JP5642702B2 - アミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体 - Google Patents
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Description
認知症の全症例の約70%は、認知に重要な脳領域および神経回路の選択的損傷に関連するアルツハイマー病が原因である。アルツハイマー病は、特に海馬錐体ニューロンにおける神経原線維タングルならびに主にアミロイド沈着の高密度核および拡散したハローを有する多数のアミロイド斑を特徴とする。
本発明の第1の局面は、アミロイドβペプチドに対する抗体に結合する抗イディオタイプ抗体に加えて、本発明によるアッセイにおけるその使用である。一態様では、該抗体は、寄託細胞系DSM ACC2939から得られる抗体と同じまたはオーバーラップするエピトープに結合することを特徴とする。別の態様は、該抗体が、寄託細胞系DSM ACC2939から得られる抗体であることである。
本発明による「アミロイドβペプチドに対する抗体」という用語は、個体に投与することができる抗体であって、結果として投与後に該個体の試料が該抗体を含むと推測される抗体を意味する。本発明による一つのアッセイ内で、捕捉抗体およびトレーサー抗体は、「同じ」抗体分子、例えば、同じ発現ベクターを用いてリコンビナント産生された、同じアミノ酸配列を含む抗体分子を含む。アミロイドβペプチドに対する抗体は、例えば、米国特許第7,256,273号、米国特許第7,189,819号、米国特許第7,179,892号、米国特許第7,195,761号、US 2008/0281082、US 2008/0221306、US 2008/0131422、US 2008/0050367、US 2007/0238154、US 2007/0154480、US 2007/0110750、US 2006/0280743、US 2006/0292152、US 2006/0165682、US 2006/0057701、US 2006/0057702、US 2006/0039906、US 2005/0249725、US 2005/0169925、US 2005/0118651、US 2005/0009150、US 2004/0171816、US 2004/0171815、およびUS 2004/0192898に記載されている。
実施例1
アミロイドβペプチドに対する抗体のF(ab’)2フラグメントの調製
例えば、例示的なアミロイドβペプチドに対する抗体(抗Aβ抗体)およびそれに対応する核酸配列は、国際公開公報第2003/070760号またはUS 2005/0169925または配列番号:1〜12に報告されている。
モノクローナル抗イディオタイプ抗体の産生
a)マウスの免疫処置
それぞれ8〜12週齢の雌性Balb/cまたはNMRIマウスに、実施例1に概要したように得られた、配列番号:7〜9より選択される重鎖可変ドメインおよび配列番号:10〜12より選択される軽鎖可変ドメインを含む、モノクローナル抗Aβ抗体のF(ab’)2フラグメント100μgをCFA(フロイント完全アジュバント)と混合したものを腹腔内に初回免疫処置した。続いて4、7、および10週間後に、マウス1匹あたり100μgの上記F(ab’)2フラグメントをIFA(フロイント不完全アジュバント)と混合したものを適用する3回の腹腔内免疫処置段階をさらに行った。続いてPBS(リン酸緩衝食塩水)中にそれぞれ25〜100μgのF(ab’)2フラグメントを用いて、それぞれ静脈内または腹腔内追加免疫を行い。3日後に融合させた。
a)により免疫処置されたマウスの脾臓細胞由来細胞、骨髄腫細胞との融合を、Galfre, G.およびMilstein, C.(Galfre, G., and Milstein, C., Methods Enzymol. 73 (1981) 3-46)により行った。約1×108個の脾臓細胞を2×107個の骨髄腫細胞(P3x63-Ag8.653, ATCC CRL1580)と混合し、遠心分離(10分間、300×g、4℃)した。その後、FCS(ウシ胎児血清)不含培地RPMI1640で細胞を1回洗浄し、50ml尖形バイアルに入れて400×gで再度遠心分離した。その後、1mlのPEG(ポリエチレングリコール、分子量4000g/mol)を添加した。ピペッティングにより混合を行った。37℃の水浴中で1分後に、5mlのFCS不含RPMI1640を滴加した。この懸濁液を混合し、FCSを10%(v/v)含有するRPMI1640で50mlに調整し、その後遠心分離した。FCSを10%含有するRPMI1640に沈降細胞を再懸濁し、成長因子インターロイキン6(IL−6、100U/ml)を含有するヒポキサンチン−アザセリン選択培地(FCSを10%含有するRPMI1640中の100mmol/lのヒポキサンチン、1μg/mlのアザセリン)に蒔いた。約10日後に、特異的抗体合成について初代培養物をアッセイした(実施例3参照)。上記F(ab’)2フラグメントに結合性を示すが、ヒトIgGと交叉反応を示さず、抗イディオタイプであることが示された初代培養物は、成長因子インターロイキン6(100U/ml)を含有する培地と共にフローサイトメーター(FACSAria, BD Biosciences)を使って96ウェル細胞培養プレートに単一細胞堆積により個別化した。このプロトコールに従うことにより、寄託クローン1.5.74を作出した(表1)。本発明に有用な細胞系をDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)(ドイツ)に寄託した。
作出されたハイブリドーマ細胞系を、FCS10%補充RPMI1640培地1mlあたり1.0×105個細胞の最初の細胞密度で接種し、スピナー培養で増殖させた。そこから細胞を、FCS10%補充RPMI1640培地1mlあたり2.4×106個細胞の最初の細胞密度(生細胞)でMinipermユニットに接種し、増殖させた。回収した培養上清に1.2mg/mlのモノクローナル抗体濃度を達成した。培養上清からの抗体の精製は、標準的なタンパク質化学法、例えばBruck, C., et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 587- 596により行った。
抗イディオタイプ抗体の検出のためのスクリーニングアッセイ
a)薬物抗体に結合する抗体についての一次スクリーニング
ハイブリドーマ細胞の培養上清中の抗体の特異性を測定するために、リコンビナントストレプトアビジンを予備コーティングしたMTP(マイクロタイタープレート)(MicroCoat, Bernried, Germany)に、それぞれ1.0%(w/v)のBSAフラクションIIを補充したPBS中に200ng/mlのビオチン化モノクローナル抗Aβ抗体、または2μg/mlのビオチン化ヒトIgGをコーティングした(100μl/ウェル、振盪しながら外界温度で60分間インキュベーション)。続いて0.05%(w/v)Tween(登録商標)20を含有する0.9%(w/v)塩化ナトリウム溶液でウェルを3回洗浄した。次の段階で、ウェル1個あたり100μlのアッセイされるべき抗体溶液(培養上清)を添加し、振盪しながら外界温度で60分間インキュベーションした。ウェルあたり0.9%(w/v)NaCl/0.05%Tween(登録商標)20で3回の洗浄段階を行った後で、ヒツジポリクローナル抗マウスFcγ抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼラベル化F(ab’)2フラグメント(100μl)を添加し、振盪しながら外界温度で60分間インキュベーションした。続いて、洗浄を上記のように行った。最終的にウェルあたり100μlのABTS(登録商標)(Roche Diagnostics GmbH, Germany、カタログ番号1684302)を添加した。外界温度で30分間インキュベーション後に、市販のマイクロタイタープレートELISAリーダーで吸光度(光学密度OD)を405および492nm[405/492]で測定した。このスクリーニングは、モノクローナル抗Aβ抗体IgGに良好に結合し、ヒトIgGに低い交叉反応性だけを、または無交叉反応性さえも示す抗体の選択を導いた。この抗体選択物をさらにアッセイb)に供した。
一次スクリーニングa)の抗体選択物から、抗イディオタイプである抗体を同定するために、以下に記載したアッセイを行った。リコンビナントストレプトアビジンを予備コーティングされたMTP(MicroCoat, Bernried, Germany)に、PBS中の250ng/mlのビオチン化Aβペプチド(0.5%のBSAフラクションII含有)をコーティングし(100μl/ウェル、振盪しながら外界温度で60分間インキュベーション)、続いて0.9%(w/v)NaCl/0.05%Tween(登録商標)20で3回洗浄した。次の段階に、ウェル1個あたりモノクローナル抗Aβ抗体のジゴキシゲニンラベル化Fabフラグメント(50μl、2.5〜15ng/ml)、および50μlのPBS(参照シグナル)または50μlの候補抗体(培養上清;アッセイシグナル)をそれぞれ添加し、外界温度で60分間振盪しながらインキュベーションした。結合したヒトモノクローナル抗Aβ抗体−ジゴキシゲニンコンジュゲートを検出するために、ウェルあたり0.9%(w/v)NaCl/0.05%Tween(登録商標)20で3回の洗浄段階を行った後に、ヒツジポリクローナルジゴキシゲニンに対する抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼラベル化Fabフラグメント(100μl)を添加し、外界温度で振盪しながら60分間インキュベーションした。続いて、上記のように洗浄を行った。最終的に、ウェルあたり100μlのABTS(登録商標)(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany、カタログ番号1684302)を添加した。外界温度で30分間インキュベーション後に、市販のマイクロタイタープレートELISAリーダーで吸光度を[405/492]nmで測定した。関連する参照シグナルと比較して大きく減少したアッセイシグナルを示す抗体を、さらなる使用のための候補として選択した。
スクリーニングb)の候補からヒトIgGに最低の交叉反応性を示すものを同定するために、以下に記載するアッセイを行った。リコンビナントストレプトアビジンで予備コーティングされたMTP(MicroCoat, Bernried, Germany)に緩衝液中のビオチン化モノクローナル抗Aβ抗体IgG(50ng/ml)をコーティングし(125μl/ウェル、振盪しながら外界温度で30分間インキュベーション)、続いて、0.9%(w/v)NaCl/0.05%Tween(登録商標)20で3回洗浄した。次の段階に、100μlのそれぞれの候補抗体(培養上清)、100μlのヒトIgG(最大73mg/mlの濃度)、および200μlのジゴキシゲニンラベル化モノクローナル抗Aβ抗体−Fabフラグメントの混合物をウェルあたり100μl添加し、振盪しながら外界温度で60分間インキュベーションした。結合したモノクローナル抗Aβ抗体−Fab−ジゴキシゲニンコンジュゲートを検出するために、ウェルあたり0.9%(w/v)NaCl/0.05%Tween(登録商標)20で3回の洗浄段階を行った後で、ヒツジポリクローナルジゴキシゲニンに対する抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼラベル化Fabフラグメント(100μl)を添加し、振盪しながら外界温度で60分間インキュベーションした。続いて、上記のように洗浄を行った。最終的に、ウェルあたり100μlのABTS(登録商標)(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany、カタログ番号1684302)を添加した。外界温度で30分間インキュベーション後に、市販のマイクロタイタープレートELISAリーダーを用いて[405/492]nmで吸光度を測定した。ヒトIgGを添加しない場合に比べて、ヒトIgGの添加によるアッセイシグナルの最小の減損を示す抗体をさらなる使用のために選択した。
モノクローナル抗Aβ抗体に対するマウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体の精製
モノクローナル抗Aβ抗体IgGに対する抗体の発酵上清を約10倍濃縮し、20mM Tris、1M硫酸アンモニウムを有する緩衝液(pH9.0)に移し、プロテインA−セファロースに適用した。0.2Mクエン酸ナトリウムおよび0.2M硫酸アンモニウムを有するpH5.5の溶出液をリン酸緩衝液(pH7.5)で透析した。ウシIgGの混入物(発酵ブロス中のFCSから)をウシIgGに対する固定化抗体で免疫吸着することによって分離した。
モノクローナル抗Aβ抗体に対するビオチン化抗体の調製
モノクローナル抗Aβ抗体−IgGに対する抗体を、リン酸緩衝液(pH8.5)で約15mg/mlのタンパク質濃度に調整した。D−ビオチノイル−アミノカプロン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドをDMSOに溶解させ、それをその溶液に1:5のモル比で添加した。60分後にL−リシンを添加することにより反応を停止させ、150mM塩化ナトリウムを有する25mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)を用いた透析およびゲル濾過により、過剰のラベル化試薬を除去した。
モノクローナル抗Aβ抗体に対するジゴキシゲニル化抗体の調製
モノクローナル抗Aβ抗体−IgGに対する抗体を、リン酸緩衝液(pH8.5)で約15mg/mlのタンパク質濃度に調整した。ジゴキシゲニン3−O−メチルカルボニル−ε−アミノカプロン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドをDMSOに溶解させ、1:5のモル比で抗体溶液に添加した。60分後にL−リシンを添加することにより反応を停止させ、150mM塩化ナトリウムを有する25mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)を用いた透析およびゲル濾過により、過剰のラベル化試薬を除去した。
モノクローナル抗Aβ抗体の定量アッセイ
ELISAは、ストレプトアビジン−マイクロタイタープレート(MTP)を用いてヒト血漿中のモノクローナル抗Aβ抗体を定量測定するためのアッセイである。較正用標準および試料を、モノクローナル抗Aβ抗体のイディオタイプに対するビオチン化抗イディオタイプ抗体およびジゴキシゲニル化抗イディオタイプ抗体(−IgG−Biおよび−IgG−Dig)と共に予備インキュベーションする。30分間の予備インキュベーション後に、その混合物をマイクロタイタープレートに移す。サンドイッチ−ELISAは、ABTS(登録商標)基質の呈色反応を触媒するペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたヒツジジゴキシゲニンに対する抗体で検出する。シグナルをELISAリーダーにより測定する。抗−DIG pAb−Fab−POD(pAb=ポリクローナル抗体)と共にインキュベーションする前後に洗浄段階を行う。全ての較正用標準および試料は、10%のヒト血漿を含む。
モノクローナル抗Aβ抗体に対する抗薬物抗体を検出するためのアッセイ
第1段階で、ビオチン化モノクローナル抗Aβ抗体を、ストレプトアビジンをコーティングされたマイクロタイタープレート(SA−MTP)のウェルにコンジュゲーション(結合)させた。ユニバーサル緩衝液で洗浄することによって、コンジュゲーションしていない(未結合の)抗体を除去した。その後、試料および参照標準(5%ヒト血清に添加されたモノクローナル抗イディオタイプ抗Aβ抗体抗体)をウェル中でインキュベーションした。抗−抗Aβ抗体抗体は、固定化モノクローナル抗Aβ抗体に結合した。未結合の物質を洗浄除去後に、結合した抗−抗Aβ抗体抗体をジゴキシゲニル化モノクローナル抗Aβ抗体で検出し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼラベル化ジゴキシゲニンに対する抗体と共にインキュベーションした(図1参照)。抗体−酵素コンジュゲートは、ABTS(登録商標)基質の呈色反応を触媒した。シグナルは、ELISAリーダーにより405nm(参照波長:490nm)で測定した。各血清試料の吸光値を3重で繰り返しで測定した。
モノクローナル抗Aβ抗体を定量するための代替アッセイ
ELISAは、アミノ酸1−40を含むアミロイドβタンパク質(Aβ(1−40))をコーティングされたマイクロタイタープレート(MTP)を用いてヒト血漿中のモノクローナル抗Aβ抗体を定量測定するためのアッセイである。較正用標準および試料は、Aβ(1−40)でコーティングされたマイクロタイタープレートのウェルの中でインキュベーションし、Aβ(1−40)でコーティングされた表面に結合したモノクローナル抗Aβ抗体の量は、モノクローナル抗Aβ抗体のイディオタイプに対するジゴキシゲニル化抗イディオタイプ抗体(−IgG−Dig)とABTS(登録商標)基質との呈色反応を触媒するペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する抗体を用いて検出する。シグナルは、ELISAリーダーにより測定する。
モノクローナル抗Aβ抗体に対する抗薬物中和抗体を検出するためのアッセイ
治療用モノクローナル抗Aβ抗体の相補性決定領域に対する抗薬物中和抗体を分析するために、競合ELISAを開発した。血漿試料または標準としてモノクローナル抗Aβ抗体に対する抗イディオタイプ抗体をモノクローナル抗Aβ抗体−DIGコンジュゲートと共に予備インキュベーションする。残りの遊離モノクローナル抗Aβ抗体−DIGコンジュゲートは、Aβでコーティングしたマイクロタイタープレートに捕捉し、ペルオキシダーゼラベル化ジゴキシゲニンに対する抗体、その後ABTSを用いた呈色反応で検出する。
Claims (8)
- 細胞系DSM ACC2939から得られる抗体。
- 細胞系DSM ACC2939から得られた抗体を採用する、イムノアッセイを用いた試料中のアミロイドβペプチドに対する抗体の免疫学的測定のための方法。
- 細胞系DSM ACC2939から得られた抗体を採用する、イムノアッセイを用いた試料中のアミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体の免疫学的測定のための方法。
- イムノアッセイが、捕捉抗体、トレーサー抗体および検出抗体を含み、該捕捉抗体が、ストレプトアビジンを介して固相にコンジュゲーションした、細胞系DSM ACC2939から得られた、アミロイドβペプチドに対する抗体に対するビオチン化抗イディオタイプ抗体であり、該トレーサー抗体が、検出可能なラベルとしてのジゴキシゲニンにコンジュゲーションした、細胞系DSM ACC2939から得られた、アミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体であり、該検出抗体が、ペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する抗体であることを特徴とする、請求項2記載の方法。
- イムノアッセイが、固相にコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドと、検出可能なラベルとしてのジゴキシゲニンにコンジュゲーションした、細胞系DSM ACC2939から得られた、アミロイドβペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体と、ペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する検出抗体とを含むことを特徴とする、請求項2記載の方法。
- イムノアッセイが、捕捉抗体およびトレーサー抗体を含み、該捕捉抗体が、結合対の第1部分にコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドに対する抗体であり、該トレーサー抗体が、検出可能なラベルにコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドに対する抗体であることを特徴とする、請求項3記載の方法。
- イムノアッセイが、固相にコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドと、検出可能なラベルとしてのジゴキシゲニンにコンジュゲーションしたアミロイドβペプチドに対する抗体と、ペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたジゴキシゲニンに対する検出抗体とを含むことを特徴とする、請求項3記載の方法。
- イムノアッセイが、捕捉抗体およびトレーサー抗体を含み、該捕捉抗体が、固相にコンジュゲーションされる抗体部位で異なる少なくとも二つの該抗体を含む混合物であり、該トレーサー抗体が、検出可能なラベルとコンジュゲーションされる抗体部位で異なる少なくとも二つの該抗体を含む該抗体の混合物であることを特徴とする、請求項2〜7のいずれか一項記載の方法。
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