PL218883B1

PL218883B1 - Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało do zastosowania w leczeniu klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera

Info

Publication number: PL218883B1
Application number: PL386125A
Authority: PL
Inventors: David M. Holtzman; Ronald Demattos; Naoya Tsurushita; Maximiliano Vasquez; Steven Marc Paul; Kelly Rene Bales
Original assignee: Lilly Co Eli; Univ Washington
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2001-02-26
Publication date: 2015-02-27
Also published as: JP2003523764A; SI1257584T1; NO329840B1; UA75881C2; SK12212002A3; HK1048640A1; TR200202799T3; US7892545B2; EP3070100A1; PT1481992T; CZ2008595A3; US20090238821A1; PL210157B1; DK1481992T3; HRP20080430A9; NO20023957D0; CA2400559A1; SK288711B6; PT1257584E; EA006606B1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało do zastosowania w leczeniu klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera.

Niniejszym ujawniono zastosowanie przeciwciała wiążącego się z epitopem znajdującym się pomiędzy aminokwasami 13 a 28 w peptydzie Αβ do zapobiegania i leczenia stanów związanych z beta-amyloidem, takich jak choroba Alzheimera. Wynalazek ujawnia zwłaszcza zastosowania kompozycji przeciwciał do sekwestrowania peptydu beta-amyloidowego (peptydu Αβ) w osoczu, w mózgu i w płynie mózgowo-rdzeniowym w celu zapobiegania kumulowania się bądź odwracania procesu odkładania się peptydu Aβ w mózgu i w układzie naczyń krwionośnych mózgu i w efekcie do polepszenia pojmowania.

Wiele zespołów charakterystycznych objawów, które w rezultacie dają upośledzenie pojmowania, udary, krwotoki mózgowe i ogólny niedorozwój umysłowy okazuje się być związanych z zawierającymi peptyd beta-amyloidu - Αβ płytkami w nerwach i w naczyniach mózgowych w mózgu. Do takich stanów należą zarówno przedkliniczna jak i kliniczna faza choroby Alzheimera, zespół Downa oraz przedkliniczna i kliniczna faza angiopatii amyloidowej mózgowej (CAA). Płytki amyloidowe są uformowane z peptydów amyloidowych beta. Peptydy te krążą we krwi i w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF), na ogół w postaci skompleksowanej z lipoproteinami. Peptyd Aβ w formie krążącej we krwi składa się z 39-43 aminokwasów (najczęściej 40 lub 42 aminokwasów) powstających z rozszczepienia wspólnego białka prekursorowego, amyloidowego białka prekursorowego, często oznaczanego skrótem APP. Niektóre formy rozpuszczalnego peptydu Aβ są same w sobie neurotoksyczne i mogą determinować stopień zaawansowania neurodegeneracji i/lub upośledzenia pojmowania [McLean, C. A. i wsp., Ann. Neurol. (1999) 46: 860-866; Lambert M. P. i wsp. (1998) 95: 6448-6453; Naslund J., J. Am. Med. Assoc. (2000) 283: 1571].

Istnieją dowody na to, że peptyd Aβ może być transportowany w obydwu kierunkach, pomiędzy mózgiem a krwią [Ghersi-Egea, J-F. i wsp. J. Neurochem. (1996) 67: 880-883; Zlokovic B. V. i wsp., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67: 1034-1040; Shibata M. i wsp., J. Clin. Invest. (2000) 106: 1489-1499]. Poza tym peptyd Aβ w płytkach i rozpuszczalna forma białka Aβ są ze sobą w równowadze w mózgu i we krwi [Kawarabayashi T. i wsp., J. Neurosci. (2000) 21: 372-381].

Jak podano w zgłoszeniach patentowych PCT US00/35681 i US 09/153.130, włączonych do niniejszego opisu jako odnośniki, całkowite poziomy peptydu Aβ krążącego w płynie mózgowo-rdzeniowym są podobne u osób normalnych i predysponowanych do pojawienia się u nich objawów choroby Alzheimera. Jednakże średnio, poziomy peptydu Aβ₄2 są niższe u osobników z chorobą Alzheimera [Nitsch R. M. i wsp., Ann. Neurol. (1995), 37: 512-518]. Wiadomo, że peptyd Aβ₄2 ma większą skłonność do agregacji niż peptyd Aβ₄₀ i jeśli to zjawisko następuje, w konsekwencji pojawiają się jego niepożądane skutki, takie jak odkładanie się płytek amyloidowych, przekształcanie się peptydu Aβ w toksyczne formy rozpuszczalne, uszkodzenie komórek nerwowych i upośledzenia behawioralne, takie jak otępienie [Golde T. E. i wsp., Biochem. Biophys. Acta (2000) 1502: 172-187].

Sposoby indukowania odpowiedzi immunologicznej w celu zmniejszenia depozytów amyloidowych są opisane w publikacji zgłoszenia PCT WO 99/27944 opublikowanej 10 czerwca 1999. W opisie tym postuluje się, że zagregowany peptyd Aβ o pełnej długości mógłby być użytecznym immunogenem. Podanie fragmentu Aβ (aminokwasy 13-28) skoniugowanego z anty-mysią IgG owcy nie powodowało zmiany w obciążeniu amyloidowym kory mózgowej i tylko u jednego z dziewięciu zwierząt, którym podano iniekcje koniugatu fragmentu 13-28 peptydu Aβ wystąpiła limfoproliferacja w odpowiedzi na Aβ₄o. W tym zgłoszeniu wskazuje się również, że przeciwciała, które swoiście wiążą się z peptydem Aβ mogą być użyte jako środki lecznicze. Jednak okazuje się to być jedynie domysłem, gdyż przytoczone dane odnoszą się do protokołów, w których prowadzono aktywną immunizację z użyciem np. peptydu Aβ₄2. Peptydy te dostarczano łącznie z adiuwantami i oznaczano miana przeciwciała powstającego w wyniku immunizacji a także poziomy peptydu Aβ i peptydu prekursorowego. W publikacji mocno podkreśla się tezę, że dla złagodzenia objawów choroby Alzheimera konieczne jest zmniejszenie płytki Aβ i że w efektywnym zmniejszaniu płytki Aβ wymagany jest udział procesów komórkowych.

Publikacja zgłoszenia międzynarodowego, WO 99/60024 z 25 listopada 1999 r. dotyczy sposobów usuwania amyloidu z użyciem przeciwciał anty-amyloidowych. Podano jednakże, że mechanizm tego procesu polega na wykorzystaniu zdolności przeciwciał anty-Aji do wiązania się z już uformowanymi złogami amyloidowymi (czyli płytkami), co w konsekwencji daje miejscowe oczyszczanie mikroPL 218 883 B1 gleju ze zlokalizowanych w nim płytek. Mechanizm ten nie został potwierdzony w próbach in vivo.

W publikacji tej twierdzi się poza tym, że aby przeciwciała anty-Αβ były skuteczne przeciw płytkom Αβ, muszą one dotrzeć do miąższu mózgu i przejść przez barierę krew-mózg.

Kilka zgłoszeń patentowych PCT odnoszących się do prób kontroli płytek amyloidowych opublikowano 7 grudnia 2000 r. W publikacji zgłoszeniowej WO 00/72880 opisane jest znaczne zmniejszenie obciążenia płytkami w korze mózgowej i w hipokampie myszy transgenicznych stanowiących model choroby Alzheimera po traktowaniu N-końcowymi fragmentami peptydów Aβ i przeciwciałami, które się z nimi wiążą, ale nie po traktowaniu fragmentem Aβ 13-28 skoniugowanym z anty-mysią IgG owcy ani przeciwciałem przeciw fragmentowi 13-28, czyli przeciwciałem 266. W badaniach in vitro wykazywano, że przeciwciała skierowane przeciw fragmentom N-końcowym przechodzą przez barierę krew-mózg i indukują fagocytozę płytek amyloidowych.

Publikacja zgłoszeniowa WO 00/72876 zawiera zasadniczo to samo ujawnienie co WO 00/72880 i dotyczy immunizacji samymi składnikami włókienek amyloidowych.

W publikacji zgłoszeniowej WO 00/77178 opisane są przeciwciała zaprojektowane tak, aby katalizowały hydrolizę β-amyloidu, między innymi przeciwciała przeciw mieszaninie związków przejściowych fenyloalanino-statyny, Cys^i_0-25, statyno-Phe₁₉-Phe₂₀ i Cys-Aji-_{0 25}-statyno-Phe₂₀-Ala₂- i przeciwciała przeciw Aβ_10-25 posiadające zredukowane wiązanie amidowe pomiędzy Phe₁₉ i Phe₂₀. W tym dokumencie wspomniano o sekwestrowaniu peptydu Aβ lecz jest to jedynie przypuszczenie, gdyż nie przytoczono dowodu takiego sekwestrowania. Poza tym dokument nie dostarcza dowodu in vivo na fakt, że podanie przeciwciał powoduje wypływ peptydu Aβ z ośrodkowego układu nerwowego, przeciwdziała tworzeniu się płytek, zmniejsza obciążenie pytkami, tworzy kompleksy pomiędzy tymi przeciwciałami i peptydem Aβ w próbkach tkanki ani, że usprawnia pojmowanie.

Wykazano, że jeden szlak w metabolizmie Aβ przebiega poprzez transport z ośrodkowego układu nerwowego do osocza [Zlokovic B. V. i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) (1996) 93: 4229-4234; Ghersi-Egea J-F. i wsp., J. Neurochem. (1996) 67: 880-883]. Ponadto wykazano, że peptyd Aβ znajdujący się w osoczu może przekraczać barierę krew-mózg i docierać do mózgu [Zlokovic B. V. i wsp., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67: 1034-1040]. Dowiedziono także, że podanie niektórych poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał anty-Aji zmniejsza odkładanie się płytek amyloidowych u transgenicznych myszy App^V717F stanowiących model choroby Alzheimera [Bard F. i wsp., Nature Med. (2000) 6: 916-919]. Podano jednakże, że zachodzi to dzięki niektórym przeciwciałom anty-Aji przenikającym przez barierę krew-mózg i stymulującym fagocytozę płytek amyloidowych przez komórki mikrogleju. W doświadczeniach Barda, próby ex vivo na skrawkach mózgu ujawniły, że obecność dodanego przeciwciała anty-Aji, łącznie z wprowadzonym egzogennie mikroglejem, indukowała fagocytozę Aβ, w wyniku czego ulegały usuwaniu złogi Aβ.

Poziomy obydwu rozpuszczalnych peptydów, Aβ₄₀ i Aβ₄₂ w płynie mózgowo-rdzeniowym i we krwi można łatwo oznaczyć wykonując standaryzowane próby z użyciem przeciwciał przeciw epitopom znajdującym się wzdłuż łańcucha Λβ. Takie próby są opisane, przykładowo w opisach patentowych US 5.766.846, US 5.837.672 i US 5.593.846. W opisach tych ujawnione jest wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych przeciw centralnej domenie peptydu Aβ, która, jak podano, posiada epitopy wokół pozycji 16 i 17 oraz w tych pozycjach. Opisane są również przeciwciała skierowane przeciw regionowi N-terminalnemu. Stwierdzono, że niektóre przeciwciała monoklonalne wchodzą w reakcję immunologiczną z pozycjami 13-28 peptydu Λβ. Te przeciwciała nie wiążą się z peptydem reprezentującym pozycje 17-28, a więc, według cytowanych opisów patentowych, świadczy to o tym, że jest to ten region włącznie z pozycjami 16-17 (miejsce α-sekretazy), który jest celem dla tych przeciwciał. Wśród przeciwciał, o których wiadomo, że wiążą się w miejscach pomiędzy aminokwasami 13 a 28 peptydu Aβ znajdują się przeciwciała mysie 266, 4G8 i 1C2.

Nieoczekiwanie odkryliśmy, że podanie przeciwciała 266 bardzo szybko i prawie całkowicie przywraca pojmowanie (pamięć przedmiotów) u 24-miesięcznej hemizygotycznej myszy transgenicznej (APP^V717F). Przeciwciało to wcale nie ma właściwości, którymi według stanu techniki powinno się charakteryzować przeciwciało, aby było skuteczne w leczeniu choroby Alzheimera, zespołu Downa i innych stanów związanych z peptydem Aβ. Ku naszemu dalszemu zdumieniu zaobserwowaliśmy, że przeciwciała, które wiążą peptyd Aβ w pozycjach pomiędzy 13 a 28 (266 i 4G8) mają zdolność sekwestrowania rozpuszczalnych form tego peptydu Aβ z ich związanych form krążących we krwi i że obwodowe podanie przeciwciała 266 powoduje szybki wypływ stosunkowo dużych ilości peptydu Aβ z ośrodkowego układu nerwowego do osocza. W rezultacie uzyskuje się zmieniony klirens rozpuszczalnego peptydu Aβ, zapobieganie powstawaniu płytek i co najbardziej zdumiewające, poprawę poj4

PL 218 883 B1 mowania, nawet bez niezbędnego obniżenia obciążenia płytkami amyloidowymi Αβ, przekraczania bariery krew-mózg w jakimś znaczącym stopniu, dekorowania płytek, aktywowania mechanizmów komórkowych czy wiązania z dużym powinowactwem zagregowanego peptydu Aβ.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało do zastosowania w leczeniu klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera, w której przeciwciało zawiera region zmienny łańcucha lekkiego posiadający następującą sekwencję:

10 15

Asp Xaa Val Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa

25 30

Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Xaa

40 45

Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro

55 60

Gly Gin Ser Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe

70 75

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val

100 105

Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa

110

Gly Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys Arg (SEQ ID Nr.: 7);

w której:

Xaa w pozycji 2 oznacza Val lub Ile;

Xaa w pozycji 7 oznacza Ser lub Thr;

Xaa w pozycji 14 oznacza Thr lub Ser;

Xaa w pozycji 15 oznacza Leu lub Pro;

Xaa w pozycji 30 oznacza Ile lub Val;

Xaa w pozycji 50 oznacza Arg, Gln lub Lys;

Xaa w pozycji 88 oznacza Val lub Leu;

Xaa w pozycji 105 oznacza Gln lub Gly;

Xaa w pozycji 108 oznacza Lys lub Arg; i

Xaa w pozycji 109 oznacza Val lub Leu;

i region zmienny w łańcuchu ciężkim posiada następującą sekwencję:

PL 218 883 B1

10 15

Xaa Val Gin Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly

25 30

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

40 45

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu

55 60

Xaa Leu Val Ala Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr

70 75

Pro Asp Xaa Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa

85 90

Xaa Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp

100 105

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly

110

Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID Nr.: 8);

w której:

Xaa w pozycji 1 oznacza Glu lub Gln;

Xaa w pozycji 7 oznacza Ser lub Leu;

Xaa w pozycji 46 oznacza Glu, Val, Asp lub Ser;

Xaa w pozycji 63 oznacza Thr lub Ser;

Xaa w pozycji 75 oznacza Ala, Ser, Val lub Thr;

Xaa w pozycji 76 oznacza Lys lub Arg;

Xaa w pozycji 89 oznacza Glu lub Asp; i

Xaa w pozycji 107 oznacza Leu lub Thr.

Korzystnie, przeciwciało posiada region zmienny łańcucha lekkiego odpowiadający sekwencji SEQ ID Nr 9 i region zmienny łańcucha ciężkiego odpowiadający sekwencji SEQ ID Nr 10.

Korzystnie, przeciwciało posiada izotyp IgG1 immunoglobuliny.

Korzystnie, przeciwciało hamuje tworzenie się płytek amyloidowych.

Korzystnie, przeciwciało redukuje ilość płytek amyloidowych lub wpływa na rozpuszczalne toksyczne rodzaje Αβ związane z chorobą Alzheimera.

Korzystnie, przeciwciało jest podawane obwodowo, korzystniej, doustnie, dootrzewnowo, podskórnie, domięśniowo lub dożylnie.

Korzystnie, leczenie klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera odnosi się do leczenia, zapobiegania lub odwracania upośledzenia pojmowania u pacjentów ze zdiagnozowaną kliniczną lub przedkliniczną fazą choroby Alzheimera.

PL 218 883 B1

Korzystnie, leczenie klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera odnosi się do poprawiania pojmowania u pacjentów ze zdiagnozowaną kliniczną lub przedkliniczną fazą choroby Alzheimera.

Niniejszym ujawniono zastosowanie kompozycji przeciwciała, które specyficznie wiąże się z epitopem zawartym w pozycjach 13-28 peptydu Αβ do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia przedklinicznej lub klinicznej choroby Alzhaimer'a.

Przeciwciało to hamuje tworzenie się płytek amyloidowych lub wpływa na rozpuszczalne toksyczne rodzaje związane z chorobą Alzheimera, oraz także przeciwciało redukuje ilość płytek amyloidowych lub wpływa na rozpuszczalne toksyczne rodzaje związane z chorobą Alzheimera.

W jeszcze innym rozwiązaniu, zastosowanie przeciwciała leczy lub odwraca postęp choroby poznawczej związany z chorobą Alzheimera, oraz także korzystnie, przeciwciało poprawia zdolności poznawcze u osobnika z chorobą Alzheimera. Przeciwciało, w zastosowaniu w kompozycji według wynalazku sekwestruje Aβ od makromolekularnych kompleksów we krwi lub w płynie mózgowo-rdzeniowym. Przeciwciało, może być przeciwciałem humanizowanym.

Przeciwciało może także zawierać ludzki region zrębowy, lub humanizowany region zrębowy.

Niniejszym ujawniono także zastosowania humanizowanych przeciwciał względnie ich fragmentów, wpływających dodatnio na pojmowanie w chorobach i stanach, w których zaangażowany jest peptyd Aβ, takich jak faza kliniczna lub przedkliniczna choroby Alzheimera. Te przeciwciała bądź ich fragmenty nie muszą przekraczać bariery krew-mózg, dekorować płytki amyloidowej, aktywować odpowiedzi komórkowych ani nawet koniecznie zmniejszać obciążenia płytkami amyloidowymi. Ujawnione humanizowane przeciwciała i ich fragmenty, mogą sekwestrować peptyd Aβ z jego formy związanej krążącej we krwi i zmieniając klirens formy rozpuszczalnej i związanej peptydu Aβ w ośrodkowym układzie nerwowym i w osoczu. Ujawniono zatem takie humanizowane przeciwciała i ich fragmenty, które swoiście wiążą się z epitopem pomiędzy aminokwasami 13 a 28 w cząsteczce Λβ.

Takie humanizowane przeciwciała i ich fragmenty są użyteczne do sekwestrowania peptydu Aβ u ludzi, do leczenia i zapobiegania u ludzi rozwojowi chorób i stanów charakteryzujących się płytkami Λβ bądź toksycznością Aβ w mózgu, takich jak choroba Alzheimera.

Stosowanie odpowiedniego humanizowanego przeciwciała in vivo do sekwestrowania peptydu Aβ krążącego w płynach biologicznych ma na celu zapobieganie i leczenie stanów związanych z tworzeniem się zawierających peptyd Aβ płytek rozsianych, neuronowych i naczyniowych w mózgu. Takie humanizowane przeciwciało, w tym również jego fragment immunologicznie reaktywny powoduje usunięcie peptydu Aβ z makrocząsteczkowych kompleksów, co na ogół będzie oznaczało transportowanie go w płynach ustrojowych do i z miejsc tworzenia się płytek lub z miejsc, w których mogą być toksyczne. Poza tym, sekwestrowanie osoczowego peptydu Aβ przeciwciałem lub jego fragmentem działa jak zatapianie, skutecznie sekwestrując rozpuszczalny peptyd Λβ w przedziale osocza i indukując peptyd Aβ do przechodzenia do osocza z miejsc w ośrodkowym układzie nerwowym (o.u.n). Przez sekwestrowanie peptydu Aβ we krwi, jego wypływ netto z mózgu zwiększa się, zapobiega się procesowi odkładania się rozpuszczalnego Λβ w nierozpuszczalnych płytkach i powstawaniu jego toksycznych rozpuszczalnych postaci w mózgu. Ponadto, nierozpuszczalny peptyd Aβ w płytkach, znajdujący się w równowadze z rozpuszczalnym peptydem Λβ, może być usuwany z mózgu poprzez efekt sekwestrowania we krwi. Sekwestrowanie peptydu Aβ przeciwciałem zwiększa również jego usuwanie z organizmu i hamuje działanie toksyczne rozpuszczalnego peptydu Λβ w mózgu a także rozwój i dalsze gromadzenie się nierozpuszczalnego peptydu Λβ jako amyloidu w płytkach. Przeciwciała użyteczne w wynalazku nie przechodzą w dużych ilościach przez barierę krew-mózg (poziomy<0,1% w osoczu). Humanizowane przeciwciała, po podaniu obwodowo, nie muszą wywoływać odpowiedzi immunologicznej komórkowej w mózgu jeśli zostaną związane z peptydem Λβ bądź gdy krążą we krwi w stanie wolnym, wywierając korzystne działania. Następnie, przy wprowadzeniu obwodowym, do uzyskania ich korzystnego działania nie jest potrzebne, aby w znaczącym stopniu wiązały zagregowany peptyd Aβ w mózgu.

Wynalazek jest związany ze zdumiewającą obserwacją, że w przeciągu krótkiego czasu po podaniu przeciwciała w kompozycji według wynalazku, z ośrodkowego układu nerwowego wypływają do krwi względnie duże ilości peptydu Λβ. Wynalazkiem objęte są zatem sposoby uzyskiwania odpowiedzi u człowieka na traktowanie przeciwciałem wiążącym Aβ lub jego fragment, polegające na: a) podaniu osobnikowi przeciwciała bądź jego fragmentu i b) pomiarze stężenia peptydu Λβ we krwi tego osobnika.

Wynalazek pozwala na leczenie człowieka przeciwciałem wiążącym Aβ lub jego fragment, polegający na: a) podania osobnikowi pierwszej ilości tego przeciwciała lub jego fragmentu, b) na pomiaPL 218 883 B1 rze stężenia Αβ we krwi tego osobnika w ciągu 3 godzin do dwóch tygodni po podaniu pierwszej dawki, c) o ile to potrzebne, wyliczeniu drugiej ilości przeciwciała lub jego fragmentu w oparciu o rezultaty etapu b), przy czym druga ilość jest taka sama lub różni się od pierwszej ilości i d) podaniu drugiej ilości tego przeciwciała lub jego fragmentu.

Wynalazek pozwala również na sposób oceny u człowieka skuteczności przeciwciała wiążącego się z peptydem Αβ lub jego fragmentem w hamowaniu lub w zapobieganiu tworzenia się pytki am yloidowej Αβ, zdolności zmniejszania płytki amyloidowej Αβ osłabiania skutków toksycznego działania rozpuszczalnych form bądź do leczenia stanu lub choroby związanej z płytką Αβ, który to sposób obejmuje: a) uzyskanie pierwszej próbki osocza lub płynu mózgowo-rdzeniowego osobnika, b) pomiar wyjściowego stężenia Aβ w tej pierwszej próbce, c) podanie osobnikowi przeciwciała lub jego fragmentu, d) uzyskanie drugiej próbki osocza lub płynu mózgowo-rdzeniowego tego osobnika w czasie od 3 godzin do dwóch tygodni po podaniu przeciwciała lub jego fragmentu i e) pomiar stężenia Aβ w tej drugiej próbce, przy czym skuteczność odnosi się do ilości Aβ związanego z przeciwciałem we krwi i stężenia Αβ w płynie mózgowo-rdzeniowym.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 przedstawia procent peptydu Αβ usuniętego przez Mab 266 z płynu mózgowo-rdzeniowego człowieka poprzez błonę dializacyjną w funkcji masy cząsteczkowej odcinanej przez tę błonę dializacyjną.

Fig. 2 przedstawia stężenie całkowitego Αβ (Αβο^α^) oznaczone w osoczu myszy transgenicznych APP^V717F po iniekcji 200 μg albo 600 μg Mab 266 w funkcji czasu.

Fig. 3A przedstawia ilość peptydu Αβ odłożonego w korze mózgowej myszy transgenicznych APP^V717F traktowanych solą fizjologiczną, mysią IgG albo Mab 266.

Fig. 3B przedstawia korelację tych wyników z wynikami uzyskanymi na zwierzętach macierzystych.

Fig. 4 przedstawia sekwencje polinukleotydowe do ekspresji łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała 266 z plazmidu pVk-Hu266 i jednoliterowe kody aminokwasów dla wytworzonego łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała 266 (w stanie dojrzałym odpowiadającego sekwencji

SEQ ID Nr. 11).

Fig. 5 przedstawia sekwencje polinukleotydowe do ekspresji łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała 266 z plazmidu pVg1-Hu266 i jednoliterowe kody aminokwasów dla wytworzonego łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała 266 (w stanie dojrzałym odpowiadającego sekwencji SEQ ID Nr. 12).

Fig. 6 przedstawia mapę plazmidu pVk-Hu266.

Fig. 7 przedstawia mapę plazmidu pVg1-Hu266.

Peptydy Αβ krążące w płynach biologicznych człowieka reprezentują region końca karboksylowego białka prekursorowego kodowanego na chromosomie 21. Na podstawie wyników badań in vitro donoszono, że peptyd Αβ jest słabo rozpuszczalny w roztworach fizjologicznych, gdyż zawiera ciąg aminokwasów hydrofobowych stanowiących część regionu, który zakotwicza swój dłuższy prekursor w błonach lipidowych komórek.

Nie jest zatem zaskoczeniem, że krążący peptyd jest normalnie kompleksowany innymi resztami, które zapobiegają jego agregacji. Wynikają stąd trudności w wykrywaniu peptydu krążącego w płynach biologicznych.

W wyżej wymienionych dokumentach patentowych (US 5.766.846, US 5.837.672 i US 5.593.846) opisane jest wytwarzanie przeciwciał, w tym przeciwciała monoklonalnego oznaczonego jako klon 266, które to przeciwciało powstaje przeciw peptydowi zawierającemu aminokwasy 13-28 z peptydu Αβ i wykazano, że wiąże się swoiście z tym peptydem.

Zgłaszający niniejszy wynalazek odkryli, że przeciwciała, które wiążą się w obrębie tego regionu, w odróżnieniu od przeciwciał, które wiążą się w innych miejscach sekwencji aminokwasowej Αβ, mają zdolność bardzo efektywnego sekwestrowania rozpuszczalnego peptydu Αβ z kompleksów makrocząsteczkowych. Sekwestrowanie to powoduje wypływ netto peptydu Αβ z ośrodkowego układu nerwowego, zmienia jego klirens w o.u.n. i w osoczu i obniża jego dostępność do celów tworzenia płytki. Tak więc, przeciwciała o takiej swoistości, zmodyfikowane w celu zmniejszenia ich immunogenności przez przekształcenie ich w formę humanizowaną dają sposobność traktowania zarówno profilaktycznego jak i leczniczego stanów związanych z tworzeniem się płytek amyloidowych. Jak wspomniano powyżej, do takich stanów zalicza się przedkliniczną i kliniczną fazę choroby Alzheimera, zespół Downa oraz przedkliniczną i kliniczną fazę angiopatii mózgowej amyloidowej.

PL 218 883 B1

Stosowany w opisie termin traktowanie obejmuje traktowanie lecznicze, gdy wiadomo, że stan, który ma być leczony już występuje i traktowanie profilaktyczne czyli zapobieganie lub łagodzenie przypuszczalnego przyszłego zaistnienia stanu chorobowego.

Określenie monoklonalne przeciwciała, które wiążą się ze środkowym regionem peptydu Αβ oznacza przeciwciała monoklonalne (Mab albo Mabs), które wiążą sekwencję aminokwasową reprezentującą epitop znajdujący się pomiędzy pozycjami 13-28 Αβ. Celem nie musi być cały region. Jeśli tylko przeciwciało wiąże przynajmniej epitop w obrębie tego regionu (zwłaszcza np. epitop obejmujący miejsce sekretazy 16-17 albo miejsce, w którym wiąże się przeciwciało 266), to takie przeciwciało jest skuteczne w ujawnionym sposobie.

Termin przeciwciało oznacza przeciwciało monoklonalne jako takie albo jego fragment efektywny immunologicznie, taki jak Fab, Fab' albo F(ab')2. W niektórych przypadkach, w niniejszym opisie fragmenty będą szczególnie wymienione dla uwypuklenia; tym niemniej, należy rozumieć, że niezależnie od tego, czy fragmenty są wyszczególnione czy nie, termin przeciwciało obejmuje takie fragmenty oraz formy jednołańcuchowe. Jak długo dane białko zachowuje zdolność wiązania żądanego celu, a w tym przypadku, sekwestrowania peptydu Αβ z jego białek nośnikowych we krwi, tak długo jest objęte terminem przeciwciało. Terminem przeciwciało objęte są również np. formy jednołańcuchowe, ogólnie nazywane regionami Fv, przeciwciał o tej swoistości. Korzystnie ale nie koniecznie, przeciwciała użyteczne w wynalazku wytwarza się technikami rekombinacji, gdyż w celu przekształcenia ich w formy humanizowane potrzebna jest manipulacja na zazwyczaj mysich lub innych nieludzkich przeciwciałach o odpowiedniej swoistości. Przeciwciała mogą ale nie muszą być zglikozylowane, chociaż korzystne są przeciwciała zglikozylowane. Jak wiadomo, przeciwciała są odpowiednio sieciowane poprzez mostki dwusiarczkowe.

Wiadomo, że podstawowa jednostka strukturalna przeciwciała jest tetramerem. Każdy tetramer składa się z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, każda para zawiera jeden łańcuch lekki (około 25 kDa) i jeden łańcuch ciężki (około 50-70 kDa). Część amino-terminalna każdego łańcucha zawiera region zmienny złożony z około 100 do 110 lub większej ilości aminokwasów, w pierwszym rzędzie odpowiedzialnych za rozpoznanie antygenu. Część karboksyterminalna każdego łańcucha definiuje region stały, głównie odpowiedzialny za funkcję efektorową.

Łańcuchy lekkie klasyfikuje się na gamma, mu, alfa i lambda. Łańcuchy ciężkie dzieli się na gamma, mu, alfa, delta i epsilon. Określają one izotyp przeciwciała, odpowiednio jako IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. W łańcuchach lekkich i ciężkich, regiony zmienne i stałe są połączone regionem J złożonym z około 12 lub większej ilości aminokwasów a łańcuch ciężki zawiera również region D składający się z około 10 lub większej ilości aminokwasów.

Regiony zmienne każdej pary łańcucha lekkiego i ciężkiego tworzą miejsce wiążące przeciwciała. Tak więc, nienaruszone przeciwciało ma dwa miejsca wiązania. Wszystkie łańcuchy wykazują tą samą ogólną strukturę stosunkowo konserwatywnych regionów zrębowych (FR), połączonych poprzez trzy regiony hiperzmienne, zwane również regionami determinującymi dopasowanie albo CDR. CDR z dwóch łańcuchów każdej pary są ze sobą zrównane przez regiony zrębowe, co umożliwia wiązanie ze swoistym epitopem. Od końca aminowego do końca karboksylowego, zarówno łańcuchy lekkie jak i ciężkie zawierają domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Przydział aminokwasów do każdej domeny jest zgodny ze znanymi konwencjami [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (Sekwencje białek o znaczeniu immunologicznym), National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 i 1991; Chothia i wsp., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), Chithia i wsp., Nature 342: 878-883 (1989)].

Jak powszechnie wiadomo, przeciwciała monoklonalne o odpowiedniej swoistości można łatwo generować standardowymi technikami immunizacji ssaków, uzyskując hybrydoma z komórek tych ssaków wytwarzających przeciwciała bądź unieśmiertelniając te komórki w inny sposób i prowadząc hodowlę hybrydoma lub unieśmiertelnionych komórek dla nadania im odpowiedniej swoistości. W tym przypadku, takie przeciwciała można generować przez immunizację człowieka, królika, szczura lub myszy, np. peptydem reprezentującym epitop obejmujący region 13-28 peptydu Αβ albo jego odpowiedni podregion. Materiały do manipulacji rekombinacyjnej można uzyskać drogą przesiewania sekwencji nukleotydowych kodujących żądane przeciwciało z komórek hybrydoma lub innych je wytwarzających. Takie sekwencje nukleotydowe można następnie przekształcać, dostarczając je w formie humanizowanej.

Termin przeciwciało humanizowane oznacza przeciwciało składające się częściowo lub całkowicie z sekwencji aminokwasowych pochodzących z ludzkiej linii wytwarzającej przeciwciała dzięki

PL 218 883 B1 zmianie tej sekwencji przeciwciała, która zawiera nie-ludzkie regiony determinujące dopasowanie (CDR). Taka najprostsza zmiana może polegać na prostej zamianie stałego regionu mysiego na region stały ludzkiego przeciwciała. Uzyskuje się ludzko/mysią chimerę, która może się okazać wystarczająco słabo immunogenna aby mogła być zaakceptowana do użycia w produkcie farmaceutycznym.

Jednakże korzystnie, region zmienny tego przeciwciała a nawet CDR jest również humanizowany sposobami, które już obecnie są znane w stanie techniki. Części zrębowe regionów zmiennych są zastąpione odpowiednimi regionami zrębowymi ludzkimi z pozostawieniem nie-ludzkich CDR zasadniczo nie zmienionych a nawet regiony hiperzmienne (CDR) są zastąpione sekwencjami pochodzącymi z genomu ludzkiego. W pełni ludzkie przeciwciała wytwarza się z użyciem genetycznie modyfikowanych myszy, których układy immunologiczne zostały tak zmienione aby odpowiadały układom immunologicznym ludzkim. Jak wspomniano powyżej, do użycia w ujawnionych sposobach wystarczy wykorzystać fragment przeciwciała swoisty immunologicznie, w tym również fragmenty reprezentujące formy jednołańcuchowe.

W dalszym ciągu, termin humanizowane przeciwciało odnosi się do przeciwciała zawierającego ludzki region zrębowy, co najmniej jeden CDR z przeciwciała nie-ludzkiego, w którym to przeciwciele każdy region stały jest zasadniczo identyczny z regionem stałym ludzkiej immunoglobuliny, a więc, jest identyczny w co najmniej około 85-90%, korzystnie w co najmniej 95%. Tak więc, wszystkie części humanizowanego przeciwciała, za wyjątkiem ewentualnie regionów hiperzmiennych są w zasadzie identyczne z odpowiednimi częściami jednej lub większej ilości natywnych sekwencji immunoglobuliny ludzkiej. Przykładowo, humanizowana immunoglobulina nie będzie na ogół obejmować przeciwciała chimerycznego z mysim regionem zmiennym i ludzkim regionem stałym.

Humanizowane przeciwciała posiadają co najmniej trzy potencjalne zalety w stosunku do przeciwciał nie-ludzkich i chimerycznych w odniesieniu do ich użycia do leczenia ludzi:

1) dzięki temu, że część efektorowa jest ludzka, może lepiej reagować z innymi częściami ludzkiego układu immunologicznego (np. niszczyć komórki docelowe bardziej wydajnie według mechanizmu cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) lub cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC)).

2) Ludzki układ immunologiczny nie powinien rozpoznawać regionu zrębowego ani regionu C przeciwciała humanizowanego jako obcego, a zatem, odpowiedź przeciwciał na takie wstrzyknięte przeciwciało powinna być słabsza niż na całkowicie nie-ludzkie przeciwciało lub na częściowo obce przeciwciało chimeryczne.

3) W piśmiennictwie są doniesienia, że podane przez iniekcję przeciwciała nie-ludzkie mają znacznie krótszy okres półtrwania w układzie krążenia człowieka niż przeciwciała ludzkie. Wstrzykn ięte humanizowane przeciwciała będą miały okres półtrwania w zasadzie identyczny z okresem półt rwania naturalnie występujących w ustroju przeciwciał ludzkich, co pozwoli na stosowanie mniejszych i mniej częstych dawek.

Strukturę humanizowanych immunoglobulin można projektować następująco. Zastępuje się aminokwas zrębowy w przeznaczonej do użycia ludzkiej immunoglobulinie (immunoglobulinie akceptorowej) aminokwasem zrębowym z nie-ludzkiej immunoglobuliny dostarczającej CDR (immunoglobuliny donorowej) wówczas, jeśli aminokwas ten mieści się w niżej podanej kategorii:

(a) Jeśli aminokwas w ludzkim regionie zrębowym immunoglobuliny akceptorowej jest nietypowy dla ludzkiej immunoglobuliny w tej pozycji, podczas gdy odpowiedni aminokwas w immunoglobulinie donorowej jest typowy dla immunoglobuliny ludzkiej w tej pozycji;

(b) Jeśli aminokwas ten znajduje się w pozycji bezpośrednio sąsiadującej z jednym z regionów hiperzmiennych (CDR) albo (c) Jeśli dowolny atom łańcucha bocznego aminokwasu zrębowego znajduje się w odległości około 5-6 angstremów (środek do środka) od dowolnego atomu aminokwasu z regionu CDR w trójwymiarowym modelu immunoglobuliny [Queen i wsp., op. cit. and Co., i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)]. Jeśli każdy z aminokwasów w ludzkim regionie zrębowym immunoglobuliny akceptorowej i odpowiadający mu aminokwas w immunoglobulinie donorowej jest nietypowy dla ludzkiej immunoglobuliny w tej pozycji to taki aminokwas wymienia się na aminokwas typowy dla immunoglobuliny ludzkiej w tej pozycji.

Korzystnym humanizowanym przeciwciałem jest humanizowana forma mysiego przeciwciała 266. Regiony CDR humanizowanego 266 mają następujące sekwencje aminokwasowe:

CDR1 łańcucha lekkiego:

PL 218 883 B1

10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu

His (SEQ ID Nr.1)

CDR2 łańcucha lekkiego:

5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID Nr. 2)

CDR3 łańcucha lekkiego:

5

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID Nr. 3)

CDR1 łańcucha ciężkiego:

5

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID Nr. 4)

CDR2 łańcucha ciężkiego:

10 15

Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID Nr. 5) i CDR3 łańcucha ciężkiego:

Gly Asp Tyr (SEQ ID Nr. 6).

Korzystny region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała posiada niżej podaną sekwencję aminokwasową, w której region zrębowy pochodzi z ludzkiej linii komórek zarodkowych, z segmentu Vk, DPK18 i segmentu J, Jk1, z kilkoma substytucjami w aminokwasach consensus w tej samej ludzkiej podgrupie V, w celu obniżenia immunogenności:

PL 218 883 B1

1

5

10

15

Asp

Xaa

Val

Met

Thr

Gin

Xaa

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

Val

Xaa

20

25

30

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Gin

Ser

Leu

Xaa

35

40

45

Tyr

Ser

Asp

Gly

Asn

Ala

Tyr

Leu

His

Trp

Phe

Leu

Gin

Lys

Pro

50

55

60

Gly

Gin

Ser

Pro

Xaa

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

65

70

75

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

80

85

90

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Xaa

Gly

Val

95

100

105

Tyr

Cys

Ser

Gin

Ser

Thr

His

Val

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Xaa

110

Gly

Thr

Xaa

Glu

Ile

Lys

Arg

(SEQ

ID Nr. 7)

w której:

Xaa w pozycji 2 oznacza Val albo Ile;

Xaa w pozycji 7 oznacza Ser albo Thr;

Xaa w pozycji 14 oznacza Thr albo Ser;

Xaa w pozycji 15 oznacza Leu albo Pro;

Xaa w pozycji 30 oznacza Ile albo Val;

Xaa w pozycji 50 oznacza Arg, Gln albo Lys;

Xaa w pozycji 88 oznacza Val albo Leu;

Xaa w pozycji 105 oznacza Gln albo Gly;

Xaa w pozycji 108 oznacza Lys albo Arg i

Xaa w pozycji 109 oznacza Val albo Leu.

Korzystny region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała może posiadać niżej podaną sekwencję aminokwasową, w której to sekwencji region zrębowy pochodzi z ludzkiej linii komórek zarodkowych, segmentu VH, DP53 i segmentu J, JH4, z kilkoma substytucjami w aminokwasach consensus w tej samej ludzkiej podgrupie, w celu obniżenia immunogenności:

PL 218 883 B1

1

5

10

15

Xaa

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Xaa

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

20

25

30

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

35

40

45

Arg

Tyr

Ser

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Xaa

Leu

Val

Ala

Gin

Ile

Asn

Ser

Val

Gly

Asn

Ser

Thr

Tyr

65

70

75

Pro

Asp

Xaa

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Xaa

80

85

90

Xaa

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Xaa

Asp

95

100

105

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

Ser

Gly

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

110

Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID Nr. 8) w której:

Xaa w pozycji 1 oznacza Glu albo Gln;

Xaa w pozycji 7 oznacza Ser albo Leu;

Xaa w pozycji 46 oznacza Glu, Val, Asp albo Ser;

Xaa w pozycji 63 oznacza Thr albo Ser;

Xaa w pozycji 75 oznacza Ala, Ser, Val albo Thr;

Xaa w pozycji 76 oznacza Lys albo Arg;

Xaa w pozycji 89 oznacza Glu albo Asp;

Xaa w pozycji 107 oznacza Leu albo Thr.

Szczególnie korzystny region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała może posiadać niżej podaną sekwencję aminokwasową, w której to sekwencji region zrębowy pochodzi z ludzkiej linii komórek zarodkowych, z segmentu Vk, DPK18 i segmentu J, Jk1, z kilkoma substytucjami w aminokwasach consensus w tej samej ludzkiej podgrupie V, w celu obniżenia potencjalnej immunogenności:

PL 218 883 B1

10 15

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu

25 30

Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile

40 45

Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro

55 60

Gly Gin Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe

70 75

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val

100 105

Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gin

110

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg (SEQ ID Nr. 9)

Szczególnie korzystny region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała może posiadać niżej podaną sekwencję aminokwasową, w której to sekwencji region zrębowy pochodzi z ludzkiej linii komórek zarodkowych, segmentu DP53 i segmentu J, JH4:

PL 218 883 B1

1

5

10

15

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

20

25

30

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

35

40

45

Arg

Tyr

Ser

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Leu

Val

Ala

Gin

Ile

Asn

Ser

Val

Gly

Asn

Ser

Thr

Tyr

65

70

75

Pro

Asp

Thr

Val

Lys

Giy

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

80

85

90

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

95

100

105

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

Ser

Gly

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

110

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

(SEQ

ID Nr. 10).

Korzystny łańcuch lekki humanizowanego przeciwciała ma następującą sekwencję aminokwasową:

PL 218 883 B1

5

Asp Val Val Met Thr

Gly Gin Pro Ala Ser

Tyr Ser Asp Gly Asn

Gly Gin Ser Pro Arg

Ser Gly Val Pro Asp

Phe Thr Leu Lys Ile

Tyr Tyr Cys Ser Gin

110

Gly Thr Lys Val Glu

125

Phe Ile Phe Pro Pro

140

Ser Val Val Cys Leu

155

Val Gin Trp Lys Val

170

Glu Ser Val Thr Glu

185

Ser Ser Thr Leu Thr

200

Val Tyr Ala Cys Glu

215

Thr Lys Ser Phe Asn

Gin Ser Pro Leu

Ile Ser Cys Arg

Ala Tyr Leu His

Leu Leu Ile Tyr

Arg Phe Ser Gly

Ser Arg Val Glu

Ser Thr His Val

Ile Lys Arg Thr

Ser Asp Glu Gin

Leu'Asn Asn Phe

Asp Asn Ala Leu

Gin Asp Ser Lys

Leu Ser Lys Ala

Val Thr His Gin

Ser Leu Pro Val Thr

Ser Ser Gin Ser Leu

Trp Phe Leu Gin Lys

Lys Val Ser Asn Arg

Ser Gly Ser Gly Thr

Ala Glu Asp Val Gly

100

Pro Trp Thr Phe Gly

115

Val Ala Ala Pro Ser

130

Leu Lys Ser Gly Thr

145

Tyr Pro Arg Glu Ala

160

Gin Ser Gly Asn Ser

175

Asp Ser Thr Tyr Ser

190

Asp Tyr Glu Lys His

205

Gly Leu Ser Ser Pro (SEQ ID Nr. 11)

Leu

Ile

Pro

Phe

Asp

Val

105

Gin

120

Val

135

Ala

150

Lys

165

Gin

180

Leu

195

Lys

210

Val

Arg Gly Glu Cys

PL 218 883 B1

Korzystny łańcuch ciężki humanizowanego przeciwciała ma następującą sekwencję aminokwasową:

10 15

Glu

Val

Gin

Leu

Val 20

Glu

Ser

Gly

Gly Leu Val 25

Gin

Pro

Gly 30

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

35

40

45

Arg

Tyr

Ser

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Leu

Val

Ala

Gin

Ile

Asn

Ser

Val

Gly

Asn

Ser

Thr

Tyr

65

70

75

Pro

Asp

Thr

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

80

85

90

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

95

100

105

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

Ser

Gly

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

110

115

120

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Giy

Pro

Ser

Val

PL 218 883 B1

125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

155

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

170

Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu

185

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

200

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

215

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

230

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

245

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290

Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr

305

Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu

130 135

Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150

Phe Pro Glu Pro Val Thr

160 165

Ser Gly Val His Thr Phe

175 180

Tyr Ser Leu Ser Ser Val

190 195

Thr Gin Thr Tyr Ile Cys

205 210

Lys Val Asp Lys Lys Val

220 225

Thr Cys Pro Pro Cys Pro

235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro

250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr

265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe

280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys

295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val

310 315

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

PL 218 883 B1

Dla łańcuchów lekkiego i ciężkiego humanizowanych przeciwciał i dla humanizowanego przeciwciała 266 możliwe są również inne sekwencje. Te immunoglobuliny mogą mieć dwie pary kompleksów łańcuch lekki/łańcuch ciężki, w których przynajmniej jeden łańcuch zawiera jeden lub większą ilość mysich regionów determinujących dopasowanie funkcyjnie połączonych z ludzkimi segmentami regionu zrębowego.

Niniejszym ujawniono także polinukleotydy rekombinacyjne kodujące przeciwciała, które, wytworzono w wyniku ekspresji tychże polinukleotydów zawierają CDR w łańcuchach ciężkim i lekkim z przeciwciała z kompozycji według wynalazku. Odnośnie ludzkiego regionu zrębowego, region zrębowy lub sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego nie-ludzkiej immunoglobuliny dostarczającej CDR jest porównywana z odpowiadającymi sekwencjami w kolekcji sekwencji regionów zmiennych immunoglobuliny ludzkiej i jest wybierana sekwencja wykazująca wysoki procent identycznych aminokwasów. Przykładowe polinukleotydy, których ekspresja daje łańcuchy polipeptydowe zawierające CDR łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała monoklonalnego 266 są przedstawione na fig. 4 i 5. Ze względu na degenerację kodonu i substytucje aminokwasowe nie mające krytycznego znaczenia, sekwencje te można z łatwością zastąpić innymi sekwencjami polinukleotydowymi. Szczególnie korzystne ujawnione polinukleotydy kodują przeciwciała, które wytworzone w wyniku ekspresji, zawierają regiony hiperzmienne (CDR) odpowiadające sekwencjom SEQ ID Nr. 1 - SEQ ID Nr. 6 lub regiony

PL 218 883 B1 zmienne odpowiadające sekwencjom SEQ ID Nr. 7 - SEQ ID Nr. 10 albo łańcuchy lekki i ciężki odpowiadające sekwencjom SEQ ID Nr. 11 i SEQ ID Nr. 12.

Polinukleotydy te będą na ogół ponadto zawierały sekwencję polinukleotydową kontrolującą ekspresję, związaną operacyjnie z sekwencjami kodującymi humanizowaną immunoglobulinę, w tym naturalne lub heterologiczne regiony promotora. Korzystnie, sekwencje kontrolujące ekspresję będą eukariotycznymi układami promotora w wektorach zdolnych do transformowania lub transfekowania eukariotycznych komórek gospodarza, ale można również użyć sekwencje kontrolne dla gospodarzy prokariotycznych. Po wprowadzeniu wektora do odpowiedniej linii komórek gospodarza, komórki te namnaża się w warunkach umożliwiających wysoki stopień ekspresji tych sekwencji nukleotydowych, i o ile to pożądane, można prowadzić operacje gromadzenia i oczyszczania łańcuchów lekkich, łańcuchów ciężkich, dimerów łańcucha lekkiego i ciężkiego bądź całych przeciwciał, fragmentów łączących i innych form immunoglobuliny.

Ujawnione sekwencje polinukleotydowe zdolne ostatecznie do ekspresji żądanych humanizowanych przeciwciał można tworzyć z wielu różnych polinukleotydów (genomowego lub cDNA, synt etycznych oligonukleotydów, i podobnych) i komponentów (np. regionów V, J, D i C) wykorzystując wiele różnych technik. Łączenie odpowiednich sekwencji genomowych i syntetycznych jest powszechnie stosowanym sposobem produkcji, jednak można również użyć sekwencje cDNA.

Sekwencje ludzkiego regionu stałego można izolować stosując znane procedury z wielu różnych komórek ludzkich ale korzystnie z unieśmiertelnionych komórek B. Regiony CDR do produkcji ujawnionych immunoglobulin będą podobnie pochodziły z nie-ludzkich przeciwciał monoklonalnych zdolnych do wiązania się z epitopem pomiędzy aminokwasem 13 a 28 w peptydzie Λβ, które to przeciwciała monoklonalne wytwarza się w dowolnym dogodnym źródle ssaczym obejmującym myszy, szczury, króliki i inne kręgowce mające właściwości wytwarzania przeciwciał, wykorzystując znane sposoby opisane powyżej. Odpowiednie komórki źródłowe dla sekwencji polinukleotydowych i komórki gospodarza do ekspresji i wydzielania immunoglobuliny można uzyskać z wielu źródeł dobrze znanych w stanie techniki.

Poza humanizowanymi immunoglobulinami szczegółowo tu opisanymi, można łatwo projektować i wytwarzać inne zasadniczo homologiczne modyfikowane immunoglobuliny, stosując różne, znane specjalistom, techniki rekombinacji DNA. Przykładowo, regiony zrębowe mogą się różnić od sekwencji natywnych na poziomie struktury pierwszorzędowej kilkoma substytucjami aminokwasowymi, addycjami i delecjami na końcach i w środku sekwencji i podobnymi zmianami. Ponadto, jako podstawę do humanizowanych ujawnionych immunoglobulin można użyć pojedynczo lub w kombinacjach wiele różnych ludzkich regionów zrębowych. W zasadzie, modyfikacji genów można z łatwością dokonywać wieloma różnymi, dobrze znanymi technikami, takimi jak sterowana miejscem mutageneza.

Alternatywnie, można wytwarzać fragmenty polipeptydowe zawierające tylko część pierwszorzędowej struktury przeciwciała, które to fragmenty posiadają jedną lub więcej aktywności immunoglobuliny (np. aktywność wiązania dopełniacza). Takie fragmenty polipeptydowe można wytwarzać przez rozszczepienie proteolityczne całych przeciwciał metodami znanymi w stanie techniki albo przez insercję kodonów stopu w żądanych miejscach w wektorach użytych do sterowanej miejscem mutagenezy, takich jak po CH1, w celu wytworzenia fragmentów Fab albo po regionie zawiasowym, wytwarzając fragmenty F(ab')2. Przeciwciała jednołańcuchowe można wytwarzać przez połączenie genów VL i VH łącznikiem DNA.

Jak podano powyżej, kodujące sekwencje nukleotydowe będą podlegały ekspresji w gospodarzach po ich operacyjnym związaniu z sekwencją kontrolującą ekspresję (usytuowaną tak, aby zapewnić ich funkcjonowanie). Na ogół, takie wektory ekspresyjne replikują się w organizmach gospodarzy albo jako episomy albo jako integralna część chromosomalnego DNA gospodarza. Zazwyczaj, wektory ekspresyjne będą zawierały markery umożliwiające selekcję, np. marker tetracyklinowy lub neomycynowy, pozwalające na detekcję komórek transformowanych żądanymi sekwencjami DNA.

E. coli jest gospodarzem prokariotycznym szczególnie użytecznym do klonowania ujawnionych polinukleotydów. Do innych gospodarzy mikrobakteryjnych przydatnych do użycia należą bakterie z rodzaju Bacillus, takie jak Bacillus subtilis i inne pałeczki jelitowe (Enterobacteriaceae), takie jak Salmonella, Serratia i różne rodzaje Pseudomonas. W tych gospodarzach prokariotycznych można również wbudowywać wektory ekspresyjne, które na ogół będą posiadały sekwencje kontroli ekspresji zgodne z komórką gospodarza (np. źródło replikacji). Ponadto, może się w nich zawierać jeden z wielu znanych promotorów, takich jak układ promotora laktozowego, układ promotora tryptofanowego (trp), układ promotora betalaktamazy lub układ promotora z faga lambda. Promotory te będą kontro20

PL 218 883 B1 lowały ekspresję, ewentualnie łącznie z sekwencją operatora i będą posiadały sekwencje miejsca wiązania rybosomu i podobne, do inicjowania i zakańczania transkrypcji i translacji.

Do ekspresji można również użyć inne mikroorganizmy, takie jak drożdże. Korzystnym gospodarzem są Saccharomyces z odpowiednimi wektorami posiadającymi sekwencje kontroli ekspresji, takie jak promotory obejmujące sekwencje dla kinazy 3-fosfoglicerynianowej albo innych enzymów glikolitycznych oraz źródło replikacji, sekwencje terminatora i podobne, stosownie do potrzeb.

Poza mikroorganizmami, do ekspresji i produkcji polipeptydów można również użyć hodowle tkankowe ssacze. Faktycznie preferowane są komórki eukariotyczne, gdyż opracowano dotychczas wiele odpowiednich linii komórkowych gospodarzy zdolnych do sekrecji całych immunoglobulin. Należą do nich linie komórek CHO, różne linie komórek COS, linie komórek jajowych chomika syryjskiego, komórki HeLa, korzystnie linie komórek szpiczaka, transformowane komórki B, ludzkie linie embrionalnych komórek nerki albo hybrydoma. Wektorami ekspresyjnymi dla tych komórek mogą być sekwencje kontroli ekspresji, takie jak źródło replikacji, promotor lub wzmacniacz i niezbędne miejsca przetwarzania informacji, takie jak miejsca wiązania rybosomu, miejsca składania miejsca poliadenylacji i sekwencje zakańczania transkrypcji. Korzystnymi sekwencjami kontroli ekspresji są promotory pochodzące z genów immunoglobulin, SV40, Adenowirusa, bydlęcego wirusa brodawek, cytomegalowirusa i podobnych.

Wektory niosące żądane sekwencje nukleotydowe (np. sekwencje kodujące łańcuch ciężki i łańcuch lekki oraz sekwencje kontrolujące ekspresję) można wprowadzać do komórki gospodarza znanymi sposobami, które są zróżnicowane i zależą od typu komórki gospodarza. Przykładowo, transfekcję z użyciem chlorku wapnia powszechnie stosuje się w odniesieniu do komórek prokariotycznych a traktowanie fosforanem wapnia bądź elektroporację można stosować wobec komórek innych gospodarzy.

Po ekspresji, całe przeciwciała, ich dimery, poszczególne łańcuchy lekkie i ciężkie lub inne formy immunoglobuliny można oczyszczać stosując standardowe procedury znane ze stanu techniki, w tym strącanie siarczanem amonowym, chromatografię kolumnową jono-wymienną, powinowactwa, z odwróconymi fazami, chromatografię z wykorzystaniem oddziaływania hydrofobowego, elektroforezę w żelu i podobne. Korzystne są zasadniczo czyste immunoglobuliny, o homogenności co najmniej około 90 do 95% a najkorzystniejsze do celów farmaceutycznych są immunoglobuliny o homogenności 98 do 99%. Po oczyszczeniu częściowym lub do żądanej homogenności, polipeptydy te można stosować do celów leczniczych lub profilaktycznych, jak opisano powyżej.

Przeciwciała (w tym fragmenty aktywne immunologicznie) podaje się osobnikowi zagrożonemu lub takiemu, u którego wystąpiły już objawy lub patologie związane z peptydem Aβ, takie jak kliniczna lub przedkliniczna faza choroby Alzheimera, zespół Downa lub kliniczna bądź przedkliniczna faza angiopatii amyloidowej, stosując standardowe techniki podawania, korzystnie obwodowe (czyli nie przez podawanie do ośrodkowego układu nerwowego), drogą dożylną, dootrzewnową, podskórną, dopłucną, transdermalną, domięśniową, donosową, dopoliczkową, podjęzykową lub przez podanie czopka. Jakkolwiek przeciwciała można podawać bezpośrednio do układu komorowego, płynu rdzeniowego lub miąższu mózgu a techniki dostarczania do tych miejsc są dobrze znane, nie ma potrzeby stosowania tych znacznie trudniejszych procedur. Ujawnione przeciwciała są skuteczne po podaniu prostszymi technikami opartymi na dostarczaniu do obwodowego układu krążenia. Korzyści z wynalazku obejmują zdolność przeciwciała do wywierania korzystnego działania nawet wówczas, gdy nie jest ono dostarczone bezpośrednio do samego ośrodkowego układu nerwowego. Rzeczywiście, wykazano w niniejszym opisie, że ilość przeciwciała, która przechodzi przez barierę krew-mózg wynosi <0,1% jego poziomu w osoczu i że przeciwciała według wynalazku mają zdolność sekwestrowania również w krążeniu obwodowym, zmieniając klirens rozpuszczalnego peptydu Αβ w o.u.n. i w osoczu.

Kompozycje farmaceutyczne przeznaczone do stosowania projektuje się tak, aby były odpowiednie do wybranego sposobu podawania. Stosuje się w nich, stosownie do potrzeb, dopuszczalne farmaceutycznie substancje pomocnicze, takie jak środki dyspergujące, bufory, środki powierzchniowo czynne, środki konserwujące, solubilizujące, środki nadające izotoniczność, środki stabilizujące i podobne. Encyklopedia Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, ostatnie wydanie, włączona do niniejszego opisu jako odnośnik, dostarcza całej wiedzy o technikach sporządzania preparatów farmaceutycznych i jest ogólnie znana specjalistom sporządzającym formy leków. Może się okazać szczególnie użyteczna zmiana właściwości rozpuszczalności przeciwciał według wynalazku tak, aby stały się bardziej lipofilowe, np. przez ich enkapsulację w liposomach albo przez zablokowanie grup polarnych.

PL 218 883 B1

Korzystne jest dostarczanie układowe obwodowe przez iniekcje dożylne, dootrzewnowe albo podskórne. Nośniki odpowiednie do takich iniekcji są proste. Ponadto, przeciwciała te można dostarczać również przez błony śluzowe, podając aerozole lub czopki. Odpowiednie receptury dla tych sposobów stosowania są dobrze znane i zazwyczaj zawierają środki powierzchniowo czynne ułatwiające przenikanie przez błonę. Te środki powierzchniowo czynne są często pochodnymi steroidowymi albo lipidami kationowymi, takimi jak chlorek N-[1-(2,3-dioleoilo)propylo-N,N,N-trimetyloamoniowy (DOTMA) albo różnymi związkami, takimi jak hemibursztynian cholesterolu, fosfatydyloglicerole i podobnymi.

Stężenie humanizowanego przeciwciała w preparatach będzie się zawierać w szerokich granicach, od tak niskiego jak około 0,1% do tak wysokiego jak 15 lub 20% wagowych i będzie ono dobrane głównie w oparciu o objętości płynów, lepkości i podobne czynniki, stosownie do wybranej konkretnej drogi podania. Tak więc, typowa kompozycja farmaceutyczna do iniekcji może być tak sporządzona, aby zawierała 1 ml sterylnej, buforowanej fosforanem soli fizjologicznej i 1 - 100 mg humanizowanego przeciwciała. Tę kompozycję sterylizuje się przez filtrację po jej sporządzeniu albo w inny sposób przygotowuje się kompozycję akceptowaną pod względem mikrobiologicznym. Typowa kompozycja do infuzji dożylnej powinna mieć objętość nawet 250 ml cieczy, takiej jak sterylny roztwór Ringera i stężenie przeciwciała wynoszące 1 - 100 mg/ml lub większe.

Ujawnione środki terapeutyczne można zamrażać albo liofilizować do przechowywania i rekonstytuowania przed użyciem w odpowiednim sterylnym nośniku. Liofilizacja i rekonstytucja może się wiązać z różnym stopniem spadku aktywności przeciwciała (np. wiadomo, że znane immunoglobuliny, przeciwciała IgM mają większą tendencję do spadku aktywności niż przeciwciała IgG). Dla wyrównania tych strat, powinny być odpowiednio dobrane dawki. Wartość pH tych preparatów powinna być tak dobrana, aby zachować równowagę pomiędzy stabilnością przeciwciała (chemiczną i fizyczną) a komfortem dla pacjenta podczas podawania. Na ogół, tolerowane jest pH w zakresie od 4 do 8.

Jakkolwiek powyższe metody wydają się najbardziej dogodne i najodpowiedniejsze do podawania białek, takich jak humanizowane przeciwciała to również, przy odpowiedniej adaptacji, mogą być stosowane inne techniki podawania, takie jak stosowanie transdermalne i doustne, pod warunkiem, że będzie opracowana właściwa forma preparatu farmaceutycznego.

Może być poza tym pożądane stosowanie preparatów o kontrolowanym uwalnianiu, z użyciem błon i matryc biodegradowalnych albo mini-pomp osmotycznych względnie układów dostarczania opartych na perełkach dekstranowych, alginianach bądź kolagenie.

Podsumowując, są dostępne preparaty do podawania przeciwciał jak ujawniono według wynalazku, są dobrze znane ze stanu techniki i mogą być dobrane spośród wielu możliwości.

Typowe zakresy dawek można optymalizować wykorzystując standardowe techniki kliniczne. Dawki te będą zależne od sposobu stosowania i stanu pacjenta.

Poniższe przykłady są zamieszczone dla ilustracji wynalazku, nie mają one na celu ograniczenia jego zakresu.

W przykładach tych użyto między innymi mysie przeciwciało monoklonalne oznaczone symbolem 266, które po raz pierwszy wytworzono przez immunizację peptydem złożonym z reszt 13-28 ludzkiego peptydu Αβ. Potwierdzono, że przeciwciało to wchodzi w reakcję immunologiczną z tym peptydem, jednak uprzednio doniesiono, że nie reaguje ono z peptydem zawierającym jedynie reszty 17-28 ludzkiego peptydu Αβ ani z żadnym innym epitopem w obrębie peptydu Λβ. Wytwarzanie tego przeciwciała jest opisane w publikacji patentu Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.766.846, wprowadzonej do niniejszego opisu jako odnośnik. Ponieważ w przykładach opisane są doświadczenia prowadzone w układach mysich, użycie mysich przeciwciał monoklonalnych jest wystarczające. Jednakże w ujawnionych sposobach leczenia mających zastosowanie u ludzi korzystne są humanizowane formy przeciwciał o swoistości immunologicznej właściwej dla przeciwciała 266.

P r z y k ł a d 1. Sekwestrowanie dodanego peptydu Αβ w płynach ludzkich

Próbki ludzkiego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) (po 50 μΊ) i osocza ludzkiego (po 50 μΊ) inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej następująco:

1. sama próbka

2. łącznie z 5 ng peptydu Λβ 40 albo

3. łącznie z 5 ng peptydu Λβ 40 plus 1 mg przeciwciała monoklonalnego 266 (opisanego np. w patencie US 5 766 846 wprowadzonym do niniejszego opisu jako odnośnik).

Próbki poddano elektroforezie w nie-denaturującym 4-25% żelu gradientowym, czyli niedenaturującej elektroforezie gradientowej (NDGGE) i przeniesiono na nitrocelulozę. Następnie wybar22

PL 218 883 B1 wiano bioty odczynnikiem Ponceau S lub, w przypadku Western-blottingu, używano znakowane biotyną przeciwciało monoklonalne (3D6) jako sondę, które reaguje z pierwszymi pięcioma aminokwasami peptydu Αβ, sondę wywoływano kompleksem: streptawidyna-peroksydaza chrzanowa i wykrywano metodą wzmocnionej chemiluminescencji (ECL). Średnice w stanie uwodnienia materiałów zawartych w prążkach na biotach szacowano względem markerów mas cząsteczkowych firmy Pharmacia. Tak więc, jeśli peptyd Aβ jest związany z innymi cząsteczkami, to powinien wędrować zgodnie z wielkością wytworzonego kompleksu.

Western bloty płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) bez dodatku lub z dodatkiem 5 ng peptydu Αβ nie wykazywały obecności peptydu Αβ w odpowiedzi na detekcję z udziałem przeciwciała 3D6. Podobne wyniki otrzymano dla osocza ludzkiego. Było to prawidłowe, pomimo faktu, że peptyd Aβ mógł być wykryty metodą SDS-PAGE z następującym Western-blottingiem z użyciem tej samej techniki i na tych samych próbkach CSF. Prawdopodobnie, detekcji peptydu Aβ przeciwdziałały interakcje między tym peptydem a innymi czynnikami w testowanych płynach. Jednakże, jeśli do mieszaniny inkubacyjnej dodano Mab 266 to występowały charakterystyczne prążki reprezentujące sekwestrowany peptyd Αβ skompleksowany z przeciwciałem, zarówno w osoczu jak i w CSF. Cząsteczki w głównym prążku miały średnicę w stanie uwodnionym około 11 nm, co odpowiada monomerowi przeciwciała, dodatkowy mniejszy prążek zawierał cząsteczki o średnicy 13 nm, co odpowiada dimerowi przeciwciała.

P r z y k ł a d 2. Swoistość sekwestrującego przeciwciała

Użyto próbki zawierające 50 gl ludzkiego CSF lub 10 gl CSF APP^V717F. APP^V717F to myszy transgeniczne reprezentujące mysi model choroby Alzheimera. Zachodzi w nich ekspresja transgenu dla białka prekursorowego ludzkiego amyloidu z mutacją rodzinnej choroby Alzheimera, co powoduje, że w ośrodkowym układzie nerwowym wytwarzany jest ludzki peptyd Aβ.

Próbki inkubowano z dodatkiem lub bez dodatku różnych przeciwciał monoklonalnych (Mab) w ilości po 1 gg, przez godzinę w temperaturze pokojowej i następnie poddano je elektroforezie na 4-25% NDGGE i przeniesiono na nitrocelulozę, jak w przykładzie 1. Użyto następujące przeciwciała:

Mab 266 (wiąże się w pozycjach 13-28);

Mab 4G8 (wiąże się w pozycjach 17-24);

QCBpan (przeciwciało poliklonalne królika dla pozycji 1-40);

Mysią IgG (nie-swoista);

Mab 3D6 (wiąże się w pozycjach 1-5);

Mab 21F12 (wiąże się w pozycjach 33-42);

Mab 6E10 (wiąże się w pozycjach 1-17); i

QCB₄₀,₄₂ (przeciwciała poliklonalne królika dla Aβ₄₀ i Aβ₄₂).

Detekcję kompleksu peptydu Αβ z przeciwciałem prowadzono w sposób opisany w przykładzie 1, z użyciem wyznakowanego biotyną 3D6 (dla N-końca peptydu Aβ) następnie streptawidyny-peroksydaza chrzanowa, i z detekcją ECL. Podobną detekcję prowadzono w próbkach ludzkiego CSF inkubowanych z Mab 266, w niektórych przypadkach zastąpionym przez QCB40,42 które wiąże się z końcem karboksylowym peptydu Aβ, dla 3D6.

Doświadczenia wykazały, że spośród testowanych przeciwciał, tylko Mab 4G8 i Mab 266 pozwalały na detekcję peptydu Aβ.

Wyniki pokazały, że w ludzkim CSF, tylko Mab 266 i Mab 4G8 miały zdolność sekwestrowania w wykrywalnych ilościach kompleksu przeciwciało^ (również w tym przypadku, bez dodania przeciwciała nie wykrywano Aβ). Mab 266 dawało również wyniki podobne do tych, jakie uzyskano dla ludzkiego CSF w doświadczeniach z CSF pochodzącym od transgenicznych myszy APP^V717F. Peptyd Αβ mógł być sekwestrowany w ludzkim CSF w próbach z użyciem Mab 266 niezależnie od tego, czy do wywoływania Western-blotów w Western-blottingu było użyte przeciwciało 3D6 czy QCB40,42.

P r z y k ł a d 3. Wykazanie kompleksu peptyd Αβ - Mab 266 w dwukierunkowej elektroforezie

Próbkę zawierającą 50 ng peptydu Αβ40 inkubowano z 2 gg Mab 266 w temperaturze 37°C przez 3 godziny. Jako kontrolę prowadzono równoległą inkubację z samym Mab 266. Następnie próbki poddano dwukierunkowej elektroforezie żelowej. W pierwszym kierunku, inkubowane próbki rozwijano techniką NDGGE, jak opisano w przykładzie 1. Żel poliakryloamidowy cięto na poszczególne pasma, prostopadle do kierunku rozwijania w pierwszym kierunku, a w drugim kierunku przeprowadzono rozdział w żelu w warunkach denaturujących/redukujących metodą SDS-PAGE (w żelu Tricine-mocznik). Obecność prążków wykrywano albo metodą barwienia odczynnikiem Ponceau-S (każde

PL 218 883 B1 białko) albo metodą specyficznego wywoływania z użyciem przeciwciała 6E10 Mab (Senetek Inc.) i biotynylowanego anty-mysiego Αβ w układzie detekcji opartym na peroksydazie chrzanu (HRP).

Barwienie odczynnikiem Ponceau-S blotów na nitrocelulozie po przeniesieniu umożliwiło wizualizację łańcuchów ciężkiego i lekkiego samego Mab 266. Potwierdzono, że peptyd Αβ znajdował się w kompleksie z Mab 266, gdyż wystąpił prążek przy 4 kDa, odpowiadający wielkości Mab 266 o pełnej długości widocznemu po elektroforezie NDGGE w pierwszym kierunku.

P r z y k ł a d 4. Wykazanie nierównoważności wiązania i sekwestrowania

Jako, że peptyd Αβ krąży w osoczu i w CSF, sądzi się, że znajduje się on w kompleksie z białkami, w tym z apolipoproteiną E. W niniejszym przykładzie wykazano, że przeciwciała przeciw apoE, chociaż zdolność wiązania się z kompleksem, nie sekwestrują apoE z pozostałej reszty kompleksu.

Kompleksy apoE (500 ng) inkubowano z Mab lub z przeciwciałami poliklonalnymi przeciw apoE (2 μ-g) w temperaturze 37°C przez godzinę. Po inkubacji, próbki poddano elektroforezie NDGGE z użyciem technik opisanych w przykładzie 1. Po NDGGE przeprowadzono Western-blotting z użyciem oczyszczonych metodą powinowactwa kozich przeciwciał anty-apoE, z detekcją ECL. Jeśli przeciwciało jest nieobecne, wówczas apoE można wykryć w paśmie 8-13 nm odpowiadającym jej obecności w cząsteczkach lipoproteiny. Obecność monoklonalnych lub poliklonalnych przeciwciał przeciw apoE powoduje przesunięcie populacji apoE w kierunku związków o większych masach cząsteczkowych, tak zwane super przesunięcie (super shift). Jest to dowodem na fakt, że przeciwciała przeciw apoE nie sekwestrują, czyli nie usuwają apoE z cząsteczki lipoproteinowej, natomiast wiążą się z apoE na lipoproteinach wytwarzając cząsteczki o większych masach cząsteczkowych.

P r z y k ł a d 5. Przeciwciała anty-apoE nie zaburzają sekwestrowania Αβ

Próbkę 100 ludzkiego CSF inkubowano albo z samym Mab 266 albo z poliklonalnym anty-apoE albo z obydwoma przeciwciałami, w czasie 60 minut w temperaturze 37°C. Próbki analizowano metodą NDGGE, jak opisano w przykładzie 1 i następnie prowadzono detekcję prążków jak opisano w przykładzie 1.

Wyniki doświadczenia wskazują, że jeśli do próbki był dodany Mab 266, wówczas był widoczny prążek odpowiadający średnicy około 11 nm, charakterystycznej dla zsekwestrowanego kompleksu: Mab 266-peptyd Αβ. Jest to przypadek, w którym anty-apoE jest obecne lub nieobecne. Ten prążek, reprezentujący zsekwestrowany Αβ, pojawiał się również jeśli do mieszaniny inkubacyjnej zawierającej Mab 266 dodano 50 ng peptydu Ap. Tak więc, zmiana masy cząsteczkowej apoE w obecności przeciwciał anty-apoE nie zakłóca sekwestrowania peptydu Αβ przez Mab 266.

P r z y k ł a d 6. Sekwestrowanie peptydu Αβ in vivo

A. W transgenicznych myszach APP^V717F, znanych również pod nazwą myszy PDAPP, zachodzi nad-ekspresja zmutowanej formy ludzkiego białka APP. Myszy te wytwarzają ludzki Αβ w ośrodkowym układzie nerwowym i mają podwyższony poziom ludzkiego peptydu Αβ krążącego w CSF i w osoczu. Myszom ośmiomiesięcznym wstrzykiwano dożylnie sól fizjologiczną lub 100 pg Mab 266. Od myszy pobierano krew po 10 minutach od początkowej iniekcji i po 20 godzinach od początkowej iniekcji.

Próbki zawierające 20 pl osocza od każdego zwierzęcia analizowano metodą NDGGE i Western-blottingiem, z przeciwciałem 3D6, jak to opisano w przykładzie 1. U zwierząt traktowanych solą fizjologiczną nie wykazano obecności prążka odpowiadającego średnicy 11 nm, charakterystycznego dla sekwestrowanego peptydu Αβ ani po 10 minutach ani po 20 godzinach. Jednakże u dwu zwierząt, którym wstrzyknięto Mab 266 był widoczny ten prążek w osoczu pobranym po 20 godzinach.

B. W tym badaniu użyto dwumiesięczne myszy APP^V717F. W dniu 0, myszom nie podano wcale Mab 266, podano 1 mg Mab 266 albo 100 pg tego przeciwciała. Pobierano próbki osocza na dwa dni przed podaniem przeciwciał i w dniach 1, 3, 5 i 7. Próbki osocza analizowano metodą NDGGE z następnym Western-blottingiem i detekcją 3D6, jak opisano w przykładzie 1. We wszystkich punktach czasowych po podaniu Mab 266, wykrywano kompleks 266/Αβ, o ile próbka osocza nie była traktowana białkiem G, które wiąże się z immunoglobuliną, usuwając przez to skutecznie Mab 266. Oznaczano zgodne poziomy kompleksu w badanym czasie za wyjątkiem lekkiego spadku w siódmym dniu u zwierząt, którym wstrzyknięto 100 pg Mab 266. Generalnie, poziomy kompleksu u zwierząt, którym podano 100 pg były zgodnie niższe od poziomów oznaczonych u myszy, którym podano 1 mg tego przeciwciała.

C. Dwóm dwumiesięcznym myszom APP^V717F podano dożylnie po 1 mg Mab 266 i od każdej myszy pobrano 25 pl próbkę osocza. Próbkę osocza analizowano metodą NDGGE, następnie prowadzono Western-blotting, jak opisano powyżej, z tym wyjątkiem, że po związaniu z biotynylowanym

125 przeciwciałem 3D6 prowadzono detekcję streptawidyną I (Amersham) i ekspozycję na kliszę wła24

PL 218 883 B1 ściwą dla substancji znakowanych izotopem fosforu. Poziom kompleksu oceniano przez porównanie z krzywą standardową sporządzoną na znanych ilościach skompleksowanego z wysycającymi ilościami Mab 266 i prowadząc podobną detekcję. Ilość peptydu związanego z Mab 266 szacowano na około 100 ng/ml, co oznacza mniej więcej 1000-krotny wzrost ponad poziom endogennego peptydu Aβ u tych myszy, oznaczony na około 100 pg/ml. Jest on podobny również do poziomu peptydu Aβ w mózgu myszy APP^V717F przed odłożeniem się Aβ (50-100 ng/g). Ludzki APP i ludzki Aβ u myszy APP^V717F Tg jest wytwarzany prawie wyłącznie w mózgu. Okazuje się zatem, że obecność Mab 266 w osoczu działa jak zatapiacz peptydu Aβ, ułatwiając jego wypływ netto z ośrodkowego układu nerwowego i osocza. Ten zwiększony wypływ netto prawdopodobnie wynika zarówno ze zwiększonego wypływu Aβ z o.u.n. do osocza jak i z zapobiegania temu, aby Aβ obecny w osoczu powtórnie wnikał do mózgu.

Prawidłową wielkość sekwestrowanego peptydu Aβ potwierdzono przez elektroforezę 20 pl próbek osocza, uzyskanego od myszy APP^V717F po 24 godzinach od iniekcji 1 mg Mab 266 metodą SDS-PAGE w żelu TRIS-tricine i następujący Western-blotting z użyciem przeciwciała 6E10 anty-Aji przed lub po ekspozycji na białko G, w postaci perełek ze związanym białkiem G. Prążek, który nie zawierał białka G był wykrywany w paśmie 4-8 kDa, co jest zgodne z obecnością monomerów i prawdopodobnie dimerów peptydu Aβ.

D. Dwumiesięcznym myszom APP^V717F podano dootrzewnowo albo PBS (n=7) albo 500 pl biotynylowanego Mab 266, czyli m266B (n=9). Przed iniekcją i po 24 godzinach od podania iniekcji analizowano osocze na całkowity peptyd Aβ metodą ELISA zmodyfikowaną według Johnsona-Wooda K. i wsp. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 1550-1555] i Balesa K. R., i wsp. [Nature Genet (1997) 17: 263-264]. Całkowity Aβ związany z m266B oznaczano w 96-dołkowych płytkach Optiplates (Packard, Inc.) powleczonych przeciwciałem m3D6. Rozcieńczone próbki osocza i standardy (różne stężenia i m266B) inkubowano przez noc w powleczonych płytkach i oznaczono ilość całkowitego komplek125 su Aβ/m266B metodą z użyciem I-streptawidyny. Ponadto, w punkcie czasowym 24-tej godziny, próbki osocza na początku traktowano białkiem G w celu ilościowego oznaczenia peptydu Aβ nie związanego z Mab 266, a następnie oznaczano w płynie mózgowo-rdzeniowym całkowity Aβ ^_Totai) i Aβ₄2 metodą ELISA. U zwierząt traktowanych PBS, poziomy peptydu Aβ w osoczu wynosiły 140 pg/ml zarówno przed jak i po iniekcji. Poziomy w osoczu były podobne jak przed iniekcją u myszy, którym wstrzyknięto Mab 266 ale poziomy peptydu Aβ nie związanego z Mab 266 były niewykrywalne po 24 godzinach od iniekcji.

Oznaczano również poziomy w CSF. CSF reprezentuje przedział pozakomórkowy w ośrodkowym układzie nerwowym i stężenie cząsteczek w CSF jest w pewnym stopniu odzwierciedleniem stężenia substancji w przestrzeni pozakomórkowej mózgu. CSF pobierano ze zbiornika móżdżkowordzeniowego. Myszy usypiano pentobarbitalem i usuwano umięśnienie od podstawy czaszki do pierwszego kręgu. CSF zbierano przez ostrożne nakłucie mikroigłą pod mikroskopem preparacyjnym błony pajęczynówkowej okrywającej zbiornik i wyciągnięcie CSF do mikropipepty polipropylenowej. Po 24 godzinach od iniekcji, stwierdzono wzrost poziomu całkowitego peptydu Aβ w CSF u myszy, którym wstrzyknięto Mab 266 i około dwukrotny wzrost w poziomie w porównaniu z poziomem u myszy, którym podano PBS. Potwierdzono to wykonując elektroforezę w żelu denaturującym i następującym Western-blottingiem z Aβ₄2-swoistym przeciwciałem 21F12.

W dodatkowym doświadczeniu, trzymiesięcznym myszom APP^V717F Tg wstrzyknięto albo PBS albo Mab 266 dożylnie i oznaczano poziomy Aβ₄₀ i Aβ₄2 w sposób następujący:

Aby oznaczyć Aβ₄₀, użyto przeciwciało monoklonalne m2G3, swoiste względem Aβ₄₀. Próbę ELISA opisaną przez Johnsona-Wooda K. i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 1550-1555) zmodyfikowano przekształcając ją w próbę radioimmunologiczną (RIA) przez zastąpienie odczynnika

125 streptawidyna-HRP wyznakowaną ¹²⁵I-streptawidyną. Dla próbek osocza i CSF prowadzono procedurę w warunkach niedenaturujących, nie stosując guanidyny w buforach. Aby oznaczyć w homogenacie mózgu Aβ rozpuszczalne i nierozpuszczalne w węglanie, próbki homogenizowano w temperaturze 4°C, w roztworze o składzie: 100 węglanu, 40 NaCl (pH 11,5), wirowano z szybkością 10000 x g przez 15 minut i oznaczano Aβ we frakcjach supernatantu (rozpuszczalny) i peletkach (nierozpuszczalny), według opisu podanego w przytoczonej powyżej publikacji Johnson-Wood K. i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 1550-1555). Oznaczenie kompleksu Aβ/Mab 266 w osoczu prowadzono modyfikowaną próbą radioimmunologiczną. Myszom wstrzyknięto biotynylowane Mab 266 (Mab 266B) i izolowano osocze w wielu punktach czasowych. Całkowity Aβ związany z Mab 266 oznaczano w płytkach 96-dołkowych Optiplates (Packard, Inc.) powleczonych przeciwciałem m3D6. Rozcieńczone

PL 218 883 B1 próbki osocza i standardy (różne stężenia Aβ₄₀ i Mab 266B) inkubowano przez noc w powleczonych

125 płytkach i oznaczano ilość całkowitego kompleksu Aβ/Mab 266B metodą z użyciem I-streptawidyny.

Po trzech godzinach od dożylnego podania Mab 266, obserwowano dwukrotny wzrost poziomu Aβ₄₀ w CSF i nieznaczny wzrost poziomu Aβ₄2. Jednakże, zarówno po 24 jak i po 72 godzinach poziomy zarówno Aβ₄₀ jak i Aβ₄2 w CSF wzrastały dwu- do trzykrotnie. Podobne wyniki uzyskano prowadząc analizę w żelu denaturującym z następującym Western-blottingiem na obecność Aβ w połączonych płynach CSF. Wypływ Aβ przez płyn tkankowy mózgu, będący w pewnym stopniu odzwierciedleniem poziomu w CSF, jest prawdopodobnym wytłumaczeniem obserwowanego wzrostu Aβ w CSF.

Jest ważne, że zmiana w poziomach peptydu w CSF nie może być spowodowana wniknięciem Mab 266 do CSF, gdyż jego poziomy mierzone po 24 godzinach od iniekcji, wynoszące poniżej 0,1% poziomu Mab 266 w osoczu, są niewystarczające aby wytłumaczyć tę zmianę. Powyższe wyniki sugerują, że peptyd Aβ jest usuwany z miąższu mózgu do CSF dzięki obecności przeciwciała w układzie krążenia krwi.

Formy peptydu Aβ rozpuszczalne w PBS lub w buforze węglanowym oznaczano w homogenatach kory mózgowej u tych samych myszy, którym wstrzyknięto Mab 266 i u których analizowano CSF w sposób opisany powyżej. Obserwowano podobne wzrosty w poziomach tych rozpuszczalnych form w homogenatach kory mózgowej.

P r z y k ł a d 7. Mab 266 działa jak zatapiacz peptydu Aβ in vitro

Skonstruowano komorę dializacyjną działającą jako system in vitro do badania zdolności Mab 266 do działania jako zatapiacz peptydu Aβ. W górnej komorze rurki polipropylenowej oddzielonej od dolnej komory membraną dializacyjną specyficznie odcinającą cząsteczki o masach cząsteczkowych w zakresie 10-100 kDa umieszczono jeden ml ludzkiego CSF. Dolna komora zawierała 75 pl PBS z dodatkiem lub bez dodatku 1 pg Mab 266.

Stan równowagi ustalał się po 3 godzinach, co oznaczono przez poddanie materiału w dolnej komorze w różnych punktach czasowych działaniu kwaśnych żeli mocznikowych i następującej metodzie Western-blottingu na obecność peptydu Aβ z 6E10. Próbki denaturowano w kwasie mrówkowym do końcowego stężenia wynoszącego 80% (objętościowo) i redukowano 1%-owym β-merkaptoetanolem. Próbki poddano elektroforezie (od anody do katody) w buforze do rozwijania z 0,9 M kwasem octowym, w od 4% do 35% gradientowym żelu poliakryloamidowym zawierającym 6 M mocznika, 5% (objętościowo) lodowatego kwasu octowego i 2,5% odczynnika TEMED. Przed przeniesieniem na nitrocelulozę zobojętniano kwaśny odczyn żelu. Następnie, do identyfikacji Aβ zastosowano standardowe techniki Western-blottingu. Wykryte prążki odpowiadały masie cząsteczkowej 4 kDa.

Następnie oznaczono ilość Aβ usuniętego z górnej komory przez analizę techniką ELISA zawartości obydwu komór, górnej i dolnej (n=4) po 3 godzinach. Wyniki dla różnych odcięć mas cząsteczkowych w obecności i w nieobecności Mab 266 są przedstawione na fig. 1. Jak to jest widoczne na figurze, jedynie minimalne ilości peptydu Aβ przechodziły przez membranę jeśli w dolnej komorze znajdował się PBS, natomiast 50% peptydu Aβ ulegało sekwestrowaniu w dolnej komorze jeśli znajdował się w niej Mab 266 a masa cząsteczkowa odciętej frakcji wynosiła 25 kDa; wzrastające ilości przenikały przez membranę wraz ze wzrostem odcinanych mas cząsteczkowych do 100 kDa, gdzie prawie 100% peptydu Aβ przeszło przez membranę.

Zaobserwowano również, że przeciwciała 3D6 i 10D5, przeciw N-końcowi Λβ, mają zdolność przeciągania peptydu Λβ przez membranę w tym układzie, jakkolwiek nie mają one właściwości sekwestrowania peptydu Aβ w analizach opisanych w przykładzie 1. Wyniki doświadczenia wskazują, że przeciwciała przeciw peptydowi Aβ mają powinowactwo w warunkach doświadczenia wystarczające do sekwestrowania tego peptydu obok innych białek wiążących w roztworach fizjologicznych ale przeciwciała monoklonalne takie jak Mab 266, które wchodzą w reakcję immunologiczną z epitopem w pozycjach 13-28 są znacząco bardziej efektywne i wiążą się z większym powinowactwem.

W podobnych próbach, wydzielana przez astrocyty apoE, którą oczyszczano w sposób opisany przez DeMattos'a R. B. i wsp. [J. Biol. Chem. (1998) 273: 4206-4212], Sun'a Y. i wsp. [J. Neurosci. (1998) 18: 3261-3272] wywierała mały ale statystycznie znaczący wpływ na wzrost masy peptydu Λβ w dolnej komorze. Nie zaobserwowano żadnego widocznego wpływu w przypadku, gdy zamiast Mab 266 użyto poliklonalną IgG albo BSA.

P r z y k ł a d 8. Przepływ peptydu Aβ z ośrodkowego układu nerwowego do osocza

A. Jeden pg peptydu Aβ₄₀ rozpuszczono w 5 pl CSF szczura aby utrzymywać go w stanie rozpuszczonym i wstrzyknięto go do przestrzeni podpajęczynówkowej zbiornika móżdżkowo-rdzeniowego myszy rasy Swiss-Webster typu dzikiego. Myszom tym uprzednio podano dożylne iniekcje albo PBS

PL 218 883 B1 (n=3) albo 200 μg biotynylowanego Mab 266 (n=3). W różnych punktach czasowych od traktowania oznaczano poziom całkowitego Λβ (Ap_Total) w osoczu myszy metodą Λβ ELISA z użyciem 3D6 jako przeciwciała powlekającego i standardów Λβ zmieszanych z nadmiarem biotynylowanego Mab 266. Każdą próbkę osocza po pobraniu od każdego zwierzęcia, wysycano nadmiarem biotynylowanego Mab 266 w celu detekcji Aβ techniką EL^. U myszy, którym wstrzyknięto PBS występowały minimalne wykrywalne ilości tego peptydu, dając poziomy 0,15 ng/ml jako wartości szczytowe po 30-60 minutach i po tym czasie poziomy spadały w zasadzie do zera. U myszy, którym podano Mab 266 poziom peptydu Αβ w osoczu osiągnął po 60 minutach wartości 330-krotnie wyższe od wykrytych u myszy, którym wstrzyknięto PBS (około 50 ng/ml) a po 180 minutach poziom ten wzrósł do wartości średnio 90 ng/ml.

B. Powtórzono powyższą procedurę, wstrzykując dożylnie dawki 200 μg (n=3) albo 600 μg (n=3) dwumiesięcznym myszom APP^V717F Mab 266 wstrzyknięto dożylnie 3-miesięcznym myszom APP^V717F+/+ w powyższych dawkach. Przed iniekcją i w różnych punktach czasu po iniekcji dożylnej, oznaczano stężenie w osoczu Αβ związanego z Mab 266 metodą radioimmunologiczną. Szczegółowe wyniki dla jednej przykładowej myszy są przedstawione na fig. 2.

Okazało się, że stężenie Λβ związanego z przeciwciałem monoklonalnym Mab 266 wzrosło w ciągu 4 dni z poziomów wyjściowych 150 pg/ml do poziomów ponad 100 ng/ml. Z analizy wczesnych punktów czasowych na krzywej wyznaczono, że szybkość wnikania netto Λβτο^ι do osocza myszy APP^V717F Tg wynosiła 42 pg/ml/minutę wobec wysycających poziomów tego przeciwciała.

Badanie wpływu Mab 266 na poziomy Λβ w osoczu, zarówno u myszy typu dzikiego jak i myszy APP^V717F Tg, jak również wpływu tego przeciwciała na stężenie Aβ w CSF wykazało, że obecność Mab 266 krążącego we krwi powoduje zmianę w równowadze przepływu Λβ lub w jego transporcie pomiędzy ośrodkowym układem nerwowym a osoczem.

P r z y k ł a d 9. Wpływ Mab 266 na Λβ w mózgu

Czteromiesięcznym myszom ΛPP^V717F+/+ podawano co 2 tygodnie przez 5 miesięcy dootrzewnowo iniekcje soli fizjologicznej, Mab 266 (500 μg) albo kontrolną IgG mysią 100 μg, Pharmigen). Myszy uśmiercano w wieku 9 miesięcy i oznaczano odkładanie się Λβ w korze mózgowej. Ilościowo oznaczano procent powierzchni objętej reaktywnością immunologiczną Αβ zidentyfikowaną przeciwciałem pan-Aji królika (QCB, Inc.) w korze mózgowej bezpośrednio pokrywającej grzbietową część hipokampa, w sposób opisany przez Holtzmana D. M. i wsp. ^nn. Neurol. (2000) 97: 2892-2897]. Wyniki są przedstawione na fig. 3Λ. W tym wieku, u około połowy zwierząt z każdej grupy nie zaczęło się odkładanie Λβ. Jednakże, procent myszy z >50% obciążeniem Λβ w korze mózgowej był znacząco niższy (p=0,02, test Chikwadrat) w grupie zwierząt traktowanych Mab 266. Jakkolwiek u myszy APP^V717F w ciągu 9 miesięcy mogą się odłożyć bardzo duże ilości złogów Aβ to zaznacza się duża zmienność. U około 50% myszy nie obserwuje się złogów a u około 50% występują znaczne złogi. U myszy traktowanych PBS i IgG, odpowiednio 6/14 i 5/13 myszy miało powyżej 50% kory mózgowej objętej barwieniem na Αβ podczas gdy u jedynie jednej z 14 myszy traktowanych Mab 266 wystąpił taki poziom zabarwienia. U prawie 50% zwierząt we wszystkich grupach wcale nie rozwinęły się złogi Αβ do wieku 9 miesiąca życia. Ten ostatni fakt wydaje się wynikać z pochodzenia rodzicielskiego poszczególnych myszy w naszej kohorcie, gdyż chociaż u wszystkich badanych myszy potwierdzono, że mają typ APP^V717F+/+, to wysokie poziomy złogów Λβ obserwowano jedynie u myszy pochodzących od 4/8 par hodowlanych (mioty o wysokiej patologii). Myszy pochodzące od innych 4 par hodowlanych były rzeczywiście wolne od złogów Λβ (mioty o niskiej patologii). Przyjmując pochodzenie rodzicielskie jako dodatkową zmienną, uzyskano silny, znaczący wpływ m266 na zmniejszenie złogów Λβ (p=0,0082, fig. 3B).

P r z y k ł a d 10. Wstrzyknięte obwodowo Mab 266 nie wiąże się z płytkami u myszy APP^V717F Tg

Do badania, czy Mab 266 wstrzykiwany dootrzewnowo w ciągu 5 miesięcy związał się z Λβ w mózgu, użyto skrawki mózgów od 9-miesięcznych myszy ΛPP^V717F Tg ze złogami uprzednio traktowanych albo Mab 266 albo solą fizjologiczną albo kontrolną IgG. Obróbkę tkanki i barwienie immunologiczne prowadzono w sposób opisany w piśmiennictwie [Bales K. R. i wsp., Nature Genet.(1997) 17: 263-264]. Tkankę pobraną od wszystkich grup zwierząt inkubowano z wyznakowaną fluoresceiną IgG anty-mysią (Vector, Inc.) a następnie badano pod mikroskopem fluorescencyjnym. W żadnej z grup nie było widocznych specyficznych barwnych plam złogów Λβ. Odwrotnie, jeśli zastosowano Mab 266 na skrawki przed ich inkubacją z anty-mysią IgG, wówczas złogi Λβ były łatwo wykrywalne.

P r z y k ł a d 11. Wpływ podawania przeciwciała 266 na pojmowanie 24-miesięcznych transgenicznych, hemizygotycznych myszy PDAPP

PL 218 883 B1

Użyto 16 hemizygotycznych, transgenicznych myszy APP^V717F. Na początku badania wiek myszy wynosił około 24 miesiące. Wszystkie iniekcje podawano dootrzewnowo (i.p.). Połowa myszy dostawała cotygodniowe iniekcje buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) i służyła jako kontrola a drugiej połowie podawano 500 mikrogramów mysiego przeciwciała 266 rozpuszczonego w PBS. Iniekcje stosowano w czasie 7 tygodni (42 dni), podając ogółem po 6 iniekcji. Po trzech dniach od ostatniej iniekcji oceniano zachowanie się zwierząt w próbie zadania rozpoznania przedmiotu (Object recognition task), prowadzonej zasadniczo w sposób opisany w publikacji J.-C.Dodart'a i wsp. [Behavioral Neuroscience 113 (5) 982-990 (1999)]. Wyliczano współczynnik rozpoznawania (TB x 100)/(TB-TA). Wyniki są podane w poniższej tabeli 1.

T a b e l a 1. Statystyka opisowa dla współczynnika rozpoznawania

	Współczynnik rozpoznawania	minuty)
	N	Średnia	Odchylenie standardowe	Błąd standardowy
Kontrola	8	y-\| 2**	8,80	3,11
(PBS)
Przeciwciało	8	54,35	7,43	2,62
266

p=0,0010

Podawanie 500 mikrogramów przeciwciała 266 cotygodniowo, 24-miesięcznym, hemizygotycznym, transgenicznym myszom wiązało się ze znaczącą zmianą zachowania. Myszy transgeniczne traktowane przeciwciałem miały współczynniki rozpoznawania podobne jak u kontrolnych myszy typu dzikiego [J.-C. Dodart i wsp.]. Różnica we współczynniku rozpoznawania była statystycznie znamienna przy poziomie prawdopodobieństwa 0,001. Większy współczynnik rozpoznawania wskazuje na to, że traktowanie przeciwciałem, które wiąże się z peptydem beta-amyloidowym w regionie 13-28 aminokwasów będzie odwracać upośledzenie behawioralne, które jest udokumentowane w mysim modelu choroby Alzheimera. Tak więc, stosowanie przeciwciał, które wiążą peptyd beta-amyloidowy w regionie 13-28 aminokwasów będzie leczyć takie choroby jak choroba Alzheimera i zespół Downa i będzie powstrzymywać spadek zdolności pojmowania, typowo związany z postępem choroby.

Obciążenie amyloidem (procent powierzchni objętej materiałem reaktywnym immunologicznie po barwieniu przeciwciałami anty-Aji, 3D6 albo 21F12) oznaczano ilościowo w korze mózgowej bezpośrednio przylegającej do hipokampa, w tym powierzchni obręczy i ciemieniowej kory mózgowej z mózgów 24-miesięcznych zwierząt traktowanych mysim przeciwciałem 266 przez 7 tygodni, jak opisano powyżej. Wyniki podano w poniższej tabeli. Różnice pomiędzy traktowanymi grupami nie są statystycznie znamienne.

T a b e l a 2. Obciążenie płytkami amyloidowymi u myszy APP^V717F+/- po traktowaniu mysim przeciwciałem

266 anty-A|^J>

	Obciążenie płytkami (%)
Stosując 3D6	Stosując 21F12
	N	Średnia	Błąd standardowy	Średnia	Błąd standardowy
Kontrola (PBS)	7	44,3	5,93	0,77	0,14
Przeciwciało 266	8	38,0	2,96	0,93	0,11

U tych bardzo starych zwierząt, traktowanie mysim przeciwciałem 266 nie doprowadziło do znacząco różnego obciążenia amyloidowego w porównaniu z grupą kontrolną, traktowaną PBS, według oznaczeń z użyciem albo 3D6 albo 21F12. Poza tym obciążenie Aβ było znacząco większe i znacząco podwyższone w porównaniu do obciążenia amyloidowego u zwierząt młodszych (patrz poniżej), które nie mogły odróżnić nowego przedmiotu od przedmiotu znanego w teście rozpoznania przedmiotu. Co najbardziej zdumiewające, wyniki te pokazują, że przeciwciała anty-Aji mogą odwracać upośledzenie pojmowania bez potrzeby zmniejszania obciążenia amyloidowego jako takiego.

PL 218 883 B1

Po 7 tygodniach traktowania, współczynnik rozpoznawania grupy traktowanej m266 nie różnił się statystycznie od tego, jakiego można byłoby się spodziewać dla kohorty 24-miesięcznych myszy typu dzikiego. Wskazuje to na całkowite odwrócenie spadku zdolności pojmowania u tych transgenicznych zwierząt.

P r z y k ł a d 12. Wpływ podawania przeciwciała 266 na pojmowanie u młodych, transgenicznych, hemizygotycznych myszy PDAPP

Użyto pięćdziesiąt cztery (54) homozygotyczne, transgeniczne myszy. Na początku badania, dwadzieścia trzy myszy (23) były w wieku około 2 miesięcy. Pozostałe myszy, na początku badania były w wieku około 4 miesięcy. Doświadczenie trwało 5 miesięcy. Tak więc, w końcowym stadium badania myszy miały albo około siedem (7) miesięcy albo około dziewięciu (9) miesięcy.

Wszystkie iniekcje podawano dootrzewnowo (i.p.). Każda mysz w grupie kontrolnej PBS otrzymywała cotygodniowo iniekcję buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS; 200 pl). Każda mysz w kontrolnej grupie IgG otrzymywała co tydzień iniekcję izotypu IgG1K1 jako kontrolę (100 pg/mysz/tydzień). Każda mysz w grupach Wysokiej Dawki otrzymywała co tydzień iniekcję 500 mikrogramów przeciwciała 266 rozpuszczonego w PBS (HD). Każda mysz w grupie Niskiej Dawki otrzymywała co tydzień iniekcję 100 mikrogramów przeciwciała 266 rozpuszczonego w PBS (LD). Po trzech dniach od ostatniej iniekcji oceniano zachowanie zwierząt w próbie zadania rozpoznania przedmiotu, jak to opisano w powyższym przykładzie 10, i wyliczano współczynnik odróżniania jako różnicę pomiędzy czasem spędzonym przy nowym przedmiocie a czasem spędzonym przy znajomym przedmiocie. Wyniki są przedstawione w tabeli 3. Dane są zgrupowane według wieku myszy na końcu badania.

T a b e l a 3. Statystyka opisowa dla współczynnika odróżniania

		Współczynnik odróżniania (minuty)
	N	Średnia	Odchylenie standardowe	Błąd standardowy
Wiek 7 miesięcy
PBS	7	2,12	4,22	1,59
IgG	8	0,81	3,64	1,29
HD	8	10,04*	6,52	2,30
Wiek 9 miesięcy
PBS	7	1,87	3,54	1,34
IgG	8	0,96	3,51	1,24
LD	8	10,75*	6,44	2,28
HD	8	12,06***	7,82	2,76

* p < 0,05 *** p < 0,0001

Powyższe dane rozpatrywane łącznie, potwierdzają konkluzję, że podawanie przeciwciała 266, przeciwciała skierowanego przeciw centralnej domenie Aβ, zmniejsza odkładanie się płytek u 7-9-miesięcznych transgenicznych myszy APP^V717F a także odwraca uprzednio występujące upośledzenia behawioralne. Leczenie pacjentów przeciwciałem skierowanym przeciw centralnej domenie peptydu Aβ będzie hamowało bądź zapobiegało upośledzeniu pojmowania typowo związanemu z postępem choroby i będzie go odwracało.

Współczynnik odróżniania dla traktowanych zwierząt nie różnił się znacząco od tego, jakiego można byłoby oczekiwać dla myszy typu dzikiego w tym samym wieku. Tak więc, tak, jak w przypadku starszych zwierząt (przykład 11), traktowanie przeciwciałem m266 całkowicie odwracało upośledzenie pojmowania u tych młodszych zwierząt transgenicznych.

P r z y k ł a d 13. Synteza humanizowanego przeciwciała 266

Komórki i przeciwciała. Mysią linię komórek szpiczaka Sp2/0 uzyskano z ATCC (Manassas, VA). Utrzymywano ją w pożywce DME zawierającej 10% FBS (nr katalogowy: SH32661.03, HyClone, Logan, UT) w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C. Mysie komórki hybrydoma 266 początkowo hodowano w pożywce RPMI-1640 zawierającej 10% FBS (HyClone), 10 mM HEPES, 2 mM glutaminy,

PL 218 883 B1

0,1 mM aminokwasów egzogennych, 1 mM pirogronianu sodu i 25 gg/ml gentamycyny i następnie powiększono skalę do objętości 2,5 litra w pożywce bez surowicy (Hybridoma SFM, nr katalogowy: 12045-076, Life Technologies, Rockville, MD) zawierającej 2% FBS o niskiej zawartości Ig (Iow Ig FBS, nr katalogowy: 30151.03, HyClone) w butelkach cylindrycznych. Mysie przeciwciało monoklonalne 266 (Mu266) oczyszczano z supernatantu hodowli metodą chromatografii powinowactwa z użyciem kolumny wypełnionej Sepharozą z białkiem G. Biotynylowane Mu266 przygotowano z użyciem biotyny EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (nr katalogowy: 21338ZZ, Pierce, Rockford, IL).

Klonowanie cDNA dla regionu zmiennego. Całkowity RNA ekstrahowano z około 10⁷ komórek hybrydoma stosując odczynnik TRIzol (Life Technologies). Izolowano poli(A)⁺RNA w układzie PolyTract mRNA Isolation System (Promega, Madison, WI), postępując według instrukcji dostawcy. Dwuniciowy cDNA syntetyzowano w zestawie do amplifikacji SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Palo Alto, CA), postępując stosownie do instrukcji dostawcy. cDNA dla regionu zmiennego łańcuchów lekkiego i ciężkiego amplifikowano w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) z użyciem 3'-primerów, które przyłączają się odpowiednio do mysich regionów stałych kappa i gemma i uniwersalny primer 5' dostarczony w zestawie SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit. Primer 3' do reakcji PCR amplifikującej cDNA części zmiennej łańcucha lekkiego miał następującą sekwencję:

5'-TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3'

[SEQ ID Nr. 13] z resztami 17-46 hybrydyzującymi z mysim regionem Ck. Primery 3' do reakcji PCR amplifikującej cDNA dla części zmiennej łańcucha ciężkiego (VH) miały zdegenerowane sekwencje:

A G T

5'-TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTCGTTTTGGC-3'

T

[SEQ ID Nr. 14] z resztami 17-50 hybrydyzującymi z mysim łańcuchem gamma CH1. cDNA dla VL i VH subklonowano do wektora pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) w celu oznaczenia sekwencji. Sekwencjonowanie DNA prowadzono w cyklach sekwencjonowania PCR z użyciem fluorescencyjnych terminatorów łańcucha dideoksy (Applied Biosystems, Foster City, CA), postępując według instrukcji producenta. Reakcje sekwencjonowania analizowano w modelu 377 aparatu do sekwencjonowania DNA (Applied Biosystems).

Konstruowanie regionów zmiennych humanizowanego 266 (Hu266). Humanizację mysich regionów zmiennych przeciwciała prowadzono w sposób opisany przez Queen'a i wsp. [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1988)]. W oparciu o homologię sekwencji wybrano ludzki region zrębowy części zmiennej jako akceptor dla regionów hiperzmiennych (CDR) Mu266. Do sporządzenia modelu molekularnego regionów zmiennych użyto programy komputerowe ABMOD i ENCAD [Levitt M., J. Mol. Biol. 168: 595-620 (1983)]. Aminokwasy w humanizowanych regionach V przewidywanych jako te, które mają kontakt z regionami CDR zastąpiono odpowiednimi resztami Mu266. Substytucji tej dokonano na resztach 46, 47, 49 i 98 w łańcuchu ciężkim i na reszcie 51 w łańcuchu lekkim. W celu wyeliminowania potencjalnej immunogenności, zamieniono aminokwasy w humanizowanym regionie V, które okazały się rzadkie w tej samej podgrupie regionu V na aminokwasy konsensus. Zmian tych dokonano na resztach 42 i 44 w łańcuchu lekkim.

Stosując osiem zachodzących na siebie syntetycznych oligonukleotydów o długości w zakresie od około 65 do 80 zasad [He X., Y. i wsp., J. Immunol. 160: 1029-1035 (1998)]. Skonstruowano geny dla regionu zmiennego łańcucha lekkiego i ciężkiego i dokonano ich amplifikacji. Oligonukleotydy te zgrzewano parami i wydłużano fragmentem Klenowa polimerazy DNA I, uzyskując cztery fragmenty dwuniciowe. Otrzymane fragmenty denaturowano, zgrzewano parami i wydłużano za pomocą fragmentu Klenowa, uzyskując dwa fragmenty. Te fragmenty denaturowano, zgrzewano parami i wydłużano raz jeszcze, uzyskując gen o pełnej długości. Otrzymany produkt amplifikowano w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) w układzie Expand High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemi30

PL 218 883 B1 cals, Indianapolis, IN). Fragmenty amplifikowane w reakcji PCR oczyszczano w żelu i klonowano do wektora pCR4Blunt-TOPO. Po potwierdzeniu sekwencji, geny dla VL i VH trawiono enzymami MIuI i Xbal, oczyszczano w żelu i subklonowano odpowiednio do wektorów przygotowanych do ekspresji łańcuchów lekkiego i ciężkiego, konstruując w ten sposób wektory pVk-Hu266 i pVg1-Hu266 (patrz odpowiednio figury 6 i 7) [Go M. S. i wsp., J. Immunol. 148: 1149-1154 (1992)]. Dojrzałe humanizowane przeciwciało 266 powstałe w wyniku ekspresji tych plazmidów ma łańcuch lekki zgodny z sekwencją SEQ ID Nr. 11 i łańcuch ciężki zgodny z SEQ ID Nr. 12.

Trwała transfekcja. Trwałą transfekcję do linii mysich komórek szpiczaka Sp2/0 przeprowadzono przez elektroporację w aparacie Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) przy napięciu 360 V i natężeniu 25 pF w sposób opisany w literaturze (Co i wsp., 1992). Przed transfekcją linearyzowano DNA plazmidów pVk-Hu266 i pVg1-Hu266 za pomocą enzymu Fspl. Około 10⁷ komórek Sp2/0 transfekowano 20 pg pVk-Hu266 i 40 pg pVg1-Hu266. Transfekowane komórki zawieszano w pożywce DME zawierającej 10% FBS i posiewano do kilku 96-dołkowych płytek. Po 48 godzinach użyto pożywki selekcyjne (pożywkę DME zawierającą 10% FBS, suplement do pożywek HT, 0,3 mg/ml ksantyny i 1 pg/ml kwasu mykofenolowego). Po około 10 dniach od rozpoczęcia selekcji, analizowano supernatanty hodowli na produkcję przeciwciała metodą ELISA, jak opisano poniżej. Klony dające wysoką wydajność namnażano w pożywce DME zawierającej 10% FBS i dalej analizowano na ekspresję przeciwciała. Wyselekcjonowane klony zaadaptowano do wzrostu w pożywce Hybridoma SFM.

Oznaczanie ekspresji przeciwciała metodą ELISA. Wgłębienia w 96-dołkowej płytce ELISA (Nunc-Immuno plate, nr katalogowy: 439454, NalgeNunc, Naperville, IL) powleczono ilością 100 poliklonalnego przeciwciała, koziej IgG anty-ludzkiej, specyficznej względem fragmentu Fcy (nr katalogowy: 109-005-098, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) o stężeniu 1 pg/ml, w buforze 0,2 M węglanu/dwuwęglanu sodu (pH 9,4) przez dobę, w temperaturze 4°C. Po przemyciu buforem do przemywania (PBS z dodatkiem 0,1% Tween'u 20), wgłębienia blokowano 400 pl buforu Superblock Blocking Buffer (nr katalogowy 37535, Pierce) w czasie 30 minut i następnie przemywano buforem do przemywania. Próbki zawierające Hu266 rozcieńczano odpowiednio buforem ELISA (PBS z dodatkiem 1% BSA i 0,1% Tween 20) i wprowadzono do płytek ELISA (100 pl/wgłębienie). Jako standard użyto humanizowane przeciwciało monoklonalne HuM195, IgG1 anty-CD33 (Co i wsp., 1992, jak wyżej). Płytkę ELISA inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, po czym wgłębienia przemyto buforem do przemywania. Następnie, do każdego wgłębienia podano 100 pl rozcieńczonych w stosunku 1/1000 skoniugowanych z HPR anty-ludzkich, kozich przeciwciał poliklonalnych kappa (nr katalogowy: 1050-05, Southern Biotechnology, Birmingham, AL) w buforze ELISA. Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej i przemyciu buforem do przemywania, do każdego wgłębienia dodano po 100 pl substratu ABTS (nr. katalogowe: 507602 i 506502, Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Wywoływanie barwy zatrzymywano przez dodanie do każdego dołka 100 pl 2% kwasu szczawiowego. Odczyt absorbancji prowadzono przy 415 nm w czytniku do mikropłytek OPTImax (Molecular Devices, Menlo Park, CA).

Oczyszczanie Hu266. Jeden ze stabilnych transfektantów Sp2/0 o wysokiej ekspresji Hu266 (klon 1D9), zaadaptowano do wzrostu w pożywce Hybridoma SFM i powiększono hodowlę do 2 litrów w cylindrycznych kolbach. Gdy żywotność komórek osiągnęła 10% lub była niższa, zebrano wyczerpany supernatant hodowli w czasie i wprowadzono go na kolumnę z sefarozą - białko A. Kolumnę przemyto PBS i następnie eluowano przeciwciało roztworem 0,1 M chlorowodorku glicyny (pH 2,5) i 0,1 M NaCl. Eluowane białko dializowano wobec 3 zmian po 2 litry PBS, przefiltrowano przez filtr 0,2 pm i przechowywano w temperaturze 4°C. Stężenie przeciwciała oznaczano przez pomiar absorbancji przy 280 nm (1 mg/ml = 1,4 A280). Przeprowadzono elektroforezę SDS-PAGE w buforze Tris-glicyna, postępując według standardowych procedur, w żelu gradientowym 4-20% (nr katalogowy: EC6025, Novex, San Diego, CA). Oczyszczone humanizowane przeciwciało 266 redukowano i poddano elektroforezie w żelu SDS-PAGE. Całe przeciwciało daje dwa pasma o masach cząsteczkowych około 25 kDa i 50 kDa. Te wyniki są zgodne z masami cząsteczkowymi łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego albo fragmentu łańcucha ciężkiego wyliczonymi na podstawie ich składu aminokwasowego.

P r z y k ł a d 14. Własności wiążące in vitro humanizowanego przeciwciała 266

Wydajność wiążącą humanizowanego przeciwciała 266, zsyntetyzowanego i oczyszczonego jak opisano powyżej, porównano z mysim przeciwciałem 266, stosując biotynylowane mysie przeciwciało 266 w porównawczej próbie ELISA. Wgłębienia w 96-dołkowej płytce ELISA (Nunc-Immuno plate, nr katalogowy: 439454, NalgeNunc) powlekano, 100 pl peptydu β-amyloidowego (1-42) skoniugowanego z BSA w buforze 0,2 M węglanu/dwuwęglanu sodu (pH 9,4) (10 pg/ml) przez dobę, w tempePL 218 883 B1 raturze 4°C. Koniugat Aβ_1-42-BSΛ sporządzono przez rozpuszczenie 7,5 mg Λβ_1-42-Cys₄3 (C-terminalna cysteina Ap_1-42, AnaSpec) w 500 μl dimetylosulfotlenku i następne natychmiastowe dodanie 1500 μl destylowanej wody. Dwa (2) miligramy aktywowanej maleimidem albuminy surowicy cielęcej (Pierce) rozpuszczono w 200 μl wody destylowanej. Te dwa roztwory połączono, dokładnie zmieszano i pozostawiono w temperaturze pokojowej na dwie godziny. Nieprzereagowany peptyd oddzielono od koniugatu Aβ_1-42-Cys-BSA z zastosowaniem kolumny chromatograficznej z żelem.

Po przemyciu wgłębień buforowaną fosforanem solą fizjologiczną (PBS) z dodatkiem 0,1% Tween 20 (bufor do przemywania) w urządzeniu do przemywania płytek EL^, wgłębienia blokowano przez dodanie 300 μl odczynnika SuperBlock (Pierce) do każdego wgłębienia. Po 30 minutach blokowania, wgłębienia przemyto buforem do przemywania i usunięto nadmiar płynu.

Do każdego wgłębienia dodano mieszaninę biotynylowanego Mu266 (w końcowym stężeniu 0,3 μg/ml) i przeciwciała konkurencyjnego (Mu266 lub Hu266, zaczynając od końcowego stężenia 750 μg/ml, poprzez następne seryjne 3-krotne rozcieńczenia) w buforze EL^, w końcowej objętości 100 μl/wgłębienie, nastawiając po trzy jednakowe próbki. Do próbki kontrolnej bez przeciwciała konk urencyjnego dodano 100 μl biotynylowanego Mu266 o stężeniu 0,3 μg/ml. W próbce kontrolnej służącej jako tło użyto tylko 100 μl buforu EL^. Płytkę EL^ inkubowano w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Po przemyciu wgłębień buforem do przemywania, do każdego wgłębienia dodano po 100 μl skoniugowanej z HPR streptawidyny (nr katalogowy 21124, Pierce) o stężeniu 1 μg/ml. Płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut, po czym przemyto ją buforem do przemywania. Λby wywołać barwę dodano 100 μl/wgłębienie substratu dla peroksydazy ΛBTS (Kirkegaard & Perry Laboratories). Wywoływanie barwy kończono dodając 100 μl/wgłębienie 2% kwasu szczawiowego. Pomiar absorbancji wykonywano przy 415 nm. Wartości absorbancji wykreślono względem logarytmu stężenia przeciwciała konkurencyjnego, krzywe dopasowano do punktów doświadczalnych (za pomocą Prism) i oznaczono IC50 dla każdego przeciwciała ogólnie znanymi metodami.

Średnie IC₅₀ dla mysiego 266 wyniosło 4,7 μg/ml (trzy oddzielne doświadczenia, odchylenie standardowe = 1,3 μg/ml) a dla humanizowanego 266 wyniosło 7,5 μg/ml (trzy oddzielne doświadczenia, odchylenie standardowe = 1,1 ng/ml). Przeprowadzono drugą serię trzech doświadczeń, zasadniczo w sposób opisany powyżej. Oznaczone IC₅₀ dla mysiego 266 wyniosło 3,87 ng/ml (SD = 0,12 ng/ml) a dla ludzkiego 266 IC₅₀ wyniosło 4,0 ng/ml (SD = 0,5 ng/ml). Na podstawie tych wyników wyciągnęliśmy wniosek, że humanizowane 266 ma właściwości wiążące bardzo podobne do mysiego przeciwciała 266. Tak więc, zakładamy, że humanizowane 266 ma bardzo podobną aktywność in vitro i in vivo do aktywności mysiego 266 i u ludzi będzie wywierać takie samo działanie jak mysie 266 u myszy.

P r z y k ł a d 15. Właściwości wiążące in vitro mysich przeciwciał 266 i 4G8

Wyznaczono powinowactwo przeciwciała (KD = Kd/Ka) z zastosowaniem czujnika biologicznego BIAcore biosensor 2000 i zanalizowano dane programem BIAevaluation (v.3.1). Przeciwciało wychwytujące (przeciwciało królika anty-mysie) sprzęgano poprzez wolne grupy aminowe z grupami karboksylowymi w celce przepływowej 2 koszyka czujnika (CMS) z użyciem N-etylo-N-dimetyloaminopropylo-karbodiimidu i N-hydroksysukcynimidu (EDC/NHS). Nieswoistą IgG królika sprzęgnięto z celką przepływową 1 jako kontrolę tła. Przeciwciała monoklonalne wychwytywano tak, aby uzyskać 300 jednostek rezonansowych (RU). Następnie przez koszyk przepływał beta amyloid 1-40 albo 1-42 (Biosource International, Inc.) w zmniejszających się stężeniach (1000 do 0,1 x KD). W celu regeneracji koszyka, związane przeciwciało anty-Aji eluowano z koszyka poprzez przemywanie chlorowodorkiem glicyny (pH 2). Iniekcja kontrolna nie zawierająca amyloidu-beta służyła jako kontrola do odjęcia linii bazowej. Zanalizowano sensogramy uwidaczniające fazy asocjacji i dysocjacji w celu oznaczenia Kd i Ka. Stosując tę metodę, oznaczono, że powinowactwo mysiego przeciwciała 266 zarówno do Λβ_1-40 jak i Aβ_1-42 wynosi 4 pM. Powinowactwo 4G8 do Aβ_1-40 wynosiło 23 nM a do Aβ_1-42 wynosiło 24 nM. Pomimo 6000-krotnej różnicy w powinowactwach do Λβ, zarówno 266 jak i 4G8, wiążące się z epitopami pomiędzy aminokwasami 13 a 28 peptydu Λβ, skutecznie sekwestrują Aβ z ludzkiego płynu mózgowo-rdzeniowego. Tak więc, w oznaczaniu zdolności przeciwciała do sekwestrowania peptydu Aβ i uzyskania pożytecznych i nieoczekiwanych korzyści z wynalazku, główne znaczenie ma lokalizacja epitopu a nie powinowactwo wiązania.

P r z y k ł a d 16. Mapowanie epitopu mysiego przeciwciała 266 z użyciem metodologii Biacore i rozpuszczalnych peptydów

BAcore jest zautomatyzowanym układem czujnika biologicznego do pomiaru interakcji molekularnych [Karlsson R. i wsp., J. Immunol. Methods 145: 229-240 (1991)]. Zaleta układu BAcore w stosunku do innych prób wiązania polega na tym, że można oznaczać wiązanie antygenu bez potrzeby

PL 218 883 B1 jego znakowania lub immobilizacji (antygen utrzymuje się w bardziej naturalnej konformacji). Metodologię BIAcore zastosowano do oceny wiązania różnych fragmentów peptydu beta amyloidowego z mysim przeciwciałem 266, zasadniczo jak opisano powyżej w przykładzie 12, z tym, że do wszystkich rozcieńczeń stosowano buforowaną HEPES sól fizjologiczną zawierającą Tween 20, wstrzykiwano różne fragmenty Aβ (BioSource International) i wstrzykiwano pojedyncze stężenie każdego fragmentu (440 nM).

Beta-amyloidowe fragmenty 1-28, 12-28, 17-28 i 16-25 wiązały się z mysim przeciwciałem 266, natomiast fragmenty 1-20, 10-20 i 22-35 nie wiązały się. Fragmenty 1-20, 10-20 i 22-35 wiązały się z innymi przeciwciałami monoklonalnymi o znanej swoistości epitopowej dla tych regionów Aβ. Stosując tę metodologię wykazano, że epitop wiążący się z mysim przeciwciałem 266 znajduje się pomiędzy aminokwasami 17 a 25 peptydu Aβ. Ponieważ wiązanie występuje zazwyczaj z co najmniej trzema resztami w epitopie, można wywnioskować, że ten epitop jest zawarty na resztach 19-23.

P r z y k ł a d 17. Właściwości wiążące in vitro humanizowanego przeciwciała 266

Powinowactwo UKD = Kd/Ka) humanizowanego przeciwciała 266, zsyntetyzowanego i oczyszczonego jak opisano powyżej, oznaczano zasadniczo tak samo jak opisano w przykładzie 15. Oznaczone tą metodą powinowactwo humanizowanego przeciwciała 266 wobec Aβ_1-42 wynosi 4 pM.

Claims

1. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało do zastosowania w leczeniu klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera, w której przeciwciało zawiera region zmienny łańcucha lekkiego posiadający następującą sekwencję:

1 5 10 15 Asp Xaa Val Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa 20 25 30 Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Xaa 35 40 45 Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro 50 55 60 Gly Gin Ser Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 80 85 90 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val 95 100 105 Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa 110 Gly Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys Arg (SEQ ID Nr. : : 7); w której:

Xaa w pozycji 2 oznacza Val lub Ile; Xaa w pozycji 7 oznacza Ser lub Thr; Xaa w pozycji 14 oznacza Thr lub Ser;

PL 218 883 B1

Xaa w pozycji 15 oznacza Leu lub Pro;

Xaa w pozycji 30 oznacza Ile lub Val;

Xaa w pozycji 50 oznacza Arg, Gln lub Lys;

Xaa w pozycji 88 oznacza Val lub Leu;

Xaa w pozycji 105 oznacza Gln lub Gly;

Xaa w pozycji 108 oznacza Lys lub Arg; i

Xaa w pozycji 109 oznacza Val lub Leu;

i region zmienny w łańcuchu ciężkim posiada następującą sekwencję:

1 5 10 15 Xaa Val Gin Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 35 40 45 Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Xaa Leu Val Ala Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 Pro Asp Xaa Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa 80 85 90 Xaa Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp 95 100 105 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID Nr. : 8) Z w której”

Xaa w pozycji 1 oznacza Glu lub Gln;

Xaa w pozycji 7 oznacza Ser lub Leu;

Xaa w pozycji 46 oznacza Glu, Val, Asp lub Ser;

Xaa w pozycji 63 oznacza Thr lub Ser;

Xaa w pozycji 75 oznacza Ala, Ser, Val lub Thr;

Xaa w pozycji 76 oznacza Lys lub Arg;

Xaa w pozycji 89 oznacza Glu lub Asp; i

Xaa w pozycji 107 oznacza Leu lub Thr.

2. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało do zastosowania w leczeniu klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciało posiada region zmienny łańcucha lekkiego odpowiadający sekwencji SEQ ID Nr. 9 i region zmienny łańcucha ciężkiego odpowiadający sekwencji SEQ ID Nr. 10.

3. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało do zastosowania w leczeniu klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera według któregokolwiek z zastrz. 1-2, znamienna tym, że przeciwciało posiada izotyp IgG1 immunoglobuliny.

4. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało do zastosowania w leczeniu klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera według któregokolwiek z zastrz. 1-3, znamienna tym, że przeciwciało hamuje tworzenie się płytek amyloidowych.

PL 218 883 B1

5. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało do zastosowania w leczeniu klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera według zastrz. 1-3, znamienna tym, że przeciwciało redukuje ilość płytek amyloidowych lub wpływa na rozpuszczalne toksyczne rodzaje Λβ związane z chorobą Alzheimera.

6. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało do zastosowania w leczeniu klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera według któregokolwiek z zastrz. 1-5, znamienna tym, że przeciwciało jest podawane obwodowo.

7. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało do zastosowania w leczeniu klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera według zastrz. 6, znamienna tym, że przeciwciało jest podawane doustnie, dootrzewnowo, podskórnie, domięśniowo lub dożylnie.

8. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało do zastosowania w leczeniu klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera według któregokolwiek z zastrz. 1-3, znamienna tym, że leczenie klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera odnosi się do leczenia, zapobiegania lub odwracania upośledzenia pojmowania u pacjentów ze zdiagnozowaną kliniczną lub przedkliniczną fazą choroby Alzheimera.

9. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało do zastosowania w leczeniu klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera według któregokolwiek z zastrz. 1-3, znamienna tym, że leczenie klinicznej lub przedklinicznej choroby Alzheimera odnosi się do poprawiania pojmowania u pacjentów ze zdiagnozowaną kliniczną lub przedkliniczną fazą choroby Alzheimera.