JP2003523764A

JP2003523764A - Ａβペプチドを隔離するヒト化抗体

Info

Publication number: JP2003523764A
Application number: JP2001562582A
Authority: JP
Inventors: デイビッド・エム・ホルツマン; ロナルド・デマットス; ケリー・アール・ベイルズ; スティーブン・エム・ポール; 直也鶴下; マキシミリアノ・バスケス
Original assignee: Eli Lilly and Co; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: Eli Lilly and Co; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2001-02-26
Publication date: 2003-08-12
Anticipated expiration: 2021-02-26
Also published as: CN101670105B; PL218883B1; DK1257584T3; EP1257584B9; HRP20080430B1; CZ304211B6; CZ306683B6; EP1257584A2; HRP20080430A9; EP1481992B1; ES2184660T1; SI1257584T1; IL151378A0; WO2001062801A3; US7892545B2; IL193631A; IL151378A; SK288723B6; EP3150633A1; SI1257584T2

Abstract

(57)【要約】アミロイドプラークの形成によって特徴付けられる症状を予防的および治療的に処置する方法が記載されている。この方法は、Ａβペプチドを生物学的液から隔離するか、あるいはアミロイドベータペプチドＡβの第１３位−第２８位内に含有されるエピトープと好ましくは特異的に結合するヒト化抗体を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願への相互参照この出願は、２０００年２月２４日提出の米国仮出願６０／１８４，６０１、
２０００年１２月８日提出の６０／２５４，４６５、および２０００年１２月８
日提出の６０／２５４，４９８（これらの開示内容は引用により本明細書中に包
含される）の優先権を主張する。

【０００２】技術分野本発明は、Ａβペプチドのアミノ酸１３〜２８間のエピトープに結合するヒト
化抗体および、ベータアミロイドと関連する症状、例えばアルツハイマー疾患、
ダウン症候群、および脳性アミロイド血管障害の予防的および治療的処置に関す
る。より具体的には、血漿、脳、および脳脊髄液中のアミロイドベータ（Ａβ）
ペプチドを隔離（sequester）し、脳内および脳血管内のＡβペプチドの蓄積を
防ぎ、あるいは堆積を逆転させ、認識を改善させるためのヒト化モノクローナル
抗体の使用に関する。

【０００３】背景技術認識欠損、発作、脳出血、および全般的精神衰弱を生じさせる多くの総合的症
状は、アミロイドベータペプチド（Ａβ）を含有する脳内の神経突起および脳血
管プラークと関連すると思われる。これらの症状には、前臨床的および臨床的な
アルツハイマー疾患、ダウン症候群、および前臨床的および臨床的な脳性アミロ
イド血管障害（ＣＡＡ）がある。アミロイドプラークはアミロイドベータペプチ
ドから形成される。これらのペプチドは血中および脳脊髄液（ＣＳＦ）中を、典
型的にはリポタンパク質との複合体型で循環する。循環型のＡβペプチドは、共
通前駆体タンパク質、アミロイド前駆体タンパク質（しばしばＡＰＰと称される
）の分解により生じた３９〜４３アミノ酸（ほとんどが４０または４２アミノ酸
）から構成される。いくつかの型の可溶性Ａβはそれ自身神経毒性であり、神経
変性および／または認識減退の重篤度を決定するものであり得る（McLean, C. A
., et al., Ann. Neurol. (1999) 46:860-866; Lambert, M. P., et al. (1998)
95: 6448-6453; Naslund, J., J. Am. Med. Assoc. (2000) 283: 1571）。

【０００４】Ａβが脳および血液の間を行ったり来たりして輸送され得ることを示唆する証
拠がある（Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67: 880-883; Z
lokovic, B. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67: 1034-104
0; Shibata M, et al., J. Clin, Invest. (2000) 106: 1489-1499）。さらに、
プラーク中のＡβは脳および血液内の可溶性Ａβと平衡状態にある（Kawarabaya
shi T, et al., J. Neurosci. (2001) 21: 372-381）。

【０００５】引用により本明細書中に包含されるＰＣＴ出願ＵＳ００／３５６８１および米
国第０９／１５３，１３０号に記載されるように、ＣＳＦ中のＡβペプチドのト
ータル循環レベルは正常な個体およびアルツハイマーの症状を示す傾向がある個
体において同様である。しかし、Ａβ_４２レベルは、アルツハイマー疾患を有す
る個体において平均的に少ない（Nitsch, R. M., et al., Ann. Neurol. (1995)
37: 512-518）。Ａβ_４２がＡβ_４０より凝集する傾向があることが既知であり
、そうであると、アミロイドプラーク中のＡβ堆積、Ａβの毒性可溶型への変換
、神経細胞の損傷、および痴呆のような行動上の障害のような有害な結果が生じ
る（Golde, T. E., et al., Biochem. Biophys. Acta. (2000) 1502: 172-187）
。

【０００６】アミロイド堆積を減少させる免疫応答を誘導する方法は、１９９９年６月１０
日公開のＰＣＴ公開ＷＯ９９／２７９４４に記載されている。この記載は完全長
凝集Ａβペプチドは有用な免疫原であろうと仮定している。ヒツジ抗マウスＩｇ
ＧとコンジュゲートされたＡβ断片（アミノ酸１３〜２８）の投与は皮質アミロ
イド堆積にいかなる変化も生じさせず、Ａβ１３〜２８断片コンジュゲート注射
された９動物のうち１動物のみがＡβ_４０に応答する何らかのリンパ球増殖を示
しただけである。この出願はまた、Ａβペプチドに特異的に結合する抗体を治療
物質として用いることができることを示している。しかし、サポートするデータ
が、例えばＡβ_４２を用いる活性な免疫化を含むプロトコルを反映しているため
、これは推測であるようだ。このペプチドはアジュバントを用いて供給され、免
疫化から形成される抗体力価、ならびにＡβペプチドレベルおよび前駆体ペプチ
ドレベルが測定される。この公報は、アルツハイマーの症状を緩和するためには
Ａβプラークが減少しなければならず、Ａβプラークを首尾良く減少させるのに
細胞媒介性のプロセスが必要とされることを強く示唆する。

【０００７】１９９９年１１月２５日公開のＷＯ９９／６００２４は、抗アミロイド抗体を
用いるアミロイド除去のための方法に関する。しかし、その機構は、前形成アミ
ロイド堆積（すなわちプラーク）に結合し、次いで局在化プラークの局所的なミ
クログリアのクリアランスを生じさせる抗Ａβ抗体の能力を利用すると記載され
ている。この機構はインビボでは証明されていない。この公報はさらに、Ａβプ
ラークに対して有効であるために、抗Ａβ抗体は脳実質へのアクセスを得、血液
脳関門を横切らなければならないことを記載している。

【０００８】アミロイドプラークの制御を試みることに関するいくつかのＰＣＴ出願が、２
０００年１２月７日に公開された。ＷＯ００／７２８８０は、ＡβペプチドのＮ
末端断片およびそれに結合する抗体を用いて処置された場合には、アルツハイマ
ー疾患のトランスジェニックマウスモデルの皮質および海馬におけるプラークが
有意に減少し、ヒツジ抗マウスＩｇＧとコンジュゲートされたＡβ１３−２８断
片または１３−２８断片に対する抗体、抗体２６６を用いて処置された場合には
そうではないことを記載している。このＮ末端に対する抗体は、血液脳関門を横
切り、インビトロ試験においてアミロイドプラークの貪食を誘導することが示さ
れている。

【０００９】ＷＯ００／７２８７６はＷＯ／７２８８０と実質的に同じ開示内容を有し、ア
ミロイドフィブリル成分自体を用いる免疫化に関する。

【００１０】ＷＯ００／７７１７８は、β−アミロイドの加水分解を触媒するように設計さ
れた抗体、例えばフェニルアラニンスタチントランジション化合物Ｃｙｓ−Ａβ _{１０−２５} 、スタチンＰｈｅ_１９−Ｐｈｅ_２０およびＣｙｓ−Ａβ_{１０−２５}ス
タチンＰｈｅ_２０−Ａｌａ_２１の混合物に対して作成された抗体および、Ｐｈｅ _１９およびＰｈｅ_２０間に還元アミド結合を有するＡβ_{１０−２５}に対して作成
された抗体を記載している。この文献は、Ａβの隔離を記載しているが、このよ
うな隔離の証拠が与えられておらず、これは推測である。さらに、この文献は、
抗体の投与が中枢神経系からのＡβの流出を生じさせるか、プラーク形成を妨害
するか、プラーク堆積を減少させるか、組織サンプル中、この抗体とＡβ間の複
合体を形成させるか、あるいは認識に影響するインビボの証拠を提供していない
。

【００１１】Ａβ代謝に関する一経路はＣＮＳから血漿への輸送を介するものであることが
示された（Zlokovic, B. V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) (1996) 93
: 4229-4234; Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67: 880-883
）。さらに、血漿中のＡβが血液脳関門を横切って脳にはいることができること
が示された（Zolkovic, B. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993)
67: 1034-1040）。また、アルツハイマー疾患のＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}トランスジェ
ニックマウスモデルにおいて、特定のポリクローナルおよびモノクローナルＡβ
抗体を投与するとアミロイドプラーク中のＡβ堆積が減少することが示された（
Bard, F., et al., Nature Med. (2000)6:916-919）；しかしこれは、特定の抗
Ａβ抗体が血液脳関門を横切り、アミロイドプラークのミクログリア細胞による
貪食を刺激したせいであると言われた。Bard の実験では、脳スライスのエクス
ビボアッセイにより、外部から加えられたミクログリアとともに添加Ａβ抗体が
存在することがＡβの貪食を誘導し、結果的にＡβ堆積の除去を導くことが示さ
れた。

【００１２】ＣＳＦおよび血液中の可溶性Ａβ_４０およびＡβ_４２両者のレベルは、Ａβ鎖
に沿ったエピトープに対する抗体を用いる標準化されたアッセイにより容易に検
出できる。このようなアッセイは例えば、米国特許５，７６６，８４６；５，８
３７，６７２；および５，５９３，８４６中に報告されている。これらの特許は
、Ａβペプチドの中央ドメインに対するマウスモノクローナル抗体の作成を記載
しており、これらは第１６位および第１７位まわりおよびこれらを含むエピトー
プを有することが報告された。Ｎ末端領域に対する抗体も同様に記載された。い
くつかのモノクローナル抗体がＡβペプチドの第１３−２８位と免疫反応するこ
とが示され；これらは第１７−２８位を表すペプチドと結合せず、したがって、
引用特許によれば、これらの抗体の標的が第１６−１７位（α−セクレターゼ部
位）を含むこの領域であることが確立された。Ａβのアミノ酸１３および２８の
間と結合することが既知である抗体には、マウス抗体２６６、４Ｇ８、および１
Ｃ２がある。

【００１３】発明者らは、予期せず、２４月齢半接合性トランスジェニックマウス（ＡＰＰ ^{Ｖ７１７Ｆ} ）において、２６６抗体を投与すると、非常に迅速に、ほとんど完全
に認識（物質記憶）が回復することを発見した。しかし、この抗体は、アルツハ
イマー疾患、ダウン症候群、およびＡβペプチドに関連する他の症状の処置に有
効であるために、抗体に必要とされると当技術分野で教示されている性質を有し
ていない。さらに驚いたことに、Ａβと第１３位および第２８位間で結合する抗
体（２６６および４Ｇ８）が可溶型のＡβを血液中のその結合、循環型から隔離
でき、抗体２６６を末梢投与すると、比較的大量のＡβペプチドがＣＮＳから血
漿内へ迅速に流出することが観察された。これは、Ａβアミロイドプラーク堆積
を減少させること、血液脳関門を任意に有意な程度にまで横切ること、プラーク
を修飾すること、細胞性機構を活性化させること、または凝集したＡβに対して
大きな親和力で結合することを必ずしも伴わずにさえ、可溶性Ａβの変更された
クリアランス、プラーク形成の妨害、および、最も驚くべきことに、認識の改善
を生じさせる。

【００１４】発明の開示本発明は、Ａβが関与し得る疾患および症状、例えば臨床的または前臨床的な
アルツハイマー疾患、ダウン症候群、および臨床的または前臨床的な脳性アミロ
イド血管障害において認識に正に影響するヒト化抗体またはその断片を提供する
。この抗体またはその断片は血液脳関門を横切る必要がなく、アミロイドプラー
クを修飾する必要がなく、細胞応答を活性化する必要がなく、あるいは必ずしも
アミロイドプラーク堆積を減少させることさえ必要がない。別の側面では、本発
明は、Ａβペプチドをその血中の結合、循環型から隔離し、中枢神経系および血
漿中の可溶型および結合型Ａβのクリアランスを変更するヒト化抗体およびその
断片を提供する。別の側面では、本発明は、Ａβ分子のアミノ酸１３および２８
の間のエピトープに特異的に結合するヒト化抗体およびその断片を提供する。別
の側面では、本発明は、ＣＤＲがマウスモノクローナル抗体２６６由来であるヒ
ト化抗体およびその断片であって、およそマウス抗体の結合性質を保持し、マウ
ス抗体と機能的に同等なインビトロおよびインビボ性質を有するもの（配列番号
１〜配列番号６）を提供する。別の側面では、本発明は、可変領域がマウス抗体
２６６由来のＣＤＲおよび特定のヒトフレームワーク配列を含む配列（配列番号
７〜配列番号１０）を有するヒト化抗体およびその断片であって、およそマウス
抗体の結合性質を保持し、マウス抗体２６６と機能的に同等なインビトロおよび
インビボ性質を有するものを提供する。別の側面では、本発明は、軽鎖が配列番
号１１であり、重鎖が配列番号１２であるヒト化抗体およびその断片を提供する
。

【００１５】また本発明の一部分は、上に開示されるヒト化抗体またはその断片をコードす
るポリヌクレオチド配列、そのヒト化抗体またはその断片をコードするポリヌク
レオチド配列を含むベクター、そのベクターで形質転換されたか、あるいはその
ポリヌクレオチドを包含し、ヒト化抗体またはその断片を発現する宿主細胞、本
明細書中に開示されるヒト化抗体およびその断片の医薬製剤、およびその作成お
よび使用方法である。

【００１６】このようなヒト化抗体およびその断片はヒトにおけるＡβの隔離；ヒトにおけ
る脳内のＡβプラークまたはＡβ毒性によって特徴付けられる疾患および症状、
例えばアルツハイマー疾患、ダウン症候群、および脳性アミロイド血管障害の処
置および予防；ヒトにおけるこれらの疾患の診断；およびヒト被検体がＡβに対
するヒト抗体を用いる処置に応答するかどうかの測定に有用である。

【００１７】生物学的液中を循環するＡβペプチドを隔離するために適当なヒト化抗体をイ
ンビボ投与することは、脳内のＡβ含有散在、神経突起、および脳血管プラーク
の形成に関連する症状の予防的および治療的処置に有用である。その免疫学的反
応性断片を含むヒト化抗体は、プラークが形成可能であるか、あるいは毒性とな
り得る部位へ、およびその部位から、体液内においてそれを輸送するのに、通常
重要であるだろう高分子複合体からのＡβペプチドの除去を生じさせる。さらに
、抗体またはその断片を用いて血漿Ａβペプチドを隔離すると、「シンク（sink
）」としてふるまい、血漿コンパートメント内で有効に可溶性Ａβペプチドを隔
離し、Ａβが中枢神経系（ＣＮＳ）中の位置から血漿にはいるのを導く。血中の
Ａβを隔離することにより、脳からの正味の流出が高められ、可溶性Ａβが不溶
性プラーク内に堆積することおよび脳内で毒性の可溶性種を形成するのを防ぐ。
さらに、可溶性Ａβと平衡しているプラーク中の不溶性Ａβを、血中の隔離作用
を介して脳から除去することができる。Ａβペプチドを抗体で隔離することはま
た、その身体からの除去を高め、脳内における可溶性Ａβの毒性作用を阻害し、
プラーク中アミロイドとしての不溶性Ａβの発達およびさらなる蓄積を阻害する
。本発明において有用な抗体は血液脳関門を大量に横切らない（＜０．１％血漿
レベル）。さらに、本発明で用いられるヒト化抗体は、末梢的に投与される場合
、Ａβペプチドと結合したとき、あるいは遊離して循環しているとき、その有益
な作用を有するために脳内の細胞性免疫応答を導き出す必要がない。さらに、末
梢的に投与される場合、これらは、その有益な作用を有するために、脳内の凝集
Ａβペプチドとはっきり感知できるほどに結合する必要がない。

【００１８】したがって、一側面では、本発明は、ヒトにおけるβ−アミロイドタンパク質
を含有するプラークの形成を特徴とする症状の処置方法および予防方法であって
、その処置を必要としているヒトに、Ａβペプチドの中間領域に特異的に結合す
るヒト化モノクローナル抗体または免疫学的に反応性であるその断片の治療的ま
たは予防的有効量を好ましくは末梢的に投与することを含む方法に関する。別の
側面では、本発明は、ヒトにおけるアミロイドプラーク形成の阻害方法およびア
ミロイドプラークのクリアランス方法であって、その阻害を必要としているヒト
被検体に、Ａβペプチドをその血中の循環型から隔離し、脳からの流出ならびに
血漿および脳中の変化したＡβクリアランスを導くヒト化抗体の有効量を投与す
ることを含む方法に関する。さらなる側面では、本発明は、その免疫学的に有効
な部分を含む、そのようなヒト化抗体およびその製造方法に関する。

【００１９】本発明はまた、臨床的または前臨床的なアルツハイマー疾患、ダウン症候群、
または臨床的または前臨床的な脳性アミロイド血管障害であると診断された被検
体における認識減退を逆転させる方法、認識を改善させる方法、認識減退を処置
する方法、および認識減退を予防する方法であって、被検体に本発明のヒト化抗
体の有効量を投与することを含む方法を含む。

【００２０】本発明はまた、ヒトにおいて、アルツハイマー疾患、ダウン症候群、または脳
性アミロイド血管障害を処置し、予防し、あるいは逆転させるための；臨床的ま
たは前臨床的なアルツハイマー疾患、ダウン症候群、または臨床的または前臨床
的な脳性アミロイド血管障害における認識減退を処置し、予防し、あるいは逆転
させるための；またはアミロイドプラーク形成または毒性の可溶性Ａβ種の作用
を阻害するための、ヒト組織中の抗体または抗体断片の組換え配列の延長された
発現を含む、薬物の製造のための本発明のヒト化抗体の使用に関する。

【００２１】本発明は、本発明の抗体の投与後短い時間の間、比較的大量のＡβが中枢神経
系から血液へ流出するという驚くべき発見に関する。したがって本発明は、Ａβ
またはその断片と結合する抗体を用いる処置に対するヒト被検体の応答を評価す
る方法であって、ａ）抗体またはその断片を被検体に投与し；ならびにｂ）被検
体血液中のＡβ濃度を測定することを含む方法を含む。

【００２２】本発明はまた、Ａβまたはその断片と結合する抗体を用いてヒト被検体を処置
する方法であって、ａ）第一の量の抗体またはその断片を被検体に投与し；ｂ）
第一用量の投与後３時間〜２週間のうちに被検体血液中のＡβ濃度を測定し；ｃ
）必要であれば、工程ｂ）の結果に基づいて抗体またはその断片の第二の量を計
算し、ここに第二の量は第一の量と同じであるか、あるいは異なっており；なら
びにｄ）第二の量の抗体または断片を投与することを含む方法を含む。

【００２３】本発明はまた、ヒト被検体において、Ａβアミロイドプラーク形成を阻害また
は予防するための、Ａβアミロイドプラークを減少させるための、毒性の可溶性
Ａβ種の作用を減少させるための、またはＡβプラークと関連する症状または疾
患を処置するための、Ａβに結合する抗体またはその断片の効力を評価する方法
であって、ａ）被検体血漿またはＣＳＦの第一のサンプルを得；ｂ）第一サンプ
ル中のＡβのベースライン濃度を測定し；ｃ）抗体またはその断片を被検体に投
与し；ｄ）抗体またはその断片の投与後３時間〜２週間のうちに、被検体血漿ま
たはＣＳＦの第二のサンプルを得；ならびにｅ）第二のサンプル中のＡβの濃度
を測定することを含む方法を含む。ここに効力は血液中で抗体に結合したＡβ量
およびＣＳＦ中のＡβ濃度と関連する。

【００２４】本発明の実施の様式ヒト生物学的液中を循環するＡβペプチドは、染色体２１上にコードされる前
駆体タンパク質のカルボキシ末端領域である。インビトロ実験の結果から、Ａβ
ペプチドは、細胞の脂質膜にその長い前駆体をアンカーする領域の一部分である
一連の疎水性アミノ酸を含有するために、生理学的溶液中で低い溶解性しか有さ
ないことが報告された。したがって、循環Ａβペプチドが通常、その凝集を防ぐ
他の部分と複合体化していることは驚くべきことではない。これは生物学的液中
の循環Ａβペプチドの検出を困難にしてきた。

【００２５】上記特許文献（米国特許５，７６６，８４６；５，８３７，６７２および５，
５９３，８４６）は、Ａβペプチドのアミノ酸１３−２８を含むペプチドに対し
て作成され、これに特異的に結合することが示されたクローン２６６と称される
抗体（モノクローナル抗体を含む）の製造を記載している。本発明者らは、この
領域の範囲内と結合する抗体が、Ａβのアミノ酸配列の他の部分と結合する抗体
とは対照的に、可溶性Ａβペプチドを高分子複合体から非常に効率的に隔離でき
ることを発見した。この隔離はＣＮＳからの正味のＡβペプチド流出を生じさせ
、ＣＮＳおよび血漿中のそのクリアランスを変更し、プラーク形成のアベイラビ
リティーを減少させる。したがって、ヒト化型に変換することによってその免疫
原性を減少させるよう修飾されたこの特異性を有する抗体は、ベータ−アミロイ
ドプラークの形成と関連する症状を予防的および治療的に処置する機会を提供す
る。これらの症状には、上記のように、前臨床的および臨床的なアルツハイマー
、ダウン症候群、および前臨床的および臨床的な脳性アミロイド血管障害が含ま
れる。

【００２６】本明細書中で用いられる用語「処置」には、処置される症状がすでに存在する
ことが既知である治療処置、ならびに予防−すなわち可能性ある未来の症状の開
始の予防または緩和が含まれる。

【００２７】「Ａβペプチドの中間領域に結合するモノクローナル抗体」とは、Ａβの第１
３位から第２８位間に含有されるエピトープを表すアミノ酸配列と結合するモノ
クローナル抗体（ＭａｂまたはＭａｂｓ）を意味する。全領域が標的化される必
要はない。抗体がこの領域内の少なくとも１エピトープ（特に、例えばα−セク
レターゼ部位１６−１７または抗体２６６が結合する部位を含む）と結合する限
り、このような抗体は本発明の方法において有効である。

【００２８】「抗体」とは、本質的にモノクローナル抗体または免疫学的に有効なその断片
、例えばそのＦ_ａｂ、Ｆ_ａｂ'、またはＦ_(ａｂ')２断片を意味する。本明細書中
、いくつかの関連では、強調のために断片が具体的に記載される；しかし、断片
が特定されるかどうかにかかわらず、用語「抗体」にはこのような断片ならびに
単一鎖型が含まれることが理解されよう。タンパク質が意図される標的に結合す
る特異的能力、そしてこの場合、血液中でＡβペプチドをその担体タンパク質か
ら隔離する能力を保持している限り、用語「抗体」内に含まれる。また、定義「
抗体」内に含まれるものは、例えば、この特異性を有する抗体の、単一鎖型、一
般にはＦ_ｖ領域と称されるものである。ヒト化型に変換するために、適当な特異
性を有する、典型的にはマウスまたは他の非ヒト抗体の操作が必要とされるため
、必ずしもそうではないが、好ましくは、本発明において有用な抗体は組換え的
に作成されたものである。抗体はグリコシル化されていてもいなくてもよいが、
グリコシル化された抗体が好ましい。抗体は周知のように、ジスルフィド結合を
介して適正に架橋されている。

【００２９】基本的な抗体の構造単位はテトラマーを含むことが既知である。各テトラマー
は２つの同一対のポリペプチド鎖から構成され、各対は１「軽」鎖（約２５ｋＤ
ａ）および１「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分
は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域
を含む。各鎖のカルボキシ末端部分はエフェクター機能を主に担う定常領域を規
定する。

【００３０】軽鎖はガンマ、ミュー、アルファ、およびラムダとして分類される。重鎖はガ
ンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、それぞれ
抗体のイソ型、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。軽鎖
および重鎖のうち、可変領域および定常領域は約１２またはそれ以上のアミノ酸
の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた、約１０またはそれ以上のアミノ酸
の「Ｄ」領域を含んでいる。

【００３１】各軽／重鎖対の可変領域は抗体の結合部位を形成する。したがって、無傷の抗
体は２結合部位を有する。鎖はすべて、相補性決定領域またはＣＤＲｓと称され
る３つの超可変領域と連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）
の同一の全体構造を示す。各対の２つの鎖由来のＣＤＲｓはフレームワーク領域
によって向きを調節され、特定のエピトープと結合することが可能にされている
。Ｎ末端からＣ末端で、軽鎖および重鎖はともに、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、
ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。アミノ酸の各ドメイ
ンへの割り当ては周知の慣例にしたがうものである［Kabat "Sequences of Prot
eins of Immunological Interest" National Institutes of Health, Bethesda,
Md., 1987 および 1991; Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987
); Chothia, et al, Nature 342:878-883 (1989)］。

【００３２】当分野でよく理解されているように、哺乳類を免疫化し、該哺乳類の抗体産生
細胞由来のハイブリドーマを形成させ、またはそれを不死化し、ならびにハイブ
リドーマまたは不死化細胞を培養し、その適当な特異性に関して評価する標準的
技術によって適当な特異性を有するモノクローナル抗体を容易に作成できる。こ
の場合、このような抗体は、ヒト、ウサギ、ラットまたはマウスを例えばＡβペ
プチドの１３−２８領域を含むエピトープを表すペプチドまたはその適当なサブ
領域を用いて免疫化することにより作成できる。組換え操作に関する材料は、所
望の抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞から所望の抗体をコードする
ヌクレオチド配列を回収することによって得ることができる。これらのヌクレオ
チド配列は次いでヒト化型の抗体を提供するために操作することができる。

【００３３】「ヒト化抗体」とは、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体の配列を
変更することによって、ヒト抗体生殖系列由来のアミノ酸配列から部分的に、あ
るいは全体的に構成される抗体を意味する。最もシンプルなこのような変更は単
に、マウス定常領域をヒト抗体の定常領域で置換し、したがって、医薬的使用に
関して許容されるほど十分に低い免疫原性を有し得るヒト／マウスキメラを作成
することからなるものであり得る。しかし、好ましくは、抗体の可変領域および
ＣＤＲでさえもまた、現在までに当分野に周知である技術によってヒト化される
。可変領域のフレームワーク領域は対応するヒトフレームワーク領域によって置
換され、非ヒトＣＤＲは実質的に無傷のままであるか、あるいはそのＣＤＲはヒ
トゲノム由来の配列で置換されることさえある。完全なヒト抗体は、免疫系がヒ
ト免疫系に対応するように変更された遺伝的に修飾されたマウス内で生産される
。上記のように、単一鎖型である断片を含む、抗体の免疫学的に特定の断片を用
いれば、本発明の方法における使用に関しては十分である。

【００３４】ヒト化抗体とはさらに、ヒトフレームワーク、少なくとも１つの非ヒト抗体由
来ＣＤＲを含み、存在する任意の定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域と実質
的に同一、すなわち少なくとも約８５−９０％、好ましくは少なくとも９５％同
一であるものを表す。したがって、可能性としてはＣＤＲを除いて、ヒト化抗体
のすべての部分は１またはそれ以上の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する
部分と実質的に同一である。例えば、ヒト化免疫グロブリンは典型的にはキメラ
マウス可変領域／ヒト定常領域抗体を含まないだろう。

【００３５】ヒト化抗体は、ヒト治療における使用に関して、非ヒトおよびキメラ抗体と比
べて少なくとも３つの潜在的な利点を有する：１）エフェクター部分がヒトであるから、ヒト免疫系の他の部分とより首尾良
く相互作用することができる（例えば、補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）または
抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）によってより効率的に標的細胞を破壊する）
。２）ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワークまたはＣ領域を外来物として
認識しないはずであり、したがってこのような注入抗体に対する抗体応答は完全
に外来の非ヒト抗体または部分的に外来のキメラ抗体に対するものより低くなる
はずである。３）注入非ヒト抗体はヒト循環系においてヒト抗体の半減期よりもずっと短い
半減期を有することが報告された。注入ヒト化抗体は天然に存在するヒト抗体と
本質的に同一の半減期を有し、投与量および頻度をより少なくできるだろう。

【００３６】ヒト化免疫グロブリンの設計は、以下のように行うことができる。アミノ酸が
以下のカテゴリーに含まれる場合、用いられるヒト免疫グロブリン（アクセプタ
ー免疫グロブリン）のフレームワークアミノ酸はＣＤＲ提供非ヒト免疫グロブリ
ン（ドナー免疫グロブリン）由来のフレームワークアミノ酸で置換される：（ａ）アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中のアミノ酸は
その部位のヒト免疫グロブリンに関して通常でないが、ドナー免疫グロブリン中
の対応するアミノ酸はその部位のヒト免疫グロブリンに関して典型的である；（ｂ）このアミノ酸の位置がＣＤＲの１つのすぐ隣であるか；あるいは、（ｃ）フレームワークの任意の側鎖原子が、三次元免疫グロブリンモデル中、
ＣＤＲアミノ酸の任意の原子の約５−６オングストローム（中心から中心）内で
ある［Queen, et al., op. cit., and Co, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 88, 2869 (1991)］。アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域
中の各アミノ酸およびドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸がその位置の
ヒト免疫グロブリンに関して通常でない場合、このようなアミノ酸はその位置の
ヒト免疫グロブリンに関して典型的なアミノ酸によって置換される。

【００３７】好ましいヒト化抗体はマウス抗体２６６のヒト化型である。ヒト化２６６のＣ
ＤＲｓは以下のアミノ酸配列を有する：軽鎖ＣＤＲ１：

【数９】軽鎖ＣＤＲ２：

【数１０】軽鎖ＣＤＲ３：

【数１１】重鎖ＣＤＲ１：

【数１２】重鎖ＣＤＲ２：

【数１３】および重鎖ＣＤＲ３：

【数１４】

【００３８】本発明のヒト化抗体の好ましい軽鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列を有し、
そのフレームワークはヒト生殖系列ＶｋセグメントＤＰＫ１８およびＪセグメン
トＪｋ１起源であり、同一ヒトＶサブグループ内のコンセンサスアミノ酸へのい
くつかのアミノ酸置換を有し、潜在的免疫原性が減少している：

【数１５】式中：第２位のＸａａはＶａｌまたはＩｌｅであり；第７位のＸａａはＳｅｒまたはＴｈｒであり；第１４位のＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒであり；第１５位のＸａａはＬｅｕまたはＰｒｏであり；第３０位のＸａａはＩｌｅまたはＶａｌであり；第５０位のＸａａはＡｒｇ、Ｇｌｎ、またはＬｙｓであり；第８８位のＸａａはＶａｌまたはＬｅｕであり；第１０５位のＸａａはＧｌｎまたはＧｌｙであり；第１０８位のＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇであり；ならびに、第１０９位のＸａａはＶａｌまたはＬｅｕである。

【００３９】本発明のヒト化抗体の好ましい重鎖可変領域は以下のアミノ酸配列を有し、そ
のフレームワークはヒト生殖系列ＶＨセグメントＤＰ５３およびＪセグメントＪ
Ｈ４を起源とし、同一ヒトサブグループ内のコンセンサスアミノ酸へのいくつか
のアミノ酸置換を有し、潜在的免疫原性が減少している：

【数１６】式中：第１位のＸａａはＧｌｕまたはＧｌｎであり；第７位のＸａａはＳｅｒまたはＬｅｕであり；第４６位のＸａａはＧｌｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり；第６３位のＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒであり；第７５位のＸａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＴｈｒであり；第７６位のＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇであり；第８９位のＸａａはＧｌｕまたはＡｓｐであり；ならびに、第１０７位のＸａａはＬｅｕまたはＴｈｒである。

【００４０】本発明のヒト化抗体の特に好ましい軽鎖可変領域は以下のアミノ酸配列を有し
、そのフレームワークはヒト生殖系列ＶｋセグメントＤＰＫ１８およびＪセグメ
ントＪｋ１起源であり、同一ヒトＶサブグループ内のコンセンサスアミノ酸への
いくつかのアミノ酸置換を有し、潜在的免疫原性が減少している：

【数１７】。

【００４１】本発明のヒト化抗体の特に好ましい重鎖可変領域は以下のアミノ酸配列を有し
、そのフレームワークはヒト生殖系列ＶＨセグメントＤＰ５３およびＪセグメン
トＪＨ４起源である；

【数１８】。

【００４２】本発明のヒト化抗体に関する好ましい軽鎖は以下のアミノ酸配列を有する：

【数１９】。

【００４３】本発明のヒト化抗体の好ましい重鎖は以下のアミノ酸配列を有する：

【数２０】

【数２１】。

【００４４】本発明のヒト化抗体およびヒト化２６６に関する軽鎖および重鎖に関して他の
配列が可能である。この免疫グロブリンは二対の軽酸／重鎖複合体を有すること
ができ、少なくとも一鎖は１またはそれ以上のマウス相補性決定領域を含み、こ
れはヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に連結されている。

【００４５】別の側面では、本発明は、発現時に、本発明の抗体由来の重鎖および軽鎖ＣＤ
Ｒｓを含む抗体をコードする組換えポリヌクレオチドに関する。ヒトフレームワ
ーク領域に関して、ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンのフレームワークま
たは可変領域のアミノ酸配列がヒト免疫グロブリン可変領域配列コレクション中
の対応する配列と比較され、高いパーセンテージの同一アミノ酸を有する配列が
選択される。発現時にモノクローナル抗体２６６の重鎖および軽鎖ＣＤＲｓを含
むポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドの例を、図４および５に挙げる
。コドンの縮重および決定的ではないアミノ酸置換のせいで、他のポリヌクレオ
チド配列が容易にそれらの配列の代わりになる。特に好ましい本発明のポリヌク
レオチドは、発現時に、配列番号１〜配列番号６、または配列番号７〜配列番号
１０の可変領域のいずれか、または配列番号１１および配列番号１２の軽鎖およ
び重鎖を含む抗体をコードするものである。

【００４６】ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に付随するか、あるいは異種プロモー
ター領域を含む、ヒト化免疫グロブリンをコードする配列に作動可能に連結され
た発現制御ポリヌクレオチド配列をさらに含む。好ましくは発現制御配列は真核
生物宿主細胞の形質転換またはトランスフェクトを可能にするベクター中の真核
生物プロモーター系であるが、原核生物宿主に関する制御配列もまた使用できる
。このベクターを適当な宿主セルラインへ包含させた後、この宿主細胞を、この
ヌクレオチド配列の高レベル発現に適する条件下で増殖させ、所望であれば、軽
鎖、重鎖、軽／重鎖二量体または無傷の抗体、結合性断片または他の免疫グロブ
リン型の収集および精製を行ってもよい。

【００４７】最終的に所望のヒト化抗体を発現可能な本発明のヌクレオチド配列は、種々の
異なるポリペプチド（ゲノム性またはｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチ
ドなど）および成分（例えば、Ｖ、Ｊ、Ｄ、およびＣ領域）から、ならびに種々
の異なる技術によって形成させることができる。適当なゲノムおよび合成配列の
連結が一般的作成方法であるが、ｃＤＮＡ配列を用いてもよい。

【００４８】ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、周知の手法にしたがって種々のヒト細胞から単離
できるが、好ましくは不死化されたＢ細胞から単離する。本発明の免疫グロブリ
ンを作成するためのＣＤＲｓは同様に、Ａβペプチドのアミノ酸１３および２８
間のエピトープに結合可能な非ヒトモノクローナル抗体由来であり、このモノク
ローナル抗体は任意の都合よい哺乳類ソース、例えばマウス、ラット、ウサギ、
または上記周知の方法によって抗体を作成可能な他の脊椎動物において作成され
たものである。免疫グロブリン発現および分泌についてポリヌクレオチド配列お
よび宿主細胞に関する適当なソースは当分野に周知の多数のソースから得ること
ができる。

【００４９】本明細書中に具体的に記載されているヒト化免疫グロブリンに加えて、他の「
実質的に相同な」修飾免疫グロブリンを容易に設計でき、当業者に周知の種々の
組換えＤＮＡ技術を用いて製造できる。例えば、フレームワーク領域は一次構造
レベルでいくつかのアミノ酸置換、末端および中間の付加および欠失などにより
天然配列から変化し得るものである。さらに、種々の異なるヒトフレームワーク
領域を、本発明のヒト化免疫グロブリンに関する基礎として、単独で、あるいは
組み合わせて用いることができる。一般に、この遺伝子の修飾は、種々の周知の
技術、例えばサイトダイレクト突然変異誘発によって容易に達成することができ
る。

【００５０】別法では、プライマリーな抗体構造の一部分のみを含むポリペプチド断片を作
成することができ、この断片は１またはそれ以上の免疫グロブリン活性（例えば
補体固定活性）を有する。これらのポリペプチド断片は、当分野に周知の方法に
より無傷の抗体をタンパク質分解することによって、あるいはサイトダイレクト
突然変異誘発を用いてベクター中の所望の位置に終止コドンを挿入することによ
って作成（例えばＣＨ１の後ろに挿入してＦａｂ断片を作成またはヒンジ領域の
後ろに挿入してＦ(ａｂ')_２断片を作成）することができる。単一鎖抗体はＤＮ
Ａリンカーを用いてＶＬおよびＶＨを連結することによって作成することができ
る。

【００５１】以前に述べたように、コード化ヌクレオチド配列は発現制御配列に作動可能に
連結（すなわち、確実に機能する位置に配置）された後、宿主内で発現される。
これらの発現ベクターは典型的に、宿主生物内において、エピソマーとしてか、
あるいは宿主染色体ＤＮＡの組込み部分として複製可能である。一般に、発現ベ
クターは選択マーカー、例えばテトラサイクリンまたはネオマイシンを含有し、
所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にする。

【００５２】大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドのクローニングに特に有用な原核生物宿
主である。使用に適する他の微生物宿主には、桿菌（bacilli）、例えば枯草菌
（Bacillus subtilus）、および他の腸内細菌科、例えばサルモネラ（Salmonell
a）、セラチア（Serratia）、および種々のシュードモナス種（Pseudomonas spe
cies）が含まれる。これらの原核生物宿主では、典型的に、宿主細胞と両立可能
な発現制御配列（例えば複製起点）を含有する発現ベクターを作成できる。さら
に、多数の周知のプロモーター系、例えばラクトースプロモーター系、トリプト
ファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、また
はファージラムダ由来のプロモーター系のいずれかが存在してもよい。プロモー
ターは典型的に、場合によりオペレーター配列を伴って発現を制御し、転写およ
び翻訳を開始および完了させるために、リボソーム結合部位配列などを有する。

【００５３】他の微生物、例えば酵母もまた、発現用に用いることができる。酵母菌（Sacc
haromyces）は、発現制御配列、例えばプロモーター（３−ホスホグリセラート
キナーゼまたは他の糖分解酵素を含む）、および複製起点、終結配列など所望の
ものを有する適当なベクターを用いて好ましい宿主となる。

【００５４】微生物に加えて、哺乳類組織細胞培養を用いて、本発明のポリペプチドを発現
および作成してもよい。真核生物細胞は、無傷の免疫グロブリンを分泌可能な多
数の適当な宿主セルラインが当分野で開発されたため、実際に好ましく、これに
は、ＣＨＯセルライン、種々のＣＯＳセルライン、シリアンハムスター卵巣セル
ライン、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫セルライン、形質転換Ｂ細胞、ヒト胎
児腎臓セルライン、またはハイブリドーマが含まれる。これらの細胞に関する発
現ベクターには、発現制御配列、例えば複製起点、プロモーター、エンハンサー
、および必要なプロセッシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡス
プライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列が含まれ得る。好まし
い発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳
頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。

【００５５】目的のヌクレオチド配列（例えば重鎖および軽鎖をコードする配列および発現
制御配列）を含むベクターは、細胞性宿主のタイプに応じて変化する周知の方法
によって宿主細胞内にトランスファーすることができる。例えば塩化カルシウム
トランスフェクションは一般に原核生物細胞に関して用いられ、リン酸カルシウ
ム処理またはエレクトロポレーションは他の細胞性宿主に関して用いることがで
きる。

【００５６】発現時、本発明の完全抗体、その二量体、個々の軽鎖および重鎖、または免疫
グロブリン型は、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換、アフィニティー、逆相、
疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当分野の標
準的手法にしたがって精製できる。少なくとも約９０〜９５％均一性を有する実
質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均一性
を有するものが医薬用途には最も好ましい。所望により部分的に、あるいは均一
にまで精製した後、このポリペプチドは、本明細書中に示されるように、治療的
または予防的に用いることができる。

【００５７】Ａβに関連する徴候または病態、例えば臨床的または前臨床的なアルツハイマ
ー疾患、ダウン症候群、または臨床的または前臨床的なアミロイド血管障害を示
す危険性を有する被検体に、標準的投与技術を、静脈内、腹腔内、皮下、肺性、
経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下、または坐剤投与により好ましくは末梢的に
（すなわち中枢神経系への投与によってではなく）用いて、抗体（免疫学的な反
応性断片を含む）を投与する。抗体は心室系、脊髄液、または脳実質に直接投与
することができ、これらの位置に向ける技術は当分野に周知であるが、これらの
より困難な手法を用いる必要はない。本発明の抗体は、末梢循環系に依存するよ
りシンプルな技術によって投与された場合に有効である。本発明の利点には、中
枢神経系そのものに直接提供されない場合でさえ、その有効な効果を発揮する抗
体の能力が含まれる。実際、本明細書中には、血液−脳関門を横切る抗体の量が
血漿レベルの＜０．１％であること、および本発明の抗体が、末梢循環中のＡβ
を隔離し、ならびにＣＮＳおよび血漿可溶性Ａβクリアランスを変更するその能
力を発揮することが示されている。

【００５８】投与用医薬組成物は選択される投与様式に適当であるように設計され、製薬的
に許容される賦形剤、例えば分散剤、バッファー、界面活性剤、保存剤、可溶化
剤、等張剤、安定化剤などが適当に用いられる。引用により本明細書中に包含さ
れる Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA
, latest edition は、概して当業者に既知の製剤化技術の概論を提供する。例
えばリポソーム内にカプセル化するか、あるいは極性基を保護することによって
本発明の抗体の可溶性を変更し、それらをよりに親油性にすることは特に有用で
あるかもしれない。

【００５９】静脈内または腹腔内または皮下注射による末梢全身性デリバリーが好ましい。
このような注射に関する適当なビヒクルは簡単なものである。しかし、さらに鼻
腔エアロゾルまたは坐剤を用いて、粘膜を介して投与することもできる。このよ
うな投与様式に適当な製剤は周知であり、典型的には膜を横切る移動を促進する
界面活性剤を含む。このような界面活性剤はしばしばステロイド由来であり、あ
るいはカチオン性脂質、例えばＮ−[１−(２,３−ジオレオイル)プロピル−Ｎ,
Ｎ,Ｎ−トリエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）または種々の化合物
、例えばコレステロールヘミスクシナート、ホスファチジルグリセロールなど
である。

【００６０】選択される特定の投与様式にしたがって、製剤中のヒト化抗体の濃度は、少な
くて約０．１重量％〜多くて１５または２０重量％であり、主に液体容量、粘度
などに基づいて選択される。したがって、典型的な注射用医薬組成物は、リン酸
緩衝化塩類溶液の１ｍＬ滅菌緩衝水および本発明のヒト化抗体１〜１００ｍｇを
含有して構成され得る。この製剤は、製剤の作成後に滅菌ろ過するか、あるいは
微生物学的に許容されるものにすることができる。典型的な静脈内注入用組成物
は、２５０ｍＬ量の液体、例えば滅菌リンガー溶液、および１〜１００ｍｇ／ｍ
Ｌまたはそれ以上の抗体濃度を有し得る。本発明の治療剤は保存用に凍結あるい
は凍結乾燥することができ、使用前に適当な滅菌担体中に再組成することができ
る。凍結乾燥および再組成は、抗体活性喪失の程度を変化させ得る（例えば慣用
的免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体より大きな活性喪失を示す傾向
がある）。用量を調節して埋め合わせる必要があるだろう。製剤のｐＨは、抗体
の安定性（化学的および物理的）および投与時の患者に対する苦痛のなさのバラ
ンスをとって択される。一般に、４〜８の範囲のｐＨが寛容される。

【００６１】タンパク質、例えばヒト化抗体の投与には、前記方法が最も都合がよく、最も
適当であると思われるが、適当な適合化により、適正な製剤されれば、他の投与
技術、例えば経皮投与および経口投与を用いることができる。

【００６２】さらに、生物分解性フィルムおよびマトリクス、または浸透性ミニポンプ、ま
たはデキストランビーズ、アルギナート、またはコラーゲンに基づくデリバリー
系を利用する制御放出製剤を用いるのが望ましいこともある。

【００６３】まとめると、製剤は、本発明の抗体の投与に利用可能であり、当分野に周知で
あり、種々のオプションから選択することができる。

【００６４】典型的な投与量は、標準的臨床技術を用いて最適化することができ、これは投
与の様式および患者の症状に応じる。

【００６５】以下の実施例は本発明を制限するためのものではなく、例示するためのもので
ある。

【００６６】本明細書中以下の実施例は、他のもののうち、元々、ヒトＡβペプチドの残基
１３−２８から構成されるペプチドを用いる免疫化によって製造された「２６６
」と称されるマウスモノクローナル抗体を用いる。この抗体はこのペプチドと免
疫反応することが確認されているが、ヒトＡβペプチドの残基１７−２８のみを
含有するペプチド、またはＡβペプチド内の任意の他のエピトープにおいては反
応しないことが以前に報告されている。この抗体の製造は、引用により本明細書
中に包含される米国特許５，７６６，８４６に記載されている。本明細書中の実
施例はマウス系において行われた実験を記載しているので、マウスモノクローナ
ル抗体の使用で十分である。しかし、ヒトにおける使用を意図される本発明の処
置方法では、抗体２６６の免疫特異性に対応する免疫特異性を有するヒト化型の
抗体が好ましい。

【００６７】実施例１ヒト体液における添加されたＡβペプチドの隔離ヒトの脳脊髄液（ＣＳＦ）（５０μＬ）およびヒト血漿（５０μＬ）の試料を
室温で１時間インキュベートした。該インキュベートは、１．単独で；２．Ａβ４０ペプチド（５ｎｇ）と一緒に；または３．Ａβ４０ペプチド（５ｎｇ）をモノクローナル抗体２６６（１ｍｇ）（例
えば、米国特許第５，７６６，８４６号（これは本明細書の一部を構成する）に
記載されている）と一緒に；行なった。

【００６８】次いで、該試料を４〜２５％の非変性勾配ゲル（すなわち、非変性勾配電気泳
動（ＮＤＧＧＥ））を用いて電気泳動を行ない、ニトロセルロースに移行した。
次いで、該ブロットをポニソー（Poncesu）Ｓを用いて染色するか、またはウェ
スタンブロッティング分析の場合には、ビオチン標識化したモノクローナル抗体
（３Ｄ６）（このものは、Ａβペプチドの最初の５つのアミノ酸に関する）を用
いてプローブし、ストレプトアビジン−ホースラディシュペルオキシダーゼを用
いて展開して増幅化学ルミネセンス（ＥＣＬ）を用いて検出した。該ブロット上
のバンドに含まれる物質の水和直径を、ファルマシア分子量マーカーを用いて見
積った。従って、Ａβペプチドが他の分子と結合する場合には、得られた複合体
のサイズについて実験する。

【００６９】Ａβペプチド（５ｎｇ）のあるなしでのＣＳＦのウェスタンブロッティング分
析は、抗体３Ｄ６によって媒介される検出ヘの応答ではＡβペプチドの証拠は全
くないことを示す。同様な結果は、ヒト血漿の場合にも得られる。このことは、
ＡβペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出し、続いて同じ方法および同じＣ
ＳＦ試料を用いたウェスタンブロッティング分析によって検出することができる
という事実にも関わらず、このことは本当であった。恐らく、Ａβペプチドの検
出はこのペプチドと該試験液中の他の因子との相互作用によって抑制されたので
あろう。しかしながら、Ｍｂ２６６を該インキュベートに加えた場合には、該抗
体と複合形成する隔離Ａβペプチドを示す特性バンドが、血漿およびＣＳＦの両
方の場合に存在する。主なバンドは約１１ｎｍの水和直径（このものは抗体二量
体に対応する）と更に小さいバンド（１３ｎｍ）（これは、抗体の単量体に相当
する）である。

【００７０】実施例２隔離抗体の特異性ヒトＣＳＦ（５０μＬ）またはＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}ＣＳＦ（１０μＬ）を含有す
る試料を使用した。ＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}は、アルツハイマー疾患のマウスモデルで
あるトランスジェニックなマウスである。ここでは、家族性アルツハイマー疾患
突然変異を有するヒトアミロイド前駆体タンパク質トランスジーンを発現し、中
枢神経系においてヒトＡβペプチドの産生を生じる。

【００７１】該試料を、実施例１に記載の通り、様々なＭａｂｓ（１μｇ）のあるなしで室
温で１時間インキュベートし、次いで４〜２５％ＮＤＧＧＥ上で電気泳動を行な
い、ニトロセルロース上にブロットした。該抗体は、Ｍａｂ２６６（１３〜２８位と結合）Ｍａｂ４Ｇ８（１７〜２４位と結合）ＱＣＢパン（１〜４０位のウサギポリクローナル）マウスＩｇＧ（非特異的）Ｍａｂ３Ｄ６（１〜５位で結合する）Ｍａｂ２１Ｆ１２（３３〜４２位と結合する）Ｍａｂ６Ｅ１０（１〜１７位と結合する）及びＱＣＢ４０、４２（Ａβ_４０およびＡβ_４２に対するウサギポリクローナル）
である。

【００７２】Ａβペプチド抗体複合体の検出は、実施例１に記載に通りであった。すなわち
、標識化した３Ｄ６（このものは、ＡβペプチドＮ−末端に対する）を行ない、
続いてストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＥＣＬを行なった。Ｍａｂ２６６（
３Ｄ６の場合には、例えばＡβペプチドのカルボキシル末端と結合するＱＣＢ_４ _０，４２に代える）と一緒にインキュベートしたヒトＣＳＦにおいて、同様な検
出を行なった。

【００７３】該結果は、試験抗体においてＭａｂ４Ｇ８およびＭａｂ２６６だけがＡβ
ペプチドの検出を可能にすることを示した。

【００７４】該結果は、ヒトＣＳＦの場合には、検出可能な量の抗体Ａβ複合体においてＭ
ａｂ２６６およびＭａｂ４Ｇ８だけを分離することができることを示した（
ここで、いずれの抗体も存在しない場合には、Ａβは全く検出されない）。Ｍａ
ｂ２６６は、ＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}トランスジェニックマウス由来のＣＳＦを用い
た場合には、ヒトＣＳＦを用いた場合に得られる結果と同様な結果を与えること
もできた。３Ｄ６またはＱＣＢ_{４０，４２}抗体のいずれをウェスタンブロッティ
ング分析を開発するのに使用するかに関わらず、ＡβペプチドはＭａｂ２６６
を用いてヒトＣＳＦ中で分離することができた。

【００７５】実施例３２次元電気泳動による、Ａβペプチドと２６６との複合体の隔離Ａβ_４０ペプチド（５０ｎｇ）を含有する試料を、Ｍａｂ２６６（２μｇ）
と一緒に３７℃で３時間インキュベートした。Ｍａｂ２６６単独での相当する
インキュベートしたものを、コントロールとして使用した。

【００７６】次いで、試料について２次元ゲル電気泳動を行なった。

【００７７】１番目の次元において、該インキュベートした試料について実施例１に記載に
通り、ＮＤＧＧＥ分析を行なった。次いで、該ポリアクリルアミドゲルを１番目
の次元のフローの方向に垂直な個々のレーンに切断し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（トリ
シン（Tricine）ウレアゲル）による変性／還元条件下でゲル分離を２番目の
次元において行なった。該バンドの存在は、ポンス−Ｓ染色（いずれかのタンパ
ク質）によるか、またはＨＲＰ−ベースの検出システムにおける６Ｅ１０Ｍａ
ｂ（セネテック（Senetec社）製）およびビオチン標識化した抗−マウスＡβを
用いた特定の開発によって検出した。

【００７８】移行後のニトロセルロースブロッティングのポンス−Ｓ染色により、Ｍａｂ
２６６のみの重鎖および軽鎖の視覚化が可能になった。Ａβペプチドが４ｋＤの
バンドとしてのＭａｂ２６６との複合体に存在することを確認し、１次元のＮ
ＤＧＧＥ後に完全鎖Ｍａｂ２６６のサイズを有する配列が観察された。

【００７９】実施例４非等価な結合および隔離の実証血漿およびＣＳＦ中を循環するＡβペプチドはアポリタンパク質Ｅを含めたタ
ンパク質との複合体中に含まれると考えられる。本実施例は、アポＥについての
抗体（このものは、複合体と結合することができる）が該複合体の残りからアポ
Ｅを分離することができないことを実証する。

【００８０】アポＥ複合体（５００ｎｇ）を、ＭａｂまたはアポＥについてのポリクローナ
ル抗体（２μｇ）と３７℃で１時間インキュベートした。次いで、該インキュベ
ートした試料について、実施例１に記載の方法を用いるＮＤＧＧＥを行なった。
ＮＤＧＧＥ後に、ウェスタンブロッティング法を、アフィニティー精製したヤギ
抗−アポＥ抗体を用いて行ない、ＥＣＬによる検出を行なった。抗体が存在しな
い場合には、アポＥを８〜１３ｎｍで検出することができ、このことはリポタン
パク質粒子中にそのものが存在することと一致する。アポＥについてのモノクロ
ーナル抗体またはポリクローナル抗体が存在することにより、アポＥのより大き
な分子種ヘの集団シフト、「スーパーシフト」を生じる。このことは、アポＥに
ついての抗体が分離されず、すなわちリポタンパク質粒子からアポＥが除かれず
、むしろそれらはリポタンパク質上でアポＥと結合してより大きな分子種を形成
することを示す。

【００８１】実施例５Ａβの分離は、抗−アポＥ抗体によって撹乱されないヒトＣＳＦ（１００μＬ）の試料をＭａｂ２６６単独であるか、ポリクロー
ナル抗−アポＥと一緒であるか、または両方の抗体と一緒に３７℃で６０分間イ
ンキュベートを行なった。次いで、該試料を実施例１に記載の通り、ＮＤＧＧＥ
によって分析して、該バンドの検出を実施例１に記載の通り行なった。

【００８２】該結果は、Ｍａｂ２６６を該試料に添加する限り、分離された２６６−Ａβ
ペプチド複合体に特徴的な約１１ｎｍ直径でのバンドは見ることができることを
示す。このことは、抗−アポＥが存在するかどうかという場合である。分離され
たＡβを示すこのバンドは、Ａβペプチド（５０ｎｇ）をＭａｂ２６６の存在
下でのインキュベート混合物に加える場合にも見られる。従って、抗−アポＥ抗
体の存在によるアポＥの分子量の変化は、Ｍａｂ２６６によるＡβペプチドの
隔離を妨害しない。

【００８３】実施例６インビボでのＡβペプチドの隔離Ａ．トランスジェニックなＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}マウス（これは、ＰＤＡＰＰマ
ウスとも呼ばれる）は、ヒトＡＰＰタンパク質の突然変異体を過剰発現する。こ
れらのマウスは、ＣＮＳ中でヒトＡβを産生し、ＣＳＦおよび血漿中で循環する
ヒトＡβペプチドのレベルを上昇させる。８ヶ月齢のマウスに、サリンまたはＭ
ａｂ２６６（１００μｇ）を静脈内注射した。それらは内部注射の１０分後に
出血し、内部注射の２０時間後に再び出血した。

【００８４】各々の動物由来の血漿（２０μＬ）を含有する試料を、実施例１に記載の通り
、ＮＤＧＧＥおよび抗体３Ｄ６を用いるウェスタンブロッティング法によって分
析を行なった。サリンを注射した動物は、１０分後または２０時間後のいずれか
で特徴的な１１ｎｍの分離されたＡβペプチドのバンドの存在を示さなかった。
しかしながら、Ｍａｂ２６６を注射された２動物は２０時間後にはこのバンド
の出現を示した。

【００８５】Ｂ．２ヶ月齢のＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}マウスを本研究に使用した。０日めに、該
マウスにＭａｂ２６６なし、Ｍａｂ２６６（１ｍｇ）またはこの抗体（１０
０μｇ）を与えた。血漿試料を抗体の投与２日前、並びに１、３、５および７日
めに採取した。実施例１に記載の通り、該血漿試料をＮＤＧＧＥ分析を行い、続
いてウェスタンブロッティング分析を行い、３Ｄ６を用いて検出した。血漿試料
をプロテインＧ（このものは、免疫グロブリンと結合する）を用いて処置しない
場合には、Ｍａｂ２６６の投与後のあらゆる時点で、２６６／Ａβ複合体を検
出し、従って、Ｍａｂ２６６が有効に除去された。Ｍａｂ２６６（１００μ
ｇ）を注射した動物において７日めにわずかに減少したことを除いては、試験期
間中での一貫したレベルの複合体を見出した。一般に、１００μｇを投与した動
物における該レベルは、この抗体（１ｍｇ）を投与したマウスにおいて観察され
るレベルよりも一貫して低かった。

【００８６】Ｃ．２ヶ月齢のＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}マウスに、Ｍａｂ２６６（１ｍｇ）を静
脈内投与し、血漿試料（２５μＬ）を各々から採取した。該血漿試料についてＮ
ＤＧＧＥ分析を行ない、続いて上記の通り（但し、ビオチン標識化した３Ｄ６と
結合させて、引き続いてストレプトアビジン^１２５Ｉ（アマーシャム製）を用い
て検出してホスホルイメージングスクリーニングに曝露させる点を除く）、ウェ
スタンブロッティング分析を行なった。飽和レベルのＭａｂ２６６と複合化さ
せて且つ同様に検出したＡβ_４０の公知の量を用いる標準曲線と比較して、該複
合体のレベルを見積った。Ｍａｂ２６６と結合したＡβペプチドの量を、約１
００ｎｇ／ｍＬと見積り、このことはこれらのマウスにおける内因性のＡβペプ
チド（これは、約１００ｐｇ／ｍＬであると測定される）の約１，０００倍の増
加であることを示す。このことは、Ａβ沈積前のＡＰＰ^Ｖ７１７脳におけるＡβ
ペプチドのレベルとも同じであった。ヒトＡＰＰおよびＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ} Ｔｇ
マウスにおけるヒトＡβは、ほとんど脳だけで産生される。従って、血漿中での
Ｍａｂ２６６の存在はＡβペプチドのシンクとして作用し、このためにＡβペ
プチドのＣＮＳから血漿中への正味の流出を促進する。この増加した正味の流出
は、ＣＮＳから血漿中へのＡβの流出の増加から生じるようであり、また血漿中
のＡβが脳に再流入することが防止されることからも生じるようである。

【００８７】トリス−トリクリン（Tricline）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のＭａｂ２６６（
１ｍｇ）を注射した２４時間後のＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}マウスから血漿試料（２０μ
Ｌ）を採取し、引き続いてプロテインＧと結合したベッドを用いたプロテインＧ
曝露の前後に、抗−Ａβ抗体６Ｅ１０を用いたウェスタンブロッティングを行な
うことによって、分離されたＡβペプチドについての正確なサイズを確認した。
プロテインＧによって減少するバンドは４〜８ｋＤで検出され、このことはＡβ
ペプチドの単体、ひょっとしたらその二量体が存在していることと一致する。

【００８８】Ｄ．２ヶ月齢のＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}マウスを、ＰＢＳ（ｎ＝７）またはビオチン
標識化したＭａｂ２６６（すなわち、ｍ２６６Ｂ（ｎ＝９））（５００μｇ）
のいずれかを用いて腹膜内処理した。注射前およびその２４時間後の両方で、血
漿をＥＬＩＳＡ法（Johnson-Wood, K.らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA (19
97) 94: 1550-1555; およびBales, K. R. らによるNature Genet (1997) 17: 26
3-264）の改良法を用いて、全Ａβペプチドについて分析した。ｍ２６６Ｂと結
合する全Ａβを、ｍ３Ｄ６で被覆した９６ウェルオプチプレート（optiplate）
（パッカード社製）を用いることによって測定した。希釈した血漿試料および標
準品（これは、様々な濃度のＡβ_４０およびｍ２６６Ｂ）を、被覆したプレート
中で終夜インキュベートし、全てのＡβ／ｍ２６６Ｂ複合体の量を、^１２５Ｉ−
ストレプトアビジンを用いて測定した。加えて、該２４時間時には血漿試料を第
１にプロテインＧを用いて処理して、Ｍａｂ２６６とは結合しないＡβペプチ
ドを定量化する。そして、ＣＳＦ中のＡβ_全ておよびＡβ_４２をＥＬＩＳＡ法に
よって測定した。ＰＢＳを注射した動物において、血漿Ａβペプチドレベルは注
射の前後で１４０ｐｇ／ｍＬであった。血漿レベルはその注射前にＭａｂ２６
６を注射したマウスのレベルと同様であったが、Ｍａｂ２６６とは結合してい
ないＡβペプチドのレベルは注射の２４時間後では検出することはできなかった
。

【００８９】ＣＳＦ中のレベルをも測定した。ＣＳＦは、ＣＮＳ中の細胞外コンパートメン
トであり、ＣＳＦ中の分子の濃度は脳の細胞外腔における物質の濃度にある程度
影響を及ぼす。ＣＳＦは、大槽コンパートメントから単離した。マウスをペント
バルビタールを用いて麻酔をかけ、頭蓋の底部から第１の椎骨ヘの筋系を取り出
した。解剖用顕微鏡下でマイクロニードルを該槽を覆っているくも膜を注意深く
穿刺して、該ＣＳＦをポリプロピレンマイクロピペット中に除くことによって、
ＣＳＦを集めた。注射の２４時間後に、Ｍａｂ２６６を注射したマウスのＣＳ
Ｆにおける全Ａβペプチドの増加が観察され、ＰＢＳ注射したマウスと比較して
、Ａβ_４２についての約２倍量の増加がＣＳＦにおいて得られた。このことは、
変性ゲル電気泳動、続いてＡβ_４２特異的抗体２１Ｆ１２を用いるウェスタンブ
ロッティング分析法を用いて確認した。

【００９０】更なる実験において、３ヶ月齢のＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}Ｔｇマウスを、ＰＢＳまた
はＭａｂ２６６のいずれかを静脈内注射し、ＣＳＦにおけるＡβ_４０レベルお
よびＡβ_４２レベルの両方を以下の通り、評価した。

【００９１】Ａβ_４０の測定の場合には、Ａβ_４０に特異的なモノクローナル抗体ｍ２Ｇ３
を使用した。上記（Johnson-Wood, K.らによるProc. Natl. Acad. USA (1977) 9
4: 1550-1555）のＥＬＩＳＡ法を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ試薬を^１２５Ｉ
−ストレプトアビジンに置き代えることによって、ＲＩＡに改良した。血漿試料
およびＣＳＦ試料の場合には、該方法を緩衝液中にグアニジンがない非変性条件
下で行なった。脳のホモジネートにおけるカルボネートに可溶なＡβおよび不溶
なＡβの評価については、試料をカルボネート（１００ｍＭ）、ＮａＣｌ（４０
ｍＭ）、ｐＨ１１．５（４℃）でホモジネートし、スピン（１０，０００×ｇ
）を１５分間行なった。そして、上記の文献（Johnson-Wood, K.らによるProc.
Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 1550-1555）および上記の通り、上清（可溶
物）およびペレット（不溶物）の画分中のＡβを評価した。血漿中のＡβ／Ｍａ
ｂ２６６複合体の測定を、改良したＲＩＡ法によって行なった。マウスにビオ
チン標識化したＭａｂ２６６（Ｍａｂ２６６Ｂ）を注射し、血漿を多くの時
点で単離した。Ｍａｂ２６６と結合した全Ａβを、ｍ３Ｄ６で被覆した９６ウ
ェルオプチプレート（パッカード社製）を用いることによって測定した。希釈し
た血漿試料および標準品（様々な濃度のＡβ_４０およびＭａｂ２６６Ｂ）を、
該被覆したプレート中で終夜インキュベートし、全Ａβ／Ｍａｂ２６６複合体
の量を^１２５Ｉ−ストレプトアビジンを用いて測定した。

【００９２】Ｍａｂ２６６の静脈内注射の３時間後に、ＣＳＦ中のＡβ_４０レベルは２倍
量増加し、Ａβ_４２のレベルは有意に増加しなかった。しかしながら、２４時間
後および７２時間後の両方において、ＣＳＦ中のＡβ_４０およびＡβ_４２の両方
は２〜３倍に増加した。同様な結果は、変性ゲル分析、続いて貯蔵ＣＳＦのＡβ
ウェスタンブロッティング法を用いることによって、同様な結果を得た。脳の間
質液からのＡβの流出（これは、ＣＳＦレベルによってある程度の影響を受ける
）は、観察されたＣＳＦ中のＡβの増加を説明するであろう。

【００９３】ＣＳＦ中でのＡβペプチドレベルの変化は、ＣＳＦ中へのＭａｂ２６６の流
入が原因ではあり得ないことは重要である。その理由としては、注入２４時間後
に測定されるレベル（これは、Ｍａｂ２６６の０．１％血漿レベルよりも低い
）は該変化を説明するのに不十分であるからである。これらの結果は、該抗体が
血流中に存在することによって、Ａβベプチドが脳の実質からＣＳＦ中に除かれ
ることを示唆する。

【００９４】ＰＢＳまたはカルボネート緩衝液中で可溶であるＡβペプチドの形態は、Ｍａ
ｂ２６６を注射し、上記の通りＣＳＦを分析した同じマウスにおける大脳皮質
ホモジネート中で観察された。該皮質ホモジネート中でのこれらの可溶な形態の
同様な増加が観察された。

【００９５】実施例７Ｍａｂ２６６は、インビトロでＡβペプチドシンクとして作用するＭａｂ２６６がＡβペプチドのシンクとして作用する能力を調べるために、
透析用チャンバーをインビトロシステムとして構築した。ヒトＣＳＦ（１ｍＬ）
を透析膜（このものは、Ｍａｂ２６６（１μｇ）のあるなしでＰＢＳ（７５μ
Ｌ）を含有する下部チャンバーから１０〜１００ｋＤの範囲で特定にカットオフ
されている）によって隔てられたポリプロピレンチューブのトップチャンバーに
置いた。

【００９６】平衡は３時間後に達したようであり、このことは下部チャンバー中の物質を酸
性ウレアゲルに置き、続いて様々な時点で６Ｅ１０を用いてＡβペプチドについ
てウェスタンブロッティング法を行なうことによって測定される。試料をギ酸中
で変性させて、最終濃度を８０％（容量比）とし、β−メルカプトエタノール（
１％）を用いて還元させた。試料を、４〜３５％のポリアクリルアミド勾配ゲル
を通る０．９Ｍ酢酸実験用（running）緩衝液（このものは、６Ｍウレア、５％
（容量比）氷酢酸および２．５％ＴＥＭＥＤを含有する）中で電気泳動（陽極か
ら陰極へ）させた。ニトロセルロースヘ移行させる前に、ゲルの酸性ｐＨを中和
した。引き続いて、標準的なウェスタンブロッティング法を用いてＡβを同定し
た。検出したバンドは、４ｋＤに相当する。

【００９７】従って、該トップチャンバーから除かれるＡβの量を、３時間後に上部および
下部のチャンバー（ｎ＝４）の両方についてのＥＬＩＳＡ分析によって測定した
。Ｍａｂ２６６のあるなしでの様々な分子量のカットオフについての結果を、
図１に示す。図示する通り、ＰＢＳを下部チャンバーに置いた場合には、最少量
のＡβペプチドだけが該膜を通過するが、Ｍａｂ２６６が存在しており、分子
量のカットオフが約２５ｋＤである場合には、５０％のＡβペプチドが該下部チ
ャンバー中で分離されていた。ほとんど１００％のＡβペプチドが該膜を通過す
る場合には、分子量のカットオフが１００ｋＤにまで増加するにつれて、通過す
る量は増加した。

【００９８】実施例１に記載するアッセイにおいてはＡβペプチドを分離することができな
いが、抗−Ｎ−末端Ａβ抗体である３Ｄ６および１０Ｄ５は、Ａβペプチドをこ
のシステムにおける膜に通過させることができることも観察した。これらの結果
は、Ａβペプチドの抗体が生理学的な溶液中の該ペプチドを他の結合性タンパク
質から分離させるこれらの条件下で十分なアフィニティーを有しているが、Ｍａ
ｂｓ（例えば、２６６）（このものは、１３〜２８位のエプトープと免疫反応性
である）が実質的により有効であって高いアフィニティーで結合することを示す
。

【００９９】同様なアッセイにおいて、星状細胞分泌性のアポＥ４（このものは、DeMattos
, R. B.らによるJ. Biol. Chem. (1998) 273: 4206-4212; Sun, Y.らによるJ. N
eurosci (1988) 18: 3261-3272に記載されている通り精製した）は、下部チャン
バーにおけるＡβペプチドの量を増加させるのに小さいが統計学的に有意な効果
を有していた。ポリクローナルＩｇＧまたはＢＳＡをＭａｂ２６６の代わりに
用いた場合には、全く顕著な効果は観察されなかった。

【０１００】実施例８ＣＮＳから血漿へのＡβペプチドの流れＡ．Ａβ_４０（１μｇ）をラットＣＳＦ（５μＬ）に溶解して、そのものを
可溶の状態に保ち、次いで野生型スイスウェブスターマウス（このものは、予め
ＰＢＳ（ｎ＝３）またはビオチン標識化したＭａｂ２６６（ｎ＝３）（２００
μｇ）のいずれかを静脈内注射する）の大槽のくも膜下腔に注射した。処置後の
異なる時点での、マウスの血漿におけるＡβ_全てを、ＡβＥＬＩＳＡ（これは、
コーティング抗体として３Ｄ６を用い、および過剰量のビオチン標識化した２６
６と混合させたＡβの標準品を使用）によって測定した。ＥＬＩＳＡにおけるＡ
β検出のための各々の動物から除去後に、過剰量のビオチン標識化した２６６を
用いてスパイク（spike）した。ＰＢＳを注射したマウスの場合には、レベルが
０．１５ｎｇ／ｍＬのペプチドの最少の検出可能な量を、３０〜６０分後にピー
ク値として検出した。その後該レベルは実質的に０であった。しかしながら、Ｍ
ａｂ２６６を投与したマウスにおいては、血漿Ａβペプチドは６０分後にＰＢ
Ｓを注射したマウスにおいて検出されるレベル（約５０ｎｇ／ｍＬ）よりも３３
０倍高いレベルに達し、１８０分後には約９０ｎｇ／ｍＬの値に達した。

【０１０１】Ｂ．２００μｇ（ｎ＝３）または６００μｇ（ｎ＝３）のいずれかを２ヶ月
齢のＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}マウスに静脈内注射することを用いるこの操作を繰り返し
た。Ｍａｂ２６６を、上記の用量を用いて３ヶ月齢のＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}＋／＋
マウスに静脈内注射した。静脈内注射前およびその後の異なる時点での、Ｍａｂ２６６と結合したＡβ２６６の血漿濃度をＲＩＡ法によって測定した。ある例
示的なマウスからの詳細な結果を図２に示す。

【０１０２】モノクローナル抗体Ｍａｂ２６６と結合するＡβの濃度は、１５０ｐｇ／ｍ
Ｌの基底レベルから１００ｎｇ／ｍＬ以上のレベルにまで４日間で増加すること
を見出した。該曲線上の早期の時点を分析することによって、Ａβ_全てがＡＰＰ ^{Ｖ７１７Ｆ} Ｔｇマウスの血漿ヘ流入する正味の割合は飽和レベルの抗体の存在下
では４２ｐｇ／ｍＬ／分であった。

【０１０３】Ｍａｂ２６６が野生型およびＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}Ｔｇマウスの両方における血
漿Ａβレベルに及ぼす影響、並びに該抗体がＣＳＦ中のＡβ濃度に及ぼす影響は
、循環性のＭａｂ２６６が存在することにより、Ａβの流れの平衡の変化、ま
たはＣＮＳおよび血漿の間での輸送の変化を生じることを示す。

【０１０４】実施例９Ｍａｂ２６６が脳におけるＡβに及ぼす影響４ヶ月齢のＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}＋／＋マウスを、サリン、Ｍａｂ２６６（５０
０μｇ）またはコントロールマウスＩｇＧ（１００μｇ、ファルミゲン）の腹膜
内注射により、２週間毎に５ヶ月間処置した。該マウスを９ヶ月齢で殺し、皮質
中のＡβ沈積を測定した。Ａβ−免疫反応性によって適用される面積（％）（こ
のものは、ラビットパン（pan）−Ａβ抗体（ＱＣＢ社製）を用いて同定される
）を、Holtzman, D. M.らによるAnn. Neurol. (2000) 97: 2892-2897に記載され
ている通り、背側の海馬を直接に覆っている皮質について定量化した。該結果を
図３Ａに示す。この年齢では、各々の群のおよそ半分はＡβ沈積の発生は未だ始
まっていなかった。しかしながら、皮質中に＞５０％のＡβ荷（burden）を有す
るマウスの％は、２６６で処置した群の場合に有意に低かった（Ｐ＝０．０２、
カイ二乗試験）。ＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}マウスは９ヶ月で大量のＡβ沈積を発生する
ことができるが、約５０％は沈積なしを示して、約５０％は実質的に沈積してい
るという大きな可変性を示した。ＰＢＳおよびＩｇＧで処置した動物において、
６／１４および５／１３のマウスが５０％よりも大きいＡβ染色によって覆われ
た皮質を有していた。一方で、Ｍａｂ２６６を用いて処置した１４マウスのう
ちの１つだけがこのレベルの染色を有していた。全ての群におけるほとんど５０
％の動物が、９ヶ月齢でＡβの沈積を未だ発生していなかった。後者は、我々の
コホートにおける個々のマウスの親世代が原因と考えられる。その理由は、研究
される全てのマウスはＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ＋／＋}であると確認されていても、高レ
ベルのＡβの沈積は４／８繁殖ペア由来のマウスにおいてのみ観察されるからで
ある。他の４つの繁殖ペア由来のマウスについても、Ａβの沈積は実質的になか
った（低症状の同腹仔）。共変動として親世代を用いた場合には、Ａβ沈積の減
少においてｍ２６６の強力で有意な効果が存在した（ｐ＝０．００８２、図３Ｂ
）。

【０１０５】実施例１０末梢注射したＭａｂ２６６は、ＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}Ｔｇマウスにおけるプラークとは結合しない５ヶ月間腹膜腔内注射したＭａｂ２６６が脳中でＡβと結合するかどうかを
測定するために、９齢のＡｐｐ^{Ｖ７１７Ｆ＋／＋}Ｔｇマウス由来の脳の切片（こ
のものは、Ａβ沈積物に含まれ、Ｍａｂ２６６、サリンまたはコントロールＩ
ｇＧのいずれかを用いて処理する）を使用した。組織の処理および免疫染色を上
記（Bales, K. R. らによるNature Genet. (1977) 17: 263-264）に記載の通り
行なった。全ての群の動物由来の組織を、フルオレセリンで標識化した抗−マウ
スＩｇＧ（ベクター製）と一緒にインキュベートし、次いで蛍光顕微鏡下で調べ
た。Ａβ沈積の特異的な染色は、いずれの群においても観察されなかった。それ
に対して、該切片を抗−マウスＩｇＧとインキュベートする前の切片に、Ｍａｂ２６６を適用した場合には、Ａβははっきりと検出された。

【０１０６】実施例１１２４月齢トランスジェニックヘミ接合体ＰＤＡＰＰマウスの認知に対する抗体２６６の投与効果ヘミ接合体トランスジェニックマウス（ＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}）を１６匹用いた。
実験の開始時、マウスはおよそ２４月齢であった。注射は全て腹膜内（ｉ．ｐ．
）であった。半分のマウスにはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、「コントロー
ル」）の注射を毎週投与し、他の半分にはＰＢＳに溶解したマウス抗体２６６（
５００μｇ）を投与した。７週間（４２日）の期間にわたって、合計６回の注射
を行った。最後の注射の３日後に、基本的にはＪ．−Ｃ．Ｄｏｄａｒｔら、Ｂｅ
ｈａｖｉｏｒａｌＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１１３（５）９８２−９９０（
１９９９）に記載されているように、対象物認知課題（object recognition tas
k）を用いて動物の挙動を評価した。認知指数（recognition index）（Ｔ_Ｂ×１
００）／（Ｔ_Ｂ−Ｔ_Ａ）を計算した。結果を以下の表１に示す。

【０１０７】表１．認知指数についての統計表

【表１】認識指数（分） ^＊＊ｐ＝０．００１０

【０１０８】２４月齢ヘミ接合体トランスジェニックマウスへの抗体２６６（５００μｇ）
の毎週の投与は、挙動における有意な変化と関連していた。抗体処置トランスジ
ェニックマウスは、野生型コントロール動物に類似する認知指数を有した［Ｊ．
−Ｃ．Ｄｏｄａｒｔら］。認知指数における差異は、０．００１の確率水準で統
計的に有意であった。認知指数の上昇は、アミノ酸１３〜２８の領域でβアミロ
イドペプチドに結合する抗体を用いる処置がアルツハイマー病のマウスモデルで
説明されている挙動欠陥を逆転させることを示す。それゆえ、アミノ酸１３〜２
８の領域においてβアミロイドペプチドに結合する抗体の投与はアルツハイマー
病およびダウン症候群のような疾患を処置し、概して疾患の進行と関連する認識
減退を停止する。

【０１０９】アミロイド負荷（堆積）（抗Ａβ抗体３Ｄ６または２１Ｆ１２を用いて染色し
た後に免疫反応性物質により覆われる領域の％）を、上記のように７週間の間、
マウス抗体２６６を用いて処置した２４月齢の動物の脳から、帯状回および頭頂
皮質の領域を含む海馬のすぐ下の皮質中で定量した。結果を以下の表に示す。処
置群間における差異は統計的に有意ではない。

【０１１０】表２．マウス２６６抗Ａβ抗体を用いて処置した後のＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ＋／−} マウスにおけるアミロイドプラーク負荷

【表２】プラーク負荷（％）

【０１１１】これらの非常に高齢の動物に関しては、マウス抗体２６６を用いての処置は、
３Ｄ６または２１Ｆ１２のいずれかを用いる測定で、ＰＢＳ処置群と比較して有
意に異なるアミロイド負荷は生じなかった。さらに、Ａβ負荷は、対象物認知課
題においてありふれたものから新規な対象物を区別することができない低年齢の
動物のアミロイド負荷と比較して実質的に高く、そして有意に上昇していた（以
下を参照のこと）。最も驚くべきことには、これらの結果は、抗Ａβ抗体はアミ
ロイド負荷自体の減少を必要とせずに認識欠損を逆転させることができることを
示している。

【０１１２】処置の７週間後、ｍ２６６処置群の認知指数は、２４月齢マウスの野生型コー
ホートに関して予想したものと有意な差異はなかった。このことは、これらのト
ランスジェニック動物における認識低下（減退）の完全な回復を示す。

【０１１３】実施例１２若齢トランスジェニックヘミ接合体ＰＤＡＰＰマウスにおける抗体２６６の投与の認識に対する効果５４匹のホモ接合体トランスジェニックマウス（ＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}）を用いた
。２３匹のマウスは、実験開始時にはおよそ２ヶ月齢であった。残りのマウスは
実験開始時にはおよそ４ヶ月齢であった。処置期間は５ヶ月であった。従って、
実験終了時にはマウスはおよそ７ヶ月齢であるか、またはおよそ９ヶ月齢である
かのいずれかであった。

【０１１４】注射は全て腹膜内（ｉ．ｐ．）であった。「ＰＢＳ」コントロール群の各マウ
スにはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、２００μＬ）の注射を毎週投与した。
「ＩｇＧ」コントロール群の各マウスにはＩｇＧ１κ１イソタイプコントロール
の注射を毎週投与した（１００μｇ／マウス／週）。「高用量」群の各マウスに
はＰＢＳに溶解した抗体２６６（５００μｇ）を毎週投与した（「ＨＤ」）。「
低用量」群の各マウスはＰＢＳに溶解したマウス抗体２６６（１００μｇ）を毎
週投与した（「ＬＤ」）。最後の注射の３日後に、上記の実施例１０に記載のよ
うに動物の挙動を対象物認知課題を用いて動物の挙動を評価し、そして識別指数
を新規な対象物に対して費やした時間と見慣れた対象物に対して費やした時間と
の差異として計算した。結果を以下の表３に示す。実験の終止時に、マウスの年
齢によりデータをグループ分けした。

【０１１５】表３．識別指標に関する統計表

【表３】識別指数（分） ^＊ｐ＜０．０５^＊＊＊ｐ＜０．０００１

【０１１６】これらのデータは総合的に、抗体２６６（Ａβの中心ドメインに対する抗体）
の投与が７〜９ヶ月齢ＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}トランスジェニックマウスのプラーク沈
着を減弱し、ならびに先に特徴を記載した挙動欠陥を逆転させるという結果を支
持する。患者をＡβペプチドの中心ドメインに対する抗体を用いて処置すること
により、代表的には疾患の進行と関連している認識減退を阻害または予防し、そ
してそれを逆転させる。

【０１１７】処置動物に関する識別指標は、同齢の野生型マウスに関して期待したほど有意
に異なっていなかった。それゆえ、ちょうどより老齢の動物におけるように（実
施例１１）、ｍ２６６での処置はこれらのより若年齢のトランスジェニック動物
における認知減退を完全に逆転させた。

【０１１８】実施例１３ヒト化抗体２６６の合成細胞および抗体マウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得
、そして３７℃ ＣＯ_２インキュベーター中で１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥ培
地（カタログ番号ＳＨ３２６６１．０３、ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）
中で維持した。マウス２６６ハイブリドーマ細胞を、まず、１０％ＦＢＳ（Ｈｙ
Ｃｌｏｎｅ）、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須ア
ミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有す
るＲＰＭＩ−１６４０培地中で生育させ、次いでローラー瓶中、２．５Ｌの体積
に、２％低ＩｇＦＢＳ（カタログ番号３０１５１．０３、ＨｙＣｌｏｎｅ）を含
有する無血清培地（ＨｙｂｒｉｄｏｍａＳＦＭ、カタログ番号１２０４５−０
７６、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｒｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中で
拡大した。マウスモノクローナル抗体２６６（Ｍｕ２６６）を、アフィニティー
クロマトグラフィーによりプロテインＧセファロースカラムを用いて培養上清か
ら精製した。ビオチン化Ｍｕ２６６をＥＺ−ＬｉｎｋＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｌ
Ｃ−ＬＣ−ビオチン（カタログ番号２１３３８ＺＺ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ，ＩＬ）を用いて製造した。

【０１１９】種々の領域のｃＤＮＡのクローニング製造業者のプロトコルに従って、およそ１０^７個のハイブリドーマ細胞からＴ
ＲＩｚｏｌ試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて全ＲＮＡを抽
出し、ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡをＰｏｌｙＡＴｒａｃｔｍＲＮＡ単離システム（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて単離した。製造業者のプロトコ
ルに従って、ＳＭＡＲＴ^ＴＭＲＡＣＥｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成した。軽鎖および
重鎖に対する種々の領域のｃＤＮＡを、それぞれ、マウスκおよびγ鎖定常域に
アニーリングする３’プライマー、およびＳＭＡＲＴ^ＴＭＲＡＣＥｃＤＮＡ増
幅キット中に提供される５’ユニバーサルプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＶＬＰＣＲに関しては、３’プライマーは、
マウスＣｋ領域にハイブリダイズする１７〜４６残基を有する以下の配列を有す
る：

【数２２】。ＶＨＰＣＲに関しては、３’プライマーは、マウスγ鎖ＣＨ１にハイブリダイ
ズする１７〜５０残基を有する以下の縮重配列を有する：

【数２３】。ＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを、配列決定のためにｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ
ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニン
グした。ＤＮＡ配列決定を、製造業者の指示に従って蛍光ダイデオキシ連鎖ター
ミネーター（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ
，ＣＡ）を用いてＰＣＲサイクル配列決定反応により行った。配列決定反応をＭ
ｏｄｅｌ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）で分析した。

【０１２０】ヒト化２６６（Ｈｕ２６６）可変領域の構築マウス抗体Ｖ領域のヒト化を、Ｑｕｅｅｎら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９−１００３３（１９８８）］に概説される
ように行った。Ｍｕ２６６ＣＤＲのアクセプターとして用いるヒトＶ領域フレー
ムワークを配列ホモロジーに基づいて選択した。コンピュータープログラムＡＢ
ＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ［Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８
：５９５−６２０（１９８３）］を用いて可変領域の分子モデルを構築した。Ｃ
ＤＲと接触すると推定されるヒト化Ｖ領域におけるアミノ酸を、Ｍｕ２６６の対
応する残基で置換した。これは、重鎖中の４６、４７、４９および９８残基で、
ならびに軽鎖中の５１残基で行った。同一のＶ領域サブグループにおいてまれで
あることが分かっているヒト化Ｖ領域のアミノ酸を、コンセンサスなアミノ酸に
変えて、潜在的な免疫原性を排除した。これは、軽鎖の４２および４４残基で行
った。

【０１２１】軽鎖および重鎖可変領域遺伝子を構築し、およそ６５〜８０塩基の長さにわた
る、８個の重複合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した［Ｈｅ，Ｘ．Ｙ．ら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：０２９−１０３５（１９９８）］。オリゴヌクレ
オチドを２つ１組にしてアニーリングさせ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏ
ｗフラグメントを用いて伸長し、２個のフラグメントを得た。これらのフラグメ
ントを変性させ、２つ１組でアニーリングさせ、再度伸長させ、全長遺伝子を得
た。得られた生成物を、ＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ（ＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，
Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅
したフラグメントをゲル精製し、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクロ
ーニングした。配列を確認した後、ＭＩｕＩおよびＸｂａＩを用いてＶＬおよび
ＶＨ遺伝子を消化し、ゲル精製し、それぞれ、軽鎖および重鎖の発現のためのベ
クターにサブクローニングしてｐＶｋ−Ｈｕ２６６およびｐＶｇｌ−Ｈｕ２６６
を作製した（それぞれ、本明細書中の図６および７を参照のこと）［Ｃｏ，Ｍ．
Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９−１１５４（１９９２）］。こ
れらのプラスミドから発現された成熟ヒト化２６６抗体は、配列番号１１の軽鎖
、および配列番号１２の重鎖を有する。

【０１２２】安定なトランスフェクションマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０への安定なトランスフェクションを、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いるエレク
トロポレーションにより、記載されるように３６０Ｖおよび２５μＦで達成した
（Ｃｏら、１９９２）。トランスフェクションの前に、ｐＶｋ−Ｈｕ２６６およ
びｐＶｇｌ−Ｈｕ２６６プラスミドＤＮＡを、ＦｓｐＩを用いて線状化した。お
よそ１０^７Ｓｐ２／０細胞を、ｐＶｋ−Ｈｕ２６６（２０μｇ）およびｐＶｇｌ
−Ｈｕ２６６（４０μｇ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトし
た細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥ培地中に懸濁し、数個の９６ウェルプ
レートにプレーティングした。４８時間後、選択培地（１０％ＦＢＳ、ＨＴ培地
補充物、０．３ｍｇ／ｍｌキサンチンおよび１μｇ／ｍｌミコフェノール酸を含
有するＤＭＥ培地）を添加した。選択開始約１０日後、培養上清を抗体産生につ
いてＥＬＩＳＡにより以下のようにアッセイした。高収率のクローンを、１０％
ＦＢＳを含有するＤＭＥ培地中で拡大し、抗体発現に関してさらに分析した。次
いで、選択したクローンを適合させてハイブリドーマＳＦＭを生育させた。

【０１２３】ＥＬＩＳＡによる抗体発現の測定９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏプレート、カタログ
番号４３９４５４、ＮａｌｇｅＮｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）のウェ
ルを、０．２Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）中の
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγフラグメント特異的なポリクローナル抗体）（カタロ
グ番号１０９−００５−０９８、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃ
ｈ、ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ、ＰＡ）１００μｌを用いて、一晩４℃でコーティン
グした。洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）を用いて洗浄
した後、ＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋＢｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液（カタログ番号；３７
５３５，Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて３０分間ウェルをブロックし、次いで洗浄緩衝
液を用いて洗浄した。Ｈｕ２６６を含有するサンプルを適当にＥＬＩＳＡ緩衝液
（１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で希釈し、ＥＬ
ＩＳＡプレート（１００μｌ／ウェル）に適用した。標準として、ヒト化抗−Ｃ
Ｄ３３ＩｇＧ１モノクローナル抗体ＨｕＭ１９５（Ｃｏら、１９９２、上記）
を用いた。ＥＬＩＳＡプレートを２時間室温でインキュベートし、ウェルを洗浄
緩衝液を用いて洗浄した。次いで、ＥＬＩＳＡ緩衝液中に１／１０００に希釈し
たＨＲＰ結合型ヤギ抗ヒトκポリクローナル抗体（カタログ番号１０５０−０５
、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａ
Ｌ）１００μｌを各ウェルに適用した。１時間室温でインキュベートし、そして
洗浄緩衝液を用いて洗浄した後、ＡＢＴＳ基質（カタログ番号５０７６０２およ
び５０６５０２、ＫｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を各ウェルに添加した。ウェル
毎に２％シュウ酸を１００μｌ添加することにより呈色を停止させた。ＯＰＴＩ
ｍａｘマイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅ
ｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ）を用いて４１５ｎｍで吸光度を読み取った。

【０１２４】Ｈｕ２６６の精製高Ｈｕ２６６−発現Ｓｐ２／０安定トランスフェクション体のうちの１つ（ク
ローン１Ｄ９）を採用してＨｙｂｒｉｄｏｍａＳＦＭ中で生育させ、ローター
ビン中２リットルまで拡大させた。細胞生存率が１０％以下に到達した時点で用
いた培養上清を回収し、プロテインＡセファロースカラムにロードした。ＰＢＳ
を用いてカラムを洗浄した後、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）、０．
１ＭＮａＣｌを用いて抗体を溶離した。溶離したタンパク質を２リットルのＰ
ＢＳで３回透析し、０．２μｌフィルターを用いてろ過した後に４℃で保存した
。２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより抗体濃度を測定した（１ｍｇ／ｍ
ｌ＝１．４Ａ_２８０）。標準的な手順に従って、４〜２０％グラジエントゲル（
カタログ番号ＥＣ６０２５、Ｎｏｖｅｘ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）でＴｒｉ
ｓ−グリシン緩衝液中でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。精製したヒト化２６６抗体
を還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。全抗体はおよそ分子量２５ｋＤａ
および５０ｋＤａの２本のバンドを示す。これらの結果は、アミノ酸組成から算
出した軽鎖および重鎖もしくは重鎖フラグメントの分子量と一致する。

【０１２５】実施例１４ヒト化２６６抗体のインビトロ結合特性上記のように合成し、精製したヒト化２６６抗体の結合効率を、ビオチン化マ
ウス２６６抗体を用いて比較ＥＬＩＳＡにおいてマウス２６６抗体と比較した。
９６−ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏプレート、カタログ
番号４３９４５４、ＮａｌｇｅＮｕｎｃ）のウェルを、０．２Ｍ炭酸ナトリウム
／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）中ＢＳＡ結合型β−アミロイドペプ
チド（１−４２）１００μｌ（１０μｇ／ｍＬ）を用いて一晩４℃でコーティン
グした。Ａβ_１−４２−ＢＳＡ結合体は、Ａβ_１−４２−Ｃｙｓ_４３（Ｃ−末端
システインＡβ_１−４２、ＡｎａＳｐｅｃ）をジメチルスルホキシド５００μＬ
中に溶解し、次いで直ぐに蒸留水１，５００μＬを添加することにより製造した
。マレイミド活性型ウシ血清アルブミン（Ｐｉｅｒｃｅ）２ｍｇを蒸留水２００
μＬに溶解した。２つの溶液を合わせ、徹底的に混合し、室温で２時間静置した
。ゲルクロマトグラフィーカラムを用いて未反応のペプチドをＡβ_１−４２−Ｃ
ｙｓ−ＢＳＡ結合体から分離した。

【０１２６】ＥＬＩＳＡプレート洗浄器を用いて０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸
緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（洗浄緩衝液）でウェルを洗浄した後、Ｓｕｐｅｒ
Ｂｌｏｃｋ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）をウェルあたり３００μＬ添加することにより
ウェルをブロックした。３０分ブロックした後、洗浄緩衝液を用いてウェルを洗
浄し、過剰な液体を取り除いた。

【０１２７】ＥＬＩＳＡ緩衝液中のビオチン化Ｍｕ２６６（０．３ｇ／ｍｌ最終濃度）およ
び競合抗体（Ｍｕ２６６またはＨｕ２６６；７５０μｇ／ｍｌ最終濃度で開始、
３倍系列希釈）の混合物を、１ウェルあたり最終体積１００μｌでトリプリケー
トで添加した。競合物なしのコントロールとして、０．３μｇ／ｍｌビオチン化
Ｍｕ２６６を１００μｌ添加した。バックグラウンドコントロールとして、ＥＬ
ＩＳＡ緩衝液１００μｌを添加した。ＥＬＩＳＡプレートを室温で９０分間イン
キュベートした。洗浄緩衝液を用いてウェルを洗浄した後、１μｇ／ｍｌＨＲＰ
結合型ストレプトアビジン（カタログ番号２１１２４、Ｐｉｅｒｃｅ）を１００
μｌ、各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間インキュベートし、洗浄
緩衝液で洗浄した。呈色のために、１００μｌ／ウェルＡＢＴＳペルオキシダー
ゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１
００μｌ／ウェルで添加した。２％シュウ酸を１００μｌ／ウェル添加すること
により呈色を停止した。４１５ｎｍで吸光度を読み取った。競合物濃度のｌｏｇ
に対して吸光度をプロットし、（Ｐｒｉｓｍを用いて）曲線をデータ点に適合さ
せ、当該分野において周知の方法を用いて各抗体についてのＩＣ５０を決定した
。

【０１２８】マウス２６６に関する平均ＩＣ５０は４．７μｇ／ｍＬであり（３回の別個の
実験、標準偏差＝１．３μｇ／ｍＬ）、ヒト化２６６に関しては７．５μｇ／ｍ
Ｌであった（３回の別個の実験、標準偏差＝１．１μｇ／ｍＬ）。第２のセット
の３回の実験を基本的には上記の通りに行い、マウス２６６に関する平均ＩＣ５
０が３．８７μｇ／ｍｌであること（ＳＤ＝０．１２μｇ／ｍＬ）を決定し、ヒ
ト２６６に関してはＩＣ５０は４．０μｇ／ｍＬであること（ＳＤ＝０．５μｇ
／ｍＬ）を決定した。これらの結果に基づき、本発明者らはヒト化２６６はマウ
ス抗体２６６と非常に類似する結合特性を有すると結論した。それゆえ、本発明
者らはヒト化２６６は、マウス２６６と比較して非常に類似したインビトロおよ
びインビボ活性を有し、マウス２６６を用いてマウス中で実証されたと同様の効
果をヒトにおいても示すと予想する。

【０１２９】実施例１５マウス抗体２６６および４Ｇ８のインビトロ結合特性ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー２０００を用いて抗体親和性（ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋ
ａ）を測定し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ｖ．３．１）ソフトウェアを用い
てデータを分析した。捕捉抗体（ウサギ抗マウス）を遊離アミン基を介して、Ｎ
−エチル−Ｎ−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシス
クシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）を用いてバイオセンサーチップ（ＣＭ５）のフ
ローセル２上のカルボキシル基に連結させた。非特異的ウサギＩｇＧをフローセ
ル１にバックグラウンドコントロールとして結合させた。モノクローナル抗体を
捕捉して３００共鳴単位（ｒｅｓｏｎａｎｃｅｕｎｉｔ）（ＲＵ）を得た。次
いで、アミロイドβ１−４０または１−４２（ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を減少濃度（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇｃｏｎｃｅ
ｎｔｒａｔｉｏｎ）（１０００〜０．１倍ＫＤ）でチップに流した。チップを再
生するために、グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２）での洗浄により結合型抗Ａβ抗体を
チップから溶離した。アミロイドβ非含有コントロール注射はベースライン減法
に対するコントロールとして機能した。相の会合および解離を示す感知図を分析
してＫｄおよびＫａを決定した。この方法を用いて、マウス抗体２６６のＡβ_１ _−４０およびＡβ_１−４２両方に対する親和性は４ｐＭであることを見出した。
４Ｇ８のＡβ_１−４０に対する親和性は２３ｎＭであり、Ａβ_１−４２に対して
は２４ｎＭであった。２６６および４Ｇ８の両方のＡβに対する親和性に６００
０倍の差があるにもかかわらず、これらはＡβの１３〜２８アミノ酸の間のエピ
トープに結合し、Ａβを効率的にヒトＣＳＦから隔離する。それゆえ、抗体がＡ
βを隔離し、本発明の有益かつ驚くべき利点を提供する能力を決定する際には、
エピトープの位置が結合親和性よりも重要である。

【０１３０】実施例１６ＢＩＡｃｏｒｅ方法および可溶性ペプチドを用いるマウス抗体２６６のエピトープマッピングＢＩＡｃｏｒｅは、分子相互作用を測定するための自動バイオセンサーシステ
ムである［ＫａｒｌｓｓｏｎＲ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
１４５：２２９−２４０（１９９１）］。ＢＩＡｃｏｒｅの、他の結合アッセイ
を超える利点は、抗原の結合を、抗原を標識または固定化する必要なく測定する
ことができるということである（すなわち、抗原がよりネイティブな立体配座を
維持している）。全ての希釈物をＴｗｅｅｎ２０を含むＨＥＰＥＳ緩衝化生理食
塩水を用いて作製したこと、種々のＡβのフラグメント（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を注入したこと、各フラグメントを１つの濃度で
注入した（４４０ｎＭ）ことを除いて基本的には実施例１２に記載のように、Ｂ
ＩＡｃｏｒｅ方法を使用して種々のアミロイドβペプチドフラグメントのマウス
抗体２６６への結合を評価した。

【０１３１】アミロイドβフラグメント１〜２８、１２〜２８、１７〜２８および１６〜２
５はマウス抗体２６６に結合したが、Ａβフラグメント１〜２０、１０〜２０お
よび２２〜３５は結合しなかった。フラグメント１〜２０、１０〜２０および２
２〜３５は他のＭＡｂ群と、Ａβのそれら領域に関して公知のエピトープ特異性
で結合した。この方法を用いると、マウス抗体２６６に対する結合エピトープは
Ａβのアミノ酸１７および２５の間に存在するようである。通常、結合は少なく
とも３残基のエピトープが存在すると生じるので、さらに、エピトープは残基１
９〜２３の中に含まれていると推測することができる。

【０１３２】実施例１７ヒト化抗体２６６のインビトロ結合特性上記のように合成し、精製したヒト化２６６抗体の親和性（ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ
）は、基本的に実施例１５に上記のように測定した。この方法を用いると、ヒト
化２６６のＡβ_１−４２に対する親和性は４ｐＭであることが見出された。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｍａｂ２６６により透析膜を通してヒト脳脊髄液から回
収したＡβペプチドの割合を、透析膜の分子量カットオフの関数として示す。

【図２】図２は、Ｍａｂ２６６を２００μｇまたは６００μｇのいずれか
で注射した後のＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}トランスジェニックマウスの血漿中に見出され
るＡβ_合計の濃度を時間の関数として示す。

【図３】図３Ａは、生理食塩水、マウスＩｇＧまたはＭａｂ２６６で処置
したＡＰＰ^{Ｖ７１７Ｆ}トランスジェニックマウスの皮質におけるＡβペプチド沈
着量を示す。図３Ｂはこれらの結果と親起源との相間関係を示す。

【図４】プラスミドｐＶｋ−Ｈｕ２６６由来のヒト化２６６軽鎖を発現す
るためのポリヌクレオチド配列、および発現されるヒト化２６６軽鎖をコードす
る単鎖アミノ酸（成熟すると配列番号１１に対応する）を示す。

【図５】プラスミドｐＶｇ１−Ｈｕ２６６由来のヒト化２６６重鎖を発現
するためのポリヌクレオチド配列、および発現されるヒト化２６６重鎖をコード
する単鎖アミノ酸（成熟すると配列番号１２に対応する）を示す。

【図６】図６はｐＶｋ−Ｈｕ２６６のプラスミドマップである。

【図７】図７はｐＶｇ１−Ｈｕ２６６のプラスミドマップである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号６０／２５４，４９８ (32)優先日平成12年12月８日(2000．12．8) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者デイビッド・エム・ホルツマンアメリカ合衆国63141ミズーリ州セント・ルイス、サンウェイ368番 (72)発明者ロナルド・デマットスアメリカ合衆国63110ミズーリ州セント・ルイス、ウエスト・パイン・ブールバード 4949番、アパートメント・ナンバー12エス (72)発明者ケリー・アール・ベイルズアメリカ合衆国46120インディアナ州クローバーデイル、サウス・1000・イースト 6376番 (72)発明者スティーブン・エム・ポールアメリカ合衆国46032インディアナ州カーメル、ローレルウッド1145番 (72)発明者鶴下直也アメリカ合衆国94306カリフォルニア州パロ・アルト、レッドウッド・サークル3719 番 (72)発明者マキシミリアノ・バスケスアメリカ合衆国94303カリフォルニア州パロ・アルト、ルイス・ロード3813番Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA61 CA02 DA02 4B065 AA90 AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C085 AA14 CC23 GG02 GG03 GG04 GG06 4H045 AA11 AA30 BA12 BA13 BA14 BA15 BA17 CA40 DA75 EA21 EA50

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ａβの第１３位−第２８位内に含有されるエピトープと特異
的に結合するヒト化抗体。
【請求項２】Ａβペプチドを血液中のその結合、循環型から隔離し、中枢
神経系および血漿中の可溶性および結合型Ａβのクリアランスを変更するヒト化
抗体。
【請求項３】ヒト化抗体本体である、請求項１または２に記載のヒト化抗
体。
【請求項４】断片である、請求項１または２に記載のヒト化抗体。
【請求項５】Ａβの第１７位−第２５位の間（エピトープ位置はＢＩＡｃ
ｏｒｅ法を用いて決定される）のアミノ酸を有するエピトープと特異的に結合す
る、請求項１または２に記載のヒト化抗体。
【請求項６】Ａβの第１９位−第２３位の間（エピトープ位置はＢＩＡｃ
ｏｒｅ法を用いて決定される）のアミノ酸を有するエピトープと特異的に結合す
る、請求項１または２に記載のヒト化抗体。
【請求項７】抗体２６６が特異的に結合するＡβのエピトープと特異的に
結合する、請求項１または２に記載のヒト化抗体。
【請求項８】該Ａβペプチドの第１３位−第２０位に含有されるエピトー
プと特異的に結合する、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項９】該Ａβペプチドの第１６位、第１７位、または第１８位を含
むエピトープと特異的に結合する、請求項８に記載のヒト化抗体。
【請求項１０】単一鎖抗体である、請求項１または２に記載のヒト化抗体
。
【請求項１１】ヒトフレームワーク領域を含む、請求項１または２に記載
のヒト化抗体。
【請求項１２】ヒト化ＣＤＲを含む、請求項１または２に記載のヒト化抗
体。
【請求項１３】ヒト化Ｍａｂ２６６である、請求項１または２に記載のヒ
ト化抗体。
【請求項１４】マウスモノクローナル抗体２６６由来の３つの軽鎖相補性
決定領域（ＣＤＲｓ）および、ヒト免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖可変領域フレ
ームワーク配列を含むヒト化軽鎖；および、マウスモノクローナル抗体２６６由
来の３つの重鎖ＣＤＲｓおよび、ヒト免疫グロブリン重鎖由来の重鎖可変領域フ
レームワーク配列を含むヒト化重鎖を含み、ここに軽鎖ＣＤＲｓが以下のアミノ
酸配列を有し：軽鎖ＣＤＲ１：【数１】軽鎖ＣＤＲ２：【数２】および、軽鎖ＣＤＲ３：【数３】ならびに重鎖ＣＤＲｓが以下のアミノ酸配列を有する：重鎖ＣＤＲ１：【数４】重鎖ＣＤＲ２：【数５】および、重鎖ＣＤＲ３：【数６】請求項１３に記載のヒト化抗体またはその断片。
【請求項１５】以下の配列を含むヒト化軽鎖可変領域：【数７】［式中：第２位のＸａａはＶａｌまたはＩｌｅであり；第７位のＸａａはＳｅｒまたはＴｈｒであり；第１４位のＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒであり；第１５位のＸａａはＬｅｕまたはＰｒｏであり；第３０位のＸａａはＩｌｅまたはＶａｌであり；第５０位のＸａａはＡｒｇ、Ｇｌｎ、またはＬｙｓであり；第８８位のＸａａはＶａｌまたはＬｅｕであり；第１０５位のＸａａはＧｌｎまたはＧｌｙであり；第１０８位のＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇであり；ならびに、第１０９位のＸａａはＶａｌまたはＬｅｕである］および以下の配列を含む重鎖可変領域：【数８】［式中：第１位のＸａａはＧｌｕまたはＧｌｎであり；第７位のＸａａはＳｅｒまたはＬｅｕであり；第４６位のＸａａはＧｌｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり；第６３位のＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒであり；第７５位のＸａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＴｈｒであり；第７６位のＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇであり；第８９位のＸａａはＧｌｕまたはＡｓｐであり；ならびに、第１０７位のＸａａはＬｅｕまたはＴｈｒである］を含む、請求項１３に記載のヒト化抗体またはその断片。
【請求項１６】配列番号９に記載の配列の軽鎖可変領域および配列番号１
０に記載の重鎖可変領域を有する、請求項１５に記載のヒト化抗体またはその断
片。
【請求項１７】配列番号１１に記載の配列の軽鎖および配列番号１２に記
載の配列の重鎖を有する、請求項１６に記載のヒト化抗体またはその断片。
【請求項１８】請求項１〜１７のいずれかに記載のヒト化抗体の酵素分解
によって得られる抗体断片。
【請求項１９】ＦａｂまたはＦ(ａｂ')_２断片である、請求項１８に記載
の断片。
【請求項２０】Ｆ(ａｂ')_２断片である、請求項１９に記載の断片。
【請求項２１】Ｆａｂ断片である、請求項１９に記載の断片。
【請求項２２】ＩｇＧ_１免疫グロブリンイソ型である、請求項１〜２１の
いずれかに記載のヒト化抗体または断片。
【請求項２３】抗体またはその断片が、骨髄腫細胞、チャイニーズハムス
ター卵巣細胞、シリアンハムスター卵巣細胞、およびヒト胎児腎臓細胞からなる
群から選択される宿主細胞内で生産される、請求項１〜１８のいずれかに記載の
ヒト化抗体または断片。
【請求項２４】ヒト被検体に末梢的に投与される場合に、その有益な作用
を発揮するために被検体の血液−脳関門を横切る必要がない、請求項１〜２３の
いずれかに記載のヒト化抗体または断片。
【請求項２５】ヒト被検体に末梢的に投与される場合に、その有益な作用
を発揮するために被検体の脳における細胞性応答を必要としない、請求項１〜２
３のいずれかに記載のヒト化抗体または断片。
【請求項２６】ヒト被検体に末梢的に投与される場合に、被検体の脳内の
凝集Ａβと実質的に結合しない、請求項１〜２３のいずれかに記載のヒト化抗体
または断片。
【請求項２７】ヒト被検体に末梢的に投与される場合に、その有益な作用
のすべてを発揮するために被検体の脳内のＡβプラーク堆積を有意に減少させる
必要がない、請求項１〜２３のいずれかに記載のヒト化抗体または断片。
【請求項２８】請求項１〜２７のいずれかに記載のヒト化抗体の軽鎖また
は重鎖をコードする配列またはその断片を含む核酸。
【請求項２９】適当な宿主細胞内で発現された場合に、請求項１〜２７の
いずれかに記載の抗体を産生する、１またはそれ以上の核酸。
【請求項３０】配列番号７または配列番号９に記載の軽鎖可変領域をコー
ドする配列を含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３１】配列番号８または配列番号１０に記載の重鎖可変領域をコ
ードする配列を含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３２】配列番号１１に記載の軽鎖をコードする配列を含む、請求
項２８に記載の核酸。
【請求項３３】配列番号１２に記載の重鎖をコードする配列を含む、請求
項２８に記載の核酸。
【請求項３４】請求項１〜２７のいずれかに記載の抗体または断片を発現
するための発現ベクターであって、該抗体または断片をコードするヌクレオチド
配列を含むベクター。
【請求項３５】請求項３４に記載の発現ベクターでトランスフェクトされ
た細胞。
【請求項３６】第一のベクターが軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含
み、第二のベクターが重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３４に
記載の２個の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞。
【請求項３７】請求項１３〜１７のいずれかに記載のヒト化抗体または断
片を生産する組換え細胞。
【請求項３８】骨髄腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、シリアン
ハムスター卵巣細胞、およびヒト胎児腎臓細胞からなる群から選択される、請求
項３５〜３７のいずれかに記載の細胞。
【請求項３９】請求項１〜２７のいずれかに記載のヒト化抗体または断片
および製薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４０】ヒトにおけるアミロイドプラークの形成または毒性の可溶
性Ａβ種の作用を阻害する方法であって、その阻害を必要としているヒト被検体
に、Ａβの第１３位−第２８位に含有されるエピトープと特異的に免疫反応する
ヒト化抗体またはその断片の有効量を投与することを含む方法。
【請求項４１】ヒトにおけるアミロイドプラークまたは毒性の可溶性Ａβ
種の作用を減少させる方法であって、その減少を必要としているヒト被検体に、
Ａβの第１３位−第２８位に含有されるエピトープと特異的に免疫反応するヒト
化抗体またはその断片の有効量を投与することを含む方法。
【請求項４２】ヒトにおけるアミロイドプラークの形成または毒性の可溶
性Ａβ種の作用を阻害する方法であって、その阻害を必要としているヒト被検体
に、Ａβペプチドを血液中のその結合、循環型から隔離するヒト化抗体またはそ
の断片の有効量を投与することを含む方法。
【請求項４３】ヒトにおけるアミロイドプラークまたは毒性の可溶性Ａβ
種の作用を減少させる方法であって、その減少を必要としているヒト被検体に、
Ａβペプチドを血液中のその結合、循環型から隔離するヒト化抗体またはその断
片の有効量を投与することを含む方法。
【請求項４４】抗体または断片が、ヒトに対して末梢的に投与される場合
に、アミロイドプラークの形成または毒性の可溶性Ａβ種の作用を阻害するため
に血液−脳関門を横切る必要がない、請求項４０〜４３のいずれかに記載の方法
。
【請求項４５】抗体または断片が、ヒトに対して末梢的に投与される場合
に、アミロイドプラークの形成または毒性の可溶性Ａβ種の作用を阻害するため
に細胞性応答を必要としない、請求項４０〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】抗体または断片が、ヒトに対して末梢的に投与される場合
に、脳内の凝集Ａβと実質的に結合しない、請求項４０〜４３のいずれかに記載
の方法。
【請求項４７】被検体が臨床的または前臨床的なアルツハイマー疾患、ダ
ウン症候群、または臨床的または前臨床的な脳性アミロイド血管障害と診断され
る、請求項４０〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】被検体が臨床的または前臨床的なアルツハイマー疾患、ダ
ウン症候群、または臨床的または前臨床的な脳性アミロイド血管障害と診断され
ない、請求項４０〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】抗体が末梢経路により投与される、請求項４０〜４８のい
ずれかに記載の方法。
【請求項５０】抗体が経口、腹腔内、皮下、筋肉内、または静脈内経路に
より投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】臨床的または前臨床的なアルツハイマー疾患、ダウン症候
群、または臨床的または前臨床的な脳性アミロイド血管障害を処置するための、
ヒト組織における抗体または抗体断片の組換え配列の延長された発現を含む、薬
物を製造するための、請求項１〜２７のいずれかに記載のヒト化抗体またはその
断片の使用。
【請求項５２】被検体における認識減退を逆転させる方法であって、この
被検体に請求項１〜２７のいずれかに記載のヒト化抗体または断片の有効量を投
与することを含む方法。
【請求項５３】被検体における認識を改善させる方法であって、この被検
体に請求項１〜２７のいずれかに記載のヒト化抗体または断片の有効量を投与す
ることを含む方法。
【請求項５４】被検体における認識減退を処置する方法であって、この被
検体に請求項１〜２７のいずれかに記載のヒト化抗体または断片の有効量を投与
することを含む方法。
【請求項５５】被検体における認識減退を予防する方法であって、この被
検体に請求項１〜２７のいずれかに記載のヒト化抗体または断片の有効量を投与
することを含む方法。
【請求項５６】抗体または断片が、ヒトに対して末梢的に投与される場合
に、認識に影響するために血液−脳関門を横切る必要がない、請求項５２〜５５
のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】抗体または断片が、ヒトに対して末梢的に投与される場合
に、認識に影響するために細胞性応答を必要としない、請求項５２〜５５のいず
れかに記載の方法。
【請求項５８】抗体または断片が、ヒトに対して末梢的に投与される場合
に、脳内の凝集Ａβと実質的に結合しない、請求項５２〜５５のいずれかに記載
の方法。
【請求項５９】被検体が臨床的または前臨床的なアルツハイマー疾患、ダ
ウン症候群、または臨床的または前臨床的な脳性アミロイド血管障害と診断され
る、請求項５２〜５７のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】被検体が臨床的または前臨床的なアルツハイマー疾患、ダ
ウン症候群、または臨床的または前臨床的な脳性アミロイド血管障害と診断され
ない、請求項５２〜５７のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】抗体が末梢経路によって投与される、請求項５２〜６０の
いずれかに記載の方法。
【請求項６２】抗体が経口、腹腔内、皮下、筋肉内、または静脈内経路に
よって投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】臨床的または前臨床的なアルツハイマー疾患、ダウン症候
群、または臨床的または前臨床的な脳性アミロイド血管障害における認識減退を
処置し、予防し、あるいは逆転させるための、ヒト組織における該抗体または抗
体断片の組換え配列の延長された発現を含む、薬物を製造するための、請求項１
〜２７のいずれかに記載のヒト化抗体または断片の使用。
【請求項６４】アルツハイマー疾患を処置する方法であって、それを必要
としている患者に請求項１〜２７のいずれかに記載の抗体または断片の有効量を
投与することを含む方法。
【請求項６５】アルツハイマー疾患処置用の薬物を製造するための、請求
項１〜２７のいずれかに記載のヒト化抗体または断片の使用。
【請求項６６】Ａβまたはその断片と結合する抗体を用いる処置に対する
ヒト被検体の応答を評価する方法であって：ａ）抗体またはその断片を被検体に投与し；ならびに、ｂ）被検体血液中のＡβ濃度を測定することを含む方法。
【請求項６７】Ａβまたはその断片と結合する抗体を用いてヒト被検体を
処置する方法であって：第一の量の抗体またはその断片を被検体に投与し；第一用量の投与後３時間〜２週間のうちに被検体血液中のＡβ濃度を測定し；ｃ）必要であれば、工程ｂ）の結果に基づいて抗体またはその断片の第二の量
を計算し、ここに第二の量は第一の量と同じであるか、あるいは異なっており；
ならびに、ｄ）第二の量の抗体または断片を投与することを含む方法。
【請求項６８】ヒト被検体において、Ａβアミロイドプラーク形成を阻害
または予防するための、Ａβアミロイドプラークを減少させるための、毒性の可
溶性Ａβ種の作用を減少させるための、またはＡβプラークと関連する症状また
は疾患を処置するための、Ａβに結合する抗体またはその断片の効力を評価する
方法であって、ａ）被検体血漿またはＣＳＦの第一のサンプルを得；ｂ）第一サンプル中のＡβのベースライン濃度を測定し；ｃ）抗体またはその断片を被検体に投与し；ｄ）抗体またはその断片の投与後３時間〜２週間のうちに、被検体血漿または
ＣＳＦの第二のサンプルを得；ならびに、ｅ）第二のサンプル中のＡβの濃度を測定する（ここに効力は血液中で抗体に結合したＡβ量およびＣＳＦ中のＡβ濃度と関連
する）ことを含む方法。