JP2018522891A - 凝集ペプチドを標的とする外傷性脳損傷の治療方法 - Google Patents

Abstract

【課題】凝集ペプチドを標的とする外傷性脳損傷の治療方法を提供する。
【解決手段】個人における外傷性脳損傷を予防、軽減又は治療する方法は、脳内の１種以上のペプチドの１種以上の凝集形態の量を減少することが可能な薬剤の、治療効果があり且つ生理的に許容できる量を前記個人に投与することを含む。脳内の１種以上のペプチドの１種以上の凝集形態の量を減少することが可能な薬剤は、外傷性脳損傷の予防、軽減又は治療における使用のために好適である。
外傷性脳損傷後の合併症の個人のリスクの予測方法は、前記個人の脳内における、外傷性脳損傷事象の結果として凝集する傾向がある１種以上のペプチドの１種以上の凝集形態を検出することを含み、ここで、脳におけるこのような凝集体のレベルの増加は、合併症のリスクの増大を示す。
【選択図】図１Ａ

Description

発明の分野
本発明は、外傷性脳損傷の予防、軽減、治療及び診断に関する。

発明の背景
例えば、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、低酸素症及び脳卒中を含む一群の一般的な障害を包含する、虚血性又は出血性の急性脳損傷は、重篤な病理学的結果をもたらす。ＴＢＩは、１５歳から３０歳の間の人における死亡及び障害の最も一般的な原因である。最も重篤な傷害は、結果として長期にわたる意識消失の障害をもたらし得る。重度のＴＢＩを有する患者の１０ないし１５％が植物状態の救急治療から解放される（Ｌｅｖｉｎ等、１９９１年 Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ；４８巻：５８０−５頁）。デンマーク、スウェーデン、フィンランド、ポルトガル、ドイツからの、そして、ノルウェー、スウェーデン、イタリア、スイス、スペイン、デンマーク、アイルランド、イギリス及びフランス内の地域からの国民調査の知見を伴う２３のヨーロッパの報告は、入院の総計と致命的なＴＢＩ発生率の合計が１００，０００当り約２３５であると報告した（Ｔａｇｌｉａｆｅｒｒｉ等、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ（ウィーン）２００６年；１４８巻：２５５−６８頁）。この研究において、１０万人当たり約１５人の平均死亡率が報告された。

外傷性脳損傷の病因の不完全な理解は、事象の厳密な時系列の構築を可能にしない。最も頻繁に提案される細胞機構は、びまん性軸索損傷であるが、それは、幾つかの生理学的過程における変化に関連する。変化したプロテオスタシスは、異なるタンパク質凝集が組織病理学的レベルでしばしば見られるため、最も明確なものの1つである。興味深いことに、両方の状態で同一のタンパク質が凝集するため、傷害に起因する特発性神経変性と神経変性の経路の間には重複が存在する。

Ａβ斑及び軸索内Ａβ沈着物の形態におけるアミロイドβ（Ａβ）は、既存の臨床的認知症又は認知障害の症状を有さない致死的ＴＢＩを有する患者の３分の１に見出されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ等、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．１９９４年；５７巻：４１９−２５頁）。早くも重度の脳傷害の２時間後には、生存者の３０％の脳において、可溶性Ａβペプチドの増加したレベル及びアミロイド斑の沈着が、年齢にかかわらず明確となる（Ｉｋｏｎｏｍｏｖｉｃ等、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ２００４年；１９０巻：１９２−２０３頁）。

集中治療室において、脳内微量透析は、神経外科手術後に患者を監視するために日常的に使用されている。脳微小透析は、急性脳損傷後の二次的傷害の早期警告徴候を提供し得る代謝劣化の早期兆候を検出するために、幾つかある用途の中で特に臨床的に使用されている。微小透析カテーテルは、同時に、Ａβのレベルを測定するために使用されている。患者の神経学的状態が改善したとき、Ａβの脳間質液のレベルは増加した。患者が臨床的に安定していれば、Ａβレベルは安定したままであった（Ｍａｇｎｏｎｉ等、Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１０年；６７巻：１０６８−７３頁）。同様に、患者の神経学的状態が悪化すると、Ａβ濃度が低下することも示された。脳内のＡβの間質液のレベルもまた代謝変化に関連していた：Ａβの低い間質液のレベルは、高い脳の乳酸−ピルビン酸比率及び低い脳血糖値に関連していた。

幾つかの他のタンパク質と同様に、Ａβは自己会合する能力を有し、より大きな可溶性オリゴマーであるプロトフィブリル（ｐｒｏｔｆｉｂｒｉｌｓ）、線維（フィブリル）の
不溶性凝集体を含む様々なサイズのダイマーからオリゴマーの範囲の異なる集合（ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）を形成することができる。脳内のアミロイド斑におけるＡβ線維の形成及び蓄積は、以前は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病と関連付けられていた。しかし、最近のデータは、脳の生化学的分析が、非線維性形態のＡβの濃度がシナプスの喪失及び認知症の存在と良好に相関することを示しているため、非線維性及び可溶性の毒性種のＡβのための、より重要な役割を示唆している。

従って、可溶性並びに不溶性種を含む、Ａβ種の１種以上を標的とする治療剤に基づいて、アルツハイマー病の治療法の開発に相当な努力が注がれてきた。殆どの場合、提案された治療剤は、標的モノマー及び／又は様々な可溶性凝集体並びに不溶性の凝集体形態に特異性が低い。従って、様々な程度の特異性を有する様々なＡβ形態を標的とする広範囲の抗体が、長年にわたり文献に開示されている。

国際公開第０２／０３９１１号パンフレットには、ある種の神経変性疾患、特にアルツハイマー病の発症において特に重要であるＡβプロトフィブリルが記載され、そして、国際公開第０５／１２３７７５号パンフレット及び国際公開第０７／１０８７５６号パンフレット中に開示されたようにして、Ａβプロトフィブリルに対して高い親和性及び選択性を有する抗体が生産された。そのような抗体は現在、アルツハイマー病の治療のための臨床試験中である。

国際公開第０２／０３９１１号パンフレット 国際公開第０５／１２３７７５号パンフレット 国際公開第０７／１０８７５６号パンフレット

Ｌｅｖｉｎ等、１９９１年 Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ；４８巻：５８０−５頁 Ｔａｇｌｉａｆｅｒｒｉ等、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ（ウィーン）２００６年；１４８巻：２５５−６８頁 Ｒｏｂｅｒｔｓ等。 Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．１９９４年；５７巻：４１９−２５頁 Ｉｋｏｎｏｍｏｖｉｃ等、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ２００４年；１９０巻：１９２−２０３頁 Ｍａｇｎｏｎｉ等、Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１０年；６７巻：１０６８−７３頁

１実施形態において、本発明は、個人における外傷性脳損傷を予防、軽減又は治療する方法に関する。この方法は、個人に、脳内の１種以上のペプチドの１種以上の凝集形態の量を減少することが可能な薬剤の治療効果があり且つ生理的に許容できる量を投与することを含む。

別の実施形態において、本発明は、外傷性脳損傷の予防、軽減又は治療に使用するための、脳内の１種以上のペプチドの１種以上の凝集形態の量を減少することが可能な薬剤に関する。

別の実施形態において、本発明は、個人の脳内における外傷性脳損傷事象の結果として凝集する傾向がある１種以上のペプチドの１種以上の凝集形態を検出することを含む、外
傷性脳損傷後の合併症の個人のリスクを予測する方法に関するものであり、ここで、脳内におけるそのような凝集体の増加したレベルは、合併症の増加したリスクを示す。

本発明の更なる実施形態、観点及び利点は、詳細な説明を考慮して明らかとなる。

及び 図１Ａ及び１Ｂは、実施例中に記載のプロトフィブリル及びオリゴマーＡβの結合を示す。図１Ａは、ｍＡｂ１５８サンドイッチＥＬＩＳＡで検出された患者サンプルにおけるプロトフィブリルＡβレベルを示す。各バーは、２つの異なる場合において実施された２つのＥＬＩＳＡ実験からの平均値及び標準偏差（ＳＤ）を表す。図１Ｂは、ｍＡｂ８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡで検出された患者サンプルにおけるオリゴマーＡβレベルを示す。各バーは、２つの異なる場合において実施された２つのＥＬＩＳＡ実験からの平均値及びＳＤを表す。バーの不存在は、その値が検出のアッセイ限界未満であったことを示す。 及び 図２Ａ及び２Ｂは、実施例に記載されているモノマー性のＡβ４０及び４２の結合を示す。図２Ａは、中間領域ｍＡｂ４Ｇ８によって検出された合計のモノマー性のＡβｘ−４０及びｘ−４２のレベル（それぞれ、少なくともアミノ酸４０及び４２が存在する、Ｎ−末端切断及び全長モノマー）を示す。各バーは、２つの異なる場合において実施された２つのＥＬＩＳＡ実験からの平均値及びＳＤを表す。アルツハイマー病（ＡＤ）サンプルパネルの値のうちの６つは、規格外であるが、総タンパク質１ｍｇ当たり一定の数千ｐｇとして示されている。図２Ｂは、Ｎ末端ｍＡｂ６Ｅ１０によって検出された全長モノマー性のＡβ１−４０及び１−４２のレベルを示す。各バーは、二重ＥＬＩＳＡのウェルの間の変化を示すＳＤを用いた１つのＥＬＩＳＡ実験からの平均値を表す。ＡＤサンプルパネルからの４つの値は、規格外であり、上記の各バーの代わりに総タンパク質１ｍｇ当たり一定の数千ｐｇとして示されている。殆どのサンプルにおいて、Ａβ３８（少なくともアミノ酸ｘ−３８が存在するＡβペプチド）のレベルは検出未満であった（データは示さず）。

脳内の特定のペプチドは、急性脳損傷の結果として凝集する傾向のあるものとして同定されている。形成された凝集体、特に毒性のある凝集体は、急性期において最も頻繁に生じる、生命機能に対する損傷に深刻な寄与をもたらす。これらのペプチドの前駆体、ペプチド自体、又はそれらの凝集形態を標的とする、急性治療及び診断のための方法及び手段が、本発明に従って提供される。従って、脳内の凝集体の量を排除するか又は実質的に減少させるという目標に到達するために、治療のための幾つかの可能性が利用可能である。特に、実施形態において、本発明の方法及び薬剤は、アミロイド−β（Ａβ）、α−シヌクレイン及び／又はタウペプチド及び／又はタウペプチド誘導体、例えば、Ｐ−タウ、及び／又はプロトフィブリルのようなペプチドのオリゴマー形態を標的とする。本願の開示内において、プロトフィブリルは、より大きな可溶性オリゴマーを指す。特定の実施形態において、プロトフィブリルは、１００ｋＤａを超える見かけの分子量を有する。より特定の実施形態において、プロトフィブリルは、１００ｋＤａを超える見かけの分子量、及び、直径が４−１１ｎｍで長さが２００ｎｍ未満の曲線構造を有する。このようなプロトフィブリルは、例えば、Ｗａｌｓｈ等、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７２巻（３５号）：２２３６４−２２３７２頁（１９９７年）及びＷａｌｓｈ等、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７４巻（３６号）：２５９４５−２５９５２頁（１９９９年）に記載されているが、それらの両方は参照としてここに組み込まれる。より特定の実施形態において、本発明の方法及び薬剤は、神経毒性Ａβプロトフィブリルを標的とする。本発明の
特定の実施形態に従って、外傷性脳損傷の予防、軽減、治療及び／又は診断が、そのようなペプチドを含む１種以上の種に対する抗体の使用によって達成される。本明細書において、ペプチド（類）という用語が使用されるが、一方、科学文献はそれらをタンパク質（類）と呼ぶことがある。

本発明に従って、脳内の特定の標的ペプチドの凝集形態の排除又は少なくとも実質的な減少は、新しい医学的症状、即ち、急性脳損傷事象を伴う状況における効率的な治療を提供する。脳内におけるこれらの標的ペプチドは、急性脳損傷事象に応答して凝集体を形成することにより特徴付けられる。これらの条件下で凝集する傾向にあるペプチドの群は、アミロイドペプチド、特に、Ａβペプチド、α−シヌクレイン及びタウペプチドを含む。本発明は、主に、急性脳損傷事象の結果として凝集する傾向がある脳内のペプチドの群の１つのメンバーであるアミロイドペプチド、Ａβを用いる例示により、以下において説明される。しかしながら、本発明は同様に、急性脳損傷事象の結果として、類似の方法において凝集する傾向のある他のペプチドも包含する。排除又は実質的な減少は、幾つかの異なる方法で得ることができる。通常、ペプチド、例えば、Ａβは、インビボで発現される受容体の一部であり、例えば、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）であり、そして、１種以上の酵素で切断される。Ａβの産生をもたらすことにより、例えば、ＡＰＰの発現レベル又は切断レベルにおいて、凝集反応を受けることができる種の数が減少する。Ａβ系におけるこれらのプロセスに影響を及ぼす物質は、例えば、α−セクレターゼアゴニスト、β−セクレターゼ及びγ−セクレターゼのアンタゴニストである。また、Ａβペプチドの減少はまた、Ａβ分解酵素の刺激によっても、例えば、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）、ネプリライシン等によっても、達成され得る。

ペプチドの凝集形態の排除又は少なくとも実質的な減少は、凝集プロセス自体を阻害する、即ち、ペプチドモノマーを、ほぼ凝集が起こりにくくするか、又は、低分子量凝集体が更なる凝集を受けて、最もありそうなより大きな毒性の凝集体、特にプロトフィブリル、即ち、より大きな可溶性オリゴマーとなることを防止する、物質によっても達成され得る。例えば、このことは、ペプチドモノマー及び／又は低分子量凝集体に結合する物質を投与して、それらが更に凝集することを防止することにより達成され得る。当然のことながら、凝集形態の排除はまた、系からの種の排除のために、例えばアミノ酸及び／又はモノマー又はより毒性の低い小さな凝集体に崩壊することにより、そのような凝集形態の１つ以上を標的とする物質を投与することによっても達成され得る。特に重要なものは、凝集した形態のＡβ、α−シヌクレイン又はタウペプチドに対して高い親和性を有するように設計された抗体の使用である。特定の実施形態において、本発明は、特に、プロトフィブリル、例えば、Ａβ、α−シヌクレイン又はタウペプチドのプロトフィブリルに対して高い親和性を有するように設計された抗体の使用に関する。本発明の更なる観点に従って、有毒なオリゴマー形態又はプロトフィブリル形態は、ミクログリア細胞による抗体媒介性の取り込みによって排除され得る。本発明の更なる観点に従って、オリゴマー形態、特にプロトフィブリルの毒性は、例えば、プロトフィブリル上の毒性部位を破壊又は遮断する物質の投与により低下する。

従って、一実施形態において、外傷性脳損傷を予防、軽減及び／又は治療する方法は、例えば、急性脳損傷後に凝集する傾向のあるペプチド又はそれらの凝集形態に対する特異的な抗体を伴って、個人にペプチドの１種以上の凝集形態の量を減少させるための薬剤の有効量を投与することを含む。本発明の特定の実施形態において、Ａβ又はＡβの凝集形態に対する抗体は、覚醒及び／又は行動反応性を増強するために、長期の意識消失の障害を回避するために及び／又は回復のペースを変えるか又は機能的転帰を改善するために、ペプチドの１種以上の凝集形態の量を減少させるために使用される。目標は、覚醒状態、意識的な意識回復、植物状態の回避及び／又は認知の改善である。
特定の実施形態において、抗体は、静脈内注入、静脈内又は皮下注射として急性期中に最
初に投与されるか、又は脳室又は髄腔内に直接送達される。
回復を更に改善するために、投与は入院患者の神経リハビリテーション中に延長して使用し得る。

急性脳損傷事象の後に凝集する傾向のあるペプチドであって、その、モノマー、オリゴマー及びプロトフィブリルの形態が本発明に従う方法の標的であるペプチドが、例えば、産生に関連する“不完全な”開裂反応の結果として、又は、ある段階における様々な酵素の作用の結果として、種々の長さで生じ得ることが知られている。再度、Ａβ系からの実施例を伴って、全長ペプチドであるＡβペプチドは、殆どの場合、１−３９，１−４０，１−４１，１−４２及び１−４３である。しかし、ペプチドの一方又は両方の末端（Ｎ末端及び／又はＣ末端）における切断は、まれではなく、１−２８，３−４０／４２，１−４０／４２，１７−４０／４２及び２４−３５は、インビボ系において生じ得る種々の長さを有するＡβペプチドのほんの幾つかの例である。同様に、切断されたペプチドは、上記のオリゴマー、プロトフィブリル及び線維形態に凝集し得るが、これは、Ａβのインビボで凝集した形態が、全長及び切断された形態の種々の組み合わせ及び量を含み得ることを意味する。プロトフィブリルを含む切断されたＡβの凝集形態もまた、本方法の標的である。そのような切断されたプロトフィブリルに対する抗体は、国際公開第０５／１２３７７５号パンフレット及び国際公開第２０１１／００１３６６号パンフレット中に開示されているが、それらは、その全体が参照としてここに組み込まれ、そして、本方法における使用のために好適である。

凝集する傾向のあるペプチドの更なる変種は、ペプチド配列中のアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸と交換された、突然変異形態を含み得る。フラマン（Ａ２１Ｇ）、北極（Ｅ２２Ｇ）、オランダ（Ｅ２２Ｑ）、イタリア（Ｅ２２Ｋ）及びアイオワ（Ｄ２３Ｎ）の突然変異はよく知られており、特徴付けられている。特に、北極の突然変異は、かなり安定で有毒なＡβプロトフィブリルを容易に形成するため、凝集に関して重要であることが判明している。そのプロトフィブリルを含む、このような突然変異体の凝集形態に対する抗体もまた、本方法における使用のために好適である。

脳における別のペプチドはα−シヌクレインであるが、これもまた、特定の条件下で凝集して種々のオリゴマー形態、プロトフィブリル及び線維を与える。このペプチド及びその凝集形態は、パーキンソン病及びレビー小体を伴う認知症の発症に強く関連している。Ａβの場合と同様に、様々なα−シヌクレイン凝集種を標的とする治療法の開発に多大な努力が注がれている。α−シヌクレインのプロトフィブリルを標的とするいくつかの抗体が、国際公開第２０１１／１０４６９６号パンフレットに開示されているが、これは、その全体が参照としてここに組み込まれ、そして、本方法における使用のためにも好適である。

本発明の一観点に従って、急性脳損傷事象を患うか又は犠牲者であることが疑われる人が、これらのペプチド及び／又はこのようなペプチドから既に形成されている凝集体の１種以上を標的とする薬剤で治療されるところの方法が提供される。特定の実施形態において、可溶性及び／又は不溶性の凝集形態が標的とされる。薬剤は、脳内でその効果を発揮するように投与され、全身投与される場合には血液脳関門を貫通する必要がある。可能な投与は脳実質内へ直接なされる。

本発明の特定の実施形態において、薬剤はプロトフィブリルを標的とする抗体である。本発明のより特定の実施形態において、薬剤はＡβプロトフィブリルを標的とする抗体である。好適な薬物候補の例は、抗体の詳細な開示を提供する国際公開第０７／１０８７５６号パンフレット中で開示されたｍＡｂ１５８に基づくヒト化抗体であり、その全体が参照としてここに組み込まれる。

凝集する傾向のあるペプチド及び／又はその１種以上の凝集形態を標的とする抗体は、これらの種の１種以上に対して高い親和性を有するべきである。特定の実施形態において、抗体は、１種以上のプロトフィブリルに対して高い親和性を有する。高親和性は、１０^-7Ｍ未満、１０^-8Ｍ未満、１０^-9Ｍ未満、１０^-10Ｍ未満、又はアッセイ１０^-11ＭのＥＬＩＳＡ法のＩＣ ５０（アッセイシグナルの５０％を阻害するために必要な抗体の濃度）として規定される。より特定の実施形態において、１種以上のペプチド種に対する高親和性に加えて、抗体は、ＩｇＧクラス、例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラス又はその組み合わせ又はその突然変異体であり、高いＦｃ受容体結合及び低いＣ１（Ｃ１ｑ）結合の維持に加えて、標的ペプチド種のクリアランスにおいて有効であり、炎症の低減されたリスクを伴う。

個人における外傷性脳損傷の治療方法の一実施形態において、外傷性脳損傷事象の結果として凝集する傾向のあるペプチドの１種以上の凝集形態の量を個人の脳内において減少する薬剤の治療効果があり且つ生理的に許容できる量を、個人に投与することを含み、該凝集体の量は、対照と比較して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％減少する。１％の減少でさえ、有意な臨床的利点を有し得る。

外傷性脳損傷事象から本発明に従う治療までの時間範囲は可能な限り短くすべきであると考えられる。このことは、病院の救急センターに到達する外傷性脳損傷が疑われる患者は、本発明に従って直ちに、そして、少なくとも、外傷性脳損傷事象によって引き起こされたペプチド凝集体の増加したレベルが存在する期間の間に、治療されるべきである。

脳内の可溶性Ａβプロトフィブリルの増加したレベルが、長年の後に認知症、特にアルツハイマー病を引き起こすと考えられている。この理由から、本発明はまた、認知症及びアルツハイマー病を引き起こし得る神経変性を減少させる薬剤によるＴＢＩの慢性／予防的治療にも関する。例えば、後にＴＢＩの合併症のリスクがある個人は、予防的治療の対象となり得る。

脳損傷事象の結果としての凝集体の形成は、もちろん、単独で又はこのタイプの脳疾患の伝統的な特徴と組み合わせて、診断的な又はおそらくはより正確な予測的な値である。外傷性の脳傷害事象後の脳内のこのタイプの凝集体の形成は、重篤な合併症のリスクを示す。リスクの診断／予測のために、１種以上のペプチド凝集体を標的とする標識物質、例えば標識抗体が注入され得、凝集体の局在化及び量は、例えば、ＰＥＴ又はＭＲＩ技術により測定され得る。例えば、蛍光、磁気、又は放射標識された抗体が使用され得る。さもなくば、体液サンプルの組織をインビトロ分析のために収集し得る。特に、１種以上の凝集形態、例えばプロトフィブリルに対する抗体は、このような方法において非常に重要である。

本発明の一観点において、個人における外傷性脳損傷を予防、軽減又は治療する方法であって、個人の脳内の１種以上のペプチドの１種以上の凝集形態の量を減少することが可能な薬剤の治療効果があり且つ生理的に許容できる量を該個人に投与することを含む方法が提供される。

この観点の一実施形態において、外傷性脳損傷は、急性脳損傷事象の結果である。この観点の一実施形態において、外傷性脳損傷は、物理的脳損傷事象の結果である。この観点の一実施形態において、外傷性脳損傷は、脳卒中又は低酸素症によって引き起こされる脳損傷の結果である。

この観点の一実施形態において、１種以上のペプチドは、Ａβペプチド、α−シヌクレ
インペプチド及びタウペプチドからなる群から選択される。

この観点の一実施形態において、１種以上の凝集形態のペプチドは、プロトフィブリルの形態にある凝集したＡβペプチドである。

この観点の一実施形態において、薬剤は抗体である。特定の実施形態において、抗体はＡβプロトフィブリルに結合する。

この観点の一実施形態において、外傷性脳損傷は、軽度の外傷性脳損傷である。この観点の一実施形態において、外傷性脳損傷は中程度の外傷性脳損傷である。この観点の一実施形態において、外傷性脳損傷は、重度の外傷性脳損傷である。

この観点の一実施形態において、個人は、アポリポタンパク質Ｅ４対立遺伝子のキャリアである。この観点の一実施形態において、個人はアポリポタンパク質Ｅ３／Ｅ４又はアポリポタンパク質Ｅ４／Ｅ４の遺伝子型である。

本発明の一観点において、外傷性脳損傷の予防、軽減又は治療に用いるための、脳内の１種以上のペプチドの１種以上の凝集形態の量を減少することが可能な薬剤が提供される。特定の実施形態において、この薬剤は、外傷性脳損傷の予防、軽減又は治療に使用するための医薬である。

この観点の一実施形態において、外傷性脳損傷は、急性脳損傷事象の結果である。この観点の一実施形態において、外傷性脳損傷は、物理的脳損傷事象の結果である。この観点の一実施形態において、外傷性脳損傷は、脳卒中又は低酸素症によって引き起こされる脳損傷の結果である。

この観点の一実施形態において、１種以上のペプチドは、Ａβペプチド、α−シヌクレインペプチド及びタウペプチドからなる群から選択される。

この観点の一実施形態において、１種以上の凝集形態のペプチドは、プロトフィブリルの形態にある凝集したＡβペプチドである。

この観点の一実施形態において、薬剤は抗体である。特定の実施形態において、抗体はＡβプロトフィブリルに結合する。

この観点の一実施形態において、前記外傷性脳損傷は、軽度の外傷性脳損傷である。この観点の一実施形態において、前記外傷性脳損傷は中程度の外傷性脳損傷である。この観点の一実施形態において、前記外傷性脳損傷は、重度の外傷性脳損傷である。

この観点の一実施形態において、使用のための前記薬剤は、アポリポタンパク質Ｅ４対立遺伝子のキャリアの個人のためのものである。この観点の一実施形態において、使用のための前記薬剤は、アポリポタンパク質Ｅ３／Ｅ４又はアポリポタンパク質Ｅ４／Ｅ４の遺伝子型である個人のためのものである。

本発明の一観点において、個人の脳内における、外傷性脳損傷事象の結果として凝集する傾向がある１種以上のペプチドの１種以上の凝集形態を検出することを含む、外傷性脳損傷後の合併症の個人のリスクの予測方法であって、脳内における、そのような凝集体の増加したレベルは、合併症の増加したリスクを示す、方法が提供される。

この観点の一実施形態において、１種以上のペプチドは、Ａβペプチド、α−シヌクレ
インペプチド及びタウペプチドからなる群から選択される。

この観点の一実施形態において、１種以上の凝集形態のペプチドは、プロトフィブリルの形態にある凝集したＡβペプチドである。

この観点の一実施形態において、１種以上の凝集形態のペプチドは、抗体で検出可能である。

この観点の一実施形態において、１種以上の凝集形態のペプチドは、Ａβプロトフィブリルに結合する抗体で検出可能である。

この観点の一実施形態において、本方法は、アポリポタンパク質の遺伝子型を決定することを更に含む。

以下の非限定的な例は、本発明の特定の観点を説明する。

実施例１
ヒトの死後の脳物質の使用は、ウプサラの地域倫理委員会（決定番号２００９／０８９）によって承認された。研究に関わるすべての被験者（又はその親族）から書面による同意が得られた。

この実施例は、１２人の重度のＴＢＩの被験者を研究した。ウプサラ脳バンクからの５つの死後のＡＤの側頭皮質脳サンプル（ＡＤ１（スウェーデン突然変異キャリア）、ＡＤ３、ＡＤ１０、ＡＤ１３、及びＡＤ１８）及び４つの神経学的に無傷の（Ｎ１）対照サンプル（ＵＢＢ１２、ＵＢＢ２３、ＵＢＢ２４及びＵＢＢ３１）及び正常圧の水頭症（ＮＰＨ）（ｎ＝４）を有する患者もまたこの研究に含めた。１２人の重度のＴＢＩの被験者の特徴を以下の表１に示す：
^*血液凝固障害
∧∧Ｃｃｘ前のＤＣ，再手術において実施
^**初回入院におけるａＳＤＨとＤＣのための初回手術、ＣＣＸ＋修正ＤＣ二次手術
^***ａＳＤＨのための初期手術、再手術におけるＣｃｘ

略語：

ＤＣ＝減圧性頭蓋切除術、Ｍ＝男性；Ｆ＝女性；Ｌ＝左；Ｒ＝右；Ｔ＝時間；Ｆ＝前頭葉、Ｐ＝頭頂葉、Ｃｃｘ＝皮質挫傷の除去；ＧＭＳ＝グラスゴー昏睡スケールの運動成分；ＳＰＲ＝スポーツ関連；ＭＶＡ＝自動車事故；ＨＢＯ＝物体と衝突；Ｔｈｉ＝胸部損傷；Ｅｆｘ＝四肢の骨折；Ｆｆｘ＝顔面骨折、ＧＯＳ＝グラスゴーアウトカムスケール；Ａβ＝β−アミロイド、ＡＡ＝アミロイド血管症；ＡＰＰ＝アミロイド前駆体タンパク質；ＡＳ＝軸索腫脹。
方法

製造業者に従って、プロテオプターインヒビターを添加した１：１０の質量：体積であるトリス緩衝生理食塩水（２０ｍＭトリス、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）中の生検物（ｂｉｏｐｓｉｓ）及び脳の試料を、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー（２×１０ストローク）を用いて、氷上でホモジナイズした（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、ロシュ）。該試料を、＋４℃で１時間１６０００×ｇで遠心分離し、上清をＴＢＳ抽出物として定義した。

Ａβ１−４２ペプチドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、カルフォルニア州、米国から購入した（バッチ＃１２０７７００６Ｔ）。凍結乾燥したペプチ
ドを１０ｍＭ ＮａＯＨに溶解して１００μＭとした。Ａβ１−４２ペプチドを、ｐＨ７．４の、０．３Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液中で５０μＭまで希釈することにより、Ａβ１−４２プロトフィブリルを調製した。該調製物を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、１６０００×ｇで５分間遠心分離して、潜在的な大きな凝集体をペレット化した。上清を、ｐＨ７．４の０．０５Ｍリン酸緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ中、０．０８ｍｌ／分の流速で、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）によりモノマーから更に精製し、プロトフィブリルを、以前に記載されたようにして、空隙中に回収した（Ｎｉｌｓｂｅｒｔｈ Ｃ等、（２００１年）Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ４巻、８８７−８９３頁；Ｗａｌｓｈ ＤＭ等、（１９９７年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２巻、２２３６４−２２３７２頁；Ｓｅｈｌｉｎ Ｄ等、（２０１２年）ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ７巻、ｅ３２０１４頁）。

総タンパク質含量の決定のために従来のアッセイを用いて、Ａβ−データ（ＢＣＡタンパク質アッセイキット、＃２３２２７、Ｐｉｅｒｃｅ）の標準化のためのデータセットを生成した。
Ａβプロトフィブリルのアッセイ

Ｅｎｇｌｕｎｄ Ｈ等（２００７年 Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ １０３巻、３３４−３４５頁）中において以前に記載されている、ｍＡｂ１５８サンドイッチＥＬＩＳＡは、Ａβモノマーからの干渉なしに、Ａβプロトフィブリルを特異的に検出する。プロトフィブリル選択性のモノクローナルマウス抗体ｍＡｂ１５８（ｌｇＧ２ａ、ＢｉｏＡｒｃｔｉｃ
Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、ストックホルム、スウェーデン）を２ｍｇ／ｍｌの濃度で滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中に処方したが、以前に特徴付けられている。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのｍＡｂ１５８で＋４℃において一晩被覆し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１時間ブロックした。ＴＢＳ抽出物を５倍に希釈し、振とう（６００ｒｐｍ）しながら２２℃で２時間２回インキュベートし、その後、ビオチン化ｍＡｂ１５８（０．５μｇ／ｍｌ）を添加し、プレートを更に１時間インキュベートした。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン １：５０００）を検出試薬として使用した（１時間のインキュベーション）。プレートをＴＭＢ基質で発色させ、２Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄の添加により２５分後に反応を停止させた。吸光度を４５０ ｎｍで測定し、４−パラメータ方程式を用いてＡβ４２プロトフィブリル標準曲線から試料濃度を計算した。データは、総タンパク質データセットと共に再計算され、各試料中の総タンパク質１ｍｇ当たりのｐｇプロトフィブリルとして提示された。
Ａβオリゴマー／プロトフィブリル（ＯＬ）のアッセイ

ｍＡｂ８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡは、Ａβモノマーに結合することなく、Ａβオリゴマー／プロトフィブリル（プロトフィブリルに対するダイマー）を検出する（Ｔｕｃｋｅｒ Ｓ等、（２０１５年） Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ
Ｄｉｓ．２０１５年； ４３巻（２号）：５７５−８８頁、追加の図４）。ｍＡｂ８２Ｅ１は、β−セクレターゼで切断されたＡβＰＰのＮ末端を検出する抗体である（ＩＢＬ、日本）。ここに記載したｍＡｂ８２Ｅ１サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、純粋なｍＡｂ８２Ｅ１を捕捉に使用し、検出のために同じビオチン化抗体を使用する。ｍＡｂ８２Ｅ１のためのサンドイッチＥＬＩＳＡプロトコルは、ＥＬＩＳＡプレートの被覆と検出の両方が０．２５μｇ／ｍｌのｍＡｂ８２Ｅ１の濃度で行われたことを除いて、上記のｍＡｂ１５８サンドイッチＥＬＩＳＡと本質的に同じであった。サンプル濃度は、４パラメータ方程式を用いて、Ａβ４２プロトフィブリル標準曲線から計算した。
データは、総タンパク質データセットと共に再計算され、各試料中の総タンパク質１ｍｇ当たりのｐｇオリゴマーとして提示された。
モノマーＡβ３８，４０及び４２

３種混合（３本組）のウェルフォーマットにおけるＡβ３８、Ａβ４０及びＡβ４２の完全長及び切断型の両方を測定する２つの異なる免疫測定キット（ｍＡｂ６Ｅ１０検出、カタログ番号 Ｋ１５２００Ｅ−２及びｍＡｂ４Ｇ８検出、カタログ番号 Ｋ１５１９９Ｅ−２）を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ロックビル、メリーランド州、米国）から入手した。ＴＢＳ抽出物を、１０倍希釈して２連のウェルに添加する前に、１％ＳＤＳ中で煮沸することによって変性及びモノマー化を受けさせた。同じ最終濃度のＳＤＳ（０．１％）をキット付属のＡβ標準液に添加し、この手順はアッセイを妨害しないことが示された（データは示されていない）。データを再計算し、各試料中の総タンパク質１ｍｇ当たりのｐｇのＡβとして提示した。
ＨＡＭＡ分析

ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）は、ナイーブ血清試料の１０〜２０％に見出され、サンドイッチＥＬＩＳＡ法において潜在的に抗体を架橋することができ、結果として偽陽性シグナルを生じる（Ｋｏｓｈｉｄａ等、２０１０年）。
ＨＡＭＡに対処するために、ｍＡｂ１５８及びｍＡｂ８２Ｅ１ ＥＬＩＳＡを、ＨＡＭＡ緩衝液（３６５ Ｊ２、Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）の存在下、無関係なマウスＩｇＧ（０１５−０００−００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ウエスト グローブ、ペンシルベニア州、米国）でＥＬＩＳＡプレートを塗布して行った。
アポリポタンパク質Ｅ遺伝子型決定

アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子型決定は、基本的に、Ｈｉｘｓｏｎ及びＶｅｒｎｉｅｒ（Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ １９９０年、３月；３１巻（３号）：５４５−８頁）に記載されているように、プライマー配列をわずかに改変して行った。市販のキット（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット、カタログ番号 ５１３０４）を用いて２５ｍｇの脳組織からゲノムＤＮＡを調製した。４０ｎｇのＤＮＡを、フォワードＡｐｏＥプライマー（ＡＧＡＣＧＣＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＡＧＣ）（配列番号：１）及びリバースＡｐｏＥプライマー（ＴＣＧＣＧＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＴＧＣ）（配列番号：２）を用い、５％ＤＭＳＯの添加を伴って、製造業者により記載されたようにＴａｑポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＢ０９０８）を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲサイクリングは、９５℃で１分間の変性、９５℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で１．５分間の伸長の３５ラウンドを完了した。２４４ｂｐのＰＣＲ産物を、製造業者に従って、制限酵素Ｈｈａ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０８１９８７０）を使用して切断し、消化された断片を高分解能４％ＭｅｔａＰｈｏｒ（登録商標）アガロースゲル（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号５０１８１）で分離した。
結果

外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、アルツハイマー病（ＡＤ）の確立された危険因子である。最近の証拠は、可溶性で神経毒性のＡβオリゴマー（ＯＬ）とプロトフィブリル（ＰＦ）が、認知障害と神経変性のより重要な原因であり得ることを示唆するものの、ＡＤ脳における特徴的な病理学的所見はアミロイド−β（Ａβ）の不溶性斑である。驚くべきことに、ＴＢＩ患者のサブセットにおいて、Ａβ斑は数時間以内に前もって観察されたが、重度のＴＢＩ後の数年間持続した。しかし、ＴＢＩにおける潜在的な神経毒性Ａβ ＯＬ及びＰＦの役割は確立されていない。

生死に関わる脳梗塞及び／又は頭蓋内圧上昇に起因して、記載された１２人の重度のＴＢＩ患者（平均４９．６歳、範囲１９〜７４）において、損傷後最初の週の間に外科的に切除された、脳組織中のＡβオリゴマー及びプロトフィブリル（ＯＬ）の存在を評価するために酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用した。ＡＤ患者からの死後の脳組
織（ｎ＝５）及び正常圧の水頭症を有する患者からの皮膚生検物（ｎ＝４）及び無関係の原因で死に至った神経学的に無傷の（ＮＩ）患者からの死後の脳組織（ｎ＝４）を対照として使用した。ＴＢＩ組織のサブセット（ｎ＝９）の免疫組織化学は、３／９のＴＢＩ患者においてＡβ斑を明らかにした。対照群と比較した場合、ＴＢＩ患者において、Αβ ＯＬ（中央値１２９（範囲２９〜３４２）対０（範囲０〜０）ｐｇ／ｍｇ総タンパク質、ｐ＜０．０１）及びＰＦ（中央値１７．５（範囲０〜６２６）対０（範囲０〜０）ｐｇ／ｍｇ総タンパク質、ｐ＜０．０１）のレベルが増加した。脳組織中のＡβ ＯＬ及びＰＦのレベルもまた、ＡＤ患者（中央値ＯＬ ２７、範囲０〜３９９、ｐ＝０．１６及びＰＦ
０、範囲０〜７８、ｐ＝０．３７）との比較において、ＴＢＩにおいて、より高かった（中央値ＯＬ １２９、範囲２９〜３４２及びＰＦ １７．５、範囲０〜６２６ｐｇ／ｍｇ総タンパク質）。Ａβ斑の免疫組織化学的証拠を有する患者は、Ａβ ＰＦの最も高いレベルを有していた。我々は、ヒトＴＢＩが、損傷した脳組織内において可溶性Ａβオリゴマー及びプロトフィブリルの迅速な蓄積を誘導すると結論する。可溶性Ａβ種の誘導は、二次的な脳損傷を悪化させ、ＴＢＩ後のＡＤのリスク増加に寄与し得る。

ＡｐｏＥ遺伝子型決定の結果を、以下の表２に示した。

ＰＣＲ増幅及びＨｈａ Ｉ制限は、同様の結果を有する３つの別個の実験において行われた。高Ａβプロトフィブリルレベルを有する１２人のＴＢＩ患者のうち４人（図１Ａ）は、Ｅ３／Ｅ４遺伝子型であると同定された。残りの８人の患者のうち、低いか又は検出不可能なＡβプロトフィブリルレベルを有する７人の患者は、Ｅ３／Ｅ３遺伝子型であり、低いか又は検出不可能なＡβプロトフィブリルレベルを有する１人の患者は、Ｅ２／Ｅ４遺伝子型である。

Ｅ３／Ｅ４遺伝子型は、ＡＤ群における最も一般的な遺伝子型であり、水頭症の対照の中で、４人の患者のうちの１人が、Ｅ３／Ｅ４遺伝子型を保有するが、一般集団において予想されるものと同様の頻度である（http://www.alzgene.org/meta.asp?genelD=83）。

データは、Ｅ３／Ｅ４遺伝子型を保有することと、外傷性脳損傷の直後に高いＡβプロトフィブリルレベルで応答することとの間の関連を示唆する。

ＨＡＭＡ緩衝液及び／又は無関係のマウスＩｇＧの塗布と並行して標準設定でｍＡｂ１５８及びｍＡｂ８２Ｅ１ ＥＬＩＳＡを行った結果は、観察が真実であり、アッセイにおけるＨＡＭＡ活性の結果ではないことを示唆した（データは示されていない）。この研究から、１２人のＴＢＩ患者のうちの４人（３３％）において、対照の脳と比較して、上昇したＡβプロトフィブリルレベルを測定することが可能であったと結論した。同じ４人のＴＢＩ患者において、対照の脳と比較して、高レベルの可溶性Ａβ４２レベルが検出された。１２人のＴＢＩ患者のうち１１人において、対照の脳と比較して、上昇したＡβオリゴマーレベルが測定された。可溶性Ａβ４２は、主にＮ−末端切断型である。

ここに記載された特定の実施例及び実施形態は、本質的に例示としてのみであり、特許請求の範囲によって規定される本発明を限定するものではない。更なる実施形態及び実施例、及びその利点は、本明細書の観点から当業者には明らかであり、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内である。

Claims (32)

1. 個人における外傷性脳損傷を予防、軽減又は治療する方法であって、脳内の１種以上のペプチドの１種以上の凝集形態の量を減少することが可能な薬剤の、治療効果があり且つ生理的に許容できる量を前記個人に投与することを含む方法。
2. 前記外傷性脳損傷は、急性脳損傷事象の結果である請求項１記載の方法。
3. 前記外傷性脳損傷は、物理的脳損傷事象の結果である請求項１記載の方法。
4. 前記外傷性脳損傷は、脳卒中又は低酸素症により引き起こされる脳損傷の結果である請求項１記載の方法。
5. 前記１種以上のペプチドは、Ａβペプチド、α−シヌクレインペプチド及びタウペプチドからなる群より選択される請求項１乃至請求項４の何れか１項に記載の方法。
6. 前記ペプチドの１種以上の凝集形態は、プロトフィブリルの形態にある凝集したＡβペプチドである請求項１乃至請求項４の何れか１項に記載の方法。
7. 前記薬剤は、抗体である請求項１乃至請求項６の何れか１項に記載の方法。
8. 前記抗体は、Ａβプロトフィブリルに結合する請求項７記載の方法。
9. 前記外傷性脳損傷は、軽度の外傷性脳損傷である請求項１乃至請求項８の何れか１項に記載の方法。
10. 前記外傷性脳損傷は、中程度の外傷性脳損傷である請求項１乃至請求項８の何れか１項に記載の方法。
11. 前記外傷性脳損傷は、重度の外傷性脳損傷である請求項１乃至請求項８の何れか１項に記載の方法。
12. 前記個人は、アポリポタンパク質Ｅ４対立遺伝子のキャリアである請求項１乃至請求項１１の何れか１項に記載の方法。
13. 前記個人は、アポリポタンパク質Ｅ３／Ｅ４遺伝子型又はアポリポタンパク質Ｅ４／Ｅ４遺伝子型である請求項１乃至請求項１１の何れか１項に記載の方法。
14. 外傷性脳損傷の予防、軽減又は治療における使用のための、脳内の１種以上のペプチドの１種以上の凝集形態の量を減少することが可能な薬剤。
15. 前記外傷性脳損傷は、急性脳損傷事象の結果である請求項１４記載の使用のための薬剤。
16. 前記外傷性脳損傷は、物理的脳損傷事象の結果である請求項１４記載の使用のための薬剤。
17. 前記外傷性脳損傷は、脳卒中又は低酸素症により引き起こされる脳損傷の結果である請求項１４記載の使用のための薬剤。
18. 前記１種以上のペプチドは、Ａβペプチド、α−シヌクレインペプチド又はタウペプチドからなる群より選択される請求項１４乃至請求項１７の何れか１項に記載の使用のための薬剤。
19. 前記ペプチドの１種以上の凝集形態は、プロトフィブリルの形態にある凝集したＡβペプチドである請求項１４乃至請求項１７の何れか１項に記載の使用のための薬剤。
20. 前記薬剤は、抗体である請求項１４乃至請求項１９の何れか１項に記載の使用のための薬剤。
21. 前記抗体は、Ａβプロトフィブリルに結合する請求項２０記載の使用のための薬剤。
22. 前記外傷性脳損傷は、軽度の外傷性脳損傷である請求項１４乃至請求項２１の何れか１項に記載の使用のための薬剤。
23. 前記外傷性脳損傷は、中程度の外傷性脳損傷である請求項１４乃至
    請求項２１の何れか１項に記載の使用のための薬剤。
24. 前記外傷性脳損傷は、重度の外傷性脳損傷である請求項１４乃至請求項２１の何れか１項に記載の使用のための薬剤。
25. 前記個人は、アポリポタンパク質Ｅ４対立遺伝子のキャリアである請求項１４乃至請求項２４の何れか１項に記載の使用のための薬剤。
26. 前記個人は、アポリポタンパク質Ｅ３／Ｅ４遺伝子型又はアポリポタンパク質Ｅ４／Ｅ４遺伝子型である請求項１４乃至請求項２４の何れか１項に記載の使用のための薬剤。
27. 前記個人の脳内における、外傷性脳損傷事象の結果として凝集する傾向がある１種以上のペプチドの１種以上の凝集形態を検出することを含む、外傷性脳損傷後の合併症の個人のリスクの予測方法であって、脳内における、そのような凝集体の増加したレベルは、合併症の増加したリスクを示す、方法。
28. 前記１種以上のペプチドは、Ａβペプチド、α−シヌクレインペプチド又はタウペプチドからなる群より選択される請求項２７記載の方法。
29. 前記ペプチドの１種以上の凝集形態は、プロトフィブリルの形態にある凝集したＡβペプチドである請求項２７記載の方法。
30. 前記ペプチドの１種以上の凝集形態は、抗体で検出可能である請求項２７乃至請求項２９の何れか１項に記載の方法。
31. 前記ペプチドの１種以上の凝集形態は、Ａβプロトフィブリルに結合する抗体で検出可能である請求項２７乃至請求項２９の何れか１項に記載の方法。
32. 更に、前記個人のアポリポタンパク質遺伝子型の決定を含む、請求項２７乃至請求項３１の何れか１項に記載の方法。