ES2627482T3 - Procedimiento para la detección de una proteína de unión multiespecífica - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la determinación de la cantidad total de un anticuerpo multiespecífico terapéutico en una muestra de suero o plasma en un inmunoensayo de tipo sándwich que comprende la etapa de: - determinar la cantidad de un complejo formado entre i) un anticuerpo anti-idiotipo que se une específicamente a un primer determinante antigénico del anticuerpo multiespecífico terapéutico, y ii) el anticuerpo multiespecífico terapéutico incubando el complejo con un anticuerpo anti-idiotipo que se une específicamente a un segundo determinante antigénico del anticuerpo multiespecífico terapéutico, que es diferente del primer determinante antigénico y determinar así la cantidad del anticuerpo multiespecífico terapéutico en la muestra, en el que se conjuga el anticuerpo anti-idiotipo que se une específicamente a un primer determinante antigénico del anticuerpo multiespecífico terapéutico con una fase sólida, en el que se marca el anticuerpo anti-idiotipo que se une específicamente a un segundo determinante antigénico del anticuerpo multiespecífico terapéutico, y en el que la cantidad del anticuerpo anti-idiotipo que se une específicamente a un segundo determinante antigénico del anticuerpo multiespecífico terapéutico unido se correlaciona directamente con la cantidad de anticuerpo multiespecífico terapéutico en la muestra.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la deteccion de una proteina de union multiespecifica

La presente invencion se refiere a un procedimiento para la deteccion de una proteina de union multiespecifica en una muestra, en el que se detecta la proteina de union multiespecifica usando anticuerpos anti-idiotipo dirigidos contra los diferentes determinantes antigenicos de la proteina de union multiespecifica.

Antecedentes de la invencion

Los inmunoensayos en fase solida estandar con anticuerpos implican la formacion de un complejo entre un anticuerpo adsorbido/inmovilizado en una fase solida (anticuerpo de captura), el antigeno, y un anticuerpo contra otro epitopo del antigeno conjugado con una enzima o marcador detectable (anticuerpo de deteccion). En el ensayo, se forma un sandwich: fase solida/anticuerpo de captura/antigeno/anticuerpo de deteccion. En la reaccion catalizada por el sandwich, entre otras cosas, la actividad de la enzima conjugada con el anticuerpo es proporcional a la concentracion de antigeno en el medio de incubacion. Los ensayos de anticuerpos anti-idiotipo se mencionan, por ejemplo, en el documento US 5.219.730; el documento WO 87/002778; el documento EP 0 139 389; y el documento EP 0 170 302. Wadhwa, M., et al. (J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17) informan de estrategias para la deteccion, medicion y caracterizacion de anticuerpos indeseados inducidos por farmacos biologicos. En el documento EP 1 917 854 se informa de un procedimiento para producir anticuerpos anti-idiotipo.

En el documento WO 2008/119353 se informa de anticuerpos biespecificos y procedimientos para producir los mismos. Se informa de un procedimiento ex vivo para la generacion de un anticuerpo biespecifico, que comprende las etapas de: a) proporcionar un primer anticuerpo que tenga un primer determinante antigenico, en el que dicho primer anticuerpo comprende una region CH3 similar a IgG4, b) proporcionar un segundo anticuerpo que tenga un segundo determinante antigenico que difiera de dicho primer determinante antigenico, en el que dicho segundo anticuerpo comprende una region CH3 similar a IgG4, c) incubar juntos dichos primer y segundo anticuerpos en condiciones reductoras que permitan que las cisteinas en la region bisagra del nucleo consigan una isomerizacion de los enlaces disulfuro y d) obtener un anticuerpo biespecifico. En el documento WO 2006/096697, se informa de procedimientos para determinar la bivalencia de farmacos de anticuerpos y proteinas. En el documento WO 2008/134046 se informa de anticuerpos anti-CD4 potentes, estables y no inmunodepresores. Muller, K.M., et al. informan de que se puede usar el primer dominio constante (CH1 y CL) de un anticuerpo como dominio de heterodimerizacion para minianticuerpos biespecificos.

Sumario de la invencion

Se ha descubierto que usando dos anticuerpos anti-idiotipo como anticuerpo de captura y de deteccion en un inmunoensayo de tipo sandwich para la determinacion de la cantidad de un anticuerpo multiespecifico en una muestra, de forma que cada uno de los anticuerpos anti-idiotipo se une a determinantes antigenicos diferentes del anticuerpo multiespecifico, se pueden minimizar las influencias debidas a la matriz de la muestra (por ejemplo, plasma humano o suero, antigenos, etc.). Adicionalmente, es posible usar una configuracion de ensayo que sea mas sensible, menos influenciable por la matriz de la muestra, se pueda realizar mas rapidamente, requiera una eliminacion/dilucion minima de la matriz de la muestra y proporcione mas flexibilidad para el marcado/derivatizacion/inmovilizacion del anticuerpo de captura y/o de deteccion, respectivamente. Esto se logra usando dos anticuerpos anti-idiotipo, uno dirigido contra el primer determinante antigenico del anticuerpo biespecifico y otro contra el segundo determinante antigenico del anticuerpo biespecifico.

De esta manera, en el presente documento se informa de un procedimiento para la determinacion (inmunologica) de la cantidad de una proteina de union multiespecifica en una muestra que comprende la etapa de:

- determinar la cantidad de un complejo formado entre

i) un anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un primer determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica, y

ii) la proteina de union multiespecifica

incubar el complejo con un anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un segundo determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica, que es diferente del primer determinante antigenico del anticuerpo multiespecifico, y

determinar asi la cantidad de la proteina de union multiespecifica en la muestra.

Un aspecto que se informa en el presente documento es un procedimiento para la determinacion de la cantidad total de un anticuerpo multiespecifico terapeutico en una muestra de suero o plasma en un inmunoensayo de tipo sandwich que comprende la etapa de:

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- determinar la cantidad de un complejo formado entre i) un anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un primer determinante antigenico del anticuerpo multiespecifico terapeutico, y ii) el anticuerpo multiespecifico terapeutico incubando el complejo con un anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un segundo determinante antigenico del anticuerpo multiespecifico terapeutico, que es diferente del primer determinante antigenico y determinar asi la cantidad del anticuerpo multiespecifico terapeutico en la muestra,

en el que se conjuga el anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un primer determinante antigenico del anticuerpo multiespecifico terapeutico con una fase solida,

en el que se marca el anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un segundo determinante antigenico del anticuerpo multiespecifico terapeutico, y

en el que se correlaciona directamente la cantidad del anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un segundo determinante antigenico del anticuerpo multiespecifico terapeutico unido con la cantidad de anticuerpo multiespecifico terapeutico en la muestra.

En un modo de realizacion, la muestra es suero humano o plasma humano. En un modo de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico, o un anticuerpo triespecifico, o un anticuerpo tetraespecifico, o un anticuerpo pentaespecifico o un anticuerpo hexaespecifico. En un modo de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico.

En un modo de realizacion, el determinante antigenico es un sitio de union o una pareja de un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo.

En un modo de realizacion, el anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un primer determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica esta biotinilado y la fase solida esta recubierta de estreptavidina. En un modo de realizacion, la fase solida es una microesfera paramagnetica recubierta con estreptavidina o una microesfera de sefarosa recubierta con estreptavidina.

En un modo de realizacion, el anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente al segundo determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica esta digoxigenilado.

En un modo de realizacion, el procedimiento comprende la etapa de

- determinar la cantidad de un complejo formado entre

i) un anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un primer determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica,

ii) la proteina de union multiespecifica, y

iii) un anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un segundo determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica y que comprende un marcador detectable,

mediante la determinacion del marcador detectable en el complejo formado.

En un modo de realizacion, se realiza la conjugacion de un anticuerpo anti-idiotipo con su ligando uniendo quimicamente por medio de grupos N-terminales y/o £-amino (lisina), grupos £-amino de diferentes lisinas, grupos funcionales carboxi, sulfhidrilo, hidroxilo y/o fenolico de la cadena principal aminoacidica del anticuerpo terapeutico y/o grupos alditol de la estructura glucidica del anticuerpo terapeutico.

En un modo de realizacion, el anticuerpo anti-idiotipo es una mezcla que comprende el anticuerpo anti-idiotipo conjugado por medio de al menos dos grupos amino diferentes con la fase solida. Se puede realizar dicho acoplamiento por medio de grupos amino diferentes mediante acilacion de una parte de los grupos £-amino con agentes protectores quimicos, por ejemplo, mediante citraconilacion, en una primera etapa. En una segunda etapa, se realiza la conjugacion por medio de los grupos amino restantes. Posteriormente, se elimina la citraconilacion y se conjuga el anticuerpo con la fase solida por medio de los grupos amino libres restantes, es decir, se conjuga el anticuerpo obtenido con la fase solida por medio de grupos amino que no se han protegido por citraconilacion. Los agentes protectores quimicos adecuados forman enlaces en aminas de cadena lateral no protegida y son menos estables y diferentes de los enlaces en el extremo N. Se conocen muchos de dichos agentes protectores quimicos (vease, por ejemplo, el documento EP 0 651 761). En un modo de realizacion, los agentes protectores quimicos incluyen anhidridos de acidos dicarboxilicos ciclicos, como anhidrido de acido maleico o citraconico.

En un modo de realizacion, se conjuga el anticuerpo anti-idiotipo con la fase solida mediante adsorcion pasiva. Por ejemplo, se describe la adsorcion pasiva en Butler, J.E., in “Solid Phases in Immunoassay” (1996) 205-225 y Diamandis, E.P., and Christopoulos, T.K. (editores), en “Immunoassays” (1996) Academic Press (San Diego).

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En un modo de realizacion, se conjuga (inmoviliza) el anticuerpo anti-idiotipo por medio de una pareja de union especifica. En un modo de realizacion, dicha pareja de union (primer componente/segundo componente) se selecciona de estreptavidina o avidina/biotina, anticuerpo/antigeno (vease, por ejemplo, Hermanson, G.T., et a/., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996) lectina/polisacarido, esteroide/proteina de union a esteroides, hormona/receptor de hormonas, enzima/sustrato, IgG/proteina A y/o G, etc. En un modo de realizacion, se conjuga el anticuerpo anti-idiotipo con biotina y se realiza la inmovilizacion por medio de estreptavidina o avidina inmovilizada.

Descripcion de las figuras

Figura 1 Principio del ensayo ELISA farmacocinetico esquematico para la determinacion de concentraciones de anticuerpos biespecificos en muestras celulares y de suero (ELISA basado en anticuerpos anti-idiotipo).

Figura 2 ELISA de tipo sandwich basado en antigenos para la deteccion de anticuerpos anti-VEGF/ANG2. Se recubrio directamente angiopoyetina 2 humana recombinante en una placa de microtitulacion. En paralelo, se preincubaron muestras que contenian anticuerpos anti-VEGF/ANG2 con VEGF recombinante marcado con digoxigenina. Despues del recubrimiento, la placa se lavo e incubo con la mezcla preincubada. Los complejos de anticuerpo anti-VEGF/ANG2 y VEGF marcado con digoxigenina se unen a la ANG2 en la superficie de la placa de microtitulacion. Se detecto el VEGF marcado con digoxigenina unido con el conjugado anticuerpo anti-digoxigenina- HRP y ABTS.

Figura 3 Comparacion de las curvas de calibracion obtenidas en un ELISA basado en antigenos (A) y un ELISA basado en anticuerpos anti-idiotipo (B) para la deteccion de anticuerpo anti-VEGF/ANG2 biespecifico.

Figura 4 Comparacion de las curvas de calibracion del ELISA basado en anticuerpos anti-idiotipo y del ELISA basado en antigenos en presencia de suero humano al 5 %, 10 % y 20 %.

Descripcion detallada de la invencion

En el presente documento se informa de un procedimiento in vitro para la determinacion de la cantidad de una proteina de union multiespecifica, tal como farmacos/anticuerpos biespecificos, en muestras preclinicas y clinicas.

Se ha descubierto que se tiene que detectar una proteina de union multiespecifica en una muestra usando dos anticuerpos anti-idiotipo que se unen a diferentes determinantes antigenicos de la proteina de union multiespecifica a fin de minimizar las influencias por la matriz de la muestra y permitir un mayor grado de flexibilidad en la configuracion y realizacion de la determinacion inmunologica de la cantidad de la proteina de union multiespecifica en la muestra.

A continuacion, se ejemplifica el procedimiento que se informa en el presente documento con un anticuerpo multiespecifico como aspecto de una proteina de union multiespecifica.

Se usa el termino "anticuerpo" en el presente documento en el sentido mas amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo, pero no limitadas a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de union a antigeno deseada.

La proteina de union multiespecifica es un anticuerpo multiespecifico, por ejemplo, un anticuerpo biespecifico. Los anticuerpos multiespecificos son anticuerpos monoclonales que tienen determinantes antigenicos para al menos dos sitios diferentes. En determinados modos de realizacion, uno de los determinantes antigenicos es para un primer antigeno y la otra para un segundo antigeno diferente. En determinados modos de realizacion, se pueden unir anticuerpos biespecificos a dos epitopos diferentes del mismo antigeno. Se pueden preparar anticuerpos biespecificos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo. En un modo de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico que se une especificamente a un primer y un segundo antigeno. En un modo de realizacion, el anticuerpo biespecifico tiene i) un primer determinante antigenico que se une especificamente a un primer antigeno o un primer epitopo en un antigeno y ii) un segundo determinante antigenico que se une especificamente a un segundo antigeno o un segundo epitopo en el mismo antigeno. En un modo de realizacion, el segundo epitopo en el mismo antigeno es un epitopo no solapante.

Se describen anticuerpos multiespecificos en los documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 o WO 2010/145793.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molecula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porcion de un anticuerpo intacto que se une al antigeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no estan limitados a, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

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La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o region constante que posee su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, y y p, respectivamente.

El termino "antigeno libre" denota el antigeno que se puede unir especificamente mediante un determinante antigenico de un anticuerpo, pero que actualmente no esta unido a este determinante antigenico. En un modo de realizacion, el antigeno libre es un antigeno no unido a anticuerpo o un antigeno que no forma complejo con anticuerpo.

Se usa el termino "region Fc" en el presente documento para definir una region de extremo C de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porcion de la region constante. El termino incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En un modo de realizacion, una region Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, puede estar presente o no lisina en el extremo C (Lys447) de la region Fc. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeracion de los residuos aminoacidicos en la region Fc o region constante es de acuerdo con el sistema de numeracion EU, tambien llamado el indice EU, como se describe en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.° ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

“Region estructural” o “FR” se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la region hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste generalmente en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen generalmente en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1 -H1 (L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Un “anticuerpo humano” es uno que posee una secuencia aminoacidica que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano o una celula humana derivada de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definicion de un anticuerpo humano excluye especificamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de union a antigeno no humanos.

Un anticuerpo “humanizado” se refiere a un anticuerpo quimerico que comprende residuos aminoacidicos de HVR no humanas y residuos aminoacidicos de FR humanas. En determinados modos de realizacion, un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todos de al menos un dominio variable, y tipicamente dos, en que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) se corresponden con las de un anticuerpo no humano y todas o sustancialmente todas las FR se corresponden con las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porcion de una region constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una “forma humanizada” de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanizacion.

El termino “region hipervariable” o “HVR”, como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente (“bucles hipervariables”). Generalmente, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden generalmente residuos aminoacidicos de los bucles hipervariables y/o de las “regiones determinantes de la complementariedad” (CDR), siendo las ultimas de variabilidad de secuencia mas alta y/o estando implicada en el reconocimiento antigenico. Los bucles hipervariables ejemplares se producen en los residuos aminoacidicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 2632 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). Las CDR ejemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) se ubican en los residuos aminoacidicos 2434 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2 y 95-102 de H3 (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.° ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991), NIH Publication 91-3242). Con la excepcion de la CDR1 de la VH, las CDR comprenden generalmente los residuos aminoacidicos que forman los bucles hipervariables. Las CDR tambien comprenden “residuos determinantes de la especificidad” o “SDR”, que son los residuos que entran en contacto con el antigeno. Los SDR estan contenidos en regiones de las CDR llamadas CDR abreviadas o a-CDR. Las a-CDR ejemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) se producen en los residuos aminoacidicos 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1,50-58 de H2 y 95-102 de H3 (Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., arriba.

El termino “anticuerpo monoclonal” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos y/o se unen al mismo epitopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o surgen durante la produccion de una preparacion de anticuerpos monoclonales, estando presentes generalmente dichas variantes en cantidades menores. A diferencia de las

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preparaciones de anticuerpos policlonales, que tipicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparacion de anticuerpos monoclonales se dirige contra un unico determinante en el antigeno. De esta manera, el modificador “monoclonal” indica el caracter del anticuerpo por haberse obtenido a partir de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la produccion del anticuerpo por ningun procedimiento particular. Por ejemplo, se pueden preparar los anticuerpos monoclonales a usar de acuerdo con la presente invencion se pueden preparar mediante una variedad de tecnicas, incluyendo, pero no limitadas al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentacion en fagos y procedimientos que utilizan animales transgenicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, estando descritos dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales en el presente documento.

El termino “region variable” o “dominio variable” se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que participa en la union del anticuerpo al antigeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural generalmente tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR) (vease, por ejemplo, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), pagina 91). Un unico dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de union a antigeno. Ademas, se pueden aislar anticuerpos que se unen a un antigeno particular usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antigeno para cribar una coleccion de dominios VL o VH complementarios, respectivamente (vease, por ejemplo, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

El termino “anticuerpo anti-idiotipo” denota un anticuerpo que se une especificamente a un determinante antigenico tal como un sitio de union de un anticuerpo precursor, es decir, que esta dirigido, por ejemplo, contra un sitio de union a antigeno de un anticuerpo precursor. En un modo de realizacion, el anticuerpo anti-idiotipo se une especificamente a una o mas de las CDR del anticuerpo precursor. El anticuerpo precursor es un anticuerpo multiespecifico terapeutico. En un modo de realizacion, el anticuerpo precursor es un anticuerpo biespecifico.

Dos epitopos se solapan si se detecta una reduccion de la senal de un 50 % o mas, en un modo de realizacion de un 75 % o mas, mediante un ensayo de resonancia de plasmon superficial (RPS) usando el anticuerpo inmovilizado y el antigeno soluble, o viceversa, con el epitopo en cuestion a una concentracion de 20-50 nM y el anticuerpo cuyo solapamiento de epitopos se tiene que detectar a una concentracion de 100 nM. De forma alternativa, se puede usar un procedimiento en el que se determina el solapamiento de epitopos de dos anticuerpos que se unen al mismo antigeno con ayuda de un sistema de ensayo competitivo. Para este proposito, por ejemplo, con ayuda de un inmunoensayo enzimatico basado en celulas (ELISA) que emplea celulas que expresan epitopos de antigenos recombinantes, se analiza si el anticuerpo cuyo solapamiento de epitopos se tiene que detectar compite con el otro anticuerpo por la union al antigeno inmovilizado. Para este proposito, se incuba el antigeno inmovilizado con el anticuerpo en forma marcada y en exceso del anticuerpo cuyo solapamiento de epitopos se tiene que detectar. Mediante la deteccion del marcador unido se puede averiguar facilmente el solapamiento de epitopos. Si se determina una reduccion de senal de mas de un 70 %, en un modo de realizacion de mas de un 80 %, a la misma concentracion, o un desplazamiento de mas de un 80 %, en un modo de realizacion de mas de un 90 %, a concentraciones mas altas, en un caso con un exceso de 105 veces del anticuerpo cuyo solapamiento de epitopos se tiene que detectar, relativo al anticuerpo conocido, entonces existe solapamiento o identidad de epitopos y ambos anticuerpos se unen al mismo epitopo o a uno solapante en el mismo antigeno.

Los principios de diferentes inmunoensayos se describen, por ejemplo, en D.S. (Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R). Lu, B., et al. (Analyst 121 (1996) 29R-32R) e informan de la inmovilizacion orientada de anticuerpos para el uso en inmunoensayos. Se informa de inmunoensayos mediados por avidina-biotina, por ejemplo, en Wilchek, M., and Bayer, E.A., Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469.

Los anticuerpos monoclonales y sus dominios constantes contienen como proteinas una serie de cadenas laterales reactivas para acoplarse a un ligando, tal como una superficie, una proteina, un polimero (por ejemplo, PEG, celulosa o poliestireno), una enzima o un miembro de una pareja de union. Los grupos reactivos quimicos de los anticuerpos son, por ejemplo, grupos amino (lisinas, grupos alfa-amino), grupos tiol (cistinas, cisteinas y metioninas), grupos acido carboxilico (acidos asparticos, acidos glutamicos) y grupos alditol. Dichos procedimientos, por ejemplo, se describen en Aslam M., y Dent, A., “Bioconjugation”, MacMillan Ref. Ltd. 1999, pp. 50-100.

Uno de los grupos reactivos mas comunes de las proteinas es el £-amino alifatico del aminoacido lisina. En general, practicamente todos los anticuerpos contienen abundante lisina. Las aminas de lisina son nucleofilos razonablemente buenos por encima de pH 8,0 (pKa = 9,18) y, por lo tanto, reaccionan facil y limpiamente con una variedad de reactivos para formar enlaces estables. Los compuestos reactivos con amino reaccionan principalmente con lisinas y los grupos a-amino de las proteinas. Los esteres reactivos, particularmente los esteres de N-hidroxi- succinimida (NHS), estan entre los reactivos empleados mas comunmente para la modificacion de grupos amino. El pH optimo para la reaccion en un entorno acuoso es pH 8,0 a 9,0. Los isotiocianatos son reactivos de modificacion de aminas y forman enlaces de tiourea con las proteinas. Reaccionan con aminas proteicas en solucion acuosa (optimamente a pH de entre 9,0 y 9,5). Los aldehidos reaccionan en condiciones acuosas suaves con aminas

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alifaticas y aromaticas, hidracinas e hidracidas para formar un intermedio de imina (base de Schiff). Se puede reducir selectivamente una base de Schiff con agentes reductores suaves o fuertes (tales como borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio) para obtener un enlace de alquilamina estable. Otros reactivos que se han usado para modificar aminas son anhidridos de acido. Por ejemplo, el anhidrido del acido dietilentriaminopentaacetico (DTPA) es un agente quelante bifuncional que contiene dos grupos anhidrido reactivos con amina. Puede reaccionar con grupos de extremo N y £-amino de proteinas para formar enlaces de amida. Los anillos de anhidrido se abren para crear brazos quelatantes de metal multivalentes que se pueden unir firmemente a metales en un complejo de coordinacion.

Otro grupo reactivo comun en los anticuerpos es el residuo tiol del aminoacido que contiene azufre cistina y su producto de reduccion cisteina (o media cistina). La cisteina contiene un grupo tiol libre, que es mas nucleofilo que las aminas y es generalmente el grupo funcional mas reactivo en una proteina. Los tioles son generalmente reactivos a pH neutro, y, por lo tanto, se pueden acoplar selectivamente a otras moleculas en presencia de aminas. Puesto que los grupos sulfhidrilo libres son relativamente reactivos, las proteinas con estos grupos a menudo existen con ellos en su forma oxidada como grupos disulfuro o enlaces disulfuro. En dichas proteinas, se requiere la reduccion de los enlaces disulfuro con un reactivo tal como ditiotreitol (DTT) para generar el tiol libre reactivo. Los compuestos reactivos con tiol son los que se acoplan a los grupos tiol de las proteinas, formando productos acoplados con tioeter. Estos reactivos reaccionan rapidamente a pH de ligeramente acido a neutro y, por lo tanto, se pueden hacer reaccionar selectivamente en presencia de grupos amino. La bibliografia informa del uso de varios reactivos de reticulacion tiolantes, tales como el reactivo de Traut (2-iminotiolano), (acetiltio)acetato de succinimidilo (SATA) y 6-[3-(2-piridilditio)propionamido]hexanoato de sulfosuccinimidilo (Sulfo-LC-SPDP) para proporcionar maneras eficaces de introducir multiples grupos sulfhidrilo por medio de grupos amino reactivos. Los derivados de haloacetilo, por ejemplo, yodoacetamidas, forman enlaces tioeter y tambien son reactivos para la modificacion con tiol. Otros reactivos utiles son las maleimidas. La reaccion de maleimidas con reactivos con tiol es esencialmente la misma que con yodoacetamidas. Las maleimidas reaccionan rapidamente a pH de ligeramente acido a neutro.

Otro grupo reactivo comun en los anticuerpos es el acido carboxilico. Las proteinas contienen grupos acido carboxilico en la posicion de extremo C y en las cadenas laterales del acido aspartico y acido glutamico. La reactividad relativamente baja de los acidos carboxilicos en agua habitualmente hace dificil el uso de estos grupos para modificar selectivamente proteinas y otras biomoleculas. Cuando se hace esto, el grupo acido carboxilico habitualmente se convierte en un ester reactivo mediante el uso de una carbodiimida soluble en agua y se hace reaccionar con un reactivo nucleofilo, tal como una amina, hidracida o hidracina. El reactivo que contiene amina debe ser una base debil a fin de reaccionar selectivamente con el acido carboxilico activado en presencia de las £- aminas mas basicas de la lisina para formar un enlace amida estable. Se puede producir la reticulacion de proteinas cuando el pH se eleva por encima de 8,0.

Se puede usar peryodato de sodio para oxidar la parte alcoholica de un azucar de un resto glucidico fijado a un anticuerpo a un aldehido. Se puede hacer reaccionar cada grupo aldehido con una amina, hidracida o hidracina como se describe para los acidos carboxilicos. Puesto que el resto glucidico se encuentra predominantemente en la region del fragmento cristalizable (Fc) de un anticuerpo, se puede lograr la conjugacion a traves de la modificacion dirigida al sitio del glucido lejos del sitio de union a antigeno. Se forma un intermedio de base de Schiff, que se puede reducir a una alquilamina a traves de la reduccion del intermedio con agentes reductores solubles en agua de cianoborohidruro de sodio (suave y selectivo) o borohidruro de sodio (fuerte).

El termino “muestra” incluye, pero no esta limitada a, cualquier cantidad de una sustancia de un ser vivo o ser vivo anterior. Dichos seres vivos incluyen, pero no estan limitados a, seres humanos, ratones, monos, ratas, conejos y otros animales. En un modo de realizacion, la muestra se obtiene de un mono, especialmente un macaco cangrejero, o un conejo, o un raton o rata. Dichas sustancias incluyen, pero no estan limitadas a, sangre entera, suero o plasma de una persona, que son las fuentes de muestra mas ampliamente usadas en la rutina clinica.

El termino “fase solida” denota una sustancia no liquida, e incluye particulas (incluyendo microparticulas y microesferas) preparadas de materiales tales como polimero, metal (particulas paramagneticas, ferromagneticas), vidrio y ceramica; sustancias en gel tales como silice, alumina y geles polimericos; capilares, que pueden estar preparados de polimero, metal, vidrio y/o ceramica; zeolitas y otras sustancias porosas; electrodos; placas de microtitulacion; tiras solidas; y cubetas, tubos u otros recipientes de muestras de espectrometro. Un componente de fase solida se distingue de las superficies solidas inertes en que una "fase solida" contiene al menos un resto en su superficie, que esta destinado a interaccionar con una sustancia en una muestra. Una fase solida puede ser un componente estacionario, tal como un tubo, tira, cubeta o placa de microtitulacion, o pueden ser componentes no estacionarios, tales como microesferas y microparticulas. Se puede usar una variedad de microparticulas que permitan la fijacion no covalente o covalente de proteinas y otras sustancias. Dichas particulas incluyen particulas polimericas tales como poliestireno y poli(metacrilato de metilo); particulas de oro tales como nanoparticulas de oro y coloides de oro; y particulas ceramicas tales como silice, vidrio y particulas de oxido de metal. Vease, por ejemplo, Martin, CR, y col., Analytical Chemistry-News & Features, 70 (1998) 322A-327A, o Butler, J.E., Methods 22 (2000) 423.

A partir de cromogenos (grupos fluorescentes o luminiscentes y colorantes), enzimas, grupos activos por RMN,

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particulas de metal o haptenos, tales como digoxigenina, se selecciona el marcador detectable en un modo de realizacion. El marcador detectable tambien puede ser un grupo de reticulacion fotoactivable, por ejemplo, un grupo azido o azirina. Los quelatos de metal que se pueden detectar mediante electroquimioluminiscencia tambien son en un modo de realizacion grupos emisores de senales, dandose particular preferencia a quelatos de rutenio, por ejemplo, un quelato de rutenio (bispiridilo)32+. Los grupos marcadores de rutenio adecuados se describen, por ejemplo, en los documentos EP 0 580 979, WO 90/05301, WO 90/11511 y WO 92/14138.

El termino “proteina de union multiespecifica terapeutica” denota una proteina de union multiespecifica que esta destinada para su uso en un ser humano. La proteina de union multiespecifica es un anticuerpo multiespecifico. En un modo de realizacion, el anticuerpo multiespecifico es un anticuerpo biespecifico. En un modo de realizacion, el anticuerpo multiespecifico o biespecifico es un anticuerpo monoclonal. En un modo de realizacion, el anticuerpo multiespecifico o anticuerpo biespecifico es un anticuerpo monoclonal humano o humanizado.

El termino “animal de experimentacion” denota cualquier mamifero, por ejemplo, animales domesticos y de granja, asi como primates superiores, pero excluye a los humanos. En un modo de realizacion, el procedimiento que se informa en el presente documento se realiza con una muestra obtenida a partir de un animal de experimentacion seleccionado del grupo que comprende raton, rata, conejo, cabra, oveja, perro, gato y primates como lemures, monos, titles y simios. Si el animal de experimentacion es un simio inferior, se excluyen los parientes mas cercanos al hombre, los grandes simios, especialmente el grupo de chimpances, bonobos, gorilas y orangutanes.

El termino “proteina de union multiespecifica terapeutica total” denota cualquier proteina de union multiespecifica terapeutica presente en una muestra de un animal de experimentacion independientemente de si la proteina de union multiespecifica terapeutica es activa (es decir, todavia reactiva con su uno o mas ligandos), inactiva y/o forma complejo con el ligando.

El termino “proteina de union multiespecifica terapeutica activa” denota la proteina de union multiespecifica terapeutica presente en una muestra de un animal de experimentacion que todavia se puede unir a uno o mas de sus ligandos.

El termino “proteina de union multiespecifica terapeutica que forma complejo con su ligando” indica la proteina de union multiespecifica terapeutica presente en una muestra de un animal de experimentacion en el que al menos un determinante antigenico se une especificamente a su ligando.

En el presente documento se informa de un procedimiento de determinacion inmunologica para la determinacion de la cantidad de una proteina de union multiespecifica en una muestra.

La determinacion inmunologica se realiza como ensayo de doble captura usando una molecula de captura, una molecula trazadora y una molecula de deteccion.

La molecula de captura se une a una fase solida. La molecula de captura puede ser cualquiera de un ligando de la proteina de union multiespecifica (por ejemplo, uno de los antigenos de un anticuerpo biespecifico), un agente de formacion de complejos general de la proteina de union multiespecifica (por ejemplo, un receptor Fc en el caso de un anticuerpo de longitud completa o un anticuerpo anti-region Fc en el caso de un anticuerpo de longitud completa), o un primer ligando de una pareja de union si la proteina de union multiespecifica se derivatiza con el segundo ligando de una pareja de union, o un anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a una determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica.

La molecula de deteccion puede ser cualquiera de un ligando de la proteina de union multiespecifica (por ejemplo, uno de los antigenos de un anticuerpo biespecifico, pero si se usa un antigeno como molecula de captura, se tiene que usar un antigeno diferente como molecula de deteccion), un agente de formacion de complejos general de la proteina de union multiespecifica (por ejemplo, un receptor Fc en el caso de un anticuerpo de longitud completa con la condicion de que esta molecula ya no se use como molecula de captura o un anticuerpo anti-region Fc en el caso de un anticuerpo de longitud completa con la condicion de que este anticuerpo se una a un epitopo diferente si tambien se usa la misma clase de anticuerpo como molecula de captura), o un primer ligando de una pareja de union si la proteina de union multiespecifica se derivatiza con el segundo ligando de una pareja de union (con la condicion de que se use una pareja de union diferente que la usada para inmovilizar la molecula de captura), o un anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica (con la condicion de que este se una a un determinante antigenico diferente que un anticuerpo anti- idiotipo usado como molecula de captura).

Se ha descubierto ahora que para la determinacion de la cantidad de una proteina de union multiespecifica en una muestra es ventajoso usar un anticuerpo anti-idiotipo como molecula de captura y como molecula de deteccion, con lo que los anticuerpos anti-idiotipo se unen a diferentes determinantes antigenicos de la proteina de union multiespecifica.

Mediante el uso de un anticuerpo anti-idiotipo como molecula de captura y como molecula de deteccion en la

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determinacion inmunologica de un anticuerpo multiespecifico en una muestra, el procedimiento es i) mas robusto/sufre menos interferencia con respecto a las sustancias en la matriz de la muestra, ii) requiere menos dilucion de la muestra, iii) se puede realizar mas rapidamente, iv) es mas flexible con respecto al marcaje/derivatizacion/inmovilizacion del anticuerpo de deteccion y/o de captura en comparacion con un procedimiento que usa los antigenos de la proteina de union multiespecifica como molecula de deteccion y de captura.

Se ha descubierto que la determinacion inmunologica de la cantidad de una proteina de union multiespecifica en una muestra, especialmente en una muestra que contiene plasma humano o suero obtenida a partir de un animal de experimentacion, esta fuertemente influenciada por la matriz de la muestra si se usan los antigenos de la proteina de union multiespecifica como molecula de deteccion y de captura.

Si la muestra se obtiene a partir de un animal de experimentacion en el que, por ejemplo, se lleva a cabo un estudio farmacocinetico, la muestra tambien contendra, ademas de la proteina de union multiespecifica, otros componentes estrechamente relacionados derivados del animal de experimentacion. Por ejemplo, si la muestra es suero obtenido a partir de la sangre de un animal de experimentacion, tambien contendra uno o mas de los ligandos (por ejemplo, ligandos solubles de un receptor o moleculas de receptor desprendidas) de la proteina de union multiespecifica (por ejemplo, los antigenos de un anticuerpo multiespecifico), inmunoglobulinas de diferentes subclases en una cantidad mas alta o mas baja que la de la proteina de union multiespecifica, moleculas de formacion de complejos no especificas, etc. Todas estas moleculas pueden interferir en un procedimiento de determinacion inmunologica.

Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo biespecifico, la muestra tambien comprende, ademas del anticuerpo biespecifico, uno o ambos de los antigenos del anticuerpo biespecifico. Esto da como resultado la presencia de una mezcla de anticuerpo biespecifico libre, anticuerpo biespecifico que forma complejo con un antigeno, anticuerpo biespecifico que forma complejo con dos antigenos y cada una de las moleculas enumeradas anteriormente que forman complejos no especificos con otros componentes del plasma humano o suero. Se puede detectar el anticuerpo biespecifico libre con cualquier combinacion posible de molecula de deteccion y de captura como se explica anteriormente. Tambien se puede detectar principalmente el anticuerpo que forma complejo con antigeno con cualquiera de las combinaciones anteriores, pero la sensibilidad del procedimiento se reducira a medida que se retire parte del anticuerpo biespecifico de la cantidad total de anticuerpo presente en la muestra, ya que el anticuerpo que forma complejo con antigeno esta en un equilibrio con la forma que no forma complejo. La cantidad de anticuerpo que forma complejo con antigeno es altamente variable y, por eso, influye en el ensayo, tambien de manera altamente variable. Esto se puede contrarrestar, al menos parcialmente, usando tiempos de incubacion prolongados, lo que, por otra parte, ralentiza la realizacion del ensayo.

Se ha descubierto ahora que se puede mejorar la sensibilidad de un procedimiento de determinacion inmunologica de la cantidad de un anticuerpo biespecifico en una muestra de suero o plasma obtenida a partir de un animal de experimentacion usando como molecula de captura y como molecula de deteccion un anticuerpo anti-idiotipo que se una especificamente a las CDR de los diferentes determinantes antigenicos del anticuerpo biespecifico. Asimismo, se puede reducir el tiempo requerido para realizar la determinacion, ya que, entre otras cosas, no son necesarios tiempos de incubacion prolongados a fin de desplazar el equilibrio de union. Adicionalmente, se puede reducir la cantidad requerida de molecula de captura/densidad de la molecula de captura en la superficie solida, ya que se puede capturar el anticuerpo biespecifico independientemente de la formacion de complejos con antigeno y, de esta manera, se requiere menos molecula de captura.

Un aspecto que se informa en el presente documento es un procedimiento para determinar la cantidad o concentracion de un anticuerpo multiespecifico terapeutico, especialmente un anticuerpo biespecifico, en una muestra obtenida a partir de un animal de experimentacion que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) incubar una muestra con un primer anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un primer determinante antigenico del anticuerpo multiespecifico terapeutico,

b) incubar la muestra con un segundo anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un segundo determinante antigenico del anticuerpo multiespecifico terapeutico, con lo que el segundo determinante antigenico es diferente del primer determinante antigenico y

c) correlacionar el complejo formado en la etapa b) con la cantidad o concentracion de la proteina de union multiespecifica terapeutica.

En un modo de realizacion, la proteina de union multiespecifica es un anticuerpo biespecifico.

En un modo de realizacion, el determinante antigenico es una pareja de un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo con su dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo analogo.

En un modo de realizacion, el ligando de uno o mas determinantes antigenicos de la proteina de union

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multiespecifica es un antigeno. En un modo de realizacion, el antigeno se selecciona independientemente unos de otros para cada determinante antigenico a partir de antigenos solubles y antigenos unidos a membrana. En un modo de realizacion, el antigeno se selecciona independientemente unos de otros para cada determinante antigenico a partir de ligandos de receptores y receptores de la superficie celular.

El procedimiento es un inmunoensayo. El inmunoensayo es un inmunoensayo de tipo sandwich.

En un modo de realizacion, se realiza la conjugacion de la proteina de union multiespecifica a su ligando uniendo quimicamente por medio de grupos de extremo N y/o £-amino (lisina), grupos £-amino de diferentes lisinas, grupos funcionales carboxi, sulfhidrilo, hidroxilo y/o fenolico de la cadena principal aminoacidica del anticuerpo y/o grupos alditol de la estructura glucidica del anticuerpo.

En un modo de realizacion, se inmoviliza el anticuerpo anti-idiotipo de captura por medio de una pareja de union especifica. En un modo de realizacion, se conjuga el anticuerpo anti-idiotipo de captura con biotina y la inmovilizacion se realiza por medio de estreptavidina o avidina inmovilizada.

En un modo de realizacion, se conjuga el anticuerpo anti-idiotipo de deteccion con el marcador detectable por medio de una pareja de union especifica. En un modo de realizacion, se conjuga el anticuerpo anti-idiotipo de deteccion con digoxigenina y el enlace al marcador detectable se realiza por medio de un anticuerpo contra digoxigenina.

En un modo de realizacion, el animal de experimentacion se selecciona del grupo que comprende los miembros de

las familias de titles y tamarinos, monos del Viejo Mundo, lemures raton y enanos, gibones y simios inferiores,

lemures verdaderos, asi como cruces de los mismos.

En un modo de realizacion, el anticuerpo terapeutico es un anticuerpo humano o uno humanizado. En un modo de realizacion, el anticuerpo humano o humanizado es un anticuerpo monoclonal. En un modo de realizacion, se detecta el anticuerpo terapeutico total, en otro se detecta el anticuerpo terapeutico activo y en un modo de realizacion se detecta el anticuerpo terapeutico unido a su antigeno.

En un modo de realizacion, se conjuga el anticuerpo anti-idiotipo con una microesfera paramagnetica.

En un modo de realizacion, se conjuga el anticuerpo anti-idiotipo con una fase solida.

Se pueden tener que evaluar diversos aspectos relacionados con la aplicacion de una proteina de union multiespecifica terapeutica en un animal de experimentacion durante los estudios preclinicos. En determinadas configuraciones, puede ser pertinente analizar la cantidad total de proteina de union multiespecifica terapeutica presente en una muestra, o puede ser importante analizar determinados fragmentos de una proteina de union multiespecifica terapeutica en una muestra, determinadas modificaciones de una proteina de union multiespecifica terapeutica en una muestra, la concentracion de proteina de union multiespecifica terapeutica en una muestra unida a su uno o mas ligandos en la muestra, o la fraccion de proteina de union multiespecifica terapeutica en una muestra que todavia se puede unir a uno o mas de sus ligandos. En un modo de realizacion, el procedimiento que se informa en el presente documento es para la deteccion de proteina de union multiespecifica terapeutica total, o proteina de union multiespecifica terapeutica activa, o proteina de union multiespecifica terapeutica que forma complejo con su ligando, respectivamente.

Se puede detectar directamente la proteina de union multiespecifica terapeutica total, activa o en forma de complejo con su ligando en un procedimiento como se informa en el presente documento.

Adicionalmente, tambien es posible evaluar indirectamente cualquier proteina de union multiespecifica terapeutica "inactiva". Dicha proteina de union multiespecifica terapeutica puede ser, por ejemplo, un anticuerpo biespecifico terapeutico unido a uno o ambos de sus antigenos, o un anticuerpo biespecifico terapeutico unido a un antigeno de reactividad cruzada o un anticuerpo biespecifico terapeutico bloqueado por un autoanticuerpo contra el anticuerpo biespecifico terapeutico. En el caso de que la cantidad de la proteina de union multiespecifica total sea mayor que la suma de proteina de union multiespecifica activa y proteina de union multiespecifica terapeutica que forma complejo con su ligando, habra una fraccion adicional de proteina de union multiespecifica que comprende la proteina de union multiespecifica inactiva no unida a su correspondiente ligando.

Estan disponibles diversos sistemas de ensayo para analizar, por ejemplo, una proteina de union multiespecifica terapeutica total, activa o en forma de complejo con su ligando.

Por ejemplo, se puede detectar la proteina de union multiespecifica total en un sistema denominado de inmunoensayo competitivo o en un sistema de ensayo denominado de tipo sandwich.

Se puede realizar dicho ensayo sin etapas de lavado (inmunoensayo homogeneo) o con etapas de lavado (inmunoensayo heterogeneo).

En el presente documento se detecta la cantidad de proteina de union multiespecifica terapeutica total en un

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inmunoensayo de tipo sandwich, en el que se usa un anticuerpo anti-idiotipo en ambos lados de dicho ensayo de tipo sandwich, con lo que los dos anticuerpos anti-idiotipo se unen especificamente a diferentes determinantes antigenicos de la proteina de union multiespecifica. El anticuerpo anti-idiotipo usado en un lado de dicho sandwich se une o se puede unir a una fase solida (a menudo se denomina anticuerpo anti-idiotipo de captura), mientras que el anticuerpo anti-idiotipo en el otro lado de dicho sandwich se marca de tal manera que se facilite la deteccion directa o indirecta (se denomina anticuerpo anti-idiotipo de deteccion). La cantidad de anticuerpo anti-idiotipo de deteccion unido en dicho procedimiento de ensayo de tipo sandwich se correlaciona directamente con la cantidad de proteina de union multiespecifica terapeutica en la muestra investigada.

En la tecnica (por ejemplo, el documento US 2003/0068664) se conocen sistemas de ensayo que permiten la deteccion de anticuerpos terapeuticos activos. Dichos sistemas requieren la union del antigeno a una fase solida, la union del anticuerpo terapeutico a este antigeno unido y la deteccion del anticuerpo terapeutico unido por medio del antigeno a la fase solida.

Se puede lograr la deteccion de la proteina de union multiespecifica activa en una muestra mediante procedimientos del estado de la tecnica convenientes. Sin embargo, la deteccion de la proteina de union multiespecifica terapeutica total o de la fraccion de proteina de union multiespecifica terapeutica que forma complejo con su ligando es bastante complicada y requiere configuraciones de ensayo muy diferentes y especialmente requiere reactivos preparados a medida para cada uno de los diferentes ensayos. Con el procedimiento que se informa en el presente documento es posible evaluar la fraccion de proteina de union multiespecifica terapeutica activa, proteina de union multiespecifica terapeutica total o proteina de union multiespecifica terapeutica que forma complejo con su ligando en sistemas de prueba que son analogos entre si. Por su propia naturaleza, esta clase de evaluacion comparativa de proteina de union multiespecifica terapeutica activa, total o en forma de complejo con su ligando debe tener ventajas una vez que se hacen comparaciones cuantitativas entre estas diversas fracciones de proteina de union multiespecifica terapeutica.

Se puede disponer un formato de ensayo de tipo sandwich para detectar la proteina de union multiespecifica terapeutica activa. En un modo de realizacion, se usa el anticuerpo anti-idiotipo que se une a un determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica terapeutica como anticuerpo anti-idiotipo de captura y la parte de deteccion de dicho ensayo de tipo sandwich hace uso de un antigeno, que se une especificamente mediante otro determinante antigenico respectivo de la proteina de union multiespecifica, en una forma marcada, o de forma alternativa, despues de la union de un antigeno, que se une especificamente mediante otro determinante antigenico respectivo de la proteina de union multiespecifica, hace uso de un segundo anticuerpo que no se une ni compite con el epitopo reconocido por la proteina de union multiespecifica terapeutica, en el que el segundo anticuerpo es especificamente detectable y/o esta marcado de tal manera que se facilite la deteccion directa o indirecta.

Se puede detectar la proteina de union multiespecifica terapeutica que forma complejo con su ligando en un formato de ensayo de tipo sandwich usando un anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica como un anticuerpo anti-idiotipo de captura. En la deteccion se usa un segundo anticuerpo que se une al ligando que se une especificamente mediante un determinante antigenico diferente de la proteina de union multiespecifica en un epitopo que no compite con el epitopo de la proteina de union multiespecifica terapeutica. En un modo de realizacion, dicho segundo anticuerpo se marca de tal manera que se facilite la deteccion directa o indirecta.

Para la deteccion directa, el grupo marcador se puede seleccionar de cualquier grupo marcador detectable conocido, tal como colorantes, grupos marcadores luminiscentes, tales como grupos quimioluminiscentes, por ejemplo, esteres de acridinio o dioxetanos, o colorantes fluorescentes, por ejemplo, fluoresceina, cumarina, rodamina, oxazina, resorufina, cianina y sus derivados. Otros ejemplos de grupos marcadores son complejos de metal luminiscentes, tales como complejos de rutenio o europio, enzimas, por ejemplo, las usadas para ELISA o para CEDIA (inmunoensayo donante de enzima clonada) y radioisotopos. En un modo de realizacion, los quelatos de metal que se pueden detectar mediante electroquimioluminiscencia tambien son grupos emisores de senales usados como marcadores detectables, dandose particular preferencia a quelatos de rutenio. En un modo de realizacion, el grupo marcador es un quelato de rutenio (bispiridilo)32+.

Los sistemas de deteccion indirecta comprenden, por ejemplo, que el reactivo de deteccion, por ejemplo, el anticuerpo anti-idiotipo de deteccion, se marque con un primer ligando de una pareja de union bioafin. Los ejemplos de parejas de union adecuadas son hapteno o antigeno/anticuerpo, biotina o analogos de biotina, tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina/avidina o estreptavidina, azucar/lectina, acido nucleico o analogo de acido nucleico/acido nucleico complementario, y receptor/ligando, por ejemplo, receptor de hormona esteroidea/hormona esteroidea. En un modo de realizacion, los primeros miembros de parejas de union comprenden hapteno, antigeno y hormona. En un modo de realizacion, el hapteno se selecciona del grupo que comprende digoxigenina, teofilina, carborano y biotina, asi como analogos de los mismos. El segundo ligando de dicha pareja de union, por ejemplo, un anticuerpo, estreptavidina, etc., se marca habitualmente para permitir la deteccion directa, por ejemplo, mediante los marcadores que se mencionan anteriormente.

Los inmunoensayos se conocen bien por el experto en la tecnica. Se resumen procedimientos para llevar a cabo

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dichos ensayos, asi como aplicaciones practicas y procedimientos en libros de texto relacionados. Los ejemplos de libros de texto relacionados son Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates in “Practice and theory of enzyme immunoassays” (1990) 221-278, eds. R. H. Burdon and v. P. H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam) y diversos volumenes de "Methods in Enzymology", eds. S. P. Colowick, N. O. Caplan and S. P., Academic Press), que tratan sobre procedimientos de deteccion inmunologica, especialmente los volumenes 70, 73, 74, 84, 92 y 121.

En todos los procedimientos de deteccion inmunologica anteriores se eligen condiciones para los reactivos que permitan la union de los reactivos empleados, por ejemplo, la union de un anticuerpo a su antigeno correspondiente. El experto en la tecnica se refiere al resultado de dicho acontecimiento de union usando el termino complejo. El complejo formado en un procedimiento de ensayo de acuerdo con la presente invencion se correlaciona por procedimientos del estado de la tecnica con la concentracion correspondiente de la proteina de union multiespecifica terapeutica en la muestra. Dependiendo del reactivo de deteccion empleado, esta etapa de correlacion dara como resultado la concentracion de proteina de union multiespecifica terapeutica total, activa o en forma de complejo con su ligando.

Debido al uso de uno y el mismo reactivo, el anticuerpo anti-idiotipo en los diferentes ensayos, los valores obtenidos se pueden comparar facilmente entre si e incluso evaluar las proporciones de los mismos. Se puede relacionar el procedimiento en el presente documento con la proporcion de proteina de union multiespecifica terapeutica activa con respecto a la total. Esta proporcion tambien puede servir como un indicador de la eficacia de una proteina de union multiespecifica terapeutica.

En el presente documento se informa de un aspecto de un procedimiento para la determinacion inmunologica de la cantidad de una proteina de union multiespecifica en una muestra que comprende la etapa de:

- determinar la cantidad de un complejo formado entre

i) un primer anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un primer determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica, y

ii) la proteina de union multiespecifica

incubar el complejo con un segundo anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un segundo determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica, que es diferente del primer determinante antigenico del anticuerpo multiespecifico, y

determinar asi la cantidad de la proteina de union multiespecifica en la muestra.

En un modo de realizacion, la determinacion de la cantidad de la proteina de union multiespecifica es mediante un inmunoensayo de doble captura. En un modo de realizacion, el inmunoensayo comprende un anticuerpo de captura y un anticuerpo de deteccion, en el que el anticuerpo de captura se conjuga con una fase solida y el anticuerpo de deteccion se conjuga con un marcador detectable. En un modo de realizacion, el anticuerpo de captura y el anticuerpo de deteccion son ambos anticuerpos anti-idiotipo que se unen a diferentes determinantes antigenicos de la proteina de union multiespecifica.

En un modo de realizacion, el anticuerpo de captura se conjuga con una fase solida.

En un modo de realizacion, el anticuerpo de deteccion comprende un marcador detectable.

El anticuerpo de captura anti-idiotipo util en un procedimiento que se informa en el presente documento se puede conjugar a una fase solida. En un modo de realizacion, la conjugacion se realiza mediante union quimica por medio de grupos N-terminales y/o £-amino (lisina), grupos £-amino de diferentes lisinas, grupos funcionales carboxi, sulfhidrilo, hidroxilo y/o fenolico de la cadena principal aminoacidica del anticuerpo y/o grupos alditol de la estructura glucidica del anticuerpo. En un modo de realizacion, el anticuerpo de captura anti-idiotipo es una mezcla de al menos dos anticuerpos conjugados con una fase solida, en el que los al menos dos anticuerpos conjugados con una fase solida difieren en el sitio en el que estan conjugados con la fase solida. Por ejemplo, la mezcla de al menos dos anticuerpos conjugados con una fase solida puede comprender un anticuerpo conjugado por medio de un aminoacido de la cadena principal aminoacidica del anticuerpo con la fase solida y un anticuerpo conjugado por medio de un grupo alditol de una estructura glucidica del anticuerpo con la fase solida. Tambien, por ejemplo, la mezcla de al menos dos anticuerpos conjugados con una fase solida puede comprender anticuerpos conjugados con la fase solida por medio de diferentes residuos aminoacidicos de su cadena principal aminoacidica. La expresion “residuo aminoacidico diferente” denota dos clases diferentes de aminoacidos, tales como, por ejemplo, lisina y acido aspartico, o tirosina y acido glutamico, o bien dos residuos aminoacidicos de la cadena principal aminoacidica que difieren en su posicion en la secuencia aminoacidica del anticuerpo. En este ultimo caso, el aminoacido puede ser de la misma clase o de diferente clase. La expresion “difieren en el sitio de anticuerpo” denota una diferencia en la clase de sitio, por ejemplo, grupo aminoacido o alditol, o bien en el numero del aminoacido de la cadena principal

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aminoacfdica, por ejemplo, en que se conjuga el anticuerpo conjugado con la fase solida. Lo mismo se aplica al contrario al anticuerpo de deteccion util en un procedimiento que se informa en el presente documento.

En un modo de realizacion del procedimiento, el inmunoensayo comprende un anticuerpo de captura, un anticuerpo trazador y un anticuerpo de deteccion, en el que el anticuerpo de captura es un anticuerpo anti-idiotipo biotinilado que se une especificamente a un primer determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica conjugado con una fase solida por medio de estreptavidina, el anticuerpo de deteccion es un anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un segundo determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica que es diferente del primer determinante antigenico conjugado con digoxigenina y el anticuerpo de deteccion es un anticuerpo contra digoxigenina conjugado con peroxidasa de rabano picante.

En un modo de realizacion, el procedimiento comprende las siguientes etapas:

- incubar una muestra que comprende una proteina de union multiespecifica con un primer anticuerpo anti- idiotipo que se une especificamente a un primer determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica, con lo que se forma un complejo entre el primer anticuerpo anti-idiotipo y la proteina de union multiespecifica,

- incubar el complejo entre el anticuerpo de captura anti-idiotipo y la proteina de union multiespecifica con un segundo anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un segundo determinante antigenico de la proteina de union multiespecifica que no sea identica, es decir, que sea diferente al determinante antigenico al que se une el primer anticuerpo anti-idiotipo, con lo que se forma un complejo entre el primer anticuerpo anti-idiotipo, la proteina de union multiespecifica y el segundo anticuerpo anti-idiotipo, y

- determinar la cantidad del complejo formado en la etapa previa.

En un modo de realizacion, la determinacion de la cantidad de la proteina de union multiespecifica es usando una curva de calibracion.

En un modo de realizacion, el segundo anticuerpo anti-idiotipo se conjuga con un marcador detectable.

En un modo de realizacion, la determinacion de la cantidad de la proteina de union multiespecifica es determinando la cantidad de marcador detectable inmovilizado.

En un modo de realizacion, la proteina de union multiespecifica es una proteina de union biespecifica. En un modo de realizacion, la proteina de union biespecifica es un anticuerpo biespecifico.

Se proporcionan los siguientes ejemplos y figura para ayudar a la comprension de la presente invencion, cuyo verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Procedimiento general para la determinacion de la cantidad de un anticuerpo biespecifico en una muestra

Se determinaron las concentraciones de la proteina de union multiespecifica/anticuerpo biespecifico con un enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA).

Para la cuantificacion de anticuerpos biespecificos en muestras de suero o plasma de raton y lisados oculares, se realizo un inmunoensayo de tipo sandwich en serie en fase solida con anticuerpos anti-idiotipo monoclonales biotinilados y digoxigenados contra los diferentes determinantes antigenicos del anticuerpo biespecifico como anticuerpos de captura y deteccion a fin de verificar la integridad de la bispecificidad del anticuerpo biespecifico. En esta configuracion, para un anticuerpo anti-VEGF/ANG2 biespecifico, el anticuerpo de captura anti-idiotipo biotinilado se une especificamente al sitio de union a VEGF, mientras que el anticuerpo de deteccion anti-idiotipo digoxigenado se une especificamente al sitio de union a ANG2. Se detecto el complejo inmunitario unido del anticuerpo de captura, anticuerpo biespecifico y anticuerpo de deteccion en la fase solida de la placa de microtitulacion recubierta con estreptavidina (SA-MTP) con una peroxidasa de rabano picante acoplada a un anticuerpo anti-digoxigenina. Despues de lavar el material no unido de la SA-MTP y adicion de sustrato ABTS, la senal conseguida fue proporcional a la cantidad de anticuerpo biespecifico unido en la fase solida de la SA-MTP. Se hizo la cuantificacion convirtiendo las senales medidas de las muestras en concentraciones referenciadas a los calibradores analizados en paralelo.

Configuracion para la deteccion de un anticuerpo anti-VEGF/ANG2 biespecifico

En una primera etapa, se recubre la SA-MTP con 100 pl/pocillo de la solucion de anticuerpo de captura anti-idiotipo biotinilado (anticuerpo anti-anticuerpoanti-VEGF M-2.45.51-Bi) con una concentracion de 1 pg/ml durante una hora a

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500 rpm en un agitador de MTP. Mientras tanto, se prepararon los calibradores, las muestras de CC y las muestras. Se diluyeron los calibradores y las muestras de CC hasta obtener una matriz de suero al 2 %. Se diluyeron las muestras hasta que las senales estuvieron en el intervalo lineal de los calibradores.

Despues de recubrir la SA-MTP con anticuerpo de captura anti-idiotipo, se lavo tres veces la placa con 300 pl/pocillo de tampon de lavado. Posteriormente se pipetearon 100 pl/pocillo de los calibradores, muestras de CC y muestras en la SA-MTP y se incubaron durante una hora a 500 rpm.

El anticuerpo anti-VEGF/ANG2 biespecifico estaba ahora unido a su sitio de union a VEGF por medio del anticuerpo de captura de anticuerpo anti-VEGF anti-idiotipo a la fase solida de la SA-MTP. Despues de la incubacion, se elimino el analito no unido lavando la placa. Posteriormente, se anadio 100 pl/pocillo del anticuerpo de deteccion anti-idiotipo (anticuerpo anti-anticuerpo anti-ANG2 M-2.6.81-Dig) con una concentracion de 250 ng/ml a los pocillos de la SA- MTP. Luego, se incubo la placa durante una hora a 500 rpm en un agitador. Despues del lavado, se anadio 100 pl/pocillo del segundo anticuerpo de deteccion (conjugado de anticuerpo policlonal anti-digoxigenina-Fab-POD) a una concentracion de 50 mU/ml a los pocillos de la SA-MTP y se incubo la placa durante una hora a 500 rpm. Despues de una etapa de lavado final para eliminar el exceso del segundo anticuerpo de deteccion, se anadio 100 pl/pocillo de sustrato (ABTS). El conjugado de anticuerpo-POD cataliza la reaccion de color del sustrato ABTS®. Entonces se midio la senal mediante un lector de ELISA a una longitud de onda de 405 nm (longitud de onda de referencia: 490 nm ([405/490] nm)).

Ejemplo 2

Uso de un ensayo de acuerdo con el ejemplo 1 para la caracterizacion farmacocinetica de un anticuerpo biespecifico en ratones con FcRn transgenicos para FcRn humano

Fase in vivo

El estudio incluyo ratones C57BL/6J hembra (fondo), que eran ratones deficientes en FcRn y transgenicos hemicigoticos para FcRn humano (huFcRn, linea 276 -/tg).

Parte 1

A todos los ratones se les inyecto una vez por via intravitrea en el ojo derecho 2 pl/animal de la solucion apropiada (es decir, 21 pg de compuesto/animal (anticuerpo anti-VEGF/ANG2 sin las mutaciones I253A, H310A y H435A (numeracion de acuerdo con el indice EU de Kabat), vease el documento EP 12176299.1 para detalles adicionales con respecto a los anticuerpos y secuencias aminoacidicas usadas) o 23,6 pg de compuesto/animal (anticuerpo anti- VEGF/ANG2 que comprende las mutaciones I253A, H310A y H435A (numeracion de acuerdo con el indice EU de Kabat).

Se asignaron los ratones a 2 grupos con 6 animales cada uno. Se tomaron muestras de sangre del grupo 1 a las 2, 24 y 96 horas y del grupo 2 a las 7, 48 y 168 horas despues de la aplicacion del anticuerpo biespecifico respectivo. Se realizo la inyeccion en el humor vitreo del ojo derecho del raton usando el sistema de microjeringuilla NanoFil para inyeccion de nanolitros de World Precision Instruments, Inc., Berlin (Alemania). Se anestesiaron los ratones con isoflurano al 2,5 % y para la visualizacion del ojo del raton se uso un microscopio Leica MZFL 3 con un aumento de 40 veces y un anillo de luz con una iluminacion Leica KL 2500 LCD. Posteriormente, se inyectaron 2 pl del compuesto usando una aguja de calibre 35.

Se extrajo sangre del plexo venoso retroocular del ojo contralateral de cada animal para la determinacion de los niveles de compuesto en suero.

Se obtuvieron muestras de suero de al menos 50 pl a partir de sangre despues de 1 hora a temperatura ambiente mediante centrifugacion (9.300 x g) a 4 °C durante 3 min. Se congelaron las muestras de suero directamente despues de la centrifugacion y se almacenaron congeladas a -80 0C hasta su analisis.

Los ojos tratados de los animales del grupo 1 se aislaron 96 horas despues del tratamiento y los ojos tratados de los animales del grupo 2 se aislaron 168 horas despues del tratamiento.

Las muestras se almacenan congeladas a -80 0C hasta su analisis.

Parte 2

A todos los ratones se les inyecto una vez por via intravenosa en la vena de la cola 200 pl/animal de la solucion apropiada (es decir, 21 pg de compuesto/animal (anticuerpo anti-VEGF/ANG2 sin las mutaciones I253A, H310A y H435A (numeracion de acuerdo con el indice EU de Kabat) o 23,6 pg de compuesto/animal (anticuerpo anti- VEGF/ANG2 que comprende las mutaciones I253A, H310A y H435A (numeracion de acuerdo con el indice EU de Kabat).

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Se asignaron los ratones a 2 grupos con 5 animales cada uno. Se tomaron muestras de sangre del grupo 1 a las 1, 24 y 96 horas y del grupo 2 a las 7, 48 y 168 horas despues de la aplicacion del anticuerpo biespecifico respectivo. Se extrajo sangre del plexo venoso retroocular de cada animal para la determinacion de los niveles de compuesto en suero.

Se obtuvieron muestras de suero de al menos 50 pl a partir de sangre despues de 1 hora a temperatura ambiente mediante centrifugacion (9.300 x g) a 4 °C durante 3 min. Se congelaron las muestras de suero directamente despues de la centrifugacion y se almacenaron congeladas a -80 0C hasta su analisis.

Preparacion de lisados oculares completos (ratones)

Se consiguieron los lisados oculares mediante disgregacion ffsico-qufmica de todo el ojo de animales de laboratorio. Para la disgregacion mecanica, se transfirio cada ojo a un microfrasco de 1,5 ml con fondo conico. Despues de la congelacion y la descongelacion, se lavaron una vez los ojos con 1 ml de tampon de lavado celular (Bio-Rad, Bio- Plex Cell Lysis Kit, n.° de cat. 171-304011). En la siguiente etapa, se anadio 500 pl de tampon de lisis celular recien preparado y se molieron los ojos usando una mano de mortero de molienda de tejido de 1,5 ml (Kimble Chase, mano de mortero de 1,5 ml, art. n.° 749521-1500). Entonces, la mezcla se congelo y descongelo cinco veces y se molio de nuevo. Para separar el lisado del tejido restante, se centrifugaron las muestras durante 4 min a 4500 g. Despues de la centrifugacion se recogio el sobrenadante y se almaceno a -20 °C hasta su analisis posterior en el ELISA de cuantificacion.

Analisis

Se realizo la determinacion de la cantidad de anticuerpo biespecifico en la muestra de acuerdo con el ejemplo 1. Evaluacion farmacocinetica

Se calcularon los parametros farmacocineticos mediante analisis no compartimental, usando el programa de evaluacion farmacocinetica WinNonlin™ (Pharsight), version 5.2.1.

Resultados

A) Concentraciones en suero

Los resultados para las concentraciones en suero se muestran en las tablas 1 a 2.

Tabla 1: Comparacion de las concentraciones en suero despues de la aplicacion intravitrea e intravenosa de anticuerpos anti-VEGF/ANG2 sin las mutaciones I253A, H310A y H435A.

concentracion en suero despues de la aplicacion intravitrea concentracion en suero despues de la aplicacion intravenosa

ID

concentracion media [pg/ml] concentracion media [pg/ml]

1 h

17,7

2 h

9,8

7 h

10,4 12,1

24 h

6,4 8,3

48 h

6,5 6,9

96 h

3,4 4,1

168 h

2,9 2,7

Tabla 2: Comparacion de las concentraciones en suero despues de la aplicacion intravitrea e intravenosa de anticuerpo anti-VEGF/ANG2 con las mutaciones I253A, H310A y H435A.

concentracion en suero despues de la aplicacion intravitrea concentracion en suero despues de la aplicacion intravenosa

ID

concentracion media concentracion media

[pg/ml] [pg/ml]

1 h

18,4

2 h

7,0

5

10

15

20

25

30

7 h

8,7 10,0

24 h

2,2 3,3

48 h

1,0 1,0

96 h

0,1 0,1

168 h

0,0 0,0

B) Concentraciones en los lisados oculares de los ojos izquierdo y derecho

Los resultados para las concentraciones en lisadosoculares se muestran en las tablas 3 a 4.

Tabla 3a: Concentraciones de anticuerpo anti-VEGF/ANG2 sin las mutaciones I253A, H310A y H435A en lisados oculares despues de la aplicacion intravitrea en el ojo derecho.

valores de concentracion media de n = 6 ratones

ID

concentracion media [ng/ml]

96 h

ojo izquierdo 8,7

ojo derecho

46,1

168 h

ojo izquierdo 4,3

ojo derecho

12,9

Tabla 3b: Concentraciones de anticuerpo anti-VEGF/ANG2 sin las mutaciones I253A, H310A y H435A en lisados oculares despues de la aplicacion intravenosa.

valores de concentracion media de n = 5 ratones

ID

concentracion media [ng/ml]

96 h

ojo izquierdo 4,2

ojo derecho

7,5

168 h

ojo izquierdo 3,4

ojo derecho

6,1

Tabla 4a: Concentraciones de anticuerpo anti-VEGF/ANG2 con las mutaciones I253A, H310A y H435A en lisados oculares despues de la aplicacion intravitrea en el ojo derecho.

valores de concentracion media de n = 5 ratones

ID

concentracion media [ng/ml]

96 h

ojo izquierdo 0,3

ojo derecho

34,5

168 h

ojo izquierdo 0,1

ojo derecho

9,0

Tabla 4b: Concentraciones de anticuerpo anti-VEGF/ANG2 con las mutaciones I253A, H310A y H435A en lisados oculares despues de la aplicacion intravenosa.

valores de concentracion media de n = 5 ratones

ID

concentracion media [ng/ml]

96 h

ojo izquierdo 0,0

ojo derecho

0,1

168 h

ojo izquierdo 0,0

ojo derecho

0,1

Ejemplo 3

Ensayo para la caracterizacion farmacocinetica de anticuerpos biespecificos

Se analizaron el mismo conjunto de muestras que comprendian un anticuerpo anti-VEGF/ANG2 en plasma humano/EDTA al 10 % con un ELISA basado en antigenos (A) y un ELISA basado en anticuerpos anti-idiotipo (B).

ELISA basado en antigenos para la deteccion de anticuerpo anti-VEGF/ANG2:

Se recubrio directamente angiopoyetina 2 humana recombinante (ANG2) a una placa de microtitulacion Maxisorb durante una hora, en la primera etapa. En paralelo, se preincubo el VEGF humano recombinante marcado con

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10

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20

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35

40

digoxigenina con las muestras que contenian cantidades no conocidas de anticuerpo anti-VEGF/ANG2 o patrones de referencia, respectivamente. Se diluyeron por un factor de 10 las muestras antes de la preincubacion con VEGF marcado con digoxigenina. Despues del recubrimiento y lavado de la placa de microtitulacion, se pipeteo la solucion preincubada de anticuerpo anti-VEGF/ANG2 y VEGF marcado con digoxigenina en la placa de microtitulacion y se incubo durante otra hora. Se unieron los anticuerpos anti-VEGF/ANG2 unidos a VEGF marcado con digoxigenina a partir de la solucion de preincubacion a ANG2 inmovilizada. Despues de otra etapa de lavado, se anadio un anticuerpo anti-digoxigenina marcado con HRP (marcado con peroxidasa de rabano picante) a la placa y se incubo durante otra hora. Posteriormente, la placa se lavo y se anadio solucion de sustrato ABTS para activar una reaccion de color (vease la figura 2).

ELISA basado en anticuerpos anti-idiotipo para la deteccion de anticuerpo anti-VEGF/ANG2:

En una primera etapa, se recubrio la SA-MTP (placa de microtitulacion recubierta con estreptavidina) con una solucion de anticuerpo de captura anti-idiotipo biotinilado (anticuerpo anti-anticuerpo anti-VEGF (M-2.45.51-BI)). Mientras tanto, se prepararon los calibradores, las muestras de control (muestras de CC) y las muestras. Se diluyeron los calibradores y las muestras de CC hasta obtener una matriz de plasma de macaco cangrejero al 10 %. Se diluyeron las muestras hasta que las senales estuvieron en el intervalo lineal de los calibradores.

Despues de recubrir la SA-MTP con anticuerpo de captura anti-idiotipo, se lavo tres veces la placa. Posteriormente se pipetearon las muestras de CC y muestras en la SA-MTP y se incubaron durante una hora a 500 rpm.

El anticuerpo biespecifico anti-VEGF/ANG2 se unio por medio de su sitio de union a VEGF al anticuerpo de captura del anticuerpo anti-VEGF anti-idiotipo a la fase solida de la SA-MTP. Despues de la incubacion, se elimino el analito no unido lavando la placa. Posteriormente, se anadio el anticuerpo de deteccion anti-idiotipo (anticuerpo anti- anticuerpo anti-ANG2 (M-2.6.81-DIG), 0,5 pg/ml) a los pocillos de la SA-MTP. Luego, se incubo la placa durante una hora a 500 rpm en un agitador. Despues del lavado, se anadio el segundo anticuerpo de deteccion (conjugado de anticuerpo policlonal anti-digoxigenina-Fab-POD (POD=peroxidasa)) a los pocillos de la SA-MTP y se incubo la placa durante una hora a 500 rpm. Despues de una etapa de lavado final para eliminar el exceso del segundo anticuerpo de deteccion, se anadio sustrato (ABTS). El conjugado de anticuerpo-POD cataliza la reaccion de color del sustrato ABTS®. Entonces se midio la senal mediante un lector de ELISA a una longitud de onda de 405 nm (longitud de onda de referencia: 490 nm ([405/490] nm)). Se midieron las senales de DO de los patrones de calibracion desde 0,1-30 ng/ml en plasma humano al 10 % a 405 nm.

Tabla 5: Comparacion del ensayo (A) y el ensayo (B) para la deteccion del anticuerpo anti-VEGF/ANG2.

(ng/ml)

ensayo basado en antigenos ensayo basado en anticuerpos anti-idiotipo

30

0,963 2,282

15

0,296 1,982

7,5

0,117 1,493

3,75

0,077 0,930

1,88

0,037 0,506

0,94

0,036 0,292

0,47

0,032 0,169

0,23

0,031 0,098

0,12

0,030 0,065

0,06

0,030 0,047

0,03

0,030 0,037

0,01

0,030 0,032

0

0,030 0,033

Las curvas de calibracion obtenidas con los diferentes ensayos (A) y (B) se muestran en la figura 3.

A partir de la figura 4 se puede observar que el ensayo basado en anticuerpos anti-idiotipo proporciona resultados comparables en presencia de suero humano al 5 %, 10 % y 20 %, mientras que el ensayo basado en antigenos muestra grandes desviaciones.

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para la determinacion de la cantidad total de un anticuerpo multiespecifico terapeutico en 5 una muestra de suero o plasma en un inmunoensayo de tipo sandwich que comprende la etapa de:

   - determinar la cantidad de un complejo formado entre i) un anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un primer determinante antigenico del anticuerpo multiespecifico terapeutico, y ii) el anticuerpo multiespecifico terapeutico incubando el complejo con un anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un segundo 10 determinante antigenico del anticuerpo multiespecifico terapeutico, que es diferente del primer determinante antigenico y determinar asi la cantidad del anticuerpo multiespecifico terapeutico en la muestra,

   en el que se conjuga el anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un primer determinante antigenico del anticuerpo multiespecifico terapeutico con una fase solida,

   15

   en el que se marca el anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un segundo determinante antigenico del anticuerpo multiespecifico terapeutico, y

   en el que la cantidad del anticuerpo anti-idiotipo que se une especificamente a un segundo determinante antigenico 20 del anticuerpo multiespecifico terapeutico unido se correlaciona directamente con la cantidad de anticuerpo multiespecifico terapeutico en la muestra.
2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion precedente, caracterizado por que el anticuerpo multiespecifico terapeutico es un anticuerpo biespecifico.