KR20230025783A - 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

일반적으로, 본 발명은 면역 세포의 활성화 및 특이적 표적 세포로의 전향을 위한 신규한 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자에 관한 것이다. 이에 더하여, 본 발명은 상기 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 생산하기 위한 방법, 및 질환의 치료에서 상기 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자
일반적으로, 본 발명은 면역 세포의 활성화 및 특이적 표적 세포로의 전향을 위한 신규한 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자에 관한 것이다. 이에 더하여, 본 발명은 상기 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 생산하기 위한 방법, 및 질환의 치료에서 상기 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다.
다양한 임상적 세팅에서 개별 세포 또는 특정한 세포 유형의 선별적 파괴가 종종 바람직하다. 예를 들면, 암 요법의 주요한 목적은 건강한 세포와 조직을 무손상 및 손상되지 않은 상태로 남겨두면서 종양 세포를 특이적으로 파괴하거나, 특이적 표면 항원에 의해 확인된 일정한 세포 부분집합을 파괴하는 것이다.
이것을 달성하는 매력적인 방식은 종양 세포를 공격하고 파괴하기 위한 면역 효과기 세포 예컨대 자연 킬러(NK) 세포, 단핵구/대식세포 또는 세포독성 T 림프구(CTL)를 모집함으로써, 관심되는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 것이다.
표적 세포의 면역 효과기 세포 매개된 사멸 또는 고갈을 유도하기 위한 한 가지 방식은 IgG1 아이소타입의 ADCC-적격성 항체뿐만 아니라 증강된 ADCC 효과기 기능을 갖는 항체를 통한 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC) 또는 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP)을 통해 이루어진다(Zahavi et al, AntibodyTherapeutics, 1, 7-12 (2018)). 대안으로 T 세포는 표적 세포의 사멸을 위해, 표적 세포 상에서 표면 항원에 결합하도록 설계되고 제2 결합 모이어티를 갖는(T 세포) 이중특이적 항체를 통해, T 세포 수용체(TCR) 복합체의 활성화, 불변 성분으로 모집될 수 있다(Clynes and Desjarlais, Annu Rev Med 70:427-450 (2019)). BiTE(이중특이적 T 세포 인게이저)(Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)), 디아바디(Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)), DART(이중 친화성 재표적화) (Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)) 또는 이른바 2+1 T 세포 이중특이적 항체(TCB)(Bacac et al., Clin Cancer Res 24, 4785-4797 (2018))를 비롯한 여러 이중특이적 형식이 개발되었고, T 세포 매개된 면역요법에 대한 그들의 적합성이 조사된다.
개발 중인 다양한 형식은 면역요법에서 면역 세포 전향 및 활성화에 기인한 높은 잠재력을 보여준다. 지금까지, 개발된 이중특이적 항체는 항상, 관심되는 원하는 항원과 직접적으로 맞물리고, 그것에 의하여 표적 세포 및 CTL을 연결하여 표적 세포 용해를 야기한다. 이들 이중특이적 항체 형식은 독성, 적용가능성 및 생성력에 관련된 도전에 직면한다. 게다가, 각각의 단일 표적(조합)에 대해, 각 표적에 대해 특이적인 개별 분자가 생성되어야 한다. 항체 및 이들의 유도체의 치료적 유용성은 T 세포 인게이저로서 기능에 한정되지 않을 뿐만 아니라 저해 또는 활성 관문의 조정에서 적용을 발견한다. 예시적인, 면역 관문 저해 항체를 사용하는 것은 여러 적응증에서 지속적 반응을 보여주었다(Hodie et al. N Engl J Med.; 363(8):711-23. (2010); Prieto PA, et al. Clin cancer Res.;18:2039-2047 (2012)). 게다가, 좀 더 최근에, T 세포 이중특이적 항체의 활성이 CD28의 활성화(Skokos et al., Sci Trans Med 12(525):1-14 (2020)) 또는 4-1BB 신호전달(Claus et al., Sci Trans Med 11(496), eaav5989 (2019))을 통한 T 세포 상에서 이른바 동시자극성 경로를 활성화하는 이중특이적 작용제에 의해 더욱 증강될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
현재의 성공 이외에, 요법은 복수의 상이한 항원을 표적으로 하는 그들의 유연성에서, 또한, 1회의 적용에서 조합되는 NK 또는 CTL 기능을 선택적으로 활용하는 능력에서 한정된다.
면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티; 및
(b) 면역 활성화 모이어티를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 본원에서 제공된다.
한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 Fc 수용체에 결합을 감소시키고/시키거나 효과기 기능을 감소시킨다.
한 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는
(c) 반감기 연장 Fc 도메인을 추가로 포함하고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 Fc에 결합을 감소시킨다. 한 구체예에서, 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인은 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성된다.
한 구체예에서, 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인, 특이적으로 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인이다.
한 구체예에서, 표적 Fc 도메인은 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다.
한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다.
한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 Fc 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트의 경우에서와 같이 동일한 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트에서 아미노산은 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트와 비교하여 동일한 위치에서 상이한 아미노산으로 치환된다.
한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 Fc 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시킨다.
한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 233(카밧(Kabat) EU 색인에 따른 넘버링), 234, 235, 238, 253, 265, 269, 270, 297, 310, 331, 327, 329 및 435로 구성된 목록으로부터 선택되는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 233(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), 234, 235, 238, 253, 265, 269, 270, 297, 310, 331, 327, 329 및 435로 구성된 목록으로부터 선택되는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 글리신(G) 이외의 아미노산에 의한 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서, 아르기닌(R), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 구성된 목록으로부터 선택되는 아미노산에 의한 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아르기닌(R)에 의한 치환을 포함한다.
도 1. 본원 발명의 개념의 도해. 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함하는 표적화 항체는 인간 요법을 위한 표준 재고 분자의 다능한 세트를 생성하기 위해 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자와 병용된다. 표적화 항체는 자신의 Fc 도메인(본원에서 표적 Fc 도메인으로서 지칭됨)에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 이런 아미노산 치환(들)(이하에서 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트로서 지칭됨)을 포함하는 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 이하에서 Fc 도메인 결합 모이어티로서 지칭되는 항원 결합 모이어티를 통해 표적화 항체(하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는)에 특이적으로 결합할 수 있다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 면역 활성화 모이어티(예컨대 예를 들면 CD3, CD28 또는 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티) 및/또는 예를 들면 사이토카인(예컨대 예를 들면 IL2) 및/또는 동시자극성 리간드(예컨대 예를 들면 4-1BBL)를 추가로 포함한다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 이러한 면역 활성화 모이어티를 통해 면역 세포(예를 들면, T 세포)를 활성화할 수 있다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 또한, Fc 도메인을 포함할 수 있는데, 이런 Fc 도메인은 이하에서 반감기 연장 Fc 도메인(표적 Fc 도메인과 식별하기 위해)으로서 지칭된다. 반감기 연장 Fc 도메인 역시 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들면 효과기 기능을 감소시키기 위해)을 포함할 수 있는데, 이런 아미노산 치환(들)은 이하에서 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트(하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트와 식별하기 위해)로서 지칭된다. 다른 (동일한) 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자에 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 결합을 방지하기 위해, Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 없다. 이러한 개념에서, 면역 세포를 발동하는 항체 요법은 필요한 효과기 기능의 관점으로부터 및/또는 치료 동안 시간의 추이에서 특이적으로 적응될 수 있다. 도 43은 아래에 제공된 예시적인 치료적 도구 상자의 도해를 보여준다.
도 2. 본원 발명의 (다중특이적) 항체의 예시적인 입체형상. (a, d) "1+1 CrossMab" 분자의 도해. (b, e) Crossfab와 Fab 구성요소의 대안적 순서("반전됨")를 갖는 "2+1 IgG Crossfab" 분자의 도해. (c, f) "2+1 IgG Crossfab" 분자의 도해. (g, k) Crossfab와 Fab 구성요소의 대안적 순서("반전됨")를 갖는 "1+1 IgG Crossfab" 분자의 도해. (h, l) "1+1 IgG Crossfab" 분자의 도해. (i, m) 2개의 CrossFab를 갖는 "2+1 IgG Crossfab" 분자의 도해. (j, n) 2개의 CrossFab 및 Crossfab와 Fab 구성요소의 대안적 순서("반전됨")를 갖는 "2+1 IgG Crossfab" 분자의 도해. (o, s) "Fab-Crossfab" 분자의 도해. (p, t) "Crossfab-Fab" 분자의 도해. (q, u) "(Fab)2-Crossfab" 분자의 도해. (r, v) "Crossfab-(Fab)2" 분자의 도해. (w, y) "Fab-(Crossfab)2" 분자의 도해. (x, z) "(Crossfab)2-Fab" 분자의 도해. ++, --: CH1과 CL 도메인 내에 임의적으로 도입된 반대 전하의 아미노산. Crossfab 분자는 VH와 VL 영역의 교환을 포함하는 것으로 묘사되지만, - 전하 변경이 CH1과 CL 도메인 내에 도입되지 않는 양상에서 - CH1과 CL 도메인의 교환을 대안적으로 포함할 수도 있다.
도 3. 포획된 재조합 인간 Fcg 수용체에 huIgG1 P329x 변이체의 결합. (a) 설정; 재조합 FcgR이 칩 표면 상에 고정된 항-His 항체에 의해 포획된다. 제2 단계에서, 150, 300 및 600 nM의 농도에서 huIgG1 P329x 변이체가 주입되고 FcgR과의 상호작용이 분석된다. (b) huFcgRIa에 huIgG1 P329x 변이체의 결합을 보여주는 센서그램. (c) huFcgRIIa에 huIgG1 P329x 변이체의 결합을 보여주는 센서그램. (d) huFcgRIIb에 huIgG1 P329x 변이체의 결합을 보여주는 센서그램. (e) huFcgRIIIa에 huIgG1 P329x 변이체의 결합을 보여주는 센서그램.
도 4. 항 P329G 항체에 huIgG1 P329x LALA 변이체의 결합. (a) 검정의 설정; 항-P329G(M-1.7.24) 항체가 센서 칩의 표면에 연계되었다. 제2 단계에서, huIgG1 P329x 변이체가 500 nM의 농도로 주입되었다(삼중으로 실행됨). HuIgG1 P329G가 양성 대조로서 사용되었다. (b) 항-P329G(M-1.7.24) 항체에 대한 huIgG1 P329L의 상호작용을 보여주는 센서그램(삼중). (c) 항-P329G(M-1.7.24) 항체에 대한 huIgG1 P329I의 상호작용을 보여주는 센서그램(삼중으로 실행됨). (d) 항-P329G(M-1.7.24) 항체에 대한 huIgG1 P329R의 상호작용을 보여주는 센서그램(삼중으로 실행됨). (e) 항-P329G(M-1.7.24) 항체에 대한 huIgG1 P329A의 상호작용을 보여주는 센서그램(삼중으로 실행됨).
도 5. (a) 실시예에서 사용되는 T 세포 이중특이적 항체 (TCB) 분자의 개략적 도해. 모든 검사된 TCB 항체 분자는 전하 변경(CD3 결합체에서 VH/VL 교환, 표적 세포 항원 결합체에서 전하 변경, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K)을 갖는 "2+1 IgG CrossFab, 반전됨"으로서 생산되었다. (b-e) TCB의 조립을 위한 구성요소: CH1과 CL에서 전하 변경을 갖는 항-TYRP1 Fab 분자의 경쇄(b), 항-CD3 교차 Fab 분자의 경쇄(c), Fc 영역에서 노브 및 PG LALA 돌연변이를 갖는 중쇄(d), Fc 영역에서 홀 및 PG LALA 돌연변이를 갖는 중쇄(e).
도 6. 실시예 3에서 사용되는 표면 플라스몬 공명(SPR) 설정의 개략적 도해. C1 센서칩에 연계된 항-PG 항체. 인간 및 시노몰구스 CD3(Fc 영역에 융합됨)이 TCB에서 항-CD3 항체의 CD3과의 상호작용을 분석하기 위해 표면 위에 통과된다.
도 7. 최적화된 항-CD3 항체를 내포하는 TCB가 CHO-K1 TYRP1 클론 76을 표적 세포로서 사용하여 Jurkat NFAT 리포터 검정에서 검사되었다. CD3본래를 내포하는 TCB와의 비교가 실행되었다. 처리 시에 4 시간(a) 및 24 시간(b) 후 발광을 계측함으로써, Jurkat NFAT 리포터 세포의 활성화가 결정되었다.
도 8. 최적화된 항-CD3 항체 또는 부모 결합체 CD3본래 중 어느 하나를 내포하는 TCB로 치료될 때, 건강한 공여자로부터 획득된 PBMC를 사용하여, 흑색종 세포주 M150543의 종양 세포 사멸이 평가되었다. 24 시간(a) 및 48 시간(b) 후 LDH 방출의 정량에 의해 종양 세포 사멸이 계측되었다.
도 9. CD8 T 세포(a, b) 상에서 및 CD4 T 세포(c, d) 상에서 CD25 및 CD69 상향조절이 표적 세포로서 M150543 흑색종 세포주의 존재하에, 최적화된 항-CD3 항체 또는 부모 결합체 CD3본래 중 어느 하나를 내포하는 TCB로 치료된 건강한 공여자로부터 획득된 PBMC에 대해 분석되었다. 48 시간 후 유세포분석에 의해 분석이 실행되었다.
도 10. CD8(a) 상에서 및 CD4 T 세포(b) 상에서 CD25 발현이 종양 표적 세포의 부재에서, 최적화된 항-CD3 항체 또는 부모 결합체 CD3본래 중 어느 하나를 내포하는 TCB로 치료된 건강한 공여자로부터 획득된 PBMC에 대해 분석되었다. 48 시간 후 유세포분석에 의해 분석이 실행되었다.
도 11. (a) 실시예 19에서 생성된 일가 IgG 분자의 개략적 도해. 일가 IgG 분자는 CD3 결합체에서 VH/VL 교환을 갖는 인간 IgG1로서 생산되었다. (b-e) 일가 IgG의 조립을 위한 구성요소: 항-CD3 교차 Fab 분자의 경쇄(b), Fc 영역에서 노브 및 PG LALA 돌연변이를 갖는 중쇄(c), Fc 영역에서 홀 및 PG LALA 돌연변이를 갖는 중쇄(d).
도 12. (a) 본원 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(TCB)의 예시적인 입체형상. 항-P329G x CD3 1+1 보편적 TCB(uTCB)의 도해. (b) 종양 표적화 IgG의 P329G 돌연변이 및 T 세포 상에서 T 세포 수용체(TCR)에 1+1 uTCB의 결합 방식의 예시적인 입체형상. ++, --: CH와 CL 도메인 내에 도입된 반대 전하의 아미노산.
도 13. (a) 본원 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(TCB)의 예시적인 입체형상. 항-P329G x CD3 2+1 보편적 TCB(uTCB)의 도해. (b) 종양 표적화 IgG의 P329G 돌연변이 및 T 세포 상에서 T 세포 수용체(TCR)에 2+1 uTCB의 결합 방식의 예시적인 입체형상. 이러한 2+1 uTCB 형식은 P32G 돌연변이를 소유하는 2개의 종양 표적화 항체에 동시에 결합할 수 있다. ++, --: CH와 CL 도메인 내에 도입된 반대 전하의 아미노산.
도 14는 항-CD3 효과기 모이어티를 갖는 상이한 면역 활성화 Fc 결합 분자의 계통도를 묘사한다(다른 효과기 모이어티가 동일한 형식에서 사용될 수 있다, 다시 말하면, 항-CD3 효과기 모이어티, 예를 들면, 항-CD28, 항-4-1BB를 대체할 수 있다). 반감기 연장 Fc 도메인은 P329x 돌연변이를 포함하고, x는 글리신(G) 이외의 아미노산이다. 14a: 1+1 형식, 항-P329G, 교차된 항-CD3, 전하 변이체 KK/EE, P329x, LALA, 노브/홀. 14b: 고전적 2+1 형식, 항-P329G, 교차된 항-CD3, 전하, P329x, LALA, 노브/홀. 14c/d: 반전된 2+1 형식, 항-P329G, 교차된 항-CD3, 전하, P329x, LALA, 노브/홀.
도 15. a) 항-P329G(VH3VL1) x CD3(CH2527) 1+1 TCB는 고정된 인간 CD3 엡실론-델타-Fc 및 hu Fc(P329G)에 동시에 결합할 수 있다; b) 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 1+1 TCB는 고정된 인간 CD3 엡실론-델타-Fc 및 hu Fc(P329G)에 동시에 결합할 수 있다; c) 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB는 고정된 인간 CD3 엡실론-델타-Fc 및 hu Fc(P329G)에 동시에 결합할 수 있다. 삼중 주입.
도 16. 상이한 농도의 항-FolR1(6D5) P329G LALA huIgG1 항체와 병용으로 상이한 농도의 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB에 의한 T 세포의 동역학적 활성화. Jurkat-NFAT 리포터 검정을 사용한, CD3 하류 신호전달의 강도의 정량에 의해 평가됨. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고, 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 17: 상이한 농도의 항-CD20(GA101) P329G LALA huIgG1 항체와 병용으로 상이한 농도의 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB에 의한 T 세포의 동역학적 활성화. Jurkat-NFAT 리포터 검정을 사용한, CD3 하류 신호전달의 강도의 정량에 의해 평가됨. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고, 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 18. 상이한 농도의 항-FAP(4B9) P329G LALA huIgG1 항체와 병용으로 상이한 농도의 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB에 의한 T 세포의 동역학적 활성화. Jurkat-NFAT 리포터 검정을 사용한, CD3 하류 신호전달의 강도의 정량에 의해 평가됨. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고, 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 19. 항-CD20(GA101) P329G LALA huIgG1 항체와 병용으로 변하는 농도의 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB에 의한 T 세포의 활성화. 표적 세포로서, CD20+ z-138(도 6a) 또는 CD20+ SU-DHL-4 세포 중 어느 한 가지가 사용되었다. Jurkat-NFAT 리포터 검정을 사용한, CD3 하류 신호전달의 강도의 정량에 의해 평가됨. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고, 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 20. 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB와 병용으로, P329G 돌연변이를 갖는 종양 표적화 항-CD20(GA101) 항체의 존재하에 T 세포의 특이적, 용량 의존성 활성화. 항-CD20 야생형 huIgG1 또는 항-CD20 LALA 돌연변이된 huIgG1은 T 세포를 활성화시키지 못한다. Jurkat-NFAT 리포터 검정을 사용한, CD3 하류 신호전달의 강도의 정량에 의해 평가됨. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고, 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 21. 종양 표적화 항-EpCAM(도 21a), 항-STEAP(도 21b) 또는 항-FAP(4B9)(도 21c) P329G LALA huIgG1과 병용으로 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB의 존재하에 유착성 종양 세포의 표적 세포 수의 감소. 시간의 추이에서 적색 핵 세포 수의 정량에 의해 평가됨. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고, 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 22. 상이한 uTCB 형식에 의한 T 세포의 활성화. 뮤린 또는 인간화 P329G 결합체 및 상이한 CD3 결합체를 갖는 1+1 uTCB 또는 2+1 uTCB. Jurkat-NFAT 리포터 검정을 사용한, CD3 하류 신호전달의 강도의 정량에 의해 평가됨. 표적 세포로서, FolR1+ HeLa 세포(도 22a) 또는 CD19+ SU-DHL-4 세포(도 22b) 중 어느 한 가지가 사용되었다. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고, 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 23. 인간 PBMC 및 인간화 P329G 결합체를 갖는 1+1 uTCB 또는 2+1 uTCB에서 uTCB를 사용한 FolR1+ HeLa 표적 세포 용해(E:T 비율 5:1). uTCB 및 P329G LALA IgG1의 비율은 1:2이었다. 종양 세포 용해가 유산 탈수소효소(LDH) 방출의 열량측정 정량에 의해 5.5 시간, 20 시간 및 42 시간 후 평가되었다. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고, 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 24. 인간 PBMC 및 인간화 P329G 결합체를 갖는 1+1 uTCB 또는 2+1 uTCB에서 uTCB(E:T 비율 5:1) 및 CD3 결합체 P035.093을 사용한 CD19+ Nalm 6 표적 세포 용해. uTCB 및 P329G LALA IgG1의 비율은 1:2이었다. 종양 세포 용해가 유산 탈수소효소(LDH) 방출의 열량측정 정량에 의해 5.5 시간, 20 시간 및 42 시간 후 평가되었다. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고, 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 25. 항-PG 및 항-CD28 모이어티를 포함하는 면역 활성화 Fc 결합 분자의 도해.
도 26. 고정된 항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412_var15_교차됨) 1+1은 인간 IgG (P329G) 및 인간 CD28-Fc에 동시에 결합할 수 있다. 중복 주입.
도 27. CHO 형질감염체 세포에서 과다발현된 인간 CD28에 대한 이중특이적 항원 결합 분자의 결합 분석. SD와 함께 삼중물로부터 상대적 중앙 형광 값(MFI)이 묘사된다. 결합의 EC50 값이 GraphPadPrism에 의해 계산되었다.
도 28. 발광에 의해 결정된 대로, 4 시간의 배양 후 IL2-리포터 세포 검정. 25,000개 IL2-리포터 효과기 세포가 증가하는 농도의 PG-CD28(8.4 pM - 34.4 nM)의 존재 또는 부재에서 625 pM의 고정된 농도의 CD3 IgG(PGLALA 내포 Fc)와 함께 배양되었다. 종양 표적의 부재로 인해 이러한 검정 설정에서 교차연결되지 않는 종양 표적화 CD28 분자인 PG-CD28이 대조로서, 아이소타입 대조(PGLALA 내포 Fc 포함)의 존재하에 포함되었다. 상대적 발광(RLU)이 4 시간 후 Jurkat 활성화의 직접적인 치수로서 결정되었다. SD와 함께 삼중물로부터 RLU 값이 묘사된다.
도 29. (a)는 IL2v(사이토카인) 효과기 모이어티를 갖는 면역 활성화 Fc 결합 분자의 계통도를 묘사한다(b) 항-P329G(M-1.7.24) x IL2v hugG1은 고정된 huIL2R-Fc 및 hu Fc(P329)에 동시에 결합할 수 있다. 삼중 주입 (c) IL-2v 기초된 분자에 12 분 노출 시에 인간 PD1+ CD4 T 세포에서 STAT5-P의 빈도로서 묘사된 IL-2 신호전달(STAT5-P). 2명의 공여자의 평균 ± SEM. (d) IL-2v 기초된 분자에 12 분 노출 시에 인간 PD1+ CD4 T 세포에서 STAT5-P의 MFI로서 묘사된 IL-2 신호전달(STAT5-P). 2명의 공여자의 평균 ± SEM.
도 30. 일가 P329G 표적화 분할 삼합체성 인간 4-1BB 리간드의 조립을 위한 구성요소. a) 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된 이합체성 리간드. b) 인간 IgG1-CH1 도메인에 융합된 단량체성 리간드.
도 31. 항-P329G x 4-1BBL huIgG1.* 하전된 잔기로 또한 명명되는, 하전된 잔기를 갖는 CH-CL 교차를 내포하는 일가 P329G 표적화 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 Fc(kih) LALA 융합.
도 32. hu4-1BB 및 huIgG1-P329G에 항-P329G(M-1.7.24) x 4-1BBL huIgG1의 동시 결합. a) 설정; b) hu4-1BB-Fc(kih) 및 Fc 내에 P329G 돌연변이를 내포하는 인간 IgG1에 항-P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1의 동시 결합. 복제물이 도시된다.
도 33. B 세포 고갈된 PBMC가 글로피타맵(CD20-TCB, 1 nM), 항-P329G x 4-1BBL (1nM) 또는 둘 모두의 조합의 존재하에 3일 동안 WSU DLCL2와 함께 배양되었다. 종양 세포 용해가 LDH 방출 (왼쪽)에 의해 결정되었고, T 세포 활성화가 유세포분석법(오른쪽, 실례: CD4+ T 세포, 3일 자, 중앙 형광 강도)에 의해 결정되었다.
도 34. 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항-4-1BB Fab 단편(4-1BB에 이가 결합) 및 자체의 중쇄의 C 말단에서 4-1BB Fab 단편의 중쇄 중에서 하나의 N 말단에 융합되는 1개의 항-P329G 교차-Fab 단편(VH와 VL 영역이 교환되는 Fab 단편)을 포함하는 huIgG1 LALA 형식이다. 이러한 형식은 본원에서 2+1 형식으로 명명된다. 큰 검은색 반점은 노브 인투 홀 돌연변이를 상징하고, 반면 CH1/CL 도메인 내에 작은 검은색 반점은 중쇄의 항-4-1BB 경쇄와의 정확한 대합을 향상시키는 아미노산 돌연변이를 상징한다.
도 35. 상이한 검정 설정이 서로 비교되었다. 항-P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1 분자가 Jurkat 리포터 세포주 검정을 사용하여, 이의 기능성에 대해 검사되었다. 이런 이유로 종양 표적(Her2, CEACAM5, FAP) 발현 세포(KPL4, MKN45, NIH/3T3-huFAP 클론 19)가 항-P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1의 존재 또는 부재에서 5 시간 동안, 인간 4-1BB 수용체 발현 Jurkat 리포터 세포(Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2) 및 상이한 농도의 종양 표적(TT) 특이적 인간 IgG1 P329G LALA 항체와 공동배양되었다. 그 후에 검출 용액(One-Glo)을 첨가하고, 루시페라아제 매개된 산화 동안 방출된 광 방출을 계측함으로써 루시페라아제 활성이 계측되었다(도 5a). 이러한 활성은 양성 대조로서 직접적으로 종양 표적화된 TT-4x1BBL huIgG1과 직접적으로 비교되었다(도 5b).
도 36. 항-P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1 및 종양-표적 특이적 huIgG1 P329G LALA 사이에 상이한 비율의 검사. 항-P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1 분자가 Jurkat 리포터 세포주 검정을 사용하여 기능성에 대해 검사되었는데, 여기서 분자들이 용해 상태로 유지되거나 Her2+ KPL4 인간 유방암 세포의 첨가에 의해 교차연결되었다(도 6a). 직접적인 종양 표적화 Her2x4-1BBL huIgG1이 간접적인 교차연결된 항-P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1과 비교되었다. 본원에서 항-Her2 huIgG1 P329G LALA는 종양 표적 Her2 및 항-P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1 사이의 링커로서 역할을 하였는데, 여기서 항-Her2 huIgG1 P329G LALA 및 항-P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1 사이의 비율이 안정되게 유지되었다(도 6a). 동일한 설정이 CEACAM5+ MKN45 위암 세포 및 CEACAM5 특이적 항체로 또한 검사되었다(도 6b).
도 37. 항-P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1 분자가 Jurkat 리포터 세포주 검정을 사용하여 기능성에 대해 검사되었는데, 여기서 분자들이 용해 상태로 유지되거나 Her2+ KPL4 인간 유방암 세포의 첨가에 의해 교차연결되었다(도 7a). 직접적인 종양 표적화 Her2x4-1BBL huIgG1이 간접적인 교차연결된 항-P329G(M-1.7.24)x4-1BBL huIgG1과 비교되었는데, 이것은 1:2 비율로 제공된 항-Her2 특이적 huIgG1 P329G LALA에 의해 연결되고 안정되게 유지되었다. 추가의 비결합(DP47) 분자가 대조로서 포함되었다. 동일한 설정이 CEACAM5+ MKN45 위암 세포(도 7b) 및 FAP+ NIH/3T3-huFAP 클론 19 섬유모세포(도 7c)로 반복되었다.
도 38. (a) 종양 표적화 분자(예를 들면 IgG1, SM)의 P329G 돌연변이에 결합할 수 있는 ADCC 적격성 IgG1 효과기 분자(항-P329G IgG1)의 예시적인 도해. (b) 종양 표적화 IgG의 P329G 돌연변이 및 면역 효과기 세포 상에서 FcγIII에 대한 항-P329G IgG1 효과기 분자의 결합 방식의 예시적인 입체형상.
도 39. P329G LALA 돌연변이를 갖는 종양 표적화 IgG1의 존재하에, 당조작된 Fc(GE)를 갖는 항-P329G(VH3VL1) huIgG1에 의해 매개된 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC). 표적 세포의 유산 탈수소효소(LDH) 방출의 정량에 의해 평가됨. 기술적 삼중물의 평균이 묘사되고, 오차 막대는 SD를 표시한다. 통계학적 분석으로서, 본페로니 교정을 동반한 일원 변량 분석이 수행되었다. p 값으로서, 뉴잉글랜드 저널 오브 메디슨 스타일이 GraphPadPrism 7에서 열거된 바와 같이 사용되었다. *= P ≤ 0.033; **= P ≤ 0.002; ***= P ≤ 0.001을 의미함.
도 40. P329G LALA 돌연변이를 갖는 종양 표적화 IgG1과 병용으로 항-P329G(VH3VL1) huIgG1로 활성화 시에 NK 세포에서 CD16 수용체의 하향조절. 유세포분석법에 의해 평가됨. 기술적 삼중물로부터 평균값이 묘사되고, 오차 막대는 SD를 표시한다. 통계학적 분석으로서, 본페로니 교정을 동반한 일원 변량 분석이 수행되었다. p 값으로서, 뉴잉글랜드 저널 오브 메디슨 스타일이 GraphPadPrism 7에서 열거된 바와 같이 사용되었다. *= P ≤ 0.033; **= P ≤ 0.002; ***= P ≤ 0.001을 의미함.
도 41. P329G LALA 돌연변이를 갖는 종양 표적화 IgG1와 병용으로 항-P329G(VH3VL1) huIgG1로 활성화 시에 NK 세포에서 CD107a의 상향조절. 유세포분석법에 의해 평가됨. 기술적 삼중물로부터 평균값이 묘사되고, 오차 막대는 SD를 표시한다. 통계학적 분석으로서, 본페로니 교정을 동반한 일원 변량 분석이 수행되었다. p 값으로서, 뉴잉글랜드 저널 오브 메디슨 스타일이 GraphPadPrism 7에서 열거된 바와 같이 사용되었다. *= P ≤ 0.033; **= P ≤ 0.002; ***= P ≤ 0.001을 의미함.
도 42. 항-FAP(클론 4B9) 인간 IgG1 P329GLALA 및 항-P329G 인간 IgG1 mAb의 병용만 ADCC 수행능력의 척도인, Jurkat FcγRIIIa 리포터 세포에서 용량 의존성 NFAT 활성화를 유도한다. 각 포인트는 한 가지 실험의 기술적 복제물의 평균값을 나타낸다. 평균의 표준 오차는 오차 막대에 의해 표시된다.
(a) 고정된 농도(10 μg/mL)의 항-FAP(4B9) P329G LALA huIgG1이 8배 감소하는 연속 적정의 항-P329G huIgG1 mAB와 병용되었다. (b) 8배 감소하는 연속 적정의 항-FAP(4B9) P329G LALA huIgG1이 고정된 농도(10 μg/mL)의 항-P329G huIgG1과 병용되었다. 항-P329G huIgG1은 완전히 푸코실화된(삼각형) 및 비푸코실화된(원) 인간 IgG1 아이소타입으로서 검사되었다.
도 43. 아래에 제공된 예시적인 치료적 도구 상자의 도해. 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 (치료적) 표적화 항체는 표적화 항체의 Fc 도메인 내에 P329G 돌연변이에 특이적으로 결합할 수 있는 상이한 면역 활성화 Fc 도메인 결합 모이어티와 병용된다. 제공되는 효과기 기능은 당조작된 Fc 도메인(예를 들면, ADCC), 항-CD3(예를 들면, T 세포 활성화), 4-1BBL 및/또는 항-4-1BB(예를 들면, T 세포 동시자극), 항-CD28(예를 들면, T 세포 동시자극) 및 IL2v(예를 들면 T 세포 증식)을 포함한다. 효과기 기능은 치료적 유익성을 최대화하기 위해, 조합으로 및/또는 시간의 추이에서 최적 농도로 적정될 수 있다.
도 44. PD-1 양성 T 세포의 시스 표적화에 대한 예시적인 입체형상의 도해. PD1에 특이적으로 결합할 수 있고 P329G 돌연변이를 포함하는 표적화 항체가 IL2v 면역 활성화 모이어티를 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자와 병용된다.
도 45. 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc와 함께 상이한 농도의 항-FOLR1 P329G LALA huIgG1(몰 비율 IgG:TCB 2:1)에 의한 T 세포의 동역학적 활성화. 사용된 TCB의 농도: 0 nM(도 45a), 0.05 nM(도 45b), 5 nM(도 45c). HeLa(FOLR1+) 세포가 표적 세포로서 사용되었다. Jurkat-NFAT 리포터 검정을 사용한, CD3 하류 신호전달의 강도의 정량에 의해 평가됨. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고; 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 46. 여러 FOLR1+ 표적 세포주에서, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB LALA Fc와 함께 항-FOLR1 P329G LALA huIgG1(몰 비율 IgG:TCB 2:1)에 의한 T 세포의 활성화. 표적 세포로서, HeLa(도 46a), JAR(도 46b), OVCAR-3(도 46c), SKOV-3(도 46d)이 사용되었다. HeLa(FOLR1+) 세포가 표적 세포로서 사용되었다. Jurkat-NFAT 리포터 검정을 사용한, CD3 하류 신호전달의 강도의 정량에 의해 평가됨. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고; 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 47. LALA Fc 또는 P329R LALA Fc를 내포하는 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB와 함께 항-FOLR1 P329G LALA huIgG1(몰 비율 IgG:TCB 2:1)에 의한 T 세포의 활성화. HeLa(FOLR1+) 세포가 표적 세포로서 사용되었다. Jurkat-NFAT 리포터 검정을 사용한, CD3 하류 신호전달의 강도의 정량에 의해 평가됨. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고; 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 48. LALA Fc 또는 P329R LALA Fc 중 어느 하나를 내포하는 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB와 함께 항-FOLR1 P329G LALA huIgG1(몰 비율 IgG:TCB 2:1)의 존재하에, CD8+ T 세포 상에서 CD25 상향조절에 의해 계측된 일차 인간 T 세포 활성화. 효과기 세포로서, 건강한 공여자로부터 획득된 범 T 세포(도 48a, c) 또는 PBMC(도 b, d) 중 어느 한 가지가 사용되었다. SKOV-3(FOLR1+)(도 48a, b) 또는 표적 세포 없음(도 48c, d) 중 어느 한 가지가 사용되었다. 48 시간 후 유세포분석에 의해 분석이 실행되었다. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고; 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 49. CD3 결합체로서 P035.093, CH2527 또는 클론 22를 갖는, 항-P329G(VH3VL1) x CD3 2+1 TCB P329R LALA Fc와 함께 종양 표적화 P329G LALA huIgG1(몰 비율 IgG:TCB 2:1)에 의한 T 세포의 활성화. 여러 표적 및 여러 표적 세포 상에서 수행됨. 표적 및 표적 세포 쌍으로서, CD19+ SU-DHL-8 세포(도 49a), FOLR1+ HeLa 세포(도 49b), CEA+ MKN-45 세포(도 49c), HER2+ LNCaP 세포(도 49d), STEAP1+ LNCaP 세포(도 49e)가 사용되었다. Jurkat-NFAT 리포터 검정을 사용한, CD3 하류 신호전달의 강도의 정량에 의해 평가됨. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고; 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 50. 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB P329R LALA Fc와 함께 항-FOLR1(도 50a) 또는 항-CEA(도 50b) P329G LALA huIgG1의 존재하에 일차 인간 범 T 세포에 의한 종양 세포 용해의 동역학. 표적 세포로서, HeLa NLR(FOLR1+)(도 50a) 및 MKN-45 NLR(도 50b)이 사용되었다. 시간의 추이에서 적색 핵 세포 수의 정량에 의해 평가됨. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고; 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 51. CD3 결합체로서 P035.093, CH2527 또는 클론 22를 갖는, 항-P329G(VH3VL1) x CD3 2+1 TCB P329R LALA Fc와 함께 항-FOLR1 P329G LALA huIgG1(몰 비율 IgG:TCB 2:1)의 존재하에 일차 인간 범 T 세포에 의한 종양 세포 용해의 동역학. 표적 세포로서, HeLa NLR(FOLR1+)이 사용되었다. 시간의 추이에서 적색 핵 세포 수의 정량에 의해 평가됨. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고; 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 52. CD3 결합체로서 P035.093, CH2527 또는 클론 22를 갖는, 항-P329G(VH3VL1) x CD3 2+1 TCB P329R LALA Fc와 함께 항-FOLR1 P329G LALA huIgG1(몰 비율 IgG:TCB 2:1)의 존재하에, CD8+ T 세포에서 CD69 상향조절에 의해 계측된 일차 인간 T 세포 활성화. 효과기 세포로서, 3명의 건강한 공여자로부터 획득된 범 T 세포가 사용되었다 - 공여자 A(도 52a), 공여자 B(도 52b), 공여자 C(도 52c). HeLa(FOLR1+)가 표적 세포로서 사용되었다. 48 시간 후 유세포분석에 의해 분석이 실행되었다. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고; 오차 막대는 SD를 표시한다.
도 53. 100 nM 항-CEA P329G LALA huIgG1 및 0.5 nM 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB P329R LALA Fc의 존재하에, 동시자극성 분자 항-P329G(VH3VL1) x 4-1BBL LALA huIgG1, 1+1 및 항-P329G(VH3VL1) x CD28 LALA huIgG1, 1+1에 의한 4-1BB 리포터 T 세포의 활성화. SKOV-3 huCEA(CEA+) 세포가 표적 세포로서 사용되었다. Jurkat-NFκB 리포터 검정을 사용한, 4-1BB 하류 신호전달의 강도의 정량에 의해 평가됨. 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고; 오차 막대는 SD를 표시한다.
정의
용어는 하기에서 별도로 규정되지 않으면, 당해 분야에서 일반적으로 사용된 바와 같이 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 분자"는 가장 넓은 의미에서, 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 실례는 면역글로불린 및 이들의 유도체, 예를 들면 단편이다.
본원에서 목적으로 "수용자 인간 프레임워크"는 아래에 규정된 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이것은 아미노산 서열 변화를 내포할 수 있다. 일부 양상에서, 아미노산 변화의 개수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 양상에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열에서 동일하다.
용어 "이중특이적"은 항원 결합 분자가 2개 이상의 구별되는 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하고, 이들은 각각 상이한 항원 결정인자에 대해 특이적이다. 일정한 구체예에서 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결정인자, 특히 2개의 구별되는 세포 상에서 발현되는 2개의 항원 결정인자에 동시에 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "활성화 T 세포 항원"은 항원 결합 분자와의 상호작용 시에 T 세포 활성화를 유도할 수 있는, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 표면 상에서 발현된 항원 결정인자를 지칭한다. 구체적으로, 항원 결합 분자 및 활성화 T 세포 항원의 상호작용은 T 세포 수용체 복합체의 신호전달 캐스케이드를 촉발함으로써 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. 특정한 구체예에서 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 CD3의 엡실론 아단위이다(참조: UniProt 번호 P07766(버전 130), NCBI RefSeq 번호 NP_000724.1; 또는 UniProt 번호 Q95LI5(버전 49), NCBI GenBank 번호 BAB71849.1).
"친화성"은 분자(예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너(예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 별도로 표시되지 않으면, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원(예를 들면, 항체와 항원) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수(KD)에 의해 표현될 수 있다. 친화성은 본원에서 설명된 것들을 비롯한, 당해 분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 계측될 수 있다. 결합 친화성을 계측하기 위한 특정한 예시적이고 모범적인 방법은 하기에서 설명된다.
"친화성 성숙된" 항체는 변경을 갖지 않는 부모 항체와 비교하여, 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)에서 한 가지 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭하는데, 이런 변경은 항원에 대한 항체의 친화성에서 향상을 유발한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포괄하는 것으로 의미된다. 최종 작제물이 원하는 특징, 예를 들면, Fc 수용체에 감소된 결합, 또는 다른 펩티드와의 증가된 연관을 소유한다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합이 만들어질 수 있다. 아미노산 서열 결실과 삽입은 아미노산의 아미노 및/또는 카르복시 말단 결실과 삽입을 포함한다. 특정 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들면 Fc 영역의 결합 특징을 변경하는 목적으로, 비보존성 아미노산 치환, 다시 말하면, 한 가지 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 비-자연 발생 아미노산에 의한, 또는 20개의 표준 아미노산의 자연 발생 아미노산 유도체(예를 들면 4-히드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-히드록실리신)에 의한 대체를 포함한다. 아미노산 돌연변이는 당해 분야에서 널리 공지된 유전학적 또는 화학적 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 유전학적 방법은 특정 부위 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전공학 이외의 방법, 예컨대 화학적 변형에 의해 아미노산의 측쇄 기를 변경하는 방법 또한 유용할 수 있는 것으로 예기된다. 다양한 지정이 동일한 아미노산 돌연변이를 지시하기 위해 본원에서 사용될 수 있다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 사용되고, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체), 항체 단편(이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 실례는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자(예를 들면, scFv 및 scFab); 단일 도메인 항체(dAb); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 항체 단편에 관한 검토를 위해, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)을 참조한다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 상보적인 구역을 포함하는, 항체의 부분을 지칭한다. 항원 결합 도메인은 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역으로 또한 불림)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다.
"항원 결합 부위"는 항원과의 상호작용을 제공하는, 항원 결합 분자의 부위, 다시 말하면, 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들면, 항체의 항원 결합 부위는 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 아미노산 잔기를 포함한다. 선천적 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위를 갖고, Fab 분자는 전형적으로 단일 항원 결합 부위를 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 모이어티"는 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 한 구체예에서, 항원 결합 모이어티는 자신이 부착되는 실체(예를 들면 제2 항원 결합 모이어티)를 표적 부위로, 예를 들면 항원 결정인자를 보유하는 특이적 유형의 종양 세포 또는 종양 간질로 지향시킬 수 있다. 다른 구체예에서 항원 결합 모이어티는 자체의 표적 항원, 예를 들면 T 세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화할 수 있다. 항원 결합 모이어티는 본원에서 더욱 규정된 바와 같은 항체 및 이들의 단편을 포함한다. 특정 항원 결합 모이어티는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 모이어티는 본원에서 더욱 규정되고 당해 분야에서 공지된 바와 같은 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역은 5가지 아이소타입: α, δ, ε, γ, 또는 μ 중 어느 것을 포함한다. 유용한 경쇄 불변 영역은 두 가지 아이소타입: κ 및 λ 중 어느 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결정인자"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이고, 항원 결합 모이어티가 결합하여 항원 결합 모이어티-항원 복합체가 형성되는, 폴리펩티드 거대분자 상에 부위(예를 들면 아미노산의 연속 스트레치 또는 비연속 아미노산의 상이한 영역으로 구성되는 입체형태적 형상)를 지칭한다. 유용한 항원 결정인자는 예를 들면 종양 세포의 표면 상에서, 바이러스-감염된 세포의 표면 상에서, 다른 병든 세포의 표면 상에서, 면역 세포의 표면 상에서, 혈청에서 자유롭게 및/또는 세포외 기질(ECM)에서 발견될 수 있다. 본원에서 항원으로서 지칭되는 단백질은 별도로 표시되지 않으면, 포유동물 예컨대 영장류(예를 들면 인간) 및 설치류(예를 들면 생쥐 및 쥐)를 비롯한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 유래된 단백질의 임의의 선천적 형태일 수 있다. 특정한 구체예에서 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특이적 단백질이 언급되는 경우에, 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 단백질뿐만 아니라 세포 내에서 처리로부터 발생하는 상기 단백질의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, 단백질의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다.
"항체 의존성 세포 매개된 세포독성"("ADCC")은 면역 효과기 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해를 야기하는 면역 기전이다. 표적 세포는 항체 또는 Fc 영역을 포함하는 이들의 유도체가 일반적으로, Fc 영역의 N 말단인 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "감소된 ADCC"는 앞서 규정된 ADCC의 기전에 의해, 표적 세포를 둘러싸는 배지에서 소정의 항체 농도에서 소정의 시점에 용해되는 표적 세포의 숫자에서 감소 및/또는 ADCC의 기전에 의해, 소정의 시점에 소정의 숫자의 표적 세포의 용해를 달성하는 데 필요한, 표적 세포를 둘러싸는 배지에서 항체의 농도에서 증가 중 어느 한 가지로서 규정된다. ADCC에서 감소는 동일한 표준 생산, 정제, 조제 및 저장 방법(이들은 당업자에게 공지된다)을 사용하여 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생산되지만 조작되지 않은 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 상대적이다. 예를 들면, ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 Fc 도메인 내에 포함하는 항체에 의해 매개된 ADCC에서 감소는 Fc 도메인 내에 이러한 아미노산 치환이 없는 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 상대적이다. ADCC를 계측하기 위한 적합한 검정은 당해 분야에서 널리 공지된다(참조: 예를 들면 PCT 공개 번호 WO 2006/082515 또는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831).
항체의 "부류"는 이의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들 중에서 몇몇은 하위부류(아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 나눠질 수 있다. 일정한 양상에서, 항체는 IgG1 아이소타입이다. 일정한 양상에서, 항체는 Fc-영역 효과기 기능을 감소시키기 위한 P329G, L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 IgG1 아이소타입이다. 다른 양상에서, 항체는 IgG2 아이소타입이다. 일정한 양상에서, 항체는 IgG4 항체의 안정성을 향상시키기 위한, 힌지 영역에서 S228P 돌연변이를 갖는 IgG4 아이소타입이다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 두 가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 기원으로부터 유래된 불변 영역" 또는 "인간 불변 영역"은 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 불변 중쇄 영역 및/또는 불변 경쇄 카파 또는 람다 영역을 표시한다. 이런 불변 영역은 인간 또는 인간화 항체에서 사용될 수 있고, 당해 분야에서 널리 알려져 있으며, 예를 들면, Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)에 의해 설명된다(예를 들면 Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788을 또한 참조한다). 본원에서 별도로 특정되지 않으면, 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242에서 설명된 바와 같이, Kabat의 EU 색인으로 또한 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"교차" Fab 분자("Crossfab"로 또한 명명됨)는 Fab 중쇄와 경쇄의 가변 도메인이 교환되는(다시 말하면, 서로 대체되는) Fab 분자인 것으로 의미된다, 다시 말하면, 교차 Fab 분자는 경쇄 가변 도메인 VL 및 중쇄 불변 도메인 1 CH1로 구성되는 펩티드 쇄(VL-CH1, N에서 C 말단 방향으로), 및 중쇄 가변 도메인 VH 및 경쇄 불변 도메인 CL로 구성되는 펩티드 쇄(VH-CL, N에서 C 말단 방향으로)를 포함한다. 명료함을 위해, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인이 교환되는 교차 Fab 분자에서, 중쇄 불변 도메인 1 CH1을 포함하는 펩티드 쇄는 본원에서 교차 Fab 분자의 "중쇄"로서 지칭된다.
작용제, 예를 들면, 약학 조성물의 "효과량"은 원하는 치료적 또는 방지적 결과를 달성하는 데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
"효과기 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인한 생물학적 활성을 지칭하는데, 이들은 항체 아이소타입에 따라서 변한다. 항체 효과기 기능의 실례는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들면, B 세포 수용체)의 하향조절; 및 B 세포 활성화.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조작한다, 조작된, 조작하는"은 펩티드 중추의 임의의 조작, 또는 자연 발생 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 번역후 변형을 포함하는 것으로 고려된다. 가공은 아미노산 서열의 변형, 글리코실화 패턴의 변형, 또는 개별 아미노산의 측쇄 기의 변형뿐만 아니라 이들 접근법의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, Fab 분자 등에 대하여 용어 "제1", "제2" 또는 "제3"은 하나 초과의 각 유형의 모이어티가 있을 때 편의상 식별을 위해 사용된다. 이들 용어의 사용은 만약 명시적으로 진술되지 않으면, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 특정한 순서 또는 배향정위를 부여하는 것으로 의도되지 않는다.
"Fab 분자"는 면역글로불린의 중쇄의 VH와 CH1 도메인("Fab 중쇄") 및 경쇄의 VL과 CL 도메인("Fab 경쇄")으로 구성되는 단백질을 지칭한다.
"융합된"은 구성요소(예를 들면 Fab 분자 및 Fc 도메인 아단위)가 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해, 펩티드 결합에 의해 연결되는 것으로 의미된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일 쇄"는 펩티드 결합에 의해 선형으로 연결되는 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 모이어티 중에서 하나는 단일 쇄 Fab 분자, 다시 말하면 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄가 펩티드 링커에 의해 연결되어 단일 펩티드 쇄을 형성하는 Fab 분자이다. 이와 같은 특정 구체예에서, Fab 경쇄의 C 말단은 단일 쇄 Fab 분자에서 Fab 중쇄의 N 말단에 연결된다.
그것과 대조적으로, "전통적인" Fab 분자는 이의 자연 형식에서, 다시 말하면, 중쇄 가변과 불변 도메인으로 구성되는 중쇄(VH-CH1, N에서 C 말단 방향으로), 및 경쇄 가변과 불변 도메인으로 구성되는 경쇄(VL-CL, N에서 C 말단 방향으로)를 포함하는 Fab 분자인 것으로 의미된다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 선천적 항체 구조와 실제적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본원에서 규정된 바와 같은 Fc 영역을 내포하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 사용된다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 내포하는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 규정하는 데 사용된다. 상기 용어는 선천적 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 비록 IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 변할 수도 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로, Cys226부터, 또는 Pro230부터 중쇄의 카르복실 말단까지 걸쳐있는 것으로 규정된다. 하지만, 숙주 세포에 의해 생산되는 항체는 중쇄의 C 말단으로부터 하나 이상, 특히 1개 또는 2개의 아미노산의 번역후 개열을 겪을 수 있다. 이런 이유로, 전장 중쇄를 인코딩하는 특이적 핵산 분자의 발현에 의해 숙주 세포에 의해 생산되는 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있거나, 이것은 전장 중쇄의 개열된 변이체(본원에서 "개열된 변이체 중쇄"로서 또한 지칭됨)를 포함할 수 있다. 이것은 중쇄의 최종 2개의 C 말단 아미노산이 글리신(G446) 및 리신(K447, Kabat EU 색인에 따른 넘버링)인 경우에 그러할 수 있다. 이런 이유로, Fc 영역의 C 말단 리신(Lys447), 또는 C 말단 글리신(Gly446) 및 리신(K447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. Fc 도메인(또는 본원에서 규정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위)을 포함하는 중쇄의 아미노산 서열은 별도로 표시되지 않으면, C 말단 글리신-리신 디펩티드가 없이 표시된다. 본원 발명의 구체예에서, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원 발명의 구체예에서, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신 잔기(G446, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원 발명의 조성물, 예컨대 본원에서 설명된 약학 조성물은 본원 발명의 항원 결합 분자의 모집단을 포함한다. 항원 결합 분자의 모집단은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 개열된 변이체 중쇄를 갖는 분자를 포함할 수 있다. 항원 결합 분자의 모집단은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 개열된 변이체 중쇄를 갖는 분자의 혼합물로 구성될 수 있고, 이들 항원 결합 분자 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%가 개열된 변이체 중쇄를 갖는다. 본원 발명의 구체예에서, 본원 발명의 항원 결합 분자의 모집단을 포함하는 조성물은 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 갖는 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 항원 결합 분자를 포함한다. 본원 발명의 구체예에서, 본원 발명의 항원 결합 분자의 모집단을 포함하는 조성물은 추가의 C 말단 글리신 잔기(G446, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 갖는 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 포함한다. 본원 발명의 구체예에서, 이런 조성물은 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 분자; 추가의 C 말단 글리신 잔기(G446, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 갖는 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 분자; 및 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 갖는 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 도메인의 아단위를 포함하는 중쇄를 포함하는 분자로 구성되는 항원 결합 분자의 모집단을 포함한다. 본원에서 별도로 특정되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 바와 같이, EU 색인으로 또한 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다(또한 상기 참조). 본원에서 사용된 바와 같이, Fc 도메인의 "아단위"는 이합체성 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중에서 하나, 다시 말하면, 안정되게 자가 결합할 수 있는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들면, IgG Fc 도메인의 아단위는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Fc 도메인 결합 모이어티"는 Fc 도메인에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "반감기 연장 Fc"는 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 내에 포함되는 Fc 도메인(존재하는 경우에)이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "표적 Fc"는 본원 발명의 표적화 항체 내에 포함되는 Fc 도메인이다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양액"은 교체가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 및 이런 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포에는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"가 포함되는데, 이들은 일차 형질전환된 세포 및 계대(passage)의 횟수에 상관없이, 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 부모 세포와 완전하게 동일하지 않을 수도 있으며 돌연변이를 내포할 수도 있다. 최초 형질전환된 세포에 대해 선별검사되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 도메인에 의한 인게이지먼트 이후에, 수용체-보유 세포가 효과기 기능을 수행하도록 자극하는 신호전달 사건을 이끌어 내는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)를 포함한다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 활용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정적으로 배제한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 유래된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), Vols. 1-3의 경우에서와 같은 하위군이다. 한 양상에서, VL의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음의 경우에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 양상에서, VH의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음의 경우에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비인간 CDR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 일정한 양상에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 CDRs의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 항체의 것들에 상응하고, FR의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 임의적으로, 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변성이고 항원 결합 특이성을 결정하는 항체 가변 도메인의 각 영역, 예를 들면 "상보성 결정 영역"("CDR")을 지칭한다.
일반적으로, 항체는 6개의 CDR을 포함한다: VH에서 3개(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), 및 VL에서 3개(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). 본원에서 예시적인 CDR은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)에서 발생하는 초가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)에서 발생하는 CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); 및
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)에서 발생하는 항원 접촉(MacCallum et al. J. Mol . Biol. 262: 732-745 (1996)).
별도로 표시되지 않으면, CDR은 Kabat et al., 위와 같음에 따라서 결정된다. 당업자는 CDR 지정이 Chothia, 위와 같음, McCallum, 위와 같음, 또는 임의의 다른 과학적으로 용인된 명명법 시스템에 따라서 또한 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "면역 활성화 모이어티"는 면역 세포 상에서 항원, 수용체 또는 리간드(또는 활성화를 유도하는 세포의 다른 요소)와의 상호작용 시에 면역 세포(예를 들면 T 세포)의 활성화를 유도하는 하나 이상의 폴리펩티드(들)를 지칭한다. 면역 활성화 모이어티의 실례는 T 세포 수용체 복합체의 신호전달 캐스케이드를 촉발하는 활성화 T 세포 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 분자이다. 특정한 구체예에서 면역 활성화 모이어티는 CD3, 특히 CD3의 엡실론 아단위에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티이다(참조: UniProt 번호 P07766(버전 130), NCBI RefSeq 번호 NP_000724.1; 또는 UniProt 번호 Q95LI5(버전 49), NCBI GenBank 번호 BAB71849.1). 다른 예시적인 면역 활성화 모이어티는 사이토카인(예를 들면 IL2), 동시자극성 T 세포 항원(예를 들면 CD28, 4-1BB)에 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티, 또는 본원에서 설명된 바와 같은 동시자극성 리간드(예를 들면 4-1BBL)이다.
"면역접합체"는 세포독성 작용제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 한 가지 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 순치된 동물(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들면, 인간 및 비인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들면, 생쥐와 쥐)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 양상에서, 개체 또는 피험자는 인간이다.
"단리된" 항체는 이의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 양상에서, 항체는 예를 들면, 전기이동(예를 들면, SDS-PAGE, 등전위 초점(IEF), 모세관 전기이동) 또는 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 결정될 때, 95% 또는 99%보다 높은 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가를 위한 방법에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조한다.
용어 "면역글로불린 분자"는 자연 발생 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들면, IgG 부류의 면역글로불린은 이황화 결합되는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이종사합체성 당단백질이다. N 말단으로부터 C 말단으로, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 영역으로 또한 불리는 가변 도메인(VH), 그 이후에 중쇄 불변 영역으로 또한 불리는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단으로부터 C 말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 영역으로 또한 불리는 가변 도메인(VL), 그 이후에 경쇄 불변 영역으로 또한 불리는 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), 또는 μ(IgM)으로 불리는 5가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있으며, 이들 중에서 일부는 아형, 예를 들면 γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 더욱 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 두 가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다. 면역글로불린은 본질적으로, 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된, 2개의 Fab 분자 및 Fc 도메인으로 구성된다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 상보성 결정 영역(CDR) 이외에 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, CDR과 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2- CDR-H2(CDR-L2)-FR3- CDR-H3(CDR-L3)-FR4.
"Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 연결을 증진하는 변형"은 동종이합체를 형성하는, Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드의 동일한 폴리펩티드와의 연관을 감소시키거나 예방하는 펩티드 중추의 조작 또는 Fc 도메인 아단위의 번역후 변형이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 연결을 증진하는 변형은 특히, 연결하기 원하는 2개의 Fc 도메인 아단위 각각(다시 말하면, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위)에 만들어진 별개의 변형을 포함하고, 이들 변형은 2개의 Fc 도메인 아단위의 연결을 증진하기 위해 서로에 상보적이다. 예를 들면, 연결을 증진하는 변형은 Fc 도메인 아단위의 연결을 각각, 입체적으로 또는 정전으로 우호적으로 만들기 위해, 이들 중에서 하나 둘 모두의 구조 또는 전하를 변경할 수 있다. 따라서, 각각의 아단위(예를 들면 항원 결합 모이어티)에 융합된 추가 구성요소가 동일하지 않다는 의미에서 비동일할 수도 있는, 제1 Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드 및 제2 Fc 도메인 아단위를 포함하는 폴리펩티드 사이에서 (이종)이합체화가 일어난다. 일부 구체예에서 연결을 증진하는 변형은 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이, 특이적으로 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 구체예에서, 연결을 증진하는 변형은 Fc 도메인의 2개의 아단위 각각에서 별개의 아미노산 돌연변이, 특이적으로 아미노산 치환을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 동질성 항체의 모집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 모집단을 구성하는 개별 항체는 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 내포하거나 단일클론 항체 제조물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체(이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 동질성 모집단으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 표시하고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본원 발명에 따른 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 전시 방법, 및 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있는데, 이런 방법 및 단일클론 항체를 만들기 위한 다른 예시적인 방법은 본원에서 설명된다.
"나신 항체"는 이종성 모이어티(예를 들면, 세포독성 모이어티) 또는 방사성 표지에 접합되지 않는 항체를 지칭한다. 나신 항체는 약학 조성물 내에 존재할 수 있다.
"선천적 항체"는 변화하는 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 선천적 IgG 항체는 디설피드 결합되는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이종사합체성 당단백질이다. N 말단으로부터 C 말단으로, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 영역으로 또한 불리는 가변 도메인(VH), 그 이후에 3개의 불변 중쇄 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단으로부터 C 말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 영역으로 또한 불리는 가변 도메인(VL), 그 이후에 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다.
용어 "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 각 뉴클레오티드는 염기, 특이적으로 퓨린- 또는 피리미딘 염기(다시 말하면, 시토신(C), 구아닌(G), 아데닌(A), 티민(T) 또는 우라실(U)), 당(다시 말하면, 데옥시리보오스 또는 리보오스), 및 인산염 기로 구성된다. 종종, 핵산 분자는 염기의 서열에 의해 설명되는데, 여기서 상기 염기는 핵산 분자의 일차 구조(선형 구조)를 나타낸다. 염기의 서열은 전형적으로 5'에서 3'로 나타내진다. 본원에서, 용어 핵산 분자는 예를 들면, 상보성 DNA(cDNA) 및 유전체 DNA를 비롯한 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 특히 전령 RNA(mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태, 및 이들 분자 중에서 두 가지 이상을 포함하는 혼성 중합체를 포괄한다. 핵산 분자는 선형 또는 환상일 수 있다. 이에 더하여, 용어 핵산 분자는 센스와 안티센스 가닥뿐만 아니라 단일 가닥과 이중 가닥 형태 둘 모두를 포함한다. 게다가, 본원에서 설명된 핵산 분자는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 내포할 수 있다. 비-자연 발생 뉴클레오티드의 실례는 유도체화된 당 또는 인산염 중추 연쇄 또는 화학적으로 변형된 잔기를 갖는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함한다. 핵산 분자는 또한, 시험관내에서 및/또는 생체내에서, 예를 들면, 숙주 또는 환자에서 본원 발명의 항체의 직접적인 발현을 위한 벡터로서 적합한 DNA와 RNA 분자를 포괄한다. 이런 DNA(예를 들면, cDNA) 또는 RNA(예를 들면, mRNA) 벡터는 변형되지 않거나 변형될 수 있다. 예를 들면, mRNA는 mRNA가 개체 내로 주입되어 항체가 생체내에서 생성될 수 있도록, RNA 벡터의 안정성 및/또는 인코딩된 분자의 발현을 증강하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다(참조: 예를 들면, Stadler ert al, Nature Medicine 2017, 2017년 6월 12일 온라인 공개됨, doi:10.1038/nm.4356 또는 EP 2 101 823 B1).
본원 발명의 참조 뉴클레오티드 서열과 예를 들면, 적어도 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각 100개 뉴클레오티드마다 5개까지의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 점을 제외하고, 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일하다는 것으로 의도된다. 다시 말하면, 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 획득하기 위해, 참조 서열에서 5%까지의 뉴클레오티드가 결실되거나 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있으며, 또는 참조 서열에서 총 뉴클레오티드 중 5%까지의 숫자의 뉴클레오티드가 참조 서열 내로 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이들 변경은 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 이들 말단 위치 사이의 어딘가 에서 일어날 수 있고, 참조 서열 내에 잔기 사이에서 개별적으로 또는 참조 서열 내에 하나 이상의 인접한 군으로 산재될 수 있다. 현실적인 문제로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 본원 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지는 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 폴리펩티드에 대해 상기 논의된 것들(예를 들면 ALIGN-2)을 전통적으로 사용하여 결정될 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 특정된 핵산 요소로, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 원형자 DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편 내로 통합될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열 중에서, 전사되는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 발현 카세트는 본원 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이들의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
참조 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 및 정렬의 목적으로 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 규정된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign(DNASTAR) 소프트웨어 또는 FASTA 프로그램 패키지를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 대안으로, 동일성 퍼센트 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성될 수 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저술되었고, 소스 코드가 사용자 문서로 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559에 제출되었는데, 여기서 이것은 U.S. Copyright 등록 번호 TXU510087하에 등록되고 WO 2001/007611에서 설명된다.
별도로 표시되지 않으면, 본원에서 목적을 위해, 퍼센트 아미노산 서열 동일성 값은 BLOSUM50 비교 매트릭스를 갖는 FASTA 패키지 버전 36.3.8c 또는 그 이후 버전의 ggsearch 프로그램을 사용하여 생성된다. FASTA 프로그램 패키지는 W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzymol. 266:227- 258; 및 Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36에 의해 저술되었고, www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 또는 www. ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta로부터 공개적으로 가용하다. 대안으로, 국부보다는 전역 정렬이 수행되도록 담보하기 위해 ggsearch(global protein:protein) 프로그램 및 디폴트 옵션(BLOSUM50; 개방: -10; ext: -2; Ktup = 2)을 사용하여, fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi에서 접근 가능한 공개 서버가 서열을 비교하는 데 사용될 수 있다. 퍼센트 아미노산 동일성은 출력 정렬 헤더에서 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합(펩티드 결합으로서 또한 알려져 있음)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성되는 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 두 개 이상의 아미노산의 임의의 쇄을 지칭하고, 특정한 길이의 산물을 지칭하지 않는다. 따라서, 두 개 이상의 아미노산의 쇄을 지칭하는 데 사용되는 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 쇄", 또는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신에, 또는 이들과 교체가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질분해성 개열, 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형을 제한 없이 포함하는, 폴리펩티드의 발현후 변형의 산물을 지칭하는 것으로 의도된다. 폴리펩티드는 자연의 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 지정된 핵산 서열로부터 반드시 번역되는 것은 아니다. 이것은 화학적 합성을 비롯한, 임의의 방식으로 생성될 수 있다. 본원 발명의 폴리펩티드는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상, 또는 2,000개 이상의 아미노산의 크기일 수 있다. 폴리펩티드는 규정된 3차원 구조를 가질 수 있지만, 반드시 이런 구조를 갖는 것은 아니다. 규정된 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 접힘된 것으로 지칭되고, 규정된 3차원 구조를 소유하지 않는 폴리펩티드는 오히려 다수의 상이한 입체형태를 채택할 수 있고 접힘되지 않은 것으로 지칭된다.
용어 "약학 조성물" 또는 "약학적 제제"는 그 안에 내포된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 그런 형태이고, 이러한 약학 조성물이 투여될 개체에게 받아들이기 어려울 정도로 독성인 추가 성분을 내포하지 않는 제조물을 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 개체에게 비독성인, 약학 조성물 또는 제제에서 활성 성분 이외의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 산물의 상업적인 패키지 내에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 지칭하는 데 사용되는데, 이것은 이런 치료 산물의 사용에 관련된 징후, 용법, 용량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 주의사항에 관한 정보를 내포한다.
"감소된 결합", 예를 들면 Fc 수용체에 감소된 결합은 예를 들면 SPR에 의해 계측될 때, 개별 상호작용에 대한 친화성에서 감소를 지칭한다. 명료함을 위해, 상기 용어는 또한, 제로(또는 분석 방법의 검출 한계 미만)까지 친화성의 감소, 다시 말하면, 상호작용의 완전한 소멸을 포함한다. 반대로, "증가된 결합"은 개별 상호작용에 대한 결합 친화성에서 증가를 지칭한다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이고, 원치 않는 또는 비특이적 상호작용으로부터 차별될 수 있다는 것으로 의미된다. 특이적 항원 결정인자에 결합하는 항원 결합 모이어티의 능력은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 또는 당업자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술(BIAcore 기기에서 분석됨)(Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329(2000)) 및 전통적인 결합 검정(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 계측될 수 있다. 한 구체예에서, 관련 없는 단백질에 대한 항원 결합 모이어티의 결합 정도는 예를 들면, SPR에 의해 계측될 때 항원에 대한 항원 결합 모이어티의 결합의 약 10%보다 적다. 일정한 구체예에서, 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티, 또는 상기 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들면 10-8 M 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "T 세포 활성화"는 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현에서 선택되는, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 한 가지 이상의 세포 반응을 지칭한다. 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. T 세포 활성화를 계측하기 위한 적합한 검정은 당해 분야에서 공지되고 본원에서 설명된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들면 종양에서 세포 예컨대 암 세포 또는 종양 간질의 세포의 표면 상에서 제시된 항원 결정인자를 지칭한다. 특정한 구체예에서, 표적 세포 항원은 CD20, 특히 인간 CD20이다(참조: UniProt 번호 P11836).
작용제, 예를 들면, 약학 조성물의 "치료 효과량"은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는 데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 작용제의 치료 효과량은 예를 들면 질환의 부정적인 효과를 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화하거나 예방한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 이의 문법적 변이, 예컨대 "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체에서 질환의 자연 경과를 변경하려는 시도에서 임상적 개입을 지칭하고, 임상 병리의 예방을 위해 또는 임상 병리의 경과 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이 예방, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 향상된 예후를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 양상에서, 본원 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추는 데 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합가(valent)"는 항원 결합 분자 내에 특정된 숫자의 결합 부위의 존재를 표시한다. 따라서, 용어 "항원에 일가 결합"은 항원 결합 분자 내에 항원에 대해 특이적인 하나(및 하나보다 많지 않은) 항원 결합 부위의 존재를 표시한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는 데 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 선천적 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 도메인(각각, VH와 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. (참조: 예를 들면, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 부여하는 데 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각, 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별검사하기 위해, 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 참조: 예를 들면, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신이 연관되는 다른 핵산을 증식할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기 복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 유전체 내로 통합된 벡터를 포함한다. 일정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 주동할 수 있다. 이런 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인터류킨-2" 또는 "IL-2"는 별도로 표시되지 않으면, 포유동물, 예컨대 영장류(예를 들면, 인간) 및 설치류(예를 들면, 생쥐와 쥐)를 비롯한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 선천적 IL-2를 지칭한다. 상기 용어는 처리되지 않은 IL-2뿐만 아니라 세포에서 처리로부터 발생하는 IL-2의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, IL-2의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 예시적인 인간 IL-2의 아미노산 서열은 서열번호 166에서 도시된다. 처리되지 않은 인간 IL-2는 성숙 IL-2 분자에서 부재하는 N 말단 20개 아미노산 신호 펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "IL-2 돌연변이체" 또는 "돌연변이체 IL-2 폴리펩티드"는 전장 IL-2, IL-2의 절두된 형태 및 IL-2가 예컨대 융합 또는 화학적 접합에 의해 다른 분자에 연결되는 형태를 비롯한 다양한 형태의 IL-2 분자의 임의의 돌연변이체 형태를 포괄하는 것으로 의도된다. IL-2와 관련하여 사용될 때 "전장"은 성숙, 자연 길이 IL-2 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 전장 인간 IL-2는 133개의 아미노산을 갖는 분자(참조: 예를 들면 서열번호 166)를 지칭한다. 다양한 형태의 IL-2 돌연변이체는 IL-2의 CD25와의 상호작용에 영향을 주는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 것으로 특징화된다. 이러한 돌연변이는 상기 위치에서 정상적으로 위치되는 야생형 아미노산 잔기의 치환, 결실, 절두 또는 변형을 수반할 수 있다. 아미노산 치환에 의해 획득된 돌연변이체가 선호된다. 별도로 표시되지 않으면, IL-2 돌연변이체는 본원에서 돌연변이체 IL-2 펩티드 서열, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드, 돌연변이체 IL-2 단백질 또는 돌연변이체 IL-2 유사체로서 지칭될 수 있다.
다양한 형태의 IL-2의 지정은 본원에서 서열번호 19에서 도시된 서열에 대해 이루어진다. 다양한 지정은 동일한 돌연변이를 표시하기 위해 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들면 위치 42에서 페닐알라닌에서 알라닌으로의 돌연변이는 42A, A42, A42, F42A, 또는 Phe42Ala로서 표시될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인간 IL-2 분자"는 서열번호 166의 인간 IL-2 서열과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 96% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 분자인 것으로 의미된다. 특히, 서열 동일성은 적어도 약 95%, 더욱 특히 적어도 약 96%이다. 특정한 구체예에서, 인간 IL-2 분자는 전장 IL-2 분자이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CD25" 또는 "IL-2 수용체의 α 아단위"은 별도로 표시되지 않으면, 포유동물, 예컨대 영장류(예를 들면, 인간) 및 설치류(예를 들면, 생쥐와 쥐)를 비롯한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 선천적 CD25를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 CD25뿐만 아니라 세포에서 처리로부터 발생하는 CD25의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, CD25의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 일정한 구체예에서, CD25는 인간 CD25이다. 인간 CD25의 아미노산 서열은 예를 들면, UniProt 엔트리 번호 P01589(버전 185)에서 발견된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "높은 친화성 IL-2 수용체"는 수용체 γ 아단위(통상적인 사이토카인 수용체 γ 아단위, γc, 또는 CD132로서 또한 알려져 있음, UniProt 엔트리 번호 P14784(버전 192) 참조), 수용체 β 아단위(CD122 또는 p70으로서 또한 알려져 있음, UniProt 엔트리 번호 P31785(버전 197) 참조) 및 수용체 α 아단위(CD25 또는 p55로서 또한 알려져 있음, UniProt 엔트리 번호 P01589(버전 185) 참조)로 구성되는 IL-2 수용체의 이종삼합체 형태를 지칭한다. 대조적으로 용어 "중간 친화성 IL-2 수용체"는 α 아단위 없이, γ 아단위 및 β 아단위만을 포함하는 IL-2 수용체를 지칭한다. (검토를 위해 예를 들면 Olejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)을 참조한다).
용어 "TNF 리간드 패밀리 구성원" 또는 "TNF 패밀리 리간드"는 친염증성 사이토카인을 지칭한다. 일반적으로 사이토카인, 및 특히 TNF 리간드 패밀리의 구성원은 면역계의 자극과 조화에서 결정적인 역할을 수행한다. 현재는, 19개의 사이토카인이 서열, 기능 및 구조 유사성에 근거하여 TNF(종양 괴사 인자) 리간드 상과의 구성원으로서 확인되었다. 이들 리간드 모두 C 말단 세포외 도메인(엑토도메인), N 말단 세포내 도메인 및 단일 막경유 도메인을 갖는 II형 막경유 단백질이다. TNF 상동성 도메인(THD)으로서 알려져 있는 C 말단 세포외 도메인은 상과 구성원 사이에 20-30% 아미노산 동일성을 갖고 수용체에 결합에 대한 책임을 진다. TNF 엑토도메인은 또한, TNF 리간드가 특이적 수용체에 의해 인식되는 삼합체성 복합체를 형성하도록 하는 책임을 진다. TNF 리간드 패밀리의 구성원은 림프독소 α(LTA 또는 TNFSF1로서 또한 알려져 있음), TNF(TNFSF2로서 또한 알려져 있음), LTβ(TNFSF3으로서 또한 알려져 있음), OX40L(TNFSF4로서 또한 알려져 있음), CD40L(CD154 또는 TNFSF5로서 또한 알려져 있음), FasL(CD95L, CD178 또는 TNFSF6으로서 또한 알려져 있음), CD27L(CD70 또는 TNFSF7로서 또한 알려져 있음), CD30L(CD153 또는 TNFSF8로서 또한 알려져 있음), 4-1BBL(TNFSF9로서 또한 알려져 있음), TRAIL(APO2L, CD253 또는 TNFSF10으로서 또한 알려져 있음), RANKL(CD254 또는 TNFSF11로서 또한 알려져 있음), TWEAK(TNFSF12로서 또한 알려져 있음), APRIL(CD256 또는 TNFSF13으로서 또한 알려져 있음), BAFF(CD257 또는 TNFSF13B로서 또한 알려져 있음), LIGHT(CD258 또는 TNFSF14로서 또한 알려져 있음), TL1A(VEGI 또는 TNFSF15로서 또한 알려져 있음), GITRL(TNFSF18로서 또한 알려져 있음), EDA-A1(엑토디스플라신 A1로서 또한 알려져 있음) 및 EDA-A2(엑토디스플라신 A2로서 또한 알려져 있음)로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 용어는 별도로 표시되지 않으면, 포유동물, 예컨대 영장류(예를 들면, 인간), 비인간 영장류(예를 들면, 시노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들면, 생쥐와 쥐)를 비롯한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 선천적 선천적 TNF 패밀리 리간드를 지칭한다.
용어 "동시자극성 TNF 리간드 패밀리 구성원" 또는 "동시자극성 TNF 패밀리 리간드"는 T 세포의 증식 및 사이토카인 생산을 동시자극할 수 있는 TNF 리간드 패밀리 구성원의 하위군을 지칭한다. 이들 TNF 패밀리 리간드는 그들의 상응하는 TNF 수용체와의 상호작용 시에 TCR 신호를 동시자극할 수 있고, 그들의 수용체와의 상호작용은 T 세포 활성화를 유발하는 신호전달 캐스케이드를 개시하는 TNFR 연관 인자(TRAF)의 모집을 야기한다. 동시자극성 TNF 패밀리 리간드는 4-1BBL, OX40L, GITRL, CD70, CD30L 및 LIGHT로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 특히 동시자극성 TNF 리간드 패밀리 구성원은 4-1BBL이다.
전술된 바와 같이, 4-1BBL은 II형 막경유 단백질이고 TNF 리간드 패밀리의 한 구성원이다. 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 완전한 또는 전장 4-1BBL은 세포의 표면 상에서 삼합체를 형성하는 것으로 설명되었다. 삼합체의 형성은 4-1BBL의 엑토도메인의 특정한 모티브에 의해 가능해진다. 상기 모티브는 본원에서 "삼합체화 영역"으로서 지정된다. 인간 4-1BBL 서열의 아미노산 50-254가 4-1BBL의 세포외 도메인을 형성하지만, 이들의 단편도 삼합체를 형성할 수 있다. 본원 발명의 특정한 구체예에서, 용어 "4-1BBL 또는 이의 단편의 엑토도메인"은 서열번호 120(인간 4-1BBL의 아미노산 52-254), 서열번호 117(인간 4-1BBL의 아미노산 71-254), 서열번호 119(인간 4-1BBL의 아미노산 80-254) 및 서열번호 118(인간 4-1BBL의 아미노산 85-254)에서 선택되는 아미노산을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 121(인간 4-1BBL의 아미노산 71-248), 서열번호 124(인간 4-1BBL의 아미노산 52-248), 서열번호 123(인간 4-1BBL의 아미노산 80-248) 및 서열번호 122(인간 4-1BBL의 아미노산 85-248)에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭하지만, 삼합체화할 수 있는 엑토도메인의 다른 단편 또한 본원에 포함된다.
"엑토도메인"은 세포외 공간(다시 말하면, 표적 세포 외부의 공간)으로 신장하는 막 단백질의 도메인이다. 엑토도메인은 통상적으로, 표면과의 접촉을 개시하여, 신호 전달을 야기하는 단백질의 부분이다. 본원에서 규정된 바와 같은 TNF 리간드 패밀리 구성원의 엑토도메인은 따라서, 세포외 공간(세포외 도메인) 내로 신장하는 TNF 리간드 단백질의 부분을 지칭하지만, 삼합체화 및 상응하는 TNF 수용체에 결합에 대한 책임을 지는 더 짧은 부분 또는 이들의 단편 또한 포함한다. 용어 "TNF 리간드 패밀리 구성원 또는 이의 단편의 엑토도메인"은 따라서, 세포외 도메인을 형성하는 TNF 리간드 패밀리 구성원의 세포외 도메인, 또는 수용체에 여전히 결합할 수 있는 이의 부분(수용체 결합 도메인)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "PD1", "인간 PD1", "PD-1" 또는 "인간 PD-1"(예정된 세포 사멸 단백질 1, 또는 예정된 사멸 1로서 또한 알려져 있음)은 인간 단백질 PD1을 지칭한다. 또한 UniProt 엔트리 번호 Q15116(버전 156)을 참조한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "PD-1에 결합하는 항체", "PD-1에 특이적으로 결합하는 항체", "PD-1에 결합하는 항체" 또는 "항-PD-1 항체"는 PD-1, 특히 세포 표면 상에서 발현되는 PD-1 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체로서, PD-1의 표적화에서 진단 시약 및/또는 치료제로서 유용할 만큼 충분한 친화성을 갖는 항체를 지칭한다. 한 구체예에서, 관련 없는, 비-PD-1 단백질에 항-PD-1 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사면역검정(RIA) 또는 유세포분석(FACS)에 의해, 또는 바이오센서 시스템 예컨대 Biacore® 시스템을 사용한 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 계측될 때, PD-1에 대한 상기 항체의 결합의 약 10%보다 적다. 일정한 구체예에서, PD-1에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들면 10-8 M 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 인간 PD-1에 결합에 대한 결합 친화성의 KD 값을 갖는다. 한 구체예에서, 결합 친화성의 KD 값은 인간 PD-1의 세포외 도메인(ECD)을 항원으로서 사용한 표면 플라스몬 공명 검정에서 결정된다.
발명의 상세한 설명
본원 발명은 원하는 적응증에 적합될 수 있는 유연한 항원 표적화 및 개별 면역 세포 자극을 위한 모듈식 항체 기반 플랫폼을 제공한다. 관심되는 표적과 직접적으로 맞물리는 전통적인 이중특이적 형식 및 관문 조절인자와 비교하여, 본원 발명은 플러그 앤드 플레이 방식으로 개별적으로 적합되고 사용될 수 있는 두 가지 성분으로 구성된다. 이러한 모듈식 플랫폼은 주로 2가지 부분: (i) 원하는 경우에 면역 세포를 자극하는 능력을 소유하는, 생산하기 쉬운 표적화 분자를 통한 정밀하고 선택적인 항원 표적화를 위한 표적화 항체, 및 (ii) 표적화 항체의 Fc 부분을 특이적으로 인식하고, 그것에 의하여 면역 효과기 세포를 모집하고 예를 들면 CTL을 전향시키기 위한 면역학적 시냅스를 확립하는 것을 통해 이들을 활성화하며, 표적 세포의 후속 용해를 개시하는 면역 활성화(Fc 도메인 결합) 분자에 주력한다(도 1 및 43 참조). 표적화 항체 및 면역 활성화(Fc 도메인 결합) 분자(들)의 병용을 통해, 각각의 모든 고유한 표면 항원에 대한 상이한 효과기 분자를 생성할 필요 없이, 개별 면역 세포를 자극하기 위한 개별화되고, 맞춤 가능한 표준 재고 접근법이 가능하다.
따라서, 한 양상에서, 본원 발명은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자를 제공한다.
본원 발명의 한 양상에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) Fc 도메인 결합 모이어티; 및
(b) 면역 활성화 모이어티를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
일부 양상에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 예를 들면 만약 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 짧은 반감기가 선호되면, Fc 도메인을 포함하지 않는다. 따라서, 본원 발명은 Fc 도메인을 결여하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 제공한다(예시적인 형식에 대해 도 2o-2z를 참조한다).
하지만, 많은 경우에 Fc 도메인을 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 내에 포함하는 것이 선호될 것이다. Fc 도메인은 표적 조직에서 우수한 축적에 기여하는 긴 혈청 반감기 및 우호적인 조직-혈액 분포 비율을 비롯한, 우호적인 약동학적 특성을 항체에 부여한다.
따라서, 본원 발명의 바람직한 양상에서, (c) 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다. 특히, Fc 도메인 결합 모이어티가 반감기 연장 Fc에 결합할 수 없도록 담보하는 것이 바람직할 수 있다. 반감기 연장 Fc 도메인에 Fc 도메인 결합 모이어티의 결합은 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 자가 결합을 야기할 수 있다, 다시 말하면 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 반감기 연장 Fc 도메인을 통해 다른 (동일한) Fc 도메인 결합 분자에 결합한다. 자가 결합은 복수의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 교차연결을 야기할 수 있는데, 이것은 바람직하지 않을 수 있다.
따라서, 본원 발명의 바람직한 양상에서,
(a) 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티,
(b) 면역 활성화 모이어티; 및
(c) 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공되고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
Fc 도메인 결합 모이어티가 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않기 때문에, 어떤 자가 결합 또는 교차연결도 발생하지 않을 것이다, 다시 말하면 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 Fc 도메인(도메인만)을 인식하고 이것에 결합할 것이다. 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 Fc 도메인은 본원에서 표적 Fc 도메인으로서 지칭된다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 내에 포함된 Fc 도메인은 본원에서 반감기 연장 Fc 도메인으로서 지칭된다. 이론에 한정됨 없이, 표적 Fc 도메인이 또한 표적화 항체의 반감기를 연장할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 하지만, 표적 Fc 도메인 및 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 내에 포함된 Fc 도메인을 명확하게 구별하기 위해, 본원에서 설명된 바와 같은 반감기 연장 Fc 도메인은 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 내에 포함된 Fc 도메인을 항상 지칭할 것이다.
본원에서 설명된 바와 같은 Fc 도메인(예를 들면, 표적 Fc 도메인 또는 반감기 연장 Fc 도메인)은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성된다. 예를 들면, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이합체이며, 이것의 각 아단위는 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개의 아단위는 서로 안정되게 연결될 수 있다. 한 구체예에서, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 1개 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
전술된 바와 같이, Fc 도메인은 긴 혈청 반감기를 비롯한, 우호적인 약물동력학적 특성을 항체에 부여한다. 이와 동시에 이것은 하지만, 바람직한 항원-보유 세포보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포로, 바람직하지 않은 표적화를 야기할 수 있다. 게다가, Fc 수용체 신호전달 경로의 공동활성화는 사이토카인 방출을 야기할 수 있는데, 이것은 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 T 세포 활성화 특성 및 긴 반감기와 함께, 전신 투여 시에 사이토카인 수용체의 과도한 활성화 및 중증 부작용을 유발한다. T 세포 이외에 (Fc 수용체-보유) 면역 세포의 활성화는 예를 들면, NK 세포에 의한 T 세포의 잠재적인 파괴로 인해, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 효능을 심지어 감소시킬 수 있다.
본원에서 설명된 바와 같이, 바람직한 구체예에서, 표적 Fc 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 Fc 수용체에 결합을 감소시키고/시키거나 효과기 기능을 감소시킨다. 게다가, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 Fc 수용체에 결합을 감소시키고/시키거나 효과기 기능을 감소시킨다.
따라서, 본원 발명의 한 가지 특정한 양상은 표적화 항체 및/또는 면역 활성화 항체의 효과기 기능을 감소시키는 것이다. 이런 구체예에서, Fc 도메인 결합 모이어티는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 Fc 도메인(표적 Fc 도메인)에는 특이적으로 결합하지만, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트를 포함하는 Fc 도메인(반감기 연장 Fc 도메인)에는 특이적으로 결합하지 않는다. 이런 바람직한 특이성을 갖는 Fc 도메인 결합 모이어티는 아래에 설명되고, 원하는 특이성을 갖는 추가의 Fc 도메인 결합 모이어티를 생성하기 위한 방법 또한 아래에 설명된다(예를 들면 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 Fc 도메인으로 포유류 면역계의 면역화, 및 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 및/또는 제2 세트가 Fc 수용체에 결합을 감소시키는 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트를 포함하는 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는 Fc 도메인 결합 모이어티에 대한 선별검사).
표적 Fc 도메인(여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트가 P329G 치환을 포함한다)에는 특이적으로 결합하지만, 반감기 연장 Fc 도메인(여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트가 P329G 치환을 포함하지 않거나, 다시 말하면 P329 위치에서 야생형이거나 위치 P329에서 글리신 이외의 아미노산 치환을 포함한다)에는 그렇지 않는 예시적인 Fc 도메인 결합 모이어티는 서열번호 1(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), 2, 3, 4, 5 및 6의 CDR 서열을 포함하고 WO2017/072210에서 더욱 설명된 바와 같은 항-P329G(M-1.7.24) huIgG1 결합체이다.
표적 Fc 도메인에는 특이적으로 결합하지만, 반감기 연장 Fc 도메인에는 그렇지 않는 다른 예시적인 Fc 도메인 결합 모이어티는 서열번호 168(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), 169, 170, 171, 172 및 173의 CDR 서열을 포함하고 WO2017/072210에서 더욱 설명된 바와 같은 항-AAA 결합체이다.
표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인은 각각, 표적화 항체 및 또는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자에 증가된 효과기 기능을 부여하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 Fc 수용체에 결합을 증가시키고/시키거나 효과기 기능을 증가시킨다. 한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 Fc 수용체에 결합을 증가시키고/시키거나 효과기 기능을 증가시킨다. 이런 바람직한 특이성을 갖는 Fc 도메인 결합 모이어티는 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 Fc 도메인으로 포유류 면역계의 면역화, 및 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 및/또는 제2 세트가 Fc 수용체에 결합을 증가시키는 및/또는 효과기 기능을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트를 포함하는 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는 Fc 도메인 결합 모이어티에 대한 선별검사에 의해 본원에서 설명된 바와 같이 생성될 수 있다.
Fc 수용체에 대한 이런 결합 및/또는 효과기 기능을 부여하는 Fc 돌연변이(예를 들면 아미노산 치환)는 당해 분야에서 공지되고 아래에 설명된다. 한 구체예에서, 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인, 특이적으로 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인이다. 한 구체예에서, 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인은 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 분자)은 개별적으로, 선천적 IgG1 Fc 도메인(또는 선천적 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 분자)과 비교하여, Fc 수용체에 대한 결합 친화성의 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만, 및 가장 바람직하게는 5% 미만 및/또는 선천적 IgG1 Fc 도메인(또는 선천적 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 분자)과 비교하여, 효과기 기능의 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만, 및 가장 바람직하게는 5% 미만을 나타낸다. 한 구체예에서, 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 분자)은 Fc 수용체에 실질적으로 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 특정한 구체예에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 한 구체예에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 한 구체예에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정한 구체예에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더 특이적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 특이적으로 인간 FcγRIIIa이다. 한 구체예에서, 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP 및 사이토카인 분비의 군으로부터 선택되는 한 가지 이상이다. 특정한 구체예에서, 효과기 기능은 ADCC이다. 한 구체예에서, 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인은 개별적으로, 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 실제적으로 유사한 결합 친화성을 나타낸다. FcRn에 대한 실제적으로 유사한 결합은 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 분자)이 개별적으로, FcRn에 대한 선천적 IgG1 Fc 도메인(또는 선천적 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 분자)의 결합 친화성의 약 70% 초과, 특히 약 80% 초과, 더욱 특히 약 90% 초과를 나타낼 때 달성된다.
일정한 구체예에서, 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인은 개별적으로, 비조작된 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 특정한 구체예에서, 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인은 개별적으로, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 치환은 표적 Fc 도메인의 2개의 아단위 각각에서 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인의 2개의 아단위 각각에서 존재한다. 하지만, 표적 Fc 도메인에서 아미노산 치환 및 반감기 연장 Fc 도메인에서 아미노산 치환은 만약 반감기 연장 Fc 도메인에 대한 Fc 도메인 결합 모이어티의 비결합이 담보되어야 하면, 동일할 수 없다. 이런 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트 및 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 아래에 설명된 바와 같이, 각각이 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 개별적으로 포함하도록 구상된다. 한 구체예에서, 아미노산 치환은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시킨다. 한 구체예에서, 아미노산 치환은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시키는 하나 초과의 아미노산 치환이 있는 구체예에서, 이들 아미노산 치환의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 적어도 10배, 적어도 20배, 또는 심지어 적어도 50배 감소시킬 수 있다. 한 구체예에서, 표적화 항체 및/또는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 개별적으로, 비조작된 Fc 도메인을 포함하는 분자와 비교하여, Fc 수용체에 대한 결합 친화성의 20% 미만, 특히 10% 미만, 더욱 특히 5% 미만을 나타내는 조작된 Fc 도메인을 포함한다. 특정한 구체예에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 구체예에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일부 구체예에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 특정한 구체예에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더 특이적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 특이적으로 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게는, 이들 수용체 각각에 대한 결합이 감소된다. 일부 구체예에서, 보체 성분에 대한 결합 친화성, 특정하게는 C1q에 대한 결합 친화성 역시 감소된다. 한 구체예에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화성은 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실제적으로 유사한 결합, 다시 말하면, 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성의 보존은 이러한 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 분자)이 FcRn에 대한 비조작된 형태의 Fc 도메인(또는 상기 비조작된 형태의 Fc 도메인을 포함하는 분자)의 결합 친화성의 약 70% 초과를 나타낼 때 달성된다. 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본원 발명의 분자는 개별적으로, 이런 친화성의 약 80% 초과 및 심지어 약 90% 초과를 나타낼 수 있다. 일정한 구체예에서, 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인은 개별적으로, 비조작된 Fc 도메인과 비교하여 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 감소된 효과기 기능은 하기 중에서 한 가지 이상을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다: 감소된 보체 의존성 세포독성(CDC), 감소된 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC), 감소된 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 감소된 면역 복합체 매개된 항원 흡수, NK 세포에 감소된 결합, 대식세포에 감소된 결합, 단핵구에 감소된 결합, 다형핵 세포에 감소된 결합, 감소된 직접적인 신호전달 유도 아폽토시스, 표적-결합된 항체의 감소된 교차연결, 감소된 수지상 세포 성숙, 또는 감소된 T 세포 초회감작. 한 구체예에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC, 감소된 ADCC, 감소된 ADCP, 및 감소된 사이토카인 분비의 군으로부터 선택되는 한 가지 이상이다. 특정한 구체예에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 ADCC이다. 한 구체예에서, 감소된 ADCC는 비조작된 Fc 도메인(또는 비조작된 Fc 도메인을 포함하는 분자)에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만이다.
하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트
하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 도 1에서 도해된 바와 같이, 표적화 항체 내에(표적 Fc 도메인 내에) 포함된다. 따라서, 본원 발명의 한 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 표적 Fc 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 Fc 수용체에 대한 표적 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 표적 Fc 도메인은 E233(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), L234, L235, N297, P331 및 P329의 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구체예에서, 표적 Fc 도메인은 L234(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), L235 및 P329의 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링) 및 L235A를 포함한다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 표적 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 한 구체예에서, 표적 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구체예에서, 아미노산 치환은 P329A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링) 또는 P329G, 특히 P329G이다. 한 구체예에서, 표적 Fc 도메인은 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산 치환, 및 E233, L234, L235, N297 및 P331에서 선택되는 위치에서 추가 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구체예에서, 추가 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정한 구체예에서, 표적 Fc 도메인은 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), L234 및 L235에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구체예에서, 표적 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA")를 포함한다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 표적 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 본원에서 온전히 참조로서 편입되는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831에서 설명된 바와 같이, 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체(뿐만 아니라 보체) 결합을 거의 완전히 전폐한다. WO 2012/130831은 또한, 이런 돌연변이체 Fc 도메인을 제조하는 방법, 및 이의 특성 예컨대 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능을 결정하기 위한 방법을 설명한다.
IgG4 항체는 IgG1 항체와 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 구체예에서, 표적화 항체의 표적 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 한 구체예에서, IgG4 표적 Fc 도메인은 위치 S228에서 아미노산 치환, 특이적으로 아미노산 치환 S228P(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. Fc 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 더욱 감소시키기 위해, 한 구체예에서, IgG4 표적 Fc 도메인은 위치 L235에서 아미노산 치환, 특이적으로 아미노산 치환 L235E(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다. 다른 구체예에서, IgG4 표적 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환, 특이적으로 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다. 특정한 구체예에서, IgG4 표적 Fc 도메인은 위치 S228, L235 및 P329에서 아미노산 치환, 특이적으로 아미노산 치환 S228P(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), L235E 및 P329G를 포함한다. 이런 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 이들의 Fcγ 수용체 결합 특성은 본원에서 온전히 참조로서 편입되는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831에서 설명된다.
특정한 구체예에서, 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 표적 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), L235A 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
일정한 구체예에서, 표적 Fc 도메인의 N-글리코실화가 제거되었다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 표적 Fc 도메인은 위치 N297(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산 치환, 특히 아스파라긴을 알라닌(N297A) 또는 아스파르트산(N297D)에 의해 대체하는 아미노산 치환을 포함한다.
전술된 표적 Fc 도메인에 더하여, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 갖는 표적 Fc 도메인은 또한, Fc 도메인 잔기 238(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중에서 하나 이상의 치환을 갖는 것들(U.S. 특허 번호 6,737,056)을 포함한다. 이런 표적 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 두 개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(US 특허 번호 7,332,581).
돌연변이체 표적 Fc 도메인은 당해 분야에서 널리 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 사용한 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조될 수 있다. 유전학적 방법은 인코딩 DNA 서열의 부위 특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성, 기타 등등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는 예를 들면 염기서열분석에 의해 실증될 수 있다.
Fc 수용체에 결합은 예를 들면 ELISA에 의해, 또는 표준 기계장치 예컨대 BIAcore 기기(GE Healthcare)를 사용한 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 쉽게 결정될 수 있고, Fc 수용체는 재조합 발현에 의해 획득될 수 있다. 적합한 이런 결합 검정은 본원에서 설명된다. 대안으로, Fc 수용체에 대한 표적 Fc 도메인 또는 표적 Fc 도메인을 포함하는 표적화 항체의 결합 친화성은 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포주, 예컨대 FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포를 사용하여 평가될 수 있다.
표적 Fc 도메인, 또는 이런 표적 Fc 도메인을 포함하는 표적화 항체의 효과기 기능은 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 계측될 수 있다. ADCC를 계측하기 위한 적합한 검정은 본원에서 설명된다. 관심되는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 다른 실례는 U.S. 특허 번호 5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) 및 Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); U.S. 특허 번호 5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)에서 설명된다. 대안으로, 비방사성 검정 방법이 사용될 수 있다(참조: 예를 들면, 유세포분석의 경우에 ACTI™ 비방사성 세포독성 검정(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비방사성 세포독성 검정(Promega, Madison, WI)). 이런 검정을 위한 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 킬러(NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 부가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 동물 모형, 예컨대 Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)에서 개시된 것에서 평가될 수 있다.
일부 구체예에서, 보체 성분, 특이적으로 C1q에 대한 표적 Fc 도메인의 결합이 감소된다. 따라서, 표적 Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작되는 일부 구체예에서, 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 검정은 표적화 항체가 C1q에 결합할 수 있고, 따라서 CDC 활성을 갖는지를 결정하기 위해 실행될 수 있다. 참조: 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q와 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다(참조: 예를 들면, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); 및 Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트
하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 도 1에서 도해된 바와 같이, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 반감기 연장 Fc 도메인 내에 포함된다. 따라서, 본원 발명의 한 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 반감기 연장 Fc 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 Fc 수용체에 대한 반감기 연장 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 E233(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), L234, L235, N297, P331 및 P329의 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 L234(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), L235 및 P329의 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링) 및 L235A를 포함한다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구체예에서, 아미노산 치환은 P329A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링) 또는 P329G, 특히 P329G이다. 한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산 치환, 및 E233, L234, L235, N297 및 P331에서 선택되는 위치에서 추가 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구체예에서, 추가 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), L234 및 L235에서 아미노산 치환을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A("LALA", Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 더 특정한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA", Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 본원에서 온전히 참조로서 편입되는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831에서 설명된 바와 같이, 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체(뿐만 아니라 보체) 결합을 거의 완전히 전폐한다. WO 2012/130831은 또한, 이런 돌연변이체 Fc 도메인을 제조하는 방법, 및 이의 특성 예컨대 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능을 결정하기 위한 방법을 설명한다.
바람직한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 IgG1이고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 P329G 치환을 포함한다. 이와 같은 한 가지 특정 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 서열번호 29의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
하지만, Fc 도메인 결합 모이어티가 P329G 치환을 포함하는 표적 Fc 도메인에 결합할 수 있는 일부 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 글리신(G) 이외의 아미노산에 의한 아미노산 치환을 포함하는 것이 바람직하다. 한 구체예에서, 전술된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 글리신(G) 이외의 아미노산에 의한 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 글리신(G) 이외의 아미노산에 의한 치환을 포함하는데, 여기서 이런 아미노산은 Fc 감마 수용체 내에, 특히 FcgRIIIa 내에 2개의 보존된 트립토판 측쇄 사이에서 프롤린 샌드위치를 형성할 수 없다.
바람직한 이런 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서, 아르기닌(R), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 구성된 목록으로부터 선택되는 아미노산에 의한 치환을 포함한다. 더 바람직한 이런 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아르기닌(R)에 의한 치환을 포함한다. "LALA" 아미노산 치환과 각각 개별적으로 조합된 "P329R", "P329L", "P329I" 및 "P329A" 아미노산 치환은 본원에서 설명된 바와 같은 Fcγ 수용체(뿐만 아니라 보체)를 거의 완전히 전폐한다. 한 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 IgG1이고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 P329L 치환(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다. 이와 같은 한 가지 특정 구체예에서, P329L 치환(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함하는 반감기 연장 Fc 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 IgG1이고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 P329I 치환(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다. 이와 같은 한 가지 특정 구체예에서, 329I 치환(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함하는 반감기 연장 Fc 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 IgG1이고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 P329R 치환(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다. 이와 같은 한 가지 특정 구체예에서, P329R 치환(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함하는 반감기 연장 Fc 도메인은 서열번호 32의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 IgG1이고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 P329A 치환(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다. 이와 같은 한 가지 특정 구체예에서, P329A 치환(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함하는 반감기 연장 Fc 도메인은 서열번호 33의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
IgG4 항체는 IgG1 항체와 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 반감기 연장 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 한 구체예에서, IgG4 반감기 연장 Fc 도메인은 위치 S228에서 아미노산 치환, 특이적으로 아미노산 치환 S228P(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. Fc 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 더욱 감소시키기 위해, 한 구체예에서, IgG4 반감기 연장 Fc 도메인은 위치 L235에서 아미노산 치환, 특이적으로 아미노산 치환 L235E(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다. 다른 구체예에서, IgG4 반감기 연장 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환, 특이적으로 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 특정한 구체예에서, IgG4 반감기 연장 Fc 도메인은 위치 S228, L235 및 P329에서 아미노산 치환, 특이적으로 아미노산 치환 S228P(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), L235E 및 P329G를 포함한다. 이런 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 이들의 Fcγ 수용체 결합 특성은 본원에서 온전히 참조로서 편입되는 PCT 공개 번호 WO 2012/130831에서 설명된다.
특정한 구체예에서, 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 반감기 연장 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다(Kabat EU 색인에 따른 넘버링).
일정한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인의 N-글리코실화가 제거되었다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 위치 N297에서 아미노산 치환, 특히 아스파라긴을 알라닌(N297A) 또는 아스파르트산(N297D)에 의해 대체하는 아미노산 치환(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다.
전술된 반감기 연장 Fc 도메인에 더하여, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 갖는 반감기 연장 Fc 도메인은 또한, Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중에서 하나 이상의 치환을 갖는 것들(U.S. 특허 번호 6,737,056)(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다. 이런 반감기 연장 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 두 개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(US 특허 번호 7,332,581).
돌연변이체 (치환된) 반감기 연장 Fc 도메인은 당해 분야에서 널리 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 사용한 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조될 수 있다. 유전학적 방법은 인코딩 DNA 서열의 부위 특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성, 기타 등등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는 예를 들면 염기서열분석에 의해 실증될 수 있다.
Fc 수용체에 결합은 예를 들면 ELISA에 의해, 또는 표준 기계장치 예컨대 BIAcore 기기(GE Healthcare)를 사용한 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 쉽게 결정될 수 있고, Fc 수용체는 재조합 발현에 의해 획득될 수 있다. 적합한 이런 결합 검정은 본원에서 설명된다. 대안으로, Fc 수용체에 대한 반감기 연장 Fc 도메인 또는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 결합 친화성은 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 알려진 세포주, 예컨대 FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포를 사용하여 평가될 수 있다.
반감기 연장 Fc 도메인, 또는 이런 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 효과기 기능은 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 계측될 수 있다. ADCC를 계측하기 위한 적합한 검정은 본원에서 설명된다. 관심되는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 다른 실례는 U.S. 특허 번호 5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) 및 Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); U.S. 특허 번호 5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)에서 설명된다. 대안으로, 비방사성 검정 방법이 사용될 수 있다(참조: 예를 들면, 유세포분석의 경우에 ACTI™ 비방사성 세포독성 검정(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비방사성 세포독성 검정(Promega, Madison, WI)). 이런 검정을 위한 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 자연 킬러(NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 부가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 동물 모형, 예컨대 Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)에서 개시된 것에서 평가될 수 있다.
일부 구체예에서, 보체 성분, 특이적으로 C1q에 대한 반감기 연장 Fc 도메인의 결합이 감소된다. 따라서, 반감기 연장 Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작되는 일부 구체예에서, 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 검정은 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 C1q에 결합할 수 있고, 따라서 CDC 활성을 갖는지를 결정하기 위해 실행될 수 있다. 참조: 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q와 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다(참조: 예를 들면, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); 및 Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
이종이합체화를 증진하는 Fc 도메인 변형
본원 발명에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 반감기 연장 Fc 도메인의 2개의 아단위 중 하나 다른 하나에 융합된 상이한 Fab 분자 및 면역 활성화 모이어티(예를 들면, Fab 분자, 사이토카인, 리간드)를 포함하고, 따라서 반감기 연장 Fc 도메인의 2개의 아단위는 전형적으로, 2개의 비동일한 폴리펩티드 쇄 내에 포함된다. 이들 폴리펩티드의 재조합 공동발현 및 차후 이합체화는 이들 2개의 폴리펩티드의 여러 가능한 조합을 야기한다. 재조합 생산에서 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 수율과 순도를 향상시키기 위해, 원하는 폴리펩티드의 연결을 증진하는 변형을 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자(다시 말하면 반감기 연장 Fc 도메인)의 Fc 도메인에 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정한 구체예에서, 본원 발명에 따른 반감기 연장 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 연결을 증진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개의 아단위 사이에서 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다. 따라서, 한 구체예에서 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인 내에 있다.
이종이합체화를 시행하기 위한 Fc 도메인의 CH3 도메인에서 변형을 위한 여러 접근법이 존재하는데, 이들은 예를 들면 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291에서 충분히 설명된다. 전형적으로, 이와 같은 모든 접근법에서 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인 및 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인은 각 CH3 도메인(또는 이것을 포함하는 중쇄)이 그 자체로는 더 이상 동종이합체를 형성할 수 없지만, 상보적으로 조작된 다른 CH3 도메인과 이종이합체를 형성하도록 강제되도록(제1 및 제2 CH3 도메인이 이종이합체를 형성하고, 2개의 제1 또는 2개의 제2 CH3 도메인 사이에 어떤 동종이합체도 형성되지 않도록), 둘 모두 상보성 방식으로 조작된다. 향상된 중쇄 이종이합체화를 위한 이들 상이한 접근법은 경쇄 오대합 및 Bence Jones-유형 부산물을 감소시키는, 본원 발명에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자에서 중쇄-경쇄 변형(하나의 결합 팔에서 VH와 VL 교환/대체 및 CH1/CL 인터페이스에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 치환의 도입)과 조합으로 상이한 대안으로서 예기된다.
특정한 구체예에서, Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 연결을 증진하는 상기 변형은 반감기 연장 Fc 도메인의 2개의 아단위 중 하나에서 "노브" 변형 및 반감기 연장 Fc 도메인의 2개의 아단위 중 다른 하나에서 "홀" 변형을 포함하는, 이른바 "노브 인투 홀" 변형이다.
노브 인투 홀 기술은 예를 들면 US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)에서 설명된다. 일반적으로, 상기 방법은 이종이합체 형성을 증진하고 동종이합체 형성을 방해하기 위해 융기가 공동 내에 배치될 수 있도록, 융기("노브")를 제1 폴리펩티드의 인터페이스에서, 및 상응하는 공동("홀")을 제2 폴리펩티드의 인터페이스 내에 도입하는 것을 수반한다. 융기는 제1 폴리펩티드의 인터페이스로부터 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예를 들면 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 융기와 동일한 또는 유사한 크기의 보상성 공동은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 폴리펩티드의 인터페이스 내에 창출된다.
따라서, 특정한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동에서 위치 가능한 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 생성되고, 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 위치 가능한 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동이 생성된다.
바람직하게는 더 큰 측쇄 용적을 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 더 작은 측쇄 용적을 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
융기 및 공동은 이들 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을, 예를 들면 부위 특이적 돌연변이유발에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 변경함으로써 만들어질 수 있다.
특정한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 아단위("노브" 아단위)의 CH3 도메인 내에 위치 366에서 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기(T366W)로 대체되고, 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위("홀" 아단위)의 CH3 도메인 내에 위치 407에서 티로신 잔기가 발린 잔기(Y407V)로 대체된다. 한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위 내에 추가적으로 위치 366에서 트레오닌 잔기가 세린 잔기(T366S)로 대체되고 위치 368에서 류신 잔기가 알라닌 잔기(L368A)로 대체된다(Kabat EU 색인에 따른 넘버링).
또 다른 추가의 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 아단위 내에 추가적으로 위치 354에서 세린 잔기가 시스테인 잔기(S354C)로 대체되거나 위치 356에서 글루타민산 잔기가 시스테인 잔기(E356C)로 대체되고, 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위 내에 추가적으로 위치 349에서 티로신 잔기가 시스테인 잔기(Y349C)에 의해 대체된다(Kabat EU 색인에 따른 넘버링). 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개의 아단위 사이에 이황화 다리의 형성을 야기하여, 이합체를 더욱 안정시킨다(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
특정한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 아단위는 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고, 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위는 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다(Kabat EU 색인에 따른 넘버링).
특정한 구체예에서, 면역 활성화 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 아단위("노브" 변형 포함)에 융합된다. 이론에 한정됨 없이, 반감기 연장 Fc 도메인의 노브 내포 아단위에 면역 활성화 모이어티의 융합은 2개의 면역 활성화 모이어티를 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 생성(2개의 노브 내포 폴리펩티드의 입체 충돌)을 (더욱) 최소화할 것이다.
이종이합체화를 시행하기 위한 CH3-변형의 다른 기술이 본원 발명에 따른 대안으로서 예기되고, 예를 들면 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291에서 설명된다.
한 구체예에서, EP 1870459 A1에서 설명된 이종이합체화 접근법이 대안적으로 사용된다. 이러한 접근법은 반감기 연장 Fc 도메인의 2개의 아단위 사이에서 CH3/CH3 도메인 인터페이스 내에 특정한 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 도입에 기초된다. 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자에 대한 한 가지 바람직한 구체예는 아미노산 돌연변이 R409D(Kabat EU 색인에 따른 넘버링); 2개의 CH3 도메인(반감기 연장 Fc 도메인의) 중 하나에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; 반감기 연장 Fc 도메인의 CH3 도메인 중 다른 하나에서 E357K이다.
다른 구체예에서, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366W(Kabat EU 색인에 따른 넘버링) 및 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 및 부가적으로 아미노산 돌연변이 R409D; 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 E357K를 포함한다.
다른 구체예에서, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366W 및 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하거나, 상기 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366W 및 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V, 및 부가적으로 아미노산 돌연변이 R409D; Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인에서 E357K를 포함한다(이들 모두 Kabat EU 색인에 따른 넘버링).
한 구체예에서, WO 2013/157953에서 설명된 이종이합체화 접근법이 대안적으로 사용된다. 한 구체예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366K(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351D를 포함한다. 추가의 구체예에서, 제1 CH3 도메인은 추가 아미노산 돌연변이 L351K를 포함한다. 추가의 구체예에서, 제2 CH3 도메인은 Y349E(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), Y349D 및 L368E에서 선택되는 아미노산 돌연변이(바람직하게는 L368E)를 추가로 포함한다.
한 구체예에서, WO 2012/058768에서 설명된 이종이합체화 접근법이 대안적으로 사용된다. 한 구체예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가의 구체예에서, 제2 CH3 도메인은 위치 T411(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), D399, S400, F405, N390 또는 K392에서, 예를 들면, a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E 또는 T411W, b) D399R, D399W, D399Y 또는 D399K, c) S400E, S400D, S400R 또는 S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V 또는 F405W, e) N390R, N390K 또는 N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F 또는 K392E에서 선택되는 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다. 추가의 구체예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366V, K409F를 포함한다. 추가의 구체예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가의 구체예에서, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K392E, T411E, D399R 및 S400R을 추가로 포함한다.
한 구체예에서, WO 2011/143545에서 설명된 이종이합체화 접근법이 예를 들면, 368(Kabat EU 색인에 따른 넘버링) 및 409로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 변형으로, 대안적으로 사용된다.
한 구체예에서, 전술된 노브 인투 홀 기술을 또한 사용하는, WO 2011/090762에서 설명된 이종이합체화 접근법이 대안적으로 사용된다. 한 구체예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366W를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함한다. 한 구체예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366Y(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407T를 포함한다.
한 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인은 IgG2 하위부류의 것이고, WO 2010/129304에서 설명된 이종이합체화 접근법이 대안적으로 사용된다.
대안적 구체예에서, 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 연결을 증진하는 변형은 예를 들면 PCT 공개 WO 2009/089004에서 설명된 바와 같이, 정전 스티어링 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 이러한 방법은 동종이합체 형성이 정전적으로 불리하지만 이종이합체화가 정전적으로 유리하게 되도록, 하전된 아미노산 잔기에 의한 2개의 Fc 도메인 아단위의 인터페이스에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 대체를 수반한다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예를 들면 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D), 바람직하게는 K392D 또는 N392D)으로 K392 또는 N392의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 CH3 도메인은 양으로 하전된 아미노산(예를 들면 리신(K) 또는 아르기닌(R), 바람직하게는 D399K, E356K, D356K 또는 E357K, 더 바람직하게는 D399K 및 E356K)으로 D399, E356, D356 또는 E357의 아미노산 치환을 포함한다. 추가의 구체예에서, 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예를 들면, 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D), 바람직하게는 K409D 또는 R409D)으로 K409 또는 R409의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서, 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예를 들면, 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D))으로 K439 및/또는 K370의 아미노산 치환(이들 모두 Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 추가로 또는 대안적으로 포함한다.
다른 추가의 구체예에서, WO 2007/147901에서 설명된 이종이합체화 접근법이 대안적으로 사용된다. 한 구체예에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K253E(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), D282K 및 K322D를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 D239K, E240K 및 K292D를 포함한다.
또 다른 구체예에서, WO 2007/110205에서 설명된 이종이합체화 접근법이 대안적으로 사용될 수 있다.
한 구체예에서, Fc 도메인의 제1 아단위는 아미노산 치환 K392D(Kabat EU 색인에 따른 넘버링) 및 K409D를 포함하고, Fc 도메인의 제2 아단위는 아미노산 치환 D356K 및 D399K를 포함한다.
Fc 도메인 결합 모이어티
본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 도 1에서 도해된 바와 같은 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 Fc 도메인 결합 모이어티를 포함한다
따라서, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 표적화 항체, 다시 말하면 치료 항체의 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에서 설명된 바와 같이, 본원 발명은 특이적 효과기 기능을 표적 세포로 지향시키기 위한 다능한 플랫폼을 제공한다. 표적화 항체는 표적 세포를 인식하고 이에 결합힌다. 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 표적화 항체 내에 포함된 표적 Fc 도메인을 인식하고 이에 결합한다. 표적 Fc 도메인은 표적 조직에서 우수한 축적에 기여하는 긴 혈청 반감기 및 우호적인 조직-혈액 분포 비율을 비롯한, 우호적인 약동학적 특성을 표적화 항체, 다시 말하면 치료 항체에 부여한다. 그와 동시에 이것은 하지만, 바람직한 항원-보유 세포보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포로, 치료 항체의 바람직하지 않은 표적화를 야기할 수 있다. 게다가, Fc 수용체 신호전달 경로의 공동활성화는 사이토카인 방출을 야기할 수 있는데, 이것은 치료 항체의 전신 투여 시에 사이토카인 수용체의 과도한 활성화 및 심각한 부작용을 유발한다. T 세포 이외에 (Fc 수용체-보유) 면역 세포의 활성화는 면역 세포의 잠재적인 파괴로 인해, 치료 항체의 효능을 심지어 감소시킬 수 있다. 따라서, 당해 분야에서 공지된 치료 항체는 예를 들면, 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내도록 조작되거나 돌연변이될 수 있다.
본원 발명의 바람직한 양상에서, 표적화 항체는 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내도록 조작되거나 돌연변이된다. 전술된 바와 같이, 표적 Fc 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함할 수 있다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 표적화 항체는 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖는다. 그와 동시에 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트에서 아미노산 치환이 Fc 도메인 결합 모이어티를 통해 표적 Fc 도메인을 특이적으로 표적화하는 데 사용된다. 바람직한 특이성을 갖는 Fc 도메인 결합 모이어티는 아래에 설명되고, 원하는 특이성을 갖는 추가의 Fc 도메인 결합 모이어티를 생성하기 위한 방법 또한 아래에 설명된다(예를 들면 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 Fc 도메인으로 포유류 면역계의 면역화, 예를 들면 본원에서 참조로서 편입되는 WO2017/072210을 참조한다).
바람직한 구체예에서, Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다(본원 발명의 2개 이상의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 교차연결을 방지하기 위해). 이런 구체예에서, 표적 Fc 도메인 및 반감기 연장 Fc 도메인 내에 동일한 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 통합하는 것이 바람직할지도 모른다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 전술된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 Fc 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키고, 전술된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트의 경우에서와 같이 동일한 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트에서 아미노산은 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트와 비교하여, 동일한 위치에서 상이한 아미노산으로 치환된다. 바람직한 구체예에서, Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 결합하지 않는다. 이런 바람직한 특이성을 갖는 Fc 도메인 결합 모이어티는 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 Fc 도메인으로 포유류 면역계의 면역화, 및 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 및/또는 제2 세트가 Fc 수용체에 결합을 증가시키는 및/또는 효과기 기능을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트를 포함하는 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는 Fc 도메인 결합 모이어티에 대한 선별검사에 의해 본원에서 설명된 바와 같이 생성될 수 있다.
표적 Fc 도메인(여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트가 P329G 치환을 포함한다)에는 특이적으로 결합하지만, 반감기 연장 Fc 도메인(여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트가 P329G 치환을 포함하지 않거나, 다시 말하면 P329 위치에서 야생형이거나 위치 P329에서 글리신 이외의 아미노산 치환을 포함한다)에는 그렇지 않는 예시적인 Fc 도메인 결합 모이어티는 서열번호 1(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), 2, 3, 4, 5 및 6의 CDR 서열을 포함하고 WO2017/072210에서 더욱 설명된 바와 같은 항-P329G(M-1.7.24) huIgG1 결합체이다. 표적 Fc 도메인에는 특이적으로 결합하지만, 반감기 연장 Fc 도메인에는 그렇지 않는 다른 예시적인 Fc 도메인 결합 모이어티는 서열번호 168(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), 169, 170, 171, 172 및 173의 CDR 서열을 포함하고 WO2017/072210에서 더욱 설명된 바와 같은 항-AAA 결합체이다.
본원 발명의 바람직한 구체예에서, 아미노산 치환 P329G를 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티를 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 제공된다. P329G 돌연변이는 Fcγ 수용체에 결합 및 연관된 효과기 기능을 감소시킨다. 따라서, P329G 치환을 포함하는 돌연변이된 Fc 도메인은 비-치환된 Fc 도메인과 비교하여 감소된 또는 전폐된 친화성으로 Fcγ 수용체에 결합한다. 바람직한 구체예에서, Fc 도메인 결합 모이어티는 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 글리신(G) 이외의 아미노산에 의한 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인에 결합할 수 없다. 한 구체예에서, Fc 도메인 결합 모이어티는 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 글리신(G) 이외의 아미노산에 의한 치환을 포함하는 Fc 도메인에 결합할 수 없는데, 여기서 이런 아미노산은 Fc 감마 수용체 내에, 특히 FcgRIIIa 내에 2개의 보존된 트립토판 측쇄 사이에서 프롤린 샌드위치를 형성할 수 없다. 바람직한 구체예에서, Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 돌연변이 P329G를 포함하는 Fc 도메인에는 결합할 수 있지만, 위치 P329에서 아르기닌(R), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 구성된 목록으로부터 선택되는 아미노산에 의한 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인에는 결합할 수 없다.
특정한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 위치 P329(IgG1 Fc 내에)에서 아미노산 치환을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 IgG1 Fc 내에 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 한 구체예에서, Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
한 구체예에서, 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티는
(i) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 11, 서열번호 16 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
(ii) 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
한 구체예에서, 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티는
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) EITPDSSTINYTPSLKD(서열번호 2), EITPDSSTINYTPSLKG(서열번호 11) 및 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16)로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR H2 아미노산 서열; 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정한 구체예에서, 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티는
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKD(서열번호 2); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정한 구체예에서, 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티는
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKG(서열번호 11); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티는
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티는 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 17 및 서열번호 19로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티는
(i) 서열번호 7과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 8과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(ii) 서열번호 12와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(iii) 서열번호 17과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는
(iv) 서열번호 19와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티는 서열번호 7의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 8의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티는 서열번호 12의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티는 서열번호 17의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티는 서열번호 19의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 치환 I253A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), H310A 및 H435A을 포함하는 Fc 도메인에 결합할 수 있다. 한 구체예에서, Fc 도메인 결합 모이어티는 위치 I253, H310 및 H435에서 알라닌(A) 이외의 아미노산에 의한 아미노산 치환(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함하는 Fc 도메인에 결합할 수 없다. 한 구체예에서, Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 치환 I253A, H310A 및 H435A를 포함하는 Fc 도메인에는 결합할 수 있지만, 위치 I253, H310 및 H435에서 알라닌(A) 이외의 아미노산에 의한 아미노산 치환(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함하는 Fc 도메인에는 결합할 수 없다.
한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 IgG1 Fc 내에 위치 I253A, H310A 및 H435A에서 아미노산 치환(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)을 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 IgG1 Fc 내에 아미노산 치환 I253A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), H310A 및 H435A를 포함한다. 한 구체예에서, Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 치환 I253A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), H310A 및 H435A를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
다른 구체예에서, 아미노산 돌연변이 I253A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), H310A 및 H435A를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티는
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 SYGMS(서열번호 168);
(b) CDR H2 아미노산 서열 SSGGSY(서열번호 169); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 LGMITTGYAMDY(서열번호 170)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSQTIVHSTGHTYLE(서열번호 171);
(e) CDR L2 아미노산 서열 KVSNRFS(서열번호 172); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV FQGSHVPYT(서열번호 173)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, 아미노산 돌연변이 I253A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), H310A 및 H435A를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티는 서열번호 174와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 175와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 아미노산 돌연변이 I253A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), H310A 및 H435A를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인 결합 모이어티는 서열번호 174의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 175의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
본원 발명의 이중특이적 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자
추가의 양상에서, 본원 발명은 이중특이적 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 제공한다, 다시 말하면, 면역 활성화 모이어티는 항원 결합 모이어티(예를 들면 Fab 분자)이다.
따라서, 본원 발명은 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자로서,
(a) 본원에서 설명된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티,
(b) Fab 분자, scFv 분자 또는 scFab 분자인 면역 활성화 모이어티; 및
(c) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 제공하고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 본원에서 설명된 바와 같은 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자의 구성요소는 다양한 입체형상에서 서로 융합될 수 있다. 예시적인 입체형상은 도 2에서 묘사된다. 일부 구체예에서, 면역 활성화 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서, 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된 Fab 분자이다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, Fc 도메인 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서, 제2 Fab 분자인 면역 활성화 모이어티의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된 Fab 분자이다. 특정한 이런 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 제1 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 제2 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 이런 입체형상은 도 2g 및 2k에서 개략적으로 묘사된다. 임의적으로, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄가 추가적으로 서로 융합될 수 있다.
다른 특정한 이런 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 Fab 분자인 Fc 도메인 결합 모이어티 및 제2 Fab 분자인 면역 활성화 모이어티, 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 제1 및 제2 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다. 이런 입체형상은 도 2a 및 2d에서 개략적으로 묘사된다. 제1 및 제2 Fab 분자는 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 반감기 연장 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정한 구체예에서, 제1 및 제2 Fab 분자는 각각, 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 특정한 구체예에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이고, 특히 여기서 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다.
다른 구체예에서, Fc 도메인 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서, 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된 Fab 분자이다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 면역 활성화 모이어티는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된 제2 Fab 분자이다. 특정한 이런 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 제2 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 제1 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 이런 입체형상은 도 2h 및 2l에서 개략적으로 묘사된다. 임의적으로, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄가 추가적으로 서로 융합될 수 있다.
Fab 분자는 직접적으로, 또는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2-20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 반감기 연장 Fc 도메인에 또는 서로 융합될 수 있다. 펩티드 링커는 당해 분야에서 공지되고 본원에서 설명된다. 적합한, 비면역원성 펩티드 링커는 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함한다. "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다. 한 구체예에서, 상기 펩티드 링커는 적어도 5개 아미노산, 한 구체예에서 5 내지 100개 아미노산, 추가의 구체예에서 10 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는다. 한 구체예에서, 상기 펩티드 링커는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm인데, 여기서 G=글리신, S=세린, 및 (x=3, n= 3, 4, 5 또는 6 및 m=0, 1, 2 또는 3) 또는 (x=4, n=2, 3, 4 또는 5 및 m= 0, 1, 2 또는 3)이고, 한 구체예에서 x=4 및 n=2 또는 3이고, 추가의 구체예에서 x=4 및 n=2이다. 한 구체예에서, 상기 펩티드 링커는 (G4S)2이다. 제1 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄를 서로 융합하기 위한 특히 적합한 펩티드 링커는 (G4S)2이다. 제1 및 제2 Fab 단편의 Fab 중쇄를 연결하는 데 적합한 예시적인 펩티드 링커는 서열 (D)-(G4S)2를 포함한다. 제1 및 제2 Fab 단편의 Fab 중쇄를 연결하는 데 적합한 다른 예시적인 펩티드 링커는 서열 (G4SG5)를 포함한다. 추가적으로, 링커는 면역글로불린 힌지 영역(이의 부분)을 포함할 수 있다. 특히 Fab 분자가 Fc 도메인 아단위의 N 말단에 융합되는 경우에, 이것은 추가 펩티드 링커와 함께 또는 이것 없이, 면역글로불린 힌지 영역 또는 이의 부분을 통해 융합될 수 있다.
일부 사례에서, 예를 들면 표적 Fc 도메인으로의 표적화를 최적화하거나 표적 분자의 교차연결을 가능하게 하기 위해, 본원에서 설명된 바와 같은 2개 이상의 Fc 도메인 결합 모이어티를 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자(도 2b, 2c, 2e, 2f, 2i, 2j, 2m 또는 2n에서 도시된 실례를 참조한다)를 갖는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정한 구체예에서, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 본원에서 설명된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자를 추가로 포함한다. 한 구체예에서, 제3 Fab 분자는 전통적인 Fab 분자이다. 한 구체예에서, 제3 Fab 분자는 제1 Fab 분자와 동일하다(다시 말하면 제1 및 제3 Fab 분자는 동일한 중쇄와 경쇄 아미노산 서열을 포함하고 도메인의 동일한 배열(다시 말하면 전통적인 또는 교차)을 갖는다). 특정한 구체예에서, 제2 Fab 분자는 면역 활성화 항원, 특히 CD3에 특이적으로 결합하고, 제1 및 제3 Fab 분자는 본원에서 설명된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합한다.
대안적 구체예에서, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 면역 활성화 항원, 특히 CD3에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자를 추가로 포함한다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 제3 Fab 분자는 교차 Fab 분자(Fab 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 VH와 VL이 서로 교환되는 / 대체되는 Fab 분자)이다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 제3 Fab 분자는 제2 Fab 분자와 동일하다(다시 말하면 제2와 제3 Fab 분자는 동일한 중쇄와 경쇄 아미노산 서열을 포함하고 도메인의 동일한 배열(다시 말하면 전통적인 또는 교차)을 갖는다). 이와 같은 한 가지 구체예에서, 제1 Fab 분자는 면역 활성화 항원, 특히 CD3에 특이적으로 결합하고, 제2와 제3 Fab 분자는 본원에서 설명된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합한다.
한 구체예에서, 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다.
특정한 구체예에서, 제2와 제3 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되고, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 특정한 이런 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1, 제2와 제3 Fab 분자, 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 제1 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 제2 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 아단위의 N 말단에 융합되고, 제3 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 이런 입체형상은 도 2b 및 2e(제3 Fab 분자가 전통적인 Fab 분자이고, 바람직하게는 제1 Fab 분자와 동일한 특정한 구체예), 및 도 2i 및 2m(제3 Fab 분자가 교차 Fab 분자이고, 바람직하게는 제2 Fab 분자와 동일한 대안적 구체예)에서 개략적으로 묘사된다. 제2와 제3 Fab 분자는 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 반감기 연장 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정한 구체예에서, 제2와 제3 Fab 분자는 각각, 면역글로불린 힌지 영역을 통해 반감기 연장 Fc 도메인에 융합된다. 특정한 구체예에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이고, 특히 여기서 반감기 연장 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 임의적으로, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄가 추가적으로 서로 융합될 수 있다.
다른 구체예에서, 제1 및 제3 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 반감기 연장 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되고, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 특정한 이런 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1, 제2와 제3 Fab 분자, 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 제2 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 제1 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 아단위의 N 말단에 융합되고, 제3 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제2 아단위의 N 말단에 융합된다. 이런 입체형상은 도 2c 및 2f(제3 Fab 분자가 전통적인 Fab 분자이고, 바람직하게는 제1 Fab 분자와 동일한 특정한 구체예), 및 도 2j 및 2n(제3 Fab 분자가 교차 Fab 분자이고, 바람직하게는 제2 Fab 분자와 동일한 대안적 구체예)에서 개략적으로 묘사된다. 제1 및 제3 Fab 분자는 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 반감기 연장 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정한 구체예에서, 제1 및 제3 Fab 분자는 각각, 면역글로불린 힌지 영역을 통해 반감기 연장 Fc 도메인에 융합된다. 특정한 구체예에서, 면역글로불린 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역이고, 특히 여기서 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 임의적으로, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄가 추가적으로 서로 융합될 수 있다.
Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 면역글로불린 힌지 영역을 통해 반감기 연장 Fc 도메인의 각각의 아단위의 N 말단에 융합되는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 입체형상에서, 2개의 Fab 분자, 힌지 영역 및 반감기 연장 Fc 도메인은 본질적으로 면역글로불린 분자를 형성한다. 특정한 구체예에서, 면역글로불린 분자는 IgG 부류 면역글로불린이다. 훨씬 특정한 구체예에서, 면역글로불린은 IgG1 하위부류 면역글로불린이다. 다른 구체예에서, 면역글로불린은 IgG4 하위부류 면역글로불린이다. 더 특정한 구체예에서, 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 구체예에서, 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 또는 인간화 면역글로불린이다.
본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 중 일부에서, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄가 임의적으로 펩티드 링커를 통해 서로 융합된다. 제1 및 제2 Fab 분자의 입체형상에 따라서, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄가 자체의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄의 N 말단에 융합될 수 있거나, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄가 자체의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄의 N 말단에 융합될 수 있다. 제1 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄의 융합은 정합되지 않은 Fab 중쇄와 경쇄의 오대합을 더욱 감소시키고, 또한, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 중에서 일부의 발현을 위해 필요한 플라스미드의 숫자를 감소시킨다.
일정한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(다시 말하면, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 Fc 도메인 아단위와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)), 및 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 아단위와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 예를 들면, 이황화 결합에 의해 공유 연결된다.
일부 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(다시 말하면 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 Fc 도메인 아단위와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 다른 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(다시 말하면 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 Fc 도메인 아단위와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다.
이들 구체예 중 일부에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는, 제2 Fab 분자의 교차 Fab 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 이들 구체예 중 다른 것들에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 적절하면, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1)), 또는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))를 추가로 포함한다.
이들 구체예에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 (i) Fc 도메인 아단위 폴리펩티드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 아단위(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) 및 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 예를 들면, 이황화 결합에 의해 공유 연결된다.
일부 양상에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 예를 들면 만약 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 짧은 반감기가 선호되면, Fc 도메인을 포함하지 않는다. 따라서, 본원 발명은 Fc 도메인을 결여하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 제공한다(예시적인 형식에 대해 도 2o-2z를 참조한다). 일부 구체예에서, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 일정한 이런 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 Fc 도메인을 포함하지 않는다. 일정한 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1 및 제2 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 제1 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 이런 입체형상은 도 2o 및 2s에서 개략적으로 묘사된다. 다른 구체예에서, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 일정한 이런 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 Fc 도메인을 포함하지 않는다. 일정한 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1 및 제2 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 제2 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 이런 입체형상은 도 2p 및 2t에서 개략적으로 묘사된다. 일부 구체예에서, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제3 Fab 분자를 추가로 포함하고, 상기 제3 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 이와 같은 특정 구체예에서, 상기 제3 Fab 분자는 전통적인 Fab 분자이다. 다른 이런 구체예에서, 상기 제3 Fab 분자는 본원에서 설명된 바와 같은 교차 Fab 분자, 다시 말하면 Fab 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 VH와 VL이 서로 교환되는 / 대체되는 Fab 분자이다. 일정한 이런 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1, 제2와 제3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 제1 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 제3 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 이런 입체형상은 도 2q 및 2u(제3 Fab 분자가 전통적인 Fab 분자이고, 바람직하게는 제1 Fab 분자와 동일한 특정한 구체예)에서 개략적으로 묘사된다. 일부 구체예에서, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제3 Fab 분자를 추가로 포함하고, 상기 제3 Fab 분자가 Fab 중쇄의 N 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C 말단에 융합된다. 이와 같은 특정 구체예에서, 상기 제3 Fab 분자는 본원에서 설명된 바와 같은 교차 Fab 분자, 다시 말하면 Fab 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 VH와 VL이 서로 교환되는 / 대체되는 Fab 분자이다. 다른 이런 구체예에서, 상기 제3 Fab 분자는 전통적인 Fab 분자이다. 일정한 이런 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1, 제2와 제3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 제1 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 제3 Fab 분자가 Fab 중쇄의 N 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C 말단에 융합된다. 이런 입체형상은 도 2w 및 2y(제3 Fab 분자가 교차 Fab 분자이고, 바람직하게는 제2 Fab 분자와 동일한 특정한 구체예)에서 개략적으로 묘사된다. 일부 구체예에서, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제3 Fab 분자를 추가로 포함하고, 상기 제3 Fab 분자가 Fab 중쇄의 N 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C 말단에 융합된다. 이와 같은 특정 구체예에서, 상기 제3 Fab 분자는 전통적인 Fab 분자이다. 다른 이런 구체예에서, 상기 제3 Fab 분자는 본원에서 설명된 바와 같은 교차 Fab 분자, 다시 말하면 Fab 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 VH와 VL이 서로 교환되는 / 대체되는 Fab 분자이다. 일정한 이런 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1, 제2와 제3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 제2 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 제3 Fab 분자가 Fab 중쇄의 N 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C 말단에 융합된다. 이런 입체형상은 도 2r 및 2v(제3 Fab 분자가 전통적인 Fab 분자이고, 바람직하게는 제1 Fab 분자와 동일한 특정한 구체예)에서 개략적으로 묘사된다. 일부 구체예에서, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제3 Fab 분자를 추가로 포함하고, 상기 제3 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 이와 같은 특정 구체예에서, 상기 제3 Fab 분자는 본원에서 설명된 바와 같은 교차 Fab 분자, 다시 말하면 Fab 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 VH와 VL이 서로 교환되는 / 대체되는 Fab 분자이다. 다른 이런 구체예에서, 상기 제3 Fab 분자는 전통적인 Fab 분자이다. 일정한 이런 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1, 제2와 제3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 링커로 본질적으로 구성되고, 제2 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, 제3 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다. 이런 입체형상은 도 2x 및 2z(제3 Fab 분자가 교차 Fab 분자이고, 바람직하게는 제1 Fab 분자와 동일한 특정한 구체예)에서 개략적으로 묘사된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는(다시 말하면 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하는) 폴리펩티드(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(다시 말하면 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는(다시 말하면 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하는) 폴리펩티드(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(다시 말하면 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(다시 말하면, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는(다시 말하면, 제3 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하는) 폴리펩티드(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-VL(3)-CH1(3))를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(다시 말하면, 제3 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하고(다시 말하면, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역에 의해 대체되는 교차 Fab 중쇄를 포함하고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VL(3)-CH1(3)-VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카르복시 말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드(VH(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
임의의 상기 구체예에 따라서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 구성요소(예를 들면 Fab 분자, Fc 도메인)는 직접적으로, 또는 본원에서 설명되거나 당해 분야에서 공지되는 다양한 링커, 특히 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2-20개 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 적합한, 비면역원성 펩티드 링커는 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함하는데, 여기서 n은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다.
전하 변경
일부 양상에서, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 이중특이적이다, 다시 말하면 이것은 2개의 구별되는 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 일부 양상에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 분자(다시 말하면 가변 도메인 및 불변 도메인을 각각 포함하는, 중쇄 및 경쇄로 구성되는 항원 결합 도메인)이다. 한 구체예에서, 상기 Fab 분자는 인간이다. 다른 구체예에서, 상기 Fab 분자는 인간화이다. 또 다른 구체예에서, 상기 Fab 분자는 인간 중쇄와 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
항원 결합 모이어티 중에서 하나 이상은 교차 Fab 분자이다. 이런 변형은 상이한 Fab 분자로부터 중쇄와 경쇄의 오대합을 감소시켜, 재조합 생산에서 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 수율과 순도를 향상시킨다. 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자에 유용한 특정 교차 Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인(각각, VL 및 VH)이 교환된다. 하지만, 심지어 이러한 도메인 교환에서도, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 제조물은 오대합된 중쇄와 경쇄 사이에 이른바 Bence Jones-유형 상호작용으로 인해 일정한 부산물을 포함할 수 있다(참조: Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191). 상이한 Fab 분자로부터 중쇄와 경쇄의 오대합을 더욱 감소시켜, 본원 발명에 따른 원하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 순도와 수율을 증가시키기 위해, 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산이 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자(들), 또는 면역 활성화 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자 중 어느 한 가지의 CH1과 CL 도메인 내에 특정한 아미노산 위치에 도입된다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 내에 포함된 전통적인 Fab 분자(들)(예컨대 예를 들면 도 2 a-c, g-j에서 도시됨), 또는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 내에 포함된 교차 Fab 분자(들)(예컨대 예를 들면 도 2 d-f, k-n에서 도시됨) 중 어느 한 가지에서 전하 변경이 만들어진다(그러나 둘 모두에서 그러하지는 않음). 특정한 구체예에서, 전하 변경은 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 내에 포함된 전통적인 Fab 분자(들)(이것은 특정한 구체예에서 표적 세포 항원에 특이적으로 결합한다)에서 만들어진다.
CD3 결합 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자
본원 발명에 따른 특정한 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 전술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티; 및 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3에 동시에 결합할 수 있다. 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 Fc 도메인 및 표적 세포 상에서 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함하는 표적화 항체와 병용된다. 이런 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 표적화 항체가 표적 세포에 결합하는 동안, 표적 Fc 도메인 및 활성화 T 세포 항원에 동시에 결합함으로써 T 세포 및 표적 세포를 교차연결할 수 있다. 훨씬 특정한 구체예에서, 이런 동시 결합은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 야기한다. 한 구체예에서, 이런 동시 결합은 T 세포의 활성화를 야기한다. 다른 구체예에서, 이런 동시 결합은 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현의 군으로부터 선택되는, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 세포 반응을 야기한다. 한 구체예에서, 표적 세포에 동시적 교차연결 없이, 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3에 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 결합은 T 세포 활성화를 야기하지 않는다.
한 구체예에서, 표적화 항체와 병용으로 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 T 세포의 세포독성 활성을 표적 세포로 전향시킬 수 있다. 특정한 구체예에서, 상기 전향은 표적 세포에 의한 MHC-매개된 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성과 무관하다.
특히, 본원 발명의 임의의 구체예에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포이다.
따라서, 본원 발명의 한 양상에서, 면역 활성화 모이어티는 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티이다.
한 구체예에서, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 Fab 분자(본원에서 "활성화 T 세포 항원 결합 Fab 분자"로서 또한 지칭됨)를 포함한다. 특정한 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 Fab 분자(또는 다른 Fab 분자)를 포함한다. 한 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 일가 결합을 제공한다.
특정한 구체예에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 본원에서 설명된 바와 같은 교차 Fab 분자, 다시 말하면 Fab 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 VH와 VL이 서로 교환되는 / 대체되는 Fab 분자이다. 이런 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fab 분자(들)는 전통적인 Fab 분자이다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 내에 포함된 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 하나 초과의 Fab 분자가 있는 구체예에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 바람직하게는 교차 Fab 분자이고, 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 전통적인 Fab 분자이다.
대안적 구체예에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 전통적인 Fab 분자이다. 이런 구체예에서, 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fab 분자(들)는 본원에서 설명된 바와 같은 교차 Fab 분자, 다시 말하면 Fab 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 VH와 VL이 서로 교환되는 / 대체되는 Fab 분자이다.
특정한 구체예에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 인간 CD3이다. 특정한 구체예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 Fab 분자는 인간 및 시노몰구스 CD3에 대해 교차반응성이다(다시 말하면 이것에 특이적으로 결합한다). 일부 구체예에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3의 엡실론 아단위(CD3 엡실론)이다.
일부 구체예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 Fab 분자는 CD3, 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 43으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
한 구체예에서, CD3 결합 Fab 분자는 서열번호 35의 중쇄 CDR1, 서열번호 37의 중쇄 CDR2, 서열번호 43의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 53의 경쇄 CDR1, 서열번호 54의 경쇄 CDR2 및 서열번호 55의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, CD3 결합 Fab 분자는 서열번호 49와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 56과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, CD3 결합 Fab 분자는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 Fab 분자는 CD3, 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고, 서열번호 34, 서열번호 37, 서열번호 41로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
한 구체예에서, CD3 결합 Fab 분자는 서열번호 34의 중쇄 CDR1, 서열번호 37의 중쇄 CDR2, 서열번호 41의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 53의 경쇄 CDR1, 서열번호 54의 경쇄 CDR2 및 서열번호 55의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, CD3 결합 Fab 분자는 서열번호 47과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 56과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, CD3 결합 Fab 분자는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 활성화 T 세포 항원 결합 Fab 분자는 CD3, 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 176으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
한 구체예에서, CD3 결합 Fab 분자는 서열번호 35의 중쇄 CDR1, 서열번호 37의 중쇄 CDR2, 서열번호 176의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 53의 경쇄 CDR1, 서열번호 54의 경쇄 CDR2 및 서열번호 55의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, CD3 결합 Fab 분자는 서열번호 177과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 56과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, CD3 결합 Fab 분자는 서열번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 89와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 70과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 178과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 179와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 89와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 68과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 178과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 179와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 89와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 180과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 178과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 179와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 187의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
추가의 구체예에서, 아르기닌(R), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 구성된 목록으로부터 선택되는 아미노산에 의한, 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 치환을 추가로 포함하는 전술된 바와 같은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자 중에서 한 가지가 제공된다.
CD28 결합 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자
본원 발명에 따른 특정한 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 전술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티; 및 동시자극성 T 세포 항원, 특히 CD28에 동시에 결합할 수 있다. 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 Fc 도메인 및 표적 세포 상에서 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함하는 표적화 항체와 병용된다. 이런 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 표적화 항체가 표적 세포에 결합하는 동안, 표적 Fc 도메인 및 동시자극성 T 세포 항원에 동시에 결합함으로써 T 세포 및 표적 세포를 교차연결할 수 있다. 훨씬 특정한 구체예에서, 이런 동시 결합은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 야기한다. 한 구체예에서, 이런 동시 결합은 T 세포의 활성화 또는 증가된 활성화를 야기한다. 다른 구체예에서, 이런 동시 결합은 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현의 군으로부터 선택되는, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 (증가된) 세포 반응을 야기한다. 한 구체예에서, 표적 세포에 동시적 교차연결 없이, 동시자극성 T 세포 항원, 특히 CD28에 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 결합은 (증가된) T 세포 활성화를 야기하지 않는다.
한 구체예에서, 표적화 항체와 병용으로 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 표적 세포에 대한 T 세포의 세포독성 활성을 증가시킬 수 있다. 특정한 구체예에서, 상기 전향은 표적 세포에 의한 MHC-매개된 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성과 무관하다.
특히, 본원 발명의 임의의 구체예에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포이다.
따라서, 본원 발명의 한 양상에서, 면역 활성화 모이어티는 동시자극성 T 세포 항원, 특히 CD28에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티이다.
한 구체예에서, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 Fab 분자(본원에서 "동시자극성 T 세포 항원 결합 Fab 분자"로서 또한 지칭됨)를 포함한다. 특정한 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 Fab 분자(또는 다른 Fab 분자)를 포함한다. 한 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 동시자극성 T 세포 항원에 일가 결합을 제공한다.
특정한 구체예에서, 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 본원에서 설명된 바와 같은 교차 Fab 분자, 다시 말하면 Fab 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 VH와 VL이 서로 교환되는 / 대체되는 Fab 분자이다. 이런 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fab 분자(들)는 전통적인 Fab 분자이다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 내에 포함된 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 하나 초과의 Fab 분자가 있는 구체예에서, 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 바람직하게는 교차 Fab 분자이고, 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 전통적인 Fab 분자이다.
대안적 구체예에서, 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 전통적인 Fab 분자이다. 이런 구체예에서, 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fab 분자(들)는 본원에서 설명된 바와 같은 교차 Fab 분자, 다시 말하면 Fab 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 VH와 VL이 서로 교환되는 / 대체되는 Fab 분자이다.
특정한 구체예에서, 동시자극성 T 세포 항원은 CD28, 특히 인간 CD28이다. 특정한 구체예에서, 동시자극성 T 세포 항원 결합 Fab 분자는 인간 및 시노몰구스 CD28에 대해 교차반응성이다(다시 말하면 이것에 특이적으로 결합한다).
일부 구체예에서, 동시자극성 T 세포 항원 결합 Fab 분자는 CD28에 특이적으로 결합하고, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
한 구체예에서, CD28 결합 Fab 분자는 서열번호 94의 중쇄 CDR1, 서열번호 95의 중쇄 CDR2, 서열번호 96의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 97의 경쇄 CDR1, 서열번호 98의 경쇄 CDR2 및 서열번호 99의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 동시자극성 T 세포 항원 결합 Fab 분자는 CD28에 특이적으로 결합하고, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 102으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 103, 서열번호 98, 서열번호 99의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
다른 구체예에서, CD28 결합 Fab 분자는 서열번호 94의 중쇄 CDR1, 서열번호 95의 중쇄 CDR2, 서열번호 102의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 103의 경쇄 CDR1, 서열번호 98의 경쇄 CDR2 및 서열번호 99의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, CD28 결합 Fab 분자는 서열번호 100과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 101과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, CD28 결합 Fab 분자는 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, CD28 결합 Fab 분자는 서열번호 104의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 105의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, CD28 결합 Fab 분자는 서열번호 104와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 105와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, CD28 결합 Fab 분자는 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, CD28 결합 Fab 분자는 서열번호 104의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 105의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
추가의 구체예에서, 아르기닌(R), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 구성된 목록으로부터 선택되는 아미노산에 의한, 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 치환을 추가로 포함하는 전술된 바와 같은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자 중에서 한 가지가 제공된다.
4-1BB 결합 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자
본원 발명에 따른 특정한 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 전술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티; 및 4-1BB에 동시에 결합할 수 있다. 따라서, 본원 발명의 한 양상에서, 면역 활성화 모이어티는 동시자극성 T 세포 항원, 특히 4-1BB에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티이다. 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 Fc 도메인 및 표적 세포 상에서 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함하는 표적화 항체와 병용된다. 이런 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 표적화 항체가 표적 세포에 결합하는 동안, 표적 Fc 도메인 및 동시자극성 T 세포 항원에 동시에 결합함으로써 T 세포 및 표적 세포를 교차연결할 수 있다. 훨씬 특정한 구체예에서, 이런 동시 결합은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 야기한다. 한 구체예에서, 이런 동시 결합은 T 세포의 활성화 또는 증가된 활성화를 야기한다. 다른 구체예에서, 이런 동시 결합은 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현의 군으로부터 선택되는, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 (증가된) 세포 반응을 야기한다. 한 구체예에서, 표적 세포에 동시적 교차연결 없이, 동시자극성 T 세포 항원, 특히 4-1BB에 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 결합은 (증가된) T 세포 활성화를 야기하지 않는다.
한 구체예에서, 표적화 항체와 병용으로 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 표적 세포에 대한 T 세포의 세포독성 활성을 증가시킬 수 있다. 특정한 구체예에서, 상기 전향은 표적 세포에 의한 MHC-매개된 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성과 무관하다.
특히, 본원 발명의 임의의 구체예에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 구체예에서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포이다.
한 구체예에서, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 Fab 분자(본원에서 "동시자극성 T 세포 항원 결합 Fab 분자"로서 또한 지칭됨)를 포함한다. 특정한 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 Fab 분자(또는 다른 Fab 분자)를 포함한다. 한 구체예에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 동시자극성 항원에 일가 결합을 제공한다.
특정한 구체예에서, 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 본원에서 설명된 바와 같은 교차 Fab 분자, 다시 말하면 Fab 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 VH와 VL이 서로 교환되는 / 대체되는 Fab 분자이다. 이런 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fab 분자(들)는 전통적인 Fab 분자이다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 내에 포함된 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 하나 초과의 Fab 분자가 있는 구체예에서, 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 바람직하게는 교차 Fab 분자이고, 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 전통적인 Fab 분자이다.
대안적 구체예에서, 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 전통적인 Fab 분자이다. 이런 구체예에서, 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fab 분자(들)는 본원에서 설명된 바와 같은 교차 Fab 분자, 다시 말하면 Fab 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 VH와 VL이 서로 교환되는 / 대체되는 Fab 분자이다.
특정한 구체예에서, 동시자극성 T 세포 항원은 4-1BB, 특히 인간 CD28이다. 특정한 구체예에서, 동시자극성 T 세포 항원 결합 Fab 분자는 인간 및 시노몰구스 4-1BB에 대해 교차반응성이다(다시 말하면 이것에 특이적으로 결합한다).
일부 구체예에서, 동시자극성 T 세포 항원 결합 Fab 분자는 4-1BB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 136, 서열번호 137, 서열번호 138의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
한 구체예에서, 4-1BB 결합 Fab 분자는 서열번호 133의 중쇄 CDR1, 서열번호 134의 중쇄 CDR2, 서열번호 135의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 136의 경쇄 CDR1, 서열번호 137의 경쇄 CDR2 및 서열번호 138의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, 4-1BB 결합 Fab 분자는 서열번호 139와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 140과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 4-1BB 결합 Fab 분자는 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 구체예에서, CD28 결합 Fab 분자는 서열번호 139의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 140의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
(b) 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
(c) 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
추가의 구체예에서, 아르기닌(R), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 구성된 목록으로부터 선택되는 아미노산에 의한, 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 치환을 추가로 포함하는 전술된 바와 같은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자 중에서 한 가지가 제공된다.
사이토카인을 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자
한 구체예에서, 면역 활성화 모이어티는 사이토카인이다. 한 구체예에서, 사이토카인은 IL2, IL7, IL15, IL18, IFNa 및 IFNg로 구성된 군으로부터 선택된다. 이와 같은 특정 구체예에서, 본원 발명의 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자는 면역요법에 대한 유리한 특성을 갖는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드를 포함한다. 특히, 독성에 기여하지만 IL-2의 효능을 위해 필수적이지 않는 IL-2의 약리학적 특성이 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드에서 제거된다. 이런 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 WO 2012/107417에서 상세하게 설명되는데, 이것은 본원에서 온전히 참조로서 편입된다. 상기 논의된 바와 같이, IL-2 수용체의 상이한 형태는 상이한 아단위로 구성되고 IL-2에 대한 상이한 친화성을 나타낸다. β와 γ 수용체 아단위로 구성되는 중간 친화성 IL-2 수용체는 휴면 효과기 세포 상에서 발현되고 IL-2 신호전달에 충분하다. 상기 수용체의 α 아단위를 추가적으로 포함하는 높은 친화성 IL-2 수용체는 주로, 조절 T(Treg) 세포 상에서뿐만 아니라 활성화된 효과기 세포 상에서 발현되는데, 여기서 IL-2에 의한 이의 인게이지먼트는 각각, Treg 세포 매개된 면역억제 또는 활성화 유발 세포 사멸(AICD)을 증진할 수 있다. 따라서, 이론에 한정됨 없이, IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 IL-2의 친화성을 감소시키거나 전폐하는 것은 조절 T 세포에 의한 효과기 세포 기능의 IL-2 유도된 하향조절 및 AICD의 과정에 의한 종양 내성의 발달을 감소시킬 것이다. 다른 한편으로, 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 친화성을 유지하는 것은 IL-2에 의한, NK 및 T 세포와 같은 효과기 세포의 증식과 활성화의 유도를 보존할 것이다.
본원 발명에 따른 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자 내에 포함된 돌연변이체 인터류킨-2(IL-2) 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 각각 비교하여, IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 전폐하거나 감소시키고, 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 보존하는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
CD25에 대한 감소된 친화성을 갖는 인간 IL-2(hIL-2)의 돌연변이체는 예를 들면 아미노산 위치 35, 38, 42, 43, 45 또는 72 또는 이들의 조합(인간 IL-2 서열 서열번호 166에 상대적으로 넘버링)에서 아미노산 치환에 의해 생성될 수 있다. 예시적인 아미노산 치환은 K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R 및 L72K를 포함한다. 본원 발명의 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자에서 유용한 특정 IL-2 돌연변이체는 인간 IL-2의 잔기 42, 45 또는 72, 또는 이들의 조합에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 아미노산 돌연변이는 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R 및 L72K의 군으로부터 선택되는 아미노산 치환, 더 특정하게는 F42A, Y45A 및 L72G의 군으로부터 선택되는 아미노산 치환이다. 이들 돌연변이체는 IL-2 돌연변이체의 야생형 형태와 비교하여, 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 실제적으로 유사한 결합 친화성을 나타내고, IL-2 수용체의 α 아단위 및 높은 친화성 IL-2 수용체에 대한 실제적으로 감소된 친화성을 갖는다.
유용한 돌연변이체의 다른 특징은 IL-2 수용체-보유 T 및/또는 NK 세포의 증식을 유도하는 능력, IL-2 수용체-보유 T 및/또는 NK 세포에서 IL-2 신호전달을 유도하는 능력, NK 세포에 의한 이차성 사이토카인으로서 인터페론(IFN)-γ를 생성하는 능력, 말초혈 단핵 세포(PBMC)에 의한 이차성 사이토카인 - 특히 IL-10 및 TNF-α -의 정교화를 유도하는 감소된 능력, 조절 T 세포를 활성화하는 감소된 능력, T 세포에서 아폽토시스를 유도하는 감소된 능력, 및 감소된 생체내 독성 프로필을 포함할 수 있다.
본원 발명에서 유용한 특정 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 전폐하거나 감소시키지만, 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 보존하는 3개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 3개의 아미노산 돌연변이는 인간 IL-2의 잔기 42, 45 및 72에 상응하는 위치에 있다. 한 구체예에서, 상기 3개의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 한 구체예에서, 상기 3개의 아미노산 돌연변이는 F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R 및 L72K의 군으로부터 선택되는 아미노산 치환이다. 특정한 구체예에서, 상기 3개의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(서열번호 166의 인간 IL-2 서열에 상대적으로 넘버링)이다.
일정한 구체예에서, 상기 아미노산 돌연변이는 IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 적어도 5배, 특이적으로 적어도 10배, 더 특이적으로 적어도 25배 감소시킨다. IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 있는 구체예에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 적어도 30배, 적어도 50배, 또는 심지어 적어도 100배 감소시킬 수 있다. 한 구체예에서, 상기 아미노산 돌연변이 또는 아미노산 돌연변이의 조합은 결합이 표면 플라스몬 공명에 의해 전혀 검출되지 않도록, IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 전폐한다.
중간 친화성 수용체에 대한 실제적으로 유사한 결합, 다시 말하면 상기 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성의 보존은 IL-2 돌연변이체가 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 IL-2 돌연변이체의 야생형 형태의 친화성의 약 70% 초과를 나타낼 때 달성된다. 본원 발명의 IL-2 돌연변이체는 이런 친화성의 약 80% 초과 및 심지어 약 90% 초과를 나타낼 수 있다.
IL-2의 O-글리코실화의 제거와 조합으로 IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 IL-2의 친화성의 감소는 향상된 특성을 갖는 IL-2 단백질을 야기한다. 예를 들면, O-글리코실화 부위의 제거는 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 포유류 세포 예컨대 CHO 또는 HEK 세포에서 발현될 때, 더 균질한 산물을 야기한다.
따라서, 일정한 구체예에서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 인간 IL-2의 잔기 3에 상응하는 위치에서 IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는 상기 추가 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예시적인 아미노산 치환은 T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K 및 T3P를 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 추가 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 T3A이다.
일정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 본질적으로 전장 IL-2 분자이다. 일정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2 분자이다. 한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 돌연변이가 없는 서열번호 166을 포함하는 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 전폐하거나 감소시키지만, 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 보존하는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 서열번호 166의 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 돌연변이가 없는 서열번호 167을 포함하는 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, IL-2 수용체의 α 아단위에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 전폐하거나 감소시키지만, 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드의 친화성을 보존하는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 서열번호 167의 서열을 포함한다.
특정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 활성화된 T 림프구 세포 증식, 활성화된 T 림프구 세포 분화, 세포독성 T 세포(CTL) 활성, 활성화된 B 세포 증식, 활성화된 B 세포 분화, 자연 킬러(NK) 세포 증식, NK 세포 분화, 활성화된 T 세포 또는 NK 세포에 의한 사이토카인 분비, 및 NK/림프구 활성화된 킬러(LAK) 항종양 세포독성으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 반응 중에서 한 가지 이상을 이끌어 낼 수 있다.
한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, 조절 T 세포에서 IL-2 신호전달을 유도하는 감소된 능력을 갖는다. 한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, T 세포에서 더 적은 활성화 유발 세포 사멸(AICD)을 유도한다. 한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, 감소된 생체내 독성 프로필을 갖는다. 한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교하여, 연장된 혈청 반감기를 갖는다.
본원 발명에서 유용한 특정 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2의 잔기 3, 42, 45 및 72에 상응하는 위치에서 4개의 아미노산 치환을 포함한다. 특이적 아미노산 치환은 T3A, F42A, Y45A 및 L72G이다. WO 2012/107417에서 예시된 바와 같이, 상기 사중 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 CD25에 대한 검출 가능한 결합 없음, T 세포에서 아폽토시스를 유도하는 감소된 능력, Treg 세포에서 IL-2 신호전달을 유도하는 감소된 능력, 및 감소된 생체내 독성 프로필을 나타낸다. 하지만, 이것은 효과기 세포에서 IL-2 신호전달을 활성화하고, 효과기 세포의 증식을 유도하고, NK 세포에 의한 이차성 사이토카인으로서 IFN-γ를 생성하는 능력을 유지한다.
게다가, 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 WO 2012/107417에서 설명된 바와 같은 추가의 유리한 특성, 예컨대 감소된 표면 소수성, 좋은 안정성, 및 좋은 발현 수율을 갖는다. 예상치 않게, 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 또한, 야생형 IL-2와 비교하여, 연장된 혈청 반감기를 제공한다.
본원 발명에서 유용한 IL-2 돌연변이체는 IL-2의 CD25 또는 글리코실화 부위와의 인터페이스를 형성하는 IL-2의 영역에서 돌연변이를 갖는 것에 더하여, 이들 영역 외부의 아미노산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 또한 가질 수 있다. 인간 IL-2에서 이런 추가 돌연변이는 추가 이점 예컨대 증가된 발현 또는 안정성을 제공할 수 있다. 예를 들면, 위치 125에서 시스테인은 U.S. 특허 번호 4,518,584에서 설명된 바와 같이, 중성 아미노산 예컨대 세린, 알라닌, 트레오닌 또는 발린으로 대체되어, 각각 C125S IL-2, C125A IL-2, C125T IL-2 또는 C125V IL-2가 생성될 수 있다. 그 안에 설명된 바와 같이, IL-2의 N 말단 알라닌 잔기가 또한 결실되어, des-A1 C125S 또는 des-A1 C125A와 같은 돌연변이체가 생성될 수 있다. 대안으로 또는 결합하여, IL-2 돌연변이체는 야생형 인간 IL-2의 위치 104에서 정상적으로 발생하는 메티오닌이 중성 아미노산 예컨대 알라닌에 의해 대체되는 돌연변이를 포함할 수 있다(참조: U.S. 특허 번호 5,206,344). 결과의 돌연변이체, 예를 들면, des-A1 M104A IL-2, des-A1 M104A C125S IL-2, M104A IL-2, M104A C125A IL-2, des-A1 M104A C125A IL-2, 또는 M104A C125S IL-2(이런 저런 돌연변이체는 U.S. 특허 번호 5,116,943에서 및 Weiger et al., Eur J Biochem 180, 295-300 (1989)에서 발견될 수 있다)는 본원 발명의 특정 IL-2 돌연변이와 함께 사용될 수 있다.
따라서, 일정한 구체예에서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2의 잔기 125에 상응하는 위치에서 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 추가 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환 C125A이다.
당업자는 어떤 추가 돌연변이가 본원 발명의 목적으로 추가 이점을 제공할 수 있는지를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들면, 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 IL-2의 친화성을 감소시키거나 전폐하는 IL-2 서열에서 아미노산 돌연변이, 예컨대 D20T, N88R 또는 Q126D(참조: 예를 들면 US 2007/0036752)가 본원 발명에 따른 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드 내에 포함되는 데 적합하지 않을 수 있다는 것을 인지할 것이다.
한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 상응하는 야생형 IL-2 서열, 예를 들면 서열번호 166의 인간 IL-2 서열과 비교하여 12 개 이내, 11 개 이내, 10 개 이내, 9 개 이내, 8 개 이내, 7 개 이내, 6 개 이내, 또는 5개 이내의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 특정한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 상응하는 야생형 IL-2 서열, 예를 들면 서열번호 166의 인간 IL-2 서열과 비교하여, 5개 이내의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열번호 167의 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열번호 167의 서열로 구성된다.
한 양상에서, 본원 발명은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 본원에서 설명된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티,
(b) 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드인 면역 활성화 모이어티로서, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열번호 166에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고;
(c) 본원에서 설명된 바와 같은 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 돌연변이체 IL-2를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자를 제공하고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
한 양상에서, 본원 발명은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 본원에서 설명된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티,
(b) 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드인 면역 활성화 모이어티로서, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 T3A, F42A, Y45A, L72G 및 C125A(인간 IL-2 서열 서열번호 166에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이고;
(c) 본원에서 설명된 바와 같은 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 돌연변이체 IL-2를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자를 제공하고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
한 양상에서, 본원 발명은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 본원에서 설명된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티,
(b) 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드인 면역 활성화 모이어티로서, 여기서 상기 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 본원에서 설명된 바와 같은 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 돌연변이체 IL-2를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자를 제공하고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
임의의 상기 구체예에서, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 링커 펩티드를 거쳐, 자체의 아미노 말단 아미노산에서 반감기 연장 Fc 도메인의 어느 한 쪽 또는 양쪽 아단위의 카르복시 말단 아미노산에 융합될 수 있다.
한 양상에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
(c) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 양상에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
(c) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
바람직한 양상에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자는 T 세포 항원, 특히 CD8 또는 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있는 표적화 항체와 병용된다. 바람직한 구체예에서, 표적화 항체는 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있다. 이런 병용은 T 세포의 시스-활성화에 유용하다(도 44 참조). 특정한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자는 서열번호 160의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄 및 서열번호 161의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 표적화 항체와 병용된다.
추가의 구체예에서, 아르기닌(R), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 구성된 목록으로부터 선택되는 아미노산에 의한, 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 치환을 추가로 포함하는 전술된 바와 같은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자 중에서 한 가지가 제공된다.
4-1BBL 삼합체 내포 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자
본원 발명의 한 양상에서, 면역 활성화 모이어티는 동시자극성 T 세포 리간드, 특히 4-1BBL이다. 따라서, 다른 양상에서, 본원 발명은 또한, 신규한 4-1BBL 삼합체 내포 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 제공한다.
제1 양상에서, 본원 발명은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 본원에서 설명된 바와 같은 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티,
(b) 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인을 포함하는 것으로 특징화되고,
(c) 본원에서 설명된 바와 같은 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자를 제공하고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
추가의 양상에서, 앞서 규정된 바와 같은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 본원에서 설명된 바와 같은 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티; 및
(b) 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는
(i) 각각, 제1 폴리펩티드가 CH1 또는 CL 도메인을 내포하고, 제2 폴리펩티드가 CL 또는 CH1 도메인을 내포하고, 제2 폴리펩티드가 CH1과 CL 도메인 사이의 이황화 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 및 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인을 포함하거나,
(ii) 각각, 제1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 내포하고, 제2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 내포하고, 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 및 CH3 도메인의 C 말단에 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C 말단에 연결되는 상기 4-1BBL 또는 이의 단편의 단지 1개의 엑토도메인을 포함하거나,
(iii) 각각, 제1 폴리펩티드가 VH-CL 또는 VL-CH1 도메인을 내포하고, 제2 폴리펩티드가 VL-CH1 도메인 또는 VH-CL 도메인을 내포하고, 제2 폴리펩티드가 CH1과 CL 도메인 사이의 이황화 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 및 VH 또는 VL에 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 VL 또는 VH에 연결되는 상기 TNF 리간드 패밀리 구성원 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인을 포함하는 것으로 특징화되고,
(c) 본원에서 설명된 바와 같은 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공되고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
다른 양상에서, 앞서 규정된 바와 같은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 본원에서 설명된 바와 같은 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티; 및
(b) 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는
(i) 각각, 제1 폴리펩티드가 CH1 또는 CL 도메인을 내포하고, 제2 폴리펩티드가 CL 또는 CH1 도메인을 내포하고, 제2 폴리펩티드가 CH1과 CL 도메인 사이의 이황화 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 및 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인을 포함하거나,
(ii) 각각, 제1 폴리펩티드가 CH3 도메인을 내포하고, 제2 폴리펩티드가 CH3 도메인을 내포하고, 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 및 CH3 도메인의 C 말단에 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CH3 도메인의 C 말단에 연결되는 상기 4-1BBL 또는 이의 단편의 단지 1개의 엑토도메인을 포함하는 것으로 특징화되고,
(c) 본원에서 설명된 바와 같은 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공되고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
한 양상에서, 4-1BBL의 엑토도메인은 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123 및 서열번호 124로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 117 또는 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 특히, 4-1BBL의 엑토도메인은 서열번호 117 또는 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함한다. 가장 특히, 4-1BBL의 엑토도메인은 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 4-1BBL 또는 이의 단편의 3개의 엑토도메인 모두가 동일한, 앞서 규정된 바와 같은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
추가의 양상에서, 본원 발명의 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자는
(a) 본원에서 설명된 바와 같은 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티,
(b) 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 상기 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127 및 서열번호 128로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 서열번호 117, 서열번호 121, 서열번호 119 및 서열번호 120으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징화되고,
(c) 본원에서 설명된 바와 같은 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
한 양상에서, 본원 발명의 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자는
(a) 본원에서 설명된 바와 같은 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티,
(b) 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징화되고,
(c) 본원에서 설명된 바와 같은 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
추가의 양상에서, 본원 발명의 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자는
(a) 본원에서 설명된 바와 같은 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티,
(b) 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징화되고,
(c) 본원에서 설명된 바와 같은 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
다른 양상에서, 본원 발명의 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자는
(a) 본원에서 설명된 바와 같은 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티,
(b) 각각, CH1 또는 CL 도메인을 내포하는 제1 폴리펩티드 및 CL 또는 CH1 도메인을 내포하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 제2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 이황화 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고,
및 여기서 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 및 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 단지 1개의 엑토도메인을 포함하는 것으로 특징화된다.
한 양상에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 본원에서 설명된 바와 같은 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티,
(b) CH1 도메인을 내포하는 제1 폴리펩티드 및 CL 도메인을 내포하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공되고, 제2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 이황화 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고,
및 여기서 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 및 CH1 도메인에 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인을 포함하는 것으로 특징화된다.
다른 양상에서, 본원 발명은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 본원에서 설명된 바와 같은 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티; 및
(b) 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인을 포함하는 것으로 특징화되고,
(c) 본원에서 설명된 바와 같은 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자를 제공하고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
또 다른 양상에서, 본원 발명은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 본원에서 설명된 바와 같은 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 하나 초과의 Fc 도메인 결합 모이어티; 및
(b) 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인을 포함하는 것으로 특징화되고,
(c) 본원에서 설명된 바와 같은 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자를 제공하고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
한 양상에서, 본원 발명은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 본원에서 설명된 바와 같은 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 2개의 Fc 도메인 결합 모이어티; 및
(b) 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드로서,
여기서 항원 결합 분자는 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인을 포함하는 것으로 특징화되고,
(c) 본원에서 설명된 바와 같은 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자를 제공하고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티가 항체, 항체 단편 및 골격 항원 결합 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는, 앞서 규정된 바와 같은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자를 제공한다.
한 양상에서, 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티가 항체 단편, Fab 분자, 교차 Fab 분자, 단일 쇄 Fab 분자, Fv 분자, scFv 분자, 단일 도메인 항체, 또는 aVH 및 골격 항원 결합 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는, 전술된 바와 같은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 양상에서, 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티는 aVH 또는 골격 항원 결합 단백질이다.
특정한 양상에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공되는데, 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티는 Fab 분자 또는 교차 Fab 분자이다. 특히, 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티는 Fab이다.
추가의 양상에서, 제1 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하는 펩티드가 자체의 C 말단에서 제2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 CH1 도메인에 융합되고, 상기 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인이 자체의 C 말단에서 제3 펩티드 링커에 의해 경쇄 상에서 CL 도메인에 융합되는, 본원 발명에 따른 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
다른 양상에서, 제1 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하는 펩티드가 자체의 C 말단에서 제2 펩티드 링커에 의해 중쇄의 CL 도메인에 융합되고, 상기 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인이 자체의 C 말단에서 제3 펩티드 링커에 의해 경쇄 상에서 CH1 도메인에 융합되는, 본원 발명에 따른 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 제1 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하는 펩티드가 자체의 C 말단에서 제2 펩티드 링커에 의해 경쇄의 CL 도메인에 융합되고, 상기 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인이 자체의 C 말단에서 제3 펩티드 링커에 의해 중쇄의 CH1 도메인에 융합되는, 본원 발명에 따른 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자와 관련된다.
특정한 양상에서, 본원 발명은 펩티드 링커가 (G4S)2인, 앞서 규정된 바와 같은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자에 관계한다.
다른 양상에서, 앞서 규정된 바와 같은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자는 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 Fc 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
(b) 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄.
(c) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
한 구체예에서, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄,
(b) 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄.
(c) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
(d) 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자가 제공된다.
추가의 구체예에서, 아르기닌(R), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 구성된 목록으로부터 선택되는 아미노산에 의한, 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 치환을 추가로 포함하는 전술된 바와 같은 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자 중에서 한 가지가 제공된다.
Fc 수용체 면역 활성화 모이어티를 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자
본원 발명의 한 양상에서, 면역 활성화 모이어티는 Fc 수용체이다. 한 구체예에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 한 구체예에서, 면역 활성화 모이어티는 ACDD를 유도하였다. 한 구체예에서, Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)로 구성된 목록으로부터 선택된다. 특정한 구체예에서, 면역 활성화 모이어티는 FcγRIIIa(CD16a), 또는 이의 단편이다.
특정한 구체예에서, 면역 활성화 모이어티는 FcγRIIa(CD32), 또는 이의 단편이다. 특정한 구체예에서, 면역 활성화 모이어티는 FcαRI(CD89), 또는 이의 단편이다.
본원 발명에 따른 추가의 특이적 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자
면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자로서:
(a) 다음을 포함하는 Fab 분자:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) EITPDSSTINYTPSLKD(서열번호 2), EITPDSSTINYTPSLKG(서열번호 11) 및 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16)로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR H2 아미노산 서열; 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(b) 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아르기닌(R)에 의한 치환을 포함하는 IgG1 Fc 도메인, 및
(c) 전술된 바와 같은 면역 활성화 모이어티를 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 제공된다.
면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자로서:
(a) 다음을 포함하는 Fab 분자:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKD(서열번호 2); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(b) 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아르기닌(R)에 의한 치환을 포함하는 IgG1 Fc 도메인, 및
(c) 전술된 바와 같은 면역 활성화 모이어티를 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 제공된다.
면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자로서:
(a) 다음을 포함하는 Fab 분자:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKG(서열번호 11); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(b) 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아르기닌(R)에 의한 치환을 포함하는 IgG1 Fc 도메인, 및
(c) 전술된 바와 같은 면역 활성화 모이어티를 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 제공된다.
면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자로서:
(a) 다음을 포함하는 Fab 분자:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(b) 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아르기닌(R)에 의한 치환을 포함하는 IgG1 Fc 도메인, 및
(c) 전술된 바와 같은 면역 활성화 모이어티를 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 제공된다.
표적화 항체
표적화 항체는 표적 세포에 결합할 수 있다(도 43에서 도시된 바와 같이). 전술된 바와 같이, 표적화 항체는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인을 포함한다. 표적화 항체는 전술된 임의의 변형 및/또는 치환, 특히 전술된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함할 수 있다. 본원 발명의 개념에 따라서 및 전술된 바와 같이, 표적화 항체는 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 및 표적 세포를 가교하거나/연계하거나/연결한다(참조: 예를 들면 도 1, 12, 13, 38 및 43)
한 양상에서, 본원 발명은 표적 세포 상에서 표적 항원에 결합하는 표적화 항체를 제공한다. 한 양상에서, 표적 세포 상에서 표적 항원에 결합하는 단리된 표적화 항체가 제공된다. 한 양상에서, 본원 발명은 PD-L1, CD20, FolR1, CD25, FAP, EpCAM, STEAP1, Her2 및 CEA로 구성된 목록으로부터 선택되는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
다른 양상에서, 표적화 항체는 면역 세포, 특히 T 세포에 결합할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 표적화 항체는 PD-1에 결합할 수 있다. 표적화 PD-1은 사이토카인을 T 세포로 표적화하는 (전달하는) 데 특히 유용하다. 한 구체예에서, 표적화 항체는 PD-1에 결합할 수 있다.
추가의 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 표적화 항체는 IgG1 아이소타입/하위부류이다.
추가의 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 표적화 항체는 서열번호 146의 중쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다. 다른 양상에서, 임의의 상기 양상에 따른 항체는 서열번호 147의 경쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다.
추가의 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 표적화 항체는 서열번호 148의 중쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다. 다른 양상에서, 임의의 상기 양상에 따른 항체는 서열번호 149의 경쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다.
추가의 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 표적화 항체는 서열번호 150의 중쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다. 다른 양상에서, 임의의 상기 양상에 따른 항체는 서열번호 151의 경쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다.
추가의 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 표적화 항체는 서열번호 152의 중쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다. 다른 양상에서, 임의의 상기 양상에 따른 항체는 서열번호 153의 경쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다.
추가의 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 표적화 항체는 서열번호 154의 중쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다. 다른 양상에서, 임의의 상기 양상에 따른 항체는 서열번호 155의 경쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다.
추가의 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 표적화 항체는 서열번호 156의 중쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다. 다른 양상에서, 임의의 상기 양상에 따른 항체는 서열번호 157의 경쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다.
추가의 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 표적화 항체는 서열번호 158의 중쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다. 다른 양상에서, 임의의 상기 양상에 따른 항체는 서열번호 159의 경쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다.
추가의 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 표적화 항체는 서열번호 160의 중쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다. 다른 양상에서, 임의의 상기 양상에 따른 항체는 서열번호 161의 경쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다.
추가의 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 표적화 항체는 서열번호 162의 중쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다. 다른 양상에서, 임의의 상기 양상에 따른 항체는 서열번호 163의 경쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다.
추가의 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 표적화 항체는 서열번호 164의 중쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다. 다른 양상에서, 임의의 상기 양상에 따른 항체는 서열번호 165의 경쇄 또는 이의 불변 부분을 포함한다.
한 양상에서, 추가적으로 C 말단 글리신(Gly446)이 앞서 설명된 중쇄 서열 내에 존재한다. 한 양상에서, 추가적으로 C 말단 글리신(Gly446) 및 C 말단 리신(Lys447)이 존재한다.
폴리뉴클레오티드
본원 발명은 본원에서 설명된 바와 같은 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 또는 이의 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 더욱 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 단편은 항원 결합 단편이다.
본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전체 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드로서, 또는 공동발현되는 복수(예를 들면, 2개 이상)의 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공동발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 예를 들면, 이황화 결합 또는 다른 수단을 통해 연결되어, 기능적 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 형성할 수 있다. 예를 들면, Fab 분자의 경쇄 부분은 Fab 분자의 중쇄 부분, Fc 도메인 아단위 및 임의적으로 다른 Fab 분자(이의 일부)를 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 공동발현될 때, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 연결되어 Fab 분자를 형성할 것이다. 다른 실례에서, 2개의 Fc 도메인 아단위 중에서 하나 및 임의적으로 하나 이상의 Fab 분자(이의 일부)를 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 부분은 2개의 Fc 도메인 아단위 중에서 다른 것 및 임의적으로 Fab 분자(이의 일부)를 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 부분과 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있었다. 공동발현될 때, Fc 도메인 아단위는 연결되어 Fc 도메인을 형성할 것이다.
일부 구체예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에서 설명된 바와 같은 발명에 따른 전체 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 인코딩한다. 다른 구체예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에서 설명된 바와 같은 발명에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 내에 포함된 폴리펩티드를 인코딩한다.
일정한 구체예에서 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 구체예에서, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 전령 RNA(mRNA)의 형태에서 RNA이다. 본원 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 예를 들면, 고체-상태 펩티드 합성(예를 들면 Merrifield 고체상 합성) 또는 재조합 생산에 의해 획득될 수 있다. 재조합 생산의 경우에, 예를 들면, 전술된 바와 같은 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자(단편)를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 단리되고, 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이런 폴리뉴클레오티드는 전통적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 염기서열분석될 수 있다. 한 구체예에서, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드 중에서 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당업자에게 널리 공지된 방법이 적합한 전사/번역 제어 신호와 함께 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자(단편)의 코딩 서열을 내포하는 발현 벡터를 작제하는 데 사용될 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들면, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)에서 설명된 기술을 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 부분일 수 있거나, 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자(단편)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(다시 말하면, 코딩 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소와 작동가능하게 연결되어 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 구성되는 핵산의 부분이다. "종결 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지는 않지만, 만약 존재하면 코딩 영역의 일부인 것으로 고려될 수 있으며, 임의의 측접 서열, 예를 들면 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론, 5'와 3' 비번역 영역 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 두 개 이상의 코딩 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 작제물 내에, 예를 들면 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 작제물 내에, 예를 들면 별개의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 게다가, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 내포할 수 있거나, 두 개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다, 예를 들면 본원 발명의 벡터는 단백질분해 개열을 통해 최종 단백질로 번역후 또는 공동번역에서 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 이에 더하여, 본원 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 융합되지 않은 이종성 코딩 영역을 인코딩할 수 있다. 이종성 코딩 영역은 특수한 요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩티드 또는 이종성 기능적 도메인을 제한 없이 포함한다. 작동 가능한 연결은 유전자 산물의 발현이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어하에 놓이도록 하는 그와 같은 방식으로, 유전자 산물, 예를 들면 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이 하나 이상의 조절 서열과 연결될 때이다. 2개의 DNA 단편(예컨대 폴리펩티드 코딩 영역 및 그것과 연결된 프로모터)은 만약 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 야기하고, 만약 이들 2개의 DNA 단편 사이의 연쇄의 성격이 유전자 산물의 발현을 주동하는 발현 조절 서열의 능력을 간섭하지 않거나 전사되는 DNA 주형의 능력을 간섭하지 않으면 "작동가능하게 연결"된다. 따라서, 프로모터 영역은 만약 이러한 프로모터가 핵산의 전사를 달성할 수 있다면, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 작동가능하게 연결될 것이다. 프로모터는 미리 결정된 세포에서만 DNA의 실제적인 전사를 주동하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 전사 제어 요소, 예를 들면 인핸서, 오퍼레이터, 억제인자, 및 전사 종결 신호가 세포 특이적 전사를 주동하기 위해 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역이 본원에서 개시된다. 다양한 전사 제어 영역이 당업자에게 알려져 있다. 이들은 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 하지만 제한 없이, 시토메갈로바이러스로부터 프로모터와 인핸서 분절(예를 들면 인트론-A와 함께 극초기 프로모터), 유인원 바이러스 40(예를 들면 초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예컨대 예를 들면 라우스 육종 바이러스)를 제한 없이 포함한다. 다른 전사 제어 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들 예컨대 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 α-글로빈뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 제어 영역은 조직 특이적 프로모터와 인핸서뿐만 아니라 유도성 프로모터(예를 들면 프로모터 유도성 테트라사이클린)를 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 당업자에게 알려져 있다. 이들은 리보솜 결합 부위, 번역 개시와 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소(특히 내부 리보솜 유입 부위 또는 IRES, CITE 서열로서 또한 지칭됨)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 발현 카세트는 또한, 다른 특질 예컨대 복제 기점 및/또는 염색체 통합 요소 예컨대 레트로바이러스 긴 말단 반복(LTR) 또는 아데노 관련 바이러스(AAV) 반전 말단 반복(ITR)을 포함할 수 있다.
본원 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 본원 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 분비를 주동하는 분비 또는 신호 펩티드를 인코딩하는 추가 코딩 영역과 연결될 수 있다. 예를 들면, 만약 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 분비가 요망되면, 신호 서열을 인코딩하는 DNA가 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산의 상류에 배치될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유류 세포에 의해 분비된 단백질은 일단 조면소포체의 전역에서 성장 단백질 쇄의 이출이 시작되면, 성숙 단백질로부터 개열되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드가 일반적으로, 이러한 폴리펩티드의 N 말단에 융합된 신호 펩티드를 갖는다는 것을 인식하는데, 신호 펩티드는 번역되는 폴리펩티드로부터 개열되어 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙" 형태가 생산된다. 일정한 구체예에서, 선천적 신호 펩티드, 예를 들면 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 자신과 작동가능하게 연결되는 폴리펩티드의 분비를 주동하는 능력을 유지하는 상기 서열의 기능적 유도체가 사용된다. 대안으로, 이종성 포유류 신호 펩티드, 또는 이의 기능적 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열이 인간 조직 플라스미노겐 활성인자(TPA) 또는 생쥐 β-글루쿠론산분해효소의 리더 서열로 치환될 수 있다.
추후 정제를 가능하게 하거나(예를 들면 히스티딘 태그) 또는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 표지화를 보조하는 데 사용될 수 있었던 짧은 단백질 서열을 인코딩하는 DNA가 상기 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자(단편) 인코딩 폴리뉴클레오티드 내에 또는 이의 단부에서 포함될 수 있다.
추가의 구체예에서, 본원 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이들 폴리뉴클레오티드와 벡터는 각각, 폴리뉴클레오티드 및 벡터와 관련하여 본원에서 설명된 임의의 특질을 단독적으로 또는 조합으로 통합할 수 있다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 숙주 세포는 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자(이의 일부)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들면 상기 벡터로 형질전환되거나 형질감염되었다). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 또는 이의 단편을 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 복제하고 이들의 발현을 뒷받침하는 데 적합한 숙주 세포는 당해 분야에서 널리 알려져 있다. 이런 세포는 타당하면, 특정 발현 벡터로 형질감염되거나 형질도입될 수 있고, 대량의 벡터 내포 세포는 대규모 발효기에 파종되어 임상적 적용을 위한 충분한 양의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 획득하기 위해 성장될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예컨대 대장균(E. coli), 또는 다양한 진핵 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포, 또는 기타 유사한 것을 포함한다. 예를 들면, 폴리펩티드는 특히 글리코실화가 필요하지 않을 때 세균에서 생산될 수 있다. 발현 후, 폴리펩티드는 가용성 분획물에서 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 더욱 정제될 수 있다. 원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어, 부분적으로 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 생산을 유발하는 균류 및 효모 균주를 비롯한, 실모양 균류 또는 효모가 폴리펩티드-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참조: Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). (글리코실화된) 폴리펩티드의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 실례는 식물과 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다양한 바쿨로바이러스 계통이 확인되었다. 식물 세포 배양액 또한, 숙주로서 활용될 수 있다. 참조: 예를 들면, US 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429(유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명). 척추동물 세포 또한, 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁 상태에서 성장하도록 적응되는 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 실례는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)에서 설명된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 아기 햄스터 신장 세포(BHK), 생쥐 세르톨리 세포(예를 들면, Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)에서 설명된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 경부 암종 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 쥐 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 생쥐 유방 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들면, Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)에서 설명된 바와 같이), MRC 5 세포, 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 dhfr- CHO 세포를 비롯한, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0, P3X63 및 Sp2/0을 포함한다. 단백질 생산에 적합한 일정한 포유류 숙주 세포주에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예컨대 몇몇 예를 들면, 포유류 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포를 포함하지만, 그러나 또한 유전자도입 동물, 유전자도입 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프구양 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
이들 시스템에서 외래 유전자를 발현하는 표준 기술은 당해 분야에서 공지된다. 항원 결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄 중 어느 한 가지를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는 발현된 산물이 중쇄와 경쇄 둘 모두를 갖는 항체이도록, 이들 항체 쇄 중에서 다른 것을 또한 발현하도록 조작될 수 있다.
한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 생산하는 방법이 제공되는데, 여기서 상기 방법은 본원에서 제시된 바와 같은 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에, 상기 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.
본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 구성요소는 서로 유전적으로 융합된다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 이의 구성요소가 서로에 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 설계될 수 있다. 링커의 조성과 길이는 당해 분야에서 널리 공지된 방법에 따라서 결정될 수 있고 효능에 대해 검사될 수 있다. 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 상이한 구성요소 사이에 링커 서열의 실례는 본원에서 제공된 서열에서 발견된다. 원하는 경우에, 융합의 개별 구성요소를 분리하기 위한 개열 부위를 통합하기 위해 추가 서열, 예를 들면 엔도펩티다아제 인식 서열이 또한 포함될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 하나 이상의 항원 결합 모이어티는 항원 결정인자에 결합할 수 있는 항체 가변 영역을 적어도 포함한다. 가변 영역은 자연 또는 비-자연 발생 항체 및 이들의 단편의 일부를 형성하고 이들로부터 유래될 수 있다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체를 생산하기 위한 방법은 당해 분야에서 널리 알려져 있다(참조: 예를 들면 Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 비-자연 발생 항체는 고체상-펩티드 합성을 사용하여 작제될 수 있거나, 재조합적으로 생산될 수 있거나(예를 들면 U.S. 특허 번호 4,186,567에서 설명된 바와 같이), 또는 예를 들면, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리를 선별검사함으로써 획득될 수 있다(참조: 예를 들면 U.S. 특허 번호 5,969,108, McCafferty).
임의의 동물 종의 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역이 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자에서 사용될 수 있다. 본원 발명에서 유용한 무제한적 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 뮤린, 영장류, 또는 인간 기원일 수 있다. 만약 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 인간 사용 용도로 의도되면, 항체의 불변 영역이 인간으로부터 유래되는, 항체의 키메라 형태가 사용될 수 있다. 항체의 인간화 또는 완전 인간 형태 역시 당해 분야에서 널리 알려진 방법에 따라서 제조될 수 있다(참조: 예를 들면 U.S. 특허 번호 5,565,332, Winter). 인간화는 (a) 비인간(예를 들면, 공여자 항체) CDR을, 결정적인 프레임워크 잔기(예를 들면, 우수한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 유지하는 데 중요한 것들)의 보유와 함께 또는 보유 없이 인간(예를 들면 수용자 항체) 프레임워크 및 불변 영역 위에 합체하거나, (b) 비인간 특이성 결정 영역(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 결정적인 잔기)만을 인간 프레임워크 및 불변 영역 위에 합체하거나, (c) 전체 비인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 대체에 의해 이들을 인간 유사 섹션으로 "은폐하는" 것을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 인간화 항체 및 이들을 만드는 방법은 예를 들면, Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)에서 검토되고, 예를 들면, Riechmann et al., Nature 332, 323-329(1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005)(SDR(a-CDR) 합체를 설명); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)("표면치환"을 설명); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)("FR 셔플링"을 설명); 및 Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)(FR 셔플링에 대한 "보도된 선택" 접근법을 설명)에서 더욱 설명된다. 인간 항체 및 인간 가변 영역은 당해 분야에서 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)에서 전반적으로 설명된다. 인간 가변 영역은 하이브리도마 방법에 의해 만들어진 인간 단일클론 항체의 일부를 형성하고 이들로부터 유래될 수 있다. (참조: 예를 들면 Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한, 항원 공격에 대한 응답으로 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 포함하는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다(참조: 예를 들면 Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005). 인간 항체 및 인간 가변 영역은 또한, 인간-유래된 파지 전시 라이브러리에서 선택되는 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. (참조: 예를 들면, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); 및 McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). 파지는 전형적으로, 단일 쇄 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 전시한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명에서 유용한 항원 결합 모이어티는 예를 들면, U.S. 특허 출원 공개 번호 2004/0132066에서 개시된 방법에 따라서 증강된 결합 친화성을 갖도록 조작되고, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 편입된다. 특이적 항원 결정인자에 결합하는 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 능력은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 또는 당업자에게 익숙한 다른 기술, 예를 들면 표면 플라스몬 공명 기술(BIACORE T100 시스템에서 분석됨)(Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329(2000)) 및 전통적인 결합 검정(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 계측될 수 있다. 특정 항원에 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인, 예를 들면 CD3에 결합에 대해 V9 항체와 경쟁하는 항체를 확인하는 데 경쟁 검정이 사용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이런 경쟁 항체는 참조 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들면, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑하기 위한 상술된 예시적인 방법은 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에서 제공된다. 예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 항원(예를 들면 CD3)이 상기 항원에 결합하는 제1 표지화된 항체(예를 들면, US 6,054,297에서 설명된 V9 항체) 및 상기 항원에 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 검사되는 제2 표지화되지 않은 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 제2 항체가 하이브리도마 상층액 내에 존재할 수 있다. 대조로서, 고정된 항원이 제1 표지화된 항체를 포함하지만 제2 표지화되지 않은 항체를 포함하지 않는 용액에서 항온처리된다. 항원에 제1 항체의 결합을 허용하는 조건하에 항온처리 후, 과잉의 결합되지 않은 항체가 제거되고, 고정된 항원과 연관된 표지의 양이 계측된다. 만약 고정된 항원과 연관된 표지의 양이 대조 샘플에 비하여 검사 샘플에서 실제적으로 감소되면, 이것은 제2 항체가 항원에 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 표시한다. 참조: Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
본원에서 설명된 바와 같이 제조된 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 공지된 기술 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기이동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 기타 등등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하는 데 사용되는 실제 조건은 순전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 부분적으로 의존할 것이고, 당업자에게 명백할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원이 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스가 사용될 수 있다. 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피가 본질적으로 실시예에서 설명된 바와 같이 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 단리하는 데 사용될 수 있다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 순도는 겔 전기이동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 비롯한 임의의 다양한 널리 알려진 분석법에 의해 결정될 수 있다.
검정
본원에서 제공된 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 당해 분야에서 공지된 다양한 검정에 의해, 그들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인되거나, 선별검사되거나, 특징화될 수 있다.
친화성 검정
Fc 수용체 또는 표적 항원에 대한 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 친화성은 실시예에서 진술된 방법에 따라서, 표준 기계장치 예컨대 BIAcore 기기(GE Healthcare)를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 결정될 수 있고, 수용체 또는 표적 단백질은 예컨대 재조합 발현에 의해 획득될 수 있다. 대안으로, 상이한 수용체 또는 표적 항원에 대한 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 결합은 예를 들면 유세포분석법(FACS)에 의해, 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용하여 평가될 수 있다. 결합 친화성을 계측하기 위한 특정한 예시적이고 모범적인 구체예는 하기에서 및 아래의 실시예에서 설명된다.
한 구체예에 따라서, KD는 25℃에서 BIACORE® T100 기계(GE Healthcare)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 계측된다.
Fc 부분 및 Fc 수용체 사이의 상호작용을 분석하기 위해, His-태깅된 재조합 Fc-수용체가 CM5 칩 상에 고정된 항-Penta His 항체(Qiagen)에 의해 포획되고, 이중특이적 작제물이 피분석물로서 사용된다. 간단히 말하면, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, GE Healthcare)이 공급업체의 사용설명서에 따라서 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)로 활성화된다. 항 펜타-His 항체가 거의 6500 반응 단위(RU)의 연계된 단백질을 달성하기 위해, 5 μl/분의 유속에서 주입 전 10 mM 아세트산나트륨, pH 5.0으로 40 μg/ml까지 희석된다. 리간드의 주입 이후에, 반응하지 않은 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민이 주입된다. 차후에 Fc-수용체가 4 또는 10 nM에서 60 s 동안 포획된다. 동역학적 계측을 위해, 이중특이적 작제물의 4배 연속 희석액(500 nM 및 4000 nM 사이의 범위)이 25℃에서 30 μl/분의 유속에서 120 s 동안 HBS-EP(GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 % 계면활성제 P20, pH 7.4)에 주입된다.
표적 항원에 대한 친화성을 결정하기 위해, 이중특이적 작제물이 항 펜타-His 항체에 대해 설명된 바와 같이, 활성화된 CM5-센서 칩 표면 상에 고정되는 항인간 Fab 특이적 항체(GE Healthcare)에 의해 포획된다. 연계된 단백질의 최종량은 대략 12000 RU이다. 이중특이적 작제물은 300 nM에서 90 s 동안 포획된다. 표적 항원은 250 내지 1000 nM 범위의 농도에서 30 μl/분의 유속으로 180 s 동안 흐름 셀에 통과된다. 해리가 180 s 동안 모니터링된다.
참조 흐름 셀에서 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정된다. 항정 상태 반응이 랭뮤어 결합 등온선의 비선형 곡선 적합에 의해 해리 상수 KD를 도출하는 데 사용되었다. 연관 속도(k온) 및 해리 속도(k오프)는 연관 및 해리 센서그램을 동시에 적합시킴으로써 단순한 1 대 1 랭뮤어 결합 모형(BIACORE® T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 사용하여 계산된다. 평형 해리 상수(KD)는 비율 k오프/k온으로서 계산된다. 참조: 예를 들면, Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).
활성 검정
본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 생물학적 활성은 실시예에서 설명된 바와 같은 다양한 검정에 의해 계측될 수 있다. 생물학적 활성은 예를 들면, T 세포의 증식의 유도, T 세포에서 신호전달의 유도, T 세포에서 활성화 마커의 발현의 유도, T 세포에 의한 사이토카인 분비의 유도, 표적 세포 예컨대 종양 세포의 용해의 유도, 및 종양 퇴화의 유도 및/또는 생존의 향상을 포함할 수 있다.
조성물, 제제 및 투여 루트
추가의 양상에서, 본원 발명은 예를 들면, 임의의 하기 치료 방법에서 사용을 위한 본원에서 제공된 임의의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 약학 조성물은 본원에서 제공된 임의의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 다른 구체예에서, 약학 조성물은 예를 들면, 아래에 설명된 바와 같이, 본원에서 제공된 임의의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 및 적어도 한 가지의 추가 치료제를 포함한다.
생체내 투여에 적합한 형태에서 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 생산하는 방법이 더욱 제공되고, 상기 방법은 (a) 본원 발명에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 획득하는 단계, 및 (b) 상기 분자를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체로 조제하는 단계를 포함하고, 상기 분자의 제조물은 생체내 투여용으로 조제된다.
본원 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체에서 용해되거나 분산된 한 가지 이상의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 치료 효과량을 포함한다. 관용구 "약학적 또는 약리학적으로 허용되는"은 일반적으로 사용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성인, 다시 말하면, 적절하면 동물, 예컨대 예를 들면, 인간에게 투여될 때 불리한 반응, 알레르기 반응 또는 다른 부반응을 발생시키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 적어도 한 가지의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 및 임의적으로 추가 활성 성분을 내포하는 약학 조성물의 제조는 본원에서 참조로서 편입되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에 의해 예시된 바와 같이, 본원 발명에 비추어 당업자에게 알려져 있을 것이다. 게다가, 동물(예를 들면, 인간) 투여의 경우에, 제조물은 FDA 생물 표준 사무국 또는 다른 국가에서 해당 정부 당국에 의해 요구되는 바와 같은 무균, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 기준에 부합해야 하는 것으로 이해될 것이다. 바람직한 조성물은 동결 건조된 제제 또는 수성 용액이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 공지된 바와 같은, 임의의 모든 용매, 완충액, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들면, 항세균제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연 작용제, 염, 보존제, 항산화제, 단백질, 약물, 약물 안정제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료, 이들과 유사한 물질 및 이들의 조합을 포함한다(예를 들면, 본원에서 참조로서 편입되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329를 참조한다). 임의의 전통적인 담체가 활성 성분과 양립하지 않는 경우가 아닌 한에 있어서, 치료적 또는 약학 조성물에서 이의 사용이 예기된다.
조성물은 이것이 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는지, 및 이것이 주사로서 이런 투여 루트를 위해 무균이어야 하는지에 따라서 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자(및 임의의 추가 치료제)는 정맥내, 피내, 동맥내, 복막내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 비장내, 신장내, 흉강내, 기관내, 비내, 유리체내, 질내, 직장내, 종양내, 근육내, 복막내, 피하, 결막하, 방광내, 점막, 심낭내, 배꼽내, 안구내, 경구, 국소, 국부, 흡입(예를 들면 에어로졸 흡입)에 의해, 주사, 주입, 연속 주입, 표적 세포를 직접적으로 베이딩하는 국부 관류, 카테터를 통해, 세척을 통해, 크렘에서, 지질 조성물(예를 들면 리포솜)에서, 또는 당업자에게 공지된 바와 같은 다른 방법 또는 전술한 것들의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다(예를 들면, 본원에서 참조로서 편입되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990을 참조한다). 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 투여하기 위해 비경구 투여, 특히 정맥내 주사가 가장 흔히 사용된다.
비경구 조성물은 주사, 예를 들면 피하, 피내, 병소내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 척수강내 또는 복막내 주사에 의한 투여용으로 설계된 것들을 포함한다. 주사를 위해, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 수성 용액에서, 바람직하게는 생리학적으로 양립성 완충액 예컨대 행크 용액, 링거액, 또는 생리식염수 완충액에서 조제될 수 있다. 용액은 조제 작용제 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 내포할 수 있다. 대안으로, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 사용 전, 적합한 운반제, 예를 들면, 무균 발열원 없는 물로 구성을 위한 분말 형태일 수 있다. 무균 주사가능 용액은 적합한 용매에서 필요한 양의 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를, 필요에 따라, 아래에 열거된 다양한 다른 성분과 통합함으로써 제조된다. 살균은 예를 들면, 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 살균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분을 내포하는 무균 운반제 내로 통합함으로써 제조된다. 무균 주사가능 용액, 현탁액 또는 유제의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 또는 동결 건조 기술인데, 이들 기술은 이전에 무균 여과된 액체 배지로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 생성한다. 액체 매질은 필요하면 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 주사에 앞서, 충분한 식염수 또는 글루코오스로 먼저 등장성이 되도록 만들어져야 한다. 조성물은 제조와 보관의 조건하에 안정되어야 하고, 미생물, 예컨대 세균 및 균류의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준에서, 예를 들면, 0.5 ng/mg 단백질 미만으로 최소한으로 유지되어야 함을 인지할 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 완충액, 예컨대 인산염, 구연산염, 및 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 덱스트란, 또는 기타 유사한 것을 내포할 수 있다. 임의적으로, 현탁액은 또한, 화합물의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 데 적합한 안정제 또는 작용제를 내포할 수 있다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적합한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 운반제는 지방유 예컨대 호마유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 클리트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다.
활성 성분은 예를 들면, 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로유제에서 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)에서 개시된다. 지속된 방출 제조물이 제조될 수 있다. 지속된 방출 제조물의 적합한 실례는 폴리펩티드를 내포하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하는데, 이들 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 특정한 구체예에서, 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 이들 조성물에서 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합의 사용에 의해 달성될 수 있다.
전술된 조성물에 더하여, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 또한 저장소 제조물로서 조제될 수 있다. 이런 지속성 제제는 이식(예를 들면, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 적합한 중합성 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용되는 오일에서 유제로서) 또는 이온 교환 수지로, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들면, 난용성 염으로서 조제될 수 있다.
본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 포함하는 약학 조성물은 전통적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결 건조 과정에 의하여 제조될 수 있다. 약학 조성물은 이들 단백질의 약학적으로 사용될 수 있는 제조물로의 처리를 가능하게 하는 한 가지 이상의 생리학적으로 허용가능 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 전통적인 방식으로 조제될 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 루트에 의존한다.
면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 유리 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태에서 조성물로 조제될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 유리 산 또는 염기의 생물학적 활성을 실제적으로 유지하는 염이다. 이들은 산 부가염, 예를 들면, 단백질성 조성물의 자유 아미노 기로 형성된 것들, 또는 무기 산 예컨대 예를 들면, 염화수소산 또는 인산, 또는 유기 산 예컨대 아세트산, 옥살산, 주석산 또는 만델산으로 형성된 것들을 포함한다. 자유 카르복실 기로 형성된 염은 또한, 무기 염기 예컨대 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철; 또는 유기 염기 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인으로부터 유래될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매에서 더 가용성인 경향이 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에서 제공된 임의의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 치료 방법에서 사용될 수 있다. 본원 발명의 분자는 예를 들면 암의 치료에서 면역치료제로서 사용될 수 있다.
치료 방법에서 사용을 위해, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 모범 의료행위 지침과 일치하는 방식으로 조제되고, 투약되고, 투여될 것이다. 이러한 문맥에서 고려되는 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여의 일정, 및 개업의에게 공지된 다른 인자를 포함한다.
한 양상에서, 약제로서 사용을 위한 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 제공된다. 추가의 양상에서, 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 제공된다. 일정한 구체예에서, 치료 방법에서 사용을 위한 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 제공된다. 한 구체예에서, 본원 발명은 치료가 필요한 개체에서 질환의 치료에서 사용을 위한 본원에서 설명된 바와 같은 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 질환을 겪는 개체를 치료하는 방법에서 사용을 위한 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 제공하고, 상기 방법은 상기 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 치료 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서 치료되는 질환은 증식성 장애이다. 특정한 구체예에서 질환은 암이다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제, 예를 들면, 만약 치료되는 질환이 암이면 항암제의 치료 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서, 본원 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 데 사용하기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 표적 세포의 용해를 유도하기 위한 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용을 위한 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 제공한다. 임의의 상기 구체예에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 약제의 제조 또는 준비에서 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 용도를 제공한다. 한 구체예에서, 약제는 치료가 필요한 개체에서 질환의 치료를 위한 것이다. 추가의 구체예에서, 약제는 질환을 치료하는 방법에서 사용을 위한 것이고, 상기 방법은 상기 약제의 치료 효과량을 질환을 겪는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서 치료되는 질환은 증식성 장애이다. 특정한 구체예에서 질환은 암이다. 한 구체예에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제, 예를 들면, 만약 치료되는 질환이 암이면 항암제의 치료 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서, 약제는 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 것이다. 다른 추가의 구체예에서, 약제는 표적 세포의 용해를 유도하기 위한 약제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용을 위한 것이다. 임의의 상기 구체예에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 치료 효과량을 이런 질환을 겪는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서 약학적으로 허용되는 형태에서 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 포함하는 조성물이 상기 개체에게 투여된다. 일정한 구체예에서 치료되는 질환은 증식성 장애이다. 특정한 구체예에서 질환은 암이다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제, 예를 들면, 만약 치료되는 질환이 암이면 항암제의 치료 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 상기 구체예에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 방법을 제공한다. 한 구체예에서 상기 방법은 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재하에, 표적 세포를 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 추가의 양상에서, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 방법이 제공된다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 표적 세포의 용해를 유도하기 위한 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, "개체"는 인간이다.
일정한 구체예에서 치료되는 질환은 증식성 장애, 특히 암이다. 암의 무제한적 실례는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평상피 세포 암종, 골암, 및 신장암을 포함한다. 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 사용하여 치료될 수 있는 다른 세포 증식 장애는 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비 샘(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 영역, 및 비뇨생식기계에서 위치된 신생물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 전암성 상태 또는 병변 및 암 전이 또한 포함된다. 일정한 구체예에서 암은 신장 세포 암, 피부암, 폐암, 결장직장암, 유방암, 뇌암, 두경부암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 당업자는 많은 경우에 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 치유를 제공할 수 없을 수도 있으며 단지 부분적인 유익성만을 제공할 수도 있다는 것을 쉽게 인식한다. 일부 구체예에서, 일부 유익성을 갖는 생리학적 변화 또한 치료적으로 유익한 것으로 고려된다. 따라서, 일부 구체예에서, 생리학적 변화를 제공하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 양은 "효과량" 또는 "치료 효과량"인 것으로 고려된다. 치료가 필요한 개체, 환자, 또는 피험자는 전형적으로 포유동물, 더 특정하게는 인간이다.
일부 구체예에서, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 효과량은 세포에 투여된다. 다른 구체예에서, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 치료 효과량은 질환의 치료를 위해 개체에게 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위한, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 적절한 용량(단독으로 사용되거나 한 가지 이상의 다른 추가 치료제와 병용될 때)은 치료되는 질환의 유형, 투여 루트, 환자의 체중, 분자의 유형, 질환의 중증도와 경과, 분자가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 또는 동시 치료적 개입, 환자의 임상 병력 및 분자에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의존할 것이다. 어떤 상황에서든, 투여에 대한 책임이 있는 의사가 조성물에서 활성 성분(들)의 농도 및 개별 개체에 대한 적합한 용량(들)을 결정할 것이다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸쳐 복수 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 예기된다.
면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 적합하게는, 한꺼번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질환의 유형과 중증도에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.1 mg/kg - 10mg/kg)의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 예를 들면, 1회 이상의 별개 투여에 의한, 또는 연속 주입에 의한 것인지에 상관없이, 환자에게 투여를 위한 초기 후보 용량일 수 있다. 한 가지 전형적인 일일량은 전술된 인자에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수도 있다. 수일 이상에 걸쳐 반복된 투여의 경우에, 상태에 따라서, 치료는 일반적으로, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 한 가지 예시적인 용량은 약 0.005 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 안에 있을 것이다. 다른 무제한적 실례에서, 용량은 또한, 투여마다 약 1 마이크로그램/체중 kg, 약 5 마이크로그램/체중 kg, 약 10 마이크로그램/체중 kg, 약 50 마이크로그램/체중 kg, 약 100 마이크로그램/체중 kg, 약 200 마이크로그램/체중 kg, 약 350 마이크로그램/체중 kg, 약 500 마이크로그램/체중 kg, 약 1 밀리그램/체중 kg, 약 5 밀리그램/체중 kg, 약 10 밀리그램/체중 kg, 약 50 밀리그램/체중 kg, 약 100 밀리그램/체중 kg, 약 200 밀리그램/체중 kg, 약 350 밀리그램/체중 kg, 약 500 밀리그램/체중 kg으로부터 약 1000 mg/체중 kg 이상까지, 및 그 안에서 도출 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에서 열거된 숫자로부터 도출 가능한 범위의 무제한적 실례에서, 약 5 mg/체중 kg 내지 약 100 mg/체중 kg, 약 5 마이크로그램/체중 kg 내지 약 500 mg/체중 kg, 기타 등등의 범위가 전술된 숫자에 근거하여 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합) 중에서 한 가지 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이런 용량은 간헐적으로, 예를 들면 매주 또는 3 주마다(예를 들면 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 용량의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 제공받도록) 투여될 수 있다. 초기 더 높은 부하 용량, 그 이후에 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 하지만, 다른 투약 섭생이 유용할 수도 있다. 이러한 요법의 진행은 전통적인 기술과 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 일반적으로, 의도된 목적을 달성하는 데 효과적인 양으로 사용될 것이다. 질환 상태를 치료하거나 예방하는 데 사용을 위해, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 또는 이의 약학 조성물은 치료 효과량으로 투여되거나 적용된다. 치료 효과량의 결정은 특히 본원에서 제공된 상술된 개시에 비추어, 당업자의 능력 범위 안에 있다.
전신 투여의 경우, 치료적으로 유효 용량은 시험관내 검정, 예컨대 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 용량은 이후, 세포 배양액에서 결정된 대로의 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모형에서 공식화될 수 있다. 이런 정보는 인간에서 유용한 용량을 더 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다.
초기 용량은 또한, 당해 분야에서 널리 공지된 기술을 사용하여 생체내 데이터, 예를 들면, 동물 모형으로부터 추정될 수 있다. 당업자는 동물 데이터에 근거하여 인간에 대한 투여를 쉽게 최적화할 수 있었다.
복용량 및 간격은 치료 효과를 유지하는 데 충분한, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 주사에 의한 투여를 위한 통상의 환자 용량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일의 범위 안에 있다. 치료적으로 효과적인 혈장 수준은 매일 복수 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 혈장에서 수준은 예를 들면, HPLC에 의해 계측될 수 있다.
국부 투여 또는 선택적 흡수의 사례에서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 효과적인 국부 농도는 혈장 농도에 관련되지 않을 수도 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 치료적으로 효과적인 국부 용량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에서 설명된 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 치료적으로 유효 용량은 일반적으로, 실제적인 독성을 유발하지 않으면서 치료적 유익성을 제공할 것이다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 독성 및 치료 효능은 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양액 검정 및 동물 연구가 LD50(모집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50 (모집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하는 데 사용될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이에 용량 비율은 치료 지수인데, 이것은 비율 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 선호된다. 한 구체예에서, 본원 발명에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양액 검정 및 동물 연구로부터 획득된 데이터는 인간에서 사용에 적합한 용량의 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 용량은 바람직하게는, 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 안에 있다. 용량은 다양한 인자, 예를 들면, 사용된 약형, 활용된 투여 루트, 개체의 상태 등에 따라서 이러한 범위 내에서 변할 수 있다. 정확한 제제, 투여 루트 및 용량은 환자의 상태에 비추어 개별 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들면, 본원에서 온전히 참조로서 편입되는 Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1을 참조한다).
본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자로 치료되는 환자에 대한 주치의는 독성, 장기 기능장애 등으로 인해 투여를 언제 및 어떻게 종결하거나, 중단하거나, 조정할지를 알고 있을 것이다. 반대로, 주치의는 또한, 만약 임상적 반응이 적절하지 않으면 (독성 배제) 치료를 더 높은 수준으로 조정하는 것을 알고 있을 것이다. 관심되는 장애의 관리에서 투여된 용량의 크기는 치료되는 질환의 중증도, 투여 루트 등에 따라서 변할 것이다. 질환의 중증도는 예를 들면 부분적으로, 표준 예후적 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 게다가, 용량 및 아마도 투약 빈도 또한 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라서 변할 것이다.
다른 작용제 및 치료
본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 치료 동안 한 가지 이상의 다른 작용제와 병용 투여될 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 적어도 한 가지 추가 치료제와 병용 투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 이런 치료가 필요한 개체에서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여되는 임의의 작용제를 포괄한다. 이런 추가 치료제는 치료되는 특정 징후에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 추가 치료제는 면역조정제, 정균제, 세포 부착의 저해제, 세포독성제, 세포 아폽토시스의 활성인자, 또는 아폽토시스성 유도인자에 대한 세포의 민감도를 증가시키는 작용제이다. 특정한 구체예에서, 추가 치료제는 항암제, 예를 들면 미소관 교란물질, 대사길항물질, 국소이성화효소 저해제, DNA 삽입제, 알킬화제, 호르몬 요법, 키나아제 저해제, 수용체 길항제, 종양 세포 아폽토시스의 활성인자, 또는 항신생혈관제이다.
이런 다른 작용제는 적절하게는 의도된 목적에 효과적인 양에서 조합으로 존재한다. 이런 다른 작용제의 효과량은 사용된 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 일반적으로, 본원에서 설명된 바와 동일한 용량에서 및 투여 루트로, 또는 본원에서 설명된 용량의 약 1 내지 99%에서, 또는 경험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정되는 임의의 용량에서 및 임의의 루트에 의해 사용된다.
전술된 이런 병용 요법은 병용 투여(여기서 두 가지 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 조성물 내에 포함된다) 및 별개 투여를 포괄하고, 이러한 사례에서, 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 투여는 추가 치료제 및/또는 어쥬번트의 투여에 앞서, 투여와 동시에 및/또는 투여 이후에 발생할 수 있다. 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 또한, 방사선요법과 병용될 수 있다.
제조 물품
본원 발명의 다른 양상에서, 전술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 내포하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 단독으로, 또는 질환을 치료하는, 예방하는 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 조합으로 조성물을 보유하고, 무균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물에서 적어도 한 가지 활성제는 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택 질환을 치료하는 데 사용된다는 것을 지시한다. 게다가, 제조 물품은 (a) 조성물이 그 안에 내포된 제1 용기(여기서 상기 조성물은 본원 발명의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 포함한다); 및 (b) 조성물이 그 안에 내포된 제2 용기(여기서 상기 조성물은 추가 세포독성제 또는 만약 그렇지 않으면 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본원 발명의 이러한 구체예에서 제조 물품은 조성물이 특정 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용되는 완충액, 예컨대 정균성 주사용수(BWFI), 인산염-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수도 있다. 이것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수도 있다.
본원 발명의 바람직한 양상을 설명하는 넘버링된 구체예
1. 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
(a) 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티; 및
(b) 면역 활성화 모이어티를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자.
2. 구체예 1의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 Fc 수용체에 결합을 감소시키고/시키거나 효과기 기능을 감소시킨다.
3. 구체예 1의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 Fc 수용체에 결합을 증가시키고/시키거나 효과기 기능을 증가시킨다.
4. 구체예 1 내지 3 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서
(c) 반감기 연장 Fc 도메인을 추가로 포함하고,
여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는다.
5. 구체예 1 내지 4 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 반감기 연장 Fc 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트를 포함한다.
6. 구체예 5의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 Fc 수용체에 결합을 감소시키고/시키거나 효과기 기능을 감소시킨다.
7. 구체예 6의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 Fc 수용체에 결합을 증가시키고/시키거나 효과기 기능을 증가시킨다.
8. 구체예 1 내지 7 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인은 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성된다.
9. 구체예 1 내지 8 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다.
10. 구체예 1 내지 9 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인, 특이적으로 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인이다.
11. 구체예 10의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 표적 Fc 도메인은 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다.
12. 구체예 10의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 반감기 연장 Fc 도메인은 선천적 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다.
13. 구체예 1 내지 12 중 어느 하나의 면역 활성화 분자, 여기서 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인은 Fc 수용체에 결합을 증가시키기 위해 및/또는 효과기 기능을 증가시키기 위해 당조작된다
14. 구체예 1 내지 13 중 어느 하나의 면역 활성화 분자, 여기서 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인은 감소된 수준의 푸코오스 잔기를 갖고/갖거나 표적 Fc 도메인 및/또는 반감기 연장 Fc 도메인의 올리고당류는 양분된다.
15. 구체예 1 내지 14 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 Fc 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트의 경우에서와 같이 동일한 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트에서 아미노산은 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트와 비교하여 동일한 위치에서 상이한 아미노산으로 치환된다.
16. 구체예 15의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 Fc 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시킨다.
17. 구체예 1 내지 16 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 233(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), 234, 235, 238, 253, 265, 269, 270, 297, 310, 331, 327, 329 및 435로 구성된 목록으로부터 선택되는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
18. 구체예 1 내지 17 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 233(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), 234, 235, 238, 253, 265, 269, 270, 297, 310, 331, 327, 329 및 435로 구성된 목록으로부터 선택되는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
19. 구체예 1 내지 18 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산 치환, 또는 위치 I253(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), H310 및 H435에서 아미노산 치환을 포함한다.
20. 구체예 1 내지 19 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), 또는 아미노산 치환 I253A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), H310A 및 H435A를 포함한다.
21. 구체예 1 내지 20 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 글리신(G) 이외의 아미노산에 의한 치환을 포함한다.
22. 구체예 1 내지 21 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서, Fc 감마 수용체 내에, 특히 FcgRIIIa 내에 2개의 보존된 트립토판 측쇄 사이에서 프롤린 샌드위치를 형성할 수 없는 아미노산에 의한 치환을 포함한다.
23. 구체예 1 내지 22 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서, 아르기닌(R), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 구성된 목록으로부터 선택되는 아미노산에 의한 치환을 포함한다.
24. 구체예 1 내지 23 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 부모 비돌연변이된 IgG1 Fc 도메인에는 특이적으로 결합할 수 없다.
25. 구체예 1 내지 20 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 아미노산 치환 I253A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), H310A 및 H435A를 포함하고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 위치 I253(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), H310 및 H435에서 알라닌(A) 이외의 아미노산에 의한 하나 이상의 치환을 포함한다.
26. 구체예 1 내지 20 또는 25 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 돌연변이 I253A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), H310A 및 H435A를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 부모 비돌연변이된 IgG1 Fc 도메인에는 특이적으로 결합할 수 없다.
27. 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트는 L234(Kabat EU 색인 넘버링) 및 L235의 군으로부터 선택되는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
28. 구체예 1 내지 27 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트는 L234(Kabat EU 색인 넘버링), L235의 군으로부터 선택되는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
29. 구체예 1 내지 23 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 표적 Fc 도메인은 활성화 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A(Kabat EU 색인 넘버링), L235A 및 P329G이다.
30. 구체예 1 내지 29 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 반감기 연장 Fc 도메인은 활성화 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A(Kabat EU 색인 넘버링), L235A 및 P329X이고, X는 글리신(G) 이외의 아미노산이다.
31. 구체예 1 내지 30 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다.
32. 구체예 1 내지 31 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 효과기 기능은 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)이다.
33. 구체예 8 내지 32 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 반감기 연장 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 및 제2 아단위의 연결을 증진하는 변형을 포함한다.
34. 구체예 33의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동에서 위치 가능한 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 생성되고, 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 아미노산 잔기가 더 작은 측쇄 용적을 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 융기가 위치 가능한 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 공동이 생성된다.
35. 구체예 34의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 더 큰 측쇄 용적을 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 구성된 군으로부터 선택되고, 더 작은 측쇄 용적을 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
36. 구체예 34 또는 35의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 아단위의 CH3 도메인 내에 위치 366(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기(T366W)로 대체되고, 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위의 CH3 도메인 내에 위치 407에서 티로신 잔기가 발린 잔기(Y407V)로 대체되고, 임의적으로 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위 내에 추가적으로 위치 366에서 트레오닌 잔기가 세린 잔기(T366S)로 대체되고 위치 368에서 류신 잔기가 알라닌 잔기(L368A)로 대체된다.
37. 구체예 34 내지 36 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 아단위 내에 추가적으로 위치 354(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 세린 잔기가 시스테인 잔기(S354C)로 대체되거나 위치 356에서 글루타민산 잔기가 시스테인 잔기(E356C)로 대체되고, 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위 내에 추가적으로 위치 349에서 티로신 잔기가 시스테인 잔기(Y349C)에 의해 대체된다.
38. 구체예 34 내지 37 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 반감기 연장 Fc 도메인의 제1 아단위는 아미노산 치환 S354C(Kabat EU 색인에 따른 넘버링) 및 T366W를 포함하고, 반감기 연장 Fc 도메인의 제2 아단위는 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다.
39. 구체예 1 내지 38 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티 및/또는 면역 활성화 모이어티는 Fab 분자, scFv 분자 또는 scFab 분자이다.
40. 구체예 1 내지 39 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티 및/또는 면역 활성화 모이어티는 Fab 분자이다.
41. 구체예 1 내지 24 및 27 내지 40 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) EITPDSSTINYTPSLKD(서열번호 2), EITPDSSTINYTPSLKG(서열번호 11) 및 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16)로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR H2 아미노산 서열; 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
42. 구체예 41의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKD(서열번호 2); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
43. 구체예 41의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKG(서열번호 11); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
44. 구체예 41의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
45. 구체예 1 내지 24 및 27 내지 44 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티는 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 17 및 서열번호 19로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
46. 구체예 45의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 7과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 8과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(ii) 서열번호 12와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(iii) 서열번호 17과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는
(iv) 서열번호 19와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열.
47. 구체예 46의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 치환 P329G(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티는 서열번호 19의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
48. 구체예 1 내지 20 및 25 내지 40 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 아미노산 돌연변이 I253A(Kabat EU 색인에 따른 넘버링), H310A 및 H435A를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 SYGMS(서열번호 168);
(b) CDR H2 아미노산 서열 SSGGSY(서열번호 169); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 LGMITTGYAMDY(서열번호 170)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSQTIVHSTGHTYLE(서열번호 171);
(e) CDR L2 아미노산 서열 KVSNRFS(서열번호 172); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV FQGSHVPYT(서열번호 173)를 포함하는 경쇄 가변 영역.
49. 구체예 40 내지 48 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL과 VH가 서로 대체되거나, 면역 활성화 모이어티의 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL과 VH가 서로 대체된다.
50. 구체예 40 내지 48 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 도메인 CL과 CH1이 서로 대체되거나, 면역 활성화 모이어티의 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 도메인 CL과 CH1이 서로 대체된다.
51. 구체예 1 내지 50 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 제1 Fab 분자를 포함하고, 면역 활성화 모이어티는 제2 Fab 분자를 포함한다.
52. 구체예 51의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서
i) 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고, 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환되거나;
ii) 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고, 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다.
53. 구체예 51 또는 52에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고, a) 하에 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산 또는 위치 213에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다.
54. 구체예 51 내지 53 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고, 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다.
55. 구체예 51 내지 54 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고 위치 123(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되며, 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환되고 위치 213(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E) 또는 아스파르트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다.
56. 구체예 55에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고 위치 123(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 아르기닌(R)에 의해 치환되며, 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고 위치 213(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환된다.
57. 구체예 55에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고 위치 123(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되며, 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고 위치 213(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환된다.
58. 구체예 51 내지 57 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서
d) 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자를 추가로 포함한다.
59. 구체예 58에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제3 Fab 분자는 제1 Fab 분자와 동일하다.
60. 구체예 58 또는 59의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제3 Fab는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) EITPDSSTINYTPSLKD(서열번호 2), EITPDSSTINYTPSLKG(서열번호 11) 및 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16)로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR H2 아미노산 서열; 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
61. 구체예 60의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제3 Fab는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKD(서열번호 2); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
62. 구체예 60의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제3 Fab는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKG(서열번호 11); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
63. 구체예 60의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제3 Fab는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
64. 구체예 58 또는 59의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제3 Fab는 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 17 및 서열번호 19로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
65. 구체예 64의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제3 Fab는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 7과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 8과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(ii) 서열번호 12와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(iii) 서열번호 17과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는
(iv) 서열번호 19와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열.
66. 구체예 64의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제3 Fab는 서열번호 19의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
67. 구체예 58 또는 59의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제3 Fab는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 SYGMS(서열번호 168);
(b) CDR H2 아미노산 서열 SSGGSY(서열번호 169); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 LGMITTGYAMDY(서열번호 170)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSQTIVHSTGHTYLE(서열번호 171);
(e) CDR L2 아미노산 서열 KVSNRFS(서열번호 172); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV FQGSHVPYT(서열번호 173)를 포함하는 경쇄 가변 영역.
68. 구체예 47 내지 67 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 및 제2 Fab 분자는 임의적으로 펩티드 링커를 통해 서로 융합된다.
69. 구체예 47 내지 68 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다.
70. 구체예 47 내지 69 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다.
71. 구체예 69 또는 70의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 임의적으로 펩티드 링커를 통해 서로 융합된다.
72. 구체예 47 내지 71 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다.
73. 구체예 47 내지 71 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다.
74. 구체예 47 내지 71 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 및 제2 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
75. 구체예 47 내지 73 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 아단위의 N 말단에 융합된다.
76. 구체예 47 내지 71 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제2와 제3 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되고, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다.
77. 구체예 47 내지 71 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 및 제3 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되고, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합된다.
78. 구체예 1 내지 77 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
79. 구체예 78의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 활성화 T 세포 항원은 CD3이다.
80. 구체예 78 또는 79의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 활성화 T 세포 항원은 CD3 엡실론이다.
81. 구체예 78 내지 80 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 더욱 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합한다.
82. 구체예 78 내지 81 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 Fab 분자이다.
83. 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
a) 제1 Fab 분자,
b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL과 VH가 서로 대체되는 제2 Fab 분자, 및
c) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자;
여기서,
(i) 제1 Fab 분자는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하고, 제2 Fab 분자는 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 더욱 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고, 제1 Fab 분자는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않거나;
(ii) 제2 Fab 분자는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하고, 제1 Fab 분자는 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 더욱 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고, 제2 Fab 분자는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않고;
여기서 a) 하에 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고 위치 123(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 아르기닌(R) 또는 리신(K)에 의해 치환되며, a) 하에 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고 위치 213(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되며;
여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 b) 하에 제2 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
84. 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
a) 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자,
b) 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 더욱 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL과 VH가 서로 대체되는 제2 Fab 분자,
c) 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자, 및
d) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자,
여기서 제1 및 제2 Fab 분자는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않고;
여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고 위치 123(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 아르기닌(R) 또는 리신(K)에 의해 치환되며, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고 위치 213(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되며;
여기서,
(i) a) 하에 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나,
(ii) b) 하에 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
85. 구체예 82 내지 84 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 CD3 엡실론이고, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 35의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 37의 중쇄 CDR 2, 서열번호 43의 중쇄 CDR 3, 서열번호 53의 경쇄 CDR 1, 서열번호 54의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 55의 경쇄 CDR 3을 포함한다.
86. 구체예 82 내지 85 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 CD3 엡실론이고, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 49의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
87. 구체예 82 내지 84 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 CD3 엡실론이고, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 35의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 33의 중쇄 CDR 2, 서열번호 176의 중쇄 CDR 3, 서열번호 53의 경쇄 CDR 1, 서열번호 54의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 55의 경쇄 CDR 3을 포함한다.
88. 구체예 82 내지 85 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 CD3 엡실론이고, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 177의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
89. 구체예 82 내지 84 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 CD3 엡실론이고, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 34의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 37의 중쇄 CDR 2, 서열번호 41의 중쇄 CDR 3, 서열번호 53의 경쇄 CDR 1, 서열번호 54의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 55의 경쇄 CDR 3을 포함한다.
90. 구체예 82 내지 85 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 CD3 엡실론이고, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 47의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
91. 구체예 82 내지 86 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) EITPDSSTINYTPSLKD(서열번호 2), EITPDSSTINYTPSLKG(서열번호 11) 및 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16)로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR H2 아미노산 서열; 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
92. 구체예 82 내지 86 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
93. 구체예 82 내지 92 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 17 및 서열번호 19로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
94. 구체예 82 내지 93 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 7과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 8과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(ii) 서열번호 12와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(iii) 서열번호 17과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는
(iv) 서열번호 19와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열.
95. 구체예 82 내지 93 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 서열번호 19의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
96. 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
a) 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자;
b) 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 더욱 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL과 VH가 서로 대체되는 제2 Fab 분자;
c) 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자; 및
d) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자;
여기서,
(i) Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않고;
(ii) a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 2, 서열번호 11 및 서열번호 16으로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR 2 서열, 서열번호 3의 중쇄 CDR 3, 서열번호 4의 경쇄 CDR 1, 서열번호 5의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 3을 포함하고, b) 하에 제2 Fab 분자는 서열번호 35의 중쇄 CDR 1, 서열번호 37의 중쇄 CDR 2, 서열번호 43의 중쇄 CDR 3, 서열번호 53의 경쇄 CDR 1, 서열번호 54의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 55의 경쇄 CDR 3을 포함하고;
(iii) a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고 위치 123(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R), 특히 아르기닌(R)에 의해 치환되며, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고 위치 213(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되며;
(iv) a) 하에 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
97. 구체예 96의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 16의 중쇄 CDR 2 서열, 서열번호 3의 중쇄 CDR 3, 서열번호 4의 경쇄 CDR 1, 서열번호 5의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 3을 포함한다.
98. 구체예 96 또는 97의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 7과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 8과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(ii) 서열번호 12와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(iii) 서열번호 17과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는
(iv) 서열번호 19와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열.
99. 구체예 96 또는 97의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, 서열번호 19의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
100. 구체예 96 내지 99 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 b) 하에 제2 Fab 분자는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
101. 구체예 78 내지 100 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 반감기 연장 Fc 도메인은 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서, 아르기닌(R), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 구성된 목록으로부터 선택되는 아미노산에 의한 치환을 포함한다.
102. 구체예 1 내지 77 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
103. 구체예 102의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 동시자극성 T 세포 항원은 CD28이다.
104. 구체예 102 또는 103의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합한다.
105. 구체예 102 내지 104 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 CD28에 특이적으로 결합한다.
106. 구체예 102 내지 105 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 Fab 분자이다.
107. 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
a) 제1 Fab 분자,
b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL과 VH가 서로 대체되는 제2 Fab 분자, 및
c) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자;
여기서,
(i) 제1 Fab 분자는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하고, 제2 Fab 분자는 동시자극성 T 세포 항원, 특히 CD28에 특이적으로 결합하고, 제1 Fab 분자는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않거나;
(ii) 제2 Fab 분자는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하고, 제1 Fab 분자는 동시자극성 T 세포 항원, 특히 CD28에 특이적으로 결합하고, 제2 Fab 분자는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않고;
여기서 a) 하에 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고 위치 123(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 아르기닌(R) 또는 리신(K)에 의해 치환되며, a) 하에 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고 위치 213(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되며;
여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 b) 하에 제2 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
108. 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
a) 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자,
b) 동시자극성 T 세포 항원, 특히 CD28에 특이적으로 결합하고, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL과 VH가 서로 대체되는 제2 Fab 분자,
c) 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자, 및
d) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자,
여기서 제1 및 제2 Fab 분자는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않고;
여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고 위치 123(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 아르기닌(R) 또는 리신(K)에 의해 치환되며, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고 위치 213(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되며;
여기서,
(i) a) 하에 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나,
(ii) b) 하에 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
109. 구체예 106 내지 108 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 94의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 95의 중쇄 CDR 2, 서열번호 96의 중쇄 CDR 3, 서열번호 97의 경쇄 CDR 1, 서열번호 98의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 99의 경쇄 CDR 3; 또는 서열번호 94의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 95의 중쇄 CDR 2, 서열번호 102의 중쇄 CDR 3, 서열번호 103의 경쇄 CDR 1, 서열번호 98의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 99의 경쇄 CDR 3을 포함한다
110. 구체예 106 내지 109 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 CD28에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 100의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 101의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 서열번호 104의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 105의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
111. 구체예 106 내지 110 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) EITPDSSTINYTPSLKD(서열번호 2), EITPDSSTINYTPSLKG(서열번호 11) 및 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16)로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR H2 아미노산 서열; 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
112. 구체예 106 내지 110 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
113. 구체예 106 내지 112 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 17 및 서열번호 19로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
114. 구체예 106 내지 113 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 7과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 8과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(ii) 서열번호 12와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(iii) 서열번호 17과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는
(iv) 서열번호 19와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열.
115. 구체예 106 내지 113 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 서열번호 19의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
116. 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
a) 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자;
b) 동시자극성 T 세포 항원, 특히 CD28에 특이적으로 결합하고, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL과 VH가 서로 대체되는 제2 Fab 분자;
c) 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자; 및
d) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자;
여기서,
(i) Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않고;
(ii) a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 2, 서열번호 11 및 서열번호 16으로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR 2 서열, 서열번호 3의 중쇄 CDR 3, 서열번호 4의 경쇄 CDR 1, 서열번호 5의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 3을 포함하고, b) 하에 제2 Fab 분자는 서열번호 94의 중쇄 CDR 1, 서열번호 95의 중쇄 CDR 2, 서열번호 96의 중쇄 CDR 3, 서열번호 97의 경쇄 CDR 1, 서열번호 98의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 99의 경쇄 CDR 3; 또는 서열번호 94의 중쇄 CDR 1, 서열번호 95의 중쇄 CDR 2, 서열번호 102의 중쇄 CDR 3, 서열번호 103의 경쇄 CDR 1, 서열번호 98의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 99의 경쇄 CDR 3을 포함하고;
(iii) a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고 위치 123(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R), 특히 아르기닌(R)에 의해 치환되며, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고 위치 213(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되며;
(iv) a) 하에 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
117. 구체예 116의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 16의 중쇄 CDR 2 서열, 서열번호 3의 중쇄 CDR 3, 서열번호 4의 경쇄 CDR 1, 서열번호 5의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 3을 포함한다.
118. 구체예 116 또는 117의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 7과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 8과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(ii) 서열번호 12와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(iii) 서열번호 17과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는
(iv) 서열번호 19와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열.
119. 구체예 116 또는 117의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, 서열번호 19의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
120. 구체예 116 내지 119 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 b) 하에 제2 Fab 분자는 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
121. 구체예 102 내지 120 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 반감기 연장 Fc 도메인은 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서, 아르기닌(R), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 구성된 목록으로부터 선택되는 아미노산에 의한 치환을 포함한다.
122. 구체예 1 내지 77 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
123. 구체예 122의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 동시자극성 T 세포 항원은 4-1BB이다.
124. 구체예 122 또는 123의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합한다.
125. 구체예 122 내지 124 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 4-1BB에 특이적으로 결합한다.
126. 구체예 122 내지 125 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 Fab 분자이다.
127. 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
a) 제1 Fab 분자,
b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL과 VH가 서로 대체되는 제2 Fab 분자, 및
c) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자;
여기서,
(i) 제1 Fab 분자는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하고, 제2 Fab 분자는 동시자극성 T 세포 항원, 특히 4-1BB에 특이적으로 결합하고, 제1 Fab 분자는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않거나;
(ii) 제2 Fab 분자는 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하고, 제1 Fab 분자는 동시자극성 T 세포 항원, 특히 4-1BB에 특이적으로 결합하고, 제2 Fab 분자는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않고;
여기서 a) 하에 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고 위치 123(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 아르기닌(R) 또는 리신(K)에 의해 치환되며, a) 하에 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고 위치 213(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되며;
여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 b) 하에 제2 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 c) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
128. 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
a) 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자,
b) 동시자극성 T 세포 항원, 특히 4-1BB에 특이적으로 결합하고, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL과 VH가 서로 대체되는 제2 Fab 분자,
c) 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자, 및
d) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자,
여기서 제1 및 제2 Fab 분자는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않고;
여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고 위치 123(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 아르기닌(R) 또는 리신(K)에 의해 치환되며, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고 위치 213(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되며;
여기서,
(i) a) 하에 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합되거나,
(ii) b) 하에 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 a) 하에 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
129. 구체예 126 내지 129 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 4-1BB에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 133의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 134의 중쇄 CDR 2, 서열번호 135의 중쇄 CDR 3, 서열번호 136의 경쇄 CDR 1, 서열번호 137의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 138의 경쇄 CDR 3을 포함한다.
130. 구체예 126 내지 129 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 4-1BB에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 i) 서열번호 139의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 140의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
131. 구체예 126 내지 130 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) EITPDSSTINYTPSLKD(서열번호 2), EITPDSSTINYTPSLKG(서열번호 11) 및 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16)로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR H2 아미노산 서열; 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
132. 구체예 126 내지 140 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 다음을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
(a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
(b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16); 및
(c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
(d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
(e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
(f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 가변 영역.
133. 구체예 126 내지 132 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 17 및 서열번호 19로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
134. 구체예 116 내지 133 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 7과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 8과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(ii) 서열번호 12와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(iii) 서열번호 17과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는
(iv) 서열번호 19와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열.
135. 구체예 126 내지 133 중 어느 하나에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 Fab 분자 및/또는 제3 Fab 분자는 서열번호 19의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
136. 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자로서,
a) 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자;
b) 동시자극성 T 세포 항원, 특히 4-1BB에 특이적으로 결합하고, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL과 VH가 서로 대체되는 제2 Fab 분자;
c) 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자; 및
d) 안정되게 연결될 수 있는 제1 및 제2 아단위로 구성되는 반감기 연장 Fc 도메인을 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자;
여기서,
(i) Fc 도메인 결합 모이어티는 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않고;
(ii) a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 2, 서열번호 11 및 서열번호 16으로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR 2 서열, 서열번호 3의 중쇄 CDR 3, 서열번호 4의 경쇄 CDR 1, 서열번호 5의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 3을 포함하고, b) 하에 제2 Fab 분자는 서열번호 133의 중쇄 CDR 1, 서열번호 134의 중쇄 CDR 2, 서열번호 135의 중쇄 CDR 3, 서열번호 136의 경쇄 CDR 1, 서열번호 137의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 138의 경쇄 CDR 3을 포함하고;
(iii) a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CL 내에 위치 124(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K)에 의해 치환되고 위치 123(Kabat에 따른 넘버링)에서 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R), 특히 아르기닌(R)에 의해 치환되며, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1 내에 위치 147(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되고 위치 213(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서 아미노산이 글루타민산(E)에 의해 치환되며;
(iv) a) 하에 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C 말단에서 b) 하에 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N 말단에 융합되고, b) 하에 제2 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, Fab 중쇄의 C 말단에서 d) 하에 Fc 도메인의 아단위 중에서 하나의 N 말단에 융합된다.
137. 구체예 136의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 16의 중쇄 CDR 2 서열, 서열번호 3의 중쇄 CDR 3, 서열번호 4의 경쇄 CDR 1, 서열번호 5의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 6의 경쇄 CDR 3을 포함한다.
138. 구체예 136 또는 137의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 7과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 8과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(ii) 서열번호 12와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(iii) 서열번호 17과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는
(iv) 서열번호 19와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열.
139. 구체예 136 또는 137의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 a) 하에 제1 Fab 분자 및 c) 하에 제3 Fab 분자는 각각, 서열번호 19의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
140. 구체예 136 내지 139 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 b) 하에 제2 Fab 분자는 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
141. 구체예 122 내지 140 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 반감기 연장 Fc 도메인은 위치 P329(Kabat EU 색인에 따른 넘버링)에서, 아르기닌(R), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 구성된 목록으로부터 선택되는 아미노산에 의한 치환을 포함한다.
142. 구체예 1 내지 48 중 어느 하나의 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 사이토카인이다.
143. 구체예 142의 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자, 여기서 사이토카인은 IL2, IL7, IL15, IL18, IFNa 및 IFNg로 구성된 군으로부터 선택된다.
144. 구체예 142 또는 143의 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 돌연변이체 인터류킨-2(IL-2) 폴리펩티드이다.
145. 구체예 105의 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자, 여기서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열번호 166에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자이다.
146. 구체예 145의 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자, 여기서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 아미노산 치환 T3A 및/또는 아미노산 치환 C125A를 추가로 포함한다.
147. 구체예 144 내지 146 중 어느 하나의 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자, 여기서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열번호 167의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 각각 비교하여 높은 친화성 IL-2 수용체에 대한 감소된 친화성 및 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 실제적으로 유사한 친화성을 나타낸다.
148. 구체예 144 내지 147 중 어느 하나의 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자, 여기서 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드는 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함한다.
149. 구체예 143 내지 148 중 어느 하나의 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 Fab 분자를 포함한다.
150. 구체예 149의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fab는 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 17 및 서열번호 19로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
151. 구체예 149의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fab는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 7과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 8과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(ii) 서열번호 12와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(iii) 서열번호 17과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는
(iv) 서열번호 19와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열.
152. 구체예 151의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fab는 서열번호 19의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
153. 구체예 1 내지 44 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 4-1BBL 또는 이의 단편의 3개의 엑토도메인을 포함한다.
154. 구체예 1 내지 44 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 각각, 제1 폴리펩티드는 제1 중쇄 불변(CH1) 또는 경쇄 불변(CL) 도메인을 내포하고, 제2 폴리펩티드는 CL 또는 CH1 도메인을 내포하고, 제2 폴리펩티드는 CH1과 CL 도메인 사이의 이황화 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 제1 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 서로 및 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인을 포함한다.
155. 구체예 153 또는 154의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 4-1BBL 또는 이의 단편의 엑토도메인은 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123 및 서열번호 124로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 117 또는 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함한다.
156. 구체예 153 내지 155 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 면역 활성화 모이어티는 제1 폴리펩티드가 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127 및 서열번호 128로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 서열번호 117, 서열번호 121, 서열번호 119 및 서열번호 120으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징으로 한다.
157. 구체예 1 내지 48 또는 153 내지 156 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 상기 분자는 Fc 도메인 결합 모이어티를 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄, 특히 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자, 및 면역 활성화 모이어티를 포함하는 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 포함하고, 각각, 제2 중쇄는 펩티드에 의해 서로 및 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하고, 제2 경쇄는 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
158. 구체예 154 내지 157 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 제1 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하는 제1 펩티드는 자체의 C 말단에서 제2 펩티드 링커에 의해, 중쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되고, 상기 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인을 포함하는 제2 펩티드는 자체의 C 말단에서 제3 펩티드 링커에 의해, 경쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합된다.
159. 구체예 153 내지 158 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 도메인 결합 모이어티는 Fab 분자를 포함한다.
160. 구체예 159의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fab는 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 17 및 서열번호 19로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
161. 구체예 159 또는 160의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fab는 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 7과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 8과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(ii) 서열번호 12와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열,
(iii) 서열번호 17과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열, 또는
(iv) 서열번호 19와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열.
162. 구체예 158 또는 159의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fab는 서열번호 19의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
163. 구체예 1 내지 70 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 면역 활성화 모이어티는 Fc 수용체에 특이적으로 결합할 수 있다.
164. 구체예 163의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 수용체는 Fc 감마 수용체, 특히 FcgRIIIa 수용체이다.
165. 구체예 163 또는 164의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 Fc 수용체는 CD16이다.
166. 구체예 1 내지 165 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 인코딩하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드.
167. 구체예 166의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 하나 이상의 벡터, 특히 발현 벡터.
168. 구체예 166의 폴리뉴클레오티드(들) 또는 구체예 167의 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포.
169. 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자를 생산하는 방법, 여기서 상기 방법은 a) 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 구체예 168의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 b) 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 회수하는 단계를 포함한다.
170. 구체예 169의 방법에 의해 생산된 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자.
171. 구체예 1 내지 165 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
172. 약제로서 사용을 위한 구체예 1 내지 165 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 또는 구체예 171의 약학 조성물.
173. 치료가 필요한 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한 구체예 1 내지 165 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 또는 구체예 171의 약학 조성물.
174. 구체예 173에 따른 사용을 위한 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 또는 약학 조성물, 여기서 질환은 암이다.
175. 치료가 필요한 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한 구체예 1 내지 165 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 또는 구체예 171의 약학 조성물, 여기서 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 표적 Fc 도메인을 포함하는 표적화 항체와 병용된다.
176. 구체예 175에 따른 사용을 위한 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 또는 약학 조성물, 여기서 질환은 암이다.
177. 구체예 175 또는 176의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 여기서 표적화 항체는 표적 항원, 특히 암 세포 상에서 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
178. 치료가 필요한 개체에서 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 구체예 1 내지 165 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 용도.
179. 개체에서 질환을 치료하는 방법, 여기서 상기 방법은 약학적으로 허용되는 형태로 구체예 1 내지 165 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 포함하는 조성물의 치료 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
180. 구체예 178의 용도 또는 구체예 179의 방법, 여기서 상기 질환은 암이다.
181. 개체에서 질환을 치료하는 방법, 여기서 상기 방법은
(a) 약학적으로 허용되는 형태로 구체예 1 내지 165 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 포함하는 조성물의 치료 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계; 및
(b) 표적 Fc 도메인을 포함하는 표적화 항체를 포함하는 조성물의 치료 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
182. 구체예 181의 방법, 여기서 질환은 암이다.
183. 구체예 181 또는 182의 방법, 여기서 표적화 항체는 표적 항원, 특히 암 세포 상에서 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
184. 구체예 181 내지 183 중 어느 하나의 방법, 여기서 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자는 표적 Fc 도메인을 포함하는 항체 이전에, 상기 항체와 동시에, 또는 상기 항체 이후에 투여된다.
185. 세포의 용해를 유도하기 위한 방법, 여기서 상기 방법은 세포를 T 세포의 존재하에 구체예 165 중 어느 하나의 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 및 표적 Fc 도메인을 포함하는 표적화 항체와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 표적화 항체가 세포 상에서 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
186. 전술된 바와 같은 발명.
예시적인 서열
항-P329G 항체
Kabat에 따른 CDR 정의
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
P329 IgG1 Fc 변이체
Figure pct00004
향상된 CD3 결합체
Kabat에 따른 CDR 정의
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
활성화 T 세포 항원 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 예시적인 면역 활성화 Fc 결합 분자
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
동시자극성 T 세포 항원 CD28에 특이적으로 결합할 수 있는 예시적인 면역 활성화 Fc 결합 분자
Kabat에 따른 CDR 정의
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
IL2 변이체를 포함하는 예시적인 면역 활성화 Fc 결합 분자
Figure pct00016
4-1BBL 엑토도메인을 포함하는 예시적인 면역 활성화 Fc 결합 분자
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
동시자극성 T 세포 항원 41BB에 특이적으로 결합할 수 있는 예시적인 면역 활성화 Fc 결합 분자
Kabat에 따른 CDR 정의
Figure pct00020
Figure pct00021
예시적인 표적화 항체
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
예시적인 IL2 서열
Figure pct00025
항-AAA 결합체
Figure pct00026
향상된 CD3 결합체
Figure pct00027
활성화 T 세포 항원 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 예시적인 면역 활성화 Fc 결합 분자
Figure pct00028
Figure pct00029
실시예
다음은 본원 발명의 방법과 조성물의 실시예이다. 앞서 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 구체예가 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
일반적인 방법
재조합 DNA 기술
Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989에서 설명된 바와 같은 표준 방법이 DNA를 조작하는 데 사용되었다. 분자 생물학적 시약은 제조업체의 사용설명서에 따라서 사용되었다. 인간 면역글로불린 경쇄와 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242에서 제공된다.
DNA 염기서열분석
DNA 서열은 이중 가닥 염기서열분석에 의해 결정되었다.
유전자 합성
원하는 유전자 분절은 필요한 경우에, 적합한 주형을 사용한 PCR에 의해 생성되거나, 자동화된 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 산물로부터 Geneart AG(Regensburg, Germany)에 의해 합성되었다. 정확한 유전자 서열이 가용하지 않은 경우에, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 가장 가까운 동족체로부터 서열에 기초하여 설계되었고, 유전자가 적합한 조직으로부터 유래하는 RNA로부터 RT-PCR에 의해 단리되었다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 개열 부위와 측접된 유전자 분절이 표준 클로닝 / 염기서열분석 벡터 내로 클로닝되었다. 플라스미드 DNA가 형질전환된 세균으로부터 정제되었고, 농도가 UV 분광법에 의해 결정되었다. 하위클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열이 DNA 염기서열분석에 의해 확증되었다. 유전자 분절이 개별 발현 벡터로의 하위클로닝을 가능하게 하기 위한 적합한 제한 부위를 갖도록 설계되었다. 모든 작제물은 진핵 세포에서 분비를 위한 단백질을 표적으로 하는 리더 펩티드를 코딩하는 5' 단부 DNA 서열을 갖도록 설계되었다.
HEK293 EBNA 또는 CHO EBNA 세포에서 IgG 유사 단백질의 생산
항체 및 이중특이적 항체가 HEK293 EBNA 세포 또는 CHO EBNA 세포의 일시적인 형질감염에 의해 생성되었다. 세포가 원심분리되었고, 배지가 미리 가온된 CD CHO 배지(Thermo Fisher, 카탈로그 번호 10743029)에 의해 대체되었다. 발현 벡터가 CD CHO 배지에 혼합되었고, PEI(폴리에틸렌이민, Polysciences, Inc, 카탈로그 번호 23966-1)가 첨가되었고, 용액이 와동되고 실온에서 10 분 동안 배양되었다. 그 후에, 세포(2 Mio/ml)가 벡터/PEI 용액과 혼합되고, 플라스크로 이전되고, 5% CO2 공기가 있는 진탕 인큐베이터에서 37℃에서 3 시간 동안 배양되었다. 배양 후, 보충물(총 용적의 80%)을 포함하는 Excell 배지가 첨가되었다(W. Zhou and A. Kantardjieff, Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, DOI: 10.1007/978-3-642-54050-9; 2014). 형질감염 후 1일에, 보충물(피드, 총 용적의 12%)이 첨가되었다. 세포 상층액이 7일 후 원심분리 및 차후 여과(0.2 μm 필터)에 의해 수확되었고, 단백질이 아래에 지시된 바와 같은 표준 방법에 의해, 수확된 상층액으로부터 정제되었다.
CHO K1 세포에서 IgG 유사 단백질의 생산
대안으로, 본원에서 설명된 항체 및 이중특이적 항체는 Evitria에 의해, 전통적인(비-PCR 기반) 클로닝 기술과 함께 자사의 독점적인 벡터 시스템을 사용하여, 및 현탁 적응 CHO K1 세포(본래 ATCC로부터 수령되고 Evitria에서 현탁 배양 동안 혈청 없는 성장에 적응됨)를 사용하여 제조되었다. 생산을 위해, Evitria는 자사의 독점적인, 동물-성분 없고 혈청 없는 배지(eviGrow 및 eviMake2) 및 자사의 독점적인 형질감염 시약(eviFect)을 사용하였다. 상층액이 원심분리 및 차후 여과(0.2 μm 필터)에 의해 수확되었고, 단백질이 표준 방법에 의해, 수확된 상층액으로부터 정제되었다.
IgG 유사 단백질의 정제
단백질이 표준 프로토콜을 참조하여, 여과된 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다. 간단히 말하면, Fc 내포 단백질이 단백질 A-친화성 크로마토그래피(평형화 완충액: 20 mM 구연산나트륨, 20 mM 인산나트륨, pH 7.5; 용리 완충액: 20 mM 구연산나트륨, pH 3.0)에 의해 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다. pH 3.0에서 용리가 달성되었고, 그 이후에 샘플의 즉각적인 pH 중화가 뒤따랐다. 단백질이 원심분리(Millipore Amicon® ULTRA-15 (Art.Nr.: UFC903096)에 의해 농축되었고, 응집된 단백질이 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화나트륨, pH 6.0에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단량체성 단백질로부터 분리되었다.
IgG 유사 단백질의 분석기술
정제된 단백질의 농도가 Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423에 따라서 아미노산 서열에 기초하여 계산된 질량 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 흡수를 계측함으로써 결정되었다. 이들 단백질의 순도와 분자량이 LabChipGXII 또는 LabChip GX Touch(Perkin Elmer)를 사용하여 환원제의 존재와 부재에서 CE-SDS에 의해 분석되었다. 응집체 함량의 결정이 작업 완충액(200 mM KH2PO4, 250 mM KCl pH 6.2, 0.02% NaN3)에서 평형화된 분석적 크기 배제 칼럼(TSKgel G3000 SW XL 또는 UP-SW3000)을 사용하여 25℃에서 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행되었다.
실시예 1
인간화 항-P329G 항체의 생성과 특징화
부모 및 인간화 항-P329G 항체가 HEK 세포에서 생산되고, 단백질A 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 모든 항체는 좋은 품질로 정제되었다(표 2).
[표 2]
항-P329G 항체의 생화학적 분석. 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 단량체 함량. 비환원 SDS 모세관 전기이동에 의해 결정된 순도.
Figure pct00030
인간 Fc(P329G)에 항-P329G 결합체 M-1.7.24의 부모 및 6개의 인간화 변이체의 결합
기계장치: Biacore T200
칩: CM5(# 739)
Fc1 내지 4: 항인간 Fab 특이적(GE Healthcare 28-9583-25)
포획: 40 s 동안 50 nM IgG(상층액으로부터)
피분석물: 200 nM 인간 Fc(P329G)(P1AD9000-004) 단일 주입
작업 완충액: HBS-EP
T°: 25℃
유량: 30 μl/분
연관: 240 초
해리: 240 초
재생: 2x60 초 동안 10 mM 글리신 pH 2.1
SPR 실험이 HBS-EP+를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20(BR-1006-69, GE Healthcare))으로서 사용하여, Biacore T200에서 수행되었다. 항인간 Fab 특이적 항체(GE Healthcare 28-9583-25)가 아민 연계에 의해 CM5 칩(GE Healthcare) 상에 직접적으로 고정되었다. IgG가 50 nM에서 40 s 동안 상층액으로부터 포획되었다. 연관 단계를 기록하기 위해, 200 nM의 인간 Fc(P329G)가 240 초 동안 30 μl/분으로 리간드 위에 통과되었다. 해리 단계가 240 s 동안 모니터링되고 샘플 용액에서 HBS-EP+로 전환함으로써 촉발되었다. 모든 주기 후, 60 초 동안 10 mM 글리신 pH 2.1의 2회 주입을 사용하여 칩 표면이 재생되었다. 참조 흐름 셀 1에서 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. 비교의 편의성을 위한 k오프를 획득하기 위해, 단일 결합 곡선이 해리 단계에서 적합되었다(Biacore Evaluation 소프트웨어, GE Healthcare).
인간 Fc(P329G)에 대한 항-P329G 결합체 M-1.7.24의 부모 및 3개의 인간화 변이체의 친화성
기계장치: Biacore T200
칩: CM5(# 772)
Fc1 내지 4: 항인간 Fab 특이적(GE Healthcare 28-9583-25)
포획: 60 s 동안 50 nM IgG
피분석물: 인간 Fc(P329G)(P1AD9000-004)
작업 완충액: HBS-EP
T°: 25℃
희석: 0.59에서 37.5 nM로 HBS-EP에서 2배 희석
유량: 30 μl/분
연관: 240 초
해리: 800 초
재생: 2x60 초 동안 10 mM 글리신 pH 2.1
SPR 실험이 HBS-EP+를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20(BR-1006-69, GE Healthcare))으로서 사용하여, Biacore T200에서 수행되었다. 항인간 Fab 특이적 항체(GE Healthcare 28-9583-25)가 아민 연계에 의해 CM5 칩(GE Healthcare) 상에 직접적으로 고정되었다. IgG가 50 nM에서 60 s 동안 포획되었다. 연관 단계를 기록하기 위해, 인간 Fc(P329G)의 2배 연속 희석액이 240 초 동안 30 μl/분으로 리간드 위에 통과되었다. 해리 단계가 800 s 동안 모니터링되고 샘플 용액에서 HBS-EP+로 전환함으로써 촉발되었다. 모든 주기 후, 60 초 동안 10 mM 글리신 pH 2.1의 2회 주입을 사용하여 칩 표면이 재생되었다. 참조 흐름 셀 1에서 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. Biaeval 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 적합시킴으로써, 친화성 상수가 동력학 속도 상수로부터 도출되었다. 계측이 독립된 연속 희석에서 삼중으로 수행되었다.
하기 샘플이 인간 Fc(P329G)에 결합에 대해 분석되었다(표 3).
[표 3]
인간 Fc(P329G)에 결합에 대해 분석된 샘플에 관한 설명.
Figure pct00031
인간 Fc(P329G)가 인간 IgG1의 플라스민 소화, 그 이후에 단백질A 및 크기 배제 크로마토그래피에 의한 친화성 정제에 의해 제조되었다.
인간 Fc(P329G)에 항-P329G 결합체 M-1.7.24의 부모 및 6개의 인간화 변이체의 결합
오프 레이트를 특징화하는 데 도움을 주기 위해, 해리 단계가 단일 곡선에 적합되었다. 결합 대 포획 반응 수준 사이의 비율이 계산되었다(표 4).
[표 4]
인간 Fc(P329G)에 결합에 대한 6개의 인간화 변이체의 결합 평가.
Figure pct00032
인간 Fc(P329G)에 대한 항-P329G 결합체 M-1.7.24의 부모 및 3개의 인간화 변이체의 친화성
부모와 유사한 결합 패턴을 갖는 3개의 인간화 변이체가 더 상세하게 평가되었다. 1:1 랭뮤어 결합에 대한 동역학 상수는 표 5에서 요약된다.
[표 5]
동역학 상수(1:1 랭뮤어 결합). 독립된 삼중물(동일한 실행 내에 독립된 연속 희석)의 평균과 표준 편차(괄호 안).
Figure pct00033
결론
6개의 인간화 변이체가 생성되었다. 이들 중 3개(VH4VL1, VH1VL2, VH1VL3)는 부모 M-1.7.24와 비교하여 인간 Fc(P329G)에 감소된 결합을 보여주었다. 다른 3개의 인간화 변이체(VH1VL1, VH2VL1, VH3VL1)는 부모 결합체와 매우 유사한 결합 동역학을 갖고, 인간화를 통해 친화성을 상실하지 않았다.
실시예 2
인간 IgG1 Fc에 FcγR 결합의 제거를 위한 P329x 변이체
P329G Fc 프레임워크에 결합하는 항체에 의해 인식되지 않는, 최소 효과기 기능을 갖는 Fc 변이체의 설계.
IgG1 Fc 프레임워크 내에 P329G 돌연변이에 대해 특이적인 항체(doi:10.1093/protein/gzz027.)의 보편적인 항체로서의 사용은 유사한 혈청 지속성을 유지하면서, Fc 감마 수용체에 결합을 제거하기 위한 Fc의 조작을 필요로 하였다. 본 실시예에서는 P329G 특이적 항체에 의해 인식되지 않는 침묵 Fc를 설계하기 위한, 인간 IgG1의 프롤린 329 주변의 변형을 설명한다.
2가지 파라미터가 고려되었다: a) 위치 329에서 잔기의 측쇄가 Fc 감마 수용체(doi: 10.1093/protein/gzw040.) 내에 2개의 보존된 트립토판 측쇄 사이에서 이른바 프롤린 샌드위치를 형성할 수 없어야 한다. b) 위치 329에서 돌연변이가 항-P329G 특이적 항체(doi.org/10.1093/protein/gzz027)에 의해 인식되지 않아야 한다.
Fc(PDB 코드: 6S5A)와 복합으로 항-P329G 항체의 구조의 분석은 Fc(쇄 H, 6S5A의)의 Gly329가 항-P329G 항체의 중쇄 가변 도메인의 3개 이상의 잔기(쇄 H의 Trp33, Pro100 및 Trp106. PDB 엔트리에 따른 잔기 넘버링)와 밀접하게 접촉한다는 것을 드러냈다. 이런 이유로, 글리신의 측쇄보다 큰 임의의 측쇄는 증가된 반발로 인해 항체 결합을 감소시킬 것으로 결론되었다. 숙주 방어에 의한 이러한 항체의 원치 않는 인식을 야기할 수 있는 신규한 B 세포 에피토프를 방지하기 위해, 항체 결합에 통상적으로 관련되는 큰, 표면-노출된, 친수성 잔기, 예컨대 리신, 글루타민 및 글루타민산염은 선택되지 않았다(doi: 10.1073/pnas.0804851105). 이들 고려 사항에도 불구하고, 아르기닌은 가장 큰 반발 잠재력을 갖는 잔기일 것으로 추정되었고, 이런 이유로 포함되었다. 더 작은 잔기 예컨대 알라닌, 류신, 이소류신(doi: 10.1073/pnas.0804851105)은 포함되지 않았다. 이들 고려 사항에 근거하여 4개의 아미노산이 선택되었다: 알라닌, 류신, 이소류신 및 아르기닌(가장 작은 측쇄에서 가장 큰 측쇄로 열거됨). P329A, P329L, P329I 및 P329R로 명명되는 돌연변이가 huIgG1 프레임워크 내에 도입되었다.
P329x huIgG1 변이체의 제조
4-1BB에 대해 특이적인 결합체를 인코딩하는 중쇄와 경쇄 DNA 서열의 가변 영역이 인간 IgG1의 불변 중쇄 또는 불변 경쇄 중 어느 하나와 인프레임으로 하위클로닝되었다.
Fc 부분에서, 329에서 프롤린이 다음 아미노산: 류신(L), 이소류신(I), 아르기닌(R) 및 알라닌(A)으로 치환되었다. Fc 감마 수용체에 결합을 제거하기 위해, Pro329 돌연변이뿐만 아니라 Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이가 중쇄의 불변 영역 내에 도입되었다. P329x 돌연변이를 내포하는 Fc 부분의 아미노산 서열은 서열번호 30-33이다.
이들 항체는 포유류 세포를, 1:1("중쇄": "벡터 경쇄")에서 상응하는 발현 벡터로 형질감염시킴으로써 생산되었다.
[표 6]
항-4-1BB huIgG1 P329x 변이체의 생화학적 분석
Figure pct00034
재조합 Fcγ 수용체에 huIgG1 P329x 변이체의 결합
재조합 Fc 감마 수용체에 결합하는 능력이 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 평가되었다. 모든 SPR 실험은 25℃에서 HBS-P+를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.30 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, GE Healthcare에 의해 공급됨)으로서 사용하여, Biacore T200에서 수행되었다. His-태깅된 인간 FcγR이 CM5 센서 칩의 표면에 연계된 항-His 항체에 의해 포획되었다. huIgG1 P329x 변이체가 150, 300 및 600 nM의 농도로 단일 주기 양식에서 20 μl/분의 유동률로 주입되었다. 해리 단계가 360 s까지 동안 모니터링되었다. 10 μl/분의 유동률에서 글리신 pH 1.5 용액으로 1 분 세척함으로써, 표면이 재생되었다. 포획된 FcγRI가 없는 표면으로부터 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. 블랭크 주입 또한 차감된다(=이중 참조). 양성 대조로서, 리툭시맙(CH B3026)이 또한 검정에 사용되었는데, 그 이유는 FcγRI에 전형적인 IgG1-유형 결합이 예상될 수 있기 때문이다. 이러한 설정은 도 3a에서 도시된다.
도 3b-3e의 센서그램에서 알 수 있는 바와 같이, P329L, P329I, P329R 및 P329A를 내포하는 huIgG1은 인간 FcγR1a, FcγR2a, FcγR2b 및 FcγR3a에 의해 결합될 수 없었다.
항-P329G 항체에 huIgG1 P329x 변이체의 결합
huIgG1 P329x 변이체가 항-P329G 항체(클론 M-1.7.24)에 의해 결합되는 능력에 대해 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 분석되었다. 모든 SPR 실험은 25℃에서 HBS-EP를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, Biacore, Freiburg/Germany)으로서 사용하여, Biacore T200에서 수행되었다. 항-P329G(M-1.7.24) 항체가 CM5 센서 칩의 표면에 연계되었다(고정 수준, 대략 5700 RU). huIgG1 P329x 변이체가 500 nM의 농도에서 30 μl/분의 유동률로 주입되었다. 해리 단계가 600 s까지 동안 모니터링되었다. 30 μl/분의 유동률에서 글리신 pH 2.1 용액으로 2 분 세척함으로써, 표면이 재생되었다. 고정된 항체가 없는 표면으로부터 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. 이러한 설정은 도 4a에서 목격될 수 있다.
P329L, P329I, P329A 또는 P329R 돌연변이를 갖는 huIgG1 항체는 P329G 돌연변이를 보유하는 인간 Fc에 대해 특이적인 항-P329G 결합체 M-1.7.24에 의해 인식되지 않는다(도 4b-4e). P329G와 유사하게, P329L/I/A/R 돌연변이는 인간 Fc 효과기를 침묵시키는 데 사용될 수 있다. P329G와 반대로, P329L/I/A/R 돌연변이는 항-P329G 결합체에 의해 인식되지 않는다.
실시예 3
최적화된 항-CD3(다중특이적) 항체의 제조
모든 최적화된 항-CD3 항체(클론 P033.078, P035.093, P035.064, P021.045, P004.042)는, 본원에서"CD3본래(CD3orig)"로 명명되고 각각, 서열번호 47 및 56의 VH와 VL 서열을 포함하는 전술된(예를 들면 본원에서 참조로서 편입되는 WO 2014/131712를 참조한다) CD3 결합체로부터 유래된 라이브러리를 사용한 파지 전시 선택 캠페인에 의해 생성되었다. 이들 라이브러리에서, 중쇄의 CDR3 영역 내에 위치된 위치 N97(Kabat 넘버링) 및 N100이 침묵되거나 제거되었다. 직접적인 비교를 위해, 모든 분자가 도 5a에서 묘사된 바와 같이, 항-TYRP1 항체를 예시적인 표적 세포 항원 결합 모이어티(서열번호 57-64)로서 사용하여, T 세포 이중특이적 항체(TCB) 형식으로 전환되었다.
중쇄와 경쇄 DNA 서열의 가변 영역이, 도 5 b-e에서 도시된 바와 같은 개별 수용자 포유류 발현 벡터 내로 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄 중 어느 하나와 인프레임으로 하위클로닝되었다.
이들 최적화된 항-CD3 항체의 서열은 표 7에서 표시된 서열번호에서 제공된다.
[표 7]
본 실시예에서 생성된 최적화된 항-CD3 항체의 서열.
Figure pct00035
경쇄의 상응하는 중쇄와의 정확한 대합을 향상시키기 위해, 돌연변이가 TYRP1 결합 Fab 분자의 인간 CL(E123R, Q124K) 및 인간 CH1(K147E, K213E) 내에 도입되었다.
중쇄의 정확한 대합(이종이합체성 분자의 형성)을 위해, 노브 인투 홀 돌연변이가 항체 중쇄의 불변 영역(각각, T366W/S354C 및 T366S/L368A/Y407V/ Y349C) 내에 도입되었다.
게다가, Fcγ 수용체에 결합을 제거하기 위해, P329G, L234A 및 L235A 돌연변이가 항체 중쇄의 불변 영역 내에 도입되었다.
제조된 TCB 분자의 전체 서열은 서열번호 65, 66, 67 및 69(P033.078), 서열번호 65, 66, 67 및 70(P035.093), 서열번호 65, 66, 67 및 71(P035.064), 서열번호 65, 66, 67 및 72(P021.045), 서열번호 65, 66, 67 및 73(P004.042)에서 제공된다.
CD3본래를 CD3 결합체로서 포함하는 상응하는 분자 역시 제조되었다.
이들 TCB는 Evitria(Switzerland)에 의해, 전통적인(비-PCR 기반) 클로닝 기술과 함께 자사의 독점적인 벡터 시스템을 사용하여, 및 현탁 적응 CHO K1 세포(본래 ATCC로부터 수령되고 Evitria에서 현탁 배양 동안 혈청 없는 성장에 적응됨)를 사용하여 제조되었다. 생산을 위해, Evitria는 자사의 독점적인, 동물-성분 없고 혈청 없는 배지(eviGrow 및 eviMake2) 및 자사의 독점적인 형질감염 시약(eviFect)을 사용하였다. 이들 세포는 1:1:2:1("벡터 노브 중쇄":"벡터 홀 중쇄":"벡터 CD3 경쇄":"벡터 TYRP1 경쇄")에서 상응하는 발현 벡터로 형질감염되었다. 상층액이 원심분리 및 차후 여과(0.2 μm 필터)에 의해 수확되었고, 단백질이 표준 방법에 의해, 수확된 상층액으로부터 정제되었다.
간단히 말하면, Fc 내포 단백질이 단백질 A-친화성 크로마토그래피(평형화 완충액: 20 mM 구연산나트륨, 20 mM 인산나트륨, pH 7.5; 용리 완충액: 20 mM 구연산나트륨, pH 3.0)에 의해, 여과된 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다. pH 3.0에서 용리가 달성되었고, 그 이후에 샘플의 즉각적인 pH 중화가 뒤따랐다. 단백질이 원심분리(Millipore Amicon® ULTRA-15, #UFC903096)에 의해 농축되었고, 응집된 단백질이 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화나트륨, pH 6.0에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단량체성 단백질로부터 분리되었다.
정제된 단백질의 농도가 Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423에 따라서 아미노산 서열에 기초하여 계산된 질량 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 흡수를 계측함으로써 결정되었다. 이들 단백질의 순도와 분자량이 LabChipGXII(Perkin Elmer)를 사용하여 환원제의 존재와 부재에서 CE-SDS에 의해 분석되었다. 응집체 함량의 결정이 작업 완충액(각각, 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노히드로클로라이드, pH 6.7 또는 200 mM KH2PO4, 250 mM KCl pH 6.2)에서 평형화된 분석적 크기 배제 칼럼(TSKgel G3000 SW XL 또는 UP-SW3000)을 사용하여 25℃에서 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행되었다.
제조된 TCB 분자의 생화학적 및 생물물리학적 분석으로부터 결과는 표 8에서 제공된다.
모든 TCB 분자는 좋은 품질로 생산될 수 있었다.
[표 8]
TCB 형식에서 항-CD3 항체의 생화학적 및 생물물리학적 분석.
Figure pct00036
최적화된 항-CD3(다중특이적) 항체의 열 안정성의 결정
실시예 1에서 제조된 항-CD3 항체(TCB 형식에서)의 열 안정성이 동적 광 산란(DLS)에 의해, 및 Optim 2 기기(Avacta Analytical, UK)를 사용하여 온도 램프를 적용함으로써 온도 의존성 내재성 단백질 형광의 모니터링에 의해 모니터링되었다.
1 mg/ml의 단백질 농도를 갖는 10 μg의 여과된 단백질 샘플이 Optim 2에 이중으로 적용되었다. 온도가 25℃에서 85℃로 0.1℃/분씩 높아졌고, 350 nm/330 nm에서 형광 강도의 비율 및 266 nm에서 산란 강도가 수집되었다.
결과는 표 9에서 도시된다. 실시예 1에서 생산된 모든 최적화된 CD3 결합체의 응집 온도(Tagg) 및 관찰된 온도 유도된 언폴딩 전이(Tm)의 중간점은 전술된 CD3 결합체 CD3본래와 비슷하거나 이보다 높다.
[표 9]
동적 광 산란 및 온도 의존성 내재성 단백질 형광의 변화에 의해 계측될 때 TCB 형식에서 항-CD3 항체의 열 안정성.
Figure pct00037
표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 최적화된 항-CD3(다중특이적) 항체의 기능적 특징화
모든 표면 플라스몬 공명(SPR) 실험은 HBS-EP+를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20; Biacore, Freiburg/Germany)으로서 사용하여, 25℃에서 Biacore T200에서 수행되었다.
친화성 계측을 위해, TCB 분자가 C1 센서칩(GE Healthcare) 표면 상에서, 고정된 항-Fc(P329G) IgG(인간 IgG1 Fc(P329G)에 특이적으로 결합하는 항체; "항-PG 항체" - 본원에서 참조로서 편입되는 WO 2017/072210을 참조한다)로 포획되었다. 실험 설정은 도 6에서 개략적으로 묘사된다. 포획 IgG가 표준 아민 연계 키트(GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여, 대략 400 공명 단위(RU)의 직접적인 고정에 의해 센서칩 표면에 연계되었다.
CD3에 대한 상호작용을 분석하기 위해, TCB 분자가 10 μl/분의 유동률로 25 nM에서 80 s 동안 포획되었다. 인간 및 시노몰구스 CD3ε 스토크-Fc(노브)-Avi/CD3δ 스토크-Fc(홀)(CD3ε/δ, 서열번호 41과 42(인간) 및 서열번호 43과 44(시노몰구스)를 참조한다)이 30 μl/분의 유동률에서 0.122 - 125 nM의 농도로 300 s 동안 흐름 셀을 통해 통과되었다. 해리가 800 s 동안 모니터링되었다.
참조 흐름 셀에서 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. 여기에서, 이들 항원은 고정된 항-PG 항체를 갖지만 TCB 분자 대신에 HBS-EP가 주입된 표면 위에 날려졌다.
수치 적분에 의해 1:1 랭뮤어 결합에 대한 반응 속도식을 적합시키기 위해, 동역학 상수가 Biacore T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 도출되었다. 상호작용의 반감기(t1/2)가 공식 t1/2 = ln2/k오프를 사용하여 계산되었다.
표 10에서, 전술된 결합체 CD3본래와 비교하여 최적화된 항-CD3 항체의 결합의 모든 동역학적 파라미터가 열거된다. 최적화된 항-CD3 항체(TCB 형식에서)는 낮은 nM 범위 내지 높은 pM 범위에서 KD 값으로 CD3ε/δ에 결합하는데, 인간 CD3ε/δ의 경우에 600 pM 내지 1.54 nM, 및 시노몰구스 CD3ε/δ의 경우에 200 pM 내지 700 pM의 KD-값으로 결합한다. CD3본래와 비교하여, 최적화된 항-CD3 항체의 인간 CD3ε/δ에 대한 결합 친화성이 SPR에 의해 동일한 조건하에 계측될 때 7 내지 10배까지 증가된다.
인간 CD3ε/δ에 일가 결합의 반감기는 항-CD3 항체 클론 P033.078의 경우에, CD3본래의 결합 반감기보다 6배까지 높은 11.6 분이다.
[표 10]
인간 및 시노몰구스 CD3ε/δ에 대한 항-CD3 항체(TCB 형식에서)의 친화성.
Figure pct00038
스트레스 후 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 최적화된 항-CD3(다중특이적) 항체의 특징화
탈아미드화 부위 제거의 효과 및 항체의 안정성에 대한 이의 효과를 평가하기 위해, 최적화된 항-CD3 항체(TCB 형식에서)가 37℃, pH 7.4에서 및 40℃, pH 6에서 14 일 동안 항온처리되고, 인간 CD3ε/δ에 그들의 결합 능력에 대해 SPR에 의해 더욱 분석되었다. -80℃ pH 6에서 보관된 샘플이 참조로서 사용되었다. 참조 샘플 및 40℃에서 스트레스 부하된 샘플은 20 mM His, 140 mM NaCl, pH 6.0에서, 및 37℃에서 스트레스 부하된 샘플은 PBS, pH 7.4에서, 1.0 mg/ml의 농도로 존재하였다. 스트레스 기간(14 일) 후, PBS에서 샘플이 추가 분석을 위해 20 mM His, 140 mM NaCl, pH 6.0에 다시 투석되었다.
모든 SPR 실험은 HBS-P+(10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7.4, 0.05% 계면활성제 P20)를 작업 및 희석 완충액으로서 사용하여, 25℃에서 Biacore T200 기기(GE Healthcare)에서 수행되었다. 비오틴화된 인간 CD3ε/δ(실시예 3, 서열번호 41 및 42 참조)뿐만 아니라 비오틴화된 항-huIgG(Capture Select, Thermo Scientific, #7103262100)가 시리즈 S 센서 칩 SA(GE Healthcare, #29104992) 상에 고정되어, 적어도 1000 공명 단위(RU)의 표면 밀도를 야기하였다. 2 μg/ml의 농도를 갖는 항-CD3 항체가 5 μl/분의 유동률로 30 s 동안 주입되었고, 해리가 120 s 동안 모니터링되었다. 10 mM 글리신 pH 1.5를 60 s 동안 주입함으로써 표면이 재생되었다. 블랭크 주입을 차감함으로써, 및 블랭크 대조 흐름 셀로부터 획득된 반응을 차감함으로써 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. 평가를 위해, 결합 반응이 주입 종료 5 초 후에 취해졌다. 결합 신호를 정규화하기 위해, CD3 결합이 항-huIgG 반응(고정된 항-huIgG 항체 상에서 CD3 항체의 포획 시에 획득된 신호(RU))에 의해 나눠졌다. 상대적 결합 활성이 각각의 온도 스트레스 부하된 샘플을 상응하는 스트레스 부하되지 않은 샘플에 참조함으로써 계산되었다.
표 11에서 도시된 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 모든 항-CD3 항체는 CD3본래와 비교하여, 스트레스 시에 CD3ε/δ에 대한 향상된 결합을 보여준다.
[표 11]
2 주 동안 pH 6/40℃ 또는 pH 7.4/37℃에서 항온처리 후 인간 CD3ε/δ에 대한 항-CD3 항체(TCB 형식에서)의 결합 활성.
Figure pct00039
최적화된 항-CD3(다중특이적) 항체를 사용한 Jurkat NFAT 리포터 세포 검정
최적화된 항-CD3 항체를 내포하는 (TYRP1 표적화) TCB가 표적 세포로서 CHO-K1 TYRP1 클론 76(세포가 CHO-K1 세포의 안정된 형질도입에 의해 생성되었다)의 존재하에 Jurkat NFAT 리포터 세포 검정에서 검사되었다. Jurkat NFAT 리포터 세포(Promega)가 10% FBS, 2 g/l 글루코오스(Sigma), 2 g/l NaHCO3(Sigma), 25 mM HEPES(Gibco), 1% GlutaMax(Gibco), 1 x NEAA(Sigma), 1% SoPyr(Sigma)(Jurkat NFAT 배지)를 내포하는 RPMI 1640(Gibco)에서 0.1-0.5 mio 세포/ml로 배양되었다. CHO-K1 TYRP1 클론 76 세포가 10% FBS 및 6 μg/ml 푸로마이신(Invivogen)을 내포하는 DMEM / F12 + GlutaMAX(1x)(Gibco)에서 배양되었다. 검정이 Jurkat NFAT 배지에서 수행되었다.
CHO-K1 TYRP1 클론 76 세포는 트립신(Gibco)을 사용하여 분리되었다. 세포가 계수되었고, 생존력이 검사되었다. 이들 표적 세포는 검정 배지에서 재현탁되었고, 10,000개의 세포가 흰색 편평 바닥 384 웰 평판에서 웰마다 파종되었다. 이후 TCB가 표시된 농도로 첨가되었다. Jurkat NFAT 리포터 세포가 계수되었고, 생존력이 검사되었고, 20,000개의 세포가 2:1의 효과기 대 표적(E:T) 비율에 상응하도록, 웰마다 파종되었다. 또한, 2% 단부 용적의 GloSensor cAMP 시약(E1291, Promega)이 각 웰에 첨가되었다. 표시된 배양 시간 후, Tecan Spark10M 장치를 사용하여 발광이 계측되었다.
도 7a-b에서 도시된 바와 같이, 최적화된 항-CD3 항체를 내포하는 TCB는 Jurkat NFAT 리포터 세포 상에서, 부모 결합체 CD3본래를 내포하는 TCB와 유사한 기능적 활성을 가졌다. 검사된 TCB는 CD3 활성화를 농도 의존성 방식으로 유도하였다.
최적화된 항-CD3(다중특이적) 항체를 사용한 원발성 흑색종 세포의 종양 세포 사멸
(TYRP1 표적화) TCB 형식에서 최적화된 항-CD3 항체가 새로 단리된 인간 PBMC를 사용한 종양 세포 사멸 검정에서 검사되고, 인간 흑색종 세포주 M150543(원발성 흑색종 세포주, University of Zurich의 피부과학 세포 은행으로부터 획득됨)과 공동배양되었다. 종양 세포 용해가 24 시간 및 48 시간 후 아폽토시스성 또는 괴사성 세포에 의해 세포 상층액 내로 방출된 LDH의 정량에 의해 결정되었다. CD4와 CD8 T 세포의 활성화가 48 시간 후 양쪽 세포 부분집합에서 CD69 및 CD25의 상향조절에 의해 분석되었다.
검정이 시작되기 전날에, 표적 세포(M150543)가 트립신(Gibco)을 사용하여 분리되고, PBS로 1회 세척되고, 성장 배지(10% FBS, 1% GlutaMax(Gibco) 및 1% SoPyr(Sigma)을 내포하는 RPMI 1640(Gibco))에서 0.3 mio 세포/ml의 밀도로 재현탁되었다. 100 μl의 세포 현탁액(30,000개의 세포를 내포)이 96 웰 편평 바닥 평판 내로 파종되었다. 이들 세포는 인큐베이터 내에 37℃에서 하룻밤 동안 배양되었다.
다음 날, PBMC가 건강한 공여자의 혈액으로부터 단리되었고, 생존력이 검사되었다. 배지가 도말된 표적 세포로부터 제거되었고, 100 μl의 검정 배지(2% FBS 및 1% GlutaMax(Gibco)를 내포하는 RPMI 1640(Gibco))가 웰에 첨가되었다. 항체가 검정 배지에서 표시된 농도로 희석되었고, 웰마다 50 μl가 표적 세포에 첨가되었다. 검정 배지가 대조 웰에 첨가되었다. 단리된 PBMC가 6 mio 세포/ml의 밀도로 재현탁되었고, 50 μl가 웰마다 첨가되어 300,000개 세포/웰(E:T 10:1)을 야기하였다. 자연발생적 LDH 방출(최소 용해 = 0%)의 결정을 위해, PBMC 및 표적 세포만 공동배양되었다. 최대 LDH 방출(최대 용해 = 100%)의 결정을 위해, 검정 배지만 표적 세포에 첨가되었다. 표적 세포의 부재에서 PBMC 플러스 TCB를 포함하는 대조 웰이 이들 TCB의 특이성을 검사하는 데 사용되었다. CD8과 CD4 T 세포가 표적을 발현하는 종양 세포의 부재에서 활성화되는지를 결정하기 위해, 48 시간 후 CD25의 발현이 분석되었다.
일차 LDH 계측 수 시간 전, 4% 트리톤 X-100(Bio-Rad)을 내포하는 50 μl의 검정 배지가 최대 LDH 방출을 위해 표적 세포만을 내포하는 웰에 첨가되었다(웰마다 1% 트리톤 X-100의 최종 농도를 야기). 검정물이 인큐베이터 내에 37℃에서 총 48 시간 동안 배양되었다. 일차 LDH 계측이 검정이 시작된 후 24 시간째에 수행되었다. 이를 위해, 세포독성 검출 키트(LDH)(Roche/Sigma, #11644793001)가 계측 전 실온으로 조정되었다. 검정 평판이 420 x g에서 4 분 동안 원심분리되었고, 웰마다 50 μl의 상층액이 분석을 위해 96 웰 편평 바닥 평판으로 이전되었다. 이후 웰마다 1.25 μl의 LDH 촉매 및 56.25 μl의 LDH 기질의 반응 혼합물이 제조되었다. 50 μl의 LDH 반응 혼합물이 차후에, 각 웰에 첨가되었고, 흡광도가 TECAN Infinite F50 기기를 사용하여 즉시 계측되었다. 이러한 계측은 검정이 시작된 후 48 시간째에 반복되었다.
그 후에 PBMC가 수확되고, CD25 및 CD69 상향조절을 계측함으로써 활성화에 대해 분석되었다. 상세하게는, 100 μl의 FACS 완충액이 각 웰에 첨가되었고, 세포가 FACS 염색을 위해 96 웰 U 바닥 평판으로 이전되었다. 평판이 400 x g에서 4 분 동안 원심분리되었고, 상층액이 제거되었고, 세포가 웰마다 150 μl FACS 완충액으로 세척되었다. 평판이 다시 한 번, 400 x g에서 4 분 동안 원심분리되었고, 상층액이 제거되었다. 차후에, CD4 APC(클론 RPA-T4, BioLegend), CD8 FITC(클론 SK1, BioLegend), CD25 BV421(클론 BC96, BioLegend) 및 CD69 PE(클론 FN50, BioLegend)를 내포하는, 웰마다 30 μl의 항체 혼합물이 세포에 첨가되었다. 이들 세포는 냉장고에서 30 분 동안 배양되었다. 그 후에 이들 세포는 FACS 완충액으로 2회 세척되고, 웰마다 1% PFA를 내포하는 100 μl FACS 완충액에서 재현탁되었다. 계측 전, 세포가 150 μl FACS 완충액에서 재현탁되었다. BD LSR Fortessa 장치를 사용하여 분석이 수행되었다.
항-CD3 항체 클론 P035.093 및 클론 P021.045을 내포하는 TCB를 사용한 처리는 가장 높은 종양 세포 사멸을 야기하였고, 클론 P033.078 및 클론 P035.064는 중간 정도의 종양 세포 사멸을 야기하였고, 그 다음 클론 P004.042는 부모 결합체 CD3본래를 내포하는 TCB와 비교하여 유사한 종양 세포 사멸을 유도하였다(도 8a-b). T 세포의 활성화는 항-CD3 항체 클론 P035.093 및 클론 P021.045를 내포하는 TCB로 처리될 때 가장 높은 반면, 다른 항-CD3 항체 클론을 내포하는 TCB는 부모 결합체 CD3본래를 내포하는 TCB와 유사한 T 세포 활성화를 야기하였다(도 9a-d).
도 10a-b에서 도시된 바와 같이, 검사된 TCB는 종양 표적 세포의 부재 시에 CD8과 CD4 T 세포에서 CD25 상향조절을 유도하지 않았다. 이러한 결과는 검사된 CD3 결합체가 예를 들면 T 세포 활성화를 유도하기 위해 종양 세포에 결합을 통한 교차연결에 의존하고 일가 형식에서 T 세포 활성화를 유도할 수 없다는 것을 보여준다.
최적화된 항-CD3 항체의 제조
최적화된 항-CD3 항체 클론 P033.078, P035.093 및 P004.042는 일가 인간 IgG1 형식으로 전환되었는데, 도 11a에서 묘사된 바와 같이 CD3 결합 모이어티 상에 교차된 VH와 VL 도메인을 가졌다.
중쇄와 경쇄 DNA 서열의 가변 영역이 도 11 b-d에서 도시된 바와 같이, 개별 수용자 포유류 발현 벡터 내로 미리 삽입된 불변 중쇄 또는 불변 경쇄 중 어느 하나와 인프레임으로 하위클로닝되었다.
중쇄의 정확한 대합(이종이합체성 분자의 형성)을 위해, 노브 인투 홀 돌연변이가 항체 중쇄의 불변 영역 내에 도입되었다(각각, T366W/S354C 및 T366S/L368A/Y407V/ Y349C).
게다가, Fcγ 수용체에 결합을 제거하기 위해, P329G, L234A 및 L235A 돌연변이가 항체 중쇄의 불변 영역 내에 도입되었다.
CD3본래를 CD3 결합체로서 포함하는 상응하는 분자 역시 제조되었다.
일가 IgG 분자가 실시예 1에서 TCB 분자에 대해 설명된 바와 같이, Evitria(Switzerland)에서 제조되고, 정제되고, 분석되었다. 세포의 형질감염을 위해, 상응하는 발현 벡터가 1:1:1 비율("벡터 노브 중쇄":"벡터 홀 중쇄":"벡터 경쇄")로 적용되었다.
제조된 일가 IgG 분자의 생화학적 및 생물물리학적 분석으로부터 결과는 표 12에서 제공된다.
모든 일가 IgG 분자는 좋은 품질로 생산될 수 있었다.
[표 12]
일가 IgG 형식에서 항-CD3 항체의 생화학적 및 생물물리학적 분석.
Figure pct00040
최적화된 항-CD3 항체의 열 안정성의 결정
일가 IgG 형식에서 항-CD3 항체의 열 안정성이 전술된 바와 같이, 동적 광 산란(DLS)에 의해, 및 온도 의존성 내재성 단백질 형광의 모니터링에 의해 모니터링되었다.
결과는 표 13에서 도시된다. 일가 IgG 형식에서 모든 최적화된 CD3 결합체의 응집 온도(Tagg) 및 관찰된 온도 유도된 언폴딩 전이(Tm)의 중간점은 전술된 CD3 결합체 CD3본래에 대해서와 비슷하거나 이보다 높다.
[표 13]
동적 광 산란 및 온도 의존성 내재성 단백질 형광의 변화에 의해 계측될 때 일가 IgG 형식에서 항-CD3 항체의 열 안정성.
Figure pct00041
표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 최적화된 항-CD3 항체의 기능적 특징화
SPR 실험이 전술된 바와 같은 일가 IgG 분자를 사용하여, 전술된 바와 같이 수행되었다.
CD3에 대한 상호작용을 분석하기 위해, IgG 분자가 5 μl/분의 유동률로 50 nM에서 240 s 동안 포획되었다. 인간 및 시노몰구스 CD3ε 스토크-Fc(노브)-Avi/CD3δ-스토크-Fc(홀)가 30 μl/분의 유동률에서 0.061 - 250 nM의 농도로 300 s 동안 흐름 셀을 통해 통과되었다. 해리가 800 s 동안 모니터링되었다.
표 14에서, 전술된 결합체 CD3본래와 비교하여 최적화된 항-CD3 항체의 결합의 모든 동역학적 파라미터가 열거된다. 최적화된 항-CD3 항체(일가 IgG 형식에서)는 낮은 nM 범위 내지 높은 pM 범위에서 KD 값으로 CD3ε/δ에 결합하는데, 인간 CD3ε/δ의 경우에 770 pM 내지 1.36 nM, 및 시노몰구스 CD3ε/δ의 경우에 200 pM 내지 400 pM의 KD-값으로 결합한다. CD3본래와 비교하여, 최적화된 항-CD3 항체의 인간 CD3ε/δ에 대한 결합 친화성이 SPR에 의해 동일한 조건하에 계측될 때 3.5 내지 15배까지 증가된다.
인간 CD3ε/δ에 일가 결합의 반감기는 항-CD3 항체 클론 P033.078의 경우에, CD3본래의 결합 반감기보다 2배를 초과하여 높은 8.69 분이다.
[표 14]
인간 및 시노몰구스 CD3ε/δ에 대한 항-CD3 항체(일가 IgG 형식에서)의 친화성. 삼중 계측으로부터 획득된 데이터.
Figure pct00042
*동역학적 값 및 친화성 값은 나쁜 적합 품질로 인해, 완전히 신뢰할 수는 없다
실시예 4
활성화 T 세포 항원 결합체를 포함하는 면역 활성화 Fc 결합 분자
하기 분자가 본 실시예에서, 포유류 세포에서 형질감염에 의해, 및 단백질A 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제에 의해 제조되었다.
전하 변경(CD3 결합체에서 VH/VL 교환)을 갖는 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB(도 2b의 형식, 서열번호 86, 68, 87, 88).
전하 변경(CD3 결합체에서 VH/VL 교환)을 갖는 항-P329G(VH3VL1) x CD3(CH2527) 1+1 TCB(도 2a의 형식, 서열번호 89, 68, 90, 91)
전하 변경(CD3 결합체에서 VH/VL 교환)을 갖는 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 1+1 TCB(도 2a의 형식, 서열번호 89, 70, 90, 91).
전하 변경(CD3 결합체에서 VH/VL 교환)을 갖는 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB(도 2b의 형식, 서열번호 89, 70, 90, 92).
[표 15]
항-P329G T 세포 이중특이체의 생화학적 분석. 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 단량체 함량. 비환원 SDS 모세관 전기이동에 의해 결정된 순도.
Figure pct00043
인간 CD3 엡실론-델타-Fc에 대한 항-P329G x CD3 TCB의 친화성
기계장치: Biacore T200
칩: SA(# 786)
Fc4: 인간 CD3 엡실론-델타-Fc 비오틴화됨(P1AA6127-015)
피분석물: 항-P329G x CD3 TCB
작업 완충액: HBS-EP
T°: 25℃
희석: 0.41에서 300 nM로 HBS-EP에서 3배 희석
유량: 30 μl/분
연관: 240 초
해리: 240 초
재생: 30 초 동안 10 mM 글리신 pH 1.5
SPR 실험이 HBS-EP+를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20(BR-1006-69, GE Healthcare))으로서 사용하여, Biacore T200에서 수행되었다. 비오틴화된 인간 CD3 엡실론-델타-Fc가 SA 칩(GE Healthcare) 상에 고정되었다. 연관 단계를 기록하기 위해, 항-P329G x CD3 TCB의 3배 연속 희석액이 240 초 동안 30 μl/분으로 리간드 위에 통과되었다. 해리 단계가 240 s 동안 모니터링되고 샘플 용액에서 HBS-EP+로 전환함으로써 촉발되었다. 모든 주기 후, 30 초 동안 10 mM 글리신 pH 1.5의 1회 주입을 사용하여 칩 표면이 재생되었다. 참조 흐름 셀 1에서 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. Biaeval 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 적합시킴으로써, 친화성 상수가 동력학 속도 상수로부터 도출되었다. 계측이 독립된 연속 희석에서 삼중으로 수행되었다.
고정된 인간 CD3 엡실론-델타-Fc에 항-P329G x CD3 TCB의 결합에 대한 1:1 랭뮤어 결합에 대한 동역학 상수는 표 16에서 요약된다.
[표 16]
항-P329G x CD3 TCB 및 인간 CD3 엡실론-델타-Fc 사이의 상호작용의 동역학 상수(1:1 랭뮤어 결합). 독립된 삼중물(동일한 실행 내에 독립된 연속 희석)의 평균과 표준 편차(괄호 안).
Figure pct00044
TCB( P329G)에 대한 항-P329G x CD3 TCB의 친화성
기계장치: Biacore T200
칩: C1(# 784, 785)
Fc 2(784): 항-P329G(VH3VL1) x CD3(CH2527) 1+1 TCB
Fc 3(784): 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 1+1 TCB
Fc 3(785): 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB
피분석물: Fc 상에 P329G를 갖는 관련 없는 TCB(P1AE7925-003)
작업 완충액: HBS-EP
T°: 25℃
희석: 0.09에서 600 nM로 HBS-EP에서 3배 희석
유량: 30 μl/분
연관: 240 초
해리: 800 초
재생: 2x60 초 동안 10 mM 글리신 pH 1.5
SPR 실험이 HBS-EP+를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20(BR-1006-69, GE Healthcare))으로서 사용하여, Biacore T200에서 수행되었다. 항-P329G x CD3 TCB가 아민 연계에 의해 C1 칩(GE Healthcare) 상에 직접적으로 고정되었다. 연관 단계를 기록하기 위해, Fc 상에 P329G를 갖는 관련 없는 TCB의 3배 연속 희석액이 240 초 동안 30 μl/분으로 리간드 위에 통과되었다. 해리 단계가 800 s 동안 모니터링되고 샘플 용액에서 HBS-EP+로 전환함으로써 촉발되었다. 모든 주기 후, 60 초 동안 10 mM 글리신 pH 1.5의 2회 주입을 사용하여 칩 표면이 재생되었다. 참조 흐름 셀 1에서 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. Biaeval 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 적합시킴으로써, 친화성 상수가 동력학 속도 상수로부터 도출되었다. 계측이 독립된 연속 희석에서 삼중으로 수행되었다.
Fc 상에 P329G 돌연변이를 보유하는 작제물에 항-P329G x CD3 TCB의 결합에 대한 1:1 랭뮤어 결합에 대한 동역학 상수는 표 17에서 요약된다.
[표 17]
항-P329G x CD3 TCB 및 Fc 상에 P329G 돌연변이를 보유하는 TCB의 상호작용의 동역학 상수(1:1 랭뮤어 결합). 독립된 삼중물(동일한 실행 내에 독립된 연속 희석)의 평균과 표준 편차(괄호 안).
Figure pct00045
인간 CD3 엡실론-델타-Fc 및 인간 Fc(P329G)에 항-P329G x CD3 TCB의 동시 결합
기계장치: Biacore T200
칩: SA(# 786)
Fc 2, 3, 4: 인간 CD3 엡실론-델타-Fc 비오틴화됨(P1AA6127-015)
피분석물: 항-P329G x CD3 TCBs, 그 이후에 인간 Fc(P329G) (P1AD9000-004)
작업 완충액: HBS-EP
T°: 25℃
유량: 30 μl/분
SPR 실험이 HBS-EP+를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20(BR-1006-69, GE Healthcare))으로서 사용하여, Biacore T200에서 수행되었다. 비오틴화된 인간 CD3 엡실론-델타-Fc가 스트렙타비딘 칩 상에 고정되었다. 50 nM의 항-P329G x CD3 TCB가 30 μl/분으로 30 초 동안, 그 이후에 500 nM의 인간 Fc(P329G)가 60 초 동안 주입되었다.
샘플
하기 샘플이 인간 CD3 엡실론-델타-Fc, 및 P329G 돌연변이를 보유하는 인간 Fc를 갖는 작제물에 결합에 대해 분석되었다(표 18).
[표 18]
인간 CD3 엡실론-델타-Fc 및 인간 Fc(P329G)에 결합에 대해 분석된 샘플에 관한 설명.
Figure pct00046
인간 Fc(P329G)가 인간 IgG1의 플라스민 소화, 그 이후에 단백질A 및 크기 배제 크로마토그래피에 의한 친화성 정제에 의해 제조되었다.
각 TCB에 대한 동시 결합의 센서그램은 도 15(a 내지 c)에서 도시된다.
항-P329G x CD3 TCB는 예상한 바와 같이 인간 CD3 엡실론-델타-Fc에 결합한다. P035.093 결합체의 친화성은 CH2527 결합체(0.3 및 3 nM 각각)에 대해서보다 대략 10배 높다. P329G 돌연변이를 보유하는 작제물에 대한 친화성은 6 및 30 nM 사이에서 변하고, 분자의 형식에 의해 영향을 받을지도 모른다. 이에 더하여, 양쪽 항원은 이중특이적 분자로부터 예상한 바와 같이, 동시에 결합될 수 있다.
FolR1+ HeLa 세포에서 Jurkat NFAT 활성화 검정
Jurkat NFAT 활성화가 10 시간의 기간에 걸쳐 2 시간의 간격을 두고 계측되었다. T 세포 교차연결 및 차후에 T 세포 활성화를 유도하는, 종양 표적화 huIgG1 및 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB의 능력이 종양 항원 양성 표적 세포(HeLa) 및 Jurkat-NFAT 리포터 세포(NFAT 프로모터를 갖는 CD3-발현 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주, GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega #CS176501)의 공동배양액을 사용하여 평가되었다. 고정된 huIgG1(종양 표적에 결합됨)의 P329G 돌연변이 및 CD3 항원(Jurkat-NFAT 리포터 세포 상에서 발현됨)에 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB의 동시 결합 시에, NFAT 프로모터가 활성화되고 활성 반딧불이 루시페라아제의 발현을 야기한다. 발광 신호(루시페라아제 기질의 첨가 시에 획득됨)의 강도는 CD3 활성화 및 신호전달의 강도에 비례한다.
종양 표적화 항체로서, 항-FolR1(16D5) P329G LALA huIgG1의 10배 감소하는 연속 적정이 uTCB의 가장 높은 최종 농도 66nM 내지 0.0066 nM의 범위 안에서 10배 감소하는 농도의 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB와 병용되었다. 종양 특이적 huIgG1 또한, 66nM 내지 0.0066 nM의 가장 높은 최종 농도를 획득하도록 적정되었다. 이러한 방식으로, Jurkat-NFAT-리포터 세포의 최적 활성화를 획득하기 위해, P329G huIgG1의 각 농도가 모든 농도의 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB와 병용되었다.
검정을 위해, HeLa 인간 종양 세포가 수확되었다. 이런 이유로 성장 배지가 제거되었고, 세포가 인산염 완충된 식염수(PBS, Gibco life technologies)로 1회 세척되었다. PBS를 제거한 후, 세포가 트립신처리되었다(트립신-EDTA(0.05%), 페놀 레드, Gibco). 세포 수 및 생존력이 ViCell을 사용하여 결정되었다. 약 0.002 x 106개 세포/웰(10 μl/웰)이 검정의 전날에, 편평 바닥, 하얀 벽 투명 바닥 384-웰-평판(Corning #3826) 내에 검정 배지(RPMI 1640, 10% FBS 및 1% 글루타맥스)에 도말되었다. 검정 당일에, Jurkat-NFAT 리포터 세포가 수확되었다. 이런 이유로 세포가 계수되었고, 생존력이 ViCell을 사용하여 평가되었다. 필요한 양이 350g에서 5 분 동안 원심분리에 의해 수확되었다. 5:1 표적 및 효과기 세포의 최종 E:T를 획득하기 위해, 약 0.01 x 106개 세포/웰(10 μl/웰)이 검정 배지에 도말되었다. 차후에 또한 상이한 항체가 40 μl의 최종 용적으로 384 웰 평판 내로 동시에 파종되었다. 상대적 발광 단위(RLU)의 동역학적 계측을 가능하게 하는, 기질로서 GloSensor™ cAMP 검정(E1290, Promega)이 제조업체의 프로토콜에 따라서 사용되었다. 배양 조건(37℃ 및 5% CO2)을 교란하지 않으면서 자동화된 계측을 가능하게 하는, 온도 제어 및 가습된 공기를 갖는 TecanReader를 사용하여, 판독이 2 시간마다 수행되었다. 도 16에서 각 포인트는 한 가지 실험의 기술적 삼중물의 평균값을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대에 의해 표시된다. P329G huIgG1과 조합으로 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB를 사용한 Jurkat-NFTA 리포터 검정에 대한 최적 조건으로서, 66nM uTCB 및 6.6 nM P329G huIgG1의 농도가 결정되었는데, 여기서 판독이 6-8 시간 후 수행되어야 한다.
CD20 + z-138 세포에서 Jurkat NFAT 활성화 검정
Jurkat NFAT 활성화가 10 시간의 기간에 걸쳐 2 시간의 간격을 두고 계측되었다. 상기 검정은 전술된 바와 같이 수행되었다. HeLa 세포 대신에, z-138 표적 세포가 사용되었다. 종양 표적화 항체로서, 항-CD20 P329G LALA huIgG1의 적정이 uTCB의 66nM 내지 0.0066 nM의 최종 농도 범위 안에서 상이한 농도의 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB와 병용되었다. 종양 특이적 huIgG1 또한, 66nM 내지 0.0066 nM의 최종 농도를 획득하도록 적정되었다. 도 17에서 각 포인트는 한 가지 실험의 기술적 삼중물의 평균값을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대에 의해 표시된다. P329G huIgG1과 조합으로 uTCB를 사용한 Jurkat-NFTA 리포터 검정에 대한 최적 조건으로서, 66nM uTCB 및 6.6 nM P329G huIgG1의 농도가 결정되었는데, 여기서 판독이 6-8 시간 후 수행되어야 한다.
FAP + MV3 세포에서 Jurkat NFAT 활성화 검정
Jurkat NFAT 활성화가 10 시간의 기간에 걸쳐 2 시간의 간격을 두고 계측되었다. 상기 검정은 전술된 바와 같이 수행되었다. HeLa 세포 대신에, MV3(FAP+) 표적 세포가 사용되었다. 종양 표적화 항체로서, 항-FAP P329G LALA huIgG1의 적정이 TCB의 66nM 내지 0.0066 nM의 최종 농도 범위 안에서 상이한 농도의 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB와 병용되었다. 종양 특이적 IgG 또한, 66nM 내지 0.0066 nM의 최종 농도를 획득하도록 적정되었다. 이러한 방식으로, Jurkat-NFAT-리포터 세포의 최적 활성화를 획득하기 위해, P329G IgG의 각 농도가 모든 농도의 uTCB와 병용되었다.
T 세포 교차연결 및 차후에 T 세포 활성화를 유도하는, 종양 표적화 huIgG1 및 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB의 능력이 종양 항원 양성 표적 세포(MV3) 및 Jurkat-NFAT 리포터 세포(NFAT 프로모터를 갖는 CD3-발현 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주, GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega #CS176501)의 공동배양액을 사용하여 평가되었다. 고정된 huIgG1(종양 표적에 결합됨)의 P329G 돌연변이 및 CD3 항원(Jurkat-NFAT 리포터 세포 상에서 발현됨)에 TCB의 동시 결합 시에, NFAT 프로모터가 활성화되고 활성 반딧불이 루시페라아제의 발현을 야기한다. 발광 신호(루시페라아제 기질의 첨가 시에 획득됨)의 강도는 CD3 활성화 및 신호전달의 강도에 비례한다. 도 18에서 각 포인트는 한 가지 실험의 기술적 삼중물의 평균값을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대에 의해 표시된다. P329G huIgG1과 조합으로 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB를 사용한 Jurkat-NFTA 리포터 검정에 대한 최적 조건으로서, 66nM TCB 및 6.6 nM P329G huIgG1의 농도가 결정되었는데, 여기서 판독이 6-8 시간 후 수행되어야 한다.
CD20 + Z-138 세포 및 SU-DHL-4 세포에서 Jurkat NFAT 활성화 검정
Jurkat NFAT 활성화가 표적화 항체의 Fc 내에 P329G 돌연변이 및 T 세포 상에 CD3을 표적으로 하는 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB와 함께 CD20 표적화 P329G LALA huIgG1의 존재하에 계측되었다. 종양 표적화 항체로서, 항-CD20 P329G LALA IgG1의 적정이 66nM 내지 0.0066 nM의 가장 높은 최종 농도의 범위 안에서 상이한 농도의 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB 둘 모두와 병용되었다.
Jurkat NFAT 리포터 세포주는 NFAT 프로모터를 갖는 CD3-발현 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega #CS176501)이다. 고정된 huIgG1(종양 표적에 결합됨)의 P329G 돌연변이 및 CD3 항원(Jurkat-NFAT 리포터 세포 상에서 발현됨)에 TCB의 동시 결합 시에, NFAT 프로모터가 활성화되고 활성 반딧불이 루시페라아제의 발현을 야기한다. 발광 신호(루시페라아제 기질의 첨가 시에 획득됨)의 강도는 CD3 활성화 및 신호전달의 강도에 비례한다.
검정을 위해, 종양 표적 세포 z-138(CD20+) 또는 SU-DHL-4(20+)가 계수되고, ViCell을 사용하여 그들의 생존력에 대해 검사되었다. 원하는 양의 종양 표적 세포가 350g에서 5 분 동안 원심분리에 의해 수확되었다. 세포가 검정 배지(RPMI1640 + 10% FBS 및 1% 글루타맥스)에서 재현탁되었고, 0.002 x 106개 세포/웰(10 μl/웰) 각각이 편평 바닥, 하얀 벽 투명 바닥 384-웰-평판(Corning #3826)에 도말되었다. 차후에, Jurkat-NFAT 리포터 세포가 수확되었고, ViCell을 사용하여 생존력이 평가되었다. 5:1의 최종 E:T를 획득하기 위해, 세포가 0.01 x 106개 세포/웰(10 μl/웰)로 도말되었다. uTCB 및 IgG의 연속 희석액이 검정 배지에서 제조되었다. 각각, 10 μl/웰의 IgG 및 10 μl/웰의 원하는 uTCB 농도가 384 웰 평판 내에 개별 웰에 첨가되었다. 최종 검정 용적은 40 μl이었다.
7 시간의 배양 시간 후, 20%의 ONE-Glo™ 루시페라아제 검정 판독(Promega, E6120)이 추가되었고, 상대적 발광 단위(RLU)를 계측하는, Tecan® 평판 판독기를 사용한 판독이 즉시 수행되었다. 각 포인트는 한 가지 실험의 기술적 삼중물의 평균값을 나타낸다. 표준 편차는 오차 막대에 의해 표시된다.
항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB 단독은 표적 세포의 어떤 활성화도 나타내지 않고, 일차 항체로서 항-FolR1 P329G huIgG1 항체가 사용된 대조 조건(FOLR1이 표적 세포 상에서 발현되지 않는다) 또한 어떤 Jurkat 활성화도 나타내지 않는다. Jurkat NFAT 세포의 활성화는 일차 항-CD20 P329G LALA huIgG1 항체가 TCB와 병용될 때 관찰될 수 있었다(도 19). 이러한 활성화는 용량 의존성이다.
CD20 + SU-DHL-4 세포에서 Jurkat NFAT 활성화 검정
특이적 T 세포 교차연결 및 차후에 T 세포 활성화를 유도하는, 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB의 능력이 종양 표적 세포 및 Jurkat-NFAT 리포터 세포(NFAT 프로모터를 갖는 CD3-발현 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주, GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega #CS176501)의 공동배양액을 사용하여 평가되었다. 상기 검정은 전술된 바와 같이 수행되었다. P329G 돌연변이에 대한 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB의 결합 특이성이 SU-DHL-4(CD20+) 종양 세포 및 Jurkat-NFAT 리포터 세포의 공동배양액에서 항-CD20 P329G LALA huIgG1, 항-CD20 LALA huIgG1 또는 항-CD20 야생형-Fc huIgG1의 적정을 사용하여 평가되었다. 모든 항체는 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB와 병용으로 6.6 nM(1:10 연속 희석)부터 시작하여 적정되었다. 이러한 검정은 TCB의 특이성을 보여주는데, 그 이유는 P329G 돌연변이를 갖는 종양 항원 표적화 CD20 항체가 TCB와 병용되는 경우에만, 리포터 세포주의 활성화가 검출 가능하기 때문이다(도 20).
유착성 종양 세포의 사멸
유착성 종양 세포의 사멸이 시간의 추이에서 생존 세포 영상화 장치 Incucyte를 사용하여, 적색 핵 세포 수의 정량에 의해 평가되었다. 유착성 표적 세포가 수확되고, 계수되고, vicell 계수기를 사용하여 그들의 생존력에 대해 검사되었다. 실험 전날에, 세포가 검정 배지(진전된 RPMI 1640 +10%FBS + 1% 글루타맥스 + Pen/Strep)에서 원하는 세포 밀도로 조정되고, 웰에 적절한 유착을 담보하기 위해 100 μl 검정 배지에 파종되었다. 검정 평판으로서, TPP로부터 편평 바닥 투명 96 웰 평판이 사용되었다. 효과기 세포로서, 인간 PBMC 또는 항-P329G CAR T 세포(항-P329G TCB와 동일한 돌연변이에 대하여 특이적)가 계수되고, Vicell 계수기를 사용하여 그들의 생존력에 대해 검사되었다. 세포가 원심분리(5 분 및 350g)에 의해 수확되고, 원하는 세포 밀도로 조정되었다. 세포가 10:1의 E:T 비율로 검정 배지에 파종되었다. 세포가 50 또는 검정-배지에 파종된다. 항체의 제조: 항체가 검정 배지에서 희석되었고, 66nM TCB 및/또는 6.6 nM 종양 표적화 P329G huIgG1의 최종 농도를 획득하기 위해, 50 μl의 IgG 및/또는 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB가 개별 웰에 첨가되었다(항-EpCAM: 도 21a, 항-STEAP: 도 21b 또는 항-FAP: 도 21c). 평판이 IncuCyte(37℃ 및 5% CO2 가습된 공기) 내에 배치되었다. 이미지당 표적 세포 수가 Essen BioScience 소프트웨어를 사용하여 평가되었다. 이미지당 적색 핵 수치에 의해 평가된, 시간의 추이에서 종양 세포 감소를 보여주는 대표적인 그래프가 묘사된다(도 21a-21c). 항-P329G(M-1.7.24) x CD3(CH2527) 2+1 TCB 중 어느 하나가 개별 종양 특이적 P329G 소유 huIgG1과 병용될 때, 종양 세포 성장이 손상되는 것으로 관찰될 수 있다. 게다가 종양 세포 성장은 또한, 개별 항원을 직접적으로 표적화하는 개별 TCB가 사용되거나, 항-P329G CAR T 세포가 종양 특이적 P329G 소유 huIgG1과 병용될 때 손상된다.
상이한 T 세포 활성화 Fc 결합 분자 형식에 의한 T 세포의 활성화
특이적 T 세포 교차연결 및 차후에 T 세포 활성화를 유도하는, 2+1 또는 1+1 항-P329G TCB의 능력이 전술된 바와 같이, 종양 표적 세포 및 Jurkat-NFAT 리포터 세포(NFAT 프로모터를 갖는 CD3-발현 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주, GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega #CS176501)의 공동배양액을 사용하여 평가되었다. P329G 소유 종양 옵소닌화 huIgG1 및 CD3 항원(Jurkat-NFAT 리포터 세포 상에서 발현됨)에 항-P329G TCB의 동시 결합 시에, Jurkat NFAT 프로모터가 활성화되고 활성 반딧불이 루시페라아제의 발현을 야기한다. 발광 신호의 강도는 CD3 활성화 및 신호전달의 강도에 비례하고, 루시페라아제 기질의 첨가 시에 계측될 수 있다. 검정을 위해, 종양 표적 SUDHL-4 세포는 75 nM의 가장 높은 농도에서 시작하여 적정된 TCB(1:4 연속 희석에서) 또는 150 nM의 가장 높은 농도에서 시작하는 huIgG1(또한, 1:4의 연속 희석에서)의 항체 희석 열이었다. 10 μl/웰의 각 항체가 개별 웰에 첨가되었다. 실험이 1:2의 최종 TCB 대 huIgG1 비율로 수행되었다. 최종 검정 용적은 웰마다 40 μl이었다. 이러한 검정은 항-P329G x CD3 1+1 TCB 형식을 갖는 항-P329G x CD3 2+1 TCB를, CD3 결합체 변이체 CH2527 또는 P035 039와 병용으로 M-1.7.24 또는 인간화 VH3VL1 P329G 결합체와 비교하기 위해 수행되었다(도 22). TCB 형식과 무관하게, (CH2527) CD3 결합체와 병용으로 뮤린 항-P329G(M-1.24) 결합체는 인간화 항-P329G 결합체 및 P035 039 CD3 결합체를 갖는 TCB보다 덜 강력한 것으로 증명된다. 이러한 실험은 SU-DHL-4 표적 세포 및 CD20 표적화 huIgG1이 사용된 점을 제외하고, 상기에서와 유사하게 수행되었다. 도 22는 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P 035 093) 2+1 TCB가 EC50 및 안정기 값의 관점에서 최고의 성과를 낸다는 것을 보여준다.
인간 PBMC에 의한 HeLa 표적 세포 용해
항-P329G(VH3VL1) x CD3(P 035 093) 2+1 보편적 TCB 또는 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P 035 093) 1+1 보편적 TCB(uTCB)와 함께 배양 시에 5.5 시간, 24 시간 및 48 시간 후 방출된 LDH의 계측에 의해, 종양 세포 용해가 결정되었다. 표적 세포가 수확되고, 계수되고, 그들의 생존력에 대해 검사되었다. 0.03 x106개 세포/웰이 TPP로부터 편평 바닥 96 웰 평판 내에 100 μl의 그들의 배양 배지에 도말되었다.
다음 날 PBMC 효과기 세포가 헬싱키 선언에 따라서 Zurich 헌혈 센터로부터 획득된 백혈구연층으로부터 단리되었다. 백혈구연층이 PBS로 2:1 희석되었고, 인간 PBMC가 Histopaque-1077(Sigma-Aldrich #10771) 위에서 밀도 기울기 원심분리(450 x g, 중단 없이 실온에서 30 분)에 의해 단리되었다. PBMC가 간기로부터 수확되고, 350 g에서 10 분 동안 PBS로 3회 세척되었다. 세척한 후 PBMC가 계수되었고, 원하는 양이 검정 평판의 개별 웰 내에 100 μl 용적으로 검정 배지에 5:1 E:T 비율로 파종되었다.
uTCB 및 IgG의 연속 희석액이 검정 배지에서 1:10 희석 단계에서 제조되었다. uTCB 대 IgG 비율은 1:2이었는데, 최종 uTCB 농도는 75 nM 내지 0.0000075 nM이었고, 최종 IgG 농도는 150 nM 내지 0.0000150 nM의 범위 안에 있었다.
5.5 시간, 24 시간 및 48 시간의 배양 후, 아폽토시스성/괴사성 세포에 의해 세포 상층액 내로 방출된 LDH의 정량(LDH 검출 키트, Roche Applied Science, #11 644 793 001)에 의해, 표적 세포 사멸이 평가되었다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)는 대조 웰마다 1% 트리톤 X-100의 최종 농도와 함께 표적 세포의 배양(가습된 인큐베이터 내에 37℃ 및 5 Co2에서 1 시간)에 의해 달성되었다. 최소 용해(= 0%)는 이중특이적 항체 없이 효과기 세포와 공동배양된 표적 세포를 지칭한다. 멀티채널 피펫을 사용하여, 50 μl의 상층액이 투명 96 웰 평판으로 이전되었고, 1:1 갓 제조된 세포독성 시약이 제조업체의 프로토콜에 따라서 제조되었고, 흡광도가 10 분의 간격에 걸쳐 Tecan Spark 판독기로 계측되었다.
삼중물로부터 기술적 평균값의 용량 적합 곡선이 묘사되고, 오차 막대는 GraphPadPrism7을 사용하여 계산된 SD를 표시한다. 도 23은 5.5 시간 배양(도 23a) 후 종양 세포 용해가 유도되지 않았음을 보여준다. 20 시간(도 23b) 후, 종양 용해가 1+1 형식에서뿐만 아니라 2+1 형식에서 양쪽 형식 uTCB에 대해 검출 가능해지기 시작하였다. 42 시간(도 23c) 후, 계측된 종양 세포 용해가 양쪽 형식에 대해 증가하지만, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P 035 093) 2+1 TCB 형식이 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P 035 093) 1+1 TCB 형식과 비교하여 우수하였다.
인간 PBMC에 의한 CD19+ Nalm 6 표적 세포 용해
항-P329G(VH3VL1) x CD3(P 035 039) 2+1 TCB 또는 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P 035 039) 1+1 TCB 형식(uTCB)과 함께 배양 시에 5.5 시간(도 14a), 24 시간(도 14b) 및 48 시간(도 14c) 후 방출된 LDH 의 계측에 의해, 종양 세포 용해가 결정되었다. 표적 세포가 수확되고, 계수되고, 그들의 생존력에 대해 검사되었다. 0.03 x106개 세포/웰이 TPP로부터 편평 바닥 96 웰 평판 내에 100 μl의 그들의 배양 배지에 도말되었다. 다음 날 인간 PBMC 효과기 세포가 Histopaque(Sigma) 위에서 구배 원심분리에 의해 신선한 혈액으로부터 단리되고, 2% FCS 및 1% GlutaMax를 내포하는 50 μl 진전된 RPMI1640(검정 배지)에 파종되었다. uTCB 및 IgG의 연속 희석액이 검정 배지에서 1:10 희석 단계에서 제조되었다. uTCB 대 IgG 비율은 1:2이었는데, 최종 uTCB 농도는 75 nM 내지 0.0000075 nM이었고, 최종 IgG 농도는 150 nM 내지 0.0000150 nM의 범위 안에 있었다. 종양 세포 용해가 유산 탈수소효소(LDH) 방출의 열량측정 정량에 의해 5.5 시간, 20 시간 및 42 시간 후 평가되었다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)는 1% 트리톤 X-100과 함께 표적 세포의 배양에 의해 달성되었다. 최소 용해(= 0%)는 이중특이적 항체 없이 효과기 세포와 공동배양된 표적 세포를 지칭한다. 삼중물로부터 기술적 평균값의 용량 적합 곡선이 묘사되고, 오차 막대는 GraphPadPrism7을 사용하여 계산된 SD를 표시한다. 도 24a는 5.5 시간 후 검출 가능한 종양 세포 용해가 없음을 보여준다. 20 시간 후, 종양 용해가 1+1 형식에서뿐만 아니라 2+1 형식에서 양쪽 형식 uTCB에 대해 검출 가능해지기 시작하였다(도 24b). 42 시간 후, 계측된 종양 세포 용해가 양쪽 형식에 대해 증가하지만, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P 035 093) 2+1 TCB 형식이 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P 035 093) 1+1 TCB 형식과 비교하여 우수하였다(도 24C).
실시예 4
동시자극성(CD28) 면역 활성화 모이어티를 포함하는 Fc 결합 분자
CD28의 세포외 도메인의 클로닝
인간 CD28(Uniprot: P10747)의 세포외 도메인(성숙된 단백질의 아미노산 1 내지 134)을 인코딩하는 DNA 단편이, 용해도- 및 정제 태그로서 역할을 하는 hum IgG1 Fc 단편을 인코딩하는 단편의 상류에 두 가지 상이한 포유류 수용자 벡터 내로 인프레임으로 삽입되었다. 발현 벡터 중에서 하나는 Fc 영역에서 "홀" 돌연변이를 내포하였고, 다른 하나는 "노브" 돌연변이뿐만 아니라 Bir A 비오틴 리가아제와의 공동발현 동안 특이적 비오틴화를 가능하게 하는 C 말단 avi 태그를 내포하였다. 이에 더하여, 양쪽 Fc 단편은 PG-LALA 돌연변이를 내포하였다. 양쪽 벡터는 Fc-노브 쇄의 C 말단에서 일가 비오틴화된 avi-태그를 갖는 이합체성 CD28-Fc 작제물을 얻기 위해, BirA 비오틴 리가아제를 코딩하는 단편과 함께 동시형질감염되었다.
표적화된 CD28 작제물의 클로닝
모든 발현 플라스미드의 생성을 위해, 가변 도메인의 서열이 사용되고, 개별 수용자 포유류 발현 벡터 내에 미리 삽입되는 개별 불변 영역과 인프레임으로 하위클로닝되었다. 결과의 분자에 관한 개략적 설명은 도 25에서 도시된다. 표시된 경우에, Fc 감마 수용체에 결합을 제거하기 위해, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이(LALA)가 인간 IgG1 중쇄의 불변 영역 내에 도입되었다. 이중특이적 및 삼중특이적 항체의 생성을 위해, Fc-단편은 중쇄의 오대합을 방지하기 위한 "노브" 또는 "홀" 돌연변이 중 어느 하나를 내포하였다. 모든 작제물에서 경쇄의 오대합을 방지하기 위해, VH/VL, CH1/CL(카파), 또는 CH1/CL(람다) 도메인의 교환이 하나의 결합 모이어티에 도입되었다(CrossFab 기술). 다른 결합 모이어티에서, 전하가 CH1 및 C카파 또는 C람다 도메인 내로 도입되었다.
하기 분자가 클로닝되었다; 이들의 개략적 도해는 도 25에서 도시된다:
분자 A, 항-P329G 결합체 M-1.7.24에서 전하 변경 및 TGN1412 결합제 변이체 15(노브)에서 VH/VL 교환을 갖는 항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412 _변이체 15_교차됨) 1+1, 이중특이적 huIgG1 LALA CrossFab 분자(도 25a, 서열번호 93, 106, 88, 107).
분자 B, 항-P329G 결합체 M-1.7.24에서 전하 변경 및 TGN1412 결합제 변이체 8(노브)에서 VH/VL 교환을 갖는 항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412 _변이체 8_교차됨) 1+1, 이중특이적 huIgG1 LALA CrossFab 분자(도 25b, 서열번호 93, 108, 88, 109).
분자 C, 인간화 항-P329G 결합체 VH3xVL1에서 전하 변경 및 TGN1412 결합제 변이체 8(노브)에서 VH/VL 교환을 갖는 항-P329G(VH3xVL1) x CD28(TGN1412 _변이체 8_교차됨) 1+1, 이중특이적 huIgG1 LALA CrossFab 분자(도 25c, 서열번호 89, 108, 90, 109).
분자 D, TGN1412 결합제 변이체 8(노브)에서 전하 변경 및 인간화 항-P329G 결합체 VH3xVL1(홀)에서 VH/VL 교환을 갖는 항-P329G(VH3VL1) x CD28(TGN1412 _변이체 8)1+1, 이중특이적 huIgG1 LALA CrossFab 분자(도 25d, 서열번호 110, 111, 112, 113).
분자 E, TGN1412 결합제 변이체 8에서 VH/VL 교환 및 인간화 항-P329G 결합체 VH3VL1에서 전하 변경을 갖는 항-P329G(VH3VL1) x CD28(TGN1412 _변이체 8) 2+1_반전됨, 2+1 huIgG1 LALA CrossFab 분자, "반전된 배향정위"(도 25e, 서열번호 89, 108, 90, 114).
분자 F, TGN1412 결합제 변이체에서 VH/VL 교환 및 인간화 항-P329G 결합체 VH3VL1에서 전하 변경을 갖는 항-P329G(VH3VL1) x CD28(TGN1412 _변이체 8) 2+1_고전적, 2+1 huIgG1 LALA CrossFab 분자, "고전적인 배향정위"(도 25f, 서열번호 89, 108, 90, 115).
표적화된 CD28 작제물의 생산
전술된 분자의 발현은 CMV 프로모터에 의해 주동된다. 폴리아데닐화가 CDS의 3' 단부에 위치된 합성 폴리A 신호 서열에 의해 시작된다. 이에 더하여, 각 벡터는 상염색체 복제를 위한 EBV OriP 서열을 내포한다.
항체 및 이중특이적 항체가 전술된 바와 같이 HEK293 EBNA 세포 또는 CHO EBNA 세포의 일시적인 형질감염에 의해 생성되었고, 단백질이 아래에 표시된 바와 같이 표준 방법에 의해, 수확된 상층액으로부터 정제되었다.
표적화된 CD28 작제물의 정제
단백질이 표준 프로토콜을 참조하여, 및 전술된 바와 같이, 여과된 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다.
표적화된 CD28 작제물의 분석기술
정제된 단백질의 농도가 전술된 바와 같이 결정되었다. 모든 분자의 정제 파라미터의 요약은 표 19에서 제공된다.
[표 19]
"항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412 _변이체 15_교차됨) 1+1" 분자의 생산과 정제의 요약
Figure pct00047
PG 표적화 CD28 분자 A의 SPR 분석
샘플
표 20에서 설명된 샘플은 인간 CD28-Fc, 및 P329G 돌연변이를 보유하는 인간 Fc를 갖는 작제물에 결합에 대해 분석되었다.
[표 20]
인간 CD28-Fc 및 인간 Fc(P329G)에 결합에 대해 분석된 샘플에 관한 설명.
Figure pct00048
인간 CD28-Fc에 대한 항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412_var15_교차됨) 1+1의 친화성
기계장치: Biacore T200
칩: C1(# 782)
Fc4: 항인간 Fc 특이적(Roche internal)
포획: 30 s 동안 25 nM CD28-Fc(P1AE1329-007)
피분석물: 항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412_var15_교차됨) 1+1 (P1AE9465-005)
작업 완충액: HBS-EP
T°: 25℃
희석: 0.09에서 200 nM로 HBS-EP에서 3배 희석
유량: 30 μl/분
연관: 240 초
해리: 1000 초
재생: 2x60 초 동안 10 mM 글리신 pH 2.1
SPR 실험이 HBS-EP+를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20(BR-1006-69, GE Healthcare))으로서 사용하여, Biacore T200에서 수행되었다. 항인간 Fc 특이적 항체(Roche internal)가 아민 연계에 의해 C1 칩(GE Healthcare) 상에 직접적으로 고정되었다. CD28-Fc가 25 nM에서 30 s 동안 포획되었다. 연관 단계를 기록하기 위해, 항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412_var15_교차됨) 1+1의 3배 연속 희석액이 240 초 동안 30 μl/분으로 리간드 위에 통과되었다. 해리 단계가 1000 s 동안 모니터링되고 샘플 용액에서 HBS-EP+로 전환함으로써 촉발되었다. 모든 주기 후, 60 초 동안 10 mM 글리신 pH 2.1의 2회 주입을 사용하여 칩 표면이 재생되었다. 참조 흐름 셀 1에서 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. Biaeval 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 적합시킴으로써, 친화성 상수가 동력학 속도 상수로부터 도출되었다. 계측이 독립된 연속 희석에서 삼중으로 수행되었다. 1:1 랭뮤어 결합에 대한 동역학 상수는 표 21에서 요약된다.
[표 21]
항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412_var15_교차됨) 1+1 및 인간 CD28-Fc 사이의 상호작용의 동역학 상수(1:1 랭뮤어 결합). 독립된 삼중물(동일한 실행 내에 독립된 연속 희석)의 평균과 표준 편차(괄호 안).
Figure pct00049
TCB( P329G)에 대한 항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412_var15_교차됨) 1+1의 친화성
기계장치: Biacore T200
칩: C1(# 787)
Fc 3: 항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412_var15_교차됨) 1+1 (P1AE9465-005)
피분석물: Fc 상에 P329G를 갖는 관련 없는 TCB(P1AE7925-003)
작업 완충액: HBS-EP
T°: 25℃
희석: 0.69에서 500 nM로 HBS-EP에서 3배 희석
유량: 30 μl/분
연관: 240 초
해리: 600 초
재생: 2x60 초 동안 10 mM 글리신 pH 1.5
SPR 실험이 HBS-EP+를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20(BR-1006-69, GE Healthcare))으로서 사용하여, Biacore T200에서 수행되었다. 항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412_var15_교차됨) 1+1이 아민 연계에 의해 C1 칩(GE Healthcare) 상에 직접적으로 고정되었다. 연관 단계를 기록하기 위해, Fc 상에 P329G를 갖는 관련 없는 TCB의 3배 연속 희석액이 240 초 동안 30 μl/분으로 리간드 위에 통과되었다. 해리 단계가 600 s 동안 모니터링되고 샘플 용액에서 HBS-EP+로 전환함으로써 촉발되었다. 모든 주기 후, 60 초 동안 10 mM 글리신 pH 1.5의 2회 주입을 사용하여 칩 표면이 재생되었다. 참조 흐름 셀 1에서 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. Biaeval 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 적합시킴으로써, 친화성 상수가 동력학 속도 상수로부터 도출되었다. 계측이 독립된 연속 희석에서 삼중으로 수행되었다. 1:1 랭뮤어 결합에 대한 동역학 상수는 표 22에서 요약된다.
[표 22]
항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412_var15_교차됨) 1+1 및 Fc 상에 P329G 돌연변이를 보유하는 TCB의 상호작용의 동역학 상수(1:1 랭뮤어 결합). 독립된 삼중물(동일한 실행 내에 독립된 연속 희석)의 평균과 표준 편차(괄호 안).
Figure pct00050
인간 CD28-Fc 및 TCB(P329G)에 항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412_var15_교차됨) 1+1의 동시 결합
기계장치: Biacore T200
칩: C1(# 787)
Fc 3: 항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412_var15_교차됨) 1+1 (P1AE9465-005)
피분석물: 인간 CD28-Fc(P1AE1329-007), 그 이후에 Fc 상에 P329G를 갖는 관련 없는 TCB(P1AE7925-003)
작업 완충액: HBS-EP
T°: 25℃
유량: 30 μl/분
SPR 실험이 HBS-EP+를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20(BR-1006-69, GE Healthcare))으로서 사용하여, Biacore T200에서 수행되었다.
항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412_var15_교차됨) 1+1이 표준 아민 연계 키트(GE Healthcare)를 사용하여 C1 칩 상에 화학적으로 고정되었다. 600 nM의 인간 CD28-Fc가 120 초 동안 30 μl/분으로 주입되었고, 그 이후에 Fc 상에 P329G 돌연변이를 갖는 500 nM의 관련 없는 TCB가 120 초 동안 주입되었다. 주입은 2회 반복되었다.
동시 결합의 센서그램은 도 26에서 도시된다.
인간 CD28을 과다발현하는 세포에 CD28 이중특이적 항체의 결합
인간 CD28에 결합을 계측하기 위해, 우리는 인간 CD28을 과다발현하도록 안정되게 형질감염된 CHO 세포(부모 세포주 CHO-k1 ATCC #CCL-61)를 사용한 FACS 기반 결합 검정을 수행하였다.
간단히 말하면, 유착성 CHO 세포가 세포 해리 완충액(Gibco)을 사용하여 분리되고, 계수되고, 생존력에 대해 검사되었다. 모든 차후 단계는 4℃에서 수행되었다.
세포가 ml당 1 Mio 세포로 FACS 완충액에서 재현탁되었다. 0.1 Mio 세포가 둥근 바닥 96 웰-평판의 웰마다 도말되고 원심분리되었고, 상층액이 폐기되었다. 세포가 웰마다 50 μl의 총 용적에서, 및 증가하는 농도의 표시된 CD28 이중특이적 분자(0.12 - 500 nM)로 4℃에서 30 분 동안 염색되었다. 세포는 FACS 완충액으로 2회 세척되고, 미리 희석된 이차 항체(Jackson Immunoresearch으로부터 PE-AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항인간 IgG, Fcγ 단편 특이적, 109-116-170)를 내포하는, 웰마다 총 25 μl로 4℃에서 30 분 동안 배양되고, FACS 완충액에서 1:100 희석되었다. 세포가 2회 세척되고, 소프트웨어 FACS Diva가 구비된 BD Canto 유세포분석기에서 분석되었다. 결합 곡선 및 EC50 값이 GraphPadPrism6을 사용하여 획득되었다.
도 27은 19.6 nM의 EC50으로, 인간 CD28에 aPG-CD28 분자의 농도 의존성 결합을 보여준다.
IL-2 리포터 검정(T 세포 활성화의 기능적 특징화)
CD3 IgG-매개된 T 세포 활성화를 뒷받침하는 aPG-CD28의 능력을 평가하기 위해, IL-2 리포터 세포(Promega, 카탈로그 번호 J1651)가 효과기 세포(IL-2 프로모터에 의해 주동된 루시페라아제 리포터를 발현하는 Jurkat T 세포주)로서 사용되었다.
간단히 말하면, 2.5 x104개의 IL-2 리포터 세포가 흰색 편평 바닥 384 웰 평판(353988 FalconTM)의 웰 내로 첨가되고, 37℃에서 4 시간 동안, 단독으로 또는 감소하는 농도의 CD28 이중특이적 분자(34.4 nM - 8.4 pM; 1:4 희석 단계)와 함께, 625 pM CD3 IgG(PGLALA 내포 Fc 부분을 갖는 CD3 결합체 CH2527)의 존재하에 배양되었다. 검정 평판이 실온에서 5 분 동안 배양되었고, 그 이후에 20 μl의 기질(ONE-Glo 용액, Promega, 카탈로그 번호 E6120)의 첨가가 뒤따랐다. 실온에서 어둠하에 추가로 10 분의 배양 후, Tecan Spark 10M 평판 판독기를 사용하여 발광(수치/초)이 정량되었다.
도 28에서 묘사된 바와 같이, PG 표적화 CD28 분자는 제1 T 세포 활성화 자극, 다시 말하면 CD3 IgG의 부재에서 어떤 Jurkat 활성화도 유도할 수 없다. 하지만, CD3 IgG의 Fc 부분의 PG 돌연변이뿐만 아니라 Jurkt 세포 상에서 발현된 CD28에 동시 결합 시에, 이것은 Jurkat 세포의 CD3 IgG 유발 기준선 활성화를 농도 의존성 방식으로 부양할 수 있다. 그것에 의하여, 가장 강한 부스팅 효과가 34.4 nM의 aPG-CD28 분자에서 관찰된다. 이러한 효과는 양쪽 표적화 모이어티를 통한 PG-CD28의 교차연결에 의존한다: PG 표적화 모이어티 대신에 관련 없는 종양-항원 표적화 모이어티를 나타내는 유사한 CD28 분자의 존재하에는 CD3 IgG 매개된 Jurkat 활성화의 부스팅이 관찰되지 않았다. 게다가, PG 표적화 CD28 분자는 단독으로, 또는 자체의 Fc 부분에서 PGLALA를 내포하는 인간 IgG 아이소타입 대조의 존재하에 투여될 때 어떤 Jurkat T 세포 활성화도 유도할 수 없다.
결론
항-P329G(M-1.7.24) x CD28(TGN1412_var15_교차됨) 1+1은 예상한 바와 같이, 3 nM의 친화성으로 인간 CD28-Fc에 결합한다. Fc(P329G)에 대한 친화성은 예상보다 낮고, 5 nM가 아닌 대략 40 nM이다. 친화성은 CD28 결합 Fab 팔에 의해 영향을 받을지도 모른다. 양쪽 항원은 이중특이적 분자로부터 예상한 바와 같이, 동시에 결합될 수 있다.
항-P329G-항-CD28 분자는 P329G 돌연변이뿐만 아니라 인간 CD28에 농도 의존성 방식으로 결합하고, 결과적으로, 제1 T 세포 자극 단독의 존재하에 (Jurkat) T 세포 활성화를 유도한다.
실시예 5
사이토카인( IL2v ) 면역 활성화 모이어티를 포함하는 Fc 결합 분자
하기 분자가 본 실시예에서, 포유류 세포에서 형질감염에 의해, 및 단백질A 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제에 의해 제조되었다.
항-P329G(M-1.7.24) x IL2v huIgG1(도 29a의 형식, 서열번호 86, 116, 88).
항-P329G(VH3VL1) x IL2v huIgG1(도 29a의 형식, 서열번호 15, 116, 90).
항-P329G(M-1.7.24) x IL2v huIgG1은 좋은 품질로 생산되었다(표 23).
[표 23]
항-P329G(M-1.7.24) x IL2v huIgG1의 생화학적 분석. 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 단량체 함량. 비환원 SDS 모세관 전기이동에 의해 결정된 순도.
Figure pct00051
샘플
하기 샘플이 인간 IL2R 베타-감마-Fc, 및 P329G 돌연변이를 보유하는 인간 Fc를 갖는 작제물에 결합에 대해 분석되었다(표 24).
[표 24]
인간 IL2R 베타-감마-Fc 및 인간 Fc(P329G)에 결합에 대해 분석된 샘플에 관한 설명.
Figure pct00052
인간 Fc(P329G)가 인간 IgG1의 플라스민 소화, 그 이후에 단백질A 및 크기 배제 크로마토그래피에 의한 친화성 정제에 의해 제조되었다.
인간 IL2R-Fc에 대한 항-P329G(M-1.7.24) x IL2v huIgG1의 친화성
기계장치: Biacore T200
칩: CM5(# 772)
Fc1 내지 4: 항인간 Fab 특이적(GE Healthcare 28-9583-25)
포획: 120 s 동안 10 nM IgG-IL2v
피분석물: 인간 IL2R 베타-감마-Fc(P1AE2657-005)
작업 완충액: HBS-EP
T°: 25℃
희석: 0.09에서 200 nM로 HBS-EP에서 3배 희석
유량: 30 μl/분
연관: 240 초
해리: 800 초
재생: 2x60 초 동안 10 mM 글리신 pH 2.1
SPR 실험이 HBS-EP+를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20(BR-1006-69, GE Healthcare))으로서 사용하여, Biacore T200에서 수행되었다. 항인간 Fab 특이적 항체(GE Healthcare 28-9583-25)가 아민 연계에 의해 CM5 칩(GE Healthcare) 상에 직접적으로 고정되었다. 항-P329G(M-1.7.24) x IL2v huIgG1이 10 nM에서 120 s 동안 포획되었다. 연관 단계를 기록하기 위해, 인간 IL2R 베타-감마-Fc의 3배 연속 희석액이 240 초 동안 30 μl/분으로 리간드 위에 통과되었다. 해리 단계가 800 s 동안 모니터링되고 샘플 용액에서 HBS-EP+로 전환함으로써 촉발되었다. 모든 주기 후, 60 초 동안 10 mM 글리신 pH 2.1의 2회 주입을 사용하여 칩 표면이 재생되었다. 참조 흐름 셀 1에서 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. Biaeval 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 적합시킴으로써, 친화성 상수가 동력학 속도 상수로부터 도출되었다. 계측이 독립된 연속 희석에서 삼중으로 수행되었다.
1:1 랭뮤어 결합에 대한 동역학 상수는 표 25에서 요약된다.
[표 25]
항-P329G(M-1.7.24) x IL2v huIgG1 및 인간 IL2R-Fc 사이의 상호작용의 동역학 상수(1:1 랭뮤어 결합). 독립된 삼중물(동일한 실행 내에 독립된 연속 희석)의 평균과 표준 편차(괄호 안).
Figure pct00053
TCB( P329G)에 대한 항-P329G(M-1.7.24) x IL2v huIgG1의 친화성
기계장치: Biacore T200
칩: C1(# 785)
Fc 2: 항-P329G(M-1.7.24) x IL2v huIgG1
피분석물: Fc 상에 P329G를 갖는 관련 없는 TCB(P1AE7925-003)
작업 완충액: HBS-EP
T°: 25℃
희석: 0.09에서 600 nM로 HBS-EP에서 3배 희석
유량: 30 μl/분
연관: 240 초
해리: 800 초
재생: 2x60 초 동안 10 mM 글리신 pH 1.5
SPR 실험이 HBS-EP+를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20(BR-1006-69, GE Healthcare))으로서 사용하여, Biacore T200에서 수행되었다. 항-P329G(M-1.7.24) x IL2v huIgG1이 아민 연계에 의해 C1 칩(GE Healthcare) 상에 직접적으로 고정되었다. 연관 단계를 기록하기 위해, Fc 상에 P329G를 갖는 관련 없는 TCB의 3배 연속 희석액이 240 초 동안 30 μl/분으로 리간드 위에 통과되었다. 해리 단계가 800 s 동안 모니터링되고 샘플 용액에서 HBS-EP+로 전환함으로써 촉발되었다. 모든 주기 후, 60 초 동안 10 mM 글리신 pH 1.5의 2회 주입을 사용하여 칩 표면이 재생되었다. 참조 흐름 셀 1에서 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정되었다. Biaeval 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합에 적합시킴으로써, 친화성 상수가 동력학 속도 상수로부터 도출되었다. 계측이 독립된 연속 희석에서 삼중으로 수행되었다.
1:1 랭뮤어 결합에 대한 동역학 상수는 표 26에서 요약된다.
[표 26]
항-P329G(M-1.7.24) x IL2v huIgG1 및 Fc 상에 P329G 돌연변이를 보유하는 TCB의 상호작용의 동역학 상수(1:1 랭뮤어 결합). 독립된 삼중물(동일한 실행 내에 독립된 연속 희석)의 평균과 표준 편차(괄호 안).
Figure pct00054
인간 IL2R 베타-감마-Fc 및 인간 Fc(P329G)에 항-P329G(M-1.7.24) x IL2v huIgG1의 동시 결합
기계장치: Biacore T200
칩: SA(# 783)
Fc 2: IL2R 베타-감마-Fc 비오틴화됨(P1AE2657-005)
피분석물: 항-P329G(M-1.7.24) x IL2v huIgG1, 그 이후에 인간 Fc (P329G)(P1AD9000-004)
작업 완충액: HBS-EP
T°: 25℃
유량: 30 μl/분
SPR 실험이 HBS-EP+를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20(BR-1006-69, GE Healthcare))으로서 사용하여, Biacore T200에서 수행되었다. 비오틴화된 인간 IL2R 베타-감마-Fc가 스트렙타비딘 칩 상에 고정되었다. 200 nM의 항-P329G(M-1.7.24) x IL2v huIgG1이 240 초 동안 30 μl/분으로 주입되었고, 그 이후에 400 nM의 인간 Fc(P329G)가 180 초 동안 주입되었다. 주입은 3회 반복되었다.
동시 결합의 센서그램은 도 29b에서 도시된다.
결론
항-P329G(M-1.7.24) x IL2v huIgG1은 예상한 바와 같이 인간 IL2R 베타-감마-Fc 및 인간 Fc(P329G)에 결합한다. 양쪽 항원은 이중특이적 분자로부터 예상한 바와 같이, 동시에 결합될 수 있다.
항-PD-1 처리된 및 처리되지 않은 PD-1 + CD4 T 세포에서 증가하는 용량의 aPG-IL2v로 처리 시에 IL-2R 신호전달(STAT5-P)
이러한 실험에서, STAT5 인산화(STAT5-P)가 항-PD-1 항체로 이전에 전처리된 PD-1+ CD4 T 세포의 IL-2R로 항-PG-IL2v 화합물의 IL-2v 전달을 증명하는 데 사용되었다.
이러한 목적으로 CD4 T 세포가 CD4 비드(130-045-101, Miltenyi)로 건강한 공여자 PBMC로부터 분류되고, PD-1 발현을 유도하기 위해 1 μg/ml 평판 결합된 항-CD3(하룻밤 동안 피복됨, 클론 OKT3, #317315, BioLegend) 및 1 μg/ml의 가용성 항-CD28(클론 CD28.2, #302923, BioLegend) 항체의 존재하에 3일 동안 활성화되었다. 3 일 후, 이들 세포는 수확되고 내인성 IL-2를 제거하기 위해 수회 세척되었다. 이후, 이들 세포는 2개의 군으로 분할되었는데, 이들 중에서 하나가 실온에서 30 분 동안 포화 농도의 항-PD1 항체(인하우스 분자, 10ug/ml)와 함께 배양되었다.
과잉의 결합되지 않은 항-PD-1 항체를 제거하기 위한 여러 세척 단계 이후에, 37℃에서 12 분 동안 증가하는 농도의 치료 항체(50ul, 66 nM의 가장 높은 농도를 갖는 1:10 희석 단계)로 처리되기 전, 항-PD1 전처리된 및 처리되지 않은 세포(50ul, 2*106개 세포/ml)가 V-바닥 평판 내로 파종되었다. 인산화 상태를 보존하기 위해, 다양한 작제물과 함께 12 분 배양 직후에 동등한 양의 Phosphoflow Fix 완충액 I(100ul, 557870, BD)가 첨가되었다. 이들 세포는 이후, Phosphoflow PermBuffer III(558050, BD)로 -80℃에서 하룻밤 동안 투과화되기 전 37℃에서 추가로 30 분 동안 배양되었다. 그 다음 날, 인산화된 형태에서 STAT-5가, 항-STAT-5P 항체(47/Stat5(pY694) 클론, 562076, BD)를 사용함으로써 4℃에서 30 분 동안 염색되었다.
세포가 FACS BD-LSR Fortessa(BD Bioscience)에서 획득되었다. STAT-5P의 빈도 및 기하 평균 형광 강도(MFI)가 FlowJo(V10)로 결정되고 GraphPad Prism으로 플로팅되었다(도 29c 및 29d).
이러한 실험은 aPG-IL2v가, 여기에서 양성 대조로서 사용된 PD1-IL2v보다 거의 3배 더 적은 효능으로 IL-2v를 항-PD-1 전처리된 CD4 T 세포로 전달한다는 것을 증명한다. 항-PD-1 전처리의 부재, 및 이런 이유로 표적화의 부재에서, PG-IL2v는 표적화되지 않은 IL-2R 신호전달을 평가하기 위한 대조로서 여기에서 사용된 FAP-IL2v와 비슷하였다.
실시예 6
동시자극성(4- 1BBL ) 면역 활성화 모이어티를 포함하는 Fc 결합 분자
P329G 표적화 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 Fc 융합 단백질의 제조
P329G Fc 돌연변이에 대해 특이적인 결합체를 인코딩하는 중쇄와 경쇄 DNA 서열의 가변 영역이 홀의 불변 중쇄 또는 인간 IgG1의 불변 경쇄 중 어느 하나와 인프레임으로 하위클로닝되었다.
인간 4-1BB 리간드의 엑토도메인(아미노산 71-248)의 일부를 인코딩하는 DNA 서열이 Uniprot 데이터베이스의 P41273 서열에 따라서 합성되었다.
(G4S)2 링커에 의해 분리되고 인간 IgG1-CL 도메인에 융합된, 4-1BB 리간드의 2개의 엑토도메인을 내포하는 폴리펩티드가 도 30a에서 묘사된 바와 같이 클로닝되었다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 결합기, 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 결합기, 인간 CL.
4-1BB 리간드의 1개의 엑토도메인을 내포하고 인간 IgG1-CH 도메인에 융합된 폴리펩티드가 도 30b에서 설명된 바와 같이 클로닝되었다: 인간 4-1BB 리간드, (G4S)2 결합기, 인간 CH.
정확한 대합을 향상시키기 위해, 하기 돌연변이가 교차된 CH-CL 내에 도입되었다. 인간 CL에 융합된 이합체성 4-1BB 리간드에서, E123R 및 Q124K. 인간 CH1에 융합된 단량체성 4-1BB 리간드에서, K147E 및 K213E.
Fc 감마 수용체에 결합을 제거하기 위해, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이가 노브와 홀 중쇄의 불변 영역 내에 도입되었다.
S354C/T366W 돌연변이를 내포하는 이합체성 리간드-Fc 노브 쇄, 단량체성 CH1 융합, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 내포하는 표적화된 항-P329G-Fc 홀 쇄 및 항-P329G 경쇄의 조합은 항-P329G x 4-1BBL huIgG1로 또한 명명되는, 조립된 삼합체성 4-1BB 리간드 및 P329G 결합 Fab를 포함하는 이종이합체의 생성을 가능하게 한다(도 31).
하기 분자가 클로닝되었다; 이들의 개략적 도해는 도 31에서 도시된다:
항-P329G 결합체에서 전하 변경을 갖는 항-P329G(M-1.7.24) x 4-1BBL huIgG1 LALA(서열번호 10, 129, 130, 131).
항-P329G 결합체에서 전하 변경을 갖는 인간화 항-P329G(VH3VL1) x 4-1BBL huIgG1 LALA(서열번호 15, 129, 130, 132).
이들 이중특이적 작제물은 포유류 세포를 1:1:1:1에서 상응하는 발현 벡터("벡터 4-1BBL Fc-노브 쇄": "벡터 4-1BBL 경쇄": "벡터 Fc-홀 쇄": "벡터 경쇄")로 형질감염시킴으로써 생산되었다.
HEK293 EBNA 또는 CHO EBNA 세포에서 IgG 유사 단백질의 생산
이중특이적 항체가 전술된 바와 같이 HEK293 EBNA 세포 또는 CHO EBNA 세포의 일시적인 형질감염에 의해 생성되었고, 단백질이 아래에 표시된 바와 같이 표준 방법에 의해, 수확된 상층액으로부터 정제되었다.
IgG 유사 단백질의 정제
단백질이 전술된 바와 같이 표준 프로토콜을 참조하여, 여과된 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다.
IgG 유사 단백질의 분석기술
정제된 단백질의 농도가 전술된 바와 같이 결정되었다.
[표 27]
항-P329G(M-1.7.24) x 4-1BBL huIgG1의 생화학적 분석
Figure pct00055
표면 플라스몬 공명에 의한 P329G 표적화 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 Fc 융합의 기능적 특징화
인간 4-1BB Fc(kih) 및 P329G 돌연변이를 내포하는 인간 Fc에 동시에 결합하는 능력이 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 평가되었다. 모든 SPR 실험은 25℃에서 HBS-EP를 작업 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, Biacore, Freiburg/Germany)으로서 사용하여, Biacore T200에서 수행되었다. 비오틴화된 인간 4-1BB-Fc(kih) 단백질이 SA 칩의 흐름 셀에 직접적으로 연계되었다. 대략 4000 RU의 고정 수준이 사용되었다.
항-P329G(M-1.7.24) x 4-1BBL huIgG1 작제물이 240 초에 걸쳐 30 μL/분의 유량에서 200 nM의 농도 범위로 흐름 셀을 통해 통과되었고, 해리가 제로 초에 세팅되었다. Fc 내에 P329G 돌연변이를 내포하는 인간 IgG1 항체가 180 초에 걸쳐 30 μL/분의 유량에서 200 nM의 농도로 흐름 셀을 통해 제2 피분석물로서 주입되었다(도 32a). 해리가 600 초 동안 모니터링되었다. 어떤 단백질도 고정되지 않은 참조 흐름 셀에서 획득된 반응을 차감함으로써, 벌크 굴절률 차이가 교정되었다.
도 32b에서 알 수 있는 바와 같이, 항-P329G(M-1.7.24) x 4-1BBL huIgG1은 인간 4-1BB 및 Fc 내에 P329G 돌연변이를 내포하는 인간 IgG1에 동시에 결합할 수 있다.
항-P329G x 4-1BBL huIgG1은 CD20-TCB 매개된 T 세포 활성화 및 종양 세포 용해를 증강할 수 있다
단독으로, 또는 항-P329G(M-1.7.24) x 4-1BBL huIgG1과 병용으로 CD20-TCB에 의한 T 세포 매개된 용해가 WSU DLBCL 표적에서 평가되었다. 인간 B 세포 고갈된 PBMC가 효과기 세포로서 사용되었고, 이중특이적 항체(1 nM CD20-TCB, 1 nM 항-P329G x 4-1BBL huIgG1)와 함께 3 일 배양 후 사멸뿐만 아니라 T 세포 활성화가 계측되었다.
간단히 말하면, 웰마다 50,000개의 WSU DLCL2가 96-U-바닥 평판 내로 파종되었다. 말초혈 단핵 세포(PBMC)가 건강한 인간 공여자로부터 획득된 농축된 림프구 제조물(백혈구연층)의 Histopaque 밀도 원심분리에 의해 준비되었다. 신선한 혈액이 무균 PBS로 희석되고 Histopaque 구배(Sigma, #H8889) 위에 적층되었다. 원심분리(450 x g, 30 분, 제동 없음, 실온) 후, PBMC 내포 간기를 초과하는 혈장이 폐기되었고, PBMC가 50 ml의 PBS로 차후에 채워지는 새로운 falcon 튜브에 이전되었다. 혼합물이 원심분리되었고(350 x g, 10 분, 실온), 상층액이 폐기되었고, 무균 PBS(원심분리 300 x g, 10 분)으로 세척하기 전 37℃에서 5 분 동안 적혈구 용해 용액에서 PBMC 펠렛이 배양되었다. 결과의 PBMC 모집단이 PBS에서 재현탁되고 자동적으로 계수되었다(ViCell). B 세포 고갈이 제조업체의 사용설명서에 따라서 CD20 마이크로비드(Miltenyi)를 사용하여 수행되었다. B 세포 고갈된 PBMC가 계수되고(ViCell), 및 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(Biochrom, K0302)을 내포하는 RPMI1640 배지에서 5 x 106/ml로 재현탁되었다. 사멸 검정을 위해, 250,000개의 B 세포 고갈된 PBMC가 표적(E:T 5:1)에 첨가되었고, 항체 희석액이 추가되었다(삼중으로 1 nM 종말 농도). 37℃, 5% CO2에서 3 일의 배양 후, 아폽토시스성/괴사성 세포에 의해 세포 상층액 내로 방출된 LDH의 정량(LDH 검출 키트, Roche Applied Science, #11 644 793 001)에 의해, 표적 세포 사멸이 평가되었다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)는 1% 트리톤 X-100과 함께 표적 세포의 배양에 의해 달성되었다. 최소 용해(= 0%)는 이중특이적 작제물 없이 효과기 세포와 공동배양된 표적 세포를 지칭한다. LDH 계측을 위한 상층액의 제거 후, 유세포분석법에 의해 T 세포 활성화를 결정하기 위해 나머지 세포가 염색되었다. 간단히 말하면, 세포가 PBS로 2회 세척되었고, 그 이후에 생존/죽음 염색(Zombie Aqua, 실온에서 20 분)이 뒤따랐다. 먼저 PBS로, 그 이후에 FACS 완충액으로 반복된 세척 후, 4℃에서 어둠하에 30 분 동안 항인간 CD4-BV605, 항인간 CD8-BV711, 항인간 CD25-PECy7 및 항인간 CD69-BV421(모두 Biolegend)을 사용하여 세포가 염색되었다. 세포가 세척되고, BD FACS CantoII를 사용한 계측에 앞서 BD FACS 용해 용액으로 처리되었다.
결과는 항-P329G(M-1.7.24) x 4-1BBL huIgG1이 CD20-TCB 매개된 T 세포 활성화 및 종양 세포 용해를 증강할 수 있다는 것을 증명한다(도 33).
4-1BB에 이가 결합 및 P329G 돌연변이를 내포하는 Fc에 일가 결합을 갖는 이중특이적 항체의 생성
4-1BB에 대한 이가 결합 및 P329G를 내포하는 Fc에 대한 일가 결합을 갖는 이중특이적 효현성 4-1BB 항체가 도 34에서 묘사된 바와 같이 제조되었다. 이러한 작제물은 또한, 2+1 항-4-1BB x 항-P329G huIgG1로 명명된다.
이러한 작제물의 제1 중쇄 HC1은 하기 구성요소로 구성되었다: 항-4-1BB 결합체(클론 20H4.9)의 VHCH1, 그 이후에 Fc 홀. 제2 중쇄 HC2는 항-P329G 결합체(교차 Fab 형식에서)의 VLCH1, 그 이후에 항-4-1BB(클론 20H4.9)의 VHCH1 및 Fc 노브로 구성되었다. P329G 결합체의 생성과 제조는 WO2017/072210에서 설명되는데, 이것은 본원에서 참조로서 편입된다. 4-1BB 결합체의 경우에, 클론 20H4.9의 VH와 VL 서열이 US 7,288,638 B2 또는 US 7,659,384 B2에 따라서 획득되었다. 이들 2개의 중쇄의 조합은 1개의 P329G 결합 교차 Fab 및 2개의 4-1BB 결합 Fab를 포함하는 이종이합체의 생성을 가능하게 한다(도 34).
정확한 대합을 향상시키기 위해, 하기 돌연변이가 항-4-1BB Fab 분자의 CH-CL 내에 도입되었다: CL에서 E123R과 Q124K 및 CH1에서 K147E와 K213E. 항-P329G 결합체의 제2 경쇄 LC2는 VHCL로 구성되었다(교차 Fab).
이종이합체의 생성을 가능하게 하기 위해, Y349C/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 제1 중쇄 HC1(Fc 홀 중쇄) 내에 도입함으로써, 및 S354C/T366W 돌연변이를 제2 중쇄 HC2(Fc 노브 중쇄) 내에 도입함으로써 노브 인투 홀 기술이 적용되었다.
Fc 감마 수용체에 결합을 제거하기 위해, Leu234Ala 및 Leu235Ala 돌연변이가 노브와 홀 중쇄의 불변 영역 내에 도입되었다.
이중특이적 항체 2+1 항-4-1BB(20H4.9) x 항-P329G(M-1.7.24) huIgG1에 대한 아미노산 서열은 표 4에서 찾아볼 수 있다. 이중특이적 항체 2+1 항-4-1BB(20H4.9) x 항-P329G(VH3VL1) huIgG1에 대한 아미노산 서열은 표 5에서 찾아볼 수 있다.
하기 분자가 클로닝되었다; 이들의 개략적 도해는 도 34에서 도시된다:
항-P329G 결합체에서 전하 변경 및 항-P329G 결합체(노브)에서 VH/VL 교환을 갖는 항-4-1BB(20H4.9) x 항-P329G(M-1.7.24) 2+1, 이중특이적 huIgG1 LALA CrossFab 분자(서열번호 141, 142, 143, 1442).
항-P329G 결합체에서 전하 변경 및 항-P329G 결합체(노브)에서 VH/VL 교환을 갖는 항-4-1BB(20H4.9) x 인간화 항-P329G(VH3VL1) 2+1, 이중특이적 huIgG1 LALA CrossFab 분자(서열번호 110, 142, 145, 144).
이들 이중특이적 작제물은 포유류 세포를 1:1:1:2("벡터 Fc-노브 쇄": "벡터 경쇄(a-P329G)" : "벡터 Fc-홀 쇄": "벡터 경쇄(20H4.9)")에서 상응하는 발현 벡터로 형질감염시킴으로써 생산되었다.
HEK293 EBNA 또는 CHO EBNA 세포에서 IgG 유사 단백질의 생산
이중특이적 항체가 전술된 바와 같이 HEK293 EBNA 세포 또는 CHO EBNA 세포의 일시적인 형질감염에 의해 생성되었고, 단백질이 아래에 표시된 바와 같이 표준 방법에 의해, 수확된 상층액으로부터 정제되었다.
IgG 유사 단백질의 정제
단백질이 표준 프로토콜을 참조하여, 및 전술된 바와 같이, 여과된 세포 배양 상층액으로부터 정제되었다.
IgG 유사 단백질의 분석기술
정제된 단백질의 농도가 전술된 바와 같이 결정되었다.
시험관내 검정에서 항-P329G 표적화 분할 삼합체성 4-1BB 리간드 Fc 융합의 기능적 특징화 - 인간 4-1BB 및 NFκB-루시페라아제 리포터 유전자 발현 리포터 세포주 Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2에서 NF-κB 활성화
리간드(4-1BBL)에 4-1BB(CD137) 수용체의 효현성 결합은 핵인자 카파 B(NFkB)의 활성화를 통해 4-1BB-하류 신호전달을 유도하고 CD8 T 세포의 생존과 활성을 증진한다(Lee HW, Park SJ, Choi BK, Kim HH, Nam KO, Kwon BS. 4-1BB promotes the survival of CD8(+) T lymphocytes by increasing expression of Bcl-x(L) and Bfl-1. J Immunol 2002; 169:4882-4888). 항-P329G-4-1BBL 이중특이적 항체 유사 융합 분자에 의해 매개된 이러한 NFκB-활성화를 모니터링하기 위해, Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2 리포터 세포주가 Promega(Germany)로부터 구입되었다. 이들 세포는 전술된 바와 같이 배양되었다. 검정을 위해, 세포가 수확되고, 10 %(v/v) FBS 및 1 %(v/v) GlutaMAX-I가 공급된 검정 배지 RPMI 1640 배지에서 재현탁되었다. 2 x 103개의 Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2 리포터 세포를 내포하는 10 μl가 뚜껑이 달린 무균 흰색 384-웰 편평 바닥 조직 배양 평판(Corning, 카탈로그 번호3826)의 각 웰로 이전되었다. 단독으로, 또는 1 x 104개 세포의 표적 발현 세포, 예를 들면 CEACAM5(CD66e)+ MKN45 인간 위암 세포 또는 Her2+ KPL4 인간 유방암 또는 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP)+ NIH/3T3-huFAP 클론 19 유전적으로 변형된 생쥐 섬유모세포를 내포하는 추가의 10 μL의 검정 배지가 공급되었다. 양성 대조로서, 20 μL 적정된 농도의 종양 표적화 (TT)-4-1BBL 예를 들면 Her2(페르투주맙)-4-1BBL, CEA(T84.66-LCHA)-4-1BBL 또는 FAP(4B9)-4-1BBL이 추가되었다. 다른 웰에 10 μL 배지 또는 적정된 농도의 항-P329G-4-1BBL이 추가되었다. 그 후에 10 μL의 적정된 농도의 huIgG P329G LALA가 추가되었는데, 여기서 이들은 Her2(페르투주맙), CEACAM5(T84.66-LCHA), FAP(4B9)에 대해 특이적이거나, 비특이적이었다(DP47, 음성 대조). 종양 특이적 huIgG1 P329G LALA 및 항-P329G-4-1BBL(고정됨) 사이에 상이한 비율을 검사하기 위해, huIgG1 P329G LALA의 추가된 농도가 조정되었다. 평판이 세포 인큐베이터 내에 37℃ 및 5 % CO2에서 5 시간 동안 배양되었다. 8 μl 갓 해동된 One-Glo 루시페라아제 검정 검출 용액(Promega, 카탈로그 번호 E6110)이 각 웰에 첨가되었고, 발광 광 방출이 Tecan 마이크로평판 판독기(500 ms 통합 시간, 모든 파장을 수집하는 필터 없음)를 사용하여, 방출광의 단위(URL)로서 즉시 계측되었다. 값이 처리되지 않은 웰의 기준선 루시페라아제 활성 값을 사용하여 기준선 교정되었다. 설명된 설정은 도 35에서 개략적으로 도시된다.
도 36에서 도시된 바와 같이, 최적 비율을 평가하기 위해 aP329G-4-1BBL(고정된 농도) 및 종양-표적 특이적 인간 IgG1 P329G LALA(가변적 농도) 사이에 상이한 비율이 검사되었다. 이러한 평가는 상이한 비율이 aP329G-4-1BBL의 활성을 변화시키지 않았다는 것을 보여준다. 간접적인 교차연결(huIgG1 P329G LALA + aP329G-4-1BBL)의 적용은 직접적인 표적화 TT-4-1BBL 분자와 비교하면 더 높은 EC50 값을 야기한다. 흥미롭게도, 활성화의 최댓값은 직접적으로 표적화된 Her2(페르투주맙)-4-1BBL과 비교하면 aP329G-4-1BBL과 유사하지만, CEA(T84.66-LCHA)-4-1BBL과 비교하면 그렇지 않았다.
도 37에서 도시된 바와 같이, aP329G-4-1BBL은 사용된 종양-표적 특이적 인간 IgG1 P329G LALA와 무관하게 기능적이다. 게다가 이러한 기능성은 표적 특이적이고 농도 의존성이다. 적합 EC50 값은 표 28에서 열거된다. 이번에도 EC50 값은 직접적인 종양 표적화(TT)-4-1BBL과 비교하면 간접적인 표적화 aP329G-4-1BBL의 경우에 감소되지만, 활성의 최댓값은 만약 분자가 Her2 또는 FAP를 통해 표적화되면 유사하였는데, 이로써 CEACAM5를 통한 표적화는 만약 4-1BB가 간접적으로 교차연결된 aP329G-4-1BBL를 통해 활성화되면 최댓값의 감소를 야기하지만 TT-4-1BBL에 의해서는 그렇지 않았다. 이런 이유로 aP329G-4-1BBL 및 TT-4-1BBL 사이의 차이는 표적 의존성이다.
[표 28]
EC50 값 [nM] 및 최대 활성 값 [URL]
Figure pct00056
실시예 7
ADCC 적격성 분자
본원 발명의 면역 효과기 세포 활성화 Fc 결합 분자의 예시적인 입체형상
도 38은 종양 표적화 분자(예를 들면 IgG1, SM)의 P329G 돌연변이에 결합할 수 있는 IgG1 효과기 분자(항-P329G(VH3VL1) huIgG1)의 예시적인 도해를 보여준다. (b) 종양 표적화 IgG의 P329G 돌연변이 및 면역 효과기 세포 상에 FcγRIII에 항-P329G IgG1 효과기 분자의 결합 방식의 예시적인 입체형상. 종양 세포 및 표적 세포의 교차연결이 개별 종양 표적화 IgG에 항-P329G huIgG1의 결합에 의해 유도된다. 더 상세하게는 항-P329G IgG1의 양쪽 Fab 팔이 예를 들면 항원 특이적 IgG의 Fc 영역 내에 존재하는 P329G 돌연변이에 결합할 수 있다. 이러한 항원 특이적 IgG는 2개의 Fab 팔을 갖는 표적 항원에 결합할 수 있다. 항-P329G IgG Fc 결합 분자의 Fc 부분은 면역 효과기 세포 상에 존재하는 FcγRIII 수용체에 결합할 수 있다. 항-P329Ghu IgG1 + 항원 표적화 IgG 복합체의 형성은 면역 효과기 세포 및 종양 세포의 교차연결을 야기하여, 면역 효과기 세포 활성화 및 표적 세포 용해를 야기한다.
P329G LALA 돌연변이를 갖는 종양 항원 표적화 IgG1(IgG1 TA ) 의 존재하에 당조작된 Fc를 갖는 IgG1 ( IgG1 ADCC 구동기 항체)에 의한 ADCC 유도
항-P329G IgG1ADCC 구동기 항체 및 항-CD20 IgG1TA의 복합체에 의해 ADCC를 유도하는 능력이 표적 세포의 유산 탈수소효소(LDH) 방출의 정량에 의해 평가되었다. 이런 이유로 PBMC 효과기 세포가 헬싱키 선언에 따라서 Zurich 헌혈 센터로부터 획득된 백혈구연층으로부터 단리되었다. 백혈구연층이 PBS로 2:1 희석되었고, 인간 PBMC가 Histopaque-1077(Sigma-Aldrich #10771) 위에서 밀도 기울기 원심분리(450 x g, 중단 없이 실온에서 30 분)에 의해 단리되었다. PBMC가 간기로부터 수확되고, 350 g에서 10 분 동안 PBS로 3회 세척되었다. 세척한 후 PBMC가 Vi-세포를 사용하여 계수되었다. 세포가 RPM11640 +2%FBS+ 1% 글루타맥스 + 1% Gibco™ 항생제-항진균제(100X)(카탈로그 번호 15240062)(검정 배지)에서 12.5 Mio/ml로 준비되었다. 0.625 Mio 생존 세포/웰이 투명, 96-U 웰 평판(TPP) 내로 50 μl/웰로 파종되었다. 표적 세포로서, z-138(CD20+) 세포가 Vi-세포를 통해 계수되었고, 2,500개 생존 세포/ml가 개별 웰 내에 50 μl의 검정 배지에서 PVMC와의 공동배양액 내로 파종되었다. 효과기 대 표적 비율은 25:1이었다.
상이한 항체의 연속 희석액이 450 nM의 IgG1ADCC 구동기 항체 항-P329G huIgG1 또는 항-CD20(GA101) huIgG1 GE 변이체 및 900 nM의 IgG1TA 항-CD20(GA101) huIgG1 P329G LALA 항원 표적화 항체의 농도로 시작하여, 검정 배지에서 1:10 희석 단계에서 제조되었다. IgG1ADCC 구동기 대 IgGTA의 최종 비율은 1:2이었다. 유세포 분석을 위해 380 μl 항-CD107a-PE + 3420 μl 검정 배지가 제조되었고, 10 μl/웰의 희석된 인간 항-CD107a(biologend)가 세포에 첨가되었다. 웰의 최종 용적은 210 μl이었다. 평판이 가습된 인큐베이터 내에 37℃ 및 5% CO2에서 5 시간 동안 배양되었다.
ADCC가 5 시간 후, 아폽토시스성/괴사성 세포에 의해 세포 상층액 내로 방출된 LDH의 정량(LDH 검출 키트, Roche Applied Science, #11 644 793 001)에 의해 평가되었다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)는 대조 웰마다 1% 트리톤 X-100의 최종 농도와 함께 표적 세포의 배양(가습된 인큐베이터 내에 37℃ 및 5% CO2에서 적어도 1 시간 동안)에 의해 달성되었다. 최소 용해(= 0%)는 항체 없이 효과기 세포와 공동배양된 표적 세포를 지칭한다. 멀티채널 피펫을 사용하여, 50 μl의 상층액이 투명 96 웰 평판으로 이전되었고, 1:1 갓 제조된 세포독성 시약이 제조업체의 프로토콜에 따라서 제조되었고, 흡광도가 10 분의 간격에 걸쳐 Tecan Spark 판독기로 계측되었다. 도 39에서, 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고, 오차 막대는 SD를 표시한다. p 값으로서, 뉴잉글랜드 저널 오브 메디슨 스타일이 GraphPadPrism 7에서 열거된 바와 같이 사용되었다. *= P ≤ 0.033; **= P ≤ 0.002; ***= P ≤ 0.001을 의미함.
도 39에서, 항-CD20(GA101) huIgG1 GE 변이체는 용량 의존성 ADCC를 유도하는 것으로 관찰될 수 있다. 이러한 GE 변이체를 사용하는 항-CD20(GA101) huIgG1 P329G LALA + 항-P329G(VH3VL1) huIgG1 복합체 역시 용량 의존성 ADCC를 매개한다. 항-CD20(GA101) huIgG1 P329G LALA + 항-P329G(VH3VL1) huIgG1 야생형 복합체는 ADCC 주동 항체의 450 nM의 가장 높은 농도에서 상기 GE 변이체와 비교하여 유의미한 차이를 나타내는 더 낮은 정도로 ADCC를 유도한다.
당조작된 Fc를 소유하는 IgG1(IgG1 ADCC 구동기 항체)와 공동배양 시에 NK 세포에서 수용체 조절
도 40 및 도 41에서 도해된 실험: 도 39에서 설명된 실험에 기반을 둔다. 도 39에서 도해된 실험에서는 단지 검정의 상층액만 분석되었다. 그 대신에, 아래에 도해된 실험(도 40 및 도 41)에서는 자연 살해 세포(NK)가 유세포분석에서 그들의 CD16 하향조절(도 40) 및 CD107a 상향조절(도 33)에 의해 특징화되었다. 이런 이유로 검정 평판이 원심분리되었고, 상층액이 폐기되었다. 평판이 PBS로 3회 세척되었다. 세포 염색을 위한 항체 혼합물이 다음과 같은 400 μl CD3-PE/Cy7 + 400 μl CD56-APC + 400 μl CD16-FITC + 18800 μl PBS 완충액으로서 제조되었다(모든 항체는 biolegend로부터 구입되었다). 세포가 어둠하에 대략 4-8℃에서 30 분 동안 염색되었다. 평판이 이후, FACS 완충액(PBS + 2 % FCS + 5 mM EDTA + 0.25 % 아지드화나트륨으로 2회 세척되었고, 샘플이 FACSCantoII에 의해 계측되고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 도 40 및 도 41에서 삼중물로부터 기술적 평균값이 묘사되고, 오차 막대는 SD를 표시한다. p 값으로서, 뉴잉글랜드 저널 오브 메디슨 스타일이 GraphPadPrism 7에서 열거된 바와 같이 사용되었다. *= P ≤ 0.033; **= P ≤ 0.002; ***= P ≤ 0.001을 의미함. 도 40은 GE 변이체 및 항-CD20(GA101) huIgG1 GE를 사용하는 항-CD20(GA101) huIgG1 P329G LALA + 항-P329G(VH3VL1) huIgG1 복합체로 활성화 시에 CD16의 용량 의존성 하향조절을 보여준다. 항-CD20(GA101) huIgG1 P329G LALA + 항-P329G(VH3VL1) huIgG1 야생형 복합체의 사용은 CD16 수용체의 하향조절을 보여주지 않는다. 도 41에서, GE 변이체 또는 항-CD20(GA101) huIgG1 GE를 사용하는 항-CD20(GA101) huIgG1 P329G LALA + 항-P329G(VH3VL1) huIgG1 복합체가 사용되었을 때, NK 세포 상에서 CD107a의 용량 의존성 상향조절이 관찰될 수 있다. 이들 항체의 높은 농도의 경우에도, 항-CD20(GA101) huIgG1 P329G LALA + 항-P329G(VH3VL1) huIgG1 복합체의 사용은 NK 세포 상에서 CD107a 수용체의 상향조절을 보여준다. 항-CD20 IgG1 P329G LALA + 항-P329G IgG1 GE 복합체 및 항-CD20(GA101) huIgG1 P329G LALA + 항-P329G(VH3VL1) huIgG1 복합체 사이의 차이는 45 nM보다 높은 농도에 대해 유의미하다.
FcRγIIIa를 유도하는 종양 간질 표적화 huIgG1 ( aFAP 클론 4B9 ) 및 항- P329G 인간 IgG1 mAb
FcRγIIIa 교차연결, 및 차후에 NFAT 활성화 및 ADCC를 유도하는, 종양 간질 표적화 huIgG1(aFAP 클론 4B9) 및 항-P329G 인간 IgG1 mAb의 능력이 표적 단백질 코팅된 비드(인간 FAP) 및 Jurkat-NFAT 리포터 세포(NFAT 프로모터를 갖는 FcγRIIIA-발현 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주, Jurkat FcγRIIIa V158_NFAT-RE_luc, Promega, Cat# G9791)의 공동배양액을 사용하여 평가되었다. 고정된 huIgG1(FAP에 결합됨)의 P329G 돌연변이 및 FcRγIIIa(Jurkat-NFAT 리포터 세포 상에서 발현됨)에 항-P329G huma IgG1 항체의 동시 결합 시에, NFAT 프로모터가 활성화되고 활성 반딧불이 루시페라아제의 발현을 야기한다. 발광 신호(루시페라아제 기질의 첨가 시에 획득됨)의 강도는 CD16 활성화 및 신호전달의 강도에 비례한다.
2가지 조건이 검사되었다. 종양 표적화 항체로서, 고정된 농도(10 μg/mL)의 항-FAP(4B9) P329G LALA huIgG1이 가장 높은 최종 농도 20 μg/mL 내지 7.6 *10-5 μg/mL의 범위 안에서 항-P329G huIgG1의 8배 감소하는 연속 희석액과 병용되었다(도 42a). 또는, 종양 표적화 항체로서, 가장 높은 최종 농도 20 μg/mL 내지 7.6 *10-5 μg/mL의 범위 안에서 항-FAP(4B9) P329G LALA huIgG1의 8배 감소하는 연속 적정액이 고정된 농도(10 μg/mL)의 항-P329G huIgG1과 병용되었다(도 42b). ADCC 적격성 항체의 효과기 기능은 항체의 Fc 영역에서 N 연결된 글리코실화에 의해 조정되는 것으로 널리 알려져 있다. 특히, Fc N-글리칸에서 코어 푸코오스의 부재는 면역 효과기 세포 예컨대 자연 살해 세포 상에 존재하는 FcγRIIIa에 대한 IgG1 Fc 결합 친화성을 증가시키고, 증강된 ADCC 활성을 야기하는 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, 항-P329G huIgG1이 완전히 푸코실화된 및 비푸코실화된 인간 IgG1 아이소타입으로서 검사되었다.
검정을 위해, Jurkat FcγRIIIa V158_NFAT-RE_luc 리포터 세포가 수확되었다. 세포가 계수되었고, Cedex HiRes 세포 계수기를 사용하여 생존력이 평가되었다. 필요한 양이 300g에서 5 분 동안 원심분리에 의해 수확되었다. 약 2 x 104개 세포/웰이 흰색 편평 바닥 384-웰-평판(Corning #3826) 내에 AIM-V 검정 배지에 도말되었다. 차후에, 4 대 1의 효과기 대 표적 비율에 도달하기 위해, FAP 코팅된 비드가 5 x 103개 비드/웰의 수치로 추가되었다. 상이한 항체 조합이 또한, 384 웰에 30 μl의 최종 용적으로 추가되었다. 상대적 발광 단위(RLU)의 종결점 계측을 가능하게 하는, 기질로서 ONE-Glo 루시페라아제 검정 시스템(E6120, Promega)이 제조업체의 프로토콜에 따라서 사용되었다. 22 시간 후, Tecan Spark 10M 발광 평판 판독기 및 500 ms 통합 시간을 사용하여, 판독이 수행되었다. 도 42에서 각 포인트는 한 가지 실험의 기술적 복제물의 평균값을 나타낸다. 평균의 표준 오차는 오차 막대에 의해 표시된다.
FAP 코팅된 비드가 제조업체의 프로토콜에서 설명된 바와 같이, 이들을 비오틴화된 인간 FAP(Roche)로 코팅하여, Dynabeads™ M-280 스트렙타비딘(Invitrogen, #11205D)로부터 제조되었다. 간단히 말하면, 12x106개의 PBS 세척된 비드가 온건한 회전(MACSmix™ 튜브 회전기)하에 21.5 μL PBS에서 2.43 μg 비오틴화된 인간 FAP로 30 분 동안 코팅되었다.
단지 항-FAP(클론 4B9) 인간 IgG1 P329GLALA 및 항-P329G 인간 IgG1 mAb의 조합만 ADCC 수행능력의 척도인, Jurkat FcγRIIIa V158_NFAT-RE_luc 리포터 세포에서 용량 의존성 NFAT 활성화를 유도한다. 항-FAP(클론 4B9) 인간 IgG1 P329GLALA 및 항-P329G 인간 IgG1 mAb 단독 중 어느 것도 그렇게 할 수 없었다(용량 반응 곡선의 제1 데이터 포인트). 따라서, 표적 포화 및 ADCC 수행능력을 위한 최적 농도가 환자에서 치료 효능을 최적화하기 위해 독립적으로 선택될 수 있다. 항-P329G 인간 IgG1 mAb의 비푸코실화된 버전은 완전히 푸코실화된 인간 IgG1 mAb와 동일한 클론과 비교하여 우수한 ADCC 효능을 보여주었다.
실시예 8
Jurkat NFAT Luc 동역학적 T 세포 활성화 검정
항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, LALA Fc에 의해 유도된 T 세포 활성화의 동역학이 24 시간의 기간에 걸쳐 2 시간의 간격을 두고, HeLa 종양 세포의 존재하에 Jurkat NFAT 리포터 세포를 사용하여 계측되었다.
Jurkat NFAT 리포터 세포(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega #CS176501)는 반딧불이 루시페라아제의 발현을 제어하는 NFAT-반응 요소를 갖는 CD3-발현 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주이다. CD3의 교차연결 시에, NFAT 프로모터가 활성화되어, 루시페라아제의 용량 의존성 발현을 야기한다. 루시페라아제 기질을 첨가하는 것은 Jurkat NFAT T 세포 활성화의 강도를 반영하는 발광 신호를 야기한다. 종양 표적 및 Jurkat 세포 상에서 CD3에 동시에 결합하는 TCB에 의해 교차연결이 시작될 수 있다.
항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB에 의해 유도된 Jurkat NFAT 활성화가 종양 표적화 P329G LALA huIgG1의 존재하에 검사되었다.
T 세포 활성화를 유도하는, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc와 병용된 종양 표적화 항-FOLR1 P329G LALA huIgG1의 능력이 종양 항원 양성 표적 세포(HeLa) 및 Jurkat-NFAT 리포터 세포의 공동배양액을 사용하여 평가되었다.
종양 표적화 항체로서, 항-FolR1(16D5) P329G LALA huIgG1이 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc와 병용되었다. 양성 대조로서, 직접적인 종양 표적화 항-FolR1(16D5) x CD3(P035.093) 2+1 TCB가 사용되었다.
비결합 DP47 x CD3(P035.093) 2+1 TCB가 음성 대조로서 사용되었다. Jurkat-NFAT-리포터 세포 활성화의 용량 의존성을 평가하기 위해, 3가지 TCB 농도가 검사되었다: 0 nM, 0.05 nM, 5 nM.
검정을 위한 제조물로서, HeLa 인간 종양 세포가 수확되었다. 성장 배지가 세포 배양 플라스크로부터 제거되었고, 세포가 인산염 완충된 식염수(PBS, Gibco #20012)로 1회 세척되었다. PBS를 제거한 후, 세포가 트립신처리되었다(트립신-EDTA(0.05%), 페놀 레드, Gibco #25300-054). 세포 수 및 생존력이 Countess 자동화된 세포 계수기(Invitrogen #C10227)를 사용하여 결정되었다. 0.002 x 106개 세포/웰(10 μl/웰)이 검정 하루 전, 편평 바닥, 흰색 384-웰 평판(Corning #353988) 내에 검정 배지(RPMI 1640, 10% FBS, 1% GlutaMAX)에 도말되었다. 검정 당일에, Jurkat-NFAT 리포터 세포가 수확되었다. 세포가 계수되고, Countess 장치를 사용하여 생존력에 대해 평가되었다. 필요한 양이 350g에서 5 분 동안 원심분리에 의해 수확되었다. 5:1의 최종 효과기-대-표적 세포 비율(E:T)을 획득하기 위해, 0.01 x 106개 세포/웰(10 μl/웰)이 검정 배지에 도말되었다. 차후에, 항체 희석액이 검정 배지에서 제조되었고, 40 μl의 최종 용적을 획득하기 위해 384 웰 평판에 첨가되었다. 상대적 발광 단위(RLU)의 동역학적 계측을 가능하게 하는, 루시페라아제 기질로서 GloSensor™ cAMP 검정(Promega #E1290)이 제조업체의 프로토콜에 따라서 사용되었다. 온도와 CO2 제어(37℃ 및 5% CO2) 및 가습된 공기를 갖는 Tecan Spark 10M 판독기를 사용하여 2 시간마다 판독이 자동적으로 수행되었고, 따라서 배양 조건을 교란하지 않으면서 자동화된 계측이 가능하였다. 발광 신호가 300 ms/웰에 대해 획득되고, 웰마다 RLU/s를 반영하도록 계산되었다.
도 45는 0 nM(도 45a), 0.05 nM(도 45b) 및 5 nM(도 45c) 농도의 TCB로 수행된 실험을 나타낸다. 데이터 포인트는 한 가지 실험의 기술적 삼중물의 평균값을 보여준다. 오차 막대는 표준 편차를 표시한다. 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc의 동역학적 활성이 평가되었고, Jurkat-NFAT-Luc 리포터 검정을 위한 최적 배양이 4 시간 및 6 시간 사이인 것으로 결정되었다. 직접적인 TCB와 비슷한 효과에 도달하는 데 필요한 항-P329G TCB 농도는 대략 5 nM인 것으로 결정되었다.
한 세트의 FOLR + 세포: HeLa, JAR, OVCAR-3, SKOV-3에서 Jurkat NFAT Luc 활성화 검정
여러 FOLR1+ 종양 세포주 전체에 대하여 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, LALA Fc와 병용된 FOLR1 표적화 P329G LALA huIgG1의 T 세포 활성화 능력이 전술된 Jurkat-NFAT 리포터 세포(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega #CS176501)로 평가되었다.
항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, LALA Fc에 의해 유도된 Jurkat NFAT 활성화가 종양 표적화 P329G LALA huIgG1의 존재하에 검사되었다.
종양 표적화 항체로서, 항-FolR1(16D5) P329G LALA huIgG1이 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, LALA Fc와 병용되었다. 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 항-P329G TCB와 병용된 비결합 DP47 P329G LALA huIgG1이 음성 대조로서 사용되었다. 양성 대조로서, 직접적인 종양 표적화 항-FolR1(16D5) x CD3(P035.093) 2+1 TCB가 사용되었다.
이들 항-P329G TCB는 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 가장 높은 농도로 개별 IgG와 혼합되고 함께 적정되었다. 모든 TCB는 75 nM의 TCB부터 시작하여 연속적으로 4배 희석되어, 75 nM 내지 1.12 x 10-6 nM의 농도 범위를 야기하였다.
실험이 단일 시점으로 구성되는 다른 판독 프로토콜을 사용하여, 전술된 바와 같이 수행되었다. HeLa, JAR, OVCAR-3 및 SKOV-3이 표적 세포로서 사용되었다. 이들 검정 구성요소는 37℃ 및 5% CO2에서 6 시간 동안 배양되었다. 배양 시간 후, 상대적 발광 단위(RLU)의 계측을 가능하게 하는, 루시페라아제 기질인 ONE-Glo™ 루시페라아제 검정 시약(Promega # E6120)이 제조업체의 프로토콜에 따라서 사용되었다. Tecan Spark 10M 판독기를 사용하여, 판독이 수행되었다. 발광 신호가 300 ms/웰에 대해 획득되고, 웰마다 RLU/s를 반영하도록 계산되었다.
도 46은 HeLa(도 46a), JAR(도 46b), OVCAR-3(도 46c), SKOV-3(도 46d)으로 수행된 실험으로부터 결과를 묘사한다. 데이터 포인트는 한 가지 실험의 기술적 삼중물의 평균값을 보여준다. 오차 막대는 표준 편차를 표시한다.
항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, LALA Fc는 모든 검사된 FOLR1+ 세포주 전체에 대하여 항-FOLR1 P329G LALA huIgG1의 존재하에 용량 의존성 T 세포 활성화 능력을 보여주고, IgG1 어댑터를 실행 가능한 전략으로서 실증한다. DP47 P329G LALA huIgG1의 존재하에, 항-P329G TCB는 대부분의 검사된 농도에서 무효하고, 75 nM에서 잔류 활성을 보여준다.
HeLa(FOLR1+) 세포에서 Jurkat NFAT 활성화 검정; 항-P329G TCB의 P329R LALA Fc 및 LALA Fc 버전의 비교
항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, LALA Fc 및 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc의 T 세포 활성화 능력이 전술된 Jurkat-NFAT 리포터 세포(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega #CS176501)로 평가되었다.
LALA Fc 또는 P329R LALA Fc와 병용된 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB에 의해 유도된 Jurkat NFAT 활성화가 종양 표적화 P329G LALA huIgG1의 존재하에 검사되었다.
종양 표적화 항체로서, 항-FolR1(16D5) P329G LALA huIgG1이 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc 또는 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, LALA Fc와 병용되었다. P329G LALA huIgG1이 없는 항-P329G TCB가 음성 대조로서 사용되었다. 양성 대조로서, 직접적인 종양 표적화 항-FolR1(16D5) x CD3(P035.093) 2+1 TCB가 사용되었다.
이들 항-P329G TCB는 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 가장 높은 농도로 개별 IgG와 혼합되고 함께 적정되었다. 모든 TCB는 75 nM의 TCB부터 시작하여 연속적으로 10배 희석되어, 75 nM 내지 75 x 10-9 nM의 농도 범위를 야기하였다.
실험이 단일 시점 계측을 사용하여, 전술된 바와 같이 수행되었다. HeLa가 표적 세포로서 사용되었다. 이들 검정 구성요소는 루시페라아제 기질의 첨가 및 판독 절차 전 37℃ 및 5% CO2에서 6 시간 동안 배양되었다.
도 47은 HeLa 세포로 수행된 실험으로부터 결과를 묘사한다. 데이터 포인트는 한 가지 실험의 기술적 삼중물의 평균값을 보여준다. 오차 막대는 표준 편차를 표시한다.
a-P329G TCB의 양쪽 버전, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, LALA Fc 및 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc는 항-FOLR1 P329G LALA huIgG1의 존재하에 용량 의존성 T 세포 활성화 능력을 보여준다. P329G LALA huIgG1이 없으면, 양쪽 항-P329G TCB 둘 모두 대부분의 검사된 농도에서 무효하고, 75 nM에서 잔류 활성을 보여준다. 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc가 더 적은 비특이적 활성화를 보여준다.
실시예 9
SKOV-3(FOLR1+) 세포에서 일차 인간 T 세포 활성화 검정; 항-P329G TCB의 P329R LALA Fc 및 LALA Fc 버전의 비교; 효과기 세포로서 T 세포 및 PBMC의 비교
항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, LALA Fc 및 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc의 T 세포 활성화 능력이 건강한 공여자로부터 획득된 일차 인간 범 T 세포 또는 PBMC 세포로 평가되었다.
LALA Fc 또는 P329R LALA Fc와 병용된 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB에 의해 유도된 T 세포 활성화가 종양 표적화 P329G LALA huIgG1의 존재하에 검사되었다.
종양 표적화 항체로서, 항-FolR1(16D5) P329G LALA huIgG1이 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc 또는 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, LALA Fc와 병용되었다. 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 이들 항-P329G TCB 중 어느 하나와 병용된 비결합 DP47 P329G LALA huIgG1이 음성 대조로서 사용되었다. 양성 대조로서, 직접적인 종양 표적화 항-FolR1(16D5) x CD3(P035.093) 2+1 TCB가 사용되었다. 사용된 표적 세포는 SKOV-3(FOLR1+)이었다. 이들 항-P329G TCB는 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 가장 높은 농도로 개별 IgG와 혼합되고 함께 적정되었다. 모든 TCB는 50 nM의 TCB부터 시작하여 연속적으로 10배 희석되어, 50 nM 내지 50 x 10-8 nM의 농도 범위를 야기하였다.
검정을 위한 제조물로서, SKOV-3(FOLR1+) 인간 종양 세포가 수확되었다. 성장 배지가 세포 배양 플라스크로부터 제거되었고, 세포가 인산염 완충된 식염수(PBS, Gibco #20012)로 1회 세척되었다. PBS를 제거한 후, 세포가 트립신처리되었다(트립신-EDTA(0.05%), 페놀 레드, Gibco #25300-054). 세포 수 및 생존력이 Countess 자동화된 세포 계수기(Invitrogen #C10227)를 사용하여 결정되었다. 0.015 x 106개 세포/웰(30 μl/웰)이 검정 하루 전, 편평 바닥, 흰색 384-웰 평판(Corning #353988) 내에 검정 배지(RPMI 1640, 10% FBS, 1% GlutaMAX)에 도말되었다. 검정 당일에, 건강한 공여자의 혈액으로부터 이전에 단리된 동결된 PBMC 및 범 T 세포가 해동되었다. 세포가 계수되고, Countess 장치를 사용하여 생존력에 대해 평가되었다. 필요한 양이 350g에서 5 분 동안 원심분리에 의해 수확되었다. 5:1의 최종 효과기-대-표적 세포 비율(E:T)을 획득하기 위해, 0.75 x 106개 세포/웰(10 μl/웰)이 검정 배지에 도말되었다. 차후에, 항체 희석액이 검정 배지에서 제조되고, 100 μl의 최종 용적을 획득하기 위해 384 웰 평판에 첨가되었다.
이들 검정 구성요소는 37℃ 및 5% CO2에서 48 시간 또는 72 시간 동안 배양되었다. 48 시간 또는 72 시간 시점에서, PBMC 및 T 세포가 수확되고, T 세포 활성화의 마커로서 CD25 및 CD69 발현에 대해 분석되었다.
상세하게는, 상층액이 평판으로부터 제거되었고, 60 μl의 PBS가 각 웰에 첨가되었고, 세포가 FACS 염색을 위해 96 웰 U 바닥 평판으로 이전되었다. 평판이 600 x g에서 3 분 동안 원심분리되었고, 상층액이 제거되었고, 세포가 웰마다 200 μl의 PBS로 세척되었다. 평판이 다시 한 번, 600 x g에서 3 분 동안 원심분리되었고, 상층액이 제거되었다. 차후에, Zombie Aqua™ 고정가능 생존력 키트(Biolegend, #423102), 항-huCD4 PerCP/Cy5.5(Biolegend, #344608), 항-huCD8a BV711(Biolegend, #301044), 항-huCD25 PE(Biolegend, #302606) 및 항-huCD69 FITC(Biolegend, #310904)를 내포하는 30 μl의 항체 혼합물이 각 웰에 첨가되었다. 평판이 4℃에서 30 분 동안 배양되었다. 그 후에, 세포가 FACS 완충액으로 2회 세척되고 웰마다 60 μl의 FACS 완충액에서 재현탁되었다. 세포가 BD FACSymphony A3 유세포분석기를 사용하여 획득되었다.
도 48은 SKOV-3 세포(도 48a, 도 48b)로, 및 표적 세포 없이(도 48c, 도 48d), 수행된 실험으로부터 결과를 묘사한다. 효과기 세포로서, 범 T 세포(도 48a, 도 48c) 및 PBMC(도 48b, 도 48d)가 LALA 및 P329R LALA Fc와 병용된 항-P329G TCB의 비특이적 활성화에 대한 FcγR-보유 세포의 효과를 평가하는 데 사용되었다. 데이터 포인트는 한 가지 실험의 기술적 삼중물의 평균값을 보여준다. 오차 막대는 표준 편차를 표시한다.
a-P329G TCB의 양쪽 버전, LALA Fc 또는 P329R LALA Fc를 내포하는 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB는 항-FOLR1 P329G LALA huIgG1의 존재하에 용량 의존성 T 세포 활성화 능력을 보여준다. P329G LALA huIgG1이 없으면, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc는 무효하고, 비-특이성 없음을 보여준다. PBMC와 함께 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, LALA Fc는 표적 세포가 있는 경우 및 없는 경우 둘 모두에서, 높은 비특이적 T 세포 활성화를 보여준다. 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc는 비특이적 활성화를 억제하는 관점에서 LALA Fc 버전보다 우수하다.
실시예 10
상이한 표적 단백질을 사용한, 한 세트의 종양 세포에서 Jurkat NFAT 활성화 검정; 상이한 어댑터 P329G LALA huIgG 어댑터 분자를 사용한 TCB 활성의 비교
3가지 상이한 CD3 결합체(P035.093, CH2527, 클론 22)와 병용된 3개의 a-P329G TCB의 T 세포 활성화 능력이 평가되었다. 검정이 실시예 8에서 설명된 Jurkat-NFAT 리포터 세포(GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega #CS176501)로 수행되었다. 검사된 TCB는 다음과 같았다: 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(CH2527) 2+1 TCB, P329R LALA Fc, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(Clone 22) 2+1 TCB, P329R LALA Fc.
종양 표적을 발현하는 한 세트의 종양 세포주에서, 상이한 항-P329G TCB에 의해 유도된 Jurkat NFAT 활성화가 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 종양 표적화 P329G LALA huIgG1의 존재하에 검사되었다. 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 항-P329G TCB와 병용된 비결합 DP47 P329G LALA huIgG1이 음성 대조로서 사용되었다. 양성 대조로서, 직접적인 종양 표적화 2+1 TCB가 사용되었다.
이들 항-P329G TCB는 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 가장 높은 농도로 개별 IgG와 혼합되고 함께 적정되었다. 모든 TCB는 50 nM의 TCB부터 시작하여 연속적으로 10배 희석되어, 50 nM 내지 50 x 10-8 nM의 농도 범위를 야기하였다.
실험이 단일 시점 계측을 사용하여, 실시예 8에서 설명된 바와 같이 수행되었다. 이들 검정 구성요소는 루시페라아제 기질의 첨가 및 판독 절차 전 37℃ 및 5% CO2에서 6 시간 동안 배양되었다.
도 49는 상이한 표적화된 P329G LALA huIgG1 및 표적-발현 종양 세포주를 사용한 Jurkat NFAT T 세포 활성화 실험으로부터 결과를 묘사한다. 하위도면은 CD19(도 49a), FOLR1(도 49b), CEA(도 49c), HER2(도 49d), STEAP1(도 49e)을 표적으로 하는 분자를 사용한 결과를 보여준다. 데이터 포인트는 한 가지 실험의 기술적 삼중물의 평균값을 보여준다. 오차 막대는 표준 편차를 표시한다. 실례로서, 도 49a는 SU-DHL-8(CD19+) 종양 세포, 및 종양 표적화 분자로서 항-CD19 P329G LALA huIgG1로 수행된 검정을 보여준다. -P329G TCB의 3가지 CD3 결합체 버전, 항-P329G(VH3VL1) x CD3 2+1 TCB, P329R LALA Fc 모두 T 세포를 용량 의존성 방식으로 활성화한다. 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc는 다른 CD3 결합체와 비교하여, DP47 P329G LALA huIgG1과 병용될 때 가장 높은 비특이적 T 세포 활성화를 유도하고, 이로 인해 이것은 다른 클론보다 열등하다.
실시예 11
일차 인간 T 세포를 사용한 종양 세포 용해 검정
T 세포 매개된 종양 세포 용해를 유도하는, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc의 능력이 Incucyte 사멸 검정에 의해 평가되었다. 추가적으로, 3가지 상이한 CD3 결합체(P035.3093, CH2527, 클론 22)와 병용된 항-P329G TCB의 3가지 버전의 비교가 이러한 검정에서 수행되었다. 상기 검정은 Incucyte S3 장치(Essen Bioscience, #4647)를 사용한, 인큐베이터(37℃ 및 5% CO2 가습된 공기)의 내부에서 시간의 추이에서 적색 형광 단백질을 발현하는 종양 세포의 영상화 기반 정량을 활용한다.
항-P329G(VH3VL1) x CD3 2+1 TCB, P329R LALA Fc에 의해 유도된 T 세포 활성화가 종양 표적화 P329G LALA huIgG1, 및 건강한 공여자로부터 획득된 일차 인간 범 T 세포의 존재하에 검사되었다. 검사된 TCB는 다음과 같았다: 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(CH2527) 2+1 TCB, P329R LALA Fc, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(클론 22) 2+1 TCB, P329R LALA Fc.
종양 표적화 항체로서, 항-FolR1(16D5) P329G LALA huIgG1(HeLa NLR 세포의 경우) 또는 항-CEA(T84.66-LCHA) P329G LALA huIgG1(MKN-45 NLR 세포의 경우)가 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 항-P329G(VH3VL1) x CD3 2+1 TCB, P329R LALA Fc와 병용되었다. 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 이들 항-P329G TCB 중 어느 하나와 병용된 비결합 DP47 P329G LALA huIgG1이 음성 대조로서 사용되었다. 양성 대조로서, 직접적인 종양 표적화 항-FolR1(16D5) x CD3(P035.093) 2+1 TCB 또는 항-CEA(T84.66-LCHA) x CD3(CH2527) 2+1 TCB가 사용되었다.
이들 항-P329G TCB는 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 최종 농도로 개별 huIgG1과 혼합되어, 1 nM의 IgG 및 0.5 nM의 TCB를 야기하였다.
검정을 위한 제조물로서, HeLa NLR 및 MKN-45 NLR 인간 종양 세포가 수확되었다. 성장 배지가 세포 배양 플라스크로부터 제거되었고, 세포가 인산염 완충된 식염수(PBS, Gibco #20012)로 1회 세척되었다. PBS를 제거한 후, 세포가 트립신처리되었다(트립신-EDTA(0.05%), 페놀 레드, Gibco #25300-054). 세포 수 및 생존력이 Countess 자동화된 세포 계수기(Invitrogen #C10227)를 사용하여 결정되었다. 0.004 x 106개 세포/웰(100 μl/웰)이 검정 하루 전, 편평 바닥, 투명 바닥 96 웰-평판(TPP #Z707902) 내에 검정 배지(RPMI 1640, 10% FBS, 1% GlutaMAX)에 도말되었다. 검정 당일에, 건강한 공여자의 혈액으로부터 이전에 단리된 동결된 범 T 세포가 해동되었다. 세포가 계수되고, Countess 장치를 사용하여 생존력에 대해 평가되었다. 필요한 양이 350g에서 5 분 동안 원심분리에 의해 수확되었다. 5:1의 최종 효과기-대-표적 세포 비율(E:T)을 획득하기 위해, 0.02 x 106개 세포/웰(50 μl/웰)이 검정 배지에 도말되었다. 차후에, 항체 희석액이 검정 배지에서 제조되고, 200 μl의 최종 용적을 획득하기 위해 96 웰 평판에 첨가되었다. 평판이 Incucyte 인큐베이터 내로 배치되었고, 이미지의 획득이 4 시간 간격에 세팅되었다. 최종 판독은 웰마다 정규화된 적색 형광 구역으로 구성되었다.
72 시간 시점에서, 15 μl/웰의 상층액이 사이토카인 계측을 위해 수집되고 -20℃에서 동결되었다. 사이토카인 판독의 당일에, 검정 시작 30 분 전에 상층액이 해동되었다. 기술적 삼중물이 빼내지고, 제조업체의 프로토콜에 따라서 Bio-Plex Pro 인간 사이토카인 8-Plex 검정(Bio-Rad, #M50000007A)으로 분석되었다. 판독이 Bio-Plex 200 시스템으로 수행되었다.
도 50은 HeLa NLR(도 50a) 및 MKN-45 NLR(도 50b) 세포로 수행된 실험으로부터 종양 세포 용해 결과를 묘사한다. 일차 인간 범 T 세포에 의한 종양 세포의 동역학이 도시된다. 데이터 포인트는 한 가지 실험의 기술적 삼중물의 평균값을 보여준다. 오차 막대는 표준 편차를 표시한다. 유일하게 유효한 요법은 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc와 병용된 직접적인 종양 표적화 TCB 및 항-FolR1(16D5) P329G LALA huIgG1 또는 항-CEA(T84.66-LCHA) P329G LALA huIgG1이다.
도 51은 3가지 상이한 CD3 결합체를 비교하는, HeLa-NLR로 수행된 실험으로부터 종양 세포 용해 결과를 묘사한다. 데이터 포인트는 한 가지 실험의 기술적 삼중물의 평균값을 보여준다. 오차 막대는 표준 편차를 표시한다. 항-FOLR1(16D5) P329G LALA huIgG1과 병용된 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc는 상이한 CD3 결합체와 병용된 모든 a-P329G TCB 중에서, 종양 세포 용해에 대한 최고 능력을 보여주었다.
실시예 12
HeLa(FOLR1+) 세포에서 일차 인간 T 세포 활성화 검정; 항-P329G TCB에서 CD3 결합체의 비교; 3명의 T 세포 공여자
3가지 상이한 CD3 결합체(P035.093, CH2527, 클론 22)와 병용된 3개의 a-P329G TCB의 T 세포 활성화 능력이 3명의 건강한 공여자로부터 획득된 일차 인간 범 T 세포 또는 PBMC 세포로 평가되었다.
항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(CH2527) 2+1 TCB, P329R LALA Fc, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(클론 22) 2+1 TCB, P329R LALA Fc에 의해 유도된 T 세포 활성화가 종양 표적화 P329G LALA huIgG1의 존재하에 검사되었다.
종양 표적화 항체로서, 항-FolR1(16D5) P329G LALA huIgG1이 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 3가지 버전(P035.093, CH2527, 클론 22) 중 하나에서 항-P329G(VH3VL1) x CD3 2+1 TCB, P329R LALA Fc와 병용되었다. 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 이들 항-P329G TCB 중 어느 하나와 병용된 비결합 DP47 P329G LALA huIgG1이 음성 대조로서 사용되었다. 양성 대조로서, 직접적인 종양 표적화 항-FolR1(16D5) x CD3(P035.093) 2+1 TCB가 사용되었다. 사용된 표적 세포는 HeLa(FOLR1+)이었다. 이들 항-P329G TCB는 몰 비율 IgG:TCB 2:1에서 가장 높은 농도로 개별 IgG와 혼합되고 함께 적정되었다. 모든 TCB는 50 nM의 TCB부터 시작하여 연속적으로 10배 희석되어, 50 nM 내지 50 x 10-8 nM의 농도 범위를 야기하였다.
일차 인간 T 세포 활성화 검정이 실시예 9에서 설명된 바와 같이 수행되었다
도 52는 HeLa 세포 및 3명의 상이한 건강한 공여자 - 공여자 A(도 52a), 공여자 B(도 52b), 공여자 C(도 52c)로부터 획득된 T 세포로 수행된 실험으로부터 T 세포 활성화 결과를 묘사한다. CD8+ T 세포 풀 중에서 CD69+ T 세포의 백분율이 T 세포 활성화 마커로서 평가되었다. 데이터 포인트는 한 가지 실험의 기술적 삼중물의 평균값을 보여준다. 오차 막대는 표준 편차를 표시한다.
3명의 공여자 모두의 경우에, 종양 표적화 huIgG1과 병용될 때, 항-P329G(VH3VL1) x CD3(CH2527) 2+1 TCB, P329R LALA Fc는 CH2527 및 클론 22 CD3 결합체와 병용된 항-P329G TCB 버전과 비교하여 우수한 활성을 보여준다. 항-P329G TCB의 3가지 CD3 결합체 버전 모두 CD8+ T 세포 활성화를 용량 의존성 방식으로 유도한다.
실시예 13
동시자극성 분자의 평가를 위한 Jurkat NFκB 4-1BB 활성화 검정
T 세포에서 동시자극성 신호전달을 유도하는, 분자 항-P329G(VH2VL1) x 4-1BBL LALA huIgG1 1+1 및 항-P329G(VH2VL1) x CD28 LALA huIgG1 1+1의 능력이 Jurkat NFκB 4-1BB(Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2, Promega) 리포터 세포주에 의해 평가되었다. 이러한 검정은 실시예 8에서 설명된 Jurkat NFAT T 세포 활성화 검정과 동일한 원리를 따른다.
Jurkat NFκB 4-1BB 리포터 세포는 반딧불이 루시페라아제의 발현을 제어하는 NFκB -반응 요소를 갖는 4-1BBL-발현 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주이다. 4-1BB의 교차연결 시에, NFκB 프로모터가 활성화되어, 루시페라아제의 용량 의존성 발현을 야기한다. 루시페라아제 기질을 첨가하는 것은 Jurkat NFκB T 세포 동시자극의 강도를 반영하는 발광 신호를 야기한다. 교차연결은 종양 표적 및 Jurkat 세포 상에서 4-1BB에 동시에 결합하는 이중특이적 항체에 의해 시작될 수 있다. 추가적으로, NFκB 유도가 T 세포에서 TCR 신호전달의 하류이기 때문에, CD3 교차연결(예를 들면 TCB에 의해 유도됨)이 루시페라아제 발현을 야기할 수 있다.
항-P329G(VH2VL1) x 4-1BBL LALA huIgG1 1+1 및 항-P329G(VH2VL1) x CD28 LALA huIgG1 1+1에 의해 유도된 Jurkat NFκB 4-1BB 활성화가 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc와 함께 또는 이것 없이, 종양 표적화 항-CEA(T84.66-LCHA) P329G LALA huIgG1의 존재하에 검사되었다.
항-P329G TCB 또는 동시자극성 분자와 병용된 비결합 DP47 P329G LALA huIgG1이 음성 대조로서 사용되었다.
항-P329G huIgG1은 100 nM의 고정된 농도로 사용된 반면, 항-P329G TCB는 0.5 nM(T 세포 활성화를 위한 준최적 용량)의 고정된 농도로 사용되었다. 동시자극성 분자는 75 nM의 TCB부터 시작하여 연속적으로 10배 희석되어, 50 nM 내지 50 x 10-8 nM의 농도 범위를 야기하였다.
이들 검정 구성요소는 37℃ 및 5% CO2에서 6 시간 동안 배양되었다.
단일-시점 Jurkat NFAT 검정에 대해 실시예 8에서 설명된 바와 같이, 판독이 수행되었다.
도 53은 동시자극성 분자의 존재하에 Jurkat NFκB 4-1BB 리포터 세포 및 SKOV-3 huCEA 세포로 수행된 실험으로부터 결과를 묘사한다. 데이터 포인트는 한 가지 실험의 기술적 삼중물의 평균값을 보여준다. 오차 막대는 표준 편차를 표시한다. 항-P329G(VH2VL1) x 4-1BBL LALA huIgG1 1+1 및 항-P329G(VH2VL1) x CD28 LALA huIgG1 1+1 둘 모두 Jurkat NFκB 4-1BB 세포를 용량 의존성 방식으로 활성화한다. 이들의 활성은 단지 항-P329G(VH3VL1) x CD3(P035.093) 2+1 TCB, P329R LALA Fc의 준최적 용량에서만, 및 항-CEA(T84.66-LCHA) P329G LALA huIgG1의 동시 존재하에만 나타난다. 종양 표적화 huIgG1을 DP47 P329G LALA huIgG로 치환하는 것은 TCB와 병용될 때에도 활성화를 야기하지 않는데, 이것은 동시자극 주도 효과를 암시한다.
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비록 전술된 발명이 이해의 명료함을 위해 예시와 실례로서 일부 상세하게 설명되긴 했지만, 이들 설명과 실례는 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에서 인용된 모든 특허와 과학 문헌의 개시는 명시적으로 온전히 참조로서 편입된다.
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Leu Asn Gly Lys 530 535 540 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Arg Ala Pro Ile Glu 545 550 555 560 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 565 570 575 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 580 585 590 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 595 600 605 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 610 615 620 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 625 630 635 640 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 645 650 655 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 660 665 670 <210> 180 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 180 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr 100 105 110 Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val 115 120 125 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 130 135 140 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 145 150 155 160 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 165 170 175 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 195 200 205 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 210 215 220 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230

Claims (91)

  1. (a) 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 Fc 도메인 결합 모이어티; 및
    (b) 면역 활성화 모이어티
    를 포함하는, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    (c) 반감기 연장 Fc 도메인
    를 추가로 포함하고, Fc 도메인 결합 모이어티가 반감기 연장 Fc 도메인에 특이적으로 결합하지 않는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    반감기 연장 Fc 도메인이 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트를 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트가 Fc 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트가 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트의 경우에서와 같이 동일한 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트에서 아미노산이 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트와 비교하여 동일한 위치에서 상이한 아미노산으로 치환된, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트가 233, 234, 235, 238, 253, 265, 269, 270, 297, 310, 331, 327, 329 및 435로 구성된 목록(카밧(Kabat) EU 색인에 따른 넘버링)으로부터 선택되는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트가 233, 234, 235, 238, 253, 265, 269, 270, 297, 310, 331, 327, 329 및 435로 구성된 목록(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)으로부터 선택되는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트가 아미노산 치환 P329G(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트가 아미노산 치환 P329G(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하고, 하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트가 위치 P329(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)에서 글리신(G) 이외의 아미노산에 의한 치환을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트가 위치 P329(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)에서, 아르기닌(R), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 구성된 목록으로부터 선택되는 아미노산에 의한 치환을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트가 위치 P329(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)에서 아르기닌(R)에 의한 치환을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인 결합 모이어티가 아미노산 치환 P329G(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 부모 비돌연변이된 IgG1 Fc 도메인에는 특이적으로 결합할 수 없는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트가 L234 및 L235의 군(카밧 EU 색인 넘버링)으로부터 선택되는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환의 제2 세트가 L234 및 L235의 군(카밧 EU 색인 넘버링)으로부터 선택되는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 Fc 도메인이, 활성화 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환이 L234A, L235A 및 P329G(카밧 EU 색인 넘버링)인, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    반감기 연장 Fc 도메인이, 활성화 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환이 L234A, L235A 및 P329X(카밧 EU 색인 넘버링)이고, X가 글리신(G) 이외의 아미노산인, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인 결합 모이어티 및/또는 면역 활성화 모이어티가 Fab 분자인, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인 결합 모이어티가 아미노산 치환 P329G(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티가
    (i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
    (a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
    (b) EITPDSSTINYTPSLKD(서열번호 2), EITPDSSTINYTPSLKG(서열번호 11) 및 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16)로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR H2 아미노산 서열; 및
    (c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)
    를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    (ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
    (d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
    (e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
    (f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)
    를 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  18. 제17항에 있어서,
    Fc 도메인 결합 모이어티가 아미노산 치환 P329G(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티가
    (i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
    (a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
    (b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKD(서열번호 2); 및
    (c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)
    를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    (ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
    (d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
    (e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
    (f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)
    를 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  19. 제17항에 있어서,
    Fc 도메인 결합 모이어티가 아미노산 치환 P329G(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티가
    (i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
    (a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
    (b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYTPSLKG(서열번호 11); 및
    (c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    (ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
    (d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
    (e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
    (f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)
    를 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  20. 제17항에 있어서,
    Fc 도메인 결합 모이어티가 아미노산 치환 P329G(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티가
    (i) 중쇄 가변 영역(VH)으로서,
    (a) 중쇄 상보성 결정 영역(CDR H) 1 아미노산 서열 RYWMN(서열번호 1);
    (b) CDR H2 아미노산 서열 EITPDSSTINYAPSLKG(서열번호 16); 및
    (c) CDR H3 아미노산 서열 PYDYGAWFAS(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    (ii) 경쇄 가변 영역(VL)으로서,
    (d) 경쇄 상보성 결정 영역(CDR L) 1 아미노산 서열 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 4);
    (e) CDR L2 아미노산 서열 GTNKRAP(서열번호 5); 및
    (f) CDR L3 아미노산 서열 ALWYSNHWV(서열번호 6)
    를 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인 결합 모이어티가 아미노산 치환 P329G(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티가 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 17 및 서열번호 19로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 8 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  22. 제21항에 있어서,
    Fc 도메인 결합 모이어티가 아미노산 치환 P329G(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티가
    (i) 서열번호 7과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 8과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열;
    (ii) 서열번호 12와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열;
    (iii) 서열번호 17과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (iv) 서열번호 19와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열
    을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  23. 제22항에 있어서,
    Fc 도메인 결합 모이어티가 아미노산 치환 P329G(카밧 EU 색인에 따른 넘버링)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있고, Fc 도메인 결합 모이어티가 서열번호 19의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인 결합 모이어티가 제1 Fab 분자를 포함하고, 면역 활성화 모이어티가 제2 Fab 분자를 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  25. 제24항에 있어서,
    (d) 하나 이상의 아미노산 치환의 제1 세트를 포함하는 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자
    를 추가로 포함하는 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  26. 제25항에 있어서,
    제3 Fab 분자가 제1 Fab 분자와 동일한, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  28. 제27항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원이 CD3인, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원이 CD3 엡실론인, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 더욱 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 Fab 분자인, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  32. 제31항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원이 CD3, 특히 CD3 엡실론이고, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자가 서열번호 35의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 37의 중쇄 CDR 2, 서열번호 43의 중쇄 CDR 3, 서열번호 53의 경쇄 CDR 1, 서열번호 54의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 55의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원이 CD3, 특히 CD3 엡실론이고, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자가 서열번호 49의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  34. 제31항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원이 CD3, 특히 CD3 엡실론이고, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자가 서열번호 35의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 33의 중쇄 CDR 2, 서열번호 176의 중쇄 CDR 3, 서열번호 53의 경쇄 CDR 1, 서열번호 54의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 55의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  35. 제31항 또는 제34항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원이 CD3, 특히 CD3 엡실론이고, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자가 서열번호 177의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  36. 제31항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원이 CD3, 특히 CD3 엡실론이고, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자가 서열번호 34의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 37의 중쇄 CDR 2, 서열번호 41의 중쇄 CDR 3, 서열번호 53의 경쇄 CDR 1, 서열번호 54의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 55의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  37. 제31항 또는 제36항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원이 CD3, 특히 CD3 엡실론이고, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자가 서열번호 47의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  38. (a) 서열번호 89와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
    (b) 서열번호 70과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
    (c) 서열번호 178과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
    (d) 서열번호 179와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄
    를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자.
  39. (a) 서열번호 89와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
    (b) 서열번호 68과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
    (c) 서열번호 178과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
    (d) 서열번호 179와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄
    를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자.
  40. (a) 서열번호 89와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄;
    (b) 서열번호 180과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄;
    (c) 서열번호 178과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및
    (d) 서열번호 179와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄
    를 포함하는 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자.
  41. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  42. 제41항에 있어서,
    동시자극성 T 세포 항원이 CD28인, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 CD28에 특이적으로 결합하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 Fab 분자인, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  46. 제45항에 있어서,
    CD28에 특이적으로 결합하는 Fab 분자가 서열번호 94의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 95의 중쇄 CDR 2, 서열번호 96의 중쇄 CDR 3, 서열번호 97의 경쇄 CDR 1, 서열번호 98의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 99의 경쇄 CDR 3; 또는 서열번호 94의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 95의 중쇄 CDR 2, 서열번호 102의 중쇄 CDR 3, 서열번호 103의 경쇄 CDR 1, 서열번호 98의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 99의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서,
    CD28에 특이적으로 결합하는 Fab 분자가
    서열번호 100의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 101의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    서열번호 104의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 105의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  48. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  49. 제48항에 있어서,
    동시자극성 T 세포 항원이 4-1BB인, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 동시자극성 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 4-1BB에 특이적으로 결합하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 Fab 분자인, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  53. 제52항에 있어서,
    4-1BB에 특이적으로 결합하는 Fab 분자가 서열번호 133의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 134의 중쇄 CDR 2, 서열번호 135의 중쇄 CDR 3, 서열번호 136의 경쇄 CDR 1, 서열번호 137의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 138의 경쇄 CDR 3을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서,
    4-1BB에 특이적으로 결합하는 Fab 분자가 서열번호 139의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 140의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  55. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 사이토카인인, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자.
  56. 제55항에 있어서,
    사이토카인이 IL2, IL7, IL15, IL18, IFNa 및 IFNg로 구성된 군으로부터 선택되는, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 돌연변이체 인터류킨-2(IL-2) 폴리펩티드인, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자.
  58. 제57항에 있어서,
    돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G(인간 IL-2 서열 서열번호 166에 상대적으로 넘버링)를 포함하는 인간 IL-2 분자인, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자.
  59. 제58항에 있어서,
    돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 아미노산 치환 T3A 및/또는 아미노산 치환 C125A를 추가로 포함하는, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 서열번호 167의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 야생형 IL-2 폴리펩티드와 각각 비교하여 높은 친화성 IL-2 수용체에 대한 감소된 친화성 및 중간 친화성 IL-2 수용체에 대한 실제적으로 유사한 친화성을 나타내는, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이체 IL-2 폴리펩티드가 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하는, 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자.
  62. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 4-1BBL 또는 이의 단편의 3개의 엑토도메인을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  63. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 각각, 제1 폴리펩티드가 제1 중쇄 불변(CH1) 또는 경쇄 불변(CL) 도메인을 내포하고, 제2 폴리펩티드가 CL 또는 CH1 도메인을 내포하고, 제2 폴리펩티드가 CH1과 CL 도메인 사이의 이황화 결합에 의해 제1 폴리펩티드에 연결되고, 제1 폴리펩티드가 펩티드 링커에 의해 서로 및 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서,
    4-1BBL 또는 이의 단편의 엑토도메인이 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123 및 서열번호 124로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 특히 서열번호 117 또는 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가, 제1 폴리펩티드가 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127 및 서열번호 128로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드가 서열번호 117, 서열번호 121, 서열번호 119 및 서열번호 120으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  66. 제1항 내지 제23항 및 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 Fc 도메인 결합 모이어티를 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄, 특히 표적 Fc 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 분자, 및 면역 활성화 모이어티를 포함하는 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 포함하고, 각각, 제2 중쇄가 펩티드에 의해 서로 및 CH1 또는 CL 도메인에 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하고, 제2 경쇄가 펩티드 링커를 통해 상기 폴리펩티드의 CL 또는 CH1 도메인에 연결되는 상기 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 펩티드 링커에 의해 서로 연결되는 4-1BBL 또는 이의 단편의 2개의 엑토도메인을 포함하는 제1 펩티드가 자체의 C 말단에서 제2 펩티드 링커에 의해, 중쇄의 일부인 CL 도메인에 융합되고, 상기 4-1BBL 또는 이의 단편의 1개의 엑토도메인을 포함하는 제2 펩티드가 자체의 C 말단에서 제3 펩티드 링커에 의해, 경쇄의 일부인 CH1 도메인에 융합되는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  68. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 모이어티가 Fc 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  69. 제68항에 있어서,
    Fc 수용체가 Fc 감마 수용체, 특히 FcgRIIIa 수용체인, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서,
    Fc 수용체가 CD16인, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 인코딩하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드.
  72. 제71항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터, 특히 발현 벡터.
  73. 제71항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제73항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  74. (a) 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 제73항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 회수하는 단계
    를 포함하는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 생산하는 방법.
  75. 제74항에 따른 방법에 의해 생산된 면역 활성화 단편 결정화 가능(Fc) 도메인 결합 분자.
  76. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  77. 제1항 내지 제70항 및 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 또는 약학 조성물.
  78. 제1항 내지 제70항 및 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료가 필요한 개체에서 질환의 치료에 사용하기 위한 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 또는 약학 조성물.
  79. 제78항에 있어서,
    질환이 암인, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 또는 약학 조성물.
  80. 제1항 내지 제70항 및 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료가 필요한 개체에서 질환의 치료에 사용하기 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 또는 약학 조성물로서, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가 표적 Fc 도메인을 포함하는 표적화 항체와 병용되는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 또는 약학 조성물.
  81. 제80항에 있어서,
    질환이 암인, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자 또는 약학 조성물.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서,
    표적화 항체가 표적 항원, 특히 암 세포 상에서 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자.
  83. 치료가 필요한 개체에서 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자의 용도.
  84. 약학적으로 허용되는 형태로 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 포함하는 조성물의 치료 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 질환을 치료하는 방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서,
    질환이 암인, 용도 또는 방법.
  86. (a) 약학적으로 허용되는 형태로 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자를 포함하는 조성물의 치료 효과량을 개체에게 투여하는 단계; 및
    (b) 표적 Fc 도메인을 포함하는 표적화 항체를 포함하는 조성물의 치료 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 상기 개체의 질환을 치료하는 방법.
  87. 제85항에 있어서,
    질환이 암인, 방법.
  88. 제85항 또는 제87항에 있어서,
    표적화 항체가 표적 항원, 특히 암 세포 상에서 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 방법.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자가, 표적 Fc 도메인을 포함하는 항체 이전에, 상기 항체와 동시에, 또는 상기 항체 이후에 투여되는, 방법.
  90. 세포를 T 세포의 존재하에 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 따른 면역 활성화 Fc 도메인 결합 분자, 및 표적 Fc 도메인을 포함하는 표적화 항체와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 표적화 항체가 세포 상에서 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 세포의 용해를 유도하는 방법.
  91. 본원에 전술된 발명.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11672858B2 (en) 2018-12-21 2023-06-13 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibody molecules binding to CD3 and TYRP-1
CR20220637A (es) 2020-06-19 2023-01-31 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y cd19
TW202342535A (zh) * 2022-02-11 2023-11-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 免疫綴合物及其用途
WO2023180511A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved chimeric receptors
WO2023186760A1 (en) * 2022-03-28 2023-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved folr1 protease-activatable t cell bispecific antibodies
WO2024052389A1 (en) * 2022-09-08 2024-03-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant t cell receptors

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2808353C2 (de) 1977-04-18 1984-01-19 Hitachi Metals, Ltd., Tokyo Ohrring
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
ATE299938T1 (de) 1997-05-02 2005-08-15 Genentech Inc Ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
JP2003505082A (ja) 1999-07-26 2003-02-12 ジェネンテック・インコーポレーテッド 新規なポリヌクレオチドとその使用法
CA2385347C (en) 1999-10-04 2009-12-15 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
ATE542137T1 (de) 2001-12-04 2012-02-15 Merck Patent Gmbh Immunocytokine mit modulierter selektivität
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
WO2005100402A1 (en) 2004-04-13 2005-10-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
WO2006082515A2 (en) 2005-02-07 2006-08-10 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules that bind egfr, vectors encoding same, and uses thereof
DK3050963T3 (da) 2005-03-31 2019-12-09 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptid ved regulering af arrangement
EP1999154B1 (en) 2006-03-24 2012-10-24 Merck Patent GmbH Engineered heterodimeric protein domains
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
EP2424567B1 (en) 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
US20130089554A1 (en) 2009-12-29 2013-04-11 Emergent Product Development Seattle, Llc RON Binding Constructs and Methods of Use Thereof
CA2797981C (en) 2010-05-14 2019-04-23 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
PL2635607T3 (pl) 2010-11-05 2020-05-18 Zymeworks Inc. Projekt stabilnego przeciwciała heterodimerowego z mutacjami w domenie FC
DK3489255T3 (da) 2011-02-10 2021-08-23 Roche Glycart Ag Muterede interleukin-2-polypeptider
CN103476795B (zh) 2011-03-29 2016-07-06 罗切格利卡特公司 抗体Fc变体
DK2794905T3 (da) 2011-12-20 2020-07-06 Medimmune Llc Modificerede polypeptider til bispecifikke antistofgrundstrukturer
MX360109B (es) 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
NZ708182A (en) 2013-02-26 2019-08-30 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP2982692A1 (en) * 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
CN114920846A (zh) 2015-10-29 2022-08-19 豪夫迈·罗氏有限公司 抗变体Fc区抗体及使用方法
TWI829667B (zh) * 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體

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