CZ2008595A3 - Léčivo pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci - Google Patents

Abstract

Je popsáno použití protilátky, která specificky váže epitop obsažený v pozicích 13 až 28 A.beta. peptidu pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci. Je také popsán farmaceutický prostředek vhodný k uvedenému použití.

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká použiti protilátky, která specificky váže epitop obsažený v pozicích 13 až 28 Αβ peptidu, pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčeni preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci. Konkrétně se vynález týká take farmaceutického prostředku k uvedenému použiti.

Dosavadní stav techniky vedou ke kognitivním deficitům, mrtvicím, elkovému mentálním zhoršení je patrně cerebrovasculárními plaky v mozku, stavy syndrom

Mnoho stavů, které mozkovému krvácení a c asociováno s neuritickými a které obsahuji amyloidový beta peptid (Αβ)· Mezi takové patři preklinické a klinická Alzheimerova nemoc, tomta a preklinické a klinická cerebrálnl amyloidová angiopatie (CAA) . Amyloidové plaky jsou tvořeny z amyloidových beta peptidů. Tyto peptidy cirkulují v krvi a v mozkomišnim moku (CSF), obvykle ve s lipoproteiny. Αβ peptid v cirkulující forme ₃e 43 aminokyselin (nejčastěji z 40 nebo 42 které vznikají ze štěpení společného proteinu, amyloidového prekursorového proteinu, formě komplexů složen z 39 až aminokyselin), prek.ursorového který se často

- 2označuje jako APP. Některé formy solubilního A 3=ou sa» J neurotoxické a mohou určovat závažnost neurodegenerace a n kognitivní deficit (McLean, C. A., et al., Ann. Neurol. (19 9) 46:860-866; Lambert, Μ. Ρ„ et al. (1998) 95:6448-6453,- Naslund,

J., J. Am. Med. ASSOC. (2000) 283:1571).

Důkazy naznačuji, že A muže být transportován mezi mozkem a krví (Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67:880-883; Zlokovic, B. v., et al., Biochem. Biophys. Res. Co™. (1993) 67:1034-1040; Shibata M, et al., J. Clin. Invest (2000) 106:1489-1499). Dále, Αβ v plakách je v rovnováze se solubilním Αβ v mozku a v krvi (Kawarabayashi T, et al., J.

Neurosci. (2001)21:372-381).

jak bylo popsáno v PCT přihlášce US 00/35681 a U.S. pořadové č. 09/153,130, které jsou zde uvedeny jako odkazy, celkove , , cirkulující hladiny A peptidu v CSF jsou podobné u normálních jedinců a u jedinců predisponovaných k příznakům Alzheimerovi nemoci. Nicméně, hladiny AB42 jsou v průměru nizsr u jedinců s Alzheimerovou nemocí (Nitsch, R. M., et al., Ann. Neuro (1995) 37:512-518) . Je známo, že AB_<2 je více náchylný k agregaci než AE , a když k tomu dojde, vznikají nežádoucí následky jako je depozice Αβ v amyloidových plakách, konverze Afi na toxické solubilní formy, poškození nervových buněk a poruchy chován, ja je demence (Golds, T.E., et al., Biochem. Biophys. Acta. (2000) 1502:172-187) .

Způsoby pro indukci imunitní reakce pro redukci amyloidoyych depozit jsou popsány v PCT publikaci W0 99/27944 publikované _ 10.6.1999. Přihláška uvádí, že kompletní agregovaný Αβ peptid muže být užitečným imunogenem. imunogen. Podaní Αβ fragmentu (aminokyseliny 13-28) konjugovaného na ovčí anti-mysi IgG nezpůsobuje žádnou změnu v ukládání amyloidu v kortexu, a pou u jednoho zvířete z devíti, kterým byl podán konjugát . fragmentu, vykazovalo určitou lymfoproliferaci v reakci na AS . přihláška také naznačuje, že protilátky, ktere se specific y v na AB peptid, mohou být použity jako terapeutická činidla. _ Nicméně, toto se jeví jako spekulace, protože data podporující tutu hypotézu odrážejí protokoly, které zahrnují aktivní imunizaci _za použití, například, AB_<S- Peptidy jsou podány pomoci adjuvant a jsou určeny titry protilátky indukované imunizaci, stejne jako koncentrace AB pepcidu a prekursorového peptidu. Pnhlaska silné naznačuje, že AB plak musí být redukován pro zmírněni příznaku Alzheimerovi nemoci, a že pro úspěšnou redukci AB plaku jsou nutné procesy zprostředkované buňkami.

WO 99160024, publikovaná 25.11.1999, se týká způsobů p odstranění amyloidu za použití anti-amyloidové protilátky. Nicméně, je uvedeno, že mechanismus využívá schopnosti anti-AB protilátky vázat se na pre-existující amyloidová deposita (t.j., plaky) a způsobit následnou lokální mikrogliální reakci na lokalizovaných plakách. Tento mechanismus nebyl ověřen in vivo. Tato přihláška dále uvádí, že aby byly účinné proti AB plakum, musí pronikat anti-AB protilátky do mozkového parenchyma, a překonávat hematoencefalickou bariéru.

Několik PCT přihlášek, které se týkají pokusů o kontrolu amyloidových plaků, bylo publikováno 7.12.2000. WO 00/72880 popisuje významnou redukci plaků v kortexu a hippocampu^ v transgenním myším modelu Alzheimerovi nemoci při léčbě N-terminálních fragmentů AB peptidů a protilátek, ktere se vazi tyto fragmenty, ale ne při léčbě AB₁₃_„ fragmentem konjugovanym na ovčí anti-myší IgG nebo při použití protilátky proti 13-28 fragmentu, protilátky 266. Bylo zjištěno, že protilátky proti N-konci překonávají hematoencefalickou bariéru a indukuji fagocytózu amyloidových plaků v pokusech in vitro.

- 4WO 00/72876 popisuje v podstatě to šatné co WO 00/72880 a týká se imunizace složkami amyloidových fibril samotnými.

WO 00/77178 popisuje protilátky, které katalyzují hydrolýzu D-amyloidu, včetně protilátek namířených proti směsi fenylalanin-statinových přechodných sloučenin Cys-AE_XO.„ slatin , π ar cjtatin Phe -Ala a protilátky proti Phe -Phe a Cys-AS_io__2S statin m;_2O

Ag s redukovanou amidovou vazbou mezi Phe_i9 a Phe_2Q. Ta přihláška zmiňuje sekvestrování Αβ, ale jedná se o spekulaci, protože není uveden žádný důkaz takového sekvestrování. Dale, přihláška neuvádí žádný důkaz in vivo, že podání protilátky způsobuje vylučování Αβ z centrálního nervového systému, interferuje s tvorbou plaků, redukuje tvorbu plaků, tvoři komplexy mezi protilátkou a Αβ ve tkáních nebo ovlivňuje kognitivní funkce.

Bylo zjištěno, že jednou dráhou A£ metABolismu je transport z CNS do plasmy (Zlokovic, B.V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1996) 93:4229-4234; Ghersi-Egea, J-F., et al., J. _ Neurochem. (1996) 67:880-883). Dále bylo zjištěno, že Αβ v plasmě může pronikat přes hematoencefalickou-bariéru a vstupovat do mozku (Zlokovic, B. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040). Také bylo zjištěno, že podání některých polyklonálních a monoklonálních AS protilátek snižuje deponování Αβ v amyloidových plakách v APPV717F transgenním myším modelu Alzheimerovi nemoci (Bard, F., et al., Nature Med. (2000) 6:916-9 19); nicméně, uvádělo se, že toto je způsobeno tím, že nektere anti-Αβ protilátky procházející hematoencefalickou-bariérou stimulují fagocytosu amyloidových plaků mikrogliemi. v Bardových pokusech testy na řezech mozku ex vivo ukázaly, že přítomnost Αβ protilátky, společně s exogenně přidanými mikrogliemi, indukuje fagocytosu Αβ, což vede k odstranění Αβ depozit.

- 5 “

Koncentrace jak solubilního AS„, tak v CSF a krvi mohou být snadno zjištěny za použití standardních testů za požiti protilátky namířené proti epitopům v AS řetězci. Takové testy jsou popsány, například, v U.S. patentech 5,766,846; 5,837,672, a 5,593,846. Tyto patenty popisují produkci myší monoklonalnr protilátky k centrální doméně AS peptidu, ta obsahuje ep' py okolo a včetně pozic 16 a 17. Také byly popsány protilátky^ namířené proti N-terminálnímu regionu. Bylo zjištěno, ze ⁿ®^^c“^e monoklonální protilátky jsou imunoreaktivní s pozicemi 13peptidu; tyto se neváží na peptid obsahující pozice 17 28, a p - podle uvedených patentů - že tyto protilátky se váží na tento region, včetně pozic 16-17 (místo alfa-sekretasy). Mezi protilátky, o kterých je známo, že se váží na region mezi aminokyselinami 13 a 28 AS, patří myší protilátky 266, 4G8 a 1C2.

Neočekávaně jsme zjistili, že podání 266 protilátky velmi rychle a téměř úplně obnovuje kognitivní funkce (pamět) u 24-měsíčních hemizygotních transgenních myší (APP V717F) . Dale, protilátka nemá vlastnosti, které se v oboru uvádějí jako nutné pro to, aby byla protilátka účinná při léčbě Alzheimerovi nemoci, Downova syndromu a jiných onemocnění souvisejících s AS peptidem. K našemu překvapení jsme pozorovali, že protilátky, ktere se vazi na AS mezi pozicemi 13 a 28 (266 a 4G8), jsou schopné sekvestrovat solubilní formy AB z vázaných, cirkulujících forem v krvi, a ze periferní podání protilátky 266 vede k rychlému vylučováni relativně velkých wožství AS peptidu z CNS do pla»my. Toto vede ke změně klírens solubilního AS, prevenci tvorby plaků, a J nejvíce překvapivé - ke zlepšení kognitivních funkcí, i bez nutné redukce AS amyloidových plaků, jakéhokoliv významného překonávám hematoencefalické bariéry, vazby na plaky, aktivace buněčných mechanismů nebo vazby s vysokou afinitou na agregovaný AS.

- 6 Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je farmaceutický prostředek obsahující humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky váže na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, pro použití pro prevenci nebo léčení preklmicke nebo klinické Alzheimerovy nemoci, kde uvedená protilátka obsahuje:

a) lehký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce majícího dále uvedené aminokyselinové sekvence:

CDR1 lehkého řetězce:

5

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Tle Tyr Ser

Asp Gly Asn Ala Tyr

Leu His (SEQ ID NO: 1) nebo

Arg

Ser

Ser Gin ¹⁰

Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID

NO:

15)

CDR2 lehkého řetězce:

Lys Val Ser Asn

Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

CDR3 lehkého řetězce:

5

Trn Thr (SEQ ID NO: 3), a a region úseku základní struktury lehkého retezce z lidské imunoglobulinového lehkého retezce, a tři regiony určující řetězce dále

b) těžký řetězec obsahující komplementaritu (CDR) tezkeho aminokyselinových sekvencí:

uvedených

CDR1 těžkého řetězce:

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

CDR2 těžkého řetězce:

Gin lie Asn Ser Vai Gly Asn

Ser Thr Tyr Tyr

Pro Asp Thr

Vai Ly^{s G1}Y (SEQ ID

NO: 5) nebo

Gin ne Asn ser Val Gly han ^Thr

Pro _Asp Ser val Lys Gly (SEQ ID NO:16) a

CDR3 těžkého řetězce i

Gly Asp Tyr, (SEQ ID NO:

6) a sekvence

^.ív-.απΙ ί úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského i nového těžkého řetězce.

Předmětem tohoto vynálezu dále ₃e farmaceutický prostředek obsahující humanizovanou monoklonálnl protilátku, která se specificky váže na epitcp obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu A_ř, pro prevenci, léčení nebo reverzi kognitivního deficitu u subjektu, kterému byla diagnostikována preklinická nebo klinická Alzheimerova nemoc, kde uvedená protilátka obsahuje:

a) lehký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce majícího dale aminokyselinové sekvence:

uvedené

CDR1 lehkého řetězce:

Arg

Ser

Ser

Gin Ser Leu He ^TY^{r Ser}

Asp Gly Asn Ala Tyr

Leu His (SEQ ID

NO:

1) nebo

Ser

Ser

Gin ¹⁵

Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID

NO:

15)

CDR2 lehkého řetězce:

Lys Val Ser Asn

Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

CDR3 lehkého řetězce:

5

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3) a a region úseku základní struktury lehkeho imunoglobulinového lehkého řetězce a řetězce z lidského

b) těžký řetězec obsahující tri regiony i komplementaritu (CDR) těžkého řetězce dale aminokyselinových sekvencí.

určující > uvedených

CDR1 těžkého řetězce:

Arg Tyr Ser Met (SEQ ID NO: 4)

Ser

CDR2 těžkého řetězce:

Gin lie Asn

Ser

Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr

Pro

Asp Thr

Val

Lys Gly (SEQ ID

NO: 5) nebo lie Asn

Gin (SEQ ID NO: 16) a

Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr

Pro

Asp Ser

Val

Lys Gly

DR3 těžkého řetězce:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6) a a sekvenci úseku základní struktury těžkého imunoglobulinového těžkého řetězce.

řetězce z lidského

Výhodné provedení každého z farmaceutických použití uvedená výše spočívá v tom, že protilátka lehký řetězec:

prostředků pro obsahuje CDR1 i- Asp Gly Asn Ala

Tyr Leu His

CDR2 těžký řetězec:

5

Gin lie Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr ¹⁵

Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5) .

Výhodné provedeni každého z farmaceutických prostředku p použiti uvedená výše spočívá v tom, že humanizovaná protilátka obsahuje variabilní region lehkého řetězce obsahující dale uvedené sekvence:

Asp Xaa Val Met

Gin Pro Ala Ser

Asp Glv Asn Ala

Pro Xaa Leu Leu

Asp Arg Phe Ser

Thr Gin Xaa Pro lie Ser Cys Arg

Thr His Val Pro

100

Tyr Leu His Trp lie Tyr Lys Val

Gly Ser Gly Ser

Ala Glu Asp Xaa

Trp Thr Phe Gly

Leu Ser Leu Pro

Ser Ser Gin Ser

Phe Leu Gin Lys

Ser Asn Arg Phe

Gly Thr Asp Phe

Gly Val Tyr Tyr 90

Xaa Gly Thr Xaa

105

Val Xaa Xaa Gly

Leu Xaa Tyr Ser

Pro Gly Gin Ser

Ser Gly Val Pro

Thr Leu Lys lie

Cys Ser Gin Ser

Xaa Glu lie Lys

110

Arg (SEQ ID NO: 7) kde

Xaa v pozici 2 je Val nebo Ι1θ«

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Thr;

Xaa v pozici 14 je Thr nebo Ser,

Xaa v pozici 15 je Leu nebo Pro,

Xaa v pozici 30 je lie nebo Val, * on -í rs atct Gin nebo Lys

Xaa v pozici 50 je axy, _Xaa v pozici 88 je Val nebo Leu;

Xaa v pozici 105 je Gin nebo Gly

Xaa v pozici 108 je Lys nebo Arg, a Xaa v pozici 109 je Val nebo Leu.

a variabilní region těžkého řetězce obsahuje dále uvedené sekvence:

Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 10 _Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Leu Val 45 _Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Xaa Val 60

Asp Asn Xaa Xaa Asn Thr Leu Tyr 75

Xaa Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 ^yó

Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser ^y 110

105

Xaa Val Gin Leu Val Glu Xaa Gly 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala

Ala Gin lie Asn Ser Val Gly Asn 50

Lys Gly Arg Phe Thr Tle Ser Arg 65

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85

Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Glr

100 kde

Xaa v pozici 1 je Glu nebo Gin;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Leu;

Xaa v pozici 46 je Gin, Val, Asp, nebo Ser,

Xaa v pozici 63 je Thr nebo Ser;

Xaa v pozici 75 je Ala, Ser, Val, nebo Thr,

Xaa v pozici 76 je Lys nebo Arg;

Xaa v pozici 89 je Glu nebo Asp; a

Xaa v pozici 107 je Leu nebo Thr.

Výhodné provedeni pro použití svrchu uvedeného předmětu vynálezu spočívá ve farmaceutickém prostředku, kde protilátka ma sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 9 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEO ID

NO: 10.

Výhodné provedeni pro použiti každého svrchu uvedeneho předmětu vynálezu spočívá ve farmaceutickém prostředku,~kde protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce^ uvedenou v SEQ ID NO: 11 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 12.

Předmětem tohoto vynálezu je take pouzitr farmaceutického prostředku obsahujícího humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky váže na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčeni preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci, kde uvedena protilátka obsahuje:

a) lehký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce majícího dale uvedene aminokyselinové sekvence:

- CDR1 lehkého řetězce:

6g

Leu His

Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr řetězce:

, _τ τ-i „ ς_ΡΤ Δςη Glv Asn Ala Tyr Leu His

Arg Ser Ser Gin Ser Leu lie lyr Ser Asp y (SEQ ID NO: 1) nebo _T 10 ¹⁵

Arg Ser Ser Gin (SEQ ID NO: 15)

CDR2 lehkého

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

CDR3 lehkého řetězce:

5

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3) a _a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce a

b) těžký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) těžkého řetězce dále uvedených aminokyselinových sekvencí:

CDR1 těžkého řetězce:

5

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

Gin Ile

Ser Val Gly Asn (SEQ ID NO:

nebo

Gin Ile

Asn

Ser Val Gly Asn

-W

Ser Thr

Ser Thr

Tyr Tyr Pro

Asp Thr

Val·

Lys Gly

Tyr Tyr Pro

Asp Ser Val

Lys Gly (SEQ ID NO: 16) a

CDR3 těžkého řetězce:

Gly Asp Tyr' (SEQ ID NO: 6) a a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského iinunogl obul lnového těžkého řetězce.

předmětem tohoto vynálezu fe také použití farmaceutického prostředku obsahujícího humanizovanou monoklonální protilátku která se specificky váže na epitop obsazený v pozicích 1 az . peptidu Αβ, pro výrobu léčiva pro prevenci, léčeni nebo reverzr kognitivního deficitu u subgektu, kterému byla diagnostikovaná preklinická nebo klinická Alzheimerova nemoc, kde uvedena protilátka obsahuje.

a) lehký řetězec obsahující tři regiony urč j' komplementaritu (CDR) lehkého řetězce majícího dále uvedene aminokyselinové sekvence:

CDR1 lehkého řetězce:

^{10 15} , .

ta, Ser ser Gin Ser Léu n. Tyr «« ^te *^{U ΤΚ} (SEQ ID NO: 1) nebo

Arg Ser ¹⁵ , _{T Ser} Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His _Ser Gin Ser Leu Val Tyr ser p (SEQ ID NO: 15)

CDR2 lehkého řetězce:

5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

CDR3 lehkého řetězce:

Ser Gin Ser Thr Hle Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3), a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce a

b) těžký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) těžkého řetězce dále uvedených aminokyselinových sekvencí:

CDR1 těžkého řetězce:

5

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

Gin He Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Vai Lys Gly (SEQ ID NO: 5) nebo

Gin He

Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai

Lys Gly (SEQ ID NO:

16) a

CDR3 těžkého řetězce:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6) a a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž farmaceutický pro použiti blíže specifikované v úvodu této kapitoly, protilátka obsahuje CDR1 lehký řetězec:

prostředek kde

Arg Ser ^{10 15} .

_ser Gin Ser Lev Πθ Hrs (SEQ ID NO: 1) a

CDR2 těžký řetězec:

! 5 10 ¹⁵ _Gln ne Asn ser Vel Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5).

-íi Výhodným provedením tohoto vynálezu je použiti farmaceutického prostředku, ve kterém, jak uvedeno výše,

- protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkeho řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 9 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 10, nebo

- protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkeho řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 11 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 12, nebo

- farmaceutický prostředek obsahuje humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky vaze na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, přičemž uvedená protilátka obsahuje:

a) lehký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce majícího dále uvedene aminokyselinové sekvence:

CDR1 lehkého řetězce SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 15;

CDR2 lehkého řetězce SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO. 3 a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce a

b) těžký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) těžkého řetězce dále uvedených aminokyselinových sekvencí:

CDRl těžkého řetězce SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 15;

- CDR2 těžkého řetězce SEQ ID NO: 5 nebo SEQ ID NO: 16; CDR3 těžkého řetězce SEQ ID NO: 6 a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce, kde humanizovaná protilátka obsahuje variabilní region lehkého řetězce obsahující dále uvedené sekvence:

Asp Xaa Val ^Met

Gin Pro Ala Ser

Asp Gly Asn Ala

Pro Xaa Leu Leu

Asp Arg Phe Ser

Ser Arg Vai Glu

Thr His Vai Pre

Thr Gin Xaa Pro lie Ser Cys Arg

Tyr Leu His Trp

Leu Ser Leu Pro

Ser Ser Gin Ser phe Leu Gin Lys

He Tyr Lys Vai

Gly Ser Gly Ser

Ala Glu Asp Xaa

Trp Thr Phe Gl^

Ser Asn Arg Phe

Gly Thr Asp Phe

Gly Vai Tyr Tyr

Xaa Gly Thr Xae

105

Vai Xaa Xaa Gly

Leu Xaa Tyr Ser

Pro Gly Gin Ser

Ser Gly Vai Pro

Thr Leu Lys He

Cys Ser Gin Ser

Xaa Glu Ηθ ^LY^S

110

Arg (SEQ ID NO: 7) kde v pozici v pozici

J pozici v pozici v pozici v pozici v pozici v pozici Xaa v pozici Xaa v pozici

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Val nebo lie;

Ser nebo Thr;

Ser;

Pro;

Val;

nebo Lys;

Leu;

je je je Thr nebo Leu nebo lie nebo Arg, Gin Val nebo

105 je Gin nebo Gly

108 je Lys nebo Arg, a

109 je Val nebo je je je

Leu.

a variabilní region těžkého řetězce obsahující dále uvedené sekvence:

-H Gly Gly Leu Val 10 _ser Gly Phe Thr

Pro Gly Lys Gly

Ser Thr Tyr Tyr

Asp Asn Xaa Xaa

Xaa Asp Thr Ala

Gly Thr Xaa Val

Val Glu Xaa Gly

Ser Cys Ala Ala

Val Arg Gin Ala

Ser Val Gly Asn

Thr Ile Ser Arg

Ser Leu Arg Ala

Tyr Trp Gly Gin

Xaa Val Gin Leu

Ser Leu Arg Leu

Ser Met Ser Trp

Ala Gin lie Asn

Lys Gly Arg Phe

Leu Gin Met Asn

Ala Ser Gly Asp

Glr. Pro- Gly Gly ?he Ser Arg Tyr

Leu Xaa Leu Val

Pro Asp Xaa Val

Asn Thr Leu Tyr

Val Tyr Tyr Cys

Thr Val Ser Ser

110

100

105 (SEQ ID NO: 8) kde

Xaa v pozici 1 je Glu nebo Gin;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Leu, xaa v pozici 46 je Gin, Val, Asp, nebo Ser; xaa v pozici 63 je Thr nebo Ser;

• ne -íp Ala Ser, Val» nebo Thr

Xaa v pozici 75 je Aia,

Xaa v pozici 76 je 1Υ^{Ξ ne}^° _ř

Xaa v pozici 89 je Glu nebo Asp, a

Xaa v pozici 107 je Leu nebo Thr.

Výhodným provedením tohoto vynálezu je použití farmaceutického prostředku uvedeného v předcházejícím odstavci, kde protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 9 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 10.

Výhodným provedením tohoto vynálezu je použiti farmaceutického prostředku uvedeného v odstavci zařazeném před předcházejícím odstavcem, kde protilátka má sekvence variabilního regionu lehkého řetězce obsahující SEQ ID NO: 11 a variabilního regionu těžkého řetězce obsahující SEQ ID NO: 12.

Dále se popisuje předmětný vynález v širších souvislostech. Jsou také uvedeny srovnávací údaje.

Vynález poskytuje humanizované protilátky, nebo jejich fragmenty, které pozitivně ovlivňují kognitivní funkce u nemoci asociovaných s Αβ, jako je klinická nebo preklmická Alzheimerova nemoc, Downův syndrom a klinická nebo preklmická cerebrální amyloidová angiopatie. Protilátky nebo jejich fragmen^ nemus± pronikat hematoencefalickou bariérou, vázat se na amyloidove plaky, aktivovat buněčnou reakci nebo redukovat amyloidové plaky.

V jiném aspektu předkládaný vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, které sekvestrují Αβ peptid , z vázané, cirkulující formy v krvi, a mění klírens solubilních a vázaných forem Αβ v centrálním nervovém systému a plasmě.

V jiném aspektu předkládaný vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, kde humanizované protilátky se specificky váží na epitop mezi aminokyselinami 13 a 28 Αβ molekuly. V jiném aspektu vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, kde CDR jsou odvozeny od myší monoklonální protilátky 266 a kde si protilátky přibližné zachovávají vazebné vlastnosti myší protilátky a máji in vitro a in vivo vlastnosti funkčně ekvivalentní myší protilátce (sekvence SEQ ID NO: 1 až SEQ ID N0:6). V jiném aspektu . předkládaný vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, kde variabilní regiony máji sekvence obsahující CDR z myší protilátky 266 a specifické lidské pracovní sekvence (sekvence SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 10), kde si protilátky přibližně zachovávají vazebné charakteristiky myší protilátky a mají in vitro a in vivo vlastnosti funkčně ekvivalentní myší protilátce 266. V jiném aspektu předkládaný vynález poskytuje humanizované protilátky a jejich fragmenty, kde lehký řetězec má SEQ ID NO: 11 a těžký řetězec má SEQ ID NO: 12.

Součástí nalezeného řešení jsou také polynukleotidové sekvence, které kódují humanizované protilátky nebo jejich fragmenty popsané výše, vektory obsahující polynukleotidové sekvence kódující humanizované protilátky nebo jejich fragmenty, hostitelské buňky transformované vektory nebo inkorporující polynukleotidy, které exprimují humanizované protilátky nebo jejich fragmenty, farmaceutické přípravky humanizované protilátky a jejích fragmentů popsaných výše, a způsoby výroby a použití těchto přípravků.

Takové humanizované protilátky a jejich fragmenty jsou použitelné pro sekvestrování AS u lidí; pro léčbu a prevenci nemocí a stavů charakterizovaných AS plaky nebo AS toxicity v mozku, jako je Alzheimerovi nemoc, Downův syndrom a cerebrální amyloidová angiopatie u člověka; pro diagnostiku těchto nemocí u člověka; a pro určení toho, zda bude lidský jedinec odpovídat na léčbu lidskou protilátkou proti AS.

Podání vhodné humanizované protilátky in vivo pro sekvestraci AS peptidu cirkulujícího v biologických tekutinách je použitelné pro preventivní a terapeutickou léčbu stavů spojených s tvorbou difusních, neuritických a cerebrovaskulárních plaků obsahujících AS v mozku. Humanizované protilátky, včetně jejich imunologicky reaktivních fragmentů, způsobují odstranění AS peptidu z makromolekulárních komplexů, které se normálně podílejí na jejich transportu v tělesných tekutinách do a z míst, ve kterých mohou být tvořeny plaky nebo kde mohou být toxické. Dále, sekvestrování plazmatického AS peptidu pomocí protilátky nebo jejího fragmentu působí jako jímka, která účinně sekvestruje solubilní AS peptid v plasmatickém kompartmentu a indukuje přesun AS do plasmy z regionů v centrálním nervovém systému (CNS) . Sekvestrováním AS v krvi se zvyšuje vylučování AS z mozku a brání se ukládání solubilního AS v insolubilních plakách a tvorbě toxických solubilních typů AS v mozku. Dále, insolubilní AS '8.

v plakách, který je v rovnováze se solubilním AS, muže být odstraněn z mozku prostřednictvím sekvestrace v krvi. Sekvestrováním AS peptidu pomocí protilátky také zvyšuje jeho vylučování z těla a inhibuje toxické účinky solubilního AS v mozku a vznik a další akumulaci insolubilního AS ve formě amyloidu v plakách. Protilátky podle předkládaného vynálezu nepronikají hematoencefalickou bariérou ve velkých množstvích (0,l« plasmatické koncentrace). Dále, humanizované protilátky podle předkládaného -vynálezu nemusí při periferním podání pro dosažení účinku vyvolávat buněčnou imunitní reakci v mozku nebo cirkulaci při vazbě na AS peptid. Dále, při periferním podání se nemusí pro dosažení účinku vázat na agregovaný AS peptid v mozku.

Tak je v jednom aspektu vynález zaměřen na způsob pro léčbu a pro prevenci stavů charakterizovaných tvorbou plaků obsahujících beta-amyloidový protein u člověka, kde tento způsob zahrnuje podání, výhodně periferní, terapeuticky nebo profylakticky účinného množství humanizované monoklonální protilátky nebo jejího imunologicky reaktivního fragmentu, kde tato protilátka se specificky váže na střední region AS peptidu. v jiném aspektu je vynález zaměřen způsob pro inhibici tvorby amyloidových plaků a pro odstranění amyloidových plaků u člověka, kde tento způsob zahrnuje podání účinného množství humanizované protilátky, která sekvestruje AS peptid z cirkulující formy v krvi a indukuje vylučování peptidu z z mozku, stejně jako mění AS klírens v plasmě a mozku, člověku, který potřebuje takovou inhibici. V dalších aspektech je vynález na takové humanizované protilátky, včetně jejich imunologicky účinných částí, a na způsoby jejich přípravy.

Vynález se také týká způsobů pro zastavení zhoršování kognitivních funkcí, zlepšení kognitivních funkcí, léčbu zhoršení kognitivních funkcí a prevenci zhoršení kognitivních funkci u jedince s diagnostickovanou klinickou nebo preklinickou

4HAlzheimerovou nemocí, Downovým syndromem nebo klinickou nebo preklinickou cerebrální amyloidovou angiopatií, který zahrnuje podání účinného množství humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu danému jedinci.

Vynález také zahrnuje použití humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu pro výrobu léčiva, včetně dlouhodobé exprese rekombinantní sekvence protilátky nebo protilátkového fragmentu v lidských tkáních, pro léčbu, prevenci nebo reverzi Alzheimerovi nemoci, Downova syndromu nebo cerebrální amyloidové angiopatie; pro léčbu, prevenci, nebo reverzi zhoršování kognitivních funkcí při klinické nebo preklinické Alzheimerovi nemoci, Downova syndromu nebo klinické nebo preklinické cerebrální amyloidové angiopatie; nebo pro inhibici tvorby amyloidových plaků nebo působení toxických solubilních typů AS u člověka.

Vynález se týká překvapivého zjištění, že během krátké doby po podání protilátky podle předkládaného vynálezu dojde k vyloučení relativně velkých množství AS z centrálního nervového systému do krve. Proto předkládaný vynález zahrnuje způsoby pro hodnocení odpovědi lidského jedince na léčbu protilátkou, která se váže na AS nebo jeho fragment, které zahrnují: a) podání protilátky nebo jejího fragmentu jedinci; a b) měření koncentrace AS v krvi j edince.

Vynález také zahrnuje způsob pro léčbu lidského jedince protilátkou, která se váže na AS nebo jeho fragment, který zahrnuje: a) podání první dávky protilátky nebo jejího fragmentu jedinci; b) během 3 hodin až 2 týdnů po podání první dávky měření koncentrace AS v krvi jedince; c) pokud je to nutné, vypočítání druhé dávky protilátky nebo jejího fragmentu podle výsledků z kroku b), kde druhá dávka je stejná nebo jiná než první dávka; a d) podání druhé dávky protilátky nebo jejího fragmentu.

-1.VVynález také zahrnuje způsob pro hodnocení účinnosti protilátky, která se váže na Αβ nebo jeho fragment, v inhibici nebo prevenci tvorby Αβ amyloidových plaků, v redukci Αβ amyloidových plaků, v redukci účinků toxických solubilních typů AE, nebo v léčbě stavů a onemocnění asociovaných s Αβ plaky, u člověka, který zahrnuje: a) získání prvního vzorku plasmy nebo CSF jedince; b) měření základní koncentrace Αβ v pivním vzorku, c) podání protilátky nebo jejího fragmentu jedinci; d) během 3 hodin až 2 týdnů po podání protilátky nebo jejího fragmentu získání druhého vzorku plasmy nebo CSF jedince; a e) měření koncentrace Αβ ve druhém vzorku; kde účinnost je hodnocena podle množství Αβ navázaného na protilátku v krvi a podle koncentrace Αβ v CSF.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 ukazuje procento Αβ peptidu v lidském mozkomíšním moku, který se získá přes dialyzační membránu pomocí MAb 266 v závislosti na hraniční hodnotě molekulové hmotnosti dialyzační membrány.

Obr. 2 ukazuje koncentrace AfiTotal v plasmě APP V717F transgenních myší po injekci buď 200 ug nebo 600 ug MAb 266 v závislosti na čase.

Obr. 3A ukazuje množství uloženého Αβ peptidu v kortexu APP C717F transgenních myší léčených salinickým roztokem, myším IgG, nebo MAb 266. Obr. 3B ukazuje korelaci těchto výsledků s původem.

Obr. 4 ukazuje polynukleotidové sekvence pro expresi humanizovaného 266 lehkého řetězce z pla^midu pVk-Hu266 a jednotlivé aminokyseliny kódované v exprimovanem humanizovaném 266 lehkém řetězci (což odpovídá SEQ ID NO: 11 ve zralém stavu).

Obr. 5 ukazuje polynukleotidové sekvence pro expresi humanizovaného 266 těžkého řetězce z pla$midu pVgl-Hu266 a jednotlivé aminokyseliny kódované v exprimovaném humanizovaném 266 těžkém řetězci (což odpovídá SEQ ID NO: 12 ve zralém stavu).

i.

Obr. 6 je mapa plaámidu pVk-Hu266.

£

Obr. 7 je mapa pla$midu pVgl-Hu266.

Způsoby provedení vynálezu

AS peptidy, které cirkulují v biologických kapalinách, představují karboxy terminální region prekursorového proteinu kódovaného na chromosomu 21. Z výsledků pokusů in vitro bylo popsáno, že AS peptid má špatnou rozpustnost ve fyziologických roztocích, protože obsahuje řetězec hydrofobních aminokyselin, které jsou součástí regionu, který zakotvuje jeho delší prekursor do buněčných lipidových membrán. Proto není překvapivé, že cirkulující AS peptid je za normálních okolností v komplexu s jinými skupinami, které brání jeho agregaci. Toto způsobuje obtíže při detekci cirkulujících AS peptidu v biologických kapalinách.

Výše uvedené patenty (U.S. patenty 5,766,846; 5,837,672 a 5,593,846) popisují přípravu protilátky, včetně monoklonální protilátky, označené jako klon 266, která je namířena k a specificky se váže na peptid obsahující aminokyseliny 13-28 AS peptidu. Předkladatelé vynálezu zjistili, že protilátky, které se váží na tento region, oproti protilátkám, které se váží na jakékoliv jiné místo aminokyselinové sekvence AS, jsou schopné velmi účinně sekvestrovat solubilní AS peptid z makromolekulových komplexů. Tato sekvestrace způsobuje vylučování AS peptidu z CNS, mění jeho klírens v CNS a plasmě, a redukuje jeho schopnost tvořit plaky. Proto jsou protilátky s touto specificitou, modifikované tak, aby byla snížena jejich imunogenicita pomocí přeměny na humanizované formy, možnou léčbou - jak profylaktickou, tak terapeutickou, stavů spojených s tvorbou beta-amyloidových plaků. Mezi takové stavy patří, jak bylo uvedeno výše, preklinická a klinická Alzheimerova nemoc, Downův syndrom a preklinická a klinická cerebrální amyloidová angiopatie.

Termín léčba, jak je zde použit, zahrnuje terapeutickou léčbu, při které již existuje léčené onemocnění, stejně jako profylaktickou léčbu - t.j., prevenci nebo zmírnění možného budoucího onemocnění.

Termín monoklonální protilátky, které se váží na střední region AS peptidu, označuje monoklonální protilátky (MAb nebo MAbs), které se váží na aminokyselinovou sekvenci představující epitop obsažený mezi pozicemi 13-28 AS. Nemusí být pokryt celý region. Pokud se protilátka váže na alespoň epitop v toto regionu (zejména včetně místa pro x-sekretasu 16-17 nebo místa, na které se váže protilátka 266), tak je protilátka účinná ve způsobu podle předkládaného vynálezu.

Termín protilátka označuje monoklonální protilátku jako takovou, nebo její imunologicky účinný fragment, jako je FAS, FAS' nebo F(AS')2 fragmentu. V některých kontextech jsou fragmenty specificky uvedeny; nicméně, je třeba si uvědomit, že bez ohledu na to, zda jsou uvedeny fragmenty, zahrnuje termín protilátka takové fragmenty, stejně jako jednořetězcové formy. Pokud si protein zachovává schopnost specifické vazby na zamýšlený cil, a v tomto případě schopnost sekvestrace AS peptidu z proteinových nosičů v krvi, je zahrnut v termínuprotilátka. Termín protilátka také zahrnuje, například, jedno-řetězcové formy, » « obvykle označované jako Fv regiony, protilátky s touto specificitou. Výhodně, ale ne nutně, jsou protilátky použitelné v předkládaném vynálezu produkovány rekombinantně, protože při úpravě typické myší nebo jiné non-lidské protilátky s vhodnou specificitou je nutná její přeměna na humanizovanou formu. Protilátky mohou a nemusí být glykosylované, ačkoliv glykosylované protilátky jsou výhodné. Protilátky jsou správně zesítěné prostřednictvím disulfidových vazeb, jak je dobře známo v oboru.

Je známo, že základní strukturální jednotka protilátky je tvořena tetramerem. Každý tetramer je tvořen dvěma identickými páry polypeptidových řetězců, kde každý pár je tvořen jedním lehkým (přibližně 25 kDa) a jedním těžkým řetězcem (přibližně 50-70 kDa). Amino-koncová část každého řetězce obsahuje variabilní region velikosti přibližně 100 až 110 nebo více aminokyselin primárně odpovědný za rozpoznávání antigenu. Karboxy-koncová část každého řetězce definuje konstantní region primárně odpovědný za efektorové funkce.

Lehké řetězce se dělí na gamma, mu, alfa a lambda. Těžké řetězce se dělí na gamma, mu, alfa, delta a epsilon, a definují izotyp protilátky jako IgG, IgM, IgA, IgD a IgE, v příslušném pořadí. V lehkých a těžkých řetězcích jsou variabilní a konstantní regiony spojeny J” regionem tvořeným přibližně 12 nebo více aminokyselinami, kde těžký řetězec také obsahuje T region tvořený přibližně 10 dalšími aminokyselinami.

VariASilní regiony každého lehkého/těžkého páru řetězců tvoří vazebné místo protilátky. Proto má intaktní protilátka dvě vazebná místa. Řetězce mají stejnou obecnou strukturu tvořenou dvěma relativně konzervovanými pracovními regiony (FR) spojenými třemi hypervariabilními regiony, které se také označují jako regiony určující komplementaritu neboli CDR. CDR ze dvou řetězců každého

S » 1 páru jsou uspořádány pomocí pracovních regionů, což umožňuje vazbu na specifický epitop. Od N- konce k C-konci obsahují jak lehký, tak těžký řetězec domény FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Přiřazení aminokyselin ke každé doméně je v souladu s dobře známou konvencí (KASat Sequences of Proteins of imunological interest National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 a 1991; Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901 -917 (1987); Chothia, et al., Nature 342:878-883 (1989)).

Jak je v oboru známo, mohou být monoklonální protilátky snadno připraveny s vhodnou specificitou za použití standardních technik imunizace savců, přípravy hybridomů z buněk produkujících protilátky od uvedených savců a kultivací hybridomů nebo imortalizovaných buněk pro hodnocení jejich specificity. V tomto případě mohou být protilátky připraveny imunizací člověka, králíka, krysy nebo myší peptidem reprezentujícím epitop obsahující 13-28 region Αβ peptidu nebo jeho vhodný subregion. Materiály pro rekombinantní úpravu mohou být získaný získáním nukleotidové sekvence kódující požadovanou protilátku z hybridomů nebo jiných buněk, které jí produkují. Tato nukleotidová sekvence za zisku nukleotidu v humanizované formě.

Termín humanizovaná protilátka označuje protilátku, která je složena částečně nebo zcela z aminokyselinové sekvence odvozené od lidské protilátky pozměněním sekvence protilátky mající non-lidské regiony určující komplementaritu (CDR). Nej jednodušší alterace může spočívat v substituci konstantního regionu lidské protilátky za myší konstantní region, za vzniku lidské/myší chiméry, která může mít dostatečně nízkou imunogenicitu pro to, aby byla přijatelná pro farmaceutické použití. Výhodně jsou variabilní region protilátky a i CDR také humanizované za použití technik, které jsou dobře známé v oboru. Pracovní regiony variabilních regionů jsou substituované příslušnými lidskými

i» f« m »i 3» i >

-iopracovními regiony za ponechání non-lidských CDR v podstatě beze změn, nebo nahrazením CDR sekvencí odvozenou z lidského genomu. Plně lidské protilátky jsou produkované geneticky modifikovanými myšmi, jejichž imunitní systémy byly pozměněny tak, aby odpovídaly lidským imunitním systémům. Jak bylo uvedené výše, je ve způsobech podle předkládaného vynálezu dostačující použití imunologicky specifického fragmentu protilátky, včetně fragmentů reprezentujících jednořetězcové formy.

Humanizované protilátka opět označuje protilátku obsahující lidský pracovní region, alespoň jeden CDR z non-lidské protilátky, a ve které jakýkoliv přítomný konstantní region je v podstatě identický s lidským imunoglobulinovým konstantním regionem, t.j., alespoň přibližně z 85|9(j%, výhodně alespoň z 95^ identický. Proto jsou všechny části humanizované protilátky, s výjimkou CDR, v podstatě identické s příslušnými částmi jedné nebo více přirozených lidských imunoglobulinových sekvencí. Například, humanizovaný imunoglobulin obvykle neoznačuje protilátku tvořenou chimérickým myším variabilním regionem/lidským konstantním regionem.

Humanizované protilátky mají alespoň tři potenciální výhody před non-lidskými a chimérickými protilátkami pro použití v lidské terapii:

1) vzhledem k tomu, že efektorová část je lidská, mohou lépe interagovat s lidským imunitním systémem (například účinněji likvidovat cílové buňky pomocí cytotoxicity závislé na komplementu (CDC) nebo buněčné cytotoxicity závislé na protilátkách (ADCC)).

2) Lidský imunitní systém by neměl rozpoznávat pracovní region nebo C region humanizované protilátky jako cizí a proto by protilátková reakce proti takové injikované protilátce měla být menší než proti totálně cizorodé non-lidské protilátce nebo a částečně cizorodé chimérické protilátce.

3) Bylo popsáno, že injikované non-lidské protilátky mají poločas v lidské cirkulaci mnohem kratší než je poločas lidských protilátek. Injikované humanizované protilátky budou mít poločas v podstatě identický jako přirozené lidské protilátky, coz umožni podání nižších dávek a méně často.

Návrh humanizovaných imunoglobulinů může být proveden následujícím způsobem. Když spadá aminokyselina do následující kategorie, tak může být aminokyselina pracovního rámce lidského imunoglobulinu (akceptorového imunoglobulinu) nahrazena aminokyselinou pracovního regionu z non-lidského imunoglobulinu poskytujícího CDR (donoroveho imunoglobulinu).

(a) aminokyselina v lidském pracovním regionu akceptorového imunoglobulinu je neobvyklá pro lidský imunoglobulin v této pozici, zatímco odpovídající aminokyselina v donorovém imunoglobulinu je typická pro lidský imunoglobulin v této pozici;

(b) pozice aminokyseliny je bezprostředně sousedící s jedním z CDR; nebo (c) jakýkoliv atom vedlejšího řetězce pracovní aminokyseliny je ve vzdálenosti přibližně 5^6 angstromů (centrum-centrum) od jakéhokoliv atomu CDR aminokyseliny ve třírozměrném modelu imunoglobulinů (Queen, et al., op. cit., a Co, et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)]. Když je každá aminokyselina v lidském pracovním regionu akceptorového imunoglobulinu a příslušná aminokyselina v donorovém imunoglobulinu neobvyklá pro lidský imunoglobulin v této pozici, tak je aminokyselina nahrazena aminokyselinou typickou pro lidský imunoglobulin v této pozici.

Výhodná humanizovaná protilátka je humanizovaná forma myší protilátky 266. CDR humanizované 266 mají následující aminokyselinové sekvence:

lehký řetězec CDR1:

^{10 15}

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO:1) lehký řetězec CDR2:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO:2) lehký řetězec CDR3:

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO:3) těžký řetězec CDR1:

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO:4) těžký řetězec CDR2:

10 ¹⁵

Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO:5) a těžký řetězec CDR3:

Gly Asp Tyr (SEQ ID NO:6).

Výhodný variabilní region lehkého řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynalezu má následující aminokyselinovou sekvenci, ve které pracovní region pochází z lidských Vk segmentů DPK18 a J segmentu Jkl, s několika aminokyselinovými substitucemi na konvenční aminokyseliny ve stejné lidské V podskupině pro redukci potenciální imunogenicity:

io 15

Asp Xaa Val Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa

5550

61y Gin Ser Pro Xaa Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe

7075

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

8590

Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val

100105

Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa kde:

no

Gly Thr Xaa Xaa Glu lie Lys Arg (SEQ ID NO:7)

Xaa v pozici 2 je Val nebo lie;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Thr;

Xaa v pozici 14 je Thr nebo Ser;

Xaa v pozici 15 je Leu nebo Pro;

Xaa v pozici 30 je lie nebo Val;

Xaa v pozici 50 je Arg, Gin nebo Lys;

Xaa v pozici 88 je Val nebo Leu;

Xaa v pozici 105 je Gin nebo Gly

Xaa v pozici 108 je Lys nebo Arg; a

Xaa v pozici 109 je Val nebo Leu.

Výhodný variabilní region těžkého řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynalezu ma následující aminokyselinovou sekvenci, ve které pracovní region pochází z lidských VH segmentů DP53 a J segmentu JH4, s několika aminokyselinovými substitucemi na konvenční aminokyseliny ve stejné lidské V podskupině pro redukci potenciální imunogenicity:

i 5 1015

Xaa Val Gin Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly

2530

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

4045

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu

5560

Xaa Leu Val Ala Gin lie Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr

7075

Pro Asp Xaa Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asň Xaa

8590

Xaa Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp

100

105 kde:

Xaa v pozici 1 je Glu nebo Gin;

Xaa v pozici 7 je Ser nebo Leu;

Xaa v pozici 46 je Gin, Val, Asp, nebo Ser,

Xaa v pozici 63 je Thr nebo Ser;

Xaa v pozici 75 je Ala, Ser, Val, nebo Thr,

Xaa v pozici 76 je Lys nebo Mg;

Xaa v pozici 89 je Giu nebo Asp; a

Xaa v pozici 107 je Leu nebo Thr.

Zejména výhodný variabilní region lehkého řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu má následující aminokyselinovou sekvenci, ve které pracovní region pochází z lidských Vk segmentů DPK18 a J segmentu Jkl, s několika aminokyselinovými substitucemi na konvenční aminokyseliny ve stejné lidské V podskupině pro redukci potenciální imunogenicity:

1 Asp Val

Val Met

5 Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

10 Ser

Leu

Pro Val

Thr

15 Leu

Gly

Gin

Pro Ala

20 Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

25 Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

30 Ile

Tyr

Ser

Asp Gly

35 Asn

Ala

Tyr

Leu

His

40 Trp

Phe

Leu

Gin

Lys

45 Pro

Gly

Gin

Ser Pro

50 Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

55 Lys

Val

Ser

Asn

Arg

60 Phe

Ser

Gly

Val Pro

65 Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

70 Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

75 Asp

Phe

Thr

Leu Lys

80 Ile

Ser

Arg

Val

Glu

85 Ala

Glu

Asp

Val

Gly

90 Val

Tyr

Tyr

Cys Ser

95 Gin

Ser

Thr

His

Val

100 Pro Trp

Thr

Phe

Gly

105 Gin

110

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg (SEQ ID NO:9).

-5ΓZejména výhodný variabilní region těžkého řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu má následující aminokyselinovou sekvenci, ve které pracovní region pochází z lidských VH segmentů DP53 a J segmentu JH4.

Glu Val

Gin

Leu Val Glu

Gly ser

Leu

Arg Leu Ser ίο ¹⁵

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly

Phe Ser

Cys Ala Ala

Ser Gly Phe Thr

Arg

Ser

Met

Ser Trp

Val Arg Gin

Ala

Pro Gly

Lys

Gly Leu

Glu

Leu

Val

Ala

Gin Ile Asn Ser

Val

Gly

Pro

Asp

Thr

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr Ile

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn Ser

Asn Ser

Thr

Ser Arg

Asp Asn Ala

Leu Arg Ala Glu Asp

100 i°⁵

Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly (SEQ ID NO:1θ) · Výhodnýlehký řetězec pro humanizované protilátky podle

Ala

Cys

110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

Thr

Ala

Val předkládaného vynálezu má aminokyselinovou sekvenci:

_X 5 10

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu ^{20 2580}

Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile

4045

Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro ⁵⁰⁵⁵

Gly Gin Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg P e

7075

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp ⁸⁰⁸⁵

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly al

100405

Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gin

Gly Thr

Phe

Ile

110 ^5

Lys val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

130

Glu Gin Leu Lys phe Pro

125

Pro

Ser

Asp

Ser

Val

Val

Cys

140 Leu

Leu

Asn

Ala

145

Asn Phe Tyr Pro

Ser

Arg

Val

Gin Trp

Lys

155 Val

Asp

Asn

Ala

Leu

160 Gin Ser

Glu

Ser Val

Thr

170

Glu Gin Asp

Ser

Lys

175

Asp Ser

Ser

Ser

Thr Leu

185 Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Val

Ala Cys

200 Glu

Val

Thr

His

Gin

Thr

Lys

Ser Phe

215 Asn

Arg

Gly

Glu

120

Pro Ser Val

Gly Thr

Glu Ala

Gly

Thr

Asn

Ser

135 Ala

150

Lys

Ser

165 Gin

180 Leu

190

Asp Tyr

Glu

Lys

His

195

Lys

205

Gly Leu Ser

Ser

Pro (SEQ ID

210 Val humanizované protilátky podle

Výhodný těžký řetezec pro předkládaného vynálezu má aminokyselinovou sekvenci:

10

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin

Pro Gly

Gly

Ser

Leu

Arg

20 Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

25 Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

30 Ser

Arg

Tyr

Ser

Met

35 Ser

Trp

Val

Arg

Gin

40 Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

45 Leu

Glu

Leu

Val

Ala

50 Gin

Ile

Asn

Ser

Val

55 Gly

Asn

Ser

Thr

Tyr

60 Tyr

Pro

Asp

Thr

Val

65 Lys

Gly Arg

Phe

Thr

70 Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

75 Ala

Lys

Asn

Thr

Leu

80 Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

85 Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

90 Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

95 Tyr

Cys

Ala

Ser

100 Gly Asp Tyr

Trp

Gly

Gin

105 Gly

110 115 120

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

2-2

Phe

Pro Leu

125

Ala Pro Ser

Ser

Lys

Ser

130

Thr ser

Gly

Gly Thr

135 Ala

Ala

Leu Gly

140 Leu Vai

Lys

Asp

145 Phe Pro

Glu

Pro Vai

150

Thr

Vai

Ser

Trp

Asn

155

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

160

Ser Gly

Vai

His Thr

165 Phe

Pro

Ala

Vai

Leu

170 Gin

Ser

Ser

Gly Leu

Leu

Ser Ser

180 Vai

Vai

Thr

Vai

Pro

185

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

190

Thr Gin

Thr

He

195 Cys

Asn

Vai Asn

His

200 Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

205

Lys Vai

Asp

Lys

Lys

210 Vai

Glu

Pro

Lys

Ser

215 Cys

Asp

Lys

Thr

His

220 Thr Cys

Pro

Pro

Cys

225

Pro

230

Leu Gly Gly

Ser

235

Vai Phe

Leu

Phe Pro

240

Pro

Pro

Glu

Leu

Ala

Pro

Lys	Pro	Lys	Asp	245 Thr	Leu :	Met	lie
Cys	Val	Val	Val	260 Asp	Val	Ser	His
Asn	Trp	Tyr	Val	275 Asp	Gly	Val	Glu
Pro	Arg	Glu	Glu	290 Gin	Tyr	Asn	Ser
Leu	Thr	val	Leu	305 His	Gin	Asp	Trp
Cys Lys	Val	Ser	320 Asn	Lys	Ala	Leu
lie	Ser	Lys	Ala	335 Lys	Gly	Gin	Pro
Leu	Pro	Pro	Ser	350 Arg	Asp	Glu	Leu
Thr	Cys	Leu	Val	365 Lys	Gly	Phe	Tyr
				380

Ser

Glu

Vai

Thr

Leu

Pro

Arg

Thr

Pro

Glu

Gin

Gly

Pro

Asn

Glu

Ser

Trp

250

Arg Thr

265 Asp Pro

Pro

Val

Leu

Asp

395

Ser

Asp

Gly

Ser

Pro

Glu

Thr

Val

Asp

Lys

410

Ser

Arg

Trp

Gin

Glu

Vai

Vai

Lys

280

His Asn

295

Tyr Arg

310

Asn Gly

325

Ala Pro

340 Glu Pro

355

Lys Asn

370

Ser Asp

385

Asn

Phe

Gin

Ala

Vai

Lys lie

Gin

Gin

He

Lys

Thr

Vai

Glu

Glu

Val

Val

Lys

400

Phe Leu

415

Gly Asn

255

Thr

270 Phe

285 Lys

Ser

300 Val

315 Lys

330 Lys Thr

345 Tyr Thr

Ser

360

Leu

Ala

Thr

Ser

Val

Val

Thr

Lys

Phe

375 Glu

Ser

390

Pro

405 Leu

420 Cys

Pro lehké a těžké řetězce humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu a pro humanizovanou 266 jsou možné i jme sekvence. Imunoglobuliny mohou obsahovat dva páry komplexů lehký řetězec/těžký řetězec, kde alespoň řetězec obsahujeJeden nebo^ více myších regionů určujících komplementaritu funkčně navázaných na segmenty lidského pracovního regionu.

V jiném aspektu se předkládaný vynález týká rekombmantnich polynukleotidů kódujících protilátky, které - po expresi - obsahují CDR těžkého a lehkého řetězce z protilátky podle předkládaného vynálezu. Stejně jako pro lidský pracovní region je aminokyselinová sekvence pracovního nebo variabilního non-lidského imunoglobulinu poskytujícího CDR srovnávána s odpovídajícími sekvencemi v knihovně variabilních regionu lidského imunoglobulinu a je vybrána sekvence mající nejvyssi. procento identických aminokyselinami. Příkladem polynukleotidu, které kódují polypeptidové řetězce obsahující CDR pro těžký a lehký řetězec monoklonální protilátky 266, jsou uvedeny na obr. 4 a 5. V důsledku degenerace kodonů a nekritických aminokyselinových substitucí mohou být za tyto polynukleotidové sekvence zaměněny jiné sekvence. Zejména výhodné polynukleotidy podle předkládaného vynálezu kódují protilátky, které, < po expresi₍ , obsahují CDR SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:6, nebo jakékoliv variabilní regiony SEQ ID NO:7 - SEQ ID NO:10, nebo lehký a těžký řetězec SEQ ID NO: 11 a. SEQ ID NO. 12.

Polynukleotidy budou obvykle dále obsahovat polynukleotidové sekvence řídící expresi operativně navázané na sekvence kódující humanizovaný imunoglobulin, včetně přirozeně asociovaných či heterologních promotorových regionů. Výhodně, jsou sekvence řidiči expresi eukaryotické promotorové systémy ve vektorech schopných transformovat nebo transfektovat eukaryotické hostitelské buňky, ale mohou být použity také řídící sekvence pro prokaryotické hostitelské buňky. Po inkorporaci vektoru do vhodné hostitelské buněčné linie se hostitelské buňky propagují za podmínek vhodných pro vysokou expresi nukleotidové sekvence, a, pokud je to žádoucí, může být potom proveden odběr a přečištění lehkých řetězců, těžkých řetězců, dimerů lehký/těžký řetězec nebo intaktní protilátky, jejich vazebných fragmentů nebo jiných forem imunoglobul inů.

Nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu schopné exprimovat požadované humanizované protilátky mohou být připraveny z mnoha různých polynukleotidů (genomové nebo cDNA, RNA, syntetických oligonukleotidů, atd.) a složek (napr., V, J, D a C regionů), stejně jako za použití různých technik. Spojeni vhodné genomové a syntetické sekvence je běžným způsobem produkce, ale mohou být také použity cDNA sekvence.

DNA sekvence lidského konstantního regionu mohou být isolovány za použití dobře známých technik z různých lidských buněk, ale výhodně z imortalizovaných B-lymfocytů. CDR pro produkci imunoglobulinů podle předkládaného vynálezu budou obdobně odvozeny z non-lidské monoklonální protilátky vážící se na epitop mezi aminokyselinami 13 a 28 AS peptidu, kde tyto monoklonální protilátky jsou produkovány v jakémkoliv vhodném savčím zdroji, včetně myší, králíků nebo jiných obratlovců schopných produkovat protilátky dobře známými způsoby, jak je popsáno výše. Vhodnými zdrojovými buňkami pro polynukleotidové sekvence a hostitelskými buňkami pro expresi a sekreci imunoglobulinů jsou buňky známé v oboru.

Kromě humanizovaných imunoglobulinů, které byly popsány, mohou být snadno připraveny a vyrobeny v podstatě homologni modifikované imunoglobuliny, za použití různých rekombinantnich DNA technik dobře známých odborníkům v oboru. Například, pracovní regiony se mohou lišit od přirozené sekvence ve struktuře primární sekvence několika aminokyselinovými substitucemi, termmalnimi a intermediálními adicemi a delecemi, a podobně. Dále, různé lidské pracovní regiony mohou být použity samostatně nebo v kombinaci podle jako základ pro humanizované imunoglobuliny podle předkládaného vynálezu. Obecně, modifikace genů múze být snadno provedena za použití různých dobře známých technik, jako je místně cílená mutagenese.

Alternativně mohou být připraveny polypeptidové fragmenty obsahující pouze část primární protilátky, kde tyto fragmenty mají jednu nebo více aktivit imunoglobulinu (např., fixaci komplementu). Tyto polypeptidové fragmenty mohou být produkovány proteolytickým štěpením intaktní protilátky za použiti způsobů dobře známých v oboru, nebo insercí stop kodonů v požadovaných pozicích do vektorů za použití místně cílené mutagenese, například za CH1, což vede k produkci FAB fragmentů nebo za pantový region, což vede k produkci F(AB')2 fragmentů. Jednořetězcové protilátky mohou být produkovány spojením VL a VH za použití DNA linkeru.

Jak bylo uvedeno výše, kódující nukleotidová sekvence bude exprimována v hostitelých po operativním navázání sekvence na (t. j ., umístění zajištujícím její funkci) sekvenci řídící expresi. Tyto expresní vektory jsou obvykle replikovatelné v hostitelských organismech buď jako episomy, nebo jako integrální součást chromosomální DNA hostitele. Obecně expresní vektory obsahuji selekční markéry, např., tetracyklinový nebo neomycinový, umožňující detekci buněk transformovaných požadovanou DNA sekvencí.

B. coli je prokaryotický hostitel použitelný pro klonovaní polynukleotidů podle předkládaného vynálezu. Mezi další použitelné mikroorganismy patří bacilli, jako je Bacillus subtilus, a další enterobacteriacea; jako je Salmonella, Serratia a různé Pseudomonas species. V těchto prokaryotických hostitelých _De možno také připravit expresní vektory, které budou obsahovat sekvence řídící expresi kompatibilní s hostitelskou buňkou (např., sekvenci rozpoznávající poěátek replikace). Dále, může být použit jakýkoliv počet dobře známých promotorů, jako je laktosový promotorovy systém, tryptofanový (tip) promotorový systém, beta-laktamasový promotorový systém nebo a promotorový systém z tágu lambda. Promotory obvykle obsahují sekvencí řídící expresi, volitelné s operátorovou sekvencí, a obsahují sekvenci vazebného místa pro ribosom a podobně, pro iniciaci a dokončení transkripce a translace.

Další mikroby, jako jsou kvasinky, mohou být také použity pro expresi. Saccharomyces jsou výhodným hostitelem, a mohou být použity s vhodnými vektory obsahujícími sekvence řídící expresi, jako jsou promotory, včetně 3-fosfoglycerát- kinasového nebo z jiných glykolytických enzymů, sekvenci rozpoznávající počátek replikace, terminační sekvence a podobně.

Kromě mikroorganismů mohou být savčí tkáňové kultury také použity pro expresi a produkci polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Eukaryotické buňky jsou opravdu výhodné,^protože v oboru existuje mnoho vhodných hostitelských buněčných linu schopných secernovat intaktní imunoglobuliny a mezi tyto linie patří CHO buněčné linie, různé COS buněčné linie, buněčné linie ovariálních buněk, HeLa buňky, výhodně myelomové buněčné linie, transformované B-lymfocyty, lidské buněčné linie z embryonálních ledvin nebo hybridomy. Expresní vektory pro tyto buňky mohou

-U' je sekvence zesilovač transkripce, obsahovat sekvence pro řízení exprese, jako rozpoznávající počátek replikace, promotor, a nutné místa pro zpracování, jako jsou vazebna místa pro ribozomy, místa pro sestřih RNA, polyadenylacm msta, sekvence pro ukončení transkripce. Výhodnými sekvencemx pro razeni . transkripce jsou promotory získané z imunoglobulxnovych genu, SV40, Adenoviru, hovězího papilloma viru, cytomegalovxru a podobně.

vektory obsahující požadovanou nukleotxdovou sekvenci Jnapr. sekvence kódující těžký a lehký řetězec a sekvence řídicí expresi) mohou být přeneseny do hostitelské bučky dobře známými způsoby, které jsou vybrány podle typu hostitele. Například, pro prokaryotické buňky se běžně používá transfekce chloridem vápenatým, zatímco pro ostatní hostitelské buňky se bezne používá transfekce s fosforečnanem vápenatým nebo elektroporace.

Po expresi mohou být celé protilátky, jejich dimey, jednotlivé lehké a těžké řetězce, nebo jiné formy imunoglobulinu podle předkládaného vynálezu, přečištěny za použití standardních postupů, včetně srážení síranem amonným, iontové vymeny, afinitní, reversní, hydrofobní chromatografie, gelové elektroforezy a podobně, výhodné jsou významně přečištěné imunoglobulxny magici alespoň přibližně 90 až 95% homogenitu, nej výhodně] ši jsou pro farmaceutické použití imunoglobuliny mající 93 až 99% nebo vyšší homogenitu. Po přečištěni - částečném nebo do požadované homogenity, mohou být polypeptidy použity terapeuticky nebo profylaktíčky, jak je zde popsáno.

Protilátky (včetně imunologicky reaktivních fragmentů) jsou^ podávány jedincům s rizikem nebo existencí příznaků souvisegicíc ΓΑβ-peptidem, nebo s patologií související s AB peptxdem, gako ]e klinická nebo preklinická Alzheimerova nemoc, Downuv syndrom o ·»

-28 -Μ>

klinická nebo preklinická amyloidová angiopatie, za pouzí i standardních technik podání, výhodně za použití periferního (t.j. ne podání do centrálního nervového systému) pomoci mtravenosni, intraperitoneální, subkutánní, pulmonální, transdermalni, intramuskulámí, intranasální, bukální, sublinguálm aplikace aplikace v čípku. Protilátky mohou být také podaný přímo o komorového systému, mozkomíšního moku nebo mozkového parenchyma, _a techniky pro taková podání jsou dobře známé v oboru, takže není nutné používat obtížnějších postupů. Protilátky podle předkládaného vynálezu jsou účinné tehdy, když jsou podaný za použití jednodušších technik, jako je podání do periferní cirkulace. Mezi výhody předkládaného vynálezu patři schopnost protilátky vykazovat příznivé účinky i tehdy, když není podana přímo do centrálního nervového systému. Kromě toho bylo zgisteno, že množství protilátky, které překonává hematoencefalickou bariéru, je <0,1% plasmatické koncentrace a že protilátky podle předkládaného vynálezu mají schopnost sekvestrovat M v pen erni cirkulaci, stejně jako měnit klírens CNS a plasmatickeho solubilního AB.

Farmaceutické prostředky jsou navrženy tak, aby byly vhodné pro vybraný způsob podání, a farmaceuticky přijatelné přísady, ja o jsou disperzní činidla, pufry, surtaktanty, konzervační cini a, solubilizační činidla, činidla upravující izotomcitu, stabilizační činidla a podobně jsou použita podle potřeby. Remington’s Farmaceutické Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, poslední vydání, zde uvedené jako odkaz, poskytuje techniky pro přípravu farmaceutických prostředků. Zejména výhodné muže byt změnění rozpustnosti protilátky podle předkládaného vynálezu tak, aby byla více lipofilni, například za použití enkapsulace v liposomech nebo blokování polárních skupin.

Výhodné je periferní systémové podání intravenosní nebo

-Irt” jako je (DOTMA) je od intraperitoneální nebo podkožní injekcí. Vhodná vehikul., pro takové injekce jsou známá. Dále může být podaní provedeno pres sliznice za použití nasálního aerosolu nebo cípku. Vhodné přípravky pro taková podání jsou dobře známé a obvykle obsahuji surfaktanty, které usnadňují průnik membránou. Takové surfaktan y jsou často odvozeny od steroidů nebo kationtových lipidu N- [i - (2,3-dioleoyl)propyl-N,N,N-trimethylaramoniumchlorid nebo různé sloučeniny jako je cholesterol hemisukcmat, fosfatidylglyceroly a podobně.

Koncentrace lidské izolované protilátky v prostředcích přibližně 0,í% do 15 nebo 2<£ hmotnostních a je určena po e. objemu kapalin, viskosity a podobné, v souladu s vybraným způsobem podání. Tak mohou být typické farmaceutické prostředky pro injekce připraveny tak, aby obsahovaly 1 ml sterilní pufrované vody a iflOO mg humanizované protilátky podle předkládaného vynalezu. Přípravek by měl být sterilně přefiltrován po výrob, nebo by mel být jiným způsobem upraven tak, aby byl mikrobiologicky přijatelný. Typický prostředek pro intravenosní infusi by mel mi objem asi 250 ml, například za použití sterilmhg Ringerova roztoku, a koncentrace protilátky by měla být IflOO mg na .

Terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu mohou být zmražena nebo lyof llizována pro uskladnění a rekonstituci ^ve vhodném sterilním nosiči před použitím. Lyofilizace a re o mohou vést k různému stupni ztráty aktivity protilátky (napr. u běžných imunoglobulinů mají IgM protilátky tendenci k vetší ztrátě aktivity než IgG protilátky) . Dávky by měly být upraveny za účelem kompenzace této ztráty. pH prostředku by melo byt ta ove, aby bylo dosaženo rovnováhy mezi stabilitou protilátky (chemickou a fyzikální) a komfortem pacienta při aplikaci.Obecne je tolerováno pH mezi 4 a 8.

- H-b

Ačkoliv se uvedené způsoby zdají být nejvhodnější a nejvýhodnější pro podání proteinů, jako jsou humanizované protilátky, mohou být použity i jiné způsoby podaní, transdermální podání a orální podání, pokud je připraven vhodný prostředek.

Dále, může být výhodné použít prostředky s řízeným uvolňováním _za použití biodegradovatelných potahů a matric, nebo osmotickyc mini-pump, nebo systémů na bázi dextranových korálku, alginatu nebo kolagenu.

Závěrem, prostředky pro podání protilátek podle předkládaného vynálezu jsou dobře známé v oboru a mohou být vybrány z ruznyc možností.

Typické dávky mohou být optimalizovány za použití standardních klinických technik a dávky závisí na způsobu podání a stavu pacienta.

Následující příklady ilustrují, ale nijak neomezuji, předkládaný vynález.

Příklady uvedené dále využívají, mimo jiné, myší monoklonální protilátku označenou ”266” , která byla původně připravena imunizací peptidem složeným ze zbytků 13-28 lidského AS peptidu. Bylo potvrzeno, že tato protilátka je imunoreaktivni s tímto peptidem, ale dříve bylo uvedeno, že nereaguje s peptidem obsahujícím pouze zbytky 17-28 lidského AS peptidu, nebo jakýkoliv jiný epitop v AS peptidu. Prostředek obsahující tuto protilátku je popsán v U.S. patentu 5,766,846, který je zde uveden jako odkaz. Protože příklady popisují pokusy provedené na myších, je použiti myší monoklonální protilátky uspokojivé. Nicméně, v lecbe lidi za použití způsobů podle předkládaného vynálezu jsou výhodné > _c ^t-iiát-kv s imunospecificitou odpovídající humanizované formy protilátky protilátce 266.

Příklad 1 - x,

Sekvestrace přidaného AB peptidu v lidských tekutinách vzorky lidského mozkomíšním moku (CSF) (50 ul) a lidské plasmy (50 ul) se inkubovaly po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti následujícím způsobem:

1. samostatně;

2. spolu s 5 ng AB 40 peptidu; nebo

5 ng AB 40 peptidu plus 1 mg monoklonální protilat y (popsané, například, v U.S. patentu 5,766,846 který je zde uve jako odkaz).

Vzorky se potom zpracovaly elektroforézou na 4-25%. nedenaturujícím gradientovém gelu, t.j. nedenaturuj' gradientovou elektroforesou (NDGGE) a přenesly se do nitrocelulosy. Skvrny se potom barvily Ponceau S nebo, P^r° westernovou hybridizaci, sondovaly biotinem-značenou monoklonaln protilátkou (3D6), která je namířena proti prvním pěti aminokyselinám AB peptidu, vyvíjely se za použiti streptavidinu-křenové peroxidasy a detekovaly se chemuluminiscence (ECL) . Hydratované průměry matena u V proužcích na biotech se vyhodnocovaly za použití Pharmacia markérů molekulové hmotnosti. Pokud se AB peptid vazal na jme molekuly, procházel gelem podle velikosti vzniklého komplexu.

Westernová hybridizace CSF s nebo bez 5 ng M peptidu neukazovala žádný důkaz AB peptidu při detekci pomoci proti y 3D6 Podobné výsledky byly získány pro lidskou plasmu, o o platilo i přes skutečnost, že AB peptid mohl být detekován i I stejné techniky a na cnQ-PACE no Westernové hybridizaci za použití

Stejných vzorcích CSF. Pravděpodobné bránila detekci Αβ peptidu interakce mezi tímto peptidem a jinými faktory v testovaný kapalinách. Nicméně, když byla MAb 2« pHdána k. byly proužky charakteristické pro sekvestru₃i i Αβ peptid v kodexu s protilátkou přítok jak v plasmě, tak vOhavní proužek má hydratovaný průměr přibližné 1! nm, “^Z monomeru protilátky, menéí proužek mel 13 nm, coz odpo protilátky

Příklad 2

Specificita sekvestrující protilátky

Použily se vzorky obsahující 50 ul lidského CSF nebo 10 ul of ,npv7i7F _CSFi APP^VV1VH jsou transgenní myší reprezentujici my i vn irt-A-rvoh ie exprimován transgen pro model Alzheimerovi nemoci, ve který J P lidský amyloidový prekursorový protein s familiární mutaci pro Alzheimerovu nemoc, což vede k produkci lidského Αβ pept V centrálním nervovém systému.

lidského Αβ peptidu

MAb (1 ug) po dobu 1 zpracovaly elektroforesou NDGGE a přenesly se na nitrocelulosu způsobem popsaným

Vzorky se inkubovaly s nebo bez různých hodiny při teplotě místnosti a potom se na 4/25 v příkladu 1. Protilátky byly následující:

MAb 266 (váže se na pozice 13ς28),

MAb 4G8 (váže se na pozice 17/24),

QCBpan (králičí polyklonální protilátka pro pozice li ; myší IgG (nespecifický);

MAb 3D6 (váže se na pozice 1/-5) ,

MAb 21F12 (váže se na pozice ^/⁴²^ '

MAb 6E10 (váže se na pozice ifU); a _QCB40,42 (králičí polyklonální protilátka pro AB40 a AB42).

Detekce komplexu Αβ peptid-protilátka se provedla způsobem popsaným v příkladu 1 za použití biotinem značené 3D6 (k N-konci AS peptidu) a potom streptavidinu-HRP a ECL. Podobná detekce byly provedena v lidském CSF inkubovaném s MAb 266, v některých případech zaměněnou za QCB40,42, která se váže na karboxylový konec Αβ peptidu, pro 3D6.

Výsledky ukazují, že z testovaných protilátek pouze MAb 4G8 a MAb 266 umožňují detekci Αβ peptidu.

Výsledky ukazují, že pro lidský CSF pouze MAb 266 a MAb 4G8 mohou sekvestrovat v detekovatelných množstvích komplex protilátka-Αβ (opět, bez protilátky nebyl Αβ detekován). MAb 266 byla také schopna produkovat podobné výsledky jako výsledky získané s lidským CSF s CSF z APP^V'^7XVF transgenních myší. Αβ peptid mohl být sekvestrován v lidském CSF za použití MAb 266 bez ohledu na to, zda byla pro vyvíjení ve westernovém přenosu použita 3D6 nebo QCB40,42 protilátka.

Příklad 3

Demonstrace komplexu Αβ peptid-266 dvourozměrnou elektroforesou

Vzorek obsahující 50 ng Αβ peptidu se inkubuje s 2 ug MAb 266 a při 37 °C po dobu 3 hodin. Stejná inkubace MAb 266 samotné se použije jako kontrola.

Vzorky se potom zpracují 2-dimenzionální elektroforesou.

V prvním rozměru se inkubované vzorky zpracují NDGGE jak je popsáno v příkladu 1. Polyakrylamidové gely se potom nastříhají na jednotlivé dráhy kolmé ke směru toku v prvním rozměru a ve druhém rozměru se provede gelová separace za denaturačních/ redukčních podmínek pomocí SDS-PAGE (Tricin-ureové gely). Přítomnost proužků se detekuje buď Ponceau-S barvením (jakýkoliv protein) nebo specifickým barvením za použití 6E10 MAb (Senetek, lne.) a biotinylované anti-myší A13 v detekčním systému na bázi HRP.

Ponceau-S barvení nitrocelulosových membrán po přenosu umožňuje vizualizaci těžkého a lehkého řetězce MAb 266 samostatně. Pomocí tohot barvení bylo potvrzeno, že AS peptid byl v komplexu s MAb 266 jako proužek veliksoti 4 kD, což odpovídá velikosti kompletní MAb 266 v prvním rozměru NDGGE.

Příklad 4

Demonstrace non-ekvivalence vazby a sekvestrace žPředpokládá se, že AS peptid cirkulující v plasmě a CSF je obsažen v komplexu s proteiny, včetně apolipoproteinu E. Tento příklad demonstruje to, že protilátky k apoE, ačkoliv se váží na komplex, nesekvestrují apoE od zbytku komplexu.

ApoE komplexy (500 ng) se inkubovaly s MAb nebo polyklonalmmi protilátkami k apoE (2 ug) při teplotě 370C po dobu 1 hodiny. Inkubované vzorky se potom zpracovaly NDGGE za použití technik popsaných v příkladu 1. Po NDGGE se provedl westernový přenos s afinitně přečištěnou kozí anti-apoE protilátkou s detekcí pomocí ECL.Když nebyla přítomna žádná protilátka, tak mohl být apoE detekován při 8-13 nm, což je v souladu s přítomností lipoprotsinových částic. Přítomnost monoklonální nebo polyklonalni protilátky k apoE vedla k posunu apoE k větším molekulám, tzv. super posunu. Toto ukazuje, že protilátky k apoE nesekvestrují, t.j., neodstraňují apoE z lipoproteinových částic, ale spíše se váží na apoE na lipoproteinech za vzniku větších molekul.

Příklad 5

Sekvestrace AS není narušena anti-apoE protilátkami

Vzorek 100 ul lidského CSF se inkubuje buď s MAb 266 samotnou, nebo s polyklonální anti-apoE, nebo s oběma protilátkami po dobu 60 minut při teplotě 37^C. Vzorky se potom analyzují NDGGE jak je popsáno v příkladu 1 a detekce proužků se provede jak je popsáno v příkladu 1.

Výsledky ukazují, že když je MAb 266 přidána ke vzorku, tak je pozorovatelný přibližně 11 nm proužek charakteristický pro sekvestrovaný komplex 266-Αβ peptid. Ttak je tomu bez ohledu na to, zda je či není přítomen anti-apoE. Tento proužek, demonstrující sekvestrovaný Αβ, se také objeví tehdy, když se 50 ng Αβ peptidu přidá k inkubační směsi za přítomnosti MAb 266. Tak alterace molekulové hmotnosti apoE přítomností anti-apoE protilátky neinterferuje se sekvestrací Αβ peptidu MAb 266.

Příklad 6

Sekvestrace Αβ peptidu in vivo

A. Transgenní APP^V’^7T'^7E' myši, též označované jako PDAPP myši, nadměrně exprimují mutantní formu lidského APP proteinu. Tyto myši produkují lidský Αβ v CNS a mají zvýšené koncentrace lidského Αβ peptidu cirkulujícího v CSF a plasmě. 8j-měsíčním myším bylo intravenosní injekcí podán salinický roztok nebo 100 ug MAb 266. Krev byla těmto myším odebrána 10 minut po injekci a potom znova za 20 hodin po první injekci.

Vzorky obsahující 20 ul plasmy od každého zvířete byly analyzovány NDGGE a Westernovou hybridizací s protilátkou 3D6, jak je popsáno v příkladu 1. Zvířata, kterým byl podán salinický roztok, neměla charakteristický 11 nm proužek odpovídající sekvestrovanému Αβ peptidu po 10 minutách ani po 20 hodinách.

-ΜNicméně, dvě zvířata, kterým byla injekčně podána MAb 266, měla tento proužek po 20 hodinách.

B. V tomto pokusu se použily 2-měsíce staré APP^V'⁷¹'^7F myši. V den O se myším podala buď žádná MAb 266, nebo 1 mg MAb 266, nebo 100 „ . „ z- _w ug teto protilátky. Vzorky plasmy se odebraly dva dny před podáním £ protilátky a v dny 1, 3, 5 a 7. Vzorky plasmy se zpracovaly NDGGE a potom Westernovou hybridizací a detekcí s 3D6, jak je popsáno v příkladu 1. Ve všech dobách po podání MAb 266 byl komplex

z.

266/A13 detekován bez ohledu na to, že vzorek plasmy byl zpracován proteinem G, který se váže na imunoglobulin, čímž účinně odstraňuje MAb 266. V testovaném období byly detekovány stabilní koncentrace komplexu s výjimkou lehkého poklesu v den 7 u zvířat, kterým bylo aplikováno 100 ug MAb 266; obecný byly koncentrace u zvířat, kterým bylo podáno 100 ug, nižší než u zvířat, kterým byl podán 1 mg této protilátky.

C. Dvěma 2-měsíčním app^v’⁷¹’^7F myším se intravenosně podal 1 mg MAb „ _ z x.

266 a od kazde myši se odebral 25 ug vzorek plasmy. Vzorek plasmy se zpracoval NDGGE a potom Westernovým přenosem, jak je popsáno výše, s tou výjimkou, po vazbě biotinylované 3D6 se provedla detekce streptavidinem³·²⁵! (Amersham) a expozice na fosfo-detekčním zařízení. Koncentrace komplexu se hodnotila ve srovnání se standardní křivkou získanou za použití známých množství AE40 v komplexu se saturační koncentrací MAb 266 a podobné detekce. Množství AE peptidu navázaného na MAb 266 bylo přibližně 100 ng/ml, což představuje přibližně 1,OOO^násobné zvýšení vzhledem k endogennímu AE peptidu u těchto myší, které je přibližně 100 ul/ml. Toto je také podobné koncentraci AE peptidu v mozku APP^V'^7X'⁷¹'· myší před depozicí AE (50fl00 ng/g) ; lidský APP a lidský AE v APP^V'^7X'^7F myších jsou produkovány téměř výlučně v mozku. Tak se zdá, že přítomnost MAb 266 v plasmě způsobí vychytání AE peptidu usnadňující vylučování AE peptidu z CNS do i

plasmy. Toto zvyšuje vylučování v důsledku zvýšeného přesunu Αβ z CNS do pla|my a také prevencí pronikání AB z plasmy do mozku.

Správná velikost sekvestrovaného AB peptidu se potvrdí zpracováním 20 ul vzorků plasmy získaných od APPV717F myší za 24 hodin pro injekci 1 mg MAb 266 na TRIS-tricinových SDS-PAGE gelech a potom Westernovou hybridizací za použití anti-AB protilátky 6E10 před nebo po zpracování proteinem G za použití korálků s navázaným proteinem G. Proužek, který byl depletován proteinem G, byl detekován při 4-8 kD, což odpovídá přítomností monomerů a snad i dimerů AB peptidu.

D. 2-měsíčním APP^v-7:l‘^7F myším se aplikoval intraperitoneálně buď PBS (n=7), nebo 500 mg biotinylované MAb 266 - t.j., m266B (n=9). Před injekcí a za 24 hodin po injekci se plasma analyzovala na celkový AB peptid za použití modifikace ELISA metody dle Johnson-Wood, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555,- a Bales, K.R., et al., Nature Genet (1997) 17:263-264. Celkový AB navázaný na m266B se stanovil za použití 96-jamkových Optiplotnas (Packard, Inc.) potažených m3D6. Naředěné vzorky plasmy a standardy (různé koncentrace AB40 a m266B) se inkubovaly přes noc v potažených plotnách a množství AB/m266B komplexu se určilo za použití ^:L2sI-streptavidinu. Dále, po

24-hodinách se vzorky plasmy nejprve zpracovaly proteinem G pro kvantifikaci AB peptidu nenavázaného na MAb 266, a celkový AB a AB se určil ELISA v CSF. U myší s aplikovaným PBS byly

2 plasmatické koncentrace AB peptidu 140 ul/ml před i po injekci. Plasmatické koncentrace byly podobné u myší s aplikovanou MAb 266 před injekcí, ale koncentrace AB peptidu nenavázaného na MAb 266 byly nedetekovatelné za 24 hodin po injekci.

Také se měřily koncentrace v CSF. CSF reprezentuje extarcelulární kompartment v CNS a koncentrace molekul v CSF •-3-8· ~Γ3~ ν určitém rozsahu odráží koncentrace substancí v extracelulárním prostoru mozku. CSF se izoloval z kompartmentu cisterna magna. Myši se anestezovaly pentobarbitalem a potom se odstranila svalovina na bázi lební až prvním obratlů. CSF se získal opatrnou punkturou arachnoidní membrány překrývající cisternu za použití mikrojehly a disekčního mikroskopu a CSF se odebral do polypropylenové mikropipety. Po 24 hodinách po injekci se detekovalo zvýšení celkového Αβ peptidu v CSF myší s injekcí MAb 266, které bylo přibližně 2-násobné v Αβ₄₂ ve srovnání s myšíma, kterým byl aplikován PBS. Toto bylo potvrzeno za použití denaturační gelové elektroforesy a potom westernovou hybridizací s Afi₄₂-specifickou protilátkou 21F12.

V dalším pokusu se 3^měsíčním APP^VVXVK injikoval intravenosně buď PBS, nebo MAb 266, a následujícím způsobem se hodnotily koncentrace Αβ a Αβ v CSF:

42

Pro měření Αβ₄θ se použila monoklonální protilátka m2G3 specifická pro Αβ40. Popsaný ELISA test (Johnson-Wood, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555) se modifikoval na

RIA nahrazením Streptavidin-HRP činidla 1251-Streptavidinem. Fpro vzorky plasmy a CSF se test provedl za nedenaturačních podmínek s chyběním guanidinu v pufrech. Pro hodnocení Αβ peptidu rozpustného a nerozpustného v karbonátu v mozkovém homogenátu se vzorky homogenizovaly s 100 mM karbonátem, 40 mM NaCl, pH 11,5 (4 OC), odstředily se při 10,000 x g během 15 mm a Αβ se hodnotil v supernatantové (solubilní) a peletové (insolubilní) frakci, jak bylo popsáno dříve (Johnson-Wood, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555) a jak bylo uvedeno výše. Měření komplexu Αβ/MAb 266 v plasmě se provedlo modifikovanou RIA. Myším se podala biotinylovaná MAb 266 (MAb 26GB) a plasma se izolovala v různých časech. Celkový Αβ navázaný na MAb 266 se měřil za n

použití 96j-jamkových Optiplotnas (Packard, Inc.) potažených m3D6.

Ředěné vzorky pla|my a standardy (různé koncentrace AS_4O a MAb 26GB) se inkubovaly přes noc v potažených plotnách a množství komplexu celkový AS/MAb 266B se určilo za použití ^{12 5}1-streptavidinu.

hodiny po intravenosní injekci MAb 266 bylo detekováno λ . .

2-/násobné zvýšení koncentrace AS40 v CSF a nesignifikantni zvýšeni A&₄₂. Nicméně, za 24 a 72 hodin bylo pozorováno 3|násobné zvýšení AE_4O a AS₄₂ v CSF. Podobné výsledky byly získány za použití analýzy na denaturačním gelu následované wesetmovou hybridizací celkového CSF. Vylučování AS prostřednictvím mozkové intersticiální kapaliny, které se odráží v koncentracích CSF, je pravděpodobně odpověné za pozorované zvýšení AS v CSF.

Významné je to, že změna v koncentracích AS peptidu v CSF němůže být způsobena průnikem MAb 266 do CSF, protože koncentrace změřené za 24 hodin po injekci, které jsou nižší než 0,1% plasmatických koncentrací MAb 266, jsou nedostatečné pro to, aby způsobily tyto změny. Tyto výsledky naznačují, že AS peptid je přesouván z mozkového parenchymu do CSF přítomností protilátky v krevním řečišti.

Formy AS peptidu, které jsou rozpustné v PBS nebo uhličitanovém pufru, byly měřeny v homogenátech mozkového kůry od stejných myší, kterým byla aplikována MAb 266 a u kterých byl CSF analyzován způsobem popsaným výše. Bylo pozorováno podobné zvýšení těchto solubilních forem v homogenátech kůry mozkové.

Příklad 7

MAb 266 účinkuje in vitro jako vychytávač AS peptidu

Dialyzační komůrka se připravila jako in vitro systém pro testování schopnosti MAb 266 vychytávat AS peptid. 1 ml lidské CSF se umístil do horní komůrky polypropylenové zkumavky separované dialyzační membránou s mezí propustnosti 10-/100 kD od spodní komůrky obsahující 75 um PBS s nebo bez 1 ul MAb 266.

Zdálo se, že rovnováhy bylo dosaženo po 3 hodinách, jak se určilo zpracováním materiálu ze spodní komůrky na kyselých močovinových gelech a potom Westernovým přenosem na přítomnost AB peptidu s 6E10 v různých dobách. Vzorky se denaturovaly v kyselině mravenčí na konečnou koncentraci 80¾ (obj./obj.) a redukovaly se B-merkaptoethanolem (1%). Vzorky se zpracovaly elektroforesou (anoda-katoda) v 0,9 M pracovním pufru s kyselinou octovou na 4% až 35% polyakrylamidovém gradientovém gelu obsahujícím 6 M močoviny, 5% (obj./obj.) ledovou kyselinu octovou a 2,5% TEMED. Kyselé pH gelu se neutralizovalo před přenosem na nitrocelulosu. Potom se standardní techniky westernového přenosu použily pro identifikaci AB. Detekované proužky odpovídaly 4 kD.

Množství AE odstraněného z horní komůrky se takto určilo ELISA analýzou horní a dolní komůrky (n=4) po 3 hodinách. Výsledky pro různé meze molekulové hmotnosti za přítomnosti a nepřítomnosti MAb266 jsou uvedeny na obr. 1. Jak je uvedeno, zatímco pouze minimální množství Afi peptidu překonává membránou, když je v dolní komůrce přítomen PBS, 50% AB peptidu se sekvestruje v dolní komůrce, když tato komůrka obsahuje MAb 266 a limit molekulové hmotnosti je 25 kDa; větší množství prochází tehdy, když se limit molekulové hmotnosti zvýší na 100 kDa, kdy téměř 100% AB peptidu prochází přes membránu.

Také se pozorovalo, že protilátky proti N-konci AE 3D6 a 10D5 jsou schopné způsobit v tomto systému přenos AE přes membránu, ačkoliv nebyly schopné sekvestrovat AB peptid v testech popsaných v příkladu 1. Tyto výsledky ukazují, že protilátky k AB peptidu mají za těchto podmínek dostatečnou afinitu pro sekvestrování peptidu ve fyziologických roztocích od jiných vazebných proteinů, ale že MAb, jako je 266, které jsou imunoreaktivní s epitopem v pozici 13-28, jsou významně více účinné a váží se s vyšší afinitou.

V podobných testech měl apoE4 secernovaný astrocyty přečištěný způsobem popsaným v DeMattos, R.B., et al., J. Biol. Chem. (1998) 273:4206-4212; Sun, Y., et al., J. Neurosci. (1998) 18:3261-3272, malý, ale statisticky významný efekt na zvýšení množství AE peptidu v dolní komůrce. Žádný efekt nebyl pozorován tehdy, když byl polyklonální IgG nebo BSA zaměněn za MAb 266.

Příklad 8

Tok AS peptidu z CNS do plasmy

A. 1 ug AE40 se rozpustil v 5 ul krysího CFS pro uchování v rozpuštěném stavu a potom se injikoval do subarachnoidálního prostoru cisterna magna normálních Swiss-Webster myší, kterým byly před tím podány i.v. injekce bud' PBS (n=3), nebo 200 ug biotinylované MAb 266 (n=3). V různých časech po léčbě se celkový AS v plasmě myší určil AE ELISA, za použití 3D6 jako potahovací protilátky a standardů Afi ve směsi s nadbytkem biotinylované 266. Do každého vzorku plasmy se po odběru od každého zvířete přidal nadbytek biotinylované 266 pro P43 detekci v ELISA. U myší léčených PBS byly minimální detekovatelná množství peptidu v koncentracích 0,15 ng/ml detekovány jako píkové hodnoty po 30/60 minutách, a potom byly hodnoty prakticky nulové. U myši, kterým byla podána MAb 266, dosáhly plasmatické koncentrace P43 peptidu hodnot 330^násobně vyšších než u myší s injekcí PBS po 60 minutách (přibližně 50 ng/ml) a dosahovaly hodnot přibližně 90 ng/ml po 180 minutách.

B. Tento postup se opakoval za použití bud' 200 ug (n=3) nebo 600 ug (n=3) injikovaných i.v. 2-měsíčním APP V717F myším. MAb 266 se injikovala i.v. 3-^měsíčním ΑΡ?''⁷³-’⁷®' myším za použití výše uvedených dávek. Před a v různých intervalech po i.v. injekci se plasmatická koncentrace AS navázaného na MAb 266 určila RIA. Podrobné výsledky od jedné myši jsou uvedeny na obr. 2.

Bylo zjištěno, že koncentrace AE navázaného na monoklonální protilátku MAb 266 se zvýšila ze základních hodnot 150 ul/ml na hodnoty 100 ng/ml za 4 dny. Analýzou časných částí křivky se určilo, že čistá rychlost vstupu AB_toc do plasmy u APP^V71’^7F' Ig myší je 42 ul/ml/minutu za přítomnosti saturačních koncentrací protilátky.

Účinky MAb 266 na plasmatické koncentrace AB u přirozených a APP^v'⁷¹'^7F Tg myší, stejně jako účinky protilátky na koncentrace AE v CSF ukazují, že přítomnost MAb 266 v cirkulaci vede k změně z rovnováhy v transportu AE mezi CNS a plasmou.

Příklad 9

Účinek MAb 266 na AE v mozku

4-měsíční app^v’⁷³-’^7F-^,-^/-¹· myši se léčily každé 2 týdny po dobu 5 měsíců IP injekcemi salinického roztoku, MAb 266 (500 ug) nebo kontrolního myšího IgG (100 ug, Pharmigen). Myši se utratily ve věku 9 měsíců a určilo se ukládání AE v kůře mozkové. % plochy pokryté AE-imunoreaktivitou, jak byla určena králičí pan-AE protilátkou (QCB, lne.), se kvantifikovalo v kůře mozkové ihned po barvení dorsálního hippocampu, jak je popsáno v Holtzman, D.M., et al., Ann. Neurol. (2000) 97:2892-2897. Výsledky jsou uvedeny na obr. 3A. V tomto věku se u přibližně poloviny myší z každé skupiny ještě nezačaly vyvíjet depozita AE. Nicméně, % myší s >50% ukládáním AE v kůře mozkové bylo signifikantně nižší (P=0,02, Chi-kvadrátový test) ve skupině léčené 266. Ačkoliv se u APPV717P myší mohou vyvíjet větší depozita AS v 9 měsících, existuje značná variabilita s přibližně 50% bez depozit a přibližně 50% s výraznými depozity. U zvířat léčených PBS a IgG mělo 6/14 a 5/13 myší více než 50^ kůry mozkové nASarveno AS barvením, zatímco pouze jedna ze 14 myší léčených MAb 266 měla tuto úroveň barvení. Téměř 5of% zvířat ve všech skupinách nemělo ukládání AS v 9 měsících věku. Toto se zdá být způsobeno původem myší v naší kohortě, protože ačkoliv byly všechny testované myši oveřené jako APPV717+/+, byly vysoké hladiny deponování AS pozorovány pouze u myší ze 4/8 párů (vrhy s vysokou patologií). Myši z druhých 4 vrhů byly v podstatě bez depozit AS(vrhy s malou patologií). Za použití vrhů jako ko-proměnné byl patrný silný, statisticky významný efekt m266 na redukci deponování AS (p=0,0082, obr. 3B).

Příklad 10

Periferně injikovaná MAb 266 se neváže na plaky u APPV717F Tg myší

Pro stanovení toho, zda se MAb 266 injikovaná i.p. během 5 měsíců váže na AS v mozku se použily řezy mozkem od 9^mesicni APP^V717F _Tg myši, které obsahovaly depozita AS a které byly léčeny MAb 266, salinickým roztokem nebo kontrolním IgG. Zpracování tkání a imunobarvení se provedly popsaným způsobem (Bales, K.R., et al., Nature Genet. (1997) 17:263-264). Tkáně od všech skupin zvířat se inkubovaly s fluoresceinem-značeným anti-myším IgG (Vektor; lne.) a potom se hodnotily pod fluorescenčním mikroskopem. V žádné skupině nebylo pozorováno specifické barvení AS depozit. Naopak, při aplikování MAb 266 na řezy před inkubací řezů s anti-myším IgG byla depozita AS jasně detekována.

Příklad 11

Efekt podání protilátky 266 na kognitivní funkce 24-měsíčních transgenních hernyzygotních PDAPP myší

44- -5V

Použilo se 16 hemizygotních transgenních myší (APP^VV1VF). Myši byly v době zahájení testu staré 24 měsíců. Všechny injekce byly intraperitoneální (i.p.). Polovině myší se podávaly jednou týdně injekce fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS, kontrola) a druhé polovině injekce 500 ug myší protilátky 266 rozpuštěné v PBS. Injekce se prováděly po dobu 7 týdnů (42 dnů), celkově 6 injekcí. 3 dny po poslední injekci se hodnotilo chování zvířat za použití testu kognitivních funkcí, jak je popsán v J.C. Dodart, et al., Behavioral Neuroscience, 113 (5) 982-990 (1999). Vypočetl se index kognitivních funkcí (TB x 100)/(TB-TA). Výsledky jsou uvedeny dále v tabulce 1.

Tabulka 1

Index kognitivních funkcí
	N	Průměr	Standardní	Standardní
			odchylka	chyba
Kontrola (PBS)	8	7,22“	8,80	3,11
Protilátka 266	8	54,35	7,43	2,62

** p = 0,0010

Podávání 500 ug protilátky 266 jednou týdně 24-měsíčním, hemizygotním, transgenním myším bylo spojeno se statisticky významnou změnou chování. Protilátkou léčené myši měly indexy kognitivních funkcí podobné jako normální kontrolní zvířata [J.-C. Dodart, et al.]. Rozdíly v indexech kognitivních funkcí byly statisticky významné při p=0,001. Vyšší index kognitivní funkce ukazuje, že léčba protilátkou, která se váže na beta amyloidový peptid v regionu aminokyselin 13-28 revertuje poruchy • I * I » *

chování, které byly dokumentovány v tomto myším modelu Alzheimerovi nemoci. Proto může podání protilátky, která se váže na beta amyloidový peptid v regionu aminokyselin 13-28 léčit onemocnění jako je Alzheimerovy nemoc a Downův syndrom a také může zastavit zhoršování kognitivních funkcí, které je obvykle spojeno s progresí onemocnění.

Postižení amyloidem (% plochy barvené imunoreaktivním materiálem po barvení anti-AS protilátkou 3D6 nebo 21F12) se kvantifikovalov kůře mozkové ihned po nABarvení hippocampu včetně oblastí cinguly a parietálního kortexu v mozku 24-měsíčních zvířat léčených myší protilátkou 266 po dobu 7 týdnů, jak je popsáno výše. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce. Rozdíly mezi skupinami nebyly statisticky významné.

Tabulka 2: Množství amyloidových plaků u APPV717F +/- myší po léčbě myší 266 anti-AS protilátkou

Velikost plaků (%)
Při použití 3D6	Při použití 21F12
N	Průměr Standard, chyba	Průměr Standardní chyba
Kontrola (PBS) 7	44,3 5,93	0,77 0,14
Protilátka 266 8	38,0 2,96	0,93 0,11

Pro tato velmi stará zvířata nevede léčba myší protilátkou

266 v významně odlišnému množství amyloidu ve srovnání se skupinou léčenou PBS, podle měření buď pomocí 3D6 nebo za použití 21F12. Dále, množství AS bylo významně vyšší a signifikantně zvýšení ve srovnání s množstvím amyloidu u mladších zvířat (viz dále), které nebyly schopné rozpoznat nový objekt od známého objektu v testu kognitivních funkcí. Překvapivě tyto výsledky demonstrují, že anti-AB protilátky mohou revertovat kognitivní defekty bez nutnosti redukovat množství amyloidu jako takového.

Po 7 týdnech léčby se index kognitivních funkcí ve skupině léčené m26 statisticky významně nelišil od skupiny normálních 24-měsíců starých myší. Toto ukazuje na kompletní vylepšení kognitivního deficitu u těchto transgenních myší.

Příklad 12

Efekt podání protilátky 266 na kognitivní funkce u mladých transgenních hemizygotních PDAPP myší

Použilo se 54 homozygotnich, transgenních myší (APP^V'^71VF’) . 23 myší bylo na začátku testu ve věku přibližně 2 měsíce. Zbývající myši byly na začátku testu ve věku přibližně 4 měsíce. Trvání léčby bylo 5 měsíců. Tak bylo na konci testu staří myši přibližné sedm (7) měsíců nebo přibližně devět (9) měsíců.

Všechny injekce byly intraperitoneální (i.p.). Všechny myši v kontrolní PBS skupině dostávaly jednou týdně injekci fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS; 200 ul). Všechny myši v IgG kontrolních skupinách dostávaly jednou týdně injekci IgGlkappal isotypu (100 ug/myš/týden). Všechny myši v high dose skupinách dostávaly jednou týdně injekci 500 ug protilátky 266 rozpuštěné v PBS (HD). Všechny myši v low dose skupinách dostávaly jednou týdně injekci 100 ug protilátky 266 rozpuštěné v PBS (LD). Tři dny po poslední injekci se chování myší hodnotilo za použití testu kognitivních funkcí, jak je popsán v příkladu 10, a diskriminační index se vypočetl jako rozdíl mezi dobou strávenou na novém objektu a dobou strávenou na známém objektu. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 3. Data jsou sdružena podle věku myší na konci testu.

Tabulka 3: Statistika pro diskriminační index

	Diskriminační index (minuty)
	N	Průměr	Standardní odchylka	Standardní chyba
7 měsíců
PBS	7	2,12	4,22	1,59
igG	8	0,81	3,64	1,29
HD	8	10,04*	6,52	2,30
9 měsíců
PBS	7	1,87	3,54	1,34
igG	8	0,96	3,51	1,24
LD	8	10,75*	6,44	2,28
HD	8	12,06***	7,82	2,76

* p < 0.05 *** pcO.OOOl

Dohromady tato data podporují závěr, že podávání protilátky 266, protilátky namířené proti centrální doméně AB, zmírňuje deponování plaků u 7/9 měsíčních ΑΡΡ^ννινΕ' myší, stejně jako revertuje existující poruchy chování. Léčba pacientů protilátkou proti AB peptidu bude inhibovat nebo bránit zhoršování kognitivních funkcí, které je obvykle spojeno s progresí onemocnění, a bude obvykle revertovat takové zhoršení.

Diskriminační index pro léčená zvířata nebyl statisticky významně odlišný od indexu myší stejného věku. Proto - stejně jako u starších zvířat (příklad 11) - léčba m266 zcela revertovala zhoršování kognitivních funkcí u těchto mladších transgenních zvířat.

Příklad 13

Syntéza humanizované protilátky 266

Buňky a protilátky. Myší myelomová buněčná linie Sp2/0 se získala z ATCC (Manassas, VA) a kultivovala se v DME mediu obsahujícím 10% PBS (kat. # SH32661.03, HyClone, Logan, UT) při 370C v CO2 inkubátoru. Myší 266 hybridomové buňky se nějprve kultivovaly v RPMI-1640 mediu obsahujícím 10% FBS (HyClone), 10 mM HEPES, 2 mM glutamin, 0,1 mM neesenciální aminokyseliny, 1 mM natrium-pyruvát, 25 ug/ml gentamicinu, a potom se expandovaly v bezsérovém mediu (Hybridoma SFM, kat # 12045-076, Life Technologies, Rockville, MD) obsahujícím 2% FBS s nízkým obsahem Ig (kat # 30151.03, HyClone) na objem 2,5 litru ve válcových zkumavkách. Myší monoklonální protilátka 266 (Mu266) se přečistila ze supernatantu kultury afinitní chromátografií za použití protein-G sepharosové kolony. Biotinylovaná Mu266 se připravila za použití EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotinu (kat # 21338ZZ, Pierce, Rockford, IL).

Klonování cDNA variabilního regionu. Celková RNA se extrahovala z přibližně 107 hybridomových buněk za použití TRIzol činidla (Life Technologies) a poly(A)+ RNA se izolovala pomocí PolyATract mRNA Isolation systému (Promega, Madison, WI) podle návodu výrobce. Dvoj řetězcová cDNA se synettizovala za použití SMART-RACE cDNA Amplification Kitu (Clontech, Palo Alto, CA) podél návodu výrobce. cDNA pro variabilní regiony pro lehký a těžký řetězec se amplifikovaly polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) za použití 3' primerů, které se váží v příslušném pořadí na myší kappa a gamma řetězce konstantních regionů, a 5' univerzálního primeru obsaženého v SMARTTM RACE cDNA Amplification Kitu. Pro VL PCR měl 3' primer sekvenci:

49· -Gh5' - TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC -3' [SEQ ID

NO: 13] kde zbytky 17-46 hybridizují na myší Ck region. Pro VH PCR měly 3' primery degenerovanou sekvenci:

A G T ' -TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTCGTTTTGGC-3'

T [SEQ ID NO:14] se zbytky 17-50 hybridizujíčími na myší gamma řetězec CHI. VL a VH cDNA se subklonovaly do pCR4Blunt-TOPO vektoru (Invitrogen, Carlsbad, CA) za účelem stanovení sekvence. DNA sekvencování se provedlo za použití PCR cyklických sekvencovacích reakcí s fluorescentními dideoxy-řetězcovými terminátory (Appplied Biosystems, Foster City, CA) podle návodu výrobce. Sekvencovací reakce se analyzovaly na Model 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems).

Konstrukce variabilních regionů humanizované 266 (Hu266). Humanizace V regionů myší protilátky se provedla způsobem popsaným v Queen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1988)]. Pracovní region lidského V regionu použitý jako akceptor pro Mu266 CDR se vybral podle homologie sekvence. Počítačové programy ABMOD a ENCAD [Levitt, Μ., 1. Mol. Biol. 168:595-620 (1983)] se použily pro konstrukci molekulového modelu variabilních regionů. Aminokyseliny v humanizovaném V regionu, které byly určeny jako kontaktní s CDR, se substituovaly příslušnými zbytky Mu266. Toto se provedlo ve zbytcích 46, 47, 49 a 98 v těžkém řetězci a se zbytkem 51 v lehkém řetězci. Aminokyseliny v humanizovaném V regionu, které byly vzácné ve stejné podskupině V-regionů, byly změněny na konvenční aminokyseliny pro eliminaci potenciální imunogenicity. Toto se v lehkém řetězci.

provedlo ve zbytkách 42 a 44

Geny pro variabilní regiony lehkého a těžkého řetězce se připravily a amplifikovaly za použití 8 překrývajících se syntetických oligonukleotidů délky od přibližně 65 do 80 baží [He, X. Y., et al, J. Immunol. 160: 029-1035 (1998)]. Oligonukleotidy se tepelnou reakcí spárovaly a prodloužily se Klenow fragmentem DNA polymerasy I, za zisku 4 dvouřetězcových fragmentů. Získané fragmenty se denaturovaly, tepelnou reakcí se spárovaly a prodloužily se Klenow fragmentem za zisku dvou fragmentů. Tyto fragmenty se denaturovaly, tepelnou reakcí se spárovaly a znovu se prodloužily za zisku dvou kompletního genu. Získaný produkt se amplifikoval PCR za použití Expand High Fidelity PCR Systému (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN).

PCR-amplifikované fragmenty se přečistily na gelu a klonovaly se do pCR4Blunt-TOPO vektoru. Po potrvzení sekvence se VL a VH geny trávily MIuI a Xbal, přečistily se na gelu a subklonovaly se v příslušném pořadí do vektorů pro expresi lehkého a těžkého řetězce za zisku pVk-Hu266 a pVgl-Hu266 (viz obr. 6 a 7, v příslušném pořadí) [Co. M. S., et al., J. Immunol. 148:1149-1154 (1992)]. Zralá exprimovaná z těchto pla$midů měla lehký řetězec SEQ ID NO:11 a těžký řetězec SEQ ID NO:12.

humanizovaná 266 protilátka

Stabilní transfekce. Stabilní transfekce do myší myelomové buněčné linie Sp2/O se provedla elektroporací za použití Gene Pulser přístroje (BioRad, Hercules, CA) při 360 V a 25 uF, jak je popsáno (Co et al., 1992). Před transfekcí se pVk-Hu266 a pVgl-Hu266 plafcmidové DNA linearizovaly za použití Fspl. Přibližně 107 Sp2/0 buněk se transfektovalo 20 ug pVk-Hu266 a 40 ug pVgl-Hu266. Transfektované buňky se suspendovaly v DME mediu obsahujícím 10% PBS a buňky se umístily na několik 96J-jamkových ploten. Po 48 hodinách se přidalo selekční medium (DME medium obsahující 10% PBS, HT mediový doplněk, 0,3 mg/ml xanthinu a 1 ug/ml kyseliny mykofenolové. Přibližně 10 dní po zahájení selekce se supematanty kultury testovaly na produkci protilátek za použití ELISA, jak je popsáno dále. Klony s vysokou produkcí se expandovaly v DME mediu obsahujícím 10% PBS a dále se analyzoval na expresi protilátek. Selektované klony se potom adaptovaly na růst v Hybridoma SFM.

Měření exprese protilátek ELISA. Jamky 96^jamkové ELISA plotny (Nunc-Immuno plotna, kat. # 439454, NalgeNunc, Naperville, IL) se potáhly 100 ul 1 ug/ml kozím anti-lidským IgG, specifickým pro Fcgamma fragment, polyklonální protilátkou (kat # 109-005-098, Jackson ImunoResearch, West Grove, PA) v 0,2 M pufru tvořeným uhličitanem sodným-hydrogenuhličitaném sodný (pH 9,4) přes noc při teplotě 40j^z Po promytí promývacím pufrem (PBS obsahující 0,1^ Tween 20) se jamky blokovaly 400 pl Superblock Blocking Buffer (kat # 37535, Pierce) po dobu 30 minut a potom se promyly promývacím pufrem. Vzorky obsahující Hu266 se vhodné naredily v ELISA pufru (PBS obsahující 1% BSA a 0,1% Tween 20) a aplikovaly se na ELISA plotny (100 pl na jamku). Jako standard se použila humanizovaná anti-CD33 IgGl monoklonální protilátka HuM195 (Co, et al., 1992, výše). ELISA plotna se inkubovala po dobu 2 hodin při teplotě místnosti a jamky se potom promyly promývacím pufrem. Potom se do každé jamky přidalo 100 ul 1/1000-ředěné HRP-konjugované kozí anti-lidský kappa polyklonální protilátky (kat # 105 0-05, Southern Biotechnology, Birmingham, AL) v ELISA pufru. Po inkubaci po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a promytí promývacím pufrem se do každé jamky přidalo 100 ul AETS substrátu (kat # 507602 a 506502, Kirkegaard a Perry LAEoratories,

Gaithersburg, MD). Vyvíjení barvy se ukončilo přidáním 100 ul 2% kyseliny šúavelové na jamku. Absorbance se odečítala při 415 nm za použití OPTImax čtečky mikroploten (Molecular Devices, Menlo Park,

CA) .

Přečištění Hu266. Jeden z transformantů s vysokou expresí Hu266 označený jako Sp2/0 (klon 1D9) se upravil na růst v Hybridoma SFM a expandoval se na objem 2 litry ve otočných baňkách. Vyčerpaný supernatant kultury se získal poté, co procento živých buněk dosáhlo 10% nebo méně a vnesl se do protein-A Sepharosové kolony. Kolona se promyla PBS před tím, než se protilátka eluovala 0,1 M glycinem-HCl (pH 2,5), 0,1 M NaCl. Eluovaný protein se dialyzoval proti 3 výměnám 2 litrů PBS a přefiltroval se přes 0,2 um filtr před uskladněním při 40$ý Koncentrace protilátky se určila měřením absorbance při 280 nm (1 mg/ml =1,4 A280). SDS-PAGE v Tris-glycinovém pufru se provedla standardním způsobem na 4(-20% gradientovém gelu (kat # EC6025, Novex, San Diego, CA). Přečištěná humanizovaná 266 protilátka se redukovala a zpracovala se na SDS-PAGE gelu. Celá protilátka vykazuje dva proužky přibližné molekulové hmotnosti 25 kDa a 50 kDa. Tyto výsledky jsou v souladu s molekulovými hmotnostmi pro lehký řetězec a těžký řetězec nebo fragment těžkého řetězce vypočtenými podle jejich aminokyselinového složení.

Příklad 14

In vitro vazebné vlastnosti humanizované 266 protilátky

Vazebná účinnost humanizované 266 protilátky, syntetizované a přečištěné způsobem popsaným výše, se srovnávala s myší 266 protilátkou za použití biotinylované myší 266 protilátky ve srovnávací ELISA analýze. Jamky 96-jamkové ELISA plotny (Nunc-Imuno plotna, kat # 439454, NalgeNunc) se potáhly 100 ul 13-amyloidového peptidu (1-42) konjugovaného na BSA v 0,2 M pufru tvořeném uhličitanem sodným/hydrogenuhličitanem sodným (pH 9,4) (10 ug/ml) přes noc při 40C. Konjugát AE1-42-BSA se připravil rozpuštěním 7,5 mg AEl-42-Cys43 (C-terminální cystein na AE1-42,

AnaSpec) v 500 ul dimethylsulfoxidu, a potom okamžitým přidáním 1500 ul destilované vody. 2 miligramy maleimidem-aktivovaného hovězího sérového albuminu (Pierce) se rozpustily v 200 ul destilované vody. Tyto dva roztoky se smísily a nechaly se ustát při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Chromatografie na gelové koloně se použila pro separování nezreagovaného peptidu od konjugátu ΑβΙ-42-Cys-BSA.

Po promytí jamek fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS) obsahujícím 0,1% Tween 20 (promývací pufr) za použití promývacího zařízení pro ELISA plotny se jamky blokovaly přidáním 300 ul SuperBlock činidla (Pierce) na jamku. Po 30 minutách blokování se jamky promyly promývacím pufrem a odstranil se nadbytek kapaliny.

Směs biotinylované Mu266 (konečná koncentrace 0,3 ug/ml) a kompetiční protilátky (Mu266 nebo Hu266; konečná koncentrace od 750 ul/ml a sériová 3^násobná ředění) v ELISA pufru se přidala v trojím provedení v objemu 100 ul na jamku. Jako nekompetiční kontrola se přidalo 100 ul 0,3 ug/ml biotinylované Mu266. Jako základní kontrola se přidalo 100 ul ELISA pufru. ELISA plotna se inkubovala při teplotě místnosti po dobu 90 min. Po promytí jamek promývacím pufrem se do každé jamky přidalo 100 ul 1 ul/ml HRP-konjugovaného streptavidinu (kat # 21124, Pierce). Plotna se inkubovala při teplotě místnosti po dobu 30 min. a promyla se promývacím pufrem. Pro vývoj barvy se přidalo 100 ul/jamku ARTS Peroxidase Substrate (Kirkegaard & Perry LASoratories). Vývoj barvy se ukončil přidáním 2% kyseliny štavelové v dávce 100 ul/jamku. Absorbance se odečítala při 415 nm. Absorbance se zanesly do grafu proti logaritmu koncentrace kompetitoru, křivky se upravily pro data (za použití Prism) a určily se IC50 pro každou protilátku za použití způsobů dobře známých v oboru.

Průměrná IC_so pro myší 266 byla 4,7 ug/ml (tri samostatné pokusy, standardní odchylka = 1,3 ul/ml) a pro humanizovanou 266 byla 7,5 ul/ml ((tři samostatné pokusy, standardní odchylka = 1,1 ul/ml). Byla provedena druhá sada pokusů, v podstatě tak, jak je popsáno výše, a průměrná IC50 pro myší 266 byla 3,87 ul/ml (SD = 0,12 ul/ml) a pro lidskou 266 byla IC_so 4,0 ul/ml (SD = 0,5 ul/ml). Podle těchto výsledků lze říci, že humanizovaná 266 má vazebné vlastnosti, které jsou velmi podobné vlastnostem myší protilátky 266. Proto předpokládáme, že humanizovaná 266 má velmi podobné in vitro a in vivo aktivity ve srovnání s myší 266 a dále předpokládáme, že bude mít u člověka stejné účinky jako myší 266 u myší.

Příklad 15

In vitro vazebné vlastnosti myších protilátek 266 a 4G8

Afinita protilátky (KD = Kd/Ka) se určila za použití BIAcore biosensoru 2000 a data se analyzovala BIAevaluation (v.3.1) softwarem. Záchytná protilátka (králičí anti-myší) se navázala prostřednictvím volných amino skupin na karboxylové skupiny na průtokové komůrce 2 biosenzorového čipu (CM5) za použití N-ethyl-N-dimethylaminopropyl-karbodiimidu a N- hydroxysukcinimidu (EEC/NHS). Nespecifický králičí IgG se navázal na průtokovou komůrku 1 jako základní kontrola. Monoklonální protilátky byly zachyceny za dosažení 300 rezonančních jednotek (RU). Amyloid-beta 1-40 nebo 1-42 (Bioscience International Inc.) se potom nechal protékat okolo čipu v klesajících koncentracích (1000 až 0,1-násobek KD). Pro regeneraci čipu se navázané anti-AB protilátka eluovala z čipu za použití výplachu glycinem-HCl (pH 2) . Kontrolní injekce neobsahující beta-amyloid sloužila jako kontrola pro odečtení základních hodnot. Sensorogramy ukazující asociační a disociační fáze se analyzovaly pro stanovení Kd a Ka. Za použití tohoto způsobu byla afinita myší protilátky 266 pro AS a pro Αβ stanovena na 4 pM. Afinita 4G8 pro Αβ byla 1-40 ^c 1-42 nM a pro AS ₂ byla 24 nM. I přes 6000-násobný rozdíl v afinitách pro AS jak 266, tak 4G8, která se váže na epitopy mezi aminokyselinami 13 a 28 AS, účinně sekvestrují AS z lidského CSF. Proto je lokalizace epitopu nejdůležitější - důležitější než vazebná afinita - pro stanovení schopnosti protilátky sekvestrovat AB a tím poskytovat výhody předkládaného vynálezu.

Příklad 16:

Epitopové mapování myší protilátky 266 za použití Biacore metody a solubilních peptidů

BIAcore je automatizovaný biosenzorový systém pro měření molekulových interakcí (Karlsson R., et al., J. Immunol. Methods 145: 229-240 (1991)). Výhody BIAcore ve srovnání s jinými vazebnými testy spočívají v tom, že vazba antigenu může být měřena bez značení nebo imobilizace antigenu (tj. antigen je v přirozenější konformaci). BIAcore metoda byla použita pro hodnocení vazby různých fragmentů beta-amyloidového peptidu na myší protilátku 266, v podstatě tak, jak je to popsáno v příkladu 12, s tou výjimkou, že všechna ředění byla provedena s HEPES pufrovaným salínickým roztokem obsahujícím Tween 20, a injikovaly se různé fragmenty AS (BioSource International), a injikovala se jediná koncentrace každého fragmentu (440 nM).

Fragmenty beta-amyloidu 1-28, 12-28, 17-28 a 6-25 se vázaly na myší protilátku 266, zatímco AS fragmenty 1-20, 10-20 a 22-35 se nevázaly na protilátku. Fragmenty 1-20, 10-20 a 22-35 se vázaly na jiné mAS se známou epitopovou specificitou pro tyto regiony AS. Podle této metody se zdá, že vazebný epitop myší protilátky 266 je mezi aminokyselinami 17 a 25 AS. Protože se vazba realizuje obvykle s alespoň 3 zbytky v epitopu, lze odvodit, že epitop je obsažen ve zbytkách 19-23.

Příklad 17

In vitro vazebné vlastnosti humanizované protilátky 266

Afinita (KD=Kd/Ka) humanizované protilátky 266, syntetizované a přečištěné způsobem popsaným výše, se určila v podstatě způsobem popsaným v příkladu 15. Za použití tohoto způsob u se určila afinita humanizované 266 pro AS1-42 jako 4 pM.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický prostředek obsahující humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky vaze na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, pro použití pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci, kde uvedená protilátka obsahuje.

   a) lehký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce majícího dále uvedené aminokyselinové sekvence:

   CDR1 lehkého řetězce:

   ! 5 10

   Arg ser Ser Gin Ser Leg He Tyr Ser Aap Gly Asn ^LeU“ (SEQ ID NO: 1) nebo ! 5 10

   Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Aap Gly Aan Ala Tyr Leu Bus (SEQ ID NO: 15)

   CDR2 lehkého řetězce:

   1 ⁵

   Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

   CDR3 lehkého řetězce:

   (SEQ ID NO: 3) , a a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce, a

   b) těžký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) těžkého řetězce dále uvedených aminokyselinových sekvencí:

   CDR1 těžkého řetězce:

   1 5

   Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

   CDR2 těžkého řetězce:

   Gin lie Asn

   Ser

   Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro

   Asp Thr Val

   Lys Gly (SEQ ID nebo

   Gin lie Asn

   Ser

   Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro

   Asp Ser Val

   Lys Gly (SEQ ID NO:16) a

   CDR3 těžkého řetězce:

   Gly Asp Tyr, (SEQ ID NO: 6) a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského innvóhn ťXŤkóho řetězce.
2. 2. Farmaceutický prostředek obsahující humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky váže na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, pro použití pro prevenci, léčení nebo reverzi kognitivního deficitu u subjektu, kterému byla diagnostikována preklinická nebo klinická Alzheimerova nemoc, kde uvedená protilátka obsahuje:

   a) lehký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce majícího dále uvedené aminokyselinové sekvence:

   CDR1 lehkého řetězce:

   Arg

   Ser

   Ser

   5 ¹⁰

   Gin Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr

   Leu His (SEQ ID

   NO:

   nebo

   Arg

   Ser

   Ser

   5 10

   Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr

   Leu His (SEQ ID

   NO:

   CDR2 lehkého řetězce:

   Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

   CDR3 lehkého řetězce:

   1 5

   Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3) a a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce a

   b) těžký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) těžkého řetězce dále uvedených aminokyselinových sekvencí:

   CDR1 těžkého řetězce:

   Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

   CDR2 těžkého řetězce:

   15 1015

   Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5) nebo

   15 10 ¹⁵

   Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID NO: 16) a

   CDR3 těžkého řetězce:

   Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6) a a sekvenci úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce.
3. 3. Farmaceutický prostředek pro použití podle nároku 1 nebo

   2, kde protilátka obsahuje CDR1 lehký řetězec:

   1 ⁵ 10 ¹⁵ c_o-r Άςη 01 v Asn Ala Tyr Leu His

   CDR2 těžký řetězec:

   1 5 10

   Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr

   Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID NO: 5).
4. 4. farmaceutický prostředek pro použití podle jakéhokoli z předcházejících nároků, kde humanizovaná protilátka obsahuje variabilní region lehkého řetězce obsahující dále uvedene sekvence:

   Asp Xaa Val Met

   Gin Pro Ala Ser

   Asp Gly Asn Ala

   Pro Xaa Leu Leu

   Asp Arg Phe Ser

   Ser Arg Val Glu

   Thr Gin Xaa Pro Leu Ser c; 10

   Tle Ser Cys Arg Ser Ser

   Tyr Leu His Trp Phe Leu

   Ile Tyr Lys Val Ser Asn 55

   Gly Ser Gly Ser Gly Thr 70

   Ala Glu Asp Xaa Gly Val

   Thr His Val Pro

   100

   Trp Thr Phe Gly Xaa Gly

   105

   Leu Pro Val Xaa Xaa Gly

   Gin Ser Leu Xaa Tyr Ser

   Gin Lys Pro Gly Gin Ser

   Arg Phe Ser Gly Val Pro 60

   Asp Phe Thr Leu Lys Ile 75 ⁸⁰

   Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser

   Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys

   110

   Arg (SEQ ID NO: 7) kde

   Xaa v pozici 2 je Val nebo lie,

   Xaa v pozici 7 je Ser nebo Thr;

   Xaa v pozici 14 je Thr nebo Ser,

   Xaa v pozici 15 je Leu nebo Pro,

   Xaa v pozici 30 je Ιΐθ nebo Val,

   Xaa v pozici 50 je Arg, Gin nebo Lys,

   Xaa v pozici 88 je Val nebo Leu;

   Xaa v pozici 105 je Gin nebo Gly

   Xaa v pozici 108 je Lys nebo Arg; a

   Xaa v pozici 109 je Val nebo Leu.

   a variabilní region těžkého řetězce obsahuje dále uvedené sekvence:

   Xaa Val Gin Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly ! 5 ser Leu Arg Leu Ser Cya Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25

   Ser Met Ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Leu Val 35 ¹⁰⁴⁵

   Ala Gin lie Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Xaa val 50 55

   Lys Gly Arg Phe Thr Lie Ser Arg Asp Asn Xaa xaa Asn Thr Leu Tyr 65 7“

   Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys

   Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser

   100 kde

   Xaa v pozici 1 je Glu nebo Gin;

   Xaa v pozici 7 je Ser nebo Leu;

   Xaa v pozici 46 je Gin, Val, Asp, nebo Ser;

   Xaa v pozici 63 je Thr nebo Ser;

   Xaa v pozici 75 je Ala, Ser, Val, nebo Thr;

   Xaa v pozici 76 je Lys nebo Mgq Arj,

   Xaa v pozici 89 je GÍu nebo Asp; a

   Xaa v pozici 107 je Leu nebo Thr.
5. 5. Farmaceutický prostředek pro použiti podle nároku 4, kde protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 9 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 10.
6. 6. Farmaceutický prostředek pro použití podle jakéhokoli z předcházejících nároků, kde protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 11 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO:

   12.
7. 7. Použit farmaceutického prostředku obsahujícího humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky váže na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčení preklinické nebo klinické Alzheimerovy nemoci, kde uvedená protilátka obsahuje:

   a) lehký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce majícího dále uvedené aminokyselinové sekvence:

   CDR1 lehkého řetězce:

   15 1015

   Arg Ser Ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu Hus (SEQ ID NO: 1) nebo

   15 ¹⁰¹⁵

   Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

   CDR2 lehkého řetězce:

   Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

   CDR3 lehkého řetězce:

   Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3) a a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce a

   b) těžký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) těžkého řetězce dále uvedených aminokyselinových sekvencí:

   CDR1 těžkého řetězce:

   1 5

   Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

   10 ^{8 * * * * * * 15}

   Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly

   10 15

   Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly

   1 5

   Gin lie Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr (SEQ ID NO: 5) nebo

   1 5

   Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr (SEQ ID NO: 16) a

   CDR3 těžkého řetězce:

   Gly Asp Tyr^: (SEQ ID NO: 6) a a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce.
8. 8. Použiti farmaceutického prostředku obsahujícího humanizovanou monoklonální protilátku, která se specificky váže na epitop obsažený v pozicích 13 až 28 peptidu Αβ, pro výrobu léčiva pro prevenci, léčení nebo reverzi kognitivního deficitu u subjektu, kterému byla diagnostikována preklinická nebo klinická Aizheimerova nemoc, kde uvedená protilátka obsahuje:

   a) lehký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) lehkého řetězce majícího dále uvedené aminokyselinové sekvence:

   CDR1 lehkého řetězce:

   Arg Ser Ser Gin Ser Leu lie Tyr Ser

   Asp

   Gly Asn Ala

   Tyr Leu His (SEQ ID NO:

   1) nebo

   Arg Ser ser Gin Ser Leu Val Tyr Ser Asp

   Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 15)

   CDR2 lehkého řetězce:

   1 5

   Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) a

   CDR3 lehkého řetězce:

   1 5

   Ser Gin Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3), a region úseku základní struktury lehkého řetězce z lidského imunoglobulinového lehkého řetězce a

   b) těžký řetězec obsahující tři regiony určující komplementaritu (CDR) těžkého řetězce dále uvedených aminokyselinových sekvencí:

   CDR1 těžkého řetězce:

   ¹ 5

   Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4)

   Gin He Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Vai Lys Gly (SEQ ID NO: 5) nebo

   1 5 10 -L“¹

   Gin He Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Vai Lys Gly (SEQ ID NO: 16) a

   CDR3 těžkého řetězce:

   Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6) a a sekvence úseku základní struktury těžkého řetězce z lidského imunoglobulinového těžkého řetězce.
9. 9. Farmaceutický prostředek pro použití podle nároku 1 nebo

   2, kde protilátka obsahuje CDR1 lehký řetězec:

   j 5 10 ¹⁵

   Ar, _SeI ser Gin Ser Leu He Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu Hus (SEQ ID NO: 1) a

   CDR2 těžký řetězec:

   15 jo 15

   Gin Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr val Lys Gly (SEQ ID NO: 5) .
10. 10. Použití farmaceutického prostředku podle jakéhokoli z nároků 7 až 9, kde humanizovaná protilátka obsahuje variabilní region lehkého řetězce obsahující dále uvedené sekvence:

    Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa Gly

    10 ¹⁵

    Ser Ser Gin Ser Leu Xaa Tyr Ser 25 ³⁰

    Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser

    Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 60

    Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Tle

    75 ^tíU

    Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser 90 ⁹⁵

    Xaa Gly Thr Xaa Xaa Glu He Lys 105 ¹¹⁰

    Asp Xaa Val Met Thr Gin Xaa Pro

    Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg

    Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp

    3540

    Pro Xaa Leu Leu lie Tyr Lys Val 50

    Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65

    Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa 85

    Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly

    100

    Arg (SEQ ID NO: 7) kde _xaa v pozici 2 je Val nebo Ile xaa V pozici 7 je Ser nebo Thr _Xaa v pozicí 14 je Thr nebo Ser; _xaa v pozici 15 je Leu nebo Pro;

    _Xaa v pozici 30 je Ile nebo Val; xaa v pozici 50 je Arg, Gin nebo bys xaa v pozici 88 je val nebo Len;

    _Xaa v pozici 105 je Gin nebo Gly _Xaa v pozici 108 je Lys nebo Arg; a Xaa v pozici 109 je Val nebo Leu.

    a variabilní region těžkého řetězce obsahující dale uvedené sekvence:

    Xaa Val Gin Leu Val

    Ser Leu Arg Leu Ser

    Ser Met Ser Trp Val

    Ala Gin Ile Asn Ser

    Lys Gly Arg Phe Thr

    Leu Gin Met Asn Ser

    Ala Ser Gly Asp Tyr

    31u Xaa Gly Gly Gly Leu

    Cys Ala Ala Ser Gly Phe 25

    Arg Gin Ala Pro Gly Lys 40

    Val Gly Asn Ser Thr Tyr 55

    Ile Ser Arg Asp Asn Xaa 70 ⁷⁵

    Leu Arg Ala Xaa Asp Thr 90

    Trp Gly Gin Gly Thr Xaa

    Val Gin Pro Gly Gly

    Thr Phe Ser Arg Tyr

    31y Leu Xaa Leu Val

    Tyr Pro Asp Xaa Val

    Xaa Asn Thr Leu Tyr

    Ala Val Tyr Tyr Cys

    Val Thr Val Ser Ser

    110

    100

    105 kde (SEQ ID NO: 8)

    Xaa v pozici 1 je Glu nebo Gin;

    Xaa v pozici 7 je Ser nebo Leu; xaa v pozici 46 je Gin, Val, Asp, nebo Ser; Xaa v pozici 63 je Thr nebo Ser, • ic ňo sia Ser Val, nebo Thr Xaa v pozici 75 je Ala, ber, » Xaa v pozici 76 je Lys nebo Mgp, >4q/ Xaa v pozici 89 je Glu nebo Asp, a Xaa v pozici 107 je Leu nebo Thr.
11. 11. Použiti farmaceutického prostředku podle nároku 10, kde protilátka má sekvenci variabilního regionu lehkého retezce uvedenou v SEQ ID NO: 9 a variabilního regionu těžkého řetězce uvedenou v SEQ ID NO: 10.
12. 12. Použiti farmaceutického prostředku podle jakéhokoli z nároků 7 až 11, kde protilátka má sekvence variabilního regionu lehkého řetězce obsahující SEQ ID NO: 11 a variabilního regionu těžkého řetězce obsahující SEQ ID NO: 12.