔기, 위치 12 에서, S, T, N, Q, G 및 P 로 이루어지는 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 중성 친수성 아미노산 잔기 또는 사슬 배향에 영향을 주는 잔기;
- HVR-H3 (SEQ ID NO: 19) 에서: 위치 2 에서, M, A, V, L, I, W, Y 및 F 로 이루어지는 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 소수성 또는 방향족 아미노산 잔기, 위치 10 에서, S, T, N, Q, W, Y 및 F 로 이루어지는 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 중성 친수성 또는 방향족 아미노산 잔기;
- HVR-L1 (SEQ ID NO: 25) 에서: 위치 3 에서, S, T, N 및 Q 로 이루어지는 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 중성 친수성 아미노산 잔기, 위치 14 에서, S, T, N, Q, D 및 E 로 이루어지는 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 중성 친수성 또는 산성 아미노산 잔기;
- HVR-L2 (SEQ ID NO: 27) 에서: 위치 4 에서, E, D, H, K 및 R 로 이루어지는 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 산성 또는 염기성 아미노산 잔기; 및
- HVR-L3 (SEQ ID NO: 31) 에서: 위치 1 에서, M, A, V, L 및 I 로 이루어지는 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 소수성 아미노산 잔기, 위치 6 에서, S, T, N, Q, D 및 E 로 이루어지는 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 중성 친수성 또는 산성 아미노산 잔기.
상기 치환의 모든 가능한 조합은 SEQ ID NO: 11, 15, 19, 25, 27 및 31 의 컨센서스 서열에 의해 포함된다.
상기 임의의 구현예에서, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 인간화된다. 한 구현예에서, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 상기 임의의 구현예에서와 같은 HVR 을 포함하고, 수용기 인간 골격, 예를 들어 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격을 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서 인간화 항체는 SEQ ID NO: 01 에서 유래한 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 02 에서 유래한 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하고, 인간화 항체는 중쇄 가변 도메인으로서 SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열 및 경쇄 가변 도메인으로서 SEQ ID NO: 02 의 아미노산 서열을 함유하는 키메라 또는 쥐과 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는다.
또 다른 구현예에서 인간화 항체는 SEQ ID NO: 03 에서 유래한 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 04 에서 유래한 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하고, 인간화 항체는 중쇄 가변 도메인으로서 SEQ ID NO: 03 의 아미노산 서열 및 경쇄 가변 도메인으로서 SEQ ID NO: 04 의 아미노산 서열을 함유하는 키메라 또는 쥐과 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는다.
또 다른 구현예에서 인간화 항체는 SEQ ID NO: 07 에서 유래한 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 08 에서 유래한 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하고, 인간화 항체는 중쇄 가변 도메인으로서 SEQ ID NO: 07 의 아미노산 서열 및 경쇄 가변 도메인으로서 SEQ ID NO: 08 의 아미노산 서열을 함유하는 키메라 또는 쥐과 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 SEQ ID NO: 01, 03 및 07 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하나, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 변이체 (인간) Fc-부위에 결합하는 능력을 유지하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 개 아미노산이 SEQ ID NO: 01, 03 및 07 중 어느 하나에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 부위에서 (즉, FR 에서) 발생한다. 임의로는, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 서열의 번역 후 변형을 포함하여, SEQ ID NO: 01, 03 및 07 중 어느 하나에서와 같은 VH 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체가 제공되며, 여기서 항체는 SEQ ID NO: 02, 04 또는 08 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하나, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 변이체 (인간) Fc-부위에 결합하는 능력을 유지하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 02, 04 또는 08 에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 부위에서 (즉, FR 에서) 발생한다. 임의로는, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 서열의 번역 후 변형을 포함하여, SEQ ID NO: 02, 04 또는 08 의 VL 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체가 제공되며, 여기서 항체는 상기 제공된 구현예 중 어느 하나에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 구현예 중 어느 하나에서와 같은 VL 을 포함한다. 한 구현예에서, 항체는 (i) SEQ ID NO: 01 및 SEQ ID NO: 02 에서의 VH 및 VL 서열, 또는 (ii) SEQ ID NO: 03 및 SEQ ID NO: 04 에서의 VH 및 VL 서열 각각, 또는 (iii) SEQ ID NO: 07 및 SEQ ID NO: 08 에서의 VH 및 VL 서열 (이들 서열의 번역 후 변형 포함) 을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 보고하는 바와 같은 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체 (항-PG 항체) 는:
● 아미노산 잔기(들) ((A)234, (A)235 및) (G)329 를 포함하는 변이체 (인간) Fc-부위 상의 에피토프에 특이적으로 결합하고 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름),
● (위치 234 및 235 에서 알라닌 아미노산 잔기, 및) 위치 329 에서 글리신 아미노산 잔기를 갖는 변이체 (인간) Fc-부위에 특이적으로 결합하고 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름),
● 위치 234 및 235 에서 알라닌 아미노산 잔기, 위치 329 에서 글리신 아미노산 잔기 및 위치 253 에서 이소류신 아미노산 잔기 및 위치 310 에서 히스티딘 아미노산 잔기 및 위치 435 에서 히스티딘 아미노산 잔기를 갖는 변이체 (인간) Fc-부위에 특이적으로 결합하고 (번호화는 Kabat 에 따름),
● 위치 234, 235, 253, 310 및 435 에서 알라닌 아미노산 잔기, 및 위치 329 에서 글리신 아미노산 잔기를 갖는 변이체 (인간) Fc-부위에 특이적으로 결합하고 (번호화는 Kabat 에 따름),
● (위치 234 및 235 에서 류신 아미노산 잔기, 및) 위치 329 에서 프롤린 아미노산 잔기를 갖는 야생형 (인간) Fc-부위에 (특이적으로) 결합하지 않고 (번호화는 Kabat 에 따름),
● 위치 234 및 235 에서 류신 아미노산 잔기, 및 위치 329 에서 프롤린 아미노산 잔기 및 위치 253 에서 이소류신 아미노산 잔기 및 위치 310 에서 히스티딘 아미노산 잔기 및 위치 435 에서 히스티딘 아미노산 잔기를 갖는 야생형 (인간) Fc-부위에 (특이적으로) 결합하지 않고 (번호화는 Kabat 에 따름),
● 위치 234 및 235 에서 류신 아미노산 잔기, 및 위치 329 에서 프롤린 아미노산 잔기 및 위치 253 에서 알라닌 아미노산 잔기 및 위치 310 에서 알라닌 아미노산 잔기 및 위치 435 에서 알라닌 아미노산 잔기를 갖는 변이체 (인간) Fc-부위에 (특이적으로) 결합하지 않는다 (번호화는 Kabat 에 따름).
항-PG 항체 생성을 위해 수행된 면역화가 P329G, L234A 및 L235A Fc-부위 치환을 가지는 인간 IgG1 로 수행되었으므로, 이들 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하는 항체를 수득하는 것이 예측되었다. 놀랍게도, 수득한 항체가 L234A 및 L235A 돌연변이의 존재 또는 부재와 관계없이 인간 IgG1 및 Fc-부위 단편 (P239G 돌연변이만을 가짐) 에 특이적으로 결합하는 한편, 인간 wt-IgG1 및 인간 IgG1 (돌연변이 L234A 및 L235A 를 가짐) 에는 결합하지 않았다. 따라서, 본원에서 보고하는 바와 같은 항-PG 항체는 인간 IgG1 의 Fc-부위에서의 단일 P329G-치환에 대해 특이적이다.
한 특정 구현예에서 변이체 (인간) Fc-부위는 돌연변이 P329G 를 갖는 인간 IgG1 또는 IgG4 하위부류의 Fc-부위이다 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름).
한 양태에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 20 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 32 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 34 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 35 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 에서 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 HVR 을 포함하는, 위치 329 에서 아미노산 잔기 글리신 (및 임의로는 위치 234 및 235 에서 아미노산 잔기 알라닌) (번호화는 Kabat EU 지표에 따름) 을 포함하는 Fc-부위에 특이적으로 결합하는 항-Fc-부위 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) SEQ ID NO: 20 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) SEQ ID NO: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 22 에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) SEQ ID NO: 32 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) SEQ ID NO: 34 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 를 포함하는 VL 도메인, 및 (c) SEQ ID NO: 35 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 20 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO 22 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 32 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 34 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 35 에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 상기 제공되는 바와 같은 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체의 임의의 하나 이상의 아미노산은 하기의 HVR 위치에서 치환된다:
- HVR-L1 (SEQ ID NO: 33) 에서: 위치 9.
특정 구현예에서, 치환은 본원에서 제공되는 바와 같이 보존적 치환이다. 특정 구현예에서, 하기 아미노산 잔기 중 임의의 하나 이상 (단독 또는 서로 독립적으로 조합으로의 임의의 것) 은 임의의 조합으로 하기와 같이 존재할 수 있다:
- HVR-L1 (SEQ ID NO: 33) 에서: 위치 9 에서, S, T, N, Q, G 및 P 로 이루어지는 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 중성 친수성 아미노산 잔기 또는 사슬 배향에 영향을 주는 잔기.
상기 치환의 모든 가능한 조합은 SEQ ID NO: 33 의 컨센서스 서열에 의해 포함된다.
상기 임의의 구현예에서, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 인간화된다. 한 구현예에서, 항- 변이체 (인간) Fc-부위 항체는 상기 임의의 구현예에서와 같은 HVR 을 포함하고, 수용기 인간 골격, 예를 들어 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격을 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서 인간화 항체는 SEQ ID NO: 05 에서 유래한 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 06 에서 유래한 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하고, 인간화 항체는 중쇄 가변 도메인으로서 SEQ ID NO: 05 의 아미노산 서열 및 경쇄 가변 도메인으로서 SEQ ID NO: 06 의 아미노산 서열을 함유하는 키메라 또는 쥐과 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 SEQ ID NO: 05 의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하나, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 변이체 (인간) Fc-부위에 결합하는 능력을 유지하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 05 에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 부위에서 (즉, FR 에서) 발생한다. 임의로는, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 서열의 번역 후 변형을 포함하여, SEQ ID NO: 05 에서와 같은 VH 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체가 제공되며, 여기서 항체는 SEQ ID NO: 06 의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하나, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 변이체 (인간) Fc-부위에 결합하는 능력을 유지하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 06 에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 부위에서 (즉, FR 에서) 발생한다. 임의로는, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 서열의 번역 후 변형을 포함하여, SEQ ID NO: 06 의 VL 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체가 제공되며, 여기서 항체는 상기 제공된 임의의 구현예에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 임의의 구현예에서와 같은 VL 을 포함한다. 한 구현예에서, 항체는 이들 서열의 번역 후 변형을 포함하여, SEQ ID NO: 05 및 SEQ ID NO: 06 에서의 VH 및 VL 을 포함한다 .
발명의 추가 양태에서, 상기 임의의 구현예에 따른 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하여, 단일클론 항체이다. 한 구현예에서, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 구현예에서, 항체는 전체 길이 항체, 예를 들어 인간 IgG1 하위부류 또는 기타 항체 부류 또는 동형 (본원에서 정의되는 바와 같음) 의 미손상 항체이다.
추가 양태에서, 상기 임의의 구현예에 따른 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 하기 섹션 1-4 에서 기재되는 바와 같은 임의의 특성을 단일하게 또는 조합으로 포함할 수 있다:
1. 항체 단편
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 비제한적으로, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 기타 단편을 포함한다. 특정 항체 단편의 검토를 위해서는, [Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134] 를 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해서는, 예를 들어 Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315; 또한 WO 93/16185; US 5,571,894 및 US 5,587,458 을 참조한다. 구제 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하며 증가한 생체내 (in vivo) 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 토의를 위해서는, US 5,869,046 을 참조한다.
디아바디는 이가 또는 이중특이적일 수 있는 2 개의 항원-결합 위치를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 및 Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 [Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134)] 에 기재되어있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, US 6,248,516 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이, 미손상 항체의 단백질분해 소화 뿐 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어 대장균 (E. coli) 또는 파지) 에 의한 생성을 비제한적으로 포함하는 각종 기법에 의해 만들어질 수 있다.
2. 키메라 및 인간화 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어, US 4,816,567; 및 Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855) 에 기재되어있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 부위 (예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이에서 유래한 가변 부위) 및 인간 불변 부위를 포함한다. 추가예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모체 항체의 것으로부터 변화되는 "부류 전환" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 통상, 비-인간 항체는 모체 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서, 인간에 대한 면역원성이 감소되도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 이의 일부) 이 비-인간 항체에서 유래하고, FR (또는 이의 일부) 이 인간 항체 서열에서 유래하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의로는 또한, 인간 불변 부위의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화 항체에서의 일부 FR 잔기는 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래하는 항체) 로부터의 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성이 회복되거나 개선된다.
인간화 항체 및 이의 생성 방법은 예를 들어, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 에서 검토되며, 예를 들어 Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5, 821,337, US 7,527,791, US 6,982,321, 및 US 7,087,409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (특이성 결정 부위 (SDR) 그래프팅을 기재함); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 ("재표면화 (resurfacing)" 를 기재함); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 ("FR 셔플링" 을 기재함); 및 Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 and Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 을 기재함) 에서 추가 기재된다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 골격 부위는 비제한적으로 하기를 포함한다: "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 골격 부위 (예를 들어, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 부위의 특정 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열에서 유래한 골격 부위 (예를 들어, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이화됨) 골격 부위 또는 인간 생식세포 골격 부위 (예를 들어, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝에서 유래한 골격 부위 (예를 들어, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 및 Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618 참조).
3. 다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2 개의 상이한 위치에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 변이체 (인간) Fc-부위에 대한 것이고, 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 변이체 (인간) Fc-부위의 2 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전체 길이 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 만들기 위한 기법은 비제한적으로 하기를 포함한다: 상이한 특이성을 갖는 2 개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현 (Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, 및 Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659 참조), 및 "놉-인-홀 (knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, US 5,731,168 참조). 다중-특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이량체 분자를 만들기 위한 정전 스티어링 효과 (electrostatic steering effect) 조작 (WO 2009/089004); 2 개 이상의 항체 또는 단편의 교차결합 (예를 들어, US 4,676,980, 및 Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83 참조); 이중특이적 항체를 생성하기 위한 류신 지퍼 사용 (예를 들어, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553 참조); 이중특이적 항체 단편을 생성하기 위한 "디아바디" 기술 사용 (예를 들어, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 참조); 및 단일 사슬 Fv (sFv) 이량체 사용 (예를 들어 Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374 참조); 및 삼중특이적 항체 제조 (예를 들어, Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69 에 기재된 바와 같음) 에 의해 만들어질 수 있다.
"옥토푸스 (Octopus) 항체" 를 포함하는, 3 개 이상의 기능적 항원 결합 위치를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어 US 2006/0025576 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한, 변이체 Fc-부위 뿐 아니라 또 다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 위치를 포함하는 "이중 작용 (Dual Acting) Fab" 또는 "DAF" 를 포함한다 (예를 들어 US 2008/0069820 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2010/145793 에 기재된 다중특이적 항체를 포함한다.
이종이량체화를 지지하기 위한 CH3-변형에 대한 여러 접근방식이 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291 에 기재되어있다. 통상, 당업계에 공지된 접근방식에서, 제 1 중쇄의 CH3 도메인 및 제 2 중쇄의 CH3 도메인은 둘 모두 상보적 방식으로 조작되어, 1 개의 조작된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄는 동일한 구조의 또 다른 중쇄와 더 이상 동종이량체화될 수 없다 (예를 들어 CH3-조작된 제 1 중쇄는 또 다른 CH3-조작된 제 1 중쇄와 더 이상 동종이량체화될 수 없고; CH3-조작된 제 2 중쇄는 또 다른 CH3-조작된 제 2 중쇄와 더 이상 동종이량체화될 수 없음). 그로써, 1 개의 조작된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄는, 상보적 방식으로 조작되는 CH3 도메인을 포함하는 또 다른 중쇄와 이종이량체화되도록 강요된다. 이러한 구현예에 대해, 제 1 중쇄의 CH3 도메인 및 제 2 중쇄의 CH3 도메인은 아미노산 치환에 의해 상보적 방식으로 조작되어, 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄가 이종이량체화되도록 강요되는 한편, 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄는 더 이상 동종이량체화될 수 없다 (예를 들어 입체적 이유로).
상기 인용되고 포함된, 당업계에 공지된 중쇄 이종이량체화를 지지하기 위한 상이한 접근방식은, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는, 제 1 항체에서 유래한 "비-교차된 Fab 부위", 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는, 제 2 항체에서 유래하는 "교차된 Fab 부위" 를, 상기 기재된 특정 아미노산 치환과 조합으로 포함하는 본원에 보고하는 바와 같은 다중특이적 항체를 제공하는데 있어서 사용된 상이한 대안물로서 고려된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 다중특이적 항체의 CH3 도메인은 예를 들어 WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; 및 Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681 에 여러 예로 상세히 기재되는 "놉-인투-홀 (knob-into-hole)" 기술에 의해 변경될 수 있다. 이러한 방법에서 2 개 CH3 도메인의 상호작용 표면이 변경되어, 이들 2 개 CH3 도메인을 함유하는 중쇄 둘 모두의 이종이량체화가 증가한다. (2 개 중쇄의) 2 개 CH3 도메인 각각은 "놉 (knob)" 일 수 있는 한편, 다른 것은 "홀 (hole)" 이다. 디술피드 브릿지의 도입은 이종이량체를 추가로 안정화시키며 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) 수율을 증가시킨다.
한 바람직한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 다중특이적 항체는 "놉 사슬" 의 CH3 도메인에서 T366W 돌연변이를, 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인에서 T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름). CH3 도메인 사이의 추가적인 사슬간 디술피드 브릿지가 또한, 예를 들어 Y349C 돌연변이를 "놉 사슬" 의 CH3 도메인에, 및 E356C 돌연변이 또는 S354C 돌연변이를 "홀 사슬" 의 CH3 도메인에 도입함으로써 사용될 수 있다 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681). 따라서 또 다른 바람직한 구현예에서, 본원에서 보고하는 바와 같은 다중특이적 항체는 2 개 CH3 도메인 중 1 개에서 Y349C 및 T366W 돌연변이를, 및 2 개 CH3 도메인 중 다른 것에서 E356C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나, 본원에서 보고하는 바와 같은 다중특이적 항체는 2 개 CH3 도메인 중 1 개에서 Y349C 및 T366W 돌연변이를, 및 2 개 CH3 도메인 중 다른 것에서 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다 (1 개의 CH3 도메인에서의 추가적인 Y349C 돌연변이 및 다른 CH3 도메인에서의 추가적인 E356C 또는 S354C 돌연변이는 사슬간 디술피드 브릿지를 형성함) (번호화는 Kabat EU 지표에 따름).
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태 및 구현예 중 한 구현예에서 다중특이적 항체는 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 항체이다. 한 바람직한 구현예에서 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, 항체는 이가 또는 삼가 항체이다. 한 구현예에서 항체는 이가 항체이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, 다중특이적 항체는 IgG 유형 항체의 불변 도메인 구조를 갖는다. 본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 인간 하위부류 IgG1, 또는 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 인간 하위부류 IgG1 의 것임을 특징으로 한다. 본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 인간 하위부류 IgG2 의 것임을 특징으로 한다. 본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 인간 하위부류 IgG3 의 것임을 특징으로 한다. 본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 인간 하위부류 IgG4, 또는 추가적 돌연변이 S228P 를 갖는 인간 하위부류 IgG4 의 것임을 특징으로 한다. 본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 인간 하위부류 IgG1 또는 인간 하위부류 IgG4 의 것임을 특징으로 한다. 본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 인간 하위부류 IgG1 의 것임을 특징으로 한다 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름). 본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 를 갖는 인간 하위부류 IgG1 의 것임을 특징으로 한다 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름). 본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 돌연변이 S228P 및 L235E 를 갖는 인간 하위부류 IgG4 의 것임을 특징으로 한다 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름). 본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G 를 갖는 인간 하위부류 IgG4 의 것임을 특징으로 한다 (번호화는 Kabat EU 지표에 따름).
4. 항체 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 변형의 항체 인코딩 뉴클레오티드 서열 내 도입, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실, 및/또는 항체의 아미노산 서열 내 잔기로의 삽입 및/또는 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어져 최종 구성물에 이르게 될 수 있는데, 단, 최종 구성물은 원하는 특징, 예를 들어 항원-결합을 갖는다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환형 돌연변이유발에 대한 관심 위치는 HVR 및 FR 을 포함한다. 보존적 치환을 "바람직한 치환" 의 제목 하에 표 1 에 나타낸다. 보다 실질적인 변화를 "예시적 치환" 의 제목 하에 표 1 에 제공하며, 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 하기에 추가로 기재하는 바와 같다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입될 수 있으며 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC 에 대해 스크리닝된다.
표 1
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아미노산은 공통의 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 또 다른 부류에 대하여 이들 부류 중 하나의 일원을 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환형 변이체의 한 유형은 모체 항체 (예를 들어 인간화 또는 인간 항체) 의 하나 이상의 과가변 부위 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성 변이체(들) 은 모체 항체에 대해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가한 친화성, 감소한 면역원성) 에 있어서 변형 (예를 들어, 개선) 을 가지고/가지거나, 모체 항체의 실질적으로 유지된 특정 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환형 변이체는, 예를 들어, 본원에 기재된 것들과 같은 파지 디스플레이-기반 친화성 성숙 기법을 사용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화성 성숙 항체이다. 간략하게는, 하나 이상의 HVR 잔기는 성숙되고 변이체 항체는 파지 상 디스플레이되며 특정 생물학적 활성 (예를 들어 결합 친화성) 에 대해 스크리닝된다.
예를 들어 항체 친화성이 개선되도록, 변경 (예를 들어, 치환) 이 HVR 에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟 (hotspot)", 즉, 체세포 성숙 과정 동안 고빈도로 돌연변이를 거치는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기 (예를 들어, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196 참조), 및/또는 결합 친화성에 대해 시험되는 생성 변이체 VH 또는 VL 과 항원을 접촉시키는 잔기에서 이루어질 수 있다. 2 차 라이브러리로부터의 구성 및 재선택에 의한 친화성 성숙은 예를 들어 [Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37] 에 기재되어있다. 친화성 성숙의 일부 구현예에서, 다양성이 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 실수-유발 (error-prone) PCR, 사슬 셔플링 (chain shuffling) 또는 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이유발) 에 의하여 성숙을 위해 선택된 가변적 유전자에 도입된다. 그런 다음, 2 차 라이브러리가 생성된다. 라이브러리를 스크리닝하여, 원하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하기 위한 또 다른 방법은 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한번에 4-6 개 잔기) 가 무작위화되는 HVR-유도 접근방식을 포함한다. 항원 결합에 포함되는 HVR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링 (modeling) 을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3 은 특히 종종 표적화된다.
특정 구현예에서, 이러한 변경이 항체를 항원에 결합시키는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 치환, 삽입 또는 결실은 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에서 제공되는 바와 같은 보존적 치환) 은 HVR 에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어, HVR 에서 항원 접촉 잔기 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR 은 변경되지 않거나, 1, 2 또는 3 개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 부위 또는 잔기의 확인을 위한 유용한 방법은 [Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085] 에 의해 기재되는 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발" 로 지칭된다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들어, 하전된 잔기 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu) 이 확인되고 중성 또는 음하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌) 에 의해 대체됨으로써, 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지 여부가 결정된다. 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증하는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조는 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위한 것이다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체를 스크리닝하여, 이들이 원하는 특성을 포함하는지 여부를 결정할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은, 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 (intrasequence) 삽입 뿐 아니라 1 개 잔기에서 100 개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합물을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입형 변이체는, 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소 (예를 들어 ADEPT 용) 에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합물을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체는 항체가 글리코실화되는 정도가 증가되거나 감소되도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 위치의 첨가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 위치가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc-부위를 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생성된 선천적 항체는 통상, Fc-부위의 CH2 도메인의 Asn297 에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형, 바이안테너리 (biantennary) 올리고당을 포함한다. 예를 들어, [Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32] 를 참조한다. 올리고당은 각종 탄수화물, 예를 들어, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스 및 시알산 뿐 아니라 바이안테너리 올리고당 구조의 "줄기" 에서 GlcNAc 에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체에서의 올리고당의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체가 생성되도록 이루어질 수 있다.
한 구현예에서, Fc-부위에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코오스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서의 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65%, 또는 20% 내지 40% 일 수 있다. 푸코오스의 양은, 예를 들어 WO 2008/077546 에서 기재된 바와 같은, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 바와 같이 Asn 297 에 부착된 모든 당구조 (예를 들어, 복합, 하이브리드 및 높은 만노오스 구조) 의 합계에 대한 Asn297 에서의 당 사슬 내 푸코오스의 평균량을 계산함으로써 측정된다. Asn297 은 Fc-부위에서 약 위치 297 (Fc-부위 잔기의 EU 번호화) 에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내나; Asn297 은 또한, 항체에서의 비주요 (minor) 서열 변이로 인해 위치 297 의 약 ± 3 개 아미노산 업스트립 또는 다운스트림, 즉 위치 294 에서 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, US 2003/0157108; US 2004/0093621 을 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코오스-부족" 항체 변이체에 관련된 발행물의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 부족한 Lec13 CHO 세포 (Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 (knockout) 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라아제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; WO 2003/085107 참조) 를 포함한다.
항체 변이체에는, 예를 들어 항체의 Fc-부위에 부착된 바이안테너리 올리고당이 GlcNAc 에 의해 이등분되는, 이등분된 올리고당이 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는 예를 들어 WO 2003/011878; US 6,602,684; 및 US 2005/0123546 에 기재되어있다. Fc-부위에 부착된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토오스를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764 에 기재되어있다.
c) Fc-부위 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공되는 항체의 Fc-부위에 도입되어, 그로써 Fc-부위 변이체를 생성할 수 있다. Fc-부위 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어 치환) 을 포함하는 인간 Fc-부위 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc-부위) 을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서 본 발명은, 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 특정 효과기 기능 (예컨대 보체 및 ADCC) 이 불필요하거나 해로운, 적용을 위해 바람직한 후보물이 되게 하는, 모두는 아닌 일부 효과기 기능을 갖는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행되어 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/감손을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정이 수행되어, 항체가 FcγR 결합이 부족 (따라서 ADCC 활성이 부족할 수 있음) 하나, FcRn 결합 능력을 유지한다는 것을 보장할 수 있다. ADCC 매개를 위한 1 차 세포, NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 한편, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현한다. 조혈 세포 상 FcR 발현은 [Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492] 의 464 페이지 표 3 에 요약되어있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 US 5,500,362 (예를 들어 Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; 및 Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502 참조); US 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 참조) 에 기재되어있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유세포 분석을 위한 ACTITM 비-방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI) 참조). 이러한 검정을 위한 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성을, 예를 들어 [Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656] 에서 개시된 바와 같은 동물 모델에서 생체내 평가할 수 있다. C1q 결합 검정을 또한 실행하여, 항체가 C1q 에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 부족하다는 것을 확인할 수 있다 (예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402 에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조). 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743 참조). FcRn 결합 및 생체내 소거/반감기 측정을 또한, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769) 참조).
감소한 효과기 기능을 갖는 항체는 Fc-부위 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (US 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297 의 알라닌에 대한 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2 개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (US 7,332,581).
FcR 에 대한 개선되거나 약화된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어있다 (예를 들어, US 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 참조).
특정 구현예에서, 항체 변이체는 ADCC 를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc-부위의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 번호화) 에서의 치환을 갖는 Fc-부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 변경이 Fc-부위에 이루어져, 변경된 (즉, 개선되거나 약화된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC) 을 초래한다 (예를 들어, US 6,194,551, WO 99/51642, 및 Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184 에 기재된 바와 같음).
증가한 반감기, 및 모계 IgG 의 태아로의 이동을 맡는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, 및 Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434) 에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US 2005/0014934 에 기재되어있다. 이들 항체는 FcRn 에 대한 Fc-부위의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 그 안에 갖는 Fc-부위를 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 하기 Fc-부위 잔기 중 하나 이상에서 치환을 갖는 것들을 포함한다: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예를 들어, Fc-부위 잔기 434 의 치환 (US 7,371,826).
또한, Fc-부위 변이체의 다른 예와 관련하여, Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 94/29351 을 참조한다.
모든 양태의 한 구현예에서 항체는, 항체가 그 자체에 결합하지 않고/결합할 수 없다는 조건 하에, 하기를 포함한다 (모든 위치는 Kabat 의 EU 지표에 따름):
i) 임의로는 돌연변이 P329G, L234A 및 L235A 를 갖는 인간 IgG1 하위부류의 동종이량체 Fc-부위, 또는
ii) 임의로는 돌연변이 P329G, S228P 및 L235E 를 갖는 인간 IgG4 하위부류의 동종이량체 Fc-부위, 또는
iii) 임의로는 돌연변이 P329G, L234A, L235A, I253A, H310A 및 H435A, 또는 임의로는 돌연변이 P329G, L234A, L235A, H310A, H433A 및 Y436A 를 갖는 인간 IgG1 하위부류의 동종이량체 Fc-부위, 또는
iv) 하기와 같은 이종이량체 Fc-부위
a) 하나의 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366W 를 포함하고, 다른 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 포함함, 또는
b) 하나의 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366W 및 Y349C 를 포함하고, 다른 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 S354C 를 포함함, 또는
c) 하나의 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366W 및 S354C 를 포함하고, 다른 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C 를 포함함,
또는
v) Fc-부위 폴리펩티드 둘 모두가 돌연변이 P329G, L234A 및 L235A 를 포함하는, 하기와 같은 인간 IgG1 하위부류의 이종이량체 Fc-부위
a) 하나의 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366W 를 포함하고, 다른 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 포함함, 또는
b) 하나의 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366W 및 Y349C 를 포함하고, 다른 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 S354C 를 포함함, 또는
c) 하나의 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366W 및 S354C 를 포함하고, 다른 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C 를 포함함,
또는
vi) Fc-부위 폴리펩티드 둘 모두가 돌연변이 P329G, S228P 및 L235E 를 포함하는, 하기와 같은 인간 IgG4 하위부류의 이종이량체 Fc-부위
a) 하나의 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366W 를 포함하고, 다른 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 포함함, 또는
b) 하나의 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366W 및 Y349C 를 포함하고, 다른 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 S354C 를 포함함, 또는
c) 하나의 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366W 및 S354C 를 포함하고, 다른 Fc-부위 폴리펩티드가 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C 를 포함함,
또는
vii) i), ii) 및 iii) 중 하나와 vi), v) 및 vi) 중 하나의 조합.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, 본원에서 명시한 바와 같은 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는, 추가적인 C-말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, 번호화는 Kabat EU 지표에 따름) 를 포함한다. 본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서, 본원에서 명시하는 바와 같은 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는, 추가적인 C-말단 글리신 잔기 (G446, 번호화는 Kabat EU 지표에 따름) 를 포함한다.
본원에서 보고하는 바와 같은 항체는 한 구현예에서, 돌연변이 PVA236, L234A/L235A 및/또는 GLPSS331 (Kabat 의 EU 지표에 따름) 을 갖는 인간 하위부류 IgG1, 또는 하위부류 IgG4 의 것임을 특징으로 한다. 추가 구현예에서, 항체는 임의의 IgG 부류의 것이고, 한 구현예에서는 IgG1 또는 IgG4 의 것 (E233, L234, L235, G236, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 및/또는 P329 (Kabat 의 EU 지표에 따름) 에서 적어도 하나의 돌연변이를 함유함) 임을 특징으로 한다. 추가적 한 구현예에서, IgG4 하위부류의 항체는 돌연변이 S228P, 또는 돌연변이 S228P 및 L235E 를 함유한다 (Angal, S., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108) (Kabat 의 EU 지표에 따름).
본원에서 보고하는 바와 같은 항체 중쇄의 C-말단은 아미노산 잔기 PGK 로 끝나는 완전한 C-말단일 수 있다. 중쇄의 C-말단은 C-말단 아미노산 잔기 중 1 또는 2 개가 제거되는 단축된 C-말단일 수 있다. 한 바람직한 구현예에서, 중쇄의 C-말단은 PG 로 끝나는 단축된 C-말단이다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되는 "thioMAb" 를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능 위치에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기가 항체의 접근가능 위치에 배치되며, 항체를 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티와 같은 다른 모이어티에 접합시키는데 사용하여, 본원에서 추가로 기재하는 바와 같이 면역접합체를 생성시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 하기 잔기 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 번호화); 중쇄의 A118 (EU 번호화); 및 중쇄 Fc-부위의 S400 (EU 번호화). 시스테인 조작된 항체는 예를 들어 US 7,521,541 에서 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되어 있으며 용이하게 이용가능한 추가적인 비-단백질성 모이어티를 함유하도록 추가 변경될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 비제한적으로 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적 예는, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 그의 물 중 안정성으로 인해 제조시 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량의 것일 수 있으며, 분지형 또는 미분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 가변적일 수 있으며, 1 개 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 개선될 항체의 특별한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하의 치료요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 비제한적으로 포함하는 고려사항을 기반으로 하여 결정될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비-단백질성 모이어티 및 항체의 접합체가 제공된다. 한 구현예에서, 비-단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). 방사선은 임의의 파장의 것일 수 있으며, 보통의 세포에 해를 끼치지 않으나 항체-비-단백질성 모이어티에 인접한 세포가 사멸되는 온도로 비-단밸질성 모이어티를 가열시키는 파장을 비제한적으로 포함한다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들어 US 4,816,567 에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 한 구현예에서, 본원에 기재된 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄). 추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 가 제공된다. 추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 이러한 구현예에서, 숙주 세포는: (1) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다 (예를 들어 이것으로 형질전환된다). 한 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포) 이다. 한 구현예에서, 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체의 생성 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 상기 제공된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를, 항체 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 임의로는 항체를 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 회수하는 것을 포함한다.
항-변이체 (인간) Fc-부위 항체의 재조합 생성을 위해, 상기 기재한 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 종래의 절차 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리 및 서열분석될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 US 5,648,237, US 5,789,199 및 US 5,840,523 을 참조한다 (또한 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 (대장균에서의 항체 단편 발현을 기재함) 참조). 발현 후, 항체는 가용성 분획물 중 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며 추가 정제될 수 있다.
원핵세포에 추가로, 글리코실화 경로가 "인간화" 되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 초래하는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 사상균 또는 효모와 같은 진핵세포성 미생물이 항체-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 를 참조한다.
글리코실화된 항체의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 또한 다세포성 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 에서 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 확인되었다.
식물 세포 배양물은 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서의 항체 생성을 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 기재함) 를 참조한다.
척추동물 세포는 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 조정된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7); 인간 배아 신장 주 (예를 들어, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 에서 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 에서 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁 경부암 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유선 종양 (mouse mammary tumor) (MMT 060562); 예를 들어, Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는, DHFR- CHO 세포를 포함하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 을 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들어 [Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268] 을 참조한다.
C. 검정
본원에서 제공되는 바와 같은 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 당업계에 공지된 각종 검정에서 사용될 수 있다.
본원에서 보고하는 바와 같은 항체는, Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 치료적 항체 또는 이러한 치료적 항체에 대한 항-약물 항체가 예를 들어 샘플 중에서 검출되어야 하는 경우, 특히 유용하다.
한 구현예에서 치료적 항체는
i) 돌연변이 P329G 또는 P329G, L234A 및 L235A, 및/또는
ii) 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A
를 포함한다.
한 구현예에서 각각의 돌연변이를 포함하는 항체는
i) 돌연변이 P329G 또는 P329G, L234A 및 L235A, 및/또는
ii) 돌연변이 I253A, H310A 및 H435A
를 포함하는 항체이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는, (샘플 중) Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 치료적 항체 (즉, Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 항체) 의 측정을 위한 포획 항체 또는 트레이서 항체로서의 (항원 가교) 면역검정에서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항체의 용도이다. 검출 또는 포획을 위해 필요한 각각의 다른 시약은 치료적 항체의 임의의 항원, 치료적 항체에 특이적으로 결합하는 제 2 항체 또는 이와 접합되나 사용한 항체의 결합을 방해하지 않는 모이어티 (즉, 항체 둘 모두가 치료적 항체에 동시에 결합할 수 있음), 치료적 항체에 대한 항-유전자형 항체, 또는 인간 Fc 감마 수용체 I 또는 이의 Fc-부위-결합 단편 (각각, 이는 그에 따라 유도체화, 고정화 또는 표지됨) 일 수 있다.
이 검정은, 본원에서 보고하는 바와 같은 항체가 트레이서 항체로서 사용되는 경우, 임의의 비-인간 혈청에 적용가능하다. 한 구현예에서 상기 용도는 비-인간 실험 동물의 혈청 샘플에서의 측정을 위한 것이다.
이 검정은, 본원에서 보고하는 바와 같은 항체가 포획 항체로서 사용되는 경우, 임의의 혈청 (인간 혈청 포함) 에 적용가능하다.
이러한 검정은 10% 시노몰구스 혈청 중 100 pg/㎖ 미만, 예를 들어 40-80 pg/㎖ 의 정량 하한을 갖는다 (검정 농도).
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 (샘플 중) Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 치료적 항체의 측정을 위한 포획 항체로서 및 트레이서 항체로서의 항원 가교 면역검정에서의 본원에서 보고하는 바와 같은 하나 이상의 항체의 용도이다.
이 검정은 임의의 혈청 (인간 혈청 포함) 에 적용가능하다. 한 바람직한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 2 개의 상이한 항체는 포획 항체 및 트레이서 항체로서 사용된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 교정 표준으로서의 항원 가교 면역검정에서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항체의 용도이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는, 치료적 항체가 Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는, (샘플 중) 치료적 항체에 대한 항-약물 항체의 측정을 위한 면역검정에서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항체의 용도이다.
이 검정은 본원에서 보고하는 바와 같은 항체가 포획 항체로서 사용되는 경우, 임의의 혈청 (인간 혈청 포함) 에 적용가능하다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는, (샘플 중) Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 또는 IgG4 하위부류의 치료적 항체의 검출 방법이다:
a) 임의로는 분석할 샘플을 제공하는 단계,
b) 샘플을 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계,
c) 임의로는 샘플을 치료적 항체의 선택적 검출을 위한 시약과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
d) 단계 (b) 또는 (c) 에서 형성된 복합체를 치료적 항체의 존재와 연관시키고, 그로써 치료적 항체를 검출하는 단계.
한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체는 포획 항체로서 사용된다. 한 구현예에서 포획 항체는 고체 표면에 고정된다. 한 구현예에서 이러한 고체 표면은 멀티-웰 플레이트의 웰 (의 벽 또는 바닥) 이다. 따라서, 한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 샘플을 고체 표면에 고정된 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하여, 치료적 항체를 포함하는 고정된 복합체를 형성하는 단계,
b) 임의로는 고체 표면을 세척 (하여 미결합된 물질을 제거) 하는 단계,
c) 고정된 복합체를 치료적 항체에 선택적으로 결합하는 검출 시약과 함께 인큐베이션하고,
그로써 샘플 중 치료적 항체를 검출하는 단계.
한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체는 트레이서 항체로서 사용된다. 포획을 위해서는, 적합한 포획 시약은 고체 표면에 고정된다. 한 구현예에서 이러한 고체 표면은 멀티-웰 플레이트의 웰 (의 벽 또는 바닥) 이다. 따라서 한 구현예에서, 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 샘플을 고체 표면에 고정된 포획 시약과 함께 인큐베이션하여, 치료적 항체를 포함하는 고정된 복합체를 형성하는 단계,
b) 임의로는 고체 표면을 세척 (하여 미결합 물질을 제거) 하는 단계,
c) 고정된 복합체를 검출가능 표지에 접합된 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하여 추가의 복합체를 형성하는 단계,
d) 단계 c) 에서 형성된 복합체를 검출가능 표지에 선택적으로 결합하는 검출 시약과 함께 인큐베이션하고,
그로써 샘플 중 치료적 항체를 검출하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는, 포획 항체 및 트레이서 항체 둘 모두가 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편에서 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는, 포획 항체 및 트레이서 항체를 포함하는 항원 가교 면역검정을 사용하여 샘플 중 Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 또는 IgG4 하위부류의 치료적 항체를 측정하는 방법이다.
한 구현예에서 샘플은 마모셋 및 타마린 과의 일원, 구대륙 원숭이, 난쟁이 여우원숭이, 긴팔원숭이 (gibbons) 및 소형유인원류 (lesser apes), 참여우원숭이 뿐 아니라 이의 교배에서 선택되는 실험 동물로터, 또는 인간으로부터 수득된다. 한 구현예에서 샘플은 히말라야 원숭이, 또는 마모셋 원숭이, 또는 망토개코 원숭이, 또는 시노몰구스 원숭이, 또는 인간으로부터 수득된다. 한 구현예에서 실험 동물은 마카카 (macaca) 또는 마카크 (macaque) 원숭이이다. 한 구현예에서 샘플은 시노몰구스 원숭이 또는 히말라야 원숭이 또는 인간으로부터 수득된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는, (샘플 중) 총 (total), 활성, ADA-결합 또는 항원-결합 치료적 항체의 농도를 측정하기 위한, Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 또는 IgG4 하위부류의 치료적 항체에 특이적으로 결합하는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편의 용도이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 및/또는 이의 Fc-부위 결합 단편의 혼합물을 포함하는 항체 조성물이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 본원에서 보고하는 바와 같은 방법에서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 조성물의 용도이다.
한 구현예에서 면역검정은 샌드위치 면역검정이다. 또 다른 구현예에서 항체의 그의 접합 파트너에 대한 접합은 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올기 및/또는 항체의 아미노산 백본의 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀 관능기, ε-아미노기 (리신), 상이한 리신의 ε-아미노기 및/또는 N-말단을 통한 화학적 결합에 의해 수행된다. 한 구현예에서 포획 항체는 특정 결합 쌍을 통해 고정된다. 한 구현예에서 포획 항체는 비오틴에 접합되며, 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 고정화가 수행된다. 한 구현예에서 트레이서 항체는 특정 결합 쌍을 통해 검출가능 표지에 접합된다. 한 구현예에서 트레이서 항체는 디곡시게닌에 접합되며, 검출가능 표지에 대한 연결은 디곡시게닌에 대한 항체를 통해 수행된다. 한 구현예에서 치료적 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 한 구현예에서 인간 또는 인간화 항체는 단일클론 항체이다. 한 구현예에서 총 치료적 항체가 검출되고, 또 다른 구현예에서 활성 치료적 항체가 검출되고, 추가 구현예에서 그의 항원에 결합하는 치료적 항체가 검출된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는 (샘플 중) 치료적 항체의 검출 방법이다:
a) 샘플을, 고체 표면에 고정되는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하여, 복합체를 형성하는 단계,
b) 상기 샘플을 총, 활성 또는 항원-결합 치료적 항체의 선택적 검출에 적절한 시약과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
c) 단계 (b) 에서 형성된 복합체를 (샘플 중) 상기 치료적 항체의 농도와 연관시키고,
그로써 치료적 항체를 검출하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는, 하기 순서로 하기 단계를 포함하는, (샘플 중) Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체 (즉, Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 항체) 에 대한 항-약물 항체의 존재를 측정하기 위한 항-약물 항체 면역검정이다:
a) 포유류 혈청 (blood serum) 을 포함하는 샘플을, 고체 표면에 고정되는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하여, 복합체를 형성하는 단계,
b) 단계 a) 의 복합체를 전체 길이 인간 Fc 감마 수용체 I 또는 이의 Fc-부위 결합 단편와 함께 인큐베이션하여, 샘플에 존재하는 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체에 대한 항-약물 항체와 인간 Fc 감마 수용체 I 또는 이의 Fc-부위 결합 단편 사이에 복합체가 형성되고, 그로써 전체 길이 인간 Fc 감마 수용체 I 또는 이의 Fc-부위 결합 단편이 검출가능 표지에 접합되는 단계, 및
c) 이전 단계에서 형성된 복합체를 검출가능 표지에 의해 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 순서로 하기 단계를 포함하는, (샘플 중) Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체 (즉, Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 항체) 에 대한 항-약물 항체의 존재를 측정하기 위한 항-약물 항체 면역검정이다:
a) 포유류 혈청을 포함하는 샘플을, 고체 표면에 고정되는 전체 길이 인간 Fc 감마 수용체 I 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하여 복합체를 형성하는 단계,
b) 단계 a) 의 복합체를 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하여, 샘플 중 존재하는 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체에 대한 항-약물 항체와 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 사이에 복합체가 형성되고, 그로써 본원에서 보고하는 바와 같은 항체가 검출가능 표지에 접합되는 단계,
c) 이전 단계에서 형성된 복합체를 검출가능 표지에 의해 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 순서로 하기 단계를 포함하는, (샘플 중) Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체 (즉, Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 항체) 에 대한 항-약물 항체의 존재를 측정하기 위한 항-약물 항체 면역검정이다:
a) Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체가 고정되는 고체상을, 포유류 혈청을 포함하는 샘플과 함께 인큐베이션 (하여, 고체상 결합 약물 항체-항-약물 항체 복합체를 형성) 하는 단계,
b) (단계 a) 에서 형성된 약물 항체-항-약물 항체 복합체가 결합하는) 고체상을, 검출가능 표지에 접합된 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
c) 검출가능 표지의 존재를 측정하고, 그로써 샘플 중 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체에 대한 항-약물 항체의 존재를 측정함으로써, 단계 b) 에서의 고체상 결합 복합체의 형성을 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 순서로 하기 단계를 포함하는, 샘플 중 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체에 대한 항-약물 항체의 존재를 측정하기 위한 항-약물 항체 면역검정이다:
a) Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체의 FAB 가 고정되는 고체상을, 포유류 혈청을 포함하는 샘플과 함께 인큐베이션 (하여, 고체상 결합 FAB-항-약물 항체 복합체를 형성) 하는 단계,
b) (단계 a) 에서 형성된 FAB-항-약물 항체 복합체가 결합하는) 고체상을, 검출가능 표지에 접합되는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
c) 검출가능 표지의 존재를 측정하고, 그로써 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체에 대한 항-약물 항체의 존재를 측정함으로써, 단계 b) 에서의 고체상 결합 복합체의 형성을 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 순서로 하기 단계를 포함하는, (샘플 중) Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체 (즉, Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 항체) 에 대한 항-약물 항체의 존재를 측정하기 위한 항-약물 항체 면역검정이다:
a) (과량의) 약물 항체를 샘플에 첨가하는 단계로서 (이로써 샘플 중 존재하는 (임의의) 항-약물 항체를 약물-항체-항-약물 항체 복합체에서 이동시킴), 여기서 샘플이 포유류 혈청을 포함하는 단계,
b) Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체가 특이적으로 결합하는 항원이 고정되는 고체상을, 단계 a) 에서 수득한 샘플과 함께 인큐베이션 (하여, 고체상 결합 항원-약물 항체-항-약물 항체 복합체를 형성) 하는 단계,
c) (단계 b) 에서 형성된 항원-약물 항체-항-약물 항체 복합체가 결합하는) 고체상을, 검출가능 표지에 접합된 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
d) 검출가능 표지의 존재를 측정하고, 그로써 샘플 중 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체에 대한 항-약물 항체의 존재를 측정함으로써, 단계 c) 에서의 고체상 결합 복합체의 형성을 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 순서로 하기 단계를 포함하는, (샘플 중) Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체 (즉, Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 항체) 에 대한 항-약물 항체의 존재를 측정하기 위한 항-약물 항체 면역검정이다:
a) (과량의) 약물 항체를 샘플에 첨가하는 단계로서 (이로써 샘플 중 존재하는 (임의의) 항-약물 항체를 약물-항체-항-약물 항체 복합체에서 이동시킴), 여기서 샘플이 포유류 혈청을 포함하는 단계,
b) 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편이 고정되는 고체상을, 단계 a) 에서 수득한 샘플과 함께 인큐베이션 (하여, 고체상 결합 Fc-부위 항체-약물 항체-항-약물 항체 복합체를 형성) 하는 단계,
c) (단계 b) 에서 형성된 Fc-부위 항체-약물 항체-항-약물 항체 복합체가 결합하는) 고체상을 약물 항체의 항원과 함께 인큐베이션하여, 이로써 항원이 검출가능 표지에 접합되는 단계, 및
d) 검출가능 표지의 존재를 측정하고, 그로써 샘플 중 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체에 대한 항-약물 항체의 존재를 측정함으로써, 단계 c) 에서의 고체상 결합 복합체의 형성을 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 순서로 하기를 포함하는, (샘플 중) Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체 (즉, Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 항체) 에 대한 항-약물 항체의 존재를 측정하기 위한 항-약물 항체 면역검정이다:
a) (과량의) 약물 항체를 샘플에 첨가하는 단계로서 (이로써 샘플 중 존재하는 (임의의) 항-약물 항체를 약물-항체-항-약물 항체 복합체에서 이동시킴), 여기서 샘플이 포유류 혈청을 포함하는 단계,
b) 약물 항체에 대한 항-약물 항체가 고정되는 고체상을 단계 a) 에서 수득한 샘플과 함께 인큐베이션 (하여, 고체상 결합 항-약물 항체-약물 항체-항-약물 항체 복합체를 형성) 하는 단계,
c) (단계 b) 에서 형성된 항-약물 항체-약물 항체-항-약물 항체 복합체가 결합하는) 고체상을, 검출가능 표지에 접합된 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
d) 검출가능 표지의 존재를 측정하고, 그로써 샘플 중 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체에 대한 항-약물 항체의 존재를 측정함으로써, 단계 c) 에서의 고체상 결합 복합체의 형성을 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 순서로 하기 단계를 포함하는, (샘플 중) Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체 (즉, Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 항체) 에 대한 항-약물 항체의 존재를 측정하기 위한 방법이다:
- 포유류 혈청을 포함하는 샘플을 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하여, 샘플 중 존재하는 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체에 대한 항-약물 항체와 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편 사이에 복합체가 형성되고, 이로써 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편이 검출가능 표지에 접합되는 단계, 및
- 이전 단계에서 형성된 복합체를 검출가능 표지에 의해 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는, (샘플 중) 항-약물 항체와 복합화된 Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 치료적 항체 (즉, Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 항체) 의 측정을 위한 포획 항체로서의 (항원 가교) 면역검정에서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항체의 용도이다. 복합체 검출을 위해 필요한 각각의 기타 시약은, 각각 그에 따라 유도체화, 고정 또는 표지되는 인간 Fc 감마 수용체 I 또는 이의 Fc-부위-결합 단편일 수 있다.
이 검정은, 본원에서 보고하는 바와 같은 항체가 포획 항체로서 사용되는 경우, 임의의 인간 및 비-인간 혈청에 적용가능하다. 한 구현예에서 상기 용도는 비-인간 실험 동물의 혈청 샘플에서의 측정을 위한 것이다.
이러한 검정은 10% 시노몰구스 혈청 중 100 pg/㎖ 미만, 예를 들어 40-80 pg/㎖ 의 정량 하한을 갖는다 (검정 농도).
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는, 포유류 혈청을 포함하는 (샘플 중) Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체 (즉, Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 항체) 에 대한 항-약물 항체의 존재 또는 양을 측정하기 위한 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편의 용도이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서 각각의 인큐베이션 단계 이후 하기 단계가 이어진다:
- 고체상을 세척하여 미결합된 화합물을 제거하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서 검정은 (샘플 중) Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체 (즉, Fc-부위에서 각각의 돌연변이를 포함하는 항체) 에 대한 항-약물 항체의 존재 및 양을 측정하기 위한 것이며 마지막 단계로서 하기 단계를 포함한다:
- 검출가능 표지의 존재를 측정하고, 표준 곡선을 사용하여 측정 표지의 양을 항-약물 항체와 연관시켜 샘플 중 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체에 대한 항-약물 항체의 양을 측정함으로써, 이전 단계에서의 고체상 결합 복합체의 형성을 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체는 인간 IgG1 또는 IgG4 하위부류의 것이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체는 인간 IgG1 하위부류의 것이며 Fc-부위 폴리펩티드 둘 모두에서 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 를 갖거나, Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체는 인간 IgG4 하위부류의 것이며 Fc-부위 폴리펩티드 둘 모두에서 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G 를 갖거나, Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체는 인간 IgG1 하위부류의 것이며 Fc-부위 폴리펩티드 둘 모두에서 돌연변이 I253A, H310A, H435A 및 P329G 를 갖거나, Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체는 인간 IgG4 하위부류의 것이며 Fc-부위 폴리펩티드 둘 모두에서 돌연변이 I253A, H310A, H435A 및 P329G 를 갖는다 (번호화는 Kabat 에 따른 EU 번호화 시스템에 따름).
모든 양태의 한 구현예에서 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체는 이중특이적 항체, 또는 삼중특이적 항체, 또는 사중특이적 항체, 또는 오중특이적 항체, 또는 육중특이적 항체이다. 한 구현예에서 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체는 이중특이적 항체이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서 포유류 혈청은 인간 혈청 또는 시노몰구스 혈청 또는 마우스 혈청이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서 포유류 혈청은 Fc-수용체 결합 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체가 투여되는 포유동물로부터 수득된다. 한 구현예에서 샘플은 항체를 포유동물에게 처음 투여하고 적어도 2 일 후에 수득된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서 효과기 기능 억제된 인간 또는 인간화 약물 항체에 대한 항-약물 항체는 IgG 부류의 것이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서 표지의 존재 및/또는 양은 효소 연결 색 반응, 표면 플라스몬 공명, 전기화학발광 또는 방사면역검정을 사용하여 측정된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서 면역검정 및/또는 방법 및/또는 용도는 시험관내 면역검정 및/또는 시험관내 방법 및/또는 시험관내 용도이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 양태의 한 구현예에서 고체상은 결합쌍의 제 1 일원에 접합되고, 고체상에 고정될 화합물은 결합쌍의 제 2 일원에 접합된다.
한 구현예에서 이러한 결합쌍 (제 1 일원/제 2 일원) 은 스트렙타비딘 또는 아비딘/비오틴, 항체/항원 (예를 들어, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996) 참조), 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 등에서 선택된다.
한 구현예에서 제 2 결합 파트너는 특정 결합쌍을 통해 결합 (고정) 된다. 한 구현예에서 이러한 결합쌍 (제 1 성분/제 2 성분) 은 스트렙타비딘 또는 아비딘/비오틴, 항체/항원 (예를 들어, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996) 참조), 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 등에서 선택된다. 한 구현예에서 제 2 결합 파트너는 비오틴에 접합되고, 고정화는 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 수행된다.
한 바람직한 구현예에서 결합쌍의 제 1 일원은 스트렙타비딘이고, 결합쌍의 제 2 일원은 비오틴이다.
한 구현예에서 고체상은 스트렙타비딘에 접합되고, 고체상에 고정될 화합물은 비오틴화된다.
한 구현예에서 고체상은 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드 또는 스트렙타비딘 코팅된 세파로오스 비드 또는 멀티-웰 플레이트의 스트렙타비딘 코팅된 웰이다.
한 구현예에서 고체상에 접합될 화합물은, 비오틴에 접합되는 위치가 상이하고 그로써 이후 고체상에 고정되는 적어도 2 개의 화합물을 포함하는 혼합물이다.
한 구현예에서 고체상에 고정될 화합물은 폴리펩티드의 탄수화물 구조의 당 알코올기 및/또는 폴리펩티드의 아미노산 백본의 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀 관능기, ε-아미노기 (리신), 상이한 리신의 ε-아미노기 및/또는 N-말단을 통한 화학적 결합에 의해 결합쌍의 제 2 일원에 접합된다.
상이한 아미노기를 통한 이러한 접합은 제 1 단계에서 예를 들어 시트라코닐화 (citraconylation) 에 의해, 화학적 보호제를 갖는 ε-아미노기의 부분의 아실화에 의해 수행될 수 있다. 제 2 단계에서 접합은 남아있는 아미노기를 통해 수행된다. 이후 시트라코닐화는 제거되고, 결합 파트너는 남아있는 자유 아미노기를 통해 고체상에 고정되는데, 즉 수득한 결합 파트너는 시트라코닐화에 의해 보호되지 않는 아미노기를 통해 고체상에 고정된다. 적합한 화학적 보호제는 미보호된 측쇄 아민에서 결합을 형성하며, N-말단에서의 이들 결합보다 덜 안정하고 이와 상이하다. 이러한 많은 화학적 보호제는 공지되어있다 (예를 들어 EP 0 651 761 참조). 한 구현예에서 화학적 보호제는 말레산 무수물 또는 시트라코닐산 무수물과 같은 시클릭 디카르복실산 무수물을 포함한다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는, (샘플 중) 다중특이적 결합제 양의 (면역학적) 측정을 위한 방법이다:
- i) 다중특이적 결합제의 제 1 결합 특이성에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체와
ii) 다중특이적 결합제
사이에 형성된 복합체의 양을, 복합체를 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하여 측정하고,
그로써 샘플 중 다중특이적 결합제의 양을 측정하는 단계.
한 구현예에서 다중특이적 결합제의 제 1 결합 특이성에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체는 고체상에 접합된다.
한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편은 검출가능 표지에 접합된다.
한 구현예에서 샘플은 (인간) 혈청 또는 (인간) 혈장을 포함하고/하거나 세포 용해물이고/이거나 다중특이적 결합제의 하나 이상의 항원을 포함한다. 한 구현예에서 샘플은 (인간) 혈청 또는 (인간) 혈장이다.
한 구현예에서 다중특이적 결합제는 항체, 항체 또는 항체 단편 및 비-항체 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편 및 가용성 수용체를 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 항체 또는 항체 단편 및 펩티드성 결합 분자를 포함하는 융합 폴리펩티드에서 선택된다.
한 구현예에서 다중특이적 결합제는 항체이다. 한 구현예에서 항체는 이중특이적 항체, 또는 삼중특이적 항체, 또는 사중특이적 항체, 또는 오중특이적 항체, 또는 육중특이적 항체이다. 한 구현예에서 항체는 이중특이적 항체이다.
한 구현예에서 결합 특이성은 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인의 결합 위치 또는 쌍이다.
한 구현예에서 다중특이적 결합제의 제 1 결합 특이성에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체는 비오틴화되고, 고체상은 스트렙타비딘 코팅된다. 한 구현예에서 고체상은 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드 또는 스트렙타비딘 코팅된 세파로오스 비드이다.
한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편은 디곡시게닐화된다.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- i) 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편,
ii) 다중특이적 결합제, 및
iii) 다중특이적 결합제의 결합 특이성에 특이적으로 결합하며 검출가능 표지를 포함하는 항-유전자형 항체
사이에 형성된 복합체의 양을, 형성된 복합체 중 검출가능 표지를 측정함으로써 측정하는 단계.
한 구현예에서 항-유전자형 항체의 그의 접합 파트너에 대한 접합은 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올기 및/또는 약물 항체의 아미노산 백본의 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀 관능기, ε-아미노기 (리신), 상이한 리신의 ε-아미노기 및/또는 N-말단을 통한 화학적 결합에 의해 수행된다.
한 구현예에서 항-유전자형 항체는 적어도 2 개의 상이한 아미노기를 통해 고체상에 접합되는 항-유전자형 항체를 포함하는 혼합물이다. 상이한 아미노기를 통한 이러한 커플링은 제 1 단계에서 예를 들어 시트라코닐화에 의해, 화학적 보호제를 갖는 ε-아미노기의 부분의 아실화에 의해 수행될 수 있다. 제 2 단계에서 접합은 남아있는 아미노기를 통해 수행된다. 이후 시트라코닐화는 제거되고, 항체는 남아있는 자유 아미노기를 통해 고체상에 접합되는데, 즉 수득한 항체는 시트라코닐화에 의해 보호되지 않는 아미노기를 통해 고체상에 접합된다. 적합한 화학적 보호제는 미보호된 측쇄 아민에서 결합을 형성하며, N-말단에서의 이들 결합보다 덜 안정하고 이와 상이하다. 이러한 많은 화학적 보호제는 공지되어있다 (예를 들어 EP 0 651 761 참조). 한 구현예에서 화학적 보호제는 말레산 무수물 또는 시트라코닐산 무수물과 같은 시클릭 디카르복실산 무수물을 포함한다.
한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편은 특정 결합쌍을 통해 접합 (고정) 된다. 한 구현예에서 이러한 결합쌍 (제 1 성분/제 2 성분) 은 스트렙타비딘 또는 아비딘/비오틴, 항체/항원 (예를 들어, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996) 참조), 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 등에서 선택된다. 한 구현예에서 항-유전자형 항체는 비오틴에 접합되고, 고정화는 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 수행된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는, 하기 단계를 포함하는, 검출될 항원이 이중특이적 항체의 제 1 결합 특이성에 특이적으로 결합할 수 있고, 이로써 항원이 이중특이적 항체에 복합화 (항원-이중특이적 항체-복합체) 되는, (샘플 중) 이중특이적 항체의 (제 1) 항원의 존재 및/또는 양을 측정하기 위한 시험관내 방법이다:
- 항원 및 이중특이적 항체를 포함하는 샘플을, 고체상에 접합되는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 항원 및 이중특이적 항체를 포함하는 샘플을, 고체상에 접합되는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
- 항원-이중특이적 항체-항-Fc-부위 항체의 복합체를 검출하고, 그로써 이중특이적 항체의 항원의 존재 및/또는 양을 측정하는 단계.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 항원 및 이중특이적 항체를 포함하는 샘플을, 고체상에 접합되는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
- 제 1 단계에서 형성된 복합체를, 이중특이적 항체에 의해 결합되는 에피토프와 상이한 에피토프에서 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 인큐베이션하고, 그로써 샘플 중 이중특이적 항체의 항원의 존재 및/또는 양을 측정하는 단계.
한 구현예에서 방법은 이중특이적 항체에 복합화되는, 이중특이적 항체의 항원의 존재 및/또는 양의 측정을 위한 방법이다.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 항원 및 이중특이적 항체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계로서, 적어도 90% 의 항원이 이중특이적 항체에 의해 복합화되는 단계,
- 항원 및 이중특이적 항체를 포함하는 샘플을, 고체상에 접합되는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
- 제 1 단계에서 형성된 복합체를, 이중특이적 항체에 의해 결합되는 에피토프와 상이한 에피토프에서 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 인큐베이션하고, 그로써 샘플 중 이중특이적 항체의 항원의 존재 및/또는 양을 측정하는 단계.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 항원 및 이중특이적 항체를 포함하는 샘플을 상당량의 이중특이적 항체와 함께 인큐베이션하여 샘플을 제공하는 단계로서, 적어도 90% 의 항원이 이중특이적 항체에 의해 복합화되는 단계,
- 이중특이적 항체에 의해 복합화된 항원을 포함하는 샘플을, 고체상에 접합되는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
- 이전 단계에서 형성된 복합체를, 이중특이적 항체에 의해 결합된 에피토프와 상이한 에피토프에서 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 인큐베이션하고, 그로써 샘플 중 이중특이적 항체의 항원의 존재 및/또는 양을 측정하는 단계.
한 구현예에서 적어도 95% 의 항원은 이중특이적 항체에 의해 복합화된다. 한 구현예에서 적어도 98% 의 항원은 이중특이적 항체에 의해 복합화된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 항원이 이중특이적 항체의 제 1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합될 수 있는, (샘플 중) 이중특이적 항체의 항체-결합 (제 1) 항원의 양을 측정하기 위한 시험관내 방법이다:
- 항원 및 이중특이적 항체를 포함하는 샘플의 제 1 분취액을 상당량의 이중특이적 항체와 함께 인큐베이션하여 샘플을 제공하는 단계로서, 적어도 90% 의 항원이 이중특이적 항체에 의해 복합화되는 단계,
- 이중특이적 항체에 의해 복합화된 항원을 포함하는 샘플을, 고체상에 접합되는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
- 이전 단계에서 형성된 복합체를, 이중특이적 항체에 의해 결합되는 에피토프와 상이한 에피토프에서 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 인큐베이션하고, 그로써 샘플 중 이중특이적 항체의 항원의 존재 및/또는 양을 측정하고, 그로써 샘플 중 존재하는 항원의 총량을 측정하는 단계,
- 항원 및 이중특이적 항체를 포함하는 샘플의 제 2 분취액을, 고체상에 접합되는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
- 형성된 복합체를, 이중특이적 항체에 의해 결합되는 에피토프와 상이한 에피토프에서 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 인큐베이션하고, 그로써 샘플 중 존재하는 이중특이적 항체의 자유 항원의 양을 측정하는 단계, 및
- 샘플 중 존재하는 항원의 총량과 샘플 중 존재하는 자유 항원의 양 사이의 차이에 의해 이중특이적 항체의 항체-결합 항원의 양을 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는, 다중특이적 결합제의 제 1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 결합 파트너 (항원, 표적, 분석물) 의 존재 및/또는 양의 시험관내 측정을 위한 방법이며, 여기서 샘플 중 존재하는 다중특이적 결합제에 결합한 결합 파트너의 분율은 샘플을 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션함에 의해 결합 파트너의 검출 전에 감손된다.
한 구현예에서 검출될 결합 파트너는 비복합화된 결합 파트너 또는 자유 결합 파트너이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 결합 파트너가 다중특이적 결합제의 제 1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합될 수 있는, 다중특이적 결합제의 (제 1) 결합 파트너의 존재 및/또는 양의 측정을 위한 시험관내 방법이다:
- (제 1) 결합 파트너 및 다중특이적 결합제를 포함하는 샘플을 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- (제 1) 결합 파트너 및 다중특이적 결합제를 포함하는 샘플을 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
- 다중특이적 결합제-감손 샘플 중 (자유 제 1) 결합 파트너의 양을 측정하는 단계.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- (제 1) 결합 파트너 및 다중특이적 결합제를 포함하는 샘플을 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계,
- 자유 결합 파트너의 존재 또는 양을 측정하기 전에 샘플로부터 Fc-부위 항체-다중특이적 결합제-복합체를 감손시키는 단계, 및
- 다중특이적 결합제-감손 샘플 중 (자유 제 1) 결합 파트너의 양을 측정하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션함으로써, 다중특이적 결합제를 샘플로부터 제거/감손시킨다. 부수적으로 또한 (제 1) 결합 파트너-다중특이적 결합제-복합체가 샘플로부터 제거된다.
한 구현예에서 다중특이적 결합제는 항체, 항체 또는 항체 단편 및 비-항체 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편 및 가용성 수용체를 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 항체 또는 항체 단편 및 펩티드성 결합 분자를 포함하는 융합 폴리펩티드에서 선택된다.
한 구현예에서 다중특이적 결합제는 항체이다. 한 구현예에서 항체는 이중특이적 항체, 또는 삼중특이적 항체, 또는 사중특이적 항체, 또는 오중특이적 항체, 또는 육중특이적 항체이다. 한 구현예에서 항체는 이중특이적 항체이다.
한 구현예에서 결합 특이성은 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인의 결합 위치 또는 쌍이다.
한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편은 고체상에 접합된다.
한 구현예에서 제 2 결합 파트너는 비오틴화되고, 고체상은 스트렙타비딘 코팅된다. 한 구현예에서 고체상은 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드 또는 스트렙타비딘 코팅된 세파로오스 비드이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 면역검정을 사용하는 샘플 중 다중특이적 결합제의 결합 파트너의 존재 및/또는 양의 면역학적 측정을 위한 방법이며, 여기서 다중특이적 결합제는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과의 인큐베이션 및 형성된 복합체의 제거에 의해 결합 파트너의 측정 전에 샘플로부터 감손된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 각각의 양태의 한 구현예에서 결합 파트너는 자유 결합 파트너, 즉 다중특이적 결합제에 의해 결합되거나 복합화되지 않는 결합 파트너이다.
한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편은 비오틴화된 제 2 결합 파트너이며, 스트렙타비딘을 통해 고체상에 접합된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 방법의 한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편은, 고체상에 접합되는 위치에 있어서 상이한 적어도 2 개의 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 및/또는 이의 Fc-부위 결합 단편을 포함하는 혼합물이다. 한 구현예에서 위치는, 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편의 아미노산 서열의 아미노산 위치이다.
한 구현예에서 제 1 결합 파트너는 폴리펩티드이다.
한 구현예에서 제 2 결합 파트너는 폴리펩티드이다.
한 구현예에서 접합은 폴리펩티드의 탄수화물 구조의 당 알코올기 및/또는 폴리펩티드의 아미노산 백본의 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀 관능기, ε-아미노기 (리신), 상이한 리신의 ε-아미노기 및/또는 N-말단을 통한 화학적 결합에 의해 수행된다.
상이한 아미노기를 통한 커플링은 제 1 단계에서 예를 들어 시트라코닐화에 의해, 화학적 보호제를 갖는 ε-아미노기의 부분의 아실화에 의해 수행될 수 있다. 제 2 단계에서 접합은 남아있는 아미노기를 통해 수행된다. 이후 시트라코닐화는 제거되고, 결합 파트너는 남아있는 자유 아미노기를 통해 고체상에 접합되는데, 즉 수득한 결합 파트너는 시트라코닐화에 의해 보호되지 않는 아미노기를 통해 고체상에 접합된다. 적합한 화학적 보호제는 미보호된 측쇄 아민에서 결합을 형성하며, N-말단에서의 이들 결합보다 덜 안정하고 이와 상이하다. 이러한 많은 화학적 보호제는 공지되어있다 (예를 들어 EP 0 651 761 참조). 한 구현예에서 화학적 보호제는 말레산 무수물 또는 시트라코닐산 무수물과 같은 시클릭 디카르복실산 무수물을 포함한다.
한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편은 수동적 흡착에 의해 고체상에 접합된다. 수동적 흡착은 예를 들어 Butler, J.E., in "Solid Phases in Immunoassay" (1996) 205-225 및 Diamandis, E.P., and Christopoulos, T.K. (Editors), in "Immunoassay" (1996) Academic Press (San Diego) 에서 기재되어있다.
한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편은 특정 결합쌍을 통해 접합 (고정) 된다. 한 구현예에서 이러한 결합쌍 (제 1 성분/제 2 성분) 은 스트렙타비딘 또는 아비딘/비오틴, 항체/항원 (예를 들어, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996) 참조), 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 등에서 선택된다. 한 구현예에서 제 2 결합 파트너는 비오틴에 접합되고, 고정화는 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 수행된다.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 다중특이적 항체-감손 샘플을 (제 1) 항원에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 함께 인큐베이션하여, 포획 항체-(제 1) 항원 복합체를 형성하는 단계, 및
- 형성된 포획 항체-(제 1) 항원 복합체를 샘플 중 (제 1) 항원의 양과 연관시키는 단계.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 다중특이적 항체-감손 샘플을 (제 1) 항원에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 함께 인큐베이션하여, 포획 항체-(제 1) 항원 복합체를 형성하는 단계,
- 포획 항체-(제 1) 항원 복합체를 트레이서 항체와 함께 인큐베이션하여, 이로써 포획 항체 및 트레이서 항체가 (제 1) 항원 상의 오버랩되지 않는 에피토프에 결합하는 단계, 및
- 형성된 포획 항체-(제 1) 항원-트레이서 항체 복합체를 샘플 중 항원의 양과 연관시키는 단계.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 다중특이적 항체-감손 샘플을 (제 1) 항원에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 함께 인큐베이션하여, 포획 항체-(제 1) 항원 복합체를 형성하는 단계,
- 포획 항체-(제 1) 항원 복합체를 트레이서 항체와 함께 인큐베이션하여, 이로써 포획 항체 및 트레이서 항체가 (제 1) 항원 상의 오버랩되지 않는 에피토프에 결합하는 단계,
- 포획 항체-(제 1) 항원-트레이서 항체 복합체를, 검출가능 표지를 포함하는 검출 항체와 함께 인큐베이션하고, 이로써 검출 항체가 트레이서 항체의 가변 도메인 외부의 에피토프에서 트레이서 항체에 특이적으로 결합하는 단계, 및
- 형성된 포획 항체-(제 1) 항원-트레이서 항체 복합체를 샘플 중 (제 1) 항원의 양과 연관시키는 단계.
한 구현예에서 다중특이적 항체는 항원 상의 제 1 에피토프 또는 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 특이성을 가지며 항원 상 제 2 에피토프 또는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 특이성을 갖는 이중특이적 항체이다.
한 구현예에서 제 1 항원 및 제 2 항원은 동일한 항원이고, 제 1 결합 특이성은 항원 상 제 1 에피토프에 결합하며 제 2 결합 특이성은 항원 상 제 2 에피토프에 결합하여, 이로써 제 2 에피토프는 제 1 에피토프에 오버랩되지 않는 에피토프이고 제 1 결합 특이성의 결합은 제 2 결합 특이성의 결합을 방해하지 않는다.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 형성된 복합체를, (제 1) 항원의 존재 또는 양 측정 전에 샘플로부터 감손시키는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 검출될 항원이 다중특이적 항체의 제 1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합될 수 있는, (샘플 중) 다중특이적 항체의 (제 1) 항원의 존재 및/또는 양의 측정을 위한 시험관내 방법이다:
- (제 1) 항원을 포함하는 샘플을 이중특이적 항체 및 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편의 복합체와 함께 인큐베이션하는 단계.
한 구현예에서 제 2 항원은 표지된 제 2 항원이다. 한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편은 특정 결합쌍을 통해 고체상에 고정된다. 한 구현예에서 특정 결합쌍은 비오틴 및 스트렙타비딘이다.
한 구현예에서 방법은 제 2 단계로서 하기 단계를 포함한다:
- 제 1 단계에서 형성된 복합체를, 이중특이적 항체에 의해 결합되는 에피토프와 상이한 에피토프에서 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 인큐베이션하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 검출될 항원이 이중특이적 항체의 제 1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합될 수 있는, 이중특이적 항체에 복합화된 (제 1 항원-이중특이적 항체-복합체) (샘플 중) 이중특이적 항체의 (제 1) 항원의 존재 및/또는 양의 측정을 위한 시험관내 방법이다:
- (제 1) 항원 및 이중특이적 항체를 포함하는 샘플을, 고체상에 접합되는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계.
한 구현예에서 방법은 제 2 단계로서 하기 단계를 포함한다:
- 제 1 단계에서 형성된 복합체를, 이중특이적 항체에 의해 결합된 에피토프와 상이한 에피토프에서 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 인큐베이션하고, 이로써 샘플 중 이중특이적 항체에 복합화된 (제 1 항원-이중특이적 항체-복합체) 이중특이적 항체의 (제 1) 항원의 양을 측정하는 단계.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 형성된 복합체를, (제 1) 항원의 존재 또는 양의 측정 전에 샘플로부터 감손시키는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 검출될 항원이 다중특이적 항체의 제 1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합될 수 있는, (샘플 중) 다중특이적 항체의 항원의 존재 및/또는 양의 측정을 위한 시험관내 방법이다:
- 다중특이적 항체, 다중특이적 항체 결합 항원 및 자유 항원을 포함하는 샘플을 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 항원 및 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
- 다중특이적 항체-감손 샘플 중 항원의 양을 측정하는 단계.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 항원 및 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계,
- 항-Fc-부위 항체-다중특이적 항체-복합체를, 자유 항원의 존재 또는 양의 측정 전에 샘플로부터 감손시키는 단계, 및
- 다중특이적 항체-감손 샘플 중 항원의 양을 측정하는 단계.
한 구현예에서 샘플은 다중특이적 항체, 자유 항원 및 다중특이적 항체-항원 복합체를 포함하며 검출은 다중특이적 항체의 자유 항원의 검출이다.
한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편은 상자성 비드에 접합된다.
한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편은 고체상에 접합된다.
한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편은 비오틴화되고, 고체상은 스트렙타비딘 코팅된다. 한 구현예에서 고체상은 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드 또는 스트렙타비딘 코팅된 세파로오스 비드이다.
한 구현예에서 결합 특이성은 결합 위치이다. 한 구현예에서 결합 위치는 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인의 쌍이다.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 다중특이적 항체, 다중특이적 항체-결합 항원 및 자유 항원을 포함하는 샘플을 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계, 및
- 항-Fc-부위 항체-다중특이적 항체 복합체를 샘플로부터 제거하는 단계.
한 구현예에서 항-Fc-부위 항체-다중특이적 항체 복합체는 항-Fc-부위 항체-다중특이적 항체 복합체 및 항-Fc-부위 항체-다중특이적 항체-항원 복합체의 혼합물이다.
한 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 항원 및 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편과 함께 인큐베이션하여, 항-Fc-부위 항체-다중특이적 항체 복합체를 형성하는 단계,
- 항-Fc-부위 항체-다중특이적 항체 복합체를 샘플로부터 제거하는 단계, 및
- 다중특이적-항체 감손 샘플 중 항원의 양을 측정하는 단계.
한 구현예에서 항원의 양을 측정하는 것은 하기 단계를 포함한다:
- 다중특이적 항체-감손 샘플을 항원에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 함께 인큐베이션하여, 포획 항체-항원 복합체를 형성하는 단계, 및
- 형성된 포획 항체-항원 복합체를 샘플 중 항원의 양과 연관시키는 단계.
한 구현예에서 항원의 양을 측정하는 것은 하기 단계를 포함한다:
- 다중특이적 항체-감손 샘플을 항원에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 함께 인큐베이션하여, 포획 항체-항원 복합체를 형성하는 단계,
- 포획 항체-항원 복합체를 트레이서 항체와 함께 인큐베이션하고, 이로써 포획 항체 및 트레이서 항체가 항원 상 오버랩되지 않는 에피토프에 결합하는 단계, 및
- 형성된 포획 항체-항원-트레이서 항체 복합체를 샘플 중 항원의 양과 연관시키는 단계.
한 구현예에서 항원의 양을 측정하는 것은 하기 단계를 포함한다:
- 다중특이적 항체-감손 샘플을 항원에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 함께 인큐베이션하여, 포획 항체-항원 복합체를 형성하는 단계,
- 포획 항체-항원 복합체를 트레이서 항체와 함께 인큐베이션하고, 이로써 포획 항체 및 트레이서 항체가 항원 상 오버랩되지 않는 에피토프에 결합하는 단계,
- 포획 항체-항원-트레이서 항체 복합체를, 검출가능 표지를 포함하는 검출 항체와 함께 인큐베이션하고, 이로써 검출 항체가 트레이서 항체의 가변 도메인 외부의 에피토프에서 트레이서 항체에 특이적으로 결합하는 단계, 및
- 형성된 포획 항체-항원-트레이서 항체 복합체를 샘플 중 항원의 양과 연관시키는 단계.
한 구현예에서 다중특이적 항체는, 항원 상 제 1 에피토프 또는 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 특이성을 가지며 항원 상 제 2 에피토프 또는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 특이성을 갖는 이중특이적 항체이다.
본원에서 보고하는 바와 같은 한 양태는 샘플로부터 다중특이적 항체의 제 2 결합 특이성에 결합한 항원의 감손을 위한 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편의 용도이다.
용어 "치료적 항체" 는 인간 치료제로서 승인을 위해 임상 연구에서 시험되거나 시험되었고 질환 치료를 위해 개인에게 투여될 수 있는 항체를 나타낸다. 한 구현예에서 치료적 항체는 단일클론 항체이다. 추가 구현예에서 치료적 항체는 인간 항체 유전자좌로 형질전환된 동물 또는 유인원으로부터 수득되거나, 인간 단일클론 항체이거나, 인간화 단일클론 항체이다. 한 구현예에서 치료적 항체는 인간 단일클론 항체이다. 한 구현예에서 치료적 항체는 인간화 단일클론 항체이다. 치료적 항체는 종양학적 질환 (예를 들어 혈액학적 및 고형 악성 종양 (비-호지킨 림프종, 유방암 및 결장직장암 포함)), 면역학적 질환, 중추 신경 질환, 혈관 질환 또는 전염성 질환과 같은 각종 질환의 치료에 널리 사용되고있다. 이러한 항체는 예를 들어, CD19, CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250, GD3, HER2, PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, Levis Y 항원, IL-6 수용체 (IL6R) 또는 IGF-1 수용체 (IGF1R) 에 대한 항체이다.
용어 "에피토프" 는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정자를 나타낸다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 집단으로 이루어지며, 통상 에피토프는 특이적인 3 차원 구조 특징 뿐 아니라 특이적인 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 (Conformational) 및 비-입체형태적 에피토프는, 변성 용매의 존재 하에 입체형태적 에피토프에 대한 결합은 있으나 비-입체형태적 에피토프에 대한 결합은 손실된다는 점에 있어서 구별된다.
상이한 면역검정의 원리가 예를 들어 [Hage, D.S. (Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R)] 에 의해 기재되어있다. Lu, B., et al. (Analyst 121 (1996) 29R-32R) 은 면역검정에서 사용되는 항체의 배향된 고정화를 보고하고있다. 아비딘-비오틴-매개 면역검정은 예를 들어 Wilchek, M., 과 Bayer, E.A. 에 의해 Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469 에서 보고된다.
폴리펩티드 및 단일클론 항체 및 그의 불변 도메인은 결합쌍의 일원, 예컨대 폴리펩티드/단백질, 중합체 (예를 들어 PEG, 셀룰로오스 또는 폴리스티롤), 또는 효소에 대한 접합을 위해 다수의 반응성 아미노산 측쇄를 포함한다. 아미노산의 화학적 반응성 기는 예를 들어 아미노기 (리신, 알파-아미노기), 티올기 (시스틴, 시스테인 및 메티오닌), 카르복실산기 (아스파르트산, 글루탐산) 및 당-알코올 기이다. 이러한 방법은 예를 들어 Aslam M., 및 Dent, A. 에 의해 "Bioconjugation", MacMillan Ref. Ltd. 1999, 50-100 페이지에 기재되어있다.
폴리펩티드 및 항체의 가장 흔한 반응성 기 중 하나는 아미노산 리신의 지방족 ε-아민이다. 일반적으로, 거의 모든 폴리펩티드 및 항체가 풍부한 리신을 함유한다. 리신 아민은 pH 8.0 초과에서 상당히 양호한 친핵체이고 (pKa = 9.18), 따라서 다양한 시약과 용이하고 깔끔하게 반응하여 안정한 결합을 형성한다. 아민-반응성 시약은 주로 단백질의 α-아미노기 및 리신과 반응한다. 반응성 에스테르, 특히 N-히드록시-숙신이미드 (NHS) 에스테르가 그 중에서도 가장 흔히 이용되는 아민기 변형용 시약이다. 수성 환경에서의 반응에 최적인 pH 는 pH 8.0 내지 9.0 이다. 이소티오시아네이트는 아민-변형 시약이고, 단백질과 티오우레아 결합을 형성한다. 이들은 (최적으로 pH 9.0 내지 9.5 에서) 수용액 중에서 단백질 아민과 반응한다. 알데히드는 온화한 수성 조건 하에 지방족 및 방향족 아민, 히드라진 및 히드라지드와 반응하여 이민 중간체 (쉬프 (Schiff) 염기) 를 형성한다. 쉬프 염기는 약한 또는 강한 환원제 (예컨대 나트륨 보로히드라이드 또는 나트륨 시아노보로히드라이드) 로 선택적으로 환원되어 안정한 알킬 아민 결합을 유도할 수 있다. 아민을 변형시키는데 사용되어 온 기타 시약은 산 무수물이다. 예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물 (DTPA) 은 2 개의 아민-반응성 무수물기를 함유하는 이관능성 킬레이트제이다. 이는 아미노산의 N-말단 및 ε-아민기와 반응하여 아미드 연결을 형성할 수 있다. 무수물 고리가 열려, 배위 착물 중 금속에 단단히 결합할 수 있는 다가, 금속-킬레이트 암 (arm) 을 생성한다.
폴리펩티드 및 항체 내의 또 다른 흔한 반응성 기는 황-함유 아미노산 시스틴 및 그의 환원 산물 시스테인 (또는 하프 시스틴 (half cystine)) 으로부터의 티올 잔기이다. 시스테인은 자유 티올기를 함유하며, 이는 아민보다 더 친핵성이고 일반적으로 단백질에서 가장 반응성인 관능기이다. 티올은 일반적으로 중성 pH 에서 반응성이고, 따라서 아민의 존재시 다른 분자에 선택적으로 커플링될 수 있다. 자유 술프히드릴기는 비교적 반응성이므로, 이들 기를 갖는 단백질은 종종 디술피드기 또는 디술피드 결합으로서 그의 산화 형태로 이들과 함께 존재한다. 이러한 단백질에서, 반응성 자유 티올을 생성하기 위해, 디티오트레이톨 (DTT) 과 같은 시약에 의한 디술피드 결합의 환원이 필요하다. 티올-반응성 시약은 폴리펩티드 상의 티올기와 커플링되어 티오에테르-커플링 산물을 형성할 것들이다. 이들 시약은 약산성 내지 중성 pH 에서 신속히 반응하고, 따라서 아민기의 존재시 선택적으로 반응할 수 있다. 문헌은 트라우트 (Traut) 시약 (2-이미노티올란), 숙신이미딜 (아세틸티오) 아세테이트 (SATA), 및 술포숙신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오) 프로피온아미도] 헥사노에이트 (술포-LC-SPDP) 와 같은 여러 티올화 교차 결합 시약을 사용하여 반응성 아미노기를 통해 다수의 술프히드릴기를 효율적으로 도입하는 방식을 제공하는 것을 보고한다. 할로아세틸 유도체, 예를 들어 요오도아세트아미드는 티오에테르 결합을 형성하고, 또한 티올 변형을 위한 시약이다. 추가로 유용한 시약은 말레이미드이다. 말레이미드와 티올-반응성 시약과의 반응은 요오도아세트아미드와의 반응과 본질적으로 동일하다. 말레이미드는 약산성 내지 중성 pH 에서 신속히 반응한다.
폴리펩티드 및 항체 내의 또 다른 흔한 반응성 기는 카르복실산이다. 폴리펩티드 및 항체는 아스파르트산 및 글루탐산의 측쇄 내에 및 C-말단 위치에서 카르복실산기를 함유한다. 물에서의 카르복실산의 비교적 낮은 반응성은 통상, 이들 기를 사용하여 폴리펩티드 및 항체를 선택적으로 변형시키는 것을 어렵게 만든다. 이것이 수행될 때, 카르복실산기는 통상 수용성 카르보디이미드를 사용하여 반응성 에스테르로 전환되고, 친핵성 시약 예컨대 아민, 히드라지드 또는 히드라진과 반응한다. 리신의 보다 고도로 염기성인 ε-아민의 존재 하에 활성화된 카르복실산과 선택적으로 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성하기 위해, 아민-함유 시약은 약염기성이어야 한다. pH 가 8.0 초과로 상승되었을 때, 단백질 교차 결합이 일어날 수 있다.
나트륨 페리오데이트 (periodate) 를 사용하여, 항체에 부착된 탄수화물 모이어티 내의 당의 알코올 부분을 알데히드로 산화시킬 수 있다. 각각의 알데히드기는 카르복실산에 대해 기재한 바와 같이 아민, 히드라지드 또는 히드라진과 반응할 수 있다. 탄수화물 모이어티는 항체의 결정화가능 (crystallizable) 단편 (Fc) 부위에서 우세하게 발견되므로, 접합은 항원-결합 위치에서 떨어져 있는 탄수화물의 위치-지정 변형을 통해 달성될 수 있다. 쉬프 염기 중간체가 형성되고, 이는 나트륨 시아노보로히드라이드 (온화하고 선택적) 또는 나트륨 보로히드라이드 (강함) 수용성 환원제에 의한 중간체의 환원을 통해 알킬 아민으로 환원될 수 있다.
용어 "샘플" 은 생물 또는 예전의 생물로부터의 임의 양의 물질을 비제한적으로 포함한다. 이러한 생물은 비제한적으로, 인간, 마우스, 원숭이, 랫트, 토끼 및 기타 동물을 포함한다. 한 구현예에서 샘플은 원숭이, 특히 시노몰구스 원숭이, 또는 토끼, 또는 마우스, 또는 랫트, 또는 인간으로부터 수득된다. 이러한 물질은 한 구현예에서 비제한적으로, 임상 일상에서 가장 널리 사용되는 샘플 공급원인 개체로부터의 전혈 또는 혈청을 포함한다.
용어 "고체상" 은 비-유체 물질을 나타내며, 중합체, 금속 (상자성, 강자성 입자), 유리, 및 세라믹과 같은 재료로 제조된 입자 (미세입자 및 비드를 포함); 실리카, 알루미나, 및 중합체 겔과 같은 겔 물질; 중합체, 금속, 유리, 및/또는 세라믹으로 제조될 수 있는 모세관; 제올라이트 및 기타 다공성 물질; 전극; 마이크로타이터 플레이트; 고체 스트립; 및 큐벳, 튜브 또는 기타 분광계 샘플 용기를 포함한다. 고체상 성분은, "고체상" 이 샘플 중 물질과 상호작용하는 것으로 의도되는 적어도 하나의 모이어티를 그의 표면 상에 함유한다는 점에서 불활성 고체 표면과 구별된다. 고체상은 튜브, 스트립, 큐벳 또는 마이크로타이터 플레이트와 같은 정치 (stationary) 성분일 수 있거나, 비드 및 미세입자와 같은 비-정치 성분일 수 있다. 단백질 및 기타 물질의 비-공유적 또는 공유적 부착을 가능하게 하는 다양한 미세입자가 사용될 수 있다. 이러한 입자는 폴리스티렌 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 와 같은 중합체 입자; 금 나노입자 및 금 콜로이드와 같은 금 입자; 및 실리카, 유리 및 금속 산화물 입자와 같은 세라믹 입자를 포함한다. 예를 들어 Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, 70 (1998) 322A-327A, 또는 Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23 을 참조한다.
한 구현예에서, 검출가능 표지는 색소원 (형광 또는 발광 기 및 염료), 효소, NMR-활성기, 금속 입자, 또는 합텐, 예컨대 디곡시게닌으로부터 선택된다. 검출가능 표지는 또한 광활성가능 교차결합기, 예를 들어 아지도 또는 아지린기일 수 있다. 전기화학발광에 의해 검출될 수 있는 금속 킬레이트는 또한 한 구현예에서 신호-방사기이고, 루테늄 킬레이트, 예를 들어 루테늄 (비스피리딜)3 2+ 킬레이트가 특히 바람직하다. 적합한 루테늄 표지기는 예를 들어 EP 0 580 979, WO 90/05301, WO 90/11511 및 WO 92/14138 에 기재되어있다.
본원에서 보고하는 바와 같은 방법 및 면역검정에서 사용되는 바와 같은 일부 화합물은 결합쌍의 일원에 접합된다. 한 구현예에서 접합은 화합물의 탄수화물 구조의 당 알코올기 및/또는 화합물의 아미노산 백본의 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀 관능기, ε-아미노기 (리신), 상이한 리신의 ε-아미노기 및/또는 N-말단을 통한 화학적 결합에 의해 수행된다. 한 구현예에서 접합된 화합물은 결합쌍의 일원에 접합된 적어도 2 개의 화합물의 혼합물이며, 여기서 혼합물 중 적어도 2 개의 화합물은 이들이 결합쌍의 일원에 접합되는 위치에 있어서 상이하다. 예를 들어, 혼합물은 탄수화물의 당 알코올기를 통한 접합 및 아미노산 백본의 아미노산을 통한 접합을 포함할 수 있다. 또한 예를 들어, 혼합물은 아미노산 백본의 상이한 아미노산 잔기를 통해 결합쌍의 일원에 접합된 화합물을 포함할 수 있다. 표현 "상이한 아미노산 잔기" 는 2 개의 상이한 종류의 아미노산, 예를 들어 리신 및 아스파르트산, 또는 티로신 및 글루탐산, 또는 화합물의 아미노산 서열에서의 그의 위치가 상이한 아미노산 백본의 2 개 아미노산 잔기를 나타낸다. 후자의 경우 아미노산은 동일한 종류의 것이거나 상이한 종류의 것일 수 있다. 표현 "위치가 상이하다" 는 위치 종류 (예를 들어 아미노산 또는 당 알코올 기), 또는 아미노산 백본의 아미노산의 수 (예를 들어 화합물이 결합쌍의 일원에 접합되는) 에서의 차이를 나타낸다.
용어 "항-유전자형 항체" 는 결합 특이성 예컨대 모체 항체의 결합 위치에 특이적으로 결합하는 항체, 즉 예를 들어 모체 항체의 항원 결합 위치에 대해 유도되는 항체를 나타낸다. 한 구현예에서 항-유전자형 항체는 모체 항체의 CDR 중 하나 이상에 특이적으로 결합한다. 한 구현예에서 모체 항체는 치료적 항체이다. 한 구현예에서 모체 항체는 다중특이적 항체이다. 한 구현예에서 모체 항체는 이중특이적 항체이다.
용어 "총 (total)" 치료적 항체는 항체가 활성 (즉, 여전히 그의 항원과 반응성), 비활성 및/또는 항원-결합인지 여부에 관계없이 검출된 임의의 항체를 나타낸다.
용어 "활성" 치료적 항체는 여전히 그의 항원에 결합할 수 있는 실험 동물에 존재하는 치료적 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 예를 들어, 그의 항원 결합 위치에서 임의의 다른 분자 또는 그의 항원에 결합하지 않는다.
용어 "항원-결합" 치료적 항체는 그의 항원에 결합하는 실험 동물의 순환에 있어서 존재하는 바와 같은 치료적 항체를 나타내는데 사용된다.
상기 정의한 바와 같은 총, 활성 또는 항원-결합 치료적 항체는 본 발명에 따른 방법에서 직접적으로 검출될 수 있다.
또한, 임의의 "비활성" 치료적 항체를 간접적으로 평가할 수도 있다. 이러한 비활성 치료적 항체는 예를 들어, 그의 항원에 결합한 치료적 항체, 교차-반응성 항원에 결합한 치료적 항체, 또는 치료적 항체에 대한 자가항체에 의해 차단된 치료적 항체일 수 있다. 당업계의 숙련자가 인지할 바와 같이, 본 개시물의 도움으로 비활성 항체의 분율을 평가할 수 있다. 총 항체가 활성 항체 및 항원-결합 항체의 합계 초과에 이르는 경우, 그의 상응하는 항원에 결합하지 않는 비활성 항체를 포함하는 항체의 추가 분율이 존재할 것이다.
한 바람직한 구현예에서 총 치료적 항체는 샌드위치 유형 면역검정에서 검출되는데, 여기서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편은 이러한 샌드위치 검정의 양측에서 사용된다. 이러한 샌드위치의 한측에서 사용된 항체는 고체상에 결합하거나 결합할 수 있는 한편 (종종 포획 항체로서 나타냄), 이러한 샌드위치의 다른 측에서의 항체는 직접 또는 간접 검출이 촉진되는 방식으로 표지된다 (소위 검출 항체). 이러한 샌드위치 검정 절차에서 결합한 검출 항체의 양은 조사한 샘플 중 치료적 항체의 양과 직접적으로 연관된다.
당해 기술분야 (예를 들어 US 2003/0068664) 에서, 활성 치료적 항체의 검출이 가능하게 하는 검정 시스템이 공지되어있다. 이러한 시스템은 고체상에 대한 항원의 결합, 이러한 결합 항원에 대한 치료적 항체의 결합, 및 항원을 통해 고체상에 결합한 치료적 항체의 검출을 필요로 한다.
샘플 중 활성 치료적 항체의 검출은 편리한 최신 절차에 의해 이루어질 수 있다. 그러나, 그의 항원에 결합한 치료적 항체의 분율 또는 총 치료적 항체의 검출은 다소 복잡하고, 꽤 상이한 검정 구성을 필요로 하며 각각의 상이한 검정에 대해 맞춤 시약을 특히 필요로 한다. 본원에서 보고하는 바와 같은 항체로, 서로 유사한 시험 시스템에서의 활성 치료적 항체, 총 치료적 항체 또는 항원-결합 치료적 항체의 분율을 평가할 수 있다. 본질적으로, 총, 활성 또는 항원-결합 치료적 항체의 이러한 종류의 비교 평가는, 이들 치료적 항체의 다양한 분율 사이에 정량적 비교가 이루어지면, 큰 이점을 가질 것이다.
샌드위치 유형 검정 포맷은 활성 치료적 항체를 검출하기 위해 (또한) 설정될 수 있다. 한 바람직한 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편은 포획 항체로서 사용되고, 이러한 샌드위치 검정의 검출 측은 항원을 표지된 형태로 사용되게 하거나, 항원 결합 후에는 치료적 항체에 의해 인지되는 에피토프에 결합하지 않거나 이와 경쟁하지 않는 제 2 항원이 사용되게 하는데, 이때 상기 제 2 항체는 특이적으로 검출가능하고/하거나 직접 또는 간접 검출이 촉진되는 방식으로 표지된다.
항원-결합 치료적 항체는 바람직하게는 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편을 포획 시약으로서 바람직하게 사용하여, 샌드위치 유형 검정 포맷에서 다시 검출된다. 검출에서 바람직하게는 제 2 항체는 치료적 항체의 에피토프와 경쟁하지 않는 에피토프에서 항원에 대한 결합에 사용된다. 상기 제 2 항체는 바람직하게는 직접 또는 간접 검출이 촉진되는 방식으로 표지된다.
직접 검출을 위해서, 표지기는 임의의 공지된 검출가능 마커기, 예컨대 염료, 발광 표지기 예컨대 화학발광기, 예를 들어 아크리디늄 에스테르 또는 디옥세탄, 또는 형광 염료, 예를 들어 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 옥사진, 레조루핀, 시아닌 및 이의 유도체에서 선택될 수 있다. 표지기의 다른 예는 발광 금속 착물, 예컨대 루테늄 또는 유로퓸 착물, 효소 (예를 들어 ELISA 또는 CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immunoassay, 예를 들어 EP-A-0 061 888) 에서 사용되는 바와 같음), 및 방사성 동위원소이다.
간접 검출 시스템은 예를 들어, 검출 시약, 예를 들어 검출 항체가 바이오아핀 (bioaffine) 결합쌍의 제 1 파트너로 표지되는 것을 포함한다. 적합한 결합쌍의 예는 합텐 또는 항원/항체, 비오틴 또는 비오틴 유사체 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘, 당/렉틴, 핵산 또는 핵산 유사체/상보적 핵산, 및 수용체/리간드, 예를 들어 스테로이드 호르몬 수용체/스테로이드 호르몬이다. 바람직한 제 1 결합쌍 일원은 합텐, 항원 및 호르몬을 포함한다. 특히 바람직한 것은 합텐 예컨대 디곡신 및 비오틴 및 이의 유사체이다. 이러한 결합쌍의 제 2 파트너, 예를 들어 항체, 스트렙타비딘 등은 통상, 예를 들어 상기 언급한 바와 같은 표지에 의해, 직접 검출이 가능하도록 표지된다.
면역검정은 당업계의 숙련자에게 널리 공지되어있다. 이러한 검정을 실행하는 방법 뿐 아니라 실제적 적용 및 절차는 관련 교본에 요약되어있다. 관련 교본의 예는 Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates (: "Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990), pp. 221-278, Eds. R.H. Burdon and v. P.H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam 에서) 및 다양한 권의 "Methods in Enzymology" (Eds. S.P. Colowick, N.O. Caplan, Academic Press) (면역학적 검출 방법을 다룸, 특히 제 70, 73, 74, 84, 92 및 121 권) 이다.
상기 면역학적 검출 방법 모두에서 시약 조건은 이용되는 시약의 결합, 예를 들어 그의 상응하는 항원에 대한 항체의 결합을 가능하게 하도록 선택된다. 숙련자는 용어 복합체를 사용하여 이러한 결합 사건의 결과를 나타낸다. 본 발명에 따른 검정 방법에서 형성된 복합체는 최신 절차에 의해 상기 치료적 항체의 상응하는 농도와 연관된다. 이용하는 검출 시약에 따라, 이러한 연관 단계는 총, 활성 또는 항원-결합 치료적 항체의 농도를 초래할 것이다.
숙련자가 이해할 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 단지 총, 항원-결합, 활성 또는 심지어 비활성 치료적 항체의 농도를 밝히지만은 않을 것이다. 하나의 동일한 시약, 본원에서 보고하는 바와 같은 항체 또는 이의 Fc-부위 결합 단편의 바람직한 사용으로 인해, 상이한 검정에서 수득한 값은 서로 용이하게 비교될 수 있고 그의 비가 평가된다. 추가 바람직한 구현예에서 본 발명은 활성 치료적 항체 대 총 치료적 항체의 비에 관한 것이다. 이러한 비는 치료적 항체의 효능에 대한 표시자로서 잘 역할할 수 있다.
D. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체는 생물학적 샘플 중 돌연변이(들) P329G(/L234A/L235A) 또는 돌연변이 I253A/H310A/H435A 를 갖는 변이체 Fc-부위를 포함하는 치료적 항체의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "검출하는" 은 정량 또는 정성 검출을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 생물학적 유체, 예를 들어 혈청을 포함한다.
한 구현예에서, 진단 또는 검출 방법에서 사용하기 위한 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체가 제공된다. 추가 양태에서, 생물학적 샘플 중 돌연변이 P329G 또는 돌연변이 I253A/H310A/H435A 를 갖는 변이체 Fc-부위를 포함하는 치료적 항체의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 방법은 돌연변이 P329G 또는 돌연변이 I253A/H310A/H435A 를 갖는 변이체 Fc-부위를 포함하는 치료적 항체에 대한 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 샘플을 본원에서 기재된 바와 같은 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체와 접촉시키고, 돌연변이 P329G 또는 돌연변이 I253A/H310A/H435A 를 갖는 변이체 Fc-부위를 포함하는 치료적 항체와 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 방법 또는 생체내 방법일 수 있다.
특정 구현예에서, 표지된 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체가 제공된다. 표지는 비제한적으로, 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대 형광, 발색, 전자-밀도, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐 아니라, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자적 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 모이어티를 포함한다. 예시적인 표지는 비제한적으로, 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라아제, 예를 들어, 반딧불이 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제 (US 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP), 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 사카라이드 옥시다아제, 예를 들어 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제, 헤테로시클릭 옥시다아제 예컨대 우레카아제 및 잔틴 옥시다아제, 염료 전구체가 산화되도록 과산화수소를 이용하여 커플링되는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다아제, 또는 마이크로퍼옥시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함한다.
III. 실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 설명을 고려하여, 다양한 기타 구현예가 실행될 수 있다는 것이 이해된다.
실시예 1
재료 및 방법
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보가 하기에 제공된다: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). 항체 사슬의 아미노산은 번호화되며 Kabat 에 따른 번호화에 따라 나타낸다 (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
재조합 DNA 기법
[Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 에 기재된 바와 같이, 표준 방법을 사용하여 DNA 를 조작할 수 있다. 분자 생물학적 시약을 제조사의 지시사항에 따라 사용한다.
유전자 합성
화학적 합성에 의해 만들어진 올리고뉴클레오티드로부터 원하는 유전자 조각을 제조할 수 있다. 단수의 제한 엔도뉴클레아제 절단 위치가 측면 위치할 수 있는 긴 유전자 조각은, PCR 증폭을 포함하는 올리고뉴클레오티드 어닐링 및 라이게이션, 및 이후 표시된 제한 위치를 통한 클로닝에 의해 어셈블리될 수 있다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열은 DNA 서열분석에 의해 확인될 수 있다.
DNA 서열 결정
DNA 서열은 이중가닥 서열분석에 의해 결정될 수 있다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) 소프트웨어 패키지 버전 10.2 및 Infomax's Vector NT1 Advance suite 버전 8.0 을, 서열 생성, 맵핑, 분석, 주석 (annotation) 및 도해 (illustration) 에 사용할 수 있다.
발현 벡터
항체 발현을 위해, CMV-인트론 A 프로모터가 존재하거나 부재하는 cDNA 조직 또는 CMV 프로모터가 존재하는 게놈 조직을 기반으로 하는 일시적 발현용 발현 플라스미드 (예를 들어 HEK293 세포에서의) 를 적용할 수 있다.
항체 발현 카세트 외에 벡터는 하기를 함유할 수 있다:
- 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 복제 기원, 및
- 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 β-락타마아제 유전자.
항체 유전자의 전사 단위는 하기 요소로 구성될 수 있다:
- 5' 말단에서의 고유한 제한 위치(들),
- 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- cDNA 조직의 경우 인트론 A 서열,
- 인간 항체 유전자에서 유래한 5'-미번역 부위,
- 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- cDNA 로서의 또는 게놈 엑손-인트론 조직을 갖는 각각의 항체 사슬 인코딩 핵산,
- 폴리아데닐화 신호 서열을 갖는 3' 미번역 부위, 및
- 3' 말단에서의 고유한 제한 위치(들).
항체 사슬을 인코딩하는 융합 유전자는 PCR 및/또는 유전자 합성에 의해 생성될 수 있고, 공지된 재조합 방법 및 예를 들어 각각의 벡터에서의 고유한 제한 위치를 사용하는 핵산 조각에 따른 연결에 의한 기법에 의해 어셈블리될 수 있다. 서브클로닝된 핵산 서열은 DNA 서열분석에 의해 확인될 수 있다. 일시적 트랜스펙션을 위해서, 형질전환된 대장균 배양물로부터의 플라스미드 제조물에 의해 더 큰 수량의 플라스미드를 제조할 수 있다.
세포 배양 기법
[Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.] 에 기재된 바와 같은 표준 세포 배양 기법을 사용할 수 있다.
HEK293 시스템에서의 일시적 트랜스펙션
항체는 일시적 발현에 의해 생성될 수 있다. 따라서 제조사의 지시사항에 따라 HEK293 시스템 (Invitrogen) 을 사용하여 각각의 플라스미드로의 트랜스펙션을 수행할 수 있다. 간략하게는, 무혈청 FreeStyleTM 293 발현 배지 (Invitrogen) 중 교반 발효기 또는 진탕 플라스크에서 현탁액 중 성장하는 HEK293 세포 (Invitrogen) 는, 각각의 발현 플라스미드 및 293fectinTM 또는 펙틴 (Invitrogen) 의 믹스로 트랜스펙션될 수 있다. 2 ℓ 진탕 플라스크 (Corning) 에 대해 HEK293 세포를 600 ㎖ 중 1.0*106 세포/㎖ 의 밀도로 시딩하고 120 rpm, 8% CO2 에서 인큐베이션할 수 있다. 다음 날, A) 600 ㎍ 총 플라스미드 DNA (1 ㎍/㎖) 를 포함하는 20 ㎖ Opti-MEM 배지 (Invitrogen) 및 B) 1.2 ㎖ 293 펙틴 또는 펙틴 (2 ㎕/㎖) 이 보충된 20 ㎖ Opti-MEM 배지의 혼합물 대략 42 ㎖ 로, 세포를 대략 1.5*106 세포/㎖ 의 세포 밀도로 트랜스펙션할 수 있다. 글루코오스 소비에 따라, 발효 과정 동안 글루코오스 용액을 첨가할 수 있다. 분비된 항체를 함유하는 상청액을 일반적으로 5-10 일 후 수확하고, 항체를 상청액으로부터 직접 정제할 수 있거나 상청액을 동결하고 저장한다.
단백질 측정
[Pace, et al., Protein Science 4 (1995) 2411-1423] 에 따라 아미노산 서열을 기반으로 하여 계산한 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm 에서의 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써, 정제된 항체 및 유도체의 단백질 농도를 측정할 수 있다.
상청액에서의 항체 농도 측정
단백질 A 아가로오스-비드 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 로의 면역침전에 의해, 세포 배양 상청액 중 항체 및 유도체의 농도를 추정할 수 있다. 따라서, 60 ㎕ 단백질 A 아가로오스 비드를 TBS-NP40 (50 mM Tris 완충제, pH 7.5, 150 mM NaCl 및 1% Nonidet-P40 으로 보충됨) 중 3 회 세척할 수 있다. 이후, 1-15 ㎖ 세포 배양 상청액을 TBS-NP40 중 예비평형화된 단백질 A 아가로오스 비드에 적용할 수 있다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 비드를 Ultrafree-MC-필터 컬럼 (Amicon) 상에서 0.5 ㎖ TBS-NP40 으로 1 회, 0.5 ㎖ 2x 인산완충식염수 (2xPBS, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 로 2 회, 그리고 0.5 ㎖ 100 mM Na-시트레이트 완충제 (pH 5.0) 로 짧게 4 회 세척할 수 있다. 35 ㎕ NuPAGE® LDS 샘플 완충제 (Invitrogen) 를 첨가하여, 결합한 항체를 용리할 수 있다. 샘플의 절반을 각각 NuPAGE® 샘플 환원제와 조합하거나 미환원된 채로 두고, 10 분 동안 70℃ 에서 가열할 수 있다. 그 결과, 5-30 ㎕ 를 4-12% NuPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE 겔 (Invitrogen) (미환원된 SDS-PAGE 에 대해서는 MOPS 완충제 사용, 환원된 SDS-PAGE 에 대해서는 MES 완충제와 NuPAGE® 산화방지제 러닝 (running) 완충 첨가제 (Invitrogen) 사용) 에 적용하고 쿠마시 블루 (Coomassie Blue) 로 염색할 수 있다.
세포 배양 상청액 중 항체의 농도를 친화성 HPLC 크로마토그래피에 의해 정량적으로 측정할 수 있다. 간략하게는, 단백질 A 에 결합하는 항체를 함유하는 세포 배양 상청액을 200 mM KH2PO4, 100 mM 나트륨 시트레이트, pH 7.4 중 Applied Biosystems Poros A/20 컬럼에 적용하고, Agilent HPLC 1100 시스템에서 200 mM NaCl, 100 mM 시트르산, pH 2.5 로 용리할 수 있다. 용리된 항체를 UV 흡광도 및 피크 면적의 적분에 의해 정량할 수 있다. 정제된 표준 IgG1 항체가 표준으로서 역할하였다.
대안적으로, 세포 배양 상청액 중 항체 및 유도체의 농도를 샌드위치-IgG-ELISA 에 의해 측정할 수 있다. 간략하게는, StreptaWell High Bind Streptavidin A-96 웰 마이크로타이터 플레이트 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 를 1 시간 동안 실온에서, 또는 대안적으로는 밤새 4℃ 에서, 0.1 ㎍/㎖ 에서 100 ㎕/웰 비오틴화 항-인간 IgG 포획 분자 F(ab')2-항-인간 Fc 감마 항체-BI (Dianova) 로 코팅한 후, 200 ㎕/웰 PBS, 0.05% Tween (PBST, Sigma) 으로 3 회 세척할 수 있다. 그 후, 각각의 항체 함유 세포 배양 상청액의, PBS (Sigma) 중 100 ㎕/웰의 연속 희석물을 웰에 첨가하고 1-2 시간 동안 진탕기에서 실온에서 인큐베이션할 수 있다. 웰을 200 ㎕/웰 PBST 로 3 회 세척할 수 있고, 결합한 항체를 1-2 시간 동안 진탕기에서 실온에서 인큐베이션하여 검출 항체로서 0.1 ㎍/㎖ 에서 100 ㎕ F(ab')2-항-인간 Fc 감마 항체-POD (Dianova) 를 사용하여, 결합한 항체를 검출하였다. 200 ㎕/웰 PBST 로 3 회 세척하여 미결합 검출 항체를 제거할 수 있다. 100 ㎕ ABTS/웰을 첨가한 후 인큐베이션하여, 결합 검출 항체를 검출할 수 있다. 405 nm 의 측정 파장에서 Tecan Fluor 분광기에서 흡광도 측정을 수행하였다 (참조 파장 492 nm).
제조용 항체 정제
표준 프로토콜을 참조하여, 여과된 세포 배양 상청액으로부터 항체를 정제할 수 있다. 간략하게는, 항체를 단백질 A 세파로오스 컬럼 (GE Healthcare) 에 적용하고 PBS 로 세척할 수 있다. pH 2.8 에서, 이후 즉시 중화에 의해 항체의 용리를 수행할 수 있다. PBS 중 또는 20 mM 히스티딘 완충제 (150 mM NaCl (pH 6.0) 포함) 중 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200, GE Healthcare) 에 의해 단량체성 항체로부터 응집된 단백질을 분리할 수 있다. 예를 들어 MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 단량체성 항체 분율을 풀링 (pooling) 하고, 농축하고 (필요시), -20℃ 또는 -80℃ 에서 동결하고 저장할 수 있다. 샘플의 일부를 후속 단백질 분석 및 분석적 특징화 (예를 들어 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 또는 질량 분석법에 의한) 를 위해 제공할 수 있다.
SDS-PAGE
NuPAGE® Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen) 을 제조사의 지시사항에 따라 사용할 수 있다. 특히, 10% 또는 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast 겔 (pH 6.4) 및 NuPAGE® MES (환원된 겔, NuPAGE® 산화방지제 러닝 완충 첨가제 가짐) 또는 MOPS (미환원된 겔) 러닝 완충제를 사용할 수 있다.
CE-SDS
순도 및 항체 무결성을 microfluidic Labchip 기술 (PerkinElmer, USA) 을 사용하여 CE-SDS 에 의해 분석할 수 있다. 따라서, 5 ㎕ 의 항체 용액을, 제조사의 지시사항에 따라 HT Protein Express 시약 키트를 사용하여 CE-SDS 분석을 위해 제조하고 HT Protein Express Chip 을 사용하여 LabChip GXII 시스템에서 분석할 수 있다. LabChip GX 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석할 수 있다.
분석용 크기 배제 크로마토그래피
항체의 응집 및 올리고머 상태의 측정을 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 를, HPLC 크로마토그래피에 의해 수행할 수 있다. 간략하게는, 단백질 A 정제된 항체를 Dionex Ultimate® 시스템 (Thermo Fischer Scientific) 에서 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4 완충제 (pH 7.5) 중 Tosoh TSKgel G3000SW 컬럼에, 또는 Dionex HPLC-시스템에서 2 x PBS 중 Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 에 적용할 수 있다. UV 흡광도 및 피크 면적의 적분에 의해, 용리된 항체를 정량할 수 있다. BioRad Gel Filtration Standard 151-1901 이 표준으로서 역할하였다.
질량 분석법
항체를, 1 mg/㎖ 의 단백질 농도에서 37℃ 에서 최대 17 시간 동안 포스페이트 또는 Tris 완충제 중 N-글리코시다아제 F 로 탈글리코실화 (deglycosylation) 할 수 있다. 제한된 LysC (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 소화를, 각각 실온에서 120 시간 동안, 또는 37℃ 에서 40 분 동안 Tris 완충제 (pH 8) 중 100 ㎍ 탈글리코실화 항체로 수행할 수 있다. 질량 분석법 전에 샘플을 Sephadex G25 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 HPLC 를 통해 탈염할 수 있다. 총 질량을, TriVersa NanoMate source (Advion) 가 장착된 maXis 4G UHR-QTOF MS 시스템 (Bruker Daltonik) 에서 ESI-MS 를 통해 측정하였다.
면역글로불린의 생성
하이브리도마 세포주를 10% FCS 및 흔히 사용되는 보충물이 보충된 RPMI 1640 중 1.0 x 105 내지 2.2 x 105 세포/㎖ 의 초기 세포 밀도 (생세포) 에서 접종하고, T-플라스크 (Celline, IBS) 에서 대략 3 주 동안 확장시킨다. 배양 상청액으로부터의 항체 정제를, 예를 들어 [Bruck, C., et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 587-596] 에서 보고된 것들과 같은 표준 단백질 화학 방법에 따라 수행한다.
가교 ADA 검정
이러한 1-단계 ELISA 가교 검정의 모든 단계를 실온 (RT) 에서 수행하였고, 샘플 및 품질 대조군을 10% HPS (인간 풀링 혈청) 의 존재 하에 분석하였다. 샘플을 비오틴화 포획 및 디곡시게닐화 검출 항체 (=치료적 항체) (각각 1.0 ㎍/㎖) 함유 low cross buffer® 중 1:10 희석하고, 밤새 RT 에서 450 rpm 에서 진탕하면서 인큐베이션하였다. 그런 다음, 샘플 (100 ㎕) 을 SA-코팅 MTP 에 옮겼다. RT 에서 1 시간 인큐베이션 (450 rpm) 후, 웰을 3 회 세척하였다 (각각 300 ㎕ 세척 완충제). 100 ㎕ 다클론 항-Dig-S-Fab-HRP 접합체 (25 mU/㎖) 첨가 및 1 시간 인큐베이션 후, 플레이트를 다시 세척하였다 (300 ㎕ 세척 완충제로 3 회). 마지막으로, 웰 당 100 ㎕ ABTS 기질을 첨가하고, 색 반응을 405 nm 에서 광도계적으로 평가하였다 (참조 파장 490 nm). 샘플을 이반복하여 측정하고 평균내었다. 이반복물의 정밀도가 변동 계수 (CV) 의 20% 이하인 경우, 측정을 유효한 것으로서 수용하였다. 34 명 개인의 블랭크 혈청 샘플 (각 17 명은 남성 및 여성) 을 이반복으로 분석하여, Shankar et al. (Shankar, G., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 48 (2008) 1267-1281) 에 따라 스크리닝 커트 포인트를 측정하였다. 스크리닝 동안 ADA 양성인 것으로 평가된 샘플을, 밤새 인큐베이션하기 전 희석된 샘플에 첨가한 미표지된 검출 항체 (치료적 항체) (333 ng/㎖) 의 존재 하에 재시험함으로써, 특이성에 대해 확인하였다.
hsFcγRI-PG 검정
절차의 모든 단계를 RT 에서 수행하였다. 샘플을 1:50 의 최종 희석에서 시험하고, 모든 샘플 및 품질 대조군을 2% HPS 및 1 ㎍/㎖ 치료적 항체의 존재 하에 분석하였다. 먼저, 100 ㎕/웰 이중표지된 항-PG 항체 (2 ㎍/㎖) 를 SA-코팅 MTP 에 결합시켰다. 1 시간 인큐베이션 (450 rpm) 후, 웰을 300 ㎕ 세척 완충제 중 3 회 세척하였다 (모든 후속 인큐베이션 및 세척 단계를 마찬가지로 수행하였음). 그런 다음, 품질 표준 및 샘플 (1 ㎍/㎖ 치료적 항체 함유 low cross buffer® 중 예비인큐베이션됨) 을 100 ㎕/웰의 부피로 첨가하였다. 인큐베이션 및 세척 후, dig-표지된 hsFcγRI (가용성 인간 FcγRI) (0.5 ㎍/㎖) 을 100 ㎕/웰로 첨가하고, 추가적인 인큐베이션 및 세척 후, 100 ㎕/웰 다클론 항-Dig-S-Fab-HRP 접합체 (50 mU/㎖) 를 첨가하였다. 상기 기재한 바와 같은 인큐베이션 및 세척 후, 100 ㎕/웰 ABTS 기질을 첨가하였다. 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다 (참조 파장 490 nm). 샘플을 이반복으로 분석하고 평균내었다. 이반복으로 남녀 25 명 개인의 블랭크 혈청 샘플 분석에 의해, 이러한 검정의 커트 포인트를 평가하였다. Shankar et al. (Shankar, G., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 48 (2008) 1267-1281) 에 따른 비-매개변수적 접근방식을 사용하여 커트 포인트 계산을 수행하였다.
실시예 2
포획 항체로서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항체
비오틴화 항-PGLALA Fc-부위 항체 또는 비오틴화 항-AAA Fc-부위 항체 각각을 스트렙타비딘-코팅 멀티-웰 플레이트 (SA-MTP) 의 웰에 결합시켜 포획 플레이트를 생성하였다. 과량의 미결합 항체를 세척에 의해 제거하였다. 인간 및 시노몰구스 원숭이 혈청 중 스파이킹된 샘플/표준 항체 (10% 최종 농도) 를 포획 항체로 코팅된 SA-MTP 멀티-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 웰을 디곡시게닐화 항-인간 카파 항체 M1.7.10 과 함께 인큐베이션하였다 (예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO 2011/048043 참조). 세척 후 결합 디곡시게닐화 항-인간 카파 항체 복합체를 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 표지된 항-디곡시게닌 항체와 함께 인큐베이션하였다. 또 다른 세척 단계 후, ABTS 용액을 웰에 첨가하고 인큐베이션하였다. 색 반응의 산물을 Elisa 판독기에 의해 405 nm 파장에서 측정하였다 (참조 파장: 490 nm). 각각의 샘플 또는 표준의 흡광도 값을 삼반복으로 측정하였다.
하기 표는, 포획 항체로서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체 M1.3.17 (SEQ ID NO: 03 및 04) 로의 혈청 중 돌연변이 P329G, L234A, L235A, I253A, H310A 및 H435A 를 갖는 항-VEGF/ANG2 항체에 대해 측정한 흡광 값을 나타낸다.
Figure pct00005
하기 표는, 포획 및 검출 항체로서 본원에서 보고하는 바와 같은 상이한 항체를 사용하여 상이한 돌연변이를 갖는 상이한 특이성의 항체에 대해 측정한 흡광 값을 나타낸다.
검정 B: 포획 항체: M1.6.22-Bi/M1.7.24-Bi/M1.3.17-Bi
트레이서 항체: 1.7.10-Dig
검정 C: 포획 항체: M1.6.22-Bi/M1.7.24-Bi/M1.3.17-Bi
트레이서 화합물: FcγRI-Dig
M1.6.22 = 항-AAA 변이체 Fc-부위 항체
M1.7.10 = 항-IgG1 카파 항체
M1.7.24 = 항-PGLALA 변이체 Fc-부위 항체
M1.3.17 = 항-PGLALA 변이체 Fc-부위 항체
샘플:
1) 항-VEGF/ANG2 항체 (돌연변이 P329G/L234A/L235A/I253A/H310A/H435A 를 갖는 IgG1 하위부류)
2) 항-VEGF/ANG2 항체 (돌연변이 P329G/L234A/L235A 를 갖는 IgG1 하위부류)
3) 항-IGF-1R 항체 (돌연변이 I253A/H310A/H435A 를 갖는 IgG1 하위부류)
4) 항-P-셀렉틴 항체 (돌연변이 S228P/L235E 를 갖는 IgG4 하위부류)
5) 항-VEGF/ANG2 항체 (야생형 IgG1 하위부류)
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
검정 D: 포획 항체: M1.7.24-Bi/M1.3.17-Bi
트레이서 항체: 1.7.10-Dig/M1.19.31-Dig
M1.7.10 = 항-IgG1 카파 항체
M1.19.31 = 항-IgG1 카파 항체
M1.7.24 = 항-PGLALA 변이체 Fc-부위 항체
M1.3.17 = 항-PGLALA 변이체 Fc-부위 항체
샘플:
6) 항-Dig 항체 (돌연변이 P329G/L234A/L235A 를 갖는 IgG1 하위부류)
Figure pct00012
실시예 3
트레이서 항체로서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항체
비오틴화 항-인간 카파 항체 M1.7.10 (예를 들어 WO 2011/048043 참조) 을 스트렙타비딘-코팅 멀티-웰 플레이트 (SA-MTP) 의 웰에 결합시켜 포획 플레이트를 생성하였다. 과량의 미결합 항체를 세척에 의해 제거하였다. 인간 및 시노몰구스 원숭이 혈청 중 스파이킹된 샘플/표준 항체 (10% 최종 농도) 를 포획 항체로 코팅된 SA-MTP 멀티-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 웰을 각각 디곡시게닐화 항-PGLALA Fc-부위 항체 또는 항-AAA Fc-부위 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후 결합 디곡시게닐화 항-인간 카파 항체 복합체를 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 표지된 항-디곡시게닌 항체와 함께 인큐베이션하였다. 또 다른 세척 단계 후, ABTS 용액을 웰에 첨가하였다. 색 반응의 산물을 Elisa 판독기에 의해 405 nm 파장에서 측정하였다 (참조 파장: 490 nm). 각각의 샘플 또는 표준의 흡광도 값을 삼반복으로 측정하였다.
하기 표는, 트레이서 항체로서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체 M1.7.24 (SEQ ID NO: 07 및 08) 로의 혈청 중 돌연변이 P329G, L234A, L235A, I253A, H310A 및 H435A 를 갖는 항-VEGF/ANG2 항체에 대해 측정한 흡광 값을 나타낸다.
Figure pct00013
하기 표는, 포획 및 검출 항체로서 본원에서 보고하는 바와 같은 상이한 항체를 사용하여 Fc-부위에서 상이한 돌연변이를 갖는 상이한 특이성의 항체에 대해 측정한 흡광 값을 나타낸다.
검정 A: 포획 항체: M1.7.10-Bi
트레이서 항체: M1.6.22-Dig/M1.7.24-Dig/M1.3.17-Dig
M1.6.22 = 항-AAA 변이체 Fc-부위 항체
M1.7.10 = 항-IgG1 카파 항체
M1.7.24 = 항-PGLALA 변이체 Fc-부위 항체
M1.3.17 = 항-PGLALA 변이체 Fc-부위 항체
샘플:
1) 항-VEGF/ANG2 항체 (돌연변이 P329G/L234A/L235A/I253A/H310A/H435A 를 갖는 IgG1 하위부류)
2) 항-VEGF/ANG2 항체 (돌연변이 P329G/L234A/L235A 를 갖는 IgG1 하위부류)
3) 항-IGF-1R 항체 (돌연변이 I253A/H310A/H435A 를 갖는 IgG1 하위부류)
4) 항-P-셀렉틴 항체 (돌연변이 S228P/L235E 를 갖는 IgG4 하위부류)
5) 항-VEGF/ANG2 항체 (야생형 IgG1 하위부류)
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
하기 표는, 포획 항체로서의 항-IL2 항체 및 트레이서 항체로서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체 M1.7.24 (SEQ ID NO: 07 및 08) 로의 혈청 중 돌연변이 P329G, L234A, L235A, I253A, H310A 및 H435A 를 갖는 사이토카인 (IL-2) 항체 접합체에 대해 측정한 흡광 값을 나타낸다.
Figure pct00017
실시예 4
포획 항체 뿐 아니라 트레이서 항체로서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항체
비오틴화 항-PGLALA Fc-부위 항체 또는 항-AAA Fc-부위 항체 각각을 스트렙타비딘-코팅 멀티-웰 플레이트 (SA-MTP) 의 웰에 결합시켜 포획 플레이트를 생성하였다. 과량의 미결합 항체를 세척에 의해 제거하였다. 인간 및 시노몰구스 원숭이 혈청 중 스파이킹된 샘플/표준 항체 (10% 최종 농도) 를 포획 항체로 코팅된 SA-MTP 멀티-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 웰을 각각 디곡시게닐화 항-PG Fc-부위 항체 또는 항-AAA Fc-부위 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후 결합 디곡시게닐화 항-인간 카파 항체 복합체를 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 표지된 항-디곡시게닌 항체와 함께 인큐베이션하였다. 또 다른 세척 단계 후, ABTS 용액을 웰에 첨가하였다. 색 반응의 산물을 Elisa 판독기에 의해 405 nm 파장에서 측정하였다 (참조 파장: 490 nm). 각각의 샘플 또는 표준의 흡광도 값을 삼반복으로 측정하였다.
하기 표는, 포획 항체로서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체 M1.3.17 (SEQ ID NO: 03 및 04) 및 트레이서 항체로서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체 M1.7.24 (SEQ ID NO: 07 및 08) 로의 혈청 중 돌연변이 P329G, L234A, L235A, I253A, H310A 및 H435A 를 갖는 항-VEGF/ANG2 항체에 대해 측정한 흡광 값을 나타낸다.
Figure pct00018
실시예 5
항-약물 항체 검정에서 교정 표준으로서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항체
항-PG Fc-부위 항체 또는 항-AAA Fc-부위 항체 각각의 연속 희석물을 표준 곡선으로서 제조하였다.
돌연변이 P329G, L234A, L235A, I253A, H310A 및 H435A 를 갖는 비오틴화 항-VEGF/ANG2 항체 및 돌연변이 P329G, L234A, L235A, I253A, H310A 및 H435A 를 갖는 디곡시게닐화 항-VEGF/ANG2 항체를 밤새 실온에서 희석된 샘플 또는 표준과 함께 예비인큐베이션하였다. 예비인큐베이션 후, 샘플을 스트렙타비딘-코팅 멀티-웰 플레이트에 옮기고 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 과량의 미결합 항체를 세척에 의해 제거하였다. 세척 단계 후 각각 돌연변이 P329G, L234A, L235A, I253A, H310A 및 H435A 를 갖는 비오틴화 및 디곡시게닐화 항-VEGF/ANG2 항체 뿐 아니라 항-PG Fc-부위 항체 M1.3.17 (SEQ ID NO: 03 및 04) 또는 항-약물 항체를 포함하는 결합 디곡시게닐화 착물을, 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 표지된 항-디곡시게닌-항체로 검출하였다. 세척 단계 후 및 각각의 기질과 함께 인큐베이션시 형성된 복합체 중 존재하는 HRP 는 ABTS 의 유색 산물로의 전환을 촉매화시킨다. 신호를 Elisa 판독기에 의해 405 nm 파장에서 측정하였다 (참조 파장: 490 nm). 각각의 혈청 샘플의 흡광도 값을 삼반복으로 측정하였다.
하기 표는, 표준 항체로서 본원에서 보고하는 바와 같은 항-변이체 (인간) Fc-부위 항체 M1.3.17 (SEQ ID NO: 03 및 04) 로의 트레이서 항체 (디곡시게닐화) 로서 뿐 아니라 포획 항체 (비오틴화) 로서 혈청 중 돌연변이 P329G, L234A, L235A, I253A, H310A 및 H435A 를 갖는 항-VEGF/ANG2 항체에 대해 측정한 흡광 값을 나타낸다.
Figure pct00019
실시예 6
샘플로부터 표적 항체를 감손시키기 위한 본원에서 보고하는 바와 같은 항체의 용도
Figure pct00020
Figure pct00021
실시예 7
PGLALAAAA 항체 검출에서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항체
비오틴화 항-PGLALA Fc-부위 항체를 스트렙타비딘-코팅 멀티-웰 플레이트 (SA-MTP) 의 웰에 결합시켜 포획 플레이트를 생성하였다. 과량의 미결합 항체를 세척에 의해 제거하였다. 인간 및 시노몰구스 원숭이 혈청 중 스파이킹된 샘플/표준 항체 (10% 최종 농도) 를 포획 항체로 코팅된 SA-MTP 멀티-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 웰을 디곡시게닐화 항-인간 카파 항체 M1.7.10 과 함께 인큐베이션하였다 (예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO 2011/048043 참조). 세척 후 결합 디곡시게닐화 항-인간 카파 항체 복합체를 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 표지된 항-디곡시게닌 항체와 함께 인큐베이션하였다. 또 다른 세척 단계 후, ABTS 용액을 웰에 첨가하고 인큐베이션하였다. 색 반응의 산물을 Elisa 판독기에 의해 405 nm 파장에서 측정하였다 (참조 파장: 490 nm). 각각의 샘플 또는 표준의 흡광도 값을 삼반복으로 측정하였다.
검정 E: 포획 항체: M1.7.24-Bi/M1.3.17-Bi
트레이서 항체: 1.7.10-Dig
M1.7.10 = 항-IgG1 카파 항체
M1.7.24 = 항-PGLALA 변이체 Fc-부위 항체
M1.3.17 = 항-PGLALA 변이체 Fc-부위 항체
샘플:
1) 항-VEGF/ANG2 항체 (돌연변이 P329G/L234A/L235A/I253A/H310A/H435A 를 갖는 IgG1 하위부류)
2) 항-VEGF/ANG2 항체 (돌연변이 P329G/L234A/L235A 를 갖는 IgG1 하위부류)
Figure pct00022
실시예 8
시노몰구스 연구 샘플의 측정 - 본 발명에 따른 항-약물 검정 및 종래의 가교 항-약물 항체 검정의 비교
가교 포맷 항-약물 항체 검정
제 1 단계에서 비오틴화 효과기 기능 침묵 치료적 항체, 효과기 기능 침묵 치료적 항체를 사용하는 인간 연구로부터의 샘플 뿐 아니라 디곡시게닐화 효과기 기능 침묵 치료적 항체를 밤새 실온에서 마이크로타이터 플레이트 (MTP) 진탕기에서 예비인큐베이션하였다 (500 rpm, 1 ㎍/㎖ 최종 포획 및 트레이서 농도; 0-100 ng/㎖ 샘플 농도). 제 2 단계에서 예비인큐베이션된 샘플을 스트렙타비딘 코팅 MTP (SA-MTP) 에 옮겼다. 과량의 미결합 착물을 각각 300 ㎕ 완충제로 3 회 세척하여 제거하였다. 세척 후 복합체-결합 디곡시게닐화 효과기 기능 침묵 치료적 항체를 서양고추냉이 퍼옥시다아제 접합 항-디곡시게닌 항체로 검출하였다 (1 시간 동안 실온에서 인큐베이션, 500 rpm 진탕). 추가 세척 단계 후 (3 회 300 ㎕ 완충제) ABTS 기질을 첨가하였다. 신호를 ELISA 판독기에 의해 405 nm 파장에서 측정하였다 (참조 파장: 490 nm). 각각의 혈청 샘플의 흡광도 값을 삼반복으로 측정하였다.
Figure pct00023
면역 복합체 검정 포맷
제 1 단계에서 비오틴화 항-PGLALA 항체를 스트렙타비딘-코팅 마이크로타이터 플레이트 (SA-MTP) 에 결합시켰다. 과량의 미결합 항체를 세척에 의해 제거하였다. 효과기 기능 침묵 치료적 항체 및 인간 혈청에서의 연구로부터의 항-약물 항체의 복합체를 포함하는 샘플을 웰에 첨가하고 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 웰을 디곡시게닐화 인간 FcγRI 와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후 결합 디곡시게닐화 인간 FcγRI 을 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 접합 항-디곡시게닌 항체로 검출하였다. 추가 세척 단계 후, ABTS 기질을 첨가하였다. 신호를 ELISA 판독기에 의해 405 nm 파장에서 측정하였다 (참조 파장: 490 nm). 각각의 혈청 샘플의 흡광도 값을 이반복으로 측정하였다.
Figure pct00024
연구 샘플 분석 결과:
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
실시예 9
결합 표적 및 전체 약물의 구별을 가능하게 하는 약물 표적 복합체 검출을 위한 포획 시약으로서의 본원에서 보고하는 바와 같은 항체
0.5 ㎍/㎖ 비오틴화 항-PG 항체를 스트렙타비딘-코팅 멀티-웰 플레이트 (SA-MTP) 의 웰에 결합시켜 포획 플레이트를 생성하였다. 과량의 미결합 항체를 세척 (300 ㎕/웰로 3 회) 에 의해 제거하였다. 100 ㎕/웰 샘플/표준 항체를 포획 항체로 코팅된 SA-MTP 멀티-웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
샘플은 PG(LALA) 변형을 갖는 항-표적 X 항체 (I) 및 표적 X 를 포함하며, 둘 모두 자유이고 결합된다. 항-표적 항체 (I) 은 플레이트에 결합할 것이다.
세척 (300 ㎕/웰로 3 회) 후, 웰을 100 ㎕/웰의 0.5 ㎍/㎖ 디곡시게닐화 항-표적 항체 (II) 와 함께 인큐베이션하였다.
항-표적 항체 (I) 및 (II) 는 또한 표적 X 에 동시에 결합할 수 있다.
세척 (300 ㎕/웰로 3 회) 후, 결합 디곡시게닐화 항-표적 항체 (II) 를 100 ㎕/웰의 50 mU/㎖ 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 표지된 항-디곡시게닌 항체와 함께 인큐베이션하였다. 또 다른 세척 단계 후, 100 ㎕/웰의 ABTS 용액을 웰에 첨가하였다. 색 반응의 산물을 Elisa 판독기에 의해 405 nm 파장에서 측정하였다 (참조 파장: 490 nm). 각각의 샘플 또는 표준의 흡광도 값을 삼반복으로 측정하였다.
약물 및 표적의 복합체만이 검정에서 신호를 생성할 것이다 (결합한 약물).
또한, 샘플을 과량의 표적과 함께 예비인큐베이션하여, 전체 약물을 취하기 위해 검정에서 측정하기 전 모든 이용가능한 약물 분자를 표적 결합한 약물로 전환시킬 수 있다.
이러한 검정의 모식도에 대해서는 도 6 을 참조한다.
전술한 발명이 이해의 명확성 목적으로 예 및 실례로서 보다 상세히 기재되어 있으나, 상세한 설명 및 실시예가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학적 문헌의 개시물은 그 전체가 참조로 명백히 포함된다.
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Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val 35 40 45 Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Val 50 55 60 Phe Ser Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Phe Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile 85 90 95 Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp 100 105 110 Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 115 120 125 <210> 3 <211> 137 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 20 25 30 Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Arg 35 40 45 Arg Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 85 90 95 Met Tyr Leu Gln Met Arg Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 4 <211> 128 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Ala Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ser Gly 1 5 10 15 Ala Ile Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Thr Thr Gly Ala Val 35 40 45 Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu 50 55 60 Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile 85 90 95 Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp 100 105 110 Tyr Ser Asp His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 115 120 125 <210> 5 <211> 140 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Met Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser 20 25 30 Thr Gly His Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 7 <211> 137 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 20 25 30 Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser 35 40 45 Arg Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Ile Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr 100 105 110 Tyr Cys Val Arg Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 130 135 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Arg Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Arg Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HVR-H1 consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X denotes a neutral hydrophilic amino acid residue <400> 11 Arg Tyr Trp Met Xaa 1 5 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Glu Ile Asn Pro Asp Ser Arg Pro Ile Asn Ser Ser Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Asp <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Glu Ile Asp Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Asp <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Glu Ile Thr Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Asp <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HVR-H2 consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X = neutral hydrophilic or acidic amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = neutral hydrophilic or basic amino aicd residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X = neutral hydrophilic or chain influencing amino aicd residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X = neutral hydrophilic or aromatic amino aicd residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X = neutral hydrophilic amino aicd residue <400> 15 Glu Ile Xaa Pro Asp Ser Xaa Xaa Ile Asn Xaa Xaa Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Asp <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Pro Leu Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Asn 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Ser 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HVR-H3 consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X=hydrophobic or aromatic amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X=neutral hydrophilic or aromatic amino acid residue <400> 19 Pro Xaa Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Xaa 1 5 10 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Leu Gly Met Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Arg Ser Thr Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HVR-L1 consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X=neutral hydrophilic amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X=neutral hydrophilic or acidic amino acid residue <400> 25 Arg Ser Xaa Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Xaa 1 5 10 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HVR-L2 consesus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X=acidic or basic amino acid residue <400> 27 Gly Thr Asn Xaa Arg Ala Pro 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Val Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Ala Leu Trp Tyr Ser Asp His Trp Val 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HVR-L3 consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 31 Xaa Leu Trp Tyr Ser Xaa His Trp Val 1 5 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser Thr Gly His Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HVR-L1 consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X=neutral or chain orientation influencing amino acid residue <400> 33 Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Xaa Thr Gly His Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5

Claims (11)

  1. (a) SEQ ID NO: 09 또는 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 12, 13 또는 14 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO: 16, 17 또는 18 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 23 또는 24 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 26 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 28, 29 또는 30 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 단리된 항체.
  2. (a) SEQ ID NO: 20 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 21 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO: 22 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 32 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 34 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 35 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 단리된 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단일클론 항체인 항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 항체.
  5. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 항체 단편인 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 인코딩하는 단리된 핵산.
  7. 제 6 항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  8. 제 7 항에 따른 숙주 세포를 배양하여 항체를 생성하는 것을 포함하는, 항체 생성 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 검출가능 표지를 포함하는 접합체.
  10. 샘플 중 Fc-부위에서 돌연변이 P329G 또는 돌연변이 P329G/L234A/L235A 또는 돌연변이 I253A/H310A/H435A 를 포함하는 IgG1 또는 IgG4 하위부류의 치료적 항체의 측정을 위한 포획 (capture) 항체 또는 트레이서 (tracer) 항체로서의 면역검정에서의 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  11. 포획 항체 및 트레이서 항체가 그들의 HVR 서열에 있어서 상이한, 샘플 중 돌연변이 I253A/H310A/H435A 를 포함하는 IgG1 또는 IgG4 하위부류의 치료적 항체의 측정을 위한 포획 항체 및 트레이서 항체로서의 면역검정에서의 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
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