JP2022025063A - 抗バリアントＦｃ領域抗体および使用法 - Google Patents

抗バリアントＦｃ領域抗体および使用法 Download PDF

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Abstract

【課題】バリアントFc領域に特異的に結合し、対応する野生型Fc領域には結合しない、バリアントFc領域に対する抗体（抗バリアントFc領域抗体）、それらの作製および使用方法を提供する。【解決手段】Fc領域に変異P329G、変異P329G/L234A/L235A、又は、変異I253A/H310A/H435Aを有する抗体に特異的に結合する抗バリアントFc領域抗体、およびそれを使用する方法を提供する。【選択図】図５

Description

発明の分野
本発明は、バリアントFc領域に特異的に結合し、対応する野生型Fc領域には結合しない、バリアントFc領域に対する抗体（抗バリアントFc領域抗体）に関する。それらの作製および使用の方法も、本明細書において報告される。
背景
1974年のKoehlerおよびMilsteinによる最初のモノクローナル抗体の開発以来、ヒトにおける治療のために適切な抗体の開発に多くの努力が捧げられた。入手可能になった最初のモノクローナル抗体は、マウスおよびラットにおいて開発された。これらの抗体は、ヒトの治療のために使用された時、抗齧歯類抗体による望まれない副作用を引き起こした。そのような望まれない副作用を低下させるため、またはさらには排除するため、多くの努力が捧げられた。
過去数年間に、市場に到達するヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体の数は、増え続けている。周知の例には、例えば、Hoffmann-La Roche（Basel）製のHerceptin（登録商標）およびMabThera（登録商標）が含まれる。
極めて多数のヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体が、調査中であり、最初の治験のためにヒトへの導入が検討され得る前に、実験動物において研究される必要がある。
2個のみを挙げるとすれば、生物学的利用能および抗体クリアランスのような重要な基準が、実験動物の助けを借りて研究されなければならない。これらの研究の多くは、宿主の自己抗体のバックグラウンドにおける治療用抗体の定量化を必要とする。大部分のケースにおいて、哺乳動物が実験動物として使用される。しばしば、マウスまたはラットのような齧歯類において、最初に毒物学が査定される。薬物開発のより進行した段階において、特に、ヒトへの薬物の導入の前には、サルも、そのような前臨床研究に含まれなければならない。
哺乳動物は、一般的に、循環血中に1ml当たり約10～約30ミリグラムの免疫グロブリンを有する。
治療用モノクローナル抗体は、典型的には、1ml当たり約1ナノグラム～1ml当たり約100マイクログラムの範囲の血清レベルで試験されなければならない。従って、治療用抗体は、約100倍～1000万倍過剰に存在する宿主抗体のバックグラウンドに対して検出されなければならない。宿主免疫グロブリンのバックグラウンドにおけるヒト治療用抗体またはヒト化治療用抗体の検出は、薬理学者にとって極めて大きなタスクとなっている。さらに、異なる治療用抗体は、異なる試薬およびアッセイフォーマットを必要とする場合があることが認識されるであろう。治療用抗体が野生型ヒト抗体に密接に関連すればするほど、ヒト抗体またはヒト化抗体の検出は困難になる。
酵素結合免疫吸着サンドイッチアッセイ（ELISA）ブリッジングアッセイ（図1A）は、スループットおよび感度が高く、異なるプロジェクトに容易に適用可能であるため、現在、免疫原性試験のための最先端のアッセイフォーマットとなっている（Mikulskis,A.,et al.,J.Immunol.Meth.365(2011)38-49（非特許文献1））。しかしながら、このアッセイの信頼性は、偽陽性結果をもたらすオリゴマー標的による干渉（Bautista,A.C.,et al.,Bioanal.2(2010)721-731（非特許文献2）；Mire-Sluis,A.R.,et al.,J.Immunol.Meth.289(2004)1-16(2004)（非特許文献3）；Weeraratne,D.K.,et al.,J.Immunol.Meth.396(2013)44-55（非特許文献4）；Zhong,Z.D.,et al.,J.Immunol.Meth.355(2010)21-28（非特許文献5））および標識された薬物分子と競合し、従って、ADAによるシグナルの生成を防止し、それによって偽陰性結果をもたらす、臨床試料中の高い薬物濃度の存在（Mire-Sluis,A.R.,et al.,J.Immunol.Meth.289(2004)1-16(2004)（非特許文献3）；Geng,D.,et al.,J.Pharm.Biomed.Anal.39(2005)364-375（非特許文献6））の両方によって脅かされる。伝統的なブリッジングアッセイにおいては、特に、薬物免疫複合体内に結合したADAの検出が有意に制限される（Mire-Sluis,A.R.,et al.,J.Immunol.Meth.289(2004)1-16(2004)（非特許文献3）；Geng,D.,et al.,J.Pharm.Biomed.Anal.39(2005)364-375（非特許文献6））。
Mikulskis,A.,et al.,J.Immunol.Meth.365(2011)38-49 Bautista,A.C.,et al.,Bioanal.2(2010)721-731 Mire-Sluis,A.R.,et al.,J.Immunol.Meth.289(2004)1-16(2004) Weeraratne,D.K.,et al.,J.Immunol.Meth.396(2013)44-55 Zhong,Z.D.,et al.,J.Immunol.Meth.355(2010)21-28 Geng,D.,et al.,J.Pharm.Biomed.Anal.39(2005)364-375
概要
抗薬物抗体（ADA）の検出のためのブリッジングアッセイは、オリゴマー標的および高い薬物濃度によってしばしば妨害されるため、改善されたアプローチが必要とされている。例えば、Fc領域へのPro329Gly（PG）置換の導入によってFcエフェクター機能を欠く治療用抗体のため、Fc領域内の置換に特異的な捕捉抗体、例えば、抗PG抗体、および検出のためのヒト可溶性Fcγ受容体を利用した、薬物および標的に寛容な免疫複合体アッセイが、本明細書において報告される。本明細書において報告されるアッセイは、従来のブリッジングアッセイと比較して増加した薬物およびオリゴマー標的に対する寛容を有する（Wessels,U.,et al.,Bioanalysis 8(2016)2135-2145）。例えば、ヒト可溶性FcγRIのようなヒト可溶性Fcγ受容体は、野生型（wt）IgGに特異的に結合し、Fc領域修飾型IgGには結合しないため、高い薬物濃度の存在下ですら、この方法は、抗薬物抗体の決定を可能にする。
両アッセイはADA Igサブタイプをディファレンシャルに認識するため、ブリッジングアッセイとの組み合わせにおいて、臨床試料の詳細なADA特徴決定が可能となる。Fc領域修飾型治療用抗体に対する個々のADA応答の徹底的な特徴決定のため、本明細書において報告されるアッセイによって、従来のブリッジングアッセイが補完される。
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、（血清含有）試料中の抗薬物抗体の存在および/または量の決定のためのアッセイである：
－（遊離抗体およびADA複合体化抗体を含む）試料から、Fcエフェクター機能を欠く抗体を捕捉するため、（Fc領域への1個または複数個の置換の導入によって）Fcエフェクター機能を欠く抗体に特異的に結合する抗体と共に、試料をインキュベートする工程、
－捕捉された抗体をヒト可溶性FcγRIと共にインキュベートすることによって、捕捉された抗体を検出し、試料中の抗薬物抗体の存在および/または量を決定する工程。
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、多重特異性結合剤の第2の結合特異性に特異的に結合する単一特異性結合剤と共に、試料をインキュベートすることによって、結合パートナーの検出の前に、多重特異性結合剤に結合した結合パートナーが枯渇させられる、多重特異性結合剤の第1の結合特異性が特異的に結合することができる結合パートナーの存在および/または量のインビトロ決定の方法である:
－結合パートナーおよび多重特異性結合剤を含む試料を、第1の結合特異性とは異なる多重特異性結合剤の第2の結合特異性に特異的に結合する単一特異性結合剤と共にインキュベートする工程、
－遊離の結合パートナーの存在または量の決定の前に、単一特異性結合剤-多重特異性結合剤複合体を試料から枯渇させる工程、ならびに
－上記の局面において報告される方法によって、多重特異性結合剤が枯渇した試料において結合パートナーの量を決定する工程。
本明細書において報告される一つの局面は、（a）SEQ ID NO:09または10のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:12、13、または14のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:16、17、または18のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:23または24のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:28、29、または30のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、253位、310位、および435位に各々アミノ酸残基アラニンを含む（カバットEUインデックスによるナンバリング）Fc領域に特異的に結合する単離された抗体である。
この抗体は、以後、抗AAA抗体と示される。
本明細書において報告される一つの局面は、（a）SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、329位にアミノ酸残基グリシンを含む（任意で、234位および235位に各々アミノ酸残基アラニンを含む）（カバットEUインデックスによるナンバリング）Fc領域に特異的に結合する単離された抗体である。
この抗体は、以後、抗PG抗体と示される。
一つの態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。
一つの態様において、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。
一つの態様において、抗体は、それぞれの変異型Fc領域に特異的に結合する抗体断片である。
本明細書において報告される一つの局面は、本明細書において報告される抗体をコードする単離された核酸である。
本明細書において報告される一つの局面は、本明細書において報告される核酸を含む宿主細胞である。
一つの態様において、宿主細胞は、真核細胞である。一つの態様において、真核細胞は、哺乳動物細胞である。一つの好ましい態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞またはHEK細胞である。
一つの局面は、抗体が産生されるように、本明細書において報告される宿主細胞を培養する工程を含む、抗体を作製する方法である。
一つの態様において、方法は、本明細書において報告される抗体をコードする核酸を含む本明細書において報告される細胞を培養する工程、および細胞または培養培地から抗体を回収する工程を含む。
本明細書において報告される一つの局面は、検出可能標識にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体を含むコンジュゲートである。
本明細書において報告される一つの局面は、（試料中の）Fc領域に変異P329Gまたは変異P329G/L234A/L235Aまたは変異I253A/H310A/H435A（カバットEUインデックスによるナンバリング）を含むIgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスの治療用抗体の測定のための、捕捉抗体またはトレーサー抗体のいずれかとしての、イムノアッセイにおける本明細書において報告される抗体の使用である。
本明細書において報告される一つの局面は、試料中の変異I253A/H310A/H435A（カバットEUインデックスによるナンバリング）を含むIgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスの治療用抗体の測定のための、捕捉抗体およびトレーサー抗体としての、イムノアッセイにおける本明細書において報告される2種の異なる抗体の使用であり、ここで、捕捉抗体およびトレーサー抗体は、HVR配列において異なっている。
本明細書において報告される一つの局面は、（試料中の）IgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスの治療用抗体に対する抗薬物抗体の測定のための、捕捉抗体またはトレーサー抗体のいずれかとしての、イムノアッセイにおける本明細書において報告される抗体の使用であり、ここで、治療用抗体のFc領域は、変異P329Gまたは変異P329G/L234A/L235Aまたは変異I253A/H310A/H435A（カバットEUインデックスによるナンバリング）を含む。
[本発明1001]
（a）SEQ ID NO:09または10のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:12、13、または14のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:16、17、または18のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:23または24のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:28、29、または30のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、単離された抗体。
[本発明1002]
（a）SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、単離された抗体。
[本発明1003]
モノクローナル抗体である、本発明1001～1002のいずれかの抗体。
[本発明1004]
ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、本発明1001～1003のいずれかの抗体。
[本発明1005]
抗体断片である、本発明1001または1004のいずれかの抗体。
[本発明1006]
本発明1001～1005のいずれかの抗体をコードする単離された核酸。
[本発明1007]
本発明1006の核酸を含む宿主細胞。
[本発明1008]
抗体が産生されるように、本発明1007の宿主細胞を培養する工程を含む、抗体を作製する方法。
[本発明1009]
本発明1001～1005のいずれかの抗体および検出可能標識を含むコンジュゲート。
[本発明1010]
試料中のFc領域に変異P329Gまたは変異P329G/L234A/L235Aまたは変異I253A/H310A/H435Aを含むIgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスの治療用抗体の測定のための、捕捉抗体またはトレーサー抗体のいずれかとしての、イムノアッセイにおける本発明1001～1005のいずれかの抗体の使用。
[本発明1011]
試料中の変異I253A/H310A/H435Aを含むIgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスの治療用抗体の測定のための、捕捉抗体およびトレーサー抗体としての、イムノアッセイにおける本発明1001および1003～1005のいずれかの抗体の使用であって、捕捉抗体およびトレーサー抗体がHVR配列において異なっている、使用。
本明細書において報告される抗体を捕捉試薬として使用したイムノアッセイのスキーム。 本明細書において報告される抗体をトレーサー試薬として使用したイムノアッセイのスキーム。 本明細書において報告される抗体を捕捉試薬およびトレーサー試薬として使用したイムノアッセイのスキーム。 本明細書において報告される抗体を標準として使用したイムノアッセイのスキーム。 本明細書において報告される抗体を捕捉抗体として使用し、可溶性Fcγ受容体をトレーサー分子として使用したイムノアッセイのスキーム。 本明細書において報告される抗体を捕捉抗体として使用し、抗標的抗体をトレーサー抗体として使用したイムノアッセイのスキーム。 臨床試験の4人の患者におけるADA発生の例示的な時間的経過：患者は、治療用抗体（各10mg用量）の隔週（A、C）または毎週（B）の投与を受容し、各投薬の前後に毎日、血液試料が収集された（C2、C3：第2および第3の処置サイクル）。全ての試料が、従来のブリッジングアッセイ（薄灰色のバー）およびhsFcγRI-PGアッセイ（黒色のバー）の両方によって、抗薬物抗体（ADA）について試験された。血中薬物濃度（ng/ml）が提供され（下の曲線）、ADA陰性（-）または陽性（+）として査定された試料が、対応するバーの上に示される。 臨床試験の4人の患者におけるADA発生の例示的な時間的経過：患者は、治療用抗体（各10mg用量）の隔週（A、C）または毎週（B）の投与を受容し、各投薬の前後に毎日、血液試料が収集された（C2、C3：第2および第3の処置サイクル）。全ての試料が、従来のブリッジングアッセイ（薄灰色のバー）およびhsFcγRI-PGアッセイ（黒色のバー）の両方によって、抗薬物抗体（ADA）について試験された。血中薬物濃度（ng/ml）が提供され（下の曲線）、ADA陰性（-）または陽性（+）として査定された試料が、対応するバーの上に示される。 臨床試験の4人の患者におけるADA発生の例示的な時間的経過：患者は、治療用抗体（各10mg用量）の隔週（A、C）または毎週（B）の投与を受容し、各投薬の前後に毎日、血液試料が収集された（C2、C3：第2および第3の処置サイクル）。全ての試料が、従来のブリッジングアッセイ（薄灰色のバー）およびhsFcγRI-PGアッセイ（黒色のバー）の両方によって、抗薬物抗体（ADA）について試験された。血中薬物濃度（ng/ml）が提供され（下の曲線）、ADA陰性（-）または陽性（+）として査定された試料が、対応するバーの上に示される。
発明の態様の詳細な説明
I.定義
本明細書において使用されるように、重鎖および軽鎖の全ての定常領域および定常ドメインのアミノ酸位置が、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)に記載され本明細書において「カバットによるナンバリング」と呼ばれるカバットナンバリングシステムに従ってナンバリングされる。具体的には、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)のカバットナンバリングシステム（647～660頁を参照すること）が、κアイソタイプおよびλアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLのために使用され、カバットEUインデックスナンバリングシステム（661～723頁を参照すること）が、定常重鎖ドメイン（CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3）のために使用される。
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義されるようなヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（VL）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（VH）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、同一のアミノ酸配列を含んでいてもよいし、またはアミノ酸配列変化を含有していてもよい。いくつかの態様において、アミノ酸変化の数は、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、または2個以下である。いくつかの態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列に関して同一である。
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性の相互作用の合計の強度をさす。そうでないことが示されない限り、本明細書において使用されるように、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）の間の1:1相互作用を反映する固有の結合親和性をさす。分子XのパートナーYに対する親和性は、一般に、解離定数（kd）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載されたものを含む、当技術分野において公知の一般的な方法によって測定され得る。
「親和性成熟」抗体とは、そのような改変を保有しない親抗体と比較して、抗体の抗原に対する親和性の改善をもたらす1個または複数個の改変を、1個または複数個の超可変領域（HVR）に有する抗体をさす。
「改変」という用語は、例えば、バリアントの抗体または融合ポリペプチドを入手するための、Fc領域のFcRn結合部分を少なくとも含む抗体または融合ポリペプチドの親アミノ酸配列における1個または複数個のアミノ酸残基の変異、付加、または欠失を示す。
「アミノ酸変異」という用語は、親アミノ酸配列のアミノ酸配列における修飾を示す。例示的な修飾には、アミノ酸の置換、挿入、および/または欠失が含まれる。一つの態様において、アミノ酸変異は置換である。「位置におけるアミノ酸変異」という用語は、明示された残基の置換もしくは欠失、または明示された残基の隣への少なくとも1個のアミノ酸残基の挿入を示す。「明示された残基の隣への挿入」という用語は、その1～2残基内の挿入を示す。挿入は、明示された残基のN末端側またはC末端側であり得る。
「アミノ酸置換」という用語は、予定された親アミノ酸配列における少なくとも1個のアミノ酸残基の、異なる「交換」アミノ酸残基への交換を示す。交換残基は、「天然に存在するアミノ酸残基」（即ち、遺伝暗号によってコードされたもの）であってよく、アラニン（Ala）；アルギニン（Arg）；アスパラギン（Asn）；アスパラギン酸（Asp）；システイン（Cys）；グルタミン（Gln）；グルタミン酸（Glu）；グリシン（Gly）；ヒスチジン（His）；イソロイシン（Ile）:ロイシン（Leu）；リジン（Lys）；メチオニン（Met）；フェニルアラニン（Phe）；プロリン（Pro）；セリン（Ser）；トレオニン（Thr）；トリプトファン（Trp）；チロシン（Tyr）；およびバリン（Val）からなる群より選択される。一つの態様において、交換残基はシステインではない。1個または複数個の天然に存在しないアミノ酸残基への置換も、本明細書におけるアミノ酸置換の定義に包含される。「天然に存在しないアミノ酸残基」とは、ポリペプチド鎖内で隣のアミノ酸残基と共有結合で結合することができる、上にリストされた天然に存在するアミノ酸残基以外の残基を示す。天然に存在しないアミノ酸残基の例には、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、aib、および、Ellman,et al.,Meth.Enzym.202(1991)301-336に記載されたもののようなその他のアミノ酸残基類似体が含まれる。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を生成するためには、Norenら（Science 244(1989)182）および/またはEllmanら（前記）の手法を使用することができる。簡単に説明すると、これらの手法は、天然に存在しないアミノ酸残基を含むサプレッサーtRNAを化学的に活性化した後の、RNAのインビトロの転写および翻訳を含む。天然に存在しないアミノ酸は、化学的なペプチド合成、およびその後の抗体または抗体断片のような組換え作製されたポリペプチドとのこれらのペプチドの融合を介して、ペプチドへ組み入れられてもよい。
「アミノ酸挿入」という用語は、予定された親アミノ酸配列への少なくとも1個の付加的なアミノ酸残基の組み入れを示す。挿入は、一般的には、1個または2個のアミノ酸残基の挿入からなるが、本願は、より大きい「ペプチド挿入」、例えば、約3～約5個またはさらには約10個までのアミノ酸残基の挿入を企図する。挿入される残基は、前記定義の天然に存在するものまたは天然に存在しないものであり得る。
「アミノ酸欠失」という用語は、アミノ酸配列内の予定された位置における少なくとも1個のアミノ酸残基の除去を示す。
本願において、アミノ酸改変が言及される場合は常に、それは、ランダムなアミノ酸修飾ではなく計画的なアミノ酸改変である。
「抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体」および「バリアント（ヒト）Fc領域に特異的に結合する抗体」という用語は、抗体がバリアント（ヒト）Fc領域を標的とするための診断剤として有用であるよう十分な親和性で、バリアント（ヒト）Fc領域に結合することができる抗体をさす。一つの態様において、抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体の対応する野生型（ヒト）Fc領域との結合の程度は、その抗体のバリアント（ヒト）Fc領域との結合の約10％未満である。これは、例えば、表面プラズモン共鳴を使用して決定され得る。ある種の態様において、バリアント（ヒト）Fc領域に特異的に結合する抗体は、10-8M以下、例えば、10-8M～10-13M、例えば、10-9M～10-13Mの解離定数（KD）を有する。
「抗体」という用語は、本明細書において、最も広義に使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含むが、これらに限定されるわけではない、様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」とは、完全抗体が結合する抗原に結合する完全抗体の一部分を含む完全抗体以外の分子をさす。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ（diabody）；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
「との結合」という用語は、例えば、抗体の抗原との結合のような、第1のエンティティの第2のエンティティとの結合を示す。この結合は、例えば、BIAcore（登録商標）アッセイ（GE Healthcare,Uppsala,Sweden）を使用して決定され得る。
例えば、BIAcore（登録商標）アッセイの一つの可能な態様において、抗原が表面に結合させられ、抗体の結合が表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定される。結合の親和性は、ka（会合定数：複合体を形成するための会合についての速度定数）、kd（解離定数；複合体の解離についての速度定数）、およびKD（kd/ka）という用語によって定義される。あるいは、SPRセンサーグラムの結合シグナルが、共鳴シグナルの高さおよび解離挙動に関して、参照の応答シグナルと直接比較されてもよい。
「CH2ドメイン」という用語は、およそEU231位～EU340位（カバットによるEUナンバリングシステム）に及ぶ抗体重鎖ポリペプチドの一部を示す。CH2ドメインは、もう一つのドメインと密接に対合しないという点で独特である。むしろ、2本のN結合型分岐炭水化物鎖が、インタクトネイティブFc領域の2個のCH2ドメインの間に挿入されている。炭水化物は、ドメイン-ドメイン対合の代わりを提供し、CH2ドメインの安定化を助けている可能性があると推測されている。Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206。
「CH3ドメイン」という用語は、およそEU341位～EU446位に及ぶ抗体重鎖ポリペプチドの一部を示す。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の起源または種に由来し、重鎖および/または軽鎖の残りが異なる起源または種に由来する抗体をさす。
抗体の「クラス」とは、その重鎖が保有している定常ドメインまたは定常領域の型をさす。抗体の五つの主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2へさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
「補体依存性細胞傷害（CDC）」という用語は、補体の存在下で、本明細書において報告される抗体によって誘導される細胞の溶解をさす。CDCは、抗体が30μg/mlの濃度で標的細胞の20％以上の溶解を誘導する場合に見出される。補体因子C1qとの結合は、ELISAにおいて測定され得る。そのようなアッセイにおいては、原理的に、ELISAプレートが、ある濃度範囲の抗体によってコーティングされ、そこに、精製されたヒトC1qまたはヒト血清が添加される。C1q結合は、C1qに対する抗体の後、ペルオキシダーゼによって標識されたコンジュゲートによって検出される。結合（最大結合Bmax）の検出は、ペルオキシダーゼ基質ABTS（登録商標）（2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホネート(6)]）についての405nmにおける光学濃度（OD405）として測定される。
「エフェクター機能」とは、抗体クラスによって変動する抗体のFc領域に起因する生物学的活性をさす。抗体エフェクター機能の例には、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）；Fc受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ADCC）；貪食；細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体）のダウンレギュレーション；ならびにB細胞活性化が含まれる。
Fc受容体結合依存性エフェクター機能は、造血細胞上の特殊な細胞表面受容体であるFc受容体（FcR）との、抗体のFc領域の相互作用によって媒介され得る。Fc受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、抗体依存性細胞傷害（ADCC）を介して、免疫複合体の貪食による抗体によってコーティングされた病原体の除去、ならびに対応する抗体によってコーティングされた赤血球および様々なその他の細胞標的（例えば、腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えば、Van de Winkel,J.G.and Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524を参照すること）。FcRは、免疫グロブリンアイソタイプに対する特異性によって定義され：IgG抗体についてのFc受容体は、FcγRと呼ばれる。Fc受容体結合は、例えば、Ravetch,J.V.and Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.,et al.,Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.,et al.,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；Gessner,J.E.,et al.,Ann.Hematol.76(1998)231-248に記載されている。
IgG抗体のFc領域の受容体（FcγR）の架橋は、貪食、抗体依存性細胞傷害、および炎症メディエーターの放出を含む多様なエフェクター機能を誘発し、免疫複合体クリアランスおよび抗体産生の制御も誘発する。ヒトにおいて、FcγRの三つのクラスが特徴決定されている：
－FcγRI（CD64）は、高い親和性で単量体IgGに結合し、マクロファージ、単球、好中球、および好酸球において発現されている。アミノ酸残基E233～G236、P238、D265、N297、A327、およびP329（カバットのEUインデックスによるナンバリング）のうちの少なくとも1個におけるFc領域IgGの修飾は、FcγRIとの結合を低下させる。233～236位のIgG2残基の、IgG1およびIgG4への置換は、FcγRIとの結合を103倍低下させ、抗体によって感作された赤血球に対するヒト単球の応答を排除した（Armour,K.L.,et al.,Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624）。
－FcγRII（CD32）は、中～低親和性で、複合体化されたIgGと結合し、広く発現されている。この受容体は、二つのサブタイプ、FcγRIIAおよびFcγRIIBへ分けられ得る。FcγRIIAは、殺傷に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）に見出され、殺傷過程を活性化することができるようである。FcγRIIBは、阻害性の過程において役割を果たすようであり、B細胞、マクロファージ、ならびにマスト細胞および好酸球に見出される。B細胞において、それは、さらなる免疫グロブリン産生、および、例えば、IgEクラスへのアイソタイプスイッチングを抑制するために機能するようである。マクロファージにおいて、FcγRIIBは、FcγRIIAを通して媒介される貪食を阻害するよう作用する。好酸球およびマスト細胞において、B型は、IgEの別々の受容体との結合を通して、これらの細胞の活性化の抑制を助けることができる。FcγRIIAに対する結合の低下は、例えば、アミノ酸残基E233～G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292、およびK414（カバットのEUインデックスによるナンバリング）のうちの少なくとも1個に変異を有するIgG Fc領域を含む抗体について見出される。
－FcγRIII（CD16）は、中～低親和性でIgGに結合し、二つの型として存在する。FcγRIIIAは、NK細胞、マクロファージ、好酸球、ならびにいくつかの単球およびT細胞に見出され、ADCCを媒介する。FcγRIIIBは、好中球において高度に発現されている。FcγRIIIAとの結合の低下は、例えば、アミノ酸残基E233～G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338、およびD376（カバットのEUインデックスによるナンバリング）のうちの1個に少なくとも変異を有するIgG Fc領域を含む抗体について見出される。
Fc受容体に対するヒトIgG1上の結合部位のマッピング、前述の変異部位、ならびにFcγRIおよびFcγRIIAとの結合を測定する方法は、Shields,R.L.,et al.J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604に記載されている。
「Fc受容体」という用語は、本明細書において使用されるように、受容体に関連した細胞質ITAM配列の存在を特徴とする活性化受容体をさす（例えば、Ravetch,J.V.and Bolland,S.,Annu.Rev.Immunol.19(2001)275-290を参照すること）。そのような受容体は、FcγRI、FcγRIIA、およびFcγRIIIAである。「FcγRの結合なし」という用語は、10μg/mlの抗体濃度で、本明細書において報告される抗体のNK細胞との結合が、WO 2006/029879に報告されたような抗OX40L抗体LC.001について見出された結合の10％以下であることを示す。
IgG4は、低下したFcR結合を示し、その他のIgGサブクラスの抗体は、強力な結合を示す。しかしながら、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297（Fc炭水化物の損失）、Pro329および234、235、236および237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、ならびにHis435も、改変された場合、低下したFcR結合を提供する残基である（Shields,R.L.,et al.J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.,et al.,FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.,et al.,Immunology 86(1995)319-324；およびEP 0 307 434）。一つの態様において、本明細書において報告される抗体は、IgG1サブクラスまたはIgG2サブクラスのものであり、変異PVA236、GLPSS331、および/またはL234A/L235Aを含む。一つの態様において、本明細書において報告される抗体は、IgG4サブクラスのものであり、変異L235Eを含む。一つの態様において、抗体は変異S228Pをさらに含む。
「Fc領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有している免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために、本明細書において使用される。この用語には、ネイティブ配列Fc領域およびバリアントFc領域が含まれる。一つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、重鎖のCys226またはPro230からカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Fc領域のC末端リジン（Lys447）は存在してもよいしまたは存在しなくてもよい。本明細書中にそうでないことが明示されない限り、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242に記載されたような、EUインデックスとも呼ばれるEUナンバリングシステムによる。
本明細書において報告される抗体は、Fc領域、一つの態様において、ヒト起源に由来するFc領域を含む。一つの態様において、Fc領域は、ヒト定常領域の全ての部分を含む。抗体のFc領域は、補体活性化、C1q結合、C3活性化、およびFc受容体結合に直接関与している。補体系に対する抗体の影響は、ある種の条件に依存するが、C1qとの結合は、Fc領域内の定義された結合部位によって引き起こされる。そのような結合部位は、最先端技術において公知であり、例えば、Lukas,T.J.,et al.,J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.,and Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.,et al.,Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.,et al.,Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.,et al.,J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.,et al.,J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.,et al.,Immunology 86(1995)319-324；およびEP 0 307 434によって記載されている。そのような結合部位は、例えば、L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、およびP329（カバットのEUインデックスによるナンバリング；本明細書中にそうでないことが明示されない限り、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242に記載されたような、EUインデックスとも呼ばれるEUナンバリングシステムによる）。サブクラスIgG1、IgG2、およびIgG3の抗体は、一般的に、補体活性化、C1q結合、およびC3活性化を示すが、IgG4は、補体系を活性化せず、C1qに結合せず、C3を活性化しない。「抗体のFc領域」とは、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づき定義される。一つの態様において、Fc領域はヒトFc領域である。一つの態様において、Fc領域は、変異S228Pおよび/またはL235E（カバットのEUインデックスによるナンバリング）を含むヒトIgG4サブクラスのものである。一つの態様において、Fc領域は、変異L234AおよびL235A（カバットのEUインデックスによるナンバリング）を含むヒトIgG1サブクラスのものである。
「フレームワーク」または「FR」とは、超可変領域（HVR）残基以外の可変ドメイン残基をさす。可変ドメインのFRは、一般に、4個のFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。従って、VH（またはVL）において、HVRおよびFRの配列が、一般に、以下の順序で出現する：FR1-H1（L1）-FR2-H2（L2）-FR3-H3（L3）-FR4。
「全長抗体」、「インタクト抗体」、および「完全抗体」という用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似している構造を有するか、または本明細書において定義されるFc領域を含有している重鎖を有する抗体をさすために、本明細書において交換可能に使用される。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外来性核酸が導入された細胞を、そのような細胞の子孫を含め、さす。宿主細胞には、初代の形質転換細胞および継代数に関係なくそれに由来する子孫を含む「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、核酸内容に関して親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有していてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたかまたは選択されたのと同一の機能または生物学的活性を有する変異体子孫が、本明細書において含まれる。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンのVLまたはVHのフレームワーク配列のセレクションにおいて最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンのVL配列またはVH配列のセレクションは、可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般に、配列のサブグループは、Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Bethesda MD(1991),NIH Publication 91-3242,Vols.1-3と同様のサブグループである。一つの態様において、VLについて、サブグループは、Kabat et al.（前記）と同様のサブグループκIである。一つの態様において、VHについて、サブグループは、Kabat et al.（前記）と同様のサブグループIIIである。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基とヒトFR由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体をさす。ある種の態様において、ヒト化抗体は、HVR（例えば、CDR）の全部または実質的に全部が非ヒト抗体のものに相当し、FRの全部または実質的に全部がヒト抗体のものに相当する、少なくとも1個、典型的には、2個の可変ドメインの実質的に全部を含むであろう。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体をさす。
「超可変領域」または「HVR」という用語は、本明細書において使用されるように、配列に関して超可変性であるアミノ酸残基ストレッチ（「相補性決定領域」もしくは「CDR」）を含み、かつ/または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ/または抗原と接触する残基（「抗原接触部」）を含有している抗体可変ドメインの領域の各々をさす。一般に、抗体は、6個のHVRを含み；VHに3個（H1、H2、H3）、VLに3個（L1、L2、L3）を含む。
HVRは、
（a）アミノ酸残基26～32（L1）、50～52（L2）、91～96（L3）、26～32（H1）、53～55（H2）、および96～101（H3）に存在する超可変ループ（Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917）；
（b）アミノ酸残基24～34（L1）、50～56（L2）、89～97（L3）、31～35b（H1）、50～65（H2）、および95～102（H3）に存在するCDR（Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242）；
（c）アミノ酸残基27c～36（L1）、46～55（L2）、89～96（L3）、30～35b（H1）、47～58（H2）、および93～101（H3）に存在する抗原接触部（MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996)）；ならびに
（d）アミノ酸残基46～56（L2）、47～56（L2）、48～56（L2）、49～56（L2）、26～35（H1）、26～35b（H1）、49～65（H2）、93～102（H3）、および94～102（H3）を含む、（a）、（b）、および/または（c）の組み合わせ
を含む。
そうでないことが示されない限り、可変ドメイン内のHVR残基およびその他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書において、Kabat et al.（前記）に従ってナンバリングされる。
「ヒンジ領域」という用語は、野生型抗体重鎖においてCH1ドメインとCH2ドメインとを接合している抗体重鎖ポリペプチドの一部、例えば、カバットのEUナンバーシステムによる約216位～約230位またはカバットのEUナンバーシステムによる約226位～約230位を示す。他のIgGサブクラスのヒンジ領域は、IgG1サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基との整列化によって決定され得る。
ヒンジ領域は、通常、同一のアミノ酸配列を有する、2個のポリペプチドからなる二量体分子である。ヒンジ領域は、一般に、約25アミノ酸残基を含み、フレキシブルであるため、結合抗原領域は独立に移動することが可能である。ヒンジ領域は、3個のドメイン:上部ヒンジドメイン、中央ヒンジドメイン、および下部ヒンジドメインへ細分され得る（例えば、Roux,et al.,J.Immunol.161(1998)4083を参照すること）。
一つの態様において、ヒンジ領域は、アミノ酸配列DKTHTCPX4CP（X4はSまたはPのいずれかである）を有する。一つの態様において、ヒンジ領域は、アミノ酸配列HTCPX4CP（X4はSまたはPのいずれかである）を有する。一つの態様において、ヒンジ領域は、アミノ酸配列CPX4CP（X4はSまたはPのいずれかである）を有する。
Fc領域の「下部ヒンジ領域」という用語は、ヒンジ領域のすぐC末端側のアミノ酸残基のストレッチ、即ち、カバットのEUナンバリングによるFc領域の残基233～239を示す。
「個体」または「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルのような非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ある種の態様において、個体または対象は、ヒトである。
「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から分離されているものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィ（例えば、イオン交換もしくは逆相HPLC）によって決定されるような95％または99％を越える純度にまで精製される。抗体純度の査定の方法の概説については、例えば、Flatman,S.et al.,J.Chromatogr.B 848(2007)79-87を参照すること。
「単離された」核酸とは、その天然環境の成分から分離されている核酸分子をさす。単離された核酸には、その核酸分子を通常含有している細胞に含有されているが、染色体外またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子が含まれる。
「抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体の重鎖および軽鎖（またはそれらの断片）をコードする1個または複数個の核酸分子をさし、単一のベクターまたは別々のベクターの中のそのような核酸分子、および宿主細胞内の1個または複数個の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、実質的に均一な抗体の集団から入手される抗体をさす。即ち、例えば、天然に存在する変異を含有しているかまたはモノクローナル抗体調製物の作製中に発生する可能性のあるバリアント抗体を除き、集団を構成する個々の抗体が、同一でありかつ／または同一のエピトープに結合する。そのようなバリアントは、一般に、微量に存在する。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から入手されるという抗体の特徴を示すのであって、特定の方法による抗体の作製を必要とするものと解釈されてはならない。例えば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有しているトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない、多様な技術によって作成され得、モノクローナル抗体を作成するためのそのような方法およびその他の例示的な方法は、本明細書に記載される。
「ネイティブ抗体」とは、変動する構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子をさす。例えば、ネイティブIgG抗体は、ジスルフィド結合した2本の同一の軽鎖および2本の同一の重鎖から構成された約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端へ、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VH）、続いて、3個の定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）を有し、第1の定常ドメインと第2の定常ドメインとの間にはヒンジ領域が位置している。同様に、N末端からC末端へ、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（VL）、続いて、定常軽鎖（CL）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる二つの型のうちの一つに割り当てられ得る。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一率（％）」とは、最大配列同一率を達成するため、配列を整列させ、必要であれば、ギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部と見なさずに、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一率を決定するためのアライメントは、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技術の範囲内にある様々な方式で達成され得る。当業者は、比較されている配列の全長における最大のアライメントを達成するために必要とされるアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のため、アミノ酸配列同一性（％）の値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用して生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムの著者は、Genentech,Inc.であり、ソースコードは、U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559にユーザドキュメンテーションと共に提出され、U.S.Copyright Registration No.TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech,Inc.（South San Francisco,California）から公に入手可能であり、またはソースコードからコンパイルされ得る。ALIGN-2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステムにおいて使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータが、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
ALIGN-2がアミノ酸配列比較のために利用される場合、所定のアミノ酸配列Aの所定のアミノ酸配列Bに対するアミノ酸配列同一性（％）（あるいは、所定のアミノ酸配列Bに対して、あるアミノ酸配列同一性（％）を有するかまたは含む所定のアミノ酸配列Aとも表現され得る）は、以下のように計算される：
100×分数X/Y
式中、Xは、プログラムによるAおよびBのアライメントにおいて配列アライメントプログラムALIGN-2によって同一マッチとして判定されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B内のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さが、アミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAのアミノ酸配列同一性（％）は、Aに対するBのアミノ酸配列同一性（％）と等しくないことが認識されるであろう。そうでないことが特記されない限り、本明細書において使用される全てのアミノ酸配列同一性（％）の値が、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して、直前のパラグラフに記載されたようにして入手される。
「ネイティブFc領域」および「野生型Fc領域」という用語は、本明細書において使用されるように、そうでないことが示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）ならびに齧歯類（例えば、マウスおよびラット）のような哺乳動物を含む任意の脊椎動物起源に由来するネイティブまたは野生型のFc領域をさす。
「バリアント（ヒト）Fc領域」という用語は、少なくとも1個の「アミノ酸改変/変異」によって「ネイティブ」または「野生型」（ヒト）Fc領域アミノ酸配列のものと異なるアミノ酸配列を示す。一つの態様において、バリアントFc領域は、ネイティブFc領域と比較した少なくとも1個のアミノ酸変異、例えば、約1～約10個のアミノ酸変異、一つの態様において、約1～約5個のアミノ酸変異をネイティブFc領域に有する。一つの態様において、（バリアント）Fc領域は、野生型Fc領域との少なくとも約80％の相同性を有し、一つの態様において、バリアントFc領域は、少なくとも約90％の相同性を有し、一つの態様において、バリアントFc領域は、少なくとも約95％の相同性を有する。
本明細書において報告されるバリアントFc領域は、含有されているアミノ酸改変によって定義される。従って、例えば、P329Gという用語は、親（野生型）Fc領域と比べて、プロリンからグリシンへの変異をアミノ酸329位に有するバリアントFc領域を示す。野生型アミノ酸の同一性は特定されていない場合もあり、そのケースにおいては、前記のバリアントは329Gと呼ばれる。改変は、付加、欠失、または変異であり得る。「変異」という用語は、天然に存在するアミノ酸への変化を示し、天然に存在しないアミノ酸への変化も示す（例えば、US 6,586,207、WO 98/48032、WO 03/073238、US 2004/0214988、WO 2005/35727、WO 2005/74524、Chin,J.W.,et al.,J.Am.Chem.Soc.124(2002)9026-9027；Chin,J.W.and Schultz,P.G.,ChemBioChem 11(2002)1135-1137；Chin,J.W.,et al.,PICAS United States of America 99(2002)11020-11024；Wang,L.and Schultz,P.G.,Chem.(2002)1-10を参照すること）。
「野生型Fc領域」という用語は、自然界に見出されるFc領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を示す。野生型ヒトFc領域には、ネイティブヒトIgG1 Fc領域（非AアロタイプおよびAアロタイプ）、ネイティブヒトIgG2 Fc領域、ネイティブヒトIgG3 Fc領域、ならびにネイティブヒトIgG4 Fc領域が含まれ、天然に存在するそれらのバリアントも含まれる。
「治療用抗体」という用語は、ヒトにおける使用を目的とした抗体調製物に関する。好ましくは、そのような治療用抗体は、モノクローナル抗体であろう。さらに好ましいそのようなモノクローナル抗体は、類人猿から入手されるかまたはヒトモノクローナル抗体であろう。好ましくは、それはヒトモノクローナル抗体であろう。ヒト化モノクローナル抗体も、好ましいそのような治療用モノクローナル抗体であろう。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原との結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインをさす。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、VHおよびVL）は、一般に、類似した構造を有しており、各ドメインが、4個の保存されたフレームワーク領域（FR）および3個の超可変領域（HVR）を含む（例えば、Kindt,T.J.et al.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),page 91を参照すること）。単一のVHドメインまたはVLドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分である場合もある。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングするため、抗原に結合する抗体に由来するVHドメインまたはVLドメインをそれぞれ使用して単離され得る（例えば、Portolano,S.et al.,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.et al.,Nature 352(1991)624-628を参照すること）。
「ベクター」という用語は、本明細書において使用されるように、連結されているもう一つの核酸を繁殖させることができる核酸分子をさす。その用語には、自己複製性の核酸構造としてのベクターも含まれるし、導入された宿主細胞のゲノムへ組み込まれたベクターも含まれる。ある種のベクターは、機能的に連結されている核酸の発現を指図することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
II.組成物および方法
一つの局面において、本発明は、対応する野生型（ヒト）Fc領域に実質的に結合しない、バリアント（ヒト）Fc領域に特異的に結合する抗体を提供することができるという所見に一部分基づく。ある種の態様において、変異P329GまたはL234A、L235A、P329GまたはI253A、H310A、H435A（カバットのEUインデックスによるナンバリング）を有するヒトFc領域に特異的に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、試料中のそれぞれの治療用抗体の決定のため、または治療用抗体に対する抗薬物抗体（ADA）の決定のため、有用である。
A.例示的な抗Fc領域抗体
カニクイザルまたはマウスにおける前臨床研究について以前に記載されたように（Stubenrauch,K.,et al.,J.Pharm.Biomed.Anal.52(2010)249-254；Moore,G.L.,et al.,MAbs 2(2010)181-189；Stubenrauch,K.,et al.,Anal.Biochem.430(2012)193-199；Carrasco-Triguero,M .,et al.,J.Immunol.Res.2016 2618575(2016)）、薬物耐性は、薬物とADA（抗薬物抗体）との複合体を検出するジェネリックまたはユニバーサルなアッセイフォーマットによって改善され得る。同様に、本明細書において報告されるアッセイ、例えば、hsFcγRI-PGアッセイによる薬物-ADA複合体（薬物＝予め投与された治療用抗体）の検出は、捕捉試薬または検出試薬として、標識された薬物抗体を必要としない。このアッセイセットアップは、改善された薬物耐性をもたらすことが見出された。これは添加（spiking）実験において確認された。
薬物耐性係数は、陽性に検出可能な陽性対照の量と、試料中に存在する薬物の量との間の比である。ブリッジングアッセイについては、6という薬物耐性係数（3μg/mLまでの薬物の存在下で500ng/mLの陽性対照を検出することができた）、hsFcγRI-PGアッセイについては、833という薬物耐性係数（25μg/mlまでの薬物の存在下で30ng/mlの対照ADAが陽性と見出された）が決定された。
本明細書において報告されるアッセイおよび標準的なブリッジングアッセイによって、4人の患者に由来する臨床試料において、ADA発生の時間的経過を決定した（図7）。これらのデータセットは、薬物耐性、感度、およびIgアイソタイプ特異性に関する両アッセイの違いを例示的に示す。
患者A（下記表；図7A）において、両アッセイは、ブリッジングアッセイについては120h、hsFcγRI-PGアッセイについては168hにおいて、初期ADA陽性を示す。両アッセイについての168hのADAシグナルは、比較可能であり、有意であり、およそ0.5のODを有する。試料中の対応する薬物レベルは極めて低い（約2ng/ml）。次の測定時点、2回目の投薬の24h後（C2 24h）の薬物レベルは、はるかに高い（約2430ng/mL）。これは、ブリッジングアッセイに影響を及ぼし、主要シグナルが、対応するカット点を下回った。hsFcγRI-PGアッセイは、対照的に、薬物によって影響を受けず、ADAシグナルが、168hからC2 24hまで、さらに上昇する。
ブリッジングアッセイについての薬物レベルの上昇による類似のシグナル低下は、他の患者試料においても観察された（下記表を参照すること）。hsFcγRI-PGアッセイのシグナルは、いずれの患者においても影響を受けず、このアッセイの改善された薬物耐性が確認された。
（表）従来のブリッジングアッセイおよび本明細書において報告されるhsFcγRI-PGアッセイによる8人の患者におけるADA形成の査定
Figure 2022025063000002
Figure 2022025063000003
図7Bは、患者Bの時間的経過を示す（前記表）。96hの初期陽性の後、ブリッジングアッセイは、次の6回の時点で極めて低いシグナルを示し、4回のシグナルは、カット点すら下回っており、これらの試料は陰性と分類された。これは、時点C2 24hおよびC3 24hについては薬物レベルの上昇による可能性があるが、定量化限界より低い薬物レベルですら（C3前）、試料は、ブリッジングアッセイにおけるカット点より低いADAシグナルを示す。
hsFcγRI-PGアッセイも、C2 24hに初期陽性を示す。しかし、この患者は、時間的経過の全体を通して有意なシグナルを有し陽性であり続ける。これは、ブリッジングアッセイと比較して優れているhsFcγRI-PGアッセイの感度を示す。患者A（前記表；図7A）も、極めて遅い時点で、ブリッジングアッセイと比較してはるかに高いシグナルを、hsFcγRI-PGアッセイにおいて示す。1人の患者は、ブリッジングアッセイにおいては、時間的経過の全体を通して陰性であり、hsFcγRI-PGアッセイにおいては、最後の2回の時点で陽性と検出された。
両アッセイについての希釈率が異なり、hsFcγRI-PGアッセイにおいては試料が50倍希釈され、ブリッジングアッセイにおいては試料が10倍希釈されたことを考慮しても、hsFcγRI-PGアッセイは、特に、後期ADA応答について、より高感度であり、いくつかの研究試料においては、ADA陽性の定性的な違いすらもたらす。
対照的に、ブリッジングアッセイは、hsFcγRI-PGアッセイよりはるかに低いカット点を有し、初期ADA応答については、ブリッジングアッセイが、hsFcγRI-PGアッセイより高いシグナルを示す。何人かの患者について、標準的なブリッジングアッセイは、hsFcγRI-PGアッセイより早期のADA陽性および/または初期ADA応答についての高いシグナル強度を示した。これは、例えば、患者Cについて観察され得る（前記表；図7C）。ブリッジングアッセイは、96h以降の全ての試料について陽性を示すが、hsFcγRI-PGアッセイは、最後の2回の時点についてのみ陽性ADA陽性を示す。hsFcγRI-PGアッセイは、IgGを排他的に検出し、IgMを検出しないため（Fridman,W.H.,FASEB J.5(1991)2684-2690）、IgMが、一般的に、初回抗原曝露に応答して出現する最初の抗体クラスであることから（Stewart,J.J.,et al.,Autoimmunity 44(2011)294-303）、ブリッジングアッセイによって観察されたADA陽性の最初のピークは、IgM応答を反映している可能性が極めて高い。IgM応答を示す、初期試料におけるブリッジングアッセイにおけるより高いADA応答のこのパターンは、3/8人の患者において観察され得た。患者D（前記表）は、一過性の進行と共に、ブリッジングアッセイについて初期ADA応答を示したため、特に、重要であった。hsFcγRI-PGアッセイは、類似した一過性の進行と共に、弱いADA陽性のみを示し、それは、IgMの割合が優勢の混合IgM、IgG応答を示す。特に、高レベルのリウマチ因子を有する患者について、IgMは、偽陽性結果をもたらすブリッジングADAアッセイの問題であり得る（Stubenrauch,K.,et al.,Clin.Ther.32(2010)1597-1609）。
両アッセイフォーマットの組み合わせは、一方のアッセイのみでは可能でないであろうADA応答に関する解釈を可能にする。
本明細書において報告されるアッセイおよび標準的なブリッジングアッセイは、ADAの捕捉および検出の原理に関して異なる。ブリッジングアッセイにおいて、ADAの捕捉および検出は、いずれも、ディファレンシャルに標識された薬物分子によってなされる。その結果として、オリゴマー標的が偽陽性結果を生成する場合があり、薬物耐性が一般的に低い（Bautista,A.C.,et al.,Bioanal.2(2010)721-731；Mire-Sluis,A.R.,et al.,J.Immunol.Meth.289(2004)1-16(2004)；Weeraratne,D.K.,et al.,J.Immunol.Meth.396(2013)44-55；Zhong,Z.D.,et al.,J.Immunol.Meth.355(2010)21-28）。しかしながら、ブリッジングアッセイは、IgMを含む様々なIgサブタイプのADAを検出することができ、あらゆる種類の治療用抗体に適用可能である（Mire-Sluis,A.R.,et al.,J.Immunol.Meth.289(2004)1-16(2004)；Geng,D.,et al.,J.Pharm.Biomed.Anal.39(2005)364-375）。hsFcγRI-PGアッセイにおいて、ADAと治療用mAbとの複合体は、治療用抗体の結合領域と無関係に検出される。このアッセイは、オリゴマー標的によって影響を受けず、薬物耐性は、標準的なブリッジングフォーマットの場合よりはるかに優れている。このアッセイは、FcyRIベースの抗体検出のため、IgG以外のIgサブタイプを認識しない。また、FcyRIベースのアッセイは、Fc領域にPG修飾を保持する治療用抗体に特に適している。治療用抗体のこの群について、hsFcγRI-PGアッセイは、ジェネリックなアプローチを表し、容易に適用され得る。
また、hsFcγRI-PGアッセイについては、標識された形態で治療用抗体（薬物）を使用する必要がない。特に、治療用抗体の上昇している複雑性（例えば、多価抗体または抗体医薬コンジュゲート）に関して、標識は困難であり得る。
要約すると、本明細書において報告されるアッセイは、Fc領域修飾型治療用抗体に対するADAの頑強で高感度の検出の可能性を提示する。標準的なブリッジングアッセイとの組み合わせで、それは、例えば、アッセイシグナルをIgGベースとして分類することによって、より詳細に免疫応答を特徴決定するために使用され得る。
本明細書において報告されるアッセイは、ジェネリックなアプローチであり、FcγR結合が防止された全ての治療用抗体、例えば、Pro329Gly置換を有するものに適用可能である。hsFcγRI-PGアッセイは、薬物-ADA複合体を検出し、2種の特異的なアッセイ試薬（i）Fc領域修飾（例えば、P329G修飾型治療用抗体）に対するbi標識抗体、および（ii）ヒトIgG1を特異的に検出し、Fc領域修飾型Igは検出しないdig標識hsFcγRIに基づく。hsFcγRI-PGアッセイにおいては、薬物耐性および後期免疫応答に対する感度が、従来のブリッジングアッセイと比較して著しく改善されている。非IgG関連シグナルは、hsFcγRIベースのアッセイによって検出されず、従来のブリッジングアッセイによって検出されるため、両アッセイの組み合わせは、IgG応答とIgM応答との初期の区別を含む、より詳細で頑強な免疫原性査定を可能にする。
本明細書において報告されるアッセイは、臨床試験および前臨床試験の両方に適用可能である。ヒトIgGおよびカニクイザルIgGの両方のFc領域は、高い配列相同性を有し（Jacobsen,F.W.,et al.,J.Immunol.186(2011)341-349）、hsFcγRIベースの検出試薬は、カニクイザルにおいて治療用mAbに対するADAを認識することが証明された（Wessels,U.,et al.,Bioanalysis 8(2016)2135-2145）。この事実は、動物およびヒトの試料の分析における異なるアッセイの必要性を排除する。さらに、Fc受容体および補体の両方に対する治療用抗体の親和性に影響を与え、結果として、機能的プロファイルを改変する、PG置換以外のいくつかのFc修飾が同定されている（Moore,G.L.,et al.,MAbs 2(2010)181-189；Richards,J.O.,et al.,Mol.Cancer.Ther.7(2008)2517-2527；Lazar,G.A.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2010)4005-4010；Schlothauer,T.,et al.,Prot.Eng.Des.Sel.29(2016)457-466）。
本明細書において報告されるアッセイの原理を、特異的抗体の生成を可能にするより広範囲のFc領域変異に移転することができる。
本明細書に提示された例においては、治療用抗体を含有しているアッセイ緩衝液において、試料をプレインキュベートしたが、薬物を事前に添加することなく、同一のプロトコルによって、既存の薬物-ADA複合体を等しく検出することができる。ADA形成に関連した多くの有害効果が、ADA免疫複合体の形成に起因するため、薬物免疫複合体内に結合したADAの検出は、特に重要であると考えられる（Krishna,M.and Nadler,S.G.,Front.Immunol.7(2016)21）。
要約すると、従来のブリッジングアッセイと本明細書において報告される方法との組み合わせは、Fcエフェクター機能が抑制または改変された治療用mAbの免疫原性プロファイルの特徴決定を助ける。高レベルの可溶性オリゴマー標的が存在する場合、ならびに高い薬物濃度が前臨床試料および臨床試料の中に存在する場合、このアプローチは、最も重要であり得る。
従って、本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、（薬物抗体を投与された患者の）試料中の抗薬物抗体の存在および/または量の決定の方法である：
－（遊離抗体およびADA複合体化抗体を含む）試料からFcエフェクター機能を欠く抗体を捕捉するため、（Fc領域への1個または複数個の置換の導入によって）Fcエフェクター機能を欠く抗体に特異的に結合する抗体と共に、試料をインキュベートする工程、
－捕捉された抗体をヒト可溶性FcγRIと共にインキュベートすることによって、捕捉された抗体を検出し、試料中の抗薬物抗体の存在および/または量を決定する工程。
一つの態様において、方法は、以下の工程を含む：
－（遊離抗体およびADA複合体化抗体を含む）試料から薬物抗体を捕捉するため、（Fc領域にP329G置換を有し、ヒトIgG1クラスのものである薬物抗体に特異的に結合する）本明細書において報告される抗PG抗体と共に、試料をインキュベートする工程、
－捕捉された薬物抗体をヒト可溶性FcγRIと共にインキュベートすることによって、捕捉された薬物抗体を検出し、結合したヒト可溶性FcγRIの存在および/または量を決定することによって、試料中の抗薬物抗体の存在および/または量を決定する工程。
一つの態様において、抗PG抗体は、固相に固定化される。
一つの態様において、抗PG抗体は、（a）SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。
本明細書において報告される抗体は、以下の配列を有する。
Figure 2022025063000004
一つの局面において、本発明は、バリアント（ヒト）Fc領域に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
ある種の態様において、本明細書において報告される抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体（抗AAA抗体）は、
・アミノ酸残基（A）253、（A）310、および（A）435（カバットEUインデックスによるナンバリング）を含むバリアント（ヒト）Fc領域上のエピトープに特異的に結合し、
・253位、310位、および435位（カバットEUインデックスによるナンバリング）にアラニンアミノ酸残基を有するバリアント（ヒト）Fc領域に特異的に結合し、
・253位にイソロイシンアミノ酸残基、310位にヒスチジンアミノ酸残基、435位にヒスチジンアミノ酸残基（カバットEUインデックスによるナンバリング）を有する野生型（ヒト）Fc領域に（特異的に）結合せず、
・253位にイソロイシンアミノ酸残基、310位にヒスチジンアミノ酸残基、435位にヒスチジンアミノ酸残基、329位にグリシンアミノ酸残基、234位にアラニンアミノ酸残基、235位にアラニンアミノ酸残基（カバットによるナンバリング）を有する（ヒト）Fc領域に（特異的に）結合せず、かつ
・253位にイソロイシンアミノ酸残基、310位にヒスチジンアミノ酸残基、435位にヒスチジンアミノ酸残基、329位にプロリンアミノ酸残基、234位にロイシンアミノ酸残基、235位にロイシンアミノ酸残基（カバットによるナンバリング）を有するバリアント（ヒト）Fc領域に（特異的に）結合しない。
「（特異的に）結合しない」という用語は、結合が決定されるアッセイにおいて、入手された結果が、当該抗体を含まない試料、即ち、ブランク試料または緩衝液試料によって入手された結果と有意に異ならないことを示す。
一つの具体的な態様において、バリアント（ヒト）Fc領域は、変異I253A、H310A、およびH435A（カバットEUインデックスによるナンバリング）を有するヒトIgG1サブクラスまたはヒトIgG4サブクラスのFc領域である。
一つの局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:09または10のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:12、13、または14のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:16、17、または18のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:23または24のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:28、29、または30のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、または6個のHVRを含む、253位、310位、および435位（カバットEUインデックスによるナンバリング）にアミノ酸残基アラニンを各々含むFc領域に特異的に結合する抗Fc領域抗体を提供する。
もう一つの局面において、本発明の抗体は、（a）（i）SEQ ID NO:09または10のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（ii）SEQ ID NO:12または13または14のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および（iii）SEQ ID NO:16、17、または18より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-H3を含むVHドメイン；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:23または24のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（ii）SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（c）SEQ ID NO:28、29、または30のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含むVLドメインを含む。
もう一つの局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:09のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:28より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体を提供する。
もう一つの局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:24のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:29より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体を提供する。
もう一つの局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:24のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:30より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体を提供する。
ある種の態様において、前記に提供される抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体の1個または複数個のアミノ酸は、以下のHVR位置において置換される：
－HVR-H1（SEQ ID NO:11）：5位；
－HVR-H2（SEQ ID NO:15）：3位、7位、8位、11位、12位；
－HVR-H3（SEQ ID NO:19）：2位、10位；
－HVR-L1（SEQ ID NO:25）：3位、14位；
－HVR-L2（SEQ ID NO:27）：4位；および
－HVR-L3（SEQ ID NO:31）：1位、6位。
ある種の態様において、置換は、本明細書において提供される保存的置換である。ある種の態様において、以下のアミノ酸残基のうちの1個または複数個（相互に独立に単独または組み合わせ）が、任意の組み合わせで存在してよい：
－HVR-H1（SEQ ID NO:11）：5位に、S、T、N、およびQからなるアミノ酸残基の群より選択される中性親水性アミノ酸残基；
－HVR-H2（SEQ ID NO:15）：3位に、S、T、N、Q、D、およびEからなるアミノ酸残基の群より選択される中性親水性または酸性のアミノ酸残基、7位に、S、T、N、Q、H、K、およびRからなるアミノ酸残基の群より選択される中性親水性または塩基性のアミノ酸残基、8位に、S、T、N、Q、G、およびPからなるアミノ酸残基の群より選択される中性親水性アミノ酸残基または鎖方向に影響を与える残基、11位に、S、T、N、Q、G、P、W、Y、およびFからなるアミノ酸残基の群より選択される中性親水性もしくは芳香族のアミノ酸残基または鎖方向に影響を与える残基、12位に、S、T、N、Q、G、およびPからなるアミノ酸残基の群より選択される中性親水性アミノ酸残基または鎖方向に影響を与える残基；
－HVR-H3（SEQ ID NO:19）：2位に、M、A、V、L、I、W、Y、およびFからなるアミノ酸残基の群より選択される疎水性または芳香族のアミノ酸残基、10位に、S、T、N、Q、W、Y、およびFからなるアミノ酸残基の群より選択される中性親水性または芳香族のアミノ酸残基；
－HVR-L1（SEQ ID NO:25）：3位に、S、T、N、およびQからなるアミノ酸残基の群より選択される中性親水性アミノ酸残基、14位に、S、T、N、Q、D、およびEからなるアミノ酸残基の群より選択される中性親水性または酸性のアミノ酸残基；
－HVR-L2（SEQ ID NO:27）：4位に、E、D、H、K、およびRからなるアミノ酸残基の群より選択される酸性または塩基性のアミノ酸残基；
－HVR-L3（SEQ ID NO:31）：1位に、M、A、V、L、およびIからなるアミノ酸残基の群より選択される疎水性アミノ酸残基、6位に、S、T、N、Q、D、およびEからなるアミノ酸残基の群より選択される中性親水性または酸性のアミノ酸残基。
前記の置換の全ての可能な組み合わせが、SEQ ID NO:11、15、19、25、27、および31のコンセンサス配列に包含される。
前記の態様のいずれかにおいて、抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、ヒト化されている。一つの態様において、抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、前記の態様のいずれかのようなHVRを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
もう一つの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO:01に由来する重鎖可変ドメインアミノ酸配列およびSEQ ID NO:02に由来する軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み、ヒト化抗体は、重鎖可変ドメインとしてのSEQ ID NO:01のアミノ酸配列および軽鎖可変ドメインとしてのSEQ ID NO:02のアミノ酸配列を含有しているキメラ抗体またはマウス抗体と同一の結合特異性を有する。
もう一つの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO:03に由来する重鎖可変ドメインアミノ酸配列およびSEQ ID NO:04に由来する軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み、ヒト化抗体は、重鎖可変ドメインとしてのSEQ ID NO:03のアミノ酸配列および軽鎖可変ドメインとしてのSEQ ID NO:04のアミノ酸配列を含有しているキメラ抗体またはマウス抗体と同一の結合特異性を有する。
もう一つの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO:07に由来する重鎖可変ドメインアミノ酸配列およびSEQ ID NO:08に由来する軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み、ヒト化抗体は、重鎖可変ドメインとしてのSEQ ID NO:07のアミノ酸配列および軽鎖可変ドメインとしてのSEQ ID NO:08のアミノ酸配列を含有しているキメラ抗体またはマウス抗体と同一の結合特異性を有する。
もう一つの局面において、抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、SEQ ID NO:01、03、および07のいずれかのアミノ酸配列との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（VH）配列を含む。ある種の態様において、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVH配列は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有しているが、その配列を含む抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、バリアント（ヒト）Fc領域に結合する能力を保持している。ある種の態様において、全部で1～10個のアミノ酸が、SEQ ID NO:01、03、および07のいずれかにおいて置換され、挿入され、かつ/または欠失している。ある種の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVR外の領域（即ち、FR）に存在する。任意で、抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、SEQ ID NO:01、03、および07のいずれかのようなVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾も含む。
もう一つの局面において、SEQ ID NO:02、04、および08のいずれか一つのアミノ酸配列との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（VL）配列を含む抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体が提供される。ある種の態様において、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVL配列は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有しているが、その配列を含む抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、バリアント（ヒト）Fc領域に結合する能力を保持している。ある種の態様において、全部で1～10個のアミノ酸が、SEQ ID NO:02、04、および08において置換され、挿入され、かつ/または欠失している。ある種の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVR外の領域（即ち、FR）に存在する。任意で、抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、SEQ ID NO:02、04、および08のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾も含む。
もう一つの局面において、前記に提供された態様のいずれかのようなVHと、前記に提供された態様のいずれかのようなVLとを含む抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体が、提供される。一つの態様において、抗体は、（i）SEQ ID NO:01およびSEQ ID NO:02のVH配列およびVL配列、または（ii）それぞれSEQ ID NO:03およびSEQ ID NO:04のVH配列およびVL配列、または（iii）SEQ ID NO:07およびSEQ ID NO:08のVH配列およびVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾も含む。
ある種の態様において、本明細書において報告される抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体（抗PG抗体）は、
・アミノ酸残基（（A）234、（A）235、および）（G）329（カバットEUインデックスによるナンバリング）を含むバリアント（ヒト）Fc領域上のエピトープに特異的に結合し、
・（234位および235位にアラニンアミノ酸残基、ならびに）329位にグリシンアミノ酸残基（カバットEUインデックスによるナンバリング）を有するバリアント（ヒト）Fc領域に特異的に結合し、
・234位および235位にアラニンアミノ酸残基、329位にグリシンアミノ酸残基、253位にイソロイシンアミノ酸残基、310位にヒスチジンアミノ酸残基、435位にヒスチジンアミノ酸残基（カバットによるナンバリング）を有するバリアント（ヒト）Fc領域に特異的に結合し、
・234位、235位、253位、310位、および435位にアラニンアミノ酸残基、329位にグリシンアミノ酸残基（カバットによるナンバリング）を有するバリアント（ヒト）Fc領域に特異的に結合し、
・（234位および235位にロイシンアミノ酸残基、ならびに）329位にプロリンアミノ酸残基（カバットによるナンバリング）を有する野生型（ヒト）Fc領域に（特異的に）結合せず、
・234位および235位にロイシンアミノ酸残基、329位にプロリンアミノ酸残基、253位にイソロイシンアミノ酸残基、310位にヒスチジンアミノ酸残基、435位にヒスチジンアミノ酸残基（カバットによるナンバリング）を有する野生型（ヒト）Fc領域に（特異的に）結合せず、かつ
・234位および235位にロイシンアミノ酸残基、329位にプロリンアミノ酸残基、253位にアラニンアミノ酸残基、310位にアラニンアミノ酸残基、435位にアラニンアミノ酸残基（カバットによるナンバリング）を有するバリアント（ヒト）Fc領域に（特異的に）結合しない。
抗PG抗体の生成のために実施される免疫は、P329G、L234A、およびL235A Fc領域置換を保持するヒトIgG1によって実施されたため、これらのアミノ酸残基に特異的に結合する抗体が入手されることが予想された。驚いたことに、入手された抗体は、L234A変異およびL235A変異の有無と無関係に、P239G変異を有するヒトIgG1およびFc領域断片にのみ特異的に結合し、ヒトwt-IgG1ならびに変異L234AおよびL235Aを有するヒトIgG1には結合しなかった。従って、本明細書において報告される抗PG抗体は、ヒトIgG1のFc領域内の単一のP329G置換に特異的である。
一つの具体的な態様において、バリアント（ヒト）Fc領域は、変異P329G（カバットEUインデックスによるナンバリング）を有するヒトIgG1サブクラスまたはヒトIgG4サブクラスのFc領域である。
一つの局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含むHVR-L3より選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、または6個のHVRを含む、329位にアミノ酸残基グリシンを含む（任意で、234位および235位にアミノ酸残基アラニンを含む）（カバットEUインデックスによるナンバリング）Fc領域に特異的に結合する抗Fc領域抗体を提供する。
もう一つの局面において、本発明の抗体は、（a）（i）SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（ii）SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および（iii）SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含むVHドメイン；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（ii）SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（c）SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含むVLドメインを含む。
もう一つの局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:35より選択されるアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体を提供する。
ある種の態様において、前記に提供される抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体の1個または複数個のアミノ酸は、以下のHVR位置において置換される:
- HVR-L1（SEQ ID NO:33）内：9位。
ある種の態様において、置換は、本明細書において提供される保存的置換である。ある種の態様において、以下のアミノ酸残基の1個または複数個（単独または相互に独立した組み合わせのいずれか）が、任意の組み合わせで存在してもよい：
- HVR-L1（SEQ ID NO:33）内：9位に、S、T、N、Q、G、およびPからなるアミノ酸残基の群より選択される中性親水性アミノ酸残基または鎖方向に影響を与える残基。
前記の置換の全ての可能な組み合わせが、SEQ ID NO:33のコンセンサス配列に包含される。
前記の態様のいずれかにおいて、抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、ヒト化されている。一つの態様において、抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、前記の態様のいずれかのHVRを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。
もう一つの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO:05に由来する重鎖可変ドメインアミノ酸配列およびSEQ ID NO:06に由来する軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み、ヒト化抗体は、重鎖可変ドメインとしてのSEQ ID NO:05のアミノ酸配列および軽鎖可変ドメインとしてのSEQ ID NO:06のアミノ酸配列を含有しているキメラ抗体またはマウス抗体と同一の結合特異性を有する。
もう一つの局面において、抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、SEQ ID NO:05のアミノ酸配列との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（VH）配列を含む。ある種の態様において、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVH配列は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有しているが、その配列を含む抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、バリアント（ヒト）Fc領域に結合する能力を保持している。ある種の態様において、全部で1～10個のアミノ酸が、SEQ ID NO:05において置換され、挿入され、かつ/または欠失している。ある種の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVR外の領域（即ち、FR）に存在する。任意で、抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、SEQ ID NO:05のようなVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾も含む。
もう一つの局面において、SEQ ID NO:06のアミノ酸配列との少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（VL）を含む抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体が、提供される。ある種の態様において、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVL配列は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有しているが、その配列を含む抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、バリアント（ヒト）Fc領域に結合する能力を保持している。ある種の態様において、全部で1～10個のアミノ酸が、SEQ ID NO:06において置換され、挿入され、かつ/または欠失している。ある種の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVR外の領域（即ち、FR）に存在する。任意で、抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、SEQ ID NO:06のようなVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾も含む。
もう一つの局面において、前記に提供された態様のいずれかのようなVHと、前記に提供された態様のいずれかのようなVLとを含む抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体が、提供される。一つの態様において、抗体は、SEQ ID NO:05およびSEQ ID NO:06のVH配列およびVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾も含む。
本発明のさらなる局面において、前記の態様のいずれかによる抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一つの態様において、抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、抗体断片、例えば、Fv、Fab、Fab'、scFv、ダイアボディ、またはF(ab')2断片である。もう一つの態様において、抗体は、本明細書において定義されるヒトIgG1サブクラスまたはその他の抗体クラスもしくはアイソタイプの全長抗体、例えば、インタクト抗体である。
さらなる局面において、前記の態様のいずれかによる抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体には、以下のセクション1～4に記載される特色のいずれかが、単独でまたは組み合わせで、組み入れられていてよい。
1.抗体断片
ある種の態様において、本明細書において提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Fab断片、Fab'断片、Fab'-SH断片、F(ab')2断片、Fv断片、およびscFv断片、ならびに下記のその他の断片が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ある種の抗体断片の概説については、Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9(2003)129-134を参照すること。scFv断片の概説については、例えば、Plueckthun,A.,In；The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore(eds.),Springer-Verlag,New York(1994),pp.269-315を参照し；WO 93/16185；US 5,571,894、およびUS 5,587,458も参照すること。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するFab断片およびF(ab')2断片の考察については、US 5,869,046を参照すること。
ダイアボディとは、二価または二重特異性であり得る、2個の抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9(2003)129-134；およびHolliger,P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448を参照すること。トリアボディ（triabody）およびテトラボディ（tetrabody）も、Hudson,P.J.,et al.,Nat.Med.9(20039 129-134) に記載されている。
シングルドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部分を含む抗体断片である。ある種の態様において、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Domantis,Inc.,Waltham,MA；例えば、US 6,248,516を参照すること）。
抗体断片は、インタクト抗体のタンパク質分解、および本明細書に記載される組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（E.coli）またはファージ）による産生を含むが、これらに限定されるわけではない、様々な技術によって作成され得る。
2.キメラ抗体およびヒト化抗体
ある種の態様において、本明細書において提供される抗体は、キメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば、US 4,816,567；およびMorrison,S.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルのような非ヒト霊長類に由来する可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、それらの抗原結合断片が含まれる。
ある種の態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、HVR、例えば、CDR（またはそれらの一部分）が非ヒト抗体に由来し、FR（またはそれらの一部分）がヒト抗体配列に由来する1個または複数個の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含むであろう。いくつかの態様において、ヒト化抗体におけるいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復するかまたは改善するため、非ヒト抗体（例えば、HVR残基が由来する抗体）に由来する対応する残基に置換される。
ヒト化抗体およびそれらを作成する方法は、例えば、Almagro,J.C.and Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633に概説されており、例えば、Riechmann,I.et al.,Nature 332(1988)323-329；Queen,C.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321、およびUS 7,087,409；（特異性決定領域（SDR）グラフティングを記載している）Kashmiri,S.V.et al.,Methods 36(2005)25-34；（「リサーフェイシング（resurfacing）」を記載している）Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498；（「FRシャフリング（shuffling）」を記載している）Dall'Acqua,W.F.et al.,Methods 36(2005)43-60；ならびに（FRシャフリングのための「ガイデッドセレクション（guided selection）アプローチ」を記載している）Osbourn,J.et al.,Methods 36(2005)61-68およびKlimka,A.et al.,Br.J.Cancer 83(2000)252-260にさらに記載されている。
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、以下のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない：「ベストフィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Sims,M.J.et al.,J.Immunol.151(1993)2296-2308を参照すること）；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter,P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；およびPresta,L.G.et al.,J.Immunol.151(1993)2623-2632を参照すること）；ヒト成熟（体細胞変異型）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域（例えば、Almagro,J.C.and Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633を参照すること）；ならびにFRライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Baca,M.et al.,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684およびRosok,M.J.et al.,J.Biol.Chem.271（19969 22611-22618を参照すること）。
3.多重特異性抗体
ある種の態様において、本明細書において提供される抗体は、多重特異性抗体,例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2種の異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある種の態様において、結合特異性のうちの一方は、バリアント（ヒト）Fc領域に対するものであり、他方は、他の抗原に対するものである。ある種の態様において、二重特異性抗体は、バリアント（ヒト）Fc領域の2種の異なるエピトープに結合してもよい。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。
多重特異性抗体を作成するための技術には、異なる特異性を有する2種の免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現（Milstein,C.and Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540、WO 93/08829、およびTraunecker,A.et al.,EMBO J.10(1991)3655-3659を参照すること）ならびに「ノブインホール」エンジニアリング（例えば、US 5,731,168を参照すること）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。多重特異性抗体は、抗体Fcヘテロ二量体分子を作成するための静電的ステアリング効果の改変（WO 2009/089004）；2種以上の抗体または断片の架橋（例えば、US 4,676,980およびBrennan,M.et al.,Science 229(1985)81-83を参照すること）；二重特異性抗体を作製するためのロイシンジッパーの使用（例えば、Kostelny,S.A.et al.,J.Immunol.148(1992)1547-1553を参照すること）；二重特異性抗体断片を作成するための「ダイアボディ」テクノロジーの使用（例えば、Holliger,P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448を参照すること）；ならびに単鎖Fv（sFv）二量体の使用（例えば、Gruber,M et al.,J.Immunol.152(1994)5368-5374を参照すること）；ならびに、例えば、Tutt,A.et al.,J.Immunol.147(1991)60-69に記載されたような三重特異性抗体の調製によっても作成され得る。
「オクトパス抗体」を含む、3個以上の機能性抗原結合部位を有する改変された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、US 2006/0025576を参照すること）。
本明細書における抗体または断片には、バリアントFc領域に結合し、もう一つの異なる抗原にも結合する抗原結合部位を含む「二重作用性Fab」または「DAF」も含まれる（例えば、US 2008/0069820を参照すること）。
本明細書における抗体または断片には、WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792、およびWO 2010/145793に記載された多重特異性抗体も含まれる。
ヘテロ二量体化を支持するためのCH3修飾のための数種のアプローチが、例えば、参照によって本明細書に含まれる、WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291に記載されている。典型的には、当技術分野において公知のアプローチにおいて、1個の改変されたCH3ドメインを含む重鎖が、同一の構造のもう1本の重鎖とホモ二量体化し得なくなるよう（例えば、CH3が改変された第1の重鎖が、もう1本のCH3が改変された第1の重鎖とホモ二量体化し得なくなり、CH3が改変された第2の重鎖が、もう1本のCH3が改変された第2の重鎖とホモ二量体化し得なくなるよう）相補的に、第1の重鎖のCH3ドメインおよび第2の重鎖のCH3ドメインの両方が改変される。それによって、1個の改変されたCH3ドメインを含む重鎖は、相補的に改変されたCH3ドメインを含むもう1本の重鎖とヘテロ二量体化することを強いられる。この態様について、第1の重鎖のCH3ドメインおよび第2の重鎖のCH3ドメインは、（例えば、立体位置的な理由のために）第1の重鎖と第2の重鎖とがヘテロ二量体化することを強いられ、第1の重鎖および第2の重鎖がホモ二量体化し得なくなるようなアミノ酸置換によって相補的に改変される。
前記に引用され含まれた、当技術分野において公知の重鎖ヘテロ二量体化を支持するための異なるアプローチは、前記の特定のアミノ酸置換と組み合わせて、第1の抗原に特異的に結合する第1の抗体に由来する「非交差性Fab領域」および第2の抗原に特異的に結合する第2の抗体に由来する「交差性Fab領域」を含む、本明細書において報告される多重特異性抗体の提供において使用される異なる別法として企図される。
本明細書において報告される多重特異性抗体のCH3ドメインは、例えば、WO 96/027011,Ridgway,J.B.,et al.,Protein Eng.9(1996)617-621；およびMerchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681に、いくつかの例と共に詳細に記載されている「ホールイントゥノブ」テクノロジーによって改変され得る。この方法においては、2個のCH3ドメインの相互作用表面が、これらの2個のCH3ドメインを含有している両重鎖のヘテロ二量体化を増加させるために改変される。（2本の重鎖の）2個のCH3ドメインの各々が、「ノブ」であってよく、他方が「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化し（Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.,et al.,J.Mol.Biol.270(1997)26-35）、収率を増加させる。
一つの好ましい態様において、本明細書において報告される多重特異性抗体は、「ノブ鎖」のCH3ドメインにT366W変異を含み、「ホール鎖」のCH3ドメインにT366S変異、L368A変異、Y407V変異（カバットEUインデックスによるナンバリング）を含む。例えば、「ノブ鎖」のCH3ドメインへY349C変異を導入し、「ホール鎖」のCH3ドメインへE356C変異もしくはS354C変異を導入することによる、CH3ドメインの間の付加的な鎖間ジスルフィド架橋も使用され得る（Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16(1998)677-681）。従って、もう一つの好ましい態様において、本明細書において報告される多重特異性抗体は、2個のCH3ドメインのうちの一方にY349C変異およびT366W変異を含み、2個のCH3ドメインのうちの他方にE356C変異、T366S変異、L368A変異、およびY407V変異を含むか、または本明細書において報告される多重特異性抗体は、2個のCH3ドメインのうちの一方にY349C変異およびT366W変異を含み、2個のCH3ドメインのうちの他方にS354C変異、T366S変異、L368A変異、およびY407V変異を含む（一方のCH3ドメインにおける付加的なY349C変異、および他方のCH3ドメインにおける付加的なE356C変異またはS354C変異は、鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（カバットEUインデックスによるナンバリング）。
本明細書において報告される全ての局面および態様の一つの態様において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体または三重特異性抗体である。一つの好ましい態様において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、抗体は、二価または三価の抗体である。一つの態様において、抗体は、二価抗体である。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、多重特異性抗体は、IgG型抗体の定常ドメイン構造を有する。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG1のもの、または変異L234AおよびL235Aを有するヒトサブクラスIgG1のものであることを特徴とする。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG2のものであることを特徴とする。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG3のものであることを特徴とする。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG4のものまたは付加的な変異S228Pを有するヒトサブクラスIgG4のものであることを特徴とする。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、ヒトサブクラスIgG1またはヒトサブクラスIgG4のものであることを特徴とする。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、変異L234AおよびL235A（カバットEUインデックスによるナンバリング）を有するヒトサブクラスIgG1のものであることを特徴とする。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、変異L234A、L235A、およびP329G（カバットEUインデックスによるナンバリング）を有するヒトサブクラスIgG1のものであることを特徴とする。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、変異S228PおよびL235E（カバットEUインデックスによるナンバリング）を有するヒトサブクラスIgG4のものであることを特徴とする。本明細書において報告される全ての局面の一つのさらなる態様において、多重特異性抗体は、変異S228P、L235E、およびP329G（カバットEUインデックスによるナンバリング）を有するヒトサブクラスIgG4のものであることを特徴とする。
4.抗体バリアント
ある種の態様において、本明細書において提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性および/またはその他の生物学的特性を改善することが、望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列へ適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および/または挿入および/または置換が含まれる。最終構築物が、所望の特徴、例えば、抗原結合を保有する限り、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達するためになされ得る
（a）置換バリアント、挿入バリアント、および欠失バリアント
ある種の態様において、1個または複数個のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換変異誘発のための関心対象の部位には、HVRおよびFRが含まれる。保存的置換は、「好ましい置換」の標題で表1中に示される。より実質的な変化は、「例示的な置換」の標題で表1中に提供され、アミノ酸側鎖クラスに関してさらに後述される。アミノ酸置換を、関心対象の抗体へ導入し、所望の活性、例えば、抗原結合の保持もしくは改善、免疫原性の減少、またはADCCもしくはCDCの改善について、生成物をスクリーニングすることができる。
（表１）
Figure 2022025063000005
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従ってグループ化され得る：
（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
（3）酸性：Asp、Glu；
（4）塩基性：His、Lys、Arg；
（5）鎖方向に影響を与える残基：Gly、Pro；
（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保存的置換とは、これらのクラスのうちの一つのメンバーの、もう一つのクラスとの交換を意味するであろう。
置換バリアントの一つの型は、親抗体の1個または複数個の超可変領域残基の置換を含む（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）。一般に、さらなる研究のために選択された得られたバリアントは、親抗体と比べて、ある種の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、かつ/または親抗体の実質的に保持されたある種の生物学的特性を有するであろう。例示的な置換バリアントは、例えば、本明細書に記載されたもののようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して便利に生成され得る親和性成熟抗体である。簡単に説明すると、1個または複数個のHVR残基を変異させ、バリアント抗体をファージ上にディスプレイし、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
改変（例えば、置換）は、例えば、抗体の親和性を改善するため、HVRにおいてなされ得る。そのような改変は、HVR「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟過程中に高頻度に変異を受けるコドンによってコードされた残基（例えば、Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196を参照すること）、および/または抗原と接触する残基においてなされ得、得られたバリアントVHまたはバリアントVLが、結合親和性について試験される。二次ライブラリーの構築およびそれからの再選択による親和性成熟は、例えば、Hoogenboom,H.R.et al.in Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37に記載されている。親和性成熟のいくつかの態様において、多様な方法のいずれか（例えば、エラープローンPCR、チェーンシャフリング、またはオリゴヌクレオチド指定変異誘発）によって、成熟のため選択された可変遺伝子へ多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーを作出する。次いで、ライブラリーを、所望の親和性を有する抗体バリアントを同定するためにスクリーニングする。多様性を導入するもう一つの方法には、いくつかのHVR残基（例えば、一度に4～6残基）をランダム化する、HVR指定アプローチが含まれる。抗原結合に関与するHVR残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して特異的に同定され得る。CDR-H3およびCDR-L3が、特に、しばしば標的とされる。
ある種の態様において、置換、挿入、または欠失が、抗体の抗原結合能を実質的に低下させない限り、そのような改変が1個または複数個のHVRに存在してもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書において提供される保存的置換）が、HVRにおいてなされ得る。そのような改変は、例えば、HVRの抗原接触残基外でなされ得る。前記に提供されるバリアントVH配列およびバリアントVL配列のある種の態様において、各HVRは、未改変であるか、または1個、2個、もしくは3個を超えないアミノ酸置換を含有している。
変異誘発の標的とされ得る抗体の残基または領域の同定のための有用な方法は、Cunningham,B.C.and Wells,J.A.,Science 244(1989)1081-1085によって記載されるように「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法においては、標的残基の残基または群（例えば、arg、asp、his、lys、およびgluのような荷電残基）が同定され、抗体の抗原との相互作用が影響を受けるか否かを決定するため、中性アミノ酸または陰性荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に交換される。最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に、さらなる置換が導入され得る。あるいはまたはさらに、抗体と抗原との間の接触点を同定するため、抗原-抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基および近隣の残基は、置換の候補として標的とされるかまたは排除され得る。バリアントは、所望の特性を含有しているか否かを決定するため、スクリーニングされ得る。
アミノ酸配列挿入には、1残基～100個以上の残基を含有しているポリペプチドの長さの範囲のアミノ末端および/またはカルボキシル末端における融合が含まれ、1個または複数個のアミノ酸残基の配列内挿入も含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入バリアントには、（例えば、ADEPTのための）酵素または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドの、抗体のN末端またはC末端への融合が含まれる。
（b）グリコシル化バリアント
ある種の態様において、本明細書において提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加させるかまたは減少させるために改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1個または複数個のグリコシル化部位が作出されるかまたは除去されるようアミノ酸配列を改変することによって、便利に達成され得る。
抗体がFc領域を含む場合、それに付着している炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生されるネイティブ抗体は、典型的には、N結合によってFc領域のCH2ドメインのAsn297に一般に付着している分岐型二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright,A.and Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32を参照すること。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」内のGlcNAcに付着したフコースを含み得る。いくつかの態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、ある種の改善された特性を有する抗体バリアントを作出するため、なされ得る。
一つの態様において、Fc領域に（直接または間接的に）付着したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体バリアントが、提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、1％～80％、1％～65％、5％～65％、または20％～40％であり得る。フコースの量は、例えば、WO 2008/077546に記載されるように、MALDI-TOF質量分析によって測定されるような、Asn297に付着した全ての糖構造（例えば、複合型、ハイブリッド型、および高マンノース型の構造）の合計と比べた、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297とは、Fc領域の約297位（Fc領域残基のEUナンバリング）に位置するアスパラギン残基をさす；しかしながら、Asn297は、抗体の軽微な配列変動のため、297位の±3アミノ酸上流または下流、即ち、294～300位に位置していてもよい。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたADCC機能を有し得る。例えば、US 2003/0157108；US 2004/0093621を参照すること。「脱フコシル」または「フコース欠損」抗体バリアントに関係する刊行物の例には、以下のものが含まれる：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki,A.et al.,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.et al.,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。脱フコシル抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質フコシル化欠損Lec13 CHO細胞（Ripka,J.,et al.,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；およびWO 2004/056312、特に、実施例11）、およびα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞のようなノックアウト細胞株（例えば、Yamane-Ohnuki,N.,et al.,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.,et al.,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；WO 2003/085107を参照すること）が含まれる。
例えば、抗体のFc領域に付着した二分岐オリゴ糖がバイセクティングGlcNAcを有する、バイセクティッド（bisected）オリゴ糖を有する抗体バリアントが、さらに提供される。そのような抗体バリアントは、低下したフコシル化および／または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、WO 2003/011878；US 6,602,684；およびUS 2005/0123546に記載されている。Fc領域に付着したオリゴ糖の中に少なくとも1個のガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、WO 1997/30087；WO 1998/58964；およびWO 1999/22764に記載されている。
（c）Fc領域バリアント
ある種の態様において、1個または複数個のアミノ酸修飾を本明細書において提供される抗体のFc領域へ導入し、それによって、Fc領域バリアントを生成することができる。Fc領域バリアントは、1個または複数個のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトFc領域配列（例えば、ヒトのIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域）を含み得る。
ある種の態様において、本発明は、インビボの抗体の半減期は重要であるが、（補体およびADCCのような）ある種のエフェクター機能は不要であるかまたは有害である適用のために望ましい候補である、いくつかのエフェクター機能を保有するが、全ては保有していない抗体バリアントを、企図する。CDC活性および／またはADCC活性の低下／枯渇を確認するため、インビトロおよび／またはインビボの細胞傷害アッセイを実施することができる。例えば、抗体がFcγR結合を欠く（従って、ADCC活性を欠く可能性が高い）が、FcRn結合能を保持することを確実にするため、Fc受容体（FcR）結合アッセイを実施することができる。ADCCを媒介するための主要な細胞、NK細胞は、Fc(RIIIのみを発現し、単球は、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、Ravetch,J.V.and Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492の464頁の表3に要約されている。関心対象の分子のADCC活性を査定するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、US 5,500,362（例えば、Hellstrom,I.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；およびHellstrom,I.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502を参照すること）；US 5,821,337（Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361を参照すること）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を利用することができる（例えば、フローサイトメトリーのためのACTI（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（CellTechnology,Inc.Mountain View,CA）；およびCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Promega,Madison,WI）を参照すること）。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が含まれる。あるいはまたはさらに、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えば、Clynes,R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656に開示されたもののような動物モデルにおいて査定され得る。抗体がC1qに結合することができず、従って、CDC活性を欠くことを確認するため、C1q結合アッセイを実施することもできる（例えば、WO 2006/029879およびWO 2005/100402のC1q結合ELISAおよびC3c結合ELISAを参照すること）。補体活性化を査定するため、CDCアッセイを実施することができる（例えば、Gazzano-Santoro,H.et al.,J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.et al.,Blood 101(2003)1045-1052；およびCragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743を参照すること）。FcRn結合およびインビボクリアランス／半減期の決定も、当技術分野において公知の方法を使用して実施され得る（例えば、Petkova,S.B.et al.,Int.Immunol.18(2006:1759-1769を参照すること）。
低下したエフェクター機能を有する抗体には、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、および329のうちの1個または複数個の置換を有するものが含まれる（US 6,737,056）。そのようなFc変異体には、アミノ酸位置265、269、270、297、および327のうちの2個以上に置換を有するFc変異体が含まれ、残基265および297のアラニンへの置換を有するいわゆる「DANA」Fc変異体が含まれる（US 7,332,581）。
FcRとの改善されたまたは減少した結合を有するある種の抗体バリアントが記載されている（例えば、US 6,737,056；WO 2004/056312、およびShields,R.L.et al.,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604を参照すること）。
ある種の態様において、抗体バリアントは、ADCCを改善する1個または複数個のアミノ酸置換、例えば、Fc領域の298位、333位、および／または334位（残基のEUナンバリング）における置換を有するFc領域を含む。
いくつかの態様において、例えば、US 6,194,551、WO 99/51642、およびIdusogie,E.E.et al.,J.Immunol.164(2000)4178-4184に記載されるように、改変された（即ち、改善されたまたは減少した）C1q結合および／または補体依存性細胞傷害（CDC）をもたらす改変が、Fc領域においてなされる。
増加した半減期、および母性IgGの胎児への移行を担う新生児型Fc受容体（FcRn）（Guyer,R.L.et al.,J.Immunol.117(1976)587-593およびKim,J.K.et al.,J.Immunol.24(1994)2429-2434）との改善された結合を有する抗体が、US 2005/0014934に記載されている。それらの抗体は、Fc領域のFcRnとの結合を改善する1個または複数個の置換を有するFc領域を含む。そのようなFcバリアントには、Fc領域残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434のうちの1個または複数個の置換、例えば、Fc領域残基434の置換（US 7,371,826）を有するものが含まれる。
Fc領域バリアントのその他の例に関しては、Duncan,A.R.and Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；およびWO 94/29351も参照すること。
全ての局面の一つの態様において、抗体は、抗体がそれ自体に結合しない/することができないことを条件として、
（i）任意で、変異P329G、L234A、およびL235Aを含む、ヒトIgG1サブクラスのホモ二量体Fc領域、または
（ii）任意で、変異P329G、S228P、およびL235Eを含む、ヒトIgG4サブクラスのホモ二量体Fc領域、または
（iii）任意で、変異P329G、L234A、L235A、I253A、H310A、およびH435Aを含むか、もしくは任意で、変異P329G、L234A、L235A、H310A、H433A、およびY436Aを含む、ヒトIgG1サブクラスのホモ二量体Fc領域、または
（iv）（a）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、およびY407Vを含むか、もしくは
（b）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびY349Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびS354Cを含むか、もしくは
（c）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびS354Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびY349Cを含む、ヘテロ二量体Fc領域、または
（v）両方のFc領域ポリペプチドが変異P329G、L234A、およびL235Aを含み、
（a）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、およびY407Vを含むか、もしくは
（b）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびY349Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびS354Cを含むか、もしくは
（c）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびS354Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびY349Cを含む、ヒトIgG1サブクラスのヘテロ二量体Fc領域、または
（vi）両方のFc領域ポリペプチドが変異P329G、S228P、およびL235Eを含み、
（a）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、およびY407Vを含むか、もしくは
（b）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびY349Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびS354Cを含むか、もしくは
（c）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびS354Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびY349Cを含む、ヒトIgG4サブクラスのヘテロ二量体Fc領域、または
（vii）（i）、（ii）、および（iii）のうちの一つの、（vi）、（v）、および（vi）のうちの一つとの組み合わせ
を含む（全て、カバットのEUインデックスによる位置）。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、本明細書に明示されるCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体は、付加的なC末端グリシン-リジンジペプチド（G446およびK447、カバットEUインデックスによるナンバリング）を含む。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、本明細書に明示されるCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体は、付加的なC末端グリシン残基（G446、カバットEUインデックスによるナンバリング）を含む。
本明細書において報告される抗体は、一つの態様において、変異PVA236、L234A/L235A、および/もしくはGLPSS331（カバットのEUインデックスによるナンバリング）を有するヒトサブクラスIgG1のもの、またはサブクラスIgG4のものであることを特徴とする。さらなる態様において、抗体は、E233、L234、L235、G236、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331、および/またはP329（カバットのEUインデックスによるナンバリング）に少なくとも1個の変異を含有している、IgGクラス、一つの態様において、IgG1またはIgG4のものであることを特徴とする。さらに、一つの態様において、IgG4サブクラスの抗体は、変異S228P、または変異S228PおよびL235E（Angal,S.,et al.,Mol.Immunol.30(1993)105-108）（カバットのEUインデックスによるナンバリング）を含有している。
本明細書において報告される抗体の重鎖のC末端は、アミノ酸残基PGKで終わる完全なC末端であり得る。重鎖のC末端は、C末端アミノ酸残基のうちの1個または2個が除去された、短縮されたC末端であり得る。一つの好ましい態様において、重鎖のC末端は、PGで終わる短縮されたC末端である。
（d）システイン改変型抗体バリアント
ある種の態様において、例えば、抗体の1個または複数個の残基がシステイン残基に置換されているシステイン改変型抗体、例えば、「チオMAb」を作出することが望ましい場合がある。具体的な態様において、置換される残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。それらの残基をシステインに置換することによって、反応性チオール基が、抗体のアクセス可能な部位に位置付けられ、本明細書にさらに記載されるようなイムノコンジュゲートを作出するため、薬物モエティまたはリンカー-薬物モエティのような他のモエティと抗体をコンジュゲートするために使用され得る。ある種の態様において、以下の残基のうちの1個または複数個がシステインに置換され得る：軽鎖のV205（カバットナンバリング）；重鎖のA118（EUナンバリング）；および重鎖Fc領域のS400（EUナンバリング）。システイン改変型抗体は、例えば、US 7,521,541に記載されるように生成され得る。
（e）抗体誘導体
ある種の態様において、本明細書において提供される抗体は、当技術分野において公知であり、容易に入手可能な付加的な非タンパク質性モエティを含有するようさらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化のために適当なモエティには、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されるわけではない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（PEG）、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー(propropylene glycol homopolymer)、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のため、製造上の利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐型または非分岐型であり得る。抗体に付着したポリマーの数は変動してもよく、複数個のポリマーが付着させられる場合、それらは同一の分子であってもよいしまたは異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／またはタイプは、改善すべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件の下で治療において使用されるか否か等を含むが、これらに限定されるわけではない考慮に基づき、決定され得る。
もう一つの態様において、抗体と、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク質性モエティとのコンジュゲートが、提供される。一つの態様において、非タンパク質性モエティは、カーボンナノチューブ（Kam,N.W.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605）である。放射線は、通常の細胞には害を与えないが、抗体-非タンパク質性モエティの近位の細胞が死滅する温度へ非タンパク質性モエティを加熱する波長を含むが、これらに限定されるわけではない、任意の波長のものであり得る。
B.組換えの方法および組成物
抗体は、例えば、US 4,816,567に記載されるような組換えの方法および組成物を使用して作製され得る。一つの態様において、本明細書に記載された抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体をコードする単離された核酸が、提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしていてよい。さらなる態様において、そのような核酸を含む1種または複数種のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一つのそのような態様において、宿主細胞は、以下のものを含む（例えば、以下のものによって形質転換されている）：（1）抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（2）抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター。一つの態様において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Y0、NS0、Sp20細胞）である。一つの態様において、前記に提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現のために適当な条件の下で培養する工程を含み、任意で、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収する工程を含む、抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体を作成する方法が提供される。
抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体の組換え作製のためには、例えば、前記の抗体をコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のため、1種または複数種のベクターへ挿入する。そのような核酸は、従来の手法を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され配列決定され得る。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現のために適当な宿主細胞には、本明細書に記載された原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、特に、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない時、抗体は細菌において作製されてもよい。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、US 5,648,237、US 5,789,199、およびUS 5,840,523を参照すること（大腸菌における抗体断片の発現を記載しているCharlton,K.A.,In：Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2003),pp.245-254も参照すること）。発現の後、抗体は、可溶性画分に細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製され得る。
原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的にまたは完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌および酵母株を含む、糸状菌または酵母のような真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適当なクローニング宿主または発現宿主である。Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；およびLi,H.et al.,Nat.Biotech.24(2006)210-215を参照すること。
グリコシル化抗体の発現のための適当な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来してもよい。無脊椎細胞の例には、植物および昆虫の細胞が含まれる。特に、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのため、昆虫細胞と共に使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物も宿主として利用され得る。例えば、（トランスジェニック植物において抗体を作製するためのPLANTIBODIES（商標）テクノロジーを記載している）US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978、およびUS 6,417,429を参照すること。
脊椎動物細胞も宿主として使用され得る。例えば、懸濁培養に適応している哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株のその他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）；ヒト胎児由来腎臓株（例えば、Graham,F.L.,et al.,J.Gen Virol.36(1977)59-74に記載されているような293または293細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（BHK）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252に記載されているようなTM4細胞）；サル腎臓細胞（CV1）；アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76）；ヒト子宮頚癌細胞（HELA）；イヌ腎臓細胞（MDCK）；バッファローラット肝細胞（BRL 3A）；ヒト肺細胞（W138）；ヒト肝細胞（Hep G2）；マウス乳房腫瘍（MMT 060562）；例えば、Mather,J.P.,et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68に記載されているようなTRI細胞；MRC 5細胞；およびFS4細胞である。その他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR- CHO細胞（Urlaub,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞；ならびにY0、NS0、およびSp2/0のような骨髄腫細胞株が含まれる。抗体作製のために適当なある種の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki,P.and Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2004),pp.255-268を参照すること。
C.アッセイ
本明細書において提供される抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体は、当技術分野において公知の様々なアッセイにおいて使用され得る。
本明細書において報告される抗体は、例えば、試料中の、Fc領域にそれぞれの変異を含む治療用抗体またはそのような治療用抗体に対する抗薬物抗体を検出しなければならない場合に、特に有用である。
一つの態様において、治療用抗体は、
（i）変異P329G、もしくはP329G、L234A、およびL235A、ならびに/または
（ii）変異I253A、H310A、およびH435A
を含む。
一つの態様において、それぞれの変異を含む抗体は、
（i）変異P329G、もしくはP329G、L234A、およびL235A、ならびに/または
（ii）変異I253A、H310A、およびH435A
を含む抗体である。
本明細書において報告される一つの局面は、（試料中の）Fc領域にそれぞれの変異を含む治療用抗体（即ち、Fc領域にそれぞれの変異を含む抗体）の測定のための、捕捉抗体またはトレーサー抗体のいずれかとしての、（抗原ブリッジング）イムノアッセイにおける本明細書において報告される抗体の使用である。検出または捕捉のために必要とされるそれぞれの他の試薬は、それぞれ、治療用抗体の抗原、治療用抗体もしくはそれにコンジュゲートしたモエティに特異的に結合するが、使用される抗体の結合に干渉しない第2の抗体（即ち、両方の抗体が治療用抗体に同時に結合することができる）、治療用抗体に対する抗イディオタイプ抗体、またはヒトFcγ受容体IもしくはそのFc領域結合断片のいずれかであり得、それらは、適宜、誘導体化、固定化、または標識される。
本明細書において報告される抗体がトレーサー抗体として使用される場合、このアッセイは、任意の非ヒト血清に適用可能である。一つの態様において、使用は、非ヒト実験動物の血清試料における決定のためである。
本明細書において報告される抗体が捕捉抗体として使用される場合、このアッセイは、（ヒト血清を含む）任意の血清に適用可能である。
そのようなアッセイは、10％カニクイザル血清（アッセイ濃度）において100pg/ml未満、例えば、40～80pg/mlの定量下限値を有する。
本明細書において報告される一つの局面は、（試料中の）Fc領域にそれぞれの変異を含む治療用抗体の測定のための、捕捉抗体およびトレーサー抗体としての、抗原ブリッジングイムノアッセイにおける本明細書において報告される1種または複数種の抗体の使用である。
このアッセイは、（ヒト血清を含む）任意の血清に適用可能である。一つの好ましい態様において、本明細書において報告される2種の異なる抗体が、捕捉抗体およびトレーサー抗体として使用される。
本明細書において報告される一つの局面は、較正標準としての抗原ブリッジングイムノアッセイにおける本明細書において報告される抗体の使用である。
本明細書において報告される一つの局面は、（試料中の）Fc領域にそれぞれの変異を含む治療用抗体に対する抗薬物抗体の測定のための、イムノアッセイにおける本明細書において報告される抗体の使用である。
本明細書において報告される抗体が捕捉抗体として使用される場合、このアッセイは、（ヒト血清を含む）任意の血清に適用可能である。
本明細書において報告される一つの局面は、
（a）任意で、分析すべき試料を準備する工程、
（b）本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共に、試料をインキュベートする工程、
（c）任意で、治療用抗体の選択的な検出のための試薬と共に、試料をインキュベートする工程、および
（d）（b）または（c）において形成された複合体を治療用抗体の存在と相関させ、それによって、治療用抗体を検出する工程
を含む、（試料中の）Fc領域にそれぞれの変異を含むヒトIgG1サブクラスまたはヒトIgG4サブクラスの治療用抗体を検出する方法である。
一つの態様において、本明細書において報告される抗体は、捕捉抗体として使用される。捕捉抗体は、一つの態様において、固体表面に固定化される。この固体表面は、一つの態様において、マルチウェルプレートのウェル（の壁または底）である。従って、一つの態様において、方法は、以下の工程を含む：
（a）治療用抗体を含む固定化された複合体を形成させるため、固体表面上に固定化された本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共に、試料をインキュベートする工程、
（b）任意で、（未結合の物質を除去するため）固体表面を洗浄する工程、
（c）治療用抗体に選択的に結合する検出試薬と共に、固定化された複合体をインキュベートし、それによって、試料中の治療用抗体を検出する工程。
一つの態様において、本明細書において報告される抗体は、トレーサー抗体として使用される。捕捉のため、適当な捕捉試薬は、一つの態様において、固体表面に固定化される。この固体表面は、一つの態様において、マルチウェルプレートのウェル（の壁または底）である。従って、一つの態様において、方法は、以下の工程を含む：
（a）治療用抗体を含む固定化された複合体を形成させるため、固体表面上に固定化された捕捉抗体と共に試料をインキュベートする工程、
（b）任意で、（未結合の物質を除去するため）固体表面を洗浄する工程、
（c）さらなる複合体を形成させるため、検出可能標識にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共に、固定化された複合体をインキュベートする工程、
（d）（c）において形成された複合体を、検出可能標識に選択的に結合する検出試薬と共にインキュベートし、それによって、試料中の治療用抗体を検出する工程。
本明細書において報告される一つの局面は、捕捉抗体およびトレーサー抗体が両方とも本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片より独立に選択されることを特徴とする、捕捉抗体およびトレーサー抗体を含む抗原ブリッジングイムノアッセイを使用して、試料中のFc領域にそれぞれの変異を含むヒトIgG1サブクラスまたはヒトIgG4サブクラスの治療用抗体を決定する方法である。
一つの態様において、試料は、マーモセットおよびタマリン、旧世界ザル、コビトキツネザルおよびネズミキツネザル、テナガザルおよび小型類人猿、キツネザルの科のメンバー、ならびにそれらの交雑種より選択される実験動物、またはヒトから入手される。一つの態様において、試料は、アカゲザルまたはマーモセットまたはヒヒまたはカニクイザルまたはヒトから入手される。一つの態様において、実験動物は、マカクまたはマカクザルである。一つの態様において、試料は、カニクイザルまたはアカゲザルまたはヒトから入手される。
本明細書において報告される一つの局面は、（試料中の）全治療用抗体、活性型治療用抗体、ADA結合型治療用抗体、または抗原結合型治療用抗体の濃度の決定のための、Fc領域にそれぞれの変異を含むヒトIgG1サブクラスまたはヒトIgG4サブクラスの治療用抗体に特異的に結合する本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片の使用である。
本明細書において報告される一つの局面は、本明細書において報告される抗体および/またはそのFc領域結合断片の混合物を含む抗体組成物である。
本明細書において報告される一つの局面は、本明細書において報告される方法における本明細書において報告される抗体組成物の使用である。
一つの態様において、イムノアッセイは、サンドイッチイムノアッセイである。もう一つの態様において、抗体のコンジュゲーションパートナーとのコンジュゲーションは、抗体のアミノ酸骨格のN末端および/もしくはεアミノ基（リジン）、異なるリジンのεアミノ基、カルボキシ官能基、スルフヒドリル官能基、ヒドロキシル官能基、および/もしくはフェノール官能基、ならびに/または抗体の炭水化物構造の糖アルコール基を介した化学結合によって実施される。一つの態様において、捕捉抗体は、特異的結合対を介して固定化される。一つの態様において、捕捉抗体は、ビオチンにコンジュゲートされ、固定化は、固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して実施される。一つの態様において、トレーサー抗体は、特異的結合対を介して検出可能標識にコンジュゲートされる。一つの態様において、トレーサー抗体は、ジゴキシゲニンにコンジュゲートされ、検出可能標識との連結は、ジゴキシゲニンに対する抗体を介して実施される。一つの態様において、治療用抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。一つの態様において、ヒト抗体またはヒト化抗体は、モノクローナル抗体である。一つの態様において、全ての治療用抗体が検出され、もう一つの態様において、活性型治療用抗体が検出され、さらなる態様において、抗原結合型治療用抗体が検出される。
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、（試料中の）治療用抗体を検出する方法である：
（a）複合体を形成させるため、固体表面上に固定化された本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共に、試料をインキュベートする工程、
（b）全治療用抗体、活性型治療用抗体、または抗原結合型治療用抗体の選択的検出のために適当な試薬と共に、試料をインキュベートする工程、および
（c）（b）において形成された複合体を、（試料中の）治療用抗体の濃度と相関させ、それによって、治療用抗体を検出する工程。
本明細書において報告される一つの局面は、以下の順に以下の工程を含む、（試料中の）Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体（即ち、Fc領域にそれぞれの変異を含む抗体）に対する抗薬物抗体の存在の決定のための抗薬物抗体イムノアッセイである：
（a）複合体を形成させるため、固体表面上に固定化された本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共に、哺乳動物血清を含む試料をインキュベートする工程、
（b）試料中に存在するFc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体と、検出可能標識にコンジュゲートされた全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との複合体が形成されるよう、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片と共に、（a）の複合体をインキュベートする工程、および
（c）検出可能標識によって、前工程において形成された複合体を決定する工程。
本明細書において報告される一つの局面は、以下の順に以下の工程を含む、（試料中の）Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体（即ち、Fc領域にそれぞれの変異を含む抗体）に対する抗薬物抗体の存在の決定のための抗薬物抗体イムノアッセイである：
（a）複合体を形成させるため、固体表面上に固定化された全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片と共に、哺乳動物血清を含む試料をインキュベートする工程、
（b）試料中に存在するFc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体と、検出可能標識にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体との複合体が形成されるよう、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共に、（a）の複合体をインキュベートする工程、
（c）検出可能標識によって、前工程において形成された複合体を決定する工程。
本明細書において報告される一つの局面は、以下の順に以下の工程を含む、（試料中の）Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体（即ち、Fc領域にそれぞれの変異を含む抗体）に対する抗薬物抗体の存在の決定のための抗薬物抗体イムノアッセイである：
（a）（固相に結合した薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるよう）Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体が固定化された固相を、哺乳動物血清を含む試料と共にインキュベートする工程、
（b）（工程（a）において形成された薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合した）固相を、検出可能標識にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、および
（c）検出可能標識の存在を決定することによって、工程（b）における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって、試料中のFc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する工程。
本明細書において報告される一つの局面は、以下の順に以下の工程を含む、試料中のFc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在の決定のための抗薬物抗体イムノアッセイである：
（a）（固相に結合したFAB-抗薬物抗体複合体が形成されるよう）Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体のFABが固定化された固相を、哺乳動物血清を含む試料と共にインキュベートする工程、
（b）（工程（a）において形成されたFAB-抗薬物抗体複合体が結合した）固相を、検出可能標識にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、および
（c）検出可能標識の存在を決定することによって、工程（b）における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって、Fc受容体結合抑制型のヒトに対する抗薬物抗体の存在を決定する工程。
本明細書において報告される一つの局面は、以下の順に以下の工程を含む、（試料中の）Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体（即ち、Fc領域にそれぞれの変異を含む抗体）に対する抗薬物抗体の存在の決定のための抗薬物抗体イムノアッセイである：
（a）（試料中に存在する（任意の）抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体へ移すため）哺乳動物血清を含む試料へ（過剰の）薬物抗体を添加する工程、
（b）（固相に結合した抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるよう）Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体が特異的に結合する抗原が固定化された固相を、工程（a）において入手された試料と共にインキュベートする工程、
（c）（工程（b）において形成された抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合した）固相を、検出可能標識にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、および
（d）検出可能標識の存在を決定することによって、工程（c）における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって、試料中のFc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する工程。
本明細書において報告される一つの局面は、以下の順に以下の工程を含む、（試料中の）Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体（即ち、Fc領域にそれぞれの変異を含む抗体）に対する抗薬物抗体の存在の決定のための抗薬物抗体イムノアッセイである：
（a）（試料中に存在する（任意の）抗薬物抗体を薬物-抗体-抗薬物抗体複合体へ移すため）哺乳動物血清を含む試料へ（過剰の）薬物抗体を添加する工程、
（b）（固相に結合したFc領域抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるよう）本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片が固定化された固相を、工程（a）において入手された試料と共にインキュベートする工程、
（c）（工程（b）において形成されたFc領域抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合した）固相を、検出可能標識にコンジュゲートされた薬物抗体の抗原と共にインキュベートする工程、および
（d）検出可能標識の存在を決定することによって、工程（c）における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって、試料中のFc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する工程。
本明細書において報告される一つの局面は、以下の順に以下の工程を含む、（試料中の）Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体（即ち、Fc領域にそれぞれの変異を含む抗体）に対する抗薬物抗体の存在の決定のための抗薬物抗体イムノアッセイである：
（a）（試料中に存在する（任意の）抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体へ移すため）哺乳動物血清を含む試料へ（過剰の）薬物抗体を添加する工程、
（b）（固相に結合した抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるよう）薬物抗体に対する抗薬物抗体が固定化された固相を、工程（a）において入手された試料と共にインキュベートする工程、
（c）（工程（b）において形成された抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合した）固相を、検出可能標識にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、および
（d）検出可能標識の存在を決定することによって、工程（c）における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって、試料中のFc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する工程。
本明細書において報告される一つの局面は、以下の順に以下の工程を含む、（試料中の）Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体（即ち、Fc領域にそれぞれの変異を含む抗体）に対する抗薬物抗体の存在の決定の方法である：
－試料中に存在するFc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体と、検出可能標識にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片との間の複合体が形成されるよう、哺乳動物血清を含む試料を、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、および
－検出可能標識によって、前工程において形成された複合体を決定する工程。
本明細書において報告される一つの局面は、（試料中の）抗薬物抗体と複合体化されたFc領域にそれぞれの変異を含む治療用抗体（即ち、Fc領域にそれぞれの変異を含む抗体）の測定のための、捕捉抗体としての、（抗原ブリッジング）イムノアッセイにおける本明細書において報告される抗体の使用である。複合体の検出のために必要とされるそれぞれの他の試薬は、それぞれ、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片であり得、それらは、適宜、誘導体化、固定化、または標識される。
このアッセイは、本明細書において報告される抗体が捕捉抗体として使用される場合、任意のヒトおよび非ヒトの血清に適用可能である。一つの態様において、使用は、非ヒト実験動物の血清試料における決定のためである。
そのようなアッセイは、10％カニクイザル血清（アッセイ濃度）において100pg/ml未満、例えば、40～80pg/mlの定量下限値を有する。
本明細書において報告される一つの局面は、哺乳動物血清を含む（試料中の）Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体（即ち、Fc領域にそれぞれの変異を含む抗体）に対する抗薬物抗体の存在または量の決定のための、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片の使用である。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、各インキュベーション工程には、以下の工程が後続する：
－未結合の化合物を除去するため、固相を洗浄する工程。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、アッセイは、（試料中の）Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体（即ち、Fc領域にそれぞれの変異を含む抗体）に対する抗薬物抗体の存在および量の決定のためであり、最終工程として以下の工程を含む：
－検出可能標識の存在を決定することによって、前工程における固相に結合した複合体の形成を決定し、標準曲線を使用して、決定された標識の量を抗薬物抗体の量と相関させることによって、試料中のFc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の量を決定する工程。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体は、ヒトIgG1サブクラスまたはヒトIgG4サブクラスのものである。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体もしくはヒト化薬物抗体は、ヒトIgG1サブクラスのものであり、両方のFc領域ポリペプチドに変異L234A、L235A、およびP329Gを有するか、またはFc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体もしくはヒト化薬物抗体は、ヒトIgG4サブクラスのものであり、両方のFc領域ポリペプチドに変異S228P、L235E、およびP329Gを有するか、またはFc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体もしくはヒト化薬物抗体は、ヒトIgG1サブクラスのものであり、両方のFc領域ポリペプチドに変異I253A、H310A、H435A、およびP329Gを有するか、またはFc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体もしくはヒト化薬物抗体は、ヒトIgG4サブクラスのものであり、両方のFc領域ポリペプチドに変異I253A、H310A、H435A、およびP329Gを有する（カバットによるEUナンバリングシステムによるナンバリング）。
全ての局面の一つの態様において、Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体は、二重特異性抗体または三重特異性抗体または四重特異性抗体または五重特異性抗体または六重特異性抗体である。一つの態様において、Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体は、二重特異性抗体である。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、哺乳動物血清は、ヒト血清またはカニクイザル血清またはマウス血清である。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、哺乳動物血清は、Fc受容体結合抑制型のヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体が投与された哺乳動物から入手されたものである。一つの態様において、試料は、哺乳動物への抗体の最初の投与の少なくとも2日後に入手される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、エフェクター機能が抑制されたヒト薬物抗体またはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体は、IgGクラスのものである。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、標識の存在および/または量は、酵素結合呈色反応、表面プラズモン共鳴、電気化学発光、またはラジオイムノアッセイを使用して決定される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、イムノアッセイおよび/または方法および/または使用は、インビトロのイムノアッセイおよび/またはインビトロの方法および/またはインビトロの使用である。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、固相は、結合対の第1のメンバーにコンジュゲートされ、固相上に固定化される化合物は、結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされる。
そのような結合対（第1のメンバー/第2のメンバー）は、一つの態様において、ストレプトアビジンまたはアビジン/ビオチン、抗体/抗原（例えば、Hermanson,G.T.,et al.,Bioconjugate Techniques,Academic Press(1996)を参照すること）、レクチン/多糖、ステロイド/ステロイド結合タンパク質、ホルモン/ホルモン受容体、酵素/基質、IgG/プロテインAおよび/またはG等より選択される。
一つの態様において、第2の結合パートナーは、特異的結合対を介して結合する（固定化される）。そのような結合対（第1の成分/第2の成分）は、一つの態様において、ストレプトアビジンまたはアビジン/ビオチン、抗体/抗原（例えば、Hermanson,G.T.,et al.,Bioconjugate Techniques,Academic Press(1996)を参照すること）、レクチン/多糖、ステロイド/ステロイド結合タンパク質、ホルモン/ホルモン受容体、酵素/基質、IgG/プロテインAおよび/またはG等より選択される。一つの態様において、第2の結合パートナーは、ビオチンにコンジュゲートされ、固定化は、固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して実施される。
一つの好ましい態様において、結合対の第1のメンバーは、ストレプトアビジンであり、結合対の第2のメンバーは、ビオチンである。
一つの態様において、固相は、ストレプトアビジンにコンジュゲートされ、固相上に固定化される化合物は、ビオチン化される。
一つの態様において、固相は、ストレプトアビジンによってコーティングされた常磁性ビーズ、またはストレプトアビジンによってコーティングされたセファロースビーズ、またはマルチウェルプレートのストレプトアビジンによってコーティングされたウェルである。
一つの態様において、固相にコンジュゲートされる化合物は、ビオチンにコンジュゲートされ、それによって、その後、固相上に固定化される部位に関して異なる少なくとも2種の化合物を含む混合物である。
一つの態様において、固相上に固定化される化合物は、ポリペプチドのアミノ酸骨格のN末端および/もしくはεアミノ基（リジン）、異なるリジンのεアミノ基、カルボキシ官能基、スルフヒドリル官能基、ヒドロキシル官能基、および/もしくはフェノール官能基、ならびに/またはポリペプチドの炭水化物構造の糖アルコール基を介した化学結合によって結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされる。
異なるアミノ基を介したそのようなコンジュゲーションは、第1の工程において、化学的保護剤によるεアミノ基の一部のアシル化によって、例えば、シトラコニル化によって、実施され得る。第2の工程において、残存するアミノ基を介して、コンジュゲーションが実施される。その後、シトラコニル化が除去され、結合パートナーが、残存する遊離のアミノ基を介して固相上に固定化される、即ち、入手された結合パートナーは、シトラコニル化によって保護されていないアミノ基を介して固相上に固定化される。適当な化学的保護剤は、保護されていない側鎖アミンにおいて結合を形成し、N末端における結合より不安定であり、それとは異なる。多くのそのような化学的保護剤が公知である（例えば、EP 0 651 761を参照すること）。一つの態様において、化学的保護剤には、マレイン酸無水物またはシトラコニル酸無水物のような環式ジカルボン酸無水物が含まれる。
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、（試料中の）多重特異性結合剤の量の（免疫学的）決定の方法である：
－本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共に、複合体をインキュベートすることによって、
（i）多重特異性結合剤の第1の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体と、
（ii）多重特異性結合剤と
の間に形成された複合体の量を決定し、それによって、試料中の多重特異性結合剤の量を決定する工程。
一つの態様において、多重特異性結合剤の第1の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体は、固相にコンジュゲートされる。
一つの態様において、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片は、検出可能標識にコンジュゲートされる。
一つの態様において、試料は、（ヒト）血清もしくは（ヒト）血漿を含み、かつ/または細胞溶解物であり、かつ/または多重特異性結合剤の1種もしくは複数種の抗原を含む。一つの態様において、試料は、（ヒト）血清または（ヒト）血漿である。
一つの態様において、多重特異性結合剤は、抗体、抗体もしくは抗体断片と非抗体ポリペプチドとを含む融合ポリペプチド、抗体もしくは抗体断片と可溶性受容体とを含む融合ポリペプチド、または抗体もしくは抗体断片とペプチド結合分子とを含む融合ポリペプチドより選択される。
一つの態様において、多重特異性結合剤は、抗体である。一つの態様において、抗体は、二重特異性抗体または三重特異性抗体または四重特異性な抗体または五重特異性な抗体または六重特異性抗体である。一つの態様において、抗体は、二重特異性抗体である。
一つの態様において、結合特異性は、結合部位または抗体重鎖可変ドメインと抗体軽鎖可変ドメインとの対である。
一つの態様において、多重特異性結合剤の第1の結合特異性に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体は、ビオチン化され、固相は、ストレプトアビジンによってコーティングされる。一つの態様において、固相は、ストレプトアビジンによってコーティングされた常磁性ビーズまたはストレプトアビジンによってコーティングされたセファロースビーズである。
一つの態様において、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片は、ジゴキシゲニル化される。
一つの態様において、方法は、
－形成された複合体内の検出可能標識を決定することによって
（i）本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と、
（ii）多重特異性結合剤と、
（iii）多重特異性結合剤の結合特異性に特異的に結合し、検出可能標識を含む抗イディオタイプ抗体と
の間に形成された複合体の量を決定する工程を含む。
一つの態様において、抗イディオタイプ抗体のコンジュゲーションパートナーへのコンジュゲーションは、薬物抗体のアミノ酸骨格のN末端および/もしくはεアミノ基（リジン）、異なるリジンのεアミノ基、カルボキシ官能基、スルフヒドリル官能基、ヒドロキシル官能基、および/もしくはフェノール官能基、ならびに/または薬物抗体の炭水化物構造の糖アルコール基を介した化学結合によって実施される。
一つの態様において、抗イディオタイプ抗体は、少なくとも2個の異なるアミノ基を介して固相へコンジュゲートされた抗イディオタイプ抗体を含む混合物である。異なるアミノ基を介したそのようなカップリングは、最初の工程において、化学的保護剤によるεアミノ基の一部のアシル化によって、例えば、シトラコニル化によって、実施され得る。第2の工程において、残存するアミノ基を介して、コンジュゲーションが実施される。その後、シトラコニル化が除去され、残存する遊離のアミノ基を介して、抗体が固相上にコンジュゲートされる。即ち、入手された抗体が、シトラコニル化によって保護されていないアミノ基を介して固相上にコンジュゲートされる。適当な化学的保護剤は、保護されていない側鎖アミンにおいて結合を形成し、N末端における結合より不安定であり、それとは異なる。多くのそのような化学的保護剤が公知である（例えば、EP 0 651 761を参照すること）。一つの態様において、化学的保護剤には、マレイン酸無水物またはシトラコニル酸無水物のような環式ジカルボン酸無水物が含まれる。
一つの態様において、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片は、特異的結合対を介してコンジュゲートされる（固定化される）。そのような結合対（第1の成分/第2の成分）は、一つの態様において、ストレプトアビジンまたはアビジン/ビオチン、抗体/抗原（例えば、Hermanson,G.T.,et al.,Bioconjugate Techniques,Academic Press(1996)を参照すること）、レクチン/多糖、ステロイド/ステロイド結合タンパク質、ホルモン/ホルモン受容体、酵素/基質、IgG/プロテインAおよび/またはG等より選択される。一つの態様において、抗イディオタイプ抗体は、ビオチンにコンジュゲートされ、固定化は、固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して実施される。
本明細書において報告される一つの局面は、
－抗原および二重特異性抗体を含む試料を、固相にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程
を含む、検出される抗原に二重特異性抗体の第1の結合特異性が特異的に結合することができ、抗原が二重特異性抗体と複合体化されている（抗原-二重特異性抗体複合体）、（試料中の）二重特異性抗体の（第1の）抗原の存在および/または量の決定のインビトロの方法である。
一つの態様において、方法は、以下の工程を含む：
－抗原および二重特異性抗体を含む試料を、固相にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、ならびに
－抗原-二重特異性抗体-抗Fc領域抗体の複合体を検出し、それによって、二重特異性抗体の抗原の存在および/または量を決定する工程。
一つの態様において、方法は、以下の工程を含む：
－抗原および二重特異性抗体を含む試料を、固相にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、ならびに
－二重特異性抗体が結合するエピトープと異なるエピトープにおいて抗原に特異的に結合する抗体と共に、第1の工程において形成された複合体をインキュベートし、それによって、試料中の二重特異性抗体の抗原の存在および/または量を決定する工程。
一つの態様において、方法は、二重特異性抗体と複合体化された二重特異性抗体の抗原の存在および/または量の決定のためである。
一つの態様において、方法は、以下の工程を含む：
－抗原の少なくとも90％が二重特異性抗体と複合体化されている、抗原および二重特異性抗体を含む試料を準備する工程、
－抗原および二重特異性抗体を含む試料を、固相にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、ならびに
－二重特異性抗体が結合するエピトープと異なるエピトープにおいて抗原に特異的に結合する抗体と共に、第1の工程において形成された複合体をインキュベートし、それによって、試料中の二重特異性抗体の抗原の存在および/または量を決定する工程。
一つの態様において、方法は、以下の工程を含む：
－抗原の少なくとも90％が二重特異性抗体と複合体化されている試料を準備するため、抗原および二重特異性抗体を含む試料を、ある量の二重特異性抗体と共にインキュベートする工程、
－二重特異性抗体によって複合体化された抗原を含む試料を、固相にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、ならびに
－二重特異性抗体が結合するエピトープと異なるエピトープにおいて抗原に特異的に結合する抗体と共に、前工程において形成された複合体をインキュベートし、それによって、試料中の二重特異性抗体の抗原の存在および/または量を決定する工程。
一つの態様において、抗原の少なくとも95％が、二重特異性抗体によって複合体化されている。一つの態様において、抗原の少なくとも98％が、二重特異性抗体によって複合体化されている。
本明細書において報告される一つの局面は、以下の工程を含む、（試料中の）二重特異性抗体の第1の結合特異性が特異的に結合することができる二重特異性抗体の抗体結合型の（第1の）抗原の量の決定のインビトロの方法である：
－抗原の少なくとも90％が二重特異性抗体によって複合体化されている試料を準備するため、抗原および二重特異性抗体を含む試料の第1のアリコートを、ある量の二重特異性抗体と共にインキュベートする工程、
－二重特異性抗体によって複合体化された抗原を含む試料を、固相にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、ならびに
－二重特異性抗体が結合するエピトープと異なるエピトープにおいて抗原に特異的に結合する抗体と共に、前工程において形成された複合体をインキュベートし、それによって、試料中の二重特異性抗体の抗原の存在および/または量を決定し、それによって、試料中に存在する抗原の全量を決定する工程、
－抗原および二重特異性抗体を含む試料の第2のアリコートを、固相にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、ならびに
－二重特異性抗体が結合するエピトープと異なるエピトープにおいて抗原に特異的に結合する抗体と共に、形成された複合体をインキュベートし、それによって、試料中に存在する二重特異性抗体の遊離の抗原の量を決定する工程、ならびに
－試料中に存在する抗原の全量と、試料中に存在する遊離の抗原の量との違いによって、二重特異性抗体の抗体結合型の抗原の量を決定する工程。
本明細書において報告される一つの局面は、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共に試料をインキュベートすることによって、結合パートナーの検出の前に、試料中に存在する多重特異性結合剤に結合した結合パートナーの画分が枯渇させられる、多重特異性結合剤の第1の結合特異性が特異的に結合することができる結合パートナー（抗原、標的、分析物）の存在および/または量のインビトロの決定の方法である。
一つの態様において、検出される結合パートナーは、複合体化されていない結合パートナーまたは遊離の結合パートナーである。
本明細書において報告される局面は、
－（第1の）結合パートナーおよび多重特異性結合剤を含む試料を、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程
を含む、多重特異性結合剤の第1の結合特異性が特異的に結合することができる多重特異性結合剤の（第1の）結合パートナーの存在および/または量の決定のインビトロの方法である。
一つの態様において、方法は、
－（第1の）結合パートナーおよび多重特異性結合剤を含む試料を、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、ならびに
－多重特異性結合剤が枯渇した試料において（遊離の第1の）結合パートナーの量を決定する工程
を含む。
一つの態様において、方法は、
－（第1の）結合パートナーおよび多重特異性結合剤を含む試料を、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、
－遊離の結合パートナーの存在または量の決定の前に、Fc領域抗体-多重特異性結合剤複合体を試料から枯渇させる工程、ならびに
－多重特異性結合剤が枯渇した試料において（遊離の第1の）結合パートナーの量を決定する工程
を含む。
本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片とのインキュベーションによって、多重特異性結合剤が、試料から除去される/枯渇させられる。同時に、（第1の）結合パートナー-多重特異性結合剤複合体も、試料から除去される。
一つの態様において、多重特異性結合剤は、抗体、抗体もしくは抗体断片と非抗体ポリペプチドとを含む融合ポリペプチド、抗体もしくは抗体断片と可溶性受容体とを含む融合ポリペプチド、または抗体もしくは抗体断片とペプチド性結合分子とを含む融合ポリペプチドより選択される。
一つの態様において、多重特異性結合剤は、抗体である。一つの態様において、抗体は、二重特異性抗体または三重特異性抗体または四重特異性抗体または五重特異性抗体または六重特異性抗体である。一つの態様において、抗体は、二重特異性抗体である。
一つの態様において、結合特異性は、結合部位、または抗体重鎖可変ドメインと抗体軽鎖可変ドメインとの対である。
一つの態様において、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片は、固相にコンジュゲートされる。
一つの態様において、第2の結合パートナーは、ビオチン化され、固相は、ストレプトアビジンによってコーティングされる。一つの態様において、固相は、ストレプトアビジンによってコーティングされた常磁性ビーズまたはストレプトアビジンによってコーティングされたセファロースビーズである。
本明細書において報告される一つの局面は、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片とのインキュベーションおよび形成された複合体の除去によって、結合パートナーの決定の前に、試料から多重特異性結合剤が枯渇させられる、イムノアッセイを使用した、試料中の多重特異性結合剤の結合パートナーの存在および/または量の免疫学的決定の方法である。
本明細書において報告される全てのそれぞれの局面の一つの態様において、結合パートナーは、遊離の結合パートナー、即ち、多重特異性結合剤と結合しておらず、複合体化されていない結合パートナーである。
一つの態様において、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片は、ビオチン化された第2の結合パートナーであり、ストレプトアビジンを介して固相にコンジュゲートされる。
本明細書において報告される方法の一つの態様において、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片は、固相にコンジュゲートされる部位に関して異なる、本明細書において報告される少なくとも2種の抗イディオタイプ抗体および/またはそれらのFc領域結合断片を含む混合物である。一つの態様において、部位は、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片のアミノ酸配列のアミノ酸位置である。
一つの態様において、第1の結合パートナーは、ポリペプチドである。
一つの態様において、第2の結合パートナーは、ポリペプチドである。
一つの態様において、コンジュゲーションは、ポリペプチドのアミノ酸骨格のN末端および/もしくはεアミノ基（リジン）、異なるリジンのεアミノ基、カルボキシ官能基、スルフヒドリル官能基、ヒドロキシル官能基、および/もしくはフェノール官能基、ならびに/またはポリペプチドの炭水化物構造の糖アルコール基を介した化学結合によって実施される。
異なるアミノ基を介したカップリングは、第1の工程において、化学的保護剤によるεアミノ基の一部のアシル化によって、例えば、シトラコニル化によって、実施され得る。第2の工程において、残存するアミノ基を介して、コンジュゲーションが実施される。その後、シトラコニル化が除去され、残存する遊離のアミノ基を介して、結合パートナーが固相上にコンジュゲートされる。即ち、入手された結合パートナーが、シトラコニル化によって保護されていないアミノ基を介して、固相上にコンジュゲートされる。適当な化学的保護剤は、保護されていない側鎖アミンにおいて結合を形成し、N末端における結合より不安定であり、それとは異なる。多くのそのような化学的保護剤が公知である（例えば、EP 0 651 761を参照すること）。一つの態様において、化学的保護剤には、マレイン酸無水物またはシトラコニル酸無水物のような環式ジカルボン酸無水物が含まれる。
一つの態様において、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片は、受動吸着によって固相にコンジュゲートされる。受動吸着は、例えば、Butler,J.E.,in "Solid Phases in Immunoassay"(1996)205-225およびDiamandis,E.P.,and Christopoulos,T.K.(Editors),in "Immunoassay"(1996)Academic Press(San Diego)によって記載されている。
一つの態様において、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片は、特異的結合対を介してコンジュゲートされる（固定化される）。そのような結合対（第1の成分/第2の成分）は、一つの態様において、ストレプトアビジンまたはアビジン/ビオチン、抗体/抗原（例えば、Hermanson,G.T.,et al.,Bioconjugate Techniques,Academic Press(1996)を参照すること）、レクチン/多糖、ステロイド/ステロイド結合タンパク質、ホルモン/ホルモン受容体、酵素/基質、IgG/プロテインAおよび/またはG等より選択される。一つの態様において、第2の結合パートナーは、ビオチンにコンジュゲートされ、固定化は、固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して実施される。
一つの態様において、方法は、以下の工程を含む：
－捕捉抗体-（第1の）抗原複合体を形成させるため、（第1の）抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共に、多重特異性抗体が枯渇した試料をインキュベートする工程、および
－形成された捕捉抗体-（第1の）抗原複合体を、試料中の（第1の）抗原の量と相関させる工程。
一つの態様において、方法は、以下の工程を含む：
－捕捉抗体-（第1の）抗原複合体を形成させるため、（第1の）抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共に、多重特異性抗体が枯渇した試料をインキュベートする工程、
－捕捉抗体およびトレーサー抗体が（第1の）抗原上のオーバーラップしないエピトープに結合するよう、捕捉抗体-（第1の）抗原複合体をトレーサー抗体と共にインキュベートする工程、ならびに
－形成された捕捉抗体-（第1の）抗原-トレーサー抗体複合体を、試料中の抗原の量と相関させる工程。
一つの態様において、方法は、以下の工程を含む：
－捕捉抗体-（第1の）抗原複合体を形成させるため、（第1の）抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共に、多重特異性抗体が枯渇した試料をインキュベートする工程、
－捕捉抗体およびトレーサー抗体が（第1の）抗原上のオーバーラップしないエピトープに結合するよう、捕捉抗体-（第1の）抗原複合体をトレーサー抗体と共にインキュベートする工程、
－検出抗体がトレーサー抗体の可変ドメイン外のエピトープにおいてトレーサー抗体に特異的に結合するよう、捕捉抗体-（第1の）抗原-トレーサー抗体複合体を、検出可能標識を含む検出抗体と共にインキュベートする工程、ならびに
－形成された捕捉抗体-（第1の）抗原-トレーサー抗体複合体を、試料中の（第1の）抗原の量と相関させる工程。
一つの態様において、多重特異性抗体は、第1の抗原または抗原上の第1のエピトープに特異的に結合する第1の結合特異性を有し、かつ第2の抗原または抗原上の第2のエピトープに特異的に結合する第2の結合特異性を有する二重特異性抗体である。
一つの態様において、第1の抗原および第2の抗原は、同一の抗原であり、第1の結合特異性は、抗原上の第1のエピトープに結合し、第2の結合特異性は、抗原上の第2のエピトープに結合し、ここで、第2のエピトープは、第1のエピトープとオーバーラップしないエピトープであり、第1の結合特異性の結合は、第2の結合特異性の結合に干渉しない。
一つの態様において、方法は、
－（第1の）抗原の存在または量の決定の前に、形成された複合体を試料から枯渇させる工程
を含む。
本明細書において報告される一つの局面は、
－（第1の）抗原を含む試料を、二重特異性抗体と本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片との複合体と共にインキュベートする工程
を含む、検出される抗原に多重特異性抗体の第1の結合特異性が特異的に結合することができる、（試料中の）多重特異性抗体の（第1の）抗原の存在および/または量の決定のインビトロの方法である。
一つの態様において、第2の抗原は、標識された第2の抗原である。一つの態様において、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片は、特異的結合対を介して固相に固定化される。一つの態様において、特異的結合対は、ビオチンおよびストレプトアビジンである。
一つの態様において、方法は、
－二重特異性抗体が結合するエピトープと異なるエピトープにおいて第1の抗原に特異的に結合する抗体と共に、第1の工程において形成された複合体をインキュベートする工程
を第2の工程として含む。
本明細書において報告される一つの局面は、
－（第1の）抗原および二重特異性抗体を含む試料を、固相にコンジュゲートされた本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程
を含む、検出される抗原に二重特異性抗体の第1の結合特異性が特異的に結合することができる、二重特異性抗体に複合体化された（試料中の）二重特異性抗体の（第1の）抗原（第1の抗原-二重特異性抗体複合体）の存在および/または量の決定のインビトロの方法である。
一つの態様において、方法は、
－二重特異性抗体が結合するエピトープと異なるエピトープにおいて第1の抗原に特異的に結合する抗体と共に、第1の工程において形成された複合体をインキュベートし、それによって、試料中の二重特異性抗体に複合体化された二重特異性抗体の（第1の）抗原（第1の抗原-二重特異性抗体複合体）の量を決定する工程
を第2の工程として含む。
一つの態様において、方法は、
－（第1の）抗原の存在または量の決定の前に、形成された複合体を試料から枯渇させる工程
を含む。
本明細書において報告される一つの局面は、
－多重特異性抗体、多重特異性抗体と結合した抗原、および遊離の抗原を含む試料を、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程
を含む、検出される抗原に多重特異性抗体の第1の結合特異性が特異的に結合することができる、（試料中の）多重特異性抗体の抗原の存在および/または量の決定のインビトロの方法である。
一つの態様において、方法は、
－抗原および多重特異性抗体を含む試料を、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、ならびに
－多重特異性抗体が枯渇した試料において抗原の量を決定する工程
を含む。
一つの態様において、方法は、
－抗原および多重特異性抗体を含む試料を、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、
－遊離の抗原の存在または量の決定の前に、抗Fc領域抗体-多重特異性抗体複合体を試料から枯渇させる工程、ならびに
－多重特異性抗体が枯渇した試料において抗原の量を決定する工程
を含む。
一つの態様において、試料は、多重特異性抗体、遊離の抗原、および多重特異性抗体-抗原複合体を含み、検出は、多重特異性抗体の遊離の抗原の検出である。
一つの態様において、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片は、常磁性ビーズにコンジュゲートされる。
一つの態様において、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片は、固相にコンジュゲートされる。
一つの態様において、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片は、ビオチン化され、固相は、ストレプトアビジンによってコーティングされる。一つの態様において、固相は、ストレプトアビジンによってコーティングされた常磁性ビーズまたはストレプトアビジンによってコーティングされたセファロースビーズである。
一つの態様において、結合特異性は、結合部位である。一つの態様において、結合部位は、抗体重鎖可変ドメインと抗体軽鎖可変ドメインとの対である。
一つの態様において、方法は、以下の工程を含む：
－多重特異性抗体、多重特異性抗体と結合した抗原、および遊離の抗原を含む試料を、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、ならびに
－試料から抗Fc領域抗体-多重特異性抗体複合体を除去する工程。
一つの態様において、抗Fc領域抗体-多重特異性抗体複合体は、抗Fc領域抗体-多重特異性抗体複合体および抗Fc領域抗体-多重特異性抗体-抗原複合体の混合物である。
一つの態様において、方法は、以下の工程を含む：
－抗Fc領域抗体-多重特異性抗体複合体を形成させるため、抗原および多重特異性抗体を含む試料を、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片と共にインキュベートする工程、
－抗Fc領域抗体-多重特異性抗体複合体を試料から除去する工程、ならびに
－多重特異性抗体が枯渇した試料において抗原の量を決定する工程。
一つの態様において、抗原の量の決定は、以下の工程を含む：
－捕捉抗体-抗原複合体を形成させるため、多重特異性抗体が枯渇した試料を、抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共にインキュベートする工程、および
－形成された捕捉抗体-抗原複合体を試料中の抗原の量と相関させる工程。
一つの態様において、抗原の量の決定は、以下の工程を含む：
－捕捉抗体-抗原複合体を形成させるため、多重特異性抗体が枯渇した試料を、抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共にインキュベートする工程、
－捕捉抗体およびトレーサー抗体が抗原上のオーバーラップしないエピトープに結合するよう、捕捉抗体-抗原複合体をトレーサー抗体と共にインキュベートする工程、ならびに
－形成された捕捉抗体-抗原-トレーサー抗体複合体を試料中の抗原の量と相関させる工程。
一つの態様において、抗原の量の決定は、以下の工程を含む：
－捕捉抗体-抗原複合体を形成させるため、多重特異性抗体が枯渇した試料を、抗原に特異的に結合する捕捉抗体と共にインキュベートする工程、
－捕捉抗体およびトレーサー抗体が抗原上のオーバーラップしないエピトープに結合するよう、トレーサー抗体と共に捕捉抗体-抗原複合体をインキュベートする工程、
－検出抗体がトレーサー抗体の可変ドメイン外のエピトープにおいてトレーサー抗体に特異的に結合するよう、検出可能標識を含む検出抗体と共に捕捉抗体-抗原-トレーサー抗体複合体をインキュベートする工程、ならびに
－形成された捕捉抗体-抗原-トレーサー抗体複合体を試料中の抗原の量と相関させる工程。
一つの態様において、多重特異性抗体は、第1の抗原または抗原上の第1のエピトープに特異的に結合する第1の結合特異性を有し、かつ第2の抗原または抗原上の第2のエピトープに特異的に結合する第2の結合特異性を有する二重特異性抗体である。
本明細書において報告される一つの局面は、多重特異性抗体の第2の結合特異性に結合した抗原の試料からの枯渇のための、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片の使用である。
「治療用抗体」という用語は、ヒト治療薬としての承認のために臨床研究において試験されるかまたは試験されている、疾患の処置のための個体へ投与され得る抗体を示す。一つの態様において、治療用抗体は、モノクローナル抗体である。さらなる態様において、治療用抗体は、ヒト抗体遺伝子座によって形質転換された類人猿もしくは動物から入手されるか、またはヒトモノクローナル抗体であるか、またはヒト化モノクローナル抗体である。一つの態様において、治療用抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。一つの態様において、治療用抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。治療用抗体は、腫瘍学的疾患（例えば、非ホジキンリンパ腫、乳癌、および結腸直腸癌を含む、血液系悪性疾患および固形悪性疾患）、免疫学的疾患、中枢神経疾患、血管疾患、または感染性疾患のような様々な疾患の処置のために広く使用されている。そのような抗体は、例えば、CD19、CD20、CD22、HLA-DR、CD33、CD52、EGFR、G250、GD3、HER2、PSMA、CD56、VEGF、VEGF2、CEA、Levis Y抗原、IL-6受容体（IL6R）、またはIGF-1受容体（IGF1R）に対する抗体である。
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を示す。エピトープは、一般的には、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的活性表面集団からなり、一般的には、エピトープは、特異的な三次元構造的特徴および特異的な電荷特徴を有する。立体構造エピトープおよび非立体構造エピトープは、前者の結合は変性溶媒の存在下で失われるが、後者は失われないという点で区別される。
異なるイムノアッセイの原理は、例えば、Hage,D.S.（Anal.Chem.71(1999)294R-304R）によって記載されている。Lu,B.ら（Analyst 121(1996)29R-32R）は、イムノアッセイにおいて使用するための抗体の定方向の固定化を報告している。アビジン-ビオチンによって媒介されるイムノアッセイは、例えば、Wilchek,M.,and Bayer,E.A.,in Methods Enzymol.184(1990)467-469によって報告されている。
ポリペプチドならびにモノクローナル抗体およびそれらの定常ドメインは、ポリペプチド/タンパク質、ポリマー（例えば、PEG、セルロース、もしくポリスチロール）、または酵素のような結合対のメンバーとのコンジュゲーションのための多数の反応性アミノ酸側鎖を含有している。アミノ酸の化学的反応基は、例えば、アミノ基（リジン、αアミノ基）、チオール基（シスチン、システイン、およびメチオニン）、カルボン酸基（アスパラギン酸、グルタミン酸）、ならびに糖アルコール基である。そのような方法は、例えば、Aslam M.,and Dent,A.,in "Bioconjugation",MacMillan Ref.Ltd.1999,pages 50-100によって記載されている。
ポリペプチドおよび抗体の最も一般的な反応基のうちの一つは、アミノ酸リジンの脂肪族εアミンである。一般に、ほぼ全てのポリペプチドおよび抗体が、豊富なリジンを含有している。リジンアミンは、pH 8.0より上で合理的に優れた求核剤であり（pKa＝9.18）、従って、安定的な結合を形成するため、多様な試薬と容易にクリーンに反応する。アミン反応性試薬は、主として、タンパク質のリジンおよびαアミノ基と反応する。反応性エステル、具体的には、N-ヒドロキシ-スクシニミド（NHS）エステルは、アミン基の修飾のための最も一般に利用される試薬のうちの一つである。水性環境における反応のための最適pHは、pH 8.0～9.0である。イソチオシアネートは、アミン修飾試薬であり、タンパク質とチオ尿素結合を形成する。それらは、水性溶液（最適には、pH 9.0～9.5）においてタンパク質アミンと反応する。アルデヒドは、脂肪族および芳香族のアミン、ヒドラジン、およびヒドラジドと温和な水性条件の下で反応し、イミン中間体（シッフ塩基）を形成する。シッフ塩基は、（水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウムのような）温和なまたは強力な還元剤によって選択的に還元され、安定的なアルキルアミン結合をもたらすことができる。アミンを修飾するために使用されている他の試薬は、酸無水物である。例えば、ジエチレントリアミン五酢酸無水物（DTPA）は、2個のアミン反応性無水物基を含有している二官能性キレート剤である。それは、アミノ酸のN末端基およびεアミン基と反応して、アミド結合を形成することができる。無水物環は、開環して、配位錯体中の金属に強く結合することができる多価の金属キレーティングアームを作出する。
ポリペプチドおよび抗体のもう一つの一般的な反応基は、硫黄含有アミノ酸シスチンおよびその還元生成物システイン（またはシスチンの半分）に由来するチオール残基である。システインは、アミンより求核性であり、一般に、タンパク質において最も反応性の官能基である遊離のチオール基を含有している。チオールは、一般に、中性pHにおいて反応性であり、従って、アミンの存在下で選択的に他の分子とカップリングされ得る。遊離のスルフヒドリル基は、比較的反応性であるため、これらの基を含むタンパク質は、しばしば、ジスルフィド基またはジスルフィド結合として酸化された型でそれらを含んで存在する。そのようなタンパク質において、ジチオスレイトール（DTT）のような試薬によるジスルフィド結合の還元は、反応性の遊離のチオールを生成するために必要とされる。チオール反応性試薬は、ポリペプチド上のチオール基とカップリングして、チオエーテルによってカップリングされた生成物を形成するものである。これらの試薬は、弱酸性～中性のpHにおいて迅速に反応し、従って、アミン基の存在下で選択的に反応させられ得る。文献は、反応性アミノ基を介して複数のスルフヒドリル基を導入する効率的な方式を提供するための、Traut試薬（2-イミノチオラン）、サクシニミジル(アセチルチオ)アセテート（SATA）、およびスルホサクシニミジル6-[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート（Sulfo-LC-SPDP）のようないくつかのチオール化架橋試薬の使用を報告している。ハロアセチル誘導体、例えば、ヨードアセトアミドは、チオエーテル結合を形成し、チオール修飾のための試薬でもある。さらなる有用な試薬はマレイミドである。マレイミドのチオール反応性試薬との反応は、ヨードアセトアミドの場合と本質的に同一である。マレイミドは、弱酸性～中性のpHにおいて迅速に反応する。
ポリペプチドおよび抗体のもう一つの一般的な反応基は、カルボン酸である。ポリペプチドおよび抗体は、C末端位、ならびにアスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖内に、カルボン酸基を含有している。水中のカルボン酸の比較的低い反応性のため、ポリペプチドおよび抗体を選択的に修飾するためにこれらの基を使用することは、一般的に困難である。これが行われる時には、カルボン酸基が、一般的に、水溶性カルボジイミドの使用によって反応性エステルに変換され、アミン、ヒドラジド、またはヒドラジンのような求核試薬と反応させられる。アミンを含有している試薬は、より高度に塩基性のリジンのεアミンの存在下で、活性化されたカルボン酸と選択的に反応し、安定的なアミド結合を形成するため、弱塩基性であるべきである。pHが8.0を超えて上げられる時、タンパク質架橋が起こり得る。
過ヨウ素酸ナトリウムは、抗体に付着した炭水化物モエティ内の糖のアルコール部分をアルデヒドへ酸化するために使用され得る。各アルデヒド基は、カルボン酸について記載されたように、アミン、ヒドラジド、またはヒドラジンと反応させられ得る。炭水化物モエティは、抗体の結晶化可能断片（Fc）領域に主に見出されるため、コンジュゲーションは、抗原結合部位から離れた炭水化物の部位特異的修飾を通して達成され得る。シッフ塩基中間体が形成され、それは、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（温和で選択的）または水素化ホウ素ナトリウム（強力）水溶性還元剤による中間体の還元を通してアルキルアミンへ還元され得る。
「試料」という用語には、生物または元生物に由来する任意の量の物質が含まれるが、これらに限定されるわけではない。そのような生物には、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ、およびその他の動物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。一つの態様において、試料は、サル、特に、カニクイザルまたはウサギまたはマウスまたはラットまたはヒトから入手される。そのような物質には、一つの態様において、臨床的なルーチンにおいて最も広く使用されている試料の起源である、個体由来の全血または血清が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
「固相」という用語は、非液状物質を示し、ポリマー、金属（常磁性、強磁性粒子）、ガラス、およびセラミックのような材料から作成された粒子（微粒子およびビーズを含む）；シリカ、アルミナ、およびポリマーゲルのようなゲル物質；ポリマー、金属、ガラス、および/またはセラミックで作成されていてよい毛細管；ゼオライトおよびその他の多孔性物質；電極；マイクロタイタープレート；固体ストリップ；ならびにキュベット、チューブ、またはその他の分光計試料容器を含む。「固相」は、試料中の物質と相互作用することが意図される少なくとも1個のモエティを表面上に含有しているという点で、固相成分は、不活性固体表面と区別される。固相は、チューブ、ストリップ、キュベット、もしくはマイクロタイタープレートのような静止成分であってもよいし、またはビーズおよび微粒子のような非静止成分であってもよい。タンパク質およびその他の物質の非共有結合性または共有結合性の付着を可能にする多様な微粒子が使用され得る。そのような粒子には、ポリスチレンおよびポリ(メチルメタクリレート)のようなポリマー粒子；金ナノ粒子および金コロイドのような金粒子；ならびにシリカ、ガラス、および金属酸化物粒子のようなセラミック粒子が含まれる。例えば、Martin,C.R.,et al.,Analytical Chemistry-News & Features,70(1998)322A-327AまたはButler,J.E.,Methods 22(2000)4-23を参照すること。
検出可能標識は、一つの態様において、色素原（蛍光性もしくは発光性の基および色素）、酵素、NMR活性基、金属粒子、またはジゴキシゲニンのようなハプテンより選択される。検出可能標識は、光によって活性化可能な架橋基、例えば、アジド基またはアジリン基であってもよい。電気化学発光（electrochemiluminescense）によって検出され得る金属キレートも、一つの態様において、シグナル放射基であり、特に好ましいのは、ルテニウムキレート、例えば、ルテニウム(ビスピリジル)3 2+キレートである。適当なルテニウム標識基は、例えば、EP 0 580 979、WO 90/05301、WO 90/11511、およびWO 92/14138に記載されている。
本明細書において報告されるイムノアッセイおよび方法において使用されるいくつかの化合物は、結合対のメンバーにコンジュゲートされる。コンジュゲーションは、一つの態様において、化合物のアミノ酸骨格のN末端および/もしくはεアミノ基（リジン）、異なるリジンのεアミノ基、カルボキシ官能基、スルフヒドリル官能基、ヒドロキシル官能基、および/もしくはフェノール官能基、ならびに/または化合物の炭水化物構造の糖アルコール基を介した化学結合によって実施される。コンジュゲートされる化合物は、一つの態様において、結合対のメンバーにコンジュゲートされた少なくとも2種の化合物の混合物であり、混合物の少なくとも2種の化合物は、結合対のメンバーにコンジュゲートされる部位に関して異なる。例えば、混合物は、アミノ酸骨格のアミノ酸を介したコンジュゲーションおよび炭水化物の糖アルコール基を介したコンジュゲーションを含み得る。また、例えば、混合物は、アミノ酸骨格の異なるアミノ酸残基を介して結合対のメンバーにコンジュゲートされた化合物を含んでいてもよい。「異なるアミノ酸残基」という表現は、例えば、リジンおよびアスパラギン酸、もしくはチロシンおよびグルタミン酸のような2個の異なる種類のアミノ酸、または化合物のアミノ酸配列内の位置に関して異なるアミノ酸骨格の2個のアミノ酸残基を示す。後者のケースにおいて、アミノ酸は、同一の種類であってもよいし、または異なる種類であってもよい。「部位に関して異なる」という表現は、部位、例えば、アミノ酸もしくは糖アルコール基の種類の違い、または、例えば、化合物が結合対のメンバーにコンジュゲートされているアミノ酸骨格のアミノ酸の数の違いを示す。
「抗イディオタイプ抗体」という用語は、親抗体の結合部位のような結合特異性に特異的に結合する抗体、即ち、例えば、親抗体の抗原結合部位に対する抗体を示す。一つの態様において、抗イディオタイプ抗体は、親抗体のCDRのうちの1個または複数個に特異的に結合する。一つの態様において、親抗体は、治療用抗体である。一つの態様において、親抗体は、多重特異性抗体である。一つの態様において、親抗体は、二重特異性抗体である。
「全」治療用抗体という用語は、抗体が活性型である（即ち、抗原と反応性である）か、不活性型であるか、かつ/または抗原結合型であるかに関係なく、検出される任意の抗体をさす。
「活性型」治療用抗体という用語は、まだ抗原に結合することができる実験動物に存在する治療用抗体に関する。そのような抗体は、例えば、抗原結合部位において抗原またはその他の分子と結合していない。
「抗原結合型」治療用抗体という用語は、抗原に結合している、実験動物の循環血中に存在する治療用抗体を示すために使用される。
前記定義の全治療用抗体、活性型治療用抗体、または抗原結合型治療用抗体は、本発明による方法において直接検出され得る。
さらに、「不活性型」治療用抗体を間接的に査定することも可能である。そのような不活性型治療用抗体は、例えば、抗原と結合した治療用抗体、交差反応性抗原と結合した治療用抗体、または治療用抗体に対する自己抗体によって阻止された治療用抗体である。当業者が認識するように、本発明の開示の助けによって不活性型抗体の画分を査定することが可能である。全抗体が、活性型抗体と抗原結合型抗体との合計を越えている場合、その対応する抗原に結合していない不活性型抗体を含む抗体の付加的な画分が存在するであろう。
一つの好ましい態様において、全治療用抗体は、サンドイッチ型イムノアッセイにおいて検出され、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片が、そのようなサンドイッチアッセイの両側で使用される。そのようなサンドイッチの一方の側において使用される抗体は、固相に結合しているかまたは結合することができ（しばしば、捕捉抗体と呼ばれる）、そのようなサンドイッチの他方の側の抗体は、直接または間接の検出が容易になるよう標識される（いわゆる、検出抗体）。そのようなサンドイッチアッセイ手法において結合した検出抗体の量は、調査されている試料の中の治療用抗体の量と直接相関する。
当技術分野において（例えば、US 2003/0068664）、活性型治療用抗体の検出を可能にするアッセイ系が公知である。そのような系は、抗原の固相への結合、この結合した抗原への治療用抗体の結合、および抗原を介して固相に結合した治療用抗体の検出を必要とする。
試料中の活性型治療用抗体の検出は、便利な最先端技術の手法によって達成され得る。しかしながら、全治療用抗体または抗原に結合した治療用抗体の画分の検出は、相当複雑であり、極めて異なるアッセイセットアップを必要とし、具体的には、異なるアッセイの各々のためのテーラーメイドの試薬を必要とする。本明細書において報告される抗体によれば、相互に類似している試験系において活性型治療用抗体、全治療用抗体、または抗原結合型治療用抗体の画分を査定することが可能である。本来、全治療用抗体、活性型治療用抗体、または抗原結合型治療用抗体のこの種の比較査定は、これらの治療用抗体の様々な画分の間で定量的比較がなされたなら、大きい利点を有するはずである。
サンドイッチ型アッセイフォーマットが、活性型治療用抗体を検出するために（も）セットアップされ得る。一つの好ましい態様において、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片は、捕捉抗体として使用され、そのようなサンドイッチアッセイの検出側は、標識された型の抗原を使用するか、または抗原の結合の後に、治療用抗体によって認識されるエピトープに結合せず競合しない、特異的に検出可能でありかつ/もしくは直接もしくは間接の検出が容易になるよう標識された第2の抗体を使用する。
抗原結合型治療用抗体は、好ましくは、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片を捕捉試薬として使用して、好ましくは、やはりサンドイッチ型アッセイフォーマットにおいて検出される。検出においては、好ましくは、治療用抗体のエピトープと競合しないエピトープにおいて抗原に結合する第2の抗体が使用される。第2の抗体は、好ましくは、直接または間接の検出が容易になるよう標識される。
直接検出のため、標識基は、色素、化学発光基、例えば、アクリジニウムエステルもしくはジオキセタンのような発光標識基、または蛍光色素、例えば、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニン、およびそれらの誘導体のような任意の公知の検出可能マーカー基より選択され得る。標識基のその他の例は、ルテニウムまたはユーロピウムの錯体のような発光金属錯体、例えば、ELISAまたはCEDIAのために使用される酵素（Cloned Enzyme Donor Immunoassay、例えば、EP-A-0 061 888）、および放射性同位体である。
間接検出系は、例えば、検出試薬、例えば、検出抗体が、バイオアフィニティ結合対の第1のパートナーによって標識されることを含む。適当な結合対の例は、ハプテンまたは抗原/抗体、ビオチン、またはアミノビオチン、イミノビオチン、もしくはデスチオビオチンのようなビオチン類似体/アビジンまたはストレプトアビジン、糖/レクチン、核酸または核酸類似体/相補的核酸、および受容体/リガンド、例えば、ステロイドホルモン受容体/ステロイドホルモンである。好ましい第一の結合対メンバーには、ハプテン、抗原、およびホルモンが含まれる。特に好ましいのは、ジゴキシンおよびビオチンのようなハプテンおよびそれらの類似体である。そのような結合対の第2のパートナー、例えば、抗体、ストレプトアビジン等は、一般的に、例えば、前述の標識による直接検出を可能にするため、標識される。
イムノアッセイは当業者に周知である。そのようなアッセイを実施する方法ならびに実際の適用および手法は、関連教科書に要約されている。関連教科書の例は、Tijssen,P.,Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates（in:"Practice and theory of enzyme immunoassays"(1990),pp.221-278,Eds.R.H.Burdon and v.P.H.Knippenberg,Elsevier,Amsterdam）、ならびに免疫学的検出方法を扱っている"Methods in Enzymology"(Eds.S.P.Colowick,N.O.Caplan,Academic Press)の様々な巻、特に、第70巻、第73巻、第74巻、第84巻、第92巻、および第121巻である。
全ての前記の免疫学的検出方法において、利用される試薬の結合、例えば、抗体の対応する抗原との結合を可能にする試薬条件が選択される。当業者は、そのような結合イベントの結果を、複合体という用語を使用することによって呼ぶ。本発明によるアッセイ方法において形成された複合体は、最先端技術の手法によって、治療用抗体の対応する濃度と相関させられる。利用される検出試薬に依って、この相関工程は、全治療用抗体、活性型治療用抗体、または抗原結合型治療用抗体の濃度をもたらすであろう。
当業者が認識するように、本発明による方法は、全治療用抗体、抗原結合型治療用抗体、活性型治療用抗体を明らかにするのみならず、不活性型治療用抗体も明らかにする。異なるアッセイにおける一つの同一の試薬、本明細書において報告される抗体またはそのFc領域結合断片の好ましい使用によって、入手された値を相互に容易に比較することができ、その比を査定することすらできる。さらなる好ましい態様において、本発明は、活性型治療用抗体と全治療用抗体との比に関する。この比は、治療用抗体の効力についての指標として役立つであろう。
D.診断および検出の方法および組成物
ある種の態様において、本明細書において提供される抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体のいずれかは、生物学的試料中の変異P329G（/L234A/L235A）または変異I253A/H310A/H435Aを有するバリアントFc領域を含む治療用抗体の存在を検出するために有用である。「検出する」という用語には、本明細書において使用されるように、定量的または定性的な検出が包含される。ある種の態様において、生物学的試料には、例えば、血清のような生物学的液体が含まれる。
一つの態様において、診断または検出の方法において使用するための抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体が提供される。さらなる局面において、生物学的試料中の変異P329Gまたは変異I253A/H310A/H435Aを有するバリアントFc領域を含む治療用抗体の存在を検出する方法が提供される。ある種の態様において、方法は、抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体の、変異P329Gまたは変異I253A/H310A/H435Aを有するバリアントFc領域を含む治療用抗体との結合を可能にする条件の下で、本明細書に記載される抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体と生物学的試料を接触させる工程、および抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体と変異P329Gまたは変異I253A/H310A/H435Aを有するバリアントFc領域を含む治療用抗体との間に複合体が形成されるか否かを検出する工程を含む。そのような方法は、インビトロまたはインビボの方法であり得る。
ある種の態様において、標識された抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体が提供される。標識には、（蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、および放射標識のような）直接検出される標識またはモエティ、ならびに間接的に、例えば、酵素反応または分子相互作用を通して検出される酵素またはリガンドのようなモエティが含まれるが、これらに限定されるわけではない。例示的な標識には、放射性同位体32P、14C、125I、3H、および131I、希土類キレート、またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンのようなフルオロフォア、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（US 4,737,456）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコース-6-リン酸脱水素酵素、HRPのような色素前駆体を酸化するために過酸化水素を利用する酵素と共役したウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼのような複素環オキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ビオチン/アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル等が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
III.実施例
以下は、本発明の方法および組成物の例である。前記に提供される一般的な説明によって、様々な他の態様が実施され得ることが理解される。
実施例1
材料および方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、以下のものに与えられる：Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。抗体鎖のアミノ酸は、カバットによるナンバリングに従ってナンバリングされ、言及される（Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)）。
組換えDNA技術
Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されるような標準的な方法が、DNAを操作するために使用され得る。分子生物学的試薬は、製造業者の説明に従って使用される。
遺伝子合成
化学合成によって作成されたオリゴヌクレオチドから、所望の遺伝子セグメントを調製することができる。唯一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接していてもよい長い遺伝子セグメントを、PCR増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによって組み立て、その後、示された制限部位を介してクローニングすることができる。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認することができる。
DNA配列決定
二本鎖配列決定によってDNA配列を決定することができる。
DNAおよびタンパク質の配列分析および配列データ管理
GCG（Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin）ソフトウェアパッケージバージョン10.2およびInfomax's Vector NT1 Advanceスイートバージョン8.0を、配列の生成、マッピング、分析、アノテーション、および図示のために使用することができる。
発現ベクター
抗体の発現のため、CMVイントロンAプロモーターを含むかもしくは含まないcDNA構成、またはCMVプロモーターを含むゲノム構成のいずれかに基づく、（例えば、HEK293細胞における）一過性発現のための発現プラスミドを、適用することができる。
抗体発現カセットの他に、ベクターは、以下のものを含有していてもよい：
－大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする複製開始点、および
－大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子。
抗体遺伝子の転写単位は、以下の要素から構成されていてよい：
－5'末端の特有の制限部位、
－ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
－cDNA構成のケースにおけるイントロンA配列、
－ヒト抗体遺伝子に由来する5'非翻訳領域、
－免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－cDNAとしての、またはゲノムエクソン-イントロン構成を有する、それぞれの抗体鎖をコードする核酸、
－ポリアデニル化シグナル配列を含む3'非翻訳領域、ならびに
－3'末端の特有の制限部位。
抗体鎖をコードする融合遺伝子は、PCRおよび/または遺伝子合成によって生成されてもよいし、それぞれのベクターにおいて、例えば、特有の制限部位を使用して、一致する核酸セグメントを接続することによる、公知の組換えの方法および技術によって組み立てられてもよい。サブクローニングされた核酸配列は、DNA配列決定によって確認され得る。一過性トランスフェクションのため、形質転換された大腸菌培養物からのプラスミド調製によって、より大量のプラスミドが調製され得る。
細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.and Yamada,K.M.(eds.),John Wiley & Sons,Inc.に記載されるような標準的な細胞培養技術を使用することができる。
HEK293系における一過性トランスフェクション
一過性発現によって抗体を作製することができる。従って、製造業者の説明書に従って、HEK293系（Invitrogen）を使用して、それぞれのプラスミドによるトランスフェクションを行うことができる。簡単に説明すると、振とうフラスコまたは撹拌発酵槽のいずれかにおいて無血清FreeStyle（商標）293発現培地（Invitrogen）において懸濁培養されたHEK293細胞（Invitrogen）を、それぞれの発現プラスミドと293fectin（商標）またはfectin（Invitrogen）とのミックスによってトランスフェクトすることができる。2Lの振とうフラスコ（Corning）の場合、600mLで1.0*106細胞/mLの密度でHEK293細胞を播種し、120rpm、8％CO2でインキュベートすることができる。翌日、およそ42mLの（A）600μg全プラスミドDNA（1μg/mL）を含む20mL Opti-MEM培地（Invitrogen）と（B）1.2mL 293 fectinまたはfectin（2μl/mL）が補足された20ml Opti-MEM培地との混合物によって、およそ1.5*106細胞/mLの細胞密度で、細胞をトランスフェクトすることができる。グルコース消費に応じて、グルコース溶液を発酵の途中で添加することができる。一般に、5～10日後に、分泌された抗体を含有している上清を採集し、抗体を上清から直接精製するか、または上清を凍結保管することができる。
タンパク質決定
精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度は、Pace,et al.,Protein Science 4(1995)2411-1423によるアミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数を使用して、280nmにおける光学濃度（OD）を決定することによって決定され得る。
上清中の抗体濃度決定
プロテインAアガロースビーズ（Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany）による免疫沈降によって、細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を推定することができる。従って、60μLのプロテインAアガロースビーズを、TBS-NP40（150mM NaClおよび1％Nonidet-P40が補足された50mMトリス緩衝液、pH 7.5）で3回洗浄することができる。その後、1～15mLの細胞培養上清を、TBS-NP40において予め平衡化されたプロテインAアガロースビーズに適用することができる。室温での1時間のインキュベーションの後、ビーズを、Ultrafree-MC-フィルターカラム（Amicon）上で、0.5mLのTBS-NP40で1回、0.5mLの2×リン酸緩衝生理食塩水（2×PBS,Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany）で2回、0.5mLの100mMクエン酸Na緩衝液（pH 5.0）で簡単に4回、洗浄することができる。35μlのNuPAGE（登録商標）LDS試料緩衝液（Invitrogen）の添加によって、結合した抗体を溶出させることができる。試料の半分を、それぞれ、NuPAGE（登録商標）試料還元剤と合わせるか、または還元しないでおき、70℃で10分間加熱することができる。従って、5～30μlを、（非還元SDS-PAGEの場合にはMOPS緩衝液、還元SDS-PAGEの場合にはNuPAGE（登録商標）抗酸化剤ランニング緩衝液添加剤（Invitrogen）を含むMES緩衝液を含む）4～12％NuPAGE（登録商標）Bis-Tris SDS-PAGEゲル（Invitrogen）に適用し、クーマシーブルーによって染色することができる。
アフィニティHPLCクロマトグラフィによって、細胞培養上清中の抗体の濃度を定量的に測定することができる。簡単に説明すると、プロテインAに結合する抗体を含有している細胞培養上清を、Agilent HPLC 1100系で、200mM KH2PO4、100mMクエン酸ナトリウム、pH 7.4で、Applied Biosystems Poros A/20カラムに適用し、200mM NaCl、100mMクエン酸、pH 2.5によって溶出させることができる。UV吸光度およびピーク面積の積分によって、溶出した抗体を定量化することができる。精製された標準IgG1抗体を、標準として用いた。
あるいは、サンドイッチIgG-ELISAによって、細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を測定することができる。簡単に説明すると、StreptaWell High Bind Streptavidin A-96穴マイクロタイタープレート（Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany）を、室温で1時間、あるいは4℃で一晩、0.1μg/mLの100μL/ウェルのビオチン化抗ヒトIgG捕捉分子F(ab')2-抗ヒトFcγ抗体-BI（Dianova）によってコーティングし、その後、200μL/ウェルのPBS、0.05％トゥイーン（PBST,Sigma）で3回洗浄することができる。その後、100μL/ウェルのそれぞれの抗体を含有している細胞培養上清のPBS（Sigma）での希釈系列を、ウェルに添加し、室温でシェーカー上で1～2時間インキュベートすることができる。ウェルを、200μL/ウェルのPBSTで3回洗浄し、室温でシェーカー上で1～2時間インキュベートすることによって、検出抗体としての100μlの0.1μg/mLのF(ab')2-抗ヒトFcγ抗体-POD（Dianova）によって、結合した抗体を検出した。200μL/ウェルのPBSTで3回洗浄することによって、未結合の検出抗体を除去することができる。100μL/ウェルのABTSを添加した後、インキュベートすることによって、結合した検出抗体を検出することができる。405nmの測定波長（参照波長492nm）において、Tecan Fluor Spectrometer上で、吸光度の決定を実施した。
調製用抗体精製
標準的なプロトコルに従って、ろ過された細胞培養上清から抗体を精製することができる。簡単に説明すると、抗体を、プロテインAセファロースカラム（GE Healthcare）に適用し、PBSで洗浄することができる。pH 2.8の直後の中和によって、抗体の溶出を達成することができる。PBS、または150mM NaCl（pH 6.0）を含む20mMヒスチジン緩衝液におけるサイズ排除クロマトグラフィ（Superdex 200,GE Healthcare）によって、単量体抗体から凝集タンパク質を分離することができる。単量体抗体画分をプールし、（必要であれば）例えば、MILLIPORE Amicon Ultra（30 MWCO）遠心濃縮器を使用して濃縮し、-20℃または-80℃で凍結保管することができる。試料の一部を、例えば、SDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）、または質量分析による、その後のタンパク質分析および分析用特徴決定のために提供することができる。
SDS-PAGE
NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲル系（Invitrogen）を、製造業者の説明に従って使用することができる。具体的には、10％もしくは4～12％NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）Bis-TRIS Pre-Castゲル（pH 6.4）およびNuPAGE（登録商標）MES（NuPAGE（登録商標）抗酸化剤ランニング緩衝液添加剤を含む還元ゲル）またはMOPS（非還元ゲル）を使用することができる。
CE-SDS
マイクロ流体Labchipテクノロジー（PerkinElmer,USA）を使用したCE-SDSによって、純度および抗体完全性を分析することができる。従って、5μlの抗体溶液を、製造業者の説明に従ってHT Protein Express Reagent Kitを使用してCE-SDS分析のために調製し、HT Protein Express Chipを使用して、LabChip GXII系において分析することができる。データをLabChip GXソフトウェアを使用して分析することができる。
分析用サイズ排除クロマトグラフィ
抗体の凝集およびオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）を、HPLCクロマトグラフィによって実施することができる。簡単に説明すると、プロテインAによって精製された抗体を、Dionex Ultimate（登録商標）系（Thermo Fischer Scientific）において、300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4緩衝液（pH 7.5）で、Tosoh TSKgel G3000SWカラムに適用するか、またはDionex HPLC-Systemにおいて、2×PBSで、Superdex 200カラム（GE Healthcare）に適用することができる。UV吸光度およびピーク面積の積分によって、溶出した抗体を定量化することができる。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901を標準として用いた。
質量分析
1mg/mlのタンパク質濃度で、17hまで、37℃で、リン酸緩衝液またはトリス緩衝液において、N-グリコシダーゼFによって、抗体を脱グリコシルすることができる。制限LysC（Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany）消化を、それぞれ、室温で120時間、または37℃で40分間、トリス緩衝液（pH 8）において、100μg脱グリコシル抗体によって実施することができる。質量分析の前に、セファデックスG25カラム（GE Healthcare）でのHPLCを介して、試料を脱塩することができる。TriVersa NanoMateソース（Advion）が装備されたmaXis 4G UHR-QTOF MS系（Bruker Daltonik）でのESI-MSを介して、全質量を決定した。
免疫グロブリンの作製
ハイブリドーマ細胞株を、10％FCSおよび一般的に使用される補足剤が補足されたRPMI 1640で、1ml当たり1.0×105～2.2×105細胞の初期細胞密度（生細胞）で播種し、およそ3週間にわたりT-フラスコ（Celline、IBS）において増大させる。培養上清からの抗体の精製を、標準的なタンパク質化学的方法、例えば、Bruck,C.,et al.,Methods Enzymol.121(1986)587-596において報告されたものに従って行う。
ブリッジングADAアッセイ
このワンステップELISAブリッジングアッセイの全ての工程が、室温（RT）で実施され、試料および品質対照は、10％HPS（ヒト血清プール）の存在下で分析された。試料を、ビオチン化捕捉抗体およびジゴキシゲニル化検出抗体（＝治療用抗体）（各1.0μg/ml）を含有しているlow cross buffer（登録商標）で1:10希釈し、RTで、450rpmで振とうしながら一晩インキュベートした。次いで、試料（100μl）を、SAによってコーティングされたMTPに移した。RT（450rpm）での1hのインキュベーションの後、ウェルを3回洗浄した（各300μlの洗浄緩衝液）。100μlのポリクローナル抗Dig-S-Fab-HRPコンジュゲート（25mU/ml）の添加および1hのインキュベーションの後、プレートを再び（300μlの洗浄緩衝液で3回）洗浄した。最後に、1ウェル当たり100μlのABTS基質を添加し、呈色反応を405nm（参照波長490nm）において測光法によって査定した。試料を2回反復で測定し、平均した。2回反復の精度が変動係数（CV）の20％以下であった場合に、その測定値を有効として受け入れた。スクリーニングカット点は、34の個々のブランク血清試料（各々17の男性および女性）を2回反復で分析することによって、Shankarら（Shankar,G.,et al.,J.Pharm.Biomed.Anal.48(2008)1267-1281）に従って決定された。スクリーニングにおいてADA陽性として査定された試料を、一晩のインキュベーションの前に、希釈された試料に添加された未標識の検出抗体（治療用抗体）（333ng/ml）の存在下で再試験することによって、特異性について確認した。
hsFcγRI-PGアッセイ
手法の全ての工程がRTで実施された。試料は1:50の最終希釈率で試験され、全ての試料および品質対照が、2％HPSおよび1μg/mL治療用抗体の存在下で分析された。第1に、100μl/ウェルのbi標識抗PG抗体（2μg/ml）を、SAによってコーティングされたMTPに結合させた。1hのインキュベーション（450rpm）の後、ウェルを、300μlの洗浄緩衝液で3回洗浄した（以後のインキュベーションおよび洗浄の工程は全て同様に実施された）。次いで、1μg/ml治療用抗体を含有しているlow cross buffer（登録商標）において予めインキュベートされた品質対照および試料を、100μl/ウェルの体積で添加した。インキュベーションおよび洗浄の後、100μl/ウェルのdig標識hsFcγRI（可溶性ヒトFcγRI）（0.5μg/ml）を添加し、付加的なインキュベーションおよび洗浄の後、100μl/ウェルのポリクローナル抗Dig-S-Fab-HRPコンジュゲート（50mU/ml）を添加した。前記のインキュベーションおよび洗浄の後、100μl/ウェルのABTS基質を添加した。吸光度を、405nmの波長（参照波長490nm）において測定した。試料を2回反復で分析し平均した。このアッセイのカット点は、2回反復でいずれかの性別の25の個々のブランク血清試料の分析によって評価された。カット点の計算は、Shankarら（Shankar,G.,et al.,J.Pharm.Biomed.Anal.48(2008)1267-1281）によるノンパラメトリックアプローチを使用して実施された。
実施例2
捕捉抗体としての本明細書において報告される抗体
捕捉プレートを作製するため、ビオチン化抗PGLALA Fc領域抗体またはビオチン化抗AAA Fc領域抗体を、それぞれ、ストレプトアビジンによってコーティングされたマルチウェルプレート（SA-MTP）のウェルに結合させた。過剰の未結合抗体を洗浄によって除去した。ヒト血清およびカニクイザル血清（10％最終濃度）に添加された試料/標準抗体を、捕捉プレートによってコーティングされたSA-MTPマルチウェルプレートのウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄の後、ウェルを、ジゴキシゲニル化抗ヒトκ抗体M1.7.10（例えば、参照によって本明細書に組み入れられるWO 2011/048043を参照すること）と共にインキュベートした。洗浄の後、結合したジゴキシゲニル化抗ヒトκ抗体複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）によって標識された抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベートした。もう1回の洗浄工程の後、ABTS溶液をウェルに添加し、インキュベートした。呈色反応の生成物を、405nmの波長（参照波長：490nm）でElisaリーダによって測定した。各試料または標準の吸光値を、3回反復で決定した。
以下の表は、本明細書において報告される抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体M1.3.17（SEQ ID NO:03および04）を捕捉抗体として、血清中の変異P329G、L234A、L235A、I253A、H310A、およびH435Aを有する抗VEGF/ANG2抗体について決定された吸光値を示す。
Figure 2022025063000006
以下の表は、本明細書において報告される異なる抗体を捕捉抗体および検出抗体として使用して、Fc領域に異なる変異を有する異なる特異性の抗体について決定された吸光値を示す。
アッセイB：捕捉抗体：M1.6.22-Bi/M1.7.24-Bi/M1.3.17-Bi
トレーサー抗体：1.7.10-Dig
アッセイC：捕捉抗体：M1.6.22-Bi/M1.7.24-Bi/M1.3.17-Bi
トレーサー化合物：FcγRI-Dig
M1.6.22＝抗AAAバリアントFc領域抗体
M1.7.10＝抗IgG1κ抗体
M1.7.24＝抗PGLALAバリアントFc領域抗体
M1.3.17＝抗PGLALAバリアントFc領域抗体
試料:
（1）抗VEGF/ANG2抗体（変異P329G/L234A/L235A/I253A/H310A/H435Aを有するIgG1サブクラス）
（2）抗VEGF/ANG2抗体（変異P329G/L234A/L235Aを有するIgG1サブクラス）
（3）抗IGF-1R抗体（変異I253A/H310A/H435Aを有するIgG1サブクラス）
（4）抗P-セレクチン抗体（変異S228P/L235Eを有するIgG4サブクラス）
（5）抗VEGF/ANG2抗体（野生型IgG1サブクラス）
Figure 2022025063000007
Figure 2022025063000008
Figure 2022025063000009
Figure 2022025063000010
Figure 2022025063000011
Figure 2022025063000012
アッセイD：捕捉抗体：M1.7.24-Bi/M1.3.17-Bi
トレーサー抗体：1.7.10-Dig/M1.19.31-Dig
M1.7.10＝抗IgG1κ抗体
M1.19.31＝抗IgG1κ抗体
M1.7.24＝抗PGLALAバリアントFc領域抗体
M1.3.17＝抗PGLALAバリアントFc領域抗体
試料:
（6）抗Dig抗体（変異P329G/L234A/L235Aを有するIgG1サブクラス）
Figure 2022025063000013
実施例3
トレーサー抗体としての本明細書において報告される抗体
捕捉プレートを作製するため、ビオチン化抗ヒトκ抗体M1.7.10（例えば、WO 2011/048043を参照すること）を、ストレプトアビジンによってコーティングされたマルチウェルプレート（SA-MTP）のウェルに結合させた。過剰の未結合抗体を洗浄によって除去した。ヒト血清およびカニクイザル血清（10％最終濃度）に添加された試料/標準抗体を、捕捉プレートによってコーティングされたSA-MTPマルチウェルプレートのウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄の後、ウェルを、それぞれ、ジゴキシゲニル化抗PGLALA Fc領域抗体または抗AAA Fc領域抗体と共にインキュベートされた。洗浄の後、結合したジゴキシゲニル化抗ヒトκ抗体複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）によって標識された抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベートした。もう1回の洗浄工程の後、ABTS溶液をウェルに添加した。呈色反応の生成物を、405nmの波長（参照波長：490nm）でElisaリーダによって測定した。各試料または標準の吸光値を3回反復で決定した。
以下の表は、本明細書において報告される抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体M1.7.24（SEQ ID NO:07および08）をトレーサー抗体として、血清中の変異P329G、L234A、L235A、I253A、H310A、およびH435Aを有する抗VEGF/ANG2抗体について決定された吸光値を示す。
Figure 2022025063000014
以下の表は、本明細書において報告される異なる抗体を捕捉抗体および検出抗体として使用して、Fc領域に異なる変異を有する異なる特異性の抗体について決定された吸光値を示す。
アッセイA：捕捉抗体：M1.7.10-Bi
トレーサー抗体：M1.6.22-Dig/M1.7.24-Dig/M1.3.17-Dig
M1.6.22＝抗AAAバリアントFc領域抗体
M1.7.10＝抗IgG1κ抗体
M1.7.24＝抗PGLALAバリアントFc領域抗体
M1.3.17＝抗PGLALAバリアントFc領域抗体
試料:
（1）抗VEGF/ANG2抗体（変異P329G/L234A/L235A/I253A/H310A/H435Aを有するIgG1サブクラス）
（2）抗VEGF/ANG2抗体（変異P329G/L234A/L235Aを有するIgG1サブクラス）
（3）抗IGF-1R抗体（変異I253A/H310A/H435Aを有するIgG1サブクラス）
（4）抗P-セレクチン抗体（変異S228P/L235Eを有するIgG4サブクラス）
（5）抗VEGF/ANG2抗体（野生型IgG1サブクラス）
Figure 2022025063000015
Figure 2022025063000016
Figure 2022025063000017
以下の表は、抗IL2抗体を捕捉抗体として、本明細書において報告される抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体M1.7.24（SEQ ID NO:07および08）をトレーサー抗体として、血清中の変異P329G、L234A、L235A、I253A、H310A、およびH435Aを有するサイトカイン（IL-2）抗体コンジュゲートについて決定された吸光値を示す。
Figure 2022025063000018
実施例4
捕捉抗体およびトレーサー抗体としての本明細書において報告される抗体
捕捉プレートを作製するため、ビオチン化抗PGLALA Fc領域抗体または抗AAA Fc領域抗体を、それぞれ、ストレプトアビジンによってコーティングされたマルチウェルプレート（SA-MTP）のウェルに結合させた。過剰の未結合抗体を洗浄によって除去した。ヒト血清およびカニクイザル血清（10％最終濃度）に添加された試料/標準抗体を、捕捉プレートによってコーティングされたSA-MTPマルチウェルプレートのウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄の後、ウェルを、それぞれ、ジゴキシゲニル化抗PG Fc領域抗体または抗AAA Fc領域抗体と共にインキュベートした。洗浄の後、結合したジゴキシゲニル化抗ヒトκ抗体複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）によって標識された抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベートした。もう1回の洗浄工程の後、ABTS溶液をウェルに添加した。呈色反応の生成物を、405nmの波長（参照波長：490nm）でElisaリーダによって測定した。各試料または標準の吸光値を3回反復で決定した。
以下の表は、本明細書において報告される抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体M1.3.17（SEQ ID NO:03および04）を捕捉抗体として、本明細書において報告される抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体M1.7.24（SEQ ID NO:07および08）をトレーサー抗体として、血清中の変異P329G、L234A、L235A、I253A、H310A、およびH435Aを有する抗VEGF/ANG2抗体について決定された吸光値を示す。
Figure 2022025063000019
実施例5
抗薬物抗体アッセイにおける較正標準としての本明細書において報告される抗体
抗PG Fc領域抗体または抗AAA Fc領域抗体の希釈系列を、それぞれ、標準曲線として調製した。
変異P329G、L234A、L235A、I253A、H310A、およびH435Aを有するビオチン化抗VEGF/ANG2抗体、ならびに変異P329G、L234A、L235A、I253A、H310A、およびH435Aを有するジゴキシゲニル化抗VEGF/ANG2抗体を、室温で一晩、希釈された試料または標準と共にプレインキュベートした。プレインキュベーションの後、試料を、ストレプトアビジンによってコーティングされたマルチウェルプレートに移し、室温で1時間インキュベートした。過剰の未結合抗体を洗浄によって除去した。洗浄工程の後、変異P329G、L234A、L235A、I253A、H310A、およびH435Aを有するビオチン化抗VEGF/ANG2抗体およびジゴキシゲニル化抗VEGF/ANG2抗体ならびに抗PG Fc領域抗体M1.3.17（SEQ ID NO:03および04）または抗薬物抗体を含む結合したジゴキシゲニル化複合体を、それぞれ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）によって標識された抗ジゴキシゲニン抗体によって検出した。洗浄工程の後、それぞれの基質とのインキュベーションによって、形成された複合体の中に存在するHRPが、ABTSの有色生成物への変換を触媒する。シグナルを、405nmの波長（参照波長：490nm）でElisaリーダによって測定した。各血清試料の吸光値を3回反復で決定した。
以下の表は、本明細書において報告される抗バリアント（ヒト）Fc領域抗体M1.3.17（SEQ ID NO:03および04）を標準抗体として、捕捉抗体（ビオチン化）およびトレーサー抗体（ジゴキシゲニル化）としての血清中の変異P329G、L234A、L235A、I253A、H310A、およびH435Aを有する抗VEGF/ANG2抗体について決定された吸光値を示す。
Figure 2022025063000020
実施例6
試料から標的抗体を枯渇させるための本明細書において報告される抗体の使用
Figure 2022025063000021
実施例7
PGLALAAAA抗体の検出における本明細書において報告される抗体
捕捉プレートを作製するため、ビオチン化抗PGLALA Fc領域抗体を、ストレプトアビジンによってコーティングされたマルチウェルプレート（SA-MTP）のウェルに結合させた。過剰の未結合抗体を洗浄によって除去した。ヒト血清およびカニクイザル血清（10％最終濃度）に添加された試料/標準抗体を、捕捉プレートによってコーティングされたSA-MTPマルチウェルプレートのウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄の後、ウェルを、ジゴキシゲニル化抗ヒトκ抗体M1.7.10（例えば、参照によって本明細書に組み入れられるWO 2011/048043を参照すること）と共にインキュベートした。洗浄の後、結合したジゴキシゲニル化抗ヒトκ抗体複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）によって標識された抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベートした。もう一つの洗浄工程の後、ABTS溶液をウェルに添加し、インキュベートした。呈色反応の生成物を、405nmの波長（参照波長：490nm）でElisaリーダによって測定した。各試料または標準の吸光値を3回反復で決定した。
アッセイE：捕捉抗体：M1.7.24-Bi/M1.3.17-Bi
トレーサー抗体：1.7.10-Dig
M1.7.10＝抗IgG1κ抗体
M1.7.24＝抗PGLALAバリアントFc領域抗体
M1.3.17＝抗PGLALAバリアントFc領域抗体
試料:
（1）抗VEGF/ANG2抗体（変異P329G/L234A/L235A/I253A/H310A/H435Aを有するIgG1サブクラス）
（2）抗VEGF/ANG2抗体（変異P329G/L234A/L235Aを有するIgG1サブクラス）
Figure 2022025063000022
実施例8
カニクイザル研究試料の測定－本発明による抗薬物アッセイと従来のブリッジング抗薬物抗体アッセイとの比較
ブリッジングフォーマット抗薬物抗体アッセイ
第1の工程において、ビオチン化エフェクター機能サイレント治療用抗体、エフェクター機能サイレント治療用抗体を使用したヒト研究からの試料、およびジゴキシゲニル化エフェクター機能サイレント治療用抗体を、マイクロタイタープレート（MTP）シェーカー上で室温（RT）で一晩プレインキュベートした（500rpm、捕捉およびトレーサーの最終濃度1μg/ml；試料濃度0～100ng/ml）。第2の工程において、プレインキュベートされた試料を、ストレプトアビジンによってコーティングされたMTP（SA-MTP）に移した。過剰の未結合複合体を、各300μLの緩衝液によって3回洗浄することによって除去した。洗浄の後、複合体に結合したジゴキシゲニル化エフェクター機能サイレント治療用抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体によって検出した（室温での1時間のインキュベーション、500rpmでの振とう）。さらなる洗浄工程（300μL緩衝液で3回）の後、ABTS基質を添加した。シグナルを、405nmの波長（参照波長：490nm）でELISAリーダによって測定した。各血清試料の吸光値を3回反復で決定した。
試料希釈 1:10
カット点 およそ0.06
薬物耐性 低
IgM検出 あり
免疫複合体アッセイフォーマット
第1の工程において、ビオチン化抗PGLALA抗体を、ストレプトアビジンによってコーティングされたマイクロタイタープレート（SA-MTP）に結合させた。過剰の未結合抗体を洗浄によって除去した。ヒト血清における研究からのエフェクター機能サイレント治療用抗体と抗薬物抗体との複合体を含む試料を、ウェルに添加し、1時間インキュベートした。洗浄の後、ウェルをジゴキシゲニル化ヒトFcyRIと共にインキュベートした。洗浄後に、結合したジゴキシゲニル化ヒトFcyRIを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）とコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体によって検出した。さらなる洗浄工程の後、ABTS基質を添加した。シグナルを、405nmの波長（参照波長：490nm）でELISAリーダによって測定した。各血清試料の吸光値を2回反復で決定した。
試料希釈 1:50
カット点 およそ0.18
薬物耐性 高
IgM検出 なし
研究試料分析結果：
Figure 2022025063000023
Figure 2022025063000024
実施例9
標的結合型薬物と全薬物との区別を可能にするための薬物-標的複合体検出のための捕捉試薬としての本明細書において報告される抗体
捕捉プレートを作製するため、0.5μg/mLビオチン化抗PG抗体を、ストレプトアビジンによってコーティングされたマルチウェルプレート（SA-MTP）のウェルに結合させた。過剰の未結合抗体を、洗浄（300μL/ウェルで3回）によって除去した。100μL/ウェルの試料/標準抗体を、捕捉抗体によってコーティングされたSA-MTPマルチウェルプレートのウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。
試料は、PG（LALA）修飾を有する抗標的X抗体（I）および標的Xを、両方とも遊離型および結合型で含む。抗標的抗体（I）は、そのプレートに結合するであろう。
洗浄（300μL/ウェルで3回）の後、ウェルを、100μL/ウェルの0.5μg/mLジゴキシゲニル化抗標的抗体（II）と共にインキュベートした。
抗標的抗体（I）および（II）は、標的Xに同時に結合することができる。
洗浄（300μL/ウェルで3回）の後、結合したジゴキシゲニル化抗標的抗体（II）を、100μL/ウェルの50mU/mL西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）によって標識された抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベートした。もう1回の洗浄工程の後、100μL/ウェルのABTS溶液をウェルに添加した。呈色反応の生成物を、405nmの波長（参照波長：490nm）でElisaリーダによって測定した。各試料または標準の吸光値を3回反復で決定した。
薬物と標的との複合体のみが、アッセイにおいてシグナルを生成するであろう（結合型薬物）。
全薬物を得るため、そのアッセイにおける測定の前に、全ての利用可能な薬物分子を標的結合型薬物へ変換するため、過剰の標的と共に試料をプレインキュベートすることも可能である。
このアッセイのスキームについては、図6を参照すること。
以上、理解の明確のため、例示および例によってある程度詳細に本発明を説明したが、説明および例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用された全ての特許文献および科学文献の開示は、参照によってその全体が明示的に組み入れられる。

Claims (11)

  1. （a）SEQ ID NO:09または10のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:12、13、または14のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:16、17、または18のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:23または24のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:28、29、または30のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、単離された抗体。
  2. （a）SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、単離された抗体。
  3. モノクローナル抗体である、請求項1～2のいずれか一項記載の抗体。
  4. ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項1～3のいずれか一項記載の抗体。
  5. 抗体断片である、請求項1または4のいずれか一項記載の抗体。
  6. 請求項1～5のいずれか一項記載の抗体をコードする単離された核酸。
  7. 請求項6記載の核酸を含む宿主細胞。
  8. 抗体が産生されるように、請求項7記載の宿主細胞を培養する工程を含む、抗体を作製する方法。
  9. 請求項1～5のいずれか一項記載の抗体および検出可能標識を含むコンジュゲート。
  10. 試料中のFc領域に変異P329Gまたは変異P329G/L234A/L235Aまたは変異I253A/H310A/H435Aを含むIgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスの治療用抗体の測定のための、捕捉抗体またはトレーサー抗体のいずれかとしての、イムノアッセイにおける請求項1～5のいずれか一項記載の抗体の使用。
  11. 試料中の変異I253A/H310A/H435Aを含むIgG1サブクラスまたはIgG4サブクラスの治療用抗体の測定のための、捕捉抗体およびトレーサー抗体としての、イムノアッセイにおける請求項1および3～5のいずれか一項記載の抗体の使用であって、捕捉抗体およびトレーサー抗体がHVR配列において異なっている、使用。
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