ES2595981T3 - Anticuerpo antiidiotipo contra un anticuerpo contra el péptido beta amiloide - Google Patents

Abstract

Uso de un anticuerpo que se une a una región determinante de complementariedad de un anticuerpo contra el péptido ß amiloide y que se une al mismo epítopo o a un epítopo solapante igual que el anticuerpo que se obtiene a partir de la línea celular DSM ACC2939 para la determinación inmunológica de un anticuerpo contra el péptido ß amiloide en una muestra usando un inmunoensayo, en el que el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo contra el péptido ß amiloide comprende una CDR3 con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1, 2 o 3 y el dominio variable de cadena ligera de dicho anticuerpo contra el péptido ß amiloide comprende una CDR3 con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 4, 5 o 6.

Description

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Se inmunizó de forma primaria a ratones hembra Balb/c o NMRI, respectivamente, de 8-12 semanas de vida, por vía intraperitoneal con 100 µg del fragmento F(ab’)2 del anticuerpo monoclonal anti-Aβ que comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado de entre las SEQ ID NO: 7 y 9 y un dominio variable de cadena ligera seleccionado de entre las SEQ ID NO: 10 a 12 mezclado con ACF (adyuvante completo de Freund) obtenido como se señala en el ejemplo 1. Siguieron tres etapas de inmunización intraperitoneal adicionales después de 4, 7 y 10 semanas, con aplicación de 100 µg del fragmento F(ab’)2 mencionado anteriormente por ratón, mezclado con AIF (adyuvante incompleto de Freund). Posteriormente, se efectuaron inmunizaciones de refuerzo por vía intravenosa o intraperitoneal, respectivamente, cada una con 25 a 100 µg de fragmento F(ab’)2 en PBS (siglas en inglés de solución salina tamponada con fosfato) tres días antes de la fusión.

b) Fusión y clonación

La fusión con células de mieloma procedentes de las células del bazo de los ratones inmunizados de acuerdo con a) se realizó de acuerdo con Galfré, G., y Milstein, C. (Galfré, G., y Milstein, C., Methods Enzymol. 73 (1981) 3-46). Se mezclaron aproximadamente 1 x 108 esplenocitos con 2 x 107 células de mieloma (P3x63-Ag8.653, ATCC CRL1580) y se centrifugaron (10 min a 300 x g a 4 °C). Las células se lavaron después una vez con el medio de cultivo RPMI 1640 sin SBF (suero bovino fetal) y se centrifugó de nuevo a 400 x g en un vial de fondo en "V" de 0 ml. A partir de ahí, se añadió 1 ml de PEG (poli (etilenglicol), peso molecular de 4.000 g/mol). La mezcla se efectuó mediante el pipeteo. Después de 1 min en un baño de agua a 37 ºC, se añadieron gota a gota 5 ml de RPMI 1640 sin SBF. La suspensión se mezcló, se rellenó hasta 50 ml con RPMI 1640 que contenía SBF al 10 % (v/v) y después se centrifugó. Las células sedimentadas se resuspendieron en RPMI 1640 con SBF al 10 % y se sembraron en medio de selección de hipoxantina-azaserina (100 mmol/l de hipoxantina, 1 µg/ml de azaserina en RPMI 1640 con SBF al 10 %) que contenía el factor de crecimiento interleucina 6 (IL-6, 100 U/ml). Después de 10 días aproximadamente, se ensayó la síntesis de anticuerpo específico de los cultivos primarios (véase el ejemplo 3). Los cultivos primarios que presentaron unión al fragmento F(ab’)2 mencionado anteriormente, así como ninguna reacción cruzada con IgG humana y que se demostró que eran antiidiotípicos se individualizaron mediante deposición de célula individual en placas de cultivo de 96 pocillos usando un citómetro de flujo (FACSAria, BD Biosciences), con el medio que contenía el factor de crecimiento interleucina 6 (100 U/ml). Siguiendo este protocolo, se generó el clon 1.5.74 depositado (tabla 1). La línea celular útil en la presente invención se depositó con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemania.

Tabla 1: Clon que produce anticuerpo monoclonal antiidiotipo

Clon

Clase y subclase de IgG N.º de depósito Fecha de depósito

1.5.74

IgGX, kappa DSM ACC2939 29.07.2008

c) Producción de inmunoglobulina a partir del sobrenadante del cultivo celular

La línea celular de hibridoma generada se inoculó a una densidad celular inicial de 1,0 x 105 células por ml en medio RPMI 1640 complementado con SBF al 10 % y se expandió en un cultivo en agitación. A partir de ahí, inoculó una unidad Miniperm con las células a una densidad celular inicial (células vivas) de 2,4 x 106 células por ml en medio RPMI 1640 complementado con SBF al 10 % y se expandió. En el sobrenadante del cultivo recogido, se alcanzó una concentración de 1,2 mg de anticuerpo monoclonal por ml. La purificación del anticuerpo a partir del sobrenadante del cultivo se efectuó de acuerdo con métodos químicos de proteínas normalizados, p. ej., de acuerdo con Bruck, C., et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 587-596.

Ejemplo 3

Ensayos de exploración para la detección de anticuerpos antiidiotípicos

a) Exploración primaria para anticuerpos que se unen al anticuerpo farmacológico

Para la determinación de la especificidad de los anticuerpos en los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma, se recubrieron placas de microtitulación (PMT) previamente recubiertas con estreptavidina recombinante (MicroCoat, Bernried, Alemania) con anticuerpo monoclonal anti-Aβ biotinilado, 200 ng/ml, o IgG humana biotinilada, 2 µg/ml, respectivamente, en PBS complementado con fracción II de SBF al 1,0 % (p/v) (100 µl por pocillo, 60 min de incubación a temperatura ambiente, con agitación). Posteriormente los pocillos se lavaron tres veces con solución de cloruro sódico al 0,9 % (p/v) que contenía Tween® 20 al 0,05 % (p/v). En la etapa siguiente, se añadieron 100 µl de la solución de anticuerpo para ensayar (sobrenadante de cultivo) y se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente, con agitación. Después de tres etapas de lavado con NaCl al 0,9 % (p/v) / Tween® 20 al 0,05 %, se añadieron 100 µl de fragmento F(ab’)2 de un anticuerpo policlonal de oveja anti Fcγ de ratón marcado con peroxidasa de rábano picante y se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente, con agitación. Posteriormente, se realizó el lavado como anteriormente. Por último, se añadieron 100 µl por pocillo de ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, Alemania, n.º de catálogo 1684302). Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente, se midió la extinción (densidad óptica, DO) a 405 y 492 nm [405/492] en un lector comercial de placas de microtitulación de ELISA. Esta exploración condujo

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