UA75881C2 - A humanized antibody being associated with beta-amyloid peptide ((a?- polynucleic acid coding it, a pharmaceutical composition containing it, and use of said humanized antibody for making medicinal agent for prophylaxis and treatment of states associated with formation of beta-amyloid plaques - Google Patents

Description

Опис винаходу

Ця заявка претендує на пріоритет за тимчасовими |заявками США 60/184,601, яка була подана 24 лютого 2000 року, 60/254,465, яка була подана 8 грудня 2000 року, та 60/254,498, яка була подана 8 грудня 2000 рокуї, вміст кожної з яких включено до цього опису як посилання.

Цей винахід має відношення до гуманізованих антитіл, які зв'язуються з епітопом між амінокислотами 13 та 28 АВ пептиду та до профілактики та лікування станів, які пов'язуються з бета-амілоїдом, наприклад, хвороби

Альцгеймера, синдрому Дауна та церебральної амілоїдної ангіопатії. Зокрема, він має відношення до 70 використання гуманізованих моноклональних антитіл для секвестрування бета-амілоїдного (АВ) пептиду у плазмі, головному мозку та цереброспінальній рідині для запобігання накопичення або для реверсування відкладення АВ пептиду у межах головного мозку та судинної сітки головного мозку, та поліпшення пізнавальної діяльності.

Видається, що з бляшками у периферичних нервах та судинах головного мозку, які вміщують бета-амілоїдний пептид (АВ), пов'язується цілий ряд симптоматологічних комплексів, наслідком яких є порушення пізнавальної діяльності, інсульт, внутрішньомозковий крововилив та загальне послаблення розумової діяльності. До цих станів відносять як передклінічну, так і клінічну форми хвороби Альцгеймера, синдром Дауна та передклінічну та клінічну форми церебральної амілоїдної ангіопатії (САА). Амілоїдні бляшки утворюються з бета-амілоїдних пептидів. Ці пептиди циркулюють у крові та у цереброспінальній рідині (СЕ), як правило, у формі комплексних сполук із ліпопротеїнами. АВ пептид у циркуляторній формі складається з 39-43 амінокислот (головним чином, з 40 або 42 амінокислот) і є наслідком розщеплення загального білка-попередника, білка-попередника амілоїду, який часто позначають як АРР. Деякі форми розчинного АВ є нейротоксичними самі по собі і можуть визначати тяжкість дегенерації нервових волокон та/або погіршення пізнавальної діяльності (Маклін КА. (Мсіеап С.А.) та інші, Апп. Меийгої. (1999) 46:860-866; Ламберт М.П. (Іатбрег М.Р.) та інші, с (1998) 95:6448-6453; Несланд Дж. (Мавішпа ..), У. Ат. Мед. Аввос. (2000) 283:1571). Ге)

Наявні дані дозволяють зробити припущення про те, що АВ може транспортуватись між головним мозком та кров'ю як у прямому, так і у зворотному напрямках (Герсі-Єджа Дж-Ф. (ОПегві-Єдеа 9-Е.) та інші, У. Меигоспет. (1996) 67:880-883; Злоковіч Б.В. (ЛоКоміс В.М.) та інші, Віоспет. Віорпуз. Кев. Сотт. (1993) 67:1034-1040;

Шібата М. (Зпіраїа М.) та інші, У. Сіїп. Іпмеві. (2000) 106:1489-1499). Додаткова кількість АВ у бляшках -- знаходиться у рівновазі з розчинним АВ у головному мозку та крові (Каварабаяші Т. (Камагарауавпі Т.) та інші, с

У. Мешговсі. (2001) 21:372-381).

За описом, який наведено (у міжнародній заявці РСТ/ОЗО0/35681 та заявці США Мо09/153,1301 (обидві со включено до цього опису як посилання), загальні циркуляторні рівні АВ пептиду у цереброспінальній рідині є ою однаковими у нормальних індивідів та індивідів, які мають схильність до демонстрування симптомів хвороби 325 Альцгеймера. Однак рівні АО42 є нижчими, за середніми показниками, в індивідів, які мають хворобу -

Альцгеймера (Нітш Р.М. (Міс К.М.) та інші, Апп. Меийгої. (1995) 37:512-518). Відомо, що АВ,» має більшу схильність до агрегування, аніж АВ до, і, у разі, коли це трапляється, виникають негативні наслідки, такі як відкладення АВ у амілоїдних бляшках, перетворення АВ на токсичні розчинні форми, пошкодження нервових « клітин та порушення поведінки, такі як слабоумство (Голд Т.Е. (СоіІде Т.Е.) та інші, Віоспет. Віорпуз. Асіа. З (2000) 1502:172-187). с Опис способів індукування імунної реакції для зменшення відкладення амілоїду наводять Гу публікації

Із» міжнародної заявки У/О 99/27944, яка була опублікована 10 червня 1999 року). У згаданому описі стверджується, що повномірний агрегований АВ пептид може бути придатним імуногеном. Введення фрагмента АВ (амінокислот 13-28), кон'югованого з овечім антимишачим ІдС, не викликало змін у загальному вмісті амілоїду у корі головного мозку, і лише одна з дев'яти тварин, які одержали впорскування кон'югованого 13-28 фрагмента АВ, і демонструвала деякі ознаки лімфопроліферації у відповідь на АВ 5о. У згаданій заявці вказується також, що 4! антитіла, які специфічно зв'язуються з АВ пептидом, можуть використовуватись як терапевтичні засоби. Однак це видається здогадами, оскільки підтверджувальні дані свідчать про застосування протоколів, які залучають

Со активну імунізацію з використанням, наприклад, АВ ло. Пептиди постачаються за допомогою ад'ювантів і о 20 визначаються як титри антитіл, які є наслідком імунізації, так і рівні АВ пептиду та пептиду-попередника. Ця щ публікація дозволяє майже з певністю стверджувати, що для полегшення симптомів хвороби Альцгеймера АВ т бляшки повинні зменшуватись і для успішного зменшення АВ бляшок необхідними є клітинно-опосередковані процеси.

ГМО 99/60024, яка була опублікована 25 листопада 1999 року), спрямована на способи видалення амілоїду 22 за допомогою антиамілоїдних антитіл. Стверджується, однак, що цей механізм використовує здатність анти-АВ

ГФ) антитіл до зв'язування із попередньо утвореними відкладами амілоїду (наприклад, бляшками) із подальшим місцевим виведенням з мікроглії локалізованих бляшок. Цей механізм не було випробувано іп мімо. У цій о публікації додатково стверджується, що для того, щоб бути ефективними проти АВ бляшок, анти-АВ антитіла повинні одержати доступ до паренхіми головного мозку та подолати гематоенцефалічний бар'єр. 60 7 грудня 2000 року були опубліковані декілька міжнародних заявок, які мають відношення до спроб контролювання амілоїдних бляшок. (У ММО 00/72880| описується значне зменшення бляшок у корі головного мозку та гіпокампі трансгенної мишачої моделі хвороби Альцгеймера у разі обробки мишей з використанням

М-кінцевих фрагментів АВ пептидів та антитіл, які зв'язуються з ними, але не у разі обробки 13-28 фрагментом

АВ, кон'югованим з овечим антимишачим Ідс або з антитілом проти 13-28 фрагмента, антитілом 266. Результати бо досліджень іп міго підтвердили, що антитіла, спрямовані проти М-кінцевої ділянки, долають гематоенцефалічний бар'єр та індукують фагоцитоз амілоїдних бляшок.

ЇМО 00/72876| має по суті таке ж саме розкриття, що і (МУО 00/72880|, і спрямовується на імунізацію за допомогою самих складових амілоїдних фібрил.

МО 00/77178) описує антитіла, які були розроблені для каталізування гідролізу В-амілоїду, у тому числі антитіла, які були одержані проти суміші фенілаланін-статинових перехідних сполук Сув-АВ 4025, СтТатин

Рпечео-Рпего та Сувз-АВ410.25 статин РНего-Аіа»і, та антитіла, одержані проти АВ.о25, які мають відновлений амідний зв'язок між Рпело та Рпего. У цьому документі згадується секвестрування АВ, але це лише здогади, оскільки у ньому не наводяться дані на підтвердження такого секвестрування. Цей документ, окрім того, не /о наводить даних іп мімо про те, що введення антитіл викликає відтік АВ з центральної нервової системи, перешкоджає утворенню бляшок, зменшує загальний вміст бляшок, утворює комплекси між антитілами та АВ у зразках тканин або впливає на пізнавальну діяльність.

Було показано, що одним із шляхів метаболізму АВ є перенесення з центральної нервової системи до плазми (Злоковіч Б.В. (ЛоКоміс В.М.) та інші, Ргос. Май). Асай. Зсі. (США) (1996) 93:4229-4234; (Герсі-Еджа Дж-Ф. 7/5 (Зпегві-Едеа 9-Р.) та інші, У. Мейгоспет. (1996) 67:880-883). На додаток до цього, було показано, що АВ у плазмі може долати гематоенцефалічний бар'єр та потрапляти до головного мозку (Злоковіч Б.В. (Локоміс В.М.) та інші, Віоспет. Віорпуз. Кев. Сотт. (1993) 67:1034-1040). Було показано також, що введення певних поліклональних та моноклональних АВ антитіл зменшує відкладення АВ у амілоцних бляшках у АРР УПР трансгенної мишачої моделі хвороби Альцгеймера (Бард Ф. (Вага Р.) та інші, Маїшге Мей. (2000) 6:916-919); го однак вказувалось на те, що згадане обумовлювалось певними анти-АВ антитілами, які долають гематоенцефалічний бар'єр та стимулюють фагоцитоз амілоїдних бляшок клітинами мікроглії. У експериментах

Барда аналіз зрізів головного мозку ех мімо показав, що присутність додаткових АВ антитіл, разом з екзогенно доданою мікроглією, індукувала фагоцитоз АВ, наслідком чого було видалення відкладів АВ.

Рівні розчинних АВдо та АВ.» у цереброспінальній рідині та крові можуть легко виявлятись за допомогою сч об стандартизованих аналізів з використанням антитіл, спрямованих проти епітопів вздовж ланцюга АВ. Про такі аналізи повідомлялось, наприклад, (у патентах США Мо5,766,846, Мо5,837,672 та Мо5,593,846|. Ці патенти о описують продукування мишачих моноклональних антитіл до центрального домену АВ пептиду, які, за повідомленням, мають епітопи довкола та із включенням положень 16 та 17. Було також наведено опис антитіл, спрямованих проти М-кінцевої ділянки. Стверджувалось, що декілька моноклональних антитіл вступали до «-

Зо імунної реакції з положеннями 13-28 АВ пептиду; вони не зв'язувались із пептидом, який представляв положення 17-28, що, за згаданим патентом, встановлювало, що ця ділянка, із включенням положень 16-17 (сайт со

А-секретази), була мішенню цих антитіл. До числа антитіл, які, як відомо, зв'язуються між амінокислотами 13 со та 28 АВ, належать мишачі антитіла 266, 458 та 102.

Ми несподівано встановили, що введення антитіла 266 дуже швидко і майже повністю відновлює пізнавальну Щео,

Здатність (пам'ять на об'єкти) у 24-місячних гемізиготних трансгенних мишей (АРР УК), Ці антитіла, однак, - не мають властивостей, які, за положеннями цієї галузі, є необхідними для того, щоб антитіло було ефективним при лікуванні хвороби Альцгеймера, синдрому Дауна та інших станів, пов'язаних з АВ пептидом. Додатковий подив викликало спостереження, яке полягало у тому, що антитіла, які зв'язують АВ між положеннями 13 та 28 « (266 та 408), є здатними до секвестрування розчинних форм АВ з їхніх зв'язаних, циркуляторних форм у крові, і 70 Що наслідком периферичного введення антитіла 266 є швидкий відтік відносно великих кількостей АВ пептиду з 8 с центральної нервової системи до плазми. Наслідком цього є зміна виведення розчинного АВ, запобігання ц утворенню бляшок і, що викликає найбільший подив, поліпшення пізнавальної діяльності, навіть без "» обов'язкового зменшення загального вмісту АВ амілоїдних бляшок, подолання гематоенцефалічного бар'єру у скільки-небудь значному обсязі, сполучення із бляшками, активування клітинних механізмів або зв'язування з

Великою спорідненістю до агрегованого АВ. -І Цей винахід надає гуманізовані антитіла або їхні фрагменти, які позитивно впливають на пізнавальну діяльність у разі хвороб та станів, до яких може залучатись АВ, наприклад, при клінічній або передклінічній і-й формах хвороби Альцгеймера, синдромі Дауна та клінічній або передклінічній формах церебральної амілоїдної (ее) ангіопатії. Згадані антитіла або їхні фрагменти не повинні долати гематоенцефалічний бар'єр, сполучатись з амілоїдними бляшками, активізувати клітинні реакції або навіть у обов'язковому порядку зменшувати загальний бо вміст амілоїдних бляшок. За іншим аспектом, цей винахід надає гуманізовані антитіла або їхні фрагменти, які - М секвеструють АВ пептид з його зв'язаної, циркуляторної форми у крові та змінюють виведення розчинних та зв'язаних форм АВ у центральній нервовій системи та плазмі. За іншим аспектом, цей винахід надає гуманізовані антитіла та їхні фрагменти, де згадані гуманізовані антитіла специфічно зв'язуються з епітопом між амінокислотами 13 та 28 молекули АВ. За іншим аспектом, цей винахід надає гуманізовані антитіла або їхні фрагменті, де гіперваріабельні ділянки одержують з мишачого моноклонального антитіла 266 і де згадані

Ф, антитіла зберігають приблизно зв'язувальні властивості мишачого антитіла і мають іп мйго та іп мімо ко властивості, функціонально еквівалентні мишачому антитілу (послідовності Мо1-6). За іншим аспектом, цей винахід надає гуманізовані антитіла та їхні фрагменти, де згадані варіабельні ділянки мають послідовності, бор які включають гіперваріабельну ділянку мишачого антитіла 266 та специфічні людські каркасні послідовності (послідовності Мо7-10), де згадані антитіла зберігають приблизно зв'язувальні властивості мишачого антитіла і мають іп міго та іп мімо властивості, функціонально еквівалентні мишачому антитілу 266. За іншим аспектом, цей винахід надає гуманізовані антитіла та їхні фрагменти, де легким ланцюгом є послідовність Мо11 і важким ланцюгом є послідовність Мо12. 65 Крім того, частиною цього винаходу є полінуклеотидні послідовності, які кодують гуманізовані антитіла або їхні фрагменти, які були розкриті перед тим, вектори, до складу яких входять полінуклеотидні послідовності,

які кодують гуманізовані антитіла та їхні фрагменти, клітини-хазяї, трансформовані векторами або такі, що включають полінуклеотиди, які експресують гуманізовані антитіла або їхні фрагменти, фармацевтичні композиції гуманізованих антитіл та їхніх фрагментів, які розкривають у цьому описі, та способи їх одержання та використання.

Такі гуманізовані антитіла та їхні фрагменти є придатними для секвестрування АВ у людей; для лікування та запобігання хвороб та станів, які характеризуються АВ бляшками або АВ токсичністю у головному мозку, наприклад, хвороби Альцгеймера, синдрому Дауна та церебральної амілоїдної ангіопатії у людей; для діагностування цих хвороб у людей; та для визначення, чи буде людина реагувати на лікування з використанням 7/0 людських антитіл проти АВ.

Введення відповідного гуманізованого антитіла іп мімо для секвестрування АВ пептиду, який циркулює у біологічних рідинах, є корисним для профілактики та лікування станів, зв'язаних з утворенням АВ-вмісних дифузних бляшок у периферичних нервах та кровоносних судинах головного мозку. Згадане гуманізоване антитіло, а також його імунологічно реактивний фрагмент, забезпечує видалення АВ пептиду з /5 макромолекулярних комплексів, які, за нормальних умов, були б залучені до його перенесення у загальній воді організму до/з місць, у яких можуть утворюватись бляшки або де він може бути токсичним. На додаток до цього, секвестрування АВ пептиду, який знаходиться у плазмі, антитілом або його фрагментом, відіграє роль "поглинача", який ефективно секвеструє розчинний АВ пептид у плазмовому компартменті та індукує проникнення АВ до плазми з місцеположень у центральній нервовій системі. Завдяки секвеструванню АВ у крові, стимулюється загальний відтік із головного мозку і запобігається відкладення розчинного АВ у формі нерозчинних бляшок та утворення токсичних розчинних видів у головному мозку. На додаток до цього, нерозчинний АВ у бляшках, який знаходиться у рівновазі з розчинним АВ, може видалятись із головного мозку завдяки секвеструвальному ефекту у крові. Секвестрування АВ пептиду антитілом також стимулює його видалення з тіла та пригнічує токсичні ефекти розчинного АВ у головному мозку та розвиток і додаткове сч ов накопичення нерозчинного АВ у вигляді амілоїду у бляшках. Антитіла, які використовуються у цьому винаході, не долають гематоенцефалічний бар'єр у значних кількостях («0,195 від рівнів у плазмі). На додаток до цього, і) гуманізовані антитіла, які використовуються у цьому винаході, у разі їх периферичного введення, не повинні викликати клітинної імунної реакції у головному мозку, у разі зв'язування з АВ пептидом або у разі вільного циркулювання, для проявлення своїх цілющих ефектів. Крім того, у разі їх периферичного введення, вони не «-

Зо повинні суттєво зв'язувати агрегований АВ пептид у головному мозку для проявлення своїх цілющих ефектів.

Таким чином, за одним з аспектів, цей винахід спрямовано на спосіб лікування та запобігання станів, які со характеризуються утворенням бляшок, які містять бета-амілоїдний білок, у людей, який включає введення, за со варіантом, якому віддається перевага, периферичне, людині, яка потребує такого лікування, терапевтично або профілактично ефективної кількості гуманізованого моноклонального антитіла або його імунологічно реактивного о фрагмента, причому згадане антитіло специфічно зв'язується з середньою ділянкою АВ пептиду. За іншим ї- аспектом, цей винахід спрямовано на спосіб пригнічення утворення амілоїдних бляшок та виведення амілоїдних бляшок у людей, який включає введення людині, яка потребує такого пригнічення, ефективної кількості гуманізованого антитіла, яке секвеструє АВ пептид з його циркуляторної форми у крові та індукує відтік із головного мозку, а також змінює виведення АВ із плазми та головного мозку. За додатковими аспектами, цей «

Винахід спрямовано на такі гуманізовані антитіла, у тому числі на їхні імунологічно ефективні ділянки, та на з с способи їх одержання.

Цей винахід включає також способи реверсування погіршення пізнавальної діяльності, поліпшення з пізнавальної діяльності, лікування погіршення пізнавальної діяльності та запобігання погіршення пізнавальної діяльності у суб'єкта, у якого була діагностована клінічна або передклінічна форма хвороби Альцгеймера, биндром Дауна або клінічна чи передклінічна форма церебральної амілоїдної ангіопатії, які включають введення -І згаданому суб'єкту ефективної кількості гуманізованого антитіла за цим винаходом.

Цей винахід включає також використання гуманізованого антитіла за цим винаходом для виготовлення о лікарського засобу, у тому числі пролонгованої експресії рекомбінантних послідовностей антитіла або фрагмента о антитіла у тканинах людини, для лікування, запобігання або реверсування хвороби Альцгеймера, синдрому 5ор Дауна або церебральної амілоїдної ангіопатії; для лікування, запобігання або реверсування погіршення со пізнавальної діяльності у разі клінічної або передклінічної форм хвороби Альцгеймера, синдрому Дауна або як клінічної чи передклінічної форм церебральної амілоїдної ангіопатії; або для пригнічення утворення амілоїдних бляшок або ефектів токсичних розчинних видів АВ у людей.

Цей винахід має відношення до спостереження, яке викликає подив і полягає у тому, що у межах короткого періоду часу після введення антитіла за цим винаходом, відносно великі кількості АВ відтікають із центральної нервової системи до крові. Таким чином, цей винахід включає способи визначення реакції людини на лікування

Ф) антитілом, яке зв'язує АВ, або його фрагментом, які включають: а) введення антитіла або його фрагмента ка людині; та Б) визначення концентрації АВ у крові людини.

Цей винахід включає також спосіб лікування людини антитілом, яке зв'язує АВ, або його фрагментом, який бо Включає: а) введення першої кількості антитіла або його фрагмента людині; б) визначення концентрації АВ у крові людини через термін від З год до двох тижнів після введення першої дози; с) у разі необхідності, визначення другої кількості антитіла або його фрагмента на основі результатів етапу Б), причому друга кількість є такою ж самою або відрізняється від першої кількості; та 4) введення другої кількості антитіла або фрагмента. 65 Цей винахід включає також спосіб визначення у людини ефективності антитіла, яке зв'язується з АВ, або його фрагмента відносно пригнічення або запобігання утворення АВ амілоїдних бляшок, зменшення АВ амілоїдних бляшок, послаблення ефектів токсичних розчинних видів АВ або лікування стану чи хвороби, пов'язаної з АВ бляшками, який включає: а) одержання першого зразка плазми або цереброспінальної рідини людини; Б) визначення вихідної концентрації АВ у першому зразку; с) введення антитіла або його фрагмента людині; 4) одержання другого зразка плазми або цереброспінальної рідини людини через термін від Згод. до двох тижнів після введення антитіла або його фрагмента; та е) визначення концентрації АВ у другому зразку; де ефективність пов'язується з кількістю АВ, яка зв'язалась з антитілом у крові, та концентрацією АВ у цереброспінальній рідині.

На Фіг.1 показано відсоток АВ пептиду, відведений з цереброспінальної рідини людини через діалізну 70 мембрану Ма 266, як функцію молекулярномасової межі пропускання діалізної мембрани.

На Фіг.2 показано концентрацію АВгзагальною, яка визначається у плазмі АРР УЛ трансгенної миші після впорскування 200мкг або б0Омкг Маб 266 як функція часу.

На Фіг.ЗА показано кількість відкладення АВ пептиду у корі головного мозку АРР "7177 трансгенних мишей, яким вводили фізіологічний розчин, мишачий дО або Ма 266. На Фіг.3В показано кореляцію цих результатів із 75 батьківським походженням.

На Фіг.4 показано полінуклеотидні послідовності для експресування легкого ланцюга гуманізованого 266 із плазміди рУк-Ни266 і одну амінокислоту, яка кодує експресований легкий ланцюг гуманізованого 266 (який, у разі визрівання, відповідає послідовності Мо11).

На Фіг.5 показано полінуклеотидні послідовності для експресування важкого ланцюга гуманізованого 266 із плазміди рМ91-Ни266 і одну амінокислоту, яка кодує експресований важкий ланцюг гуманізованого 266 (який, у разі визрівання, відповідає послідовності Мо12).

Фіг.6 - плазмідна карта рУк-Ни266.

Фіг.7 - плазмідна карта РМа1-Ни266.

АВ пептиди, які циркулюють у біологічних рідинах організму людини, представляють собою карбоксильну с кінцеву ділянку білка- попередника, який кодується на хромосомі 21. За результатами експериментів іп мйго о повідомлялось, що АВ пептид має погану розчинність у фізіологічних розчинах, оскільки до його складу входить смуга гідрофобних амінокислот, які є частиною ділянки, яка прикріплює його довшого попередника до ліпідних мембран клітин. Таким чином, не викликає подиву те, що циркуляторний АВ пептид, як правило, утворює комплекси з іншими складовими, які запобігають його агрегуванню. Наслідком цього є труднощі виявлення «- циркуляторного АВ пептиду у біологічних рідинах.

Вищезгадані патентні документи (патенти США Мо5,766,846, Мо5,837,672 та Мо5,593,846)| описують одержання со антитіл, у тому числі моноклонального антитіла, що було позначене як клон 266, яке було одержане проти і (ее) показане як таке, що специфічно зв'язується з пептидом, до складу якого входять амінокислоти 13-28 АВ пептиду. Заявники встановили, що антитіла, які зв'язуються у межах цієї ділянки, у протилежність до антитіл, о які зв'язуються будь-де на амінокислотній послідовності АВ, є здатними до дуже ефективного секвестрування АВ - пептиду з макромолекулярних комплексів. Це секвестрування буде викликати загальний відтік АВ пептиду з центральної нервової системи, змінювати його виведення з центральної нервової системи та плазми і зменшувати рівень його доступності для утворення бляшок. Таким чином, антитіла такої специфічності, « модифіковані для зниження їхньої імуногенності шляхом перетворення на гуманізовану форму, надають можливість лікування як профілактичного, так і терапевтичного станів, які пов'язуються з утворенням - с бета-амілоїдних бляшок. До таких станів належать, як згадувалось перед тим, передклінічна та клінічна форми а хвороби Альцгеймера, синдром Дауна та передклінічна та клінічна форми церебральної амілоїдної ангіопатії. "» Термін "лікування", яке використовується у цьому описі, означає терапевтичне лікування у разі уже відомої присутності стану для лікування, та профілактику, тобто запобігання, або поліпшення можливої майбутньої появи стану. -| Вираз "моноклональні антитіла, які зв'язуються з середньою ділянкою АВ пептиду" означає моноклональні сл антитіла (Маб або Мабз), які зв'язують амінокислотну послідовність, яка представляє собою епітоп, що знаходиться між положеннями 13-28 АВ. Немає потреби у забезпеченні спрямованої доставки до усієї ділянки. (ее) Доти, доки антитіло зв'язується як мінімум з одним епітопом у межах цієї ділянки (зокрема, наприклад, із бо 50 включенням сайту А-секретази 16-17 або сайту, на якому зв'язується антитіло 266), такі антитіла є ефективними у способі за цим винаходом. -. й Термін "антитіло" означає моноклональне антитіло рег зе або його імунологічно ефективний фрагмент, наприклад, такі його фрагменти, як Е дь, Раю або Е(ар)». У деяких контекстах цього опису фрагменти будуть згадуватись із конкретною метою надання особливого значення; слід розуміти, однак, що незалежно від того, чи вказуються фрагменти, термін "антитіло" включає як такі фрагменти, так і одноланцюжкові форми. Доти, доки білок зберігає здатність до специфічного зв'язування з його наміченою мішенню, і, у цьому разі, до

ІФ) секвестрування АВ пептиду від його білків-носіїв у крові, він входить до обсягу поняття, яке визначається іме) терміном "антитіло". До обсягу поняття, яке визначається терміном "антитіло" входять також одноланцюжкові форми, які, взагалі позначаються як ЕЕ ),, ділянки антитіл із такою специфічністю. За варіантом, якому 60 віддається перевага, однак не обов'язково, антитіла, придатні для цього винаходу, продукують рекомбінантними способами, оскільки типові мишачі або інші нелюдські антитіла з відповідною специфічністю потребують деякого маніпулювання з метою їх перетворення на гуманізовану форму. Антитіла можуть або можуть не глікозилуватись, хоча перевага надається глікозилованим антитілам. Загальновідомо, що антитіла відповідним чином структуруються за допомогою дисульфідних зв'язків. 65 Відомо, що основна структурна одиниця антитіла включає тетрамер. Кожний тетрамер складається із двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, причому кожна пара має один "легкий" (приблизно 25кДа) та один

"важкий" ланцюг (приблизно 50-7ОкДа). Амінокінцева частина кожного ланцюга включає варіабельну ділянку із приблизно 100-110 або більше амінокислот, яка, головним чином, відповідає за розпізнавання антигена.

Карбоксильна кінцева ділянка кожного ланцюга представляє собою константу ділянку, яка відповідає, головним Чином, за ефекторну функцію.

Легкі ланцюги класифікуються як гамма, мю, альфа та лямбда. Важкі ланцюги класифікуються як гамма, мю, альфа, дельта або епсілон і визначають ізотип антитіла як Ідс, І9М, ІдА, дО та ЧЕ, відповідно. Варіабельні та константні ділянки у межах легких та важких ланцюгів з'єднуються ділянкою ")", яка складається із приблизно 12 або більше амінокислот. До складу важкого ланцюга входить також ділянка "0", яка складається із 7/0 приблизно 10 або більше амінокислот.

Варіабельні ділянки кожної пари легкого/важкого ланцюгів утворюють сайт зв'язування антитіла. Таким чином, інтактне антитіло має два сайти зв'язування. Усі ланцюги мають однакову загальну структуру, яка включає відносно консервативні каркасні ділянки (ЕК), які сполучаються трьома гіперваріабельними ділянками, що називаються також комплементарними визначальними ділянками або СОК. Гіперваріабельні ділянки двох /5 ланцюгів кожної пари впорядковано розміщаються у межах каркасних ділянок, що забезпечує їх зв'язування зі специфічним епітопом. До складу легких та важких ланцюгів, від М-кінцевої до С-кінцевої ділянок, входять домени ЕКТ, СОКІ1, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ та ЕК4. Співвіднесення амінокислот та кожного домену відповідає добре відомим угодам |(Кабат (Кара) "Зедцепсез ої Ргоїеіпв ої Іттипоіодіса! Іпіегеві" Майопа! Іпвійшев ої

Неацйй, ВеШезаа, Ма., 1987 та 1991; Чотья (Споїйпіа) та інші, 9. Мої. ВіоІї. 196:901-917 (1987); Чотья (Споїпіа) та інші, Маїшге 342:878-883 (1989).

У цій галузі загальновідомо, що моноклональні антитіла з відповідною специфічністю можна легко одержати стандартними методами імунізації ссавців, з одержанням гібридом з антитілопродукуючих клітин згаданих ссавців або шляхом їх іморталізації будь-яким іншим способом, та культивуванням гібридом або іморталізованих клітин із визначенням відповідної специфічності. У даному разі, такі антитіла можна одержати шляхом сч імунізації людини, кролика, пацюка або миші, наприклад, пептидом, який представляє собою епітоп, що охоплює 13-28 ділянку АВ пептиду або його відповідний субрегіон. Матеріали для рекомбінантного маніпулювання можна і) одержати шляхом віднаходження нуклеотидних послідовностей, які кодують необхідне антитіло, з гібридоми або іншої клітини, яка його продукує. Після цього зі згаданими нуклеотидними послідовностями можна маніпулювати для одержання їх у гуманізованій формі. «- зо Термін "гуманізоване антитіло" означає антитіло, яке частково або повністю складається з амінокислотних послідовностей, які були одержані з зародкової лінії людських антитіл шляхом зміни послідовності антитіла, со яке має нелюдські гіперваріабельні ділянки. Найпростішою з таких змін є заміна мишачої константної ділянки со константною ділянкою людського антитіла, завдяки чому утворюється людська/мишача химера, яка може мати достатньо низьку імуногенність, щоб бути прийнятною для фармацевтичного використання. Однак за варіантом, о зв ЯКОМУ віддається перевага, варіабельна ділянка антитіла і навіть гіперваріабельна ділянка також гуманізуються ї- за допомогою методів, які на цей час є загальновідомими у цій галузі. Каркасні ділянки варіабельних ділянок замінюються на відповідні людські каркасні ділянки. Нелюдські гіперваріабельні ділянки у цьому разі залишаються по суті інтактними або навіть замінюються послідовностями, які одержують із людського геному.

Повністю людські антитіла продукуються у генетично модифікованих мишах, імунна система яких була змінена і « відповідає імунній системі людини. Як згадувалось перед тим, для здійснення способів за цим винаходом з с достатньо використовувати імунологічно специфічний фрагмент антитіла, у тому числі фрагменти, які представляють одноланцюжкові форми. з Гуманізоване антитіло означає антитіло, до складу якого входить людський каркас, як мінімум одна гіперваріабельна ділянка нелюдського антитіла, і будь-яка константна ділянка якого є по суті ідентичною константній ділянці людського імуноглобуліну, наприклад, ідентична на приблизно 85-9095, за варіантом, якому -і віддається перевага, ідентична як мінімум на 9595. Таким чином, усі частини гуманізованого антитіла, за виключенням, можливо, гіперваріабельних ділянок, є по суті ідентичними відповідним частинам однієї або о декількох нативних людських імуноглобулінових послідовностей. Наприклад, до складу гуманізованого о імуноглобуліну за типовим варіантом не буде входити химерне антитіло, що включає мишачу варіабельну 5ор ділянку/людську константну ділянку. со Гуманізовані антитіла мають як мінімум три потенційні переваги над нелюдськими та химерними антитілами

Кк при використанні для лікування людей: 1) оскільки ефекторна частина є людською, вона може краще взаємодіяти з іншими частинами людської імунної системи (наприклад, ефективніше знищувати клітини-мішені комплемент-залежною цитотоксичністю вв (СОС) або антитіло-залежною клітинною цитотоксичністю (АОСС)). 2) Людська імунна система не повинна розпізнавати каркасну або С-ділянку гуманізованого антитіла як (Ф, чужорідну і, таким чином, гуморальна імунна відповідь проти такого антитіла, яке було впорснуто, повинна бути ка меншою, аніж проти повністю чужорідного нелюдського антитіла або частково чужорідного химерного антитіла.

З) Повідомлялось, що впорснуті нелюдські антитіла мають набагато коротший час напівжиття у кровообігу бо людини, аніж людські антитіла. Впорснуті гуманізовані антитіла будуть мати час напівжиття по суті ідентичний природним людським антитілам, що дозволить вводити менші дози з меншою частотою.

Гуманізовані імуноглобуліни можуть створюватись наведеним далі чином. У разі, коли амінокислота підпадає під наведену далі категорію, каркасна амінокислота людського імуноглобуліну, що має бути використана (імуноглобулін-реципієнт), замінюється на каркасну амінокислоту нелюдського імуноглобуліну, який забезпечує 65 гіперваріабельну ділянку (імуноглобулін-донор): (а) амінокислота на людській каркасній ділянці імуноглобуліну-реципієнта є незвичною для людського імуноглобуліну у цьому положенні, у той час як відповідна амінокислота у імуноглобуліну-донора є типовою для людського імуноглобуліну у цьому положенні; (Б) положення амінокислоти є безпосередньо суміжним із положенням гіперваріабельних ділянок; або (с) будь-який атом бічного ланцюга каркасної амінокислоти знаходиться на відстані приблизно 5-6 Е (міжцентрова відстань) від будь-якого атому амінокислоти гіперваріабельної ділянки на об'ємній моделі імуноглобуліну (Квін (Сцееп) та інші, цитована робота, та Ко (Со) та інші, Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 88, 2869 (1991)). У разі, коли кожна амінокислота на людській каркасній ділянці імуноглобуліну-реципієнта та відповідна амінокислота імуноглобуліну-донора є незвичною для людського імуноглобуліну у цьому положенні, /о така амінокислота замінюється на амінокислоту, типову для людського імуноглобуліну у цьому положенні.

Гуманізованим антитілом, якому віддається перевага, є гуманізована форма мишачого антитіла 266.

Гіперваріабельні ділянки гуманізованого антитіла 266 мають наведені далі амінокислотні послідовності:

СОК1 легкого ланцюга: лиш РІ А І А га бек Нех біз Век'їва їіє Тук Бех Авр Оіу Ана Аза Тух Бех Нів (Послідовність Ле 13

СОВО легкого лайнюга: пнм в їй ш зно з - й ; » - с. Е й -. ож ніж. ШИ нок

СКЗ легкого ланщюга; сч й їй. нич и п о 3Б ши: ше І пд В -

ОВ нн й

Єій тіє Авпобек Я! Сіу Ввп бек Тк Тук тує рко Авротвк уві пуб Яїу

Ще ЦИ, НИ ся ШИ (Послідовність Ме 5) ч

СТУ со Туг (Песліловність МЕ 6),

Варіабельна ділянка легкого ланцюга гуманізованого антитіла, якій віддається перевага, за цим винаходом -і має наведену далі амінокислотну послідовність, де каркас походить зі сегментів ОРК18 людської зародкової сл лінії МК та сегмента КІ людської зародкової лінії ), з декількома амінокислотними замінами на консенсусні амінокислоти у тій же самій М людській підгрупі для зменшення потенційної імуногенності: (ее) о 50 -

Ф) іме) 60 б5 ї 5 10 зв дар'хдаа чаї меж Тнг тя Хва РО Бей бек Зей во уйї Хав Хав; біу бій Рхо Аїя Не іа Вер Сув Аа Бех Бех їй Веу їв Хва-

Тух Бек Аяр ЯМУ Авпо Аля тТух Зем Нів Тер Же Бен бів Шув ро: шо ОВ, пишна пр бу бів Вех Руо Хна їй їм ІЗе Тух Муз Уяі Бек Ави Би. Рв нон ПІНА. ИН 00 В:

Всг ау чаї РКО Айр ' АКЯ Ре Бер сту Бек ЄТу Бек ОІУ Тех Аве пн рн ПИ тя

Віа Яве Івц Цув ї1іє Бех ко Уаі бю Ат би Авр Хай сіу Ук.

Чук тут суя бек 1 бек Тк мін укі веб тер МНЕ РНе позу хай сч ї б ВА.

Оїу ве ав ла 91 лів Куй ку (Послідовність Мо7), де ч-

Хаа у положенні 2 - Ма! або Іе;

Хаа у положенні 7 - Зег або Тпг; со

Хаа у положенні 14 - Тнг або Зег; ее

Хаа у положенні 15 - І ем або Рго;

Хаа у положенні 30 - Ме або Маї; о

Хаа у положенні 50 - Агу, Сіп або І ув; ч-

Хаа у положенні 88 - Ма! або І еи;

Хаа у положенні 105 - Сіп або Су;

Хаа у положенні 108 - І уз або Аго; та «

Хаа у положенні 109 - Ма! або І еу.

Варіабельна ділянка важкого ланцюга гуманізованого антитіла, якій віддається перевага, за цим винаходом - с має наведену далі амінокислотну послідовність, де каркас походить зі сегментів ОР5З людської зародкової лінії ц МН та сегмента УН4 людської зародкової лінії У, з декількома амінокислотними замінами на консенсусні "» амінокислоти у тій же самій людській підгрупі для зменшення потенційної імуногенності: -І 1 (ее) о 50 -М (Ф) ко бо б5 ще Б: ке Й 15

Жна уйї іа дей бах буй Хва Шу ТУ О1У їва Мах бій вхо щу жи пиши шншнннни пи «1У Бек їн Яку Пси бех Сує Аза йіа беж Су Ре Те РВе: Бех тю ев тує Бек Ме Беї тер уаї вку сів лів РКО Сіу пуб сіу ай

Бо в вв

Жва реа чаї Аїа іп її АБ бат УА у вв бек тв тТук тут 5 ча и: ові жа іт міч щ Кок; ит т, ік х. шати банк: за: тири . з пла й о веСКУ а пе ік . Й з Б РО РІ ши

ЖШко'Авр Ка Уві Пув 91уУ Ату РБе Тк іє бер ку Авр Ан Хва

ВВ. го Же ВВІ ТИЕ Інв Тук ви бій Ме йад бек Тв Ялта Аїв Хва Авр нини А ИН те Мін баї Тук Тук Сує Атїа бек ЗУ Аир Ту тр лу бів су сч 25 г її о лигсхая из тн мал веж ва, (Послідовність Мов), «- 30 де

Хаа у положенні 1 - Сім або іп; (ге)

Хаа у положенні 7 - Зег або І ец; со

Хаа у положенні 46 - сім, Маї, Азр або 5ег;

Хаа у положенні 63 - Тиг або Зег; Іо) з Хаа у положенні 75 - Аа, Зег, Ма! або Тнг; М

Хаа у положенні 76 - І уз або Аго;

Хаа у положенні 89 - Сім або Азр; та

Хаа у положенні 107 - І ем або ТнНг.

Варіабельна ділянка легкого ланцюга гуманізованого антитіла, якій віддається особлива перевага, за цим « винаходом має наведену далі амінокислотну послідовність, де каркас походить зі сегментів ОРК18 людської -в с зародкової лінії МК та сегмента УК! людської зародкової лінії ), з декількома амінокислотними замшами на консенсусні амінокислоти у тій же самій М людській підгрупі для зменшення потенційної імуногенності: з -І 1 (ее) о 50 -М (Ф) ко бо б5 шини АН. шт. -«Ввр маї. чаї Мек те бів бек мо рей бек їй Ро чаї Же тех «ФУ іа рхо Аїз Бех Тів Бах буя вт Яег Вву (о бек ев хе: пп: ПОД О нн ПАК тук Бех двБр о Яа1у Авп дів Тух Мей Нів Тер Уа реп бій ув вхо:

І чо ВЕ о п В ВВ

Жек біу Маї рко Анр Ахе бе свжк С1у бек Оу Беж Ду Жви: Авр. 2 Бе тру Бей тув ллє Бет дха Мах ата йта ба Айр УвЕ зу Маї. пн ан НА НН ук Тук Сує Бех іп бег ТЕ нів Чі рео Тхр Тк Ябе Я3У бів: сч по.

Віу нт бує Чаї біз тіє йув Аху (Послідовність Моб). - зо Варіабельна ділянка важкого ланцюга гуманізованого антитіла, якій віддається особлива перевага, за цим винаходом має наведену далі амінокислотну послідовність, де каркас походить зі сегментів ОР5З людської г) зародкової лінії МН та сегмента ОНА людської зародкової лінії .): со

У 5 чо Я5 ою сти аз ср тей ху От Беж Оу ху оту цеб ува біш РЕо Ду шов в і 00003

О1уУ бег ієи аку ож Бек Сув дій ія бек Оу РБа ти Ве БОЖЕ у кину» - ЗОНИ Мн Не с ка Тук бек Мес Бек Ткр Уаї ха біз Ата Рко 01у був ту лем із й як Ж

Е--5 5. во і: ра Бей чиї вза бій тії дий Ба» чаї а1у дай бер Так туй Ту с пишна нан НА АНА Я со Бко дир: тк Мах тує 1у ва рве тве тіє Бех Ася Авр о дяй Аза

ВВ

-з ув два ТІ Без Тук Пец бій Ме Дей БЕХ Бей Ага Аа сім Ар пишними иа и АН " Чер АЇв Маі1 тТук лух Сув Ати Зек ту дер Тук Тр су сій у

Тих Тви Меї Тк чі. Чех беж (Послідовність М 10). бо 7 ї

Летий ланцюг для гуманізованого антитіла, якому віддається перевага, за цим винаходом має амінокислотну послідовність: б5

: пи: ин вх. Я 000 В дер чаї чиї Має Ти бів Бег ро ви бак тей Бсо Май Же тей й нини НН ПІНУ

О1у бів тео вів Беж їів Ббтх був кро Беу Бех бів ет ївц їїв пн но шо ЯВ. тю ЖЖк ВЕ Авр.1у Ав лів Туг лец Нів тр ВНе лез бію ПувоРко

ШИ Ба. що с: ЗИ й пу їа Бик орто дк бен лев їв ту Бує маї- Вик вв вий вав шт пн А НПЦ й вав вв 72 Віа ув рей Був Її бак Ахо Чаї біз Аів біз ляр'маї ау ма. чує тук сСув вег сло вав тини нів ча рЕВ тр Те Ре оту аза сч

Яру тр: ув Чаї їм 116 Був АРУ Тв Маї йлас АБа во Ве Чаї. ре ї1е Ве Бко йко дес Ар ати бів два був бек 1у Тк Аїд: нн ши НН пон: ИН: ЗНМ

Уві сів тер Нув Маї дер Ав ів ев біл Бек біу Лю Беж За « "лиш ше: мн : ННЦ тво З с «а Бах уаї Те бій іш Авр бек Буш Анр ех Тк туї ябх тей: з й пн НН НН -5 Веж бек: їйЕ Меч ТНК цей бат Був вія Авр тую ат Був нів Був: с і ншн : ИМН 219 со ча тух ві Сує бій Меі Зх нка їж сту дей вах Важ во Уві. о 50 жу; І: -з "р Був важ вве лен аку ху ота су (Послідовність Мо11).

Важкий ланцюг для гуманізованого антитіла, якому віддається перевага, за цим винаходом має 22 амінокислотну послідовність: о т 8 з: 5 вм» М чаї пі тей тах ска Бек О1у оту ОДУ Бей ува Фо Те ФУ бо 65 нина ин НА.

Сту ех би Аху без бек був Дія вія вах Су Ре твж Ме вах дк Тук беж Мес бер Тир Май Вк бір оліє роси пув у цех . що с бо: у) застаа ха) Ви та та дві Беж Мих сзу май Ве ре тує зе пен ПН аа ОА

Фко Лав Тк Узі ув Б1у Ака Ре Твх Т1е Бех Яка йнроАво АТя. 15 во в: 50 тллш Вт Те рез тух во сла мет АВ ек шем ВКу Аза сій дор: 300 тоБ тних дта маз рук тут був дата вет оту вар тує тер 'єзу ста ту пами ІННИ З ЛИ "ЧЕ йси чаї Твх Маї Бек Бек Ата бек твх Мув О1у Рро бек Маї.

ЖВа рЕо цей Аїа во нет вах цу Бу тТВж Бек аїу аїу те Аза. о прин ІІ у ПИШНЕ ів їеа ЗІУ був теч чаї був йкю Тук Ве Рео бів Ро Ч8ї. УБх - нон НН Ши со

У«і Бек Тур Аваробоюк ЯЩУ Для Тез ТМ беж біу Уаї Вів Тих Бра: со панни ун: ИН ю зв жо Аїв Чаї Бем бію бех Бек біу Бех отук бек Печ Бек Бех Уві. ща 185 во: та5 маї тн: чі Бо дек-век веж Бей азу тих їж ТВ Тук Тїб Оу « ння щи 260. о М Б ня М іо - с беп Уві йяп. Вів пув рко Бех дев ТВк Був Чаї Аво був Шуя Уві. г» що я Шия с ва5 сін РКО Бу бек Суц дир муз Ву йія Трж Суй Рго ро Суб РКО; ї - 230 за5 240. т та вго ати пеа їй 1у бу реко беж чаї вне пей Ва СРКо ВКо» со 70 ув РКО пув дер ту тей ме тів ех дху таж риб зій уаї тн

Щ шоошеч вою В ши Ву 7

Сув Уві Уаї Уаї дяр Маї Бек На ОЇ йвр Рко бів Уаї Був Бе 0000 во й о авв

Ф. Кв тТхр тТук Маї двр'ОМу маї ої) жах він дви дій пує жі пув: їх 0 лав ож. зо со ВКО вху 15 1 бій Тук лей Бах ТБ тує аку мат ах Важ Ма рин ни Щи Ши. бо Те Уві Тез Вів біп Хвр Ткр їеп Двп бтТу Був 01» Тук Був. б5 ел з25 850

Сув кує Уаї Бех днй ув кїа їй рЕО діа РТО її ШІ їуУв ТВ

ВЧАННЯ поошкниат ДЯ й пиши: НН и НН ї1є ех пув Ата Пувє Сіу бів Ртодха бій ро бід Маї Туд ТБ

ЯБО ЗБ зв "7 ех йко Бо бех йха йвв'біш бен їх йуз Ан біж Маї дек цен. зв Ж Сув'юва Чаї Бук сту РБо Тух вхо Бек ДЕБВ її діа чаї ЗХ й зво зав 390 "тери чех: дно Му Зі вро ій вав-дай тує ув тих ЖЕ рхо 20 вав ад жов ке ние й яка 0 лань -Я й во ва ре засно ВАД: ся щи с. ота ж кв сс Нодсстьсь. в чі и

Ко ча реж Ар Зек Ар біу Зек Ре вве рей тТук Бех пуй пев. 25 вк Маі Ввроув век йкеа тТху їв іп ЯМу дви Уаї Же бет: Сув о дес чаї мес нів бій А1а пеи Вів дей нів тує Тк Об ую веж - 30

ЗАКО ря и пк ож її ВО АН

Я) Бех їм Бек хо о1у Був со (Послідовність Мо12). ІС о) 35 Для гуманізованих антитіл за цим винаходом та для гуманізованого антитіла 266 можливими є інші м послідовності для легких та важких ланцюгів. Імуноглобуліни можуть мати дві пари комплексів легкий ланцюг/важкий ланцюг, причому до складу як мінімум одного ланцюга входить одна або декілька мишачих гіперваріабельних ділянок, функціонально зв'язаних зі сегментами людської каркасної сегментної ділянки.

За іншим аспектом, цей винахід спрямовано на рекомбінантні полінуклеотиди, які кодують антитіла, до « дю складу яких, у разі їх експресування, входять суперваріабельні ділянки важкого та легкого ланцюга антитіла за -о цим винаходом. Щодо людської каркасної ділянки, амінокислотна послідовність каркасної або варіабельної с ділянки нелюдського імуноглобуліну, який забезпечує гіперваріабельну ділянку, порівнюється з відповідними :з» послідовностями колекції послідовностей варіабельної ділянки людського імуноглобуліну і обирається послідовність, яка має високий відсоток ідентичних амінокислот. Типові полінуклеотиди, які при експресуванні кодують поліпептидні ланцюги, до складу яких входять гіперваріабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів -1 моноклонального антитіла 266, представлені на Фіг.4 та Фіг.5. Унаслідок виродження кодонів та некритичної заміни амінокислот, замість цих послідовностей можуть підставлятись інші полінуклеотидні послідовності. 1 Полінуклеотиди, яким віддається особлива перевага, за цим винаходом кодують антитіла, до складу яких, після со експресування, входять гіперваріабельні ділянки Послідовності Мої - Послідовності Моб або будь-яка з варіабельних ділянок послідовності Мо7 - послідовності Мо10, або легкі та важкі ланцюги послідовності Мо11 та (ее) послідовності Мо12. х До складу полінуклеотидів, як правило, додатково входить полінуклеотидна послідовність контролювання експресії яка функціонально зв'язана з послідовностями кодування гуманізованого імуноглобуліну, з включенням природно-асоційованих або гетерологічних промоторних ділянок. За варіантом, якому віддається ря перевага, послідовностями контролювання експресії будуть еукаріотні промоторні системи у векторах, здатних до трансформування або трансфікування еукаріотних клітин-хазяїв, однак використовуватись можуть також

ГФ) контрольні послідовності для прокаріотних хазяїв. Після включення вектора до складу відповідної лінії 7 клітин-хазяїв, клітина-хазяїн розмножується за умов, придатних для високорівневої експресії нуклеотидних послідовностей з подальшим, за бажанням, збиранням та очищенням легких ланцюгів, важких ланцюгів, димерів, во які складаються з легких/важких ланцюгів або інтактних антитіл, зв'язувальних фрагментів або інших імуноглобулінових форм.

Нуклеотидні послідовності за цим винаходом, здатні до кінцевого експресування необхідних гуманізованих антитіл, можуть формуватись із цілого ряду різних полінуклеотидів (геномна або кДНК, РНК, синтетичні олігонуклеотиди тощо) та компонентів (наприклад, ділянки М, 9), О та С), а також за допомогою цілого ряду в5 різних способів. Поєднання відповідних геномних та синтетичних послідовностей є загальноприйнятим способом продукування, однак використовуватись можуть також послідовності кДНК.

Послідовності ДНК людських константних ділянок можуть виділятись за добре відомими методиками з різноманітних людських клітин, однак за варіантом, якому віддається перевага, з іморталізованих В-клітин.

Гіперваріабельні ділянки для продукування імуноглобулінів за цим винаходом будуть подібним же чином одержуватись із нелюдських моноклональних антитіл, здатних до зв'язування з епітопом між амінокислотами 13 та 28 АВ пептиду, причому згадані моноклональні антитіла продукуються у будь-якому придатному джерелі-ссавці, у тому числі мишах, пацюках, кроликах або інших хребетних, здатних до продукування антитіл добре відомими методами, як описувалось перед тим. Відповідні клітини-джерела для полінуклеотидних послідовностей та клітини-хазяї для експресії та секретування імуноглобулінів можуть одержуватись із ряду 7/0 джерел, добре відомих у цій галузі.

На додаток до гуманізованих імуноглобулінів, конкретний опис яких наведено, інші "по суті гомологічні" модифіковані імуноглобуліни можуть легко створюватись та одержуватись за допомогою різноманітних методів рекомбінантних ДНК, добре відомих фахівцям у цій галузі. Наприклад, каркасні ділянки можуть відрізнятись від нативних послідовностей на рівні первинної структури декількома амінокислотними замшами, кінцевими та проміжними доданнями та делеціями тощо. Більше того, цілий ряд різноманітних людських каркасних ділянок може використовуватись самостійно або у комбінації як основа для гуманізованих імуноглобулінів за цим винаходом. Взагалі, модифікації генів можуть легко здійснюватись за допомогою цілого ряду добре відомих методів, наприклад, сайт-спрямованого мутагенезу.

За альтернативним варіантом можуть продукуватись поліпептидні фрагменти, до складу яких входить лише 2о частина структури основного антитіла, причому згадані фрагменти мають одну або декілька імуноглобулінових активностей (наприклад, комплементзв'язувальну активність). Ці поліпептидні фрагменти можуть продукуватись протеолітичним розщепленням інтактних антитіл за допомогою методів, добре відомих у цій галузі, або шляхом введення стоп-кодонів до необхідних положень у векторах за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу, наприклад, після СНІ для одержання Бар фрагментів або після шарнірної ділянки для одержання К(ар)2 сч ов фрагментів. Одноланцюжкові антитіла можна одержувати шляхом сполучення легкого (МІ) та важкого (МН) ланцюгів за допомогою лінкерної ДНК. і)

Як вказувалось перед тим, кодувальні нуклеотидні послідовності будуть експресуватись у хазяях після функціонального зв'язування послідовностей (наприклад, позиціонованих для забезпечення функціонування) з послідовністю контролювання експресії. Ці вектори експресії як правило, реплікуються у «- зо Мікроорганізмах-хазяях як епісоми або як складова частина хромосомної ДНК хазяїна. До складу векторів експресії, як правило, входять селекційні маркери, наприклад, тетрациклін або неоміцин, для забезпечення со виявлення трансформованих клітин із необхідними послідовностями ДНК. со

Е.соїї представляє собою прокаріотного хазяїна, придатного, зокрема, для клонування полінуклеотидів за цим винаходом. До числа інших хазяїв-мікробів, придатних для використання, належать бацили, наприклад, о

Васійив зи!ИБійй5, та інші ентеробактерії, наприклад, ЗаІтопейа, Зегтайз та інші види Рзепдотопавз. У цих ї- хазяях-прокаріотах можна також створювати вектори експресії, до складу яких, як правило, будуть входити послідовності контролювання експресії, сумісні із клітиною-хазяїном (наприклад, сайт ініціювання реплікації).

На додаток до цього, присутньою може бути будь-яка кількість добре відомих промоторів, таких як лактозна промоторна система, триптофанова (гр) промоторна система, бета-лактамазна промоторна система або « промоторна система з фагу лямбда. Згадані промотори будуть, як правило, контролювати експресію, в с факультативно з операторного послідовністю, та мати послідовності сайту зв'язування рибосом тощо для ініціювання та закінчення транскрипції та трансляції. ;» Для експресії можуть використовуватись також інші мікроби, такі як дріжджі. Сахароміцети є хазяїном, якому віддається перевага, з придатними векторами, які мають послідовності контролювання експресії, такі як промотори, з включенням З-фосфоглідераткінази або інших гліколітичних ферментів, та сайти ініціювання -І реплікації, термінатори тощо, за бажанням.

Окрім мікроорганізмів, для експресії та продукування поліпептидів за цим винаходом можуть о використовуватись також клітини культур тканин ссавців. Перевага фактично надається клітинам-еукаріотам,

Го! оскільки у цій галузі було створено цілий ряд придатних ліній клітин-хазяїв, здатних до секретування бор інтактних імуноглобулінів, у тому числі лінії клітин яєчника китайського хом'ячка, різні лінії клітин яєчника бо мавп, лінії клітин яєчника сірійського хом'ячка, клітини Неї! а, за варіантом, якому віддається перевага, лінії як клітин мієломи, трансформовані В-клітини, лінії клітин нирок людського зародка або гібридоми. Вектори експресії для цих клітин можуть включати послідовності контролювання експресії, такі як сайт ініціювання реплікації, промотор, енхансер та необхідні сайти обробки інформації, такі як сайти зв'язування рибосом, сайти сплайсинга РНК, сайти поліаденілування та послідовності термінаторів транскрипції. Послідовностями контролювання експресії, яким віддається перевага, є промотори, одержані з імуноглобулінових генів, 5М40,

Ф) аденовірусу, вірусу папілом великої рогатої худоби, цитомегаловірусу тощо. ка Вектори, до складу яких входять необхідні нуклеотидні послідовності (наприклад, послідовності кодування важких та легких ланцюгів та послідовності контролювання експресії) можуть переноситись до клітини-хазяїна во добре відомими методами, які різняться у залежності від типу клітинного хазяїна. Наприклад, для клітин-прокаріотів традиційно вдаються до трансфекції хлоридом кальцію, у той час як для інших клітинних хазяїв може використовуватись обробка фосфатом кальцію або електропорація.

Після експресії цілі антитіла, їхні димери, окремі легкі та важкі ланцюги або інші імуноглобулінові форми за цим винаходом можуть очищатись за стандартними процедурами цієї галузі, у тому числі осадженням 65 сульфатом амонію, іонообмінною, афінною хроматографією, хроматографією з оберненою фазою, гідрофобною хроматографією, гель-електрофорезом тощо. Для фармацевтичних цілей перевага віддається по суті чистим імуноглобулінам, які мають як мінімум приблизно 90-9595 гомогенність, і більша перевага віддається імуноглобулінам, які мають 98-999о5 або більшу гомогенність. Після очищення (часткового або до рівня необхідної гомогенності) поліпептиди можуть використовуватись із терапевтичними або профілактичними цілями, як вказується у цьому описі.

Антитіла (у тому числі імунологічно реактивні фрагменти) вводяться суб'єкту з підвищеним ризиком або суб'єкту, який демонструє АВ-пов'язані симптоми або патологію, таку як клінічна або передклінічна форми хвороби Альцгеймера, синдром Дауна або клінічна чи передклінічна форми амілоїдної ангіопатії, за допомогою стандартних методів введення, за варіантом, якому віддається перевага, периферично (тобто не шляхом /о введення до центральної нервової системи), інтравенозно, внутрішньоочеревинно, підшкірно, долегенево, черезшкірно, внутрішньом'язово, інтраназально, пербукально, сублінгвально або за допомогою супозиторіїв.

Хоча антитіла можуть вводитись безпосередньо до вентрикулярної системи, спінальної рідини або паренхими головного мозку і методи введення до цих ділянок є добре відомі у цій галузі, немає необхідності вдаватись до цих більш важких процедур. Антитіла за цим винаходом є ефективними у разі введення більш простими /5 Методами, які покладаються на периферичну систему кровообігу. Перевагою цього винаходу є здатність антитіла реалізувати свої цілющі ефекти навіть у тому разі, коли воно не доставляється безпосередньо до самої центральної нервової системи. Дійсно, у цьому описі було показано, що кількість антитіла, яка долає гематоенцефалічний бар'єр, дорівнює «0,190 від рівнів у плазмі і що антитіла за цим винаходом демонструють свою здатність до секвестрування АВ у периферичній системі кровообігу, а також до зміни видалення розчинних

АВ з центральної нервової системи та плазми.

Фармацевтичні композиції для введення створюються таким чином, щоб бути придатними для обраного способу введення, і відповідним чином використовуються фармацевтично прийнятні наповнювачі, такі як диспергувальні агенти, буфери, поверхнево-активні речовини, консерванти, солюбілізатори, ізотонічні агенти, стабілізатори тощо. В останньому виданні Кетіпдіоп'є Рпагтасеціїса! Зсіепсез. Маск Рибіїзпіпу Со., Еавіоп, сч

Пенсільванія, яке включено до цього опису як посилання, наведено скорочений виклад технологічних способів виготовлення лікарських засобів, загальновідомих лікарям-практикам. Особливо корисною може виявитись зміна і) характеристик розчинності антитіл за цим винаходом, що зробить їх більш ліпофільними, наприклад, шляхом їх інкапсулювання до ліпосом або шляхом блокування полярних груп.

Перевага віддається системній доставці шляхом інтравенозного, внутрішньоочеревинного або підшкірного «- зо впорскування. Придатні носії для таких упорскувань є самоочевидними. На додаток до цього, однак, введення можна здійснювати через слизові оболонки за допомогою інтраназальних аерозолів або супозиторіїв. Придатні со композиції для таких способів введення є добре відомими і, як правило, включають поверхнево-активні речовини со для полегшення переходу через мембрану. Такі поверхнево-активні речовини часто одержують зі стероїдів або вони представляють собою катіонні ліпіди, такі як М-(1-(2,3-діолеїл)пропіл-М,М,М-триметиламонійхлорид Щео, (ООТМА), або різні сполуки, такі як гемісукцинат холестерину, фосфатиділгліцерин тощо. ї-

Концентрація гуманізованого антитіла у композиції становить від приблизно 0,195 (мас.) до 1595 (мас.) або 2095 (мас.) і буде обиратись, головним чином, виходячи з об'ємів рідини, в'язкості тощо, відповідно до конкретного способу введення, який було вибрано. Таким чином, до складу типової фармацевтичної композиції для впорскування буде входити їмл стерильної забуференої води або забуференого фосфатом фізіологічного « розчину та 1-1400мг гуманізованого антитіла за цим винаходом. Композиція, після одержання, буде піддаватись з с стерильному фільтруванню або її мікробіологічна прийнятність буде забезпечуватись будь-яким іншим . способом. До складу типової композиції для інтравенозного вливання може входити до 250мл рідини, такої як и?» стерильний розчин Рінгера, з концентрацією антитіла 1-100мг/мл або більше.

Терапевтичні засоби за цим винаходом можуть заморожуватись або ліофілізуватись для збереження та Відновлюватись у відповідному стерильному носії перед використанням. Наслідком ліофілізації та відновленням -І може бути різний ступінь втрати активності антитіла (наприклад, із традиційними імуноглобулінами, ДМ антитіла мають схильність до більшої втрати активності, аніж (До антитіла). Це може компенсуватись зміною о дози. рН композиції буде підбиратись таким чином, щоб урівноважувати стабільність антитіла (хімічну та

Го! фізичну) та бути комфортною для пацієнта у разі введення. Взагалі, допустимим є рН між 4 та 8.

Незважаючи на те що наведені методи видаються найзручнішими та найпридатнішими для введення білків, бо таких як гуманізовані антитіла, з відповідною адаптацією, можуть застосовуватись інші способи введення, як наприклад, черезшкірне введення або пероральне введення, за умови розробки відповідної композиції.

На додаток до цього, може виникнути необхідність у застосуванні композицій з контрольованим виділенням із використанням плівок та матриць, які піддаються біохімічному розкладу, або осмотичних мінінасосів, або систем доставки, основу яких становлять декстранові кульки, альгінат або колаген.

Підсумовуючи, композиції для введення антитіл за цим винаходом є доступними і загальновідомими у цій

Ф) галузі і можуть обиратись із цілого ряду варіантів. ка Типові дози можуть оптимізуватись за стандартними клінічними методами і будуть залежати від способу введення та стану пацієнта. 60 Наведені далі приклади призначені для ілюстрування, але не для обмеження винаходу.

У прикладах, які наведено далі, використовують, разом з іншим, мишаче моноклональне антитіло, яке має позначення "266", яке спочатку одержали шляхом імунізації пептидом, який складався з залишків 13-28 людського АВ пептиду. Було підтверджено, що це антитіло вступає до імунної реакції з цим пептидом, однак раніше з'явилось повідомлення, що воно не реагує з пептидом, до складу якого входять лише залишки 17-28 65 / людського АВ пептиду або на будь-яких інших епітопах у межах АВ пептиду. Опис одержання цього антитіла наведено |у патенті США Мо5,766,846)|, який включено до цього опису як посилання. Оскільки у наведених прикладах дається опис експериментів, здійснених у мишачих системах, використання мишачих моноклональних антитіл є задовільним. Однак у способах лікування за цим винаходом, призначених для людей, перевага віддається гуманізованим формам антитіл з імуноспецифічністю, яка відповідає імуноспецифічності антитіла 266.

Приклад 1

Секвестрування доданого АВ пептиду М загальній воді людського організму

Зразки людської цереброспінальної рідини (С5Е) (5Омкл) та людської плазми (5Омкл) інкубували впродовж год. при кімнатній температурі наведеним далі чином: 1. самостійно; 70 2. разом з 5нг АВ.о пептиду; або

З. знг АВ.о пептиду плюс 1мг моноклонального антитіла 266 (опис якого наведено, наприклад, (У патенті США

Мо5,766,846), який включено до цього опису як посилання).

Після цього зразки піддавали електрофорезу у 4-2595 градієнті гелю за неденатурувальних умов, тобто електрофорезу у градієнті гелю за неденатурувальних умов (МОССЕ) та переносили на нітроцелюлозу. Після /5 Цього блоти забарвлювали барвником понсо З (Ропсеаи 5) для вестерн-блотингу, зондували біотин-міченим моноклональним антитілом (306), спрямованим проти перших п'яти амінокислот АВ пептиду, проявляли за допомогою стрептавідину-пероксидази із хрону та детектували засобами підсиленої хемілюмінесценції (ЕСІ).

Діаметр гідратованих матеріалів, які знаходились на смугах блотів, визначали за допомогою маркерів молекулярної маси компанії Рпагтасіа. Таким чином, у разі, якщо АВ пептид є зв'язаним з іншими молекулами,

Він буде проходити за розміром результуючого комплексу.

Вестерн-блоти цереброспінальної рідини з або без 5нг АВ пептиду не демонстрували ознак присутності АВ пептиду у відповідь на детектування, опосередковане антитілом 306. Подібні ж результати одержували для людської плазми. Це було дійсно так, незважаючи на те, що АВ пептид можна було виявити за допомогою електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (50О5-РАСЕ) з подальшим сч вестерн-блотингом із застосуванням тієї ж самої методики на тих же самих зразках цереброспінальної рідини.

Ймовірно, що виявленню АВ пептиду заважали взаємодії між цим пептидом та іншими факторами у рідинах, які і) піддавались перевірці Однак у разі додання Мар 266 під час інкубування як у плазмі, так і у цереброспінальній рідині виявлялись характеристичні смуги, які представляли секвестрований АВ пептид у комплексі з антитілом. Головна смуга припадає на приблизно 1їнм гідратований діаметр, що відповідає «- зо Мономеру антитіла, з додатковою меншою смугою при 1Знм, що відповідає димеру антитіла.

Приклад 2 со

Специфічність секвеструвального антитіла со

Були використані зразки, до складу яких входили 5О0мкл людської цереброспінальної рідини або 1Омкл цереброспінальної рідини АРРУ7Л/Р, ДРРУ/Л/Є є трансгенними мишами, які представляють собою мишачу о модель хвороби Альцгеймера, що експресують людський трансген білка-попередника амілоїду з сімейною мутацією хвороби Альцгеймера, наслідком чого є продукування людського АВ пептиду у центральній нервовій системі.

Зразки інкубували з або без різних Маре (їмкг) впродовж год. при кімнатній температурі, після чого « піддавали електрофорезу на 4-2595 МОСОЕ та блотували на нітроцелюлозі, як описано у Прикладі 1. Були використані наведені далі антитіла: 8 с Маб 266 (зв'язується з положеннями 13-28); ц Маб 408 (зв'язується з положеннями 17-24); "» ОсСВпан (кроляче поліклональне антитіло для положень 1-40); мишачий Ідс (неспецифічний);

Маб 306 (зв'язується з положеннями 1-5); -І Маб 21Е12 (зв'язується з положеннями 33-42);

Маб бЕ10 (зв'язується з положеннями 1-17); та і-й ОСВ о до (кролячі поліклональні антитіла до АВ.до та АВ»). (ее) Виявлення комплексу АВ пептид-антитіло здійснювали за описом, який було наведено у Прикладі 1 - мічене біотином антитіло 306 (до М-кінцевої ділянки АВ пептиду) з подальшим використанням со стрептавідину-пероксидази із хрону та підсиленої хемілюмінесценції. Подібному детектуванню піддавали - М людську цереброспінальну рідину, інкубовану з Маб 266, з заміною, у деяких випадках, ЗО6 на ОСВ до до, яке зв'язується з карбоксильними кінцевими ділянками АВ.

Результати показали, що з-посеред випробуваних антитіл лише Мар 4058 та Мар 266 забезпечували

Виявлення АВ пептиду.

Результати показали, що у разі людської цереброспінальної рідини, лише Мар 266 та Мар 408 були іФ) здатними до секвестрування комплексу антитіло-АВ у кількостях, які піддавались визначенню (знову таки, без ко будь-якого антитіла АВ не виявляється). Мар 266 забезпечувало одержання подібних результатів, які були одержані з людською цереброспінальною рідиною у разі використання цереброспінальної рідини АРР УР бо трансгенних мишей. АВ пептид може секвеструватись у людській цереброспінальній рідині з використанням Мар 266 незалежно від того, чи було використано для проявлення вестерн-блоту антитіло ЗО6б, чи ОСВ до 42.

Приклад З

Демонстрування комплексу АВ пептиду-антитіло 266 за допомогою двовимірного електрофорезу

Зразок, до складу якого входило 5О0нг АВ 54о пептиду, інкубували з 2мкг Мар 266 при температурі 3720 65 впродовж Згод. Відповідне інкубування самого Мав 266 було використано як контроль.

Після цього зразки були піддані 2-вимірному гель-електрофорезу. У першому напрямку, інкубовані зразки піддавали МОССЕ за описом, який було наведено у Прикладі 1. Після цього поліакриламідний гель розрізували на окремі стовпчики перпендикулярно потоку першого напрямку, і у другому напрямку здійснювали відокремлення гелю за денатурувальних/відновлювальних умов засобами 50О5-РАСЕ (трицин-сечовинний гель).

Присутність смуг виявляли забарвлюванням понсо 5 (будь-який білок) або специфічним проявленням із використанням 6Е10 Маб (компанія Зепегйек, Іпс.) та біотинілованого антимишачого АВ у системі виявлення на основі пероксидази із хрону.

Забарвлювання нітроцелюлозних блотів понсо З після перенесення забезпечувало візуалізацію важких та легких ланцюгів лише Мар 266. Була підтверджена присутність АВ пептиду у комплексі з Мар 266, оскільки 7/0 бпостерігали смугу при 4 кДа, яка співпадала з розміром повномірного Мар 266, яке реєструвалось після МОСОЕ у першому напрямку.

Приклад 4

Демонстрування нееквівалентності зв'язування та секвестрування

Гадають, що АВ пептид під час циркулювання у плазмі та цереброспінальній рідині знаходиться у комплексі з білками, у тому числі з аполіпопротеїном Е (ароЄ). Цей приклад демонструє, що антитіла до ароЕ, незважаючи на здатність до зв'язування з комплексом, не секвеструють ароєЄ з залишкової частини комплексу.

АроЕ комплекси (50ООнг) інкубували з Маб або поліклональними антитілами до ароЕ (2мкг) при температурі 372 впродовж год. Після цього інкубовані зразки піддавали МОССОЕ за методикою, опис якої наведено у

Прикладі 1. Після МООСЕ здійснювали вестерн-блотинг з очищеними засобами афінної хроматографії козячими анти-ароЕ антитілами з детектуванням засобами підсиленої хемілюмінесценції. У разі відсутності антитіла, ароЕ може детектуватись при 8-1З3нм, що відповідає його присутності у ліпопротеїнових частинках. Наслідком присутності моноклональних або поліклональних антитіл до ароЕЄ є популяційний зсув ароЕ до більших молекулярних видів, "суперзсув". Це демонструє, що антитіла до ароЕ не секвеструють, тобто не видаляють ароєЄ з ліпопротеїнової частинки, скоріше, вони зв'язуються з ароЕЄ на ліпопротеїнах з утворенням більших с молекулярних видів.

Приклад 5 і)

Секвеструванню АВ не перешкоджають анти-ароЕє антитіла

Зразок 100мкл людської цереброспінальної рідини інкубували лише з Мар 266, поліклональним анти-ароЕ або з обома антитілами впродовж бохв. при температурі 3720. Після цього зразки аналізували засобами МООСЕ -(де за описом, який було наведено у прикладі 1, і виявлення смуг здійснювали за описом, який було наведено у

Прикладі 1. со

Результати показали, що доти, доки до зразка додавали Мар 266, видимою була смуга при приблизно 11нм ее діаметрі, характерна для секвестрованого комплексу антитіло 266-АВ пептид. Подібне спостерігається незалежно від того, чи є присутнім або відсутнім анти-ароЄє. Ця смуга, яка демонструє секвестрований АВ, юю

Зз5 З'являється також у тому разі, коли до інкубаційної суміші додається 5ХОнм АВ пептиду у присутності Мар 266. ч-

Таким чином, зміна молекулярної маси ароЕмЄ завдяки присутності анти-ароєЄ антитіл не перешкоджає секвеструванню АВ пептиду Мар 266.

Приклад 6 «

Секвестрування АВ пептиду іп мімо

А. Трансгенні АРРУТТЕ миші, яких називають також РОАРР мишами, надекспресують мутантну форму /-- с людського АРР білка. Ці миші продукують людський АВ у центральній нервовій системі і мають підвищені рівні и людського АВ пептиду, що циркулює у цереброспінальній рідині та плазмі. П'ятимісячним мишам інтравенозно ,» впорскували фізіологічний розчин або 10О0мкг Мар 266. Мишей знекровлювали через 1Охв. після першого впорскування і знову через 20год. після першого впорскування.

Зразки, які вміщували 20мкл плазми від кожної тварини, аналізували засобами МОССЕ та вестерн-блотингу з -і антитілом 306 за описом, який було наведено у Прикладі 1. У тварин, яким було впорснуто фізіологічний розчин, сл не виявляли присутності характеристичної 1їнм смуги секвестрованого АВ пептиду ні через 1Охв., ні через 20год. Однак у двох тварин, яким було впорснуто Маб 266, ця смуга з'явилась через 20год. со В. У цьому дослідженні були використані двомісячні АРРУ7Є миші. У день нуль мишам або не вводили Мар оо 20 266, або вводили 1мг чи 10Омкг цього антитіла. Зразки плазми відбирали за два дні до введення антитіл та на 1, 3, 5 та 7 дні. Зразки плазми піддавали спочатку МОСС, потім вестерн-блотингу та детектуванню за -з допомогою антитіла 306 за описом, який було наведено у Прикладі 1. Комплекс Мар 266/АВ виявляли в усіх часових точках після введення Мар 266, якщо тільки зразок плазми не піддавали обробці білком б, який зв'язується з імуноглобуліном, і, таким чином, ефективно видаляє Маб 266. Відповідні рівні комплексу виявляли впродовж усього експериментального періоду, за виключенням невеликого зниження на сьомий день у тварин, о яким було впорснуто 100мкг Мар 266; взагалі, рівні у тварин, яким було впорснуто 1О0Омкг, були відповідно нижчими за рівні, які виявляли у мишей, яким було впорснуто 1мг цього антитіла. де С Двом двомісячним АРРУ7 7 мишам інтравенозно вводили мг Ма 266 і від кожної відбирали 25мкл зразок плазми. Зразок плазми піддавали МОСОСЕ з подальшим вестерн-блотингом за описом, який було наведено 60 перед тим, за виключенням того, що після зв'язування з біотинілованим 306 здійснювали детектування за допомогою 725І-стрептавідину (компанія Атегейат) з експозицією на екрані, що світиться. Рівень вмісту комплексу визначали шляхом порівняння зі стандартною кривою з використанням відомих кількостей АВ4О У комплексі з насичувальними рівнями Маб 266 і подібним же чином виявляли. Кількість АВ пептиду, зв'язаного з

Мар 266, оцінювали на рівні приблизно 17ООнг/мл, що представляло приблизно 1000-разове збільшення бо порівняно з ендогенним АВ пептидом у цих мишей, вміст якого визначався на рівні приблизно 10Опг/мл. Це також подібно до рівня АВ пептиду у мозку АРР 7777 мишей перед відкладенням АВ (50-100нг/г); людський АРР та людський АВ у АРРУ7 "Ту мишей продукується майже виключно у головному мозку. Таким чином, видається, що присутність Мар 266 у плазмі відіграє роль поглинача АВ пептиду і полегшує загальний відтік АВ пептиду з центральної нервової системи до плазми. Ймовірно, що цей підвищений загальний відтік є наслідком як підвищення відтоку АВ з центральної нервової системи до плазми, так і запобігання повторного повернення АВ із плазми до головного мозку.

Відповідну величину секвестрованого АВ пептиду було підтверджено шляхом піддання 2Омкл зразків плазми, які були одержані від АРР МУ7/Є мишей через 24год. після впорскування їмг Мар 266, 505-РАСЕ 70. (ТРИС-буфер-трициновий гель) з подальшим здійсненням вестерн-блотингу з використанням анти-АВ антитіла бЕ1ТО перед або після обробки білком С, який був нанесений на кульки. Смуга, вичерпана білком С, була виявлена при 4-8кДа, що відповідало присутності мономерів і, можливо, димерів АВ пептиду. р. Двомісячним АРР 777 мишам вводили забуферений фосфатом фізіологічний розчин (п-7) або 500мкг біотинілованого Мав 266, тобто т266В (п-9) внутрішньоочеревинно. Зразки плазми, які були відібрані перед та 72 Через 24год. після впорскування, аналізували на загальний вміст АВ пептиду за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА), модифікованого за методом Джонсон-Вуда К. (оппзоп-УУоса К.) та інших,

Ргос. Май. Асад. сі. ОБА (1997) 94:1550-1555; та Бейлса К.Р. (Ваіез К.К.) та інших, Маїшге Сепеї. (1997) 17:263-264. Загальний АВ, зв'язаний з т266В, визначали за допомогою 9б-лункових планшетів Оріїріасгез (компанія РаскКага, Іпс), сенсибілізованих т3Об. Розбавлені зразки плазми та стандарти (різні концентрації АВ/о та т2668) інкубували впродовж ночі на сенсибілізованих планшетах і загальну кількість комплексу АВ/т266В визначали за допомогою 125|-стрептавідину. На додаток до цього, у 24год. часовій точці, зразки плазми спочатку обробляли білком С для кількісного визначення АВ пептиду, який не зв'язався з Ма 266, і АВ загальний та АВ42 у цереброспінальній рідині визначали за допомогою ЕГІЗА. Рівні АВ пептиду у плазмі тварин, яким впорскували забуферений фосфатом фізіологічний розчин, дорівнювали 14Опг/мл як перед, так і після с впорскування. У мишей, яким впорскували Ма 266, рівні у плазмі були такими ж само перед впорскуванням, Ге) однак рівні АВ пептиду, який не зв'язався з Маб 266, через 24год. після впорскування виявленню не піддавались.

Визначали також рівні у цереброспінальній рідині. Цереброспінальна рідина представляє собою позаклітинний компартмент у межах центральної нервової системи і концентрація молекул у цереброспінальній рідині деякою мірою відбиває концентрацію речовин у позаклітинному просторі головного мозку. -

Цереброспінальну рідину виділяли з компартменту великої цистерни. Мишей наркотизували пентобарбіталом і ее) мускулатуру видаляли від основи черепа до першого хребця. Цереброспінальну рідину збирали шляхом обережного проколювання павутинної оболонки, яка вкриває цистерну, мікроголкою під препарувальним со мікроскопом, з відсмоктуванням цереброспінальної рідини до поліпропіленової мікропіпетки. Через 24год. після ю впорскування у цереброспінальній рідині мишей, яким впорскували Мар 266, було виявлено підвищення загального АВ пептиду та приблизно двократне підвищення АВ42, порівняно з цереброспінальною рідиною - мишей, яким впорскували забуферений фосфатом фізіологічний розчин. Це було підтверджено за допомогою гель-електрофорезу за денатурувальних умов із подальшим проведенням вестерн-блотингу з

АР42-специфічним антитілом 21Е12. «

У додатковому експерименті, тримісячним АРР У7/7Туд мишам інтравенозно впорскували забуферений з 70 фосфатом фізіологічний розчин або Мар 266 і рівні АВ.о та Ар.» у цереброспінальній рідині визначали с наведеним далі чином. :з» Для визначення АВ 30 використовували моноклональне антитіло т203, специфічне для АВ до.

Імуноферментний твердофазний аналіз, опис якого було наведено (Джонсон-Вуд К. (оппзоп-Ууоса К.) та інші,

Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА (1997) 94:1550-1555) було модифіковано у радіоїмуноаналіз (КІА) шляхом заміни -1 75 реактиву стрептавідин-пероксидаза із хрону на "25І-стрептавідин. Згадану процедуру для зразків плазми та цереброспінальної рідини здійснювали за неденатурувальних умов, тобто за відсутності гуанідину у буферних о розчинах. Для визначення карбонат-розчинного та нерозчинного АВ у гомогенаті головного мозку, зразки о гомогенізували зі Л100ММ карбонату, 40мМ масі, рН11,5 (4"С) та центрифугували при 100009 впродовж 15хв.

Вміст АВ визначали у супернатантній (розчинній) та осадовій (нерозчинній) фракціях за описом, який було бо наведено перед тим (Джонсон-Вуд К. (оппзоп-Ууоса К.) та інші, Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА (1997) 94:1550-1555) ке з одержанням результатів, які були наведені перед тим. Визначення вмісту комплексу АВ/Мар 266 у плазмі здійснювали за допомогою модифікованого радіоїмуноаналізу. Мишам впорскували біотиніловане Мар 266 (Мар 2668) і зразки плазми відбирали у численних часових точках. Загальний АВ, зв'язаний з Мар 266, визначали за допомогою 96-лункових планшетів Оріїріа(ез (компанія Раскага, Іпс), сенсибілізованих т306. Розбавлені зразки плазми та стандарти (різні концентрації АВ.о та Мар 2668) інкубували впродовж ночі на сенсибілізованих іФ) планшетах і загальну кількість комплексу АВ/Маб 2668 визначали за допомогою 722І-стрептавідину. ко Через Згод. після інтравенозного впорскування Маб 266 у цереброспінальній рідині спостерігалось двократне зростання рівнів АВ до і незначне збільшення АВ 4». Однак через 24год. та 72год. у цереброспінальній рідині бо спостерігалось дво-трикратне збільшення як АВ о, так і АВ». Подібні ж результати одержали при аналізі на АВ об'єднаної цереброспінальної рідини засобами гель-електрофорезу за денатурувальних умов з подальшим вестерн-блотингом. Підвищення вмісту АВ у цереброспінальній рідині, яке спостерігалось, може, ймовірно, пояснюватись відтоком АВ через тканинну рідину головного мозку, який деякою мірою відбивається рівнями у цереброспінальній рідині. 65 Значення має те, що зміна рівнів АВ пептиду у цереброспінальній рідині не може обумовлюватись проникненням Мар 266 до цереброспінальної рідини, оскільки рівні, які визначались Через 24год. після впорскування, і які становили менше ніж 0,195 від рівнів Мав 266 у плазмі, є недостатніми для пояснення цих змін. Ці результати дозволяють зробити припущення про те, що АВ пептид видаляється з паренхими головного мозку до цереброспінальної рідини завдяки присутності антитіла у кровотоку.

Форми АВ пептиду, які є розчинними у забуференому фосфатом фізіологічному розчині або карбонатному буфері, визначали у гомогенатах кори головного мозку тих же самих мишей, яким впорскували Мар 266 і цереброспінальну рідину яких піддавали аналізу за описом, який було наведено перед тим. Спостерігали подібне зростання вмісту цих розчинних форм у гомогенатах кори головного мозку.

Приклад 7 70 Маб 266 відіграє роль "поглинача" АВ пептиду іп мйго

Діалізну камеру сконструювали як систему іп міго, для випробування здатності Мар 266 до відігравання ролі "поглинача" АВ пептиду. тмл людської цереброспінальної рідини вміщували до верхньої частини камери з поліпропіленової трубки, відокремленої діалізною мембраною з визначеною смугою пропускання у межах 10-100кДа від нижньої частини камери, у якій знаходилось 75мкл забуференого фосфатом фізіологічного /5 розчину з або без 1мкг Маб 266.

Видається, що рівноваги досягали через Згод., що визначалось підданням матеріалу у нижній частині камери впливу підкисленого сечовинного гелю з подальшим вестерн-блотингом на АВ пептид із бЕ10 у різні часові точки. Зразки денатурували у мурашиній кислоті до кінцевої 8095 (об'єми.) концентрації і відновлювали за допомогою В-меркаптоетанолу (190). Зразки піддавали електрофорезу (від аноду до катоду) у проточному буфері (0,9М розчин оцтової кислоти) через 4-3595 градієнт поліакриламідного гелю, який вміщував ЄМ розчин сечовини, 595 (об'єми.) льодяної оцтової кислоти та 2,595 ТЕМЕО (М,М,М',М'-тетраметилетилендіамін). Кислий рн гелю нейтралізували перед перенесенням на нітроцелюлозу. У подальшому, для ідентифікування АВ, вдавались до стандартних методів вестерн-блотингу. Виявлені смуги відповідали 4кДа.

Таким чином, кількість АВ, видалена з верхньої камери, визначалась за допомогою твердофазного сч ов імуноферментного аналізу як верхньої так і нижньої камер (п-4) через Згод. Результати різних молекулярномасових смуг пропускання у присутності та за відсутності Маю 266 представлені на Фіг.1. Як і) показано, коли у нижній камері знаходився забуферений фосфатом фізіологічний розчин, мембрану долала лише мінімальна кількість АВ пептиду, у той час як у разі присутності Мар 266 та при молекулярномасовій смузі пропускання, яка дорівнювала 25кДа, у нижній камері секвеструвалось 5095 АВ пептиду; у разі підвищення - зо Ммолекулярномасової смуги пропускання до 100кДа, мембрану долали більші кількості і через згадану мембрану проходило майже 10095 АВ пептиду. со

Спостерігалось також, що анти-М-кінцеві АВ антитіла 306 та 1005 у цій системі могли переносити АВ пептид со через мембрану, хоча вони не могли секвеструвати АВ пептид у експериментах, опис яких було наведено у

Прикладі 1. Ці результати показують, що антитіла до АВ пептиду мають достатню спорідненість за цих умов для о зв секвестрування пептиду у фізіологічних розчинах від інших зв'язувальних білків, однак, що Мабз», такі як 266, ї- які є імунореактивними з епітопом у положеннях 13-28, є значно ефективнішими і зв'язуються з більшою спорідненістю.

У подібних же експериментах астроцит-секретований ароЕ4, який очищали за описом Дематтос Р.Б. (ОеМаноз К.В.) та інші, У. Віої. Спет. (1998) 273:4206-4212; Сан І. (цип М.) та інші, У. Меийговсі. (1998) « 18:3261-3272, мав менший, однак статистично значущий ефект щодо підвищення маси АВ у нижній камері. У разі пу с заміни Маб 266 поліклональним ІдсС або сироватковим альбуміном великої рогатої худоби, очевидного ефекту не спостерігалось. з Приклад 8

Приплив АВ пептиду до плазми з центральної нервової системи

А. мкг АВ40 розчиняли у 5мкл пацючої цереброспінальної рідини для підтримання його у розчинному стані, -І після чого впорскували до субарахноїдального простору великої цистерни мишей лінії Зм/ізв-УУервіег дикого типу, які попередньо одержали інтравенозне впорскування забуференого фосфатом фізіологічного розчину (п-3) о або 20Омкг біотинілованого Мар 266 (п-3). У різні часові точки після згаданої обробки у плазмі мишей за (ее) допомогою АВ ЕІ! ІЗА визначали Арзагальний З використанням 306 як сенсибілізувального антитіла та стандартів АВ, змішаних із надлишком біотинілованого 266. До кожного зразка плазми додавали надлишок со біотинілованого 266 після видалення з кожної тварини для визначення АВ у ЕГІ5ЗА. У мишей, яким впорскували - М забуферений фосфатом фізіологічний розчин, мінімально виявні кількості пептиду на рівні О,15нг/мл виявляли як максимальні значення через 30-6бОхв., після чого рівні наближались по суті до нуля. У мишей, яким вводили Мар 266, однак, рівні АВ пептиду у плазмі Через бО0хв. перевищували рівні, які були визначені у мишей, яким

Ввпорскували забуферений фосфатом фізіологічний розчин, у 330 разів (приблизно 5Онг/мл) і через 180хв. ці значення досягли рівня приблизно ООнг/мл.

Ф, В. Цю процедуру повторили з інтравенозним впорскуванням 200Омкг (п-3) або бООмкг (п-3) двомісячним їмо) АРРУТ мишам. Маб 266 у вищезгаданих дозах інтравенозно впорскували З-місячним АРР У7177-/- мишам.

Концентрацію АВ, який зв'язувався з Мар 266, у плазмі визначали за допомогою радіоімуноаналізу перед та у 60 різні часові точки після інтравенозного впорскування. Докладні результати однієї ілюстративної миші представлено на Фіг.2.

Було встановлено, що через чотири дні концентрація АВ, який зв'язувався з моноклональним антитілом Мар 266, зростала від вихідних рівнів 15Опг/мл до рівнів, які перевищували 1ООнг/мл. Шляхом аналізу початкових часових точок на кривій було визначено, що загальна швидкість проникнення АВ загальною ДО плазми АРРУ7 Ту бо мишей становила 42пгмл" хв"! у присутності насичувальних рівнів антитіла.

Вплив Ма 266 на рівні АВ у плазмі мишей дикого типу та АРРУ7"7Ту мишей, а також вплив антитіла на концентрацію АВ у цереброспінальній рідині показують, що наслідком присутності циркуляторного Маб 266 є зміна рівноваги перенесення або транспортування АВ між центральною нервовою системою та плазмою.

Приклад 9

Вплив Маь 266 на АВ у головному мозку

Чотиримісячним АРР У7/Рз/- мишам кожні 2 тижні впродовж 5 місяців робили внутрішньоочеревинні впорскування фізіологічного розчину, Мар 266 (500мкг) або контрольного мишачого ІдС (10Омкг, компанія

РІПпагтідеп). Мишей забивали у дев'ятимісячному віці і визначали відклад АВ у корі головного мозку. Відсоток 70 площі, охопленої АВ-імунореактивністю, що визначався за допомогою кролячого пан-АВ антитіла (компанія ОСВ,

Іпс.), піддавали кількісному визначенню у корі головного мозку шляхом негайного накладення затилля гіпокампу за описом Гольцмана Д.М. (Ної2тап О.М.) та інших, Апп. Меигої. (2000) 97:2892-2897. Результати показано на

Фіг.ЗА. У цьому віці у приблизно половини тварин кожної групи ще не почалось відкладення АВ. Однак у групі, якій вводили Маб 266, відсоток мишей з 25095 загальним вмістом АВ у корі головного мозку був значно меншим (Р-0,02, критерій хі-квадрат). Хоча у дев'ятимісячних АРРУП' мишей може з'явитись велика кількість відкладів

АВ, існує, однак, велика розбіжність, оскільки у приблизно 5095 відклади відсутні, а приблизно 5095 мають значні відклади. Більше ніж 50956 площі кори головного мозку було забарвлено при перевірці присутності АВ шляхом забарвлення у 6/14 та 5/13 мишей, яким вводили забуферений фосфатом фізіологічний розчин та Ідс, у той час як цей рівень забарвлення спостерігався лише у однієї з 14 мишей, яким вводили Маб 266. Майже 5095 тварин в усіх групах все ще не мали АВ відкладів до 9-місячного віку. Це, як видається, обумовлюється батьківським походженням окремих мишей у нашій групі, оскільки, незважаючи на підтвердження того, що усі експериментальні миші належали до АРРУП' ук, високі рівні АВ відкладів спостерігались лише у мишей, які були одержані від 4/8 пар, які розмножувались (приплоди з високою патологією). У мишей, які були одержані від інших 4 пар, які розмножувались, АВ відклади були фактично відсутніми (приплоди з низькою патологією). с

Використовуючи батьківське походження, як коваріантну величину, було встановлено сильний, статистично о значущий вплив т266 на зниження АВ відкладення (р-0,0082, Фіг.3В).

Приклад 10

Периферично впорснуте Ма 266 не зв'язується із бляшками у АРРУ"7 "Ту мишей

Для визначення, чи зв'язується Маб 266, яке впродовж 5 місяців впорскували внутрішньоочеревинно, з АВ у - 3о головному мозку, використовували зрізи головного мозку 9-місячних АРР 7177 4/4Тд мишей, які мали АВ відклади с і яким вводили Мар 266, фізіологічний розчин або контрольний дО. Обробку тканин та імунозабарвлювання здійснювали за описом (Бейлс К.Р. (Ваіез К.К.) та інші, Майте Сепеї. (1997) 17:263-264). Тканину від усіх со груп тварин інкубували із флуоресцеїн-міченим антимишачим Ідс (компанія Месіог, Іпс.), після чого вивчали за юю допомогою флуоресцентного мікроскопа. У жодній групі не спостерігалось специфічного забарвлення АВ відкладів. У протилежність до цього, у разі нанесення Мар 266 на зрізи перед інкубуванням зрізів з - антимишачим Ідс, АВ відклади були чітко виявленими.

Приклад 11

Вплив введення антитіла 266 на пізнавальну діяльність 24-місячних трансгенних. гемізиготних РОАРР мишей « 20 Було використано шістнадцять гемізиготних трансгенних мишей (АРР 77), На початку дослідження миші ш-в були приблизно 24-місячного віку. Усі впорскування були внутрішньоочеревинними (і.р.). Половина мишей с одержувала щотижневі впорскування забуференого фосфатом фізіологічного розчину (РВ5, "Сопіго!"), інша :з» половина одержувала 5О0Омкг мишачого антитіла 266, яке було розчинене у забуференому фосфатом фізіологічному розчині. Впорскування здійснювали впродовж семи тижнів (42 дні), усього шість упорскувань. 415 Впродовж трьох днів після останнього впорскування поведінку тварин оцінювали за допомогою завдання на - розпізнавання об'єкта по суті за описом, який було наведено Дж.-К. Додартом (9.-С. Бодай) та іншими,

Вепаміога! Мецйговзсіепсе, 113 (5) 982-990 (1999). Обчислювали коефіцієнт розпізнавання (Т в100/Тв-Тд). 1 Результати наведено далі у Таблиці 1. с со

Вентольрвяя 20100008 дтитлюо вв 8 ба о о Щотижневе введення 5О0Омкг антитіла 266 24-місячним гемізиготним трансгенним мишам було пов'язане зі значними змінами у поведінці. Коефіцієнти розпізнавання у трансгенних мишей, яким вводили антитіло, були 60 дуже подібними до коефіцієнтів розпізнавання контрольних тварин дикого типу |Дж.-К. Додарт (у.-С. бодаг) та інші). Різниця у коефіцієнті розпізнавання була статистично значущою на рівні ймовірності 0,001. Підвищений індекс розпізнавання є свідченням того, що лікування антитілом, яке зв'язується з бета-амілоїдним пептидом на ділянці амінокислот 13-28 буде реверсувати порушення поведінки, яке було задокументовано у цієї мишачої моделі хвороби Альцгеймера. Таким чином, введення антитіл, які зв'язують бета-амілоїдний пептид на ділянці бо амінокислот 13-28, буде лікувати такі хвороби, як хвороба Альцгеймера та синдром Дауна і зупинить погіршення пізнавальної діяльності, яке, як правило, пов'язують із розвитком хвороби.

Загальний вміст амілоїду у корі головного мозку (96 площі, яка покривалась імунореактивним матеріалом після забарвлювання анти-АВ антитілами 306 або 21Е12) піддавали кількісному визначенню шляхом негайного накладення гіпокампу із включенням ділянки пояска (над мозолистим тілом) та тім'яної ділянки головного мозку 24-місячних тварин, яким вводили мишаче антитіло 266 впродовж семи тижнів, як описувалось перед тим.

Результати представлені у таблиці, яка наведена далі. Різниці між експериментальними групами статистично не значущі. й

АРРУТІТЕ ху. мишей після обробки мишачим анти-АВ антитілом 266 1 альне 11111111 іАнтитло 26680 звЮ11112еб1бе3111от

У цих дуже старих тварин обробка мишачим антитілом 266 не викликала значних змін у загальному вмісті амілоїду порівняно із групою, якій вводили забуферений фосфатом фізіологічний розчин, незалежно від того, чи визначення робили за допомогою 306, чи 21Е12. Більше того, загальний вміст АВ був значно більшим і значно 720 збільшився порівняно з загальним вмістом амілоїду у молодших тварин (дивись далі), які втратили здатність відрізняти новий об'єкт від знайомого об'єкта у завданні на розпізнавання об'єкта. Найбільше здивування викликало те, що ці результати показували, що анти-АВ антитіла можуть реверсувати порушення пізнавальної діяльності без обов'язкового зменшення загального вмісту амілоїду рег зе.

Після 7-тижневого лікування коефіцієнт розпізнавання групи, яка одержувала т266, не мав значної різниці, с 25 цого можна було б очікувати для групи дикого типу 24-місячних мишей! Це вказує на повне реверсування Ге) погіршення пізнавальної діяльності у цих трансгенних тварин.

Приклад 12

Вплив введення антитіла 266 на пізнавальну діяльність молодих трансгенних, гемізиготних РОАРР мишей

Було використано п'ятдесят чотири (54) гомозиготних трансгенних мишей (АРР У7/т), На початку - дослідження двадцять три (23) миші були приблизно двомісячного віку. Решта мишей на початку дослідження (ее) була приблизно у чотиримісячному віці. Тривалість експерименту дорівнювала п'яти місяцям. Таким чином, під со час закінчення експерименту миші були у віці приблизно семи (7) та приблизно дев'яти (9) місяців.

Усі впорскування здійснювали внутрішньоочеревинно (ір.). Кожна миша у контрольних групах "Рв" ІФ) з одержувала щотижневе впорскування забуференого фосфатом фізіологічного розчину (Рв; 200Омкл). Кожна М миша у контрольних групах "Ос" одержувала щотижневе впорскування контрольного ізотипового ІдсС1Кк1 (1ООмкг/мишу на тиждень). Кожна миша у групах "Нідп ЮБозе" одержувала щотижневе впорскування 500мкг антитіла 266, яке було розчинене у забуференому фосфатом фізіологічному розчині ("НО"). Кожна миша у групі "Го Бозе" одержувала щотижневе впорскування 10Омкг антитіла 266, яке було розчинене у забуференому « 20 фосфатом фізіологічному розчині (0). Через три дні після останнього впорскування поведінку тварин -в оцінювали за допомогою завдання на розпізнавання об'єкта, як описано у Прикладі 10, який було наведено с перед тим, і коефіцієнт розпізнавання обчислювали як різницю між часом, який було проведено на новому :з» об'єкті, та часом, який було проведено на знайомому об'єкті. Результати наведено далі у Таблиці 3. Дані згруповано за віком мишей на момент закінчення досліджень. 5 т с 11 Коерцент ропонаваня свиню 111111 со те со 72 -3 евро 1ввя1111111в вв 00000852 змен 00001 уй вв 8о50010000000360000010000жю о ов ю вві 61000016 "р«0,05 »

Узяті разом, ці дані підтверджують висновок про те, що введення антитіла 266, антитіла, яке спрямовано проти центрального домену АВ, зменшує відкладення бляшок у 7-9-місячних АРР У7 трансгенних мишей, а також реверсує порушення поведінки, які реєструвались раніше. Лікування пацієнтів антитілом, спрямованим бо проти центрального домену АВ пептиду, буде пригнічувати або запобігати погіршенню пізнавальної діяльності,

яке, як правило, пов'язується з розвитком хвороби, і буде реверсувати його.

Коефіцієнт розпізнавання у тварин, які піддавались обробці, суттєво не відрізнявся від того, якого можна було б очікувати для мишей дикого типу того ж самого віку. Таким чином, як і у тварин старішого віку (Приклад 11), лікування за допомогою т266 повністю реверсувало погіршення пізнавальної діяльності у цих трансгенних тварин молодшого віку.

Приклад 13

Синтез гуманізованого антитіла 266

Клітини та антитіла. Лінію клітин мієломи мишей Зр2/0 одержали від АТСС (Американська колекція типових 7/о культур) (Мапавзав, штат Вірджинія) і підтримували у модифікованому за способом Дульбекко середовищі Ігла, до складу якого входило 1095 ЕВ5 (сироватка зародка великої рогатої худоби) (номер за каталогом 5Н32661.03, компанія НуСіопе, Їодап, штат Юта), у СО 5-інкубаторі при температурі 372. Мишачі гібридомні клітини 266 спочатку вирощували у середовищі КРМІ-1640, до складу якого входило 1095 ЕВ5 (компанія НусСіопе), 10ММ

ГЕПЕС-буферу, 2мМ глутаміну, О,1мММ незамінних амінокислот, 1мМ пірувату натрію, 25мкг/мл гентаміцину, і далі 75 розмножували у безсироватковому середовищі (Нубгідота ЗЕМ, номер за каталогом 12045-076, компанія Ге

Тесппоіодіез, КоскмШе, штат Меріленд), до складу якого входило 290 ЕВ5 з низьким вмістом Ід (номер за каталогом 30151.03, компанія НуСіопе), до об'єму 2,5л у ролерних флаконах. Мишаче моноклональне антитіло 266 (Ми266) очищали з культурального супернатанту шляхом афінного хроматографування за допомогою колонки ргоїеіп-с Зерпагозе. Біотиніловане Ми26б6 одержували за допомогою Е2-Гіпк З!ийо-МНЗ-І С-І С-Віокіп (номер за каталогом 21338272, Ріегсе, КосКога, штат Іллінойс).

Клонування кДНК варіабельних ділянок. Тотальну РНК екстрагували з приблизно 10 " гібридомних клітин за допомогою реактиву ТВЇЇ20! (компанія І йе Тесппоіодіев) і полі(А) "РНК виділяли за допомогою системи для виділення мРНК РоїуАтТгасі тАфМА ІзоЇайоп Зузіет (компанія Рготеда, Мадізоп, штат Вісконсін) за протоколами постачальника. Дволанцюжкову кКДНК синтезували за допомогою набору для ампліфікації КДНК ЗМАКТКАСЕ Ге сОМА Аптріїйісайоп Кії (компанія Сіопіесі, Раю Айо, штат Каліфорнія) за протоколом постачальника. кКДНК о варіабельних ділянок для легких та важких ланцюгів ампліфікували за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (РОК) з використанням 3' праймерів, які ренатурували ДНК відповідно до константних ділянок мишачих каппа та гамма ланцюгів, та 5 універсального праймера, які постачаються у складі набору ЗМАКТКАСЕ соОМА

Атріїйісайоп КІії. 3 праймер для МІ РСК має наведену далі послідовність: - 7 Б'-ТАТАОВОСТОААОСТТОСАТСОТОССАВСАТОСАТАСАСТТОСТеСЗ я со

Послідовність Мо13) со з залишками 17-46, які гібридизувались до мишачої СК ділянки. З праймери для МН РСК мають вироджені послідовності: й що) я є т ї- 5?" ТАТАВАВСТОААССТТОСАСТОВАТАВАССОАТОВССТОТОСТТТОВС-В

Послідовність Мо14) « з залишками 17-50, які гібридизувались до СНІ мишачого гамма ланцюга. кДНК легких та важких ланцюгів пт») с субклонували у векторі рСКаВішпі-ТОРО (компанія Іпмийгодеп, Сагізрад, штат Каліфорнія) для секвенування.

Секвенування ДНК здійснювали за допомогою секвенувальних полімеразно-ланцюгових реакцій із :з» флуоресцентними дидезокситермінаторами (компанія Арріїей Віозузіетв, Ровіег Сйу, штат Каліфорнія) за інструкцією постачальника. Реакції секвенування аналізували на ДНК-секвенаторі Модель 377 (компанія Арріїейд

Віозувіетзв). -І Конструювання варіабельних ділянок гуманізованого 266 (Ни266).

Гуманізацію М ділянок мишачого антитіла здійснювали за описом Квіна (Оцееп) та інших |Ргос. Май). Асад. о Зсі. ОСОБА 86:10029-10033 (1988)). Людський каркас М ділянки, який було використано як реципієнт для о гіперваріабельних ділянок Ми266б, обрали, виходячи з гомології послідовностей. Для конструювання молекулярної моделі варіабельних ділянок були використані комп'ютерні програми АВМОО та ЕМСАО |Левітт М. со (Гемій М.), 9. Мої. Віої. 168:595-620 (1983)). Амінокислоти гуманізованих М ділянок, які, за прогнозом, мали шк контакт із гіперваріабельними ділянками, замінили на відповідні залишки Ми266. Це було зроблено на залишках 46, 47, 49 та 98 важкого ланцюга та на залишку 51 легкого ланцюга. Амінокислоти гуманізованої М ділянки, які, як було встановлено, були рідкісними у такій же підгрупі М ділянки, замінили на консенсусні амінокислоти для 5Б ліквідування потенційної імуногенності. Це було зроблено на залишках 42 та 44 легкого ланцюга.

Гени варіабельних ділянок легких та важких ланцюгів конструювали та ампліфікували з використанням (Ф. восьми синтетичних олігонуклеотидів, які перекривались, і довжина яких коливалась у межах від приблизно 65 ка основ до 80 основ Ц(ГеКсі. (Не Х.У.) та інші, 9. ІттипоїЇї. 160:029-1035 (1998)). Олігонуклеотиди ренатурувались попарно та подовжувались фрагментом Кльонова ДНК-полімерази | з одержанням чотирьох бо дволанцюжкових фрагментів. Одержані фрагменти денатурували, попарно ренатурували та подовжили фрагментом Кльонова з одержанням двох фрагментів. Ці фрагменти денатурували, попарно ренатурували та ще раз подовжили з одержанням повномірного гена. Одержаний продукт ампліфікували за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції з використанням системи Ехрапа Нідп Рідейу РСК Зузіет (компанія Коспе

Моїіесшціаг Віоспетісаї!5, Іпаіапароїїв, штат Індіана). Фрагменти, ампліфіковані за допомогою 65 полімеразно-ланцюгової реакції, очищали у лунках із гелем та клонували у векторі рОК4ВіІшпі-ТОРО. Після підтвердження послідовностей, гени МІ та МН розщеплювали за допомогою Мін! та хХвраї, очищали у лунках із гелем та субклонували відповідно до векторів для експресування легких та важких ланцюгів з одержанням рУк-Ни266 та рМаІ-Ни266 (дивись Фіг.б та Фіг.7, відповідно, у цьому описі). (Ко М.С. (Со М.5.) та інші, 9.

Іттипої. 148:1149-1154 (1992)). Зріле гуманізоване антитіло 266, експресоване з цих плазмід, має легкий ланцюг із Послідовністю Мо11 та важкий ланцюг із Послідовністю Мо12.

Стабільна трансфекпія. Стабільну трансфекцію лінії клітин мієломи мишей Бр2/0 здійснювали електропорацією за допомогою апарату Сепе Риїзег (компанія ВіоКкай, Негсцевз, штат Каліфорнія) при 360 В та 25мМКФ, як описувалось (Ко (Со) та інші, 1992). Перед трансфекцією ДНК плазмід рук-Ни266 та руадІ-Ни266 лінеаризували за допомогою Еврі. 20мкг рук-Ни266 та 40мкг руді-Ни266 трансфікували приблизно 107 клітин 70 ЗРр2Ю. Трансфіковані клітини суспендували у модифікованому за способом Дульбекко середовищі Ігла, до складу якого входило 1095 ЕВ5, та висівали на декілька 9б-лункових планшетів. Через 48год. клітини переносили на вибірне середовище (модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла, до складу якого входило 1095

ЕВ5, додаток до живильного середовища НТ, 0,Змг/мл ксантину та Імкг/мл мікофенольної кислоти). Через приблизно 10 днів після початку відбирання, культуральні супернатанти аналізували на продукування антитіл за 75 допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА), як показано далі. Високопродуктивні клони розмножувались на модифікованому за способом Дульбекко середовищі Ігла, до складу якого входило 1095 ЕВ5, і піддавались додатковому аналізу на експресію антитіл. Після цього відібрані клони адаптувались до вирощування на живильному середовищі Нубгідота ЗЕМ.

Визначення експресії антитіл за допомогою ЕГІЗА. Лунки 9б-лункового планшету для ЕГІ5А (планшет

Мипс-Іттипо ріа(е, номер за каталогом 439454, компанія МаїдеМипс, МарегмПе, штат Іллінойс) сенсибілізували 100мкл козячих антилюдських ІДС, Реу фрагмент-специфічних, поліклональних антитіл (мкг/мл) (номер за каталогом 109-005-098, компанія Дасквоп ІттипоКевзеагсі, МУУеві ОСгоме, штат Пенсільванія) у 02М натрійкарбонатному-бікарбонатному буфері (рНО,4) впродовж ночі при температурі 42С. Після промивання промивним буфером (РВ5 з 0,195 Твій 20) лунки впродовж ЗОхв. блокували 400мкл буферу Зирегріоск Віоскіпд.д су

Вийег (номер за каталогом 37535, компанія Ріегсе), після чого промивали промивним буфером. Зразки, які о містили Ни266, відповідним чином розбавляли у буфері для ЕГІЗА (РВ5 з 195 бичачого сироваткового альбуміну та 0,195 Твін 20) та наносили на планшети для ЕГІЗА (10Омкл на лунку). Гуманізоване анти-СОЗ3 досі моноклональне антитіло НиМ195 (Ко (Со) та інші, 1992, дивись перед тим) було використано як стандарт.

Планшет для ЕГІЗА інкубували впродовж 2год. при кімнатній температурі і лувки промивали промивним - буфером. Після цього до кожної лунки вносили 1О0О0мкл кон'югованих із пероксидазою із хрону козячих антилюдських каппа поліклональних антитіл (номер за каталогом 1050-05, компанія боційегп Віогїесппоіоду, 09

Віптпіпойпат, штат Алабама) (розведення 1/1000) у буфері для ЕГІЗА. Після інкубування впродовж год. при (ее) кімнатній температурі та промивання промивним буфером, до кожної лунки додатково вносили 100мкл субстрату

АВТ (номери за каталогом 507602 та 506502, компанія Кігкедаага апа Регїту І арогагієв, СайПегериго, штат о

Меріленд). Розвиток забарвлення припиняли доданням 100мкл 295 щавлевої кислоти на лунку. Оптичну густину ї- визначали при 415нм за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів ОРТІтах (компанія Моіесшаг

Оемісез, Мепіо Рагк, штат Каліфорнія).

Очищення Ни266. Один зі стабільних Зр2/0 трансфектантів (клон 109), який забезпечував високий рівень « експресії Ни266, адаптували до вирощування на середовищі Нубгідота ЗЕМ та розмножили до 2л у ролерних флаконах. Відпрацьований культуральний супернатант збирали після того як життєздатність клітин досягала - с рівня 1095 або менше та вносили до колонки ргоїеіп-А Зерпагозе. Колонку промивали РВ5 перед елююванням ц антитіла О0,1М сумішшю гліцину з НСІ (рН2,5), 0,1М Масі. Елюйований білок діалізували проти З змін 2л РВ5 і ,» фільтрували через 0,2мкм фільтр перед збереженням при температурі 42С. Концентрацію антитіла визначали шляхом вимірювання оптичної густини при 28О0нм (Імг/мл-1,4 А ово). 5О5-РАСЕ у трис-гліциновому буфері здійснювали за стандартними процедурами на 4-2095 градієнтному гелі (номер за каталогом ЕСб025, компанія -і Момех, Зап Оіедо, штат Каліфорнія). Очищене гуманізоване антитіло 266 відновлювали та пропускали через гель сл для ЗО5-РАСЕ. Ціле антитіло дає дві смуги із приблизною молекулярною масою 25кДа та 50кДа. Ці результати відповідають молекулярним масам легкого та важкого ланцюга або фрагмента важкого ланцюга, які були (ее) визначені за їхніми амінокислотними складами. со 50 Приклад 14

Іп міго зв'язувальні властивості гуманізованого антитіла 266 -. й Зв'язувальну ефективність гуманізованого антитіла 266, синтезованого та очищеного за описом, який було наведено перед тим, порівнювали з мишачим антитілом 266, із використанням біотинілованого мишачого антитіла 266, за допомогою порівняльного твердофазного імуноферментного аналізу. Лунки 96б-лункового планшету для ЕЇІЗА (планшет Мипс-Іттипо ріаїе, номер за каталогом 439454, компанія Маїдемипс) о сенсибілізували 100мкл В-амілоїдного пептиду (1-42), кон'югованого з бичачим сироватковим альбуміном (ВЗА) у 0,2М натрійкарбонатному/бікарбонатному буфері (рНО,4) (1Омкг/мл), впродовж ночі при температурі 4260. де Кон'югат АВ. л2-В5А одержали шляхом розчинення 7,5мг АВ 4.42-Сузаз (цистеїн С-кінцевої ділянки АВ 4.до, компанія АпабЗрес) у 500мкл диметилсульфоксиду з подальшим негайним доданням 1500мкл дистильованої 60 води. 2мг малеїмід-активізованого бичачого сироваткового альбуміну (компанія Ріегсе) розчиняли у 200мкл дистильованої води. Два розчини змішували, ретельно перемішували та відстоювали при кімнатній температурі впродовж 2год. Відокремлення пептиду, який не вступив до реакції, від кон'югату АВ ..42о-Сув-В5А здійснювали за допомогою гель-хроматографічної колонки.

Після промивання лунок забуференим фосфатом фізіологічним розчином (РВ5) з 0,195 Твін 20 (промивний 65 буфер) за допомогою машини для миття планшетів для ЕГІЗА, лунки блокували доданням 300 мкл реактиву

Зи,ирегВіоскК (компанія Рієегсе) на лунку. Через ЗОхв. блокування лунки промивали промивним буфером і надлишок рідини видаляли.

Суміш біотинілованого Ми266 (кінцева концентрація 0,Змкг/мл) та конкурентного антитіла (Ми266 або Ни266; розпочинаючи з кінцевої концентрації 75Омкг/мл та послідовних З-разових розведень) у буфері для ЕГПІЗА додавали потрійним повторенням до кінцевого об'єму 100мкл на лунку. Додавали 100мкл біотинілованого Ми266 (О,Змкг/мл), яке виконувало роль неконкурентного контролю. Додавали 1О0Омкл буферу для ЕЇІЗА, який виконував роль фонового контролю. Планшет для ЕГІ5А інкубували при кімнатній температурі впродовж 9Охв.

Після промивання лунок промивним буфером, до кожної з них додавали 100мкл кон'югованого з пероксидазою із хрону стрептавідину (мкг/мл) (номер за каталогом 21124, компанія Ріегсе). Планшет інкубували при кімнатній 7/0 температурі впродовж ЗОхв. і промивали промивним буфером. Для проявлення забарвлення додавали 100мкл на лунку пероксидазного субстрату АВТО Регохідазе Зибрвігаїе (компанія Кігкедаага ЄРеїту І арогайогіев).

Розвиток забарвлення припиняли доданням 10Омкл на лунку 295 щавлевої кислоти. Оптичну густину визначали при 415нм. Показники оптичної густини наносили на криву у залежності від сд концентрації конкурентного антитіла, криві апроксимували до експериментальних точок (за допомогою Ргізт) і для кожного антитіла /5 визначали ЇС5О за допомогою методів, загальновідомих у цій галузі.

Середнє значення ІС5О для мишачого 266 становило 4,7мкг/мл (три окремі експерименти, середнє квадратичне відхилення-1,3мкг/мл) і для гуманізованого 266 становило 7,5мкг/мл (три окремі експерименти, середнє квадратичне відхилення-1,1мкг/мл). Було здійснено другу серію із трьох експериментів по суті за описом, який було наведено перед тим. Середнє визначене значення ІС5О для мишачого 266 дорівнювало

З,87мкг/мл (середнє квадратичне відхилення-О,12мкг/мл); середнє визначене значення ІСБО для людського 266 дорівнювало 4,Омкг/мл (середнє квадратичне відхилення-О,5мкг/мл). На основі цих результатів ми дійшли висновку, що гуманізоване антитіло 266 має зв'язувальні властивості, які є дуже подібними до зв'язувальних властивостей мишачого антитіла 266. Таким чином, ми сподіваємось, що гуманізоване антитіло 266 має дуже подібні іп міго та іп мімо активності, порівняно з мишачим антитілом 266 і буде демонструвати на людях такі сч ов Ж самі ефекти, які демонструються мишачим антитілом 266 на мишах.

Приклад 15 (8)

Іп міїго зв'язувальні властивості мишачих антитіл 266 та 458

Спорідненість антитіл (КО-Ка/Ка) визначали за допомогою біосенсора ВіІАсоге 2000 і дані аналізували за допомогою програми ВіАемаїчайоп (версія 3.1). Іммобілізоване антитіло (кроляче антимишаче) за допомогою «- зо Вільних аміногруп сполучали з карбоксильними групами у проточній кюветі 2 чіпу (СМ5) біосенсора з використанням М-етил-М-диметиламінопропілкарбодіїміду та М-гідроксисукциніміду (ЕОС/МН5). Неспецифічний со кролячий дО сполучали у проточній кюветі 1 як фоновий контроль. Моноклональні антитіла іммобілізували з со одержанням 300 резонансних одиниць (КІ). Після цього амілоїд-бета 1-40 або 1-42 (компанія Віозошйгсе

Іпіегпайопа!, Іпс.) пропускали над чіпом із поступово зменшеними концентраціями (1000-0,1К0). Для о відновлення чіпу, зв'язане анти-АВ антитіло елюювали з нього шляхом промивання сумішшю гліцину з НСІ (рнаг). ї-

Контрольне впорскування, яке не містило амілоїду-бета, відігравало роль контролю для вихідного віднімання.

Сенсорограми з етапами асоціації та дисоціації піддавали аналізу для визначення Ка та Ка. Використовуючи цей метод було встановлено, що спорідненість мишачого антитіла 266 як до АВ. до, так і до АВ..4о дорівнювала 4пМ.

Спорідненість 4058 до АВ.40 дорівнювала 23НМ, до АВ. 24нМ. Незважаючи на б6О00О-кратну різницю у « спорідненості до АВ, обидва 266 та 4658, які зв'язуються з епітопами між амінокислотами 13 та 28 АВ, ефективно з с секвеструють АВ з людської цереброспінальної рідини. Таким чином, у визначенні здатності антитіла до секвестрування АВ та забезпечення цілющих та вражаючих переваг за цим винаходом, найважливішим є ;» місцезнаходження епітопу, а не зв'язувальна спорідненість.

Приклад 16

Відображення епітопів мишачого антитіла 266 із використанням методології Віасоге та розчинних пептидів -І ВІАсоге представляє собою автоматизовану біосенсорну систему для визначення молекулярних взаємодій

ІКарлосон Р. (Кагіввоп МК.) та інші, У. ІттипоїЇ. Меїйодвз 145:229-240 (1991)). Перевага ВіІАсоге над іншими о аналізами зв'язування полягає у тому, що зв'язування антигена може визначатись без необхідності мітити або

Го! іммобілізувати антиген (тобто антиген зберігає більш нативну конформацію). Методологія ВіАсоге 5р Використовувалась для оцінки зв'язування різних фрагментів амілоїдного бета пептиду з мишачим антитілом 266 со по суті за описом, який було наведено перед тим у Прикладі 12, за виключенням того, що усі розведення як здійснювали за допомогою забуференого ГЕПЕС фізіологічного розчину із Твін 20, впорскували різновид фрагментів АВ (компанія Віозоигсе Іпіепайопаї) і впорскувалась одна концентрація кожного фрагмента (440ОнМ).

Фрагменти амілоїду бета 1-28, 12-28, 17-28 та 16-25 зв'язувались із мишачим антитілом 266, у той час як дв АВ фрагменти 1-20, 10-20 та 22-35 не зв'язувались. Фрагменти 1-20, 10-20 та 22-35 зв'язувались з іншими Мабз з відомою специфічністю епітопів для цих ділянок АВ. Використовуючи цю методологію було встановлено, що (Ф) зв'язувальний епітоп для мишачого антитіла 266, як видається, знаходиться між амінокислотами 17 та 25 АВ. ка Оскільки зв'язування, як правило, відбувається як мінімум із З залишками епітопу, можна зробити додатковий висновок про те, що цей епітоп знаходиться у межах залишків 19-23. во Приклад 17

Іп міго зв'язувальні властивості гуманізованого антитіла 266

Спорідненість (КО-Ка/Ка) АВ..4» гуманізованого антитіла 266, яке було синтезовано та очищено за описом, який було наведено перед тим, визначали по суті за описом, який було наведено у Прикладі 15. За допомогою цього методу було встановлено, що спорідненість гуманізованого антитіла 266 до АВ..4» дорівнює 4пМ. б5

Й м1.1

Видялений відсоток загального АД. яв Ка 5 ХДА-РВЕ оба з-д хда-РВВ у: ВУ не б5жкДа-РВВ в " 85 ВВ ко 50 хДа-РВЕ 2 ПЕ Що жав Б Щ ббхда Р

А. - УЩЕі Б5 ожкдь-е

І ДНЯ она 5Окдабе о е я шщ й юю ж в ою в в со

РВ5 -забуферений фосфатом фічологічний розвяв: ч - с з -І 1 (ее) о 50 - (Ф. ко бо б5

ФІГ. 2

Рівні АВ у плязмі після впорскування

Я. в Щи

Й КВ 4 - орних ведовіх зниилеи зломити зантиє пекан знанні ІЙ со 0 1009, 2000 8000 4000 5ОВО 6000 7009 я. со щі «

З с з -І 1 (ее) со 50 - в 52

Ф, їмо) 60 б5

Фіг. З 3 йо: Й ай й ЩІ 105 ї! і «и бен й» щі х 7

ЗЕ ж ! жічний ЛЬНИЙ (ее) ее о вя ж дів Й я ю : кі вон : х: | Кк ! й -в с БА ї- 804 | ; ! з. т 25 ! ; ; й ЩО бін стіна ння

Припліл Із (а) низькою (5) високою пеатахомею о РЕ. - забуферений «Босфетом фізіологічний розчин. бо б5

ЕЕ » с І Б ч Як В Ч ще

Ф ік ШНІЯ Д

Позінуклеотилні послідовності рУк-НИ26б для екенресії легкого ланцюга: туманізованого 266 та одна амінокислота, яка кодує експресований левкий. в нка» У вим ану Ева дчми тв З9Ж АВОСКВНВОСОВ СОСНИ ВАК ТОВ АКТ СМ АД ре НАСЕ Вноєх чув вучлпттисцканевасиввовгних

БУ ем узи дес кт вве Ме ис син яти Є яви Те соя тиків я кв КУА ів

Б. ШЕ ще же ШЕ ЕД С Б в С С А ЕП ЧЕ В і айви жива жа

ЖЕН вУТХсСвцаитжнч»м туба втчВ о - со со

ФЗаба детАдОслле А АНС ТАС АСААНСТОКАКНСТ ОВО КАКАО ОКЕАН: ою заве ий овАтАйос мото тост стано ти А ОКАААСИСОСАЛе осв яй -

ЖИ дядя пи и и ИМЯ и тик ВИ У МАКИ К КУ ся ит ТАТИ аа СІТТСТТАСТТАААСАСВ ССО ТО ОТОСТ СА ОЛААСТО ОТО ОСКАР СТАТТЮ « й ж в й й й Уж ЖИВ дек. поши. шою тт З с заїб СКИДКА СТ ТТ КАТ тус осслао са оскАВетста "» як - ши Б ШЕ Ме В і НЕ А Ж ше ШЕ Ше Ж о в п МЕ по дев: товААООтТасАт КАС ост а АСВ СКОСАа Ла тато КА АСАВСНОСТЛсНі - щі ж м ж лі б в а ж ов п ж ов У ж ж об в'я ж п я т хв ; с звов остова АККОА СВО ТК СТ ОКА СВООгАТСАКИК со ово ор ж кв жи Жя укосів

ШИ І тодів дн ші пекнуть р -зх ввучикатшикийинож х Як - шт Но - коти ту т т нях ДА У МИЛА ПЧ а и НЯ

ВІВ ОАОСТИСИ КУСОК СТАТ ОВО КК ОО КХАТАКВОТОАКУСТТТОСЬС зу КАТА Т АЛ ОС АТАКА ТТАТАНАНА САС СВІТ АСОСТА САТ ТКА як СПТОСТОВаС АКОТ КТЛатО ТТ ВОАС КОТ ТТ АСАСТСАТАТАТОСТТТСКтТТСААтТОССтелой 60 сувіжв. писк КОсВ КК кВА КК АВК ВАН ат А АНА КВАНТ СИТО АСК КАК аЖЕКА ИН во КАТА СККТ ТАН НКАСКААОАНО КК ОКА АСВ ВАК

ЗЗТаг ОСТТАКСТАСК т АЛАСКО ТИС Уа АОТОСТ СТ ОСА АТАК ОСС КАСА 65

ЕМ пери ит. и пив МАР дса с ЯР Іс Ай ие и

Повна послідовність гена легкого ланцюга Ни266 знаходиться між сайтами Міші та Ватні у рМик-Ни266. Номер нуклеотиду вказує його положення у рМоКк-Ни266. Екзони М, та Ск транслюються однолітерним кодом; точка вказує стоп-кодон трансляції. Зрілий важкий ланцюг починається на подвійно підкресленій аспарагіновій кислоті 70 (0). Інтронні послідовності позначено курсивом. с щі 6) «-

Зо со (ее)

ІС) і - - с . и? -І 1 (ее) ге» ШИ - іме) 60 б5

Полінуклеотидні послідовності рУв1-Ни266 для експресії важкого ланцюга гуманізованого 266 та одна амінокислота, яка кодує експресований важкий ланцюг гуманізованого 266 619 АСПОСТССАССАТОААТТІСОООСТСМасСтІСАТТРУССТТатосттоттттААААССТатОСстТатТсталАстТОосьосто мив іІтЬМ мі, ком ьсЕхУОох 692 СТОСАСТСТКО ОАЕ ТТАСТО СТИ СТО СЮ ТОССТОЛАСТСТОСТОТаСАОССТУСТОЗАТТСАСТТТТАЮТАО

У ЕЕ В б в б ху о Р о б 5 в В во 8 С А А Б б ЕК т в 8 ЕК 779 СТАТТССАТСТСТТОССТТООССАСОСТОСАСОСЛАСОСОСТОСААТТОСТОССАСАААТТААТАТТСТ ТЕС ТААТАССА

Її 5 М 5 М У В й А в с Кк б 1, БЕ Б У Ал 0 Її КК 5 у а ке 859 ССТАСТАТССАСАСАСТСТААВОЧОССПАТТСАССАТСТОСАСАВАСААТООСААСААСАСССТТАССТИСАЛАТОКАС т Ж ХХ Р р т У Кк п В в т Її Б я п М А Кк В т в Ух хХ о и М 20 . а39 ТОССТОАОКМССПААСАСГАСИОСИТСТАТТАСТЕТОСААСКХКЛЛЗАСТАСТИКАКСААОСМИСТИаОвСАНІСТС 5 ьИиИ АНО ТАТІ хх сьЬВА Юа о шт им ха 1919 СТОАПЕТЕАСТОСТСАСААОСТСТАСАСТТТ СТО САССССАОССОСТИАССТІСТСТІТ ОО САСОСАОСТОСТА

Б сі 29 1099 АССТСАСССЛОСТООССОСМССАОСТОИСАСАСОСААТССССАТОСАТСОСАИАСАСТОСАСОСТИЛАССТОВСОСАСАСТ о 1179 ТАдалдаАСОтдО ОСТ САС ССО СТСАСА ХЕ САССАССТТІТ СТАС іч 1259 ССКССААЛОВСОСАТОСОТСТТОССССТОСАРОСТОСТОСААОАСАССТСТОООВІСАСАОСОЮСОСТОСОСТОССТа - 5 Т Ж п в 8 М ЕЕ Б А Р Б Б ЖК В т 5 б а т АХА (ге) 13139 СТСАВОПЬСТАСТТОССОдАВОССКЮТОВОССТОоИтТОсСТоаЙААСТСОСОСОСССТаАОСМИхИКОТаСАСАССТЕСССОСо

У її п хх Ж Й ЕЕ р У т мМ Би и БА хг та мн т ЕВ А Ге 1439 ТФТССТАСАСТОСТСАОПАСТОТАСТТОССТСАССАО ТОГО ТАС СТ ОСАССАОСТТ КК САСССАВАССТАСЯ ІС у йЙоавБВа,хвїББб "Мт мая па тот т ї- 1499 ТСТОСААССТЕЛААТСАСААССССАОСААСАССАВССТОЛАСТАЛСАЛАТ ТТ ТОЛІ ССАСТТАСЛОНЕЛОІАСКИТ

ІЕСИИИчН НК нм тк чи Кк У 1579 ТСТОСТОСЛАСССАСОЄСТОАССОСТОСТОССТОПЛСССАТОССООСТАТОСАЙСОССЛІТТОСАВОЮСЛОСАЛАСОСЛОСОС « 1ї65за СОПТСТИЕССТСТТОАССОССАОСОСТОТИ СС ОСССАСТСАТЕСТ ОД ТАСЛІВІТОСТІСТаОСТТТТТССССАЦ 1739 СТООБСАСОСАСАСИСТАЄЄТИССОСТАДСССАССССТИСАСАСАЛЛСПТОСАССТЕСТККИТСАСАССТОССАЛАЄ шщ 1819 ССАТАТССОССАЛОСАСССТОССССТОАССТАЛССССАОСССАААСТССАЛАСТСТОСАСТОССТСАССТОССАСАССТТС с 1839 ТОТОСТОССАСАТТОСАСТААСТОССААТСТТСТСТСТОСАСМІОСЬАКТОТТОТОАСААААСТСАСАТАТЯСОСАСОЇ з» Е Р КВ со Кк т НТ СР й 15725 ТОСССАВСТАЛОССАСОССАЕСТОИШССТОСАССТСААСОСИИ КАСА ССТАСАСТАСТЕСАТОСАСЮСАСА,

Св це. 2059 ССССССАССССССТССТОАСАСОТССАССТОСАТСТОСТРОСТСЛОСАССТОАВСТОСТО ОО ЗАСОСТСАСТСТТОСТО

М вв Ой ра Ех 1 -

Го) 727139 ТТОСССССАЛААСССЛЛІІЗАСАСССТОАТактСстТоСООЗАССОСТОАОСТСАСЬТОСТОЧЗТОПТОСАСТТОАВОСЬЗА " РЖ ЕЕ в Кот ОМ ІїІБ В т РЕ ЕС ЧУ ЧУ чо ча НЕ 50 . (ее) ч 2219 МІАСССТОАОСТСАЛСТТСААСТОСТАСЯТ СПАТИ ТО САТАТаССВАСАСТАМОСОВСОССАОВЛЯСАСТ - в» її МЕ ВН Мн хом ЕУНМНА ЕТ КР пн ЕЕ 2299 АСАКСАОСАСЯТАССЗТОТОСТСАООЗТОСТСАСОЗУССТОСАССИОТАСТОВСТОААТОПСАЛОСАЯТАСАМТОСВАЄ у нн 5 т У Кк У м Б ХУ ьЬ т У НО р и ьо кЕУ Ж ск 2179 БРСТОСААСАЛАССССТОСТАНСССОССАТССАПААЛАССАТСТОСТАААОССАААИЗТ ОВ АССССТОКНТОСПСАСОНІС

Ф, у 8 Но Кк А її Р А Р І в Кк т ї 5 К А Кк о 2459 ДСАТОСАСАКАСССССОСТОВОСССАСССТСТОСОСТЕАВАСТОАССОСТОТАССААССТОТСТОССТАСЛССВСАЛОССС й 0 в бо 272539 СПАСАЛОСАСАССТОТАСАСССТТОООСССАВССОСОПАТСАОСТСОВОСААСАвССАОСТОМИСТаАССТОССТастсАА я ЕЕ їй 7 ХХ т 6 Бибик Е ткач пси чиІЕ 2619 МФЯСТІСТАТСССАСССЬСК ТО ССО ТО САТООСАСАСААТОФСАОССИЛОААСКАСТАСАВОАССЛСОССТОССЯ 65

Ева ТтТЕВНЕвВнОоЕжи жити бно ПКС СТ ТО ТАСАВСАНОСТСАССВТОВА СТАНИ Вот КОСАВООВААСО ТС

МДЖ ЛК ввлк сво Пн ре яти М ДІ ІЛ т диеня М НИ а я ві ші в шия вим пиву Ташимя ДУХ чових ик каннайванУкт в ев УНИКАТИ тТОЖе Во»

ЕД склекаця лава нев я Ан на а ання сни й от вої . г с секафи ву гайкав» їй й Ян ска ст рака інт м пн нич тт сківн Яка сіні дні пня нн бо миши со собітннія сви а са 029 ОвАДТОТОАВЧССТИВОТаСАТОАООВ АОС ЧО ТИС САСТИ ССО САСАСТ ОСА СТ ТО САТ: заз. стоовеозост оси СТО Со КСО ОК А РИЗОСАО ОВ ОС О С ТОССТСсвО и ЯК ав ік, і НЕ Ви й Кт тя Ж ліні дні нав пох пов о ііі а і в окиліій ко 3359 ТОТССМТІСТО ТВО У ОСТ АССТОСАТО СОС СТОЮ АНЕТТИ КОВО

АЖ вето ОКО АСтОТа САНТА АСВСАСМСТСАНСОСАВАСООВСЬ: зе СІ АРСТСА МИ СС ОО АКТ СТО САС АОС АСАЛАССТ МІС ОСС СТе 739 СИМОЦТассетасАВО ТАС СИС АСК АСКОСАОЧИСТОТ СТВ ОСТ ВОАС:

М вто РОДИН ТО То С Аюв вана вне виніс інн ; ес асан сно сни

Повна послідовність гена важкого ланцюга Ни266б знаходиться між сайтами Міші та ВатнНі у рмМаІ-Ни266.

Номер нуклеотиду вказує його положення у рМаІ-Ни266. Екзони М н та Сн транслюються однолітерним кодом.

Точка вказує стоп-кодон трансляції. Зрілий важкий ланцюг починається на подвійно підкресленій глутаміновій кислоті (Е). Інтронні послідовності позначено курсивом. с щі 6)

Claims (15)

Формула винаходу

1. Гуманізоване антитіло або його фрагмент, до складу якого входять: ч- а) легкий ланцюг, який включає три гіперваріабельні діллнки (СОК) легкого ланцюга, що мають такі со амінокислотні послідовності: СОвК-1 легкого ланцюга: (ее) 1 5 10 15 ю Ага Бек бек біп бек Пец І1е Тухк бек Авр са1у Авп Аза Тук Ге Нів і - (Послідовність Мо 1) або 1 5 10 15 Ак Зег бек біп бБег цеп Уаї Туг бег Авр Сіу Авп А1а Туг Темп Ніз « (Послідовність Мо 15) З с СОК-2 легкого ланцюга: . й 1 5 - Кув Маії Бек АвБп Аг Ріе бек 1 со (Послідовність Мо 2) о 20 та СОК-3 легкого ланцюга: -3 1 5

К.І бек біп Бек Тих Нів Уаї рко Ткр Так й й (Послідовність Мо 3); ГФ) і каркасну послідовність легкого ланцюга з легкого ланцюга гуманізованого імуноглобуліну; та ГФ Б) важкий ланцюг, який включає три гіперваріабельні ділянки (СОК) важкого ланцюга, які мають такі амінокислотні послідовності: во СОК-1 важкого ланцюга: Шо Ак Тухк Бех М І і Мо 4 Ч еє ВЗех (Послідовність Мо СОК-2 важкого ланцюга: б5

1 5 10 15 біп ч11е АБп бек Уаї с1у Авп бек ТБк Тук Тук Рко Авр ТНну Уаї пув Ф01уУ (Послідовність Ло 5) або 1 5 10 15 біп І1е Азп бек Уа1 С1у Ав беї ТПг Тук Тук Рго Азр бег Маії Був б1у (Послідовність Мо 16) 70 та СОК-3 важкого ланцюга: (Послідовність Мо І 1 тух 6); та каркасну послідовність важкого ланцюга з важкого ланцюга гуманізованого імуноглобуліну.

2. Гуманізоване антитіло або його фрагмент за п. 1, де: сч СОвК-1 легкого ланцюга має таку амінокислотну послідовність: 1 5 10 . 15 о АкгуЧ бек бек біп бек Пец І1е Тух бек Авр с1у Авп Аза Тух Гей Нів (Послідовність Мо 1), та «- СОК-2 важкого ланцюга має таку амінокислотну послідовність: 1 5 10 15 09 с1іп І1е Авп бек Уа1ї С1у АБп бек Тік Тук Тук Рко Авр ТНК Уаії пув С1У со (Послідовність Мо 5). ІФ)

3. Гуманізоване антитіло або його фрагмент за п. 1, до складу якого входить гуманізована варіабельна м ділянка легкого ланцюга, яка включає таку послідовність: 1 5 10 15 Авр Хаа ЧМа1і Меє Тк сіп Хаа Ркго Бей бек Пец рРко Уа1і Хаа Хаа « с 7 20 25 3о що сі1у сіп Рго Аза бех І1їе бек СуБ Ага бек Бек сіп Бек Ге Хаа ;» 35 а аб тук Бек Авр с1у Ап Азла Тук Пец Нів Ткр Рре Ппей сіп Пує рко -І 1 БО 55 6о со сіу сіп Бек Рго Хаа Пеп Гей І1е Тух Пув Уаї Бех АБп Аг Ре бо 65 70 75 -3х Бек сіу Уаї Рко Авр Акад Рпе Бек п1у Бек с1у Бек С1у тЬх Авр во в5 90 Рбе Так Пей Пув І1їе бег Ака Уаї сії АТа Сіц Авр Хаа сіу Маї Ф) ко 95 100 105 Тух Тук Сув Бех б1іп Бек Тіх Нів Уа1ї Рго Тур ТБк Рбе с1у Хаа

60 . 110 сіу тТрих Хаа Хаа Сі. т1е цув Ага (Послідовність Мо 7), де: 65 Хаа у положенні 2 - Ма! або Іе; Хаа у положенні 7 - Зег або Тпг;

Хаа у положенні 14 - Тнг або Зег; Хаа у положенні 15 - І ем або Рго; Хаа у положенні 30 - Ме або Маї; Хаа у положенні 50 - Аго, СіІп або І ув; Хаа у положенні 88 - Ма! або І еи; Хаа у положенні 105 - Сіп або Су; Хаа у положенні 108 - І уз або Аго та Хаа у положенні 109 - Маї або І еи; 70 та варіабельна ділянка важкого ланцюга, яка включає таку послідовність: 4 з що З Хаа уаї сіп реп Уаї сій Хаа с1іу сі1у біу Ппеп Уаї сію Рко с1у зо 18 сіу бек Брем Ака Ппей Бех Сув Ала Аза бек С1у Рбе Тік Ре бек 35 40 5 Ака Тух Бек Меї бек Тер Уаії Акад біп А1їа Рго біу Був С1Уу Гец 20 50 5Б 60 Хаа ем Уаї Аза Сію І1е Аввп бек Уа1ї С1у Авп бек ТНК Тух Тук 65 70 75 РкгосАвр Хаа уаї Пув сіу Акад РПе Тіт І1е бек Ак Авр Авп Хаа сч 29 во 85 90 о Хаа Авп тік Ппеп Туг Пец біп Меє Аво бек Пе Ату Азї1а Хаа Авр 95 100 105 Тік А1а Маї Тук Тук Сув А1а бек сС1у Авр Тук Тктр Ф1у с1озо 01у - со 110 ТЬх Хаа Уаї тах уУаї бек бек й со (Послідовність Мо 8), де: о Хаа у положенні 1 - Сім або Сп; - Хаа у положенні 7 - Зег або І ец; Хаа у положенні 46 - сім, Маї, Азр або 5ег; Хаа у положенні 63 - Тиг або Зег; « Хаа у положенні 75 - Аа, Зег, Ма! або Тнг; Хаа у положенні 76 - І уз або Аго; - с Хаа у положенні 89 - Сім або Азр та а Хаа у положенні 107 - І ем або Тнг. "» 4. Гуманізоване антитіло або його фрагмент за п. 1, що має варіабельну ділянку легкого ланцюга з послідовністю, представленою Послідовністю Мо 9, та варіабельну ділянку важкого ланцюга, представлену Послідовністю Мо 10. -і 5. Гуманізоване антитіло або його фрагмент за п. 4, що має легкий ланцюг із послідовністю, представленою сл Послідовністю Мо 11, та важкий ланцюг із послідовністю, представленою Послідовністю Мо 12.

6. Фрагмент гуманізованого антитіла за п. 1 або п. 5. (ее)

7. Гуманізоване антитіло або фрагмент за п. 1, що являє собою ізотип імуноглобуліну дос. бо 50

8. Гуманізоване антитіло або фрагмент за п. 1, продуковане у клітині-хазяїні, вибраній з групи, до складу якої входять клітина мієломи, клітина яєчника китайського хом'ячка, клітина яєчника сірійського хом'ячка та - клітина нирок людського зародка.

9. Полінуклеїнова кислота, яка включає послідовність, що кодує легкий ланцюг або важкий ланцюг гуманізованого антитіла або його фрагмент за будь-яким з пп. 1-8.

10. Полінуклеїнова кислота за п. 9, яка включає послідовність, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга, представлену Послідовністю Мо 7 або Послідовністю Мо 9. о

11. Полінуклеїнова кислота за п. 9, яка включає послідовність, що кодує варіабельну ділянку важкого іме) ланцюга, представлену Послідовністю Мо 8 або Послідовністю Мо 10.

12. Полінуклеїнова кислота за п. 9, яка включає послідовність, що кодує легкий ланцюг, представлений бо Послідовністю Мо 11.

13. Полінуклеїнова кислота за п. 9, яка включає послідовність, що кодує важкий ланцюг, представлений Послідовністю Мо 12.

14. Фармацевтична композиція, яка містить гуманізоване антитіло або його фрагмент за будь-яким з пп. 1-8, а також фармацевтично прийнятний наповнювач. 65

15. Застосування гуманізованого антитіла або його фрагмента за будь-яким з пп. 1-8 для виготовлення лікарського засобу, здатного до пролонгованої експресії рекомбінантних послідовностей антитіла або фрагмента антитіла в тканинах людини, для лікування клінічної або передклінічної форми хвороби Альцгеймера, синдрому Дауна або клінічної чи передклінічної форми церебральної амілоїдної ангіопатії, або для лікування, запобігання або реверсування погіршення пізнавальної діяльності при клінічній або передклінічній формі хвороби Альцгеймера, синдромі Дауна або клінічній чи передклінічній формі церебральної амілоїдної ангіопатії. с щі 6) «- (ее) (ее) ІС) і - -

с . и? -І 1 (ее) ге» ШИ - іме) 60 б5