NO329840B1 - Humaniserte antistoffer som binder A<beta> peptidsekvenser, polynukleinsyre som koder for disse, ekspresjonsvektorer og celler for a uttrykke antistoffene, farmasoytisk sammensetning og anvendelse av antistoffene. - Google Patents

Abstract

En fremgangsmåte for å behandle tilstander som er karakterisert ved dannelse av amyloide plakk både profylaktisk og terapeutisk blir beskrevet. Fremgangsmåten bruker humaniserte antistoffer som binder løselig Aβ fra humane biologiske væsker eller som helst spesifikt binder en epitop som finnes innen posisjon 13 til 28 av amyloid betapeptidet Aβ.

Description

Kryssreferanse til relaterte søknader

Denne søknaden krever fortrinn av Forente Staters foreløpige søknader

60/184,601 arkivert 24. februar 2000,60/254,465, arkivert 8. desember 2000, og 60/254,498, arkivert 8. desember 2000.

Teknisk felt

Oppfinnelsen relaterer seg til humaniserte antistoffer som binder seg til en epitop mellom aminosyrene 13 og 28 i AP-peptidet og anvendelse av det humaniserte antistoff for fremstilling av et medikament til preventiv og terapeutisk behandling av tilstander assosiert med P-amyloid, slik som Alzheimers sykdom, Downs syndrom, og cerebral amyloid angiopati. Mer spesifikt vedrører den anvendelse av humaniserte monoklonale antistoffer som binder amyloid beta (AP)-peptid i plasma, hjerne, og cerebrospinal væske for å hindre akkumulering og for å reversere deponering av Ap-peptidet innen hjernen og i cerebrovaskulaturen og for å forbedre tankevirksomhet.

O ppfinnelsen bakgrunn

En rekke symptomer som resulterer i kognitive mangler, slag, hjerneblødning, og generell mental svekkelse viser seg å være assosierte med neurittiske og cerebrovaskulære plakk i hjernen som inneholder amyloid P-peptidet (Ap). Blant disse tilstandene er både preklinisk og klinisk Alzheimers sykdom, Downs syndrom, og preklinisk og klinisk cerebral amyloid angiopati (CAA). De amyloide plakkene blir dannet fra amyloid betapetider. Disse peptidene sirkulerer i blodet og i den cerebrospinale væsken (SDF), typisk i kompleks med lipoproteiner. Ap-peptidet i sirkulerende form er sammensatt av 39-43 aminosyrer (mest 40 eller 42 aminosyrer) som er et resultat fra kløyvingen av et felles forløper-protein, amyloid forløper-protein, ofte kalt APP, Noen former av løselig Ap er i seg selv neurotoksiske og kan bestemme alvorligheten av neurodegenerering og/eller kognitivt forfall (McLean, C.A., et al, Ann. Neurol (1999) 46:860-866; Lambert, M.P., et al (1998) 95:6448-6453; Naslund, 1, J. Am. Med. Assoc. (2000) 283:1571).

Det finnes bevis som antyder at Ap kan transporteres frem og tilbake mellom hjernen og blodet (Ghersi-Egea, J-F., et al, J. Neurochem. (1996) 67:880-883; Zlokovic, B.V., et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040; ShibataM, et al, J. Clin. Invest (2000) 106:1489-1499). Videre er Ap i plakk i likevekt med løselig Ap i hjernen og blodet (Kawarabayashi T, et al, J. Neurosci. (2001) 21:372-381).

Som beskrevet i PCT søknaden US00/34681 og U.S. serienr. 09/153,130, er de totale sirkulerende nivåene av Ap-peptide i CSF liknende til de hos normale individer og individer som er predisponert for symptomer på Alzheimers. Imidlertid er Ap42-nivåene lavere i gjennomsnitt i individer med Alzheimers sykdom (Nitsch, R.M., et al, Ann. Neurol. (1995) 37:512-518). Det er kjent at Ap42er mer tilbøyelig til å aggregere enn Ap4o, og når dette skjer vil alvorlige konsekvenser slik som Ap-deponeringer i amyloide plakk, omdannes av Ap til toksiske løselige former, nerveceller ødelegges og adferdsforstyrrelser slik som dementia ifølge (Golde, T.E., et al, Biochem. Biophys. Acta. (2000) 1502:172-187).

Fremgangsmåter for å indusere en immunrespons for å redusere amyloid-deponeringer er beskrevet i PCT publikasjon W099/27944 publisert 10. juni 1999. Beskrivelsen postulerer at fullengde aggregerte Ap-peptid ville være et nyttig immunogen. Administreringen av et Ap-fragment (aminosyrene 13-28) konjugert til saue-antimus IgG forårsaket ikke noen forandring i cortex amyloid-byrden, og bare en av ni dyr som mottok injeksjoner av Ap 13-28 fragmentkonjugatet viste noen lymfoproliferasjon i respons på Ap4o. Søknaden indikerer også at antistoffer som spesifikt binder seg til Ap-peptid kunne anvendes som terapeutiske midler. Imidlertid viser dette seg å være spekulasjon fordi de støttende dataene reflekterer protokoller som involverer aktiv immunisering ved å anvende for eksempel AP42. Peptidene blir tilført ved å bruke adjuvans og antistoftfiterene som dannes fra immumseringen, så vel som nivåene til Ap-peptid og ril forløper-peptidet blir bestemt. Publikasjonen antyder sterkt at Ap-plakk må reduseres for å lette Alzheimers symptomer, og at cellestyrte prosesser kreves for en vellykket reduksjon av Ap-plakk.

WO 99/60024, publisert 25. november 1999 er rettet mot fremgangsmåter for å fjerne amyloid ved å anvende antiamyloide antistoffer. Imidlertid blir mekanismen erklært å benytte evnen anti-Ap-anitstoffene har til å binde seg til preformete amyloide deponeringer (dvs. plakk) og resultere i etterfølgende lokal mikroglial fjerning av lokaliserte plakk. Denne mekanismen ble ikke bevist in vivo. Denne publikasjonen erklærer videre at for å være effektiv mot Ap-plakk, må anti-Ap-anitstoffene få tilgang til hjeme-parenchyma og krysse blod-hjerne-barrieren.

Flere PCT-søknader som relaterer seg til forsøk på å kontrollere amyloide plakk ble publisert 7. desember 2000. WO 00/72880 beskriver sigmfikant reduksjon i plakk i cortex og hippocampus i en transgen musemodell med Alzheimers sykdom når musene ble behandlet med N-terminale fragmenter av Ap-peptider og antistoffer som binder seg til dem, men ikke når de blir behandlet med Ap 13-28 fragmentet konjugert til saue-antimus IgG eller med et antistoff mot 13-28 fragmentet, antistoff266. De N-terrninalt rettede antistoffene ble hevdet å kunne krysse blod-hjerne-barrieren og til å indusere fagocytose av amyloide plakk i in vitro studier.

WO 00/72876 har faktisk den samme utgreiingen som WO 00/72880 og er rettet mot irnmunisering med de amyloide fibrilkomponentene selv.

WO 00/77178 beskriver antistoffer som ble designet for å katalysere hydrolysen av p-amyloid, inkludert antistoffer som var laget mot en blanding av fenylalaninstatin transisjonsforbindelsene Cys-Apio-25, statin PheisrPhe2oog Cys-Ap 10-25 statin Phe2o-Ala2iog antistoffer mot Ap 10-25 som har en redusert amidbinding mellom Phejg og Pheao- Dette dokumentet nevner binding av Ap, men dette er spekulasjon fordi det gis ingen bevis på en slik binding. Videre tilveiebringer dokumentet ingen in vivo bevis for at administrerhigen av antistoffer forårsaker en utstrømming av Ap fra det sentrale nervesystem, interfererer med plakkdannelse, reduserer plakkbyrden, danner komplekser mellom antistoffene og Ap i vevsprøver, eller affiserer viten "cognition".?

Det er blitt vist at en rute for Ap metabolismen er via transport fra CNS til plasma (Zlokovic, B.V., et al, Proe. Nati Acad. Sei ( USA) (1996) 93:4229-4234; Ghersi-Egea, J-F., et al, J. Neurochem. (1996) 67:880-883). I tillegg er det blitt vist at Ap i plasma kan krysse blod-hjerne-barrieren og gå inn i hjernen (Zlokovic, B. V., et al, Biochem. Biophys. Res. Comm.(1993) 67:1034-1040). Det har også vært vist at adminisrreringen av visse polyklonale og monoklonale Ap-antistoffer minker Ap deponering i amyloide plakk i den APP^71717 transgene musemodellen for Alzheimers sykdom (Bard, F., et al, Nature Med. (2000) 6:916-919); imidlertid ble det sagt at dette skyldes visse anti-Ap-antistoffer som krysser blod-hjerne-barriere og stimulerer fagocytose av amyloide plakk ved mikrogliale celler. I Bards eksperimenter, viste analyser av hjeraesnitt ex vivo at tilstedeværelsen av tilsatte Ap-antistoff, sammen eksogent tilsatt mikroglia, induserte fagocytosen av Ap, noe som resulterte i fjerning av Ap deponeringene.

Winter, G., et al., Immunology Today (1993) Vol. 14, s 243-46, beskriver fordeler ved bruk av humaniserte antistoffer sammenlignet med ikke-humaniserte antistoffer.

Seubert, P., et al., Nature (1993) Vol. 359, 325-27 beskriver fremstilling av diagnostisk og terapeutisk anvendelse av anti-Ap-antistoffer som bla. 266 for påvisning og fjerning av Ap. Reichmann, L., et al., Nature, (1988) Vol 332, s 323-27 omhandler i likhet med Winter et al. Fremstilling av humaniserte antistoffer.

Nivåene av både løselig AfUoog AP42i CSF og blod kan lett detekteres ved å anvende standardanalyser som anvender antistoffer rettet mot epitoper langs Ap-kjeden. Slike analyser er blitt rapportert for eksempel i U.S. patentene 5,766,846; 5,837,672; og 5,593,846. Disse patentene beskriver produksjonen av musemonoklonale antistoffer til sentrale domener av Ap-peptidet, og disse ble rapportert å ha epitoper rundt og inkludert på posisjonene 16 og 17. Antistoffene rettet mot den N-terminale regionen ble beskrevet også. Flere monoklonale antistoffer ble påstått å immunreagere med posisjonene 13-28 i Ap-peptidet; disse bandt ikke til et peptid som representerte posisjonene 17-28, derfor ifølge de siterte patentene, ble det slått fast at det var denne regionen inkludert posisjonene 16-17 (a-sekretasesetet) som var målet for disse antistoffene. Blant antistoffer kjent for å binde mellom aminosyrene 13 og 28 i Ap er museantistoffene 266,4G8, oglC2.

Det er nå uventet funnet at admMstreringen av 266 antistoffet veldig raskt og nesten fullstendig gjenvinner viten (objekthukommelse) i 24 måneders gamle hemizygote transgene mus (APP<v7>17<F>). Likevel har ikke antistoffene egenskapene som fagfeltet sier er nødvendig for et antistoff for å være effektiv i å behandle Alzheimers sykdom. Downs syndrom, og andre tilstander som er relatert til Ap-peptidet. Det ble videre overraskende observert at antistoffer som binder Ap mellomposisjon 13 og 28 (266 og 4G8) er i stand til å binde løselige former av Ap fra deres bundne form i blod, og at perifer adimiristrering av antistoff266 resulterer i rask utstrømming av relativt store mengder av Ap-peptid fra CNS til plasma. Dette resulterer i forandret opprydding av løselig Ap, hindring av plakkdannelse og mest overraskende, forbedring i viten, selv uten nødvendigvis å redusere Ap amyloide plakkbyrden, kryssing blod-hjerne-barrieren til ethvert signifikant omfang, oppussing av plakk, aktivering av cellulære mekanismer, eller binding med stor affinitet til aggregert Ap.

Utgreiing av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter humanisert antistoff eller fragment av det kjennetegnet ved at det omfatter: a. en lett kjede som omfatter tre lett kj ede komplementær bestemmende regioner (CDRer) fra det musemonoklonale antistoff266 som har følgende aminosyresekvenser: lett kj ede CDR1:

lett kjede CDR2: og, lett kjede CDR3:

og en lett kjede leserammesekvens fra en humanisert immunglobulin lett kjede; og

b. en tung kjede som omfatter tre tunge kjede CDRer fra det musemonoklonale antistoff266 som har følgende aminosyresekvenser:

tung kjede CDR1:

tung kjede CDR2: og, tung kjede CDR3:

og en tung kjede leserammesekvens fra en humanisert immunglobulin tung kjede.

Oppfinnelsen omfatter også polynukleinsyre som er kjenentegnet ved at den omfatter en sekvens som koder for den lette kjeden eller den tunge kjeden i det humaniserte antistoffet som nevnt over.

Også polynukleinsyre, kjennetegnet ved at den omfatter en sekvens som koder for den lette kjeden eller den tunge kjeden av det humaniserte antistoffet ifølge krav 5 er omfattet av oppfinnelsen.

Videre omfattes polynukleinsyre, kjennetegnet ved at når den blir uttrykt i en passende vertscelle, gir antistoffet eller fragment av det ifølge krav 1.

Omfattet er også polynukleinsyre, kjennetegnet ved at at når den blir uttrykt i en passende vertscelle, frembringes antistoffet eller fragmentet ifølge krav 5.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også ekspresjonsvektor for å uttrykke antistoffet eller fragmentet ifølge krav 1, kjennetegnet ved at den omfatter nukleotidsekvenser som koder for nevnte antistoff eller fragment.

Videre omfattes celle, som tilveiebringer at den er transfektert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 17.

Oppfinnelsen omfatter også celle, kjennetegnet ved at den er transfektert med to ekspresjonsvektorer ifølge krav 17, hvor en første vektor omfatter polynukleotidsekvensen som koder for den lette kjeden og en annen vektor omfatter sekvensen som koder for den tunge kjeden.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse ekspresjonsvektor for å uttrykke antistoffet eller fragmentet av det ifølge krav 5, kjennetegnet ved at den omfatter nukleotidsekvenser som koder for nevnte antistoff eller fragment.

Oppfinnelsen omfatter også celle, kjennetegnet ved at den er transfektert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 20.

Celle, kjennetegnet ved at den er transfektert med to ekspresjonsvektorer ifølge krav 20, hvor en første vektor omfatter polynukleotidsekvensen som koder for den lette kjeden og en andre vektor omfatter sekvensen som koder for den tunge kjeden er også omfattet av oppfinnelsen.

Videre omfattes celle, kjennetegnet ved at den er i stand til å uttrykke det humaniserte antistoff eller fragment av det ifølge krav 1 eller krav 5.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter det humaniserte antistoffet eller fragment ifølge ethvert av kravene 1 eller 5, og et farmasøytisk akseptabelt tilsetningsstoff.

Anvendelse av det humaniserte antistoff eller et fragment av det ifølge ethvert av kravene 1 eller 5 for fremstilling av et medikament for å behandle klinisk eller preklinisk Alzheimers sykdom, Downs syndrom eller klinisk eller preklinisk cerebral amyloid angiopati er også omfattet av oppfinnelsen.

Det samme gjelder anvendelse av et humanisert antistoff eller fragment ifølge ethvert av kravene 1 eller 5 for fremstilling av et medikament for behandling, forebygging eller reversering av kognitivt forfall i klinisk eller preklinsk Alzheimers sykdom, Downs syndrom eller klinisk eller preklinisk cerebral amyloid angiopati.

Oppfinnelsen tilveiebringer humaniserte antistoffer eller fragmenter av dem, som positivt affiserer viten i sykdommer og tilstander hvor Ap kan være involvert, slik som klinisk eller preklinisk Alzheimers sykdom, Downs syndrom, og klinisk eller preklinisk cerebral amyloid angiopati. Antistoffene eller fragmenter av de, trenger ikke å krysse blod-hjerne-barrieren, rydde vekk amyloide plakk, aktivere cellulære responser, og det er heller ikke nødvendig å redusere den amyloide plakkbyrden. I et annet aspekt tilveiebringer denne oppfinnelsen humaniserte antistoffer og fragmenter av dem som binder Afl-peptid fra sin bundne sirkulerende form i blod, og forandrer opprenskingen av løselige bundne former av Ap i sentralnervesystemet og plasma. I et annet aspekt tilveiebringer denne oppfinnelsen humaniserte antistoffer og fragmenter av dem hvor de humaniserte antistoffene spesifikt bindes til en epitop mellom aminosyrene 13 og 28 i Ap-molekylet. I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen humaniserte antistoffer og fragmenter av dem hvor CDR er utledet fra musemonoklonalt antistoff 266 og hvor antistoffene bevarer tilnærmet bindingsegenskapene til museantistoffet og har in vivo og in vitro egenskaper som er funksjonelt ekvivalente til museantistoffet (sekvensene SEQ ID NO: 1 til SEQ ID NO: 6). I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen humaniserte antistoffer og fragmenter av dem, hvor de variable regionene har sekvenser som omfatter CDR fra museantistoffet 266 og spesifikke humane leserammen sekvenser (sekvensene SEQ ID NO: 7 til SEQ TD NO: 10), hvor antistoffene bevarer tilnærmet bindingsegenskapene til museantistoffet og har en in vitro og in vivo egenskaper som er funksjonelt ekvivalente til museantistoff 266.1 et annet aspekt tilveiebringer denne oppfinnelsen humaniserte antistoffer og fragmenter av dem hvor den rette kjeden er SEQ TD NO: 11 og den tunge kjeden er SEQ TD NO: 12.

Som del av oppfinnelsen er også polynukleotidsekvenser som koder for humaniserte antistoffer eller fragmenter av dem som er utgreiet over, vektorer som omfatter polyonukleotidsekvensene som koder for humaniserte antistoffer eller fragmenter av dem, vertsceller som er transformert med vektorer eller som har inkorporert polynukleotider som uttrykker humaniserte antistoffer eller fragmenter av dem, farmasøytiske preparater av de humaniserte antistoffene og fragmenter av dem som er utgreiet her og fremgangsmåter for å lag og anvende dem.

Slike humaniserte antistoffer og fragmenter av dem er nyttige for å binde Ap i mennesker, for behandling og for å hindre sykdommer og tilstanderkarakterisert vedAp plakk eller Ap toksisitet i hjernen, slik som Alzheimers sykdom, Downs syndrom, og cerebral amyloid angiopati hos mennesker; for å diagnostisere disse sykdommene i mennesker; og for å bestemme om et menneske vil respondere til behandlingen ved å anvende humane antistoffer mot Ap.

Administrering av et passende humanisert antistoff in vivo som skal binde Ap-peptid som sirkulerer i biologiske væsker er nyttige for preventiv og terapeutisk behandling av tilstander som er assosiert med dannelsen av Ap inneholdende diffuse, neurittiske og cerebrovaskulære plakk i hjernen. Det humaniserte antistoffet inkludert et immunologisk reaktivt fragment av det, resulterer i fjerning av Ap-peptidet fra makromolekylærkomplekser som normalt ville være relevant i transporten av det i kroppsvæsker til og fra seter hvor plakkene kan dannes eller hvor det kan være toksisk. I tillegg oppfører en binding av plasma Ap-peptid med antistoffet eller fragmentet av det seg som en "avløpsrenne", ved effektivt å binde løselig Ap-peptid i plasma kompartmentet og indusere Ap til å gå inn i plasma og lokaliseringer i det sentrale nervesystemet (CNS) . Ved å binde Ap i blodet, økes nettoutsrfømningen fra hjernen og løselig Ap blir hindret fra opphoping i uløselig plakk og fra å danne toksiske løselige deler i hjernen. I tillegg kan uløselig Ap i plakk som er i likevekt med løselig Ap fjernes fra hjernen gjennom bindingseffekt i blodet. Binding av Ap-peptidet med antistoffet øker også fjerning av det fra kroppen og hemmer toksiske effekter av løselig Ap i hjernen og utviklingen og videre akkumulering av uløselig Ap som amyloid plakk. Antistoffene som er nyttige denne oppfinnelsen krysser ikke blod-hjerne-barrieren i store mengder (<+0,l% plasmanivåer). I tillegg trenger ikke humaniserte antistoffer som anvendes i oppfinnelsen når de gis perifert, å utløse en cellulær immunrespons i hjernen når det er bundet til Ap-peptid eller når det sirkulerer tritt for å ha deres gunstige effekter. Videre når de blir gitt perifert trenger de ikke binde aggregert Ap-peptid i hjernen for å ha deres gunstige effekter.

Således kan derfor oppfinnelsen anvendes i en fremgangsmåte for å behandle og for å hindre tilstanderkarakterisert veddannelsen av plakk som inneholder beta-amyloid protein hos mennesker, denne fremgangsmåten omfatter admmislreririg, helst perifert, til et menneske som trenger en slik behandling av en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde humanisert monoklonalt antistoff eller immunologisk reaktivt fragment av det, dette antistoffet bindes spesifikt til midtregionen i Ap-peptidet. Oppfinnelsen kan også benyttes i en fremgangsmåte for å hemme dannelsen av amyloide plakk og for å rense amyloide plakk i mennesker. Denne metoden omfatter å gj til et menneske som trenger en slik hemming, en effektiv mengde av et humanisert antistoff som binder Ap-peptidet fra sin sirkulerende for i blod og induserer utstrørnning fra hjernen så vel som forandret Ap opprensking i plasma og hjernen. Oppfinnelsen er rettet mot slike humaniserte antistoffer inkludert immunologiske effektive deler av dem.

Oppfinnelsen kan også benyttes til fremgangsmåter for å reversere kognitivt forfall, forbedre tankevirksomheten, behandle kognitivt forfall og å hindre kognitivt forfall i en person som er diagnostisert med klinisk eller preklinisk Alzheimers sykdom, Downs syndrom, eller preklinisk cerebral amyloid angiopati, som omfatter å gi til individet en effektiv mengde av et humanisert antistoff i oppfinnelsen.

Oppfinnelsen inkluderer også anvendelsen av et humanisert antistoff i oppfinnelsen for fremstillingen av et medikament, som inkluderer forlenget ekspresjon av rekombinante sekvenser av antistoffet eller antistoff-fragment i humane vev, for behandling, forebygging eller reversering av Alzheimers sykdom, Downs syndrom, eller cerebral amyloid angiopati; forbehandling, for forebygging, eller reversering av kognitivt forfall i klinisk eller preklinisk Alzheimers sykdom, Downs syndrom, eller klinisk eller preklinisk cerebral amyloid angiopati; eller for å hemme dannelse av amyloide plakk eller effektene av toksisk løselige Ap deler hos mennesker.

Oppfinnelsen er relatert til den overraskende observasjonen at etter en kort tidsperiode etter administreringen av et antistoff i den foreliggende oppfinnelsen, strømmer relativt store mengder av beta ut fra sentralnervesystemet og inn i blodet. Derfor kan denne oppfinnelsen benyttes til fremgangsmåter for å understreke responsen i et humant individ på behandlingen med et antistoff som binder Ap eller et fragment av dem, og som omfatter; a) å gi antistoffet eller et fragment av det til individet; og b) å måle konsentrasjonen av Ap i individets blod.

Oppfinnelsen kan også benyttes i en fremgangsmåte for å behandle et humant individ med et antistoff som binder Ap eller et fragment av det, som omfatter; a) å gi en første mengde av antistoffet eller fragmentet av det til individet; b) å måle innen tre timer til to uker etter adrninistreringen av den første dosen, konsentrasjonen av Ap i individets blod; c) hvis det er nødvendig, å beregne en andre mengde av antistoff eller fragmenter av det basert på resultatet fra trinn b) hvor andre mengde er den samme eller en mengde forskjellig fra den første mengden; og d) å gi den andre mengden av antistoffet eller fragmentet.

Oppfinnelsen kan videre benyttes i en fremgangsmåte for å undersøke i et humant individ, virksomheten til et antistoff som binder seg til Ap, eller et fragment av det, for å hindre eller forebygge Ap amyloid plakkdannelse, for å redusere Ap amyloid plakk, for å redusere effektene av toksisk løselige Ap arter, eller for å behandle en tilstand eller en sykdom assosiert med Ap plakk, som omfatter: a) å skaffe til veie en første prøve av individets plasma elle CSF; b) å måle en grunnlinjekonsentrasjon av Ap i den første prøven; c) å gi antistoffet eller fragmentet av det til individet; d) å skaffe til veie innen 3 timer til to uker etter administreringen av antistoffet eller fragmentet av det, en andre prøve av individets plasma eller CSF; og e) å måle konsentrasjonen av Ap i den andre prøven; hvor virksomheten er relatert til mengde Ap bundet til antistoffet i blodet og konsentrasjonen av Ap i CSF.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser prosenten av Ap-peptidet som er trukket ut fra human cerebrospinalvæske gjennom en dialysemembran ved hjelp Mab 266 som en funksjon av den molekylære vektkutten i dialysemembranen. Figur 2 viser konsentrasjonen av Aptotai som ble funnet i plasmaet til en APPV71<7F>transgen mus etter injeksjon med enten 200 ug eller 600 u.g av Mab 266 som en funksjon av tid. Figur 3A viser mengde Ap-peptid deponeringer i cortexen i APP<V717F>transgene mus behandlet med saltvann, muse IgG, eller Mab 266. Figur 3B viser korreleringen av disse resultatene med foreldreopphavet. Figur 4 viser polynukleoitdsekvensene for å uttrykke humanisert 266 lett kjede fra plasmid pVk-Hu266 og de enkle aminosyrene som koder for den uttrykte humaniserte 266 lette kjede (korresponderer til SEQ ID NO: 11 når den er moden). Figur 5 viser polynukleotidsekvensen til uttrykt humanisert 266 tung kjede fra plasmid pVgl-Hu266 og de enkle aminosyrene som koder for den uttrykte humaniserte 266 tunge kjeden (korresponderer til SEQ ID NO: 12 når den er moden).

Figur 6 er et plasmidkart av pVk.-Hu266.

Figur 7 er et plasmidkart av pVgl-Hu266.

Måter for å utføre oppfinnelsen

Ap-peptidet som sirkulerer i humane biologiske væsker representerer den karboksyetrminale regionen av et forløper protein som kodes for på kromosom 21. Det er blitt rapportert fra resultatene av in vitro eksperimenter at Ap-peptidet har dårlig løselighet i fysiologiske løsninger, fordi det inneholder et strekk med hydrofobe aminosyrer som er en del av regionen som forankrer dets lengre forløper til lipidmembranene i celler. Det er derfor ikke overraskende at sirkulerende Ap-peptid normalt er i kompleks med andre deler som hindrer det fra aggregering. Dette har resultert i vanskeligheter i å detektere sirkulerende Ap-pepetid i biologiske væsker.

De ovennevnte patentdokumentene (U.S. patentene 5 766 846; 5 837 672 og

6 593 846) beskriver fremstillingen av antistoffer, inkludert et monoklonalt antistoff, kalt klon 266 som er reist mot, og har vært vist å binde spesifikt til, et peptid som omfatter aminosyrene 13-28 i Ap-peptidet. De foreliggende søkerne har funnet at antistoffene som binder innen regionen, i motsetning til antistoffer som binder andre steder i aminosyresekvensen til Ap, er i stand til å binde det løselige Ap-peptidet veldig effektivt fra makromolekylære komplekser. Denne bindingen vil affisere netto Ap-peptid utstrømningen fra CNS, forandre dets rensing i CNS og plasma, og redusere dets evne til plakkdannelse. Således gir antistoffer med denne spesifisiteten, modifisert for å redusere deres immunogenisitet ved å omdanne dem til en humanisert form, muligheten for å behandle, både profylaktisk og terapeutisk, tilstander som er assosiert med

dannelsen av beta-amyloide plakk. Disse tilstander inkluderer som nevnt ovenfor, preklinisk og klinisk Alzheimers, Dovns syndrom, og preklinisk og klinisk cerebral amyloid angiopati.

Som brukt her inkluderer ordet "behandle" terapeutisk behandling, hvor en tilstand som skal behandles, allerede er kjent å være til stede og profylakse dvs. forebygging av eller forbedring av den mulige fremtidsstarten på en tilstand.

Ved "monoklonale antistoffer som binder til midtregionen av AP-peptidet" menes monoklonale antistoffer (Mab eller Mabs) som binder en aminosyresekvens som representerer en epitop som finnes mellom posisjonene 13 -28 i Ap. Hele regionen trenger ikke å være et mål. Så lenge antistoffer binder seg til minst en epitop innen denne regionen (spesielt for eksempel å inkludere cc-sekretasesetet 16-17 eller setet hvor antistoffet 266 binder seg) er slike antistoffer effektive.

Med "antistoff menes et monoklonal! antistoff per se, eller et immunologisk effektivt fragment av det, slik som en f„b, Fab', eller F(ab-)2fragment av det. I noen sammenhenger heri vil fragmentene bli nevnt spesifikt for å bli vektlagt; ikke desto mindre vil det forstås at uansett om fragmentet blir spesifisert eller ikke, inkluderer uttrykket "antistoff" slike fragmenter så vel som enkelkjedete former. Så lenge som proteinet bevarer evnen spesifikt til å binde seg til tilsiktede mål, og i dette tilfelle, å binde a-peptid fra dets bærerproteiner i blod, er det inkludert innen uttrykket "antistoff". Også inkludert innen definisjonen "antistoff' er for eksempel enkelkjedeformer generelt kalt FvHregioner av antistoffer med denne spesifisiteten. Helst men ikke nødvendig, blir antistoffene som er nyttige i oppfinnelsen produsert rekombinant, som manipulering av de typiske muse eller andre ikke-humane antistoffer med den passende spesifisiteten som trengs for å omdanne den til humanisert form. Antistoffene kan eller trenger ikke være glykosylerte selv om glykosylerte antistoffer er å foretrekke. Antistoffene blir passende kryssbundet via disulfidbindinger noe som er velkjent.

Den grunnleggende antistoffstrukturelle enheten er kjent for å omfatte en tetramer. Hver tetramer er sammensatt av to identiske par med polypepitdkjeder, hvert par har en "lett"

(ca. 25 kDa) og en "tung" kjede (ca. 50-70 kDa). Den ammoterminale delen av hver kjede inkluderer en variabel region på ca. 100 til 110 eller flere aminosyrer som primært er ansvarlig for antigena enkjenningen. Den karboksyterminale delen av hver kjede definerer en konstant region som primært er ansvarlig for effektorfunksjonen.

Lette kjeder er klassifisert som gamma, mu, alfa og lambda. Tunge kjeder er klassifisert som gamma, mu, alfa, delta eller epsilon, og definerer antistoffets isotype som henholdsvis IgG, IgM, lg A, IgD og IgE. Innen lette og tunge kjeder, blir de variable og konstante regionene forbundet med en "J" region på ca. 12 eller flere aminosyrer hvor den tunge kjeden også inkluderer en "D" region for ca. 10 eller flere aminosyrer.

De variable regionene av hver lett/tung kjedepar danner det antistofifbindende sete. Derfor har et intakt antistoff to bindingsseter. Kjedene har alle den samme generelle strukturen med relativt konserverede leseramme-regioner (FR) forbundet med tre hypervariable regioner, også kalt komplementært bestemte regioner eller CDRer. CDRene fra to kjeder av hvert par blir sammenstilt av leseramme-regionene og muliggjør bmding til en spesifikk epitop. Fra N-terminal til C-terrninal omfatter både lett og tunge kjeder domene FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 og FR4. Tildelingen av aminosyrer til hvert domene er i overensstemmelse med velkjente konvensjoner [Kabat "Sequences of Proteins of hnmunological Interest" National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 og 1991; Chothia, et al., J. Mol Biol. 196:901-917 (1987); Chothia, et al., Nature 342-878-883 (1989)].

Det er velkjent i fagfeltet, at monoklonale antistoffer lett lages med passende spesifisitet ved hjelp av standard teknikker for immunisering av pattedyr, ved å danne hybridomer fra de antistoffproduserende celler fra nevnte pattedyr eller på annen måte hrmiortalisere, og dyrke hybridomasene eller immortaliserte celler for å undersøke dem for den passende spesifisiteten. I det foreliggende tilfellet kunne slike antistoffer bli laget ved å immunisere et menneske, kanin, rotte eller mus, for eksempel med et peptid som representerer en epitop som dekker 13-28 regionen i Ap-peptidet eller en passende subregjon av den. Materialer for rekombinant manipulering kan skaffes ved å gjenvinne nukleotidsekvensene som koder for det ønskede antistoffet fra hybridomaen eller en annen celle som produserer det. Disse nukleotidsekvensene kan så manipuleres for å tilveiebringe dem i humanisert form.

Ved "humanisert antistoff' menes et antistoff delvis eller fullstendig består av amrnosyresekvenser utledet fra et humant antistoff "germline" ved å forandre sekvensen til et antistoff som har ikke humane komplementære bestemmende regioner (CDR). Den enkleste av en slik forandring kan enkelt bestå av å substituere den konstante regionen til et humant antistoff med den konstante regionen hos mus, og dermed få en human/murin kimær som har tilstrekkelig lav immunogenisitet for å være akseptabel for faimasøytisk anvendelse. Imidlertid blir helst den variable regionen i antistoffet og selv CDRen helst humanisert med teknikker som er velkjent i fagfeltet. Leseramme-regionene i de variable regionene blir substituert med de korresponderende humane leseramme-regionene og etterlater den ikke humane CDRen så å si intakt, eller man kan erstatte CDRen med sekvenser utledet fra et humant genom. Fullt humane antistoffer blir produsert i genetisk modifiserte mus hvis immunsystem er blitt forandret til å korrespondere til humane immunsystemer. Som nevnt over, er det tilstrekkelig for anvendelse i fremgangsmåten i oppfinnelsen å bruke et immunologisk spesifikt fragment av antistoffet, inkludert fragmenter som representerer enkle kjedeformer.

Et humanisert antistoff igjen referer seg til et antistoff som omfatter et humant leseramme, minst en CDR fra et ikke-humant antistoff, og hvor enhver konstant region som er til stede så si er identisk til en human immunoglobulin konstant region, dvs. minst ca 85 til 90%, helst minst 95% identitet. Følgelig er alle deler av et humanisert antistoff, unntatt muligens CDRene, vesentlig identisk til korresponderende deler av ett eller flere native humane immunglobulinsekvenser. For eksempel ville et humanisert immunglobulin typisk ikke omfatte et kimært musevariabelt region/human konstant region antistoff.

Humaniserte antistoffer har minst tre potensielle fordeler over ikke humane og khnære antistoffer for anvendelse i human terapi: 1) Fordi effektfordelen er human, kan det interagere bedre med andre deler av det humane immunsystemet ( for eksempel ødelegge målcellene mer effektivt ved komplementavhengige cytotoksisitet (CDC) eller antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC))). 2) Det humane immunsystemet bør ikke gjenkjenne leserammen eller C-regionen i humaniserte antistoffer som fremmed, og derfor bør antistoffresponsen mot et slikt injisert antistoff være mindre enn mot totalt fremmed ikke-humant antistoff eller et partielt fremmed kimært antistoff. 3) Injiserte ikke-humane antistoffer er blitt rapportert å ha en halveringstid i den humane sirkulasjonen som er mye kortere enn halveringstiden på humane antistoffer. Injiserte humaniserte antistoffer vil ha en halveringstid som essensielt er identisk naturlig forekommende humane antistoff, noe som tillater til at lavere og mindre frekvente doser kan gis.

Designen av humaniserte immunglobuliner kan utføres som følger. Når en aminosyre faller under følgende kategori, blir leserammen aminosyren til et humant immunglobulin som skal anvendes (aksepterimmunglobulin) erstattet av en leserammen aminosyre fra et CDR-tilveiebringende ikke-humant immunglobulin (donor immunglobulin): (a) aminosyren i den humane leserammen regionen hos aksepterirnmunglobulinet er uvanlig for humanimmunglobulin i den posisjonen, mens den korresponderende aminosyren i donorimmunglobulinet er typisk for humant immunglobulin i den posisjonen;

(b) posisjonen til aminosyren er helt tilstøtende til en av CDRene; eller et

farmasøytisk aksepterbart salt, et hydrat eller en ester derav.

(c) ethvert sidekjedeatom i en leserammen aminosyre er innen ca. 5-6 angstrøms (senter-itl-senter) av ethvert atom i en CDR aminosyre i en tredimensjonal immunglobulinmodell [Queen, et al, op. eit, og Co. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88,2869 (1991]. Når hver av aminosyrene i den humane leserammen regionen i akseptorimmunglobulinet og en korresponderende aminosyre i donorimmunglobulinet er uvanlig for human immunglobulin i den posisjonen, blir en slik aminosyre erstattet av en aminosyre som er typisk for human immunglobulin i den posisjonen.

Et foretrukket humanisert antistoffer en humanisert form av museantistoffet 266. CDRene av humaniserte 266 har følgende aminosyresekvenser:

lett kjede CDR1:

lett kjede CDR2: lett kjede CDR3: tung k j ede Cdri:

Tung kj ede CDR2: og, tung kjede CDR3:

En foretrukket lett kjedevariabel region til et humanisert antistoff i den foreliggende oppfinnelsen har den følgende aminosyresekvensen, hvor leserammen kommer fra humane "gerrnline" Vk segmenter CPK18 og J segment Jkl, med flere aminosyresubstitusjoner i konsensus aminosyrene ai den samme humane V subgruppen for å redusere potensiell irnmungenisitet:

der:

Xaa ved posisjon 2 er Val eller ILe,

Xaa ved posisjon 7 er Ser eller Thr;

Xaa ved posisjon 14 er Thr eller Ser;

Xaa ved posisjon 15 er Leu eller Pro;

Xaa ved posisjon 30 er Ile eller Val;

Xaa ved posisjon 50 er Arg, Gin eller Lys;

Xaa ved posisjon 88 er Val eller Leu;

Xaa ved posisjon 105 er Gin eller Gly;

Xaa ved posisjon 108 er Lys eller Arg; og

Xaa ved posisjon 109 er Val eller Leu.

En foretrukket tung kjedevariabel region i et humanisert antistoff i den foreliggende oppelsen har den følgende aminosyresekvensen hvor leserammen, fra humane "germlirie" VH segmenter DP53 og J segment JH4, med flere ammosyresubstitusjoner til konsensus aminosyrer i den samme humane subgruppen for å redusere potensiell immunogenisitet:

der:

Xaa ved posisjon 1 er Glu eller Gin;

Xaa ved posisjon 7 er Ser eller Leu;

Xaa ved posisjon 46 er Gly, Val, Asp, eller Ser;

Xaa ved posisjon 63 er Thr ellr Ser;

Xaa ved posisjon 75 er Ala, Ser, Val, eller Thr;

Xaa ved posisjon 76 er Lys eller Arg;

Xaa ved posisjon 89 er Gly eller Asp; og

Xaa ved posisjon 107 er Leu eller Thr.

En spesielt foretrukket lettkjedevariabel region i et humanisert antistoff i den foreliggende oppfinnelsen har den følgende aminosyresekvensen hvor leserammen kommer fra humane "germline" Vk segmenter DPK18 og J segment Jkl, med flere armnosyresubstitusjoner til konsensus aminosyrene i den samme humane V subgruppen for å redusere potensiell immunogenisitet:

En spesielt foretrukket rung kjedevariabel region i et humanisert antistoff i den foreliggende opprinnelsen har følgende aminosyresekvens hvor leserammen kommer fra humane "germline" Vil segmenter DP53 og J segment JH4:

En foretrukket lett kjede for et humant antistoff i den foreliggende oppfinnelsen har aminosyresekvensen:

En foretrukket tung kjede for et humanisert antistoff i den foreliggende oppfinnelsen har aminosyresekvensen:

Andre sekvenser er mulige for de lette og tunge kjedene i de humaniserte antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen og for humanisert 266. Immunglobulinene kan ha to par med lett kjede/tung kjedekomplekser, minst en kjede som omfatter en eller flere mus komplementaritetsbestemmende regioner som funksjonelt er forbundet til human leserammeregionsegmenter.

I et annet aspekt er den foreliggende oppfinnelse rettet mot rekombinante polynukleotider som koder for antistoffer som når de blir uttrykt, omfatter de tunge og lette kjeder CDRene fra et antistoff i den foreliggende oppfinnelse. Som ved den humane leserammeregionen, blir en leseramme eller en variabel region aniinosyresekvens av et CDR-tilveiebringende ikke humant immunglobulin sammenliknet med korresponderende sekvenser i en human immunglobulinvariabel regionsekvenssamling, og en sekvens som hai* en høy prosent med identiske aminosyrer blir valgt. Eksempler på polynukleotider som ved ekspresjon koder for polypepridkjedene som omfatter de tunge og lette kjede-CDRene i monoklonalt antistoff266 er vist i figurene 4 og 5. På grunn av kodon degenerering ikke-kritiske aminosyresubstitusjoner, kan andre polynukleotidsekvenser lett substitueres for de sekvensene. Spesielt foretrukne polynukleotider i den foreliggende oppfinnelsen koder for antistoffer som når de uttrykkes omfatter CRene til SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO:6, eller enhver av de variable regionene i SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:10, eller de lette og tunge kjedene i SEQ ID NO: 11 og SEQ ID NO: 12.

Polynukleotidene vil typisk videre inkludere en ekspresjonskontroll polynukleotidsekvens som virkbart er koblet til de humaniserte immunglobulinkodende sekvensene, inkludert naturlig-assosierte eller heterologiske promoterregioner. Helst er ekspresjonskontrollsekvensene eukaryote promotersystemer i vektorer som er i stand til å transformere eller transfektere eukaryote vertsceller, men kontrollsekvensene for prokaryote verter kan også anvendes. Når en vektor er blitt inkorporert i den passende vereceUelinjen, blir vertscellen propagert under betingelser som er passende for høyt nivåekspresjon av nukleotidsekvensene, og som ønskelig, kan samlingen og rensingen av de lette kjedene, tunge kjedene, lette/tunge kjededimerene eller intakte antistoffer, bindingsfragmenter eller andre immunglobulinformer etterfølges.

Nukleotidsekvensene i den foreliggende oppfinnelsen som er i stand til å maksimalt uttrykke de ønskede humaniserte antistoffene kan dannes fra en rekke forskjellige polynukleotider (genomisk eller cDNA, RNA, syntetiske oligonukleotider osv.) og komponenter (for eksempel V,J,D, og C regioner), så vel som ved en rekke forskjellige teknikker. Å forbinde passende genomiske og syntetiske sekvenser er en vanlig fremgangsmåte for produksjon med cDNA sekvenser kan også brukes.

Humane konstante region DNA sekvenser kan isoleres i overensstemmelse med kjente prosedyrer fra en rekke humane celler, men helst fra immortaliserte B-celler. CDRene for å produsere immunglobuliner i den foreliggende oppfinnelsen vil på liknende måte bli utledet fra ikke humane monoklonale antistoffer som er i stand til å binde seg til en epitop mellom aminosyrene 13 og 28 i Ap-peptidet, hvis monoklonale antistoffer blir produsert i enhver passende pattedyrkilde, inkludert mus, rotter, kaniner og andre vertebrater som er i stand til å produsere antistoffer med velkjente fremgangsmåter som beskrevet over. Passende celler for polynukleotidsekvenser og vertsceller for irmnunglobulin ekspresjon og sekresjon kan skaffes fra en rekke kilder som er velkjent i fagfeltet.

I tillegg til de humaniserte immunglobulinene som spesifikt er beskrevet her, kan andre "faktisk homolog" modifiserte immunglobuliner lett designes og produseres ved å bruke forskjellige rekombinante DNA teknikker som er velkjent for fagfolk. For eksempel kan leserammeregioner variere fra native sekvenser på det primære strukrurnivået ved flere aminosyresubstitusjoner, terminale og intermediære addisjoner eller delesjoner og liknende. Videre kan en rekke forskjellige humane leseramme-regioner anvendes enkeltvis eller i kombinasjon som et grunnlag for de humaniserte immunglobulinene i den foreliggende oppfinnelsen. Generelt kan modifikasjonene av genene lett utføres ved en rekke av velkjente teknikker, slik som posisjons-dirigert mutagene.

Alternativt kan polypeptidfragmenter som omfatter bare en del av den primære antistoffstrukturen produseres, hvis fragmenter besitter en eller immunglobulinaktiviteter (for eksempel komplement fikseringsaktivitet). Disse polypeptidfragmentene kan produseres ved proteolytisk Møyving av intakte antistoffer ved hjelp av fremgangsmåter som er velkjente i fagfeltet, eller ved å sette inn stoppkodons ved de ønskede lokaliseringene i vektorer ved å anvende posisjons-dirigert mutagenest, slik som CH1 for å produsere Fab fragmenter eller etter hengselsregionen for å produsere F(ab')2 fragementer. Enkeltkjedete antistoffer kan produseres ved å kople sammen VL og VH med en DNA linker.

Som erklært tidligere, vil de kodende nukleotidsekvensene bh uttrykt i verter etter at sekvensene er blitt virksomt koplet til (dvs. posisjonert for å sikre funksjonen av) en ekspresjonskontrollsekvens. Disse ekspresjonsvektorene er typisk i stand til å replikere i vertsorganismene enten som episomer eller som en integrert del av det kromosomale DNA hos verten. Vanligvis vil ekspresjonsvektorene inneholde seleksjonsmarkører, for eksempel tetrasyklin eller neomycin for tillate deteksjon av de cellene som er transformert med de ønskede DNA sekvensene.

E. coli er en prokaryot vert som er nyttig spesielt for kloning av polynukleotidene i den foreliggende oppfinnelsen. Andre mikrobielle verter som er passende for anvendelse inkluderer bacilli, slik som Bacillus subtilus og andre enterobakterier, slik som Salmonella, Serratia og forskjellige Pseudomonas arter. I disse prokaryote vertene, kan man også lage ekspresjonsvektorer som typisk vil inneholde ekspresjonskontrollsekvenser som er kompatible med vertscellen (for eksempel en kilde for replikasjon). I tillegg kan enhver av en rekke velkjente promoterer være til stede, slik som laktosepromotersystemet, et tryptofam (trp) promotersystem, et beta-laktamase promotersystem, eller et promotersystem fra fag lambda. Promoterene vil typisk kontrollere ekspresjon, valgfritt med en operator sekvens, og har ribosombindesetesekvenser og liknende, for initiering og ferdiggjøring av transkripsjon og translasjon.

Andre mikrober slik som gjær, kan også anvendes for ekspresjon. Saccharomyces er en foretrukket vert med passende vektorer som har ekspresjonskontrollsekvenser, slik som promotere, inkludert 3-fosfoglycerat kinase eller andre glykolytiske enzymer og en replikasjonskilde, termineringssekvenser og liknende som er ønskelig.

I tillegg til mikroorganismer kan pattedyrvevcellekulturer også anvendes for å uttrykke og produsere polypeptidene i den foreliggende oppfinnelsen. Eukaryote celler faktisk foretrukket, fordi et antall passende vertscellelinjer som er i stand til å utskille immunglobuliner er blitt utviklet i fagfeltet, og inkluderer CHO cellelinjene, forskjellige COS celleliner, Syrian hamster ovariecellelinjer, HeLa celler, foretrukne myelomacellelinjer, transformerte B-celler, humane embryoniske nyrecellelinjer eller hybridomas. Ekspresjonsvektorer for disse cellene kan inkludere ekspresjonskontrollsekvenser, slik som replikasjonskilde, en promoter, en enhancer og informasjonsseter som er nødvendig for prosessering, slik som ribosombindende seter, RNA splice seter, polyadenyleringsseter, og transkripsjonsterminatorsekvenser,. Foretrukne ekspresjonskontrollsekvenser er på promotere utledet fra immunglobulingener, SV40, Adenovirus, Bovint Papilloma virus, cytomegalovirus og liknende.

Vektorene som inneholder nukleotidsekvensene av interesse (for eksempel de tunge og lette kjedekodende sekvensene og ekspresjonskontrollsekvenser) kan overføres til vertscellen ved hjelp av velkjente fremgangsmåter, som varierer avhengig av type cellulær vert. For eksempel er det vanlig at kalsiumkoridtransfeksjonen anvendes for prokaryote celler, mens kalsiumfosfatbehandling eller elektroforering kan anvendes for andre cellulære verter.

Når de er uttrykt, kan hele antistoffene, deres dimerer, individuelle lette og tunge kjeder, eller andre inmiunglobulinformer i den foreliggende oppfinnelsen renses ifølge standard prosedyrer i fagfeltet, inkludert arnmomumsulfatpresipitering, ioneutbytting, affinitet, revers fase, hydrofob interaksjon kolonnekromatografi, gelelektroforese og liknende. Vesentlig rene immunglobuhner på minst ca. 90 til 95% homogenitet er å foretrekke, og 98 til 99% eller mer homogenitet er mest foretrukket for farmasøytiske anvendelser. Når de er renset, delvis eller til den ønskede homogenitet, kan polypeptidene så anvendes terapeutisk eller profylaktisk som beskrevet her.

Antistoffene (inkludert immunologisk reaktive fragmenter) blir gitt til et individ som har risiko for eller utviser Ap-relaterte symptomer eller patologi slik som klinisk eller preklinisk Alzheimers sykdom, Downs syndrom, eller klinisk eller preklinisk amyloid angiopati, ved å anvende standard administrermgsteknikker, helst perifert (dvs. ved ikke å administrere inn i sentralnervesystemet) ved intravenøs, intraperitoneal, sukutan, pulmonelt, transdermalt, intramuskulært intranasalt, bukalt, sublingualt, eller ved stildqjilleadministrering. Selv om antistoffene kan gis direkte i det ventrikulære systemet, spinalvæske eller hjerne-parenchyma og teknikker for å finne frem til disse lokaliseringene er velkjent i fagfeltet, er det ikke nødvendig å anvende disse mer vanskelige prosedyrene. Antistoffene i oppfinnelsen er effektive når de gis ved de mer enklere teknikkene som er avhengig av det perifere sirkulasjonssystemet. Fordelene med den foreliggende oppfinnelsen inkluderer evnen antistoffene utviser med deres gunstige effekter selv om de ikke tilveiebringes direkte til sentralnervesystemet selv. Faktisk er det blitt demonstrert her at mengde antistoff som krysser blod-hjerne-barrieren er <0,1% av plasmanivåene og at antistoffene i oppfinnelsen utviser deres evne til å binde Ap i den perifere sirkulasjonen så vel som å forandre CNS og plasma rensing av løselig Ap.

De farmasøytiske sanmensetningene for adnumstrering er designet slik at de er passende for del valgte måten for administrering, og farmasøytiske akseptable tilsetningsstoffer slik som spredningsagens, buffere, surfaktanter, konserveringsmidler, oppløsrringsmidler, isotoniske midler, stabiliseringsmidler og liknende blir anvendt på en passende måte. Kemingtrm' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, siste utgave, tilveiebringer et kompendium på preparatteknikker som er generelt kjent for praktiserende leger. Det kan være spesielt nyttig å forandre løselighetskarateristikaene til antistoffene i oppfinnelsen, ved å gjøre dem mer lipofile, for eksempel ved å kapsle dem inni liposomer eller ved blokkerende polare grupper.

lavering i det perifere systemet ved intravenøs eller intraperitoneal eller subkutan injeksjon er å foretrekke. Passende vehikler for slike injeksjoner er rett frem. I tillegg kan imidlertid administreringen også bh utført gjennom de mykosomale membranene ved hjelp av nasale aerosoler eller suppositorier. Passende preparater for slike måter administrere på er velkjente og inkluderer typisk surfaktanter som fasiliteter overførsel via membran, slike surfaktanter er ofte utledet fra steroider og er kationiske lipider slik som N-[l-(2,3-dioleoyl)propyl-N,N,N-1rimetylammomumklorid(DC)TMA) eller forskjellige forbindelser slik som kolesteromeimisuksinat, fosfatidylglyseroler og liknende.

Konsentrasjonen av det humaniserte antistoffet i preparatene er fra så lavt som ca. 0,1% til så mye som 15 eller 20 vekt% og vil bli valgt primært basert på væskevolumer, viskositeter osv. overensstemmelse med den spesielle måten for administrering som blir valgt. Derfor kunne en typisk farmasøytisk sammensetiiing for injeksjon lages slik at den inneholdt 1 ml sterilt bufret vann av fosfatbufret saltvann og 1-100 mg av det humaniserte antistoffet i den foreliggende oppfinnelsen. Preparatet kunne bli sterilfiltrert etter at det var laget, eller på annen måte bli gjort mikrobiologisk akseptabelt. En typisk sarnmensetning intravenøs infusjon kunne ha et volum på så mye som 250 ml av væske, slik som steril Ringers løsning, og 1-100 mg per ml eller mer i antistoffkonsentrasjon. Terapeutiske midler ifølge oppfinnelsen kan være frosne eller lyofiliserte for lagring og bli rekonstituert i en passende steril bærer før anvendelsen. Lyofihseringen og rekonstitueringen kan føre til varierende grad av antistoffaktivitetstap (for eksempel med konvensjonelle immunglobuliner, IgM antistoffer tenderer å ha større aktivitetstap enn IgG antistoffer). Dosene må kanskje justeres for å kompensere for dette. pH av preparatet vil være valgt for å balansere antistoffstabiliteten (kjemisk og fysisk) og slik at det passer til pasienten når det blir gitt. Generelt er en pH mellom 4 og 8 tolerert.

Selv om de foregående fremgangsmåtene synes å være mest skikket og mest passende for administrering av proteiner slik som humaniserte antistoffer, ved passende tillemping, kan andre telaiikker for administrering slik som transdermal administrering og oral administrering også brukes hvis et passende preparat blir designet.

I tillegg kan det være ønskelig å bruke kontrollerte frigjøringspreparater ved å anvende biodegraderbare filmer og matriser, eller osmotiske minipumper, eller leveringssystemer basert på dekslrankuler, alginat, eller kollagen.

Oppsummert så er preparatene tilgjengelige for å gi antistoffene i oppfinnelsen og er velkjente i fagfeltet og kan velges fra en rekke opsjoner.

Typiske doseringsnivåer kan optimaliseres ved å anvende standard kliniske teknikker og vil være avhengig av administreringsmåten og tilstanden til pasienten. De følgende eksemplene er ment for å illustrere men ikke for å begrense oppfinnelsen.

Eksemplene herunder bruker blant andre, et musemonoklonalt antistoff som kalles "266" som opprinnelig ble laget ved å immunisere med et peptid som bestod av residiene 13.-28 i humant Ap-peptid. Antistoffet ble bekreftet å immunreagere med dette peptidet, men hadde tidligere blitt rapportert til ikke å reagere med peptidet som inneholdt bare residiene 17 til 28 av humant Ap-peptid, eller enhver annen epitop innen Ap-peptid. Fremstillingen av dette antistoffet er beskrevet i U.S. patent 5 766 846. Ettersom eksemplene her beskriver eksperimenter utført i musesystemer, er anvendelsen av musemonoklonale antistoffer tilfredsstillende. Imidlertid er, i behandlingsfremgangsmåter i oppfinnelsen som er ment for humant bruk, humaniserte former av antistoffene med immunspesifisiteten som korresponderer til den til antistoff 266 å foretrekke.

Eksempel 1

Binding av tilsatt Ap- peptid i humane væsker

Prøver fra human cerebrospinalvæske (CSF) (50 ul) og human plasma (50 ul) ble inkubert i 1 time ved romtemperatur som følger:

1. alene

2. sammen med 5 ng Ap 40 peptid; eller et farmasøytisk aksepterbart salt, et hydrat eller en ester derav. 3. 5ng Ap 40 peptid pluss 1 mg monoklonalt antistoff 266 (beskrevet for eksempel i U.S. 5 766 846).

Prøvene ble så kjørt på elektroforese på en 4-25% ikke-denaturerende gradient gel, dvs. ikke-denaturerende gradient elektroforese (NDGGE) og overført til nitrocellulose. Blottene ble så farget med Ponceau S eller for Western blot, probet med biotinmerket monoklonalt antistoff (3D6) som er rettet mot de første fem aminosyrene til Ap-peptidet, fremkalt med streptavidin-"horse radish peroxidase" og detektert ve anriket kjemiluminescens (ECL). De hydrerte diameterne av materialene som fantes i båndene på blotene ble estimert ved å bruke Pharmacia molekylær vektmarkører. Hvis Ap-peptidet er bundet til andre molekyler, vil det derfor vandre med størrelsen til det resulterende komplekset.

Western blot av CSF enten med eller uten 5 ng Ap-peptid viser ikke noe bevis på Ap-peptidet som respons til deteksjon styrt av antistoff 3D6. Liknende resultater ble oppnådd for humant plasma. Dette var sant til tross for det faktum at Ap-peptid kunne detekteres ved SDS-PAGE etterfulgt av Western blot ved å anvende den samme teknikken og på de samme CSF prøvene. Antakelig ble deteksjonen av AP-peptid hindret av interaksjoner mellom dette peptidet og andre faktorer i væskene som ble testet. Imidlertid, når Mab 266 blir tilsatt til inlniberingen, er karakteristiske bånd som representerer bundet Ap-peptid i kompleks med antistoffet til stede både i plasma og CSF. Hovedbåndet er ca. 11 nm hydrert diameter, korresponderende til antistoffmonomer med et tilleggs mindre bånd ved 13 nm korresponderende til antistoffdimer.

Eksempel 2

Spesifisiteten til det bundne antistoffet

Prøver som inneholdt 50 ul av humant CSF eller 10 ul av APP<v717F>CSF ble brukt. APP<V717F>er transgene mus som representerer en musemodell av Alzheimers sykdom hvor det humane amyloide forløperprotein transgent med en familiær Alzheimers sykdom mutasjon blir uttrykt og resulterer i produksjonen av humant Ap-peptid i sentralnervesystemet.

Prøvene ble inkubert med eller uten forskjellige Mab (1 iig) i 1 time ved romtemperatur og så kjørt på elektroforese på en 4-25% NDGGE og blottet over på nitrocellulose som beskrevet i eksempel 1. Antistoffene var som følger: Mab 266 (binder til posisjonene 13-28);

Mab 4G8 (binder til posisjonene 17-28);

QCBpan (kanin polyklonalt for posisjonene 1-40);

muse IGG (ikke-spesifikt);

Mab 3D6 (binder til posisjonene 1-5);

Mab 21F12 (binder til posisjonene 33-42);

Mab 6E10 (binder til posisjonene 1-17); og

QCB4o,42(kamn plyklonaler til AP40og AP42).

Deteksjon av Ap-peptidantistoffkomplekset var som beskrevet i eksempel 1 - biotin merket 3D6 (til Ap-peptidet N-terminus) etterfulgt av straptavidin-HRP og ECL. Liknende deteksjon i human CSF inkubert med Mab 266, i noen tilfeller substituert QCB40.42, som binder seg til den karboksylterminale enden av Ap-peptid, for eD6.

Resultatene visste at av antistoffene som ble testet tillot bare Mab 4G8 og Mab 266 deteksjonen av Ap-peptid.

Resultatene viste at for human CSF, var bare Mab 266 og Mab 4G8 i stand til å binde i detekterbare mengder et antistoff Ap kompleks (igjen uten noe antistoff, ingen Ap blir detekter). Mab 266 ble også i stand til å produsere liknende resultater til de som ble oppnådd med human CSF med CSF fra APP<V717F>transgene mus. Ap-peptid kunne bindes i human CSD ved å anvende Mab 266 uansett om 3D6 eller QCB4o,42antistoff ble anvendt for å fremkalle Western blot.

Eksempel 3

Demonstrasjon av A[ 3- peptid- 266 kompleks ved hjelp av todimensjonal elektroforese

En prøve som inneholdt 50 ng av Ap4o-peptid ble inkubert med 2 jig Mab 266 ved 37°C i 3 timer. En korresponderende inkubering av Mab 266 alene ble anvendt som en kontroll.

Prøvene ble så kjørt på en todimensjonal gelelekroforese.

I den første dimensjonen, ble de inkuberte prøvene utsatt for NDGGE som beskrevet i eksempel 1. Polyakrylamidgelen ble så kuttet i individuelle spor loddrett på retningen av den første dimensjonale kjøringen og gelseparasjon under denaturerende/reduserende betingelser ved SDS-PAGE (Tricin urea-gel) ble utført i den andre dimensjonen. Tilstedeværelse av båndene ble detektert enten ved Ponceau-S farging (ethvert protein) eller ved spesifikk fremkalling ved å anvende 6E10 Mab (Senetek, Inc.) og biotinylert anti-mus Ap i det HRP-baserte deteksjonssystemet.

Ponceau-S farging av nitrocelluloseblottene etter overføring tillot visuahsering av tunge og lette kjeder av Mab 266 alene. Det ble bekreftet at Ap-peptid var i et kompleks med Mab 266 fordi et bånd ved 4kD ble observert som aligner med størrelsen av fullengde Mab 266 som ble sett etter første dimensjonen NDGGE.

Eksempel 4

Demonstrasjon av ikke- ekvivalent binding og squestrasjon

Ap-peptid som sirkulerer i plasma og CSF tror man finnes som kompleks med proteiner, inkludert apolipoprotein E. Det foreliggende eksempelet demonstrerer at antistoffer til apoE, mens det er i stand til å binde komplekset er det ikke i stand til å binde apoE fra det gjenværende av komplekset.

ApoE komplekser (500 ng) ble inkubert med Mab eller polyklonale antistoffer mot apoE (2 iig) ved 37°C i en time. De inkuberte prøvene ble så utsatt for NDGGE ved å anvende teknikkene beskrevet i eksempel 1. Etter NDGGE, ble Western blotting utført med affinitetsrenset geite-anti-apE-antistoffer med deteksjon ved hjelp av ECL. Når det ikke er antistoff til stede, kan apoE detekteres ved 8-13 nm, noe som passer med dets nærvær i lipoprotempartikler. Nærværet av monoklonale eller polyklonale antistoffer mot apoE resulterer i et populasjonsskift av apoE til en større molekylær del, et "superskift". Dette demonstrerer at antistoffene til apoE ikke binder, dvs. fjerner apoE fra en lipoproteinpartikkel, heller binder de seg til apoE på lipoproteinene og danner en større molekylær del.

Eksempel 5

Bindingen av Ap blir ikke forstyrret av anti- apoE- antistoffer

En prøve på 100 ul av human CDF ble inkubert enten med Mab 266 alene, eller med polyklonalt anti-apoE, eller med begge antistoffene i 60 minutter ved 37°C. Prøvene ble så analysert ved hjelp av NDGGE som beskrevet i eksempel 1 og deteksjonen av bånd ble utført som beskrevet i eksempel.

Resultatene viser at så lenge som Mab 266 ble tilsatt til prøven, var båndet ved ca. 11 nm diameter karakteristisk for det bundne 266-Ap-peptid komplekset synlig. Dette er tilfelle enten anti-apoE er til stede eller ikke. Dette båndet som demonstrerer en binding til Ap, viser seg også hvis 50 ng av Ap-peptidet blir tilsatt til inkubasjonsblaaclingen i nærvær av Mab 266. Derfor interfererer forandringen av molekylvekten til apoE ved nærværet av anti-apoE-antistoffer ikke bindingen av Ap-peptidet av Mab 266.

Eksempel 6

Binding av A3- peptid in vivo

A Transgene APP<V717F>mus, også kalt PDAPP mus, overuttrykker en mutant form av humant APP protein. Disse musene produserer humant Ap i CNS og har forhøyede nivåer av humant Ap-peptid sirkulerende i CSF og plasma. Åtte måneder gamle mus ble injisert intravenøst med saltvann eller 100 u.g Mab 266. De ble tappet blod av 10 minutter etter den initsielle injeksjonen og igjen 20 timer etter den initsielle injeksjonen.

Prøver som inneholdt 20 ul av plasma fra hvert dyre ble analysert ved NDGGF og Western blot med antistoff 3D6 som beskrevet i eksempel 1. Saltvanninjiserte dyr viste ikke nærværet av det karakteristiske 11 nm bundne Ap-peptidbåndet verken etter 10 minutter eller 20 timer. Imidlertid viste de to dyrene som ble injisert med Mab 266 tilstedeværelsen av dette båndet etter 20 timer.

B. To måneder gamle APP<V717F>mus ble anvendt i denne studien. Ved dag null, mottok musene enten ingen Mab 266,1 mg Mab 266, eller 100 iig av dette antistoffet. Plasmaprøver ble tatt to dager før antistoffene ble gitt og på dagene 1, 3,5 og 7. Plasmaprøvene ble utsatt for NDGGF etterfulgt av Western blotting og deteksjon med 3D6 som beskrevet i eksempel 1. Ved alle tidspunktene etter administreringen av Mab 266, ble 266/Ap komplekset detektert med mindre plasmaprøvene var blitt behandlet med protein G, som binder seg til immunglobulin, og dermed effektivt fjerner Mab 266. Overensstemmende nivåer av kompleks over tidsperioden som ble testet ble funnet unntatt for en lett "drop-off" i dag syv som blir injisert med 100 fig av Mab 266; generelt var nivåene i dyr som hadde fatt 100 u.g konsekvent lavere enn de som ble funnet i mus som var gitt 1 mg av dette antistoffet. C. To 2 måneder gamle APP<v717F>mus ble gitt 1 mg Mab 266 intravenøst og en 25 ul plasmaprøve ble tatt fra hver. Plasmaprøven ble utsatt for NDGGE etterfulgt av Western blot som beskrevet over unntatt at binding med biotinylert 3D6 ble etterfulgt av deteksjon med strep1avidin<125>I(Amersham) og eksponert til en fosforimaging screen. Nivå av kompleks ble estimert i sammenlikning med en standard kurve ved å anvende kjente mengder av Ap4o i kompleks med mettende nivåer av Mab 266 og detektert på samme måte. Mengden av Ap-peptid bundet til Mab 266 ble estimert ved ca. 100 ng/ml, noe som representerer en økning på ca. 1000 ganger over endogent Ap-peptid i disse musene som var blitt bestemt til å være ca. 100 pg/ml. Dette er også liknende til nivået av Ap-peptid i APP<V7>I7Fhjerne før Ap deponering (50-100 ng/g); humant APP og humant Ap i APP<V717F>transgene mus blir produsert så å si bare i hjernen. Derfor synes det som om nærværet av Mab 266 i plasmaet virker som en Ap-peptid sink som fasiliterer den nettoutstrørruningen av Ap-peptid fra CNS til plasma. Denne økede nettoutslrømningen er sannsynligvis et resultat fra både en øket Ap utstrørnning fr CNS til plasma og også fra å hindre Ap i plasma fra å gå tilbake til hjernen.

Den korrekte størrelsen for det bundne Ap-peptidet ble bekreftet ved å kjøre 20 ul av plasmaprøvene skaffet fra APP V717TT mus 24 timer etter de var blitt injisert med 1 mg Mab 266 på TRIS-trisin SDA-PAGE geler etterfulgt av Western blotting ved å anvende anti-Ap-antistoff 6E10 før eller etter protein G eksponering ved å anvende G-bundne kuler. Et bånd som var tømt for protein G ble detektert ved 4-8 kD, i overensstemmelse med nærværet av monomerer og mulige dimerer av Ap-peptid. D. To måneder gamle APP<V717F>mus ble behandlet med enten PBS (n=7) eller 500 jig biotinylert Mab 266 - dvs. m266B (n=9) intraperitonealt. Både før og 24 timer etter injeksjonen, ble plasma analysert for totalt Ap-peptid ved å anvende en modifikasjon av ELISA-metoden til Johnson-Wood, K, et al, Proe. Nati Acad. Sei. USA (1997) 94:1550-1555; og Bales, K.R., et al, Nature Genet (1997) 17:263-264. Totalt Ap bundet til m266B ble målt ved å anvende 96-brønners Optiplater (Packard, Inc.) belagt med m3D6. Fortynnede plasmaprøver og standarder (varierende konsentrasjoner av Ap4oog m266B) ble inkubert over natten i de belagte platene og mengde av total Ap/m266B kompleks ble bestemt ved anvendelse av<125>I-Streptavidin. I tillegg, ved 24 timerstidspunktet, ble plasmaprøvene først behandlet med protein G for å kvantitere Ap-peptid som ikke var bundet til Mab 266, og Aptotaiog AP42ble bestemt ved ELISA i CSF. I PBS-injiserte dyr, var plasma Ap-peptidnivåene 140 pg/ml både før og etter injeksjon. Plasmanivåene var liknende i Mab 266-injiserte mus før injeksjon, men nivåene av Ap-peptid som ikke var bundet til Mab 266 var ikke-detekterbare ved 24 timer etter injeksjon.

Nivåene i CSF ble også målt, CSF representerer et ekstracellulært kompartment innen CNS og konsentrasjonen av molekylene i CSF reflekterer i noen grad konsentrasjonen av substansene i det ekstracellulære rommet i hjernen. CSF ble isolert fra cisterna magna compartmentet. Mus ble anestesert med pentobarbital og muskulaturen fra basen av skallen til den første virvelen ble fjernet. CSF ble samlet ved forsiktig å punktere den araknoaide membranen som dekker cisterne med en mikronål under et disseksjonsmikroskop og trekker CSF inn i en polypropylen mikropipette. Ved 24 timer etter injeksjon ble en økning i totalt Ap-peptid i CSF i Mab 266 -injiserte mus funnet, og en ca. to ganger økning i AP42sanmenliknet til PBS-injiserte mus ble oppnådd i CSF. Dette ble bekreftet ved å anvende denaturerende gel elektroforese etterfulgt av Western blotting med AP42-spesifikt antistoff 21F12.

I et tilleggseksperiment, ble tre måneder gamle APP<V717F>transgene mus injisert med enten PBS eller Mab 266 intravenøst og båe AP40og AP42nivåene ble undersøkt i CSF som følger: For måling av AP40ble det monoklonale antistoffet m2G3 som er spesifikt for AP40anvendt. ELISAen som er beskrevet (Jonson-Wood, K. et al, Proe. Nati. Acad. Sci. USA

(1997)94:1550-1555) ble modifisert til en RIA ved å erstatte Streptavidin-HRP reagenset med<125>I-Streptavidin. For plasma og CSF prøver ble prosedyren utført under ikke-denatareringsbetirigelser som manglet guanidin i bufferne. For undersøkelse av karbonatløselig og uløselig Ap i hjernehomogenat ble prøvene homogenisert med 100 mM karbonat, 40 mM NaCl, pH 11,5 (4°C), sentrifugert ved 10000 x g i 15 minutter og Ap ble undersøkt i supernatanten (løselig) og pelleten (uløselig) fraksjonene som beskrevet (Johnson-Wood. K. et al, Proe. Nati Acad. Sei. USA (1997)94:1550-1555) og opplistet over. Målingen av Ap/Mab 266 kompleks i plasma ble utført ved hjelp av et modifisert RIA. Mus ble injisert med biotinylert Mab 266 (Mab 266B) og plasma ble isolert ved flere tidspunkter. Totalt Ap bundet til Mab 266 ble målt ved å anvende 96-brørrners optiplater (Packard, Inc.) belagt med m3D6. Fortynnede plasmaprøver og standarder (varierende konsentrasjoner av Ap4oog Mab 266) og inkubert over natten i de belagte platene og mengden av totalt Ap/Mab 266B kompleks ble bestemt ved anvendelsen av I2^-Streptavidin.

Tre timer etter den intravenøse injeksjonen av Mab 266, var der en to gangers økning i CSF Ap4onivåene og en ildce-si<g>mfikant økning i AP42. Imidlertid var det ved både 24 og 72 timer en to til tre gangers økning i både AP40og Ap42i CSF. Liknende resultater ble oppnådd ved å anvende denaturerende gel analyse etterfulgt av Ap Western blotting av sammenslåtte CSF. Utstrømningen av Ap gjennom hjerne interstitisiell væske, som i noen grad er reflektert av CSF nivåene, er antakelig årsaken til den observerte økningen i CSF Ap.

Det er signifikant at forandringen i CSF Ap-peptidnivåene ikke kan skyldes at Mab 266 går inn i CSF fordi nivåene målt 24 timer etter injeksjon, som er mindre enn 0,1% plasmanivåer av Mab 266, er utilstrekkelige til å være årsak til forandringene. Disse resultatene tyder på at Ap-peptidet blir trukket tilbake fra hjerne parenchyma til CSF ved nærværet av antistoffet i blodstrømmen.

Former av Ap-peptidet som er løselig i PBS eller karbonatbuffer ble målt i cerebral cortikale homogenater i de samme musene som var blitt injisert med Mab 266 og hvor CSF ble analysert som beskrevet ovenfor. Liknende økninger i disse løselige formene i de kortikale homogenatene ble observert.

Eksempel 7

Mab 266 virker som en Ap- peptidsink in vitro

Et dialysekammer ble konstruert som et in vitro system for å teste evnen til Mab 266 til å virke son en sink for Ap-peptid. En ml human CSF ble plassert i toppkammeret til et polypropylenrør separert ved en dialysemembran med en spesifikk "cutoff' i området 10-100 kD fra et bunnkarnmer som inneholdt 75 \ iL PBS med eller uten 1 \ ig Mab 266.

Det viste seg at likevekt ble nådd etter 3 timer, som bestemt ved å utsette materialet i burrnkarnmeret for sure ureageler etterfulgt av Western blotting for Ap-peptid med 6E10 ved forskjellige tidspunkter. Prøvene ble denaturert i maursyre til en sluttkonsentrasjon på 80% (volum/volum) og redusert med p-merkaptoetanol (1%). Prøvene ble kjørt på elektroforese (anode til katode) i en 0,9 M eddiksyre kjørebuffer gjennom en 4% til 35% polyakrylamidgradientgel som inneholdt 6 M urea, 55 (volum/volum) iseddiksyre og 2,5% TEMED. Den syre pH til gelen ble nøytralisert før overføring til nitrocellulose. Etterpå ble standard Western blotting teknikker anvendt for å identifisere Ap. Båndene som ble detektert korresponderte til 4 kD.

Mengde Ap fjernet fra toppkammeret ble så bestemt ved hjelp av ELISA-analyse av både topp og burmkammerene (n=4) etter 3 timer. Resultatene for de forskjellige molkylvekt cutoffene i nærværet og fråværet av Mab 266 er vist i figur 1. Som vist, menns bare minimale mengder av Ap-peptidet krysset membranen når PBS var plassert i bunnkammeret, var 50% Ap-peptidet bundet i bunnkammeret når Mab 266 var til stede og molekyl cutoff var 25 kD; økende mengder krysset som molekylvekt cuttoffen økte til 100 kD, når nesten 100% av Ap-peptidet var dradd over membranen.

Det ble også observert at anti-N-terminal Ap antistoffene 3D6 og 10D5 bar i stand til å trekke Ap-peptidet over membranen i dette systemet, men ikke i stand til å binde Ap-peptidet i analysene som er beskrevet i eksempel 1. Disse resultatene viser at antistoffene til Ap-peptidet har tilstrekkelig affinitet under disse betingelsene til å binde peptidet i fysiologiske løsninger bort fra andre bindingsproteiner, men at Maber slik som 266 som er immunreaktive med en epitop i posisjonene 13-28 er betydelig mer effektive og binder med høyere affinitet. I liknende analyser hadde astrocytt-utskilte apoE4 som ble renset som beskrevet av DeMattos, R.B., et al., J. Biol. Chem. (1998) 273:4206-4212; Sun, Y., et al., J, Neurosci,. (1998) 18:3261-3272 en liten men statistisk signifikant effekt i å øke massen av Ap-peptid i bunnkarnmeret. Ingen tydelig effekt ble observert når polyklonalt IgG eller BSA ble substituert for Mab 266.

Eksempel 8

Strømning av Ap- peptid til plasma fra CNS

A. Et iig av Ap40ble løst i 5 ul rotte CSF for å holde det løselig og ble så injisert inn i subaraknoid-rommet i cisterna magna til villtype Swiss-Webster mus som tidligere hadde mottatt IV injeksjoner av enten PBS (n=3) eller 200 jig av biotinylert Mab 266 (n=3). Ved forskjellige tidspunkter etter behandling ble Aptotaii plasma til musene bestemt ved hjelp av Ap ELISA, ved å anvende 3D6 som det beleggende antistoffet og standarder av Ap blandet med et overskudd av biotinylert 266. Hver plasmaprøve ble blandet med et overskudd av biotinylert 266 etter fletning fra hvert dyr for Ap deteksjon i ELISA. I de PBS-injiserte musene ble minimalt detekterbare mengder av peptidet på nivåer av 0,25 ng/ml detektert som toppverdier etter 30-60 minutter, hvoretter nivåene var så å si null. I mus som hadde fått Mab 266, nådde imidlertid plasma Ap-peptidnivåene 330 ganger høyere enn de som ble detektert i PBS-injiserte mus etter 60 minutter (ca. 50 ng/ml) og nådde nivåer på ca. 90 ng/ml etter 180 minutter.

B. Denne prosedyren ble repetert ved å anvende enten 200 jig (n=3) eller 600 p,g(n=3) injisert IV inn i to måneders gamle APP<V7I7F>mus. Mab 266 ble injisert i.v. inn i 3 måneders gamle APP<V7>17F +/+ mus med de ovennevnte dosene. Før og ved forskjellige tidspunkt etter i.v. injeksjonen, ble plasmakonsentrasjonen av Ap bundet til Mab 266 bestemt ved RIA. De detaljerte resultatene fra en illustrerende mus er vist i figur 2.

Det ble funnet at konsentrasjonen av Ap bundet til det monoklonale antistoffet Mab 266 økte fra basalnivåene på 15 pg/ml til nivåer over 100 ng/ml etter fire dager. Ved å analysere tidlige tidspunkter på kurven ble det bestemt at nettohastigheten for at Aptotai kommer inn i plasma i APP^<1717>transgene mus var 42 pg/ml/minutt i nærværet av mettende nivåer av antistoffet.

Effekten av Mab 266 på plasma Ap nivåer i både villtyper og APP<V717F>transgene mus så vel som effektene av antistoffet på Ap konsentrasjonen i CSF viser at nærværet av sirkulerende Mab 266 resulterer i en forandring av Ap strømningen eller transporten mellom CNS og plasma.

Eksempel 9

Mab 266 effekt på Ap i hjernen

Fire måneder gamle APP<V7>17F+/+ mus ble behandlet hver annen uke i 5 måneder med IP injeksjoner av saltvann, Mab 266 (500 u,g) eller kontroll muse IgG (100 jig, Pharmigen). Musene ble tatt livet av ni måneder gamle og Ap deponeringer i cortex ble bestemt, %-arealet som ble dekket av Ap-immunreaktivitet, som ble identifisert med kanin pan-Ap-antistoff (QCB, Inc.), ble kvantifisert i cortexen som ligger rett over den dorsale hippocampus som beskrevet av Holtzman, D.M., et al, Ann. Neurol (2000) 97:2892-2897. Resultatene er vist i figur 3A. Ved denne alderen har ca. halvparten av hver gruppe fremdeles ikke begynt å utvikle Ap deponeringer. Imidlertid var %-andelen av med mer enn 50% Ap byrde i cortexen signifikant mindre (P=0,02, Chi-square test) i den 266-behandlede gruppen. Mens APP<V717F>mus kan utvikle store mengder av Ap deponeringer på ni måneder er det stor variabilitet med ca. 50% som ikke viser noen deponeringer og ca. 50% som viser vesentlig deponeringer. I PBS og IgG behandlede dyr, hadde 6/14 og 5/13 mus større enn 50% av cortexen dekket av Ap farging, mens bar en av 14 mus behandlet med Mab 266 hadde dette nivået med farging. Nesten 50% av dyrene i alle gruppene hadde fremdeles ikke utviklet Ap deponeringer ved ni måneders alderen. Dette siste viser seg å skyldes opphavet til individuelle mus i vår gruppe fordi selv om alle musene som var studert ble bekreftet å være APP^^+Ai-, ble høye nivåer av Ap deponering observert bare i mus som var utledet fra 4/8 avlspar (High pathology lifters). Mus utledes fra de andre 4 avlsparene bar så si frie for Ap deponeringer (Low pathology htters). Ved å bruke opphavet som en ko-variant, var der en sterk signifikant effekt av m266 i å redusere Ap deponering (p=0,0082, fig. 3B).

Eksempel 10

Perifert injisert Mab 266 binder ikke plakkene i APPV717F transgene mus

For å bestemme om Mab 266 injisert i i.p. i løpet av 5 måneder ble bundet til Ap i hjernen ble hjerneseksjoner fra 9 måneder gamle APP V71 7Tf +/+ transgene mus som inneholdt Ap deponeringer og som var blitt behandlet med enten Mab 266, saltvann eller kontroll IgG, anvendt. Behandling av vev og immunfarging ble utført som beskrevet (Bales, K.R., et al, Nature Genet. (1997) 17:263-264). Vev fra alle gruppene dyr ble inkubert med fluoresinmerket anti-mus IgG (Vector, Inc.) og så undersøkt under et fluorescensmikroskop. Ingen spesifikk farging av Ap deponeringer ble sett i noen av gruppene. I motsetning til denne ble Ap deponeringer klart detektert når Mab 266 ble anvendt på seksjoner før inkuberingen av seksjonene med anti-mus IgG.

Eksempel 11

Effekt av admmistreringen av antistoff 266 på tankevirksomhet i 24 månder gamle transgene

hemi7. yp;ote PD APP mus

Seksten hemicygote transgene mus (APPV717F) ble anvendt. Musene var ca. 24 måneder gamle ved starten av studien. Alle injeksjonene var intraperitoneale (i.p.). Halvparten av musene mottok ukentlig injeksjoner med fosfatbufret saltvann (PBS, "Control") og den andre halvparten mottok 500 mikrogram av mus antistoff 266 Høst i PBS. Injeksjonene ble gjort over en periode på syv uker (42 dager) med en total på seks injeksjoner. Tre dager etter siste injeksjon, ble oppførselen til dyrene undersøkt ved å anvende et objekt gjenkjermingsrnål, essensielt som beskrevet i J. C. Dodart, et al, Behavioral Neuroscience, 113 (5) 982-990 (1999. En gjenkjenningsindeks (Tb x 100)/(TB-TA) ble beregnet. Resultatene er vist under i tabell 1.

Administreringen av 500 mirkogram antistoff 266 ukentlig til 24 måneder gamle hemi2ygote transgene mus ble assosiert med en signifikant forandring i oppførsel. Antistoffbehandlede transgene mus hadde gjenkjenningsindisier som liknet på de av villtypekontrolldyr [J.-C. Dodart, et al]. Forskjellen i gjenkjenningsindeksen var statistisk signifikant ved 0,001 sannsynlighetsnivå. Den økede gjenkjemiingsindeksen er en indikasjon på at behandlingen med antistoff som bindes til det beta-amyloide peptidet i regionen med aminosyrene 13-28 vil reversere forstyrrelsene i oppførsel som er blitt dokumentert i denne musemodellen av Alzheimers sykdom. Derfor vil admnistreringen av antistoffer som binder beta-amyloid i regionen med aminosyrene 13-28 behandle sykdommer slik som Alzheimers sykdom og Downs syndrom og vil forsinke de kognitive forfallet som typisk er assosiert med sykdomsprogresjonen. Amyloidbyrden (% areal som er dekket av immunreaktivt materiale, etter farging med anti-Ap-antistoffer 3D6 eller 21F12) ble kvantifisert i cortexen som ligger rett over hippocampusen inkludert områdene av den cingulate og parietale cortexen fra hjernene i de 24 måneder gamle dyrene som var behandlet med muse-antistoff266 i syv uker, som beskrevet over. Resultatene er presentert i tabellen under. Forskjellene mellom behandlingsgruppene er ikke statistisk signifikante.

For disse veldig gamle dyrene, resulterte ikke behandlingen med muse-antistoff266 i en signifikant forskjellig amyloid byrde sammenliknet med den PBS-behandlede gruppen, målt ved å anvende enten 3D6 eller ved å anvende 21F12. Videre, Ap-byrden var vesentlig større og signifikant øket sammenliknet med amyloid byrden i yngre dyr (se under) som ikke var i stand til å diskriminere et nytt objekt fra et kjent et i objektgjenkjenningsmålet. Mest overraskende demonstrerer disse resultatene at anti-Ap-antistoffer kan reversere kognitive underskudd uten å måtte redusere amyloid byrden per se.

Etter 7 uker med behandling, var gjenkjenningsindeksen til den m266-behandlede gruppen ikke signifikant forskjellig enn det ville forventes fra en villtypegruppe på 24 måneder gamle mus! Dette indikerer en fullstendig forandring av kognitivt forfall i disse transgene dyrene.

Eksempel 12

Effekt av administrering av antistoff266 på tankevirksomhet i tinge transgene hemi<g>ypnte PD A PP mus

Femtifire (54) homocygote, transgene mus (APP<V717F>) ble anvendt. Tjuetre (23) mus var ca. to måneder gamle ved starten av studien. De gjenværende musene var ca. 4 måneder gamle ved starten av studien. Varigheten av behandlingen var 5 måneder. Ved studiens slutt var derfor musene enten ca. syv (7) måneder gamle eller ca. ni (9) måneder gamle.

Alle injeksjonene var intraperitoneale (i.p.). Hver mus i"PBS" kontrollgruppene mottok en ukentlig dose med fosfatbufret saltvann (PBS; 200 ul). Hver mus i "IgG" kontrollgruppene mottok en ukentlig injeksjon av IGGIkI isotype kontroll (100 ug/mus/uke). Hver mus i "høy-dose"-gruppene mottok en ukentlig injeksjon på 500 mikrogram av antistoff266 løst i PBS ("HD"). Hver mus i "lav-dose"-gruppe mottok en ukentlig injeksjon på 100 mikrogram med antistoff266 løst i PBS ("LD"). Tre dager etter siste injeksjonen, ble oppførselen til dyrene undersøkt ved å anvende en obj ektgjenkj enningsoppgave, som beskrevet i eksempel 10 over, og en m"skriminerrri<g>smdeks ble kalkulert som forskjellen mellom tiden som ble brukt på et nytt objekt og tiden som ble bruke på et familiært objekt. Resultatene er vist under i tabell 3. Dataene er gruppert etter alder av musene ved slutten av studien.

Til sammen støtter disse dataene konklusjonen om at administrering av antistoff266, et antistoff rettet mot det sentrale domene i Ap, svekker plakkdeponeringen i 7-9 måneder gamle APP V717Ftransgene mus, så vel som at forstyrrelsene i oppførselen som tidligere erkarakterisertreverseres. Behandling av pasienter med et antistoff rettet mot det sentrale domene av Ap-peptidet vil hemme eller forebygge kognitivt forfall som typisk er assosiert med sykdomsprogresjon og vil reversere den.

Diskrimineringsindeksen for behandlede dyre var ikke signifikant forskjellig fra det man ville vente for villtypemus på samme alder. Som i eldre dyr (eksempel 11), reverserte derfor behandling med m266 fullstendig kognitivt forfall i disse yngre transgene dyrene.

Eksempel 13

Syntese av humanisert antistoff 266

Celler og antistoffer. Muse myeloma cellelinje Sp2/0 ble skaffet fra ATCC (Manassas, VA) og opprettholdt i DME medium som inneholdt 10% FBS (Cat #SH32661.03, HyClone, Logan, UT) in en 37°C CO2inkubator. Muse 266 hybridomaceller ble først dyrket i RPMI-1640 medium som inneholder 10% FBS (HyClone), 10 mM HEPES, 2 mM glutamin, 0,1 mM ikke-essensiell aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat, 25 (ig/ml gentamicin og ble så ekspandert i serumfritt medium (Hybridoma SFM, Cat # 12045-076, Life Technologies, Rockville, MD) som inneholdt 2% lav lg FBS (Cat # 30151.03, HyClone) til et 2,5 liters vollum i rulleflasker. Mus monoklonalt antistoff 266 (Mu266) ble renset fra kultursupernatanten ved affinitet kromatografi ved å anvende en protein-G Sepharosekolonne. Biotinylerte Mu266 ble fremstilt ved å anvende EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Cat # 21338ZZ, Pierce, Rockford, IL).

Kinning a y variabel region cDNA. Total RNA ble ekstrhert fra ca. IO<7>hybridomaceller ved å anvende TRIzol reagens (Life Technologies) og poly(A)"<K>RNA ble isolert med PolyATract mRNA isolerende system (Promega, Madison, WI) ifølge produsentens protokoller. Dobbeltrådet cDNA ble syntetisert ved å anvende "SMART RACE" cDNA ampifiseringskitt (Clontech, Palo Alto, CA.) ved å følge produsentens protokoll. Variabel region cDNA for lette og tunge kjeder ble amplifisert ved polymrase kjedereakson (PCR) ved å anvende 3' primere som annealer henholdsvis til muse kappa og gamma kjede konstante regioner, og en 5' universal primer tilveiebrakt i "SMART RACE" cDNA amplifiseirngskittet For VLPCR, har den 3' primeren sekvensen: med residiene 17-46 som hybridiserer til muse Ck-regionen. For VH PCR, har de 3' primerne de degenererte sekvensene:

Med residiene 17-50 hybridiser til muse gamma kjede CH1. VL og VL og VH cDNAene ble subklonet inn i pCR4Blunt-TOPO vektor (mvitrogen, Carsbad, CA.) for sekvensbestemmelse. DNA sekvensering ble utført med PCR syklussekveriseringsreaksjoner med fluorescerende dideoksy kjedeterminatorer (Applied Biosystems, Foster City, CA.) ifølge produsentens instruksjon. Sekvensreaksjonene ble analysert på en modell 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems).

Konstruksjon av humaniserte 266 / Hul266) variable regioner. Humanisering av muse-antistoff V-regionene ble utført som beskrevet av Queen et al. [ Proe. Nati Acad. Sei. USA 86:10029-10033 (1988)]. Den humane V-region leseramme som ble anvendt som en akseptor for Mn266 CDRene ble valgt basert på sekvenshomologi. Computerprogrammene ABMOB og ENCAD [Levitt, M., J. Mol. Biol. 168:595-620

(1983)] ble anvendt for å konstruere en molekylær modell av de variable regionene. Aminosyrene i de humaniserte V-regionene som ble forutsagt å ha kontakt med CDRene ble substituert med de korresponderende residiene i Mu266. Dette ble gjort ved residiene 46, 47,49 og 98 i den tunge kjeden og ved residiet 51 i den lette kjeden, aminosyrene i den humaniserte V-regionen som ble funnet å være sjelden i den samme V-regionen som subgruppen ble forandret til konsensus ajninosyrene for eliminere potensiell immunogenisitet. Dette ble gjort ved residiene 42 og 44 i den lette kjeden.

De lette og tunge kjedevariable regiongenene ble konstruert og amplifisert ved å anvende åtte overlappende syntetiske oligonukleotider med en lengde på ca. 65 til 80 baser [He, X. Y., et al., J. Jmunol. 160: 029-1035 (1998)]. Oligonukeotidene ble annealet parvis og forlenget med Klenow fragment fra DNA polymerase I, og ga fire dobbeltrådete fragmenter. De resulterende fra<g>mentene ble denaturert, annealt parvis, og utvidet med Klenow, og gav to fragmenter. Disse fragmentene ble denaturert, annealt parvis og utvidet en gang til og gav et full-lengde gen. Det resulterende produktet ble amplifisert ved PCR ved å anvende "Expand High Fidelity PCR" systemet (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). De PCR-amplifiserte fragmentene ble gelrenset og konet inn i pCR4Blunt-TOPO vektor. Etter sekvensbekreftelse, ble VL- og VH-genene kuttet med MIuI og Xbal, gelrenset og subklonet henholdsvis inni vektorer for ekspresjon av lette og runge kjeder for å lage pVk-Hu266 og pVgl-Hu266 (se henholdsvis figurene 6 og 7 her) [Co, M.S., et al., J. hnmunol. 148:1149-1154 (1992))]. Det modne humaniserte 266 antistoffet uttrykt fra disse plasmidene hadde den lette kjeden av SEQ ID NO: 11 og den tunge kjeden av SEQ ID NO: 12.

Stabil transfeksjon. Stabil transfeksjon inni muse myeloma cellelinje Sp2/0 ble utført ved elektroporering ved å anvende et "Gene Pulser" apparat (BioRad, Hercules, CA.) ved 360 V og 25 uF som beskrevet (Co et al., 1992). Før transfeksjon ble pVk-Hu266 og pVgl-Hu266 plasmid DNAene linearisert ved å anvende Fspl. Ca. 10 Sp2/0 celler ble transfektert med 20 ug av pVk-Hu266 og 40 iig av pVgl-Hu266. De transfekterte cellene ble suspendert i DME medium som inneholdt 10% FBS og platet ut i flere 96-brønners plater. Etter 48 timer, ble seleksjonsmedium (DME medium som inneholdt 10% FBS, HT mediumsupplement, 03 mg/ml xantin og 1 mg/ml mykofenolsyre) anvendt. Ca. 10 dager ett er initsieringen av seleksjonen, ble kultursupernatantene analyser for antistoffproduksjon ved ELISA som vist under. Kloner med høy produksjon ble ekspandert i DME medium som inneholdt 10% FBS og videre analysert for antistoff ekspresjon. Selekterte kloner ble så adaptert til å vokse i Hybridoma SFM.

Måling av antistoff ekspresjon ved ELISA Brønnene i en 96-brønners ELISA plate

(Nunc-Immuno plate, Cat # 439454, NalgeNunc, Naperville, EL) ble belagt med 100 ul av 1 p.g/ml geit-anti-humant IgG, Fcy fragment spesifikt, polyklonale antistoffer (Cat # 109-005-098, Jackson JmmunoResearch, West Grove, PA) i 0,2 M natxiumkarbonat bikarbonatbuffer (pH 9,4) over natten ved 4°C. Etter vasking med vaskebuffer (PBS som inneholdt 0,1% "Tween 20"), ble bønnene blokkert med 400 ul av "Superblock Blockmg Buffer" (Cat #37535, Pierce) i 30 minutter og så vasket med vaskebuffer. Prøvene som inneholdt Hu266 ble passende fortynnet i ELISA buffer (PBS som inneholdt som inneholdt 1% BSA og 0,1% "Tween 20") og overført til ELISA platene (100 iil per brønn). Som en standart ble humanisert anti-CD33 IgGl monoklonalt antistoff HuMl95 (Co, et al, 1992, over) anvendt. ELISA platen ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur og brønnene ble vasket med vaskebuffer. så ble 100 ul av 1/1.000 fortynnet HRP-konjugert geite-anti-humant kappa polyklonale antistoffer (Cat # 1050-05, Southern Biotechnology, Birminghem, AL) i ELISA buffer tilsatt hver brønn. Etter inkubering i 1 time ved romtemperatur og vasking med vaskebuffer, ble 100 ul av

ABTS substrat (Cat #s 507602 og 506502, Kirkegaard og Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) tilsatt til hver brønn. Fargeutvikling ble stoppet ved å tilsette 100 ul av 2% oksalsyre per brønn. Absorbans ble lest ved 415 nm ved å anvende en OPThnax mikroplateleser (Molecular Devices, Menlo Park, CA.).

Rensing av Hu266. En av høyt Hu266 -uttrykkende Sp2/0 stabile transfektanter (klon 1D9) ble adoptert til å vokse i hybridoma SFM og ekspandert til 2 liter i rulleflasker. Brukt kultursupernatant ble høstet når celleviabiliteten nådde 10% eller under og ladet på en protein-A sepharose kolonne. Kolonnen ble vasket med PBS før antistoffet ble eluert med 0,1 M glysin-HCL (pH 2,5), 0,1 M NaCl. Det eluerte proteinet ble dialysert mot 3 bytter av 2 liter PBS og filtrert gjennom et 0,2 nm filter før oppbevaring ved 4°C. Antistoflkonsentrasjonen ble bestemt ved å måle opp absorbansen ved 280 nm (1 mg7ml -1,4 A2so)- SDS-PAGE i Tris-glysinbuffer ble utført ifølge standard prosedyrer på en 4-20% gradientgel (Cat # EC6025, Novex, San Diego, CA.). Renset humanisert 266 antistoffer redusert og kan kjøres på en SDS PAGE gel. Hele antistoffet viser to bånd med ca. molekylvekt på 25 kDa og 50 kDa. Disse resultatene er i overensstemmelse med molekylvektene til den lette kjeden og tunge kjeden eller tunge kjedefragment kalkulert fra deres ammosyresammensetning.

Eksempel 14

In vitro bindin<g>segenskaper til humanisert 266 antistoff

Bindingsevnen til humaniser 266 antistoff, syntetisert og renset som beskrevet over, ble sarrrmenliknet med muse 266 antistoffet ved å anvende biotynilert muse 266 antistoff i

en komparativ ELISA. Brønner i en 96-brønns ELISA plate (Nunc-hnmuno plate, Cat # 439454, NalgeNunc) ble belagt med 100 ul p-amyloid peptid (1-42) konjugert til BSA i 0,2 M nalxiukarbonat/bikarbonatbuffer (pH 9,4) (10fig/ml) over natten ved 4°C. ApM2-BSA-konjugatet ble laget ved å løse 7,5 mg fra Api_42-Cys43(C-terrninal cystein Api^, AnaSpec) i 500 ul dimetylsulfoksid, og så øyeblikkelig tilsette 1.500 ul destillert vann. To (2) milhgram av maleimidaktivert bovint serumalbumin (Pierce) ble løst i 200 ul destillert vann. De to løsningene ble kombinert, blandet godt, og fikk så stå i romtemperatur i to (2) timer. En gelkromatografiklonne ble anvendt for å separere ureagert peptid fra APi.42-Cys-BSA-konjugat.

Etter at brønnene var vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholdt o,2% "Tween 20" (vaskebuffer) ved å anvende en ELISA platevasker, ble brønnene blokkert ved å tilsette 300 ul av "SuperBlock" reagens (Pierce) per brønn. Etter 30 minutters blokkering, ble brønnene vasket med vaskebuffer og overskudd av væske ble fjernet.

En blanding av biotinylert Mu266 (0,3fif/ml sluttkonsentrasjon) og kompetitor antistoff (Mu266 eller Hu266; starter ved 750 ng/ml sluttkonsentrasjon og serie 3 ganger fortynninger) i ELISA buffer ble tilsatt i triplikat i et sluttvolum på 100 ml per brønn. Som en ikke-kompetitor kontroll ble 100 ul 0,3 (ig/ml biotinylert Mu266 tilsatt. Som en bakgrunnskontroll ble 100 fil av ELISA buffer tilsatt. ELIS platen ble inkubert ved romtemperatur i 90 minutter. Etter vasking av brønnene med vaskebuffer, ble 100 ul av 1 jig/mo HEP-konjugert streptavidin (Cat # 21124, Pierce) tilsatt til hver brønn. Platen ble inkubert vedr omtemperatur i 30 minutter og vasket med vaskebuffer. For fargeutvikling, ble 100 ul/brønn av ABTS peroksidasesubstrat (Kiregaard o& Perry Laboratories) tilsatt. Fargeutvikling ble stoppet ved å tilsette 100 ul/bønn av to2% oksalsyre. Absorbansen ble lest ved 415 nm. Absorbansene ble plottet mot logaritmen av kompetitorkonsentrasjonen, kurvene ble avpasset til datapunktene (ved å anvende prisme) og IC50 ble bestemt ved hvert antistoff ved å anvende metoder som er velkjente i fagfeltet

Den gjennomsnittlige IC50 for mus 266 var 4,7 ug/ml (tre separate eksperimenter, standard avvik =1,3 (ig/ml) og for humanisert 266 var den 7,5 ug/ml (tre separate eksperimenter, standard avvik =1,1 ng/ml). Et andre sett på tre eksperimenter ble utført, essensielt som beskrevet over, og den gjennomsnitthge IC50 for mus 266 ble bestemt til å være 3,87 ng/ml (SD = 0,12 iig/ ml) og for humant 266 ble IC50 bestemt til å være 4,0 ng per/ml (SD = 0,5 nag/ml). På basis av disse resultatene, konkluderes at humanisert 266 har bindingsegenskaper som er veldig like de av muse antistoff266. Derfor forventer vi at humanisert 266 har veldig like in vitro og in vivo aktiviteter sammenliknet med mus 266 og vil utvise i mennesker de samme effektene demonstrert med muse 266 i mus.

Eksempel 15

In vitro bindingsegenskaper for mus antistoffene 266 og 4G8

Anu^offafEnitet (KD = Kd/Ka) ble bestemt ved å anvende en BIAcor biosensor 2000 og data analysert med BIA-evaluering (v.3.1) software. Et fangeantistoff (kanin anti-mus) ble koplet via frie aminogrupper til akrboksylgrupper på flow-celle 2 på en biosensorchip (CN5) ved å anvende N-etyl-N-dimetylaminnopropylkarbodiimid og N-hydroksysuksinimid (EDC/NHS).

Et ikke-spesifikt kanin lg G ble koplet til flow celle 1 som en bakgrunnkontroll. Monoklonale antistoffer ble fanget til å gi 300 resonansenheter (RU). Amyloid-beta 1-40 eller 1-42 (Biosource International, Inc.) ble så strømmet over chipen ved minkende konsentrasjoner (100 til 0,1 ganger KD). For å regenerere chipen, ble under anti-Ap-antistoff eluert fra chipen ved å anvende en vask med glysin-HCL (pH 2). En kontrollinjeksjon som ikke inneholdt amyloid-beta tjente som en kontroll for grunnlinjesubtraksjon. Sensogrammer som demonstrerer assosierings og disassosieringsfaser blir analysert for å bestemme Kd og Ka. Ved å anvende denne metoden, ble affiniteten til mus antistoff 266 for både Api.40og for Api.42funnet å være 45 pM. Affiniteten av 4G8 for APi-4O var 23 nM og for AP1.42var den 24 nM. Til tross for en 6000 ganger forskjell i affinitetene for Ap, bandt både 266 og 4G8, som bindes til epitoper mellom aminosyrene 13 og 28 i Ap, effektivt Ap fra human CSF. Derfor er lokaliseringen av epitopen fremherskende, heller enn bmdmgsaffinitet, i å bestemme evnen til et antistoff til å binde Ap og til å tilveiebringe de gunstige og overraskende fordelene i den foreliggende oppfinnelsen.

Eksempel 16

Epitopmerking av muse antistoff 266 ved å anvende Biacore metodologi og løselige pe ptider

BIAcoren er et automatisert biosensorsystem for å måle molekylære interaksjoner [Karlsson R., et al. J. Immunol. Methods 145:229-240 (1991)]. Fordelen med BIAcoren over andre bindingsanalyser er at binding av antigenet kan måles uten å måtte merke eller immobilisere antigenet (dvs. antigenet opprettholder en mer nati v konformasjon). BIAcoremetodologien ble først anvendt for å undersøke bindingen av forskjelllige amyloid-beta peptidfragmenter til mus antistoff 266, essensielt som beskrevet over i eksempel 12, unntatt at aller fortynningene ble gjort med HEPES bufret saltvann som inneholdt "Tween 20", ble en rekke av fragmentene av Ap (BioSource International) injisert, og en enkel konsentrasjon av hvert fragment ble injisert (440 nM).

Amyloid-beta fragmentene 1-38, 12-28,17-28 og 16-25 bandt til mus antistoff266, mens Ap fragmentene 1 -20,10-20 og 22-35 bandt ikke. Fragmentene 1-20,10-20 og 22-35 bandt til andre MAer med kjent epitopspesifisitet for de regionene i Ap. Ved å anvende metodologien, virker det som om bindingsepitopen for muse antistoffet 266 er mellom aminosyrene 17 og 25 i Ap. Fordi bindingen vanligvis finner sted med minst 3 residier av epitopen til stede, kan man videre slutte at epitopen finnes innen residiene 19-23.

Eksempel 17

In vitro bindin<g>segenskaper til humanisert antistoff 266

Affiniteten (KD = Kd/Ka) av humanisert 266 antistoff, syntetisert og renset som beskrevet over, ble bestemt essensielt som beskrevet over i eksempel 15. Ved å anvende denne metoden, ble affiniteten til humanisert 266 for Api.42funnet å være 4 pM.

Claims (27)

1. Humanisert antistoff eller fragment av detkarakterisert vedat det omfatter: a. en lett kjede som omfatter tre lett kjede komplementær bestemmende regioner (CDRer) fra det musemonoklonale antistoff 266 som har følgende aminosyresekvenser: lett kj ede CDR1:

lett kjede CDR2:

og, lett kjede CDR3:

og en lett kjede leserammesekvens fra en humanisert irnmunglobulin lett kjede; og b. en tung kj ede som omfatter tre tunge kj ede CDRer fra det musemonoklonale antistoff 266 som har følgende aminosyresekvenser: tung kjede CDR1:

tung kjede CDR2:

og, tung kjede CDR3:

og en tung kjede leserammesekvens fra en humanisert immunglobulin tung kjede.

2. Humanisert antistoff eller fragment av det, ifølge krav 1,karakterisert vedat lett kjede CDR1 er :

tung kjede CDR2 er:

3. Humanisert antistoff eller fragment av det ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter en humanisert lett kjede variabel region som omfatter følgende sekvens:

hvor: Xaa ved posisjon 2 er Val eller Ile; Xaa ved posisjon 7 er Ser eller Thr; Xaa ved posisjon 14 er Thr eller Ser; Xaa ved posisjon 15 er Leu eller Pro; Xaa ved posisjon 30 er Ile eller Val; Xaa ved posisjon 50 er Arg, Gin, eller Lys; Xaa ved posisjon 88 er Val eller Leu; Xaa ved posisjon 105 er Gin eller Gly, Xaa ved posisjon 108 er Lys eller Arg; og Xaa ved posisjon 109 er Val eller Leu; og at en tung kjede variabel region omfatter den følgende sekvensen:

hvor: Xaa ved posisjon 1 er Glu eller Gin; Xaa ved posisjon 7 er Ser eller Leu; Xaa ved posisjon 46 er Gly, Val Asp eller Ser; Xaa ved posisjon 63 er Thr eller Ser; Xaa ved posisjon 75 er Ala, Ser, Val eller Thr; Xaa ved posisjon 76 er Lys eller Arg; Xaa ved posisjon 89 er Glu eller Asp; og Xaa ved posisjon 107 er Leu eller Thr.

4. Humanisert antistoff eller fragment av det ifølge krav 1,karakterisert vedat det har en lett kjede variabel region med sekvensen gitt ved SEQ. ID. NO: 9 og en tung kjede variabel region gitt ved SEQ. H>. NO: 10.

5. Humanisert antistoff eller fragment av det ifølge krav 4,karakterisert vedat det har en lett kjede av SEQ. ID. NO: 11 og en tung kjede av sekvensen gitt ved SEQ. ID. NO: 12.

6. Humanisert antistoff-fragment,karakterisert vedat det er et fragment ifølge krav 1 eller 5.

7. Humanisert antistoff eller fragment av det ifølge krav 1,karakterisert vedat det har en IgGiimmunglobulinisotype.

8. Humanisert antistoff eller fragment av det ifølge krav 1, k a r a k - terisert ved at antistoffet eller fragmentet av det produsert i en vertscelle selektert fra gruppen som består av en myelomacelle og en kinesisk hamster ovariecelle, en syran hamster ovariecelle.

9. Polynuldeinsyre,karakterisert vedat den omfatter en sekvens som koder for den lette kjeden eller den tunge kjeden i det humaniserte antistoffet ifølge krav 1.

10. Polynukleinsyren ifølge krav 9,karakterisert vedat den omfatter en sekvens som koder for den lett kjede variable regionen gitt ved SEQ. ID. NO: 7 eller SEQ. ID. NO: 9.

11. Polynukleinsyren ifølge krav 9,karakterisert vedat den omfatter en sekvens som koder for tung kjede variabel regionen gitt ved SEQ. ID. NO: 8 eller SEQ. ID. NO: 10.

12. Polynukleinsyren ifølge krav 9,karakterisert vedat den omfatter en sekvens som koder for den lette kjeden gitt ved SEQ. ID. NO: 11.

13. Polynukleinsyren ifølge krav 9,karakterisert vedat den omfatter en sekvens som koder for den tunge kjeden gitt ved SEQ. ID. NO: 12.

14. Polynukleinsyre,karakterisert vedat den omfatter en sekvens som koder for den lette kjeden eller den tunge kjeden av det humaniserte antistoffet ifølge krav 5.

15. Polynukleinsyre,karakterisert vedat når den blir uttrykt i en passende vertscelle, gir antistoffet eller fragment av det ifølge krav 1.

16. Polynukleinsyre,karakterisert vedatnårdenblir uttrykt i en passende vertscelle, frembringes antistoffet eller fragmentet ifølge krav 5.

17. Ekspresjonsvektor for å uttrykke antistoffet eller fragmentet ifølge krav 1,karakterisert vedat den omfatter nukleotidsekvenser som koder for nevnte antistoff eller fragment.

18. Celle,karakterisert vedat den er transfektert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 17.

19. Celle,karakterisert vedat den er transfektert med to ekspresjonsvektorer ifølge krav 17, hvor en første vektor omfatter polynukleotidsekvensen som koder for den lette kjeden og en annen vektor omfatter sekvensen som koder for den tunge kjeden.

20. Ekspresjonsvektor for å uttrykke antistoffet eller fragmentet av det ifølge krav 5,karakterisert vedat den omfatter nukleotidsekvenser som koder for nevnte antistoff eller fragment.

21. Celle,karakterisert vedat den er transfektert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 20.

22. Celle,karakterisert vedat den er transfektert med to ekspresjonsvektorer ifølge krav 20, hvor en første vektor omfatter polynukleotidsekvensen som koder for den lette kjeden og en andre vektor omfatter sekvensen som koder for den tunge kjeden.

23. Celle,karakterisert vedat den er i stand til å uttrykke det humaniserte antistoff eller fragment av det ifølge krav 1 eller krav 5.

24. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter det humaniserte antistoffet eller fragment ifølge ethvert av kravene 1 eller 5, og et farmasøytisk akseptabelt tilsetningsstoff.

25. Anvendelse av det humaniserte antistoff eller et fragment av det ifølge ethvert av kravene 1 eller 5 for fremstilling av et medikament for å behandle klinisk eller preklinisk Alzheimers sykdom, Downs syndrom eller klinisk eller preklinisk cerebral amyloid angiopati.

26. Anvendelse av et humanisert antistoff eller fragment ifølge ethvert av kravene 1 eller 5 for fremstilling av et medikament for behandling, forebygging eller reversering av kognitivt forfall i klinisk eller preklinsk Alzheimers sykdom, Downs syndrom eller klinisk eller preklinisk cerebral amyloid angiopati.

27. Anvendelse av det humaniserte antistoff eller fragment ifølge ethvert av kravene 1 eller 5 for fremstilling av et medikament for å behandle Alzheimers sykdom.