BRPI0923544B1 - Uso de um anticorpo anti-idiótipo da linhagem celular dsm acc2939 e método para a determinação imunológica de um anticorpo contra o peptídeo beta amiloide em uma amostra - Google Patents
Uso de um anticorpo anti-idiótipo da linhagem celular dsm acc2939 e método para a determinação imunológica de um anticorpo contra o peptídeo beta amiloide em uma amostra Download PDFInfo
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Abstract
anticorpo anti-idiótipo ligando-se a um anticorpo anti-abeta, seus métodos de determinação imunológica e seu uso. a presente invenção refere-se a um anticorpo anti-idiótipo ligando-se a uma região de determinação da complementaridade de um anticorpo contra o peptídeo (beta) amiloide. em uma modalidade, o dito anticorpo liga-se ao mesmo apitopo ou uma sobreposição do epítopo como o anticorpo ao mesmo epítopo ou uma sobreposição do epítopo como o anticorpo obtido a partir da linhagem celular dsm acc2939. também é relatado um imunoensaio para a determinação de um anticorpo contra o peptídeo (beta) amiloide e para a determinação de um anticorpo anti-idiótipo ligando a um anticorpo contra o peptídeo (beta) amiloide.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a um anticorpo anti-idiótipo ligando-se a um anticorpo anti-Aβ e um ensaio para a detecção de anticorpos de ligação para o mesmo ou um epítopo sobreposto em um anticorpo anti-Aβ.
[0002] Cerca de 70% dos casos de demência são devidos à doen ça de Alzheimer, que é associada ao dano seletivo das regiões cerebrais e circuitos neurais importantes para a cognição. A doença de Alzheimer é caracterizada por meio de emaranhados neurofibrilares, em especial nos neurônios piramidais do hipocampo e várias placas ami- loides contendo principalmente um núcleo denso de depósitos de ami- loide e halos neutralizados.
[0003] As placas neuríticas extracelulares contêm grandes quanti dades de um peptídeo predominantemente fibrilar denominado "β ami- loide", "A-beta", "Aβ4", "β-A4" ou "Aβ" (vide, por exemplo, Selkoe, DJ, Ann Rev. Cell Biol 10 (1994) 373 a 403; Koo, E.H., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 96 (1999) 9989 a 9990; Patente U.S. 4.666.829; ou Glenner, G.G., Biochem. Biophysics. Res. Commun. 122 (1984) 1131 a 1135). Este peptídeo β amiloide é derivado de "proteína precursora de Alzheimer/proteína precursora β-amiloide (APP). APPs são glicoprote- ínas integrais de membrana (vide, por exemplo Sisodia, S.S., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 89 (1992) 6075 a 6079) e são endoproteolitica- mente clivadas dentro da sequência Aβ por uma protease de membrana plasmática, α-secretase (vide, por exemplo Sisodia (1992), loc. cit.). Além disso, a atividade de secretase adicional, em particular ati- vidade β-secretase e atividade y-secretase, leva à liberação extracelu- lar de β-amiloide (Aβ) compreendendo tanto 39 aminoácidos (Aβ 39), 40 aminoácidos (Aβ40), 42 aminoácidos (Aβ 42) quanto 43 aminoácidos (Aβ43) (vide, por exemplo Sinha, S., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 96 (1999) 11049 a 11053; Price, D.L., Science 282 (1998) 1079 a 1083; WO 00/72880, ou Hardy, J., Trends in Neuroscience (1997) 154 a 159).
[0004] É de notar que Aβ possui várias formas de ocorrência natu ral, em que as formas humanas são referidas como Aβ 39, Aβ40, Aβ 41, Aβ42 e Aβ43 mencionados acima. A forma mais proeminente, Aβ 42, possui a sequência de aminoácidos (a partir do terminal N): DAE- FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 13). Em Aβ41, Aβ40, Aβ39, o terminal C A, IA e VIA, respectivamente, estão faltando. Na forma Aβ43, um resíduo de treonina adicional é composto no terminal C da sequência descrita acima.
[0005] Imunoensaios-padrão em fase sólida com anticorpos envol vem a formação de um complexo entre um anticorpo adsorvi- do/imobilizado em fase sólida (anticorpo de captura), o antígeno e um anticorpo para outro epítopo do antígeno conjugado a uma enzima ou o marcador detectável (anticorpo marcador). No ensaio, um sanduíche é formado: fase sólida/anticorpo de captura/antígeno/anticorpo marcador. Na reação catalisada pela sanduíche, entre outras coisas, a atividade da enzima conjugada ao anticorpo é proporcional à concentração do antígeno no meio de incubação. O método do sanduíche padrão também é chamado de imunoensaio de ponte dupla de antígeno devido à ligação à captura e marcador de anticorpos que se ligam a diferentes epítopos do mesmo antígeno. Hoesel, W., et al. (J. Immunol. Methods 294 (2004) 101 a 110) relatam um ensaio de ponte dupla de antígeno anti-EPO em que foi utilizada uma mistura de rhEPO acoplada aos grupos de aminoácidos e grupos de carboidratos. Os imunoen- saios, tais como a ponte dupla de antígeno ELISA, são os tipos de ensaio comuns na investigação de uma resposta imunogênica de um paciente a um anticorpo do fármaco. Mire-Sluis, A.R., et al. (J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16) resumem as recomendações para o projeto e otimização de imunoensaios que utilizam a detecção de anticorpos hospedeiros contra os produtos da biotecnologia. Os ensaios de anticorpos antifármacos são mencionados, por exemplo, em WO 2005/045058 e WO 90/006515. Os ensaios de anticorpos anti- idiotípicos são mencionados, por exemplo, na Patente U.S. 5.219.730; WO 87/002778; EP 0 139 389 e EP 0 170 302. Wadhwa, M., et al. (J. Immunol. Methods 278 (2003) 1 a 17) relatam estratégias para a de tecção, medição e caracterização de anticorpos induzidos por meio de agentes biológicos terapêutico indesejáveis. Em U.S. 2007/0093415, os peptídeos de amiloide específicos e suas respectivas utilizações são relatadas.Um método para a produção de anticorpos anti- idiotípicos é relatado em EP 1 917 854.
[0006] O primeiro aspecto da presente invenção é um anticorpo anti-idiótipo ligando-se a um anticorpo contra o peptídeo β amiloide, bem como seu uso em um ensaio de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o dito anticorpo é caracterizado na ligação para o mesmo ou um epítopo de sobreposição, como o anticorpo que é obtido a partir da linhagem celular ACC2939 DSM depositada. Outra modalidade é que o dito anticorpo é o anticorpo que é obtido a partir da linhagem celular ACC2939 DSM depositada.
[0007] Outros aspectos da presente invenção são os métodos pa ra a determinação imunológica de um anticorpo contra o peptídeo β amiloide em uma amostra utilizando um imunoensaio e para a determinação imunológica de um anticorpo anti-idiótipo contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide em uma amostra utilizando um imunoen- saio.
[0008] Em uma modalidade do método para a determinação imu- nológica de um anticorpo contra o peptídeo β amiloide em uma amostra de imunoensaio compreende um anticorpo de captura, um anticorpo marcador e um anticorpo de detecção, em que o anticorpo de captura é um anticorpo anti-idiótipo biotinilado contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide conjugado a uma fase sólida através de estrep- tavidina, o anticorpo marcador é um anticorpo anti-idiótipo contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide conjugado a digoxigenina como marcador detectável, e o anticorpo de detecção é um anticorpo contra digoxigenina conjugado à peroxidase de rábano silvestre.
[0009] Em uma modalidade adicional do método para determina ção imunológica de um anticorpo contra o peptídeo β amiloide em uma amostra de imunoensaio compreende o peptídeo β amiloide conjugado a uma fase sólida, um anticorpo anti-idiótipo contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide conjugado à digoxigenina como marcador detectável, e de um anticorpo de detecção contra digoxigenina conjugado à peroxidase de rábano silvestre.
[00010] Em uma modalidade, o anticorpo anti-idiótipo contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide liga-se ao mesmo ou a um epítopo de sobreposição como o anticorpo obtido a partir da linhagem celular ACC2939 DSM depositada. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-idiótipo contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide é o anticorpo obtido a partir da linhagem celular ACC2939 DSM depositada.
[00011] Em uma modalidade do método para a determinação imu- nológica de um anticorpo anti-idiótipo contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide em uma amostra de imunoensaio compreende um anticorpo de captura e um anticorpo marcador, em que o anticorpo de captura é um anticorpo contra o peptídeo β amiloide conjugado a uma primeira parte de um par de ligação e o anticorpo marcador é um anti- corpo contra o peptídeo β amiloide conjugado a um marcador detectá- vel. Em uma modalidade compreende o imunoensaio de um anticorpo de detecção contra digoxigenina conjugado à peroxidase de rábano silvestre.
[00012] Em uma modalidade adicional do método para determinação imunológica de um anticorpo anti-idiótipo contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide em uma amostra de imunoensaio compreende o peptídeo β amiloide conjugado a uma fase sólida, um anticorpo contra o peptídeo β amiloide conjugado à digoxigenina como marcador detectável, e um anticorpo de detecção contra digoxigenina conjugado à peroxidase de rábano silvestre.
[00013] Em uma modalidade do método de acordo com a presente invenção, o imunoensaio compreende um anticorpo de captura e um anticorpo marcador, em que o anticorpo de captura é uma mistura que compreende pelo menos dois anticorpos que diferem no local de anticorpo em que eles se conjugam para a fase sólida, e o anticorpo marcador é uma mistura que compreende pelo menos dois anticorpos que diferem no local de anticorpo em que são conjugados ao marcador de- tectável.
[00014] Em uma modalidade, a conjugação do anticorpo para o seu parceiro de conjugação é realizada por meio da ligação química, através do terminal N e/ou grupos ε-amino (lisina), grupos ε-amino de lisinas diferentes, grupos carbóxi, sulfidrila, hidroxila e/ou fenólicos funcionais da estrutura principal do aminoácido do anticorpo de fármacos e/ou grupos álcool de açúcar da estrutura de carboidratos do anticorpo de fármacos. Em uma outra modalidade, a mistura de anticorpo de captura compreende o anticorpo conjugado através de um grupo amino e através de uma estrutura de carboidratos a seu parceiro de conjugação.
[00015] Em uma modalidade, o anticorpo contra o peptídeo β ami- loide é o anticorpo, como relatado no WO 03/070760. Em uma outra modalidade, o anticorpo contra o peptídeo β amiloide compreende uma CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 1, 2 e 3, e uma CDR3 de cadeia leve selecionada a partir da SEQ ID NO: 4, 5 e 6. Em uma modalidade adiconal compreende o anticorpo contra o peptídeo β amiloide de um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir da SEQ ID NO: 7, 8 e 9 e/ou um domínio variável de cadeia leve selecionado a partir da SEQ ID NO: 10, 11 e 12.
[00016] Em uma modalidade adicional, a mistura de anticorpo de captura e/ou a mistura do anticorpo marcador compreendem o anticorpo conjugado através de pelo menos dois grupos amino diferentes a seu parceiro de conjugação. Tal acoplamento através de diferentes grupos amino pode ser feito por meio da acilação de uma parte dos grupos ε-amino com agentes químicos de proteção, por exemplo, por citraconilação, em uma primeira etapa. Em uma segunda etapa, a conjugação é realizada através dos grupos amino restantes. Posteriormente, a citraconilação é removida e o anticorpo é conjugado ao parceiro de conjugação através de grupos amino livres restantes, isto é, o anticorpo obtido é conjugado ao parceiro conjugação através dos grupos amino que não foram protegidos por citraconila- ção. Os agentes químicos de proteção adequados formam as ligações nas aminas de cadeia lateral desprotegida e são menos estáveis e diferentes daquelas ligações no terminal N. Muitos de tais agentes químicos de proteção são conhecidos (vide, por exemplo, EP 0 651 761). Em uma modalidade, os agentes químicos de proteção incluem anidridos de ácido dicarboxílico cíclicos como anidrido de ácido malei- co ou citraconílico.
[00017] Em uma modalidade, o anticorpo de captura é conjugado à fase sólida por meio da adsorção passiva e, portanto, é conjugado à fase sólida em pelo menos dois locais de anticorpos diferentes. A ad- sorção passiva é, por exemplo, descrita por Butler, J.E., em "Solid Phases in Immunoassay" (1996) 205 a 225 e Diamandis, E.P., e Chris- topoulos, T.K. (Editores), em "Immunoassays" (1996) Academic Press (San Diego).
[00018] Em uma modalidade, a mistura do anticorpo marcador compreende o anticorpo conjugado através de um grupo amino e através de uma estrutura de carboidratos, a seu parceiro de conjugação.
[00019] Em uma outra modalidade, a razão entre o anticorpo de captura ao anticorpo marcador é de 1:10 a 50:1 (razão significa razão molar das moléculas de anticorpo, independentemente do peso molecular dos conjugados, que podem ser diferentes). Em uma modalidade adiconal ainda, a razão do anticorpo amino conjugado (tanto o anticorpo marcador quanto de captura) ao anticorpo conjugado de carboidrato (tanto o anticorpo marcador quanto de captura) em tal mistura é 1:10 a 10:01 (razão significa a razão molar de moléculas de anticorpo, independentemente do peso molecular dos conjugados, que podem ser diferentes).
[00020] Em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo de captura é conjugado (imobilizado) através de um par de ligação específico. Tal par de ligação (primeiro componente/segundo componente) é uma modalidade selecionada a partir de estreptavidina ou avidi- na/biotina, anticorpos/antígenos (vide, por exemplo, Hermanson, G.T., et al. Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996), lecti- na/polissacarídeo, proteína de ligação de esteroides/esteroides, receptor de hormônios/hormônios, enzima/substrato, IgG/Proteína A e/ou G, etc. Em uma modalidade, o anticorpo de captura é conjugado à biotina e a imobilização é realizada através de avidina ou estreptavidina imobilizada.
[00021] Em uma outra modalidade, o anticorpo marcador é conjugado a um marcador detectável. Em uma modalidade, o anticorpo marcador é conjugado através digoxigenina e um anticorpo contra di- goxigenina ao marcador detectável. Em alternativa, o anticorpo marcador é conjugado a um marcador eletroquimioluminescente, como um complexo de rutênio bipiridila.
[00022] O termo "anticorpo contra o peptídeo β amiloide", de acordo com a presente invenção, indica um anticorpo que pode ser administrado a um indivíduo, de modo que uma amostra do dito indivíduo é suspeita de compreender o dito anticorpo após a administração. Dentro de um ensaio, de acordo com a presente invenção, o anticorpo de captura e o anticorpo marcador compõem a "mesma" molécula do anticorpo, por exemplo, recombinantemente produzida com o mesmo vetor de expressão e que compreende a mesma sequência de aminoácidos. O anticorpo contra o peptídeo β amiloide é descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. 7.256.273, U.S. 7.189.819, U.S. 7.179.892, U.S. 7.195.761, U.S. 2008/0281082, U.S. 2008/0221306, U.S. 2008/0131422, U.S. 2008/0050367, U.S. 2007/0238154,U.S. 2007/0154480, U.S. 2007/0110750, U.S. 2006/0280743, U.S 2006/0292152, U.S. 2006/0165682, U.S. 2006/0057701, U.S 2006/0057702, U.S. 2006/0039906, U.S. 2005/0249725, U.S 2005/0169925, U.S. 2005/0118651, U.S. 2005/0009150, U.S 2004/0171816, U.S. 2004/0171815, e U.S. 2004/0192898.
[00023] "Anticorpos anti-idiótipos" são anticorpos que são dirigidos contra o local de ligação do antígeno, isto é, a região variável de um anticorpo terapêutico, como a região de determinação de complementaridade. Tais anticorpos anti-idiótipos podem ocorrer durante a terapia de anticorpos como uma reação imunogênica de um paciente (vide, por exemplo Pan, Y., et al. FASEB J. 9 (1995) 43 a 49). Em uma modalidade, os ditos anticorpos anti-idiótipos contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide são ligados a uma ou mais das CDR do anticorpo contra o peptídeo β amiloide.
[00024] O primeiro aspecto da presente invenção é um anticorpo anti-idiótipo ligando-se a um anticorpo contra o peptídeo β amiloi- de. Um anticorpo exemplar para esse aspecto da presente invenção é o anticorpo que é obtido a partir da linhagem celular ACC2939 DSM depositada. Este anticorpo e seu uso em um ensaio de acordo com a presente invenção são também aspectos da presente invenção. Em uma modalidade, o dito anticorpo anti-idiótipo caracteriza-se na ligação para o mesmo ou um epítopo de sobreposição como o anticorpo que é obtido a partir da linhagem celular ACC2939 DSM depositada. Dois epítopos são sobrepostos se uma redução do sinal de 50% ou mais, em uma modalidade de 75% ou mais, for detectada por um ensaio de ressonância plasmônica de superfície (SPR) utilizando o anticorpo imobilizado e o antígeno solúvel, ou vice-versa, com o epítopo em questão a uma concentração de 20 a 50 nM e os anticorpos para os quais o epítopo de sobreposição tem de ser detectado em uma concentração de 100 nM. Alternativamente, um método pode ser usado, em que o epítopo de sobreposição de dois anticorpos que ligam-se ao mesmo antígeno é determinado com a ajuda de um sistema teste competidor. Para esse efeito, por exemplo, com a ajuda de um imuno- ensaio enzimático baseado em células (ELISA) empregando células expressando os epítopos de antígenos recombinantes, é testado se o anticorpo para o qual o epítopo de sobreposição tem de ser detectado compete com o outro anticorpo para a ligação ao antígeno imobilizado. Para este efeito, o antígeno imobilizado é incubado com o anticorpo em forma marcada e um excesso do anticorpo para o qual o epíto- po sobreposto tem que ser determinado. Pela detecção do limite de marcação pode ser facilmente verificada a sobreposição do epíto- po. Se um sinal de redução de mais de 70%, em uma modalidade de mais de 80%, na mesma concentração, ou uma deslocação de mais de 80%, em uma modalidade de mais de 90%, em altas concentrações, em um caso com um excesso de 105 vezes do anticorpo para o qual epítopo sobreposto tem que ser determinado, referido ao anticorpo conhecido é determinado então que a identidade epítopo ou a sobreposição está presente e ambos os anticorpos ligam-se ao mesmo quanto o epítopo sobreposto no mesmo antígeno. O anticorpo anti- idiótipo, de acordo com a presente invenção, é direcionado contra um anticorpo que se liga especificamente à sequência de aminoácidos do peptídeo beta amiloide, por exemplo, em uma modalidade para os resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.
[00025] Os princípios dos imunoensaios diferentes são descritos, por exemplo, em Hage, D.S. (Anal. Chem. 71 (1999) 294R a 304R). Lu, B., et al. (Analyst 121 (1996) 29R a 32R) relatam a imobilização orientada de anticorpos para o uso em imunoensaios. Os imu- noensaios mediados por avidina-biotina são relatados, por exemplo, em Wilchek, M., e Bayer, E.A., em Methods Enzymol. 184 (1990) 467 a 469.
[00026] Os anticorpos monoclonais e seus domínios constantes contêm como proteínas uma série de cadeias laterais reativas para acoplamento a um parceiro de ligação, tais como uma superfície, uma proteína, um polímero (por exemplo, PEG, celulose ou poliestireno), uma enzima, ou um membro de um par de ligação. Os grupos químicos reativos de anticorpos são, por exemplo, grupos amino (grupos lisina, alfa-amino), grupos tióis (cistinas, cisteínas, e metioninas), grupos de ácido carboxílico (ácido aspártico, ácido glutâmico), e os grupos alcoólicos de açúcar. Tais métodos são descritos, por exemplo, por Aslam M., e Dent, A., em "Bioconjugation", MacMillan Ref. Ltd. 1999, pp. 50 a 100.
[00027] Um dos grupos reativos mais comuns de proteínas é o ε- amina alifático do aminoácido lisina. Em geral, quase todos os anticor- pos contêm lisina em abundância. Lisina aminas são razoavelmente bons nucleófilos com pH acima de 8,0 (pKa = 9,18) e, portanto, reagem de forma fácil e limpa com uma variedade de reagentes para formar ligações estáveis. Os reagentes amina reativos reagem principalmente com lisinas e os grupos α-amino de proteínas. Os ésteres reativos, particularmente os ésteres N-hidróxi-succinimida (NHS), estão entre os reagentes mais comumente empregados para modificação dos grupos amina. O pH ótimo para a reação em um meio aquoso é pH 8,0 a 9,0. Os isotiocianatos são reagentes modificados por aminas e formam ligações de tioureia com proteínas. Eles reagem com aminas de proteína em solução aquosa (do modo mais eficiente em pH 9,0 a 9,5). Os aldeídos reagem em condições moderadamente aquosas com aminas alifáticas e aromáticas, hidrazinas e hidrazidas para formar um intermediário imina (base de Schiff). Uma base de Schiff pode ser seleti-vamente reduzida com agentes de redução leves ou fortes (tal como o boridrato de sódio ou cianoboridrato de sódio) para derivar uma ligação alquil amina estável. Os outros reagentes que foram utilizados para modificar as aminas são anidridos de ácido. Por exemplo, anidrido dietilenotriaminapenta-acético (DTPA) é um agente quelante bifuncio- nal que contém dois grupos reativos de anidrido de amina. Ele pode reagir com o terminal N e grupos ε-amina de proteínas para formar as ligações amida. Os anéis de anidrido se abrem para criar braços que- lantes de metais polivalentes capazes de se ligar fortemente aos metais em um complexo de coordenação.
[00028] Outro grupo reativo comum em anticorpos é o resíduo tiol a partir da cistina de ácido amino contendo enxofre e seus produtos de redução de cisteína (ou meia cistina). A cisteína contém um grupo tiol livre, que é mais nucleofílico do que aminas e é geralmente o maior grupo reativo funcional em uma proteína. Os tióis são geralmente reativos em pH neutro e, portanto, podem ser acoplados a outras molécu- las seletivamente na presença de aminas. Uma vez que os grupos livres de sulfidrila são relativamente reativos, as proteínas com esses grupos existem frequentemente com eles em sua forma oxidada como grupos dissulfeto ou pontes de dissulfeto. Em tais proteínas, a redução das pontes de dissulfeto com um reagente tal como ditiotreitol (DTT) é necessária para gerar o tiol livre reativo. Os reagentes reativos de tiol são os que vão acoplar aos grupos tiol nas proteínas, formando produtos acoplados ao tioéter. Estes reagentes reagem rapidamente em acidez leve a pH neutro e, portanto, podem ser reagidos seletivamente na presença de grupos amina. A literatura relata o uso de vários reagentes de reticulação tais como reagente de Traut (2-iminotiolano), acetato de succinimidila (acetiltio) (SATA), e 6-[3-(2 piridildi- tio)propionamido] hexoanoato de sulfossuccinimidila (sulfo-LC-SPDP ) para fornecer formas eficientes de introduzir vários grupos sulfidrila através de grupos reativos amino. Os derivados de haloacetila, por exemplo, iodoacetamidas, formam ligações tioéter e também reagentes para a modificação de tiol. Os reagentes úteis adicionais são ma- leimidas. A reação de maleimidas com reagentes reativos de tiol é essencialmente a mesma com iodoacetamidas. As maleimidas reagem rapidamente na acidez leve a pH neutro.
[00029] Outro grupo reativo comum em anticorpos são os ácidos carboxílicos. As proteínas contêm grupos de ácido carboxílico na posição terminal C e dentro das cadeias laterais de ácido aspártico e ácido glutâmico. A reatividade relativamente baixa de ácidos carboxílicos na água geralmente dificulta a utilização desses grupos para modificar seletivamente as proteínas e outras biomoléculas. Quando isso é feito, o grupo de ácido carboxílico é normalmente convertido em um éster reativo por meio do uso de uma carbodi-imida solúvel em água e reagido com um reagente nucleofílico, tal como uma amina, hidrazida ou hidrazina. O reagente contendo aminas deve ser fracamente básico, a fim de reagir seletivamente com o ácido carboxílico ativado na presença de mais ε-aminas altamente básicas de lisina para formar uma ligação amida estável. A reticulação da proteína pode ocorrer quando o pH é aumentado acima de 8,0.
[00030] O periodato de sódio pode ser usado para oxidar o uma parte de álcool de um açúcar dentro de uma porção carboidrato ligada a um anticorpo a um aldeído. Cada grupo aldeído pode ser reagido com uma amina, hidrazida, ou hidrazina como descrito para os ácidos carboxílicos. Uma vez que a porção carboidrato é predominantemente encontrada na região do fragmento cristalizável (Fc) de um anticorpo, a conjugação pode ser obtida através da modificação do local dirigido do carboidrato longe do local de ligação de antígeno. Uma base intermediária de Schiff é formada, que pode ser reduzida a uma alquil amina através da redução do intermediário com cianoboridreto de sódio (leve e seletiva) ou boridreto de sódio (forte) solúvel em água de agen-tes redutores.
[00031] O termo "amostra" inclui, mas não está limitado a, qualquer quantidade de uma substância a partir de um ser vivo ou ex vivo. Esses seres vivos incluem, mas não estão limitados a, os seres humanos, camundongos, macacos, ratos, coelhos e outros animais. Essas substâncias incluem, mas não estão limitadas a, sangue total, soro ou plasma de um indivíduo, que são as fontes mais utilizadas da amostra em rotina clínica.
[00032] O termo "fase sólida" designa uma substância não líquida, e inclui partículas (incluindo as micropartículas e contas) feitas a partir de materiais tais como polímeros, metais (partículas paramagnéticas, ferromagnéticas), vidro e cerâmica; substâncias em gel, tais como sílica, alumina, e géis de polímero; os capilares, que podem ser feitos de polímero, metal, vidro e/ou cerâmica; zeólitos e outras substâncias porosas; eletrodos, placas de microtitulação; tiras sólidas; e cuvetas, tu- bos ou outros recipientes de amostra do aparelho. Um componente da fase sólida de um ensaio distingue-se das superfícies sólidas inertes com que o ensaio pode estar em contato, em que uma "fase sólida" contém pelo menos uma porção da sua superfície, que se destina a interagir com o anticorpo de captura de fármacos. Uma fase sólida pode ser um componente estacionário, tal como um tubo, tira, cuveta, ou placa de microtitulação, ou podem ser componentes não estacionários, tais como contas e micropartículas. Uma variedade de micropartículas que permitem que tanto acoplamento não covalente quanto covalente de proteínas e outras substâncias pode ser utilizada. Tais partículas incluem partículas de polímero, tais como o poliestireno e poli (metil- metacrilato); partículas de ouro, tais como as nanopartículas de ouro e coloides de ouro; e partículas de cerâmica, tais como sílica, vidro e partículas de óxido de metal. Vide, por exemplo, Martin, C.R., et al. Analytical Chemistry-News & Features, 70 (1998) 322 a 327A, ou Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4 a 23.
[00033] A partir dos cromógenos (grupos fluorescentes ou lumines- centes e corantes), as enzimas, os grupos de RMN ativos, as partículas de metal, ou haptenos, tais como digoxigenina, o marcador detec- tável é selecionado em uma modalidade. O marcador detectável também pode ser um grupo de reticulação fotoativável, por exemplo, um grupo azido ou um grupo azirina. Os quelatos de metal que podem ser detectados por eletroquimioluminescência também estão em uma modalidade dos grupos que emitem sinal, com preferência especial dada aos quelatos de rutênio, por exemplo, um (bispiridil) 32+ quelato de ru- tênio. Os grupos de marcação de rutênio apropriados estão descritos, por exemplo, no EP 0 580 979, WO 90/05301, WO 90/11511 e WO 92/14138.
[00034] A presente invenção refere-se a um método para a determinação imunológica de um anticorpo anti-idiótipo contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide em uma amostra utilizando um imunoen- saio compreendendo um anticorpo de captura e um anticorpo marcador. Em uma modalidade, o imunoensaio é um imunoensaio de ponte de antígeno . Em uma outra modalidade, o imunoensaio compreende um anticorpo de captura e um anticorpo marcador, em que o anticorpo de captura é uma mistura do anticorpo contra o peptídeo β amiloide compreendendo pelo menos dois anticorpos que diferem no local de anticorpo em que se conjugam para a fase sólida, e o anticorpo marcador é uma mistura do anticorpo contra o peptídeo β amiloide que compreende pelo menos dois anticorpos que diferem no local de anticorpo em que são conjugados a o marcador detectável.
[00035] Os ensaios empregados comumente/geralmente possuem limitações no que diz respeito à quantificação e/ou à determinação de um anticorpo contra o peptídeo β amiloide em uma amostra, que resultam, por exemplo a partir das alterações na ligação do anticorpo contra o peptídeo β amiloide ao peptídeo β amiloide. Foi constatado que, ao utilizar um anticorpo contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide (anticorpo anti-anticorpo anti-Aβ), de acordo com a presente invenção em um imunoensaio, essas limitações podem ser superadas.
[00036] O anticorpo de captura útil em um método de acordo com a presente invenção é conjugado a uma fase sólida. A conjugação está em uma modalidade realizada por meio da ligação química, através do terminal N e/ou grupos ε-amino (lisina), os grupos ε-amino das lisinas diferentes, grupos carbóxi, sulfidrila, hidroxila e/ou fenólicos funcionais da estrutura principal de aminoácidos do anticorpo e/ou grupos álcool de açúcar,da estrutura de carboidratos do anticorpo. O anticorpo de captura útil em um método de acordo com a presente invenção é em uma modalidade uma mistura de pelo menos dois anticorpos conjugados a uma fase sólida, em que pelo menos dois anticorpos conjugados a uma fase sólida diferem no local em que se conjugam para o fase sólida. Por exemplo, a mistura de pelo menos dois anticorpos conjugados a uma fase sólida pode incluir um anticorpo contra o peptídeo β amiloide conjugado através de um aminoácido da estrutura principal de aminoácidos do anticorpo para a fase sólida e um anticorpo contra o peptídeo β amiloide conjugado através de um grupo álcool de açúcar de uma estrutura de carboidrato do anticorpo à fase sólida. Também, por exemplo, a mistura de pelo menos dois anticorpos conjugados a uma fase sólida pode incluir anticorpos conjugados à fase sólida através de diferentes resíduos de aminoácidos da sua estrutura principal de aminoácidos. A expressão "resíduos de aminoácido diferentes" denota tanto dois tipos diferentes de aminoácidos, como, por exemplo, lisina e ácido aspártico, quanto tirosina e ácido glutâmico, ou dois resíduos de aminoácidos da estrutura principal de aminoácidos dife-rentes em sua posição na sequência de aminoácidos do anticorpo. Neste último caso, o aminoácido pode ser da mesma espécie ou de espécie diferente. As expressões "diferem no local de anticorpo" e "local" denotam a diferença, quer no tipo de local, por exemplo, aminoácido ou grupo álcool, açúcar quanto o número do aminoá- cido da estrutura principal de aminoácidos, por exemplo, em que o anticorpo é conjugado à fase sólida. O mesmo se aplica vice-versa para o anticorpo marcador útil em um método de acordo com a presente invenção.
[00037] Em uma modalidade, a presente invenção compreende o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo contra o peptídeo β amiloide, uma CDR3 com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 1, 2 ou 3. Em uma modalidade adicional, o domínio variável de cadeia leve do dito anticorpo contra o peptídeo β amiloide compreende uma CDR3 com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 4, 5 ou 6. Em uma modalidade adicional ainda, o anticorpo contra o peptídeo β amiloide compreende um domínio variável de cadeia pesada com uma sequência de amino- ácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 7, 8 ou 9. Em uma modalidade adicional ainda, o dito anticorpo contra o peptídeo β amiloide compreende um domínio variável de cadeia leve, com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 10, 11 ou 12.
[00038] Em uma modalidade do método de acordo com a presente invenção, o imunoensaio compreende como o anticorpo de captura o fragmento F (ab ') 2 de um anticorpo monoclonal contra o peptídeo β amiloide, que é conjugado e biotinilado através de streptavidina, a uma fase sólida, e como anticorpo marcador um anticorpo policlonal contra a imunoglobulina G humana conjugado à peroxidase de rábano silvestre.
[00039] Em uma outra modalidade do método de acordo com a presente invenção o imunoensaio é um imunoensaio de ponte dupla do antígeno.
[00040] Em uma modalidade adicional do método de acordo com a presente invenção, o imunoensaio compreende um anticorpo de captura, um anticorpo marcador e um anticorpo de detecção, em que o anticorpo de captura é um anticorpo biotinilado contra o peptídeo β amiloi- de conjugado a uma fase sólida através de estreptavidina, o anticorpo marcador é um anticorpo contra o peptídeo amiloide β conjugado a digoxigenina, e o anticorpo de detecção é um anticorpo contra digoxi- genina conjugado à peroxidase de rábano silvestre.
[00041] Em uma outra modalidade do método de acordo com a presente invenção, o imunoensaio compreende um anticorpo de captura, um anticorpo marcador e um anticorpo de detecção, em que o anticorpo de captura é um anticorpo anti-idiótipo biotinilado contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide conjugado a uma fase sólida pela estreptavidina, o anticorpo marcador é um anticorpo anti-idiótipo contra um anticorpo contra o peptídeo amiloide β conjugado a digoxi- genina como marcador detectável, e o anticorpo de detecção é um anticorpo contra digoxigenina conjugado à peroxidase de rábano silvestre.
[00042] Em uma outra modalidade do método de acordo com a presente invenção, o imunoensaio compreende o peptídeo β amiloide conjugado a uma fase sólida, um anticorpo anti-idiótipo contra um anticorpo contra o peptídeo amiloide β conjugado à digoxigenina como marcadores detectáveis, e um anticorpo de detecção contra digoxige- nina conjugado à peroxidase de rábano silvestre.
[00043] A linhagem celular de hibridoma camundongo-camundongo de acordo com a presente invenção, linhagem celular de hibridoma MAK <Mab31> M-1.5.74, foi depositada nos termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para efeitos de procedimento de patentes, com a Deutsche Sammlung Mikroorganismen von und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemanha, em 29 de julho de 2008 sob Número de Acesso DSM ACC2939.
[00044] Os exemplos a seguir, a listagem de sequências e as figuras são fornecidas para auxiliar na compreensão da presente invenção, o verdadeiro escopo o qual é definido nas reivindicações em anexo. Entende-se que as modificações podem ser feitas nos procedimentos estabelecidos, sem se afastar do espírito da presente invenção. Descrição das Figuras
[00045] Figura 1 Seleção de anticorpo de anticorpo Aβ anti- humano anti-idiótipo .
[00046] Figura 2 Ensaio para avaliar a reatividade cruzada.
[00047] Figura 3 Quantificação do anticorpo Aβ anti-humano.
[00048] Figura 4 Ensaio alternativo para a quantificação de anti- corpo Aβ anti-humano.
[00049] Figura 5 Detecção de anticorpos de anticorpo Aβ anti- humano (ADA).
[00050] Figura 6 Detecção de anticorpos de anticorpo Aβ anti- humano neutralizante. Exemplos Exemplo 1 Preparação do Fragmento F (ab') 2 do anticorpo contra o peptídeo β amiloide
[00051] Por exemplo, um anticorpo exemplar contra o peptídeo β amiloide (um anticorpo anti-Aβ) e suas sequências de ácido nucleico correspondentes são relatados no WO 2003/070760 ou U.S. 2005/0169925 ou nas SEQ ID NO: 1 a 12.
[00052] O anticorpo anti-Aβ em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH 3,6, foi incubado com pepsina (5 μg de pepsina por mg de anticorpo). A fragmentação foi analisada por filtração em gel analítica e parada depois de 50 minutos, ajustando o pH para 7,0 com o fosfato de potássio. Após a diálise da mistura contra tampão fosfato de potássio a 50 mM, contendo cloreto de sódio a 300 mM em pH 7,5 a preparação foi concentrada a cerca de 20 mg/ml e aplicada a uma coluna em gel filtração (Superdex 200). As frações recuperadas foram analisadas por meio da filtração em gel analítica e as frações contendo o fragmento F(ab') 2 foram aplicadas a uma matriz de afinidade com anticorpos policlonais imobilizados contra Fcy humano para eliminar quantidades residuais de fragmentos contendo Fcy. O fluxo que atra-vessa foi agrupado e, finalmente, concentrado a cerca de 20 mg/ml. Exemplo 2 Geração de Anticorpos Monoclonais Anti-idiotípicos a) Imunização de Camundongos
[00053] Camundongos fêmeos Balb/c ou NMRI, respectivamente, de 8 a 12 semanas de idade, foram primeiramente imunizados intrape- ritonealmente com 100 mg de fragmento F(ab') 2 do anticorpo anti-Aβ monoclonal compreendendo um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir da SEQ ID NO: 7 a 9 e um domínio variável de cadeia leve selecionado a partir da SEQ ID NO: 10 a 12 misturado com CFA (Adjuvante de Freund Completo), obtido como descrito no exemplo 1. Três etapas de imunização intraperitoneal adicionais seguidas após 4, 7 e 10 semanas, com aplicação de 100 mg do fragmento F(ab') 2 mencionado acima por rato misturado com IFA (Adjuvante de Freund Incompleto). Posteriormente, por via intravenosa ou intraperitoneal, respectivamente, imunizações aumentadas foram feitas, cada uma com 25 a 100 μg do fragmento F(ab ') 2 em PBS (solução salina tamponada com fosfato) três dias antes da fusão. b) Fusão e Clonagem
[00054] A fusão com células de mieloma derivadas de células do baço de camundongos imunizados de acordo com a) foi realizada de acordo com Galfré, G., e Milstein, C. (Galfré, G., e Milstein, C., Methods Enzymol. 73 (1981) 3-46). Cerca de 1 x 108 esplenócitos foram misturados com 2 x 107 células de mieloma (P3x63-Ag8.653, ATCC CRL1580) e centrifugadas (10 min. A 300 xg, a 4 °C). As células foram lavadas depois uma vez com o meio de cultura RPMI 1640 sem FCS (soro de bezerro fetal) e novamente centrifugadas a 400 xg em um frasco de 50 ml. Posteriormente, um ml de PEG (poli(etileno glicol), peso molecular 4000 g/mol) foi adicionado. A mistura foi feita pela pi- petagem. Após 1 min. em banho-maria a 37° C, 5 ml de RPMI 1640 sem FCS foram adicionados gota a gota. A suspensão foi misturada, cheia até 50 ml de RPMI 1640 contendo 10% (v/v) FCS, e centrifugada em seguida. As células sedimentadas foram ressuspensas em RPMI 1640 com 10% de SFB, e semeadas em meio de seleção hipoxantina- Azasserina (100 mmols/l hipoxantina, 1 mg/ml Azasserina em RPMI 1640 com 10% de SFB), contendo o fator de crescimento interleucina 6 (IL- 6, 100 U/ml). Após aproximadamente 10 dias, as culturas primá- rias foram testadas para a síntese de anticorpos específicos (vide exemplo 3). As culturas primárias exibindo a ligação com o fragmento F (ab') 2 mencionado acima, bem como nenhuma reação cruzada com a IgG humana, e tendo sido mostrado para ser anti-idiotípicos foram individualizadas pela deposição única de célula em placas de cultura de células de 96 poços usando um citômetro de fluxo (FACSAria, BD Biosciences), com o meio contendo o fator de crescimento Interleucina 6 (100 U/ml). Ao seguir este protocolo, o clone depositado 1.5.74 foi gerado (Tabela 1). A linhagem celular útil na presente invenção foi depositada com Deutsche Sammlung von und Mikroorganismen Zellkul- turen GmbH (DSMZ), na Alemanha. Tabela 1: Clone produzindo anticorpo monoclonal anti-idiotípico
c) Produção da Imunoglobulina a partir do Sobrenadante de Cultura de Célula
[00055] A linhagem celular do hibridoma gerada foi inoculada em uma densidade celular inicial de 1,0 x 105 células por ml em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de SFB, e ampliada em um mostruário giratório de cultura. Daí em diante, uma unidade Miniperm foi inoculada com as células em uma densidade celular inicial (células vivas) de 2,4 x 106 células por ml em meio RPMI 1640 suplementado com FCS a 10%, e ampliada. No sobrenadante da cultura colhida, uma concentração de 1,2 mg de anticorpos monoclonais por ml foi atingida. A purificação do anticorpo a partir do sobrenadante da cultura foi feita de acordo com métodos químicos de proteína padrão, por exemplo, de acordo com Bruck, C., et al. Methods Enzymol 121 (1986) 587 a 596. Exemplo 3 Ensaios de triagem para a detecção de anticorpos anti-idiotípicos a) Triagem Primária para Anticorpos de Ligação ao Anticorpo de Fár- macos
[00056] Para a determinação da especificidade dos anticorpos nos sobrenadantes de cultura de células de hibridoma, MTPs (placas de microtítulo) pré-revestidas com estreptavidina recombinante (MicroCoat, Bernried, Alemanha) foram revestidos com anticorpo anti-Aβ biotini- lado monoclonal 200 ng/ml, ou IgG biotinilado humano, 2 μg/ml, respectivamente, em PBS com 1,0% (p/v) fração BSA II (100 μl por poço, 60 min. incubação à temperatura ambiente, com agitação). Posteriormente, os poços foram lavados três vezes com 0,9% (p/v) de solução de cloreto de sódio contendo 0,05% (p/v) de Tween® 20. Na próxima etapa, foram adicionados 100 μl por poço da solução de anticorpo a ser analisada (sobrenadante de cultura) e incubados por 60 min. à temperatura ambiente, com agitação. Após três etapas de lavagem, com 0,9% (p/v) de NaCl/0,05% Tween® 20 por poço, 100 μl de um fragmento F(ab')2 marcado com peroxidase de rábano silvestre de um anticorpo Fcy de ovelha anticamundongo policlonal foram adicionados e incubados por 60 min. à temperatura ambiente, com agitação. Posteriormente, a lavagem foi realizada como descrito acima. Finalmente, foram adicionados por poço 100 μl de ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha, catálogo n° 1.684.302). Depois de 30 min de incubação à temperatura ambiente, a extinção (densidade óptica OD) foi medida em 405 e 492 nm [405/492] em um leitor de placas comercial de microtitulação de ELISA. Esta triagem levou a uma sele-ção de anticorpos que se ligam bem ao anticorpo monoclonal anti-Aβ de IgG, bem como apresentando apenas uma baixa ou mesmo nenhuma reatividade cruzada a IgG humana. Esta seleção de anticorpos foi ainda submetida ao ensaio b). b) Seleção de Anticorpos Anti-idiotípicos
[00057] A fim de identificar, a partir da seleção de anticorpos da triagem primária de a), aqueles que são ant-iidiotípicos, foi realizado o ensaio descrito a seguir. MTPs pré-revestidos com estreptavidina re- combinante (MicroCoat, Bernried, Alemanha) foram revestidos com peptídeos Aβ biotinilados, 250 ng/ml em PBS com fração II a 0,5% de BSA (100 μl por poço, 60 min, incubação à temperatura ambiente, com agitação ) e, posteriormente, lavados três vezes com 0,9% (p/v) de NaCl/0,05% de Tween® 20. Na próxima etapa, foram adicionados por poço 50 μl do fragmento Fab marcado com digoxigenina do anticorpo monoclonal anti-Aβ, em 2,5 a 15 ng/ml, e 50 μl de PBS (sinal de referência), ou 50 μl dos anticorpos candidatos ( sobrenadante da cultura; sinal de ensaio), respectivamente, e incubados por 60 min. à temperatura ambiente, com agitação. Após três etapas de lavagem, com 0,9% (p/v) de NaCl/0,05% de Tween® 20 por poço, 100 μl de um fragmento Fab marcado de peroxidase de rábano silvestre de um anticorpo anti- digoxigenina de ovelhas policlonal foram adicionados para a detecção de conjugado digoxigenina-anticorpo anti-Aβ monoclonal humano, e incubados por 60 min à temperatura ambiente, com agitação. Posteriormente, a lavagem foi realizada como descrito acima. Finalmente, foram adicionados por poço 100 μl de ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, na Alemanha, catálogo n° 1.684.302). Depois de 30 min de incubação à temperatura ambiente, a extinção foi medida em [405/492] nm em um leitor de placas comercial de microtitulação ELISA. Os anticorpos exibindo um sinal de ensaio fortemente reduzido, em comparação com o sinal de referência associado, foram selecionados como candidatos para uso posterior. c) Seleção de Anticorpos com Menor Reatividade Cruzada com IgG Humana
[00058] A fim de identificar, entre os candidatos da triagem b), aqueles que apresentam menor reatividade cruzada para a IgG humana, foi realizado o ensaio descrito a seguir. MTPs pré-revestidos com estreptavidina recombinante (MicroCoat, Bernried, Alemanha) foram revestidos com anticorpo anti-Aβ monoclonal de IgG, 50 ng/ml, em um tampão (125 μl por poço, 30 min de incubação à temperatura ambiente, com agitação ) e, posteriormente, lavados três vezes com 0,9% (p/v) de NaCl/0,05% de Tween® 20. Na próxima etapa, foram adicionados por poço 100 μl de uma mistura de 100 μl do anticorpo candidato respectivo (sobrenadante de cultura), 100 μl de IgG humana (em concentrações até 73 mg/ml), e 200 mL do fragmento Fab rotulado de digoxigenina do anticorpo monoclonal anti-Aβ, foram adicionados e incubados por 60 min à temperatura ambiente, com agitação. Após três etapas de lavagem, com 0,9% (p/v) de NaCl/0,05% de Tween® 20 por poço, 100 μl de um fragmento Fab rotulado com peroxidase de rábano silvestre de um anticorpo antidigoxigenina de ovelha policlonal foram adicionados para a detecção de conjugado digoxigenina- anticorpo anti-Aβ monoclonal humano, e incubados por 60 min à temperatura ambiente, com agitação. Posteriormente, a lavagem foi realizada como descrito acima. Finalmente, foram adicionados por poço 100 μl de ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, na Alemanha, catálogo n° 1.684.302). Depois de 30 min de incubação à temperatura ambiente, a extinção foi medida em [405/492] nm em um leitor de placas comercial de microtitulação ELISA. Os anticorpos apresentando a menor perda de sinal de ensaio com a adição de IgG humana, em relação a não adição de IgG humana, foram selecionados para uso pos-terior. Exemplo 4 Purificação de Anticorpos Anti-idiotípicos Monoclonais de Camundongo contra o Anticorpo Anti-Aβ Monoclonal
[00059] O sobrenadante de fermentação de anticorpos contra o anticorpo anti-Aβ monoclonal de IgG estava concentrado cerca de dez vezes e transferido para uma reserva com Tris a 20 mM, sulfato de amônio a 1 mM, pH 9,0, e aplicado à proteína A sefarose. O eluato com citrato de sódio a 0,2 M e sulfato de amônio a 0,2 M em pH 5,5 foi dialisado contra tampão fosfato, pH 7,5. Contaminantes de IgG bovina (a partir de FCS no caldo de fermentação) foram separados por meio da imunoadsorção com anticorpos imobilizados contra IgG bovina. Exemplo 5 Preparação de Anticorpo Biotinilado contra o Anticorpo Anti-Aβ Monoclonal
[00060] O anticorpo contra o anticorpo anti-Aβ monoclonal de IgG, em tampão fosfato, pH 8,5, foi ajustado a uma concentração de proteína de cerca de 15 mg/ml.
[00061] N-hidroxissucinimida do ácido D-biotinoil-aminocaproico foi dissolvida em DMSO e adicionada à solução em uma proporção molar de 1:5. A reação foi interrompida após 60 minutos pela adição de L- lisina, e o excesso de reagente de marcação foi removido por meio da diálise contra tampão de fosfato de potássio a 25 mM, cloreto de sódio a 150 mM, pH 7,5, e por filtração em gel. Exemplo 6 Preparação de Anticorpo Digoxigenilado contra Anticorpo Anti-Aβ Monoclonal
[00062] O anticorpo contra o anticorpo anti-Aβ monoclonal de IgG, em tampão fosfato, pH 8,5, foi ajustado a uma concentração de proteína de cerca de 15 mg/ml. N-hidroxissucinimida do ácido digoxigenina 3-O-metilcarbonil-ε-aminocaproico foi dissolvido em DMSO e adicionado à solução de anticorpo em uma proporção molar de 1:5. A reação foi interrompida após 60 minutos pela adição de L-lisina, e o excesso de reagente de marcação foi removido por meio da diálise contra tampão fosfato de potássio a 25 mM, cloreto de sódio a 150 mM, pH 7,5, e por filtração em gel. Exemplo 7 Ensaio para a Quantificação do Anticorpo Anti-Aβ Monoclonal
[00063] O ELISA é um ensaio para a determinação quantitativa do anticorpo anti-Aβ monoclonal no plasma humano, usando placas de microtitulação de estreptavidina (MTP). Os padrões de calibração e as amostras são pré-incubados com um anticorpo biotinilado e anticorpos anti-idiotípicos digoxigenilados direcionados contra o idiótipo do anticorpo anti-Aβ monoclonal (Bi-IgG e IgG-Dig). Depois de 30 min de pré- incubação, a mistura é transferida para a placa de microtitulação. O sanduíche ELISA é detectado com o anticorpo de ovelha antidigoxige- nina conjugado a uma peroxidase que catalisa a reação de cor do substrato ABTS®. O sinal é determinado por um leitor de ELISA. As etapas de lavagem são feitas antes e após a incubação com anti-DIG PAB-Fab-POD (PAB = anticorpo policlonal). Todos os padrões de cali- bração e amostras incluem 10% de plasma humano. Exemplo 8 Ensaio para a Detecção de um Anticorpo Antifármaco Direcionado contra o Anticorpo Anti-Aβ Monoclonal
[00064] O anticorpo anti-Aβ monoclonal biotinilado foi conjugado (ligado aos) poços de microplacas revestidas de estreptavidina (SA- MTP) na primeira etapa. Nenhum anticorpo conjugado (desacoplado) foi removido por lavagem com tampão universal. Posteriormente, as amostras e os padrões de referência (anticorpo anti-Aβ monoclonal do anticorpo anti-idiotípico cravado em 5% de soro humano) foram incubados nos poços. O anticorpo anti-Aβ do anticorpo ligado ao anticorpo anti-anticorpo anti-Aβ monoclonal imobilizado. Depois de ter lavado as substâncias não ligadas, o anticorpo anti-Aβ ligado foi detectado com anticorpo anti-A β digoxigenilado monoclonal seguido de incubação com um anticorpo de antidigoxigenina marcado com peroxidase de rábano silvestre (vide figura 1). O conjugado anticorpo-enzima catalisou a reação de cor do substrato ABTS®. O sinal foi medido pelo leitor de ELISA a 405 nm ( comprimento de onda de ref.: 490 nm). Os valo- res de absorvância de cada amostra de soro foram determinados em triplicata. Exemplo 9 Ensaio Alternativo para a Quantificação de Anticorpo Anti-Aβ Monoclonal
[00065] O ELISA é um ensaio para a determinação quantitativa do anticorpo anti-Aβ monoclonal no plasma humano, usando placas de microtitulação (MTP) revestidas com a proteína beta-amiloide compreendendo de 1 a 40 aminoácidos (Aβ (1 a 40)). Os padrões de calibra- ção e as amostras são incubados nos poços das placas de microtitula- ção revestidas com Aβ (1 a 40) e a quantidade de anticorpo anti-Aβ monoclonal ligado à superfície revestida de Aβ (1 a 40) é detectada com o anticorpo anti-idiotípico digoxigenilado direcionado contra o idió- tipo do anticorpo anti-Aβ monoclonal (Dig-IgG) e anticorpo de antidigo- xigenina conjugado à peroxidase que catalisa a reação de cor do substrato ABTS®. O sinal é medido por um leitor ELISA.
[00066] As etapas de lavagem são feitas entre todos os ciclos de incubação. Após o revestimento da placa de microtitulação (MTP), com Aβ (1 a 40) uma etapa adicional de bloqueio é necessária (com tampão de incubação). Todos os padrões de calibração e amostras incluem 10% de plasma humano. Todas as etapas de incubação são feitas em temperatura ambiente. Exemplo 10 Ensaio para Detecção de Neutralizantes de Anticorpos de Antifármaco Direcionados contra o Anticorpo anti-Aβ Monoclonal
[00067] Para a análise de neutralização de anticorpos antifármacos dirigidos contra a região determinante de complementaridade do anticorpo anti-Aβ monoclal terapêutico, uma competição ELISA foi desenvolvida. As amostras de plasma ou anticorpos anti-idiotípicos contra o anticorpo anti-Aβ monoclonal como um padrão foram pré-incubadas com anticorpo anti-Aβ monoclonal conjugado ao anticorpo DIG. O conjugado de anticorpo DIG anti-Aβ monoclonal livre restante é capturado em uma placa de microtitulação revestida por Aβ e detectado com um anticorpo antidigoxigenina marcado com peroxidase e reação de subsequente com ABTS.
Claims (4)
1. Uso de um anticorpo anti-idiótipo, caracterizado pelo fato de que é da linhagem celular DSM ACC2939, em que o anticorpo é para a determinação imunológica de um anticorpo contra o peptídeo β amiloide em uma amostra usando imunoensaio, em que o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo contra o peptídeo amiloide β compreende um domínio variável de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NO: 7, 8 e 9 e o domínio variável de cadeia leve do dito anticorpo contra o peptídeo β amiloide compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 10, 11 e 12.
2. Método para a determinação imunológica de um anticorpo contra o peptídeo β amiloide em uma amostra, caracterizado pelo fato de usar um imunoensaio empregando um anticorpo obtido a partir da linhagem celular DSM ACC2939, em que o imunoensaio compreende um anticorpo de captura, um anticorpo marcador e um anticorpo de detecção, em que o dito anticorpo de captura é um anticorpo anti- idiótipo biotinilado contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide obtido a partir da linhagem celular DSM ACC2939 conjugado para uma fase sólida através de estreptavidina, o dito anticorpo marcador é um anticorpo anti-idiótipo contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide obtido a partir da linhagem celular DSM ACC2939 conjugado a digoxi- genina como marcador detectável, e o dito anticorpo de detecção é um anticorpo contra digoxigenina conjugada a uma peroxidase.
3. Método para a determinação imunológica de um anticorpo contra o peptídeo β amiloide em uma amostra, caracterizado pelo fato de usar um imunoensaio empregando um anticorpo obtido a partir da linhagem celular DSM ACC2939, em que o imunoensaio compreende o peptídeo β amiloide conjugado a uma fase sólida, um anticorpo anti-idiótipo contra um anticorpo contra o peptídeo β amiloide obtido a partir da linhagem celular DSM ACC2939 conjugado a digoxigenina como marcador detectável, e um anticorpo de detecção contra digoxi- genina conjugada a uma peroxidase.
4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o imunoensaio compreende um anticorpo de captura e um anticorpo marcador, em que o dito anticorpo de captura é uma mistura compreendendo pelo menos dois dos ditos anticorpos que diferem no local de anticorpo em que são conjugados à fase sólida, e o anticorpo marcador é uma mistura dos ditos anticorpos compreendendo pelo menos dois dos ditos anticorpos que diferem no local de anticorpos em que são conjugados ao marcador detectável.
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