KR101187627B1 - 식별 검정법 - Google Patents

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KR101187627B1
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마르쿠스 차다크
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체, a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체를 제공하는 단계, 상기 포획 약물 항체를 b-i) 표본, b-ii) 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본, b-iii) 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본과 각각 접촉시키는 단계, b-i) 은 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 표본에서 약물 항체에 대한 항체를 측정하는 단계를 포함하는, 포획 약물 항체 및 추적 약물 항체를 포함하는 면역검정법을 이용하여 표본에서 약물 항체에 대한 항체를 측정하는 방법을 포함한다.

Description

식별 검정법 {DISTINGUISHING ASSAY}
본 발명은 표본에서 특이적 및 비-특이적 항-약물 항체의 존재를 식별하는 방법뿐 아니라 상기 방법을 사용하기 위한 키트를 포함한다.
단일클론 항체를 사용하는 표준 고체상 면역검정법 (solid-phase immunoassay) 은 고체상에 흡착된 항체 (포획 (capture) 항체), 항원, 및 검출가능한 표지, 예를 들어 효소에 접합된 항원의 또 다른 에피토프에 대한 항체 (추적(tracer) 항체) 사이의 착물 형성을 수반한다. 따라서, 고체상-포획 항체-항원-추적 항체의 샌드위치가 형성된다. 이러한 샌드위치에 의해 촉진된 반응에서, 항체-접합 효소의 활성은 인큐베이션 배지 중에서의 항원 농도에 비례한다. 표준 샌드위치 방법은, 포획 항체 및 추적 항체가 동일한 항원의 상이한 에피토프와 결합하기 때문에 이중 항원 가교 면역검정법으로도 지칭된다. [Hoesel, W., 등, J. Immunol. Methods 294 (2004) 101-110] 에는, 아미노기 및 탄수화물기에 커플링되어 있는 고정된 rhEPO 의 혼합물을 사용한 항-EPO 이중 항원 가교 검정법이 기재되어 있다. 이중 항원 가교 ELISA 와 같은 면역검정법은 항체 약물에 대한 환자의 면역 반응을 조사하는 데 있어 흔한 형태의 검정법이다. [Mire-Sluis, A.R., 등., J. Immunol. Methods 289(2004) 1-16] 에는 생명공학적 제품에 대한 숙주 항체의 검출을 이용한 면역검정법의 설계 및 최적화에 대한 권장사항이 요약되어 있다. Mire-Sluis 등에 따른, 잘 공지되어 있는 항-약물 항체 검정법 방식은 상당한 단점을 나타낸다. 항-약물 항체 검정법은 예를 들어, WO 2005/045058 및 WO 90/006515 에 언급되어 있다. 항-유전자형 (anti-idiotypic) 항체 검정법은 예를 들어, US 5,219,730, WO 87/002778, EP 0 139 389, 및 EP 0 170 302 에 언급되어 있다. [Wadhwa, M., 등, J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17] 에는 치료적 생물학적 제제에 의해 유도된 원치않는 항체의 검출, 측정 및 특징규명에 대한 방법이 기재되어 있다. 상이한 면역검정법의 원리는, 예를 들어 [Hage, D.S., Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R. Lu, B., 등, Analyst. 121 (1996) 29R-32R] 에 기재되어 있고, 면역검정법에 사용하는 항체의 방향성 고정화가 보고되어 있다. 아비딘-비오틴-매개 면역검정법은 예를 들어 [Wilchek, M., and Bayer, E.A., Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469] 에 기재되어 있다. [Lofgren, J.A., 등, J. Immunol. 178 (2007) 7467-7472] 에는 ELISA 및 표면 플라즈몬 공명이 비교되어 있다.
발명의 요약
본 발명의 제1 양태는 하기 단계를 포함하는, 포획 약물 항체 및 추적 약물 항체를 포함하는 면역검정법을 이용하여 표본에서 약물 항체에 대한 항체 (항-약물 항체, ADA) 를 측정하는 방법이다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-iii) 과 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
c) b-i) 은 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 표본에서 약물 항체에 대한 항체를 측정하는 단계.
본 발명의 다른 양태는 하기 단계를 포함하는, 포획 약물 항체 및 추적 약물 항체를 포함하는 이중 항원 가교 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 특이적 항-약물 항체인지 비-특이적 항-약물 항체인지 측정하는 방법이다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iv) 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
b-v) 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
c) b-i), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 특이적 항-약물 항체인지 측정하거나,
b-i), b-ii) 및 b-iv) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 비-특이적 항-약물 항체인지 측정하는 단계.
본 발명의 제3 양태는 하기 단계를 포함하는, 면역검정법을 이용하여 항-인간 IgG 항체로부터 인간화 항-염증성 약물 항체에 대한 항-약물 항체를 표본에서 식별하는 방법이다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iv) 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
b-v) 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
c) b-i), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 인간화 항-염증성 약물 항체에 대한 항-약물 항체를 측정하거나,
b-i), b-ii) 및 b-iv) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 항-인간 IgG 항체인지 측정하는 단계.
본 발명의 추가의 양태는 하기 단계를 포함하는, 면역검정법을 이용하여 표본에서 항-약물 항체가 단량체 또는 올리고머 형태인지 측정하는 방법이다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iv) 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
b-v) 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
c) b-i) 은 양성 면역검정법을 이용하고,
α) b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하거나,
β) b-ii), b-iii), b-iv) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에서 항-약물 항체가 단량체 형태인지 측정하거나,
b-i) 은 양성 면역검정법을 이용하고,
α) b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하거나,
β) b-iii) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에서 항-약물 항체가 올리고머 형태인지 측정하는 단계, 상기 열거되지 않은 기타 모든 면역검정법은 양성임.
본 발명의 다른 양태는 하기 단계를 포함하는, 면역검정법을 이용하여 표본에서 올리고머 항-약물 항체의 존재를 측정하는 방법이다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iv) 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
b-v) 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
c) b-i), b-iii) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iv) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에서 항-약물 항체가 올리고머 형태인지 측정하는 단계.
본 발명의 추가 양태는 하기 단계를 포함하는, 면역검정법을 이용하여 표본에서 측정된 항-약물 항체의 부류를 측정하는 방법이다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iv) 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
b-v) 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
c) b-i), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 항-약물 항체의 부류가 단량체 및 약물 항체 특이적 항-약물 항체인지 측정하거나,
b-i), b-ii), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 항-약물 항체의 부류가 올리고머 및 약물 항체 특이적 항-약물 항체인지 측정하거나,
b-i), b-ii) 및 b-iv) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 항-약물 항체의 부류가 올리고머 및 비-약물 항체 특이적 항체인지 측정하거나,
b-i) 은 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii), b-iii), b-iv) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 항-약물 항체의 부류가 단량체 및 비-약물 항체 특이적 항체인지 측정하는 단계.
하나의 구현예에서, 항-약물 항체의 부류는 하기 표에 따라 측정된다:
Figure 112010038078214-pct00001
본 발명의 최종 양태는 하기 단계를 포함하는, 면역검정법을 이용하여 표본에서 단량체 항-약물 항체의 존재를 측정하는 방법이다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iv) 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
b-v) 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
c) b-i), b-ii) 및 b-iv) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에서 항-약물 항체가 단량체 형태인지 측정하는 단계.
본 발명의 양태에 대한 하나의 구현예에서, 면역검정법은 포획 약물 항체 및 추적 약물 항체를 포함하는 이중 항원 가교 면역검정법이다. 본 발명의 양태에 대한 다른 구현예에서, 약물 항체는 염증 질환 치료를 위한 항체이다. 하나의 구현예에서, 염증 질환 치료를 위한 항체는 류마티스 관절염 또는 퇴행성 관절염 치료를 위한 항체이다. 다른 구현예에서, 염증 질환 치료를 위한 항체는 IL-6 수용체, IGF-1 수용체, IL-13 수용체 1 알파에 대한 항체이다. 본 발명의 양태에 대한 하나의 구현예는 포획 약물 항체가 고체상과 접합하는 항체 부위가 상이한 둘 이상의 약물 항체를 포함하는 약물 항체의 혼합물이고, 추적 약물 항체는 검출가능한 표지와 접합하는 항체 부위가 상이한 둘 이상의 약물 항체를 포함하는 약물 항체의 혼합물인 것을 포함한다. 추가 구현예에서, 약물 항체와 이의 접합 상대의 접합이 약물 항체의 아미노산 골격의 N-말단 및/또는 ε-아미노 기(라이신), 상이한 라이신의 ε-아미노 기, 카르복시-, 설프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀 관능기, 및/또는 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통한 화학적 결합에 의해 달성된다. 본 발명의 양태에 대한 구현예에서, 포획 약물 항체 혼합물 또는 추적 약물 항체 혼합물은 아미노기를 통해 접합 상대와 접합하는 약물 항체 및 탄수화물 구조를 통해 접합 상대와 접합하는 약물 항체를 포함한다. 추가 구현예에서, 포획 약물 항체와 고체상의 접합이 수동 흡착에 의해, 또는 특이적 결합 쌍을 통해 수행된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 특이적 결합 쌍 (제1 성분/제2 성분)은 스트렙타비딘 또는 아비딘/비오틴, 또는 항체/항원(예를 들어, Hermanson, G.T., 등, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996 참조), 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 등으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 포획 약물 항체는 비오틴과 접합하고 고체상과의 접합은 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 수행된다. 본 발명의 양태에 대한 하나의 구현예에서, 방법은 단계 b) 후, 추가 단계 ba), 즉 단계 b) 에서 표본과 접촉된 포획 약물 항체를 상기 추적 약물 항체와 접촉시키고, 검출가능한 표지를 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명의 양태에 대한 또 다른 구현예에서, 추적 약물 항체가 특이적 결합 쌍을 통해 검출가능한 표지와 접합한다. 하나의 구현예에서, 추적 약물 항체가 디곡시제닌과 접합하고, 검출가능한 표지와의 결합은 디곡시제닌에 대한 항체를 통해 수행된다. 본 발명의 양태의 다른 구현예에서, 포획 약물 항체 대 추적 약물 항체의 비는 1:10 내지 50:1이다 (이 비는 상이할 수 있는 접합체의 분자량과 관계없이 항체 분자의 비를 의미함).
본 발명의 다른 양태는 하기를 포함하는, 표본에서 약물 항체에 대한 항-약물 항체를 측정하는 키트이다:
a) 스트렙타비딘 코팅된 마이크로타이터 플레이트,
b) 약물 항체와 비오틴의 접합을 위한 시약,
c) 약물 항체와 디곡시제닌의 접합을 위한 시약,
d) 호스라디시 페록시다제(horseradish peroxidase) 접합 항-디곡시제닌 항체,
e) 상기 약물 항체의 올리고머화를 위한 시약,
f) 단량체 형태의 인간 면역글로불린 G, 및
g) 올리고머 형태의 인간 면역글로불린 G.
본 발명의 추가 양태는 하기 단계를 포함하는, 포획 약물 항체 및 추적 약물 항체를 포함하는 이중 항원 가교 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 약물 항체 (항-약물 항체) 에 대한 항체 종류를 측정하는 방법이다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iv) 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
b-v) 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
c) b-i), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 특이적, 단량체 항-약물 항체인지 측정하거나,
b-i), b-ii), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 특이적, 올리고머 항-약물 항체인지 측정하거나,
b-i), b-ii) 및 b-iv) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 비특이적, 올리고머 항-인간 IgG 항체인지 측정하거나,
b-i), b-ii), b-iii), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 비특이적 항체인지 측정하거나,
b-i) 은 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii), b-iii), b-iv) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 비특이적, 단량체 항-인간 IgG 항체인지 측정하는 단계.
발명의 상세한 설명
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 포획 약물 항체 및 추적 약물 항체를 포함하는 면역검정법을 이용하여 표본에서 약물 항체에 대한 항체를 측정하는 방법을 제시한다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-iii) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
c) b-i) 은 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 표본에서 약물 항체에 대한 항체를 측정하는 단계.
본 발명에 따른 용어 "약물 항체"는 개체에 투여될 수 있는 항체를 의미하므로, 상기 개체의 표본이 투여 후 상기 약물 항체를 포함한다고 추정된다. 본 발명에 따라 수행된 하나의 검정법에서, 약물 항체, 포획 약물 항체 및 추적 약물 항체는 예를 들어, 동일한 발현 벡터를 사용하여 재조합적으로 제조한, 동일한 아미노산 서열을 포함하는 "동일한" 항체 분자를 포함한다. 약물 항체 (치료적 단일클론 항체) 는 종양 질환과 같은 다양한 질환 (예컨대, 비-호치킨(Hodgkin) 림프종, 유방암 및 결장직장암을 비롯한 혈액 및 고형 악성종양)의 치료에 널리 사용되고 있다. 이러한 항체는 예를 들어 [Levene, A.P., 등, Journal of the Royal Society of Medicine 98 (2005) 146-152]; [Groner, B., 등, Curr. Mol. Meth. 4 (2004) 539-547]; 및 [Harris, M., Lancet Oncol. 5 (2004) 292-302] 에 기재되어 있다. 이러한 항체는 예를 들어, CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250, GD3, HER2, PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, 레비스(Levis) Y 항원, IL-6 수용체, IGF-1 수용체 또는 또는 IL-13 수용체 1 알파에 대한 항체이다. 하나의 구현예에서, 상기 약물 항체는 염증 질환 치료에 유용한 항체, 즉 항-염증성 항체, 예컨대 항-IL-6 수용체 항체, 또는 항-IGF-1 수용체 항체, 또는 항-IL-13 수용체 1 알파 항체이다.
예시적인 (바람직하게는 단일클론) 항체는 IL-6 수용체에 대한 항체 (mAb IL-6R) 이다. 이러한 항체는 예를 들어, [Mihara 등, Clin. Immunol. 98 (2001) 319-326; Nishimoto, N., 등, Blood 106 (2005) 2627-2632]; 임상 시험 NCT00046774 또는 WO 2004/096274 에 기재되어 있다.
예시적 (바람직하게는 단일클론) 항체는 IGF-1 수용체에 대한 항체 (mAb IGF-1R) 이다. 이러한 항체는 예를 들어, WO 2004/087756 또는 WO 2005/005635 에 기재되어 있다.
예시적인 (바람직하게는 단일클론) 항체는 IL-13 수용체 알파에 대한 항체 (이후, mAb IL-13Ra1 또는 mAb IL-13R 로 언급함) 이다. IL-13Ra1 에 대한 항체는 예를 들어 WO　96/29417, WO　97/15663, WO　03/080675, [Graber, P., 등, Eur. J. Immunol. 28 (1998) 4286-4298]; [Poudrier, J., 등, J. Immunol. 163 (1999) 1153-1161]; [Poudrier, J., 등, Eur. J. Immunol. 30 (2000) 3157-3164]; [Aikawa, M., 등, Cytokine 13 (2001) 75-84] 에 공지되어 있고, 예를 들어 R&D Systems Inc. (USA) 에서 시판된다. 추가 예시적인 IL-13Ra1 에 대한 항체는 WO　2006/072564 에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항-약물 항체" 는 약물 항체의 항원 영역을 향하는, 즉 상기 영역과 결합하는 항체를 나타낸다. 이러한 항원 영역은 약물 항체의 가변 영역, CDR, 불변 영역, 또는 글리코구조 (glycostructure) 일 수 있다. 하나의 구현예에서, 항-약물 항체는 상기 약물 항체의 CDR 영역 또는 CHO 세포, HEK 세포, Sp2/0 세포, 또는 BHK 세포와 같은 비-인간 세포에서 약물 항체의 재조합 제조로부터 생성되는 약물 항체의 2차 변형으로 향한다. 일반적으로 항-약물 항체는, 약물 항체가 투여되는 동물의 면역 체계에 의해 인식되는 약물 항체의 항원 영역으로 향한다. 상기 기재된 항체는 용어 "특이적 항-약물 항체" 이다. 약물 항체는 가능한 작은 항원 영역을 포함하는 것으로 설계된다. 예를 들어, 인간에 사용하기 위한 약물 항체는, 약물 항체에 대한 면역 반응의 발생을 최소화하기 위해서 인간 환자에게 적용하기 전에 인간화된다. 이러한 면역 반응은 예를 들어 가변 도메인에서 상보적 측정 영역과 같은 인간화 약물 항체의 비-인간 부분을 향하는 항-약물 항체의 유형일 수 있다 (예를 들어, Pan, Y., 등, FASEB J. 9 (1995) 43-49 참조).
용어 "항-인간 IgG 항체" 는 항체 부류 G 의 인간 또는 인간화 항체의 임의의 항원 영역을 향하는 인간 항체를 나타낸다. 상기 항-인간 IgG 항체는 "비-특이적 항-약물 항체" 의 예이다. 용어 "비-특이적 항-약물 항체" 는 본원 내에서 약물 항체와 결합할 뿐만 아니라, 다수의 다른 항체와 결합하는 항체, 예컨대 내생의 인간 항체를 의미하는데, 이는 약물 항체의 특이성을 측정하지 않는 통상의 항원 부위와 결합하기 때문이다.
항체는 단백질로서 예를 들어 아미노기 (라이신, 알파-아미노기), 티올기 (시스틴, 시스테인, 및 메티오닌), 카르복실산기 (아스파르트산, 글루탐산) 및 당-알코올기와 같은 많은 반응성 부분을 함유한다. 이들은 표면, 단백질, 중합체 (예컨대, PEG, 셀룰로스 또는 폴리스티롤), 효소, 또는 결합 쌍의 구성원과 같은 결합 상대와의 커플링을 위해 이용된다 (예를 들어, Aslam M., and Dent A., Bioconjugation, MacMillan Ref. Ltd. (1998) 50-100 참조).
단백질의 가장 흔한 반응성 기들 중 하나는 아미노산 라이신의 지방족 ε-아민이다. 일반적으로, 거의 모든 항체는 풍부한 라이신을 함유한다. 라이신 아민은 pH 8.0(pKa = 9.18) 초과의 상당히 양호한 친핵체이므로, 다양한 시약들과 용이하고 깨끗하게 반응하여 안정한 결합을 형성한다. 항체에서 다른 흔한 반응성 기는 황-함유 아미노산인 시스틴 및 이의 환원 생성물인 시스테인 (또는 절반 시스틴) 의 티올 잔기이다. 시스테인은 아민보다 더 강력한 친핵체이면서 일반적으로 단백질에서 가장 높은 반응성을 나타내는 관능기인 자유 티올 기를 함유한다. 티올은 일반적으로 중성 pH 에서 반응성을 나타내므로, 아민의 존재 하에 다른 분자와 선별적으로 커플링될 수 있다. 자유 설프히드릴 기는 비교적 반응성을 나타내므로, 자유 설프히드릴 기를 갖는 단백질은 종종 디설파이드 기 또는 디설파이드 결합으로서 산화된 형태의 상기 기들과 함께 존재한다. 시스틴 및 시스테인 외에, 일부 단백질은 또한 티오에테르 결합에서 황을 함유하는 아미노산 메티오닌을 갖는다. 문헌에는, 반응성 아미노 기를 통해 다수의 설프히드릴 기를 도입하는 효율적인 방법을 제공하는 데 있어서 여러 티올화 가교 시약, 예컨대 트라우트 시약(Traut's reagent)(2-이미노티올란), 석신이미딜(아세틸티오) 아세테이트(SATA) 및 설포석신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오) 프로피온아미도]헥사노에이트 (설포-LC-SPDP) 의 사용이 기재되어 있다. 반응성 에스테르, 특히 N-히드록시석신이미드(NHS) 에스테르는 아민 기의 변형에 가장 흔히 사용되는 시약 중 하나이다. 수성 환경에서 반응을 위한 최적 pH 는 pH 8.0 내지 9.0 이다. 이소티오시아네이트는 아민-변형 시약이고 단백질과의 티오우레아 결합을 형성한다. 이소티오시아네이트는 (pH 9.0 내지 9.5 에서 최적) 수성 용액 중에서 단백질 아민과 반응한다. 알데히드는 약한 수성 조건 하에 지방족 및 방향족 아민, 히드라진 및 히드라지드와 반응하여 이민 중간체(쉬프(Schiff) 염기)를 형성한다. 쉬프 염기는 약한 또는 강한 환원제 (예컨대, 수소화붕소나트륨 또는 시아노수소화붕소나트륨) 에 의해 선별적으로 환원되어 안정한 알킬 아민 결합을 유도할 수 있다. 아민을 변형시키는 데 사용되는 다른 시약은 산 무수물이다. 예를 들어, 무수 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 은 2 개의 아민-반응성 무수물 기를 함유하는 이작용성 킬레이트제이다. DTPA 는 단백질의 N-말단 및 ε-아민 기와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있다. 무수물 고리는 개환되어 배위 착물에서 금속에 강하게 결합할 수 있는 다가 금속-킬레이트 아암(arm)을 생성한다.
항체에서 흔한 기타 반응성 기는 카르복실산 기 (아스파르트산, 글루탐산)이다. 단백질은 C-말단 위치에, 및 아스파르트산 및 글루탐산의 측쇄 내에서 카르복실산 기를 함유한다. 접합을 위해, 카르복실산 기는 통상적으로 수용성 카르보디이미드의 사용에 의해 반응성 에스테르로 전환되고, 아민, 히드라지드 또는 히드라진과 같은 친핵성 시약과 반응한다. 아민-함유 시약은 단백질 상의 다른 아민의 존재 하에 활성화된 카르복실산과 선별적으로 반응하기 위해 약염기성을 나타내어야 한다. 단백질 가교는 pH 가 8.0 초과로 상승한 경우 발생할 수 있다.
과아이오딘산 나트륨은 탄수화물 부분 내의 당의 알코올 부분을 알데히드로 산화시키는 데 사용될 수 있다. 각각의 알데히드 기는 카르복실산에 대해 전술한 바와 같이 아민, 히드라지드 또는 히드라진과 반응할 수 있다. 탄수화물 부분이 항체의 결정성 절편(Fc) 영역 상에서 주로 발견되기 때문에, 접합은 항원-결합 부위에서 떨어져 있는 탄수화물의 부위-지정 변형을 통해 달성될 수 있다.
티올-반응성 시약은 단백질 상의 티올기와 커플링되어 티오에테르와 커플링된 생성물을 형성하는 시약이다. 이 시약은 약산성 pH 내지 중성 pH 에서 신속히 반응하므로, 아민 기의 존재 하에 선별적으로 반응할 수 있다. 할로아세틸 유도체 예컨대, 아이오도아세트아미드는 티오에테르 결합을 형성하고 티올 변형을 위한 시약이다. 항체에서, 이 반응은 내재적으로 존재하는 시스테인 기에서 일어나거나, 항체의 다양한 위치에서의 시스틴의 디설파이드의 환원으로부터 발생된 시스테인 기에서 일어난다. 추가로 유용한 시약은 말레이미드이다. 말레이미드와 티올-반응성 시약의 반응은 아이오도아세트아미드와 본질적으로 동일하다. 말레이미드는 약산성 pH 내지 중성 pH 에서 신속히 반응한다.
아민, 히드라지드 및 히드라진은 알데히드 및 카르복실산-반응성 시약 (아미드, 히드라존 또는 알킬 아민 결합의 형성) 이다. 아민, 히드라지드 및 히드라진은 카르복실기의 활성 후 수용성 카르보디이미드에 의해 단백질의 카르복실산과 커플링될 수 있다. 아민-함유 시약은 라이신의 꽤 높은 염기성 ε-아민의 존재 하에 카르보디이미드-활성화 단백질과 선별적으로 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성하도록 약염기성을 나타내어야 한다. 항체 상의 탄수화물 잔기의 과아이오딘산염 산화에 의해 항체 상에서 발생될 수 있는 알데히드 기와의 반응에 있어서, 쉬프 염기 중간체가 형성되는데, 상기 중간체는 시아노수소화붕소나트륨 (약한 및 선별적임) 또는 수소화붕소나트륨 (강함) 수용성 환원제를 사용하여 상기 중간체의 환원을 통해 알킬 아민으로 환원될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "표본" 은 살아있는 물체 또는 살아있었던 물체로부터의 임의의 양의 물질을 의미하나 이로 한정되지 않는다. 이러한 살아있는 물체는 인간, 마우스, 원숭이, 래트, 토끼 및 다른 동물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 물질은 임상 관용적으로 가장 널리 사용되는 표본 공급원인, 개체로부터 유래한 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "고체상" 은 비-유체 물질을 의미하고, 중합체, 금속 (상자성 또는 강자성 입자), 유리 및 세라믹과 같은 물질로 만들어진 (미세입자 및 비드를 포함하는) 입자; 실리카, 알루미나 및 중합체 겔과 같은 겔 물질; 중합체, 금속, 유리 및/또는 세라믹으로 만들어질 수 있는 모세관; 제올라이트 및 기타 다공성 물질; 전극; 마이크로타이터 플레이트; 고체 스트립; 및 큐빗, 튜브 또는 다른 분광계 표본 용기를 포함한다. 검정법의 고체상 성분은 "고체상"이 포획 약물 항체와 상호작용하기 위한, 고체상 표면의 하나 이상의 부분을 함유한다는 점에서 상기 검정법이 접촉할 수 있는 불활성 고체 표면과 구별된다. 고체상은 튜브, 스트립, 큐빗 또는 마이크로타이터 플레이트와 같은 정적 성분일 수 있거나, 비드 및 미세입자와 같은 비-정적 성분일 수 있다. 미세입자는 균일한 검정법 형식을 위한 고체상으로서 사용될 수도 있다. 단백질 및 다른 물질의 비-공유 또는 공유 부착을 허용하는 다양한 미세입자가 사용될 수도 있다. 이러한 입자는 폴리스티렌 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 와 같은 중합체 입자; 금 나노입자 및 금 콜로이드와 같은 금 입자; 및 실리카, 유리 및 금속 산화물 입자와 같은 세라믹 입자를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 참조인용되어 있는 [Martin, C.R., 등, Analytical Chemistry-News & Features, (1998) 322A-327A] 을 참조한다. 본 발명에 따른 면역검정법을 위한 고체 지지체는 당업계에 널리 기재되어 있다 (예를 들어 Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23 참조).
크로모겐 (형광 또는 발광 기 및 염료), 효소, NMR-활성 기 또는 금속 입자, 햅텐, 예를 들어, 디곡시제닌은 검출가능한 표지의 예이다. 검출가능한 표지는 광활성가능한 가교 기, 예를 들어 아지도 또는 아지린 기일 수도 있다. 전기화학발광에 의해 검출될 수 있는 금속 킬레이트도 검출가능한 신호-방출 기이고, 루테늄 킬레이트, 예를 들어, 루테늄 (비스피리딜)3 2+ 킬레이트가 특히 바람직하다. 적합한 루테늄 표지 기는 예를 들어, EP 0 580 979, 및 WO 90/005301, WO 90/11511 및 WO 92/14138 에 기재되어 있다.
표본에서, 측정되고자 하는 항체는 보통 문제의 항체보다 더 많이 함유되어 있다. 따라서, 측정하고자 하는 항체를 표본이 함유하지 않더라도, 면역검정법의 측정은 결과적으로 양성 면역검정법을 야기하는 것을 회피할 수 없다. 상기 검정법을 이용하기 위해서, 양성 면역검정법은 배제되거나 적어도 허용가능한 양, 예를 들어 모든 양성 면역검정법의 5 % 미만으로 감소되어야 한다.
현재 놀랍게도, 약물 항체에 대한 항체 (항-약물 항체, ADA) 를 측정하기 위한 방법에 의해 분석되고자 하는 표본의 양성 면역검정법은 약물 항체 및 비-특이적 항체로 분석되고자 하는 표본을 스파이크하고, 스파이크된 표본을 이용한 방법의 결과를 측정함으로써 확인될 수 있다는 것을 발견하였다.
본원 내에서 사용되는 바와 같은 용어 "스파이크된" 은 분석되고자 하는 표본에 보충의 물질을 첨가하는 것을 의미하는데, 이는 상기 표본에 이미 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 물질을 보충하는 것은, 상기 물질이 상기 표본에서 문제의 항-약물 항체의 농도를 초과하는 농도로 상기 표본에 존재하는 효과를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 보충의 물질은 항체이고, 다른 구현예에서는 약물 항체 또는 Fc-부분 특이적 항체, 예컨대 항-인간 IgG 항체이다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "항체" 는 전체 항체 및 항체 절편을 포함하는 다양한 형태의 항체 구조물을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 약물 항체는 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라성 항체, 또는 T 세포 항원 제거 항체이다 (예를 들어, WO 98/33523, WO 98/52976, 또는 WO 00/34317 참조). 항체 유전 공학은 예를 들어, [Morrison, S.L., 등, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 및 US 5,204,244; Riechmann, L., 등, Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., 등, Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125] 에 기재되어 있다.
"항체 절편" 은 완전한 항체와 동일한 항원과 결합할 능력을 유지한 완전한 항체의 절편을 의미한다. "완전한 항체" 는 두 개의 폴리펩티드 경쇄 및 두 개의 폴리펩티드 중쇄로 이루어진 항체이고, 이들 각각은 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다. "항체 접합" 은 항체와 추가의 폴리펩티드와의 접합을 의미한다. 항원의 결합은 추가의 폴리펩티드와의 접합에 의해 약해지지 않는다. "항체 절편" 은 전장 (full length) 항체의 일부, 바람직하게는 그의 가변적인 도메인 또는 적어도 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 항체 절편의 예는 이들이 항체의 결합 특징을 유지하는 한, 단쇄 항체 분자 (scFv), Fab, F(ab)2 절편 등이다. ScFv 항체는 예를 들어, [Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88] 에 기술되어 있다. Huston 은 또한, 본 발명에 유용한 폴리펩티드의 연결을 위한 연결자 및 방법을 기술한다.
항체의 "Fc 부분" 은 항원과의 결합에 직접 관여하지 않으나, 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역글로불린) 은 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 의 부류로 분류된다. 상기 부류 중 일부는 하위부류 (아이소타입) 로 추가 분류될 수 있는데, 즉 IgG 가 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 로 분류되거나, IgA 가 IgA1 및 IgA2 로 분류되는 바와 같다. 항체가 속한 면역글로불린 부류에 따르면, 면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 각각 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), 및 μ(IgM) 로 지칭된다. 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서의 약물 항체는 IgG 부류에 속한다. "항체의 Fc 부분" 은 당업자에게 잘 알려진 용어이고, 항체의 파파인 절단을 바탕으로 정의된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "항체" 는 실질적으로 항체 유전자에 의해 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 지칭한다. 항체를 구성하는 상이한 폴리펩티드는 폴리펩티드의 중량에 따라 폴리펩티드 경쇄 및 폴리펩티드 중쇄로 지칭된다. 인식되는 항체 유전자는 상이한 불변 영역 유전자뿐만 아니라 무수히 많은 항체 가변 영역 유전자를 포함한다. 항체는 예를 들어, 단일 중쇄 및 경쇄, Fv, Fab, 및 F(ab)2 뿐만 아니라 단일 사슬 (scFv) 을 비롯하여 다양한 형식으로 존재할 수 있다 (예를 들어. Huston, J.S., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., 등, Science 242 (1988) 423-426; 일반적으로 Hood, L., 등, Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984); Hunkapiller, T., and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16).
항체는 일반적으로 두 개의 폴리펩티드 경쇄 및 두 개의 폴리펩티드 중쇄를 포함한다. 각각의 폴리펩티드 중쇄 및 경쇄는, 항원과 상호작용할 수 있는 결합 도메인을 함유하는 가변 영역 (폴리펩티드 사슬의 아미노 말단 부분) 을 함유한다. 각각의 폴리펩티드 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 (폴리펩티드 사슬의 카르복실 말단 부분) 을 포함한다. 중쇄의 불변 영역은 항체와 i) Fc 감마 수용체 (FcgR) 를 포함하는 세포, 예컨대 포식 세포, 또는 ii) 신생아 Fc 수용체 (FcRn)(또는 Brambell 수용체로도 공지됨) 을 포함하는 세포와의 결합을 매개한다. 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인은 차례로 상이한 부분, 즉 4 개의 골격 영역 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (CDR) 을 포함한다.
비-인간 (예를 들어 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체 및 인간 항체로부터 유래한 부분 서열을 함유하는 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 인간 항체 (수용자 항체)로부터 유래하고, 상기 항체에서 과가변 영역의 잔기는 원하는 특이성 및 친화성을 갖는, 비-인간 종, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 또는 비-인간 영장류의 과가변 영역의 잔기 (공여자 항체) 로 대체된다 (예를 들어 Morrison, S.L., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US　5,202,238; US　5,204,244 참조). 일부 예에서, 인간 항체의 골격 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 게다가, 인간화 항체는 추가 변형, 예를 들어 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형은 수용자 또는 공여자 항체의 변종을 야기시키고, 이들은 동종이지만 상응하는 모 서열과 동일하지 않다. 항체 성능을 추가 개선하기 위해 상기 변형이 행해진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 통상적으로 두 개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 인간화 항체에서 모든 또는 실질적으로 모든 과가변 루프는 비-인간 공여자 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 수용자 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 또한 항체 불변 영역의 부분 이상, 통상적으로 인간 항체의 부분 이상을 임의로 포함할 것이다. 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 인간화 항체로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "이입 (import)" 잔기로 언급되며, 이는 통상적으로 "이입" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 근본적으로 비-인간 항체의 상응하는 서열에 대한 과가변 영역 서열을 대체함으로써, Winter 및 그의 동료들의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, "인간화" 항체는 실질적으로 결코 온전치 못한 인간 가변 도메인이 비-인간 종의 상응하는 서열에 의해 치환되는 항체이다. 실제로, 인간화 항체는 설치류 또는 비-인간 영장류 항체에서 유사한 부위의 잔기에 의해 일부 과가변 영역 잔기 및 가능한 일부 골격 영역 잔기가 치환되는 통상적인 인간 항체이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동질의 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 언급한다, 즉 상기 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 매우 특이적이며, 단독 항원 부위로 향한다. 더욱이, 상이한 항원 부위 (결정기 또는 에피토프) 에 향하는 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 항원 부위에 향한다. 그의 특이성 이외에, 상기 단일클론 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "단일클론" 은 실질적으로 동질의 항체의 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특징을 나타내는 것이고, 임의의 특정 방법에 의한 상기 항체의 제조를 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "단량체 형태의 항체" 는, 상기 항체가 동일한 특이성의 추가 항체 분자와 공유적 또는 비-공유적으로 연결되지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 항-IGF-1R 항체는 제2 항-IGF-1R 항체와 연결되지 않는다면 단량체 형태이다. 이는 상기 항-IGF-IR 항체가 예를 들어 항-IL-6R 항체와 같은 다른 항체와 공유적 또는 비-공유적으로 연결될 수 있음을 배제하지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "올리고머 형태의 항체" 는, 상기 항체가 동일한 특이성의 추가 항체 분자와 공유적 또는 비-공유적으로 연결된 것을 의미한다. 하나의 구현예에서, "올리고머 형태의 항체" 는 동일한 특이성의 추가 항체 분자 하나 이상과 공유적으로 연결된다. 예를 들어, 항-IGF-1R 항체는 적어도 제2 항-IGF-1R 항체와 연결된다면 올리고머 형태이다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "동일한 특이성" 은 두 개의 항체가 동일한 표적 분자인 동일한 항원과 결합하는 것을 의미한다. 이는 두 개의 항체가 상기 항원의 상이한 에피토프와 결합하는 것을 배제하지 않는다. 하나의 구현예에서, 올리고머 형태의 항체에 포함된 항체는 동일한 항원 및 동일한 에피토프와 결합한다. 다른 구현예에서, 올리고머 형태의 항체에 포함된 항체는 동일한 단일클론 항체이다.
본 발명의 제1 양태는 하기 단계를 포함하는, 포획 약물 항체 및 추적 약물 항체를 포함하는 면역검정법을 이용하여 표본에서 약물 항체에 대한 항체를 측정하는 방법이다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-iii) 과 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 면역검정법 전에 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
c) b-i) 은 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 표본에서 약물 항체에 대한 항체를 측정하는 단계.
상기 방법은, 항-약물 항체의 검출을 위한 면역검정법, 결과적으로 양성 면역검정법에서 간섭할 수 있는 문제의 항-약물 항체 이외의 항체를 표본이 함유한다면 특히 유용하다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 항-염증성 치료에 사용되는 약물 항체의 항-약물 항체의 측정에 유용하다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "항-염증성 치료에 사용되는 약물 항체" 는, 상기 약물 항체가 염증을 매개하는 세포 표면 수용체를 향하는 것을 의미한다. 상기 수용체는 예를 들어 IL-6 수용체, IGF-1 수용체, 또는 IL-13a 수용체 1 이다. 항-염증성 약물 항체로 치료된 대상으로부터의 표본을 분석한다면, 방법의 양성 결과가 표본의 항-약물 항체 또는 항-약물 항체 이외의 항체에 근거하는지 측정되어야 한다. 이런 경우의 예는 류마티즘과 같은 자기면역 질환을 갖는 대상으로부터의 표본이고, 따라서 상기 대상으로부터 얻은 표본은 소위 "류마티스 인자" 를 함유한다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "류마티스 인자" 는 인간 IgG, 더욱 정확하게는 인간 IgG 의 Fc-부분과 결합하는 항체를 의미한다. 대부분의 경우, 상기 "류마티스 인자" 는 올리고머 결합 분자이다.
그리하여, 놀랍게도 항-인간 IgG 항체의 간섭은 단량체 또는 올리고머 형태의 정의된 항체로 분석되고자 하는 표본을 스파이크하고, 스파이크된 표본으로 항-약물 항체를 측정하는 방법을 수행함으로써 측정되고, 면역검정법이 양성인지 아닌지를 측정하는 상이한 표본으로 수행된 방법의 결과에 근거할 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명의 다른 양태는, 하기 단계를 포함하는, 포획 약물 항체 및 추적 약물 항체를 포함하는 이중 항원 가교 면역검정법을 이용하여, 표본에 존재하는 항체가 항-약물 항체인지 항-인간 IgG 항체인지 측정하는 방법, 즉 표본에 존재하는 항체가 특이적 항-약물 항체인지 비-특이적 항-약물 항체인지 측정하는 방법이다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 면역검정법 전에 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iv) 면역검정법 전에 단량체 형태로 인간 IgG 가 첨가된 표본,
b-v) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 인간 IgG 가 첨가된 표본,
c) b-i), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 항-약물 항체인지 측정하거나,
b-i), b-ii) 및 b-iv) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 항-인간 IgG 항체인지 측정하는 단계.
본원에서 상호교환적으로 사용하는 용어 "양성 면역검정법" 및 "양성 면역검정법 결과" 는 상기 보충되지 않은 표본으로 수행된 면역검정법의 경우에서, 보충되지 않은 표본으로 수행된 면역검정법이 상기 면역검정법의 바탕 준위를 훨씬 초과하는 신호를 수득하는 것을 의미한다. 하나의 구현예에서, 상기 바탕 준위는 상기 면역검정법으로, 상기 약물 항체가 투여되지 않은 상이한 개체로부터의 다수의 표본을 측정함으로써 수득한 평균 신호 + 3 × 평균 값의 표준 편차, 즉 95　% 신뢰구간이다. 마찬가지로 본원에서 상호교환적으로 사용하는 용어 "음성 면역검정법" 및 "음성 면역검정법 결과" 는 상기 면역검정법의 바탕 준위 내, 즉 상기 면역검정법에서 임의의 항체가 없는 표본으로 수득된 신호의 표준 편차 × 3 내에서의 신호를 의미한다.
본원에서 상호교환적으로 사용하는 용어 "양성 면역검정법" 및 "양성 면역검정법 결과" 는 본원에서 사용되는 바와 같은 보충된 표본으로 수행된 면역검정법의 경우에서, 상기 보충된 표본으로 수행된 면역검정법이 하나의 구현예에서 보충되지 않은 표본으로 수행된 면역검정법의 경우에서의 신호의 50 % 이상, 다른 구현예에서 65 % 이상, 또 다른 구현예에서 80 % 이상의 상대적 신호를 수득하는 것을 의미한다. 용어 "음성 면역검정법" 은 본원에서 사용되는 바와 같은 보충된 표본으로 수행된 면역검정법의 경우에서, 상기 보충된 표본으로 수행된 면역검정법이 하나의 구현예에서 보충되지 않은 표본으로 수행된 면역검정법의 경우에서의 상기 신호의 50 % 미만, 다른 구현예에서 상기 신호의 65 % 미만, 또 다른 구현예에서 상기 신호의 80 % 미만의 상대적 신호를 수득하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 면역검정법은 하기 순서로 하기 단계를 포함한다:
a) 고체상과 접합된 포획 약물 항체를 상기 스파이크 되지 않았거나 스파이크된 표본과 접촉시키는 단계,
b) 표본과 접촉된 고체상과 접합된 포획 약물 항체를 추적 약물 항체와 접촉시키는 단계,
c) 추적 약물 항체와 접합된 검출가능한 표지를 검출함으로써 추적 약물 항체를 검출하는 단계.
임의의 세척 단계가 단계 a) 및 b), 와 b) 및 c) 사이에 포함될 수 있다.
"양성 면역검정법" 및 "양성 면역검정법 결과" 는
a) 표본에 함유된 항-약물 항체가 포획 약물 항체에 의해 고체상과 결합할 때,
b) 추적 약물 항체가 a) 의 착물과 결합할 때, 및
c) 추적 약물 항체의 검출가능한 표지가 직접, 또는 추가 결합 상대의 도움으로 검출될 때, 수득된다.
"음성 면역검정법" 및 "음성 면역검정법 결과" 의 경우, 상기 하나 이상의 나열된 기준을 충족하지 않는다.
본 발명의 제3 양태는 하기 단계를 포함하는, 비-특이적 항-약물 항체로부터 특이적 항-약물 항체를 식별하기 위해서, 항-인간 IgG 항체로부터 인간화 항-염증성 약물 항체에 대한 항-약물 항체를 표본에서 식별하는 방법이다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 면역검정법 전에 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iv) 면역검정법 전에 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
b-v) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
c) b-i), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 인간화 항-염증성 약물 항체에 대한 항-약물 항체를 측정하거나,
b-i), b-ii) 및 b-iv) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 항-인간 IgG 항체인지 측정하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태는 하기 단계를 포함하는, 표본에서 항-약물 항체가 단량체 또는 올리고머 형태인지 측정하는 방법이다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 면역검정법 전에 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iv) 면역검정법 전에 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
b-v) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
c) b-i), b-ii) 및 b-iv) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 및 b-v)는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에서 항-약물 항체가 단량체 형태인지 측정하거나,
b-i), b-iii) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iv) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에서 항-약물 항체가 올리고머 형태인지 측정하는 단계.
본 발명의 다른 양태는 하기 단계를 포함하는, 표본에서의 올리고머 항-약물 항체의 존재를 측정하는 방법이다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 면역검정법 전에 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iv) 면역검정법 전에 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
b-v) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
c) b-i), b-iii) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iv) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에서 항-약물 항체가 올리고머 형태인지 측정하는 단계.
본 발명의 다른 양태는 하기 단계를 포함하는, 표본에서의 단량체 항-약물 항체의 존재를 측정하는 방법이다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 면역검정법 전에 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iv) 면역검정법 전에 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
b-v) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
c) b-i), b-ii) 및 b-iv) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에서 항-약물 항체가 단량체 형태인지 측정하는 단계.
놀랍게도, 현재 단량체 및 올리고머 형태의 약물 항체뿐만 아니라 단량체 및 올리고머 형태의 인간 IgG 로 상기 표본을 보충하여 검정법 결과 패턴을 수득할 수 있고, 그로부터 그 결과의 부류를 측정할 수 있음을 발견하였고, 하기 표로 나타내었다:
Figure 112010038078214-pct00002
따라서, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 특이적 및 비특이적일 뿐만 아니라 단량체 및 올리고머 면역검정법 반응 또는 결과를 분류할 수 있다.
그리하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 포획 약물 항체 및 추적 약물 항체를 포함하는 면역검정법을 이용하여 표본에서 약물 항체에 대한 항체 측정의 양성 결과를 측정하는 방법을 추가 양태로서 포함한다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 면역검정법 전에 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iv) 면역검정법 전에 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
b-v) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
c) b-i), b-iii) 및 b-v) 는 양성 면역검정법에 의하고, b-ii) 및 b-iv) 는 음성 면역검정법에 의한 면역검정법을 이용하여 표본에서 약물 항체에 대한 항체 측정의 양성 결과를 측정하는 단계.
본 발명의 양태에 대한 하나의 구현예에서, 상기 면역검정법은 포획 약물 항체 및 추적 약물 항체를 사용하는 이중 항원 가교 면역검정법이다. 본 발명의 양태에 대한 다른 구현예에서, 상기 약물 항체는 염증 질환 치료를 위한 항체이다. 하나의 구현예에서, 염증 질환 치료를 위한 항체는 류마티스 관절염 또는 퇴행성 관절염 치료를 위한 항체이다. 다른 구현예에서, 염증 질환 치료를 위한 항체는 IL-6 수용체, IGF-1 수용체, IL-13 수용체 1 알파에 대한 항체이다. 본 발명의 양태에 대한 하나의 구현예에서, 포획 약물 항체는 고체상과 접합하는 항체 부위가 상이한 둘 이상의 약물 항체를 포함하는 약물 항체의 혼합물이고, 추적 약물 항체는 검출가능한 표지와 접합하는 항체 부위가 상이한 둘 이상의 약물 항체를 포함하는 약물 항체의 혼합물이다. 추가 구현예에서, 약물 항체와 이의 접합 상대와의 접합은 약물 항체의 아미노산 골격의 N-말단 및/또는 ε-아미노기(라이신), 상이한 라이신의 ε-아미노기, 카르복시-, 설프히드릴-, 히드록실- 및/또는 페놀 관능기, 및/또는 약물 항체의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통한 화학적 결합에 의해 달성된다. 본 발명의 양태에 대한 구현예에서, 포획 약물 항체 혼합물 또는 추적 약물 항체 혼합물은 아미노기를 통해 접합된 약물 항체 및 탄수화물 구조를 통해 접합 상대와 접합하는 약물 항체를 포함한다. 추가 구현예에서, 포획 약물 항체와 고체상과의 접합이 수동 흡착에 의해, 또는 특이적 결합 쌍을 통해 수행된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 특이적 결합 쌍 (제1 성분/제2 성분) 은 스트렙타비딘 또는 아비딘/비오틴, 또는 항체/항원(예를 들어, Hermanson, G.T., 등, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996 참조), 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 효소/기질, IgG/단백질 A 및/또는 G 이다. 하나의 구현예에서, 포획 약물 항체는 비오틴과 접합하고, 고체상과의 접합은 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 수행된다. 본 발명의 양태에 대한 또 다른 구현예에서, 추적 약물 항체가 특이적 결합 쌍을 통해 검출가능한 표지와 접합하고, 하나의 구현예에서, 추적 약물 항체가 디곡시제닌과 접합하고, 검출가능한 표지와의 결합은 디곡시제닌에 대한 항체를 통해 수행된다. 본 발명의 양태의 다른 구현예에서, 포획 약물 항체 대 추적 약물 항체의 비는 1:10 내지 50:1 이다 (이 비는 상이할 수 있는 접합체의 분자량과 관계없이 항체 분자의 비를 의미함).
본 발명의 다른 양태는 공급된 약물 항체, 특히 치료적 항체에 대한 면역 체계 반응의 종류를 측정하는 방법이다. 상기 방법을 이용하여, 검출된 항-약물 항체가 하기 중 하나인지 식별하는 것이 가능하다:
i) 특이적, 단량체 항-약물 항체,
ii) 특이적, 올리고머 항-약물 항체,
iii) 비특이적, 올리고머 항-인간 IgG 항체,
iv) 비특이적, 단량체 항-인간 IgG 항체, 또는
v) 비특이적 항체.
따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 포획 약물 항체 및 추적 약물 항체를 포함하는 이중 항원 가교 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 약물 항체에 대한 항체 (항-약물 항체) 종류를 측정하는 방법을 포함한다:
a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
b-i) 표본,
b-ii) 면역검정법 전에 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iii) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
b-iv) 면역검정법 전에 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
b-v) 면역검정법 전에 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
c) b-i), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 특이적, 단량체 항-약물 항체인지 측정하거나,
b-i), b-ii), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 특이적, 올리고머 항-약물 항체인지 측정하거나,
b-i), b-ii) 및 b-iv) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 비특이적, 올리고머 항-인간 IgG 항체인지 측정하거나,
b-i), b-ii), b-iii), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 비특이적 항체인지 측정하거나,
b-i) 은 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii), b-iii), b-iv) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 비특이적, 단량체 항-인간 IgG 항체인지 측정하는 단계.
하기 실시예, 참고문헌 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된 것이고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구의 범위에 기재되어 있다. 본 발명의 정신을 벗어나지 않으면서 전술한 방법은 변형될 수 있음으로 이해된다.
도 1 항-약물 항체의 검출을 위한 가교 검정법:
비오틴화 약물 항체 (포획-BI) 는 스트렙타비딘-코팅된 마이크로타이터 플레이트 (SA-MTP) 와 결합한다; 항-약물 항체는 포획 약물 항체 (포획-BI; BI=비오틴화) 와 디곡시제닌-표지된 추적 약물 항체 (추적-DIG; DIG=디곡시제닐화) 가 가교한다; 고정된 착물은 다중클론성 항-디곡시제닌 호스라디시 페록시다제 접합 (DIG-pAb-POD) 에 의해 검출된다; 다중클론성 토끼 항-약물 항체 (rpAb) 는 표준으로서 사용된다.
실시예
실시예 1
D- 비오틴오일 - 아미노카프로산 -N- 히드록시석신이미드 에스테르를 사용한 항체 mAb IL -6R 의 비오틴화
IL-6 수용체에 대한 항체 (mAb IL-6R) 를 완충액 (pH 8.5 의 100 mM 인산칼륨 완충액 (하기에서 K-PO4 로 기재되어 있음)) 에 대해 투석하였다. 그 후, 상기 용액을 10 mg/㎖ 의 단백질 농도로 조절하였다. D-비오틴오일-아미노카프로산-N-히드록시석신이미드 에스테르를 DMSO 에 용해시키고 1:5의 몰 비로 항체 용액에 첨가하였다. 60 분 후, L-라이신을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 150 mM NaCl 로 보충된 pH 7.5의 25 mM K-PO4 에 대해 투석함으로써 과량의 표지 시약을 제거하였다.
실시예 2
시트라콘산 무수물을 사용하여 처리 후 D- 비오틴오일 - 아미노카프로산 -N- 히드 록시석신이미드 에스테르를 사용한 mAb IL -6R 의 비오틴화
mAb IL-6R 을 pH 8.4 의 100 mM K-PO4 에 대해 투석하였다. 그 후, 상기 용액을 20 mg/㎖ 의 단백질 농도로 조절하였다. 시트라콘산 무수물을 DMSO 에 용해시키고 1:5 의 몰 비로 항체 용액에 첨가하였다. 120 분 후, pH 8.4 의 100 mM K-PO4 로 평형화시킨 Sephadex® G25 를 사용한 컬럼 상의 크로마토그래피로 반응을 중지시켰다. 항체 용액을 약 4 mg/㎖ 의 단백질 농도로 조절하였다. D-비오틴오일-아미노카프로산-N-히드록시석신이미드 에스테르를 DMSO 에 용해시키고 1:5 의 몰 비로 항체 용액에 첨가하였다. 60 분 후, L-라이신을 첨가하여 반응을 중지시켰다. pH 5.0 의 200 mM 아세트산나트륨 완충액에 대해 투석함으로써 과량의 표지 시약을 제거하였다. Sephadex®G25 를 사용한 컬럼 상의 크로마토그래피를 이용하여, 항체 용액을 150 mM NaCl 로 보충된 pH 7.2 의 25 mM K-PO4 로 옮겼다.
실시예 3
비오틴 히드라지드를 사용한 mAb IL -6R 의 비오틴화
mAb IL-6R 을 pH 5.5 의 100 mM 아세트산나트륨 완충액에 대해 투석하였다. 그 후, 상기 용액을 20 mg/㎖ 의 단백질 농도로 조절하였다. 과아이오딘산 나트륨을 pH 5.5 의 100 mM 아세트산나트륨 완충액에 용해시키고 항체 용액에 첨가하였고, 최종 농도는 10 mM 이었다. 30분 후, pH 5.5 의 100 mM 아세트산나트륨 완충액으로 평형화시킨 Sephadex® G25 컬럼 상의 크로마토그래피로 반응을 중지시켰다. 항체 용액을 약 5 mg/㎖ 의 단백질 농도로 조절하였다. 비오틴 히드라지드를 DMSO 에 용해시키고 1:50 의 몰 비로 항체 용액에 첨가하였다. 120 분 후, 수소화붕소나트륨을 첨가하여 반응을 중지시키고 최종 농도는 15 mM 이었다. 30 분 후, 항체 용액을 150 mM NaCl 로 보충된 pH 7.2 의 25 mM K-PO4 에 대해 투석하였다.
실시예 4
디곡시제닌 3-O- 메틸카르보닐 -ε- 아미노카프로산 -N- 히드록시석신이미드 에스테르를 사용한 mAb IL -6R 의 디곡시제닐화
mAb IL-6R 을 디곡시제닐화 완충액 (pH 8.5 의 100 mM K-PO4) 에 대해 투석하였다. 그 후, 상기 용액을 10 mg/㎖ 의 단백질 농도로 조절하였다. 디곡시제닌 3-O-메틸카르보닐-ε-아미노카프로산-N-히드록시석신이미드 에스테르를 DMSO 에 용해시키고 1:5 의 몰 비로 항체 용액에 첨가하였다. 60 분 후, L-라이신을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 150 mM NaCl 로 보충된 pH 7.5 의 25 mM K-PO4 에 대해 투석함으로써 과량의 표지 시약을 제거하였다.
실시예 5
시트라콘산 무수물을 사용하여 처리한 후 디곡시제닌 3-O- 메틸카르보닐 -ε-아미노카프로산-N- 히드록시석신이미드 에스테르를 사용한 mAb IL -6R 의 디곡시제닐화
mAb IL-6R 을 pH 8.4 의 100 mM K-PO4 에 대해 투석하였다. 그 후, 상기 용액을 20 mg/㎖의 단백질 농도로 조절하였다. 시트라콘산 무수물을 DMSO 에 용해시키고 1:5 의 몰 비로 항체 용액에 첨가하였다. 120 분 후, pH 8.4의 100 mM K-PO4 로 평형화시킨 Sephadex® G25 를 사용한 컬럼 상에서 크로마토그래피로 반응을 중지시켰다. 항체 용액을 약 4 mg/㎖의 단백질 농도로 조절하였다. 디곡시제닌 3-O-메틸카르보닐-ε-아미노카프로산-N-히드록시석신이미드 에스테르를 DMSO 에 용해시키고 1:5 의 몰 비로 항체 용액에 첨가하였다. 60 분 후, L-라이신을 첨가하여 반응을 중지시켰다. pH 5.0 의 200 mM 아세트산나트륨 완충액에 대해 투석함으로써 과량의 표지 시약을 제거하였다. Sephadex® G25 를 사용한 컬럼 상에 크로마토그래피를 이용하여 항체 용액을, 25 mM K-PO4 및 150 mM NaCl 을 함유한 pH 7.2 의 완충액으로 옮겼다.
실시예 6
디곡시제닌 -X- 히드라지드를 사용한 mAb IL -6R 의 디곡시제닐화
mAb IL-6R 을 pH 5.5 의 100 mM 아세트산나트륨 완충액에 대해 투석하였다. 그 후, 상기 용액을 20 mg/㎖ 의 단백질 농도로 조절하였다. 과아이오딘산 나트륨을 pH 5.5 의 100 mM 아세트산나트륨 완충액에 용해시키고 항체 용액에 첨가하고 최종 농도는 10 mM 이었다. 30 분 후, pH 5.5 의 100 mM 아세트산나트륨 완충액으로 평형화시킨 Sephadex®G25 컬럼 상에 크로마토그래피로 반응을 중지시켰다. 항체 용액을 약 5 mg/㎖ 의 단백질 농도로 조절하였다. 디곡시제닌-X-히드라지드를 DMSO 에 용해시키고 1:50 의 몰 비로 항체 용액에 첨가하였다. 120 분 후, 수소화붕소나트륨을 첨가하여 중지시키고 최종 농도는 15 mM 이었다. 30 분 후, 항체 용액을 150 mM NaCl 로 보충된 pH 7.2 의 25 mM K-PO4 에 대해 투석하였다.
실시예 7
a) 올리고머 형태의 약물 항체의 발생
재조합 약물 항체 (IgG), 예를 들어 항-IL-6R 항체, 항-IGF-1R 항체, 또는 항-IL-13R 항체를 100 mM NaCl 로 보충된 pH 8.4 의 150 mM 인산칼륨 완충액에 대해 투석하고, 그 후 항체 용액을 55 mg/㎖ 의 항체 농도로 농축하였다. 디석신이미딜수베레이트 (DSS) 를 DMSO 에 용해시키고, 1:7 (IgG:DSS) 의 몰 비로 항체 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 25　℃ 및 pH 8.4 에서 교반하면서 인큐베이션시키고, 분석 겔 여과 크로마토그래피 (예를 들어, TSK 4000 컬럼 사용) 를 이용하여 반응물을 분석하였다. 라이신을 첨가하여 60 분 후 중합을 중지시키고, 최종 농도는 10　mM 이었다. 25　℃ 에서 인큐베이션 45 분 후, 겔 여과 (예를 들어, Sephacryl S400 컬럼 사용)로 중합된 약물 항체를 분리시켜 저분자 분획을 제거하였다.
b) 올리고머 형태의 인간 IgG 의 발생
이온 교환 크로마토그래피에 의해 인간 혈청으로부터 정제된 인간 IgG 를 100 mM NaCl 를 함유하는 pH 8.4 의 150 mM 인산 칼륨 완충액에 대해 투석하고, 단백질 용액을 75　mg/㎖ 의 단백질 농도로 농축시켰다. 디석신이미딜수베레이트 (DSS) 를 DMSO 중에 용해시키고, 1:5 (IgG:DSS) 의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 25　℃ 및 pH 8.4 에서 교반하면서 인큐베이션시키고, 분석 겔 여과 컬럼 (예를 들어 TSK 4000 컬럼을 이용함) 을 이용하여 반응물을 분석하였다. 60 분 후 라이신을 첨가하여 중합을 중지시키고, 최종 농도는 10 mM 이었다. 25　℃ 에서의 인큐베이션 45 분 후, 올리고머 인간 IgG 를 겔 여과 (예를 들어, Sephacryl S400 컬럼 사용) 를 이용하여 분리시키고 저분자 분획을 제거하였다.
실시예 8
검정법 원리
ELISA 는 항-약물 항체 (ADA) 를 함유하는 표본의 포획을 위한 스트렙타비딘 마이크로타이터 플레이트 (SA-MTP) 상에 고정된 약물 항체 (포획-BI) 를 이용한다. 포획된 ADA 는 디곡시제닐화 약물 항체 (추적-DIG) 로 검출된다. ADA 와 추적-DIG 의 결합 착물은 기질 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산)) 과 반응하는 페록시다제-접합 다중클론성 항-DIG 항체에 의해 검출되고, 이어서 광도 측정 (photometric) 의 판독을 한다. 광학 밀도 (OD) 는 405 nm (490 nm 참고파장 이용) 에서 측정된다. 표준 곡선의 측정의 경우, 표본은 정의된 농도에서 항-약물 항체의 용액으로 대체된다. 최고 표준 농도는 1.8-2.2 AU 의 OD 값에 도달해야 한다.
제1 단계에서, 1:20 으로 희석한 모든 표본을 시험함으로써 항-약물 항체 (ADA) 에 대한 양성 또는 음성에 대해 모든 표본을 스크리닝하였다 (스크리닝 검정법; 예/아니오 응답). 검정법 반응, 즉 블랭크 혈청 표본의 복합 분석으로부터의 광학 밀도 (OD) 를 이용하여 95　% 신뢰구간에서 양성/음성 컷-포인트(cut-point) 를 측정하였다.
제2 단계에서, 최대 4 개의 추가 식별 단계를 이용하여 모든 양성 표본을 재시험하여 반응을 특징화하였다(예를 들어, 약물-특이성):
i) 스파이크 되지 않은 표본,
ii) 단량체 형태의 약물 항체 1　㎛/㎖ 로 표본을 스파이크하는 단계,
iii) 올리고머 형태의 약물 항체 1　㎛/㎖ 로 표본을 스파이크하는 단계,
iv) 단량체 형태의 인간 IgG 1　㎛/㎖ 로 표본을 스파이크하는 단계,
v) 올리고머 형태의 인간 IgG 1　㎛/㎖ 로 표본을 스파이크하는 단계.
식별 단계에서, 마이크로타이터 플레이트에 적용시키기 전에, 4 개의 식별 단계에 대해 상기 기재한 바와 같이 용액 ii) 내지 v) 로 표본을 각각 인큐베이트시키는 것을 제외하고는, 상기 기재한 바와 같이 ELISA 를 다시 수행하였다 (스크리닝 검정). 스파이크된 물질은 표본의 물질 (예를 들어, ADA) 와 결합하기 위해 포획-BI 와 경쟁한다. 스파이크되지 않은 표본의 검정 신호는 검정법의 다이나믹 레인지 (dynamic range) 내에 있어야 하고, 그렇지 않으면 표본은 추가 희석되어야 한다. 상기 최종 표본-희석물은 또한 모든 식별 단계에 사용되어야 한다. 스파이크된 시약 (ii)-v)) 의 존재로 인해 흡광도의 감소가 20　% 미만이면, 시험 결과는 "양성" (양성 면역검정법) 으로 여겨졌다. 흡광도의 감소가 20 % 이상이면, 시험 결과는 "음성" (음성 면역검정법) 으로 여겨졌다. 즉, 신호 복원이 80　% 초과이면, 시험 결과는 "양성" (양성 면역검정법) 으로 여겨지고, 신호 복원이 80　% 미만이면, 시험 결과는 "음성" (음성 면역검정법) 으로 여겨졌다.
실시예 9
항- IL -6R-항체 항체의 검출을 위한 ELISA
실시예 8 에 따라 검정법을 수행하였다. 예외: (스파이크 되었거나 되지 않은) 표본을 1 시간 동안 약물-DIG 로 예비-인큐베이션시켰다. 하기 표 1 에 결과를 나타내었다.
항-IL-6R-항체 항체의 검출을 위한 ELISA 의 결과
　 약물 항체 비특이적, 올리고머 반응 약물 항체 비특이적 반응 약물 항체 비특이적, 올리고머 반응 약물 항체 특이적, 단량체 반응 약물 항체 특이적, 단량체 반응 약물 항체 비특이적, 단량체 반응
스파이크되지 않은 표본
+
+
+
+
+
+
스파이크된 표본에서의 복원된 신호
[ % ]
[ % ]
[ % ]
[ % ]
[ % ]
[ % ]
ii) 단량체 형태의 항-IL-6R 항체
96.5
+
95.1
+
93.2
+
27.9
-
2.88
-
63.3
-
iii) 올리고머 형태의 항-IL-6R 항체
41.1
-
92.0
+
12.2
-
15.3
-
BLQ
-
12.1
-
iv) 단량체 형태의 인간 IgG 항체
91.9
+
103.9
+
88.9
+
90.8
+
107.0
+
73.0
-
v) 올리고머 형태의 인간 IgG 항체
41.9
-
98.3
+
14.9
-
93.7
+
100.0
+
22.5
-
BLQ = 수량화의 한계 미만
실시예 10
항- IGF -1R 항체 항체의 검출을 위한 ELISA
실시예 8 에 따라 검정법을 수행하였다. 하기 표 2 에 결과를 나타내었다.
항- IGF -1R 항체 항체의 검출을 위한 ELISA 의 결과
　 약물 항체 비특이적 반응 약물 항체 특이적, 올리고머 반응 (IgM) 약물 항체 특이적, 단량체 반응 (IgG)
스파이크되지 않은 표본 + + +
스파이크된 표본에서의 복원된 신호
[ % ]
[ % ]
[ % ]
ii) 단량체 형태의 항-IGF-1R 항체 91.4
+		 89.5
+		 0.90
-
iii) 올리고머 형태의 항-IGF-1R 항체 82.7
+		 62.4
-		 0.32
-
iv) 단량체 형태의 인간 IgG 항체 109.1
+		 94.4
+		 95.2
+
v) 올리고머 형태의 인간 IgG 항체 111.2
+		 96.1
+		 97.4
+
실시예 11
항- IL -13R-항체 항체의 검출을 위한 ECLIA
실시예 8 에 따라 검정법을 수행하였다. 예외: 이는 검출 방법으로서 전기화학발광 (electro-chemiluminescence) 을 이용하는 검정법이다. 이는 디곡시제닐화 약물 항체 및 페록시다제-접합된 항-DIG 항체 대신에 추적-DIG 로서 루테늄-표지된 약물 항체를 사용하는 것을 의미한다. 하기 표 3 에 결과를 나타내었다.
항- IL -13R-항체 항체의 검출을 위한 ECLIA 의 결과
　 약물 항체 비특이적, 단량체 반응 약물 항체 비특이적, 단량체 반응 약물 항체 특이적, 단량체 반응
스파이크되지 않은 표본 + + +
신호 복원 [ % ] [ % ] [ % ]
b-ii) 단량체 형태의 항-IL-13Ra1 항체 3.96
-		 10.87
-		 0.08
-
b-iii) 올리고머 형태의 항- IL-13Ra1 항체 BLQ
-		 BLQ
-		 0.20
-
b-iv) 단량체 형태의 인간 IgG 항체 BLQ
-		 0.61
-		 90.84
+
b-v) 올리고머 형태의 인간 IgG 항체 BLQ
-		 BLQ
-		 85.35
+
BLQ = 수량화의 한계 미만.

Claims (23)

  1. 하기 단계를 포함하는, 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 특이적 항-약물 항체인지 비-특이적 항-약물 항체인지 측정하는 방법:
    a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
    a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
    a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
    b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
    b-i) 표본,
    b-ii) 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
    b-iii) 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
    b-iv) 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
    b-v) 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
    c) b-i), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 특이적 항-약물 항체인지 측정하거나,
    b-i), b-ii) 및 b-iv) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 비-특이적 항-약물 항체인지 측정하는 단계.
  2. 하기 단계를 포함하는, 면역검정법을 이용하여 항-인간 IgG 항체로부터 인간화 항-염증성 약물 항체에 대한 항-약물 항체를 표본에서 식별하는 방법:
    a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
    a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
    a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
    b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
    b-i) 표본,
    b-ii) 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
    b-iii) 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
    b-iv) 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
    b-v) 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
    c) b-i), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 인간화 항-염증성 약물 항체에 대한 항-약물 항체를 측정하거나,
    b-i), b-ii) 및 b-iv) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 항-인간 IgG 항체인지 측정하는 단계.
  3. 하기 단계를 포함하는, 면역검정법을 이용하여 표본에서 항-약물 항체가 단량체 또는 올리고머 형태인지 측정하는 방법:
    a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
    a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
    a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
    b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
    b-i) 표본,
    b-ii) 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
    b-iii) 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
    b-iv) 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
    b-v) 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
    c) b-i) 은 양성 면역검정법을 이용하고,
    α) b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하고, b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하거나,
    β) b-ii), b-iii), b-iv) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에서 항-약물 항체가 단량체 형태인지 측정하거나,
    b-i) 은 양성 면역검정법을 이용하고,
    α) b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하고, b-ii), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하거나,
    β) b-iii) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iv) 는 양성 면역검정법을 이용하여 표본에서 항-약물 항체가 올리고머 형태인지 측정하는 단계.
  4. 하기 단계를 포함하는, 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 약물 항체에 대한 항체 종류를 측정하는 방법:
    a) 하기 a-i) 및 a-ii) 를 제공하는 단계:
    a-i) 고체상과 접합하는 포획 약물 항체,
    a-ii) 검출가능한 표지와 접합하는 추적 약물 항체,
    b) 상기 포획 약물 항체를 하기 b-i) ~ b-v) 와 각각 접촉시키는 단계:
    b-i) 표본,
    b-ii) 단량체 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
    b-iii) 올리고머 형태로 상기 약물 항체가 첨가된 표본,
    b-iv) 단량체 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
    b-v) 올리고머 형태로 인간 면역글로불린 G 가 첨가된 표본,
    c) b-i), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii) 및 b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 특이적, 단량체 항-약물 항체인지 측정하거나,
    b-i), b-ii), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 은 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 특이적, 올리고머 항-약물 항체인지 측정하거나,
    b-i), b-ii) 및 b-iv) 는 양성 면역검정법을 이용하고, b-iii) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 비특이적, 올리고머 항-인간 IgG 항체인지 측정하거나,
    b-i), b-ii), b-iii), b-iv) 및 b-v) 는 양성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 비특이적 항체인지 측정하거나,
    b-i) 은 양성 면역검정법을 이용하고, b-ii), b-iii), b-iv) 및 b-v) 는 음성 면역검정법을 이용하여 표본에 존재하는 항체가 비특이적, 단량체 항-인간 IgG 항체인지 측정하는 단계.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역검정법이 포획 약물 항체 및 추적 약물 항체를 포함하는 이중 항원 가교 면역검정법인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 항체가 염증 질환 치료를 위한 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 염증 질환 치료를 위한 항체가 류마티스 관절염 또는 퇴행성 관절염의 치료를 위한 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 염증 질환 치료를 위한 항체가 IL-6 수용체, IGF-1 수용체, 또는 IL-13 수용체 1 알파에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 약물 항체와 고체상의 접합이 수동 흡착에 의해, 또는 특이적 결합 쌍을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 약물 항체가 비오틴과 접합하고, 고체상과의 접합이 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 후, 하기 추가 단계 ba) 를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    ba) 단계 b) 에서 표본과 접촉된 포획 약물 항체를 상기 추적 약물 항체와 접촉시키고, 검출가능한 표지를 검출하는 단계.
  12. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 추적 약물 항체가 특이적 결합 쌍을 통해 검출가능한 표지와 접합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 추적 약물 항체가 디곡시제닌과 접합하고, 검출가능한 표지와의 결합은 디곡시제닌에 대한 항체를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 하기를 포함하는, 표본에서 약물 항체에 대한 항-약물 항체를 측정하는 키트:
    a) 스트렙타비딘 코팅된 마이크로타이터 플레이트,
    b) 약물 항체와 비오틴의 접합을 위한 시약,
    c) 약물 항체와 디곡시제닌의 접합을 위한 시약,
    d) 호스라디시 페록시다제 접합 항-디곡시제닌 항체,
    e) 상기 약물 항체의 올리고머화를 위한 시약,
    f) 단량체 형태의 인간 면역글로불린 G, 및
    g) 올리고머 형태의 인간 면역글로불린 G.
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