CN102713633B

CN102713633B - 用于β-淀粉样肽的改进检测的方法和试剂

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Publication number: CN102713633B
Application number: CN201080062241.9A
Authority: CN
Inventors: J·曼纽尔·萨拉萨巴里欧
Original assignee: Araclon Biotech SL
Current assignee: Araclon Biotech SL
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2010-12-13
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2030-12-13
Also published as: JP2013513791A; BR112012014060B8; TW201131167A; IL220276A; AU2010329844B2; CA2782250A1; CN102713633A; PT2510359E; CA2782250C; DK2510359T3; KR20120115306A; JP5745531B2; RU2012129184A; IN2012DN05056A; HUE028105T2; EP2510359B1; HK1175242A1; RU2554774C2; MX2012006512A; US20210011032A1

Abstract

本发明涉及诊断神经退行性疾病，检测神经退行性疾病之前的阶段或基于β-淀粉样肽的特定池的水平以及特定的计算参数区分神经退行性疾病与神经退行性疾病之前的阶段的方法，所述β-淀粉样肽的特定池与血浆成分结合或与血细胞结合，所述特定的计算参数通过一个或多个的淀粉样肽水平的算术组合获得。本发明还涉及用于实施上述方法的试剂盒。

Description

用于β-淀粉样肽的改进检测的方法和试剂

技术领域

本发明涉及免疫测定领域，并且更具体地，涉及用于增加测定生物流体中的β-淀粉样肽的免疫测定的灵敏度的方法。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是一种中枢神经系统的进行性退行性疾病，其特征是进行性的和不断增加的记忆丧失，紧接着是丧失对肢体和身体功能的控制并最终死亡。其是痴呆症最常见的病因，影响1-6％的65岁以上人群和10-20％的80岁以上人群。

AD与其他类型痴呆症的区别在于几个病理学特征，包括患者大脑中在神经元之间的细胞外隙中进行性地出现老年斑。该斑块具有淀粉样蛋白沉积物的中心核，其主要由被变性神经炎和胶质细胞包绕的称为淀粉样β肽(Aβ)的40-42个氨基酸肽的原纤维形成。此肽由称为β淀粉样蛋白前体蛋白(βAPP)的前体蛋白的蛋白水解而成。

AD可以根据出现的年龄分为早发型(60岁以下的年龄)和迟发型(60岁以上的年龄)，根据常染色体显性遗传的存在分为家族性AD或散发性AD。AD的早发家族形式可能与βAPP编码基因早老素1和早老素2(分别位于染色体21、14和1上)的已知突变有关。这些分类不相互排斥。最常见的形式是散发性迟发形式。

在临床惯例中，使用基于典型临床标志的存在的临床标准并使用神经影像技术和血液分析排除其他类型痴呆症进行AD的诊断。使用这些标准，诊断的可靠性是可接受的，但是根据使用脑组织活检完成的研究，10-20％的被诊断有AD的患者患有不同的疾病。而且，目前的诊断方法仅可以在神经变性过程进展到患者患有严重的痴呆症并且大脑损害广泛到治疗措施数目有限的地步时才可进行。明确诊断需要尸检脑组织的病理学检查。

鉴于Aβ在AD患者的大脑中积累并且是AD发病机制的中心要素的事实，此蛋白已经被认为是作为AD生物标志物的最合适候选物。然而，Aβ作为AD的血浆生物标志物的使用面临着这样的问题，即Aβ肽(Aβ(1-40)和Aβ(1-42))在血清中的浓度极低，使得没有足够灵敏以便允许可靠检测所述肽物种的测定方法。

已经使用不同的测量来测定生物样品中的β-淀粉样肽水平(参见，例如，由Scheuner等(Nature Med.，1996，2：864-870)；Tamaoka A等(J Neurol Sci.，1996，141，65-68)；Suzuki，N.等(Science，1994，264：1336-1340)；WO200722015，Vanderstichele H等(Amyloid，2000，7，245-258)；Fukomoto y col.(Arch.Neurol.2003，60，958-964)；Mehta et al.(Arch.Neurol.57，2000，100-105)；Mayeux，R.等(Ann Neuro1.1999，46，412-416)；Lanz，T.A和Schacthter，J.B.(J.NeuroscienceMethods，2006，157：71-81)，WO200750359，WO0162801，WO0315617，WO0246237，WO0413172所述的方法。然而，目前已知的所有基于ELISA的测定具有较小的检测限，其最大也达不到单位数的pg/mL的范围，其适于检测CSF中的Aβ40和Aβ42以及检测患有家族性AD的患者血浆中的所述物种，但不适合于检测患有散发性AD的患者血浆中的Aβ42，在散发性AD中Aβ42血浆浓度低得多。

至今，显示检测限低于单位数pg/mL的唯一的Aβ肽测定对应于WO200646644中和WO2009015696中所述的测定。

WO200646644描述了一种电致化学发光(ECL)夹心测定，其中mAb 21F12(识别Aβ42的氨基酸33-42)与磁珠偶联，然后磁珠用来捕获含有Aβ42的样品中的Aβ42肽并进一步和与钌复合物偶联的3D6mAb接触。然后当施加电能时通过由钌复合物发射的光检测结合的3D6抗体的量。使用此测定，该发明人能够检测低至0.5pg/mL的Aβ42标准品。然而，当使用同一测定来比较来自AD患者和健康对照的血浆样品中的Aβ42时，在两组患者之间没有观察到显著的差异，这使得该发明人得出结论血清中完整Aβ42的量由于降解而非常低，并且转为使用21F12mAb的竞争性ELISA测定，该测定提供ng/mL范围内的较低灵敏度水平。

WO2009015696描述了一种高灵敏度ELISA夹心测定，其中检测抗体与生物素标记的显示对所述抗体有特异性的试剂接触。该试剂和与过氧化物酶偶联的链霉亲和素接触。然后通过使用TMB的比色法检测或使用QuantaBlue荧光检测过氧化物酶活性。

WO2006053251描述了一种测定样品中的β-淀粉样肽物种的方法，该方法包括使样品与变性剂接触，从样品-变性剂混合物中提取肽混合物，将β-淀粉样肽从该混合物中分离，并测定β-淀粉样肽物种的量。该方法在测定前需要分离肽的步骤，这导致增加的处理时间和增加的成本。

因此，在本领域中存在着对用于检测Aβ-衍生肽的改进的免疫学测定和试剂盒的需求，所述免疫学测定和试剂盒克服本领域中已知的方法和试剂盒的问题，具体地，它们足够灵敏从而以可靠的方式检测患有散发性AD的患者的血浆中的Aβ肽。

发明内容

在第一个方面，本发明涉及一种诊断受试者中的神经退行性疾病、检测神经退行性疾病之前的阶段或区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)确定选自由下列各项组成的组的一种或多种参数：

(a)所述受试者的生物样品中一种或多种游离的β-淀粉样肽的水平，

(b)所述受试者的生物样品中一种或多种游离淀粉样肽和与所述生物样品中存在的大分子成分缔合的所述一种或多种β-淀粉样肽的合计水平，其中所述合计水平通过在将所述样品与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述β-淀粉样肽与所述生物样品中存在的所述成分解离的条件下接触后定量所述样品的无细胞级分中所述一种或多种β-淀粉样肽的量来确定，

(c)与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的一种或多种β-淀粉样肽的水平，其中所述水平通过分离所述生物样品的细胞级分，将所述样品的所述细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述β-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触来确定；

(ii)将参数(b)或(c)中的至少一个的值或由参数(a)至(c)中的至少两个算术组合产生的计算参数的值与参比样品中对应于所述参数(b)或(c)或所述计算参数的值的参比值进行比较；以及

(iii)当相对于所述参比值所述参数的值或所述计算参数的值存在改变时，诊断所述神经退行性疾病、检测神经退行性疾病之前的阶段或区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段。

在第二个方面，本发明涉及一种用于测定生物样品中的β-淀粉样肽的试剂盒，其包含

(i)蛋白增溶剂，和

(ii)至少一种针对β-淀粉样肽的抗体。

附图说明

图1：A-F.对在两个外部实验室(Lab1和Lab2)获得的(A)UP Aβ1-40，(B)DPAβ1-40，(C)CBAβ1-40，(D)UP Aβ1-42，(E)DP Aβ1-42和(F)CB Aβ1-42的测量值的点阵图。大多数点靠近索引线(concordance line)，表明了测量值极大程度至几乎完全程度的一致性。在每个图表中的右下部插入指明了一致性相关系数(CCC)和95％置信区间。

图2：Aβ1-40(A)，Aβ1-42(B)的直接标志物以及Aβ1-40和Aβ1-42(C)的计算标志物。A.在健康对照(HC)，患有轻度认知损害(MCI)的患者和患有阿尔茨海默病(AD)的患者中以pg/ml计的血清中游离的Aβ1-40(FP)，血浆中的总Aβ1-40水平(包括游离的Aβ1-40和与血浆成分结合的Aβ1-40)(TP)以及与细胞结合的Aβ1-40(CB)的浓度。B.在健康对照(HC)，患有轻度认知损害(MCI)的患者和患有阿尔茨海默病(AD)的患者中以pg/ml计的血清中游离的Aβ1-42(FP)，血浆中的总Aβ1-42水平(包括游离的Aβ1-42和与血浆成分结合的Aβ1-42)(TP)以及与细胞结合的Aβ1-42(CB)的浓度。C.以pg/ml计的总血浆Aβ1-40(通过将血浆样品与蛋白增溶剂接触获得)加上与细胞结合的Aβ1-40(TP+CB Aβ1-40)的合计值，总血浆Aβ1-42(通过将血浆样品与蛋白增溶剂接触获得)加上与细胞结合的Aβ1-42(TP+CB Aβ1-42)的合计值，或TP+CB Aβ1-40和Aβ1-42(TP+CB Aβ1-42)的合计值。H、M和A分别表示与HC、MCI和AD相比显著(p＜0.05)。*表示p＜0.01。

图3：A-F.HC、MCI和AD受试者中的(A)DPAβ1-40，(B)CB Aβ1-40，(C)UPAβ1-42，(D)DP Aβ1-42，(E)T40和(F)T-βAPB值的点阵图。*旁边的数值指示MCI和AD组中的异常值，为了清楚地表示，其以与纵轴不同的刻度表示。水平线表示MCI和HC之间的截止值。

图4：患有MCI/HC的患者中1ab40标志物的ROC曲线。ROC曲线下面积＝0.510。

图5：患有MCI/HC的患者中2ab40标志物的ROC曲线。ROC曲线下面积＝0.778。

图6：患有MCI/HC的患者中3ab40标志物的ROC曲线。ROC曲线下面积＝0.458。

图7：患有MCI/HC的患者中1ab42标志物的ROC曲线。ROC曲线下面积＝0.576。

图8：患有MCI/HC的患者中2ab42标志物的ROC曲线。ROC曲线下面积＝0.667。

图9：患有AD/HC的患者中3ab42标志物的ROC曲线。ROC曲线下面积＝0.744。

图10：患有MCI/HC的患者中3ab42标志物的ROC曲线。ROC曲线下面积＝0.508。

图11：患有MCI/HC的患者中2ab40+3ab40标志物的ROC曲线。曲线下面积为0.830。

图12：患有AD/HC的患者中2ab42+3ab42标志物的ROC曲线。曲线下面积为0.713。

图13：患有MCI/HC的患者中2ab42+3ab42标志物的ROC曲线。曲线下面积为ROC 0.777。

图14：MCI/HC的2ab40+3ab40+2ab42+3ab42标志物的ROC曲线。曲线下面积为0.848。

具体实施方式

本发明的作者已经惊奇地发现用样品缓冲液稀释血浆导致Aβ1-40和Aβ1-42的可检测水平升高。不希望受任何理论约束，相信血浆的稀释导致样品内的离子强度和分子相互作用的改变，引起与血浆蛋白和其他成分结合的Aβ1-40和Aβ1-42的释放。

因此，在血浆稀释后测量值的增加可能是由于检测到从蛋白和其他血浆成分释放的Aβ肽所引起的，并且可能被解读为血浆中Aβ总水平的估计值。

无论如何，这些结果显示血液中的Aβ肽水平比由简单地测定其在未稀释血浆中的水平所估计的值高得多。总βAPB血液水平的完整测定应当包括定量血浆中游离的肽，与血浆蛋白结合的肽和与血细胞结合的肽。这种对βAPB的不同成分的综合定量将得到Aβ血液水平的更精确量度并且可能有助于明确健康和疾病中Aβ肽的复杂调节作用。此外，所述β-淀粉样肽池的水平以及通过将不同池的浓度与游离β-淀粉样肽的浓度算术组合得到的某些计算参数的值可以用于确定患者是否患有神经退行性疾病，患者是否处于神经退行性疾病之前的状态和将神经退行性疾病与神经退行性疾病之前的状态相区分。

本发明的诊断方法

因此，在第一个方面，本发明涉及诊断受试者中的神经退行性疾病、检测神经退行性疾病之前的阶段或区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)确定选自由下列各项组成的组的一种或多种参数：

(c)与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的一种或多种β-淀粉样肽的水平，其中所述水平通过分离所述生物样品的细胞级分，将所述样品的所述细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述β-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触来确定；以及

术语“诊断”当在本文中使用时包括评估受试者对疾病的易感性，确定受试者目前是否具有所述疾病，以及受所述疾病影响的受试者的预后。本领域技术人员要理解的是，这种评估通常对于要进行诊断的受试者来说不可能100％正确，尽管优选是100％正确的。然而，该术语要求统计学显著部分的受试者可以被鉴别为患有该疾病或具有该疾病的易患倾向。如果一部分是统计学显著的，则其可以由本领域技术人员使用几种公知的统计学评价工具，例如，确定置信区间，确定p值，t检验，Mann-Whitney检验等简单地确定。细节参见Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，New York 1983。优选的置信区间为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％。P值为优选0.2、0.1或0.05。

当在本文中使用时，术语“受试者”涉及被归类为哺乳动物的所有动物，并且包括但不限于家养动物和耕作动物，灵长类动物和人类，例如，人、非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、山羊、犬、猫或啮齿类动物。优选地，受试者是任何年龄或人种的男性或女性人类。

术语“神经退行性疾病”，当在本文中使用时，是指这样的病症或功能障碍，其中神经元细胞由于细胞死亡而损失，引起认知功能的衰退或导致可能以神经性、神经退行性、生理性、心理或行为异常为特征的损害、功能紊乱或并发症。可以采用本发明的方法诊断的合适的神经退行性疾病包括，而不限于，年龄相关性黄斑变性、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer′sDisease)、放疗诱发的痴呆症、轴突损伤、急性皮层扩布性抑制(acute corticalspreading depression)、α-共核蛋白病(alpha-synucleinopathies)、脑缺血、亨廷顿病、持续性局灶性脑缺血、周围神经再生、癫痫持续状态后模型(post-statusepilepticus model)、脊髓损伤、散发性肌萎缩侧索硬化和传染性海绵状脑病。

在优选的实施方案中，神经退行性疾病是阿尔茨海默病。术语″阿尔茨海默病″(或″老年性痴呆″)是指与特定的退行性脑病相关的精神衰退，所述特定的退行性脑病的特征为老年斑、神经炎性缠结(neuritic tangles)和进行性神经元丧失，其在临床上表现为进行性记忆减退、意识混乱、行为问题、个人不能自理、渐进性体质恶化(gradual physical deterioration)和，最终死亡。患有阿尔茨海默病的患者使用NINCDS-ADRDA标准(CDR＝1，MMSE 16至24分和在Scheltens量表中颞叶内侧萎缩(通过MRI确定)＞3分进行鉴别。

术语“所述神经退行性疾病之前的阶段”，当在本文中使用时，是指在正常个体和患有神经退行性疾病的受试者之间发生的一种过渡性状况，其特征为出现神经退行性疾病的一些体征和症状或出现在患有神经退行性疾病的患者中观察到的体征和症状亚群。在优选的实施方案中，所述神经退行性疾病之前的阶段是轻度认知损害(此后称为MCI)，其是指在正常衰老和早期阿尔茨海默病之间的认知损害过渡期。如果患者满足Mayo临床标准(CDR＝0.5，他们显示颞叶内侧萎缩(通过MRI确定)，在Scheltens量表中大于3分，则他们通常被鉴别为MCI，他们在采用18-氟脱氧葡萄糖的正电子断层扫描仪(PET-FDG)中显示顶叶和/或颞叶代谢减退的表现(提示AD)。

术语“区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段”是指区分处于神经退行性疾病之前的阶段或前驱期的患者与已经患有该疾病的患者的能力。在具体的情况下，神经退行性疾病是阿尔茨海默病，本发明的方法允许区分阿尔茨海默病和已知为轻度认知损害(MCI)的所述疾病的前驱期：

在第一步骤中，本发明的方法包括确定选自由下列各项组成的组的至少一种参数：

(c)与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的一种或多种β-淀粉样肽的水平，其中所述水平通过分离所述生物样品的细胞级分，将所述样品的所述细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述β-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触来确定。

术语“β-淀粉样肽”在本文中与“Aβ”、″Abeta″、″βAP″、″Abeta肽″或″Aβ肽”可互换使用，并且是指为在阿尔茨海默病(AD)、唐氏综合症(Down′s Syndrome)和遗传性脑出血伴荷兰型淀粉样变(HCHWA-D)患者脑中中发现的老年斑和血管淀粉样蛋白沉积物(淀粉样蛋白血管病)的主要化学成分的肽家族。B-淀粉样肽是β-淀粉样前体蛋白的片段(APP)，其包含可变数目的氨基酸，一般为38-43个氨基酸。

B-淀粉样肽通常表示为″Aβ(x-y)″其中x表示β-淀粉样肽的氨基末端的氨基酸编号，y表示羧基末端的氨基酸编号。例如，Aβ(1-40)是其氨基末端以氨基酸编号1开始且羧基末端以氨基酸编号40结束的β-淀粉样肽，其序列由SEQ IDNO：1给出。β-淀粉样肽的实例包括可以用本发明的方法确定的那些，包括，不限于，Aβ(1-38)(SEQ ID NO：2)、Aβ(1-39)(SEQ ID NO：3)、Aβ(1-40)(SEQ IDNO：1)、Aβ(1-41)(SEQ ID NO：4)、and Aβ(1-42)(SEQ ID NO；5)、Aβ(1-43)(SEQ ID NO：6)、Aβ(11-42)(SEQ ID NO：7)、Aβ(3-40)(SEQ ID NO：8)、Aβ(3-42)(SEQ ID NO：9)、Aβ(4-42)(SEQ ID NO：10)、Aβ(6-42)(SEQ IDNO：11)、Aβ(7-42)(SEQ ID NO：12)、A13(8-42)(SEQ ID NO：13)、Aβ(9-42)(SEQ ID NO：14)、Aβ(x-40)、Aβ(x-42)和Aβ(x-38)，以及总β-淀粉样肽，后者是指多个β-淀粉样肽物种，其中不区分单个物种。在优选的实施方案中，根据本发明的方法检测的β-淀粉样肽是Aβ(1-40)和Aβ(1-42)。

术语“Aβ(1-42)”，当在本文中使用时，涉及对应于APP的氨基酸672至713(SEQ ID NO：5)的42个氨基酸肽，其通过淀粉样前体蛋白(SEQ ID NO：15)被β-和γ-分泌酶相继溶蛋白性裂解而产生。

术语“Aβ(1-40)”，当在本文中使用时，涉及对应于氨基酸672至711(SEQ IDNO：1)的40个氨基酸肽，其通过淀粉样前体蛋白(SEQ ID NO：15)被β-和γ-分泌酶相继溶蛋白性裂解而产生。

术语“生物样品”，当在本发明中理解时，包括(1)生物流体诸如全血、血清、血浆、尿、淋巴、唾液、精液、痰、眼泪、粘液、汗液、乳、脑提取物和脑脊液；(2)血液成分，诸如血浆、血清、血细胞和血小板；(3)从实体组织或器官诸如脑获得的提取物；和(4)来自人或动物细胞系或原代细胞的培养物，所述原代细胞诸如原代人神经元，和来自携带人APP基因的转基因小鼠的原代神经元，例如，来自转基因PDAPP动物(例如，小鼠)的细胞，以及293人肾细胞系，人神经胶质瘤细胞系，人HeLa细胞系，原代内皮细胞系(例如，HUVEC细胞)，原代人成纤维细胞系或原代淋巴母细胞系(包含来源于具有APP突变的患者的内源性细胞)，原代人混合脑细胞培养物(包含神经元、星形细胞和神经胶质)，或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。本发明的方法特别适合于测量人或非人动物的血液样品中的Aβ，所述血液样品诸如全血、血浆，或包含任何量的任何血液成分的样品。

术语“全血”是指来自人或动物的包含细胞成分和液体成分两者的血液。全血可以处于凝固状态或非凝固状态。“全血”还包括其中一部分或全部细胞成分诸如白细胞或红细胞已经被溶解的血液。

术语“血浆”是指全血的液体成分。取决于使用的分离方法，血浆可以完全不含有细胞成分，或可以含有不同量的血小板和/或小量的其他细胞成分。

术语“血清”是指不含凝血蛋白纤维蛋白原和其他凝血因子的血浆。

术语“游离的β-淀粉样肽”，当在本文中使用时，是指不与生物样品的任何成分缔合并且易于与特异性抗体结合的β-淀粉样肽。该肽可以通过常规的免疫学技术通过将生物样品与对所述肽特异的抗体接触来测定。在优选的实施方案中，游离淀粉样肽的水平在血浆中测定。

术语“与大分子成分缔合的β-淀粉样肽”，当在本文中使用时，是指与被研究的生物样品中存在的分子非共价结合或连接的β-淀粉样肽。该肽通常不容易被利用用于免疫学检测并且因此需要对生物样品预处理以便实现该肽与所述成分的分离。在这些条件下，与大分子成分连接的β-淀粉样肽将从所述成分释放并且将变得可被利用用于使用特异性抗体的免疫学检测。由于生物样品已经含有特定量的游离β-淀粉样肽，因此在将样品与蛋白增溶剂接触后游离淀粉样肽的总量将为初始存在的游离β-淀粉样肽和在用蛋白增溶剂处理后已经释放的β-淀粉样肽水平的合计水平。在需要测定与生物样品中存在的大分子成分缔合的β-淀粉样肽的水平的情况下，通常可以如下来完成：测定用蛋白增溶剂处理前游离β-淀粉样肽的水平和用蛋白增溶剂处理后游离β-淀粉样肽的水平，并将第二值减去第一值。为了本发明的目的，其通常足以测定游离β-淀粉样肽的合计水平，该合计水平包括初始的游离β-淀粉样肽以及在用蛋白增溶剂处理后已经从大分子成分释放的β-淀粉样肽的水平。因此，通常当样品被处理以便将淀粉样肽从大分子成分解离时测定的参数对应于样品中存在的游离肽加上与大分子成分缔合的肽。

可以结合β-淀粉样肽并且有助于与大分子成分缔合的β-淀粉样肽的池的样品大分子成分包括蛋白以及脂质两者。在血液或血浆样品中进行所述方法的具体情况下，所述大分子成分包括，不限于，血液蛋白和脂质。示例性的血液蛋白包括白蛋白、免疫球蛋白G、免疫球蛋白E、免疫球蛋白M、免疫球蛋白A、纤维蛋白原(纤维蛋白及其降解产物)、α-1抗胰蛋白酶、前白蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1酸性糖蛋白、α1甲胎蛋白、触珠蛋白α2、巨球蛋白、血浆铜蓝蛋白、转铁蛋白、C3/C4β2微球蛋白、β脂蛋白；α、β和γ球蛋白、C-反应蛋白(CRP)、凝血酶原、甲状腺素结合蛋白、转甲状腺素蛋白等。示例性的血液脂质包括游离脂肪酸、胆固醇、甘油三酯、磷脂、鞘脂等。与大分子成分缔合的β-淀粉样肽的量可以通过将生物样品的无细胞样品与蛋白增溶剂在适于诱导所述β-淀粉样肽从大分子成分释放的条件下接触来确定。

对于接触，其在本文中是指向样品加入足量的包含蛋白增溶剂的溶液使得混合物中蛋白增溶剂的浓度足以有效地溶解与样品中的蛋白和细胞结合的β-淀粉样肽。优选地，所述蛋白增溶剂以缓冲溶液的形式存在于溶液中使得蛋白增溶剂的添加不会导致样品pH的大幅改变。

术语“蛋白增溶剂”当在本文中使用时，是指能够改变多肽的二级、三级和/或四级结构同时保留一级结构完整的任何化合物或组合物。由于这些性质，蛋白增溶剂能够增加样品中蛋白的溶解度以及防止蛋白的分子间和分子内聚集。适合于在本发明中使用的蛋白增溶剂包括，不限于，洗涤剂、离液剂、还原剂及其混合物。

术语“洗涤剂”，当在本文中使用时，通常作为表面活性剂的同义词使用，是指两亲性表面活性剂，其当加入至液体时，与缺少洗涤剂时的相同液体相比，减少液体的表面张力。洗涤剂还能够防止蛋白的聚集和防止污染物与目的蛋白的非特异性相互作用或结合。适合于在本发明中使用的洗涤剂包括，不限于，非离子(中性)、阴离子、阳离子或两性离子洗涤剂。

非离子或中性洗涤剂的实例包括，不限于，Tween系列的洗涤剂，诸如20、21、40、60、61、65、80、81、85；系列的洗涤剂，诸如20；Tergitol系列的洗涤剂，诸如Tergitol型号15-S-12；系列的洗涤剂，诸如35、56、72、76、92V、97、58P；Tween系列的洗涤剂，诸如20、21、40、60、61、65、80、81、85；系列的洗涤剂，诸如X-100、X-114、CF-21、CF-32、DF-12、DF-16、GR-5M、X-102、X-15、X-151、X-207、X-165、X-305、X-405、X-45、X-705-70，或至少一种所述洗涤剂的非离子保守的变体。

阴离子洗涤剂的实例包括，不限于，胆酸及其衍生物，牛磺胆酸、TritonX-200、Triton W-30、Triton-30、Triton-770、磺基丁二酸二辛酯、N₅N-二甲基十二烷基胺N-氧化物、1-烷基磺酸钠、N-月桂酰肌氨酸或脂肪酸盐。

阳离子洗涤剂的实例包括，不限于，一和二-甲基脂肪胺、烷基三甲基铵盐、二烷基二甲基铵盐、烷基胺乙酸盐、三烷基乙酸铵、烷基二甲基苄基铵盐、二烷基甲基苄基铵盐、卤化烷基吡啶鎓和烷基(烷基取代的)吡啶鎓盐、烷基甲硫基吡啶鎓盐、烷基酰胺基甲基吡啶鎓盐、烷基喹啉鎓盐、烷基异喹啉鎓盐、N，N-烷基甲基吡咯烷鎓盐、1，1-二烷基哌啶鎓盐、4，4-二烷基硫吗啉鎓盐、4，4-而烷基硫吗啉鎓-1-氧化物盐、甲基三(烷基乙基)-2-烷基甲基硫酸咪唑鎓盐(和其他盐类)、甲基双(烷基酰胺基乙基)-2-羟乙基甲基硫酸铵(和其他盐类)、烷基酰胺基丙基--二甲基苄基铵盐、羧基烷基-烷基二甲基铵盐、烷基胺氧化物、烷基二甲基胺氧化物、聚(乙烯基甲基吡啶鎓)盐、聚(乙烯基吡啶)盐、聚乙烯亚胺、三烷基鏻碳酸氢盐(和其他盐类)、三烷基甲基鏻盐、烷基乙基甲基锍盐和烷基二甲基氧化锍盐。

两性离子洗涤剂的实例包括，不限于，3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)；N-(烷基C10-C 16)-N，N-二甲基甘氨酸甜菜碱(EMPIGEN BB)；硫代甜菜碱(SB3-10)；3-[N，N-二甲基(3-肉豆蔻酰基氨基丙基)铵基]丙磺酸盐(酰胺基磺基甜菜碱-14；ASB-14)；N-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-l-丙磺酸盐(3-14洗涤剂；ZWITTERGENT)；N-十二烷基-N，N′-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐；N-十八烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐；N-癸基-N，N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐；Mirataine CB；Mirataine BB；Mirataine CBR；Mirataine ACS；Miracare2MHT和Miracare 2MCA。

在优选的实施方案中，蛋白增溶剂是洗涤剂。在另外更优选的实施方案中，洗涤剂是Tween 20。在另外更优选的实施方案中，Tween 20以0.5％的浓度使用。

“离液剂”，当在本文中使用时涉及破坏蛋白之间和蛋白内的氢键和疏水相互作用化合物或化合物的混合物。当以高浓度使用时，离液剂破坏二级蛋白结构并使否则为不溶的蛋白进入溶液中。合适的离液剂包括，不限于，尿素、异硫氰酸胍、硫氰酸钠(NaSCN)、盐酸胍、氯化胍、硫氰酸胍、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾、或三氟乙酸铯。

术语“还原剂”，当在本文中使用时，是指将巯基保持在还原状态并且还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或物质。作为实例，适合于本发明的方法的还原剂包括巯基或膦还原剂。巯基还原剂的实例包括二硫苏糖醇(DTT)、二硫丁四醇(DTE)和β-巯基乙醇。膦还原剂的实例包括三丁基膦(TBP)和三-羧基乙基膦(TCEP)。

典型地，生物样品首先被处理以去除细胞级分。然后无细胞样品与蛋白增溶剂接触。在优选的实施方案中，样品使用包含蛋白增溶剂的缓冲液稀释。典型地，样品在包含Tween 20的缓冲溶液中稀释5倍。

当在本文中使用时，“缓冲溶液”是能够中和酸和碱两者而一点也不会改变溶液的初始酸度或碱度的处于溶液中的任何物质或化合物的混合物。待在本发明的方法中使用的合适的缓冲溶液包括，不限于，Tris缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液等。优选地，缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液诸如磷酸盐-缓冲盐水或PBS。

加入至生物样品的包含蛋白增溶剂的溶液的量不是至关重要的，只要实现β-淀粉样肽的充分解离即可。作为实例，生物流体可以在包含蛋白增溶剂的溶液中以至少1/2(v/v)、1/3(v/v)、1/4(v/v)、1/5(v/v)、1/6(v/v)、1/7(v/v)、1/8(v/v)、1/9(v/v)、1/10(v/v)、1/20(v/v)、1/50(v/v)、1/60(v/v)、1/80(v/v)、1/90(v/v)、1/100(v/v)或更大的稀释度稀释。专业技术人员将理解，可以使用所述稀释率的任意组合和所述蛋白增溶剂浓度的任意组合，只要蛋白增溶剂的终浓度足以达到所需的作用即可。例如，包含蛋白增溶剂的溶液可以包含浓度在0.001％至0.5％(w/v)范围的所述选择的一种或多种蛋白增溶剂。在包含蛋白增溶剂的所述溶液中已经稀释后，所述生物流体典型地含有处于小于0.1％(w/v)、优选小于0.6％(w/v)、更优选不多于0.5％(w/v)、最优选不多于0.45％(w/v)和甚至最优选0.5％的所述一种或多种表面活性剂。

用于本发明的合适的缓冲体系包括Tris-HCl缓冲液，其包含盐诸如NaCl或KCl和，任选地包含BSA。具体的缓冲体系包括，不限于，

50mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-20；

50mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-20，1M GuHCl；

50mM Tris-HCl pH 8，0.5M KCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-20；

50mM Tris-HCl pH 8，0.5M KCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-20，1M GuHCl；

50mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-80；

50mM Tris-HCl pH 8，0.5M KCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-80；

50mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl；0.05％；BSA，0.05％Triton X-100

50mM Tris-HCl pH 8，0.5M KCl，0.05％；BSA，0.05％Triton X-100；

50mM Tris-HCl pH 8；0.05％；BSA，0.05％Tween-20；

50mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.1％；BSA，0.05％Tween-20；

50mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05％；BSA，0.1％Tween-20；

50mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.1％；BSA，0.1％Tween-20；

50mM Tris-HCl pH 8，1M NaCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-20；

50mM Tris-HCl pH 8，1.5M NaCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-20；

50mM Tris-HCl pH 8，2M NaCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-20；

50mM Tris-HCl pH 8，2，5M NaCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-20；

50mM Tris-HCl pH 8，3M NaCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-20；

50mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-20，10％DMSO；

50mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-20，0.5M GuHCl；

50mM Tris-HCl pH 6，0.5M NaCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-20；

50mM Tris-HCl pH 7，0.5M NaCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-20；

50mM Tris-HCl pH 9，0.5M NaCl，0.05％；BSA，0.05％Tween-20；

50mM Tris-HCl pH 8，0.5M NaCl，0.05％；BSA。

例如，当Tween 20用作蛋白增溶剂时，优选的浓度为0.004-0.02％，更优选0.005-0.01％(w/v)。

优选在低温下进行接触步骤以便抑制样品中存在的蛋白水解活性。合适的温度为约0-10摄氏度，优选约3-5摄氏度，例如，约4摄氏度。

一旦生物流体与包含蛋白增溶剂的溶液接触，两种流体就可以被混合。混合可以通过搅拌，优选通过摇动，更优选通过高速摇动，最优选通过涡旋至少5秒、优选至少10秒、更优选至少15秒(例如，15-50秒)来进行。所述混合、搅拌、摇动、高速摇动或涡旋的有利速度包括至少250rpm、优选至少500rpm、更优选至少1,000rpm、最优选约2,000-2,500rpm的速度。

在适于实现β-淀粉样肽从生物样品中存在的蛋白和脂质部分地或优选全部解离的条件下来进行接触步骤。所述条件可以由本领域普通技术人员通过监测在接触步骤前可检测到的β-淀粉样肽的量和在已经进行接触步骤后不同的时间点时进行性地监测β-淀粉样肽的量来适当地确定。时程实验可以如实验部分的实施例中所述进行确定。

专业技术人员要理解的是当通过用包含蛋白增溶试剂的缓冲液稀释生物样品来测定β-淀粉样肽的水平时，通过免疫学测定获得的游离β-淀粉样肽的水平要进行校正以便考虑先前应用于生物样品的稀释因子。

因此，在优选的实施方案中，在本发明的方法的步骤(i)中确定的参数为选自由下列各项组成的组的一种或多种参数：所述受试者的生物样品中游离ABETA40肽的水平(此后称为1ab40或UP Aβ(1-40))，生物样品中的游离ABETA40肽和如上所述获得的与所述生物样品的成分缔合的ABETA40肽的合计水平(此后称为2ab40或DP Aβ(1-40))，生物样品中的游离ABETA42肽的水平(此后称为1ab42或UP Aβ(1-42))和生物样品中的游离ABETA42肽和如上所述获得的与所述生物样品的成分缔合的ABETA42肽的合计水平(此后称为2ab42或DP Aβ(1-42))。

术语“与细胞缔合的β-淀粉样肽”，当在本文中使用时，是指与生物样品中存在的细胞表面非共价缔合并且不能被利用用于与添加至样品的抗体结合，因此不能被免疫学检测到的β-淀粉样肽。典型地，如果生物样品是血液，则β-淀粉样肽缔合至红细胞、白细胞，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，以及血小板。

可以确定指定样品中与细胞缔合的β-淀粉样肽的量，并且该值可以单独使用或结合本发明的方法中的涉及β-淀粉样肽的其他参数一起使用。为此目的，首先需要从生物样品中分离细胞级分。这可以使用专业技术人员已知的任何技术来进行，诸如离心、沉降、过滤等。一旦生物样品的细胞级分已经被分离，则将细胞与蛋白增溶剂接触。

合适的蛋白增溶剂包括如上所定义的洗涤剂、离液剂和还原剂，并且通常在缓冲溶液中以适宜的浓度提供。合适的试剂、缓冲溶液和缓冲溶液中试剂的浓度已经在上面进行了描述。接触步骤基本上如上面在释放与生物样品的成分(蛋白和脂质)连接的淀粉样肽的方法中所解释的那样进行。在优选的实施方案中，蛋白增溶剂是洗涤剂。在还更优选的实施方案中，洗涤剂是Tween 20。用作蛋白增溶剂的Tween 20的合适浓度如上面所定义，即，0.004-0.02％，更优选0.005-0.01％(w/v)。

典型地，接触步骤通过用包含蛋白增溶剂的溶液重悬浮生物样品中的细胞级分来进行。所述重悬浮可以通过轻柔地上下吹吸，通过搅拌，优选通过摇动，更优选通过高速摇动，最优选通过涡旋至少5秒，优选至少10秒，更优选至少15秒(例如，15-50秒)来进行。所述混合、搅拌、摇动、高速摇动或涡旋的有利速度包括至少250rpm、优选至少500rpm、更优选至少1,000rpm、最优选约2,000-2,500rpm的速度。

在足以实现β-淀粉样肽从生物样品中存在的细胞部分地或优选全部解离的条件下来进行接触步骤。所述条件可以由本领域普通技术人员通过监测在接触步骤前可检测到的β-淀粉样肽的量和在已经进行接触步骤后不同的时间点时进行性地监测β-淀粉样肽的量来适当地确定。时程实验可以如实验部分的实施例中所述进行确定。

因此，在优选的实施方案中，在本发明的方法的步骤(i)中确定的参数为选自由下列各项组成的组的一种或多种参数：与生物样品中存在的细胞缔合的ABETA40的水平(此后称为3ab40或CB Aβ(1-40))和与生物样品中存在的细胞缔合的ABETA42的水平(此后称为3ab42或CB Aβ(1-42))。

本发明的方法的下列步骤包括将参数(b)或(c)中的至少一个的值或由参数(a)至(c)中的一个或多个算术组合产生的计算参数的值与参比样品中对应于所述参数(b)或(c)或所述计算参数的值的参比值进行比较；其中(a)、(b)和(c)已经在上面被详细地定义，并且分别对应于所述受试者的生物样品中游离β-淀粉样肽的水平(a)，所述受试者的生物样品中的游离淀粉样肽和与所述生物样品中存在的大分子成分缔合的所述β-淀粉样肽的合计水平(b)以及与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的β-淀粉样肽的水平(c)。

在本发明的方法的步骤(ii)中使用的参数是直接参数，即，可以如上面所定义的那样直接测定的参数，其对应于前面被定义为2ab40、3ab40、2ab42和3ab42的那些。备选地，还能够将一种或多种直接参数算术组合以便获得计算参数。在实践中，两种以上参数的任意算术组合可以具有诊断价值的计算参数，包括加法、减法、乘法、除法和它们的组合。用于本发明的方法中的具体计算标志物包括，不限于，2ab40/2ab42、3ab40/3ab42、2ab40/3ab40、2ab42/3ab42、1ab40+2ab40、1ab40+3ab40、2ab40+3ab40、1ab40+2ab40+3ab40、1ab42+2ab42、1ab42+3ab42、2ab42+3ab42、1ab42+2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+1ab42+2ab42、1ab40+3ab40+1ab42+3ab42、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+3ab40+1ab42+2ab42+3ab42、(1ab40+2ab40)/(1ab42+2ab42)、(1ab40+3ab40)/(1ab42+3ab42)、(2ab40+3ab40)/(2ab42+3ab42)、(1ab40+2ab403ab40)/(1ab42+2ab42+3ab42)、(1ab42+2ab42)/(1ab40+2ab40)、(1ab42+3ab42)/(1ab40+3ab40)、(2ab42+3ab42)/(2ab40+3ab40)、(1ab42+2ab423ab42)/(1ab40+2ab40+3ab40)、2ab40-1ab40、2ab42-1ab42y(2ab40-1ab40)/(2ab42-1ab42)。在优选的实施方案中，计算参数由2ab40和3ab40参数相加得到(此后称为T40)。在另一优选的实施方案中，计算参数由2ab42和3ab42参数相加得到(此后称为T42)。还在另一个优选实施方案中，计算参数由2ab40、3ab40、2ab42和3ab42参数相加得到(此后称为T-βAPB)。

术语“参比值”，当在本文中使用时，是指用于比较并且已经在未患有神经退行性疾病或没有任何神经退行性疾病史的受试者中测定的参数的值。优选地，从其获得用于不同参数和计算参数的参比值的受试者是显示没有记忆主诉，在神经心理学测试中表现正常且在MRI中没有结构改变的患者。

具体地，选择参比值，能够获得大于85％的灵敏度和大于75％的特异性。在另一优选的实施方案中，选择参比值以便获得大于70％的灵敏度和大于70％的特异性。优选地，参比值能够获得具有至少80％的准确度或精确度的预测。

在本发明的方法的步骤(iii)中，使用特定组的标志物或计算标志物来进行神经退行性疾病的诊断，对神经退行性疾病之前的阶段的检测或神经退行性疾病与神经退行性疾病之前的阶段的区分，所述特定组的标志物或计算标志物提供特别适宜的特异性和灵敏度水平。因此，在具体实施例中，神经退行性疾病的诊断通过比较选自由3ab40和2ab42组成的组的参数的值或选自由2ab40+3ab40和2ab40+3ab40+2ab42+3ab42组成的组的计算参数的值来进行。

在另一个具体实施方案中，对神经退行性疾病之前的阶段的检测通过比较选自由2ab40、3ab40和2ab42组成的组的参数的值或选自由2ab40+3ab40、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+3ab40+1ab42+2ab42+3ab42、1ab40+2ab40+3ab40，1ab42+2ab42+3ab42、1ab40+1ab42+2ab42+3ab42，1ab40+2ab40+1ab42+2ab42和1ab40+3ab40+1ab42+3ab42组成的组的计算参数的值来进行。

还在另一个实施方案中，神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段的区分通过比较选自由3ab40和2ab42组成的组的参数的值或通过比较选自由2ab40+3ab40、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42和1ab40+2ab40+1ab42+2ab42组成的组的计算参数的值来进行。

用于本发明的不同诊断方法的适当参比值概括在表1中。

表1：本发明的优选方法依照参数和截止值的概述。

一旦确定了参数或计算参数的值，当所述参数的值或所述计算参数的值相对于所述参比值存在改变时，根据本发明进行神经退行性疾病的诊断，对神经退行性疾病之前的阶段的检测或区分神经退行性疾病于所述神经退行性疾病之前的阶段。

术语″改变″是指相对于参比值进行考虑时参数的值的统计学显著的增加或减小。

“统计学显著的”当在本文中使用时，涉及对两种或多种结果、终点或结局之间非随机关联性的概率的统计分析，即，相对于参比值，存在特定程度的参数的值与特定患者群体关联的数学确信度。

所述值的改变的统计学显著性可以使用p-值来确定，例如，当使用p-值时，当p-值小于0.1，优选小于0.05，更优选小于0.01，甚至更优选小于0.005，最优选小于0.001时参数被鉴别为显示显著的改变。

典型地，当与参比值比较所述值超出参比值，其为至少1.1-倍、1.5-倍、5-倍、10-倍、20-倍、30-倍、40-倍、50-倍、60-倍、70-倍、80-倍、90-倍、100-倍或甚至更高时，被考虑的参数的值可以被指定为“增加”。另一方面，当与参比值比较，所述值为至少0.9-倍、0.75-倍、0.2-倍、0.1-倍、0.05-倍、0.025-倍、0.02-倍、0.01-倍、0.005-倍或甚至更低时，该参数值可以被认为“减小”。在具体实施方案中，参数值或计算参数的值相对于参比值的改变是增加。

在本发明中可以使用适合于测定肽的任何方法。作为实例，β-淀粉样肽的浓度可以使用选自下列的一种或多种技术测定：Western印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子体共振、沉淀反应、凝胶扩散免疫扩散测定、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选法(FACS)、双向凝胶电泳、毛细管电泳、质谱测定法(MS)、基质辅助激光解吸/电离-飞行时间-MS(MALDI-TOF)、表面增强激光解吸电离-飞行时间(SELDI-TOF)、高效液相色谱法(HPLC)、快速蛋白液相色谱法(FPLC)、多维液相色谱法(LC)紧接着串联质谱法(MS/MS)、薄层色谱法、蛋白芯片表达分析和激光密度测定仪(laser densiometry)。

在优选的实施方案中，1ab40、1ab42、2ab40、2ab42、3ab40和3ab42中的至少一种或多种的测定通过免疫学方法进行。当在本文中使用时，“免疫学方法”，当应用于测定时，涉及包括使用一种或多种对靶物质特异的抗体以便测定样品中存在的不包括其他物质的所述靶物质的量/浓度的任何方法。合适的免疫学方法包括，不限于，Western印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子体共振、放射免疫测定(RIA)。

专业技术人员要理解的是任何类型的抗体适于实施根据本发明的免疫学检测方法，条件是所述抗体足够特异从而有效地区分样品中的β-淀粉样肽物种与其他物质。适合用于本发明的免疫学方法中的抗体分子包括，不限于：

(i)″完整″抗体，其包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3，

(ii)“Fab”片段，其由完整抗体的木瓜蛋白酶消化得到，并且包含单个抗原结合位点以及CL和CH1区，

(iii)“F(ab’)₂”片段，其由完整抗体的胃蛋白酶消化得到，并且包含两个抗原结合位点，

(iv)“Fab′”片段含有轻链的恒定区和重链的第一恒定结构域(CH1)，并且仅具有一个抗原结合位点。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处加入了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。

(v)“Fv”是最小的抗体片段，其包含完整的抗原识别和抗原结合位点。此区由一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体以紧密的非共价缔合方式组成。正是在此构型中，每个可变结构域的三个超变区(CDRs)相互作用从而在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。总体来说，6个超变区对抗体赋予抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或Fv的一半，仅包含对抗原特异的三个超变区)具有识别和结合抗原的能力，尽管与整个结合位点相比亲和性较小。

(vi)单链FV或″scFv″抗体片段包含VL和VH，抗体结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。优选地，VL和VH区通过多肽接头连接，使scFv能够形成对于抗原结合所需的结构。

(vii)“双体抗体(Diabodies)”包含在同一多肽链(VH-VL)上与轻链可变结构域(VL)通过肽接头连接的重链可变结构域(VH)，所述肽接头太短从而不允许同一条链上两个结构域之间的配对。这迫使与另一条链的互补结构域配对，并且促进具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分子的组装。

(viii)″双特异性抗体″(BAbs)是单个双价抗体(或其免疫治疗上有效的片段)，其具有两个不同的特异性抗原结合位点。这两个抗原位点可以经化学方法或通过本领域中已知的遗传工程方法偶联在一起。

所有这些抗体片段可以使用本领域中已知的常规技术进行进一步修饰，例如，通过单独地或组合地使用本领域中已知的一个或多个氨基酸缺失、一个或多个插入、一个或多个置换、一个或多个加成和/或重组(和/或任何其他的一种或多种修饰(例如，翻译后和化学修饰，诸如糖基化和磷酸化)。用于在基于免疫球蛋白链的氨基酸序列的DNA序列中引入此类修饰的方法是本领域专业技术人员所熟知的；参见，例如，Sambrook等；Molecular Cloning：A LaboratoryManual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989第二版和2001第三版。

抗体包括多克隆和单克隆抗体两者。对于多克隆抗体的制备，各种宿主包括山羊、兔、大鼠、小鼠、骆驼、单峰骆驼、美洲鸵、人类、鸟类和其他宿主可以通过注射与具有免疫原性性质的Aβ40或Aβ42片段对应的肽进行免疫。取决于宿主物种，各种佐剂可以用来增加免疫应答。这样的佐剂包括，但不限于，弗氏佐剂、矿物凝胶诸如氢氧化铝，和表面活性物质诸如溶血卵磷脂、聚阴离子、肽、油乳液、KLH和二硝基苯酚。在用于人类的佐剂中，特别优选BCG(卡介苗(bacilli Calmette-Guerin))和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。如果抗原是肽，则其可以用于与在待被免疫的物种中具有免疫原性的蛋白缀合。例如，抗原可以使用双功能试剂或衍生化试剂，例如，马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐或SOCl₂，与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、Blue Carrier(从Concholepasconcholepa分离的血蓝蛋白)、牛甲状腺素蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂缀合。

对于单克隆抗体的制备，可以使用常规技术。例如，单克隆抗体可以使用首先由Kohler等，Nature，256：495(1975)所述的杂交瘤方法使用Ausubel，F.M.等(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons Inc；ring-boundedition，2003)的单元11.4至11.11中详细描述的程序制备。备选地，单克隆抗体可以通过重组DNA程序从使用McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)中所述的技术产生的抗体噬菌体文库分离。Clacksoii等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)记述了分别使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的出版物记述了通过链改组(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略制备高亲和性(nM范围)人抗体(Waterhouse等，Nucl.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。

作为在放血和去除纤维蛋白凝块后从免疫宿主获得的抗血清，多克隆抗体可以直接使用。作为杂交瘤培养物的上清液或作为杂交瘤植入至合适宿主的腹腔中后的腹水，单克隆抗体可以直接使用。备选地，免疫球蛋白分子，为多克隆的或单克隆的分子，可以在其使用前通过常规方式纯化，诸如使用来源于β-淀粉样肽的肽的亲和纯化，非变性凝胶纯化，HPLC或RP-HPLC，尺寸排阻，蛋白A柱上的纯化，或这些技术的任意组合。

用于实施本发明的免疫学方法的合适抗体包括，不限于：

(i)识别来自β-淀粉样肽N-末端区的区的抗体，诸如对位于Aβ40或Aβ42的氨基酸1至16、1至17、13至28、15至24、1至5和1至11内的表位特异的抗体。针对对应于Aβ42肽的C-末端区的肽制备的抗体，其特异性地结合Aβ42，但与Aβ40或Aβ43基本上没有交叉反应，

(ii)针对对应于Aβ40肽的C-末端区的肽制备的抗体，其特异性地结合Aβ40，但与Aβ42、Aβ39、Aβ38、Aβ41或Aβ43基本上没有交叉反应，

(iii)同时识别Aβ40和Aβ42两者的C-末端区的抗体，和

(iv)对β-淀粉样肽的连接区特异的抗体，所述连接区适合用于区分β-淀粉样肽与其他APP片段，并且位于氨基酸16和17内，典型地跨越氨基酸残基13至28。

(v)(i)至(iv)所述的抗体中两种以上的组合。

在优选的实施方案中，β-淀粉样肽的量的测定通过ELISA进行。

术语“ELISA”，当在本文中使用时，代表酶联免疫吸附测定并且涉及这样的测定，未知量的靶物质(β-淀粉样肽)固定在表面上，然后特异性抗体在所述表面上冲洗，使得其可以与抗原结合。该抗体与酶连接，并且在最后的步骤中，添加可以使酶转换成一些可检测信号的物质。不同类型的ELISA测定是已知的，并且可以应用于本发明的方法，包括直接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA和ELISA反向法&装置(ELISA-R m&d)。

直接ELISA通过将包含β-淀粉样肽的测试样品与固相载体接触来进行，所述固相载体已经事先用不相互作用的蛋白或试剂(牛血清白蛋白，酪蛋白)的浓缩溶液包被。一旦存在于测试样品中的β-淀粉样肽被吸附到载体上，则在适于结合至β-淀粉样肽上的条件下加入对β-淀粉样肽特异的抗体。然后使用第二抗体检测结合的抗体，所述第二抗体与可检测标记或底物修饰酶偶联。然后由可检测标记或由底物产生的信号与结合在载体上的抗体的量成比例，所述量与样品中的β-淀粉样肽的量直接相关。

竞争ELISA测定包括第一步骤，其中包含未知量的β-淀粉样肽的测试样品与如上面所定义的第一抗体接触。抗体-抗原复合物加入至抗原包被孔。一旦将载体洗涤以去除任何非特异性结合的复合物，就用与可检测部分偶联的第二抗体检测第一抗体的量。在此类型的测定中，初始抗原浓度越高，最终信号越弱。可选的竞争ELISA测定是包括酶联抗原而不是酶联抗体的测定。标记的抗原竞争与相同的抗原(未标记的)竞争主要的抗体结合位点。使用此类型的测定，样品中的抗原浓度与孔中保留的标记抗原的量负相关，并且因此产生较弱的信号。

ELISA反向法&装置(ELISA-R m&d)使用了一种创新性的固相，所述固相由具有4-12个突出的尖顶拱的免疫吸附剂聚苯乙烯棒构成；整个装置适合于被引入至含有收集样品的测试管中，并且通过将尖顶拱浸没在标准微量板的微孔中而容易地进行后续步骤(洗涤、缀合温育和生色(chromogenous)温育)，所述微孔预先充满试剂、密封并储存备用。

在优选的实施方案中，所述ELISA测定是ELISA夹心测定。ELISA夹心测定涉及用对β-淀粉样肽特异的第一抗体包被载体，施用包含β-淀粉样肽的样品导致β-淀粉样肽与第一抗体的结合，并施用对β-淀粉样肽也特异的第二抗体，其中所述第二抗体通常与可检测标记或与底物修饰酶偶联。由所述标记或由被转变的底物产生的信号与样品中抗原的量成比例。

在本发明的上下文中，第一抗体将被称作“捕获抗体”，意味着该抗体用来从样品中回收抗体特异性结合的所有的分子物种。关于可以被用作捕获抗体的抗体的类型实际上没有限制，只要其含有对Aβ40和/或Aβ42特异的至少一个抗原结合位点即可。因此，上面提及的任一种抗体可以用作捕获抗体。

在本发明的上下文中，第二抗体将被称作“检测抗体”，因为该抗体将被用于检测已经被捕获抗体保留的抗原的量。与捕获抗体一样，关于可以用作检测抗体的抗体的类型实际上没有限制。然而，本领域技术人员还要理解的是检测抗体(i)必须与抗原的没有被捕获抗体覆盖的区域结合，以及(ii)必须不仅包含抗原结合位点而且还包含可检测标记、底物修饰酶或可以被对所述抗体显示高亲和性结合的试剂特异性地检测到的一个或多个额外的区域，以便允许对与被捕获抗体捕获的抗原结合的抗体的检测。优选地，可以被所述试剂特异性结合的额外的所述区域对应于免疫球蛋白分子的恒定区。

在优选的实施方案中，捕获抗体是对β-淀粉样肽的N-末端区特异的抗体。在还更优选的实施方案中，所述捕获抗体是对位于Aβ40或Aβ42的氨基酸1-16内的表位特异的抗体。特别优选的捕获抗体是如由Kim，K.S.(Neuroscience Res.Comm.1988，2：121-130)所述的6E10单克隆抗体。

在另一优选的实施方案中，检测抗体是对位于β-淀粉样肽的C-末端区中的表位特异的抗体。如上面所解释的那样，检测抗体的成熟可以由本领域普通技术人员根据待被检测的β-淀粉样肽物种的数目来适当地选择。

为了特异性地检测或测定Aβ40，捕获抗体可以是识别Aβ40的N-末端区(并且还识别Aβ42的N-末端区，因为两种肽具有相同的N-末端区)的抗体，并且检测抗体可以是特异性地识别Aβ40的C-末端区而与Aβ42没有任何交叉反应的抗体。备选地，Aβ40可以使用识别Aβ40的C-末端区而与Aβ42没有任何交叉反应的捕获抗体和识别Aβ40的对于Aβ40和Aβ42两者共同的区域，优选Aβ42/Aβ40的N-末端区的检检测抗体来特异性地检测。

为了特异性地检测或测定Aβ42，捕获抗体可以是识别Aβ42的N-末端区(并且还识别Aβ40的N-末端区，因为两种肽具有相同的N-末端区)的抗体，并且检测抗体可以是特异性地识别Aβ42的C-末端区而与Aβ40没有任何交叉反应的抗体。备选地，Aβ42可以使用识别Aβ42的C-末端区的捕获抗体和识别Aβ42的对于Aβ42和Aβ40两者共同的区域的检检测抗体来特异性地检测。

为了同时检测或测定Aβ42和Aβ40，捕获抗体可以是识别Aβ42和Aβ40共同的N-末端区的抗体，而检测抗体可以是至少两种抗体的组合，其中第一抗体特异性地识别Aβ42的C-末端区而与Aβ40没有任何交叉反应，第二抗体特异性地识别Aβ40的C-末端区而与Aβ42没有任何交叉反应。备选地，捕获抗体可以是识别对于Aβ42和Aβ40共同的N-末端区的抗体，而检测抗体可以是识别Aβ42和Aβ40两者的C-末端区的抗体。备选地，Aβ42和Aβ40可以使用至少两种抗体的混合物作为捕获抗体以及识别Aβ42和Aβ40两者共同的N-末端区的检测抗体而同时被检测，至少两种抗体的所述混合物包含第一抗体和第二抗体，所述第一抗体特异性地识别Aβ42的C-末端区而与Aβ40没有任何交叉反应，第二抗体特异性地识别Aβ40的C-末端区而与Aβ42没有任何交叉反应。备选地，Aβ42和Aβ40可以使用识别Aβ42和Aβ40两者的C-末端区的抗体作为捕获抗体和识别Aβ42和Aβ40两者共同的N-末端区的检测抗体而被同时检测。

对Aβ42和Aβ40特异的抗体和它们的制备方法已经详细地描述在WO2004024770和WO2004098631中，它们的内容通过援引合并入本文中。

检测抗体和/或捕获抗体可以使用包含用于制备它们的多肽序列的多肽进行亲和纯化。

如上所述，检测抗体可以与可检测标记或与底物修饰酶直接偶联。优选地，可以使用对检测抗体显示亲和性的试剂，在此情况下，所述试剂而不是检测抗体标记用可检测标记或底物修饰酶标记。此外，抗体结合试剂可以与结合对的第一成员偶联，在此情况下，结合对的第二成员可以与可检测标记或与底物修饰酶偶联。

抗体结合试剂可以与一种或多种特定类型、一种或多种特定类别和/或一种或多种特定亚类的抗体或抗体片段非共价结合。备选地，抗体结合试剂可以与对特定抗原特异的抗体非共价结合。在某些实施方案中，抗体结合试剂与检测抗体的Fc区或与F(ab)区非共价结合。优选的抗体结合试剂包括蛋白A、蛋白G、蛋白V、蛋白L、抗-Fc抗体或抗体结合片段以及Fc受体(FcR)或其抗体结合片段。可以与检测抗体非共价结合的抗体的非限制性实例包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单结构域抗体、单链Fvs(scFv)单链抗体、Fab片段、F(ab′)片段、二硫化物连接的Fvs(sdFv)、细胞内抗体和抗独特型(抗-Id)抗体，以及上述任一种的表位结合片段。Fc受体的非限制性实例包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIAα、FcγRIIIB、FcεRIα、FcεRIξ和FcγRIIIAξ。

用于检测的合适的结合对包括：

■半抗原或抗原/抗体，例如，地高辛和抗地高辛抗体

■生物素或生物素类似物(例如，氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素)/亲和素或链霉亲和素，

■糖/凝集素，

■酶和辅因子

■叶酸/叶酸盐

■选择性地结合蛋白的双链寡核苷酸/转录因子。

■核酸或核酸类似物/互补的核酸，

■受体/配体，例如，类固醇激素受体/类固醇激素。

要理解的是术语结合对的“第一”和“第二”成员是相对的，并且上述成员的每一个均可以被看做是结合对的第一或第二成员。在优选的实施方案中，结合对的第一成员是生物素或其功能等效变体，且结合对的第二成员是亲和素、链霉亲和素或其功能等效变体。

在优选的实施方案中，结合对的第二成员是链霉亲和素。

合适的可检测标记包括，不限于，荧光部分(例如，荧光素、罗丹明、藻红蛋白、香豆素、噁嗪、试卤灵、酞菁和它们的衍生物)，发光部分(例如，由QuantumDot Corporation，Palo Alto，CA供应的Qdot^TM纳米粒子)。

合适的底物修饰酶是能够产生可检测信号的那些，例如，在添加激活物、底物、修饰剂等时。适合作为用于本发明的可检测标记的酶和相应的底物包括：

●碱性磷酸酶：

○生色底物：基于对硝基苯基磷酸盐(p-NPP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/氮蓝四唑(BCIP/NPT)、Fast-Red/萘酚-AS-TS磷酸盐的底物

○荧光底物：4-甲基伞形酮磷酸盐(4-MUP)、2-(5′-氯-2’-磷酰基氧基苯基)-6-氯-4-(3H)-喹唑酮(CPPCQ)、3，6-荧光素二磷酸盐(3，6-FDP)、Fast Blue BB、Fast Red TR或Fast Red Violet LB重氮盐。

●过氧化物酶：

○基于2，2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺(OPT)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、邻联茴香胺、5-氨基水杨酸、3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)和3-甲基-2-苯并噻唑啉腙(MBTH)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)-和3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)的生色底物。

○荧光底物：4-羟基-3-甲氧基苯乙酸、还原的吩噁嗪和还原的苯并噻嗪，包括Red试剂、Amplex UltraRed和还原的二氢氧杂蒽。

●糖苷酶：

○生色底物：用于β-D-半乳糖苷酶的邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(o-NPG)、对硝基苯基-β-D-半乳糖苷和4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷(MUG)。

○荧光底物：试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二半乳糖苷(FDG)、荧光素二葡萄糖苷酸、4-甲基伞形酮β-D-吡喃半乳糖苷、羧基伞形酮β-D-吡喃半乳糖苷和氟化香豆素β-D-吡喃半乳糖苷。

●氧化还原酶(萤光素酶)：

○发光底物：萤光素。

本发明的试剂盒

本发明还提供了适合于实施本发明的方法的试剂盒。因此，在另一个方面，本发明提供了用于测定生物样品中的β-淀粉样肽的试剂盒，该试剂盒包含

(i)蛋白增溶剂，和

(ii)至少一种针对β-淀粉样肽的抗体。

试剂盒的组分(i)和(ii)基本上如关于本发明的方法所述。在优选的实施方案中，蛋白增溶剂试剂是洗涤剂。在还更优选的实施方案中，洗涤剂是Tween20。

在另一个优选的实施方案中，至少一种针对所述β-淀粉样肽的抗体选自由下列各项组成的组：

(i)针对所述β-淀粉样肽的N-末端区的抗体，

(ii)针对所述β-淀粉样肽的C-末端区的抗体，以及

(iii)针对所述β-淀粉样肽的N-末端区的抗体和针对所述β-淀粉样肽的C-末端区的抗体的组合。

在还更优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含针对β-淀粉样肽的N-末端区的抗体，所述抗体针对位于ABETA40和ABETA42的氨基酸1至16内的表位。在另一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含针对β-淀粉样肽的C-末端区的抗体，所述抗体针对肽，且选自由下列各项组成的组：

(i)针对对应于ABETA42肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，其特异性地结合ABETA42，但与ABETA40不产生任何实质性的交叉反应，

(ii)针对对应于ABETA40肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，其特异性地结合ABETA40，但与ABETA42不产生任何实质性的交叉反应，和

(iii)同时识别ABETA40和ABETA42两者的C-末端区的抗体和(iv)(i)和(ii)项所述的抗体的组合。

在优选的实施方案中，本发明的试剂盒进一步包含固相载体。当在本文中使用时，术语″载体″或″表面″是指固相，该固相是多孔的或无孔的水不溶性物质，其可以具有多种形状中的任意一种形状，诸如条、棒、颗粒，包括胶乳颗粒、磁性颗粒、微颗粒，珠子，膜，微量滴定孔和塑料管。大体而言，任何材料可适合作为固相载体，条件是其能够结合足量的捕获抗体。因此，固相材料的选择基于所需的测定形式性能特性来确定。适合于固相载体的材料包括聚合材料，尤其是纤维素材料和衍生自纤维素的材料，诸如含纤维纸，例如，滤纸、色谱纸、玻璃纤维纸，等；合成的或改性的天然存在的聚合物，诸如硝化纤维素、醋酸纤维素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、尼龙、聚丁酸乙烯酯，等；自身使用或结合其他物质使用；玻璃诸如，例如，可作为生物玻璃、陶瓷、金属等利用的玻璃。优选苯乙烯和羧化苯乙烯或用其他活性基团诸如氨基、羟基、卤素等官能化的苯乙烯的非交联聚合物。在某些情况下，将使用取代的苯乙烯与二烯诸如丁二烯的共聚物。

固相载体和抗体可以在试剂盒中分开提供，或，备选地，载体可以用捕获抗体已经预包被而交付。在此情况下，载体可以在结合捕获抗体后用封闭溶液处理。

试剂盒的其他组分可以包括：

●用于从患者取出待分析样品的装置。

●制备β-淀粉样肽的标准曲线所需的缓冲液和溶液。

●用于在测定期间洗涤和封闭固相载体的缓冲液和溶液。

●用于用包被抗体包被固相载体的缓冲液和溶液

●用于由可检测标记显示有色或荧光信号的试剂。

●用于终止由可检测标记形成有色或荧光产物的试剂(例如，1N H₂SO₄)

●包含Aβ40或Aβ42肽的储备溶液，或其组合的样品。

在优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含两种抗体，所述两种抗体可以用于ELISA夹心测定中。在此情况下，抗体之一，捕获抗体被固定化在固相载体上。固定化可以在待检测的靶多肽结合之前进行或一旦肽/蛋白结合于捕获抗体就进行。在任何情况下，如果使用固相载体，则在添加包含待测定的靶多肽的样品之前封闭过多的蛋白结合位点是有利的。优选地，封闭或淬灭载体上的肽结合位点使用与在每次结合反应后用于洗涤复合物的相同缓冲液(例如，50mM Tris-HCl，pH 8、PBS或TBS，任选地包含Tween 20)来进行，所述缓冲液补充有浓度为约0.05％至10％，优选1至5％，更优选约3％的大分子化合物(例如，牛血清白蛋白、脱脂奶粉、western封闭试剂、酪蛋白(caseine)、乳白蛋白(lactoalbumine)、卵白蛋白(ovoalbumine))。

下文借助于下列实施例说明本发明，所述实施例要被解释为仅是说明性的，且不限制本发明的范围。

实施例

实施例1

研究群体

研究包括40名参与者：16名健康对照(HC)，8名遗忘型轻度认知损害患者(MCI)和16名阿尔茨海默病患者(AD)。所有参与者的年龄均在65岁以上，每组中任一性别为50％。参与者的人口统计学特征概述在表2中。

表2.人口统计学特征

*教育水平表示为0：未上过学。1：初等教育。2：中等教育。3：大学教育。¹Kruskal-Wallis U-检验，与Mann-Whitney U-检验相比较。

H、M和A意指分别相对于HC、MCI和AD是有显著性。

在社区社交活跃的没有记忆主诉、在神经心理学测试中表现正常且在定量磁共振成像(MRI)中没有结构改变的志愿者中仔细地选择健康对照。

具有MCI的参与者满足Mayo临床标准。另外为了选择MCI参与者，要求CDR为0.5分，对于颞叶内侧萎缩在Scheltens量表(J.Neurol.NeurosurgPsychiatry.1992；55：967-972)中大于3分以及在采用18-氟脱氧葡萄糖的正电子断层扫描仪(PET-FDG)中顶叶和/或颞叶代谢减退的表现，提示转变为AD。具有除可能的神经退行性疾病以外可能导致MCI的任何精神病或系统病理学的患者被排除。

对于AD组的特定纳入标准为诊断很可能有AD(NINCDS-ADRDA标准)，CDR为1分，MMSE为16-24分，并且对于颞叶内侧萎缩在Scheltens量表中大于3分。

根据如他处所述的ACE记忆临床常规(ACE Memory Clinic routines)进行对于MCI和AD诊断的认知测试。

从每位参与者获得书面知情同意(或在严重AD患者的情况下，由他们最近的亲属签署。研究方案由Hospital Clínic i Provincial(Barcelona，Spain)的伦理委员会修改并批准。

实施例2

样品准备

从受试者采集血液，并将一丸Roche CompleteMini(蛋白酶抑制剂)加入至每10ml。血液直接离心或在4℃保存并在测定的当天离心。

将血浆与细胞级分分离，收集血浆并以0.5ml的等份试样分装在Eppendorf管中。等份试样可以保持在-80℃。

在如下所述获得的未稀释的澄清血浆中直接测定血浆中的游离淀粉样蛋白(1ab40和1ab42)。这些参数此后对于Aβ(1-40)称为1ab40或UP(未稀释的血浆)Aβ(1-40)，对于Aβ(1-42)称为1ab42或UP Aβ(1-42)。

在通过在300μl稀释缓冲液(含有0.5％Tween-20的PBS)中稀释150μl血浆获得的样品中测定总血浆淀粉样蛋白(对应于血浆中游离的淀粉样蛋白加上与血浆成分缔合的淀粉样蛋白)。这些参数此后对于Aβ(1-40)称为2ab40或DP(稀释的血浆)Aβ(1-40)，对于Aβ(1-42)称为2ab42或DP Aβ(1-42)。

通过在稀释样品(含有0.5％Tween-20的PBS)中稀释血浆细胞级分v/v 1/5测定细胞结合的β淀粉样蛋白。这些参数此后对于Aβ(1-40)称为3ab40或CB(细胞结合的)Aβ(1-40)，对于Aβ(1-42)称为3ab42或CB Aβ(1-42)。

实施例3

样品处理的条件

样品稀释

为了鉴定在ELISA测定中得到最高吸光度的样品稀释度，测试不同的稀释度和缓冲溶液。

样品稀释1/2、1/3、1/5、1/5和1/10。观察到当稀释1/4以上时，样品的吸光度下降。最佳稀释度为1/2和1/3。

样品离心

样品通过在13.000rpm离心1’进行澄清以便去除颗粒成分，这些颗粒成分可能干扰免疫学检测。可以收集上清液并直接测试或如上所述进行稀释。

样品超声处理

样品可以被超声处理5’-10’。经超声处理的样品可以直接在ELISA测定中使用或可以在13000rpm离心1’，上清液可以直接在ELISA测定中使用。经超声处理的样品还可以使用如在前面实施例中所定义的适当缓冲液稀释。

样品预清洗

基本上如Fukumoto等(Arch.Neurol.，2003，60：958-964)所述样品通过Sepharosa 4B-IgGK柱跑样以便去除可能的污染物。Sepharosa 4B-IgGK柱通过使用下面的程序使CNBr-活化的sepharose与IgG1k反应来制备：

-使用500μl IgG1k(0，6mg)和1.5ml偶联缓冲液将IgG1k(MW＝150.000)溶解在偶联缓冲液(0.1M NaHCO₃ pH 8，3和NaCl0.5M(对于300mg琼脂糖为1.5ml)。

-树脂用1mM HCl(对于每300mg树脂为60ml)洗涤

-配体与酸洗的树脂混合并在4aC温育过夜，并不断摇动(备选地，温育可以在室温下进行2h)。

-然后使用5体积的偶联缓冲液洗掉过多的配体。

-然后树脂中未反应的活性基团用0.1M Tris-HCl pH 8在室温下封闭2h并摇动。

-使用0.1M Tris-HCl pH 8+0.5M NaCl/0.1M乙酸钠pH 4+0.5MNaCl交替地洗涤树脂三个循环。

一旦获得Sepharose 4B-IgGK，样品的处理包括以下步骤：

-将300μl血浆与525μl样品缓冲液和75μl agarose-IgG1k接触并在4℃温育2h并持续搅拌。

-通过离心去除琼脂糖(5’a 1000rpm)

-100μl经处理的样品加入至微量滴定板的孔中，所述孔上已经吸附了对β-淀粉样肽的N-末端特异的捕获抗体并在4℃温育过夜。

-澄清样品中存在的β-淀粉样肽的量通过向孔中加入抗-Aβ40或抗-Aβ42特异性抗血清(1/4000)在室温下1h并持续摇动通过ELISA测定法来测定。

-然后样品与1/5000稀释度的生物素化抗兔血清在室温下温育1h并持续摇动。

-然后样品与1/4000的过氧化物酶偶联的链霉亲和素在室温下温育1h并摇动。

-然后反应物用TMB在暗处显色30’。

-用终止溶液终止显色反应，并在450nm读取吸光度。

白蛋白和IgG去除

样品通过结合白蛋白和结合IgG的柱跑样。测定穿流(flow through)以便鉴定出现淀粉样肽的级分。使用“ProteoExtract Albumin Removal，Kit”(CALBIOCHEM)根据生产厂商的说明书去除白蛋白。

使用蛋白A柱(Protein A Sepharose 4 Fast Flow，Amersham Biosciences)依照生产厂商的说明书去除IgG。

样品浓缩

样品用具有10000的截止值的microcon进行浓缩。淀粉样肽在穿流中回收，而高分子量蛋白在渗余物中回收。

不同处理方案的作用可以总结如下：

-洗涤剂：Tween-20是洗涤剂，提供增加较多的吸光度值。当Tween-20的浓度从0.05％增加至0.1％时没有观察到作用。

-pH：提供较好的结果的pH值为7和8。当测定Aβ40时，还在pH＝9时观察到适宜的吸光度值。当测定Aβ42时，在pH 9和5时获得适宜的吸光度值。

-变性条件：加入0.5M或1M GuHCl或10％DMSO不导致吸光度值的改善。

-盐：与KCl相比，当使用NaCl时获得较高的吸光度值。

-BSA：当BSA浓度从0.05％增加至0.5％时没有观察到吸光度水平的差异。

-超声处理：当样品在吸光度测定前进行超声处理时没有观察到差异。

-预清洗：当样品用Sepharosa 4B-IgGk预处理时没有观察到差异。

-白蛋白和IgG去除：淀粉样肽似乎与IgG缔合但不与白蛋白缔合。

-浓缩：淀粉样肽似乎主要存在于渗余物中。

实施例4

采用生物素-链霉亲和素放大的比色ELISA夹心测定

为了增加灵敏度，信号可以使用生物素-链霉亲和素放大。板使用6E10mAb捕获抗体包被，该抗体识别淀粉样蛋白Aβ40和淀粉样蛋白Aβ42肽两者中的氨基酸1-17。以在100mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH＝9.6中5μg/ml的浓度在4℃下过夜进行包被。然后板用300μl的封闭溶液(50mM Tris-HCl，pH 8，0，2％Tween-20，0，5％BSA)在室温下封闭3h并摇动或在37℃下封闭2h。当需要时，板可以在封闭后用100μl含有20mg/ml海藻糖的50mM Tris-HCl pH 8溶液处理。使板蒸发直至出现白晕特征的海藻糖。如此处理的板可以保持在4℃，覆盖以铝箔并可稳定两年。

在用6E10mAb包被并用海藻糖处理的板上由肽Aβ40y Aβ42的200pg/ml储备溶液制备标准曲线的样品。从这些溶液，在SDB中以1∶2制成系列稀释液，以便得到200、100、50、25、12.5、6.25和3.125pg/ml的浓度。100μl每种稀释或未稀释的样品加入至SDB(1/1.000.000)，稀释或不稀释，并在4℃温育过夜(或在37℃温育2h)。如实施例1中所述制备用于测定测试样品中的游离血浆淀粉样肽、总血浆淀粉样肽和细胞结合的淀粉样肽的样品，并使用与标准样品的样品相同的条件将样品加入至ELISA板的孔中。检测抗体(针对对应于Aβ42肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体或针对对应于Aβ40肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，取决于检测的是Aβ42还是Aβ40)加入SDB中稀释。100μl加入至每孔，然后在室温下温育1h。下一步，然后加入100μl在SDB中1/5000稀释度的生物素标记的抗兔IgG抗体(SIGMA)，并在室温下温育1h并摇动。然后将100μl在SDB中1/4000稀释度的HRP-偶联的链霉亲和素(获自SIGMA)加入至每孔并在室温下温育1h。

板使用100μl生色底物TMB(ZEU Inmunotec)显色。加入TMB并在暗处温育15-30分钟。作为终止溶液，每孔加入50μl 1N H2SO4。在平板读数器SynergyHT(BioTek Instruments)中读取450nm处的吸光度。

从用于测定总血浆淀粉样蛋白的样品(游离血浆淀粉样蛋白以及与血浆成分结合的淀粉样蛋白)获得的浓度值(pg/ml)被校正以便补偿在准备步骤期间进行的稀释。由于稀释度一般为1∶3稀释度(参见实施例1)，从吸光度读数获得的pg/ml要乘以3以便确定血浆中游离的淀粉样蛋白和与血浆成分结合的淀粉样蛋白的真实合计浓度。同样，从由用于测定细胞结合的淀粉样蛋白的样品获得的吸光度值获得的pg/ml也被校正以便补偿在准备步骤期间进行的稀释。由于稀释度一般为1∶5稀释度(参见实施例1)，从吸光度读数获得的pg/ml要乘以5以便确定与细胞结合的淀粉样蛋白的真实浓度。

在每个步骤之间，使用自动洗板机(Elx50 Bio Tek Instruments)洗涤板，该自动洗板机被编程每次进行5次清洗。洗涤溶液含有50mM de Tris-HCl pH 8，0，05％Tween-20和150mM NaCl(使用前过滤)。

实施例5

荧光ELISA夹心测定

板用碳酸氢盐缓冲液中的6E10(5μg/ml)在4℃包被过夜。然后板在室温下摇动封闭3h(300μl/孔)。然后将测试和标准曲线样品加入至板中，并在4℃下温育过夜。1/4000稀释度的检测抗体(抗-Aβ40或抗-Aβ42血清)加入至每孔并在室温下温育1h并摇动。加入系列稀释度的FITC-偶联的抗-抗体(稀释度1/1000、1/5000、1/10000)并在暗处在室温下温育1h。使用485nm的激发波长和528的发射波长产生荧光。

备选地，使用Quanta-Blu(PIERCE)荧光底物进行测定，其增加ELISA测定的灵敏度。最大激发为325nm，最大发射为420nm。其可以在315-340nm的激发范围和370-470nm的发射范围内被检测到。QuantaBlu工作溶液通过将9份QuantaBlu底物溶液与1份QuantaBlu稳定的过氧化物酶溶液(在室温下稳定24h的溶液)混合来制备。其可以在室温下温育1，5分钟至90分钟并可以在终止反应或不终止反应的条件下(产生蓝色)读数。

板用碳酸氢盐缓冲液中的6E10mAb(5μg/ml)在4℃包被过夜，然后在室温下封闭3h并摇动(300μl/孔)。然后用下列浓度的Aβ42和Aβ40肽制备不同的标准曲线：

●1000、500、250、125、62.5、31、25和15.65pg/mL

●200、100、50、25、12.5、6.25和3.125pg/mL

●25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78和0.39pg/mL

●10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125和0.156pg/mL

●5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156和0.078pg/mL

●1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125和0.0156pg/mL

加入(以1/4000稀释)检测抗体(抗-Aβ40或抗-Aβ42血清)在室温下摇动1h。然后加入HRP-偶联的抗-兔IgG 1/1000并在室温下摇动温育1h。为了使反应显色，加入100μl Quanta-Blue工作溶液，然后在室温下在暗处温育30’、60’和90’。然后在30’、60’和90’时在不终止反应或用STOP溶液终止反应的条件下读取荧光(激发：360/40nm；发射：460/40nm)。

实施例6

Aβ40和Aβ42标准曲线的制备

对于Aβ40标准曲线的制备，人Aβ40的冻干样品重配成10μg/mL。从储备溶液，制备含有下列浓度的样品(以pg/mL计)：25,000pg/ml、2,500pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、6.25pg/ml、3.125pg/ml、1.56pg/ml、0.78pg/ml。在1mM蛋白酶抑制剂AEBSF的存在下制备样品。然后根据前面实施例中定义的方法处理样品。

对于Aβ42标准曲线的制备，人Aβ42的冻干样品重配成10μg/mL。从储备溶液，制备含有下列浓度的样品(以pg/mL计)：25,000pg/ml、2,500pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、6.25pg/ml、3.125pg/ml、1.56pg/ml、0.78pg/ml。在1mM蛋白酶抑制剂AEBSF的存在下制备样品。然后根据前面实施例中定义的方法处理样品。

实施例7

统计学分析

来自16个随机选择样品的测量值的实验室间再现性通过一致性相关系数(CCC)来评估，CCC通过测量从45度线通过原点(索引线)的变化评价来自同一样品的三个读数之间的一致性，即我们自己的读数和由两个外部实验室报告的读数²⁷。在不同天数获得的同一个体的样品彼此相似的程度(受试者自身再现性)通过组内相关系数(ICC)来评估。这些相关系数所估计的一致性程度被描述为差(0.21至0.40)，中等(0.41至0.60)，大(0.61致0.80)和近乎完美(0.81至1.00)。不同诊断组中的Aβ水平使用Mann-Whitney U-检验进行比较。使用Spearman分析来评价连续变量间的相关性。对于零假设的拒绝，要求p＜0.05。所有统计学分析，包括诊断准确度的量度，采用SAS 9.1软件进行。图1-3中的图标采用PASW统计软件生成。

下列的β-淀粉样肽标志物的有效性和可靠性指标作为具有AD、MCI和HC的患者之间的筛选测试进行评价。

对于指示和确定的每种标志物，进行下面规定的分析，将参与者分为健康对照-AD、健康对照-MCI和MCI-AD：

表3：AD患者相对于健康对照的分类(TP：真阳性；FP：假阳性；TN：真阴性；FN：假阴性)

表4：MCI患者相对于健康对照的分类(TP：真阳性；FP：假阳性；TN：真阴性；FN：假阴性)

表5：AD患者相对于MCI患者的分类(TP：真阳性；FP：假阳性；TN：真阴性；FN：假阴性).

有效性：

灵敏度：其是正确分类有病个体的概率，即，对测试中的有病受试者获得阳性结果的概率。因此，灵敏度是测试检测疾病的能力。

特异性：其是正确分类健康个体的概率，即，对健康受试者获得阴性结果的概率。换句话说，特异性可以被设计为检测健康人的能力。

可靠性：

阳性预测值：其是如果在测试中获得阳性结果，患有疾病的概率。因此阳性预测值可以由测试中具有阳性结果的患者最终有病的比例来估计：

PPV = \frac{TN}{TN + FP}

阴性预测值：其是测试中具有阴性结果的受试者事实上是健康的概率。其通过用真阴性数目除以测试中具有阴性结果的患者总数来估计：

NPV = \frac{TN}{TN + FN}

除了灵敏度、特异性和预测值的概念以外，还考虑似然比、概率比或比值比。后者根据疾病的存在与否测量特定(阳性或阴性)结果哪个更可能。

阳性似然比或阳性比值比：其通过有病患者中阳性结果的概率除以健康个体中阳性结果的概率来计算。简言之，其是真阳性的分数(灵敏度)和假阳性的分数(1-特异性)之间的比率：

阴性似然比或阴性比值比：其通过在存在疾病时阴性结果的概率除以在没有疾病时阴性结果的概率来计算。因此其计算为假阴性的分数(1-灵敏度)和真阴性的分数(特异性)之间的比率：

ROC曲线借助于图表来呈现，并且具有95％CI的ROC曲线下面积、根据(有病/健康)患者的参数的真正分类以及具有95％CI的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值的值借助于表格来呈现。

所有统计学检验以0.05的显著性水平来进行。

实施例8

Aβ测量的实验室间再现性

任何参与者和抽取物的16个随机选择的样品送至两个外部实验室用于评价测量的实验室间再现性。所有标志物以相似的方式表现，CCC的范围为0.84至0.99(总95％IC为0.73至0.99，)，其对应于所有病例中大至近乎完美的一致性程度(图1)。

平均批内再现性(Average intra-assay reproducibility)，表示为三个孔的变异系数，对于每个实验室中6个标志物为4.31、5.83和8.34(表6)。在三个实验室中测定的检测限对Aβ1-40为5.β1、3.63和1.91pg/ml，对Aβ1-42为2.37、2.04和2.45pg/ml。

表6.批内再现性。

CV：对于每种标志物三个孔的变异系数。

实施例9

Aβ测量的个体内再现性(intra-individual reproducibilitv)

随着4次每周一次的血液采集(BS1-BS4)，如由ICC测量，对于三组中的所有直接标志物，Aβ测量的再现性为大至近乎完美(表7)。对于三个诊断组平均起来，较高的ICC对应于DP中Aβ1-40和Aβ1-42的测量值(分别为，0.93，95％CI＝0.98-0.80以及0.93，95％CI＝0.98-0.78；)。

表7.个体内再现性

将4次抽取物彼此比较后的平均ICC值。所有相关性均具有统计学显著性。最大和最小是指95％置信区间。

实施例10

诊断组间的比较

与测量值的高受试者自身再现性(intra-subject reproducibility)一致，在不同天数采集的4个血样(BS1至BS4)中参与者组间的比较遵循相同的模式，尽管一些p值从一个BS至另一个稍有变化。下面的描述基于BS4的测量值。

第一个惊人的结果是对于任意的诊断组，在UP中测量的Aβ1-40和Aβ1-42的浓度仅分别为DP中水平的约1/3和1/4(表8)。

表8.在每组参与者中直接和计算标志物的水平

所有值均以pg/ml表示。H、M和A分别表示相对于HC、MCI和AD具有显著性(p＜0.05)。*表示p＜0.01。

其次，从血样的细胞级分直接测量到的CB肽水平与DP中测量到的水平相似。此外，当在UP、DP或CB中测量时，Aβ1-40和Aβ1-42的水平强烈相关(分别为r＝0.58、0.71和0.71；p＜0.001)。在样品中直接测定的6个标志物的任一对之间也发现了明显的相关性(UP、PD、CB中的Aβ1-40和Aβ1-42；表9)。

表9.变量之间的相关性。

对于每对变量的Spearman系数。***、**和*分别表示p＜0.001、0.01和0.05。

此外，我们发现相对于健康对照组，每种标志物的水平在MCI和AD患者中均增加(图2，表8)。对于三种Aβ1-40标志物(UP、DP和CB分别增加了2.9、2.2和1.8倍)和对于两种Aβ1-42血浆标志物(UP和DP分别增加3.1和1.8倍)，这些增加在MCI和DC组之间达到了统计学显著性。在AD组中每种标志物的平均水平与在MCI组中的其平均水平非常相似，并且在这两组患者之间没有出现显著的差异。同样，在AD和HC组之间没有发现统计学差异，例外是Aβ1-42的CB水平(图2)。这种缺少显著性最有可能是由于AD组(n＝16)内个体测量值的范围大造成的，其显示对于每种标志物，CV比MCI组(n＝8)大1.5至2.7倍，比HC组(n＝16)大2.5至5.7倍(表8)。

Aβ1-40和Aβ1-42血浆标志物(UP和DP)两者但不是CB，与MMSE显著相关(表9)，尽管其可能被部分高估，因为HC朝向较高的标点聚类。事实上，排除MMSE≥26的参与者，在严重受累的患者(MMSE≤21，n＝5)中Aβ1-40和Aβ1-42的水平低于中度受累者(MMSE 22-25，n＝12)，尽管差异没有达到统计学显著性(数据未显示)。另外，发现三种Aβ1-42标志物但没有Aβ1-40，与右侧和左侧半球中颞叶内侧萎缩程度显著相关(表9)。

我们也考虑了由样品中直接测定的那些计算的几种标志物。除了通常的Aβ1-42/Aβ1-40比率以外，最令人感兴趣的是DP加CB Aβ1-40的总和和DP加CB Aβ1-42的总和，我们分别称它们为总Aβ1-40(T40)和总Aβ1-42(T42)，以及这两者的组合，我们称之为总βAPB(T-βAPB)。在UP、DP或CB中测量的Aβ1-42/Aβ1-40比率没有显示组间的显著差异。然而，相对于健康对照组，在MCI组中T40、T42和T-βAPB分别增加2.0、1.5和1.8倍(p≤0.03)(表4)。在HC和AD患者之间发现了类似的平均增加，但在此情况下，仅T42达到了统计学显著性(图2)。

实施例11

直接标志物和计算标志物的诊断特性

使用前面实施例中定义的方法确定表10中提及的直接参数和计算参数。

表10：在研究期间进行分析的直接参数和计算参数的列表。

上述参数的预测值被测试用于

(i)诊断阿尔茨海默病(通过将来自健康患者的样品与来自阿尔茨海默病患者的样品进行比较，AD/HC)，

(ii)诊断轻度认知损害和阿尔茨海默病之前的阶段(通过将来自健康患者的样品与来自轻度认知损害患者的样品进行比较，MCI/HC)和

(iii)区分轻度认知损害与阿尔茨海默病(通过将来自轻度认知损害患者的样品与来自阿尔茨海默病患者的样品进行比较，MCI/AD)。

测定的诊断特性通过Aβ测量值的逻辑分析和被认为是金标准的临床诊断来评估。关于灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、准确度和接受者工作特征(Receiver Operating Characteristic)(ROC)曲线下面积的结果概述在表11中。

表11.直接标志物和计算βAPB标志物的诊断特性

灰色高亮的是满足标准的结果，其被认为作为标题中的数字是合适的。PPV：阳性预测值.NPV：阴性预测值.ROC：接受者工作特征曲线下面积。

大多数直接标志物和两种计算标志物(T40和T-βAPB)满足被认为适合于区分MCI患者和HC患者的标准，这是最令人感兴趣的，因为从任何实际的角度来看，其正是诊断应当被改进的地方。因此，所有直接标志物，除了CB Aβ1-42以外，显示ROC≥0.8，并且它们中的4种(DP Aβ1-40、CB Aβ1-40、UP Aβ1-42和DP Aβ1-42)达到了＞80％的准确度，这意味着当与临床金标准相比时80％的测试是正确的(图3)。与直接标志物相比，计算的T40和T-βAPB同样准确地区分MCI和HC，而T42似乎可靠稍差(图3)。由于在AD组内Aβ测量值从一个个体到另一个个体存在极大可变性，因此不存在任何割点(cutting point)，在该割点处这些标志物以可接受的灵敏度和特异性将AD患者与其他两组参与者区分开(图3)。

实施例12

显示最高灵敏度和特异性并且适合用于本发明中的其他参数包括表12中显示的那些。

表12：显示较好的灵敏度、特异性和准确度水平的方法的概述。最优选的方法以黑背景上的白色字符给出。第二好的方法使用浅灰色背景显示。

提供的方法特别地可用于使用1ab40标志物(图4)、2ab40标志物(图5)、3ab40标志物(图6)、1ab42标志物(图7)、2ab42标志物(图8)、3ab42标志物(图9和10)、2ab40+3ab40标志物(图11)、2ab42+3ab42标志物(图12)、2ab42+3ab42(图13)和2ab40+3ab40+2ab42+3ab42(图14)从健康患者中检测轻度认知损害。

Claims

1.用于确定一种或多种参数的试剂在制造用于诊断受试者中的阿尔茨海默病或检测受试者中轻度认知损害的药物中的用途，其中所述一种或多种参数选自以下：

(b)所述受试者的生物样品中一种或多种游离的β-淀粉样肽和与所述生物样品中存在的大分子成分缔合的一种或多种所述β-淀粉样肽的合计水平，其中所述合计水平通过在将所述样品与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述β-淀粉样肽与所述生物样品中存在的成分解离的条件下接触后定量所述样品的无细胞级分中所述一种或多种β-淀粉样肽的量来确定，和

其中当参数(b)或(c)中的至少一个的值或由参数(a)至(c)中的至少两个算术组合产生的计算参数的值相对于参比样品中对应于所述参数(b)或(c)或所述计算参数的值的参比值存在改变时，阿尔茨海默病得以诊断或轻度认知损害得以检测；

并且其中所述生物样品是血浆或血液，其中所述参数的值或所述计算参数的值相对于所述参比值的改变是增加，

并且其中确定的参数是选自下列的一个或多个参数：

2ab40,对应于所述受试者的生物样品中游离ABETA40肽和与所述生物样品的大分子成分缔合的ABETA40肽的合计水平，其中通过在将所述样品与蛋白增溶剂在足以促进ABETA40肽与所述生物样品中存在的所述成分解离的条件下接触后定量所述样品中的ABETA40肽的量来确定2ab40,

2ab42,对应于所述受试者的生物样品中的游离ABETA42肽和与所述生物样品的大分子成分缔合的ABETA42肽的合计水平,其中通过在将所述样品与蛋白增溶剂在足以促进ABETA42肽与所述生物样品中存在的所述成分解离的条件下接触后定量所述样品中的ABETA42肽的量来确定2ab42,

3ab40,对应于与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的ABETA40肽的水平,其中通过在将所述生物样品的细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进β-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触后定量ABETA40肽的量来确定3ab40，和

3ab42,对应于与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的ABETA42肽的水平,其中通过在将所述生物样品的细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进β-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触后定量ABETA42肽的量来确定3ab42，

并且其中所述计算参数选自下组：2ab40+3ab40、2ab42+3ab42和2ab40+3ab40+2ab42+3ab42，

其中

(i)选自3ab42的参数的值或选自2ab42+3ab42的计算参数的值被比较，用于进行对阿尔茨海默病的诊断，或

(ii)选自由2ab40、3ab40、2ab42和3ab42组成的组的参数的值或选自由2ab40+3ab40、2ab42+3ab42、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42组成的组的计算参数的值被比较，用于进行对轻度认知损害的检测。

2.权利要求1所述的用途，其中所述蛋白增溶剂是洗涤剂。

3.权利要求2所述的用途，其中所述洗涤剂是Tween 20。

4.权利要求1至3中任一项所述的用途，其中2ab40、2ab42、3ab40和3ab42中的至少一种或多种的确定通过免疫学方法来进行。

5.权利要求4所述的用途，其中所述免疫学方法是ELISA测定。

6.权利要求5所述的用途，其中所述ELISA测定是ELISA夹心测定。

7.权利要求6所述的用途，其中所述ELISA夹心测定中的捕获抗体是针对β-淀粉样肽的N-末端区的抗体。

8.权利要求7所述的用途，其中所述针对所述β-淀粉样肽的N-末端区的抗体针对位于ABETA40和ABETA42的氨基酸1至7内的表位。

9.权利要求6至8中任一项所述的用途，其中所述ELISA夹心测定中的检测抗体是对位于β-淀粉样肽的C-末端区中的表位特异的抗体。

10.权利要求9所述的用途，其中对所述β-淀粉样肽的C-末端区特异的抗体选自下列：

(i)针对对应于ABETA42肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，其特异性地结合ABETA42，但与ABETA40不产生任何实质性的交叉反应,

11.权利要求9所述的用途，其中使用对所述检测抗体显示亲和性的试剂进一步检测所述检测抗体，所述试剂与结合对的第一成员偶联。

12.权利要求10所述的用途，其中使用对所述检测抗体显示亲和性的试剂进一步检测所述检测抗体，所述试剂与结合对的第一成员偶联。

13.权利要求11所述的用途，其中使用与可检测标记偶联的结合对的第二成员进行所述检测。

14.权利要求12所述的用途，其中使用与可检测标记偶联的结合对的第二成员进行所述检测。