CN115698080A - 蛋白酶活化的t细胞双特异性抗体 - Google Patents

蛋白酶活化的t细胞双特异性抗体 Download PDF

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Abstract

本发明总体上涉及新型蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子和独特型特异性多肽。本发明还涉及编码此类蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子和独特型特异性多肽的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生本发明的所述蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子和独特型特异性多肽的方法，以及涉及将这些蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子和独特型特异性多肽用于治疗疾病的方法。

Description

蛋白酶活化的T细胞双特异性抗体
技术领域
本发明总体上涉及新型蛋白酶可活化的抗原结合分子，其包含可逆地掩蔽分子的抗原结合的抗独特型结合部分。具体而言，本发明涉及具有抗独特型结合部分的T细胞结合分子，该抗独特型结合部分掩蔽CD3结合部分直到被蛋白酶切割。这使得CD3结合部分无法接近或“被掩蔽”，直到它靠近靶组织，例如肿瘤，例如肿瘤浸润性T细胞。此外，本发明涉及编码此类蛋白酶活化的T细胞结合分子和独特型特异性多肽的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生产本发明的蛋白酶活化的T细胞结合分子的方法，以及将其用于例如治疗疾病的方法。
背景技术
在各种临床环境中，经常希望选择性破坏单个靶细胞或特定靶细胞类型。例如，癌症疗法的主要目标是特异性破坏肿瘤细胞，同时保持健康细胞和组织完好无损。
实现这一目标的一个有吸引力的方法是通过诱导针对肿瘤的免疫应答，使免疫效应细胞如自然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击和破坏肿瘤细胞。在这方面，近年来，设计成用一个“臂”与靶细胞上的表面抗原结合，并用第二个“臂”与T细胞受体(TCR)复合物的活化的、不变的组分结合的双特异性抗体，已引起人们的关注。这种抗体与其两个靶标的同时结合将迫使靶细胞和T细胞之间发生暂时的相互作用，导致活化任何细胞毒性T细胞，并且随后裂解靶细胞。因此，免疫应答被重定向到靶细胞，并且不依赖于靶细胞的肽抗原呈递或T细胞的特异性，这与CTL的正常MHC限制性活化有关。
在这种情况下，至关重要的是，CTL仅在靠近靶细胞时才被活化，即模拟免疫突触。特别需要的是不需要淋巴细胞预处理或共刺激以引起靶细胞有效裂解的T细胞活化双特异性分子。已经开发了几种双特异性抗体形式，并已研究它们对T细胞介导的免疫疗法的适用性。这些包括BiTE(双特异性T细胞接合子)分子(Nagorsen和
Figure BDA0004001238190000021
Exp Cell Res 317,1255-1260(2011))、双抗体(Holliger等人，Prot Eng 9,299-305(1996))及其衍生物，例如串联双抗体(Kipriyanov等人，J Mol Biol 293,41-66(1999))、DART(双亲和性重新靶向)分子，(Moore等人，Blood 117,4542-51(2011))和三功能抗体(Seimetz等人，Cancer TreatRev 36,458-467(2010))。
产生适用于治疗的双特异性分子的任务提出若干技术挑战，这些技术挑战与必须满足的功效、毒性、适用性和可生产性相关。在双特异性分子靶向也在非靶组织中表达的靶细胞(例如癌细胞)上的抗原的情况下，会发生毒性反应。因此需要有效的T细胞活化双特异性分子，其在靶细胞存在下而不是在正常细胞或组织存在下释放完全的T细胞活化。
发明内容
本发明总体上涉及在靶细胞存在下被选择性活化的T细胞活化双特异性分子。
在一个方面，提供了一种蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(a)能够与CD3结合的第一抗原结合部分，其中该第一抗原结合部分包含
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(HCDR)
1、SEQ ID NO:4的HCDR 2和SEQ ID NO:10的HCDR 3，以及
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:20的轻链互补决定区(LCDR)
1、SEQ ID NO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3；
(b)能够与靶细胞抗原结合的第二抗原结合部分；以及
(c)通过蛋白酶可切割的接头共价连接至T细胞双特异性结合分子的掩蔽部分，其中该掩蔽部分能够与第一抗原结合部分的独特型结合，从而可逆地隐蔽第一或第二抗原结合部分。
在一个方面，VH包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和/或VL包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个方面，掩蔽部分共价连接至第一抗原结合部分并且可逆地隐蔽第一抗原结合部分。
在一个方面，掩蔽部分共价连接至第一抗原结合部分的重链可变区。
在一个方面，掩蔽部分为抗独特型scFv。
在一个方面，第二抗原结合部分为交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区被交换。
在一个方面，第一抗原结合部分为常规Fab分子。
在一个方面，提供了如上文所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含不超过一个能够与CD3结合的抗原结合部分。
在一个方面，提供了如上文所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含第三抗原结合部分，该第三抗原结合部分为能够与靶细胞抗原结合的Fab分子。
在一个方面，第三抗原结合部分与第二抗原结合部分相同。
在一个方面，第二抗原结合部分能够与选自由FolR1和TYRP1组成的组的靶细胞抗原结合。
在一个方面，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分彼此融合，任选地经由肽接头融合。
在一个方面，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合部分的Fab重链的N末端。
在一个方面，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合部分的Fab重链的N末端。
在一个方面，提供了如上文所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其另外地包含由能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域。
在一个方面，Fc结构域为IgG，具体地为IgG1Fc结构域或IgG4 Fc结构域。
在一个方面，Fc结构域与天然IgG1Fc结构域相比，表现出对Fc受体的降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能。
在一个方面，掩蔽部分包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)DYSMN(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)CDR H2氨基酸序列，其选自由WINTETGEPRYTDDFKG(SEQ ID NO:59)、WINTETGEPRYTDDFTG(SEQ ID NO:84)和WINTETGEPRYTQGFKG(SEQ ID NO:86)组成的组；
(c)EGDYDVFDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)轻链(CDR L)1氨基酸序列，其选自由RASKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:62)和KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:82)组成的组；
(e)YVSYLES(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)CDR L3氨基酸序列，其选自由QHSREFPYT(SEQ ID NO:64)和QQSREFPYT(SEQ IDNO:88)组成的组。
在一个方面，掩蔽部分包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)DYSMN(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)WINTETGEPRYTDDFKG(SEQ ID NO:59)的CDR H2氨基酸序列；
(c)EGDYDVFDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)RASKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:62)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)YVSYLES(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHSREFPYT(SEQ ID NO:64)的CDR L3氨基酸序列。
在一个方面，掩蔽部分包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)SYGVS(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)IIWGDGSTNYHSALIS(SEQ ID NO:59)的CDR H2氨基酸序列；
(c)GITTVVDDYYAMDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:82)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)AATFLAD(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHYYSTPYT(SEQ ID NO:64)的CDR L3氨基酸序列。
在一个方面，掩蔽部分包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)SYGVS(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)WINTETGEPRYTDDFTG(SEQ ID NO:84)的CDR H2氨基酸序列；
(c)GITTVVDDYYAMDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:82)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)AATFLAD(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHYYSTPYT(SEQ ID NO:64)的CDR L3氨基酸序列。
在一个方面，掩蔽部分包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)SYGVS(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)WINTETGEPRYTQGFKG(SEQ ID NO:86)的CDR H2氨基酸序列；
(c)GITTVVDDYYAMDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:82)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)AATFLAD(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHYYSTPYT(SEQ ID NO:64)的CDR L3氨基酸序列。
在一个方面，蛋白酶可切割的接头包含至少一个蛋白酶识别序列。
在一个方面，蛋白酶识别序列选自由以下项组成的组：
(a)RQARVVNG(SEQ ID NO:100)；
(b)VHMPLGFLGPGRSRGSFP(SEQ ID NO:101)；
(c)RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(SEQ ID NO:102)；
(d)RQARVVNGVPLSLYSG(SEQ ID NO:103)；
(e)PLGLWSQ(SEQ ID NO:104)；
(f)VHMPLGFLGPRQARVVNG(SEQ ID NO:105)；
(g)FVGGTG(SEQ ID NO:106)；
(h)KKAAPVNG(SEQ ID NO:107)；
(i)PMAKKVNG(SEQ ID NO:108)；
(j)QARAKVNG(SEQ ID NO:109)；
(k)VHMPLGFLGP(SEQ ID NO:110)；
(l)QARAK(SEQ ID NO:111)；
(m)VHMPLGFLGPPMAKK(SEQ ID NO:112)；
(n)KKAAP(SEQ ID NO:113)；和
(o)PMAKK(SEQ ID NO:114)，其中X为任何氨基酸。
在一个方面，蛋白酶可切割的接头包含蛋白酶识别序列PMAKK(SEQ ID NO:114)。
在一个方面，第二抗原结合部分能够与FolR1结合，并且包含重链可变区，该重链可变区包含：
a)NAWMS(SEQ ID NO:54)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
b)RIKSKTDGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO:55)的CDR H2氨基酸序列；和
c)PWEWSWYDY(SEQ ID NO:56)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
d)GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:20)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
e)GTNKRAP(SEQ ID NO:21)的CDR L2氨基酸序列；和
f)ALWYSNLWV(SEQ ID NO:22)的CDR L3氨基酸序列。
在一个方面，第二抗原结合部分能够与TYRP1结合，并且包含重链可变区，该重链可变区包含：
a)DYFLH(SEQ ID NO:24)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
b)WINPDNGNTVYAQKFQG(SEQ ID NO:25)的CDR H2氨基酸序列；和
c)RDYTYEKAALDY(SEQ ID NO:26)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
d)RASGNIYNYLA(SEQ ID NO:28)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
e)DAKTLAD(SEQ ID NO:29)的CDR L2氨基酸序列；和
f)QHFWSLPFT(SEQ ID NO:30)的CDR L3氨基酸序列。
在另一方面，提供了用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)DYSMN(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)CDR H2氨基酸序列，其选自由WINTETGEPRYTDDFKG(SEQ ID NO:59)、WINTETGEPRYTDDFTG(SEQ ID NO:84)和WINTETGEPRYTQGFKG(SEQ ID NO:86)组成的组；
(c)EGDYDVFDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)轻链(CDR L)1氨基酸序列，其选自由RASKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:62)和KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:82)组成的组；
(e)YVSYLES(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)CDR L3氨基酸序列，其选自由QHSREFPYT(SEQ ID NO:64)和QQSREFPYT(SEQ IDNO:88)组成的组。
在一个方面，独特型特异性多肽包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)DYSMN(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)WINTETGEPRYTDDFKG(SEQ ID NO:59)的CDR H2氨基酸序列；
(c)EGDYDVFDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)RASKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:62)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)YVSYLES(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHSREFPYT(SEQ ID NO:64)的CDR L3氨基酸序列。
在一个方面，独特型特异性多肽包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)SYGVS(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)IIWGDGSTNYHSALIS(SEQ ID NO:59)的CDR H2氨基酸序列；
(c)GITTVVDDYYAMDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:82)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)AATFLAD(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHYYSTPYT(SEQ ID NO:64)的CDR L3氨基酸序列。
在一个方面，独特型特异性多肽包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)SYGVS(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)WINTETGEPRYTDDFTG(SEQ ID NO:84)的CDR H2氨基酸序列；
(c)GITTVVDDYYAMDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:82)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)AATFLAD(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHYYSTPYT(SEQ ID NO:64)的CDR L3氨基酸序列。
在一个方面，独特型特异性多肽包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)SYGVS(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)WINTETGEPRYTQGFKG(SEQ ID NO:86)的CDR H2氨基酸序列；
(c)GITTVVDDYYAMDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:82)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)AATFLAD(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHYYSTPYT(SEQ ID NO:64)的CDR L3氨基酸序列。
在一个方面，独特型特异性多肽为抗独特型scFv。
在一个方面，独特型特异性多肽通过接头共价连接至分子。
在一个方面，接头为肽接头。
在一个方面，接头为蛋白酶可切割的接头。
在一个方面，肽接头包含至少一个蛋白酶识别位点。
在一个方面，蛋白酶识别序列选自由以下项组成的组：
(a)RQARVVNG(SEQ ID NO:100)；
(b)VHMPLGFLGPGRSRGSFP(SEQ ID NO:101)；
(c)RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(SEQ ID NO:102)；
(d)RQARVVNGVPLSLYSG(SEQ ID NO:103)；
(e)PLGLWSQ(SEQ ID NO:104)；
(f)VHMPLGFLGPRQARVVNG(SEQ ID NO:105)；
(g)FVGGTG(SEQ ID NO:106)；
(h)KKAAPVNG(SEQ ID NO:107)；
(i)PMAKKVNG(SEQ ID NO:108)；
(j)QARAKVNG(SEQ ID NO:109)；
(k)VHMPLGFLGP(SEQ ID NO:110)；
(l)QARAK(SEQ ID NO:111)；
(m)VHMPLGFLGPPMAKK(SEQ ID NO:112)；
(n)KKAAP(SEQ ID NO:113)；和
(o)PMAKK(SEQ ID NO:114)，其中X为任何氨基酸。
在一个方面，蛋白酶可切割的接头包含蛋白酶识别序列PMAKK(SEQ ID NO:114)。
在一个方面，独特型特异性多肽为T细胞活化双特异性分子的一部分。
在另一个方面，提供了一种药物组合物，其包含如上文所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或如上文所述的独特型特异性多肽以及药用载体。
在另一个方面，提供了一种分离的多核苷酸，其编码如上文所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性抗原结合分子或如上文所述的独特型特异性多肽。
在一个方面，提供了一种载体，特别是一种表达载体，其包含如上文所述的多核苷酸。
在一个方面，提供了包含如上文所述的多核苷酸或如上文所述的载体的宿主细胞。
在另一个方面，提供了一种产生蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的方法，其包括以下步骤：a)在适合于表达蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的条件下培养如上文所述的宿主细胞，以及b)回收蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。
在另一方面，提供了如上文所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子、如上文所述的独特型特异性多肽或如上文所述的药物组合物，其用作药物。
在一个方面，该药物用于在个体中治疗癌症或延缓其进展、治疗免疫相关疾病或延缓其进展、或者增强或刺激免疫应答或功能。
在另一个方面，提供了如上文所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或如上文所述的独特型特异性多肽用于制备药物的用途，该药物用于治疗疾病。
在一个方面，疾病为癌症。
在另一个方面，提供了一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，该组合物包含如上文所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。
在一个方面，该方法用于在个体中治疗癌症或延缓其进展、治疗免疫相关疾病或延缓其进展、或者增强或刺激免疫应答或功能。
附图说明
图1本发明的(多特异性)抗体的示例性构型。(A，D)“1+1CrossMab”分子示意图。(B，E)“2+1IgG Crossfab”分子示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(C，F)“2+1IgG Crossfab”分子示意图。(G，K)“1+1IgG Crossfab”分子示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(H，L)“1+1 IgG Crossfab”分子示意图。(I，M)具有两个CrossFab的“2+1 IgG Crossfab”分子的示意图。(J，N)具有两个CrossFab的“2+1 IgGCrossfab”分子的示意图，其中Crossfab和Fab组分的顺序交替(“倒置”)。(O，S)“Fab-Crossfab”分子示意图。(P，T)“Crossfab-Fab”分子示意图。(Q，U)“(Fab)2-Crossfab”分子示意图。(R，V)“Crossfab-(Fab)2”分子示意图。(W，Y)“Fab-(Crossfab)2”分子示意图。(X，Z)“(Crossfab)2-Fab”分子示意图。黑点：Fc结构域中促进异源二聚化的任选修饰。++、--：任选引入CH1和CL结构域中的具有相反电荷的氨基酸。Crossfab分子被描述为包含VH区和VL区的交换，但是可以-在其中在CH1和CL结构域中不引入电荷修饰的方面中-可替代地包含CH1和CL结构域的交换。
图2(A)实例中使用的T细胞双特异性抗体(TCB)分子的示意图。所有测试的TCB抗体分子均以带有电荷修饰的“2+1IgG CrossFab，倒置”产生(在CD3结合剂中的VH/VL交换，在靶细胞抗原结合剂中的电荷修饰，EE＝147E、213E；RK＝123R、124K)。(B-E)用于组装TCB的组件：在CH1和CL中带有电荷修饰的抗TYRP1 Fab分子的轻链(B)、抗CD3交叉Fab分子的轻链(C)、Fc区中带杵和PG LALA突变的重链(D)、Fc区中带臼和PG LALA突变的重链(E)。
图3实例3中使用的表面等离子体共振(SPR)设置的示意图。抗PG抗体与C1传感器芯片偶联。将人和食蟹猴CD3(与Fc区融合)通过表面以分析TCB中的抗CD3抗体与CD3的相互作用。
图4在以CHO-K1TYRP1克隆76作为靶细胞的Jurkat NFAT报告基因测定中测试了含有优化的抗CD3抗体的TCB。与含有CD3orig的TCB进行比较。通过测量处理后4小时(A)和24小时(B)后的发光来确定Jurkat NFAT报告细胞的活化。
图5当用含有优化的抗CD3抗体或亲本结合物CD3orig的TCB处理时，以来自健康供体的PBMC评估黑色素瘤细胞系M150543的肿瘤细胞杀伤。通过对24小时(A)和48小时(B)后LDH释放进行定量来测量肿瘤细胞杀伤。
图6在存在M150543黑色素瘤细胞系作为靶细胞的情况下，针对用含有优化的抗CD3抗体或亲本结合物CD3orig的TCB处理的来自健康供体的PBMC，分析在CD8 T细胞(A,B)和CD4 T细胞(C,D)上的CD25和CD69上调。48小时后通过流式细胞术进行分析。
图7在没有肿瘤靶细胞的情况下，针对用含有优化的抗CD3抗体或亲本结合物CD3orig的TCB处理的来自健康供体的PBMC，分析在CD8(A)和CD4 T细胞(B)上的CD25表达。48小时后通过流式细胞术进行分析。
图8(A)实施例19中产生的单价IgG分子的示意图。单价IgG分子作为人IgG1产生，在CD3结合剂中具有VH/VL交换。(B-E)用于组装单价IgG的组件：抗CD3交叉Fab分子的轻链(B)、Fc区中带杵和PG LALA突变的重链(C)、Fc区中带臼和PG LALA突变的重链(D)。
图9(A)：带有CD3Fab的经典2+1TCB分子通过(G4S)2接头(L1)与内FOLR1 Fab的VH融合。通过杵臼结构技术进行的异源二聚化，Fc中的PGLALA突变。(B)：FOLR1 proTCB，其中CD3抗独特型scFv(VH-VL方向)与CD3 VH融合。接头(L2；总共33个aa)包含特定的蛋白酶可切割序列。scFv的VH和VL之间的(G4S)4接头(L3)。(C)：与B中相同的proTCB，但在scFv和CD3Fab之间的接头中没有蛋白酶切割位点。分子中的轻链在每个Fab中都是相同的(共同轻链)。
图10(A)：由含有不同CD3结合剂的TYRP1TCB介导的Jurkat NFAT活化。示出了由具有不同CD3结合剂的TYRP1 TCB介导的Jurkat NFAT活化。将TYRP1 TCB(以先前测定中确定的EC90浓度使用)与TYRP1阳性靶细胞(CHO-huTYRP1克隆76)和Jurkat NFAT效应细胞(E:T2.5:1)在37℃孵育22小时。虚线显示与靶细胞一起孵育但没有任何TCB的Jurkat NFAT活化。DP47非靶向TCB用作阴性对照。每个点代表三次重复的平均值。标准偏差由误差条指示。
(B)：通过减少由TYRP1TCB介导的Jurkat NFAT活化来测量抗独特型4.24.72IgG的阻断能力。示出了由具有不同CD3结合剂的TYRP1 TCB介导的Jurkat NFAT活化。将TYRP1TCB(以先前测定中确定的EC90浓度使用)与TYRP1阳性靶细胞(CHO-huTYRP1克隆76)和Jurkat NFAT效应细胞(E:T 2.5:1)在37℃孵育22小时。示出了抗独特型(抗-ID)4.24.72IgG对CD3结合剂的剂量依赖性阻断。每个点代表三次重复的平均值。标准偏差由误差条指示。虚线显示与靶细胞一起孵育但没有任何TCB的Jurkat NFAT活化。DP47非靶向TCB用作阴性对照。对于EC-50值的计算，计算非线性拟合“log(激动剂)与应答可变斜率(四个参数)”(GraphPad Prism6)。
(C)：通过减少由TYRP1TCB介导的Jurkat NFAT活化来测量抗ID4.32.63IgG的阻断能力。示出了由具有不同CD3结合剂的TYRP1 TCB介导的Jurkat NFAT活化。将TYRP1 TCB(以先前测定中确定的EC90浓度使用)与TYRP1阳性靶细胞(CHO-huTYRP1克隆76)和JurkatNFAT效应细胞(E:T 2.5:1)在37℃孵育22小时。示出了抗独特型4.32.63IgG对CD3结合剂的剂量依赖性阻断。每个点代表三次重复的平均值。标准偏差由误差条指示。虚线显示与靶细胞一起孵育但没有任何TCB的Jurkat NFAT活化。DP47非靶向TCB用作阴性对照。对于EC-50值的计算，计算非线性拟合“log(激动剂)与应答可变斜率(四个参数)”(GraphPadPrism6)。
(D)：通过减少由TYRP1 TCB介导的Jurkat NFAT活化来测量抗ID4.15.64IgG的阻断能力。示出了由具有不同CD3结合剂的TYRP1 TCB介导的Jurkat NFAT活化。将TYRP1 TCB(以先前测定中确定的EC90浓度使用)与TYRP1阳性靶细胞(CHO-huTYRP1克隆76)和JurkatNFAT效应细胞(E:T 2.5:1)在37℃孵育22小时。示出了抗独特型4.15.64IgG对CD3结合剂的剂量依赖性阻断。每个点代表三次重复的平均值。标准偏差由误差条指示。虚线显示与靶细胞一起孵育但没有任何TCB的Jurkat NFAT活化。DP47非靶向TCB用作阴性对照。对于EC-50值的计算，计算非线性拟合“log(激动剂)与应答可变斜率(四个参数)”(GraphPadPrism6)。
(E)：通过减少由TYRP1TCB介导的Jurkat NFAT活化来测量抗ID4.21IgG的阻断能力。示出了由具有不同CD3结合剂的TYRP1 TCB介导的Jurkat NFAT活化。将TYRP1 TCB(以先前测定中确定的EC90浓度使用)与TYRP1阳性靶细胞(CHO-huTYRP1克隆76)和Jurkat NFAT效应细胞(E:T 2.5:1)在37℃孵育22小时。示出了抗独特型4.21IgG对CD3结合剂的剂量依赖性阻断。每个点代表三次重复的平均值。标准偏差由误差条指示。虚线显示与靶细胞一起孵育但没有任何TCB的Jurkat NFAT活化。DP47非靶向TCB用作阴性对照。对于EC-50值的计算，计算非线性拟合“log(激动剂)与应答可变斜率(四个参数)”(GraphPad Prism6)。
图11(A)：示出了由具有不同CD3结合剂的FOLR1TCB或FOLR1pro-TCB介导的JurkatNFAT活化。将FOLR1(pro-)TCBs与huFOLR1包被的珠粒和Jurkat NFAT效应细胞在37℃孵育5-6小时。具有抗ID掩模4.24.72的FOLR1 pro-TCB在指定浓度范围内不会介导Jurkat NFAT活化。然而，FOLR1 TCB介导剂量依赖性Jurkat NFAT活化。每个点代表三次重复的平均值。标准偏差由误差条指示。虚线显示与靶细胞一起孵育但没有任何TCB的Jurkat NFAT活化。
(B)：在孵育huPBMC、TCB和FOLR1阳性靶细胞(E:T＝10:1，效应子为人PBMC)48小时后，测量剂量依赖性靶细胞杀伤(具有非常高FOLR1表达的HeLa细胞)。FOLR1 TCB和活化的FOLR1 pro-TCB诱导剂量依赖性靶细胞杀伤，EC50约为0.29pM。比较EC50值时，含有不可切割的接头的掩蔽的FOLR1 pro-TCB(CD3 P035.093，掩模4.24.72scFv)显示靶细胞裂解减少约239倍。每个点代表三次重复的平均值。标准偏差由误差条指示。虚线显示与huPBMC但没有任何TCB孵育的靶细胞的自发释放。对于EC-50值的计算，计算非线性拟合“log(激动剂)与应答可变斜率(四个参数)”(GraphPad Prism6)。
(C)：通过CD69的定量分析CD8T细胞的剂量依赖性T细胞活化。对于CD8阳性T细胞，对CD69的荧光强度中位数进行印迹。将靶细胞(具有非常高FOLR1表达的HeLa细胞)与huPBMC和TCB在37℃孵育48小时(E:T＝10:1，效应子为人PBMC)。FOLR1 TCB和活化的FOLR1pro-TCB诱导剂量依赖性T细胞活化。含有不可切割的接头的掩蔽的FOLR1 pro-TCB(CD3 P035.093，掩模4.24.72scFv)在指定浓度范围内未显示T细胞活化(CD8 T细胞为CD69)。每个点代表三次重复的平均值。标准偏差由误差条指示。对于EC-50值的计算，计算非线性拟合“log(激动剂)与应答可变斜率(四个参数)”(GraphPad Prism6)。
(D)：通过CD69的定量测量CD8T细胞的剂量依赖性T细胞活化。示出了CD69阳性CD8T细胞的百分比。将靶细胞(具有非常高FOLR1表达的HeLa细胞)与huPBMC和TCB在37℃孵育48小时(E:T＝10:1，效应子为人PBMC)。FOLR1 TCB和活化的FOLR1 pro-TCB诱导剂量依赖性T细胞活化。含有不可切割的接头的掩蔽的FOLR1 pro-TCB(CD3P035.093，掩模4.24.72scFv)在指定浓度范围内显示出降低的T细胞活化(对于CD8 T细胞为CD69)。然而，从5nM开始，可以检测到一些CD69阳性CD8 T细胞在此处使用的最高浓度下增加到30％左右。每个点代表三次重复的平均值。标准偏差由误差条指示。对于EC-50值的计算，计算非线性拟合“log(激动剂)与应答可变斜率(四个参数)”(GraphPad Prism6)。
图12(A)：在孵育huPBMC 48小时后测量剂量依赖性靶细胞杀伤(Hela高FOLR1表达、Ovcar-3和Skov-3中等FOLR1表达以及具有低FOLR1表达的HT-29)，以分析具有CD3P035.093的pro-TCB形式的抗ID 4.24.72的掩蔽效率。TCB和FOLR1阳性靶细胞(E:T＝10:1，效应子为人PBMC)。FOLR1 TCB在所有细胞系(Hela、Skov-3、Ovcar-3)上诱导剂量依赖性靶细胞杀伤，而掩蔽的FOLR1 pro-TCB显示出降低的靶细胞杀伤。
(B)：在孵育huPBMC(E:T＝10:1)48小时后测量剂量依赖性靶细胞杀伤(Skov-3中等FOLR1表达和具有低FOLR1表达的HT-29)。FOLR1TCB在两种细胞系(Skov-3、HT-29)上诱导剂量依赖性靶细胞杀伤，而掩蔽的FOLR1 pro-TCB显示出降低的靶细胞杀伤。每个点代表三次重复的平均值。标准偏差由误差条指示。虚线显示与huPBMC但没有任何TCB孵育的靶细胞的自发释放。对于EC-50值的计算，计算非线性拟合“log(激动剂)与应答可变斜率(四个参数)”(GraphPad Prism6)。
图13：抗独特型掩模4.24.72的人源化变体的单臂IgG的格式。异源二聚化是通过使用杵臼结构技术实现的。
图14示出了由具有不同CD3结合剂的TYRP1TCB介导的Jurkat NFAT活化。将TYRP1TCB(以先前测定中确定的EC90浓度使用)与TYRP1阳性靶细胞(M150543)和Jurkat NFAT效应细胞(E:T 2.5:1)在37℃孵育5小时。对于CD3 CH2527(图15A)和CD3 P035.093(图15B)，示出了抗独特型(抗-ID)4.24.72IgG(亲本和人源化变体)对CD3结合剂的剂量依赖性阻断。每个点代表三次重复的平均值。标准偏差由误差条指示。对于EC-50值的计算，计算非线性拟合“log(激动剂)与应答可变斜率(四个参数)”(GraphPad Prism6)。
图15(A)：在孵育huPBMC 48小时后测量剂量依赖性靶细胞杀伤(Ovcar-3中等FOLR1表达)，以分析具有CD3 P035.093的pro-TCB形式的抗ID 4.24.72的人源化变体的掩蔽效率。TCB和FOLR1阳性靶细胞(E:T＝10:1，效应子为人PBMC)。FOLR1 TCB在Ovcar-3细胞上诱导剂量依赖性靶细胞杀伤，而掩蔽的FOLR1 pro-TCB显示出降低的靶细胞杀伤。
(B)和(C)：通过CD69的定量测量CD8T细胞的剂量依赖性T细胞活化。示出了CD69阳性CD8 T细胞的百分比(图16B)和荧光强度中位数(图16C)。将靶细胞(具有中等FOLR1表达的Ovcar-3细胞)与huPBMC和TCB在37℃孵育48小时(E:T＝10:1，效应子为人PBMC)。FOLR1TCB诱导剂量依赖性T细胞活化。含有不可切割的接头的掩蔽的FOLR1 pro-TCB(CD3P035.093，掩模4.24.72scFv的人源化变体)在指定浓度范围内显示出降低的T细胞活化(对于CD8 T细胞为CD69)。关于T细胞活化，没有检测到人源化变体的掩蔽效率差异。每个点代表三次重复的平均值。标准偏差由误差条指示。对于EC-50值的计算，计算非线性拟合“log(激动剂)与应答可变斜率(四个参数)”(GraphPad Prism6)。
图16描绘具有人源化掩蔽部分的不同蛋白酶可活化FolR1TCB分子的示意图。
图17A：具有共同轻链P329G LALA 2+1Fc(臼)Fc(杵)的抗CD3P035.093掩模scFvH1L1蛋白裂解酶位点抗FolR1 16D5，SEQ ID NO 95、66、67。
图17B：具有共同轻链P329G LALA 2+1Fc(臼)Fc(杵)的抗CD3P035.093掩模scFvH1L2蛋白裂解酶位点抗FolR1 16D5，SEQ ID NO 96、66、67。
图17B：具有共同轻链P329G LALA 2+1Fc(臼)Fc(杵)的抗CD3P035.093掩模scFvH2L2蛋白裂解酶位点抗FolR1 16D5，SEQ ID NO 97、66、67。
图17B：具有共同轻链P329G LALA 2+1Fc(臼)Fc(杵)的抗CD3P035.093掩模scFvH3L2蛋白裂解酶位点抗FolR1 16D5，SEQ ID NO 98、66、67。
具体实施方式
定义
除非在下文中另外定义，否则本文使用的术语通常如本领域中所使用的。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广泛意义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例是免疫球蛋白及其衍生物，例如其片段。
术语“双特异性”是指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种独特细胞上表达的两种抗原决定簇。
如本文所用的术语“价”表示在抗原结合分子中存在指定数目的抗原结合位点。因此，术语“与抗原单价结合”表示在抗原结合分子中存在对抗原具有特异性的一个(并且不超过一个)抗原结合位点。
“抗原结合位点”是指提供与抗原的相互作用的抗原结合分子的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)的氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
如本文所用，术语“抗原结合部分”是指特异性地结合抗原决定簇的多肽分子。在一个实施例中，抗原结合部分能够将其所附接的实体(例如第二抗原结合部分)引导至靶位点，例如引导至携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。在另一个实施例中，抗原结合部分能够通过其靶抗原(例如T细胞受体复合物抗原)活化信号传导。抗原结合部分包括如本文进一步定义的抗体及其片段。特定的抗原结合部分包括抗体的抗原结合结构域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施例中，抗原结合部分可包含如本文进一步定义且在本领域中已知的抗体恒定区。有用的重链恒定区包括以下五种同种型中的任何一种：α、δ、ε、γ，或μ。可用的轻链恒定区包括以下两种同种型中的任一种：κ和λ。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与所述位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则本文中称为抗原的蛋白质(例如FolR1、HER1、HER2、CD3、间皮素)可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在具体实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白变体，例如剪接变体或等位基因变体。可用作抗原的示例性人蛋白质包括但不限于：FolR1、HER1和CD3，尤其是CD3的ε亚基(针对人序列，参见UniProt编号P07766(第130版)，NCBI RefSeq编号NP_000724.1，SEQ ID NO:54；或针对食蟹猴[Macaca fascicularis]序列，参见UniProt编号Q95LI5(第49版)，NCBI GenBank编号BAB71849.1)。在某些实施例中，本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子与在来自不同物种的CD3或靶抗原中保守的CD3或靶细胞抗原表位结合。在某些实施例中，本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子与CD3和FolR1结合，但不与FolR2或FolR3结合。在某些实施例中，本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子与CD3和HER1结合。在某些实施例中，本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子与CD3和间皮素结合。在某些实施例中，本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子与CD3和HER2结合。“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合部分与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，抗原结合部分与不相关蛋白质的结合程度小于该抗原结合部分与抗原的结合程度的约10％，如例如通过SPR所测得的。在某些实施例中，与抗原结合的抗原结合部分或包含该抗原结合部分的抗原结合分子的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
“亲和力”是指分子(例如，受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，该固有结合亲和力反映了结合对的成员(例如，抗原结合部分与抗原，或者受体与其配体)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示，所述解离常数是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数之比保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的完善确立的方法测量，包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的特定方法为表面等离子体共振(SPR)。
“降低的结合”(例如降低的与Fc受体的结合)是指对相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。
如本文所用，“T细胞激活”是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞响应，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和激活标志物的表达。本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子能够诱导T细胞活化。测量T细胞活化的合适测定是本文中描述的本领域已知的。
如本文所用的“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，该靶细胞为例如肿瘤中的细胞(诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)。
如本文所用，关于抗原结合部分等的术语“第一”和“第二”用于方便当存在每种类型的部分中的多于一个部分时进行区分。除非明确说明，否则使用这些术语并不旨在赋予蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子特定的顺序或取向。
“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1结构域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL结构域组成的蛋白质。
所谓“融合”，意指组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)直接地或经由一个或更多个肽接头通过肽键连接。
如本文所用，术语“单链”是指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在某些实施例中，抗原结合部分之一为单链Fab分子，即其中Fab轻链和Fab重链通过肽接头连接以形成单肽链的Fab分子。在一个具体的此类实施例中，单链Fab分子中Fab轻链的C末端连接至Fab重链的N末端。
“交叉Fab分子”(也称为“Crossfab”)是指一种Fab分子，其中Fab重链和轻链的可变区或恒定区被交换，即交叉Fab分子包含由轻链可变区和重链恒定区构成的肽链，以及由重链可变区和轻链恒定区构成的肽链。为清楚起见，在其中Fab轻链的可变区和Fab重链的可变区被交换的交叉Fab分子中，包含重链恒定区的肽链在本文中称为交叉Fab分子的“重链”。相反地，在其中Fab轻链的恒定区和Fab重链的恒定区被交换的交叉Fab分子中，包含重链可变区的肽链在本文中称为交叉Fab分子的“重链”。
与此相比之下，“常规”Fab分子是指处于天然形式的Fab分子，即，包含由重链可变区和恒定区构成的重链(VH-CH1)，以及由轻链可变区和恒定区构成的轻链(VL-CL)。
术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链构成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，后接三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，接着是恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可配属为以下五种类型中的一种：称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被配属为以下两种类型中的一种：称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)。免疫球蛋白实质上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)，以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，载于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑(Springer-Verlag,New York)，第269至第315页(1994)；还可参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如EP404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad SciUSA 90,6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体在Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中也有所描述。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，这些技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化，以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所述。
术语“抗原结合结构域”是指抗体的一部分，该部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。特别地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指在序列上高变及/或形成结构上限定的环(“高变环”)的抗体可变结构域区域中的任一个。通常，天然四链抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，来自互补决定区的氨基酸残基具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。除VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为“互补决定区”(CDR)，并且这些术语在本文中可互换地用于指形成抗原结合区的可变区部分。该特定区域已由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences ofProteins of Immunological Interest(1983)以及Chothia等人，J Mol Biol 196:901-917(1987)描述，其中所述定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，使用这两者中的任一定义来指代抗体的CDR或其变体应在如本文所定义和使用的术语的范围内。作为比较，在下表1中列出了包含如上文引用的参考文献中的每一者所定义的CDR的相应氨基酸残基。包含特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而变化。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定CDR。
表1.CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM<sup>2</sup>
V<sub>H</sub> CDR1 31-35 26-32 26-35
V<sub>H</sub> CDR2 50-65 52-58 50-58
V<sub>H</sub> CDR3 95-102 95-102 95-102
V<sub>L</sub> CDR1 24-34 26-32 24-34
V<sub>L</sub> CDR2 50-56 50-52 50-56
V<sub>L</sub> CDR3 89-97 91-96 89-97
1表1中所有CDR定义的编号是根据Kabat等人提出的编号惯例(参见下文)。
2如表1中所用的具有小写字母“b”的“AbM”是指由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地将该“Kabat编号”系统分配给任何可变区序列，而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人，U.S.Dept.of Health andHuman Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)所述的编号系统。除非另有说明，否则提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统。
序列表的多肽序列不是根据Kabat编号系统编号的。然而，将序列表的序列编号转换为Kabat编号完全在本领域普通技术人员的能力范围内。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗体或免疫球蛋白的“类”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个方面，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链C端的一个或更多个(特别是一个或两个)氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子所产生的抗体可以包括全长重链，或者该抗体可以包括全长重链的经切割变体。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，EU编号)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。如果没有另外指明，则包含Fc区的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在一个方面，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，所述重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，EU编号系统)。在一个方面，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，所述重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据EU索引编号)。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。如本文所用的Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽，该多肽能够稳定自缔合。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgGCH3恒定结构域。
所谓“融合”，意指组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)直接地或经由一个或更多个肽接头通过肽键连接。
“促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰”是对肽骨架的操纵或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同源二聚体。如本文所用，“促进缔合的修饰”特别包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一者进行的单独修饰，其中所述修饰彼此互补以促进这两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变Fc结构域亚基中的一者或两者的结构或电荷，以便分别使它们的缔合在空间上或静电上有利。因此，(异源)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，这在融合至每个亚基的另外组分(例如抗原结合部分)不相同的意义上可能是不同的。在一些实施例中，促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个特定实施例中，促进缔合的修饰包括对Fc结构域的两个亚基中的每一个的单独氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。
如本文所用，术语“工程化、工程化的、工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操纵，或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。
如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如减少的与Fc受体的结合，或增加的与另一肽的缔合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和插入。特定的氨基酸突变是氨基酸取代。出于改变例如Fc区域的结合特征的目的，非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸，是特别优选的。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用天然存在的二十种标准氨基酸的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)进行替代。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。本文可使用各种名称来指示相同的氨基酸突变。例如，将Fc结构域的329位处的脯氨酸取代为甘氨酸可以表示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何链，而不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白”、“氨基酸链”或用于指代具有两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任一者使用，或与这些术语中的任一者互换地使用。术语“多肽”还旨在指代多肽的表达后修饰产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割，或用非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，而不一定从指定的核酸序列翻译而来。它可以以任何方式生成，包括通过化学合成。本发明的多肽的大小可以为约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个，或2,000个或更多个氨基酸。多肽可以具有确定的三维结构，但它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的；并且不具有确定的三维结构，而是可以采用大量不同构象的多肽则被称为未折叠的。
“分离的”多肽或变体或其衍生物意指不是处于其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，可以从多肽的天然或自然环境中移出分离的多肽。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是出于本发明的目的而分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或基本上纯化的天然或重组多肽也被认为是出于本发明的目的而分离的。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列一致性百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列一致性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从基因泰克公司(Genentech,Inc.,South San Francisco,California)公开获得，或者可以从所述源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作系统上使用，所述UNIX操作系统包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以替代地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒来源的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中存在的)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被视为分离的。分离的多核苷酸的另外的实施例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或处于溶液中的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子含有在通常含有多核苷酸分子的细胞中，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置上。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式及双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
关于与本发明的参考核苷酸序列具有至少例如95％“一致”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，是指除了多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％一致的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另外的核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可插入到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任意位置，或单个地散布在参考序列的残基之中，或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序，诸如上文针对多肽所讨论的程序(例如ALIGN-2)，常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的并且是指用于将特定基因引入与其可操作地关联的靶细胞中并指导所述基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体处于靶细胞内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”与“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指其中已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可以用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，举几个例子，例如培养的哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，以及包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
“活化性Fc受体”是这样的Fc受体：其在被抗体的Fc结构域接合后引发刺激携带该受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。人活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是与包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞，该特异性结合通常是通过Fc区的N末端的蛋白质部分。如本文所用，术语“降低的ADCC”被定义为在靶细胞周围的培养基中给定抗体浓度下在给定时间内通过上面定义的ADCC机制裂解的靶细胞数量减少，和/或在靶细胞周围的培养基中通过ADCC机制在给定时间内实现对给定数量的靶细胞的裂解所必需的抗体浓度增加。ADCC降低是相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和储存方法(该等方法为本领域技术人员已知的)，由相同类型的宿主细胞产生但尚未被工程化的相同抗体介导的ADCC。例如，由在Fc结构域中包含降低ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的降低是相对于由在Fc结构域中没有该氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。测量ADCC的合适测定法是本领域众所周知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT公开号WO 2012/130831)。
药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所需治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。具体地，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指一种制备物，该制备物的形式使得包含在其中的活性制剂的生物活性有效，并且该制备物不含对将施用该组合物的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。
“药用载体”是指药物组合物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或在临床病理学过程中执行的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
如本文所用，“独特型特异性多肽”是指识别抗原结合部分的独特型的多肽，例如对CD3具有特异性的抗原结合部分。独特型特异性多肽能够特异性结合抗原结合部分的可变区，并从而减少或阻止抗原结合部分与其同源抗原的特异性结合。当与包含抗原结合部分的分子结合时，独特型特异性多肽可以充当分子的掩蔽部分。本文具体公开了对抗CD3结合分子的独特型具有特异性的抗独特型抗体或抗独特型结合抗体片段。
如本文所用，“蛋白酶”或“蛋白水解酶”是指在识别位点切割接头并由靶细胞表达的任何蛋白水解酶。此类蛋白酶可能由靶细胞分泌或保持与靶细胞相关，例如在靶细胞表面上。蛋白酶的实例包括但不限于金属蛋白酶(例如基质金属蛋白酶1-28和解整联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)2、7-12、15、17-23、28-30和33)、丝氨酸蛋白酶(例如尿激酶型纤溶酶原激活剂和蛋白裂解酶)、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和组织蛋白酶家族成员。
如本文所用，就T细胞活化双特异性分子而言，“蛋白酶可活化”是指具有降低的或消除的活化T细胞的能力的T细胞活化双特异性分子，这是由于降低或消除T细胞活化双特异性分子的与CD3结合的能力的掩蔽部分所致。当掩蔽部分通过蛋白水解切割解离时，例如通过蛋白水解切割将掩蔽部分连接到T细胞活化双特异性分子的接头，恢复与CD3的结合并且由此活化T细胞活化双特异性分子。
如本文所用，“可逆地隐蔽”是指掩蔽部分或独特型特异性多肽与抗原结合部分或分子的结合，诸如以防止抗原结合部分或分子与其抗原(例如CD3)结合。这种隐蔽是可逆的，因为独特型特异性多肽可以从抗原结合部分或分子释放，例如通过蛋白酶切割，并从而释放抗原结合部分或分子以与其抗原结合。
具体实施方式
在一个方面，本发明涉及蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(a)能够与CD3结合的第一抗原结合部分；
(b)能够与靶细胞抗原结合的第二抗原结合部分；以及
(c)通过蛋白酶可切割的接头共价连接至T细胞双特异性结合分子的掩蔽部分，其中该掩蔽部分能够与第一抗原结合部分或第二抗原结合部分的独特型结合，从而可逆地隐蔽第一或第二抗原结合部分。
能够与CD3结合的第一抗原结合部分包含独特型。在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的掩蔽部分共价连接至第一抗原结合部分。在一个实施例中，掩蔽部分共价连接至第一抗原结合部分的重链可变区。在一个实施例中，掩蔽部分共价连接至第一抗原结合部分的轻链可变区。此共价键与掩蔽部分与独特型第一抗原结合位点的特异性结合(优选非共价结合)是分开的。第一抗原结合部分的独特型包含其可变区。在一个实施例中，当第一抗原结合部分与CD3结合时，掩蔽部分与与CD3接触的氨基酸残基结合。在一个优选的实施例中，掩蔽部分不是第一抗原结合部分的同源抗原或其片段，即，掩蔽部分不是CD3或其片段。在一个实施例中，掩蔽部分为抗独特型抗体或其片段。在一个实施例中，掩蔽部分为抗独特型scFv。在实例中详细描述了作为抗独特型scFv的掩蔽部分和包含这种掩蔽部分的蛋白酶可活化的T细胞活化分子的示例性实施例。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含(i)第一抗原结合部分，其为能够与CD3结合的Fab分子，并且其包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22；
(ii)第二抗原结合部分，其为能够与靶细胞抗原结合的Fab分子。
在一个实施例中，第一抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，第一抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
在一个具体实施例中，第二抗原结合部分能够与FolR1结合，并包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:22。
在另一具体实施例中，第二抗原结合部分能够与FolR1结合，并包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在另一具体实施例中，第二抗原结合部分能够与TYRP1结合，并包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:30。
在另一具体实施例中，第二抗原结合部分能够与TYRP1结合，并包含重链，该重链包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链，该轻链包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明提供了一种蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含(i)第一抗原结合部分，其为能够与CD3结合的Fab分子，包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22；
(ii)第二抗原结合部分，其为能够与FolR1结合的Fab分子，包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55和SEQ ID NO:56，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
在一个实施例中，本发明提供了一种蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(i)第一抗原结合部分，其为能够与CD3结合的Fab分子，包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，
(ii)第二抗原结合部分，其为能够与FolR1结合的Fab分子，包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明提供了一种蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(i)第一抗原结合部分，其为能够与CD3结合的Fab分子，包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22；
(ii)第二抗原结合部分，其为能够与TYRP1结合的Fab分子，包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30。
在一个实施例中，本发明提供了一种蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(i)第一抗原结合部分，其为能够与CD3结合的Fab分子，包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
(ii)第二抗原结合部分，其为能够与TYRP1结合的Fab分子，包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，第二抗原结合部分为常规Fab分子。
在一个特定实施例中，第一抗原结合部分为交叉Fab分子，其中Fab轻链的恒定区和Fab重链的恒定区被交换，并且第二抗原结合部分为常规Fab分子。在另一特定实施例中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分彼此融合，任选地经由肽接头融合。
在特定实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子还包含由能够稳定缔和的第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域。
在另一特定实施例中，不超过一个能够与CD3结合的抗原结合部分存在于蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子中(即蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子提供与CD3的单价结合)。
蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子形式
蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的组分可以以多种构型彼此融合。图1A-1Z、图2、图9A-9C和图17A-17DH中描绘了示例性构型。
在特定实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含由能够稳定缔和的第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域。在一些实施例中，第二抗原结合部分在Fab重链的C端处融合至Fc结构域的第一亚基或第二亚基的N端。
在一个此类实施例中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合部分的Fab重链的N末端。在一个具体的此类实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子基本上由第一和第二抗原结合部分、由第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至Fc结构域第一或第二亚基的N末端。任选地，第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链可以另外彼此融合。
在另一此类实施例中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一亚基或第二亚基的N末端。在一个具体的此类实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子基本上由第一抗原结合部分和第二抗原结合部分、由第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域，以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端处与Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端融合。
在其他实施例中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端处融合至Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。
在一个具体的此类实施例中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合部分的Fab重链的N末端。在一个具体的此类实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子基本上由第一和第二抗原结合部分、由第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至Fc结构域第一或第二亚基的N末端。任选地，第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链可以另外彼此融合。
抗原结合部分可以直接或通过肽接头与Fc结构域融合(或彼此融合)，所述肽接头包含一个或多个氨基酸，通常为约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头。“n”通常是介于1和10之间的数字，通常介于2和4之间。用于使第一抗原结合部分和第二抗原结合部分的Fab轻链彼此融合的特别合适的肽接头为(G4S)2。适于连接第一抗原结合部分和第二抗原结合部分的Fab重链的一种示例性肽接头为EPKSC(D)-(G4S)2(SEQ ID NO 105和106)。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，在抗原结合部分与Fc结构域亚基的N末端融合的情况下，可以在具有或没有另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。
具有能够结合靶细胞抗原的单个抗原结合部分的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子是有用的，特别是在高亲和力抗原结合部分结合后预期靶细胞抗原内化的情况下。在这种情况下，存在一个以上对靶细胞抗原特异的抗原结合部分可能会增强靶细胞抗原的内化，从而降低其可用性。
然而，在许多其他情况下，具有包含两个或更多个对靶细胞抗原特异的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子将是有利的(参见图1B、1C、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N、1Q、1R、1U、1V所示实例)，例如优化对靶位点的靶向或允许靶细胞抗原的交联。
因此，在某些实施例中，本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子还包含第三抗原结合部分，其为能够与靶细胞抗原结合的Fab分子。在一个实施例中，第三抗原结合部分为常规Fab分子。在一个实施例中，第三抗原结合部分能够结合与第二抗原结合部分相同的靶细胞抗原。在一个特定实施例中，第一抗原结合部分能够与CD3结合，并且第二和第三抗原结合部分能够与靶细胞抗原结合。在一个特定实施例中，第二和第三抗原结合部分是相同的(即它们包含相同的氨基酸序列)。
在一个特定实施例中，第一抗原结合部分能够与CD3结合，并且第二和第三抗原结合部分能够与FolR1结合，其中第二和第三抗原结合部分包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
在一个特定实施例中，第一抗原结合部分能够与CD3结合，并包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22；并且第二和第三抗原结合部分能够与FolR1结合，其中第二和第三抗原结合部分包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQID NO:56，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
在一个特定实施例中，第一抗原结合部分能够与CD3结合，并包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22；并且第二和第三抗原结合部分能够与FolR1结合，其中第二和第三抗原结合部分包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQID NO:56，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
在一个特定实施例中，第一抗原结合部分能够与CD3结合，并包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且第二和第三抗原结合部分能够与FolR1结合，其中第二和第三抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，第一抗原结合部分能够与CD3结合，并且第二和第三抗原结合部分能够与TYRP1结合，其中第二和第三抗原结合部分包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
在一个实施例中，第一抗原结合部分能够与CD3结合，并包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22；并且第二和第三抗原结合部分能够与TYRP1结合，其中第二和第三抗原结合部分包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:26，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQID NO:30。
在一个实施例中，第一抗原结合部分能够与CD3结合，并包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22；并且第二和第三抗原结合部分能够与TYRP1结合，其中第二和第三抗原结合部分包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:26，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQID NO:30。
在一个实施例中，第一抗原结合部分能够与CD3结合，并包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且第二和第三抗原结合部分能够与TYRP1结合，其中第二和第三抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQID NO:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
第二和第三抗原结合部分可以直接或通过肽接头融合至Fc结构域。在一个特定实施例中，第二和第三抗原结合部分各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在一个具体实施例中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区。在一个实施例中，第二和第三抗原结合部分和Fc结构域为免疫球蛋白分子的一部分。在一个特定实施例中，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更特定的实施例中，免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施例中，免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在另一具体实施例中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其他实施例中，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子基本上由能够与靶细胞抗原结合的免疫球蛋白分子和能够与CD3结合的抗原结合部分组成，其中抗原结合部分为Fab分子，特别是交叉Fab分子，任选地经由肽接头融合至免疫球蛋白重链中的一个免疫球蛋白重链的N末端。
在一个特定实施例中，第一和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的一个亚基的N末端，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合部分的Fab重链的N末端。在一个具体的此类实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子基本上由第一、第二和第三抗原结合部分、由第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一亚基的N末端，并且其中第三抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第二亚基的N末端。任选地，第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链可以另外彼此融合。
在一个实施例中，本发明提供了一种蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(i)第一抗原结合部分，其为能够与CD3结合的Fab分子，包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO:4的重链CDR 2、SEQ ID NO:10的重链CDR 3、SEQ ID NO:20的轻链CDR 1、SEQ ID NO:21的轻链CDR 2以及SEQ ID NO:22的轻链CDR 3，其中第一抗原结合部分为交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区(特别是恒定区)被交换；
(ii)第二和第三抗原结合部分，其各自为能够与FolR1结合的Fab分子，包含SEQID NO:54的重链CDR 1、SEQ ID NO:55的重链CDR 2、SEQ ID NO:56的重链CDR 3、SEQ IDNO:20的轻链CDR 1、SEQ ID NO:21的轻链CDR 2以及SEQ ID NO:22的轻链CDR3。
在一个实施例中，本发明提供了一种蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(i)第一抗原结合部分，其为能够与CD3结合的Fab分子，包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中第一抗原结合部分为交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区(特别是恒定区)被交换；
(ii)第二和第三抗原结合部分，其各自为能够与FolR1结合的Fab分子，包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明提供了一种蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(i)第一抗原结合部分，其为能够与CD3结合的Fab分子，包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO:4的重链CDR 2、SEQ ID NO:10的重链CDR 3、SEQ ID NO:20的轻链CDR 1、SEQ ID NO:21的轻链CDR 2以及SEQ ID NO:22的轻链CDR 3，其中第一抗原结合部分为交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区(特别是恒定区)被交换；
(ii)第二和第三抗原结合部分，其各自为能够与TYRP1结合的Fab分子，包含SEQID NO:24的重链CDR 1、SEQ ID NO:25的重链CDR 2、SEQ ID NO:26的重链CDR 3、SEQ IDNO:28的轻链CDR 1、SEQ ID NO:29的轻链CDR 2以及SEQ ID NO:30的轻链CDR3。
根据上述十个实施中的任一个的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子还可包含(iii)由能够稳定缔和的第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域，其中第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第一亚基的N末端，并且其中第三抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至Fc结构域的第二亚基的N末端。
在本发明的一些蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子中，第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链彼此融合，任选地通过肽接头融合。根据第一和第二抗原结合部分的构型，第一抗原结合部分的Fab轻链可以在其C末端融合至第二抗原结合部分的Fab轻链的N末端，或第二抗原结合部分的Fab轻链可以在其C末端融合至第一抗原结合部分的Fab轻链的N末端。第一和第二抗原结合部分的Fab轻链的融合进一步减少了未匹配Fab重链和轻链的错配，并且还减少了表达本发明的一些蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子所需的质粒数量。
在某些实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含多肽，其中第一抗原结合部分的Fab轻链可变区与第一抗原结合部分的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一抗原结合部分包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))，以及多肽，其中第二抗原结合部分的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子还包含多肽，其中第一抗原结合部分的Fab重链可变区与第一抗原结合部分的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第二抗原结合部分的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在某些实施例中，多肽例如通过二硫键共价连接。
在替代性实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含多肽，其中第一抗原结合部分的Fab重链可变区与第一抗原结合部分的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一抗原结合部分包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该Fab轻链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4))，以及多肽，其中第二抗原结合部分的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子还包含多肽，其中第一抗原结合部分的Fab轻链可变区与第一抗原结合部分的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第二抗原结合部分的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在某些实施例中，多肽例如通过二硫键共价连接。
在一些实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含多肽，其中第一抗原结合部分的Fab轻链可变区与第一抗原结合部分的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一抗原结合部分包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该Fab重链恒定区继而与第二抗原结合部分的Fab重链共享羧基末端肽键，该第二抗原结合部分的Fab重链继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含多肽，其中第一抗原结合部分的Fab重链可变区与第一抗原结合部分的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一抗原结合部分包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该Fab轻链恒定区继而与第二抗原结合部分的Fab重链共享羧基末端肽键，该第二抗原结合部分的Fab重链继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在又一些实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含多肽，其中第二抗原结合部分的Fab重链与第一抗原结合部分的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，该第一抗原结合部分的Fab轻链可变区继而与第一抗原结合部分的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一抗原结合部分包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，该Fab重链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含多肽，其中第二抗原结合部分的Fab重链与第一抗原结合部分的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第一抗原结合部分的Fab重链可变区继而与第一抗原结合部分的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一抗原结合部分包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，该Fab轻链恒定区继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-CH2-CH3(-CH4))。
在其中一些实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子进一步包含第一抗原结合部分的交叉Fab轻链多肽，其中第一抗原结合部分的Fab重链可变区与第一抗原结合部分的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1))并且与第二抗原结合部分的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在其他这样的实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子进一步包含交叉Fab轻链多肽，其中第一抗原结合部分的Fab轻链可变区与第一抗原结合部分的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1))并且与第二抗原结合部分的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2))。在又一些其他这样的实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子进一步包含多肽，其中第一抗原结合部分的Fab轻链可变区与第一抗原结合部分的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键，该第一抗原结合部分的Fab重链恒定区继而与第二抗原结合部分的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(1)-CH1(1)-VL(2)-CL(2))；多肽，其中第一抗原结合部分的Fab重链可变区与第一抗原结合部分的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键，该第一抗原结合部分的Fab轻链恒定区继而与第二抗原结合部分的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VH(1)-CL(1)-VL(2)-CL(2))；多肽，其中第二抗原结合部分的Fab轻链多肽与第一抗原结合部分的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，该第一抗原结合部分的Fab轻链可变区继而与第一抗原结合部分的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2)-VL(1)-CH1(1))；或多肽，其中第二抗原结合部分的Fab轻链多肽与第一抗原结合部分的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，该第一抗原结合部分的Fab重链可变区继而与第一抗原结合部分的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CL(2)-VH(1)-CL(1))。
根据这些实施例的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子可进一步包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)多肽，其中第三抗原结合部分的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，并且与第三抗原结合部分的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(3)-CL(3))。在某些实施例中，多肽例如通过二硫键共价连接。
根据上述实施例中的任一个，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的组分(例如抗原结合部分、Fc结构域)可以直接融合或通过在本文中描述或在本领域中已知的各种接头，特别是包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸的肽接头融合。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，其中n通常是1至10之间的数字，通常是2至4之间。
Fc结构域
蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。在一个实施例中，本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含不超过一个Fc结构域。
在根据本发明的一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的Fc结构域为IgG Fc结构域。在一个特定实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个实施例中，Fc结构域是IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施例中，Fc结构域为IgG4 Fc结构域，该结构域包含在位置S228处的氨基酸取代(Kabat编号)，特别是氨基酸取代S228P。该氨基酸取代减少了IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，Drug Metabolism andDisposition 38,84-91(2010))。在另一特定实施例中，Fc结构域为人。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
根据本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合部分，因此Fc结构域的两个亚基通常包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的产率和纯度，因此将有利的是在蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰。
因此，在特定实施例中，根据本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个实施例中，所述修饰位于Fc结构域的CH3结构域中。
在一个具体实施例中，所述修饰是所谓的“杵臼”修饰，其包括Fc结构域的两个亚基中的一个中的“杵”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个中的“臼”修饰。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。一般来讲，该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“杵”)并且在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得所述凸起可以定位在所述空腔中，以便促进异源二聚体的形成并且阻碍同源二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个特定实施例中，在蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，该突起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位在空腔内。
凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变或通过肽合成)来制备。
在一个具体实施例中，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，在位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)取代，而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，在位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)取代。在一个实施例中，另外在Fc结构域的第二亚基中，在位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)取代，并且在位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)取代。
在又一个进一步的实施例中，另外在Fc结构域的第一亚基中，在位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)取代，并且另外在Fc结构域的第二亚基中，在位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)取代。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定所述二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个特定实施例中，能够与CD3结合的抗原结合部分与(任选地经由能够与靶细胞抗原结合的抗原结合部分)Fc结构域的第一亚基(包含“杵”修饰)融合。不希望受理论束缚，能够与CD3结合的抗原结合部分与Fc结构域的含有杵的亚基的融合将(进一步)最小化包含两个能够与CD3结合的抗原结合部分的抗原结合分子的产生(两个含有杵的多肽的空间位阻)。
在一个替代实施例中，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。
减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
Fc结构域赋予蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子有利的药代动力学性质，包括有助于在靶组织中良好积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，与此同时它可能导致将蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子不希望地靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的携带抗原的细胞。此外，Fc受体信号传导通路的共活化可导致细胞因子释放，所述细胞因子释放与T细胞活化特性和抗原结合分子的长半衰期组合，在全身施用后导致对细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。由于对T细胞的潜在破坏(例如被NK 细胞)，T细胞以外的(带有Fc受体的)免疫细胞的活化甚至可能降低蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的功效。
因此，在特定实施例中，根据本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的Fc结构域与天然IgG1 Fc结构域相比，表现出对Fc受体的降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个此类实施例中，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子)与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子)相比，表现出对Fc受体的小于50％，优选小于20％，更优选小于10％并且最优选小于5％的结合亲和力，和/或与天然IgG1 Fc结构域结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子)相比小于50％，优选小于20％，更优选小于10％并且最优选小于5％的效应子功能。在一个实施例中，Fc结构域结构域(或包含所述Fc结构域的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子)基本上不结合Fc受体和/或诱导效应子功能。在一个特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别地是人FcγRIIIa。在一个实施例中，效应子功能是选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的组中的一种或多种效应子功能。在一个特定实施例中，效应子功能是ADCC。在一个实施例中，与天然IgG1 Fc结构域结构域相比，Fc结构域结构域对新生Fc受体(FcRn)表现出基本相似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子)表现出天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％，特别地大于约80％，更特别地大于约90％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合。
在某些实施例中，Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有对Fc受体的降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在特定实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的Fc结构域包含一个或多个氨基酸突变，该一个或多个氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。在一个实施例中，氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施例中，氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在多于一个降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施例中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍，或甚至至少50倍。在一个实施例中，与包含非工程化的Fc结构域的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子相比，包含工程化的Fc结构域的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子表现出对Fc受体的小于20％，特别地小于10％，更特别地小于5％的结合亲和力。在一个特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一些实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一些实施例中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更特别地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别地是人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合降低。在一些实施例中，对补体组分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也降低。在一个实施例中，对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子)表现出非工程化形式的Fc结构域(或包含非工程化形式的所述Fc结构域的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了基本上相似的与FcRn的结合，即保持了Fc结构域对所述受体的结合亲和力。Fc结构域或包含所述Fc结构域的本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子可表现出这种亲和力的大于约80％或甚至大于约90％。在某些实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的Fc结构域经工程化以与非工程化的Fc结构域相比具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可包括但不限于以下项中的一种或多种：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导的细胞凋亡、减少的靶结合抗体的交联、减少的树突细胞成熟，或减少的T细胞致敏。在一个实施例中，降低的效应子功能是选自降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和减少的细胞因子分泌的组中的一种或多种的降低的效应子功能。在一个特定实施例中，降低的效应子功能是降低的ADCC。在一个实施例中，降低的ADCC为由非工程化的Fc结构域(或包含非工程化的Fc结构域的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子)诱导的ADCC的小于20％。
在一个实施例中，降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施例中，Fc结构域包含在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329的组的位置处的氨基酸取代。在一个更具体的实施例中，Fc结构域包含在选自L234、L235和P329的组的位置处的氨基酸取代。在一些实施例中，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A。在一个此类实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别地是人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代。在一个更具体的实施例中，氨基酸取代为P329A或P329G，特别地是P329G。在一个实施例中，Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代，和在选自E233、L234、L235、N297和P331的位置处的进一步氨基酸取代。在一个更具体的实施例中，所述进一步氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定实施例中，Fc结构域包含在位置P329、L234和L235处的氨基酸取代。在更特定的实施例中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329GLALA”)。在一个此类实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别地是人IgG1 Fc结构域。氨基酸取代的“P329GLALA”组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体(以及补体)结合，如在PCT公开号WO2012/130831中所述，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。WO2012/130831还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。因此，在一些实施例中，本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的Fc结构域为IgG4 Fc结构域，特别地是人IgG4 Fc结构域。在一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含在位置S228处的氨基酸取代，具体地为氨基酸取代S228P。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能，在一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含在位置L235处的氨基酸取代，具体地为氨基酸取代L235E。在另一个实施例中，IgG4Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代，具体地为氨基酸取代P329G。在一个特定实施例中，IgG4 Fc结构域包含在位置S228、L235和P329处的氨基酸取代，具体地为氨基酸取代S228P、L235E和P329G。这种IgG4Fc结构域突变体以及它们的Fcγ受体结合性质描述于PCT公开号WO 2012/130831中，该PCT公开的全部内容以引用方式并入本文。
在一个特定实施例中，与天然IgG1Fc结构域相比表现出对Fc受体的降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能的Fc结构域为包含氨基酸取代L234A、L235A和任选地P329G的人IgG1 Fc结构域，或包含氨基酸取代S228P、L235E和任选地P329G的人IgG4 Fc结构域。
在某些实施例中，已消除了Fc结构域的N糖基化。在一个此类实施例中，Fc结构域包含在位置N297处的氨基酸突变，特别地是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替代天冬酰胺的氨基酸取代。
除了上文和PCT公开号WO 2012/130831中所述的Fc结构域外，具有降低的Fc受体结合和/或降低的效应子功能的Fc结构域还包括具有对Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些Fc结构域(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸中两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。本文描述了合适的此类结合测定。替代地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评估Fc结构域或包含Fc结构域的细胞活化双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。
Fc结构域或包含Fc结构域的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的效应子功能可通过本领域已知的方法测量。本文描述了用于测量ADCC的合适的测定法。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的其他示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad SciUSA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med166,1351-1361(1987)。另选地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0004001238190000521
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应物细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，ProcNatl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。
在一些实施例中，Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合减少。因此，在一些实施例中，其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J ImmunolMethods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。
抗原结合部分
本发明的抗原结合分子是双特异性的，即它包含至少两个能够特异性结合两种不同抗原决定簇的抗原结合部分。根据本发明，抗原结合部分为Fab分子(即由重链和轻链所构成的抗原结合结构域，每个抗原结合结构域包含可变区和恒定区)。在一个实施例中，所述Fab分子为人。在另一个实施例中，所述Fab分子是人源化的。在又一个实施例中，所述Fab分子包含人重链和轻链恒定区。
抗原结合部分中的至少一个抗原结合部分为交叉Fab分子。这种修饰防止来自不同Fab分子的重链和轻链的错配，从而提高了重组生产中本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的产率和纯度。在可用于本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的特定交叉Fab分子中，Fab轻链的恒定区和Fab重链的恒定区被交换。在可用于本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的另一交叉Fab分子中，Fab轻链的可变区和Fab重链的可变区被交换。
在根据本发明的特定实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子能够同时与靶细胞抗原(特别是肿瘤细胞抗原)和CD3结合。在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子能够通过同时与靶细胞抗原和CD3结合来交联T细胞和靶细胞。在一甚至更具体的实施例中，这种同时结合导致靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。在一个实施例中，这种同时结合导致T细胞的活化。在其它实施例中，这种同时结合导致T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的细胞应答，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子与CD3的结合而不同时与靶细胞抗原结合不会导致T细胞活化。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子能够将T细胞的细胞毒活性重新导向靶细胞。在一具体实施例中，所述重新导向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。
特别地，根据本发明的任何实施例的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施例中，T细胞是CD4+或CD8+T细胞，特别是CD8+T细胞。
CD3结合部分
本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含至少一个能够与CD3结合的抗原结合部分(本文中也称为“CD3抗原结合部分”或“第一抗原结合部分”)。在一个特定实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含不超过一个能够与CD3结合的抗原结合部分。在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子提供与CD3的单价结合。CD3抗原结合为交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变区或恒定区被交换的Fab分子。在蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子中存在多于一个能够结合靶细胞抗原的抗原结合部分的实施例中，能够结合CD3的抗原结合部分优选是交叉Fab分子，并且能够结合靶细胞抗原的抗原结合部分是常规的Fab分子。
在一个特定实施例中，CD3为人CD3或食蟹猴CD3，最特别是人CD3。在一个特定实施例中，CD3抗原结合部分与人和食蟹猴CD3交叉反应(即特异性结合)。在一些实施例中，第一抗原结合部分能够与CD3的ε亚基结合。
CD3抗原结合部分包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:10，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22。
在一个实施例中，CD3抗原结合部分包含SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:4的重链CDR2、SEQ ID NO:10的重链CDR3、SEQ ID NO:20的轻链CDR1、SEQ ID NO:21的轻链CDR2，以及SEQ ID NO:22的轻链CDR3。
在一个实施例中，CD3抗原结合部分包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个实施例中，CD3抗原结合部分包含SEQ ID NO:16的重链可变区序列，以及SEQ ID NO:23的轻链可变区序列。
靶细胞抗原结合部分
本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含至少一个能够与靶细胞抗原结合的抗原结合部分(本文中也称为“靶细胞抗原结合部分”或“第二”或“第三”抗原结合部分)。在某些实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含两个能够与靶细胞抗原结合的抗原结合部分。在一个特定的此类实施例中，这些抗原结合部分中的每一个都与相同的抗原决定簇特异性结合。在一个甚至更特定的实施例中，所有这些抗原结合部分都是相同的。在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含能够与靶细胞抗原结合的免疫球蛋白分子。在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含不超过两个能够与靶细胞抗原结合的抗原结合部分。
在一个优选的实施例中，靶细胞抗原结合部分为Fab分子，特别是与特定抗原决定簇结合并且能够将蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子引导至靶位点，例如引导至携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞的常规Fab分子。
在某些实施例中，靶细胞抗原结合部分与细胞表面抗原特异性结合。在一个特定实施例中，靶细胞抗原结合部分与靶细胞的表面上的叶酸受体1(FolR1)特异性结合。在另一个具体的此类实施例中，靶细胞抗原结合部分与酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)，具体地为人TYRP1特异性结合。
在某些实施例中，靶细胞抗原结合部分针对与病理状况相关的抗原，例如存在于肿瘤细胞或病毒感染细胞上的抗原。合适的抗原为细胞表面抗原，例如但不限于细胞表面受体。在特定实施例中，抗原为人抗原。在一个具体实施例中，靶细胞抗原选自叶酸受体1(FolR1)和酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)。
在特定实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含至少一个对FolR1特异的抗原结合部分。在一个实施例中，FolR1为人FolR1。在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含至少一个对人FolR1特异且不与人FolR2或人FolR3结合的抗原结合部分。在一个实施例中，对FolR1特异的抗原结合部分包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
在一个实施例中，对FolR1特异的抗原结合部分包含SEQ ID NO:54的重链CDR1、SEQ ID NO:55的重链CDR2、SEQ ID NO:56的重链CDR3、SEQ ID NO:20的轻链CDR1、SEQ IDNO:21的轻链CDR2，以及SEQ ID NO:22的轻链CDR3。
在另一实施例中，对FolR1特异的抗原结合部分包含与SEQ ID NO:53至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:23至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。
在一个实施例中，对FolR1特异的抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
掩蔽部分
本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含至少一个掩蔽部分。其他人试图通过用由结合部分识别的抗原片段加帽结合部分来掩蔽抗体的结合(例如，WO2013128194)。这种方法有若干限制。例如，使用抗原在降低结合部分的亲和力方面的灵活性较低。这是因为亲和力必须足够高才能被抗原掩模可靠地掩蔽。此外，解离的抗原可能在体内潜在地与其同源受体结合并相互作用，并对表达这种受体的细胞产生不希望的信号。相反，本文所述的方法使用抗独特型抗体或其片段作为掩模。设计有效掩蔽部分的两个相冲突的考虑因素是1.掩蔽的有效性和2.掩蔽的可逆性。如果亲和力太低，掩蔽将是无效的。然而，如果亲和力太高，掩蔽过程可能不容易可逆。无法预测高亲和力抗独特型掩模还是低亲和力抗独特型掩模会更好地工作。如本文所述，更高亲和力的掩蔽部分在掩蔽抗原结合侧方面总体表现更好，同时可以有效地去除以活化分子。在一个实施例中，抗独特型掩模具有1-8nM的KD。在一个实施例中，抗独特型掩模在37℃具有2nM的KD。在一个具体实施例中，掩蔽部分识别能够与CD3(例如人CD3)结合的第一抗原结合部分的独特型。在一个具体实施例中，掩蔽部分识别能够与靶细胞抗原结合的第二抗原结合部分的独特型。
在一个实施例中，掩蔽部分掩蔽CD3结合部分并且包含以下项中的至少一者：SEQID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:4的重链CDR2、SEQ ID NO:10的重链CDR3、SEQ ID NO:20的轻链CDR1、SEQ ID NO:21的轻链CDR2，以及SEQ ID NO:22的轻链CDR3。在一个实施例中，掩蔽部分包含SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:4的重链CDR2、SEQ ID NO:10的重链CDR3、SEQ ID NO:20的轻链CDR1、SEQ ID NO:21的轻链CDR2，以及SEQ ID NO:22的轻链CDR3。
在一个实施例中，掩蔽部分掩蔽CD3结合部分并包含与SEQ ID NO:16至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。在一个实施例中，掩蔽部分掩蔽CD3结合部分并包含SEQ ID NO:23的多肽序列。
在一个实施例中，掩蔽部分包含以下项中的至少一者：SEQ ID NO:58的重链CDR1，选自由以下项组成的组的重链CDR2：SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:86，SEQ IDNO:60的重链CDR3，选自由以下项组成的组的轻链CDR1：SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:82，SEQID NO:63的轻链CDR2，以及选自由以下项组成的组的轻链CDR3：SEQ ID NO:64和SEQ IDNO:88。
在一个实施例中，掩蔽部分包含以下项中的至少一者：SEQ ID NO:58的重链CDR1、SEQ ID NO:59的重链CDR2、SEQ ID NO:60的重链CDR3、SEQ ID NO:62的轻链CDR1、SEQ IDNO:63的轻链CDR2，以及SEQ ID NO:64的轻链CDR3。在一个实施例中，掩蔽部分包含与SEQID NO:57至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQID NO:61至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。
在一个实施例中，掩蔽部分包含以下项中的至少一者：SEQ ID NO:58的重链CDR1、SEQ ID NO:59的重链CDR2、SEQ ID NO:60的重链CDR3、SEQ ID NO:82的轻链CDR1、SEQ IDNO:63的轻链CDR2，以及SEQ ID NO:64的轻链CDR3。
在一个实施例中，掩蔽部分包含以下项中的至少一者：SEQ ID NO:58的重链CDR1、SEQ ID NO:84的重链CDR2、SEQ ID NO:60的重链CDR3、SEQ ID NO:82的轻链CDR1、SEQ IDNO:63的轻链CDR2，以及SEQ ID NO:64的轻链CDR3。
在一个实施例中，掩蔽部分包含以下项中的至少一者：SEQ ID NO:58的重链CDR1、SEQ ID NO:86的重链CDR2、SEQ ID NO:60的重链CDR3、SEQ ID NO:82的轻链CDR1、SEQ IDNO:63的轻链CDR2，以及SEQ ID NO:64的轻链CDR3。
在一个实施例中，掩蔽部分包含以下项中的至少一者：SEQ ID NO:59的重链CDR1、SEQ ID NO:86的重链CDR2、SEQ ID NO:60的重链CDR3、SEQ ID NO:62的轻链CDR1、SEQ IDNO:63的轻链CDR2，以及SEQ ID NO:88的轻链CDR3。
在一个优选的实施例中，掩蔽部分是人源化的。在一个优选的实施例中，用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽是人源化的。使免疫球蛋白人源化的方法是本领域熟知的并在本文中进行了描述。
在一个实施例中，提供了一种用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含与选自由SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83、SEQID NO:84、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:89组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与选自由SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:90组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个优选的实施例中，提供了一种用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含与选自由SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:85组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与选自由SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个实施例中，提供了一种用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含与SEQ ID NO:79至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:80至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列，在一个优选的实施例中，提供了用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含SEQ IDNO:79的重链可变区序列，以及SEQ ID NO:80的轻链可变区序列，
在一个实施例中，提供了一种用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含与SEQ ID NO:79至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:81至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列，在一个优选的实施例中，提供了用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含SEQ IDNO:79的重链可变区序列，以及SEQ ID NO:81的轻链可变区序列，
在一个实施例中，提供了一种用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含与SEQ ID NO:83至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:81至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列，在一个优选的实施例中，提供了用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含SEQ IDNO:83的重链可变区序列，以及SEQ ID NO:81的轻链可变区序列，
在一个实施例中，提供了一种用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含与SEQ ID NO:85至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:81至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列，在一个优选的实施例中，提供了用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含SEQ IDNO:85的重链可变区序列，以及SEQ ID NO:81的轻链可变区序列，
在一个实施例中，提供了一种用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含与SEQ ID NO:84至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:87至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列，在一个实施例中，提供了用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含SEQ ID NO:84的重链可变区序列，以及SEQ ID NO:87的轻链可变区序列，
在一个实施例中，提供了一种用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含与SEQ ID NO:89至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:90至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列，在一个实施例中，提供了用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含SEQ ID NO:89的重链可变区序列，以及SEQ ID NO:90的轻链可变区序列，
在一个实施例中，掩蔽部分为抗独特型scFv，其包含与SEQ ID NO:91至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。在一个实施例中，抗独特型scFv包含SEQID NO:91的多肽序列。
在一个实施例中，掩蔽部分为抗独特型scFv，其包含与SEQ ID NO:92至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。在一个实施例中，抗独特型scFv包含SEQID NO:92的多肽序列。
在一个实施例中，掩蔽部分为抗独特型scFv，其包含与SEQ ID NO:93至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。在一个实施例中，抗独特型scFv包含SEQID NO:93的多肽序列。
在一个实施例中，掩蔽部分为抗独特型scFv，其包含与SEQ ID NO:94至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。在一个实施例中，抗独特型scFv包含SEQID NO:94的多肽序列。
能够与CD3和FolR1结合的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子
如上文所述的能够与CD3结合的第一抗原结合部分、如上文所述的能够与FolR1结合的第二抗原结合部分、如上文所述的Fc结构域和如上文所述的掩蔽部分可以以多种构型彼此融合。示例性构型和序列在下文中公开。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含与SEQ ID NO:65至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列、与SEQ ID NO:66至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列以及与SEQ ID NO:67至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含SEQ ID NO:65的多肽序列、SEQ ID NO:66的多肽序列以及SEQ ID NO:67的多肽序列。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含与SEQ ID NO:74至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列、与SEQ ID NO:66至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列以及与SEQ ID NO:67至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含SEQ ID NO:74的多肽序列、SEQ ID NO:66的多肽序列以及SEQ ID NO:67的多肽序列。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含与SEQ ID NO:76至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列、与SEQ ID NO:66至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列以及与SEQ ID NO:67至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含SEQ ID NO:76的多肽序列、SEQ ID NO:66的多肽序列以及SEQ ID NO:67的多肽序列。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含与SEQ ID NO:95至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列、与SEQ ID NO:66至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列以及与SEQ ID NO:67至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含SEQ ID NO:95的多肽序列、SEQ ID NO:66的多肽序列以及SEQ ID NO:67的多肽序列。在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含一个SEQ ID NO:95的多肽、一个SEQ ID NO:66的多肽以及两个SEQ ID NO:67的多肽。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含与SEQ ID NO:96至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列、与SEQ ID NO:66至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列以及与SEQ ID NO:67至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含SEQ ID NO:96的多肽序列、SEQ ID NO:66的多肽序列以及SEQ ID NO:67的多肽序列。在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含一个SEQ ID NO:96的多肽、一个SEQ ID NO:66的多肽以及两个SEQ ID NO:67的多肽。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含与SEQ ID NO:97至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列、与SEQ ID NO:66至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列以及与SEQ ID NO:67至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含SEQ ID NO:97的多肽序列、SEQ ID NO:66的多肽序列以及SEQ ID NO:67的多肽序列。在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含一个SEQ ID NO:97的多肽、一个SEQ ID NO:66的多肽以及两个SEQ ID NO:67的多肽。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含与SEQ ID NO:98至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列、与SEQ ID NO:66至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列以及与SEQ ID NO:67至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含SEQ ID NO:98的多肽序列、SEQ ID NO:66的多肽序列以及SEQ ID NO:67的多肽序列。在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含一个SEQ ID NO:98的多肽、一个SEQ ID NO:66的多肽以及两个SEQ ID NO:67的多肽。
接头
在一个方面，本发明涉及用于可逆地隐蔽分子的抗原结合的抗原结合的独特型特异性多肽。在一个实施例中，本发明涉及一种用于可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽。这种用于可逆地隐蔽抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽必须能够与抗CD3抗原结合位点的独特型结合，并从而降低或消除抗CD3抗原结合位点与CD3的结合。在一个实施例中，独特型特异性多肽为抗独特型scFv。在一个实施例中，独特型特异性多肽通过接头共价连接至分子。在一个实施例中，独特型特异性多肽通过多于一个接头共价连接至分子。在一个实施例中，独特型特异性多肽通过两个接头共价连接至分子。在一个实施例中，接头为肽接头。在一个实施例中，接头为蛋白酶可切割的接头。
在一个实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含具有蛋白酶识别位点的接头，该蛋白酶识别位点包含与SEQ ID NO:68、70、75、99、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126或127至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。在一个实施例中，蛋白酶识别位点包含SEQ ID NO:100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113或114的多肽序列。在一个优选的实施例中，蛋白酶识别位点包含SEQ ID NO:114的多肽序列。
在一个实施例中，蛋白酶选自由以下项组成的组：金属蛋白酶(例如基质金属蛋白酶(MMP)1-28和解整联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)2、7-12、15、17-23、28-30和33)、丝氨酸蛋白酶(例如尿激酶型纤溶酶原激活剂和蛋白裂解酶)、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和组织蛋白酶。在一个具体实施例中，蛋白酶为MMP9或MMP2。在进一步具体实施例中，蛋白酶为蛋白裂解酶。
多核苷酸
本发明还提供了编码如本文所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸。在一些实施例中，所述片段是抗原结合片段。
编码本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的多核苷酸可以表达为编码完整蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他手段缔合以形成功能性蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。例如，抗原结合部分的轻链部分可以由与包含抗原结合部分的重链部分、Fc结构域亚基和任选的另一抗原结合部分(部分)的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的部分分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成抗原结合部分。在另一实例中，包含两个Fc结构域亚基之一和任选地一个或多个抗原结合部分(部分)的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的部分可以由与包含两个Fc结构域亚基中的另一个和任选地抗原结合部分(部分)的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的部分分开的多核苷酸编码。当共表达时，Fc结构域亚基将缔合以形成Fc结构域。
在一些实施例中，分离的多核苷酸编码如本文所述的根据本发明的整个蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。在其他实施例中，分离的多核苷酸编码包含在如本文所述的根据本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子中的多肽。
在另一个实施例中，本发明涉及编码本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码可变区序列的序列。在另一个实施例中，本发明涉及编码蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或其片段的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码如SEQ ID NO 65、66、67、69、74、76、91、92、93、94、95、96、97、98所示或其片段的多肽序列的序列。
编码本发明的独特型特异性多肽的多核苷酸可以表达为编码完整独特型特异性多肽的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如，两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他手段缔合以形成功能性独特型特异性多肽，例如掩蔽部分。例如，在一个实施例中，独特型特异性多肽为抗独特型scFv(单链可变片段)，其中抗独特型scFv的轻链可变部分可以由与包含抗独特型scFv的重链可变部分的抗独特型scFv的部分分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成抗独特型scFv。在一些实施例中，分离的多核苷酸编码如本文所述的根据本发明的独特型特异性多肽。
在某些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。对于重组生产，将例如如上所述的编码蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子(片段)的一种或多种多核苷酸分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在一个实施例中，提供了一种载体，优选为表达载体，该载体包含本发明的多核苷酸中的一种或多种多核苷酸。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子(片段)的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如以下文献所述的技术：Maniatis等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子(片段)的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，该异源编码区与编码本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子(片段)的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔
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珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或其片段的核酸的上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的N-末端融合的信号肽，所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施例中，使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。
编码可用于促进后续纯化的短蛋白质序列(例如组氨酸标签)或帮助标记蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的DNA可包含在蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子(片段)编码多核苷酸的内部或末端。
在另一实施例中，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施例中，提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个此类实施例中，宿主细胞包含(例如，已转化或转染)载体，该载体包含编码本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子(的一部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)和Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci383,44-68(1982)中所述)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，ProcNatl Acad Sci USA 77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methodsin Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。
用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含抗原结合结构域例如抗体的重链或轻链的多肽的细胞进行工程化，以便也表达另一条抗体链，使得表达的产物为具有重链和轻链的抗体。
在一个实施例中，提供一种制备根据本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的方法，其中该方法包括在适于表达蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的条件下培养本文所提供的包含编码蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的多核苷酸的宿主细胞，以及从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。
蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的组分彼此基因地融合。蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子可以被设计成使得其组分直接或通过接头序列彼此间接融合。接头的组成和长度可以根据本领域熟知的方法测定，并且可以测试接头的功效。蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的不同组分之间的接头序列的实例见于本文提供的序列中。如果需要的话，还可包括另外的序列(例如内肽酶识别序列)以掺入切割位点来分离融合的各个组分。
在某些实施例中，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的一个或多个抗原结合部分至少包含能够结合抗原决定簇的抗体可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分并由其衍生。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane，"Antibodies,a laboratory manual",Cold Spring HarborLaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如在美国专利号4,186,567中所述)，或者可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如McCafferty的美国专利号5,969,108)。
任何动物种类的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可用于本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子中。可用于本发明的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可以是鼠、灵长类动物或人来源的。如果蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子旨在用于人类使用，则可以使用嵌合形式的抗体，其中该抗体的恒定区来自人。也可以根据本领域熟知的方法来制备“人源化”或完全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可通过各种方法实现，所述各种方法包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)架构和恒定区上，所述架构和恒定区有或没有保留关键架构残基(例如对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能来说重要的关键架构残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人架构和恒定区上，或者(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基而用人样区段“隐藏”它们。人源化抗体及其制备方法在例如Almagro and Fransson,FrontBiosci 13,1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature 332,323-329(1988)；Queen等人,Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Jones等人,Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人,Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison and Oi,AdvImmunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人,Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,MolecImmun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人,Methods 36,25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall’Acqua等人,Methods 36,43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods 36,61-68(2005)和Klimka等人,Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体和人可变区。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr OpinImmunol 20,450-459(2008)中。人可变区可以形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分并衍生自该抗体(参见，例如Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。也可以通过以下方式来制备人抗体和人可变区：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以产生具有对抗原激发作出应答的人可变区的完整人抗体或完整抗体(参见例如Lonberg,NatBiotech 23,1117-1125(2005))。也可通过以下方式来产生人抗体和人可变区：分离选自人来源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变区序列(参见，例如Hoogenboom等人Methods inMolecular Biology 178,1-37(O’Brien等人,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)；以及McCafferty等人,Nature 348,552-554；Clackson等人,Nature 352,624-628(1991))。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。
在某些实施例中，可用于本发明的抗原结合部分被工程化改造以具有增强的结合亲和力，例如根据美国专利申请公开号2004/0132066中公开的方法，其全部内容以引用方式并入本文。本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振技术，在BIACORE T100系统上分析，(Liljeblad,等人,Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。可使用竞争测定法鉴定与参考抗体竞争与特定抗原结合的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变结构域，例如与V9抗体竞争与CD3结合的抗体。在某些实施例中，此类竞争抗体结合至由参考抗体结合的相同表位(例如，线性或构象表位)。用于定位抗体与之结合的表位的详细示例性方法提供于：Morris(1996)，“Epitope Mapping Protocols”，收录于Methods inMolecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)。在示例性竞争测定中，将固定化抗原(例如CD3)在包含与抗原结合的第一标记抗体(例如，V9抗体，描述于US 6,054,297)和正在检测其与第一抗原结合分子竞争结合抗原的能力的第二未标记抗体的溶液中孵育。该第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化抗原在包含第一标记抗体而非包含第二未标记抗体的溶液中孵育。在容许第一抗体与抗原结合的条件下孵育之后，去除过量未结合的抗体，并且测量与固定化抗原缔合的标记的量。如果相对于对照样品，测试样品中与固定化的抗原缔合的标记的量大幅减少，则表明该第二抗体在与该第一抗体竞争以结合到抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
如本文所述制备的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子可通过本领域已知的技术纯化，这些技术为诸如高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化，可以使用蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任一者来确定，所述熟知的分析方法包括凝胶电泳法、高压液相色谱法等。例如，实例中所述的表达的重链融合蛋白被显示为得到完整并且适当组装，如还原SDS-PAGE所示(参见例如图8-12)。三个条带在大约Mr 25,000、Mr 50,000和Mr 75,000处解析，对应于蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子轻链、重链和重链/轻链融合蛋白的预测分子量。
测定
本文所提供的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的物理/化学性质和/或生物学活性可通过本领域中已知的各种测定法进行鉴定、筛选或表征。
亲和力测定
蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子对Fc受体或靶抗原的亲和力可以使用诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)等的标准仪器和诸如可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，根据实例中阐述的方法通过表面等离子体共振(SPR)来确定。可替代地，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子与不同受体或靶抗原的结合可以使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估，例如通过流式细胞术(FACS)。下文和下文实例中描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。
根据一个实施例，在25℃下使用
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T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振来测量KD。
为了分析Fc部分和Fc受体之间的相互作用，His标记的重组Fc受体被固定在CM5芯片上的抗五组氨酸抗体(Qiagen)捕获，双特异性构建体用作分析物。简而言之，根据供应商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化的葡聚糖生物感测器芯片(CM5,GE Healthcare)。将抗五-组氨酸抗体用10mM醋酸钠pH 5.0稀释至40μg/ml，之后以5μl/min的流速进行注射以获得大约6500响应单位(RU)的偶联蛋白。注射配体之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。随后Fc受体在4或10nM下被捕获60秒。对于动力学测量，将双特异性构建体的四倍系列稀释液(范围在500nM和4000nM之间)在25℃下以30μl/min的流速持续120秒注射到HBS-EP(GEHealthcare，10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)中。
为了确定对靶抗原的亲和力，双特异性构建体被固定在活化的CM5传感器芯片表面上的抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare)捕获，如针对抗五组氨酸抗体所述。偶联蛋白的最终量为约12000RU。双特异性构建体在300nM下被捕获90秒。靶抗原以250到1000nM的浓度范围以30μl/min的流速通过流动池持续180秒。监控解离180秒。
通过减去在参考流动池获得的应答来校正本体折射率差异。稳态响应用于通过朗缪尔结合等温线的非线性曲线拟合导出解离常数KD。使用简单的一对一朗缪尔结合模型(
Figure BDA0004001238190000731
T100Evaluation Software 1.1.1版)，通过同时拟合缔合与解离感测器图来计算缔合速率(kon)与解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。参见例如Chen等人，J Mol Biol 293,865-881(1999)。
活性测定
本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的生物活性可以通过如实例中所述的各种测定来测量。生物活性可以例如包括T细胞增殖的诱导、T细胞中信号传导的诱导、T细胞中活化标志物表达的诱导、T细胞细胞因子分泌的诱导、靶细胞(例如肿瘤细胞)裂解的诱导，以及肿瘤消退的诱导和/或提高生存。
组合物、配方和施用途径
在另一方面，本发明提供了包含本文提供的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子中的任一者的药物组合物，其例如用于以下治疗方法中的任一者中。在一个实施例中，药物组合物包含本文提供的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子中的任一者以及药用载体。在另一个实施例中，药物组合物包含本文提供的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子中的任一者以及例如如下文所述的至少一种附加治疗剂。
还提供了一种以适于体内施用的形式产生本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的方法，该方法包括(a)获得根据本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，以及(b)用至少一种药用载体配制该蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，由此配制蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子制剂以用于体内施用。
本发明的药物组合物包含溶于或分散于药用载体中的一种或多种蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子治疗有效量。术语“药学上或药理学上可接受的”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。含有至少一种蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子和任选的附加活性成分的药物组合物的制备将是鉴于本公开而为本领域的技术人员已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack PrintingCompany,1990所示例的，该文献以引用方式并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解制备物应满足FDA生物标准办公室或其他国家/地区相应当局所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所使用的，“药用载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲液、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，类似物质以及它们的组合，如本领域普通技术人员应已知的(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences，第18版，Mack Printing Company,1990，第1289-1329页，该文献通过引用并入本文)。除了任何常规载体与活性成分不相容的情况之外，所述载体在治疗或药物组合物中的用途是可预期的。
组合物可以包含不同类型的载体，这取决于其是以固体、液体还是气雾剂形式施用，以及对于诸如注射这样的施用途径其是否需要是无菌的。本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子(和任何附加治疗剂)可以经静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、粘膜、心包内、脐内、眼内、经口、局部、局部、通过吸入(例如，气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、局部灌注直接浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、以乳霜、以脂质组合物(例如脂质体)，或通过本领域普通技术人员应已知的其他方法或前述的任何组合施用(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPrinting Company,1990，该文献以引用方式并入本文)。肠胃外施用，特别是静脉内注射，最常用于施用多肽分子，例如本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。
肠胃外组合物包括设计用于注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。为了注射，可在水溶液中配制本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，优选在生理相容性缓冲剂诸如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水中配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。另选地，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)构建。根据需要，通过将本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白质的安全水平保持最低。合适的药用载体包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。
除了先前描述的组合物之外，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子也可以配制成储库型长效制备物。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子可以用合适的聚合或疏水材料(例如作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如配制为微溶盐。
包含本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的药物组合物可通过常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干工艺进行生产。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。合适的制剂取决于所选择的施用途径。
蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子可以配制成呈游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本上保留游离酸或游离碱的生物活性的盐。这些药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或与无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。
治疗方法和组合物
本文提供的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子中的任一者可用于治疗方法中。本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子可用作免疫治疗剂，例如用于治疗癌症。
为了用于治疗方法中，本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子将按照符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾病、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾病的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
在一个方面，提供了本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其用作药物。在进一步的方面，提供了本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其用于治疗疾病。在某些实施例中，提供了本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其用于进行治疗的方法中。在一个实施例中，本发明提供了如本文所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其用于治疗有此需要的个体的疾病。在某些实施例中，本发明提供了一种用于在治疗患有疾病的个体的方法中使用的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，该方法包括向个体施用治疗有效量的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。在某些实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在进一步的实施例中，本发明提供了如本文所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其用于诱导靶细胞特别是肿瘤细胞的裂解。在某些实施例中，本发明提供了用于在个体中诱导靶细胞特别是肿瘤细胞的裂解的方法中使用的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，该方法包括向个体施用有效量的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子以诱导靶细胞的裂解。根据任何上述实施例的“个体”是哺乳动物，优选人。
在另一方面，本发明提供了本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子用于制造或制备药物的用途。在一个实施例中，所述药物用于治疗有此需要的个体的疾病。在另一实施例中，所述药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向具有所述疾病的个体施用治疗有效量的所述药物。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。在一个实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。在进一步的实施例中，药物用于诱导靶细胞特别是肿瘤细胞的裂解。在又一实施例中，药物用于在个体中诱导靶细胞特别是肿瘤细胞的裂解的方法中，包括向个体施用有效量的药物以诱导靶细胞的裂解。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
在另一方面，本发明提供了治疗疾病的方法。在一个实施例中，该方法包括向患有这种疾病的个体施用治疗有效量的本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。在一个实施例中，向所述个体施用组合物，该组合物包含药用形式的本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。在某些实施例中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个特定实施例中，所述疾病是癌症。在某些实施例中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如果待治疗的疾病是癌症，则使用抗癌剂。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。
在另一方面，本发明提供了一种用于诱导靶细胞特别是肿瘤细胞的裂解的方法。在一个实施例中，该方法包括在存在T细胞，特别是细胞毒性T细胞的情况下，使靶细胞与本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子接触。在另一方面，提供了一种在个体中诱导靶细胞特别是肿瘤细胞的裂解的方法。在一个这样的实施例中，该方法包括向个体施用有效量的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子以诱导靶细胞的裂解。在一个实施例中，“个体”为人。
在某些实施例中，待治疗的疾病为增殖性疾患，特别是癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌，以及肾癌。可以使用本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈部、神经系统(中枢和外周神经系统)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部，以及泌尿生殖系统。还包括癌前病症或病变和癌症转移。在某些实施例中，癌症选自由以下项组成的组：肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。本领域技术人员容易地认识到，在许多情况下，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子可能无法提供治愈，而仅可以提供部分益处。在一些实施例中，具有一些益处的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此，在一些实施例中，提供生理变化的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物，更特别地是人。
在一些实施例中，将有效量的本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子施用于细胞。在其他实施例中，将治疗有效量的本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子施用于个体以治疗疾病。
为了预防或治疗疾病，本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂联合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用途径、患者体重、T细胞活化双特异性抗原结合分子的类型、疾病的严重程度和进程、T细胞活化双特异性抗原结合分子是出于预防还是治疗目的施用、先前或同时进行的治疗性干预、患者的临床病史和对蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的应答以及主治医师的酌处权。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种给药时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生期望的疾病症状抑制。T细胞活化双特异性抗原结合分子的一种示例性剂量的范围为约0.005mg/kg至约10mg/kg。在其他非限制性实例中，剂量还可包括每次施用约1ug/kg体重、约5ug/kg体重、约10ug/kg体重、约50ug/kg体重、约100ug/kg体重、约200ug/kg体重、约350ug/kg体重、约500ug/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重，至约1000mg/kg体重或更多，以及从其中推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的非限制性实例中，约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5ug/kg体重至约500mg/kg体重等的范围可以基于上述数值施用。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约二至约二十或例如约六个剂量的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子)。可以施用初始较高的负荷剂量，之后施用一次或多次较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。这种疗法的进展易于通过常规的技术和测定法来监测。
本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子将通常以有效实现预期目的量使用。为用于治疗或预防病症，将本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
对于全身施用，治疗有效剂量可以最初根据体外测定(诸如细胞培养物测定)来进行估计。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC50循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。
初始剂量也可以使用本领域公知的技术，根据体内数据(例如动物模型)来估计。本领域的普通技术人员可以基于动物数据来容易地优化对人的施用。
剂量和间隔可以单独地调节，以提供足以维持疗效的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量的范围是约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。通过每天施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄入的情况下，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够在无需过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文所述的治疗有效剂量的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子通常将提供治疗益处而不会引起显著的毒性。蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的毒性和治疗功效可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，所述治疗指数可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子是优选的。在一个实施例中，根据本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个别医生根据患者的病症来选择(参见例如Fingl等人，1975，在：ThePharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。
用本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子治疗的患者的主治医师将知道如何以及何时由于毒性、器官功能障碍等终止、中断或调节施用。相反地，如果临床应答不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调整到更高水平。在目标病症的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
其他药剂和治疗
本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子可在疗法中与一种或多种其他药剂联合施用。例如，本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括被施用以治疗需要这种治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些实施例中，另外的治疗剂是免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡激活剂，或增加细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂。在一个特定实施例中，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡活化剂，或抗血管生成剂。
此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的量、病症或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子通常以与如本文所述相同的剂量和施用途径，或本文所述剂量的约1％至99％，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的途径使用。
上述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂被包含在同一组合物或分开的组合物中)，以及分开施用，在分开施用的情况下，本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子也可与放疗联合使用。
制品
在本发明的另一个方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的物质。该制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋，等等。所述容器可以由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。所述容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合能够有效地用于治疗、预防和/或诊断病症，并且所述容器可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是具有能够被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)其内含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子；以及(b)其内含有组合物的第二容器，其中该组合物包含额外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明该实施例中的制品还可包含包装插页，该包装插页指示组合物可用于治疗特定病症。可替代地或另外地，所述制品还可包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包括药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。所述药盒可以还包括从商业和用户的角度所需的其他物质，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
示例性实施例
1.一种蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(a)能够与CD3结合的第一抗原结合部分，其中该第一抗原结合部分包含
(a)能够与CD3结合的第一抗原结合部分，其中该第一抗原结合部分包含
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:2的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:4的HCDR 2和SEQ ID NO:10的HCDR 3，以及
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:20的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ IDNO:21的LCDR 2和SEQ ID NO:22的LCDR 3；
(b)能够与靶细胞抗原结合的第二抗原结合部分；以及
(c)通过蛋白酶可切割的接头共价连接至T细胞双特异性结合分子的掩蔽部分，其中该掩蔽部分能够与第一抗原结合部分或第二抗原结合部分的独特型结合，从而可逆地隐蔽第一抗原结合部分。
2.根据实施例1所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中VH包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和/或VL包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
3.根据实施例1或2所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分共价连接至第一抗原结合部分并且可逆地隐蔽第一抗原结合部分。
4.根据实施例1至3中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分共价连接至第一抗原结合部分的重链可变区。
5.根据实施例1至3中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分共价连接至第一抗原结合部分的轻链可变区。
6.根据实施例1至5中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分为scFv。
7.根据实施例2至6中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子包含可逆地隐蔽第二抗原结合部分的第二掩蔽部分。
8.根据实施例1至7中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中蛋白酶由靶细胞表达。
9.根据实施例1至8中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分为交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区被交换。
10.根据实施例1至9中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分为交叉Fab分子，其中Fab轻链的恒定区和Fab重链的恒定区被交换。
11.根据实施例1至10中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第一抗原结合部分为常规Fab分子。
12.根据实施例1至11中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含不超过一个能够与CD3结合的抗原结合部分。
13.根据实施例1至12中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含第三抗原结合部分，该第三抗原结合部分是能够与靶细胞抗原结合的Fab分子。
14.根据实施例13所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第三抗原结合部分与第二抗原结合部分相同。
15.根据实施例1至14中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分能够与FolR1或TYRP1结合。
16.根据实施例1至14中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分能够与FolR1结合。
17.根据实施例1至14中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分能够与TYRP1结合。
18.根据实施例1至17中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第一抗原结合部分与第二抗原结合部分彼此融合，任选地经由肽接头融合。
19.根据实施例1至18中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第一抗原结合部分的Fab重链的N末端。
20.根据实施例1至18中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至第二抗原结合部分的Fab重链的N末端。
21.根据实施例1至20中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链彼此融合，任选地经由肽接头融合。
22.根据实施例1至21中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其另外地包含由能够稳定缔和的第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域。
23.根据实施例22所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中Fc结构域为IgG，具体地为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。
24.根据实施例22或23所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中Fc结构域为人Fc结构域。
25.根据实施例22至24中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中Fc结构域与天然IgG1 Fc结构域相比，表现出对Fc受体的降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能。
26.根据实施例25所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中Fc结构域包含降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。
27.根据实施例26所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述一个或多个氨基酸取代位于选自由L234、L235和P329(Kabat编号)的组的一个或多个位置处。
28.根据实施例27所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中Fc结构域的每个亚基包含三个氨基酸取代，这三个氨基酸取代减少与活化Fc受体的结合和/或降低效应子功能，其中所述氨基酸取代为L234A、L235A和P329G。
29.根据实施例25至28中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中Fc受体为Fcγ受体。
30.根据实施例25至28中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中效应子功能为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
31.根据实施例1至30中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分包含重链可变区，该重链可变区包含以下项中的至少一者：
(a)DYSMN(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)CDR H2氨基酸序列，其选自由WINTETGEPRYTDDFKG(SEQ ID NO:59)、WINTETGEPRYTDDFTG(SEQ ID NO:84)和WINTETGEPRYTQGFKG(SEQ ID NO:86)组成的组；
(c)EGDYDVFDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列。
32.根据实施例1至31中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下项中的至少一者：
(d)轻链(CDR L)1氨基酸序列，其选自由RASKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:62)和KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:82)组成的组；
(e)YVSYLES(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)CDR L3氨基酸序列，其选自由QHSREFPYT(SEQ ID NO:64)和QQSREFPYT(SEQ IDNO:88)组成的组。
33.根据实施例1至30中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)DYSMN(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)CDR H2氨基酸序列，其选自由WINTETGEPRYTDDFKG(SEQ ID NO:59)、WINTETGEPRYTDDFTG(SEQ ID NO:84)和WINTETGEPRYTQGFKG(SEQ ID NO:86)组成的组；
(c)EGDYDVFDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)轻链(CDR L)1氨基酸序列，其选自由RASKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:62)和KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:82)组成的组；
(e)YVSYLES(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)CDR L3氨基酸序列，其选自由QHSREFPYT(SEQ ID NO:64)和QQSREFPYT(SEQ IDNO:88)组成的组。
34.根据实施例1至30中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)DYSMN(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)WINTETGEPRYTDDFKG(SEQ ID NO:59)的CDR H2氨基酸序列；
(c)EGDYDVFDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)RASKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:62)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)YVSYLES(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHSREFPYT(SEQ ID NO:64)的CDR L3氨基酸序列。
35.根据实施例1至30中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)SYGVS(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)IIWGDGSTNYHSALIS(SEQ ID NO:59)的CDR H2氨基酸序列；
(c)GITTVVDDYYAMDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:82)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)AATFLAD(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHYYSTPYT(SEQ ID NO:64)的CDR L3氨基酸序列。
36.根据实施例1至30中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)SYGVS(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)WINTETGEPRYTDDFTG(SEQ ID NO:84)的CDR H2氨基酸序列；
(c)GITTVVDDYYAMDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:82)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)AATFLAD(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHYYSTPYT(SEQ ID NO:64)的CDR L3氨基酸序列。
37.根据实施例1至30中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)SYGVS(SEQ ID NO:58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)WINTETGEPRYTQGFKG(SEQ ID NO:86)的CDR H2氨基酸序列；
(c)GITTVVDDYYAMDY(SEQ ID NO:60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
(d)KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:82)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)AATFLAD(SEQ ID NO:63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHYYSTPYT(SEQ ID NO:64)的CDR L3氨基酸序列。
38.根据实施例1至37中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分是人源化的。
39.根据实施例1至38中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分为人。
40.根据实施例1至39中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中蛋白酶可切割的接头包含至少一个蛋白酶识别序列。
41.根据实施例40所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中蛋白酶可切割的接头包含蛋白酶识别序列。
42.根据实施例41所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中蛋白酶识别序列选自由以下项组成的组：
(a)RQARVVNG(SEQ ID NO:100)；
(b)VHMPLGFLGPGRSRGSFP(SEQ ID NO:101)；
(c)RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(SEQ ID NO:102)，其中X为任何氨基酸；
(d)RQARVVNGVPLSLYSG(SEQ ID NO:103)；
(e)PLGLWSQ(SEQ ID NO:104)；
(f)VHMPLGFLGPRQARVVNG(SEQ ID NO:105)；
(g)FVGGTG(SEQ ID NO:106)；
(h)KKAAPVNG(SEQ ID NO:107)；
(i)PMAKKVNG(SEQ ID NO:108)；
(j)QARAKVNG(SEQ ID NO:109)；
(k)VHMPLGFLGP(SEQ ID NO:110)；
(l)QARAK(SEQ ID NO:111)；
(m)VHMPLGFLGPPMAKK(SEQ ID NO:112)；
(n)KKAAP(SEQ ID NO:113)；和
(o)PMAKK(SEQ ID NO:114)。
43.根据实施例40或41所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中蛋白酶可切割的接头包含蛋白酶识别序列PMAKK(SEQ ID NO:114)。
44.根据实施例40或41所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中蛋白酶可切割的接头包含蛋白酶识别序列VHMPLGFLGPPMAKK(SEQ ID NO:112)。
45.根据实施例40或41所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中蛋白酶可切割的接头包含蛋白酶识别序列VHMPLGFLGPRQARVVNG(SEQ ID NO:105)。
46.根据实施例40或41所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中蛋白酶可切割的接头包含蛋白酶识别序列RQARVVNG(SEQ ID NO:100)或蛋白酶识别序列VHMPLGFLGPRQARVVNG(SEQ ID NO:105)。
47.根据实施例1至46中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中蛋白酶选自由以下项组成的组：金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和组织蛋白酶。
48.根据实施例47所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中金属蛋白酶为基质金属蛋白酶(MMP)，优选MMP9或MMP2。
49.根据实施例47所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中丝氨酸蛋白酶为蛋白裂解酶。
50.根据实施例1至49中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分能够与FolR1结合，并包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56，和/或至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
51.根据实施例1至49中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分能够与FolR1结合，并包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
52.根据实施例1至51中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分能够与FolR1结合并包含重链可变区，该重链可变区包含：
a)NAWMS(SEQ ID NO:54)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
b)RIKSKTDGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO:55)的CDR H2氨基酸序列；和
c)PWEWSWYDY(SEQ ID NO:56)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
d)GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:20)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
e)GTNKRAP(SEQ ID NO:21)的CDR L2氨基酸序列；和
f)ALWYSNLWV(SEQ ID NO:22)的CDR L3氨基酸序列。
53.根据实施例1至52中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
54.根据实施例1至53中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分能够与FolR1结合，并包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
55.根据实施例1至49中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分能够与TYRP1结合，并包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，和/或至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。
56.根据实施例1至49和55中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分能够与TYRP1结合，并包含至少一个选自由以下项组成的组的重链互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，和至少一个选自由以下项组成的组的轻链CDR：SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。
57.根据实施例1至49和55至56中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分能够与TYRP1结合并包含重链可变区，该重链可变区包含：
a)NAWMS(SEQ ID NO:24)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
b)RIKSKTDGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO:25)的CDR H2氨基酸序列；和
c)PWEWSWYDY(SEQ ID NO:26)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含：
d)GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:28)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
e)GTNKRAP(SEQ ID NO:29)的CDR L2氨基酸序列；和
f)ALWYSNLWV(SEQ ID NO:30)的CDR L3氨基酸序列。
58.根据实施例1至49和55至57中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
59.根据实施例1至53中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中第二抗原结合部分能够与TYRP1结合，并包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
60.根据实施例1至54中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
a)至少一个重链，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；
b)至少一个轻链，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
61.根据实施例1至50中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(a)第一重链，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；
(b)第二重链，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及
(c)轻链，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
62.根据实施例1至54中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(a)第一重链，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；
(b)第二重链，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及
(c)轻链，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
63.根据实施例1至54中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(a)第一重链，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列；
(b)第二重链，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及
(c)轻链，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
64.根据实施例1至54中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(a)第一重链，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；
(b)第二重链，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及
(c)轻链，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
65.根据实施例1至54中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(a)第一重链，其包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列；
(b)第二重链，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及
(c)轻链，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
66.根据实施例1至54中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(a)第一重链，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；
(b)第二重链，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及
(c)轻链，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
67.根据实施例1至54中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(a)第一重链，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；
(b)第二重链，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及
(c)轻链，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
68.根据实施例1至54中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(a)第一重链，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；
(b)第二重链，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；以及
(c)轻链，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
69.根据实施例60至68中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(c)两个轻链，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
70.根据实施例1至69中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分包含scFv，其包含与SEQ ID NO:91的氨基酸序列的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
71.根据实施例1至69中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分包含scFv，其包含与SEQ ID NO:92的氨基酸序列的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
72.根据实施例1至69中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分包含scFv，其包含与SEQ ID NO:93的氨基酸序列的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
73.根据实施例1至69中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中掩蔽部分包含scFv，其包含与SEQ ID NO:94的氨基酸序列的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
74.根据实施例70至73中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中通过SPR所测得的掩蔽部分与第一抗原结合部分的结合亲和力与包含选自由SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94组成的组的氨基酸序列的掩蔽部分的结合亲和力相比大约相同或更高。
75.一种能够可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含与选自由SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:85组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与选自由SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
76.根据权利要求28所述的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含与SEQ ID NO:79至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:80至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
77.根据权利要求28所述的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含与SEQ ID NO:79至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:81至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
78.根据权利要求28所述的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含与SEQ ID NO:83至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:81至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
79.根据权利要求28所述的独特型特异性多肽，其中该独特型特异性多肽包含与SEQ ID NO:85至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQ ID NO:81至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
80.根据实施例75所述的独特型特异性多肽，其中独特型特异性多肽为抗独特型scFv、抗独特型Fab或抗独特型scFab。
81.根据实施例75至80中任一项所述的独特型特异性多肽，其中独特型特异性多肽为scFv。
82.根据实施例75至80中任一项所述的独特型特异性多肽，其中独特型特异性多肽通过接头共价连接至分子。
83.根据实施例82所述的独特型特异性多肽，其中接头为肽接头。
84.根据实施例82或83所述的独特型特异性多肽，其中接头为蛋白酶可切割的接头。
85.根据实施例82至84中任一项所述的独特型特异性多肽，其中肽接头包含至少一个蛋白酶识别序列。
86.根据实施例85所述的独特型特异性多肽，其中蛋白酶选自由以下项组成的组：金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和组织蛋白酶。
87.根据实施例91所述的独特型特异性多肽，其中金属蛋白酶是基质金属蛋白酶(MMP)，优选MMP9或MMP2。
88.根据实施例86所述的独特型特异性多肽，其中丝氨酸蛋白酶为蛋白裂解酶。
89.根据实施例85至88中任一项所述的独特型特异性多肽，其中蛋白酶识别序列选自由以下项组成的组：
(a)RQARVVNG(SEQ ID NO:100)；
(b)VHMPLGFLGPGRSRGSFP(SEQ ID NO:101)；
(c)RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(SEQ ID NO:102)，其中X为任何氨基酸；
(d)RQARVVNGVPLSLYSG(SEQ ID NO:103)；
(e)PLGLWSQ(SEQ ID NO:104)；
(f)VHMPLGFLGPRQARVVNG(SEQ ID NO:105)；
(g)FVGGTG(SEQ ID NO:106)；
(h)KKAAPVNG(SEQ ID NO:107)；
(i)PMAKKVNG(SEQ ID NO:108)；
(j)QARAKVNG(SEQ ID NO:109)；
(k)VHMPLGFLGP(SEQ ID NO:110)；
(l)QARAK(SEQ ID NO:111)；
(m)VHMPLGFLGPPMAKK(SEQ ID NO:112)；
(n)KKAAP(SEQ ID NO:113)；和
(o)PMAKK(SEQ ID NO:114)。
90.根据实施例80至83中任一项所述的独特型特异性多肽，其中蛋白酶可切割的接头包含蛋白酶识别序列PMAKK(SEQ ID NO:114)。
91.根据实施例80至90中任一项所述的独特型特异性多肽，其中独特型特异性多肽为T细胞活化双特异性分子的一部分。
92.根据实施例75至92所述的独特型特异性多肽，其中独特型特异性多肽包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
93.根据实施例75至92所述的独特型特异性多肽，其中独特型特异性多肽包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
94.根据实施例75至92所述的独特型特异性多肽，其中独特型特异性多肽包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
95.根据实施例75至92所述的独特型特异性多肽，其中独特型特异性多肽包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。
96.根据实施例75至92所述的独特型特异性多肽，其中独特型特异性多肽包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列。
97.根据实施例75至92所述的独特型特异性多肽，其中独特型特异性多肽包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列。
98.根据实施例75至97所述的独特型特异性多肽，其中抗CD3抗原结合位点包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
99.根据实施例75至98所述的独特型特异性多肽，其中独特型特异性多肽是人源化的。
100.一种分离的多核苷酸，其编码根据实施例1至74中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性抗原结合分子或根据实施例75至99中任一项所述的独特型特异性多肽。
101.一种多肽，其由根据实施例100所述的多核苷酸编码。
102.一种载体，特别是表达载体，其包含根据实施例100所述的多核苷酸。
103.一种宿主细胞，其包含根据实施例99所述的多核苷酸或根据实施例102所述的载体。
104.一种产生蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的方法，其包括以下步骤：a)在适合于表达蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的条件下培养根据实施例103所述的宿主细胞，以及b)回收蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。
105.一种通过根据实施例104所述的方法产生的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。
106.一种产生独特型特异性多肽的方法，其包括以下步骤：a)在适合表达独特型特异性多肽的条件下培养根据实施例103所述的宿主细胞，以及b)回收独特型特异性多肽。
107.一种通过根据实施例106所述的方法产生的独特型特异性多肽。
108.一种药物组合物，其包含根据实施例1至74中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子以及药用载体。
109.一种药物组合物，其包含根据实施例75至99中任一项所述的独特型特异性多肽以及药用载体。
110.根据实施例1至74中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子、根据实施例75至99中任一项所述的独特型特异性多肽或根据实施例108所述的组合物，其用作药物。
111.根据实施例110所述使用的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中该药物用于在个体中治疗癌症或延缓其进展、治疗免疫相关疾病或延缓其进展、或者增强或刺激免疫应答或功能。
112.根据实施例1至74中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或根据实施例75至99中任一项所述的独特型特异性多肽用于治疗有此需要的个体的疾病。
113.根据实施例112所述用于治疗有此需要的个体的疾病的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或独特型特异性多肽，其中疾病为癌症。
114.根据实施例1至74中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或根据实施例75至99中任一项所述的独特型特异性多肽用于制备药物的用途，该药物用于治疗疾病。
115.根据实施例114所述的用途，其中疾病为癌症。
116.一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，该组合物包含根据实施例1至74中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或根据实施例108所述的组合物。
117.一种用于诱导靶细胞的裂解的方法，其包括在存在T细胞的情况下，使靶细胞与根据实施例1至74中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或根据实施例108所述的组合物接触。
118.根据实施例117所述的方法，其中靶细胞为癌细胞。
119.根据实施例117或118所述的方法，其中靶细胞表达能够活化蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的蛋白酶。
120.一种对抗CD3抗原结合分子的独特型特异的人源化抗独特型CD3抗体或其抗原结合片段，其中该抗独特型CD3抗体或其片段在与抗CD3抗原结合分子结合时特异性阻断抗CD3抗原结合分子与CD3的结合。
121.根据实施例120所述的抗独特型CD3抗体或其抗原结合片段，其中该抗独特型CD3抗体或其片段通过包含蛋白酶识别位点的肽接头与抗CD3抗原结合分子可逆地缔合。
122.根据实施例120或121所述的抗独特型CD3抗体或其抗原结合片段，其中CD3为小鼠、猴或人CD3。
123.一种降低T细胞活化双特异性分子的体内毒性的方法，其包括将根据实施例75至99中任一项所述的独特型特异性多肽附接到具有蛋白酶可切割的接头的T细胞活化双特异性分子以形成蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中与T细胞活化双特异性分子的毒性相比，蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的体内毒性降低。
124.如前所述的本发明。
示例性序列
根据Kabat的CDR定义
Figure BDA0004001238190001001
Figure BDA0004001238190001011
Figure BDA0004001238190001021
Figure BDA0004001238190001031
Figure BDA0004001238190001041
Figure BDA0004001238190001051
Figure BDA0004001238190001061
具有改进的抗CD3(P035.093)结合剂的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子
根据Kabat的CDR定义
Figure BDA0004001238190001062
Figure BDA0004001238190001071
Figure BDA0004001238190001081
Figure BDA0004001238190001091
Figure BDA0004001238190001101
Figure BDA0004001238190001111
Figure BDA0004001238190001121
掩蔽部分人源化变体
Figure BDA0004001238190001131
Figure BDA0004001238190001141
Figure BDA0004001238190001151
掩蔽部分scFv
Figure BDA0004001238190001152
具有人源化掩模和PMAKK蛋白酶识别序列的FolR1蛋白酶可活化的T细胞活化双特 异性分子(proTCB)
Figure BDA0004001238190001161
Figure BDA0004001238190001171
Figure BDA0004001238190001181
Figure BDA0004001238190001191
示例性接头和识别序列
Figure BDA0004001238190001192
Figure BDA0004001238190001201
实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施方案。
实例1-优化的抗CD3(多特异性)抗体的制备
所有优化的抗CD3抗体(克隆P033.078、P035.093、P035.064、P021.045、P004.042)均通过噬菌体展示选择活动生成，使用源自先前描述的(参见例如WO 2014/131712，该文献以引用方式并入本文)CD3结合剂的文库，在本文中称为“CD3orig”并且分别包含SEQ ID NO14和23的VH和VL序列。在这些文库中，位于重链的CDR3区的位置N97和N100(Kabat编号)被沉默或去除。为了直接比较，使用抗TYRP1抗体作为示例性靶细胞抗原结合部分(SEQ ID NO24-31)，将所有分子转化为T细胞双特异性抗体(TCB)形式，如图2A所示。
如图2B-E所示，将重链和轻链DNA序列的可变区亚克隆到包含预先插入到相应的受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链的框架中。
优化的抗CD3抗体的序列在表1所示的SEQ ID NO中给出。
表1.在本实例中产生的优化的抗CD3抗体的序列。
克隆 HCDR1 HCDR2 HCDR3 VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 VL
P033.078 2 5 9 15 20 21 22 23
P035.093 2 4 10 16 20 21 22 23
P035.064 3 6 11 17 20 21 22 23
P021.045 2 4 12 18 20 21 22 23
P004.042 3 7 13 19 20 21 22 23
CD3<sub>orig</sub> 1 4 8 14 20 21 22 23
为了改进轻链与相应重链的正确配对，将突变引入TYRP1结合Fab分子的人CL(E123R,Q124K)和人CH1(K147E,K213E)中。
为了正确配对重链(形成异二聚体分子)，在抗体重链的恒定区中引入了杵臼突变(分别为T366W/S354C和T366S/L368A/Y407V/Y349C)。
此外，将P329G、L234A和L235A突变引入抗体重链的恒定区，以消除与Fcγ受体的结合。
所制备的TCB分子的完整序列在SEQ ID NO 32、33、34和36(P033.078)、SEQ ID NO32、33、34和37(P035.093)、SEQ ID NO 32、33、34和38(P035.064)、SEQ ID NO 32、33、34和39(P021.045)、SEQ ID NO 32、33、34和40(P004.042)中给出。
还制备了包含CD3orig作为CD3结合剂的对应分子。
TCB由Evitria(Switzerland)使用其专有的载体系统通过常规的(基于非PCR)克隆技术并使用悬浮液适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在Evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)制备。在生产过程中，Evitria使用了其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。用相应的表达载体以1:1:2:1(“载体杵重链”:“载体臼重链”:“载体CD3轻链”:“载体TYRP1轻链”)转染细胞。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用标准方法从收获的上清液中纯化蛋白质。
简言之，利用Protein A亲和色谱法(平衡缓冲液：20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH7.5；洗脱缓冲液：20mM柠檬酸钠，pH 3.0)从细胞培养上清液中纯化含Fc的蛋白质。在pH3.0下实现洗脱，随后立即中和样品的pH。通过离心(Millipore
Figure BDA0004001238190001222
ULTRA-15，#UFC903096)浓缩蛋白质，并且通过尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。
通过测量280nm处的吸光度来测定纯化的蛋白质的浓度，其中根据Pace等人(Protein Science,1995,4,2411-1423)所述的方法，使用基于氨基酸序列计算得出的质量消光系数。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII(Perkin Elmer)，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。利用HPLC色谱法在25℃下测定聚集体含量，该系统使用分析型尺寸排阻色谱柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)，并且在运行缓冲液(分别为25mMK2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸盐酸盐(pH 6.7)或200mM KH2PO4、250mM KCl(pH6.2))中平衡。
表2给出了制备的TCB分子的生化和生物物理分析结果。
所有TCB分子都可以高品质来生产。
表2.TCB形式的抗CD3抗体的生化和生物物理分析。
Figure BDA0004001238190001221
实例2-确定优化的抗CD3(多特异性)抗体的热稳定性
通过动态光散射(DLS)，并通过使用Optim 2仪器(Avacta Analytical,UK)应用温度斜坡监测温度依赖性固有蛋白荧光监测实例1中制备的抗CD3抗体(TCB形式)的热稳定性。
将10μg蛋白浓度为1mg/ml的过滤蛋白样品一式两份加到Optim 2上。温度以0.1℃/min的速度从25℃升至85℃，采集350nm/330nm处的荧光强度和266nm处的散射强度之比。
结果如表3所示。实例1中产生的所有优化的CD3结合剂的聚集温度(Tagg)和观察到的温度诱导的去折叠转变中点(Tm)与先前描述的CD3结合剂CD3orig相当或更高。
表3.TCB形式的抗CD3抗体的热稳定性，通过动态光散射和温度依赖性固有蛋白荧光的变化来测量。
抗CD3抗体 T<sub>m</sub>[℃] T<sub>agg</sub>[℃]
P033.078 57 56
P035.093 58.5 57
P035.064 57.5 54
P021.045 58.5 54
P004.042 59 56
CD3<sub>orig</sub> 57 54
实例3-通过表面等离子体共振(SPR)对优化的抗CD3(多特异性)抗体进行功能表征
所有表面等离子体共振(SPR)实验均采用Biacore T200，在25℃下使用HBS-EP+作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)。
对于亲和力测量，将TCB分子捕获在C1传感器芯片(GE Healthcare)表面上，其具有固定的抗Fc(P329G)IgG(一种特异性结合人IgG1 Fc(P329G)的抗体；“抗PG抗体”-参见WO2017/072210，该文献以引用方式并入本文)。实验装置如图3所示。Capture IgG通过使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare Life Sciences)直接固定约400个共振单位(RU)与传感器芯片表面偶联。
为了分析与CD3的相互作用，在25nM以10μl/min的流速捕获TCB分子80秒。人和食蟹猴CD3ε茎-Fc(杵)-Avi/CD3δ茎-Fc(臼)(CD3ε/δ，参见SEQ ID NO 41和42(人)和SEQ IDNO 43和44(食蟹猴))以浓度为0.122-125nM、流速为30μl/min通过流动池300秒。监测解离800秒。
通过减去在参考流动池获得的应答来校正本体折射率差异。在此，抗原飞过具有固定化抗PG抗体的表面，但在该表面上注射HBS-EP而不是TCB分子。
使用Biacore T200评估软件(GE Healthcare Life Sciences)导出动力学常数，以通过数值积分拟合1:1Langmuir结合的速率方程。使用公式t1/2＝ln2/koff计算相互作用的半衰期(t1/2)。
在表4中，列出了与先前描述的结合剂CD3orig相比优化的抗CD3抗体结合的所有动力学参数。优化的抗CD3抗体(TCB形式)与CD3ε/δ结合的KD值在低nM范围至高pM范围内，对人CD3ε/δ的KD值为600pM至高达1.54nM，且对食蟹猴Cd3ε/δ为200pM至700pM。在相同条件下通过SPR测量，与CD3orig相比，优化的抗CD3抗体与人CD3ε/δ结合的亲和力增加高达7至10倍。
抗CD3抗体克隆P033.078与人Cd3ε/δ单价结合的半衰期为11.6分钟，比CD3orig的结合半衰期高6倍。
表4.抗CD3抗体(TCB形式)对人和食蟹猴CD3ε/δ的亲和力。
Figure BDA0004001238190001241
实例4-应激后通过表面等离子体共振(SPR)表征优化的抗CD3(多特异性)抗体
为了评估脱酰胺位点去除的效果及其对抗体稳定性的影响，将优化的抗CD3抗体(TCB形式)在37℃、pH 7.4和40℃、pH 6孵育14天，并通过SPR进一步分析它们与人CD3ε/δ的结合能力。储存在-80℃pH 6的样品用作参考。参考样品和在40℃下应激的样品在20mMHis、140mM NaCl、pH 6.0中，在37℃下应激的样品在PBS、pH 7.4中，所有浓度均为1.0mg/ml。在应激期(14天)后，将PBS中的样品透析回20mM His、140mM NaCl、pH 6.0用于进一步分析。
所有SPR实验均在Biacore T200仪器(GE Healthcare)上在25℃下使用HBS-P+(10mM HEPES、150mM NaCl、pH 7.4、0.05％表面活性剂P20)作为运行和稀释缓冲液进行。将生物素化的人Cd3ε/δ(参见实例3，SEQ ID NO 41和42)以及生物素化的抗人IgG(CaptureSelect,Thermo Scientific,#7103262100)固定在S系列传感器芯片SA(GE Healthcare,#29104992)上，产生至少1000个共振单位(RU)的表面密度。以5μl/min的流速注射浓度为2μg/ml的抗CD3抗体30s，并监测解离120s。通过注射10mM甘氨酸(pH 1.5)持续60秒，使表面再生。通过减去空白注射和减去从空白对照流动池获得的应答来校正本体折射率差异。为了评估，在注射结束后5秒采取结合应答。为了标准化结合信号，CD3结合除以抗人IgG反应(在固定化的抗人IgG抗体上捕获CD3抗体时获得的信号(RU))。通过将每个温度加压样品与相应的加压力样品进行比较来计算相对结合活性。
如表5所示，与CD3orig相比，实例1中制备的所有抗CD3抗体在应激下表现出与CD3ε/δ的结合的改善。
表5.在pH 6/40℃或pH 7.4/37℃孵育2周后，抗CD3抗体(TCB形式)与人CD3ε/δ的结合活性。
Figure BDA0004001238190001251
Figure BDA0004001238190001261
实例5-使用优化的抗CD3(多特异性)抗体的Jurkat NFAT报告细胞测定
在存在CHO-K1TYRP1克隆76(通过稳定转导CHO-K1细胞产生的细胞)作为靶细胞的情况下，在Jurkat NFAT报告细胞测定中测试了含有优化的抗CD3抗体的(TYRP1靶向)TCB。Jurkat NFAT报告细胞(Promega)在含有10％FBS、2g/l葡萄糖(Sigma)、2g/l NaHCO3(Sigma)、25mM HEPES(Gibco)、1％GlutaMax(Gibco)、1x NEAA(Sigma)、1％SoPyr(Sigma)的RPMI 1640(Gibco)(Jurkat NFAT培养基)中培养，浓度为0.1-0.5mio细胞/ml。CHO-K1TYRP1克隆76细胞在含有10％FBS和6μg/ml嘌呤霉素(Invivogen)的DMEM/F12+GlutaMAX(1x)(Gibco)中培养。该测定在Jurkat NFAT培养基中进行。
使用胰蛋白酶(Gibco)分离CHO-K1TYRP1克隆76细胞。对细胞进行计数并且检查活力。将靶细胞重新悬浮在测定培养基中，并且在白色平底384孔板中，每孔接种10 000个细胞。然后以指定浓度添加TCB。对Jurkat NFAT报告细胞进行计数，检查活力，并且每孔接种20 000细胞，对应于2:1的效应物与靶标(E:T)比。此外，将2％终体积的GloSensor cAMP试剂(E1291，Promega)添加到每个孔中。在指定的孵育时间后，使用Tecan Spark10M装置测量发光。
如图4A-B所示，含有优化的抗CD3抗体的TCB在Jurkat NFAT报告细胞上具有与含有亲本结合物CD3orig的TCB相似的功能活性。测试的TCB以浓度依赖性方式诱导CD3活化。
实例6-用优化的抗CD3(多特异性)抗体的原发性黑色素瘤细胞的肿瘤细胞杀伤
(TYRP1-靶向)TCB形式的优化的抗CD3抗体在肿瘤细胞杀伤测定中用新鲜分离的人PBMC进行测试，与人黑色素瘤细胞系M150543(原发性黑色素瘤细胞系，获自苏黎世大学皮肤病学细胞库)共同孵育。肿瘤细胞裂解通过在24小时和48小时后由凋亡或坏死细胞释放到细胞上清液中的LDH的定量来确定。通过48小时后两个细胞亚群上CD69和CD25的上调来分析CD4和CD8 T细胞的活化。
在测定开始前一天，使用胰蛋白酶(Gibco)分离靶细胞(M150543)，用PBS洗涤一次并以0.3mio细胞/ml的密度重新悬浮在生长培养基中(含有10％FBS、1％GlutaMax(Gibco)和1％SoPyr(Sigma)的RPMI 1640(Gibco))。将100μl细胞悬浮液(含30 000细胞)接种到96孔平底板中。细胞在37℃在培养箱中孵育过夜。
第二天，从健康供体的血液中分离出PBMC，并检查其活力。从电镀的靶细胞中去除培养基，向孔中添加100μl测定培养基(RPMI 1640(Gibco)，含有2％FBS和1％GlutaMax(Gibco))。将抗体以指定浓度在测定培养基中稀释，并将每孔50μl添加至靶细胞。将测定培养基添加到对照孔中。以6mio细胞/ml的密度重新悬浮分离的PBMC，每孔添加50μl，从而产生300 000个细胞/孔(E:T 10:1)。为了确定自发LDH释放(最小裂解＝0％)，仅将PBMC和靶细胞共同孵育。为了确定最大LDH释放(最大裂解＝100％)，仅向靶细胞添加测定培养基。使用在不存在靶细胞的情况下具有PBMC和TCB的对照孔来测试TCB的特异性。为了确定在没有表达靶标的肿瘤细胞的情况下CD8和CD4 T细胞是否被活化，在48小时后分析了CD25的表达。
在第一次LDH测量前几个小时，将50μl含有4％Triton X-100(Bio-Rad)的测定培养基添加到仅含有靶细胞的孔中(导致每孔1％Triton X-100的最终浓度)以获得最大的LDH释放。将该测定在培养箱中在37℃共孵育48小时。第一次LDH测量在测定开始后24小时进行。为此，在测量前将细胞毒性检测试剂盒(LDH)(Roche/Sigma,#11644793001)调整至室温。将测定板以420xg离心4分钟，并将每孔50μl上清液转移至96孔平底板进行分析。然后制备每孔1.25μl LDH催化剂和56.25μl LDH底物的反应混合物。随后将50μl LDH反应混合物添加到每个孔中，并立即使用TECAN Infinite F50仪器测量吸光度。测定开始后48小时重复测量。
之后，收获PBMC，并且通过测量CD25和CD69上调来分析活化。具体而言，每孔添加100μl FACS缓冲液，并将细胞转移至96孔U底板进行FACS染色。将板以400xg离心4分钟，去除上清液并且每孔用150μlFACS缓冲液洗涤细胞。将板再次以400xg离心4分钟，并且去除上清液。然后将每孔30μl含有CD4 APC(克隆RPA-T4，BioLegend)、CD8FITC(克隆SK1、BioLegend)、CD25 BV421(克隆BC96、BioLegend)和CD69 PE(克隆FN50，BioLegend)的抗体混合物添加到细胞中。将细胞在冰箱中孵育30min。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并每孔重悬于含有1％PFA的100μl FACS缓冲液中。测量前，将细胞重新悬浮在150μl FACS缓冲液中。使用BD LSR Fortessa装置进行分析。
与含有亲本结合物CD3orig的TCB相比，用含有抗CD3抗体克隆P035.093和克隆P021.045的TCB处理导致最高的肿瘤细胞杀伤，克隆P033.078和克隆P035.064导致中等程度的肿瘤细胞杀伤，其次是克隆P004.042诱导相似的肿瘤细胞杀伤(图5A-B)。当用含有抗CD3抗体克隆P035.093和克隆P021.045的TCB处理时，T细胞的活化最高，而含有其他抗CD3抗体克隆的TCB导致与含有亲本结合物CD3orig的TCB相似的T细胞活化(图6A-D)。
如图7A-B所示，在没有肿瘤靶细胞的情况下，测试的TCB不会诱导CD8和CD4 T细胞上的CD25上调。该结果表明，测试的CD3结合剂依赖于交联，例如通过与肿瘤细胞结合来诱导T细胞活化，并且不能以单价形式诱导T细胞活化。
实例7-优化的抗CD3抗体的制备
优化的抗CD3抗体克隆P033.078、P035.093和P004.042被转化为单价人IgG1形式，在CD3结合部分上具有交叉VH和VL结构域，如图8A所示。
如图8B-D所示，将重链和轻链DNA序列的可变区亚克隆到包含预先插入到相应的受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链的框架中。
为了正确配对重链(形成异二聚体分子)，在抗体重链的恒定区中引入了杵臼突变(分别为T366W/S354C和T366S/L368A/Y407V/Y349C)。
此外，将P329G、L234A和L235A突变引入抗体重链的恒定区，以消除与Fcγ受体的结合。
还制备了包含CD3orig作为CD3结合剂的对应分子。
在Evitria(Switzerland)制备单价IgG分子，如实例1中对TCB分子所述进行纯化和分析。对于细胞的转染，以1:1:1(“载体杵重链”:“载体臼重链”:“载体轻链”)的比例施加相应的表达载体。
表6给出了制备的单价IgG分子的生化和生物物理分析结果。
所有单价IgG分子都可以高品质来生产。
表6单价IgG形式的抗CD3抗体的生化和生物物理分析。
Figure BDA0004001238190001291
实例8-确定优化的抗CD3抗体的热稳定性
如实例2所述，通过动态光散射(DLS)和通过监测温度依赖性固有蛋白荧光来监测单价IgG形式的抗CD3抗体(在实例19中制备)的热稳定性。
结果如表7所示。所有单价IgG形式的优化的CD3结合剂的聚集温度(Tagg)和观察到的温度诱导的去折叠转变中点(Tm)与先前描述的CD3结合剂CD3orig相当或更高。
表7.单价IgG形式的抗CD3抗体的热稳定性，通过动态光散射和温度依赖性固有蛋白荧光的变化来测量。
抗CD3抗体 T<sub>m</sub>[℃] T<sub>agg</sub>[℃]
P033.078 57.0 55.5
P035.093 58.0 55.5
P004.042 58.5 56.0
CD3<sub>orig</sub> 55 53.0
实例9-通过表面等离子体共振(SPR)对优化的抗CD3抗体进行功能表征
如实例3所述进行SPR实验，使用实例7中制备的单价IgG分子。
为了分析与CD3的相互作用，在50nM以5μl/min的流速捕获IgG分子240秒。人和食蟹猴CD3ε茎-Fc(杵)-Avi/CD3δ茎-Fc(臼)以浓度为0.061-250nM、流速为30μl/min通过流动池300秒。监测解离800秒。
在表8中，列出了与先前描述的结合剂CD3orig相比优化的抗CD3抗体结合的所有动力学参数。优化的抗CD3抗体(单价IgG形式)与CD3ε/δ结合的KD值在低nM范围至高pM范围内，对人CD3ε/δ的KD值为770pM至高达1.36nM，且对食蟹猴Cd3ε/δ为200pM至400pM。在相同条件下通过SPR测量，与CD3orig相比，优化的抗CD3抗体与人CD3ε/δ结合的亲和力增加高达3.5至15倍。
抗CD3抗体克隆P033.078与人CD3ε/δ单价结合的半衰期为8.69分钟，比CD3orig的结合半衰期高出2倍以上。
表8.抗CD3抗体(单价IgG形式)对人和食蟹猴CD3ε/δ的亲和力。从重复三次测量中获得的数据。
Figure BDA0004001238190001301
*由于拟合质量不佳，动力学和亲和力值可能不完全可靠
实例10-抗独特型掩模的生成
作为嵌合IgG的抗独特型掩模的生产和评估
本文所述的嵌合IgG由Evitria使用其专有的载体系统通过常规的(基于非PCR)克隆技术并且使用悬浮液适应的CHO K1细胞(最初接收自ATCC，并且适于在Evitria的悬浮液培养物中进行无血清生长)制备。在生产过程中，Evitria使用了其专有的无动物成分和无血清的培养基(eviGrow和eviMake2)及其专有的转染试剂(eviFect)。通过离心和随后的过滤(0.2μm过滤器)收获细胞上清液，并且使用标准方法纯化。
抗独特型掩模的表征-与不同CD3mAb结合
SPR实验采用Biacore T200，使用HBS-EP+作为运行缓冲液(0.01MHEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005％表面活性剂P20(BR-1006-69,GE Healthcare))进行。三种抗独特型抗体通过胺偶联直接固定在CM5芯片(GE Healthcare)上。将不同T细胞双特异性(TCB)的三倍稀释系列以30μl/min的速度通过配体180秒以记录缔合阶段。监测解离阶段持续600s，并通过从样品溶液切换到HBS-EP+来触发。在每个循环后使用一次注射10mM甘氨酸pH 2.1持续60秒，然后两次30秒的注射，使芯片表面再生。通过减去在参考流动池1获得的应答来校正本体折射率差异。亲和常数是通过使用Biaeval软件(GE Healthcare)拟合至1:1Langmuir结合由动力学速率常数得出的。使用单一稀释系列进行测量。
Figure BDA0004001238190001311
表9：不同掩模对不同CD3结合剂的结合亲和力。使用掩模作为IgG(固定在CM5芯片上)和具有不同CD3结合Fab的TCB作为分析物来评估SPR分析。
抗独特型掩模的表征-可开发性
由于抗独特型掩模(4.15.64)中的一者在CDRL1(NYS)中表现出N-糖基化位点，因此不再考虑该分子，但仅进一步评估了4.24.72和4.32.63掩模，因为它们可用于阻断不同的CD3结合剂
在20mM His/HCl、140mM NaCl pH 6.0于40℃或1xPBS pH 7.4于37℃孵育14天后，使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振对抗独特型抗体4.32.63和4.24.72的结合进行了研究。简而言之，使用标准胺偶联化学将单体FolR1-Fc(在流动池2上)和抗PGLALA抗体(在流动池4上)固定在S系列传感器芯片CM5(CE Healthcare)上，导致表面密度超过10000个共振单位(RU)。流动池1和3用作模拟对照。含有CD3-CH2527结合结构域的FolR1 TCB-D-16D5以10μg/ml的浓度以5μl/min的流速仅注射到FolR1-Fc表面上，持续120秒，导致表面密度高于1000RU。随后，将抗独特型抗体以1μg/ml的浓度以5μl/min的流速注射到所有流动池中，持续60秒和120秒。监测解离60秒。FolR1-Fc表面通过注射10mM甘氨酸pH 1.7 60秒再生，抗PGLALA表面通过注射10mM NaOH 60秒再生。通过减去从流动池1和3(模拟对照)获得的应答来校正本体折射率差异。
为了标准化抗独特型抗体的结合信号，将FOLR1TCB-D-16D5表面的结合应答除以抗PGLALA表面的结合应答。通过将每个分子应激的样品的归一化响应除以未应激参考样品的归一化响应来获得相对活性浓度。
Figure BDA0004001238190001321
表10：亲本嵌合抗独特型掩模的分子稳定性比较(应激条件下的热稳定性和分子完整性/活性，例如在不同缓冲液中孵育14天)。
对于4.32.63掩模，在40℃、pH6.0孵育14天后，观察到相对活性浓度显著降低(73％剩余靶标结合)，而4.24.72在这些条件下稳定，具有96％剩余靶标结合活性。
实例11-筛选抗CD3结合剂P035.093抗独特型克隆
使用具有TYRP1TCB(不同CD3结合剂)的Jurkat NFAT活化测定法测试抗独特型(抗-ID)克隆(4.24.72、4.32.63、4.21和4.15.64)对CD3结合剂的结合和阻断能力。由于CD3结合剂被阻断，可在Jurkat NFAT活化减少中看到抗ID IgG的阻断(图10)。
TYRP1靶向T细胞双特异性抗体(TCB)同时与靶细胞上的TYRP1和T细胞上的CD3ε结合(Jurkat NFAT)，从而诱导T细胞活化。T细胞活化与发光相关，因为Jurkat NFAT细胞在通过CD3ε(CD3ε)活化时表达荧光素酶。Jurkat-NFAT报告细胞系(Promega)是一种人急性淋巴白血病报告细胞系，具有NFAT启动子，表达人CD3ε。如果TCB结合肿瘤靶点并且CD3(交联)结合CD3ε，则可以在添加One-Glo底物(Promega)后在发光中测量荧光素酶表达。
Jurkat NFAT测定培养基：RPMI1640、2g/l葡萄糖,2g/l NaHCO3、10％FCS、25mMHEPES、2mM L-谷氨酰胺、1x NEAA、1x丙酮酸钠
Jurkat NFAT培养基：RPMI1640、2g/l葡萄糖,2g/l NaHCO3、10％FCS、25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、1x NEAA、1x丙酮酸钠、新添加的潮霉素B 200μg/ml。
收获TYRP1阳性靶细胞(CHO-huTYRP1cl 76)和效应细胞(Jurkat NFAT)，计数并检查其活力。TCB在Jurkat测定培养基中稀释(最终浓度：在之前的测定中测定的EC90浓度，50μl/孔)。将TCB、靶细胞(20.000/孔在50μl/孔中)和Jurkat NFAT效应细胞与cAMP(2％终体积)(50.000细胞/孔在50μl/孔中)混合并添加到96孔白壁平底板(Greiner BioOne)。因此E:T比率为2.5:1。在制备稀释行之前，将抗独特型IgG在Jurkat测定培养基中稀释，并且每孔添加50μl。细胞在加湿培养箱中在37℃孵育22小时，然后将它们从培养箱中取出约10分钟以适应室温，然后在Tecan Spark中以0.5秒/孔作为检测时间读取发光。TYRP1 TCB(不同的CD3结合剂)诱导Jurkat NFAT活化，而非靶向TCB(CD3 CH2527)则不会(图10A)。当抗IDIgG与CD3结合剂结合时，它可以阻断Jurkat NFAT活化，如抗ID 4.24.72IgG所示，该抗ID4.24.72IgG可阻断此处使用的所有CD3结合剂，CD3克隆22和CD3 P033.005除外(图3B)。抗ID 4.32.63IgG仅阻断CD3结合剂CH2527(图10C)。抗ID 4.15.64IgG可阻断此处使用的所有CD3结合剂，CD3克隆22除外(图10D)。抗ID4.21IgG可阻断此处使用的所有CD3结合剂，CD3克隆22除外，而对CD3 CH2527观察到的阻断最强(图10E)。总的来说，抗ID 4.24.72在该测定设置中显示出最佳阻断能力，因此使用CD3 P035.093转换为pro-TCB形式。
实例12-FOLR1pro-TCB形式的抗-ID 4.24.72的掩蔽效率
FOLR1 proTCB与不同CD3结合剂的比较
为了比较不同CD3结合剂与抗独特型掩模4.24.72的掩蔽，制备了FOLR1 proTCB和相应的FOLR1 TCB分子。proTCB分子含有在掩模和CD3 Fab之间的不可切割的GS接头或可被MMP2/9和蛋白裂解酶切割的接头序列。
所有分子都以足够的量和良好的品质生产。正如预期，与亲本TCB相比，proTCB分子通常表现出较低的产量。
Figure BDA0004001238190001341
表11：含有不同CD3结合单元的FOLR1TCB和FOLR1 proTCB的生产和表征。MMP：huMMP2/9的切割位点；MT：hu蛋白裂解酶的切割位点
FOLR1 TCB和FOLR1 pro-TCB用Jurkat NFAT活化测定法测试，以查看抗ID掩模4.24.72是否阻断pro-TCB形式的CD3结合剂(抗ID二硫键稳定的scFv N末端融合到CD3结合剂)。Jurkat NFAT测定是用huFOLR1包被的珠粒而不是靶细胞进行的。2x30μlStreptavidin Dynabeads分别在5ml DPBS中稀释。将珠粒以400rcf离心4分钟，并且吸出上清液。用1ml中的20μg生物素化FolR1抗原在4℃缓慢旋转包被珠粒1小时。孵育后，珠-ag缀合物各用5ml DPBS洗涤并重新悬浮于4ml测定培养基中。收获效应细胞(Jurkat NFAT)，计数并检查其活力。TCB在Jurkat测定培养基中稀释。将TCB(10μl/孔)、包被的珠粒(10μl/孔)和Jurkat NFAT效应细胞与cAMP(2％终体积)(20.000细胞/孔在20μl/孔中)混合并添加到384孔白壁平底板(Falcon/Corning)。将板在加湿培养箱中在37℃孵育5-6小时，然后将它们从培养箱中取出，以在Tecan Spark中以0.5秒/孔作为检测时间读取发光。
具有抗ID掩模4.24.72的FOLR1pro-TCB在指定浓度范围内不介导Jurkat NFAT活化，而FOLR1 TCB介导剂量依赖性Jurkat NFAT活化(图11A)，这意味着抗ID 4.24.72就阻断而言pro-TCB形式也适用。
下一步是测试具有可切割的接头的FOLR1pro-TCB，以测试在杀伤时的掩蔽效率(比Jurkat NFAT更敏感)和接头切割时释放的掩模。使用HeLa(FolR1+++)细胞评估由FOLR1(pro-)TCB介导的T细胞杀伤。人PBMC用作效应细胞，E:T比率为10:1。人外周血单个核细胞(PBMC)是从从健康人供体获得的血沉棕黄层中分离出来的。用无菌PBS以1:1稀释血沉棕黄层，并在Histopaque梯度(Sigma,#H8889)上分层。离心分离(450xg，30分钟，无中断，室温)后，将含PBMC间期转移到新的falcon管中，随后用50ml PBS填充。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，弃去上清液，并将PBMC沉淀球粒重新悬浮于2ml ACK缓冲液中用于红细胞裂解。在37℃孵育约2-3分钟后，将管用无菌PBS填充至50ml，并以350xg离心10分钟。在将PBMC重新悬浮在含有10％FCS、1XGlutaMax和10％DMSO的RPMI1640培养基中之前，重复该洗涤步骤一次。PBMC在
Figure BDA0004001238190001361
细胞冷冻容器(BioCision)中在-80℃缓慢冷冻，然后转移到液氮中。在测定开始前一天，用胰蛋白酶/EDTA收获粘附的靶细胞，计数，检查其活力并重新悬浮于测定培养基(RPMI1640、2％FCS、1X GlutaMax)中。在测定开始前约24小时，PBMC在高级RPMI1640培养基(+2％FCS，1X GlutaMax)中解冻。将PBMC以350g离心7分钟，并且重新悬浮于新鲜培养基(高级RPMI1640、2％FCS、1X GlutaMax)中。PBMC在用于测定之前最多保留24小时。使用96孔平底板以20 000细胞/孔的密度电镀靶细胞。将分子在测定培养基(RPMI1640、2％FCS、1X GlutaMax)中稀释，并以指定浓度添加，重复三次。将板在加湿培养箱中在37℃孵育约20小时。收获PBMCS并以350g离心7分钟，然后将它们重新悬浮于测定培养基(RPMI1640、2％FCS、1X GlutaMax)中。添加在100μl/孔中的0.2mio PBMC(E:T 10:1，基于接种靶细胞的数量)，然后将板在37℃孵育48小时。在37℃、5％CO2下孵育48小时后，通过定量凋亡/坏死细胞释放到细胞上清液中的LDH(LDH检测试剂盒，Roche AppliedScience，#11 644 793 001)来评估靶细胞杀伤。标准响应是指与效应细胞共孵育的靶细胞，而没有任何TCB。
FOLR1TCB诱导剂量依赖性HeLa细胞杀伤，EC50值为约0.29pM。活化的pro-TCB(与重组蛋白裂解酶预孵育用于接头切割)的效力与FOLR1 TCB相当。含有不可切割的接头的pro-TCB介导的降低的靶细胞杀伤(EC50增加约239倍)(图11C)。除了靶细胞杀伤外，在37℃、5％CO2下孵育48小时后，通过对CD8阳性T细胞上的CD69进行定量来评估T细胞活化。关于CD8阳性T细胞上CD69的MFI，FOLR1 TCB和预活化的FOR1 pro-TCB的效力相当，并且对于掩蔽的pro-TCB(不可切割)，没有检测到CD8 T细胞活化。关于CD69阳性CD8 T细胞的百分比，掩蔽的pro-TCB显示CD69阳性CD8 T细胞增加>5nM，在此处使用的最高浓度下增加到30％左右。针对具有不同FOLR1表达水平的不同细胞系，比较了抗ID 4.24.72的掩蔽效率。
在孵育huPBMC 48小时后测量剂量依赖性靶细胞杀伤(Hela高FOLR1表达、Ovcar-3和Skov-3中等FOLR1表达以及具有低FOLR1表达的HT-29)，以分析具有CD3 P035.093的pro-TCB形式的抗ID 4.24.72的掩蔽效率。TCB和FOLR1阳性靶细胞(E:T＝10:1，效应子为人PBMC)。FOLR1 TCB在所有细胞系(Hela、Skov-3、Ovcar-3、HT-29)上诱导剂量依赖性靶细胞杀伤，而掩蔽的FOLR1 pro-TCB显示出降低的靶细胞杀伤(图12A和12B)。掩蔽效率似乎取决于FOLR1表达水平。对于FOLR1表达水平较低的细胞，由FOLR1 pro-TCB(不可切割)诱导的靶细胞杀伤似乎降低最多。FOLR1 TCB与CD3结合剂CH2527和FOLR1 TCB与CD3结合剂P035.93的比较显示，具有CD3 P035.093的TCB的效力略高(图12B)。用抗ID 4.24.72掩蔽两种CD3结合剂是可能的。
实例13-掩模4.24.72的人源化
如实例12所示，FOLR1proTCB被掩模4.24.72有效阻断，如Jurkat NFAT T细胞活化测定中所示。接头切割后，该proTCB分子在靶细胞杀伤测定中完全活化。因此，由于这种掩模可以与不同的CD3结合剂一起使用，因此选择这种抗独特型抗体进行人源化。十种不同的可变重链和八种不同的可变轻链被设计和生产为单体单臂IgG(图13)。通过应用杵臼结构技术实现了分子的异源二聚化。单臂IgG在Expi293F细胞中以2ml小规模瞬时产生(根据制造商的建议进行转染)。使用含有单臂分子的生产上清液直接评估在Jurkat NFAT报告基因测定(如下所述)中与CD3 IgG(P035.093)的初始结合和T细胞活化的阻断。
筛选人源化变体对CD3 P035.093的阻断-Jukat NFAT活化测定
使用上述Jurkat NFAT测定法筛选人源化变体(IgG形式)对CD3结合剂P035.093(和CH2527)的阻断能力。TCB以EC90浓度(在先前的测定中确定)使用，并滴定抗ID IgG。亲本4.24.72IgG用作对照。亲本4.24.72阻断了CD3 CH2527和P035.09。人源化变体也阻断CD3CH2527和P035.093，而与CD3 CH2527相比，它们似乎对P035.093的阻断能力略高(图14)。总而言之，它们都掩蔽CD3 P035.093。根据结果，选择并生产了六种变体，并如上所述纯化为IgG和proTCB(在proTCB形式的情况下具有不可切割的接头)，用于与亲本克隆进行比较。
可开发性抗CD3 P035.093 4.24.72抗独特型抗体和相应的人源化变体
掩模4.24.72的人源化变体包含可能导致分子不稳定的潜在序列热点。因此，在14天应激条件(pH6.0时为40℃或pH7.4时为37℃)后，分析了它们的热稳定性和剩余靶标结合。
在20mM His/HCl、140mM NaCl pH 6.0中于40℃或1xPBS pH 7.4中于37℃孵育14天后，抗独特型抗体4.24.72及其人源化变体H1L1、H1L2、H2L2、H3L2、H3L3和H7L5的结合，使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振进行研究。简而言之，根据制造商的说明，使用Biotin CAPture Kit(GE Healthcare)将生物素化抗人CD3 IgG(抗CD3P035.093)和生物素化抗人IgG(ThermoScientific)固定在系列CAP芯片上。通过以5μl/min的流速分别注射5μg/ml 120秒，将抗体固定在流动池2和3上，从而使表面密度超过1000共振单位(RU)。流动池1保持为模拟表面。随后，将抗独特型抗体以1μg/ml的浓度注射到所有流动池中，持续30秒。监测解离30秒，流速设置为5μl/min。通过注射生物素捕获试剂盒中提供的NaOH和盐酸胍的混合物持续120秒，使CAP芯片再生。通过减去从流动池1(模拟表面)获得的应答来校正本体折射率差异。
为了标准化抗独特型抗体的结合信号，将抗人CD3IgG表面的结合应答除以抗人IgG表面的结合应答。通过将每个分子应激的样品的归一化响应除以未应激参考样品的归一化响应来获得相对活性浓度。
Figure BDA0004001238190001381
Figure BDA0004001238190001391
表12：人源化抗独特型掩模4.24.72的选定变体在聚集温度和应激测试后的稳定性/活性方面的比较。聚集温度高于58℃和在HIC柱上的相对保留时间小于0.35分钟被视为非临界值。除了样品H3L3和H7L5的相对活性浓度只有87％和80％外，所有其他分子在测试条件下都是稳定的。
使用SPR的抗独特型抗体与抗CD3 P035-093的结合动力学
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振研究亲本抗CD3P035.093抗独特型抗体4.24.72相较于人源化变体H1L1、4.24.72H1L2、H2L2和4.24.72H3L2的结合。简而言之，根据制造商的说明，使用标准胺偶联化学将FOLR1-Fc固定在系列传感器芯片C1上。最终表面密度在700和1000RU之间。随后，将FOLR1 CD3 TCB P035.093注射到第二流动池上持续30秒。第一流动池保持为模拟表面。将抗独特型抗体以1.2至100nM(1:3稀释系列)的浓度注射到两个流动池上持续120秒。监测解离300秒，流速设置为30μl/min。通过注射10mM Glycine pH 2.0 60秒使表面再生，然后以5μl/min的流速注射5mM NaOH 60秒。通过减去从流动池一(模拟表面)获得的应答和减去缓冲液注射(双重参照)来校正本体折射率差异。使用BIAevaluation软件(GE Healthcare)将导出的曲线拟合到1:1Langmuir结合模型。获得的拟合结果显示Rmax值在1和4RU之间。所有实验均在37℃下使用HBS-N(10mM HEPES、150mM NaCl pH 7.4、0.05％表面活性剂P-20)进行。
结果(n＝5)：
概念ID KD(nM) Stdev(nM) t1/2diss(s) Stdev(s)
4.24.72 1.5 0.4 446 140
H1L1 1.8 0.6 371 66
H1L2 1.2 0.5 396 198
H2L2 1.8 1.0 372 156
H3L2 1.1 0.5 460 222
表13：CD3 P035.093抗独特型亲本嵌合抗体4.24.72及其人源化变体的结合亲和力。
实例14-由FOLR1 pro-TCB(CD3 P035.93和人源化变体作为掩模)介导的靶细胞杀伤
进行靶细胞杀伤以测试pro-TCB形式的4.24.72抗ID掩模的人源化变体的掩蔽效率。将FOLR1阳性靶细胞(具有中等FOLR1表达水平的Ovcar-3)与huPBMC和TCB如上所述一起孵育。FOLR1 TCB用作阳性对照(图15)。与FOLR1 TCB相比，所有FOLR1 pro-TCB(不同的人源化变体作为掩模和不可切割的接头)显示出降低的靶细胞杀伤。在此测定设置中，所有人源化变体的掩蔽效率相当(图7)。另外分析了T细胞活化。FOLR1 TCB诱导剂量依赖性T细胞活化(CD8阳性T细胞的CD69增加)。含有不可切割的接头的掩蔽的FOLR1 pro-TCB(CD3P035.093，掩模4.24.72scFv的人源化变体)在指定浓度范围内显示出降低的T细胞活化(对于CD8 T细胞为CD69)，并且没有检测到人源化变体的掩蔽效率差异。
实例15-应激后通过表面等离子体共振(SPR)表征优化的抗CD3抗体
使用实例7中制备的单价IgG分子，如实例4所述进行实验。如表14所示，与CD3orig相比，所有优化的抗CD3抗体在应激下表现出与CD3ε/δ的结合的改善。
表14.在pH 6/40℃或pH 7.4/37℃孵育2周后，抗CD3抗体(单价IgG形式)与人CD3ε/δ的结合活性。
Figure BDA0004001238190001401
尽管为了清楚理解的目的先前已通过举例说明和实施方案相当详细地描述了本发明，但是这些描述和实施方案不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用方式明确地并入。
***
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> 蛋白酶活化的 T 细胞双特异性抗体
<130> P36114
<160> 127
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3orig HCDR1
<400> 1
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt HCDR1 (P033.078) (P035.093) (P021.045)
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt HCDR1 (P035.064) (P004.042)
<400> 3
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3orig HCDR2 CD3opt HCDR2 (P035.093) (P021.045)
<400> 4
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt HCDR2 (P033.078)
<400> 5
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Glu Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt HCDR2 (P035.064)
<400> 6
Arg Ile Arg Ser Lys His Asn Gly Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt HCDR2 (P004.042)
<400> 7
Arg Ile Arg Thr Lys Tyr Asn Glu Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
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<220>
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<400> 8
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<211> 14
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<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt HCDR3 (P033.078)
<400> 9
Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Phe Val Ser Tyr Phe Gly Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt HCDR3 (P035.093)
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<220>
<223> CD3opt HCDR3 (P035.064)
<400> 11
Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt HCDR3 (P021.045)
<400> 12
Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt HCDR3 (P004.042)
<400> 13
Ala Ser Asn Phe Pro Gln Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3orig VH
<400> 14
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 15
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt VH (P033.078)
<400> 15
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Glu Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Phe Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 16
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt VH (P035.093)
<400> 16
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 17
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt VH (P035.064)
<400> 17
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys His Asn Gly Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 18
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt VH (P021.045)
<400> 18
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 19
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt VH (P004.042)
<400> 19
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Thr Lys Tyr Asn Glu Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Gln Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3orig / CD3opt LCDR1
<400> 20
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3orig / CD3opt LCDR2
<400> 21
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3orig / CD3opt LCDR3
<400> 22
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 23
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3orig / CD3opt VL
<400> 23
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TYRP1 HCDR1
<400> 24
Asp Tyr Phe Leu His
1 5
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TYRP1 HCDR2
<400> 25
Trp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Asn Thr Val Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TYRP1 HCDR3
<400> 26
Arg Asp Tyr Thr Tyr Glu Lys Ala Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 27
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TYRP1 VH
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Asn Thr Val Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Asp Tyr Thr Tyr Glu Lys Ala Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TYRP1 LCDR1
<400> 28
Arg Ala Ser Gly Asn Ile Tyr Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TYRP1 LCDR2
<400> 29
Asp Ala Lys Thr Leu Ala Asp
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TYRP1 LCDR3
<400> 30
Gln His Phe Trp Ser Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TYRP1 VL
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile Tyr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 32
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TYRP1 VH-CH1(EE) - CD3orig/CD3opt VL-CH1 - Fc（杵，PGLALA）
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Asn Thr Val Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Asp Tyr Thr Tyr Glu Lys Ala Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr
225 230 235 240
Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr
245 250 255
Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp
260 265 270
Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr
275 280 285
Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu
290 295 300
Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu
305 310 315 320
Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly
325 330 335
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
340 345 350
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
355 360 365
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
370 375 380
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
385 390 395 400
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
405 410 415
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
420 425 430
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
435 440 445
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
450 455 460
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
465 470 475 480
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
485 490 495
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
500 505 510
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
515 520 525
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
530 535 540
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
545 550 555 560
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
565 570 575
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
580 585 590
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
595 600 605
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
610 615 620
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
625 630 635 640
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
645 650 655
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
660 665 670
Ser Pro
<210> 33
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TYRP1 VH-CH1(EE) -Fc（臼，PGLALA）
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Asn Thr Val Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Asp Tyr Thr Tyr Glu Lys Ala Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro
<210> 34
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TYRP1 VL-CL(RK)
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile Tyr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 35
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3orig VH-CL
<400> 35
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 36
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt (P033.078) VH-CL
<400> 36
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Glu Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Phe Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 37
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt (P035.093) VH-CL
<400> 37
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 38
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt (P035.064) VH-CL
<400> 38
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys His Asn Gly Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 39
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt (P021.045) VH-CL
<400> 39
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 40
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3opt (P004.042) VH-CL
<400> 40
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Asp Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Thr Lys Tyr Asn Glu Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Gln Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 41
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 CD3 ε 茎 - Fc（杵）- Avi
<400> 41
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro
20 25 30
Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp
35 40 45
Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys
50 55 60
Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg
65 70 75 80
Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg
85 90 95
Val Ser Glu Asn Cys Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser
100 105 110
Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu
340 345 350
Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
355 360
<210> 42
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 CD3 δ 茎 - Fc（臼）- Avi
<400> 42
Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys
1 5 10 15
Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly
35 40 45
Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr
50 55 60
Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Arg Ser Glu Gln Leu Tyr Phe Gln
65 70 75 80
Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
85 90 95
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
100 105 110
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
115 120 125
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
130 135 140
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
145 150 155 160
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
165 170 175
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
180 185 190
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
195 200 205
Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
210 215 220
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
225 230 235 240
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
245 250 255
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
260 265 270
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
275 280 285
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
290 295 300
Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
305 310 315 320
Ile Glu Trp His Glu
325
<210> 43
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴 CD3 ε 茎 - Fc（杵）- Avi
<400> 43
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu
20 25 30
Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Glu Asp Ser
35 40 45
Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly
50 55 60
Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His
65 70 75 80
His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Ser Glu Asn Cys Val Asp Glu Gln
85 90 95
Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr
100 105 110
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
130 135 140
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
145 150 155 160
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
165 170 175
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
180 185 190
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
195 200 205
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
210 215 220
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
225 230 235 240
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
245 250 255
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
260 265 270
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
275 280 285
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
290 295 300
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
305 310 315 320
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly
325 330 335
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
340 345 350
<210> 44
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴 CD3 δ 茎 - Fc（臼）- Avi
<400> 44
Phe Lys Ile Pro Val Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Lys Cys
1 5 10 15
Asn Thr Ser Val Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Thr
20 25 30
Asn Asn Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly
35 40 45
Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Ala
50 55 60
Val Gln Val His Tyr Arg Met Ser Gln Asn Cys Val Asp Glu Gln Leu
65 70 75 80
Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys
85 90 95
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
100 105 110
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
115 120 125
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
130 135 140
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
145 150 155 160
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
165 170 175
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
180 185 190
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
195 200 205
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
210 215 220
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
225 230 235 240
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
245 250 255
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
260 265 270
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
275 280 285
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
290 295 300
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly
305 310 315 320
Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
325 330
<210> 45
<211> 186
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro
20 25 30
Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp
35 40 45
Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys
50 55 60
Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg
65 70 75 80
Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg
85 90 95
Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met Ser Val Ala Thr Ile
100 105 110
Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr
115 120 125
Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly
130 135 140
Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro
145 150 155 160
Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp
165 170 175
Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
180 185
<210> 46
<211> 177
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 46
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu
20 25 30
Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Glu Asp Ser
35 40 45
Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly
50 55 60
Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His
65 70 75 80
His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp
85 90 95
Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Leu
100 105 110
Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys
115 120 125
Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly
130 135 140
Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro
145 150 155 160
Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg
165 170 175
Ile
<210> 47
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIgG1 Fc 区
<400> 47
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头 GGGGSGGGGS
<400> 48
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头 DGGGGSGGGGS
<400> 49
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 k CL 结构域
<400> 50
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 51
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 λ CL 结构域
<400> 51
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 52
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 IgG1 重链恒定区 (CH1-CH2-CH3)
<400> 52
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 53
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16D5 VH
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16D5 CDRH1
<400> 54
Asn Ala Trp Met Ser
1 5
<210> 55
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16D5 CDRH2
<400> 55
Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 16D5 CDRH3
<400> 56
Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 57
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ID_4.24.72 VH
<400> 57
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Lys Val Ser Ser
115
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ID_4.24.72 CDRH1
<400> 58
Asp Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ID_4.24.72 CDRH2
<400> 59
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ID_4.24.72 CDRH3
<400> 60
Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr
1 5
<210> 61
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ID_4.24.72 VL
<400> 61
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ID_4.24.72 CDRL1
<400> 62
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ID_4.24.72 CDRL2
<400> 63
Tyr Val Ser Tyr Leu Glu Ser
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ID_4.24.72 CDRL3
<400> 64
Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 65
<211> 969
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有蛋白酶接头和抗 CD3 P035.093 K 链的 FOLR1 proTCB
<400> 65
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr
180 185 190
Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp
210 215 220
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
290 295 300
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
305 310 315 320
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
325 330 335
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
340 345 350
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
355 360 365
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ala Ser
370 375 380
Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
385 390 395 400
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
405 410 415
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
420 425 430
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
435 440 445
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
450 455 460
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
465 470 475 480
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
485 490 495
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
515 520 525
Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
530 535 540
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln
545 550 555 560
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr
565 570 575
Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr
580 585 590
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
595 600 605
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu
610 615 620
Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
625 630 635 640
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
645 650 655
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
660 665 670
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
675 680 685
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
690 695 700
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
705 710 715 720
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
725 730 735
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
740 745 750
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
755 760 765
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
770 775 780
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
785 790 795 800
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
805 810 815
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
820 825 830
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
835 840 845
Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
850 855 860
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp
865 870 875 880
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
885 890 895
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
900 905 910
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
915 920 925
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
930 935 940
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
945 950 955 960
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
965
<210> 66
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有蛋白酶接头和抗 CD3 P035.093 H 链的 FOLR1 proTCB
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 67
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有蛋白酶接头和抗 CD3 P035.093 L 链的 FOLR1 proTCB
<400> 67
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 68
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白裂解酶接头
<400> 68
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 69
<211> 969
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有蛋白酶接头 CD3 P035.093 K 链的 FOLR1proTCB
<400> 69
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr
180 185 190
Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp
210 215 220
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val His
245 250 255
Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Arg Gln Ala Arg Val Val Asn Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
290 295 300
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
305 310 315 320
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
325 330 335
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
340 345 350
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
355 360 365
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ala Ser
370 375 380
Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
385 390 395 400
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
405 410 415
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
420 425 430
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
435 440 445
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
450 455 460
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
465 470 475 480
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
485 490 495
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
515 520 525
Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
530 535 540
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln
545 550 555 560
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr
565 570 575
Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr
580 585 590
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
595 600 605
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu
610 615 620
Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
625 630 635 640
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
645 650 655
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
660 665 670
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
675 680 685
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
690 695 700
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
705 710 715 720
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
725 730 735
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
740 745 750
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
755 760 765
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
770 775 780
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
785 790 795 800
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
805 810 815
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
820 825 830
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
835 840 845
Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
850 855 860
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp
865 870 875 880
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
885 890 895
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
900 905 910
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
915 920 925
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
930 935 940
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
945 950 955 960
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
965
<210> 70
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头 GGGGSVHMPLGFLGPRQARVVNGGGGGSGGGGS
<400> 70
Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Arg
1 5 10 15
Gln Ala Arg Val Val Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 71
<211> 969
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有不可切割的接头 CD3 P035.093 K 链的 FOLR1proTCB
<400> 71
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr
180 185 190
Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp
210 215 220
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
290 295 300
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
305 310 315 320
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
325 330 335
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
340 345 350
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
355 360 365
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ala Ser
370 375 380
Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
385 390 395 400
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
405 410 415
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
420 425 430
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
435 440 445
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
450 455 460
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
465 470 475 480
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
485 490 495
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
515 520 525
Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
530 535 540
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln
545 550 555 560
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr
565 570 575
Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr
580 585 590
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
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Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu
610 615 620
Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
625 630 635 640
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
645 650 655
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
660 665 670
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
675 680 685
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Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
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770 775 780
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
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Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGGSGGGGSGGGGS
<400> 72
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 73
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLR1 TCB CD3 P035.093 K 链
<400> 73
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1 5 10 15
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20 25 30
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
370 375 380
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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420 425 430
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
435 440 445
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450 455 460
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
465 470 475 480
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<400> 74
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835 840 845
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850 855 860
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp
865 870 875 880
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
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Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
900 905 910
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
915 920 925
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
930 935 940
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
945 950 955 960
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
965
<210> 75
<211> 33
<212> PRT
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<220>
<223> 接头 GGGGSGGGGSRQARVVNGGGGGSGGGGSGGGGS
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Val
1 5 10 15
Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 76
<211> 969
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有 MMP2/9-蛋白裂解酶接头 CD3 CH2527 K 链的 FOLR1proTCB
<400> 76
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Lys Trp Met
35 40 45
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100 105 110
Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser
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Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val His
245 250 255
Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Arg Gln Ala Arg Val Val Asn Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
435 440 445
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
485 490 495
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500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
515 520 525
Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
530 535 540
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln
545 550 555 560
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr
565 570 575
Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr
580 585 590
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
595 600 605
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu
610 615 620
Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
625 630 635 640
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
645 650 655
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
660 665 670
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
675 680 685
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
690 695 700
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
705 710 715 720
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
725 730 735
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
740 745 750
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
755 760 765
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
770 775 780
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
785 790 795 800
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
805 810 815
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
820 825 830
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
835 840 845
Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
850 855 860
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp
865 870 875 880
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
885 890 895
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
900 905 910
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
915 920 925
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
930 935 940
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
945 950 955 960
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
965
<210> 77
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头 GGGGSVHMPLGFLGPRQARVVNGGGGGSGGGGS
<400> 77
Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Arg
1 5 10 15
Gln Ala Arg Val Val Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 78
<211> 969
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有不可切割的接头 CD3 CH2527 K 链的 FOLR1 proTCB
<400> 78
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr
180 185 190
Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp
210 215 220
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
290 295 300
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
305 310 315 320
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
325 330 335
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
340 345 350
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
355 360 365
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
370 375 380
Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
385 390 395 400
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
405 410 415
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
420 425 430
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
435 440 445
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
450 455 460
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
465 470 475 480
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
485 490 495
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
515 520 525
Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
530 535 540
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln
545 550 555 560
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr
565 570 575
Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr
580 585 590
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
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Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu
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Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
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Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
645 650 655
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
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Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
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820 825 830
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835 840 845
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<223> FolR1 pro TCB P035.093 H1L2 K 链
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Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn
145 150 155 160
Cys Lys Ser Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr
180 185 190
Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp
210 215 220
Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
290 295 300
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
305 310 315 320
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
325 330 335
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
340 345 350
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
355 360 365
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ala Ser
370 375 380
Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
385 390 395 400
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
405 410 415
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
420 425 430
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
435 440 445
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
450 455 460
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
465 470 475 480
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
485 490 495
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
515 520 525
Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
530 535 540
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln
545 550 555 560
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr
565 570 575
Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr
580 585 590
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
595 600 605
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu
610 615 620
Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
625 630 635 640
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
645 650 655
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
660 665 670
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
675 680 685
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
690 695 700
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
705 710 715 720
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
725 730 735
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
740 745 750
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
755 760 765
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
770 775 780
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
785 790 795 800
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
805 810 815
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
820 825 830
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
835 840 845
Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
850 855 860
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp
865 870 875 880
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
885 890 895
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
900 905 910
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
915 920 925
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
930 935 940
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
945 950 955 960
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
965
<210> 97
<211> 969
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FolR1 pro TCB P035.093 H2L2 K 链
<400> 97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn
145 150 155 160
Cys Lys Ser Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr
180 185 190
Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp
210 215 220
Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
290 295 300
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
305 310 315 320
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
325 330 335
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
340 345 350
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
355 360 365
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ala Ser
370 375 380
Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
385 390 395 400
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
405 410 415
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
420 425 430
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
435 440 445
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
450 455 460
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
465 470 475 480
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
485 490 495
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
515 520 525
Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
530 535 540
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln
545 550 555 560
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr
565 570 575
Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr
580 585 590
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
595 600 605
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu
610 615 620
Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
625 630 635 640
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
645 650 655
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
660 665 670
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
675 680 685
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
690 695 700
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
705 710 715 720
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
725 730 735
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
740 745 750
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
755 760 765
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
770 775 780
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
785 790 795 800
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
805 810 815
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
820 825 830
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
835 840 845
Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
850 855 860
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp
865 870 875 880
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
885 890 895
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
900 905 910
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
915 920 925
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
930 935 940
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
945 950 955 960
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
965
<210> 98
<211> 969
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FolR1 pro TCB P035.093 H3L2 K 链
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Gln Gly Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn
145 150 155 160
Cys Lys Ser Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr
180 185 190
Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp
210 215 220
Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr Phe
225 230 235 240
Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
290 295 300
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
305 310 315 320
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys
325 330 335
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
340 345 350
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
355 360 365
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ala Ser
370 375 380
Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
385 390 395 400
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
405 410 415
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
420 425 430
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
435 440 445
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
450 455 460
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
465 470 475 480
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
485 490 495
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
515 520 525
Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
530 535 540
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln
545 550 555 560
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr
565 570 575
Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr
580 585 590
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
595 600 605
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr Pro Trp Glu
610 615 620
Trp Ser Trp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
625 630 635 640
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
645 650 655
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
660 665 670
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
675 680 685
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
690 695 700
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
705 710 715 720
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
725 730 735
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
740 745 750
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
755 760 765
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
770 775 780
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
785 790 795 800
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
805 810 815
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
820 825 830
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
835 840 845
Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
850 855 860
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp
865 870 875 880
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
885 890 895
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
900 905 910
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
915 920 925
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
930 935 940
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
945 950 955 960
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
965
<210> 99
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP 蛋白酶接头
<400> 99
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Leu Gly Leu Trp
1 5 10 15
Ser Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly
35
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 1
<400> 100
Arg Gln Ala Arg Val Val Asn Gly
1 5
<210> 101
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 2
<400> 101
Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Gly Arg Ser Arg Gly Ser
1 5 10 15
Phe Pro
<210> 102
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 3
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(13)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 102
Arg Gln Ala Arg Val Val Asn Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser Gly
20
<210> 103
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 4
<400> 103
Arg Gln Ala Arg Val Val Asn Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly
1 5 10 15
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 5
<400> 104
Pro Leu Gly Leu Trp Ser Gln
1 5
<210> 105
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 6
<400> 105
Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Arg Gln Ala Arg Val Val
1 5 10 15
Asn Gly
<210> 106
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 7
<400> 106
Phe Val Gly Gly Thr Gly
1 5
<210> 107
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 8
<400> 107
Lys Lys Ala Ala Pro Val Asn Gly
1 5
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 9
<400> 108
Pro Met Ala Lys Lys Val Asn Gly
1 5
<210> 109
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 10
<400> 109
Gln Ala Arg Ala Lys Val Asn Gly
1 5
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 11
<400> 110
Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro
1 5 10
<210> 111
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 12
<400> 111
Gln Ala Arg Ala Lys
1 5
<210> 112
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 13
<400> 112
Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Pro Met Ala Lys Lys
1 5 10 15
<210> 113
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 14
<400> 113
Lys Lys Ala Ala Pro
1 5
<210> 114
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶识别位点 15
<400> 114
Pro Met Ala Lys Lys
1 5
<210> 115
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 组合的 MMP9 MK062、33 AA 用于 CD3
<400> 115
Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Arg
1 5 10 15
Gln Ala Arg Val Val Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 116
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 组织蛋白酶 S/B
<400> 116
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe
1 5 10 15
Val Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 117
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KKAAPVNG
<400> 117
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Ala Pro Val
1 5 10 15
Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 118
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PMAKKVNG
<400> 118
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Val
1 5 10 15
Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 119
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> QARAKVNG
<400> 119
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Lys Val
1 5 10 15
Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 120
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP9
<400> 120
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly
1 5 10 15
Phe Leu Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 121
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> QARAK
<400> 121
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Lys Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 122
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP9-PMAKK
<400> 122
Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Pro
1 5 10 15
Met Ala Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 123
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> KKAAP
<400> 123
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Ala Pro Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 124
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PMAKK
<400> 124
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 125
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 组合的 NF9/Mat5 接头
<400> 125
Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Gly
1 5 10 15
Arg Ser Arg Gly Ser Phe Pro Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 126
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 组合的 MK062 MMP9
<400> 126
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Val
1 5 10 15
Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 127
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 组合的 MK062 MMP9
<400> 127
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Val
1 5 10 15
Asn Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser
35

Claims (51)

1.一种蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含
(a)能够与CD3结合的第一抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分包含
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：2的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：4的HCDR 2和SEQ ID NO：10的HCDR 3，以及
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：20的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：21的LCDR 2和SEQ ID NO：22的LCDR 3；
(b)能够与靶细胞抗原结合的第二抗原结合部分；以及
(c)通过蛋白酶可切割的接头共价连接至T细胞双特异性结合分子的掩蔽部分，其中所述掩蔽部分能够与所述第一抗原结合部分的独特型结合，从而可逆地隐蔽所述第一抗原结合部分。
2.根据权利要求1所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述VH包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，和/或所述VL包含与SEQ ID NO：23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述掩蔽部分共价连接至所述第一抗原结合部分并且可逆地隐蔽所述第一抗原结合部分。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述掩蔽部分共价连接至所述第一抗原结合部分的所述重链可变区。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述掩蔽部分为scFv。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述第二抗原结合部分为交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区被交换。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述第一抗原结合部分为常规Fab分子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含不超过一个能够与CD3结合的抗原结合部分。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其包含第三抗原结合部分，所述第三抗原结合部分为能够与靶细胞抗原结合的Fab分子。
10.根据权利要求9所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述第三抗原结合部分与所述第二抗原结合部分相同。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述第二抗原结合部分能够与选自由FolR1和TYRP1组成的组的靶细胞抗原结合。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述第一抗原结合部分与所述第二抗原结合部分彼此融合，任选地经由肽接头融合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至所述第一抗原结合部分的Fab重链的N末端。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合至所述第二抗原结合部分的Fab重链的N末端。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其另外地包含由能够稳定缔和的第一亚基和第二亚基所构成的Fc结构域。
16.根据权利要求15所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述Fc结构域为IgG，具体地为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。
17.根据权利要求15或16所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述Fc结构域与天然IgG1 Fc结构域相比，表现出对Fc受体的降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述掩蔽部分包含重链可变区，所述重链可变区包含：
(a)DYSMN(SEQ ID NO：58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)CDR H2氨基酸序列，其选自由WINTETGEPRYTDDFKG(SEQ ID NO：59)、WINTETGEPRYTDDFTG(SEQ ID NO：84)和WINTETGEPRYTQGFKG(SEQ ID NO：86)组成的组；
(c)EGDYDVFDY(SEQ ID NO：60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：
(d)轻链(CDR L)1氨基酸序列，其选自由RASKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO：62)和KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO：82)组成的组；
(e)YVSYLES(SEQ ID NO：63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)CDR L3氨基酸序列，其选自由QHSREFPYT(SEQ ID NO：64)和QQSREFPYT(SEQ ID NO：88)组成的组。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述掩蔽部分包含重链可变区，所述重链可变区包含：
(a)DYSMN(SEQ ID NO：58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)WINTETGEPRYTDDFKG(SEQ ID NO：59)的CDR H2氨基酸序列；
(c)EGDYDVFDY(SEQ ID NO：60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：
(d)RASKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO：62)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)YVSYLES(SEQ ID NO：63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHSREFPYT(SEQ ID NO：64)的CDR L3氨基酸序列。
20.根据权利要求1至17中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述掩蔽部分包含重链可变区，所述重链可变区包含：
(a)SYGVS(SEQ ID NO：58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)IIWGDGSTNYHSALIS(SEQ ID NO：59)的CDR H2氨基酸序列；
(c)GITTVVDDYYAMDY(SEQ ID NO：60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：
(d)KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO：82)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)AATFLAD(SEQ ID NO：63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHYYSTPYT(SEQ ID NO：64)的CDR L3氨基酸序列。
21.根据权利要求1至17中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述掩蔽部分包含重链可变区，所述重链可变区包含：
(a)SYGVS(SEQ ID NO：58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)WINTETGEPRYTDDFTG(SEQ ID NO：84)的CDR H2氨基酸序列；
(c)GITTVVDDYYAMDY(SEQ ID NO：60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：
(d)KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO：82)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)AATFLAD(SEQ ID NO：63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHYYSTPYT(SEQ ID NO：64)的CDR L3氨基酸序列。
22.根据权利要求1至17中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述掩蔽部分包含重链可变区，所述重链可变区包含：
(a)SYGVS(SEQ ID NO：58)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
(b)WINTETGEPRYTQGFKG(SEQ ID NO：86)的CDR H2氨基酸序列；
(c)GITTVVDDYYAMDY(SEQ ID NO：60)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：
(d)KSSKSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO：82)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
(e)AATFLAD(SEQ ID NO：63)的CDR L2氨基酸序列；和
(f)QHYYSTPYT(SEQ ID NO：64)的CDR L3氨基酸序列。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述蛋白酶可切割的接头包含至少一个蛋白酶识别序列。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述蛋白酶识别序列选自由以下项组成的组：
(a)RQARVVNG(SEQ ID NO：100)；
(b)VHMPLGFLGPGRSRGSFP(SEQ ID NO：101)；
(c)RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(SEQ ID NO：102)，其中X为任何氨基酸；
(d)RQARVVNGVPLSLYSG(SEQ ID NO：103)；
(e)PLGLWSQ(SEQ ID NO：104)；
(f)VHMPLGFLGPRQARVVNG(SEQ ID NO：105)；
(g)FVGGTG(SEQ ID NO：106)；
(h)KKAAPVNG(SEQ ID NO：107)；
(i)PMAKKVNG(SEQ ID NO：108)；
(j)QARAKVNG(SEQ ID NO：109)；
(k)VHMPLGFLGP(SEQ ID NO：110)；
(l)QARAK(SEQ ID NO：111)；
(m)VHMPLGFLGPPMAKK(SEQ ID NO：112)；
(n)KKAAP(SEQ ID NO：113)；和
(o)PMAKK(SEQ ID NO：114)。
25.根据权利要求23或24所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述蛋白酶可切割的接头包含蛋白酶识别序列PMAKK(SEQ ID NO：114)。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述第二抗原结合部分能够与FolR1结合并包含重链可变区，所述重链可变区包含：
a)NAWMS(SEQ ID NO：54)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
b)RIKSKTDGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：55)的CDR H2氨基酸序列；和
c)PWEWSWYDY(SEQ ID NO：56)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：
d)GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：20)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
e)GTNKRAP(SEQ ID NO：21)的CDR L2氨基酸序列；和
f)ALWYSNLWV(SEQ ID NO：22)的CDR L3氨基酸序列。
27.根据权利要求1至21中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述第二抗原结合部分能够与TYRP1结合并包含重链可变区，所述重链可变区包含：
a)DYFLH(SEQ ID NO：24)的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列；
b)WINPDNGNTVYAQKFQG(SEQ ID NO：25)的CDR H2氨基酸序列；和
c)RDYTYEKAALDY(SEQ ID NO：26)的CDR H3氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含：
d)RASGNIYNYLA(SEQ ID NO：28)的轻链(CDR L)1氨基酸序列；
e)DAKTLAD(SEQ ID NO：29)的CDR L2氨基酸序列；和
f)QHFWSLPFT(SEQ ID NO：30)的CDR L3氨基酸序列。
28.一种能够可逆地隐蔽分子的抗CD3抗原结合位点的独特型特异性多肽，其中所述独特型特异性多肽包含与选自由SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：85组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与选自由SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：81组成的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
29.根据权利要求28所述的独特型特异性多肽，其中所述独特型特异性多肽包含与SEQID NO：79至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQID NO：80至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
30.根据权利要求28所述的独特型特异性多肽，其中所述独特型特异性多肽包含与SEQID NO：79至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQID NO：81至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
31.根据权利要求28所述的独特型特异性多肽，其中所述独特型特异性多肽包含与SEQID NO：83至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQID NO：81至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
32.根据权利要求28所述的独特型特异性多肽，其中所述独特型特异性多肽包含与SEQID NO：85至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的重链可变区序列，以及与SEQID NO：81至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的轻链可变区序列。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的独特型特异性多肽，其中所述独特型特异性多肽为scFv。
34.根据权利要求28至33中任一项所述的独特型特异性多肽，其中所述独特型特异性多肽通过接头共价连接至所述分子。
35.根据权利要求34所述的独特型特异性多肽，其中所述接头为肽接头。
36.根据权利要求34或35所述的独特型特异性多肽，其中所述接头为蛋白酶可切割的接头。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的独特型特异性多肽，其中所述肽接头包含至少一个蛋白酶识别位点。
38.根据权利要求37所述的独特型特异性多肽，其中所述蛋白酶识别序列选自由以下项组成的组：
(a)RQARVVNG(SEQ ID NO：100)；
(b)VHMPLGFLGPGRSRGSFP(SEQ ID NO：101)；
(c)RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(SEQ ID NO：102)，其中X为任何氨基酸；
(d)RQARVVNGVPLSLYSG(SEQ ID NO：103)；
(e)PLGLWSQ(SEQ ID NO：104)；
(f)VHMPLGFLGPRQARVVNG(SEQ ID NO：105)；
(g)FVGGTG(SEQ ID NO：106)；
(h)KKAAPVNG(SEQ ID NO：107)；
(i)PMAKKVNG(SEQ ID NO：108)；
(j)QARAKVNG(SEQ ID NO：109)；
(k)VHMPLGFLGP(SEQ ID NO：110)；
(l)QARAK(SEQ ID NO：111)；
(m)VHMPLGFLGPPMAKK(SEQ ID NO：112)；
(n)KKAAP(SEQ ID NO：113)；和
(o)PMAKK(SEQ ID NO：114)。
39.根据权利要求37所述的独特型特异性多肽，其中所述蛋白酶可切割的接头包含蛋白酶识别序列PMAKK(SEQ ID NO：114)。
40.根据权利要求28至39中任一项所述的独特型特异性多肽，其中所述独特型特异性多肽为T细胞活化双特异性分子的一部分。
41.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至27中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或根据权利要求28至40中任一项所述的独特型特异性多肽以及药用载体。
42.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至27中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性抗原结合分子或根据权利要求28至40中任一项所述的独特型特异性多肽。
43.一种载体，特别是表达载体，其包含根据权利要求42所述的多核苷酸。
44.一种宿主细胞，其包含根据权利要求42所述的多核苷酸或根据权利要求43所述的载体。
45.一种产生蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的方法，其包括以下步骤：a)在适合于表达所述蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子的条件下培养根据权利要求44所述的宿主细胞，以及b)回收所述蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。
46.根据权利要求1至27中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子、根据权利要求28至40中任一项所述的独特型特异性多肽或根据权利要求41所述的药物组合物，其用作药物。
47.根据权利要求46所述使用的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子，其中所述药物用于在个体中治疗癌症或延缓其进展、治疗免疫相关疾病或延缓其进展、或者增强或刺激免疫应答或功能。
48.根据权利要求1至27中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子或根据权利要求28至40中任一项所述的独特型特异性多肽用于制备药物的用途，所述药物用于治疗疾病。
49.根据权利要求48所述的用途，其中所述疾病为癌症。
50.一种治疗个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含根据权利要求1至28中任一项所述的蛋白酶可活化的T细胞活化双特异性分子。
51.根据权利要求50所述的方法，其用于在个体中治疗癌症或延缓其进展、治疗免疫相关疾病或延缓其进展、或者增强或刺激免疫应答或功能。
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