ES2654906T3 - Método para determinar la cantidad total y/o la concentración de un analito en presencia de una molécula ligante, así como kits, composiciones y usos relacionados con el mismo - Google Patents

Abstract

Método in vitro para determinar la cantidad total y/o la concentración de un analito en presencia de una molécula de unión capaz de unirse mediante su sitio de unión al analito, comprendiendo el método las etapas de: (i) poner en contacto una muestra que comprende el analito y la molécula de unión con: - una molécula atrapadora dirigida contra el sitio de unión de la molécula de unión y - una molécula de detección capaz de formar un complejo con el analito y (ii) detectar el complejo de molécula de detección-analito, determinando de esta manera la cantidad total y/o la concentración del analito, en el que la molécula de detección es diferente de la molécula de unión y en el que el analito es diferente de la molécula atrapadora y en el que la molécula de detección sólo es capaz de formar un complejo con el analito en el caso de que el analito no se una a la molécula de unión, y en el que la molécula atrapadora es un anticuerpo o parte funcionalmente activa de un anticuerpo o un receptor o fragmento de receptor.

Description

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utilizando el sistema Biacore®, habitualmente se controlan con un exceso molar de 3 a 5 veces del competidor respectivo respecto a la diana. El anticuerpo anti-id no debería aplicarse a una concentración inferior de [anticuerpo terapéuticamente activo] * 3 = [antic. anti-id]. En el caso del bloqueo de la herceptina sérica con un anticuerpo anti-id, la concentración del antic. Anti-id debería ser de 5 * 2,6 µM=13 µM (2 mg/ml) de antic. anti-id, que es factible y satisface los requisitos de tiempo hasta el equilibrio.

Ejemplo 2: Aplicaciones que también resultan útiles para moléculas de unión de afinidad extremadamente elevada

Un algoritmo robusto para la concentración de aplicación de las moléculas atrapadoras podría complementarse con el cociente de afinidades:

Ejemplo A

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Ejemplo B, adición de la concentración de la molécula de unión sérica

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Antic. anti-id

Un factor de exceso molar de 3 veces del antic. anti-id frente a la molécula de unión resulta suficiente porque la concentración de antic. anti-id se incrementa por la multiplicación por el cociente de afinidad. Ejemplo C

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El Ejemplo C resulta factible; sin embargo, no presenta una buena relación coste/eficacia. Resulta preferente una molécula atrapadora de afinidad más elevada.

Otro aspecto muy importante son las valencias de unión de las moléculas de unión, en particular los anticuerpos. En la unión a analitos pequeños, una molécula de unión que es un anticuerpo típicamente muestra una valencia de unión de MR=2, mientras que por motivos estéricos, la molécula atrapadora que es un anticuerpo antiidiotipo mayoritariamente muestra una valencia de unión de MR=1 e inferior. En este caso, el cociente de molaridades funcionales preferentemente debe ser considerado en el cálculo.

Ejemplo D

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Se requieren 22 mg/ml de molécula atrapadora que es anticuerpo anti-id.

El Ejemplo D representa una realización preferente según la invención.

Ejemplo 3A: Generación de anticuerpos monoclonales

Para la generación de anticuerpos contra TWEAK, se inmunizaron ratones Balb/C, NMRI y SJL con proteína TWEAK derivada de E. coli recombinantes. Todos los ratones se sometieron a 3 inmunizaciones en los puntos temporales de 0, 6 y 10 semanas después del inicio de la campaña de inmunización. En cada punto temporal cada ratón fue inmunizado con 100 µg de inmunógeno disueltos en 100 µl de PBS. Para la primera inmunización, el inmunógeno se mezcló con 100 µl de CFA. Para la segunda y tercera inmunizaciones, el inmunógeno se mezcló con 100 µl de IFA. La primera y tercera inmunizaciones se realizaron por vía intraperitoneal y la segunda inmunización, por vía

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Ejemplo 3B: Generación de anticuerpos monoclonales antiidiotípicos

a) Inmunización de ratones

Se inmunizaron ratones NMRI principalmente por vía intraperitoneal con 100 µg de F(ab’)2 del anticuerpo monoclonal humanizado anti-TWEAK formulado con CFA (por sus siglas en inglés, adyuvante completo de Freund). Se llevaron a cabo dos etapas adicionales de inmunización intraperitoneal seguidas, tras 6 y 10 semanas, de la aplicación de 100 µg del F(ab’)2 anteriormente indicado por ratón mezclado con IFA (por sus siglas en inglés, adyuvante incompleto de Freund). A continuación, los ratones recibieron un refuerzo mediante la administración i.v. de 25 µg de F(ab’)2 (en PBS) 3 días antes de sacrificar los animales y se aislaron las células de bazo y se utilizaron para la fusión.

b) Fusión y clonación

La fusión de las células de bazo con las células de mieloma se llevó a cabo mediante procedimientos estándares utilizando polietilenglicol. Brevemente, se mezclaron 1x108 esplenocitos con aprox. 2X107 células de mieloma P3x63Ag8.653, ATCC nº CRL1580) en RPMI-1640 y se centrifugaron (10 min a 510 x g y 4°C). Las células se lavaron una vez con RPMI-1640 y se centrifugaron nuevamente. Después, se añadió 1 ml de PEG (polietilenglicol, peso molecular:

4.000 g/mol); la mezcla se llevó a cabo mediante el pipeteado. Tras 1 min en un baño de agua a 37ºC, se añadieron 5 ml de RPMI-1640 gota a gota, se mezcló la suspensión, se enrasó a 30 ml con RPMI-1640 y se centrifugó. Las células se resuspendieron en medio de selección (RPMI-1640 complementado con FCS al 10%, 100 U/ml de IL-6, Lglutamina 2 mM, NEAA 100 µM, piruvato sódico 1 mM, 2-mercaptoetanol 24 µM, hipoxantina 100 µM y 1 µg/ml de azaserina) y posteriormente se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Tras aproximadamente 10 días, los cultivos primarios se sometieron a ensayo para la producción de anticuerpos específicos (tal como se indica posteriormente).

Se clonaron cultivos primarios que mostraban unión al F(ab’)2 humanizado anteriormente indicado y ninguna reactividad cruzada con IgG humana normal se clonaron mediante separación de células individuales utilizando un citómetro de flujo (FACSAria, BD Biosciences). Se cultivaron clones celulares en RPMI-1640 complementado con FCS al 10%, 50 U/ml de IL-6, L-glutamina 2 mM, NEAA 100 µM, piruvato sódico 1 mM y 2-mercaptoetanol 24 µM. Las líneas celulares de hibridoma monoclonales establecidas se sometieron a ensayo nuevamente para especificidad tal como se indica posteriormente.

Para la conservación, las líneas celulares de hibridoma se congelaron en medio de congelación (92,5% de FCS, 7,5% de DMSO) a -80ºC utilizando un recipiente congelador (tasa de congelación: -1ºC/minuto) (Mr. Frosty, Nalgene) y posteriormente se almacenó en nitrógeno líquido.

Ejemplo 4: Ensayos de cribado para la detección de anticuerpos antiidiotípicos

a) Cribado primario para anticuerpos de unión preferente a anticuerpo monoclonal (mAb) anti-TWEAK humanizado

Para la determinación de la especificidad de los anticuerpos en los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma, se recubrieron MTP (placas de microtitulación) prerrecubiertas con estreptavidina recombinante (MicroCoat, Bernried, Alemania), con 100 µl/pocillo del fragmento F(ab’)2 biotinilado del mAb anti-TWEAK humanizado (250 ng/ml) o IgG humana policlonal biotinilada (2 µg/ml). Los anticuerpos se diluyeron en PBS/BSA II al 1,0% (Roche). Para el recubrimiento eficiente, las placas se incubaron durante 1 h a TA con la solución de anticuerpo respectiva. A continuación, las placas se lavaron con NaCl al 0,9%/Tween-20® al 0,05%. En la etapa siguiente, se añadieron 100 µl/pocillo de la solución de anticuerpo que debía someterse a ensayo (sobrenadantes de cultivo) y se incubaron durante 1 h a TA. Tras el lavado con NaCl al 0,9%/Tween-20® al 0,05%, se añadieron 100 µl/pocillo de un fragmento F(ab’)2 marcado con peroxidasa de rábano picante de un anticuerpo policlonal de oveja anti-Fcγ de ratón (100 ng/ml) para la detección de anticuerpo de muestra unido. Tras la incubación durante 1 h a TA, las placas se lavaron tal como se ha indicado anteriormente. Finalmente, se añadieron 100 µl/pocillo de ABTS® (Roche). Tras 30 min de incubación a TA, se midió la extinción (DO) a 405 nm y a 492 nm [405/492].

Este cribado condujo a la selección de anticuerpos de unión a anticuerpos monoclonales anti-TWEAK humanizados, así como que sólo mostraban una reactividad cruzada baja o nula con IgG humana. Dicha selección de anticuerpos se sometió además al ensayo b).

b) Selección de anticuerpos con la reactividad cruzada más baja con IgG humana

Con el fin de identificar de entre los candidatos del cribado b) aquellos que mostraban la reactividad cruzada más baja con IgG humana, se llevó a cabo el ensayo siguiente. Las MTP prerrecubiertas con estreptavidina recombinante (MicroCoat) se recubrieron con 100 µl/pocillo del fragmento F(ab’)2 biotinilado del mAb anti-TWEAK humanizado (250

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Claims (1)

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