KR20230025667A - 프로테아제 활성화된 t 세포 이중특이성 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 새로운 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 및 이디오타입 특이적 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 및 이디오타입 특이적 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 및 이디오타입 특이적 폴리펩티드의 생산 방법 및 질환의 치료에서 이들 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 및 이디오타입 특이적 폴리펩티드의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

프로테아제 활성화된 T 세포 이중특이성 항체
본 발명은 일반적으로 분자의 항원 결합을 가역적으로 마스킹하는 항-이디오타입-결합 모이어티를 포함하는, 새로운 프로테아제-활성화가능 항원 결합 분자에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 프로테아제에 의해 절단될 때까지 CD3-결합 모이어티를 마스킹하는 항-이디오타입-결합 모이어티를 갖는 T 세포 결합 분자에 관한 것이다. 이것은 CD3-결합 모이어티가 종양, 예를 들어, 종양 침윤 T 세포와 같은 표적 조직에 근접할 때까지 접근 불가능하거나 "마스킹"되도록 한다. 또한, 본 발명은 이러한 프로테아제 활성화된 T 세포 결합 분자 및 이디오타입 특이적 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 프로테아제 활성화된 T 세포 결합 분자를 생산하는 방법 및 예를 들어 질환의 치료에서 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
다양한 임상 환경에서 개별 표적 세포 또는 특정 표적 세포 유형을 선택적으로 파괴하는 것이 종종 바람직하다. 예를 들어, 암 치료의 주요 목표는 종양 세포를 특이적으로 파괴하면서 건강한 세포와 조직을 손상되지 않은 상태로 남겨두는 것이다.
이를 달성하는 좋은 방법은 종양에 대한 면역 반응을 유도하여 자연 살해(NK) 세포 또는 세포독성 T 림프구(CTL)와 같은 면역 효과기 세포가 종양 세포를 공격하고 파괴하도록 하는 것이다. 이와 관련하여, 최근 몇 년간 표적 세포의 표면 항원에 하나의 "팔"로 결합하고 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 활성화 불변 성분에 두 번째 "팔"로 결합하도록 설계된 이중특이성 항체가 관심의 대상이 되었다. 이러한 항체의 두 표적 모두에 대한 동시 결합은 표적 세포와 T 세포 사이에 일시적인 상호작용을 강제하여 임의의 세포독성 T 세포를 활성화시키고 후속하여 표적 세포를 용해시킬 것이다. 따라서 면역 반응은 표적 세포로 재지시되고 표적 세포에 의한 펩티드 항원 제시 또는 CTL의 정상적인 MHC 제한 활성화와 관련된 T 세포의 특이성과 무관하다.
이러한 맥락에서 CTL은 표적 세포에 매우 근접한 경우, 즉, 면역학적 시냅스가 모방되는 경우에만 활성화되는 것이 중요하다. 표적 세포의 효율적인 용해를 유도하기 위해 림프구 전처리 또는 공동 자극을 필요로 하지 않는 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 특히 바람직하다. 여러 이중특이성 항체 형식이 개발되었으며 T 세포 매개 면역요법에 대한 적합성을 조사하였다. 여기에는 BiTE(이중특이성 T 세포 인게이저) 분자(Nagorsen and B
Figure pct00001
uerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)), 디아바디(Holliger 외, Prot Eng 9, 299-305 (1996)) 및 이의 유도체, 예를 들어, 탠덤 디아바디(Kipriyanov 외, J Mol Biol 293, 41-66 (1999)), DART(이중 친화성 재표적화) 분자(Moore 외, Blood 117, 4542-51 (2011)) 및 트리오맙(Seimetz 외, Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010))이 포함된다.
치료에 적합한 이중특이성 분자를 생성하는 작업은 충족되어야 하는 효능, 독성, 적용 가능성 및 생산 가능성과 관련된 몇 가지 기술적 과제를 제공한다. 이중특이성 분자가 비표적 조직에서도 발현되는 표적 세포, 예를 들어, 암 세포 상의 항원을 표적으로 하는 경우, 독성이 발생할 수 있다. 따라서, 표적 세포의 존재시에는 완전한 T 세포 활성화를 일으키지만 정상 세포 또는 조직의 존재시에는 그러하지 않은 효과적인 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 필요하다.
본 발명은 일반적으로 표적 세포의 존재시 선택적으로 활성화되는 T 세포 활성화 이중특이성 분자에 관한 것이다.
한 양상에서, 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 제공된다:
(a) 다음을 포함하는, CD3에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 모이어티:
(i) 서열번호 2의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 4의 HCDR 2 및 서열번호 10의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및
(ii) 서열번호 20의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 21의 LCDR 2 및 서열번호 22의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(b) 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 모이어티; 및
(c) 제1 항원 결합 모이어티의 이디오타입에 결합할 수 있고, 이로써 제1 또는 제2 항원 결합 모이어티를 가역적으로 은폐할 수 있는, 프로테아제-절단가능 링커를 통해 T 세포 이중특이성 결합 분자에 공유적으로 부착된 마스킹 모이어티(masking moiety).
한 양상에서, VH는 서열번호 16에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나 VL은 서열번호 23의 아미노산 서열에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
한 양상에서, 마스킹 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티에 공유적으로 부착되어 제1 항원 결합 모이어티를 가역적으로 은폐한다.
한 양상에서, 마스킹 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티의 중쇄 가변 영역에 공유적으로 부착된다.
한 양상에서, 마스킹 모이어티는 항-이디오타입 scFv이다.
한 양상에서, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역들이 교환된 교차 Fab 분자이다.
한 양상에서, 제1 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다.
한 양상에서, CD3에 결합할 수 있는 1개 이하의 항원 결합 모이어티를 포함하는, 상기 본원에 기재된 바와 같은 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 제공된다.
한 양상에서, 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 Fab 분자인 제3 항원 결합 모이어티를 포함하는, 상기 본원에 기재된 바와 같은 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 제공된다.
한 양상에서, 제3 항원 결합 모이어티는 제2 항원 결합 모이어티와 동일하다.
한 양상에서, 제2 항원 결합 모이어티는 FolR1 및 TYRP1로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 세포 항원에 결합할 수 있다.
한 양상에서, 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 서로 융합된다.
한 양상에서, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다.
한 양상에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다.
한 양상에서, 안정한 회합이 가능한 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함하는, 상기 본원에 기재된 바와 같은 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 제공된다.
한 양상에서, Fc 도메인은 IgG, 구체적으로 IgG1 또는 IgG4, Fc 도메인이다.
한 양상에서, Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다.
한 양상에서, 마스킹 모이어티는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) DYSMN(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) WINTETGEPRYTDDFKG(서열번호 59), WINTETGEPRYTDDFTG(서열번호 84) 및 WINTETGEPRYTQGFKG(서열번호 86)로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR H2 아미노산 서열;
(c) EGDYDVFDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(d) RASKSVSTSSYSYMH(서열번호 62) 및 KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) YVSYLES(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHSREFPYT(서열번호 64) 및 QQSREFPYT(서열번호 88)로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR L3 아미노산 서열.
한 양상에서, 마스킹 모이어티는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) DYSMN(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) WINTETGEPRYTDDFKG(서열번호 59)의 CDR H2 아미노산 서열;
(c) EGDYDVFDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(d) RASKSVSTSSYSYMH(서열번호 62)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) YVSYLES(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHSREFPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열.
한 양상에서, 마스킹 모이어티는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) SYGVS(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) IIWGDGSTNYHSALIS(서열번호 59)의 CDR H2 아미노산 서열;
(c) GITTVVDDYYAMDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(d) KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) AATFLAD(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHYYSTPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열.
한 양상에서, 마스킹 모이어티는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) SYGVS(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) WINTETGEPRYTDDFTG(서열번호 84)의 CDR H2 아미노산 서열;
(c) GITTVVDDYYAMDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(d) KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) AATFLAD(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHYYSTPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열.
한 양상에서, 마스킹 모이어티는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) SYGVS(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) WINTETGEPRYTQGFKG(서열번호 86)의 CDR H2 아미노산 서열;
(c) GITTVVDDYYAMDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(d) KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) AATFLAD(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHYYSTPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열.
한 양상에서, 프로테아제-절단가능 링커는 최소 하나의 프로테아제 인식 서열을 포함한다.
한 양상에서, 프로테아제 인식 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) RQARVVNG(서열번호 100);
(b) VHMPLGFLGPGRSRGSFP(서열번호 101);
(c) RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(서열번호 102);
(d) RQARVVNGVPLSLYSG(서열번호 103);
(e) PLGLWSQ(서열번호 104);
(f) VHMPLGFLGPRQARVVNG(서열번호 105);
(g) FVGGTG(서열번호 106);
(h) KKAAPVNG(서열번호 107);
(i) PMAKKVNG(서열번호 108);
(j) QARAKVNG(서열번호 109);
(k) VHMPLGFLGP(서열번호 110);
(l) QARAK(서열번호 111);
(m) VHMPLGFLGPPMAKK(서열번호 112);
(n) KKAAP(서열번호 113); 및
(o) PMAKK(서열번호 114), 이때 X는 임의의 아미노산이다.
한 양상에서, 프로테아제 절단가능 링커는 프로테아제 인식 서열 PMAKK(서열번호 114)를 포함한다.
한 양상에서, 제2 항원 결합 모이어티는 FolR1에 결합할 수 있고 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
a) NAWMS(서열번호 54)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
b) RIKSKTDGGTTDYAAPVKG(서열번호 55)의 CDR H2 아미노산 서열; 및
c) PWEWSWYDY(서열번호 56)의 CDR H3 아미노산 서열; 및 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
d) GSSTGAVTTSNYAN(서열번호 20)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
e) GTNKRAP(서열번호 21)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
f) ALWYSNLWV(서열번호 22)의 CDR L3 아미노산 서열.
한 양상에서, 제2 항원 결합 모이어티는 TYRP1에 결합할 수 있고 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
a) DYFLH(서열번호 24)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
b) WINPDNGNTVYAQKFQG(서열번호 25)의 CDR H2 아미노산 서열; 및
c) RDYTYEKAALDY(서열번호 26)의 CDR H3 아미노산 서열; 및 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
d) RASGNIYNYLA(서열번호 28)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
e) DAKTLAD(서열번호 29)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
f) QHFWSLPFT(서열번호 30)의 CDR L3 아미노산 서열.
또 다른 양상에서, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 상기 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) DYSMN(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) WINTETGEPRYTDDFKG(서열번호 59), WINTETGEPRYTDDFTG(서열번호 84) 및 WINTETGEPRYTQGFKG(서열번호 86)로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR H2 아미노산 서열;
(c) EGDYDVFDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(d) RASKSVSTSSYSYMH(서열번호 62) 및 KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) YVSYLES(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHSREFPYT(서열번호 64) 및 QQSREFPYT(서열번호 88)로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR L3 아미노산 서열.
한 양상에서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) DYSMN(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) WINTETGEPRYTDDFKG(서열번호 59)의 CDR H2 아미노산 서열;
(c) EGDYDVFDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(d) RASKSVSTSSYSYMH(서열번호 62)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) YVSYLES(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHSREFPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열.
한 양상에서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) SYGVS(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) IIWGDGSTNYHSALIS(서열번호 59)의 CDR H2 아미노산 서열;
(c) GITTVVDDYYAMDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(d) KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) AATFLAD(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHYYSTPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열.
한 양상에서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) SYGVS(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) WINTETGEPRYTDDFTG(서열번호 84)의 CDR H2 아미노산 서열;
(c) GITTVVDDYYAMDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(d) KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) AATFLAD(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHYYSTPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열.
한 양상에서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) SYGVS(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) WINTETGEPRYTQGFKG(서열번호 86)의 CDR H2 아미노산 서열;
(c) GITTVVDDYYAMDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(d) KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) AATFLAD(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHYYSTPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열.
한 양상에서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 항-이디오타입 scFv이다.
한 양상에서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 링커를 통해 분자에 공유적으로 부착된다.
한 양상에서, 링커는 펩티드 링커이다.
한 양상에서, 링커는 프로테아제-절단가능 링커이다.
한 양상에서, 펩티드 링커는 적어도 하나의 프로테아제 인식 부위를 포함한다.
한 양상에서, 프로테아제 인식 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) RQARVVNG(서열번호 100);
(b) VHMPLGFLGPGRSRGSFP(서열번호 101);
(c) RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(서열번호 102);
(d) RQARVVNGVPLSLYSG(서열번호 103);
(e) PLGLWSQ(서열번호 104);
(f) VHMPLGFLGPRQARVVNG(서열번호 105);
(g) FVGGTG(서열번호 106);
(h) KKAAPVNG(서열번호 107);
(i) PMAKKVNG(서열번호 108);
(j) QARAKVNG(서열번호 109);
(k) VHMPLGFLGP(서열번호 110);
(l) QARAK(서열번호 111);
(m) VHMPLGFLGPPMAKK(서열번호 112);
(n) KKAAP(서열번호 113); 및
(o) PMAKK(서열번호 114), 이때 X는 임의의 아미노산이다.
한 양상에서, 프로테아제 절단가능 링커는 프로테아제 인식 서열 PMAKK(서열번호 114)를 포함한다.
한 양상에서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 T-세포 활성화 이중특이성 분자의 일부이다.
또 다른 양상에서, 상기 기재된 바와 같은 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 또는 상기 기재된 바와 같은 이디오타입 특이적 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
또 다른 양상에서, 상기 기재된 바와 같은 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 항원 결합 분자 또는 상기 기재된 바와 같은 이디오타입 특이적 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
한 양상에서, 상기 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터가 제공된다.
한 양상에서, 상기 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 상기 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
또 다른 양상에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 a) 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 발현에 적합한 조건하에 본원에 전술한 숙주 세포를 배양하는 단계 및 b) 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 회수하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 약제로서 사용하기 위한, 상기 기재된 바와 같은 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자, 상기 기재된 바와 같은 이디오타입 특이적 폴리펩티드 또는 상기 기재된 바와 같은 약학 조성물이 제공된다.
한 양상에서, 약제는 개체에서 암의 치료 또는 진행 지연, 또는 면역 관련 질환의 치료 또는 진행 지연, 또는 면역 반응 또는 기능의 향상 또는 자극을 위한 것이다.
또 다른 양상에서, 질환 치료용 약제의 제조를 위한, 상기 기재된 바와 같은 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 또는 상기 기재된 바와 같은 이디오타입 특이적 폴리펩티드의 용도가 제공된다.
한 양상에서, 질환은 암이다.
또 다른 양상에서, 개체의 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 상기 기재된 바와 같은 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
한 양상에서, 상기 방법은 개체에서 암의 치료 또는 진행 지연, 또는 면역 관련 질환의 치료 또는 진행 지연, 또는 면역 반응 또는 기능의 향상 또는 자극을 위한 것이다.
도 1. 본 발명의 (다중특이성) 항체의 예시적인 구조. (a, d) "1+1 CrossMab" 분자의 도시. (b, e) 다른 순서의 Crossfab 및 Fab 구성요소를 갖는("역전") "2+1 IgG Crossfab" 분자의 도시. (c, f) "2+1 IgG Crossfab" 분자의 도시. (g, k) 다른 순서의 Crossfab 및 Fab 구성요소를 갖는("역전") "1+1 IgG Crossfab" 분자의 도시. (h, l) "1+1 IgG Crossfab" 분자의 도시. (i, m) 두 개의 CrossFab를 갖는 "2+1 IgG Crossfab" 분자의 도시. (j, n) 2개의 CrossFab 및 다른 순서의 Crossfab 및 Fab 구성요소를 갖는("역전") "2+1 IgG Crossfab" 분자의 도시. (o, s) "Fab-Crossfab" 분자의 도시. (p, t) "Crossfab-Fab" 분자의 도시. (q, u) "(Fab)2-Crossfab" 분자의 도시. (r, v) "Crossfab-(Fab)2" 분자의 도시. (w, y) "Fab-(Crossfab)2" 분자의 도시. (x, z) "(Crossfab)2-Fab" 분자의 도시. 검은 점: 이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인의 선택적 변형. ++, --: CH1 및 CL 도메인에 선택적으로 도입된 반대 전하의 아미노산. Crossfab 분자는 VH 및 VL 영역의 교환을 포함하는 것으로 도시되지만, CH1 및 CL 도메인에 전하 변형이 도입되지 않은 양상들에서- 대안적으로 CH1 및 CL 도메인의 교환을 포함할 수 있다.
도 2. (A) 실시예에서 사용된 T-세포 이중특이성 항체(TCB) 분자의 개략도. 테스트된 모든 TCB 항체 분자는 전하 변형(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, 표적 세포 항원 결합제에서 전하 변형, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K)이 있는 "역전된, 2+1 IgG CrossFab"로 생성되었다. (B 내지 E) TCB 조립을 위한 구성요소: CH1 및 CL에 전하 변형이 있는 항-TYRP1 Fab 분자의 경쇄(B), 항-CD3 교차 Fab 분자의 경쇄(C), Fc 영역에 놉 및 PG LALA 돌연변이가 있는 중쇄(D), Fc 영역에 홀 및 PG LALA 돌연변이가 있는 중쇄(E).
도 3. 실시예 3에서 사용된 표면 플라즈몬 공명(SPR) 설정의 개략도. C1 센서칩에 커플링된 항-PG 항체. 인간 및 사이노몰구스 CD3(Fc 영역에 융합됨)을 표면 위로 통과시켜 TCB의 항-CD3 항체와 CD3의 상호작용을 분석한다.
도 4. 최적화된 항-CD3 항체를 포함하는 TCB를 표적 세포로서 CHO-K1 TYRP1 클론 76을 사용하여 Jurkat NFAT 리포터 분석에서 테스트했다. CD3orig를 포함하는 TCB와 비교했다. Jurkat NFAT 리포터 세포의 활성화는 처리 후 4시간(A) 및 24시간(B) 후 발광을 측정하여 결정되었다.
도 5. 최적화된 항-CD3 항체 또는 모 결합제 CD3orig를 함유하는 TCB로 처리된 경우, 건강한 공여자로부터의 PBMC를 사용한 흑색종 세포주 M150543의 종양 세포 사멸을 평가하였다. 종양 세포 사멸은 24시간(A) 및 48시간(B) 후 LDH 방출의 정량화에 의해 측정되었다.
도 6. 표적 세포로서 M150543 흑색종 세포주의 존재시 최적화된 항-CD3 항체 또는 모 결합제 CD3orig를 함유하는 TCB로 처리된 건강한 공여자로부터 얻은 PBMC에 대한 CD8 T 세포(A, B) 및 CD4 T 세포(C, D)에서의 CD25 및 CD69 상향조절을 분석하였다. 분석은 48시간 후 유동 세포 분석에 의해 수행되었다.
도 7. 종양 표적 세포의 부재시 최적화된 항-CD3 항체 또는 모 결합제 CD3orig를 함유하는 TCB로 처리된 건강한 공여자로부터 얻은 PBMC에 대한 CD8(A) 및 CD4 T 세포(B) 상의 CD25 발현을 분석하였다. 분석은 48시간 후 유동 세포 분석에 의해 수행되었다.
도 8. (A) 실시예 19에서 생성된 1가 IgG 분자의 개략도. 1가 IgG 분자는 CD3 결합제에 VH/VL 교환을 갖는 인간 IgG1으로서 생산되었다. (B-E) 1가 IgG 조립을 위한 구성요소: 항-CD3 교차 Fab 분자의 경쇄(B), Fc 영역에 놉 및 PG LALA 돌연변이가 있는 중쇄(C), Fc 영역에 홀 및 PG LALA 돌연변이가 있는 중쇄(D).
도 9. (A): (G4S)2 링커(L1)를 통해 내부 FOLR1 Fab의 VH에 융합된 CD3 Fab를 가진 고전적인 2+1 TCB 분자. 놉-인투-홀 기술에 의한 이종이량체화, Fc 내 PGLALA 돌연변이. (B): CD3 항-이디오타입 scFv(VH-VL 방향)가 CD3 VH에 융합된 FOLR1 proTCB. 링커(L2; 총 33개 aa)는 특정 프로테아제 절단가능한 서열을 포함한다. scFv의 VH와 VL 사이의 (G4S)4 링커(L3). (C): B에서와 동일한 proTCB이지만 scFv와 CD3 Fab 사이의 링커에 프로테아제 절단 부위가 없다. 분자의 경쇄는 각 Fab에서 동일하다(공통 경쇄).
도 10. (A): 다양한 CD3 결합제를 포함하는 TYRP1 TCB에 의해 매개되는 Jurkat NFAT 활성화. 다양한 CD3 결합제를 가진 TYRP1 TCB에 의해 매개되는 Jurkat NFAT 활성화. TYRP1 TCB(이전 분석에서 결정된 EC90 농도로 사용됨)를 37℃에서 22시간 동안 TYRP1 양성 표적 세포(CHO-huTYRP1 클론 76) 및 Jurkat NFAT 효과기 세포(E:T 2.5:1)와 함께 인큐베이션했다. 점선은 TCB 없이 표적 세포와 함께 배양된 Jurkat NFAT 활성화를 보여준다. DP47 비표적화 TCB를 음성 대조군으로 사용했다. 각 점은 삼중의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다.
(B): TYRP1 TCB에 의해 매개되는 Jurkat NFAT 활성화의 감소에 의해 측정된 항-이디오타입 4.24.72 IgG의 차단 능력. 다양한 CD3 결합제를 가진 TYRP1 TCB에 의해 매개되는 Jurkat NFAT 활성화. TYRP1 TCB(이전 분석에서 결정된 EC90 농도로 사용됨)를 37℃에서 22시간 동안 TYRP1 양성 표적 세포(CHO-huTYRP1 클론 76) 및 Jurkat NFAT 효과기 세포(E:T 2.5:1)와 함께 인큐베이션했다. 항-이디오타입(항-ID) 4.24.72 IgG에 의한 CD3 결합제의 용량 의존적 차단이 표시된다. 각 점은 삼중의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다. 점선은 TCB 없이 표적 세포와 함께 배양된 Jurkat NFAT 활성화를 보여준다. DP47 비표적화 TCB를 음성 대조군으로 사용했다. EC-50 값의 계산을 위해, 비선형 적합 "log(작용제) 대 반응 -- 가변 기울기(4개의 매개변수)"가 계산되었다(GraphPad Prism6).
(C): TYRP1 TCB에 의해 매개되는 Jurkat NFAT 활성화의 감소에 의해 측정된 항-ID 4.32.63 IgG의 차단 능력. 다양한 CD3 결합제를 가진 TYRP1 TCB에 의해 매개되는 Jurkat NFAT 활성화. TYRP1 TCB(이전 분석에서 결정된 EC90 농도로 사용됨)를 37℃에서 22시간 동안 TYRP1 양성 표적 세포(CHO-huTYRP1 클론 76) 및 Jurkat NFAT 효과기 세포(E:T 2.5:1)와 함께 인큐베이션했다. 4.32.63 IgG에 의한 CD3 결합제의 용량 의존적 차단이 표시된다. 각 점은 삼중의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다. 점선은 TCB 없이 표적 세포와 함께 배양된 Jurkat NFAT 활성화를 보여준다. DP47 비표적화 TCB를 음성 대조군으로 사용했다. EC-50 값의 계산을 위해, 비선형 적합 "log(작용제) 대 반응 -- 가변 기울기(4개의 매개변수)"가 계산되었다(GraphPad Prism6).
(D): TYRP1 TCB에 의해 매개되는 Jurkat NFAT 활성화의 감소에 의해 측정된 항-ID 4.15.64 IgG의 차단 능력. 다양한 CD3 결합제를 가진 TYRP1 TCB에 의해 매개되는 Jurkat NFAT 활성화. TYRP1 TCB(이전 분석에서 결정된 EC90 농도로 사용됨)를 37℃에서 22시간 동안 TYRP1 양성 표적 세포(CHO-huTYRP1 클론 76) 및 Jurkat NFAT 효과기 세포(E:T 2.5:1)와 함께 인큐베이션했다. 4.15.64 IgG에 의한 CD3 결합제의 용량 의존적 차단이 표시된다. 각 점은 삼중의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다. 점선은 TCB 없이 표적 세포와 함께 배양된 Jurkat NFAT 활성화를 보여준다. DP47 비표적화 TCB를 음성 대조군으로 사용했다. EC-50 값의 계산을 위해, 비선형 적합 "log(작용제) 대 반응 -- 가변 기울기(4개의 매개변수)"가 계산되었다(GraphPad Prism6).
(E): TYRP1 TCB에 의해 매개되는 Jurkat NFAT 활성화의 감소에 의해 측정된 항-ID 4.21 IgG의 차단 능력. 다양한 CD3 결합제를 가진 TYRP1 TCB에 의해 매개되는 Jurkat NFAT 활성화. TYRP1 TCB(이전 분석에서 결정된 EC90 농도로 사용됨)를 37℃에서 22시간 동안 TYRP1 양성 표적 세포(CHO-huTYRP1 클론 76) 및 Jurkat NFAT 효과기 세포(E:T 2.5:1)와 함께 인큐베이션했다. 4.21 IgG에 의한 CD3 결합제의 용량 의존적 차단이 표시된다. 각 점은 삼중의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다. 점선은 TCB 없이 표적 세포와 함께 배양된 Jurkat NFAT 활성화를 보여준다. DP47 비표적화 TCB를 음성 대조군으로 사용했다. EC-50 값의 계산을 위해, 비선형 적합 "log(작용제) 대 반응 -- 가변 기울기(4개의 매개변수)"가 계산되었다(GraphPad Prism6).
도 11. (a): 다양한 CD3 결합제를 가진 FOLR1 TCB 또는 FOLR1 pro-TCB에 의해 매개되는 Jurkat NFAT 활성화. FOLR1(pro-)TCB를 huFOLR1 코팅된 비드 및 Jurkat NFAT 효과기 세포와 함께 37℃에서 5-6시간 동안 인큐베이션했다. 항-ID 마스크 4.24.72를 가진 FOLR1 pro-TCB는 표시된 농도 범위에서 Jurkat NFAT 활성화를 매개하지 않는다. 그러나 FOLR1 TCB는 용량 의존적 Jurkat NFAT 활성화를 매개한다. 각 점은 삼중의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다. 점선은 TCB 없이 표적 세포와 함께 배양된 Jurkat NFAT 활성화를 보여준다.
(b): 용량 의존적 표적 세포 사멸(매우 높은 FOLR1 발현을 갖는 HeLa 세포)은 huPBMC, TCB 및 FOLR1 양성 표적 세포(E:T = 10:1, 효과기는 인간 PBMC임)를 48시간 인큐베이션한 후에 측정되었다. FOLR1 TCB 및 활성화된 FOLR1 pro-TCB는 약 0.29pM의 EC50으로 용량 의존적 표적 세포 사멸을 유도한다. 절단불가능 링커를 함유하는 마스킹된 FOLR1 pro-TCB(CD3 P035.093, 마스크 4.24.72 scFv)는 EC50 값을 비교할 때 약 239배의 표적 세포 용해 감소를 나타낸다. 각 점은 삼중의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다. 점선은 TCB 없이 huPBMC와 함께 인큐베이션된 표적 세포의 자발적 방출을 보여준다. EC-50 값의 계산을 위해, 비선형 적합 "log(작용제) 대 반응 -- 가변 기울기(4개의 매개변수)"가 계산되었다(GraphPad Prism6).
(c): CD69를 정량화하여 CD8 T 세포에 대한 용량 의존적 T 세포 활성화를 분석하였다. CD69에 대한 형광 강도 중앙값을 CD8 양성 T 세포에 대해 블롯팅하였다. 표적 세포(매우 높은 FOLR1 발현을 갖는 HeLa 세포)를 huPBMC 및 TCB와 함께(E:T = 10:1, 효과기는 인간 PBMC) 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션했다. FOLR1 TCB 및 활성화된 FOLR1 pro-TCB는 용량 의존적 T 세포 활성화를 유도한다. 절단 불가능한 링커를 함유하는 마스킹된 FOLR1 pro-TCB(CD3 P035.093, 마스크 4.24.72 scFv)는 표시된 농도 범위에서 T 세포 활성화(CD8 T 세포의 경우 CD69)를 나타내지 않는다. 각 점은 삼중의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다. EC-50 값의 계산을 위해, 비선형 적합 "log(작용제) 대 반응 -- 가변 기울기(4개의 매개변수)"가 계산되었다(GraphPad Prism6).
(d): CD69를 정량화하여 CD8 T 세포에 대한 용량 의존적 T 세포 활성화를 측정하였다. CD69 양성 CD8 T 세포의 백분율을 표시한다. 표적 세포(매우 높은 FOLR1 발현을 갖는 HeLa 세포)를 huPBMC 및 TCB와 함께(E:T = 10:1, 효과기는 인간 PBMC) 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션했다. FOLR1 TCB 및 활성화된 FOLR1 pro-TCB는 용량 의존적 T 세포 활성화를 유도한다. 절단 불가능한 링커를 함유하는 마스킹된 FOLR1 pro-TCB(CD3 P035.093, 마스크 4.24.72 scFv)는 표시된 농도 범위에서 감소된 T 세포 활성화(CD8 T 세포의 경우 CD69)를 나타낸다. 그러나 5nM에서 시작하여 일부 CD69 양성 CD8 T 세포는 본원에서 사용된 최고 농도에서 약 30%까지 증가하는 것으로 검출될 수 있다. 각 점은 삼중의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다. EC-50 값의 계산을 위해, 비선형 적합 "log(작용제) 대 반응 -- 가변 기울기(4개의 매개변수)"가 계산되었다(GraphPad Prism6).
도 12. (A): pro-TCB 형태에서 항-ID 4.24.72의 마스킹 효율을 분석하기 위해 CD3 P035.093 TCB 및 FOLR1 양성 표적 세포(E:T = 10:1, 효과기는 인간 PBMC임)와 함께 huPBMC를 48시간 인큐베이션한 후에 용량 의존적 표적 세포 사멸(Hela 높은 FOLR1 발현, Ovcar-3 및 Skov-3 배지 FOLR1 발현 및 낮은 FOLR1 발현을 가지는 HT-29)을 측정하였다. FOLR1 TCB는 모든 세포주(Hela, Skov-3, Ovcar-3)에서 용량 의존적 표적 세포 사멸을 유도하는 반면, 마스킹된 FOLR1 pro-TCB는 감소된 표적 세포 사멸을 나타낸다.
(B): huPBMC(E:T = 10:1)를 48시간 인큐베이션한 후 용량 의존적 표적 세포 사멸(Skov-3 배지 FOLR1 발현 및 낮은 FOLR1 발현을 갖는 HT-29)을 측정하였다. FOLR1 TCB는 모든 세포주(Skov-3, HT-29)에서 용량 의존적 표적 세포 사멸을 유도하는 반면, 마스킹된 FOLR1 pro-TCB는 감소된 표적 세포 사멸을 나타낸다. 각 점은 삼중의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다. 점선은 TCB 없이 huPBMC와 함께 인큐베이션된 표적 세포의 자발적 방출을 보여준다. EC-50 값의 계산을 위해, 비선형 적합 "log(작용제) 대 반응 -- 가변 기울기(4개의 매개변수)"가 계산되었다(GraphPad Prism6).
도 13.: 항-이디오타입 마스크 4.24.72의 인간화 변이체들의 한 팔(one-armed) IgG들의 형태. 이형이량체화는 놉-인투-홀 기술을 사용하여 이루어진다.
표 14. 다양한 CD3 결합제를 가진 TYRP1 TCB에 의해 매개되는 Jurkat NFAT 활성화를 도시한다. TYRP1 TCB(이전 분석에서 결정된 EC90 농도로 사용됨)를 37℃에서 5시간 동안 TYRP1 양성 표적 세포(M150543) 및 Jurkat NFAT 효과기 세포와 함께(E:T 2.5:1) 인큐베이션했다. 항-이디오타입(항-ID) 4.24.72 IgG(모체 및 인간화 변이체들)에 의한 CD3 결합제의 용량 의존적 차단을 CD3 CH2527(도 14A) 및 CD3 P035.093(도 14B)에 대해 표시한다. 각 점은 삼중의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다. EC-50 값의 계산을 위해, 비선형 적합 "log(작용제) 대 반응 -- 가변 기울기(4개의 매개변수)"가 계산되었다(GraphPad Prism6).
도 15. (A): pro-TCB 형태에서 항-ID 4.24.72의 마스킹 효율을 분석하기 위해 CD3 P035.093 TCB 및 FOLR1 양성 표적 세포(E:T = 10:1, 효과기는 인간 PBMC임)와 함께 huPBMC를 48시간 인큐베이션한 후에 용량 의존적 표적 세포 사멸(Ovcar-3 배지 FOLR1 발현)을 측정하였다. FOLR1 TCB는 Ovcar-3 세포들에서 용량 의존적 표적 세포 사멸을 유도하는 반면, 마스킹된 FOLR1 pro-TCB는 감소된 표적 세포 사멸을 나타낸다.
(B) 및 (C): CD69를 정량화하여 CD8 T 세포에 대한 용량 의존적 T 세포 활성화를 측정하였다. CD69 양성 CD8 T 세포의 백분율(도 15B) 및 형광 강도 중앙값(도 15C)을 표시한다. 표적 세포(중간 FOLR1 발현을 갖는 Ovcar-3 세포)를 huPBMC 및 TCB와 함께(E:T = 10:1, 효과기는 인간 PBMC) 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션했다. FOLR1 TCB는 용량 의존적 T 세포 활성화를 유도한다. 절단 불가능한 링커를 함유하는 마스킹된 FOLR1 pro-TCB(CD3 P035.093, 마스크 4.24.72 scFv의 인간화 변이체들)는 표시된 농도 범위에서 감소된 T 세포 활성화(CD8 T 세포의 경우 CD69)를 나타낸다. T 세포 활성화와 관련하여 인간화 변이체들에 대한 마스킹 효율에 대한 차이는 검출될 수 없었다. 각 점은 삼중의 평균을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대로 표시된다. EC-50 값의 계산을 위해, 비선형 적합 "log(작용제) 대 반응 -- 가변 기울기(4개의 매개변수)"가 계산되었다(GraphPad Prism6).
도 16은 인간화 마스킹 모이어티를 갖는 상이한 프로테아제-활성화가능 FolR1 TCB 분자의 개략도를 도시한다.
도 16a: 공통 경쇄 P329G LALA 2+1 Fc(홀) Fc (놉)를 가진 항-CD3 P035.093 마스크 scFv H1L1 매트립타제 부위 항-FolR1 16D5, 서열번호 95, 66, 67.
도 16b: 공통 경쇄 P329G LALA 2+1 Fc(홀) Fc(놉)를 갖는 항-CD3 P035.093 마스크 scFv H1L2 매트립타제 부위 항-FolR1 16D5, 서열번호 96, 66, 67.
도 16c: 공통 경쇄 P329G LALA 2+1 Fc(홀) Fc(놉)를 갖는 항-CD3 P035.093 마스크 scFv H2L2 매트립타제 부위 항-FolR1 16D5, 서열번호 97, 66, 67.
도 16d: 공통 경쇄 P329G LALA 2+1 Fc(홀) Fc(놉)를 갖는 항-CD3 P035.093 마스크 scFv H3L2 매트립타제 부위 항-FolR1 16D5, 서열번호 98, 66, 67.
정의
용어는 하기에서 달리 정의되지 않는 한, 당업계에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 분자"는 가장 넓은 의미로, 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 예는 면역글로불린 및 유도체, 예를 들어, 이의 단편이다.
용어 "이중특이성"은 항원 결합 분자가 적어도 2개의 개별 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 이중특이성 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하며, 이들 각각은 상이한 항원 결정인자에 대해 특이적이다. 특정 실시형태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 2개의 항원결정인자, 특히, 2개의 개별 세포에서 발현되는 2개의 항원결정인자에 동시에 결합할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "~가"는 항원 결합 분자 내 특정 수의 항원 결합 부위의 존재를 나타낸다. 이와 같이, 용어 "항원에 대한 1가 결합"은 항원 결합 분자에서 항원에 특이적인 하나(및 하나 이하)의 항원 결합 부위의 존재를 나타낸다.
"항원 결합 부위"는 항원과의 상호작용을 제공하는 항원 결합 분자의 부위, 즉 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 부위는 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 잔기를 포함한다. 천연 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위를 갖고, Fab 분자는 전형적으로 단일 항원 결합 부위를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 모이어티"는 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 한 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 그것이 부착된 실체(예를 들어, 제2 항원 결합 모이어티)를 표적 부위에, 예를 들어 항원 결정인자를 보유하는 특정 유형의 종양 세포 또는 종양 기질에 대해 지시할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 이의 표적 항원, 예를 들어, T 세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화할 수 있다. 항원 결합 모이어티는 본원에 추가로 정의된 바와 같은 항체 및 이의 단편을 포함한다. 특정 항원 결합 모이어티는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 본원에 추가로 정의되고 당업계에 공지된 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역에는 5가지 아이소형: α, δ, ε, γ 또는 μ 중 하나가 포함된다. 유용한 경쇄 불변 영역에는 κ 및 λ의 두 가지 아이소형 중 하나가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "항원 결정인자"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이며 항원 결합 모이어티가 결합하여, 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위(예를 들어, 아미노산의 연속 신장부(stretch) 또는 비인접 아미노산들의 상이한 영역들로 구성된 입체형태 구성)를 지칭한다. 유용한 항원 결정인자는 예를 들어 종양 세포의 표면, 바이러스에 감염된 세포의 표면, 다른 질환 세포의 표면, 면역 세포의 표면상에서, 혈청내 및/또는 세포외 기질(ECM) 중에서 자유롭게 발견될 수 있다. 본원에서 항원으로 지칭되는 단백질(예를 들어, FolR1, HER1, HER2, CD3, 메소텔린)은 달리 지시가 없는 한, 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 천연 형태의 단백질일 수 있다. 특정 실시형태에서 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특정 단백질을 지칭하는 경우, 이 용어는 "전장"의, 비가공 단백질, 뿐만 아니라 세포에서 가공된 임의의 형태의 단백질을 포함한다. 이 용어는 또한 단백질의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 항원으로서 유용한 예시적인 인간 단백질은 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: FolR1, HER1 및 CD3, 특히 CD3의 입실론 서브유닛(인간 서열의 경우 UniProt 번호 P07766(버전 130), NCBI RefSeq 번호 NP_000724.1, 서열번호 54, 또는 사이노몰구스[마카카 파시쿨라리스] 서열의 경우 UniProt 번호 Q95LI5(버전 49), NCBI GenBank 번호 BAB71849.1 참조). 특정 실시형태에서, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 CD3의 에피토프 또는 CD3 또는 상이한 종으로부터의 표적 항원들 중에서 보존된 표적 세포 항원에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 CD3 및 FolR1에 결합하지만 FolR2 또는 FolR3에는 결합하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 CD3 및 HER1에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 CD3 및 메소텔린에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 CD3 및 HER2에 결합한다. "특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이고 원치 않는 또는 비특이적 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 특정한 항원 결정인자에 결합하는 항원 결합 모이어티의 능력은 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 다른 기술, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술(Biacore 장비상에서 분석됨)(Liljeblad 등, Glyco J 17, 323-329 (2000)) 및 전통적인 결합 분석(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 측정될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 관련되지 않은 단백질에 대한 항원 결합 모이어티의 결합 정도는 예를 들어, SPR에 의해 측정시 항원에 대한 항원 결합 모이어티의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시형태에서, 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티 또는 그 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
"친화도"는 분자(예를 들어, 수용체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 리간드) 사이의 비공유 상호작용의 총합 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들어, 항원 결합 모이어티와 항원, 또는 수용체와 이의 리간드) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 짝 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있으며, 이는 해리 및 결합속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비이다. 따라서, 균등한 친화도는 상기 속도 상수들의 비율이 동일하게 유지되는 한 상이한 속도 상수를 포함할 수도 있다. 친화도는 본 명세서에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 잘 확립된 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화도의 특정한 측정 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)이다.
"감소된 결합", 예를 들어, Fc 수용체에 대한 감소된 결합은 예를 들어 SPR에 의해 측정시 각각의 상호작용에 대한 친화도의 감소를 지칭한다. 명확성을 위해 이 용어는 0(또는 분석 방법의 검출 한계 미만)으로의 친화도 감소, 즉, 상호 작용의 완전한 제거를 포함한다. 역으로, "증가된 결합"은 각각의 상호작용에 대한 결합 친화도의 증가를 지칭한다.
본원에 사용된 "T 세포 활성화"는 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성 및 활성화 마커의 발현으로부터 선택되는 T 림프구, 특히, 세포독성 T 림프구의 하나 이상의 세포 반응을 지칭한다. 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. T 세포 활성화를 측정하기 위한 적절한 분석은 본원에 기재된 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들어 암 세포 또는 종양 기질의 세포와 같은 종양 내의 세포의 표면에 제시된 항원 결정인자를 지칭한다.
본원에서 항원 결합 모이어티 등과 관련하여 "제1" 및 "제2"라는 용어는 각 유형의 모이어티가 하나 이상인 경우 구별의 편의를 위해 사용된다. 이러한 용어의 사용은 명시적으로 언급되지 않는 한 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 특정 순서 또는 방향을 부여하려는 의도가 아니다.
"Fab 분자"는 면역글로불린의 중쇄의 VH 및 CH1 도메인("Fab 중쇄") 및 경쇄의 VL 및 CL 도메인("Fab 경쇄")으로 구성된 단백질을 지칭한다.
"융합된"은 구성요소들(예를 들어, Fab 분자 및 Fc 도메인 서브유닛)이 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 펩티드 결합에 의해 연결됨을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "단일 사슬"은 펩티드 결합에 의해 선형으로 연결된 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티 중 하나는 단일 사슬 Fab 분자, 즉 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄가 펩티드 링커에 의해 연결되어 단일 펩티드 사슬을 형성하는 Fab 분자이다. 이러한 특정 실시형태에서, Fab 경쇄의 C-말단은 단일 사슬 Fab 분자에서 Fab 중쇄의 N-말단에 연결된다.
"교차" Fab 분자("Crossfab"이라고도 함)는 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는 Fab 분자를 의미한다, 즉, 교차 Fab 분자는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 사슬 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 사슬을 포함한다. 명확성을 위해, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되는 교차 Fab 분자에서, 중쇄 불변 영역을 포함하는 펩티드 사슬이 본원에서 교차 Fab 분자의 "중쇄"로 지칭된다. 역으로, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교환되는 교차 Fab 분자에서, 중쇄 가변 영역을 포함하는 펩티드 사슬이 본원에서 교차 Fab 분자의 "중쇄"로 지칭된다.
이와 대조적으로, "통상적인" Fab 분자는 천연 형태의 Fab 분자, 즉, 중쇄 가변 및 불변 영역(VH-CH1)으로 구성된 중쇄 및 경쇄 가변 및 불변 영역(VL-CL)으로 구성된 경쇄를 포함하는 Fab 분자를 의미한다.
"면역글로불린 분자"라는 용어는 자연 발생 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, IgG 분류의 면역글로불린은 이황화 결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 도메인 N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH), 이어서 중쇄 불변 영역으로도 불리는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VL), 이어서 경쇄 불변 영역으로도 불리는 경쇄 불변(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)라 불리는 5가지 유형 중 하나로 지정될 수 있으며, 이들 중 일부는 하위 유형, 예를 들어 γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파(κ) 및 람다(λ)라고 하는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 면역글로불린은 본질적으로 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된 2개의 Fab 분자와 Fc 도메인으로 구성된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한 단클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편을 포함하는(그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 항체 구조를 포함한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는, 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 단일 도메인 항체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 항체 단편들에 대한 리뷰는 Hudson 등, Nat. Med. 9, 129-134 (2003)를 참조한다. scFv 단편들의 리뷰는 예로써, Pluckth
Figure pct00002
n, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); WO 93/16185; 그리고 미국 특허 제5,571,894 및 5,587,458을 또한 참고한다. 구조 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프 잔기를 포함하고 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의는 미국 특허 제5,869,046을 참조하라. 디아바디는 2가 또는 이중 특이성일 수 있는 2개의 항원 결합 부위가 있는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 외, Nat. Med. 9, 129-134 (2003); 및 Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)를 참조하라. 트리아바디(Triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies)는 또한 Hudson 외. Nat. Med. 9, 129-134 (2003)에 설명되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516 B1 참조). 항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이, 온전한 항체의 단백질분해 소화, 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어, 대장균 또는 파지)에 의한 제조를 포함한(그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
용어 "항원 결합 도메인"이란 용어는 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이에 상보성인 영역을 포함하는 항체의 부분을 지칭한다. 항원 결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 항체 가변 도메인(또한 항체 가변 영역이라 칭함)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄와 경쇄(차례로 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FRs)과 3개의 초가변 영역(HVR들)을 포함한다. 예를 들어, Kindt 외. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007)을 참조하라. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변이고/이거나, 구조적으로 정의된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 지칭한다. 일반적으로 천연 4쇄 항체는 6개의 HVR을 포함한다: VH에 3개(H1, H2, H3), 그리고 VL에 3개(L1, L2, L3). HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 가장 높은 서열 가변성을 갖고/갖거나, 항원 인식에 관여한다. VH의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 영역(HVR)은 또한 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 지칭되며, 이들 용어는 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분들과 관련하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이 특정 영역은 Kabat 외, 미국 보건복지부의, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) 및 Chothia 외, J Mol Biol 196:901-917 (1987)에 의해 기술된 바 있으며, 여기서 정의는 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중복 또는 하위 집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범위에 속하는 것으로 한다. 상기 인용된 문헌 각각에 의해 정의된 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1에 제시되어 있다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어진 특정 CDR을 어떤 잔기들이 포함하는지를 관례적으로 결정할 수 있다.
표 1. CDR 정의1
Figure pct00003
1 표 1의 모든 CDR 정의의 넘버링은 Kabat 외의 문헌에 제시된 넘버링 규칙에 따른다(아래 참조).
2 표 1에 사용된 소문자 "b"가 있는 "AbM"은 Oxford Molecular의 "AbM" 항체 모델링 소프트웨어에 의해 정의된 CDR을 지칭한다.
Kabat 외의 문헌 또한 가변 영역 서열들에 대한 넘버링 체계를 정의했으며, 이는 모든 항체에 적용할 수 있다. 당업자는 상기 "Kabat 넘버링" 체계를 해당 서열 자체에서 벗어난 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고 임의의 가변 영역 서열에 명확하게 할당할 수 있다. 본원에서 사용되는 "Kabat 넘버링"은 Kabat 등, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)에 제시된 넘버링 체계를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 항체 가변 영역 내 특정한 아미노산 잔기 위치의 넘버링은 Kabat 넘버링 체계를 참조한다.
서열 목록의 폴리펩티드 서열은 Kabat 넘버링 체계에 따라 넘버링되지 않는다. 그러나, 서열 목록의 서열의 넘버링을 Kabat 넘버링으로 변환하는 것은 당업자의 통상의 기술 범위 내에 있다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기들 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열들은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
항체 또는 면역글로불린의 "분류"는 그 중쇄가 갖는 불변 영역 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체에는 5가지 주요 분류가 있으며: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 그리고 이들중 몇몇은 하위분류(아이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 세분될 수 있다. 상이한 면역글로불린 분류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 차례로 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230에서 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, 숙주 제포에 의해 생성된 항체는 중쇄의 C-말단으로부터 하나 이상, 특히 1개 또는 2개의 아미노산의 번역후 절단을 거칠 수 있다. 따라서, 전장 중쇄를 인코딩하는 특이성 핵산 분자의 발현에 의해 숙주 세포에 의해 생성되는 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있거나, 전장 중쇄의 절단된 변이체를 포함할 수 있다. 이는 중쇄의 최종 2개의 C-말단 아미노산이 글리신(G446) 및 리신(K447, EU 넘버링 체계)인 경우일 수 있다. 따라서, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447), 또는 C-말단 글리신(Gly446) 및 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. Fc 영역을 포함하는 중쇄의 아미노산 서열은 본원에서 달리 지시가 없는 한, C-말단 글리신-리신 디펩티드 없이 표시된다. 하나의 양상에서, 본 발명에 따른 항체에 포함되는 본원에 특정된 Fc 영역을 포함하는 중쇄는 또 다른 C-말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, EU 넘버링 체계)를 포함한다. 한 양상에서, 본 발명에 따른 항체에 포함되는 본원에 특정된 Fc 영역을 포함하는 중쇄는 C-말단 글리신 잔기(G446, EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 명시적으로 다른 언급이 없는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 EU 넘버링 체계, Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 소위 EU 색인에 따른다. 본원에 사용된 Fc 도메인의 "서브유닛"은 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중 하나, 즉 안정한 자가-회합이 가능한 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역들을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, IgG Fc 도메인의 서브유닛은 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"융합된"은 구성요소들(예를 들어, Fab 분자 및 Fc 도메인 서브유닛)이 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 펩티드 결합에 의해 연결됨을 의미한다.
"Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형"은 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드와 동일한 폴리펩티드와의 회합을 감소시키거나 방지하여 동종이량체를 형성하는 Fc 도메인 서브유닛의 번역 후 변형 또는 펩티드 골격의 조작이다. 본원에서 사용되는 회합을 촉진하는 변형은 특히, 회합하고자 하는 2개의 Fc 도메인 서브유닛들(즉, Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛) 각각에 대해 이루어진 별도의 변형을 포함하며, 여기서 이러한 변형은 2개의 Fc 도메인 서브유닛들의 회합을 촉진하기 위해 서로에 상보적이다. 예를 들어, 회합을 촉진하는 변형은 각각의 결합이 입체적으로 또는 정전기적으로 유리하도록 하기 위해 Fc 도메인 서브유닛들 중 하나 또는 둘 모두의 구조 또는 전하를 변경할 수 있다. 따라서, (이종)이량체화는 제1 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드와 제2 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드 사이에서 발생하며, 이는 각각의 서브유닛(예를 들어, 항원 결합 모이어티)에 융합된 추가 구성요소가 동일하지 않다는 의미에서 동일하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 회합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인 내의 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 회합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에서 별도의 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다.
용어 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하며, 이는 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 효과기 기능들의 예에는 다음이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존적인 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제공 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향조절 및 B 세포 활성화.
본원에 사용된 용어 "조작하다, 조작된, 조작"은 펩티드 골격의 임의의 조작 또는 천연 발생 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 번역후 변형을 포함하는 것으로 간주된다. 조작에는 개별 아미노산들의 아미노산 서열의, 당화 패턴의 또는 측쇄 기의 변형과 이러한 접근 방식의 조합이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포함하는 것을 의미한다. 최종 구조체가 원하는 특성, 예를 들어 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 또는 다른 펩티드와의 증가된 회합을 보유하는 한, 최종 구조체에 도달하도록 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 아미노산 서열 결실 및 삽입은 아미노- 및/또는 카르복시-말단 결실 및 아미노산 삽입을 포함한다. 특정 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들어, Fc 영역의 결합 특성을 변경하기 위한 목적으로, 비보존적 아미노산 치환, 즉 하나의 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 비-천연 발생 아미노산 또는 20개의 표준 아미노산의 자연 발생 아미노산 유도체(예를 들어, 4-히드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-히드록시리신)에 의한 대체를 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당업계에 잘 알려진 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 유전적 방법은 부위 지정 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 화학적 변형과 같은 유전 공학 이외의 방법에 의해 아미노산의 측쇄 기를 변경하는 방법이 또한 유용할 수 있는 것으로 고려된다. 동일한 아미노산 돌연변이를 나타내는 다양한 명칭이 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인의 위치 329에 있는 프롤린의 글리신으로의 치환은 329G, G329, G329, P329G 또는 Pro329Gly로 표시될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려짐)에 의해 선형으로 연결된 단량체들(아미노산들)로 구성된 분자를 지칭한다. "폴리펩티드"라는 용어는 2개 이상의 아미노산들의 사슬을 지칭하며 특정 길이의 생성물을 지칭하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 2개 이상의 아미노산 사슬을 지칭하는 데 사용되는 기타 용어들이 "폴리펩티드"의 정의에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 이러한 용어를 대신하거나 이러한 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. "폴리펩티드"라는 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후 변형의 생성물을 지칭하는 것으로 하며, 당화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단 또는 비-천연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 출처로부터 유래되거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 이는 화학적 합성을 포함하여 어떤 방식으로든 생성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상 또는 1,000개 이상 또는 2,000개 이상 아미노산 크기일 수 있다. 폴리펩티드는 정의된 3차원 구조를 가질 수 있지만 반드시 그러한 구조를 갖는 것은 아니다. 정의된 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 폴딩된(folded) 것이라 하고, 정의된 3차원 구조를 갖지 않지만 오히려 다수의 상이한 형태를 채택할 수 있는 폴리펩티드를 폴딩되지 않은(unfolded) 것이라 한다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 유도체는 자연 환경에 있지 않은 폴리펩티드를 의미한다. 특정 수준의 정제가 필요하지 않다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 천연 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분획화되거나, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드와 마찬가지로 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 서열들을 정렬하고 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기들과 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기들의 백분율로 정의되며, 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 해당 분야의 기술 범위에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이루어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 구현하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열들을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에서 제작되었으며 소스 코드는 미국 워싱턴 D.C., 20559에 소재한 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코에 소재한 Genentech, Inc.사로부터 공개적으로 이용가능하거나 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함한 UNIX 운영 체제에서 사용되도록 컴파일해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변경되지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우에, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이것과, 또는 이에 대항한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(대안적으로 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이것과, 또는 이에 대항한 소정의 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 아래와 같이 계산된다:
100 x 분율 X/Y
이 때 X는 A와 B의 해당 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매칭으로서 점수화된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 총 아미노산 잔기 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다.달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에 기재된 바와 같이 얻는다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단리된 핵산 분자 또는 구조체, 예를 들어, 전령 RNA(mRNA), 바이러스 유래 RNA 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 통상적이지 않은 결합(예를 들어, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 단편, 예를 들어, DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 그 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 목적을 위해 단리된, 벡터에 함유된 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드가 고려된다. 또 다른 단리된 폴리뉴클레오티드의 예는 이종 숙주 세포에서 유지되는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체 외부에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사물, 뿐만 아니라 양성 및 음성 가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 생성된 상기와 같은 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자와 같은 조절 요소 일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다.
본 발명의 참조 뉴클레오티드 서열에 적어도, 예를 들어 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 상기 참조 뉴클레오티드 서열의 각 100개 뉴클레오티드당 최대 5개의 점 돌연변이를 포함할 수 있음을 제외하고 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 상기 참조 서열과 동일함을 의미한다. 즉, 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해서, 상기 참조 서열 중 뉴클레오티드의 5% 이하를 결실시키거나 또는 또 다른 뉴클레오티드로 치환하거나, 상기 참조 서열의 전체 뉴클레오티드의 최대 5%의 수의 뉴클레오티드를 상기 참조 서열에 삽입할 수 있다. 상기 참조 서열의 이러한 변경은 상기 참조 서열 내 잔기들 간에 개별적으로 또는 상기 참조 서열 내 하나 이상의 인접 그룹들 중에 산재된, 상기 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 상기 말단 위치들 사이의 어디에서나 발생할 수 있다. 실제 문제로서, 임의의 특정한 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지 여부는 통상적으로 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, 폴리펩티드에 대해 상기 논의된 것들(예를 들어 ALIGN-2)을 사용하여 측정할 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 명시된 핵산 요소와 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 생성되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 재조합 발현 카세트를 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 또는 핵산 단편에 통합시킬 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은, 다른 서열들 중에서도, 전사되는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 양상에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
"벡터" 또는 "발현 벡터"란 용어는 "발현 구조체"와 동의어이며 표적 세포에서 작동 가능하게 연결된 특정 유전자의 발현을 도입하고 지시하는 데 사용되는 DNA 분자를 의미한다. 이 용어에는 자가-복제 핵산 구조체로서의 벡터 그리고 그것이 도입되는 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터가 포함된다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 다량의 안정한 mRNA의 전사를 가능하게 한다. 일단 이러한 발현 벡터가 표적 세포내에 있으면, 해당 유전자에 의해 인코딩되는 리보핵산 분자 또는 단백질이 세포 전사 및 /또는 번역 기작에 의해 생성된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "숙주 세포(host cell)", "숙주 세포주(cell line)" 및 "숙주 세포 배양물(culture)"은 호환적으로 이용되며, 외인성 핵산이 도입되어 있는 세포를 지칭하고 이러한 세포들의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 계대 수에 관계없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모체 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만 돌연변이를 포함할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자를 생성함에 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어, 몇 가지 언급하자면, 포유동물 배양된 세포, 예를 들어, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 식물 세포를 포함하나, 또한 유전자삽입 동물, 유전자삽입 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포를 포함한다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 도메인에 의한 결합 후 효과기 기능을 수행하도록 수용체-보유 세포를 자극하는 신호전달 이벤트를 유도하는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)를 포함한다.
항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)은 면역 효과기 세포에 의한 항체 코팅된 표적 세포의 용해를 초래하는 면역 메커니즘이다. 표적 세포는 일반적으로 Fc 영역의 N-말단인 단백질 부분을 통해 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 유도체가 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에 사용된 용어 "감소된 ADCC"는, 상기 정의된 ADCC의 메커니즘에 의해 표적 세포를 둘러싸고 있는 배지에서 주어진 항체 농도에서 주어진 시간에 용해되는 표적 세포 수의 감소 및/또는 ADCC의 메커니즘에 의해 주어진 시간에 주어진 수의 표적 세포의 용해를 달성하는 데 필요한 표적 세포를 둘러싼 배지에서 항체 농도의 증가로 정의된다. ADCC의 감소는 동일한 표준 생산, 정제, 제형 및 저장 방법(이는 당업자에게 공지됨)을 사용하여 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성되었으나 조작되지 않은 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC에 비해 상대적이다. 예를 들어, ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 Fc 도메인에 포함하는 항체에 의해 매개되는 ADCC의 감소는 Fc 도메인에서 이러한 아미노산 치환이 없는 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC에 비해 상대적이다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, PCT 공개 번호 WO 2006/082515 또는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831 참조).
제제의 "유효량"은 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 일으키는데 필요한 양을 지칭한다.
제제, 예를 들어, 약학 조성물의 "치료 유효량"은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 그리고 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 제제의 치료적 유효량은 예를 들어 질환의 부작용을 제거, 감소, 지연, 최소화 또는 방지한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물에는 가축(예컨대, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예컨대, 인간 및 비인간 영장류, 가령, 원숭이), 토끼 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특히, 개체 또는 대상체는 인간이다.
용어 "약학 조성물"이란 내부에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 제제를 지칭하며, 제제가 투여되는 대상체에게 허용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외에 약학 조성물 안에 있는 성분을 말하며, 대상체에게 비독성이다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 "치료(treatment)"(및 이의 문법적 변화형, 이를 테면 "치료하다(treat)" 또는 "치료하는(treating)")라는 것은 치료될 개체의 질환의 자연적인 과정을 변경시키려는 시도에 있어서의 임상적 시술과정을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상적 병리학 과정 동안 실행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 지연시키기 위해 사용된다.
"약품 설명서(package insert)"라는 용어는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상용 패키지에 관례적으로 포함되는 지침서를 지칭하는 데 사용된다.
본원에 사용된 "이디오타입 특이적 폴리펩티드"는 항원 결합 모이어티, 예를 들어, CD3에 특이적인 항원 결합 모이어티의 이디오타입을 인식하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 항원 결합 모이어티의 가변 영역에 특이적으로 결합할 수 있고, 이에 의해, 항원 결합 모이어티의 그 동족 항원에 대한 특이적 결합을 감소 또는 방지할 수 있다. 항원 결합 모이어티를 포함하는 분자와 회합될 때, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 분자의 마스킹 모이어티로서 기능할 수 있다. 항-CD3 결합 분자의 이디오타입에 특이적인 항-이디오타입 항체 또는 항-이디오타입-결합 항체 단편이 본원에 구체적으로 개시된다.
본원에 사용된 "프로테아제" 또는 "단백분해 효소"는 인식 부위에서 링커를 절단하고 표적 세포에 의해 발현되는 임의의 단백질분해 효소를 지칭한다. 이러한 프로테아제는 표적 세포에 의해 분비되거나, 예를 들어 표적 세포 표면 상에서 표적 세포와 회합된 채로 남아 있을 수 있다. 프로테아제의 예는 금속단백분해효소, 예를 들어 매트릭스 금속단백분해효소 1-28 및 A 디스인테그린 및 금속단백분해효소(ADAM) 2, 7-12, 15, 17-23, 28-30 및 33, 세린 프로테아제, 예를 들어 유로키나제-유사 플라스미노겐 활성화제 및 매트립타제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제 및 카텝신 패밀리의 구성원를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
T 세포 활성화 이중특이성 분자와 관련하여 본원에 사용된 "프로테아제-활성화가능"은, CD3에 결합하는 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 능력을 감소시키거나 제거하는 마스킹 모이어티로 인해 T 세포를 활성화시키는 능력이 감소되거나 제거된 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 지칭한다. 마스킹 모이어티의 단백질 분해 절단에 의한 해리, 예를 들어, 마스킹 모이어티를 T 세포 활성화 이중특이성 분자에 연결하는 링커가 단백질 분해 절단에 의해 마스킹 모이어티를 해리할 때, CD3에 대한 결합이 회복되고 이에 의해 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 활성화된다.
본원에 사용된 "가역적으로 은폐하는"은, 예를 들어, 해당 항원 결합 모이어티 또는 분자가 그 항원, 예를 들어, CD3에 결합하지 못하도록 하기 위한, 마스킹 모이어티 또는 이디오타입 특이적 폴리펩티드의, 항원 결합 모이어티 또는 분자에 대한 결합을 지칭한다. 이러한 은폐는 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 예를 들어 프로테아제 절단에 의해 항원 결합 모이어티 또는 분자로부터 방출될 수 있고, 이에 의해 항원 결합 모이어티 또는 분자를 유리시켜 그 항원에 결합하게 할 수 있다는 점에서 가역적이다.
상세한 설명
한 양상에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자에 관한 것이다:
(a) CD3에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 모이어티;
(b) 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 모이어티; 및
(c) 프로테아제-절단가능 링커를 통해 T 세포 이중특이성 결합 분자에 공유적으로 부착된 마스킹 모이어티(여기서 마스킹 모이어티는 제1 또는 제2 항원 결합 모이어티의 이디오타입에 결합할 수 있고, 이로써 제1 또는 제2 항원 결합 모이어티를 가역적으로 은폐할 수 있음).
CD3에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 모이어티는 이디오타입을 포함한다. 한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 마스킹 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티에 공유적으로 부착된다. 한 실시형태에서, 마스킹 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티의 중쇄 가변 영역에 공유적으로 부착된다. 한 실시형태에서, 마스킹 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티의 경쇄 가변 영역에 공유적으로 부착된다. 이 공유 결합은 이디오타입 제1 항원 결합 부위에 대한 마스킹 모이어티의 특이적 결합(바람직하게는 비공유적임)과는 별개이다. 제1 항원 결합 모이어티의 이디오타입은 이의 가변 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 마스킹 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티가 CD3에 결합될 때 CD3과 접촉하는 아미노산 잔기에 결합한다. 바람직한 실시형태에서, 마스킹 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티의 동족 항원 또는 이의 단편이 아니다, 즉, 마스킹 모이어티는 CD3 또는 이의 단편이 아니다. 한 실시형태에서 마스킹 모이어티는 항-이디오타입 항체 또는 이의 단편이다. 한 실시형태에서, 마스킹 모이어티는 항-이디오타입 scFv이다. 항-이디오타입 scFv인 마스킹 모이어티 및 이러한 마스킹 모이어티를 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 분자의 예시적인 실시형태들은 다음 실시예에 상세히 기재되어 있다.
한 실시형태에서, 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
(i) CD3에 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는, 제1 항원 결합 모이어티;
(ii) 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 Fab 분자인 제2 항원 결합 모이어티.
한 실시형태에서, 제1 항원 결합 도메인은 서열번호 16의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 FolR1에 결합할 수 있고, 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 FolR1에 결합할 수 있고, 서열번호 53의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 TYRP1에 결합할 수 있고, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 TYRP1에 결합할 수 있고, 서열번호 27의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 제공한다:
(i) CD3에 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는, 제1 항원 결합 모이어티;
(ii) FolR1에 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는, 제2 항원 결합 모이어티.
한 실시형태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 제공한다:
(i) CD3에 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 16의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제1 항원 결합 모이어티는,
(i) FolR1에 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 53의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제2 항원 결합 모이어티.
한 실시형태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 제공한다:
(i) CD3에 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는, 제1 항원 결합 모이어티;
(ii) TYRP1에 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는, 제2 항원 결합 모이어티.
한 실시형태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 제공한다:
(i) CD3에 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 16의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제1 항원 결합 모이어티,
(i) TYRP1에 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 27의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제2 항원 결합 모이어티.
한 실시형태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다.
특정 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역들이 교환되는 교차 Fab 분자이고, 제2 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다. 추가의 특정 실시형태에서, 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 서로에 융합된다.
특정 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 안정한 회합이 가능한 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함한다.
추가의 특정 실시형태에서, CD3에 결합할 수 있는 1개 이하의 항원 결합 모이어티가 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자에 존재한다(즉, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 CD3에 대한 1가 결합을 제공한다).
프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 형식
프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 구성요소들은 다양한 구조로 서로에 융합될 수 있다. 예시적인 구조가 도 1a-1z, 도 2, 도 9A-9C 및 도 17A-17DH에 도시되어 있다.
특정 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 안정한 회합이 가능한 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다.
이러한 한 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 이러한 특정 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 본질적으로 제1 및 제2 항원 결합 모이어티, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인 및 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 이루어지며, 여기서 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 선택적으로, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 추가적으로 서로에 융합될 수 있다.
또 다른 이러한 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 이러한 특정 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 본질적으로 제1 및 제2 항원 결합 모이어티, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인 및 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 이루어지며, 여기서 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 상기 서브유닛들 중 하나의 N-말단에 융합된다.
다른 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다.
이러한 특정 실시형태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 이러한 특정 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 본질적으로 제1 및 제2 항원 결합 모이어티, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인 및 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 이루어지며, 여기서 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 선택적으로, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 추가적으로 서로에 융합될 수 있다.
항원 결합 모이어티는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 또는 직접적으로 서로에 또는 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 펩티드 링커는 해당 분야에 공지이고 본원에 기재된 바와 같다. 적합한 비면역원성 펩티드 링커는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함한다. "n"은 일반적으로 1 내지 10, 일반적으로 2 내지 4의 숫자이다. 제1 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄를 서로 융합시키기에 특히 적합한 펩티드 링커는 (G4S)2이다. 제1 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄를 연결하기에 적합한 예시적인 펩티드 링커는 EPKSC(D)-(G4S)2(서열번호 105 및 106)이다. 추가로, 링커는 면역글로불린 힌지 영역(의 일부)을 포함할 수 있다. 특히 항원 결합 모이어티가 Fc 도메인 서브유닛의 N-말단에 융합되는 경우, 추가 펩티드 링커에 의해 또는 없이 면역글로불린 힌지 영역 또는 이의 일부를 통해 융합될 수 있다.
표적 세포 항원에 결합할 수 있는 단일 항원 결합 모이어티를 갖는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는, 특히, 높은 친화도의 항원 결합 모이어티의 결합 후 표적 세포 항원의 내재화가 예상되는 경우에 유용하다. 이러한 경우에, 표적 세포 항원에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 모이어티의 존재는 표적 세포 항원의 내재화를 향상시켜 그 이용가능성을 감소시킬 수 있다.
그러나 많은 다른 경우에, 예를 들어 표적 부위에 대한 표적화를 최적화하거나 표적 세포 항원들이 가교결합 할 수 있게 하기 위하여, 표적 세포 항원에 대해 특이적인 2개 이상의 항원 결합 모이어티들을 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 갖는 것이 유리할 것이다(도 1b, 1c, 1e, 1f, 1g, 1h, 1i, 1j, 1k, 1l, 1m, 1n, 1q, 1r, 1u, 1v에 도시된 실시예 참조).
따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 Fab 분자인 제3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 제3 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다. 한 실시형태에서, 제3 항원 결합 모이어티는 제2 항원 결합 모이어티와 동일한 표적 세포 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 CD3에 결합할 수 있고, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 표적 세포 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 동일하다(즉, 이들은 동일한 아미노산 서열을 포함한다).
특정 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 CD3에 결합할 수 있고, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 FolR1에 결합할 수 있으며, 여기서 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 CD3에 결합할 수 있고, 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하고; 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 FolR1에 결합할 수 있으며, 여기서 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 CD3에 결합할 수 있고, 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하고; 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 FolR1에 결합할 수 있으며, 여기서 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 CD3에 결합할 수 있고, 서열번호 16의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 FolR1에 결합할 수 있고, 여기서 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 53의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 CD3에 결합할 수 있고, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 TYRP1에 결합할 수 있으며, 여기서 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR를 포함한다.
한 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 CD3에 결합할 수 있고, 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하고; 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 TYRP1에 결합할 수 있으며, 여기서 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR를 포함한다.
한 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 CD3에 결합할 수 있고, 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하고; 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 TYRP1에 결합할 수 있으며, 여기서 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR를 포함한다.
한 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 CD3에 결합할 수 있고, 서열번호 16의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 TYRP1에 결합할 수 있고, 여기서 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 서열번호 27의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이다. 한 실시형태에서, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 일부이다. 특정 실시형태에서 면역글로불린 분자는 IgG 분류의 면역글로불린이다. 더 더욱 특정한 실시형태에서 면역글로불린은 IgG1 하위분류 면역글로불린이다. 또 다른 실시형태에서 면역글로불린은 IgG4 하위분류 면역글로불린이다. 추가의 특정 실시형태에서 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 실시형태에서 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 또는 인간화 면역글로불린이다. 한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 본질적으로 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 분자 및 CD3에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티로 구성되며, 여기서 항원 결합 모이어티는 Fab 분자, 특히, 선택적으로 펩티드 링커를 통해 면역글로불린 중쇄 중 하나의 N-말단에 융합된 교차 Fab 분자이다.
특정 실시형태에서, 제1 및 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 각각 융합되고, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 이러한 특정 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 본질적으로 제1, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인 및 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 이루어지며, 여기서 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되고, 그리고 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 선택적으로, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 추가적으로 서로에 융합될 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 제공한다:
(i) 서열번호 2의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 4의 중쇄 CDR 2, 서열번호 10의 중쇄 CDR 3, 서열번호 20의 경쇄 CDR 1, 서열번호 21의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 22의 경쇄 CDR 3을 포함하는, CD3에 결합할 수 있는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티, 여기서 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역 또는 불변 영역, 특히 불변 영역이 교환되는 교차 Fab 분자이고;
(ii) 각각이 서열번호 54의 중쇄 CDR 1, 서열번호 55의 중쇄 CDR 2, 서열번호 56의 중쇄 CDR 3, 서열번호 20의 경쇄 CDR 1, 서열번호 21의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 22의 경쇄 CDR3을 포함하는, FolR1에 결합할 수 있는 Fab 분자인 제2 및 제3 항원 결합 모이어티.
한 실시형태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 제공한다:
(i) CD3에 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 16의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제1 항원 결합 모이어티, 여기서 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역 또는 불변 영역, 특히 불변 영역이 교환되는 교차 Fab 분자이고;
(i) 각각이 FolR1에 결합할 수 있는 Fab 분자이고, 서열번호 53의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티.
한 실시형태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 제공한다:
(i) 서열번호 2의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 4의 중쇄 CDR 2, 서열번호 10의 중쇄 CDR 3, 서열번호 20의 경쇄 CDR 1, 서열번호 21의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 22의 경쇄 CDR 3을 포함하는, CD3에 결합할 수 있는 Fab 분자인 제1 항원 결합 모이어티, 여기서 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역 또는 불변 영역, 특히 불변 영역이 교환되는 교차 Fab 분자이고;
(ii) 각각이 서열번호 24의 중쇄 CDR 1, 서열번호 25의 중쇄 CDR 2, 서열번호 26의 중쇄 CDR 3, 서열번호 28의 경쇄 CDR 1, 서열번호 29의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 30의 경쇄 CDR3을 포함하는, TYRP1에 결합할 수 있는 Fab 분자인 제2 및 제3 항원 결합 모이어티 .
상기 실시형태들 중 어느 하나에 따른 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 (iii) 안정한 회합이 가능한 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되고, 그리고 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다.
본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 중 일부에서, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 선택적으로 링커 펩티드를 통해 서로에 융합된다. 제1 및 제2 항원 결합 모이어티의 구조에 따라, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 그 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있거나, 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 그 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있다. 제1 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄들의 융합은 매칭되지 않는 Fab 중쇄 및 경쇄들의 미스페어링을 추가로 감소시키고, 또한 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 일부의 발현에 필요한 플라스미드의 수를 감소시킨다.
특정 실시형태에서 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역이 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 중쇄를 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역으로 대체됨), 이는 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)), 그리고 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역이 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(1)-CL(1)) 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(2)-CL(2))를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서 폴리펩티드는 예를 들어 이황화 결합에 의해 공유적으로 연결된다.
다른 실시형태에서 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역이 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 중쇄를 포함하고, 여기서 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역으로 대체됨), 이는 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4)), 그리고 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역이 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(1)-CH1(1)) 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(2)-CL(2))를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서 폴리펩티드는 예를 들어 이황화 결합에 의해 공유적으로 연결된다.
일부 실시형태에서 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역이 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 중쇄를 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역으로 대체됨), 이는 차례로 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄와 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 이는 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 다른 실시형태에서 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역이 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 중쇄를 포함하고, 여기서 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역으로 대체됨), 이는 차례로 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄와 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 이는 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 또 다른 실시형태에서 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는, 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄가 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 이는 차례로 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 중쇄를 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역으로 대체됨), 이는 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 다른 실시형태에서 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는, 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄가 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 이는 차례로 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제1 항원 결합 모이어티는 교차 Fab 중쇄를 포함하고, 여기서 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역으로 대체됨), 이는 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다.
이들 실시형태 중 일부에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는, 제1 항원 결합 모이어티의 교차 Fab 경쇄 폴리펩티드(여기서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역은 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유함(VH(1)-CL(1))) 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(2)-CL(2))를 추가로 포함한다. 다른 이들 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역이 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 교차 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CH1(1)), 그리고 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(2)-CL(2))를 추가로 포함한다. 다른 이들 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역이 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 이는 차례로 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(1)-CH1(1)-VL(2)-CL(2)), 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역이 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 이는 차례로 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(1)-CL(1)-VL(2)-CL(2)), 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 폴리펩티드가 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 가변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 이는 차례로 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CL(2)-VL(1)-CH1(1)), 또는 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 폴리펩티드가 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄 가변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 이는 차례로 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CL(2)-VH(1)-CL(1))를 추가로 포함한다.
이들 실시형태에 따른 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩티드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제3 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카르복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) 그리고 제3 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서 폴리펩티드는 예를 들어 이황화 결합에 의해 공유적으로 연결된다.
임의의 상기 실시형태에 따르면, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 구성요소(예를 들어, 항원 결합 모이어티, Fc 도메인)은 직접적으로 또는 본 명세서에 기재되어 있거나 당업계에 공지된 다양한 링커, 특히, 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2-20개 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 적합한 비면역원성 펩티드 링커는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함하며, 여기서 "n"은 일반적으로 1 내지 10, 일반적으로 2 내지 4의 숫자이다.
Fc 도메인
프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어진다. 예를 들어, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이며, 이의 각 서브유닛은 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 두 서브유닛은 서로 안정한 회합이 가능하다. 한 실시형태에서, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 1개 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정 실시형태에서 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또 다른 실시형태에서 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 구체적인 실시형태에서, Fc 도메인은 S228 위치에 아미노산 치환(Kabat 넘버링), 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 이 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 팔 교환을 감소시킨다(Stubenrauch 외, Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010) 참조). 추가의 특정 실시형태에서 Fc 도메인은 인간이다.
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명에 따른 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 상이한 항원 결합 모이어티를 포함하므로, Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 일반적으로 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드 사슬에 포함된다. 이들 폴리펩티드의 재조합 공동발현 및 후속된 이량체화는 이들 2개 폴리펩티드의 몇 가지 가능한 조합을 유도한다. 그러므로 재조합 생산에서 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 수율 및 순도를 개선하기 위해, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 Fc 도메인에 원하는 폴리펩티드의 회합을 촉진하는 변형을 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정 실시형태에서 본 발명에 따른 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 두 서브유닛들 사이의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인에 있다. 따라서, 한 실시형태에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인에 있다.
특정 실시형태에서 상기 변형은 소위 "놉-인투-홀" 변형으로, Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 하나에 "놉" 변형 및 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 중 다른 하나에 "홀" 변형을 포함한다.
놉-인투-홀 기술은 예를 들어 US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway 외, Prot Eng 9, 617-621 (1996) 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 제1 폴리펩티드의 경계면에 돌기("놉") 그리고 제2 폴리펩티드의 경계면에 이에 상응하는 구멍("홀")을 도입시켜 상기 돌기가 상기 구멍 안에 위치되게 함으로써 이형이량체 형성을 촉진시키고, 동형이량체 형성을 방해한다. 돌기(Protuberances)는 제1 폴리펩티드의 경계면의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(가령, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 제작된다. 상기 돌기와 동일 또는 유사한 크기의 상보적 공동(cavities)은, 제2 폴리펩티드의 경계면에서 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄(가령, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 생성된다.
따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기는 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 이에 의해 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내부에, 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내부의 공동에 위치할 수 있는 돌기를 생성하고, Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기는 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 이에 의해 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내부에, 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내부의 돌기가 위치할 수 있는 공동을 생성한다.
상기 돌기 및 공동은 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을, 예를 들어, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 변경함으로써 생성될 수 있다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 366번 위치의 트레오닌 잔기는 트립토판 잔기로 대체되고(T366W), Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 407번 위치의 티로신 잔기는 발린 잔기로 대체된다(Y407V). 한 실시형태에서, Fc 도메인의 제2 서브유닛에서, 추가로 366번 위치의 트레오닌 잔기는 세린 잔기로 대체되고(T366S), 368번 위치의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 대체된다(L368A).
또한 추가 실시형태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛에서, 추가로 354번 위치의 세린 잔기는 시스테인 잔기로 대체되고(S354C), Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가로 349번 위치의 티로신 잔기는 시스테인 잔기로 대체된다(Y349C). 이들 2개 시스테인 잔기들의 도입은 Fc 도메인의 상기 2개 하위유닛들 사이에 이황화물 교차결합을 형성시키므로, 이량체를 더욱 안정화시킨다(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15(2001)).
특정 실시형태에서, CD3에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는(선택적으로 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 통해)("놉" 변형을 포함하는) Fc 도메인의 제1 서브유닛에 융합된다. 이론에 얽매이지 않고, Fc 도메인의 놉-함유 서브유닛에 대한 CD3에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티의 융합은 CD3에 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자의 생성을 (추가로) 최소화할 것이다(두 개의 놉 함유 폴리펩티드들의 입체적 충돌).
또 다른 실시형태에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형은 예를 들어 PCT 공개 공보 WO 2009/089004에 기재된 정전기적 조향 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 이 방법은 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 경계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 하전된 아미노산 잔기로의 대체를 포함하므로 동종이량체 형성은 정전기적으로 바람직하지 않지만 이종이량체화는 정전기적으로 유리하게 된다.
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
Fc 도메인은 표적 조직 내 우수한 축적에 원인이 되는 긴 혈청 반감기 및 바람직한 조직-혈액 분포 비율을 비롯하여, 프로테아제-활성화 가능한 T 세포 활성화 이중특이성 분자에 유리한 약동학적 특성들을 부여한다. 그러나 동시에 이는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 바람직한 항원-보유 세포 보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포에 대한 바람직하지 않은 표적화를 초래할 수 있다. 더욱이, Fc 수용체 신호전달 경로의 공동 활성화는 T 세포 활성화 특성 및 항원 결합 분자의 긴 반감기와 함께 사이토카인 방출을 유도할 수 있으며, 이는 전신 투여시 사이토카인 수용체의 과도한 활성화 및 심각한 부작용을 초래한다. T 세포 이외의 (Fc 수용체-보유) 면역 세포의 활성화는, 예를 들어, NK 세포에 의한 T 세포의 잠재적 파괴로 인해 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 효능을 감소시킬 수도 있다.
따라서, 특정 실시형태에서 본 발명에 따른 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 한 이러한 실시형태에서 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자)은, 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자)과 비교하여 Fc 수용체에 대해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만 및 가장 바람직하게는 5% 미만의 결합 친화도 및/또는 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 프로테아제 활성화 T 세포 활성화 이중특이성 분자)과 비교하여 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 한 실시형태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자)은 Fc 수용체에 실질적으로 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 특정 실시형태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 한 실시형태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 한 실시형태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 한 구체적인 실시형태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 한 실시형태에서 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP 및 사이토카인 분비의 군으로부터 선택된 하나 이상이다. 특정 실시형태에서 효과기 기능은 ADCC이다. 한 실시형태에서, Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 실질적으로 유사한 결합 친화도를 나타낸다. FcRn에 대해 실질적으로 유사한 결합은, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자)이 FcRn에 대하여 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자)의 결합 친화도의 약 70% 초과, 특히 약 80% 초과, 보다 특히 약 90% 초과를 나타낼 때 달성된다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 특정 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에 존재한다. 한 실시형태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시킨다. 한 실시형태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 2배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 있는 실시형태에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 적어도 10배, 적어도 20배 또는 적어도 50배 만큼 감소시킬 수 있다. 한 실시형태에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자와 비교하여 Fc 수용체에 대해 20% 미만, 특히 10% 미만, 더욱 특히 5% 미만의 결합 친화도를 나타낸다. 특정 실시형태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 실시형태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일부 실시형태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 한 구체적인 실시형태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게는, 이들 수용체 각각에 대한 결합이 감소된다. 일부 실시형태에서, 보체 성분에 대한 결합 친화도, 특히 C1q에 대한 결합 친화도도 감소된다. 한 실시형태에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화도는 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도의 보존은 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자)이 조작되지 않은 형태의 Fc 도메인(또는 상기 조작되지 않은 형태의 Fc 도메인을 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자)의 FcRn에 대한 결합 친화도의 약 70% 초과를 나타낼 때 달성된다. Fc 도메인 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 이러한 친화도의 약 80% 초과 및 심지어 약 90% 초과를 나타낼 수 있다. 특정 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 이러한 효과기 기능의 감소는 비제한적으로 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 보체 의존성 세포독성(CDC) 감소, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 감소, 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP) 감소, 사이토카인 분비 감소, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수 감소, NK 세포에 대한 결합 감소, 대식세포에 대한 결합 감소, 단핵세포에 대한 결합 감소, 다형핵세포에 대한 결합 감소, 직접적인 신호전달 유도 세포자멸사 감소, 표적-결합된 항체들의 가교결합 감소, 수지상세포 성숙화 감소 또는 T 세포 프라이밍 감소. 한 실시형태에서 효과기 기능 감소는 CDC 감소, ADCC 감소, ADCP 감소 및 사이토카인 분비 감소의 군으로부터 선택된 하나 이상이다. 특정 실시형태에서 효과기 기능 감소는 ADCC 감소이다. 한 실시형태에서, ADCC 감소는 조작되지 않은 Fc 도메인(또는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자)에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만이다.
한 실시형태에서 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 한 실시형태에서, 상기 Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329의 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 실시형태에서, 상기 Fc 도메인은 L234, L235 및 P329의 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함한다. 이러한 한 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 한 실시형태에서, 상기 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 실시형태에서, 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G이다. 한 실시형태에서 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환 및 E233, L234, L235, N297 및 P331로부터 선택된 위치에서 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 실시형태에서 추가 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정 실시형태에서 Fc 도메인은 위치 P329, L234 및 L235에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시형태에서 Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA")를 포함한다. 이러한 한 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환들의 "P329G LALA" 조합은 PCT 특허출원 공개공보 제 WO 2012/130831(본원에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체(및 보체)를 거의 완전히 제거한다. WO 2012/130831은 또한 이러한 돌연변이체 Fc 도메인을 제조하는 방법 및 이의 특성, 예를 들어, Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능을 결정하는 방법을 기재하고 있다.
IgG4 항체는 IgG1 항체와 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 실시형태에서 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 한 실시형태에서 IgG4 Fc 도메인은 위치 S228에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P를 포함한다. 한 실시형태에서 IgG4 Fc 도메인은, Fc 수용체에 대한 이의 결합 친화도 및/또는 이의 효과기 기능을 추가로 감소시키기 위해, 위치 L235에 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 L235E를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 P329에 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 P329G를 포함한다. 특정 실시형태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228, L235 및 P329에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G를 포함한다. 이러한 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 이들의 Fcγ 수용체 결합 특성은 그 전문이 본원에 참고로 포함된, PCT 특허출원 공개공보 WO 2012/130831에 기재되어 있다.
특정 실시형태에서, 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 선택적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인이거나, 아미노산 치환 S228P, L235E 및 선택적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
특정 실시형태에서 Fc 도메인의 N-당화가 제거되었다. 한 이러한 실시형태에서 Fc 도메인은 위치 N297에서 아미노산 돌연변이, 특히 아스파라긴을 알라닌(N297A) 또는 아스파르트산(N297D)으로 대체하는 아미노산 치환을 포함한다.
상기에 그리고 PCT 특허출원 공개공보 WO 2012/130831에 기재된 Fc 도메인 이외에도, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인은 또한 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국 특허 제6,737,056호). 이런 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 두 개 또는 그 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(미국 특허 제7,332,581).
돌연변이 Fc 도메인을 해당 분야에 공지된 유전학적 또는 화학적 방법을 사용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형시켜 제조할 수 있다. 유전학적 방법은 인코딩 DNA 서열의 부위-특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는 예를 들어 시퀀싱에 의해 확인할 수 있다.
Fc 수용체에 대한 결합은 예를 들어 ELISA에 의해서 또는 BIAcore 기기(GE Healthcare)와 같은 표준 기기를 사용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해서 쉽게 측정할 수 있으며 이러한 Fc 수용체는 재조합 발현에 의해 얻을 수 있다. 적합한 이러한 결합 분석이 본원에 기재되어 있다. 또는, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 이중특이성 항원 결합 분자의 결합 친화도를 특정 Fc 수용체, 예를 들어, 인간 NK 세포 발현 FcγIIIa 수용체를 발현하는 것으로 공지된 세포주를 사용하여 평가할 수 있다.
Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 효과기 기능은 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석이 본원에 기재되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 다른 예들은 US 5,500,362; Hellstrom 외, Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) 및 Hellstrom 등, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); US 5,821,337; Bruggemann 등, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)에 기재되어 있다. 대안으로, 비-방사능활성 분석 방법들이 이용될 수 있다(예를 들면, 유동 세포 분석을 위한 ACTI™ 비-방사능활성 세포독성 분석(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 그리고 CytoTox 96® 비-방사능활성 세포독성 분석(Promega, Madison, WI) 참고). 이러한 분석에 유용한 효과기 세포들은 말초 혈액 단핵 세포들(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포들을 포함한다. 대안으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은, 예를 들어, Clynes 외. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95, 652-656 (1998)에서 공개된 바와 같은 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 보체 성분, 구체적으로 C1q에 대한 Fc 도메인의 결합은 감소된다. 따라서, Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된 일부 실시형태에서, 효과기 기능 감소는 CDC 감소를 포함한다. C1q 결합 분석을 수행하여 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 C1q에 결합할 수 있는지, 그리하여 CDC 활성을 갖는지 여부를 측정할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석이 실행될 수 있다(예를 들면, Gazzano-Santoro 외. J. Immunol. Methods 202, 163 (1996); Cragg 외. Blood. 101, 1045-1052 (2003); 그리고 Cragg 및 Glennie, Blood. 103, 2738-2743 (2004) 참조).
항원 결합 모이어티
본 발명의 항원 결합 분자는 이중특이성이다, 즉, 이는 2개의 별개의 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 2개의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 본 발명에 따르면, 항원 결합 모이어티는 Fab 분자(즉, 각각 가변 및 불변 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄로 구성된 항원 결합 도메인)이다. 한 실시형태에서 상기 Fab 분자는 인간이다. 또 다른 실시형태에서 상기 Fab 분자는 인간화된다. 또 다른 실시형태에서 상기 Fab 분자는 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
항원 결합 모이어티 중 적어도 하나는 교차 Fab 분자이다. 이러한 변형은 상이한 Fab 분자로부터의 중쇄 및 경쇄의 미스페어링을 방지함으로써 재조합 생산에서 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 수율 및 순도를 개선시킨다. 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자에 유용한 특정 교차 Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교환된다. 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자에 유용한 또 다른 교차 Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환된다.
본 발명에 따른 특정 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 표적 세포 항원, 특히, 종양 세포 항원 및 CD3에 동시에 결합할 수 있다. 한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 표적 세포 항원 및 CD3에 동시 결합함으로써 T 세포 및 표적 세포를 가교결합시킬 수 있다. 훨씬 더 특정한 실시형태에서, 이러한 동시 결합은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 초래한다. 한 실시형태에서, 이러한 동시 결합은 T 세포의 활성화를 초래한다. 다른 실시형태에서, 이러한 동시 결합은 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성 및 활성화 마커의 발현의 군으로부터 선택된 T 림프구, 특히, 세포독성 T 림프구의 세포 반응을 가져온다. 한 실시형태에서, 표적 세포 항원에 대한 동시 결합 없이 CD3에 대한 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 결합은 T 세포 활성화를 초래하지 않는다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 T 세포의 세포독성 활성을 표적 세포에 대해 재지정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 재지정은 표적 세포에 의한 MHC-매개 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성과 무관하다.
특히, 본 발명의 임의의 실시형태에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 실시형태에서 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포이다.
CD3 결합 모이어티
본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 CD3에 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 모이어티(본원에서 "CD3 항원 결합 모이어티" 또는 "제1 항원 결합 모이어티"로도 지칭됨)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 CD3에 결합할 수 있는 1개 이하의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 CD3에 대한 1가 결합을 제공한다. CD3 항원 결합은 교차 Fab 분자이다, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 또는 불변 영역들이 교환되는 Fab 분자이다. 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자에 포함된, 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 모이어티가 있는 실시형태에서, CD3에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 바람직하게는 교차 Fab 분자이고 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자이다.
특정 실시형태에서 CD3은 인간 CD3 또는 사이노몰구스 CD3, 가장 특히, 인간 CD3이다. 특정 실시형태에서 CD3 항원 결합 모이어티는 인간 및 사이노몰구스 CD3에 대해 교차 반응성(즉, 특이적으로 결합한다)이다. 일부 실시형태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 CD3의 엡실론 서브유닛에 결합할 수 있다.
CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함한다.
한 실시형태에서 CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 2의 중쇄 CDR1, 서열번호 4의 중쇄 CDR2, 서열번호 10의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 21의 경쇄 CDR2 및 서열번호 22의 경쇄 CDR3을 포함한다.
한 실시형태에서, CD3 항원 결합 도메인은 서열번호 16의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, CD3 항원 결합 모이어티는 서열번호 16의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 23의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
표적 세포 항원 결합 모이어티
본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 모이어티(본원에서 "표적 세포 항원 결합 모이어티" 또는 "제2" 또는 "제3" 항원 결합 모이어티"로도 지칭됨)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 이러한 특정 실시형태에서, 이들 항원 결합 모이어티 각각은 동일한 항원 결정인자에 특이적으로 결합한다. 더더욱 특정한 실시형태에서, 이들 항원 결합 모이어티들은 모두 동일하다. 한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 포함한다. 한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 2개 이하의 항원 결합 모이어티를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 표적 세포 항원 결합 모이어티는 Fab 분자, 특히 특정 항원 결정인자에 결합하고 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 표적 부위에, 예를 들어, 항원 결정인자를 보유하는 특정 유형의 종양 세포에 지시할 수 있는 통상적인 Fab 분자이다.
특정 실시형태에서 표적 세포 항원 결합 모이어티는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합한다. 특정 실시형태에서 표적 세포 항원 결합 모이어티는 표적 세포의 표면 상의 엽산 수용체 1(FolR1)에 특이적으로 결합한다. 또 다른 특정 실시형태에서 표적 세포 항원 결합 모이어티는 티로시나제 관련 단백질 1(TYRP1), 구체적으로, 인간 TYRP1에 특이적으로 결합한다.
특정 실시형태에서 표적 세포 항원 결합 모이어티는 종양 세포 또는 바이러스-감염 세포 상에 제시된 항원과 같은 병리학적 상태와 관련된 항원에 대해 지시된다. 적합한 항원은 세포 표면 항원, 예를 들어, 세포 표면 수용체이지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서 항원은 인간 항원이다. 특정 실시형태에서 표적 세포 항원은 엽산 수용체 1(FolR1) 및 티로시나제 관련 단백질 1(TYRP1)로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 FolR1에 특이적인 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시형태에서 FolR1은 인간 FolR1이다. 한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 인간 FolR1에 특이적이고 인간 FolR2 또는 인간 FolR3에 결합하지 않는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 한 실시형태에서, FolR1에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함한다.
한 실시형태에서 FolR1에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 54의 중쇄 CDR1, 서열번호 55의 중쇄 CDR2, 서열번호 56의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 21의 경쇄 CDR2 및 서열번호 22의 경쇄 CDR3을 포함한다.
추가 실시형태에서, FolR1에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 53에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 23에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열 또는 기능성을 유지하는 이의 변이체를 포함한다.
한 실시형태에서, FolR1에 특이적인 항원 결합 모이어티는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
마스킹 모이어티
본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 적어도 하나의 마스킹 모이어티를 포함한다. 다른 사람들은 결합 모이어티에 의해 인식되는 항원의 단편으로 결합 모이어티를 캡핑함으로써 항체의 결합을 마스킹하려고 시도해왔다(예를 들어, WO 2013/128194). 이 접근 방식에는 몇 가지 제한 사항이 있다. 예를 들어, 항원을 사용하면 결합 모이어티의 친화도를 감소시키는 데 있어 유연성이 떨어진다. 항원 마스크에 의해 확실하게 마스킹되기 위해서는 친화도가 충분히 높아야 하기 때문이다. 또한, 해리된 항원은 생체내에서 이의 동족 수용체(들)에 결합하여 상호작용할 가능성이 있고 이러한 수용체를 발현하는 세포에 바람직하지 않은 신호를 유발할 수 있다. 대조적으로, 본원에 기술된 접근법은 항-이디오타입 항체 또는 이의 단편을 마스크로서 사용한다. 효과적인 마스킹 모이어티를 설계하기 위한 두 가지 상계적 고려사항은 1. 마스킹의 효율성 및 2. 마스킹의 가역성이다. 친화도가 너무 낮으면 마스킹이 비효율적이다. 그러나 친화도가 너무 높으면 마스킹 과정은 용이하게 가역성일 수 없다. 높은 친화도의 항-이디오타입 마스크 또는 낮은 친화도의 항-이디오타입 마스크 중 어느 것이 더 잘 작동할지 예측할 수 없었다. 본원에 기술된 바와 같이, 더 높은 친화도 마스킹 모이어티는 항원 결합면을 마스킹함에 있어 전반적으로 더 우수하게 수행하였으며, 동시에 분자의 활성화를 위해 효과적으로 제거될 수 있었다. 한 실시형태에서, 항-이디오타입 마스크는 1-8 nM의 KD를 갖는다. 한 실시형태에서, 항-이디오타입 마스크는 37℃에서 2nM의 KD를 갖는다. 한 특정 실시형태에서, 마스킹 모이어티는 CD3, 예를 들어, 인간 CD3에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 모이어티의 이디오타입을 인식한다. 한 특정 실시형태에서, 마스킹 모이어티는 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 모이어티의 이디오타입을 인식한다.
한 실시형태에서 마스킹 모이어티는 CD3-결합 모이어티를 마스킹하고, 서열번호 2의 중쇄 CDR1, 서열번호 4의 중쇄 CDR2, 서열번호 10의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 21의 경쇄 CDR2 및 서열번호 22의 경쇄 CDR3 중 적어도 하나를 포함한다. 한 실시형태에서 마스킹 모이어티는 서열번호 2의 중쇄 CDR1, 서열번호 4의 중쇄 CDR2, 서열번호 10의 중쇄 CDR3, 서열번호 20의 경쇄 CDR1, 서열번호 21의 경쇄 CDR2 및 서열번호 22의 경쇄 CDR3을 포함한다.
한 실시형태에서, 마스킹 모이어티는 CD3-결합 모이어티를 마스킹하고 서열번호 16에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 마스킹 모이어티는 CD3-결합 모이어티를 마스킹하고 서열번호 23의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 마스킹 모이어티는 서열번호 58의 중쇄 CDR1, 서열번호 59, 서열번호 84 및 서열번호 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2, 서열번호 60의 중쇄 CDR3, 서열번호 62 및 서열번호 82로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1, 서열번호 63의 경쇄 CDR2 및 서열번호 64 및 서열번호 88로 이루어진 군으로터 선택된 경쇄 CDR3 중 적어도 하나를 포함한다.
한 실시형태에서 마스킹 모이어티는 서열번호 58의 중쇄 CDR1, 서열번호 59의 중쇄 CDR2, 서열번호 60의 중쇄 CDR3, 서열번호 62의 경쇄 CDR1, 서열번호 63의 경쇄 CDR2 및 서열번호 64의 경쇄 CDR3 중 적어도 하나를 포함한다. 한 실시형태에서 마스킹 모이어티는 서열번호 57에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 61에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열 또는 기능성을 유지하는 이의 변이체를 포함한다.
한 실시형태에서 마스킹 모이어티는 서열번호 58의 중쇄 CDR1, 서열번호 59의 중쇄 CDR2, 서열번호 60의 중쇄 CDR3, 서열번호 82의 경쇄 CDR1, 서열번호 63의 경쇄 CDR2 및 서열번호 64의 경쇄 CDR3 중 적어도 하나를 포함한다.
한 실시형태에서 마스킹 모이어티는 서열번호 58의 중쇄 CDR1, 서열번호 84의 중쇄 CDR2, 서열번호 60의 중쇄 CDR3, 서열번호 82의 경쇄 CDR1, 서열번호 63의 경쇄 CDR2 및 서열번호 64의 경쇄 CDR3 중 적어도 하나를 포함한다.
한 실시형태에서 마스킹 모이어티는 서열번호 58의 중쇄 CDR1, 서열번호 86의 중쇄 CDR2, 서열번호 60의 중쇄 CDR3, 서열번호 82의 경쇄 CDR1, 서열번호 63의 경쇄 CDR2 및 서열번호 64의 경쇄 CDR3 중 적어도 하나를 포함한다.
한 실시형태에서 마스킹 모이어티는 서열번호 59의 중쇄 CDR1, 서열번호 86의 중쇄 CDR2, 서열번호 60의 중쇄 CDR3, 서열번호 62의 경쇄 CDR1, 서열번호 63의 경쇄 CDR2 및 서열번호 88의 경쇄 CDR3 중 적어도 하나를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 마스킹 모이어티는 인간화된다. 바람직한 실시형태에서, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 인간화된다. 면역글로불린을 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 기술되어 있다.
한 실시형태에서 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 제공되며, 이때 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 79, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85 및 서열번호 89로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 87 및 서열번호 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 바람직한 실시형태에서 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 제공되며, 이때 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 79, 서열번호 83 및 서열번호 85로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 80 및 서열번호 81로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 제공되며, 이때 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 79에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 80에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 79의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 80의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 제공되며, 이때 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 79에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 81에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 79의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 81의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 제공되며, 이때 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 83에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 81에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 83의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 81의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 제공되며, 이때 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 85에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 81에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 85의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 81의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 제공되며, 이때 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 84에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 87에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 84의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 87의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 제공되며, 이때 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 89에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 90에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 89의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 90의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 실시형태에서 마스킹 모이어티는 서열번호 91과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 항-이디오타입 scFv이다. 한 실시형태에서, 항-이디오타입 scFv는 서열번호 91의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서 마스킹 모이어티는 서열번호 92와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 항-이디오타입 scFv이다. 한 실시형태에서, 항-이디오타입 scFv는 서열번호 92의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서 마스킹 모이어티는 서열번호 93과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 항-이디오타입 scFv이다. 한 실시형태에서, 항-이디오타입 scFv는 서열번호 93의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서 마스킹 모이어티는 서열번호 94와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 항-이디오타입 scFv이다. 한 실시형태에서, 항-이디오타입 scFv는 서열번호 94의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
CD3 및 FolR1에 결합할 수 있는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자
상기 본원에 기재된 바와 같은 CD3에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 모이어티, 상기 본원에 기재된 바와 같은 FolR1에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 모이어티, 상기 본원에 기재된 바와 같은 Fc 도메인 및 상기 본원에 기재된 바와 같은 마스킹 모이어티는 다양한 구조로 서로에 융합될 수 있다. 예시적인 구조 및 서열은 본원에 하기 개시되어 있다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 65와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 66과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열 및 서열번호 67과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 65의 폴리펩티드 서열, 서열번호 66의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 67의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 74와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 66과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열 및 서열번호 67과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 74의 폴리펩티드 서열, 서열번호 66의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 67의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 76과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 66과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열 및 서열번호 67과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 76의 폴리펩티드 서열, 서열번호 66의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 67의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 95와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 66과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열 및 서열번호 67과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 95의 폴리펩티드 서열, 서열번호 66의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 67의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시형태에서 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 95의 폴리펩티드 하나, 서열번호 66의 폴리펩티드 하나 및 서열번호 67의 폴리펩티드 2개를 포함한다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 96과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 66과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열 및 서열번호 67과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 96의 폴리펩티드 서열, 서열번호 66의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 67의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시형태에서 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 96의 폴리펩티드 하나, 서열번호 66의 폴리펩티드 하나 and two 폴리펩티드 of 서열번호 67의 폴리펩티드 2개를 포함한다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 97과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 66과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열 및 서열번호 67과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 97의 폴리펩티드 서열, 서열번호 66의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 67의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시형태에서 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 97의 폴리펩티드 하나, 서열번호 66의 폴리펩티드 하나 및 서열번호 67의 폴리펩티드 2개를 포함한다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 98과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열, 서열번호 66과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열 및 서열번호 67과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 98의 폴리펩티드 서열, 서열번호 66의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 67의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 한 실시형태에서 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 98의 폴리펩티드 하나, 서열번호 66의 폴리펩티드 하나 및 서열번호 67의 폴리펩티드 2개를 포함한다.
링커
한 양상에서, 본 발명은 분자의 항원 결합의 항원 결합을 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이디오타입 특이적 폴리펩티드에 관한 것이다. 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐하기 위한 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 항-CD3 항원 결합 부위의 이디오타입에 결합할 수 있어야 하고, 이에 의해 CD3에 대한 항-CD3 항원 결합 부위의 결합을 감소 또는 제거할 수 있어야 한다. 한 실시형태에서 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 항-이디오타입 scFv이다. 한 실시형태에서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 링커를 통해 분자에 공유적으로 부착된다. 한 실시형태에서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 하나 초과의 링커를 통해 분자에 공유적으로 부착된다. 한 실시형태에서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 2개의 링커를 통해 분자에 공유적으로 부착된다. 한 실시형태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 한 실시형태에서 링커는 프로테아제-절단가능 링커이다.
한 실시형태에서, 프로테아제-활성화 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 서열번호 68, 70, 75, 99, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 또는 127과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 프로테아제 인식 부위를 갖는 링커를 포함한다. 한 실시형태에서, 프로테아제 인식 부위는 서열번호 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113 또는 114의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 한 실시형태에서, 프로테아제 인식 부위는 서열번호 114의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에서, 프로테아제는 금속단백분해효소, 예를 들어 매트릭스 금속단백분해효소(MMP) 1-28 및 A 디스인테그린 및 금속단백분해효소(ADAM) 2, 7-12, 15, 17-23, 28-30 및 33, 세린 프로테아제, 예를 들어, 유로키나제-유사 플라스미노겐 활성화제 및 매트립타제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제 및 카텝신 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 특정 실시형태에서 프로테아제는 MMP9 또는 MMP2이다. 추가의 특정 실시형태에서, 프로테아제는 매트립타제이다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 또는 이의 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 단편은 항원 결합 단편이다.
본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전체 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 또는 공동-발현되는 다중(예를 들어, 2개 이상) 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공동 발현된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 예를 들어 이황화 결합 또는 다른 수단을 통해 결합하여 기능성 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 형성할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 모이어티의 경쇄 부분은 항원 결합 모이어티의 중쇄 부분, Fc 도메인 서브유닛 및 선택적으로 또 다른 항원 결합 모이어티(의 일부)를 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 일부로부터의 별도의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 공동 발현될 때, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 회합하여 항원 결합 모이어티를 형성할 것이다. 또 다른 예에서, 2개의 Fc 도메인 서브유닛 중 하나 및 선택적으로 하나 이상의 항원 결합 모이어티(의 일부)를 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 일부는, 2개의 Fc 도메인 서브유닛 중 다른 하나 및 선택적으로 항원 결합 모이어티(의 일부)를 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 일부로부터의 별도의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 공동 발현되는 경우, Fc 도메인 서브유닛들은 회합하여 Fc 도메인을 형성할 것이다.
일부 실시형태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 전체 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 인코딩한다. 다른 실시형태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 본 발명에 따른 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자에 포함된 폴리펩티드들을 인코딩한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것으로, 여기서 폴리뉴클레오티드는 가변 영역 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 관한 것으로, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열번호 65, 66, 67, 69, 74, 76, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 이의 단편에 제시된 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
본 발명의 이디오타입 특이적 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공동 발현되는 전체 이디오타입 특이적 폴리펩티드 또는 다중(예를 들어, 2개 이상) 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공동 발현된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 예를 들어 이황화 결합 또는 다른 수단을 통해 결합하여 기능성 이디오타입 특이적 폴리펩티드, 예를 들어, 마스킹 모이어티를 형성할 수 있다. 예를 들어, 한 실시형태에서 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 항-이디오타입 scFv(단일 사슬 가변 단편)이고, 여기서 항-이디오타입 scFv의 경쇄 가변 부분은 항-이디오타입 scFv의 중쇄 가변 부분을 포함하는 항-이디오타입 scFv의 일부와 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 공동 발현될 때, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 회합하여 항-이디오타입 scFv를 형성할 것이다. 일부 실시형태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 이디오타입 특이적 폴리펩티드를 인코딩한다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 예를 들어 고상 펩티드 합성(예: Merrifield 고상 합성) 또는 재조합 생산에 의해 얻을 수 있다. 재조합 생산을 위해, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자(단편)를 인코딩하는, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 단리되고 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내부에 삽입된다. 상기와 같은 폴리뉴클레오티드는 통상적인 과정을 사용하여 쉽게 단리되고 시퀀싱 될 수 있다. 한 실시형태에서, 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터를 제공한다. 당업자들에게 주지된 방법을 사용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 이러한 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자(단편)의 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터를 제작할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어, Maniatis 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 및 Ausubel 외, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)에 기재된 기술들을 참조하라. 이러한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 부분이거나 또는 핵산 단편일 수 있다. 이러한 발현 벡터는 내부에 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자(단편)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(즉, 코딩 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작동가능한 회합으로 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈들로 구성된 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만, 존재하는 경우, 코딩 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있으나, 임의의 연접 서열, 예를 들어, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5' 및 3' 비번역 영역 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 코딩 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구조체에, 예를 들어 단일 벡터상에 또는 별도의 폴리뉴클레오티드 구조체에, 예를 들어, 별도의(상이한) 벡터상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 함유할 수 있거나, 2개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다, 예를 들어, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있으며, 이들은 단백질분해 절단을 통해 최종 단백질로 번역-후 또는 번역과 동시에 분리된다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자(단편) 또는 이의 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 또는 융합되지 않은 이종 코딩 영역들을 코딩할 수 있다. 이종 코딩 영역들은 제한없이, 특수화된 구성요소 또는 모티프, 예를 들어, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작동가능한 회합은, 유전자 산물, 예를 들어, 폴리펩티드에 대한 코딩 영역의 발현이 하나 이상의 조절 서열들의 영향 또는 제어하에 놓이도록 하는 방식으로 유전자 산물이 조절 서열들과 회합되는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예를 들어 폴리펩티드 코딩 영역 및 이와 회합된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 생성시키고 이러한 2개의 DNA 단편들 사이의 링키지의 성질이 이러한 유전자 산물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열들의 능력을 방해하지 않는 또는 전사될 DNA 템플릿의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동가능하게 회합된다". 따라서, 프로모터 영역은 프로모터가 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 전사를 실행할 수 있는 경우 이러한 핵산과 작동가능하게 회합될 것이다. 상기 프로모터는 오직 예정된 세포에서만 해당 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포-특이성 프로모터일 수 있다. 프로모터 외에, 다른 전사 조절 요소들, 예를 들어, 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호가 이러한 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 회합되어 세포-특이성 전사를 유도할 수 있다. 적합한 프로모터 및 기타 전사 조절 영역이 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역이 당업자에게 공지되어 있다. 여기에는 비제한적으로 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예를 들어 비제한적으로 거대세포바이러스로부터의 프로모터 및 인핸서 분절(예를 들어 인트론-A와 접합된, 극초기 프로모터), 유인원 바이러스 40(예를 들어, 초기 프로모터) 및 레트로바이러스(예를 들어 Rous 육종 바이러스)를 포함한다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들, 예를 들어 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼
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-글로빈, 뿐만 아니라 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열들을 포함한다. 또 다른 적합한 전사 조절 영역은 조직-특이성 프로모터 및 인핸서, 뿐만 아니라 유도성 프로모터(예를 들어 프로모터 유도성 테 트라사이클린)를 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소들이 당업자들에게 공지되어 있다. 이들에는 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소들(특히 내부 리보솜 진입 부위 또는 IRES, 또한 CITE 서열로서 지칭됨)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 발현 카세트는 또한 다른 특징들, 예를 들어 복제 원점 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들어, 레트로바이러스 긴 말단 반복 서열(LTR) 또는 아데노-연관 바이러스(AAV) 역위 말단 반복 서열(ITR)을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 분비를 지시하는, 분비 또는 신호 펩티드를 인코딩하는 또 다른 코딩 영역과 회합될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 분비를 원하는 경우, 신호 서열을 인코딩하는 DNA를 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산의 상류에 배치할 수 있다. 이러한 신호 가설에 따르면, 일단 거친면 소포체를 가로질러 성장하는 단백질 사슬의 방출이 시작되면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은 성숙한 단백질로부터 절단된 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가지며, 이는 번역된 폴리펩티드로부터 절단되어 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙한" 형태를 생성한다는 것을 알고 있다. 특정 실시형태에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드 또는 이와 작동가능하게 회합된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 해당 서열의 기능적 유도체가 사용된다. 한편, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 이의 기능적 유도체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 야생형 리더 서열을 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환할 수 있다.
추후 정제를 용이하게 하거나(예를 들어 히스티딘 태그) 또는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 표지함에 도움을 주기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 인코딩하는 DNA를, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자(단편) 인코딩 폴리뉴클레오티드 내부에 또는 이의 단부에 포함시킬 수 있다.
본 발명의 추가 실시형태에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 특정 양상에서 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 각각의 폴리뉴클레오티드 및 벡터와 관련하여 본원에 기재된 특징들 중 어느 하나를 단독으로 또는 조합하여 통합할 수 있다. 한 양상에서, 숙주 세포는 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자(의 일부)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들어 상기 벡터로 형질전환되거나 형질감염되었다). 본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 또는 이의 단편을 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 복제하고 이의 발현을 지원하기에 적합한 숙주 세포는 해당 분야에 널리 공지이다. 이러한 세포는 특정한 발현 벡터로 적절히 형질감염 또는 형질도입 될 수 있으며 다량의 벡터 함유 세포를 대규모 발효장치의 씨딩을 위해 증식시켜, 임상용으로 충분한 양의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 얻을 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예를 들어, 대장균 또는 다양한 진핵생물 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드는, 특히 당화가 필요하지 않은 경우, 박테리아에서 생성될 수 있다. 발현 후에, 이러한 폴리펩티드는 용액 분획 중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리되어 추가로 정제될 수 있다. 원핵세포 이외에도, 진핵 미생물, 이를 테면 섬유상 진균 또는 효모는 폴리펩티드-인코딩 벡터의 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 여기에는 당화 경로가 "인간화되고", 결과적으로 부분적으로 또는 온전하게 인간 당화 패턴을 가진 폴리펩티드가 생산되는 진균 및 효모 균주가 포함된다. Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), and Li 외, Nat Biotech 24, 210-215 (2006)를 참조하라. (당화된) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포들은 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래한다. 무척추동물 세포들의 예로는 식물 및 곤충 세포들이 포함된다. 스포도프테라 푸르기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포들의 형질감염을 위하여 곤충 세포들과 병용될 수 있는 많은 베큘로바이러스 균주들이 확인되었다. 식물 세포 배양물 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429호를 참고하라(유전자삽입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 을 설명). 척추동물 세포들 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하도록 개조시킨 포유동물 세포주들이 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, Graham 등, J. Gen Virol. 36, 59 (1977)에 설명된 293 또는 293T 세포), 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들면, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)에 설명된 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562), (예를 들면, Mather 등, Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 (1982)에 설명된) TRI 세포, MRC 5 세포 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR-CHO 세포를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(Urlaub 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); 및 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주를 포함한다. 단백질 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토는 예를 들어, Yazaki 및 Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)를 참고하라. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어, 몇 가지 언급하자면, 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포 및 식물 세포를 포함하나, 또한 유전자삽입 동물, 유전자삽입 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포를 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프구 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
이들 시스템에서 외래 유전자를 발현시키는 표준 기술은 해당 분야에 공지되어 있다. 항원 결합 도메인, 예를 들어, 항체의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포들은, 항체 사슬의 다른 하나를 또한 발현하도록 조작되어, 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄를 모두 갖는 항체가 되게 할 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명에 따른 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 생산하는 방법이 제공되며, 이 때 상기 방법은 본원에 제공된, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, 그리고 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 회수하는 단계를 포함한다.
프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 구성요소들은 유전적으로 서로에 융합되어 있다. 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 그의 구성요소들이 서로 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 설계될 수 있다. 링커의 조성 및 길이는 당업계에 공지된 방법으로 측정될 수 있고 효능에 대해 테스트될 수 있다. 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 상이한 성분들간의 링커 서열들의 예는 본원에 제공된 서열에서 찾을 수 있다. 또한, 이러한 융합 단백질의 개별 성분들, 예를 들어, 엔도펩티다제 인식 서열을 분리하기 위해, 또 다른 서열들이 필요에 따라 절단 부위에 혼입될 수 있다.
특정 실시형태에서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 하나 이상의 항원 결합 모이어티는 항원 결정인자에 결합할 수 있는 적어도 하나의 항체 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 천연 또는 비천연 항체 및 이의 단편의 일부를 형성하며 이로부터 유래될 수 있다. 다클론 항체 및 단클론 항체의 생산 방법은 해당 분야에 공지이다(예를 들어, Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 참조). 비천연 항체는 고상 펩티드 합성을 사용하여 제작될 수 있거나, 재조합적으로 생산될 수 있거나(예를 들어 US 4,186,567에 기재된 바와 같이) 또는 예를 들어 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리들을 스크리닝함으로써 수득될 수 있다(예를 들어 US 특허 제 5,969,108(McCafferty) 참조).
임의의 동물 종의 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역이 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자에서 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 비제한적인 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 뮤린, 영장류 또는 인간 기원일 수 있다. 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 인간에 사용하기 위한 것이라면, 항체의 불변 영역은 인간 유래인 키메라 형태의 항체가 사용될 수 있다. 항체의 인간화 형태 또는 완전한 인간 형태는 또한 해당 분야에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다(예를 들어, Winter의 미국 특허 제5,565,332 참조). 인간화를, 예를 들어, 제한없이, (a) 비인간(예를 들어 공여체 항체) CDR을 중요한 프레임워크 잔기(예를 들어 우수한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능의 유지에 중요한 것들)를 유지하면서 또는 유지하지 않고 인간(예를 들어 수용체 항체) 프레임워크 및 불변 영역에 이식하는 것, (b) 오직 비인간 특이성-결정 영역(SDR 또는 CDR; 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기)만을 인간 프레임워크 및 불변 영역상에 이식하는 것, 또는 (c) 전체 비인간 가변 도메인들을 이식하고, 그러나 이들을 표면 잔기들을 대체하여 인간-유사 섹션으로 "은폐"하는 것을 비롯한 다양한 방법들에 의해 구현할 수 있다. 인간화된 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어, Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)에 리뷰되어 있으며, 그리고 또한 Riechmann 등, Nature 332, 323-329 (1988); Queen 등, Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); 미국 특허 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; Jones 등, Nature 321, 522-525 (1986); Morrison 등, Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen 등, Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri 등, Methods 36, 25-34 (2005)(SDR(a-CDR) 이식을 기재); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)("재표면화(resurfacing)"를 기재); Dall'Acqua 등, Methods 36, 43-60 (2005)("FR 셔플링"을 기재); 및 Osbourn 등, Methods 36, 61-68 (2005) and Klimka 등, Br J Cancer 83, 252-260 (2000)(FR 셔플링으로의 "유도된 선별" 접근법을 기재)에 상세히 설명되어 있다. 인간 항체 및 인간 가변 영역을 해당 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20, 450-459 (2008)에 기재되어 있다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단클론 항체의 일부분을 형성하며 이로부터 유래될 수 있다(예를 들어, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은, 또한, 항원 공격에 반응하여 완전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생산하도록 변형시킨 유전자삽입 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조할 수 있다(예를 들어, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005) 참조). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한 인간 유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 영역 서열들을 단리함으로써 생성될 수 있다(예를 들어, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien 등, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); 및 McCafferty 등, Nature 348, 552-554; Clackson 등, Nature 352, 624-628 (1991) 참조). 파지는 일반적으로 항체 단편들을 단일 사슬 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 표시한다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 유용한 항원 결합 모이어티는 예를 들어, 미국 특허출원 공개공보 2004/0132066에 개시된 방법에 따라 향상된 결합 친화성을 갖도록 조작되며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 특정한 항원 결정인자에 결합하는 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 능력은 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 다른 기술, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 기술(BIACORE T100 시스템에서 분석됨)(Liljeblad 등, Glyco J 17, 323-329 (2000)) 및 전통적인 결합 분석(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 측정될 수 있다. 경쟁 분석은 특정 항원에 결합하기 위해 참조 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인, 예를 들어, CD3에 결합하기 위해 V9 항체와 경쟁하는 항체를 식별하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 경쟁 항체는 참조 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하기 위한 상세한 예시적 방법이 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)에 제공된다. 예시적인 경쟁 분석에서, 고정된 항원(예를 들어, CD3)은 항원(예를 들어, US 6,054,297에 기재된 V9 항체)에 결합하는 표지된 제1 항체 및 이러한 항원에 결합하기 위해 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 테스트 할, 표지되지 않은 제2 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션된다. 제2 항체는 하이브리도마 상층액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 항원은 표지된 제1 항체를 포함하지만 표지되지 않은 제2 항체는 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션된다. 항원에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 인큐베이션한 후, 과량의 결합되지 않은 항체를 제거하고, 고정된 항원과 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정된 항원과 결합된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 테스트 샘플에서 실질적으로 감소하면, 이는 제2 항체가 항원에 대한 결합을 위해 제1 항체와 경쟁하고 있음을 나타낸다. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 참조.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 해당 분야에 공지된 기술, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 젤 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다. 특정 단백질의 정제에 사용되는 실제 조건은 부분적으로, 순 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 요인들에 따라 달라질 것이며, 이는 당업자들에게 자명할 것이다. 친화도 크로마토그래피 정제를 위해서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 친화도 크로마토그래피 정제를 위해서, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 기질을 사용할 수 있다. 순차적인 단백질 A 또는 G 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피를 사용하여 본질적으로 실시예에 기재된 바와 같이 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 단리할 수 있다. 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 순도를 젤 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함한 임의의 다양한 공지의 분석 방법들에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같이 발현된 중쇄 융합 단백질은 SDS-PAGE를 감소시킴에 의해 입증된 바와 같이 온전하고 적절하게 조립되는 것으로 나타났다(예를 들어, 도 8-12 참조). 3개의 밴드가 대략 Mr 25,000, Mr 50,000 및 Mr 75,000에서 분해되었으며, 이는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 경쇄, 중쇄 및 중쇄/경쇄 융합 단백질의 예상 분자량에 해당한다.
분석
본원에 제공된 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 해당 분야에 공지된 다양한 분석법에 의해 그 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인, 스크리닝 또는 특성화될 수 있다.
친화도 분석
Fc 수용체 또는 표적 항원에 대한 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 친화도는 실시예에 제시된 방법들에 따라서 표준 기기, 예를 들어, BIAcore 기기(GE Healthcare) 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 수용체 또는 표적 단백질을 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정할 수 있다. 대안적으로, 상이한 수용체 또는 표적 항원에 대한 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 결합은 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용하여, 예를 들어 유동 세포 분석(FACS)에 의해 평가될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적인 설명적 및 예시적인 실시형태는 하기 및 하기 실시예에 기재되어 있다.
한 실시형태에 따라, 25℃에서 BIACORE® T100 기기(GE Healthcare)를 사용한 표면 플라즈몬 공명으로 KD를 측정한다.
Fc 부분과 Fc 수용체 사이의 상호작용을 분석하기 위해 His-태그가 붙은 재조합 Fc 수용체가 CM5 칩에 고정된 항-Penta His 항체(Qiagen)에 의해 포획되고 이중특이성 구조체들이 분석물로 사용된다. 간단히 말해서, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, GE Healthcare)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항 Penta-His 항체를 10mM 아세트산나트륨, pH 5.0으로 40 ㎍/㎖로 희석한 후 5 ㎍/분의 유속으로 주입하여 커플링된 단백질의 약 6500 반응 단위(RU)를 달성한다. 리간드 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 반응하지 않은 그룹을 차단한다. 그 후 Fc 수용체를 4 또는 10nM에서 60초 동안 포획한다. 동역학 측정을 위해 이중특이성 구조체들의 4배 연속 희석액(500nM 내지 4000nM 범위)을 HBS-EP(GE Healthcare, 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4)에 25℃에서 30 ㎕/분의 유속으로 120초 동안 주입한다.
표적 항원에 대한 친화도를 결정하기 위해, 이중특이성 구조체들을 항 Penta-His 항체에서 설명한 바와 같이 활성화된 CM5-센서 칩 표면에 고정된 항-인간 Fab 특이적 항체(GE Healthcare)로 포획한다. 커플링된 단백질의 최종 양은 약 12000RU이다. 이중특이성 구조체들은 300nM에서 90초 동안 포획된다. 표적 항원을 30 ㎕/분의 유속으로 250 내지 1000nM의 농도 범위에서 180초 동안 유동 세포를 통과시킨다. 해리는 180초 동안 모니터링된다.
참조 유동 세포에서 얻은 반응을 빼서 벌크 굴절률 차이를 수정한다. 정상 상태 반응을 사용하여 Langmuir 결합 등온선의 비선형 곡선 피팅으로 해리 상수 KD를 유도하였다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는, 예를 들어, 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1:1 Langmuir 결합 모델(BIACORE® T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수(KD)는 비율 koff/kon로 계산된다. 예를 들어, Chen 외, J Mol Biol 293, 865-881 (1999) 참조하라.
활성 분석
본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 생물학적 활성은 실시예에 기재된 바와 같은 다양한 분석법에 의해 측정될 수 있다. 생물학적 활성은 예를 들어 T 세포의 증식 유도, T 세포에서 신호전달 유도, T 세포에서 활성화 마커의 발현 유도, T 세포에 의한 사이토카인 분비 유도, 표적 세포, 예를 들어, 종양 세포의 용해 유도, 종양 퇴행의 유도 및/또는 생존의 개선을 포함할 수 있다.
조성물, 제형 및 투여 경로
한 추가 양상에서, 본 발명은 예를 들어 임의의 하기 치료 방법에 사용하기 위한 본원에 제공된 임의의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 실시형태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 및 적어도 하나의 추가 치료제, 예를 들어 아래 기재되는 치료제를 포함한다.
또한, 생체내 투여에 적합한 형태로 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 본 발명에 따른 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 얻는 단계 및 (b) 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체와 제형화함으로써, 생체내 투여용 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 제제가 제형화되는 단계를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체에 용해되거나 분산된, 치료적 유효량의 하나 이상의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 포함한다. 문구 "약학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"은 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성인, 즉, 동물, 예를 들어 인간에게 적절히 투여시 불리하거나, 알러지성이거나 또는 다른 부적합한 반응을 생성시키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 적어도 하나의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 및 선택적으로 추가적인 활성 성분을 함유하는 약학 조성물 제제는 본 발명에 참고로 인용된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에 예시된 바와 같이, 본원의 내용에 비추어 당업자들에게 공지되어 있을 것이다. 또한, 동물(예를 들어, 사람) 투여의 경우, 제제는 FDA 생물학적 표준 사무국 또는 다른 국가의 해당 당국에서 요구하는 멸균, 발열성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다. 바람직한 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에 사용된 "약학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 공지된 바와 같은 임의의 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 방부제(예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 염, 방부제, 항산화제, 단백질, 약물, 약물 안정화제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료 등의 물질 및 이들의 조합(예를 들어, 본원에 참고로 포함된, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329 참조)을 포함한다. 임의의 통상적인 담체는 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 치료 또는 약학 조성물에서 이의 사용이 고려된다.
조성물은 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되어야 하는지 여부 및 주사와 같은 투여 경로의 경우 멸균되어야 하는지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자(및 임의의 추가 치료제)는 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 비장내, 신장내, 흉막내, 기관내, 비강내, 유리체내, 질내, 직장내, 종양내, 근육내, 복강내, 피하, 결막하, 방광내, 점막, 심막내, 제대내, 안구내, 경구, 외용, 국소적으로, 흡입(예: 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입, 국소 관류조 표적 세포들을 직접, 카테터를 통해, 세척을 통해, 크림으로, 지질 조성물(예를 들어, 리포솜)로, 또는 당업자에게 공지(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Pr inting Company, 1990, 본원에 참고문헌으로 포함)된 다른 방법 또는 전술한 경로들의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여, 특히 정맥내 주사는 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자와 같은 폴리펩티드 분자들을 투여하기 위해 가장 일반적으로 사용된다.
비경구 조성물은 주사에 의해, 예를 들어 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내 근육내, 경막내 또는 복강내 주사에 의해 투여하기 위해 설계된 것들을 포함한다. 주사용으로, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 수용액 중에, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충제, 예를 들어 Hank 용액, Ringer액 또는 생리식염수 완충제에서 제형화할 수 있다. 이러한 용액은 제형화제, 예를 들어 현탁, 안정화 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 한편으로, 이러한 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 사용전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균된 발열물질-미함유 수로 조성되는 분말 형태 중에 존재할 수 있다. 멸균 주사액은 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 필요에 따라, 이하에 열거되는 다양한 다른 성분들과 함께 적합한 용매에 필요한 양으로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 구현될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 기본 분산 매질 및/또는 그 외 성분들을 함유하는 멸균 운반체에 다양한 멸균 활성 성분들을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액, 현탁액 또는 에멀전 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 또는 동결-건조 기술이며 이 방법은 사전에 멸균-여과된 이의 액체 매질로부터 활성 성분과 함께 원하는 임의의 추가 성분으로 된 분말을 생성한다. 상기 액체 매질을 필요한 경우 적합하게 완충시켜야 하며 상기 액체 희석제는 주사전에 먼저 충분한 염수 또는 포도당으로 등장성으로 만들어야 한다. 이러한 조성물은 제조 및 보관 조건들하에서 안정하여야 하며 미생물, 가령, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 내독소 오염을, 예를 들어 0.5 ng/mg 단백질 미만의 안전 수준에서 최소로 유지시켜야 함을 알 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부탈 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르치놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레졸); 낮은 분자량의(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로블린; 친수성 중합체 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 그리고 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트 물질 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 복합체(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점성도를 증가시키는 화합물들, 가령, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 고농축 용액을 제조할 수 있도록 화합물들의 용해도를 증가시키는 제제들을 함유할 수 있다. 추가로, 활성 화합물들의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클에는 지방 오일, 가령, 참기름 또는 합성 지방산 에스터, 가령, 에틸 올레이트 또는 트라이글리세라이드 또는 리포좀이 포함된다.
활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 각각 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 준비된 마이크로캡슐 또는 마크로에멀젼(macroemulsions)안에 포집될 수 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)에 개시되어 있다. 서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예들에는 상기 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이러한 매트릭스는 성형된 제품 형태, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태로 존재한다. 특정 실시형태에서, 주사 조성물의 흡수 연장은 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이의 조합을 조성물에 사용함으로써 이루어질 수 있다.
앞서 기재된 조성물들 외에, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분를 또한 데포 제제로서 제형화할 수 있다. 이러한 장기 작용 제형은 이식(예를 들어 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 적합한 중합체 또는 소수성 재료(예를 들어, 허용가능한 오일 중의 에멀전으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 포함하는 약학 조성물을 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포집 또는 동결건조 공정에 의해 제조할 수 있다. 약학 조성물을 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 이러한 단백질의, 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 보조제를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화할 수 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.
프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 유리산 또는 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 상기 유리산 또는 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 유지시키는 염이다. 이들은 산 부가 염, 예를 들어, 단백질성 조성물의 유리 아미노기로 형성된 것, 또는 무기산, 가령, 예를 들면, 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산으로 형성된 것들을 포함한다. 유리 카르복실기를 이용하여 형성된 염은 또한 무기 염기, 가령, 예를 들어, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘 또는 수산화 철(ferric hydroxides); 또는, 유기 염기, 가령, 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로케인으로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매 중에서 더 용해성으로 되는 성향이 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 치료 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 예를 들어 암의 치료에서 면역치료제로서 사용될 수 있다.
치료 방법에 사용하기 위해, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 우수한 의료 관행과 일치하는 방식으로 제제화, 투약 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려해야 할 요소에는 치료 중인 특정 장애, 치료 중인 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 병태, 장애의 원인, 제제 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의료 종사자에게 알려진 기타 요소가 포함된다.
한 양상에서, 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 제공된다. 추가 양상에서 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 제공된다. 특정 실시형태에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 제공된다. 한 실시형태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 질환을 가진 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 제공한다. 특정 실시형태에서, 치료될 질환은 증식성 장애이다. 한 특정 실시형태에서, 질환은 암이다. 특정 실시형태에서, 본 방법은 개체에게 치료 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제, 예를 들어, 치료할 질환이 암인 경우 항암제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 실시형태에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 표적 세포의 용해를 유도하는 유효량의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에 사용하기 위한 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 제공한다. 상기 임의의 실시형태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
추가 양상에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 조제에 있어서 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 용도를 제공한다. 한 실시형태에서, 약제는 이를 필요로 하는 개체의 질환의 치료를 위한 것이다. 한 추가 실시형태에서, 약제는 질환이 있는 개체에게 치료 유효량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, 질환을 치료하는 방법에서의 용도에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 치료될 질환은 증식성 장애이다. 한 특정 실시형태에서, 질환은 암이다. 한 실시형태에서, 본 방법은 개체에게 치료 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제, 예를 들어, 치료할 질환이 암인 경우 항암제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 한 추가 실시형태에서, 약제는 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 것이다. 또 다른 추가 실시형태에서, 약제는 표적 세포의 용해를 유도하는 유효량의 약제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 상기 실시형태 중 어느 하나의 "개체"는 포유동물, 바람직하게는, 인간일 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 치료적 유효량을 이러한 질환을 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시형태에서, 약학적으로 허용되는 형태의 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 포함하는 조성물이 상기 개체에게 투여된다. 특정 실시형태에서, 치료될 질환은 증식성 장애이다. 한 특정 실시형태에서, 질환은 암이다. 특정 실시형태에서, 본 방법은 개체에게 치료 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제, 예를 들어, 치료할 질환이 암인 경우 항암제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 실시형태 중 어느 하나의 "개체"는 포유동물, 바람직하게는, 인간일 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재하에 표적 세포를 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 추가 양상에서, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법이 제공된다. 이러한 한 실시형태에서, 상기 방법은 표적 세포의 용해를 유도하는 유효량의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시형태에서, "개체"는 인간이다.
특정 실시형태에서, 치료될 질환은 증식성 장애, 특히 암이다. 암의 비제한적 예에는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평세포암, 골암 및 신장암이 포함된다. 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 사용하여 치료할 수 있는 다른 세포 증식 장애에는, 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신 , 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 및 비뇨생식기 계통에 위치한 신생물이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 전암성 병태 또는 병변 및 암 전이가 포함된다. 특정 실시형태에서, 암은 신장 세포암, 피부암, 폐암, 결장직장암, 유방암, 뇌암, 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 당업자는 많은 경우에 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 완치를 제공하는 것이 아니라 부분적인 이점만 제공할 수 있음을 용이하게 알 수 이을 것이다. 일부 실시형태에서, 일부 이점을 갖는 생리학적 변화 또한 치료적으로 유익한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 생리학적 변화를 제공하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 양은 "유효량" 또는 "치료 유효량"으로 간주된다. 치료를 필요로 하는 대상체, 환자 또는 "개체"는 일반적으로 포유동물, 보다 구체적으로 인간이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 유효량이 세포에 투여된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 치료적 유효량은 질환의 치료를 위해 개체에게 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위하여, (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료적 제제와 조합하여 사용된 경우) 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 적절한 투여량은 치료 질환의 유형, 투여 경로, 환자 체중, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이성 항원 결합 분자가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전 또는 현재의 치료적 처치, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자에 대한 환자의 임상 이력 및 반응, 그리고 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 투여를 담당하는 주치의는, 임의의 경우에, 개개의 대상체에 적절한 투여량(들) 및 조성물 내 활성 성분(들)의 농도를 결정할 것이다. 단일 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 일시 투여 및 펄스 주입을 비롯한(그러나 이에 제한되지 않는) 다양한 투약 일정이 본원에서 고려된다.
프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 한 번에 또는 일련의 치료일정에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따르면, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 상기 언급된 요소들에 따라, 하나의 전형적인 일일 투여량의 범위는 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상이 될 수 있다. 수일 또는 보다 장기에 걸친 반복된 투여를 위하여, 병태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증세가 바람직하게 억제될 때까지 지속될 것이다. T 세포 활성화 이중특이성 항원 결합 분자의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.005 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 다른 비-제한적 예에서, 용량은 또한 투여 당 약 1 마이크로그램/kg 체중, 약 5 마이크로그램/kg 체중, 약 10 마이크로그램/kg 체중, 약 50 마이크로그램/kg 체중, 약 100 마이크로그램/kg 체중, 약 200 마이크로그램/kg 체중, 약 350 마이크로그램/kg 체중, 약 500 마이크로그램/kg 체중, 약 1 밀리그램/kg 체중, 약 5 밀리그램/kg 체중, 약 10 밀리그램/kg 체중, 약 50 밀리그램/kg 체중, 약 100 밀리그램/kg 체중, 약 200 밀리그램/kg 체중, 약 350 밀리그램/kg 체중, 약 500 밀리그램/kg 체중, 내지 약 1000 밀리그램/kg 체중 이상 및 이들 범위에서 유래하는 임의의 범위를 포함할 수도 있다. 본원에 열거된 숫자들로부터 유래될 수 있는 범위의 비제한적 예에서, 상기 숫자에 기초하여, 약 5 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 5 마이크로그램/kg 체중 내지 약 500 밀리그램/kg 체중 등의 범위가 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5mg/kg, 2.0mg/kg, 5.0mg/kg 또는 10mg/kg(또는 이의 임의의 조합)의 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들면 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다(예를 들면 상기 환자는 약 2 내지 약 20회 또는 예를 들면 약 6회 용량의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 제공받는다). 초기에는 보다 높은 부하 용량, 후속하여 보다 낮은 하나 이상의 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 요법이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터된다.
본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 일반적으로 원하는 목적을 구현하기에 효과적인 양으로 사용될 것이다. 질환 상태를 치료하거나 예방함에 사용하기 위해, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 또는 이의 약학 조성물은 치료적 유효량으로 투여되거나 적용된다. 치료 유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 설명의 내용에 비추어 볼 때 당업자의 능력 범위 이내이다.
전신 투여의 경우 치료적 유효량은 세포 배양 분석과 같은 시험관내 분석에서 초기에 추정될 수 있다. 그런 다음, 세포 배양에서 결정된 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 구현하기 위한 용량이 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 이러한 정보를 사용하여, 인간에서 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
초기 투여량은 또한 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 생체내 데이터, 예를 들어 동물 모델로부터 추정될 수 있다. 당업자는 동물 데이터에 기초하여 인간에 대한 투여를 용이하게 최적화할 수 있다.
투여량 및 투여 간격은 치료 효과를 유지하기에 충분한 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여를 위한 통상적인 환자 투여량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일 범위이다. 치료적 유효 혈장 수준은 1일 다회 용량을 투여함으로써 구현될 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어 HPLC로 측정할 수 있다.
국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련이 없을 수 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 치료적 유효 국소 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에 기재된 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 치료적 유효량은 일반적으로 실질적인 독성을 유발하지 않으면서 치료 이점을 제공할 것이다. 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 연구를 사용하여 LD50(모집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(모집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정할 수 있다. 독성 및 치료 효과간의 용량 비율은 치료 지수로서 이는 LD50/ED50 비율로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자가 바람직하다. 한 실시형태에서, 본 발명에 따른 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 사람에서 사용하기에 적합한 투여량 범위를 계산하는데 사용될 수 있다. 이러한 용량은 바람직하게는 거의 또는 전혀 독성이 없이 ED50를 포함하는 순환 농도 범위에 속한다. 투여량은 다양한 인자, 예를 들어 사용된 투여 형태, 사용된 투여 경로, 대상체의 상태 등에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다. 정확한 제형화, 투여 경로 및 투여 용량은 환자의 상태를 기준으로 개별 주치의에 의해 선택될 수 있다(예를 들어 본원에 전문이 참조로 포함되는 Fingl 등, 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1 참조).
본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자로 치료되는 환자의 주치의는 독성 및 장기 오기능 등으로 인한 투여를 어떻게 및 언제 종결, 중단 또는 조정할지를 알 것이다. 역으로, 주치의는 임상적 반응이 적절치 못한 경우(독성 제외) 치료를 보다 높은 수준으로 조정할지 여부를 알 것이다. 관심 장애의 관리에 있어서, 투여되는 용량의 크기는 치료되는 병태의 중증도 및 투여 경로 등에 따라 달라질 것이다. 병태의 중증도는 예를 들어 부분적으로 표준적인 예후 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 용량 및 예상되는 투여 빈도는 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
기타 제제 및 치료
본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 요법에서 하나 이상의 기타 제제와 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 적어도 하나의 추가 치료제와 공동 투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 치료를 필요로 하는 개체의 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여되는 임의의 제제를 포괄한다. 이러한 추가 치료제는 치료되는 특정 적응증에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해 효과를 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 추가 치료제는 면역조절제, 세포증식 억제제, 세포 부착 억제제, 세포독성제 또는 세포증식억제제, 세포 사멸의 활성화제 또는 세포사멸 유도제에 대한 세포의 감수성을 증가시키는 제제이다. 한 특정 실시형태에서, 추가 치료제는 항암제, 예를 들어 미세소관 파괴제, 항대사제, 토포이소머라제 억제제, DNA 삽입제, 알킬화제, 호르몬 요법, 키나제 억제제, 수용체 길항제, 종양 세포 사멸의 활성화제 또는 항혈관신생제이다.
이러한 기타 제제는 의도한 목적에 유효한 양으로 조합되어 적절하게 존재한다. 이러한 다른 물질들의 유효량은 사용되는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 양, 장애 또는 치료의 유형, 그리고 상기에서 논의된 다른 인자들에 따라 달라진다. 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 일반적으로 본원에 설명된 투여 경로로 동일한 투여량으로 이용되거나, 본원에서 논의된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 판단된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 이용된다.
상기의 이러한 병용 요법은 병용 투여(두 가지 또는 그 이상의 요법제가 동일한 또는 별도 조성물 안에 함유됨) 및 별도 투여를 포함하고, 이 경우, 상기 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 투여는 추가적인 요법제 및/또는 보조제들의 투여 이전, 동시 및/또는 이후에 일어난다. 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 또한 방사선 요법과 병용될 수 있다.
제조 물품
본 발명의 또 다른 양상에서, 상기 설명된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질들을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 상기 제조 물품은 용기 및 용기 위에 또는 용기에 결합된 라벨 또는 약품 설명서를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니, 등등을 포함한다. 용기는 다양한 재료들, 가령, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 자체가 조성물을 보유하거나 병태의 치료, 방지 및/또는 진단에 효과적인 또다른 조성물과 복합된 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 상기 용기는 피하 주사 바늘이 뚫을 수 있는 마개를 가진 정맥 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물에서 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자이다. 라벨 또는 약품 설명서에는 이 조성물이 선택된 병태 치료에 이용된다는 것이 명시되어 있다. 더욱이, 상기 제조 물품은 (a) 조성물이 포함된 제1 용기, 여기에서 상기 조성물은 본 발명의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 포함하고; 그리고 (b) 조성물이 포함된 제2 용기, 여기에서 상기 조성물은 또 다른 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다. 발명의 본 실시형태에서 제조물품은 이 조성물이 특정 병태의 치료에 사용될 수 있음이 표시된 약품 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 한편 또는 추가적으로, 상기 제조 물품은 약학적으로-허용되는 완충액, 가령, 주사(BWFI)용 정균수, 포스페이트-완충된 염수, Ringer 용액 및 덱스트로즈 용액이 포함된 제2(또는 제3) 용기를 더 포함할 수 있다. 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기가 포함된 상업적 그리고 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질들을 더 포함할 수 있다.
예시적인 실시형태
1. 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
(a) 다음을 포함하는, CD3에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 모이어티:
(i) 서열번호 2의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 4의 HCDR 2 및 서열번호 10의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및
(ii) 서열번호 20의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 21의 LCDR 2 및 서열번호 22의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(b) 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 모이어티; 및
(c) 제1 항원 결합 모이어티의 이디오타입에 결합할 수 있고, 이로써 제1 또는 제2 항원 결합 모이어티를 가역적으로 은폐할 수 있는, 프로테아제-절단가능 링커를 통해 T 세포 이중특이성 결합 분자에 공유적으로 부착된 마스킹 모이어티.
2. 실시형태 1에 있어서, VH는 서열번호 16에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나 VL은 서열번호 23의 아미노산 서열에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
3. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 마스킹 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티에 공유적으로 부착되어 제1 항원 결합 모이어티를 가역적으로 은폐하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티의 중쇄 가변 영역에 공유적으로 부착되는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
5. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티의 경쇄 가변 영역에 공유적으로 부착되는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 scFv인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
7. 실시형태 2 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자는 제2 항원 결합 모이어티를 가역적으로 은폐하는 제2 마스킹 모이어티를 포함하는, 프로테아제-활성화 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제는 표적 세포에 의해 발현되는, 프로테아제-활성화 가능한 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역들이 교환된 교차 Fab 분자인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역들이 교환된 교차 Fab 분자인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 제1 항원 결합 모이어티는 통상적인 Fab 분자인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, CD3에 결합할 수 있는 1개 이하의 항원 결합 모이어티를 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 Fab 분자인 제3 항원 결합 모이어티를 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
14. 실시형태 13에 있어서, 제3 항원 결합 모이어티는 제2 항원 결합 모이어티와 동일한, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
15. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 FolR1 또는 TYRP1에 결합할 수 있는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
16. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 FolR1에 결합할 수 있는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
17. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 TYRP1에 결합할 수 있는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
18. 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 서로 융합된, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
19. 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
20. 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
21. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄는 선택적으로 펩티드 링커를 통해 서로에 융합되는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
22. 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 안정한 회합이 가능한 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
23. 실시형태 22에 있어서, Fc 도메인은 IgG, 구체적으로 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
24. 실시형태 22 또는 23에 있어서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
25. 실시형태 22 내지 24 중 어느 하나에 있어서, Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
26. 실시형태 25에 있어서, Fc 도메인은 Fc 수용체 및/또는 효과기 기능에 대한 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
27. 실시형태 26에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 L234, L235 및 P329(Kabat 넘버링)의 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 존재하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
28. 실시형태 27에 있어서, Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 활성화 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
29. 실시형태 25 내지 28 중 어느 하나에 있어서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
30. 실시형태 25 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 효과기 기능은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)인, 프로테아제-활성화 가능한 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
31. 실시형태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 다음 중 적어도 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 프로테아제-활성화 가능한 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
(a) DYSMN(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) WINTETGEPRYTDDFKG(서열번호 59), WINTETGEPRYTDDFTG(서열번호 84) 및 WINTETGEPRYTQGFKG(서열번호 86)로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR H2 아미노산 서열;
(c) EGDYDVFDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열.
32. 실시형태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 다음 중 적어도 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 프로테아제-활성화 가능한 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
(d) RASKSVSTSSYSYMH(서열번호 62) 및 KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) YVSYLES(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHSREFPYT(서열번호 64) 및 QQSREFPYT(서열번호 88)로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR L3 아미노산 서열.
33. 실시형태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) DYSMN(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) WINTETGEPRYTDDFKG(서열번호 59), WINTETGEPRYTDDFTG(서열번호 84) 및 WINTETGEPRYTQGFKG(서열번호 86)로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR H2 아미노산 서열;
(c) EGDYDVFDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및
다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(d) RASKSVSTSSYSYMH(서열번호 62) 및 KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) YVSYLES(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHSREFPYT(서열번호 64) 및 QQSREFPYT(서열번호 88)로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR L3 아미노산 서열.
34. 실시형태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) DYSMN(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) WINTETGEPRYTDDFKG(서열번호 59)의 CDR H2 아미노산 서열;
(c) EGDYDVFDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및
다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(d) RASKSVSTSSYSYMH(서열번호 62)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) YVSYLES(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHSREFPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열.
35. 실시형태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) SYGVS(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) IIWGDGSTNYHSALIS(서열번호 59)의 CDR H2 아미노산 서열;
(c) GITTVVDDYYAMDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및
다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(d) KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) AATFLAD(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHYYSTPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열.
36. 실시형태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) SYGVS(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) WINTETGEPRYTDDFTG(서열번호 84)의 CDR H2 아미노산 서열;
(c) GITTVVDDYYAMDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및
다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(d) KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) AATFLAD(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHYYSTPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열.
37. 실시형태 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
(a) SYGVS(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
(b) WINTETGEPRYTQGFKG(서열번호 86)의 CDR H2 아미노산 서열;
(c) GITTVVDDYYAMDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열; 및
다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
(d) KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
(e) AATFLAD(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
(f) QHYYSTPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열.
38. 실시형태 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 인간화된, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
39. 실시형태 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 인간인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
40. 실시형태 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제-절단가능 링커는 최소 하나의 프로테아제 인식 서열을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
41. 실시형태 40에 있어서, 프로테아제-절단가능 링커는 프로테아제 인식 서열을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
42. 실시형태 41에 있어서, 프로테아제 인식 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
(a) RQARVVNG(서열번호 100);
(b) VHMPLGFLGPGRSRGSFP(서열번호 101);
(c) RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(서열번호 102)(이때 X는 임의의 아미노산임);
(d) RQARVVNGVPLSLYSG(서열번호 103);
(e) PLGLWSQ(서열번호 104);
(f) VHMPLGFLGPRQARVVNG(서열번호 105);
(g) FVGGTG(서열번호 106);
(h) KKAAPVNG(서열번호 107);
(i) PMAKKVNG(서열번호 108);
(j) QARAKVNG(서열번호 109);
(k) VHMPLGFLGP(서열번호 110);
(l) QARAK(서열번호 111);
(m) VHMPLGFLGPPMAKK(서열번호 112);
(n) KKAAP(서열번호 113); 및
(o) PMAKK(서열번호 114).
43. 실시형태 40 또는 41에 있어서, 프로테아제-절단가능 링커는 프로테아제 인식 서열 PMAKK(서열번호 114)를 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
44. 실시형태 40 또는 41에 있어서, 프로테아제-절단가능 링커는 프로테아제 인식 서열 VHMPLGFLGPPMAKK(서열번호 112)를 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
45. 실시형태 40 또는 41에 있어서, 프로테아제-절단가능 링커는 프로테아제 인식 서열 VHMPLGFLGPRQARVVNG(서열번호 105)를 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
46. 실시형태 40 또는 41에 있어서, 프로테아제-절단가능 링커는 프로테아제 인식 서열 RQARVVNG(서열번호 100) 또는 프로테아제 인식 서열 VHMPLGFLGPRQARVVNG(서열번호 105)를 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
47. 실시형태 1 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제가 금속단백분해효소, 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제 및 카텝신 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
48. 실시형태 47에 있어서, 금속단백분해효소는 기질 금속단백분해효소(MMP), 바람직하게는 MMP9 또는 MMP2인, 프로테아제-활성화능한 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
49. 실시형태 47에 있어서, 세린 프로테아제는 매트립타제인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
50. 실시형태 1 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 FolR1에 결합할 수 있고, 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및/또는 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
51. 실시형태 1 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 FolR1에 결합할 수 있고, 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
52. 실시형태 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 FolR1에 결합할 수 있고 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
a) NAWMS(서열번호 54)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
b) RIKSKTDGGTTDYAAPVKG(서열번호 55)의 CDR H2 아미노산 서열; 및
c) PWEWSWYDY(서열번호 56)의 CDR H3 아미노산 서열; 및
다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
d) GSSTGAVTTSNYAN(서열번호 20)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
e) GTNKRAP(서열번호 21)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
f) ALWYSNLWV(서열번호 22)의 CDR L3 아미노산 서열.
53. 실시형태 1 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 53의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
54. 실시형태 1 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 FolR1에 결합할 수 있고 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
55. 실시형태 1 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 TYRP1에 결합할 수 있고, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및/또는 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
56. 실시형태 1 내지 49 및 55 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 TYRP1에 결합할 수 있고, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 경쇄 CDR을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
57. 실시형태 1 내지 49 및 55 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 TYRP1에 결합할 수 있고 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
다음을 포함하는 중쇄 가변 영역:
a) NAWMS(서열번호 24)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
b) RIKSKTDGGTTDYAAPVKG(서열번호 25)의 CDR H2 아미노산 서열; 및
c) PWEWSWYDY(서열번호 26)의 CDR H3 아미노산 서열; 및
다음을 포함하는 경쇄 가변 영역:
d) GSSTGAVTTSNYAN(서열번호 28)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
e) GTNKRAP(서열번호 29)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
f) ALWYSNLWV(서열번호 30)의 CDR L3 아미노산 서열.
58. 실시형태 1 내지 49 및 55 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 서열번호 27의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
59. 실시형태 1 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 모이어티는 TYRP1에 결합할 수 있고 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
60. 실시형태 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
a) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 중쇄;
b) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 경쇄.
61. 실시형태 1 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
(a) 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄;
(b) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및
(c) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
62. 실시형태 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
(a) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄;
(b) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및
(c) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
63. 실시형태 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
(a) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄;
(b) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및
(c) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
64. 실시형태 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
(a) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄;
(b) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및
(c) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
65. 실시형태 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
(a) 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄;
(b) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및
(c) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
66. 실시형태 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
(a) 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄;
(b) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및
(c) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
67. 실시형태 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
(a) 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄;
(b) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및
(c) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
68. 실시형태 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
(a) 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄;
(b) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및
(c) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
69. 실시형태 60 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자:
(c) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄.
70. 실시형태 1 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 서열번호 91의 아미노산 서열의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, scFv를 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
71. 실시형태 1 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 서열번호 92의 아미노산 서열의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, scFv를 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
72. 실시형태 1 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 서열번호 93의 아미노산 서열의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, scFv를 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
73. 실시형태 1 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 마스킹 모이어티는 서열번호 94의 아미노산 서열의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, scFv를 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
74. 실시형태 70 내지 73 중 어느 하나에 있어서, SPR에 의해 측정된 제1 항원 결합 모이어티에 대한 마스킹 모이어티의 결합 친화도가 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 및 서열번호 94로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 마스킹 모이어티의 결합 친화도와 비교하여 대략 동일하거나 더 높은, 프로테아제-활성화 가능한 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
75. 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐할 수 있는 이디오타입 특이적 폴리펩티드로서, 이때 이러한 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 79, 서열번호 83 및 서열번호 85로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 80 및 서열번호 81로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
76. 실시형태 75에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 79에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 80에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
77. 실시형태 75에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 79에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 81에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
78. 실시형태 75에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 83에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 81에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
79. 실시형태 75에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 85에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 81에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
80. 실시형태 75에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 항-이디오타입 scFv, 항-이디오타입 Fab 또는 항-이디오타입 scFab인, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
81. 실시형태 75 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 scFv인, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
82. 실시형태 75 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 링커를 통해 분자에 공유적으로 부착되는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
83. 실시형태 82에 있어서, 링커는 펩티드 링커인, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
84. 실시형태 82 또는 83에 있어서, 링커는 프로테아제-절단가능 링커인, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
85. 실시형태 82 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 펩티드 링커는 최소 하나의 프로테아제 인식 서열을 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
86. 실시형태 85에 있어서, 프로테아제는 금속단백분해효소, 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제 및 카텝신 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
87. 실시형태 91에 있어서, 금속단백분해효소는 기질 금속단백분해효소(MMP), 바람직하게는 MMP9 또는 MMP2인, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
88. 실시형태 86에 있어서, 세린 프로테아제는 매트립타제인, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
89. 실시형태 85 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 인식 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드:
(a) RQARVVNG(서열번호 100);
(b) VHMPLGFLGPGRSRGSFP(서열번호 101);
(c) RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(서열번호 102)(이때 X는 임의의 아미노산임);
(d) RQARVVNGVPLSLYSG(서열번호 103);
(e) PLGLWSQ(서열번호 104);
(f) VHMPLGFLGPRQARVVNG(서열번호 105);
(g) FVGGTG(서열번호 106);
(h) KKAAPVNG(서열번호 107);
(i) PMAKKVNG(서열번호 108);
(j) QARAKVNG(서열번호 109);
(k) VHMPLGFLGP(서열번호 110);
(l) QARAK(서열번호 111);
(m) VHMPLGFLGPPMAKK(서열번호 112);
(n) KKAAP(서열번호 113); 및
(o) PMAKK(서열번호 114).
90. 실시형태 80 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제 절단가능 링커는 프로테아제 인식 서열 PMAKK(서열번호 114)를 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
91. 실시형태 80 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 T-세포 활성화 이중특이성 분자의 일부인, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
92. 실시형태 75 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
93. 실시형태 75 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
94. 실시형태 75 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
95. 실시형태 75 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
96. 실시형태 75 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
97. 실시형태 75 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
98. 실시형태 75 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 항-CD3 항원 결합 부위는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
99. 실시형태 75 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 이디오타입 특이적 폴리펩티드는 인간화된, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
100. 실시형태 1 내지 74 중 어느 하나의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 항원 결합 분자 또는 실시형태 75 내지 99 중 어느 하나의 이디오타입 특이적 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
101. 실시형태 100의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드.
102. 실시형태 100의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
103. 실시형태 99의 폴리뉴클레오티드 또는 실시형태 102의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
104. 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 생산하는 방법으로서, a) 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 발현에 적합한 조건하에 실시형태 103의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 b) 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
105. 실시형태 104의 방법에 의해 생산된 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
106. a) 이디오타입 특이적 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 실시형태 103의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 b) 이디오타입 특이적 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드를 생산하는 방법.
107. 실시형태 106의 방법에 의해 생산된 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
108. 실시형태 1 내지 74 중 어느 하나의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
109. 실시형태 75 내지 99 중 어느 하나의 이디오타입 특이적 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
110. 약제로서 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 74 중 어느 하나의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자, 실시형태 75 내지 99 중 어느 하나의 이디오타입 특이적 폴리펩티드 또는 실시형태 108의 조성물.
111. 실시형태 110에 있어서, 약제는 개체에서 암의 치료 또는 진행 지연, 면역 관련 질환의 치료 또는 진행 지연, 또는 면역 반응 또는 기능의 향상 또는 자극을 위한 것인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
112. 이를 필요로 하는 개체의 질환 치료에 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 74 중 어느 하나의 프로테아제-활성화 가능한 T 세포 활성화 이중특이성 분자 또는 실시형태 75 내지 99 중 어느 하나의 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
113. 실시형태 112에 있어서, 질환은 암인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 또는 이디오타입-특이성 폴리펩티드.
114. 질환 치료용 약제의 제조를 위한, 실시형태 1 내지 74 중 어느 하나의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 또는 실시형태 75 내지 99 중 어느 하나의 이디오타입 특이적 폴리펩티드의 용도.
115. 실시형태 114에 있어서, 질환은 암인, 용도.
116. 개체의 질환을 치료하는 방법으로서, 실시형태 1 내지 74 중 어느 하나의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 포함하는 조성물 또는 실시형태 108의 조성물의 치료적 유효량을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
117. T 세포의 존재하에 표적 세포를 실시형태 1 내지 74 중 어느 하나의 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자 또는 실시형태 108의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 표적 세포의 용해를 유도하는 방법.
118. 실시형태 117에 있어서, 표적 세포는 암세포인, 방법.
119. 실시형태 117 또는 118에 있어서, 표적 세포는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 활성화할 수 있는 프로테아제를 발현하는, 방법.
120. 항-CD3 항원 결합 분자의 이디오타입에 특이적인 인간화 항-이디오타입 CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 항-이디오타입 CD3 항체 또는 이의 단편이 항-CD3 항원 결합 분자에 결합될 때 CD3에 대한 항-CD3 항원 결합 분자의 결합을 특이적으로 차단하는, 인간화 항-이디오타입 CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
121. 실시형태 120에 있어서, 항-이디오타입 CD3 항체 또는 이의 단편은 프로테아제 인식 부위를 포함하는 펩티드 링커를 통해 항-CD3 항원 결합 분자와 가역적으로 회합되는, 항-이디오타입 CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
122. 실시형태 120 또는 121에 있어서, CD3은 마우스, 원숭이 또는 인간 CD3인, 항-이디오타입 CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
123. 실시형태 75 내지 99 중 어느 하나의 이디오타입 특이적 폴리펩티드를 프로테아제-절단가능한 링커로 T 세포 활성화 이중특이성 분자에 부착하여 프로테아제-활성화가능 T 세포 이중특이성 분자를 형성하는 것을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이성 분자의 생체내 독성을 감소시키는 방법으로서, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 생체내 독성이 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 독성과 비교하여 감소된, 방법.
124. 전술한 바와 같은 발명.
예시 서열
Kabat에 따른 CDR 정의
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
개선된 항-CD3 (P035.093) 결합제를 가지는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자
Kabat에 따른 CDR 정의
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
마스킹 모이어티 scFv
Figure pct00020
인간화 마스크 및 PMAKK 프로테아제 인식 서열을 갖는 FolR1 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자(proTCB)
Figure pct00021
_
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
예시적인 링커 및 인식 서열
Figure pct00025
Figure pct00026
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예들이다. 다양한 다른 실시예가 전술한 일반적인 설명에 따라 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1 - 최적화된 항-CD3(다중특이성) 항체의 제조
모든 최적화된 항-CD3 항체들(클론 P033.078, P035.093, P035.064, P021.045, P004.042)은 이전에 기술된(예를 들어 WO 2014/131712 참조, 본원에 참조로 포함됨) CD3 결합제 유래 라이브러리들을 사용하는 파지 디스플레이 선별 캠페인에 의해 생성되었으며, 본원에서 "CD3orig"로 지칭되고, 각각 서열번호 14 및 23의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 이들 라이브러리에서, 중쇄의 CDR3 영역에 위치한 위치 N97 및 N100(Kabat 넘버링)은 침묵되거나 제거되었다. 직접적인 비교를 위해, 예시적인 표적 세포 항원 결합 모이어티(서열번호 24 내지 31)로서 항-TYRP1 항체를 사용하여 모든 분자를 도 2A에 도시된 바와 같이 T-세포 이중특이성 항체(TCB) 형식으로 전환시켰다.
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역은 도 2B 내지 E에 도시된 바와 같이 각각의 수용 포유동물 발현 벡터에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄를 가진 프레임에 서브클로닝되었다.
최적화된 항-CD3 항체의 서열은 표 1에 표시된 서열번호로 제공된다.
표 1. 본원 실시예들에서 생성된 최적화된 항-CD3 항체의 서열.
Figure pct00027
상응하는 중쇄와 경쇄의 정확한 페어링을 개선하기 위해, 돌연변이들을 TYRP1 결합 Fab 분자의 인간 CL(E123R, Q124K) 및 인간 CH1(K147E, K213E)에 도입하였다.
중쇄의 정확한 페어링(이종이량체 분자의 형성)를 위해, 놉-인투-홀 돌연변이가 항체 중쇄의 불변 영역(각각 T366W/S354C 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C)에 도입되었다.
또한, P329G, L234A 및 L235A 돌연변이를 항체 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fcγ 수용체에 대한 결합을 제거하였다.
제조된 TCB 분자들의 전체 서열들은 서열번호 32, 33, 34 및 36(P033.078), 서열번호 32, 33, 34 및 37(P035.093), 서열번호 32, 33, 34 및 38(P035.064), 서열번호 32, 33, 34 및 39(P021.045), 서열번호 32, 33, 34 및 40(P004.042)에 제공된다.
CD3 결합제로서 CD3orig를 포함하는 상응하는 분자도 제조하였다.
TCB는 Evitria사(스위스)의 기존(비-PCR 기반) 클로닝 기술을 이용한 자사의 벡터 시스템과 현탁-적응된 CHO K1 세포(본래 ATCC로부터 받았고 Evitria사의 현탁 배양에서의 무혈청 성장에 적응됨)를 사용하여 제조되었다. 생산을 위해, Evitria사는 자사의 무-동물 성분 및 무혈청 배지(eviGrow 및 eviMake2)와 자사의 형질감염 시약(eviFect)을 사용했다. 세포들을 1:1:2:1("벡터 놉 중쇄": "벡터 홀 중쇄": "벡터 CD3 경쇄": "벡터 TYRP1 경쇄")의 상응하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 원심분리 및 후속 여과(0.2μm 필터)에 의해 상층액을 수확하고, 수확된 상층액으로부터 표준 방법으로 단백질을 정제하였다.
요약하면, 여과된 세포 배양 상층액으로부터 단백질 A-친화도 크로마토그래피(평형 완충액: 20mM 소듐 시트레이트, 20mM 소듐 포스페이트, pH 7.5; 용리 완충액: 20mM 소듐 시트레이트, pH 3.0)에 의해 Fc 함유 단백질을 정제하였다. pH 3.0에서 용리시킨 후 샘플을 즉각적으로 pH 중화시켰다. 원심분리(Millipore Amicon® ULTRA-15, #UFC903096)에 의해 단백질을 농축시키고 20mM 히스티딘, 140mM 소듐 클로라이드, pH 6.0에서 크기 배제 크로마토그래피로 단량체 단백질로부터 응집된 단백질을 분리하였다.
정제된 단백질의 농도는 Pace, 등, Protein Science, 1995, 4, 2411-1423에 따라 아미노산 서열을 기초로 계산된 질량 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 결정되었다. 단백질의 순도 및 분자량은 LabChipGXII(Perkin Elmer)를 사용하여 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS로 분석하였다. 응집체 함량의 결정은 전개 완충액(각각 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, pH 6.7 또는 200 mM KH2PO4, 250 mM KCl pH 6.2)에서 평형화된 분석 크기 배제 컬럼(TSKgel G3000 SW XL 또는 UP-SW3000)을 사용하는 25℃에서의 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행되었다.
제조된 TCB 분자의 생화학적 및 생물물리학적 분석 결과는 표 2에 제시된다.
모든 TCB 분자는 좋은 품질로 생산될 수 있다.
표 2. TCB 형식의 항-CD3 항체들의 생화학적 및 생물물리학적 분석.
Figure pct00028
실시예 2 - 최적화된 항-CD3(다중특이성) 항체의 열 안정성 측정
실시예 1에서 제조된 항-CD3 항체(TCB 형태)의 열 안정성을 동적 광 산란(DLS)에 의해 그리고 Optim 2 기기(Avacta Analytical, UK)를 사용하는 온도 램프를 적용하여 온도 의존적 고유 단백질 형광을 모니터링하였다.
1 mg/㎖의 단백질 농도를 갖는 10 ㎍의 여과된 단백질 샘플을 Optim 2 기기에 반복 처리하였다. 350 nm/330 nm에서 형광 강도와 266 nm에서 산란 강도의 비율을 수집하면서 온도를 25℃에서 85℃까지 0.1℃분으로 증가시켰다.
결과를 표 3에 나타낸다. 실시예 1에서 생성된 모든 최적화된 CD3 결합제의 응집 온도(Tagg) 및 관찰된 온도 유도 풀림 전이(Tm)의 중간점은 이전에 기재된 CD3 결합제 CD3orig에 대한 것과 비슷하거나 더 높다.
표 3. 동적 광산란 및 온도 의존적 고유 단백질 형광의 변화에 의해 측정된 TCB 형식의 항-CD3 항체의 열 안정성.
Figure pct00029
실시예 3 - 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 최적화된 항-CD3(다중특이성) 항체의 기능적 특성화
모든 표면 플라즈몬 공명(SPR) 실험은 전개 완충액으로서 HBS-EP+(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, Biacore, Freiburg/독일)를 사용하여 25℃에서 Biacore T200에서 수행하였다.
친화도 측정을 위해 TCB 분자는 고정된 항-Fc(P329G) IgG(인간 IgG1 Fc(P329G)에 특이적으로 결합하는 항체; "항-PG 항체" - 본원에 참고로 포함된 WO 2017/072210 참조)를 가진 C1 센서칩(GE Healthcare) 표면에서 포획되었다. 실험 설정은 도 3에 개략적으로 도시되어 있다. 포획 IgG는 표준 아민 커플링 키트(GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 약 400개의 공명 단위(RU)를 직접 고정함으로써 센서칩 표면에 커플링되었다.
CD3에 대한 상호작용을 분석하기 위해, TCB 분자들을 10 ㎕/분의 유속으로 25nM에서 80초 동안 포획했다. 인간 및 사이노몰구스 CD3ε 줄기-Fc(놉)-Avi/CD3δ 줄기-Fc(홀)(CD3ε/δ, 서열번호 41 및 42(인간) 및 서열번호 43 및 44(사이노몰구스) 참조)를 0.122 - 125nM의 농도에서 300초 동안 유동 세포들을 통해 30 ㎕/분의 유속으로 통과시켰다. 해리를 800초 동안 모니터링했다.
참조 유동 세포에서 얻은 반응을 빼서 벌크 굴절률 차이를 수정했다. 여기에서 항원은 고정된 항-PG 항체가 있는, 그러나 TCB 분자 대신 HBS-EP가 주입된 표면 위로 유동하였다.
Biacore T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 동역학 상수들을 유도하여, 1:1 Langmuir 결합에 대한 비율 방정식을 수치 적분하여 피팅하였다. 상호작용의 반감기(t1/2)는 공식 t1/2 = ln2/koff를 사용하여 계산되었다.
표 4에는 이전에 기술된 결합제 CD3orig와 비교하여 최적화된 항-CD3 항체의 결합에 관한 모든 동역학 매개변수들이 나열되어 있다. 최적화된 항-CD3 항체(TCB 형식)는 낮은 nM 범위 내지 높은 pM 범위의 KD 값으로 CD3ε/δ에 결합하며, 인간 CD3ε/δ의 경우 600pM에서 최대 1.54nM 그리고 사이노몰구스 CD3ε/δ의 경우 200pM에서 최대 700pM의 KD 값을 나타낸다. CD3orig와 비교하여 최적화된 항-CD3 항체의 인간 CD3ε/δ에 대한 결합 친화도는 동일한 조건에서 SPR로 측정할 때 최대 7 내지 10배 증가한다.
인간 CD3ε/δ에 대한 1가 결합의 반감기는 항-CD3 항체 클론 P033.078의 경우 11.6분으로 CD3orig의 결합 반감기보다 최대 6배 더 높다.
표 4. 인간 및 사이노몰구스 CD3ε/δ에 대한 항-CD3 항체(TCB 형식)의 친화도.
Figure pct00030
실시예 4 - 스트레스 후 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 최적화된 항-CD3(다중특이성) 항체의 특성화
탈아미드화 부위 제거의 효과 및 항체의 안정성에 대한 효과를 평가하기 위해 최적화된 항-CD3 항체(TCB 형식)를 37℃, pH 7.4 및 40℃, pH 6에서 14일 동안 인큐베이션하고 인간 CD3ε/δ에 대한 결합 능력에 대해 SPR로 추가로 분석하였다. -80℃ pH 6에서 보관된 샘플을 참조로 사용했다. 참조 샘플 및 40℃에서 스트레스 받은 샘플은 20mM His, 140mM NaCl, pH 6.0 중에 있었고 37℃에서 PBS, pH 7.4에서 스트레스를 받은 샘플들은 모두 1.0mg/㎖의 농도였다. 스트레스 기간(14일) 후 PBS 중의 샘플을 추가 분석을 위해 20mM His, 140mM NaCl, pH 6.0으로 다시 투석했다.
모든 SPR 실험은 전개 및 희석 완충액으로 HBS-P+ 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4, 0.05% 계면활성제 P20)을 사용하여 25℃에서 Biacore T200 기기(GE Healthcare)에서 수행되었다. 비오틴화된 인간 CD3ε/δ(실시예 3, 서열번호 41 및 42 참조) 및 비오틴화된 항-huIgG(Capture Select, Thermo Scientific, #7103262100)를 Series S 센서칩 SA(GE Healthcare, #29104992)에 고정화시켜, 적어도 1000 공명 단위(RU)의 표면 밀도를 생성하였다. 농도가 2 ㎍/㎖인 항-CD3 항체를 5 ㎕/분의 유속으로 30초 동안 주입하고, 해리를 120초 동안 모니터링하였다. 10mM 글리신 pH 1.5를 60초 동안 주입하여 표면을 재생시켰다. 벌크 굴절률 차이는 블랭크 주입을 빼고 대조군 유동 세포로부터 얻은 반응을 빼서 수정했다. 평가를 위해 주입 종료 5초 후의 결합 반응을 선택했다. 결합 신호를 정규화하기 위해, CD3 결합을 항-huIgG 반응(고정화된 항-huIgG 항체 상의 CD3 항체의 포획 시에 수득된 신호(RU))으로 나누었다. 상대 결합 활성은 온도 스트레스를 받은 각 샘플을 스트레스를 받지 않은 상응하는 샘플을 참조하여 계산되었다.
표 5에서 보는 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 모든 항-CD3 항체는 스트레스 받았을 때 CD3orig에 비해 CD3ε/δ에 대한 개선된 결합을 보여준다.
표 5. 2주 동안 pH 6/40℃ 또는 pH 7.4/37℃에서 배양 후 인간 CD3ε/δ에 대한 항-CD3 항체(TCB 형식)의 결합 활성.
Figure pct00031
실시예 5 - 최적화된 항-CD3(다중특이적) 항체를 사용한 Jurkat NFAT 리포터 세포 분석
최적화된 항-CD3 항체를 함유하는 (TYRP1-표적화된) TCB를 표적 세포로서 CHO-K1 TYRP1 클론 76(세포들은 CHO-K1 세포의 안정한 형질도입에 의해 생성되었음)의 존재하에 Jurkat NFAT 리포터 세포 분석에서 테스트하였다. Jurkat NFAT 리포터 세포(Promega)들을 10% FBS, 2g/l 글루코스(Sigma), 2g/l NaHCO3(Sigma), 25mM HEPES(Gibco), 1% GlutaMax(Gibco), 1 x NEAA(Sigma), 1% SoPyr(Sigma)(Jurkat NFAT 배지)를 함유하는 RPMI 1640(Gibco)에서 0.1-0.5 mio 세포/㎖로 배양하였다. CHO-K1 TYRP1 클론 76 세포들을 10% FBS 및 6 ㎍/㎖ 퓨로마이신(Invivogen)을 함유하는 DMEM/F12 + GlutaMAX(1x)(Gibco)에서 배양했다. 분석은 Jurkat NFAT 배지에서 수행되었다.
CHO-K1 TYRP1 클론 76 세포들은 트립신(Gibco)을 사용하여 분리되었다. 세포를 계수하고 생존력을 확인하였다. 표적 세포들을 분석 배지에 재현탁시키고 백색의 평평한 바닥 384웰 플레이트에 웰당 10000개의 세포를 시딩하였다. 그런 다음 TCB를 표시된 농도로 첨가했다. Jurkat NFAT 리포터 세포를 계수하고 생존력을 확인하고 웰당 20,000개의 세포를 시딩하였으며, 이는 2:1의 효과기 대 표적(E:T) 비율에 해당한다. 또한, 2% 최종 부피의 GloSensor cAMP 시약(E1291, Promega)를 각 웰에 첨가했다. 표시된 인큐베이션 시간 후, Tecan Spark10M 장치를 사용하여 발광을 측정했다.
도 4A-B에서 보는 바와 같이, 최적화된 항-CD3 항체를 함유하는 TCB는 Jurkat NFAT 리포터 세포에서 모 결합제 CD3orig를 함유하는 TCB와 유사한 기능적 활성을 가졌다. 테스트된 TCB는 농도 의존적 방식으로 CD3 활성화를 유도했다.
실시예 6 - 최적화된 항-CD3(다중특이성) 항체를 사용한 원발성 흑색종 세포의 종양 세포 사멸
(TYRP1-표적화된) TCB 형식의 최적화된 항-CD3 항체를 인간 흑색종 세포주 M150543(1차 흑색종 세포주, 취리히 대학교 피부과 세포 은행에서 얻음)와 함께 공동으로 인큐베이션된 새로이 단리된 인간 PBMC를 사용하여 종양 세포 사멸 분석으로 테스트하였다. 종양 세포 용해는 24시간 및 48시간 후 세포 사멸 또는 괴사 세포에 의해 세포 상청액으로 방출된 LDH의 정량화에 의해 결정되었다. CD4 및 CD8 T 세포의 활성화는 48시간 후 두 세포 하위집합에서 CD69 및 CD25의 상향 조절에 의해 분석되었다.
분석 시작 전날, 표적 세포(M150543)를 트립신(Gibco)을 사용하여 분리하고 PBS로 1회 세척하고 성장 배지(10% FBS, 1% GlutaMax(Gibco) 및 1% SoPyr(Sigma)를 함유하는 RPMI 1640(Gibco))에서 0.3mio 세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다. 100 ㎕의 세포 현탁액(30,000개 세포 함유)을 96웰 평평 바닥 플레이트에 시딩하였다. 세포를 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
다음 날, 건강한 기증자의 혈액으로부터 PBMC를 단리하고 생존력을 확인했다. 도말된 표적 세포에서 배지를 제거하고 100 ㎕의 분석 배지(2% FBS 및 1% GlutaMax(Gibco)를 함유하는 RPMI 1640(Gibco))를 웰에 첨가하였다. 항체를 표시된 농도로 분석 배지에 희석시키고 웰당 50 ㎕를 표적 세포에 첨가하였다. 분석 배지를 대조군 웰에 첨가하였다. 단리된 PBMC를 6mio 세포/㎖의 밀도로 재현탁하고, 웰당 50 ㎕를 첨가하여 300,000개 세포/웰(E:T 10:1)을 생성했다. 자발적인 LDH 방출(최소 용해 = 0%)의 결정을 위해, PBMC와 표적 세포만 공동 인큐베이션했다. 최대 LDH 방출(최대 용해 = 100%)의 측정을 위해, 분석 배지만 표적 세포에 추가되었다. TCB의 특이성을 테스트하기 위해 표적 세포가 없는, PBMC와 TCB가 있는 대조군 웰을 사용했다. CD8 및 CD4 T 세포가 표적을 발현하는 종양 세포의 부재시 활성화되는지를 결정하기 위해, CD25의 발현을 48시간 후에 분석하였다.
최대 LDH 방출의 경우, 1차 LDH 측정 몇 시간 전에 4% Triton X-100(Bio-Rad)을 포함하는 분석 배지 50 ㎕를 표적 세포만 포함하는 웰에 첨가했다(웰당 1% Triton X-100의 최종 농도가 생성됨). 분석은 인큐베이터에서 37℃에서 총 48시간 동안 인큐베이션되었다. 1차 LDH 측정은 분석 시작 24시간 후에 수행되었다. 이를 위해 측정 전 세포독성 검출 키트(LDH)(Roche/Sigma, #11644793001)를 상온으로 조정하였다. 분석 플레이트를 420 xg에서 4분 동안 원심분리하고 분석을 위해 웰당 50 ㎕의 상청액을 96웰 평평한 바닥 플레이트로 옮겼다. 그런 다음 웰당 1.25 ㎕의 LDH 촉매 및 56.25 ㎕의 LDH 기질의 반응 혼합물을 제조하였다. 이후에 LDH 반응 혼합물 50 ㎕를 각 웰에 첨가하고 TECAN Infinite F50 기기를 사용하여 흡광도를 즉시 측정하였다. 분석 시작 48시간 후 측정을 반복하였다.
그 후 PBMC를 수확하고 활성화에 대한 CD25 및 CD69 상향 조절을 측정하여 분석했다. 구체적으로, 각 웰에 FACS 완충액 100 ㎕를 첨가하고 FACS 염색을 위해 세포를 96웰 U 바닥 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 400 xg에서 4분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 웰당 150 ㎕ FACS 완충제로 세척하였다. 플레이트를 다시 400 xg에서 4분 동안 원심분리하고 상청액을 제거했다. 이어서, CD4 APC(클론 RPA-T4, BioLegend), CD8 FITC(클론 SK1, BioLegend), CD25 BV421(클론 BC96, BioLegend) 및 CD69 PE(클론 FN50, BioLegend)를 함유하는 항체 혼합물을 웰당 30 ㎕로 세포에 첨가하였다. 세포를 냉장고에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고 웰당 1% PFA를 함유하는 100 ㎕ FACS 완충액에 재현탁시켰다. 측정 전에 세포를 150 ㎕ FACS 완충액에 재현탁시켰다. 분석은 BD LSR Fortessa 장치를 사용하여 수행되었다.
항-CD3 항체 클론 P035.093 및 클론 P021.045를 함유하는 TCB를 사용한 처리는 가장 높은 종양 세포 사멸을 초래하였고, 클론 P033.078 및 클론 P035.064는 중간 정도의 종양 세포 사멸을 일으켰고, 그 다음으로 클론 P004.042는 모 결합제 CD3orig를 함유하는 TCB와 비교하여 유사한 종양 세포 사멸을 유도하였다(도 5A-B). T 세포의 활성화는 항-CD3 항체 클론 P035.093 및 클론 P021.045를 함유하는 TCB로 처리될 때 가장 높은 반면, 다른 항-CD3 항체 클론을 함유하는 TCB는 모 결합제 CD3orig를 함유하는 TCB와 유사한 T 세포 활성화를 유도했다(도 6A-D).
도 7A-B에 나타낸 바와 같이, 테스트된 TCB는 종양 표적 세포의 부재시 CD8 및 CD4 T 세포에서 CD25 상향조절을 유도하지 않았다. 이 결과는 테스트된 CD3 결합제가 예를 들어 종양 세포에 대한 결합을 통한 가교에 의존하여 T 세포 활성화를 유도하고 1가 형식에서는 T 세포 활성화를 유도할 수 없음을 보여준다.
실시예 7 - 최적화된 항-CD3 항체의 제조
최적화된 항-CD3 항체 클론 P033.078, P035.093 및 P004.042는 도 8A에 도시된 바와 같이 CD3 결합 부분에 교차된 VH 및 VL 도메인을 가지는 1가 인간 IgG1 형식으로 전환되었다.
중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변 영역은 도 8 B 내지 D에 도시된 바와 같이 각각의 수용 포유동물 발현 벡터에 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄를 가진 프레임에 서브클로닝되었다.
중쇄의 정확한 페어링(이종이량체 분자의 형성)를 위해, 놉-인투-홀 돌연변이가 항체 중쇄의 불변 영역(각각 T366W/S354C 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C)에 도입되었다.
또한, P329G, L234A 및 L235A 돌연변이를 항체 중쇄의 불변 영역에 도입하여 Fcγ 수용체에 대한 결합을 제거하였다.
CD3 결합제로서 CD3orig를 포함하는 상응하는 분자도 제조하였다.
1가 IgG 분자는 Evitria사(스위스)에서 제조되었으며, 실시예 1에서 TCB 분자에 대해 기재된 바와 같이 정제 및 분석되었다. 세포의 형질감염을 위해, 상응하는 발현 벡터는 1:1:1 비율("벡터 놉 중쇄":"벡터 홀 중쇄":"벡터 경쇄")로 적용되었다.
제조된 1가 IgG 분자의 생화학적 및 생물물리학적 분석 결과를 표 6에 나타내었다.
모든 1가 IgG 분자는 좋은 품질로 생산될 수 있다.
표 6 1가 IgG 형식의 항-CD3 항체의 생화학적 및 생물물리학적 분석.
Figure pct00032
실시예 8 - 최적화된 항-CD3 항체의 열 안정성 측정
1가 IgG 형식의 항-CD3 항체(실시예 19에서 제조됨)의 열 안정성을 동적 광 산란(DLS) 및 실시예 2에 기재된 바와 같은 온도 의존성 고유 단백질 형광의 모니터링에 의해 모니터링하였다.
결과를 표 7에 나타낸다. 1가 IgG 형식의 모든 최적화된 CD3 결합제의 응집 온도(Tagg) 및 관찰된 온도 유도 풀림 전이(Tm)의 중간점은 이전에 기재된 CD3 결합제 CD3orig에 대한 것과 비슷하거나 더 높다.
표 7. 동적 광산란 및 온도 의존적 고유 단백질 형광의 변화에 의해 측정된 1가 IgG 형식의 항-CD3 항체의 열 안정성.
Figure pct00033
실시예 9 - 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 최적화된 항-CD3 항체의 기능적 특성화
실시예 7에서 제조된 1가 IgG 분자를 사용하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 SPR 실험을 수행하였다.
CD3에 대한 상호작용을 분석하기 위해, IgG 분자를 5 ㎕/분의 유속으로 50nM에서 240초 동안 포획했다. 인간 및 사이노몰구스 CD3ε 줄기-Fc(놉)-Avi/CD3δ-줄기-Fc(홀)을 300초 동안 유동 세포를 통해 30 ㎕/분의 유속으로 0.061 - 250nM의 농도로 통과시켰다. 해리를 800초 동안 모니터링했다.
표 8에는 이전에 기술된 결합제 CD3orig와 비교하여 최적화된 항-CD3 항체의 결합에 관한 모든 동역학 매개변수들이 나열되어 있다. 최적화된 항-CD3 항체(1가 IgG 형식)는 낮은 nM 범위 내지 높은 pM 범위의 KD 값으로 CD3ε/δ에 결합하며, 인간 CD3ε/δ의 경우 770pM에서 최대 1.36nM 그리고 사이노몰구스 CD3ε/δ의 경우 200pM에서 최대 400pM의 KD 값을 나타낸다. CD3orig와 비교하여 최적화된 항-CD3 항체의 인간 CD3ε/δ에 대한 결합 친화도는 동일한 조건에서 SPR로 측정할 때 최대 3.5 내지 15배 증가한다.
인간 CD3ε/δ에 대한 1가 결합의 반감기는 항-CD3 항체 클론 P033.078의 경우 8.69분으로 CD3orig의 결합 반감기보다 2배 이상 더 높다.
표 8. 인간 및 사이노몰구스 CD3ε/δ에 대한 항-CD3 항체(1가 IgG 형식)의 친화도. 삼중 측정에서 얻은 데이터.
Figure pct00034
*동역학 및 친화도 값은 피팅 품질이 좋지 않아 완전히 신뢰가능한 것은 아니다.
실시예 10 - 항-이디오타입 마스크의 생성
키메라 IgG로서 항이디오타입 마스크의 생산 및 평가
본원에 기재된 키메라 IgG들은 Evitria사의 기존(비-PCR 기반) 클로닝 기술을 이용한 자사의 벡터 시스템과 현탁-적응된 CHO K1 세포(본래 ATCC로부터 받았고 Evitria사의 현탁 배양에서의 무혈청 성장에 적응됨)를 사용하여 제조되었다. 생산을 위해, Evitria사는 자사의 무-동물 성분 및 무혈청 배지(eviGrow 및 eviMake2)와 자사의 형질감염 시약(eviFect)을 사용했다. 원심분리 및 후속 여과(0.2μm 필터)에 의해 상층액을 수확하고, 표준 방법으로 정제하였다.
항-이디오타입 마스크의 특성화 - 다른 CD3 mAb에 대한 결합
SPR 실험은 전개 완충액으로 HBS-EP+(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20(BR-1006-69, GE Healthcare))를 사용하여 Biacore T200에서 수행되었다. 3개의 항-이디오타입 항체를 CM5 칩(GE Healthcare)에서 아민 커플링에 의해 직접 고정화시켰다. 서로 다른 T 세포 이중특이성(TCB)의 3배 희석 시리즈를 리간드 위로 30 ㎕/분의 속도로 180초 동안 통과시켜 결합 단계를 기록했다. 해리 단계를 600초 동안 모니터링하고 샘플 용액으로부터 HBS-EP+로 전환하여 트리거했다. 칩 표면은 60초 동안 10mM 글리신 pH 2.1을 한 번 주입한 다음 30초 동안 두 번 주입하여 모든 주기 후에 재생되었다. 참조 유동 세포 1에서 얻은 반응을 빼서 벌크 굴절률 차이를 수정했다. 친화도 상수는 Biaeval 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 Langmuir 결합에 피팅함으로써 동역학 속도 상수로부터 유도되었다. 측정은 단일 희석 시리즈로 수행되었다.
Figure pct00035
표 9: 서로 다른 CD3 결합제에 대한 서로 다른 마스크의 결합 친화도. SPR 분석은 마스크를 IgG(CM5 칩에 고정)로 사용하고 분석물로서 서로 다른 CD3 결합 Fab를 가진 TCB를 사용하여 평가되었다.
항-이디오타입 마스크의 특성화 - 개발 가능성
항 이디오타입 마스크 중 하나(4.15.64)는 CDRL1(NYS)에서 N-당화 부위를 나타내므로 이 분자는 더 이상 고려되지 않았지만 4.24.72 및 4.32.63 마스크만 추가로 평가되었는데, 다른 CD3 결합제들을 차단하는 데 사용될 수 있기 때문이다.
40℃에서 20mM His/HCl, 140mM NaCl pH 6.0 또는 37℃에서 1xPBS pH 7.4에서 14일 배양 후 항-이디오타입 항체 4.32.63 및 4.24.72의 결합을 Biacore T200 기기(GE Healthcare)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 조사했다. 간단히 말해서, 단량체 FolR1-Fc(유동 세포 2에서) 및 항-PGLALA 항체(유동 세포 4에서)를 표준 아민 커플링 화학을 사용하여 시리즈 S 센서 칩 CM5(CE Healthcare)에 고정시켜, 10000 공명 단위(RU) 이상의 표면 밀도를 생성했다. 유동 세포 1 및 3을 모의 대조군으로 사용했다. CD3-CH2527 결합 도메인을 포함하는 FolR1 TCB-D-16D5를 FolR1-Fc 표면에만 10 ㎍/㎖의 농도로 5 ㎕/분의 유속으로 120초 동안 주입하여 1000RU 이상의 표면 밀도를 얻었다. 이어서, 항-이디오타입 항체를 1 ㎍/㎖의 농도로 60초 및 120초 동안 5 ㎕/분의 유속으로 모든 유동 세포에 주입하였다. 해리를 60초 동안 모니터링하였다. FolR1-Fc 표면은 60초 동안 10mM Glycine pH 1.7을 주입하여 재생되었고, 항-PGLALA 표면은 10mM NaOH를 60초 동안 주입하여 재생되었다. 유동 세포 1 및 3(모의 표면)에서 얻은 반응을 빼서 벌크 굴절률 차이를 수정했다.　
항-이디오타입 항체의 결합 신호를 정규화하기 위해, FOLR1 TCB-D-16D5 표면의 결합 반응을 항-PGLALA 표면의 결합 반응으로 나누었다. 상대적 활성 농도는 스트레스를 받은 샘플의 정규화된 반응을 스트레스를 받지 않은 각 분자에 대한 참조 샘플의 정규화된 반응으로 나누어 구했다.
Figure pct00036
표 10: 모체 키메라 항-이디오타입 마스크의 분자 안정성 비교(스트레스 조건(예: 다른 완충액에서 14일 동안 인큐베이션) 후 열 안정성 및 분자 무결성/활성).
4.32.63 마스크의 경우 pH 6.0에서 40℃에서 14일 동안 인큐베이션한 후 상대 활성 농도의 상당한 감소(73% 잔여 표적 결합)가 관찰된 반면, 4.24.72는 이러한 조건에서 96% 잔여 표적 결합 활성으로 안정하다.
실시예 11 - CD3 결합제 P035.093에 대한 항-이디오타입 클론의 스크리닝
CD3 결합제에 대한 항-이디오타입(항-ID) 클론(4.24.72, 4.32.63, 4.21 및 4.15.64)의 결합 및 차단 능력은 TYRP1 TCB(다양한 CD3 결합제)를 사용한 Jurkat NFAT 활성화 분석을 사용하여 테스트되었다. 항-ID IgG의 차단은 차단된 CD3 결합제의 결과로서 Jurkat NFAT 활성화의 감소로 나타낼 수 있다(도 10).
TYRP1 표적화 T 세포 이중특이성 항체(TCB)는 표적 세포 상의 TYRP1 및 T 세포(Jurkat NFAT) 상의 CD3엡실론에 동시에 결합하여 T 세포 활성화를 유도한다. T 세포 활성화는 Jurkat NFAT 세포가 CD3엡실론(CD3ε)을 통한 활성화 시 루시퍼라제를 발현하므로 발광과 상관관계가 있다. Jurkat-NFAT 리포터 세포주(Promega)는 인간 CD3ε을 발현하는 NFAT 프로모터가 있는 인간 급성 림프구 백혈병 리포터 세포주이다. TCB가 종양 표적에 결합하고 CD3(가교)가 CD3ε에 결합하면 One-Glo 기질(Promega)을 추가한 후 발광에서 루시퍼라제 발현을 측정할 수 있다.
Jurkat NFAT 분석 배지: RPMI1640, 2g/l 글루코스, 2g/l NaHCO3, 10% FCS, 25mM HEPES, 2mM L-글루타민, 1 x NEAA, 1 x 피루브산나트륨
Jurkat NFAT 배양 배지: RPMI1640, 2g/l 글루코스, 2g/l NaHCO3, 10% FCS, 25mM HEPES, 2mM L-글루타민, 1 x NEAA, 1 x 피루브산 나트륨; 새로이 추가된 하이그로마이신 B 200 ㎍/㎖.
TYRP1 양성 표적 세포(CHO-huTYRP1 cl 76) 및 효과기 세포(Jurkat NFAT)를 수확하고, 계수하고, 생존력에 대해 확인하였다. TCB는 Jurkat 분석 배지에서 희석되었다(최종 농도: 이전 분석에서 결정된 EC90 농도, 50 ㎕/웰). TCB, 표적 세포(50 ㎕/웰에서 20.000/웰) 및 cAMP가 있는 Jurkat NFAT 효과기 세포(2% 최종 부피)(50 ㎕/웰에서 50.000개 세포/웰)를 혼합하고 96웰 흰색 벽의 평평 바닥 플레이트에 첨가했다(Greiner BioOne). 따라서 E:T 비율은 2.5:1이었다. 희석 열을 준비하고 웰당 50 ㎕를 추가하기 전에 항-이디오타입 IgG를 Jurkat 분석 배지에서 희석했다. 세포를 가습 인큐베이터에서 37℃에서 22시간 동안 인큐베이션한 후 실온에 적응시키기 위해 인큐베이터에서 약 10분 동안 꺼내 두고 0.5초/웰을 검출 시간으로 사용하여 Tecan Spark에서 발광을 판독하였다. TYRP1 TCB(다양한 CD3 결합제)는 Jurkat NFAT 활성화를 유도하지만 비표적 TCB(CD3 CH2527)는 유도하지 않는다(도 10A). 항-ID IgG가 CD3 결합제에 결합하면 CD3 클론 22 및 CD3 P033.005를 제외하고 여기서 사용된 모든 CD3 결합제를 차단하는 항-ID 4.24.72 IgG에 대해 제시된 바와 같이 Jurkat NFAT 활성화를 차단할 수 있다(도 3B). 항-ID 4.32.63 IgG는 CD3 결합제 CH2527만을 차단한다(도 10C). 항-ID 4.15.64 IgG는 CD3 클론 22를 제외하고 여기에서 사용된 모든 CD3 결합제를 차단한다(도 10D). 항-ID 4.21 IgG는 CD3 클론 22를 제외하고 여기에서 사용된 모든 CD3 결합제를 차단하는 반면, 가장 강력한 차단은 CD3 CH2527에서 관찰되었다(도 10E). 종합하면 항-ID 4.24.72는 이 분석 설정에서 최고의 차단 능력을 나타내었으므로 CD3 P035.093을 사용하여 pro-TCB 형식으로 전환되었다.
실시예 12 - FOLR1 pro-TCB 형식의 항-ID 4.24.72의 마스킹 효율성
서로 다른 CD3 결합제들을 사용한 FOLR1 proTCB의 비교
서로 다른 CD3 결합제의 마스킹을 항-이디오타입 마스크 4.24.72와 비교하기 위해 FOLR1 proTCB 및 각각의 FOLR1 TCB 분자가 생성되었다. proTCB 분자는 마스크와 CD3 Fab 사이에 절단 불가능한 GS 링커 또는 MMP2/9 및 매트립타제에 의해 절단 가능한 링커 서열을 함유했다.
모든 분자는 충분한 양과 좋은 품질로 생산되었다. 예상대로 proTCB 분자는 일반적으로 모체 TCB에 비해 낮은 수율을 나타내었다.
Figure pct00037
표 11: 상이한 CD3 결합 단위를 함유하는 FOLR1 TCB 및 FOLR1 proTCB의 생산 및 특성화. MMP: hu MMP2/9에 대한 절단 부위; MT: hu 매트립타제의 절단 부위
FOLR1 TCB 및 FOLR1 pro-TCB를 Jurkat NFAT 활성화 분석으로 테스트하여 항-ID 마스크 4.24.72가 pro-TCB 형식(CD3 결합제에 N-말단적으로 융합된 항-ID 이황화물 안정화 scFv)의 CD3 결합제를 차단하는지 확인했다. Jurkat NFAT 분석은 표적 세포 대신 huFOLR1 코팅된 비드로 수행되었다. 2x30 ㎕ 스트렙타비딘 다이나비드(Streptavidin Dynabeads)를 각각 5㎖ DPBS에 희석했다. 비드를 400rcf에서 4분 동안 원심분리하고 상청액을 흡인했다. 비드를 천천히 회전시키면서 4℃에서 1시간 동안 1㎖ 중의 20 ㎍의 비오틴화된 FolR1 항원으로 코팅했다. 인큐베이션 후, 비드-ag 접합체를 각각 5㎖ DPBS로 세척하고 4㎖ 분석 배지에 재현탁시켰다. 효과기 세포(Jurkat NFAT)를 수확하고 계수하고 생존력을 확인했다. TCB를 Jurkat 분석 배지에 희석하였다. TCB(10 ㎕/웰), 코팅된 비드(10 ㎕/웰) 및 cAMP가 있는 Jurkat NFAT 효과기 세포(2% 최종 부피)(20 ㎕/웰 중 20.000개 세포/웰)를 혼합하고 384웰 흰색 벽의 평평한 바닥 플레이트(Falcon/Corning)에 첨가했다. 플레이트를 가습 인큐베이터에서 37℃에서 5 내지 6시간 동안 인큐베이션한 후 0.5초/웰을 검출 시간으로 사용하여 Tecan Spark에서 발광을 판독하기 위해 인큐베이터에서 꺼냈다.
항-ID 마스크 4.24.72가 있는 FOLR1 pro-TCB는 표시된 농도 범위에서 Jurkat NFAT 활성화를 매개하지 않는 반면 FOLR1 TCB는 용량 의존적 Jurkat NFAT 활성화를 매개하며(도 11a), 이는 항- ID 4.24.72가 차단의 양상에서 pro-TCB 형식으로 작동함을 의미한다.
다음 단계는 링커 절단 시 마스크의 살해(Jurkat NFAT보다 더 민감함) 및 방출에서 마스킹 효율을 테스트하기 위해 절단 가능한 링커로 FOLR1 pro-TCB를 테스트하는 것이었다. FOLR1(pro-) TCB에 의해 매개되는 T 세포 사멸은 HeLa(FolR1+++) 세포를 사용하여 평가되었다. 인간 PBMC를 E:T 비율이 10:1인 효과기 세포로 사용했다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 건강한 인간 기증자로부터 얻은 버피 코트에서 단리되었다. 버피 코트를 멸균 PBS로 1:1로 희석하고 Histopaque 구배(Sigma, #H8889) 위에 적층했다. 원심분리(450 xg, 30분, 파단 없음, 실온) 후 PBMC-함유 경계면을 PBS 50㎖로 후속적으로 채워진 새로운 팔콘 튜브로 옮겼다. 혼합물을 원심분리하고(400 xg, 10분, 실온), 상청액을 버리고 적혈구 용해를 위해 PBMC 펠렛을 2 ㎖ ACK 완충액에 재현탁시켰다. 37℃에서 약 2-3분 동안 인큐베이션한 후, 튜브를 멸균 PBS로 50㎖로 채우고 10분 동안 350 xg에서 원심분리하였다. 이 세척 단계를 한 번 반복한 후, 10% FCS, 1X GlutaMax 및 10% DMSO를 포함하는 RPMI1640 배지에 PBMC를 재현탁하였다. PBMC를 -80℃의 CoolCell® 세포 동결 용기(BioCision)에서 천천히 동결시킨 다음 액체 질소로 옮겼다. 분석 시작 하루 전에 부착성 표적 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 계수하고, 생존력을 확인하고, 분석 배지(RPMI1640, 2% FCS, 1X GlutaMax)에 재현탁시켰다. 분석 시작 약 24시간 전에 PBMC를 고급 RPMI1640 배지(+2% FCS, 1X GlutaMax)에서 해동시켰다. PBMC를 350g에서 7분 동안 원심분리하고 새로운 배지(고급 RPMI1640, 2% FCS, 1X GlutaMax)에 재현탁시켰다. PBMC는 최대 24시간 동안 보관한 후 분석에 사용하였다. 표적 세포는 96-웰 평평한 바닥 플레이트를 사용하여 20,000개 세포/웰의 밀도로 도말되었다. 분자를 분석 매질(RPMI1640, 2% FCS, 1X GlutaMax)에 희석시키고 표시된 농도로 삼중으로 첨가하였다. 플레이트를 가습 인큐베이터에서 약 20시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. PBMCS를 수확하고 7분 동안 350g에서 원심분리한 후 분석 배지(RPMI1640, 2% FCS, 1X GlutaMax)에 재현탁시켰다. 100 ㎕/웰 중 0.2mio PBMC를 첨가한 후(E:T 10:1, 접종된 표적 세포의 수를 기준으로 함), 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 표적 세포 사멸은 세포 사멸/괴사 세포에 의한 세포 상청액으로의 LDH 방출을 정량화함으로써(LDH 검출 키트, Roche Applied Science, #11 644 793 001)을 정량화하여 37℃, 5% CO2에서 48시간 배양 후 평가되었다. 표준 반응은 TCB 없이 효과기 세포와 공동 인큐베이션된 표적 세포를 지칭한다.
FOLR1 TCB는 ~0.29pM의 EC50 값으로 용량 의존적 HeLa 세포 사멸을 유도한다. 활성화된 pro-TCB(링커 절단을 위해 재조합 매트립타제와 함께 사전 인큐베이션됨)의 효능은 FOLR1 TCB와 비슷했다. 절단 불가능한 링커를 포함하는 pro-TCB는 감소된 표적 세포 사멸을 매개하였다(EC50 약 239배 증가)(도 11c). 표적 세포 사멸 이외에도, CD8 양성 T 세포 상의 CD69를 정량화하여 37℃5% CO2에서 48시간 인큐베이션 후 T 세포 활성화를 평가하였다. CD8 양성 T 세포에서의 CD69에 대한 MFI와 관련하여, FOLR1 TCB 및 사전 활성화된 FOR1 pro-TCB의 효능은 비슷하며 마스킹된 pro-TCB(절단 불가능)에 대해 CD8 T 세포 활성화가 검출될 수 없었다. CD69 양성 CD8 T 세포의 백분율과 관련하여, 마스킹된 pro-TCB는 CD69 양성 CD8 T 세포 > 5nM의 증가를 보여주며, 이는 본원에 사용된 최고 농도에서 약 30%까지 증가한다. 항-ID 4.24.72의 마스킹 효율을 상이한 FOLR1 발현 수준을 갖는 상이한 세포주들에 대해 비교하였다.
CD3 P035.093을 가지는 pro-TCB 형태에서 항-ID 4.24.72의 마스킹 효율을 분석하기 위해 huPBMC를 48시간 인큐베이션한 후에 용량 의존적 표적 세포 사멸(Hela 높은 FOLR1 발현, Ovcar-3 및 Skov-3 배지 FOLR1 발현 및 저 FOLR1 발현을 가지는 HT-29)을 측정하였다. TCB 및 FOLR1 양성 표적 세포(E:T = 10:1, 효과기는 인간 PBMC임). FOLR1 TCB는 모든 세포주(Hela, Skov-3, Ovcar-3)에서 용량 의존적 표적 세포 사멸을 유도하는 반면, 마스킹된 FOLR1 pro-TCB는 감소된 표적 세포 사멸을 나타낸다(도 12A 및 12B). 마스킹 효율은 FOLR1 발현 수준에 의존하는 것으로 보인다. FOLR1 pro-TCB(절단불가능)에 의해 유도된 표적 세포 사멸은 FOLR1 발현 수준이 더 낮은 세포에서 가장 많이 감소되는 것으로 보인다. CD3 결합제 CH2527를 가진 FOLR1 TCB와 CD3 결합제 P035.93을 가진 FOLR1 TCB의 비교 결과 CD3 P035.093을 가지는 TCB에서 약간 더 높은 효능을 보여준다(도 12B). 항-ID 4.24.72로 두 CD3 결합제를 모두 마스킹할 수 있다.
실시예 13 - 마스크 4.24.72의 인간화
실시예 12에서 보는 바와 같이, FOLR1 proTCB는 Jurkat NFAT T-세포 활성화 분석에서 나타낸 바와 같이 마스크 4.24.72로 효율적으로 차단되었다. 링커 절단 후, 이 proTCB 분자는 표적 세포 사멸 분석에서 완전히 활성이었다. 따라서, 그리고 이 마스크를 다른 CD3 결합제와 함께 사용할 수 있으므로, 이 항-이디오타입 항체가 인간화를 위해 선택되었다. 10개의 상이한 가변 중쇄 및 8개의 상이한 가변 경쇄가 단량체 외팔(one-armed) IgG로서 설계 및 생산되었다(도 13). 놉-인투-홀 기술을 적용하여 분자의 이종이량체화를 가능하게 했다. 외팔(one-armed) IgG는 Expi293F 세포에서 2 ㎖의 소규모로 일시적으로 생산되었다(형질감염은 제조업체의 권장 사항에 따라 수행됨). CD3 IgG(P035.093)에 대한 초기 결합 및 Jurkat NFAT 리포터 분석에서 T-세포 활성화의 차단(아래에 설명됨)은 외팔(one-armed) 분자를 함유하는 생산 상청액을 사용하여 직접 평가되었다.
CD3 P035.093의 차단을 위한 인간화 변이체의 스크리닝 - Jukat NFAT 활성화 분석
인간화 변이체(IgG 형식)는 상기 설명한 Jurkat NFAT 분석을 사용하여 CD3 결합제 P035.093(및 CH2527)의 차단 능력에 대해 스크리닝되었다. TCB를 EC90 농도(이전 분석에서 결정)로 사용하고 항-ID IgG를 적정했다. 모체 4.24.72 IgG를 대조군으로 사용하였다. 모체 4.24.72는 CD3 CH2527 및 P035.09를 차단했다. 인간화 변이체들은 또한 CD3 CH2527 및 P035.093을 차단하는 반면, 이들 모두 CD3 CH2527에 비해 P035.093을 약간 더 잘 차단하는 것으로 보인다(도 14). 종합하면 이들은 모두 마스킹 CD3 P035.093이다. 이러한 결과에 기초하여, 모체 클론과 비교하기 위해 IgG 및 proTCB에서 상기 기재한 바와 같이 6개의 변이체를 선택하여 제조하고 정제하였다(proTCB 형식의 경우 절단 불가능한 링커를 가짐).
개발가능성 항-CD3 P035.093 4.24.72 항-이디오타입 항체 및 상응하는 인간화 변이체
마스크 4.24.72의 인간화 변이체들에는 분자의 불안정성을 유발할 수 있는 잠재적인 시퀀스 핫스팟이 포함되어 있다. 그러므로 이들을 14일 스트레스 조건(pH6.0에서 40℃ 또는 pH7.4에서 37℃) 후 열적 안정성과 남아 있는 표적 결합에 대해 분석하였다.
40℃에서 20mM His/HCl, 140mM NaCl pH 6.0 또는 37℃에서 1xPBS pH 7.4에서 14일 배양 후 항-이디오타입 항체 4.24.72 및 인간화 변이체 H1L1, H1L2, H2L2, H3L2, H3L3 및 H7L5의 결합을 Biacore T200 기기(GE Healthcare)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 조사했다. 간단히 말해서, 비오틴화된 항-인간 CD3 IgG(항-CD3 P035.093) 및 비오틴화된 항-인간 IgG(ThermoScientific)를 Biotin CAPture 키트(GE Healthcare)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 시리즈 s CAP 칩에 고정화시켰다. 항체들을 5 ㎕/분의 유속으로 각각 5 ㎍/㎖를 120초 동안 주입하여 유동 세포 2 및 3에서 고정화하여 1000 공명 단위(RU) 이상의 표면 밀도를 유도했다. 유동 세포 1은 모의 표면으로 유지되었다. 이어서, 항-이디오타입 항체를 30초 동안 1 ㎍/㎖의 농도로 모든 유동 세포에 주입하였다. 해리는 30초 동안 모니터링되었으며 유속은 5 ㎕/분으로 설정되었다. CAP 칩은 비오틴 포획 키트에 제공된 NaOH와 구아니디늄-하이드로클로라이드의 혼합물을 120초 동안 주입하여 재생되었다. 유동 세포 1(모의 표면)에서 얻은 반응을 빼서 벌크 굴절률 차이를 수정했다.　
항-이디오타입 항체의 결합 신호를 정규화하기 위해, 항-인간 CD3 IgG 표면의 결합 반응을 항-인간 IgG 표면의 결합 반응으로 나누었다. 상대적 활성 농도는 스트레스를 받은 샘플의 정규화된 반응을 스트레스를 받지 않은 각 분자에 대한 참조 샘플의 정규화된 반응으로 나누어 구했다.
Figure pct00038
표 12: 응집 온도 및 스트레스 테스트 후 안정성/활성과 관련하여 인간화 항-이디오타입 마스크 4.24.72의 선택된 변이체들의 비교. HIC 컬럼에서 응집 온도가 58℃ 이상이고 상대 머무름 시간이 0.35분 미만이면 임계값이 아닌 것으로 간주된다. 상대 활성 농도가 87% 및 80%인 샘플 H3L3 및 H7L5를 제외하고 다른 모든 분자들은 테스트된 조건에서 안정하다.
SPR을 사용한 항-CD3 P035-093에 대한 항-이디오타입 항체의 결합 동역학
인간화 변이체 H1L1, 4.24.72 H1L2, H2L2 및 4.24.72 H3L2와 비교하여 모체 항-CD3 P035.093 항-이디오타입 항체 4.24.72의 결합을 Biacore T200 기기(GE Healthcare)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 조사했다. 간단히 말해서, FOLR1-Fc는 제조업체의 지침에 따라 표준 아민 커플링 화학을 사용하여 시리즈 s 센서 칩 C1에 고정되었다. 최종 표면 밀도는 700에서 1000RU 사이에서 얻어졌다. 이어서 FOLR1 CD3 TCB P035.093을 두 번째 유동 세포에 30초 동안 주입했다. 첫 번째 유동 세포가 계속 모의 표면이었다. 항-이디오타입 항체를 1.2 내지 100 nM(1:3 희석 시리즈)의 농도로 120초 동안 두 유동 세포 모두에 주입했다. 해리는 300초 동안 모니터링되었으며 유속은 30 ㎕/분으로 설정되었다. 표면은 60초 동안 10mM 글리신 pH 2.0을 주입한 후 5 ㎕/분의 유속으로 5mM NaOH를 60초 동안 주입하여 재생되었다. 벌크 굴절률 차이는 유동 세포 하나(모의 표면)에서 얻은 반응을 빼고 완충액 주입을 빼서(이중 참조) 수정되었다. 유도된 곡선을 BIAevaluation 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 Langmuir 결합 모델에 피팅하였다. 얻어진 피팅 결과는 1과 4 RU 사이의 Rmax 값을 보여주었다. 모든 실험은 HBS-N(10mM HEPES, 150mM NaCl pH 7.4, 0.05% 계면활성제 P-20)을 사용하여 37℃에서 수행되었다.
결과(n=5):
Figure pct00039
표 13: CD3 P035.093 항-이디오타입 모체 키메라 항체 4.24.72 및 이의 인간화 변이체의 결합 친화도.
실시예 14 - FOLR1 pro-TCB에 의해 매개되는 표적 세포 사멸(마스크로서의 CD3 P035.93 및 인간화 변이체)
표적 세포 사멸은 pro-TCB 형식의 4.24.72 항-ID 마스크의 인간화 변이체의 마스킹 효율을 테스트하기 위해 수행되었다. FOLR1 양성 표적 세포(중간 FOLR1 발현 수준을 갖는 Ovcar-3 세포)를 상기 기재된 바와 같이 huPBMC 및 TCB와 함께 인큐베이션했다. FOLR1 TCB를 양성 대조군으로 사용했다(도 15). 모든 FOLR1 pro-TCB(마스크 및 절단불가능 링커와 같은 다양한 인간화 변이체)는 FOLR1 TCB와 비교하여 감소된 표적 세포 사멸을 보여준다. 마스킹 효율성은 이러한 분석 설정의 모든 인간화 변이체들과 유사하다(도 7). 추가로 T 세포 활성화를 분석했다. FOLR1 TCB는 용량 의존적 T 세포 활성화를 유도한다(CD8 양성 T 세포에 대한 CD69 증가). 절단 불가능한 링커를 함유하는 마스킹된 FOLR1 pro-TCB(CD3 P035.093, 마스크 4.24.72 scFv의 인간화 변이체)는 표시된 농도 범위에서 감소된 T 세포 활성화(CD8 T 세포의 경우 CD69)를 나타내며 인간화 변이체들에서 마스킹 효율성에 대한 어떠한 차이도 검출되지 않았다.
실시예 15 - 스트레스 후 최적화된 항-CD3 항체의 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 특성화
본 실험은 실시예 7에서 제조된 1가 IgG 분자를 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 표 14에서 보는 바와 같이, 최적화된 모든 항-CD3 항체는 CD3orig와 비교하여 스트레스 시 CD3ε/δ에 대한 개선된 결합을 나타낸다.
표 14. pH 6/40℃ 또는 pH 7.4/37℃에서 2주 동안 인큐베이션 후 인간 CD3ε/δ에 대한 항-CD3 항체(1가 IgG 형식)의 결합 활성.
Figure pct00040
전술한 발명들을 이해를 명확히 하기 위해 예시 및 실시예를 예로 들어 상세히 설명하였으나, 이러한 예시 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 내용은 그 전체가 참조문헌으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Protease-activated T cell bispecific antibodies <130> P36114 <140> PCT/EP2021/066335 <141> 2021-06-17 <150> EP 20181072.8 <151> 2020-06-19 <160> 127 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3orig HCDR1 <400> 1 Thr Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3opt HCDR1 (P033.078) (P035.093) (P021.045) <400> 2 Ser Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3opt HCDR1 (P035.064) (P004.042) <400> 3 Asn Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3orig HCDR2 CD3opt HCDR2 (P035.093) (P021.045) <400> 4 Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3opt HCDR2 (P033.078) <400> 5 Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Glu Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 6 <211> 19 <212> 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690 695 700 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 705 710 715 720 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 725 730 735 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 740 745 750 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 755 760 765 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 770 775 780 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 785 790 795 800 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 805 810 815 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 820 825 830 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 835 840 845 Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 850 855 860 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp 865 870 875 880 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe 885 890 895 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 900 905 910 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 915 920 925 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 930 935 940 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 945 950 955 960 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 965 <210> 97 <211> 969 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FolR1 pro TCB P035.093 H2L2 K chain <400> 97 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn 145 150 155 160 Cys Lys Ser Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr 180 185 190 Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr Phe 225 230 235 240 Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 245 250 255 Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 290 295 300 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg 305 310 315 320 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys 325 330 335 Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 340 345 350 Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 355 360 365 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ala Ser 370 375 380 Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 385 390 395 400 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 405 410 415 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 420 425 430 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 435 440 445 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 450 455 460 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 465 470 475 480 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 485 490 495 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly 500 505 510 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 515 520 525 Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 530 535 540 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln 545 550 555 560 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr 565 570 575 Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr 580 585 590 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 595 600 605 Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu 610 615 620 Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 625 630 635 640 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 645 650 655 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 660 665 670 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 675 680 685 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 690 695 700 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 705 710 715 720 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 725 730 735 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 740 745 750 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 755 760 765 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 770 775 780 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 785 790 795 800 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 805 810 815 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 820 825 830 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 835 840 845 Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 850 855 860 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp 865 870 875 880 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe 885 890 895 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 900 905 910 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 915 920 925 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 930 935 940 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 945 950 955 960 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 965 <210> 98 <211> 969 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FolR1 pro TCB P035.093 H3L2 K chain <400> 98 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Gln Gly Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn 145 150 155 160 Cys Lys Ser Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr 180 185 190 Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr Phe 225 230 235 240 Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 245 250 255 Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu 275 280 285 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 290 295 300 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg 305 310 315 320 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys 325 330 335 Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 340 345 350 Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 355 360 365 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ala Ser 370 375 380 Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 385 390 395 400 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 405 410 415 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 420 425 430 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 435 440 445 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 450 455 460 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 465 470 475 480 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 485 490 495 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly 500 505 510 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 515 520 525 Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 530 535 540 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln 545 550 555 560 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr 565 570 575 Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr 580 585 590 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 595 600 605 Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu 610 615 620 Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 625 630 635 640 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 645 650 655 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 660 665 670 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 675 680 685 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 690 695 700 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 705 710 715 720 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 725 730 735 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 740 745 750 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 755 760 765 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 770 775 780 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 785 790 795 800 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 805 810 815 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 820 825 830 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 835 840 845 Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 850 855 860 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp 865 870 875 880 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe 885 890 895 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 900 905 910 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 915 920 925 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 930 935 940 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 945 950 955 960 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 965 <210> 99 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP Protease linker <400> 99 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Leu Gly Leu Trp 1 5 10 15 Ser Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly 35 <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 1 <400> 100 Arg Gln Ala Arg Val Val Asn Gly 1 5 <210> 101 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 2 <400> 101 Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Gly Arg Ser Arg Gly Ser 1 5 10 15 Phe Pro <210> 102 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 3 <220> <221> misc_feature <222> (9)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 102 Arg Gln Ala Arg Val Val Asn Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Pro Leu 1 5 10 15 Ser Leu Tyr Ser Gly 20 <210> 103 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 4 <400> 103 Arg Gln Ala Arg Val Val Asn Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 5 <400> 104 Pro Leu Gly Leu Trp Ser Gln 1 5 <210> 105 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 6 <400> 105 Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Arg Gln Ala Arg Val Val 1 5 10 15 Asn Gly <210> 106 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 7 <400> 106 Phe Val Gly Gly Thr Gly 1 5 <210> 107 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 8 <400> 107 Lys Lys Ala Ala Pro Val Asn Gly 1 5 <210> 108 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 9 <400> 108 Pro Met Ala Lys Lys Val Asn Gly 1 5 <210> 109 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 10 <400> 109 Gln Ala Arg Ala Lys Val Asn Gly 1 5 <210> 110 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 11 <400> 110 Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro 1 5 10 <210> 111 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 12 <400> 111 Gln Ala Arg Ala Lys 1 5 <210> 112 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 13 <400> 112 Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Pro Met Ala Lys Lys 1 5 10 15 <210> 113 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 14 <400> 113 Lys Lys Ala Ala Pro 1 5 <210> 114 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site 15 <400> 114 Pro Met Ala Lys Lys 1 5 <210> 115 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Combined MMP9 MK062, 33 AA for CD3 <400> 115 Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Arg 1 5 10 15 Gln Ala Arg Val Val Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser <210> 116 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin S/B <400> 116 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe 1 5 10 15 Val Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Ser <210> 117 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KKAAPVNG <400> 117 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Ala Pro Val 1 5 10 15 Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser <210> 118 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PMAKKVNG <400> 118 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Val 1 5 10 15 Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser <210> 119 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QARAKVNG <400> 119 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Lys Val 1 5 10 15 Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser <210> 120 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9 <400> 120 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly 1 5 10 15 Phe Leu Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Ser <210> 121 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QARAK <400> 121 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Lys Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Ser <210> 122 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9-PMAKK <400> 122 Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Pro 1 5 10 15 Met Ala Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Ser <210> 123 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KKAAP <400> 123 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Ala Pro Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Ser <210> 124 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PMAKK <400> 124 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Ser <210> 125 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Combined NF9/Mat5 linker <400> 125 Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Gly 1 5 10 15 Arg Ser Arg Gly Ser Phe Pro Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 126 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Combined MK062 MMP9 <400> 126 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Val 1 5 10 15 Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 127 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Combined MK062 MMP9 <400> 127 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Val 1 5 10 15 Asn Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser 35

Claims (51)

  1. (a) (i) 서열번호 2의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 4의 HCDR 2 및 서열번호 10의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및
    (ii) 서열번호 20의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 21의 LCDR 2 및 서열번호 22의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
    을 포함하는, CD3에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 모이어티;
    (b) 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 모이어티; 및
    (c) 제1 항원 결합 모이어티의 이디오타입에 결합할 수 있고, 이로써 제1 항원 결합 모이어티를 가역적으로 은폐할 수 있는, 프로테아제-절단가능 링커를 통해 T 세포 이중특이성 결합 분자에 공유적으로 부착된 마스킹 모이어티(masking moiety)
    를 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    VH가 서열번호 16의 아미노산 서열에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VL이 서열번호 23의 아미노산 서열에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    마스킹 모이어티가 제1 항원 결합 모이어티에 공유적으로 부착되어 제1 항원 결합 모이어티를 가역적으로 은폐하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    마스킹 모이어티가 제1 항원 결합 모이어티의 중쇄 가변 영역에 공유적으로 부착되는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    마스킹 모이어티가 scFv인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 항원 결합 모이어티가, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 영역들이 교환된 교차 Fab 분자인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원 결합 모이어티가 통상적인 Fab 분자인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3에 결합할 수 있는 1개 이하의 항원 결합 모이어티를 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 항원에 결합할 수 있는 Fab 분자인 제3 항원 결합 모이어티를 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  10. 제9항에 있어서,
    제3 항원 결합 모이어티가 제2 항원 결합 모이어티와 동일한, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 항원 결합 모이어티가, FolR1 및 TYRP1로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 세포 항원에 결합할 수 있는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및 제2 항원 결합 모이어티가 선택적으로 펩티드 링커를 통해 서로 융합된, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    안정한 회합이 가능한 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함하는 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  16. 제15항에 있어서,
    Fc 도메인이 IgG, 구체적으로 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    Fc 도메인이 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화도 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    마스킹 모이어티가,
    (a) DYSMN(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
    (b) WINTETGEPRYTDDFKG(서열번호 59), WINTETGEPRYTDDFTG(서열번호 84) 및 WINTETGEPRYTQGFKG(서열번호 86)로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR H2 아미노산 서열; 및
    (c) EGDYDVFDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열
    을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (d) RASKSVSTSSYSYMH(서열번호 62) 및 KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
    (e) YVSYLES(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
    (f) QHSREFPYT(서열번호 64) 및 QQSREFPYT(서열번호 88)로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR L3 아미노산 서열
    을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    마스킹 모이어티가,
    (a) DYSMN(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
    (b) WINTETGEPRYTDDFKG(서열번호 59)의 CDR H2 아미노산 서열; 및
    (c) EGDYDVFDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열
    을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (d) RASKSVSTSSYSYMH(서열번호 62)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
    (e) YVSYLES(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
    (f) QHSREFPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열
    을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    마스킹 모이어티가,
    (a) SYGVS(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
    (b) IIWGDGSTNYHSALIS(서열번호 59)의 CDR H2 아미노산 서열; 및
    (c) GITTVVDDYYAMDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열
    을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (d) KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
    (e) AATFLAD(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
    (f) QHYYSTPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열
    을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    마스킹 모이어티가,
    (a) SYGVS(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
    (b) WINTETGEPRYTDDFTG(서열번호 84)의 CDR H2 아미노산 서열; 및
    (c) GITTVVDDYYAMDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열
    을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (d) KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
    (e) AATFLAD(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
    (f) QHYYSTPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열
    을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    마스킹 모이어티가,
    (a) SYGVS(서열번호 58)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
    (b) WINTETGEPRYTQGFKG(서열번호 86)의 CDR H2 아미노산 서열; 및
    (c) GITTVVDDYYAMDY(서열번호 60)의 CDR H3 아미노산 서열
    을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (d) KSSKSVSTSSYSYMH(서열번호 82)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
    (e) AATFLAD(서열번호 63)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
    (f) QHYYSTPYT(서열번호 64)의 CDR L3 아미노산 서열
    을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    프로테아제-절단가능 링커가 최소 하나의 프로테아제 인식 서열을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    프로테아제 인식 서열이,
    (a) RQARVVNG(서열번호 100);
    (b) VHMPLGFLGPGRSRGSFP(서열번호 101);
    (c) RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(서열번호 102)(이때 X는 임의의 아미노산임);
    (d) RQARVVNGVPLSLYSG(서열번호 103);
    (e) PLGLWSQ(서열번호 104);
    (f) VHMPLGFLGPRQARVVNG(서열번호 105);
    (g) FVGGTG(서열번호 106);
    (h) KKAAPVNG(서열번호 107);
    (i) PMAKKVNG(서열번호 108);
    (j) QARAKVNG(서열번호 109);
    (k) VHMPLGFLGP(서열번호 110);
    (l) QARAK(서열번호 111);
    (m) VHMPLGFLGPPMAKK(서열번호 112);
    (n) KKAAP(서열번호 113); 및
    (o) PMAKK(서열번호 114)
    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    프로테아제-절단가능 링커가 프로테아제 인식 서열 PMAKK(서열번호 114)를 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 항원 결합 모이어티가 FolR1에 결합할 수 있고,
    a) NAWMS(서열번호 54)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
    b) RIKSKTDGGTTDYAAPVKG(서열번호 55)의 CDR H2 아미노산 서열; 및
    c) PWEWSWYDY(서열번호 56)의 CDR H3 아미노산 서열
    을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    d) GSSTGAVTTSNYAN(서열번호 20)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
    e) GTNKRAP(서열번호 21)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
    f) ALWYSNLWV(서열번호 22)의 CDR L3 아미노산 서열
    을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  27. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 항원 결합 모이어티가 TYRP1에 결합할 수 있고,
    a) DYFLH(서열번호 24)의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H)1 아미노산 서열;
    b) WINPDNGNTVYAQKFQG(서열번호 25)의 CDR H2 아미노산 서열; 및
    c) RDYTYEKAALDY(서열번호 26)의 CDR H3 아미노산 서열
    을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    d) RASGNIYNYLA(서열번호 28)의 경쇄(CDR L)1 아미노산 서열;
    e) DAKTLAD(서열번호 29)의 CDR L2 아미노산 서열; 및
    f) QHFWSLPFT(서열번호 30)의 CDR L3 아미노산 서열
    을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  28. 서열번호 79, 서열번호 83 및 서열번호 85로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 80 및 서열번호 81로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 분자의 항-CD3 항원 결합 부위를 가역적으로 은폐할 수 있는 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
  29. 제28항에 있어서,
    서열번호 79에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 80에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
  30. 제28항에 있어서,
    서열번호 79에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 81에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
  31. 제28항에 있어서,
    서열번호 83에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 81에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
  32. 제28항에 있어서,
    서열번호 85에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 81에 최소 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    scFv인 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    링커를 통해 분자에 공유적으로 부착되는 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
  35. 제34항에 있어서,
    링커가 펩티드 링커인, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서,
    링커가 프로테아제-절단가능 링커인, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    펩티드 링커가 최소 하나의 프로테아제 인식 부위를 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
  38. 제37항에 있어서,
    프로테아제 인식 서열이,
    (a) RQARVVNG(서열번호 100);
    (b) VHMPLGFLGPGRSRGSFP(서열번호 101);
    (c) RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(서열번호 102)(이때 X는 임의의 아미노산임);
    (d) RQARVVNGVPLSLYSG(서열번호 103);
    (e) PLGLWSQ(서열번호 104);
    (f) VHMPLGFLGPRQARVVNG(서열번호 105);
    (g) FVGGTG(서열번호 106);
    (h) KKAAPVNG(서열번호 107);
    (i) PMAKKVNG(서열번호 108);
    (j) QARAKVNG(서열번호 109);
    (k) VHMPLGFLGP(서열번호 110);
    (l) QARAK(서열번호 111);
    (m) VHMPLGFLGPPMAKK(서열번호 112);
    (n) KKAAP(서열번호 113); 및
    (o) PMAKK(서열번호 114)
    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
  39. 제37항에 있어서,
    프로테아제-절단가능 링커가 프로테아제 인식 서열 PMAKK(서열번호 114)를 포함하는, 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
  40. 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    T-세포 활성화 이중특이성 분자의 일부인 이디오타입 특이적 폴리펩티드.
  41. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자, 또는 제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 이디오타입 특이적 폴리펩티드, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  42. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 항원 결합 분자, 또는 제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 이디오타입 특이적 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  43. 제42항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터.
  44. 제42항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 제43항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  45. a) 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자의 발현에 적합한 조건하에 제44항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
    b) 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 회수하는 단계
    를 포함하는, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 생산하는 방법.
  46. 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자, 제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 이디오타입 특이적 폴리펩티드, 또는 제41항에 따른 약학 조성물.
  47. 제46항에 있어서,
    약제가 개체에서 암의 치료 또는 진행 지연, 면역 관련 질환의 치료 또는 진행 지연, 또는 면역 반응 또는 기능의 향상 또는 자극을 위한 것인, 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자.
  48. 질환 치료용 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자, 또는 제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 이디오타입 특이적 폴리펩티드의 용도.
  49. 제48항에 있어서,
    질환이 암인, 용도.
  50. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제-활성화가능 T 세포 활성화 이중특이성 분자를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 질환을 치료하는 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    개체에서 암의 치료 또는 진행 지연, 면역 관련 질환의 치료 또는 진행 지연, 또는 면역 반응 또는 기능의 향상 또는 자극을 위한 방법.
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